KR102460518B1 - 치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents
치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 예로서, 개체의 특정한 세포 유형 (가령, 빠른-스파이킹-파브알부민 (FS-PV) 면역반응성인 개재뉴런) 및/또는 뇌 영역 (가령, 감각 피질 및/또는 해마)을 생체내에서 동기적으로 활성화시키는 주파수 (가령, 약 40 Hz)에서 자극 (가령, 광, 소리 및/또는 촉각)을 방출하는 자극-방출 장치를 이용하여 개체의 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도함으로써 개체에서 아밀로이드-β (Aβ) 펩티드, C 말단 단편-β (β-CTF), β-세크레타아제 (BACE1), γ-세크레타아제, 신경염증 및/또는 치매 (가령, 알츠하이머병 또는 연령-관련된 감퇴) 중에서 최소한 하나의 수준 또는 변화를 예방하고, 감소시키고, 치료하는 것 중에서 최소한 하나를 위한 시스템 및 방법을 제공한다.
Description
정부 지원 진술
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 보조금 번호 RF1 AG047661 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
관련된 출원(들)에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에, 2015년 11월 24일자 제출된 "치매를 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법"이라는 제목의 U.S. 출원 번호 62/259,187에 우선권을 주장하고, 이것의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
기술 분야
본 발명은 개체에서 치매를 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법에 전반적으로 관계한다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위한 시스템 및 방법에 관계한다.
배경
알츠하이머병 (AD)은 기억, 배향정위 및 추론에서 감퇴에 의해 특징되는 진행성 신경변성 질환이다. 이것은 전 세계적으로 치매의 가장 흔한 형태이고, 65세 이상 연령의 8명 중에서 거의 1명꼴로 영향을 주고, 그리고 미국에서 사망의 여섯 번째 원인이다. 이러한 진행성 신경변성 장애의 유병률은 다음 10 년 동안 40% 증가할 것으로 추정된다.
조직병리학적으로, AD는 아밀로이드-β (Aβ) 펩티드를 포함하는 아밀로이드판 및 타우 단백질로 만들어진 신경원섬유 매듭 (NFTs)의 축적에 의해 특징될 수 있다. Aβ 펩티드는 정상적인 생리학적 기능이 미확인된 상태로 남아있는 36-43개 아미노산 단백질이다. Aβ 펩티드는 β-세크레타아제 1 (BACE1) 및 γ-세크레타아제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적 단백질분해 개열에 의해 형성된다.
C 말단 단편 β (β-CTF)는 BACE1에 의한 APP의 아밀로이드형성 개열 동안 생산된 APP 유도체이고, 그리고 따라서, Aβ 펩티드 생산의 다른 지표이다. 정상적인 조건 하에, 가용성 Aβ 펩티드는 뉴런에 의해 생산되고 분비되고, 그리고 차후에, 뇌척수액 (CSF) 경로를 통해 뇌로부터 소실된다. 하지만, AD를 앓는 개체에서, Aβ 펩티드는 고차 종류로 응집하여, 농도 의존성 방식으로 가용성 소중합체 및 불용성 플라크를 형성하는 것으로 보인다. 이러한 응집은 교란된 뇌 물질대사, 신경염증, 감소된 기능적 연결성, 시냅스 및 뉴런 상실 및/또는 NFTs의 형성을 비롯한 많은 신경독성 사건을 개시할 수 있다.
Aβ 농도 및 뉴런 활성 사이에 근본적인 관계가 증명되었다. 첫 번째, APP를 과다발현하는 유전자도입 (Tg) 생쥐로부터 준비된 기관형적 해마 슬라이스의 테트로도톡신으로 처리는 뉴런 활성, 그리고 차후에, Aβ 수준을 감소시켰다. 이후, 역효과 - 증가된 뉴런 활성 - 가 피크로톡신으로 처리 시에 관찰되었다. 생체내에서 Aβ 펩티드 농도 및 궁극적인 플라크 침착의 동적 조정 또한, 뉴런 활성을 이용하여 증명되었다. 인간 AD 환자에서, 신경 영상화는 가장 심각한 플라크 침착이 "디폴트-방식 네트워크"로서 알려져 있는, 가장 일관되게 활성 뇌 구역과 보조를 같이할 수 있다는 것을 보여준다.
현재 AD는 치유법이 없고, 그리고 치료 옵션은 AD의 병리학적 진행을 저해하지 못하고, 주로 완화성이고 및/또는 복수의 골치 아픈 부작용을 가질 수 있다. 가령, Aβ 펩티드 및/또는 이의 전구체를 표적으로 하는 방지 및/또는 치료 전략 (가령, Aβ 면역요법 및 β-와 γ-세크레타아제의 저해)은 임상 시험에서 독성이고 및/또는 AD 병리를 감소시키는데 무효하였다. 아밀로이드 베타 백신 (가령, 바피네우주맙)을 수반하는 임상 시험은 인지 이득의 결여로 인해 실패하였다. 감마-세크레타아제 저해제 (가령, 세마가세스타트)는 개체에서 인지 결손의 악화로 인해 임상 시험에 실패하였다. 심지어, 아세틸콜린에스테라아제 저해제 (가령, 도네페질 및 리바스티그민) 및 N-메틸-D-아스파르트산염 (NMDA)-수용체 길항제 (가령, 메만틴)과 같은 현존하는 약제도 단지 경미한 인지 이득만을 보여준다.
요약
AD의 핵심적인 현미경적 병리학적 홀마크는 아밀로이드판, NFTs 및 광범위한 뉴런 상실의 존재를 포함한다. 뉴런 손상의 이러한 축적은 시간에 걸쳐 발생하고, 그리고 뇌에서 육안적 회로 기능장애, 구체적으로 기억 및 주의 과제 동안 감마 파워 결손을 유도한다. 이들 감마 진동 (가령, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz)은 일차적으로 기원하고, 그리고 빠른-스파이킹-파브알부민 (FSPV)-개재뉴런에 의해 조정된다.
한 양상에서, 본 발명은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하는, 개체에서 치매를 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 장치, 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 구체예에서, 치매는 AD, 혈관 치매, 전두 측두 치매, 루이체 치매 및/또는 나이 관련 인지 저하와 연관된다. 개체는 인간 또는 동물일 수 있다.
일부 구체예에서, 동기화된 감마 진동은 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 예를 들면, 약 40 Hz의 주파수를 갖는다. 동기화된 감마 진동은 세포 유형 특이적 방식으로 유도될 수 있다. 가령, 진동은 FS-PV-개재뉴런의 동기화된 활성화에 상응할 수 있다. 동기화된 감마 진동은 뇌-영역 특이적 방식으로 유도될 수 있다. 가령, 진동은 해마 영역 및 감각 피질 영역 중에서 최소한 하나에서 동기화된 활성화에 상응할 수 있다.
한 구체예에서, 개체에서 치매를 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 방법은 자극-방출 장치를 제어하여 자극을 방출하고, 그리고 개체를 이들 자극에 노출시키고 및/또는 이들 자극을 개체에 투여하고, 따라서 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 생체내 동기화된 감마 진동을 유도하는 단계를 포함한다. 자극은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수, 예를 들면, 약 40 Hz의 주파수를 가질 수 있다. 자극-방출 장치는 촉각 장치, 발광 장치 및/또는 소리-방출 장치일 수 있다. 가령, 발광 장치는 광섬유 장치일 수 있다. 자극에 대한 개체의 노출의 지속 기간 및/또는 개체에 자극의 투여는 약 1 시간일 수 있다. 자극에 대한 개체의 노출 및/또는 개체에 자극의 투여는 기간에 걸쳐 반복될 수 있다. 가령, 자극에 대한 개체의 노출 및/또는 개체에 자극의 투여는 기간에 걸쳐 최소한 하루 1회 반복될 수 있다. 기간은 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주 및/또는 1 개월 (또는 그 이상, 예를 들면, 개체의 여생 동안 하루 1회)을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
한 양상에서, 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 수준 (가령, 양 또는 비율)을 감소시키기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함한다. Aβ 펩티드는 Aβ 펩티드의 하나 또는 그 이상의 동종형 (가령, 동종형 Aβ1 -40, 동종형 Aβ1 -42 및/또는 동종형 Aβ1 -43), 가용성 Aβ 펩티드 및/또는 불용성 Aβ 펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 동기화된 감마 진동은 예로서, 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 APP의 C 말단 단편 (CTFs) 및/또는 N 말단 단편 (NTFs)의 수준 (가령, 양 또는 비율)을 감소시킴으로써 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 생산을 감소시킨다. 동기화된 감마 진동은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 BACE1 및/또는 γ-세크레타아제에 의한 APP의 CTFs 및 NTFs로의 개열을 감소시킬 수 있다. 동기화된 감마 진동은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 엔도솜의 수준 (가령, 숫자 또는 비율)을 감소시킬 수 있다. 가령, 엔도솜은 초기 엔도솜 항원 1 (EEA1) 및/또는 RAB5A 유전자에 의해 인코딩된 Ras-관련된 단백질 (Rab5)에 대해 양성일 수 있다. 일부 구체예에서, 동기화된 감마 진동은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 소실을 증진한다. 동기화된 감마 진동은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포에 의한 Aβ 펩티드의 흡수를 증가시킬 수 있다.
한 양상에서, 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하는, 소교세포의 수준 (가령, 숫자 또는 비율), 신경보호 상태와 일치하는 소교세포에서 형태적 변화 및/또는 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포의 활성을 증가시키기 위한 방법. 동기화된 감마 진동은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포 활성에 관련된 최소한 하나의 차별적으로 발현된 유전자, 예를 들면, Nr4a1, Arc, Npas4, Cd68, B2m, Bsr2, Icam1, Lyz2, Irf7, Spp1, Csf1r 및/또는 Csf2ra를 상향조절할 수 있다. 신경보호 상태와 일치하는 소교세포에서 형태적 변화는 세포체 크기에서 증가 및/또는 돌기 길이에서 감소를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체의 해마에서 Aβ 펩티드의 수준 (가령, 양 또는 비율)을 감소시키기 위한 방법은 해마에서 FS-PV-개재뉴런을 복수의 광 펄스로 광유전학적으로 자극하는 것을 포함하고, 이들 FS-PV-개재뉴런은 광유전학적 액추에이터를 발현하고, 따라서 해마에서 Aβ 펩티드의 수준을 감소시키는, 흥분성 뉴런 (가령, FS-PV-개재뉴런)에서 지역장 전위에 의해 계측된 생체내 동기화된 감마 진동을 연행한다. 광 펄스는 약 40 펄스/s의 펄스 주파수를 가질 수 있다. 각 광 펄스는 약 1 ms의 지속 기간을 가질 수 있다. 최소한 하나의 광 펄스는 약 473 nm의 파장을 가질 수 있다. 광유전학적 액추에이터는 채널로돕신, 할로로돕신 및/또는 알키로돕신을 포함할 수 있다. 가령, 광유전학적 액추에이터는 채널로돕신-2 (ChR2)일 수 있다.
한 양상에서, 개체의 시각 피질에서 가용성 및/또는 불용성 Aβ 펩티드의 수준 (가령, 양 또는 비율)을 감소시키기 위한 방법은 개체를 약 40 펄스/s의 펄스 주파수에서 복수의 광 펄스로 자극하고, 따라서 시각 피질에서 가용성 및/또는 불용성 Aβ 펩티드의 수준을 감소시키는, 시각 피질에서 생체내 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 개체의 시각 피질에서 타우 인산화의 수준 (가령, 양 또는 비율)을 감소시키기 위한 방법은 개체를 약 40 펄스/s의 펄스 주파수에서 복수의 광 펄스로 자극하고, 따라서 시각 피질에서 타우 인산화를 감소시키는, 시각 피질에서 생체내 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 개체의 해마 및/또는 청각 피질에서 Aβ 펩티드의 수준 (가령, 양 또는 비율)을 감소시키기 위한 방법은 개체를 약 40 펄스/s의 펄스 주파수에서 복수의 소리 펄스로 자극하고, 따라서 해마 및 청각 피질 중에서 최소한 하나에서 Aβ 펩티드의 수준을 감소시키는, 해마 및 청각 피질 중에서 최소한 하나에서 생체내 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 인지 기능의 수준 (가령, 양 또는 비율) 또는 이것에서 변화를 예방하고, 감소시키고 및/또는 치료하기 위한 시스템은 개체의 뇌 영역의 생체내 동기화된 활성화를 위한 자극-방출 장치, 자극 파라미터 및 프로세서 실행가능한 명령을 저장하기 위한 최소한 하나의 메모리, 그리고 자극-방출 장치 및 최소한 하나의 메모리에 통신가능하게 연결된 최소한 하나의 프로세서를 포함한다. 프로세서 실행가능한 명령의 실행 시에, 최소한 하나의 프로세서는 자극-방출 장치를 제어하여 자극 파라미터에 따라 자극을 방출하고, 이들 파라미터는 일정한 주파수를 포함하고, 상기 주파수에서 뇌 영역이 동기적으로 활성화되고, 여기서 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 치매가 예방되고, 감소되고 및/또는 치료된다. 주파수는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 예를 들면, 약 40 Hz일 수 있다. 생체내 동기화된 활성화는 효소에 의해 조절되고 및/또는 특정한 세포 유형, 예를 들면, 면역반응성인 FS-PV-개재뉴런에서 일어날 수 있다. 효소는 광유전학적 활성인자, 미생물 옵신, ChR2 및/또는 벡터 AAV - DIO - ChR2 - EYFP를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 인지 기능의 수준 (가령, 양 또는 비율) 또는 이것에서 변화를 예방하고, 감소시키고 및/또는 치료하기 위한 시스템은 개체의 최소한 하나의 눈에 대한 환경 광을 감소시키기 위한 광 폐쇄 장치 및/또는 개체의 최소한 하나의 귀에 대한 환경 잡음을 감소시키기 위한 잡음-상쇄 장치를 포함한다. 광 폐쇄 장치는 개체의 시각 피질 및 해마 중에서 최소한 하나의 생체내 동기화된 활성화를 위해 최소한 하나의 눈에 광 자극을 방출하기 위한 발광 유닛을 포함할 수 있다. 잡음-상쇄 장치는 개체의 청각 피질 및 해마 중에서 최소한 하나의 생체내 동기화된 활성화를 위해 최소한 하나의 귀에 소리 자극을 방출하기 위한 스피커 유닛을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 또한, 프로세서 실행가능한 명령을 저장하기 위한 최소한 하나의 메모리, 그리고 광 폐쇄 장치 및/또는 잡음-상쇄 장치 및 최소한 하나의 메모리에 통신가능하게 연결된 최소한 하나의 프로세서를 포함한다. 프로세서 실행가능한 명령의 실행 시에, 최소한 하나의 프로세서는 발광 유닛이 일정한 주파수에서 광 자극을 방출하도록 광 폐쇄 장치를 제어할 수 있고, 상기 주파수에서 시각 피질 및 해마 중에서 최소한 하나가 동기적으로 활성화된다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 최소한 하나의 프로세서는 스피커 유닛이 일정한 주파수에서 소리 자극을 작동시키도록 잡음-상쇄 장치를 제어할 수 있고, 상기 주파수에서 청각 피질 및 해마 중에서 최소한 하나가 동기적으로 활성화된다.
한 양상에서, 개체에서 인지 기능을 향상시키기 위한 방법은 최소한 하나의 전기음향 변환기를 제어하여, 전기 오디오 신호를 상응하는 소리 자극으로 전환하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 소리 자극은 약 35 클릭/s 내지 약 45 클릭/s의 클릭 빈도에서 클릭 훈련을 포함한다. 상기 방법은 개체를 소리 자극에 노출시키고 및/또는 상기 자극을 개체에 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 더욱 포함하고, 동기화된 감마 진동은 개체에서 인지 기능의 향상을 유발한다. 인지 기능은 인식, 식별 및/또는 공간 기억을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 인지 기능의 수준 (가령, 양 또는 비율) 또는 이것에서 변화를 예방하고, 감소시키고 및/또는 치료하기 위한 방법은 다음을 포함한다: 최소한 하나의 전기음향 변환기를 제어하여 전기 오디오 신호를 상응하는 소리 자극으로 전환하고, 상기 소리 자극은 약 35 클릭/s 내지 약 45 클릭/s의 클릭 빈도에서 클릭 훈련을 포함하고, 그리고 개체를 소리 자극에 노출시키고 및/또는 상기 자극을 개체에 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하고, 이들 동기화된 감마 진동은 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 치매의 수준의 예방, 감소 및/또는 치료를 유발한다.
Aβ 펩티드는 Aβ 펩티드의 하나 또는 그 이상의 동종형 (가령, 동종형 Aβ1 -40, 동종형 Aβ1 -42 및/또는 동종형 Aβ1 -43), 가용성 Aβ 펩티드 및/또는 불용성 Aβ 펩티드를 포함할 수 있다. 동기화된 감마 진동은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포의 숫자를 증가시키고 및/또는 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포에 의한 Aβ 펩티드의 흡수를 증강함으로써, 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 치매의 수준을 예방하고, 감소시키고 및/또는 치료할 수 있다. 최소한 하나의 뇌 영역은 청각 피질 및/또는 해마를 포함할 수 있다.
클릭 빈도는 약 40 클릭/s일 수 있다. 클릭 훈련에서 각 클릭은 약 1 ms의 지속 기간을 가질 수 있다. 클릭 훈련에서 각 클릭은 약 10 Hz 내지 약 100 kHz, 약 12 Hz 내지 약 28 kHz, 약 20 Hz 내지 약 20 kHz 및/또는 약 2 kHz 내지 약 5 kHz의 주파수를 가질 수 있다. 클릭 훈련에서 각 클릭은 약 0 dB 내지 약 85 dB, 약 30 dB 내지 약 70 dB, 그리고 약 60 dB 내지 약 65 dB의 음압 수준을 가질 수 있다.
최소한 하나의 전기음향 변환기는 최소한 하나의 헤드폰을 포함할 수 있고, 이러한 사례에서 상기 방법은 소리 자극을 개체의 최소한 하나의 귀 내로 지향시키기 위해, 최소한 하나의 헤드폰을 개체의 최소한 하나의 귀 주변에, 최소한 하나의 귀 위에 및/또는 최소한 하나의 귀 내에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한, 수동 잡음 차단 및/또는 능동 잡음 상쇄를 이용하여, 환경 잡음을 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 인지 기능의 수준 (가령, 양 또는 비율) 또는 이것에서 변화를 예방하고, 감소시키고 및/또는 치료하기 위한 시스템은 전기 오디오 신호를 상응하는 소리 자극으로 전환하기 위한 최소한 하나의 전기음향 변환기, 상기 소리 자극은 약 35 클릭/s 내지 약 45 클릭/s의 클릭 빈도에서 클릭 훈련을 포함하고, 전기 오디오 신호 및 프로세서 실행가능한 명령을 저장하기 위한 최소한 하나의 메모리 장치, 그리고 최소한 하나의 전기음향 변환기 및 최소한 하나의 메모리 장치에 통신가능하게 연결된 최소한 하나의 프로세서를 포함한다. 프로세서 실행가능한 명령의 실행 시에, 최소한 하나의 프로세서는 전기음향 변환기를 제어하여 소리 자극을 개체의 최소한 하나의 귀에 출력하고 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하고, 이들 동기화된 감마 진동은 개체에서 Aβ 펩티드, 신경염증 및/또는 치매의 수준의 예방, 감소 및/또는 치료를 유발한다.
시스템은 정류식 또는 이동식일 수 있다. 소리 자극을 개체의 최소한 하나의 귀 내로 지향시키고 환경 잡음을 감소시키기 위해 개체가 최소한 하나의 귀 주변에, 최소한 하나의 귀 위에 및/또는 최소한 하나의 귀 내에 착용하기 위한 최소한 하나의 헤드폰을 최소한 하나의 전기음향 변환기가 포함하면, 상기 시스템은 전기 오디오 신호를 최소한 하나의 헤드폰에 통신하기 위한 헤드폰 인터페이스를 더욱 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 상기 시스템은 소리 자극의 출력 이전에, 동안 및/또는 이후에 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 기능을 모니터링하기 위한 신경영상화 스캐너를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체에서 치매를 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 개체에서 스트레스 반응에 관련된 글루코코르티코이드의 혈액 수준 (가령, 양)을 유지하고 및/또는 감소시키기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 개체에서 불안을 예방하고 및/또는 감소시키기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 기억 연상을 유지하고 및/또는 증강하기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다. 기억 연상은 공간 기억에서 기초될 수 있다.
한 양상에서, 인지 유연성을 유지하고 및/또는 증강하기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 해부학 및/또는 형태학에 대한 변화를 유지하고 및/또는 감소시키기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다. 해부학 및/또는 형태학은 뇌 중량, 측 뇌실 크기, 피질층의 두께, 뉴런층의 두께 및/또는 혈관 직경을 포함할 수 있다. 최소한 하나의 뇌 영역은 개체의 시각 피질, 체성 감각 피질 및/또는 도피질을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 뉴런의 숫자, 뉴런 내에 DNA의 질 및/또는 시냅스 부점 밀도에 대한 변화를 유지하고 및/또는 감소시키기 위한 방법은 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치를 제공하는 것을 포함한다. 최소한 하나의 뇌 영역은 개체의 시각 피질, 체성 감각 피질, 도피질 및/또는 해마를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 장치는 개체에서 치매 및/또는 불안을 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하고, 개체의 기억 연상 및/또는 인지 유연성을 유지하고 및/또는 증강하고 및/또는 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 해부학, 형태학, 세포 및 분자에 대한 변화를 유지하고 및/또는 감소시킬 수 있다.
아래에 더욱 상세하게 논의된 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합 (이런 개념이 상호간에 불일치하지 않는다면)은 본원에서 개시된 발명 요부의 일부인 것으로 예기되는 것으로 인지되어야 하다. 특히, 본 발명의 끝부분에서 나타나는 청구된 요부의 모든 조합은 본원에서 개시된 발명 요부의 일부인 것으로 예기된다. 참조로서 편입된 임의의 개시에서 또한 나타날 수 있는, 본원에서 명시적으로 이용된 용어는 본원에서 개시된 특정 개념과 가장 부합하는 의미가 부여되어야 하는 것으로 또한 인지되어야 한다.
다른 시스템, 과정 및 특질은 다음의 도면 및 상세한 설명의 검토 시에 당업자에게 명백해질 것이다. 이와 같은 모든 추가 시스템, 과정 및 특질은 이러한 설명 내에 포함되고, 본 발명의 범위 내에 있고, 그리고 첨부된 청구항에 의해 보호되는 것으로 의도된다.
도면의 간단한 설명
당업자는 도면이 일차적으로, 예시를 목적으로 하고, 그리고 본원에서 설명된 발명 요부의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 이들 도면은 반드시 일정한 비율인 것은 아니다; 일부 경우에, 본원에서 개시된 발명 요부의 다양한 양상은 상이한 특질의 이해를 용이하게 하기 위해 도면에서 과장되거나 또는 확대되어 보일 수 있다. 도면에서, 유사 참고 문자는 일반적으로, 예로서 유사 특질 (가령, 기능적으로 유사한 및/또는 구조적으로 유사한 요소)을 참조한다.
도면 1은 일부 구체예에 따라서, 구형 트레드밀에서 가상의 선형 미로를 통해 움직이는 생쥐를 도해하는 계통도이다.
도면 2A 및 2B는 일부 구체예에 따라서, 해마 CA1로부터 기록된 전기 트레이스이고, 그리고 세타 진동 및 예파 연흔 (SWRs)을 도해한다.
도면 3A 및 3B는 일부 구체예에 따라서, 3-개월령 Tg 5XFAD 및 야생형 (WT) 생쥐에서 세타 기간 동안 정규화된 파워 스펙트럼 및 정규화된 파워 스펙트럼 밀도의 평균 및 표준 편차를 도해하는 플롯이다.
도면 4A 및 4B는 일부 구체예에 따라서, WT 생쥐 및 5XFAD 생쥐에 대한 SWRs를 도해하는 분광상이다.
도면 5A-5C는 일부 구체예에 따라서, SWRs 동안 순간 감마 주파수의 분포를 묘사하는 플롯이다.
도면 6A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 SWRs의 피크로부터 시간의 함수로서 Z-채점된 감마 파워를 묘사하는 일련의 그래프이다. 도면 6B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 SWRs 동안 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다. 도면 6C 및 6D는 일부 구체예에 따라서, WT 및 5XFAD 생쥐에 대한 SWRs의 피크 주변에서 100ms 동안 Z-채점된 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다. 도면 6E는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 큰 SWRs 동안 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다.
일부 구체예에 따라서, 도면 7A는 감마 진동의 위상의 함수로서 스파이크의 분율을 묘사하는 플롯이고, 그리고 도면 7B는 SWRs 동안 스파이킹의 변조의 깊이를 묘사하는 플롯이다. 도면 7C 및 7D는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동의 위상의 함수로서 SWRs 동안 해마 CA1에서 스파이크의 분율을 도해하는 플롯이다. 일부 구체예에 따라서, 도면 7E는 감마 진동의 위상의 함수로서 스파이크의 분율을 묘사하는 플롯이고, 그리고 도면 7F는 큰 SWRs 동안 스파이킹의 변조의 깊이를 묘사하는 플롯이다.
도면 8A 및 8B는 일부 구체예에 따라서, 각 동물 및 합동된 모든 동물에 대해 5XFAD 및 WT 동물에서 비-세타 기간 마다 SWR 비율을 묘사하는 플롯이다.
도면 9는 일부 구체예에 따라서, 개체의 뇌에서 특정한 세포 유형의 활성화를 조절하기 위한 바이러스 벡터를 도해하는 계통도이다.
도면 10A 및 10B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에 신호의 전달을 도해하는 계통도이다.
도면 11은 일부 구체예에 따라서, ChR2 및 DAPI로 개체에서 신경 조직의 면역염색을 도해하는 면역형광 이미지이다.
도면 12A는 일부 구체예에 따라서, PV+ 개재뉴런에서 발현된 ChR2-EYFP를 도해하는 면역형광 이미지이다. 도면 12B는 일부 구체예에 따라서, 항-EYFP 및 항-PV 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 13A 및 13B는 일부 구체예에 따라서, 연구의 계통도, 지역장 전위의 전기 트레이스, 그리고 FS-PV-개재뉴런의 파워 스펙트럼 밀도를 포함한다.
도면 14A 및 14B는 일부 구체예에 따라서, 미가공 전기 트레이스, 광유전학적 자극 후 스파이크에 대해 필터링된 트레이스, 그리고 1ms 레이저 펄스의 개시 후 스파이크 확률의 플롯을 포함한다.
도면 15A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극 및 무작위 자극 기간 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 15B는 일부 구체예에 따라서, 각 동물에 대한 40-Hz 자극, 무작위 자극 및 자극 기간 없음 마다 멀티유닛 점화율을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 16A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극에서 주파수-특이적 증가 동안 개체의 해마로부터 기록된 전기 트레이스이다. 도면 16B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극에서 지역장 전위 파워에서 주파수-특이적 증가를 도해하는 파워 스펙트럼 밀도의 플롯이다.
도면 17A 및 17B는 일부 구체예에 따라서, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의한 5XFAD/PV-Cre CA1의 상대적 Aβ1-40 및 Aβ1-42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 18A 및 18B는 일부 구체예에 따라서, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의한 5XFAD/αCamKII-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 19A는 일부 구체예에 따라서, 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 및 항-EEA1 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 이미지이다. 도면 19B는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 묘사하는 일련의 막대 그래프이다.
도면 20A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 20B는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 21A는 일부 구체예에 따라서, CA1에서 APP (CT695), APP NTF (A8967), APP CTFs (CT695) 및 β-액틴 (A5316) (부하 대조)의 수준을 묘사하는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도면 21B는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 무작위 조건과 대비하여 40-Hz에서 APP CTFs의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 21C는 일부 구체예에 따라서, CA1에서 전장 APP 2106 (CT695), APP CTFs 2108(CT695) 및 β-액틴 2112 (A5316, 부하 대조)의 수준을 묘사하는 일련의 웨스턴 블롯이다.
도면 22A는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 무작위 조건과 대비하여 40-Hz에서 APP NTFs의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 22B는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 무작위 및 40-Hz 조건에서 전장 APP의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 23은 일부 구체예에 따라서, 항-Rab5 (ADI-KAp -GP006-E)를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
일부 구체예에 따라서, 도면 24A는 EYFP에 정규화된 EEA1의 상대적 면역반응성을 나타내는 막대 그래프이고, 그리고 도면 24B는 EYFP, 40 Hz 및 무작위 자극 조건 하에 5XFAD/PV-Cre로부터 CA1의 상대적 Rab5 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 25A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 25B는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42에서 감소를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 25C는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극 이후에, CTFs (가령, β-CTF)의 수준에서 감소 및 전장 APP (액틴에 정규화된)의 수준에서 증가를 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 26A-26B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, 엔도솜 수준 (EEA1 수준에 근거된)을 도해하는 면역형광 이미지이다.
도면 27은 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, 도면 6A-6B에서 면역형광 이미지에 대한 평균 강도 값 (FAD에 정규화된)을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 28은 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극이 있는 경우와 없는 경우의 생쥐 해마 CA1 영역의 전체 전사체 리보핵산 염기서열결정 (RNA-seq)에 의해 결정된 차별적으로 발현된 유전자를 나타내는 히트맵이다.
도면 29는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 조건에서 상향- 및 하향-조절된 유전자의 FPKM 값을 도해하는 상자 플롯이다.
도면 30은 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극 이후에, 확인된 상향조절된 유전자의 세포 유형 특이적 발현 패턴을 도해하는 파이 도표이다.
도면 31은 일부 구체예에 따라서, RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 32A 및 32B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 쇼 동안 뇌 위에서 기록된 지역장 전위의 파워 스펙트럼 밀도를 도해하는 플롯이다.
도면 33은 일부 구체예에 따라서, RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 34는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre 생쥐의 해마 CA1 영역에서 항-Iba1 (019-19741) 및 항-Aβ (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 35A는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 조건에서 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35B는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 EYFP에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35C는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 EYFP에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35D는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 또한 Aβ-양성인 Iba1-양성 (소교세포) 세포체의 퍼센트를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 36은 일부 구체예에 따라서, 도면 34로부터 면역형광 이미지를 합병함으로써 형성된 일련의 3D 렌더링이다.
도면 37A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 Hoechst를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 37B는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre의 추정된 CA1 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 38A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz FS-PV+ 자극 또는 대조 자극 시에 해마 CA1의 유전체-너비 RNA-seq에 의해 결정된 차별적으로 발현된 유전자 (DEGs)를 전시하는 히트맵이다. 도면 38B는 일부 구체예에 따라서, 도면 38A에서 처리 조건에서 상향조절된 DEGs 사이에 중복을 도해하는 차트이다.
도면 39는 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 40은 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 상향조절된 유전자가 관련되는 생물학적 과정을 도해하는 플롯이다.
도면 41은 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 하향조절된 유전자가 관련되는 생물학적 과정을 도해하는 플롯이다.
도면 42A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, Iba1의 수준을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 42B는 일부 구체예에 따라서, 도면 42A에서 면역형광 이미지에 대한 평균 강도 값을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 43A는 일부 구체예에 따라서, 광 플리커 자극에 노출된 생쥐를 도해하는 계통도이다. 도면 43B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 이전 및 동안 시각 피질에서 지역장 전위 트레이스, 그리고 파워 스펙트럼 밀도의 플롯을 포함한다. 도면 43C-43F는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질에서 지역장 전위의 파워 스펙트럼 밀도를 묘사하는 플롯이다.
도면 44A는 일부 구체예에 따라서, 4 주기의 40-Hz 광 플리커 및 동등한 기간의 무작위 광 플리커에 대한 시간의 함수로서 시각 피질에서 스파이크의 분율을 묘사하는 일련의 히스토그램이다. 도면 44B는 일부 구체예에 따라서, 광 플리커 동안 뇌 위에서 기록된 지역장 전위의 일련의 전기 트레이스이다.
도면 45A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 및 무작위 광 플리커 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 45B는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질에서 멀티유닛 점화율을 도해하는 플롯이다.
도면 46A는 일부 구체예에 따라서, 실험적 패러다임을 도해하는 계통도이다. 도면 46B-46C는 일부 구체예에 따라서, 도면 46A에서 실험적 패러다임에 따라서, Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 각각의 기준선 수준에서 변화를 더욱 도해하는 플롯이다.
도면 47A 및 47B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 각각의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 48A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 5XFAD 배럴 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 48B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 APP/PS1 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 48C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 WT 시각 피질에서 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 49는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 5XFAD 시각 피질에서 항-Iba1 (019-19741) 및 항-Aβ (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 50A는 일부 구체예에 따라서, Iba1-양성 세포 (소교세포)의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 50B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 대조에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 50C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 대조에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 50D는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 또한 Aβ-양성인 소교세포의 백분율을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 51은 일부 구체예에 따라서, CLARITY-처리된 100 μm 조직 섹션으로부터 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 Iba+ 소교세포의 일련의 3D 렌더링 (면역형광 이미지로부터)이다. CLARITY는 예로서, 조직 내부로부터 만들어지고, 그리고 조직에 연결된 아크릴아미드-기초된 하이드로겔을 이용하여 뇌 조직을 투명하게 만드는 방법이다.
도면 52A는 일부 구체예에 따라서, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 시각 피질로부터 소교세포를 단리하는 방법을 도해하는 흐름 도표이다. 도면 52B는 일부 구체예에 따라서, 도면 52A의 방법을 이용하여 3-개월령 5XFAD 및 WT 대조 동물의 시각 피질로부터 단리된 소교세포에서 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 53A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 3-개월령 5XFAD 시각 피질에서 시냅토피신을 검출하기 위한 SVP38 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 53B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 광 플리커 조건 후 5XFAD 시각 피질의 상대적 SVP38 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 54A는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 시각 피질의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42에서 감소를 도해하는 막대 그래프이다. 도면 54B는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 시각 피질의 자극 후 및 상기 자극 후 24 시간에 다시 한 번, Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42의 수준을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 55A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 이전 및 동안 해마에서 지역장 전위의 전기 트레이스, 그리고 파워 스펙트럼 밀도의 플롯을 포함한다. 도면 55B는 일부 구체예에 따라서, 4 주기의 40-Hz 광 플리커 및 동등한 기간의 무작위 광 플리커 각각에 대한 시간의 함수로서 해마에서 스파이크의 분율의 일련의 히스토그램이다.
도면 56A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 및 무작위 광 플리커 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 56B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 동안 CA1에서 멀티유닛 점화율을 도해하는 플롯이다.
도면 57A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 57B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1-42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 58A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 후 회복을 갖는 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 58B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 후 회복을 갖는 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 59A는 일부 구체예에 따라서, 연구를 도해하는 계통도이다. 도면 59B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 59C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 60A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 항-Aβ 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 60B는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 Aβ-양성 플라크 침착물의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 60C는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 Aβ-양성 플라크의 구역을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 61A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-포스포Tau (S202) 및 항-MAP2 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 61B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 포스포Tau (pTau) (S202) 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 61C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 MAP2 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 62A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6202(S404) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 62B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S400/T403/S404) 형광 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 63A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6302 (S396) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 63B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S396) 형광 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 64는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-Iba1 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 65A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 65B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 대조에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 65C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 대조에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 66은 일부 구체예에 따라서, 시각 감마 자극이 있는 경우와 없는 경우에 개체의 시각 피질에서 가용성 및 불용성 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 수준을 도해하는 플롯이다.
도면 67A-67B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 머리뼈경유 감마 자극이 있는 경우와 없는 경우의 전뇌 Aβ 펩티드 수준을 도해하는 플롯이다.
도면 68A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에게 스트레스를 유발하는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 68B는 개체에서 스트레스 반응을 지시하는 코르티코스테론의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 69A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 불안을 감소시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 69B는 상승된 플러스 미로 기구를 도해하는 이미지이다. 도면 69C 및 69D는 상승된 플러스 미로 세션 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다.
도면 70은 개체가 상승된 플러스 미로 세션 동안 열린 팔 및 닫힌 팔에서 탐색하는데 소모한 평균 시간을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 71A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 스트레스 및/또는 불안을 감소시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 71B는 오픈 필드 아레나를 도해하는 이미지이다. 도면 71C 및 71D는 오픈 필드 시험 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다.
도면 72A는 개체가 오픈 필드 시험의 각 분 동안 오픈 필드의 중심에서 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 72B는 개체가 오픈 필드 시험 동안 오픈 필드의 주변에서 소모한 평균 전체 시간을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 73A 및 73B는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 선천적 신기성 탐색 행동을 변화시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 계통도이다. 도면 73C는 개체가 도면 73A의 계통도에 따른 두 번째 신기한 물체와 비교하여 첫 번째 신기한 물체를 탐색하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 74는 개체가 도면 73B의 계통도에 따라 신기한 물체를 탐색하는데 소모한 각 분 동안 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 75A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 학습 및 기억에 충격을 주는 지를 조사하기 위해, 두려움 조건화 패러다임을 이용하여 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 75B는 시간의 함수로서 변경된 콘텍스트를 갖는 색조 (tone) 시험을 도해하는 자극 다이어그램이다.
도면 76A 및 76B는 일부 구체예에 따라서, 개체에서 증강된 기억을 증명하는 막대 그래프이다.
도면 77A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 기억을 향상시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 77B는 표적 사분면에서 플랫폼이 숨겨진 Morris 수중 미로를 도해하는 다이어그램이다. 도면 77C 및 77D는 Morris 수중 미로 프로브 시험 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다.
도면 78A는 개체가 매일 Morris 수중 미로 시험 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 78B는 개체가 각 30초 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 78C는 개체가 각 30초 동안 반대 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 79A는 첫 번째 사분면에서 플랫폼이 숨겨진 Morris 수중 미로 시험을 도해하는 다이어그램이다. 도면 79B는 역전 학습을 위해, 첫 번째 사분면과 마주보는 두 번째 사분면에서 플랫폼이 숨겨진 Morris 수중 미로 시험을 도해하는 다이어그램이다. 도면 79C는 개체가 매일 Morris 수중 미로 역전 학습 검사 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 80A는 일부 구체예에 따라서, 장기 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 공간 학습 및 기억에 영향을 주는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 80B는 개체가 매일 Morris 수중 미로 시험 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 80C는 개체가 30초 시험 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 81A는 역전 학습을 포함하도록 확대된 도면 80A의 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 81B는 개체가 매일 Morris 수중 미로 역전 학습 검사 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 82A는 개체가 30초 시험 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 82B는 개체가 반대 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 83은 개체의 시각 피질에서 데옥시리보핵산 (DNA) 피해 및 뉴런 상실에 대한 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여의 효과를 조사하기 위해 수행된 연구의 시각표 다이어그램이다.
도면 84는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여의 효과를 조사하기 위해 수행된 연구에 대한 개체의 군을 도해하는 다이어그램이다.
도면 85는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 뇌 중량 변화를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 86은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 측 뇌실 확대의 배수적 변화를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 87A-87E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 측 뇌실을 도해하는 이미지이다.
도면 88A-88C는 일부 구체예에 따라서, 뇌 관심 영역을 도해하는 뇌 해부학 다이어그램이다.
도면 89는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 V1-피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 90은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 V1-NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 91A-91E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다.
도면 92는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 SS1-피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 93은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 SS1-NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 94A-94E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다.
도면 95는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질의 피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 96은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질의 NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 97A-97E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다.
도면 98은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 시각 피질 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 99는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 시각 피질 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 100은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 시각 피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 101은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 체성 감각 피질 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 102는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 체성 감각 피질 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 103은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 체성 감각 피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 104는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 105는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 106은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 도피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 107은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 해마 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 108은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 해마 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 109는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 해마 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 110은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 시각 피질 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 111은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 체성 감각 피질 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 112는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 113A-113D는 일부 구체예에 따라서, 대표적인 표본에서 Hoechst 염색, VGluT1 마커 및/또는 GAD65 마커를 도해하는 이미지이다. 도면 113E 및 113F는 일부 구체예에 따라서, 부점 정량의 방법을 도해하는 이미지이다.
도면 114는 일부 구체예에 따라서, 클릭-훈련 자극을 도해하는 자극 다이어그램이다.
도면 115는 일부 구체예에 따른 청각 감마 노출 및/또는 투여가 개체의 청각 피질에서 소교세포 활성화를 유도하는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다.
도면 116A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 평균 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 116B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포 돌출 길이의 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 117A 및 117B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교 세포의 대표적인 이미지이다.
도면 118A 및 118B는 일부 구체예에 따라서, 도면 117A 및 117B로부터 소교세포 돌출 길이의 확대된 이미지이다.
도면 119A 및 119B는 일부 구체예에 따라서, 도면 117A 및 117B로부터 소교세포 세포체 크기의 확대된 이미지이다.
도면 120A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 영상 필드마다 소교세포의 평균 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 120B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 세포체 크기에서 평균 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 121A 및 121B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 대표적인 이미지이다.
도면 122A-122D는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질 및 해마에서 가용성 Aβ 동종형 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 123A-123D는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질 및 해마에서 불용성 Aβ 동종형 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 124A-124D는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 대표적인 이미지이다.
도면 125A는 신기한 물체 인식 시험을 도해하는 흐름 도표이다. 도면 125B는 일부 구체예에 따라서, 기억에서 향상을 증명하는 막대 그래프이다.
도면 126A는 신기한 물체 위치 시험을 도해하는 흐름 도표이다. 도면 126B는 일부 구체예에 따라서, 기억 및/또는 식별에서 향상을 증명하는 막대 그래프이다.
도면 127A는 개체가 매일 Morris 수중 미로 시험 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 127B는 개체가 프로브 시험 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 128A는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질 내에 확대된 맥관구조를 도해하는 일련의 대표적인 면역형광 이미지이다. 도면 128B는 시각 피질 내에 혈관 직경을 묘사하고, 그리고 일부 구체예에 따른 감마 노출 이후에 혈관 직경에서 증가를 도해하는 막대 그래프이다.
당업자는 도면이 일차적으로, 예시를 목적으로 하고, 그리고 본원에서 설명된 발명 요부의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 이들 도면은 반드시 일정한 비율인 것은 아니다; 일부 경우에, 본원에서 개시된 발명 요부의 다양한 양상은 상이한 특질의 이해를 용이하게 하기 위해 도면에서 과장되거나 또는 확대되어 보일 수 있다. 도면에서, 유사 참고 문자는 일반적으로, 예로서 유사 특질 (가령, 기능적으로 유사한 및/또는 구조적으로 유사한 요소)을 참조한다.
도면 1은 일부 구체예에 따라서, 구형 트레드밀에서 가상의 선형 미로를 통해 움직이는 생쥐를 도해하는 계통도이다.
도면 2A 및 2B는 일부 구체예에 따라서, 해마 CA1로부터 기록된 전기 트레이스이고, 그리고 세타 진동 및 예파 연흔 (SWRs)을 도해한다.
도면 3A 및 3B는 일부 구체예에 따라서, 3-개월령 Tg 5XFAD 및 야생형 (WT) 생쥐에서 세타 기간 동안 정규화된 파워 스펙트럼 및 정규화된 파워 스펙트럼 밀도의 평균 및 표준 편차를 도해하는 플롯이다.
도면 4A 및 4B는 일부 구체예에 따라서, WT 생쥐 및 5XFAD 생쥐에 대한 SWRs를 도해하는 분광상이다.
도면 5A-5C는 일부 구체예에 따라서, SWRs 동안 순간 감마 주파수의 분포를 묘사하는 플롯이다.
도면 6A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 SWRs의 피크로부터 시간의 함수로서 Z-채점된 감마 파워를 묘사하는 일련의 그래프이다. 도면 6B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 SWRs 동안 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다. 도면 6C 및 6D는 일부 구체예에 따라서, WT 및 5XFAD 생쥐에 대한 SWRs의 피크 주변에서 100ms 동안 Z-채점된 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다. 도면 6E는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 큰 SWRs 동안 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다.
일부 구체예에 따라서, 도면 7A는 감마 진동의 위상의 함수로서 스파이크의 분율을 묘사하는 플롯이고, 그리고 도면 7B는 SWRs 동안 스파이킹의 변조의 깊이를 묘사하는 플롯이다. 도면 7C 및 7D는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동의 위상의 함수로서 SWRs 동안 해마 CA1에서 스파이크의 분율을 도해하는 플롯이다. 일부 구체예에 따라서, 도면 7E는 감마 진동의 위상의 함수로서 스파이크의 분율을 묘사하는 플롯이고, 그리고 도면 7F는 큰 SWRs 동안 스파이킹의 변조의 깊이를 묘사하는 플롯이다.
도면 8A 및 8B는 일부 구체예에 따라서, 각 동물 및 합동된 모든 동물에 대해 5XFAD 및 WT 동물에서 비-세타 기간 마다 SWR 비율을 묘사하는 플롯이다.
도면 9는 일부 구체예에 따라서, 개체의 뇌에서 특정한 세포 유형의 활성화를 조절하기 위한 바이러스 벡터를 도해하는 계통도이다.
도면 10A 및 10B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에 신호의 전달을 도해하는 계통도이다.
도면 11은 일부 구체예에 따라서, ChR2 및 DAPI로 개체에서 신경 조직의 면역염색을 도해하는 면역형광 이미지이다.
도면 12A는 일부 구체예에 따라서, PV+ 개재뉴런에서 발현된 ChR2-EYFP를 도해하는 면역형광 이미지이다. 도면 12B는 일부 구체예에 따라서, 항-EYFP 및 항-PV 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 13A 및 13B는 일부 구체예에 따라서, 연구의 계통도, 지역장 전위의 전기 트레이스, 그리고 FS-PV-개재뉴런의 파워 스펙트럼 밀도를 포함한다.
도면 14A 및 14B는 일부 구체예에 따라서, 미가공 전기 트레이스, 광유전학적 자극 후 스파이크에 대해 필터링된 트레이스, 그리고 1ms 레이저 펄스의 개시 후 스파이크 확률의 플롯을 포함한다.
도면 15A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극 및 무작위 자극 기간 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 15B는 일부 구체예에 따라서, 각 동물에 대한 40-Hz 자극, 무작위 자극 및 자극 기간 없음 마다 멀티유닛 점화율을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 16A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극에서 주파수-특이적 증가 동안 개체의 해마로부터 기록된 전기 트레이스이다. 도면 16B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극에서 지역장 전위 파워에서 주파수-특이적 증가를 도해하는 파워 스펙트럼 밀도의 플롯이다.
도면 17A 및 17B는 일부 구체예에 따라서, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의한 5XFAD/PV-Cre CA1의 상대적 Aβ1-40 및 Aβ1-42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 18A 및 18B는 일부 구체예에 따라서, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의한 5XFAD/αCamKII-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 19A는 일부 구체예에 따라서, 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 및 항-EEA1 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 이미지이다. 도면 19B는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 묘사하는 일련의 막대 그래프이다.
도면 20A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 20B는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 21A는 일부 구체예에 따라서, CA1에서 APP (CT695), APP NTF (A8967), APP CTFs (CT695) 및 β-액틴 (A5316) (부하 대조)의 수준을 묘사하는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도면 21B는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 무작위 조건과 대비하여 40-Hz에서 APP CTFs의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 21C는 일부 구체예에 따라서, CA1에서 전장 APP 2106 (CT695), APP CTFs 2108(CT695) 및 β-액틴 2112 (A5316, 부하 대조)의 수준을 묘사하는 일련의 웨스턴 블롯이다.
도면 22A는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 무작위 조건과 대비하여 40-Hz에서 APP NTFs의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 22B는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 무작위 및 40-Hz 조건에서 전장 APP의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 23은 일부 구체예에 따라서, 항-Rab5 (ADI-KAp -GP006-E)를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
일부 구체예에 따라서, 도면 24A는 EYFP에 정규화된 EEA1의 상대적 면역반응성을 나타내는 막대 그래프이고, 그리고 도면 24B는 EYFP, 40 Hz 및 무작위 자극 조건 하에 5XFAD/PV-Cre로부터 CA1의 상대적 Rab5 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 25A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 25B는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42에서 감소를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 25C는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극 이후에, CTFs (가령, β-CTF)의 수준에서 감소 및 전장 APP (액틴에 정규화된)의 수준에서 증가를 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 26A-26B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, 엔도솜 수준 (EEA1 수준에 근거된)을 도해하는 면역형광 이미지이다.
도면 27은 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, 도면 6A-6B에서 면역형광 이미지에 대한 평균 강도 값 (FAD에 정규화된)을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 28은 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극이 있는 경우와 없는 경우의 생쥐 해마 CA1 영역의 전체 전사체 리보핵산 염기서열결정 (RNA-seq)에 의해 결정된 차별적으로 발현된 유전자를 나타내는 히트맵이다.
도면 29는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 조건에서 상향- 및 하향-조절된 유전자의 FPKM 값을 도해하는 상자 플롯이다.
도면 30은 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극 이후에, 확인된 상향조절된 유전자의 세포 유형 특이적 발현 패턴을 도해하는 파이 도표이다.
도면 31은 일부 구체예에 따라서, RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 32A 및 32B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 쇼 동안 뇌 위에서 기록된 지역장 전위의 파워 스펙트럼 밀도를 도해하는 플롯이다.
도면 33은 일부 구체예에 따라서, RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 34는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre 생쥐의 해마 CA1 영역에서 항-Iba1 (019-19741) 및 항-Aβ (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 35A는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 조건에서 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35B는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 EYFP에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35C는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 EYFP에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35D는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 또한 Aβ-양성인 Iba1-양성 (소교세포) 세포체의 퍼센트를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 36은 일부 구체예에 따라서, 도면 34로부터 면역형광 이미지를 합병함으로써 형성된 일련의 3D 렌더링이다.
도면 37A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 Hoechst를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 37B는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre의 추정된 CA1 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 38A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz FS-PV+ 자극 또는 대조 자극 시에 해마 CA1의 유전체-너비 RNA-seq에 의해 결정된 차별적으로 발현된 유전자 (DEGs)를 전시하는 히트맵이다. 도면 38B는 일부 구체예에 따라서, 도면 38A에서 처리 조건에서 상향조절된 DEGs 사이에 중복을 도해하는 차트이다.
도면 39는 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 40은 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 상향조절된 유전자가 관련되는 생물학적 과정을 도해하는 플롯이다.
도면 41은 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 하향조절된 유전자가 관련되는 생물학적 과정을 도해하는 플롯이다.
도면 42A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, Iba1의 수준을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 42B는 일부 구체예에 따라서, 도면 42A에서 면역형광 이미지에 대한 평균 강도 값을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 43A는 일부 구체예에 따라서, 광 플리커 자극에 노출된 생쥐를 도해하는 계통도이다. 도면 43B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 이전 및 동안 시각 피질에서 지역장 전위 트레이스, 그리고 파워 스펙트럼 밀도의 플롯을 포함한다. 도면 43C-43F는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질에서 지역장 전위의 파워 스펙트럼 밀도를 묘사하는 플롯이다.
도면 44A는 일부 구체예에 따라서, 4 주기의 40-Hz 광 플리커 및 동등한 기간의 무작위 광 플리커에 대한 시간의 함수로서 시각 피질에서 스파이크의 분율을 묘사하는 일련의 히스토그램이다. 도면 44B는 일부 구체예에 따라서, 광 플리커 동안 뇌 위에서 기록된 지역장 전위의 일련의 전기 트레이스이다.
도면 45A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 및 무작위 광 플리커 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 45B는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질에서 멀티유닛 점화율을 도해하는 플롯이다.
도면 46A는 일부 구체예에 따라서, 실험적 패러다임을 도해하는 계통도이다. 도면 46B-46C는 일부 구체예에 따라서, 도면 46A에서 실험적 패러다임에 따라서, Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 각각의 기준선 수준에서 변화를 더욱 도해하는 플롯이다.
도면 47A 및 47B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 각각의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 48A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 5XFAD 배럴 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 48B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 APP/PS1 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 48C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 WT 시각 피질에서 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 49는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 5XFAD 시각 피질에서 항-Iba1 (019-19741) 및 항-Aβ (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 50A는 일부 구체예에 따라서, Iba1-양성 세포 (소교세포)의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 50B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 대조에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 50C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 대조에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 50D는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 또한 Aβ-양성인 소교세포의 백분율을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 51은 일부 구체예에 따라서, CLARITY-처리된 100 μm 조직 섹션으로부터 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 Iba+ 소교세포의 일련의 3D 렌더링 (면역형광 이미지로부터)이다. CLARITY는 예로서, 조직 내부로부터 만들어지고, 그리고 조직에 연결된 아크릴아미드-기초된 하이드로겔을 이용하여 뇌 조직을 투명하게 만드는 방법이다.
도면 52A는 일부 구체예에 따라서, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 시각 피질로부터 소교세포를 단리하는 방법을 도해하는 흐름 도표이다. 도면 52B는 일부 구체예에 따라서, 도면 52A의 방법을 이용하여 3-개월령 5XFAD 및 WT 대조 동물의 시각 피질로부터 단리된 소교세포에서 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 53A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 3-개월령 5XFAD 시각 피질에서 시냅토피신을 검출하기 위한 SVP38 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 53B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 광 플리커 조건 후 5XFAD 시각 피질의 상대적 SVP38 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 54A는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 시각 피질의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42에서 감소를 도해하는 막대 그래프이다. 도면 54B는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 시각 피질의 자극 후 및 상기 자극 후 24 시간에 다시 한 번, Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42의 수준을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 55A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 이전 및 동안 해마에서 지역장 전위의 전기 트레이스, 그리고 파워 스펙트럼 밀도의 플롯을 포함한다. 도면 55B는 일부 구체예에 따라서, 4 주기의 40-Hz 광 플리커 및 동등한 기간의 무작위 광 플리커 각각에 대한 시간의 함수로서 해마에서 스파이크의 분율의 일련의 히스토그램이다.
도면 56A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 및 무작위 광 플리커 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 56B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 동안 CA1에서 멀티유닛 점화율을 도해하는 플롯이다.
도면 57A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 57B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1-42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 58A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 후 회복을 갖는 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 58B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 후 회복을 갖는 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 59A는 일부 구체예에 따라서, 연구를 도해하는 계통도이다. 도면 59B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 59C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 도해하는 막대 그래프이다.
도면 60A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 항-Aβ 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 60B는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 Aβ-양성 플라크 침착물의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 60C는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 Aβ-양성 플라크의 구역을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 61A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-포스포Tau (S202) 및 항-MAP2 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 61B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 포스포Tau (pTau) (S202) 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 61C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 MAP2 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 62A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6202(S404) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 62B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S400/T403/S404) 형광 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 63A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6302 (S396) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 63B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S396) 형광 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 64는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-Iba1 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다.
도면 65A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 65B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 대조에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 65C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 대조에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 66은 일부 구체예에 따라서, 시각 감마 자극이 있는 경우와 없는 경우에 개체의 시각 피질에서 가용성 및 불용성 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 수준을 도해하는 플롯이다.
도면 67A-67B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 머리뼈경유 감마 자극이 있는 경우와 없는 경우의 전뇌 Aβ 펩티드 수준을 도해하는 플롯이다.
도면 68A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에게 스트레스를 유발하는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 68B는 개체에서 스트레스 반응을 지시하는 코르티코스테론의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 69A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 불안을 감소시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 69B는 상승된 플러스 미로 기구를 도해하는 이미지이다. 도면 69C 및 69D는 상승된 플러스 미로 세션 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다.
도면 70은 개체가 상승된 플러스 미로 세션 동안 열린 팔 및 닫힌 팔에서 탐색하는데 소모한 평균 시간을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 71A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 스트레스 및/또는 불안을 감소시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 71B는 오픈 필드 아레나를 도해하는 이미지이다. 도면 71C 및 71D는 오픈 필드 시험 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다.
도면 72A는 개체가 오픈 필드 시험의 각 분 동안 오픈 필드의 중심에서 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 72B는 개체가 오픈 필드 시험 동안 오픈 필드의 주변에서 소모한 평균 전체 시간을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 73A 및 73B는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 선천적 신기성 탐색 행동을 변화시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 계통도이다. 도면 73C는 개체가 도면 73A의 계통도에 따른 두 번째 신기한 물체와 비교하여 첫 번째 신기한 물체를 탐색하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 74는 개체가 도면 73B의 계통도에 따라 신기한 물체를 탐색하는데 소모한 각 분 동안 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 75A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 학습 및 기억에 충격을 주는 지를 조사하기 위해, 두려움 조건화 패러다임을 이용하여 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 75B는 시간의 함수로서 변경된 콘텍스트를 갖는 색조 (tone) 시험을 도해하는 자극 다이어그램이다.
도면 76A 및 76B는 일부 구체예에 따라서, 개체에서 증강된 기억을 증명하는 막대 그래프이다.
도면 77A는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 기억을 향상시키는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 77B는 표적 사분면에서 플랫폼이 숨겨진 Morris 수중 미로를 도해하는 다이어그램이다. 도면 77C 및 77D는 Morris 수중 미로 프로브 시험 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다.
도면 78A는 개체가 매일 Morris 수중 미로 시험 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 78B는 개체가 각 30초 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 78C는 개체가 각 30초 동안 반대 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 79A는 첫 번째 사분면에서 플랫폼이 숨겨진 Morris 수중 미로 시험을 도해하는 다이어그램이다. 도면 79B는 역전 학습을 위해, 첫 번째 사분면과 마주보는 두 번째 사분면에서 플랫폼이 숨겨진 Morris 수중 미로 시험을 도해하는 다이어그램이다. 도면 79C는 개체가 매일 Morris 수중 미로 역전 학습 검사 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 80A는 일부 구체예에 따라서, 장기 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 공간 학습 및 기억에 영향을 주는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 80B는 개체가 매일 Morris 수중 미로 시험 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 80C는 개체가 30초 시험 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 81A는 역전 학습을 포함하도록 확대된 도면 80A의 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 81B는 개체가 매일 Morris 수중 미로 역전 학습 검사 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다.
도면 82A는 개체가 30초 시험 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 82B는 개체가 반대 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 83은 개체의 시각 피질에서 데옥시리보핵산 (DNA) 피해 및 뉴런 상실에 대한 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여의 효과를 조사하기 위해 수행된 연구의 시각표 다이어그램이다.
도면 84는 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여의 효과를 조사하기 위해 수행된 연구에 대한 개체의 군을 도해하는 다이어그램이다.
도면 85는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 뇌 중량 변화를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 86은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 측 뇌실 확대의 배수적 변화를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 87A-87E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 측 뇌실을 도해하는 이미지이다.
도면 88A-88C는 일부 구체예에 따라서, 뇌 관심 영역을 도해하는 뇌 해부학 다이어그램이다.
도면 89는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 V1-피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 90은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 V1-NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 91A-91E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다.
도면 92는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 SS1-피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 93은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 SS1-NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 94A-94E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다.
도면 95는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질의 피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 96은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질의 NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 97A-97E는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다.
도면 98은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 시각 피질 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 99는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 시각 피질 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 100은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 시각 피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 101은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 체성 감각 피질 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 102는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 체성 감각 피질 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 103은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 체성 감각 피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 104는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 105는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 106은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 도피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 107은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 해마 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 108은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 해마 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다.
도면 109는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 나타내는 해마 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
도면 110은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 시각 피질 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 111은 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 체성 감각 피질 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 112는 일부 구체예에 따라서, 도면 84에서 개체의 군을 교차하여 도피질 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 113A-113D는 일부 구체예에 따라서, 대표적인 표본에서 Hoechst 염색, VGluT1 마커 및/또는 GAD65 마커를 도해하는 이미지이다. 도면 113E 및 113F는 일부 구체예에 따라서, 부점 정량의 방법을 도해하는 이미지이다.
도면 114는 일부 구체예에 따라서, 클릭-훈련 자극을 도해하는 자극 다이어그램이다.
도면 115는 일부 구체예에 따른 청각 감마 노출 및/또는 투여가 개체의 청각 피질에서 소교세포 활성화를 유도하는 지를 조사하기 위해 수행된 연구를 도해하는 흐름 도표이다.
도면 116A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 평균 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 116B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포 돌출 길이의 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 117A 및 117B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교 세포의 대표적인 이미지이다.
도면 118A 및 118B는 일부 구체예에 따라서, 도면 117A 및 117B로부터 소교세포 돌출 길이의 확대된 이미지이다.
도면 119A 및 119B는 일부 구체예에 따라서, 도면 117A 및 117B로부터 소교세포 세포체 크기의 확대된 이미지이다.
도면 120A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 영상 필드마다 소교세포의 평균 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 120B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 세포체 크기에서 평균 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 121A 및 121B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 대표적인 이미지이다.
도면 122A-122D는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질 및 해마에서 가용성 Aβ 동종형 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 123A-123D는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질 및 해마에서 불용성 Aβ 동종형 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 124A-124D는 일부 구체예에 따라서, 개체의 청각 피질에서 소교세포의 대표적인 이미지이다.
도면 125A는 신기한 물체 인식 시험을 도해하는 흐름 도표이다. 도면 125B는 일부 구체예에 따라서, 기억에서 향상을 증명하는 막대 그래프이다.
도면 126A는 신기한 물체 위치 시험을 도해하는 흐름 도표이다. 도면 126B는 일부 구체예에 따라서, 기억 및/또는 식별에서 향상을 증명하는 막대 그래프이다.
도면 127A는 개체가 매일 Morris 수중 미로 시험 동안 숨겨진 플랫폼을 발견하는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 도면 127B는 개체가 프로브 시험 동안 표적 사분면에서 제거된 플랫폼을 찾는데 소모한 시간의 평균량을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 128A는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질 내에 확대된 맥관구조를 도해하는 일련의 대표적인 면역형광 이미지이다. 도면 128B는 시각 피질 내에 혈관 직경을 묘사하고, 그리고 일부 구체예에 따른 감마 노출 이후에 혈관 직경에서 증가를 도해하는 막대 그래프이다.
상세한 설명
한 양상에서, 본 발명은 개체에서 뇌 장애 또는 인지 기능장애/결손을 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 방법, 장치 및 시스템을 제공한다. 일부 구체예에서, 뇌 장애는 치매이다.
인지 기능은 신경망 활성, 구체적으로 집중 및 작업 기억에 연결된 리듬인 감마 주파수 (가령, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz)에서 진동의 정밀한 시기선택에 결정적으로 의존한다. 이들 진동이 시냅스 활성으로부터 나타나기 때문에, 이들은 뉴런의 분자 성질 및 더욱 높은 수준, 일관된 뇌 활성 사이에 직접적인 연결을 제공한다. 중요하게는, 감마 진동 활성은 AD에서 분자 신경병리에 의해 약화된 신경 회로에서 교란되고, 그리고 상기 질환에서 기억 장애의 핵심 결정인자를 나타낼 수 있다. 병리 및 뇌 진동의 장애 사이에 인과관계가 있는 지는 아직 결정되지 않았다. 하지만, 뇌 리듬을 주동하는 것은 치매, 예를 들면, AD의 치료를 위한 멀티-표적 요법으로서 역할을 할 수 있고, 그리고 비침습성 요법을 통해 달성될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 감마 진동을 증강하거나 또는 유도하기 위한 장치, 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 구체예에서, 감마 진동의 증강 또는 유도는 광유전학적 방법에 의한다. 다른 구체예에서, 감마 진동의 증강 또는 유도는 행동 방법에 의한다. 본 발명은 광유전학적 방법, 행동 방법, 또는 다른 방법에 의한 감마 진동의 증강 및/또는 유도가 AD 병리를 감소시킨다는 것을 제시한다.
한 양상에서, 본 발명은 치매를 앓는 개체에서 감마 진동 리듬의 수복 또는 유도를 위한 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 치매는 AD, 혈관 치매, 전두 측두 치매 (FTD) 및/또는 루이체 치매이다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 치매를 치료하기 위한 장치, 시스템 및 방법을 제공한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 일부 구체예에서, 치료가 필요한 개체는 질환 또는 장애를 이미 앓고 있는 개체뿐만 아니라 질환 또는 장애가 발달할 수 있고 상기 질환 또는 장애를 예방하거나, 지연시키거나, 또는 축소해야 하는 대상이 되는 개체를 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 장치, 방법 및 시스템은 개체가 유전적으로 소인이 있는 질환 또는 장애, 예를 들면, AD를 예방하거나, 지연시키거나, 또는 축소하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 장치, 방법 및 시스템은 개체가 이미 진단된 질환 또는 장애, 예를 들면, AD를 치료하고, 이를 경감하고, 이의 증상을 감소시키고 및/또는 이의 진행을 지연시키는데 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "개체"는 포유동물, 예를 들면, 설치류, 고양이, 개, 또는 영장류를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 개체는 인간이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 "약"이 수식하는 대상의 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트를 지칭한다.
치매는 지적 능력의 상실 및/또는 기억 장애에 의해 특징되는 장애이다. 치매는 예로서, AD, 혈관 치매, 루이체 치매, 픽병, 전두 측두 치매 (FTD), AIDS 치매, 연령-관련된 인지 장애 및 연령-관련된 기억 장애를 포함한다. 치매는 신경학적 및/또는 정신의학적 상태, 예를 들면, 예로서, 뇌 종양, 뇌 병변, 간질, 다발성 경화증, 다운 증후군, 레트 증후군, 진행성 핵상 마비, 전두엽 증후군, 정신분열병 및 외상성 뇌 손상과 또한 연관될 수 있다.
AD는 선진국에서 가장 빈번한 신경변성 질환이다. AD는 Aβ 펩티드 및 타우 단백질로 만들어진 NFTs로 구성되는 아밀로이드판의 축적에 의해 조직병리학적으로 특징된다. 임상적으로, AD는 기억, 기능, 언어 능력, 판단 및 실행 기능의 상실에 의해 특징되는 진행성 인지 장애와 연관된다. AD는 종종, 이의 진행된 병기에서 심각한 행동 증상을 야기한다.
혈관 치매는 뇌혈관 치매로서 또한 지칭될 수 있고, 그리고 뇌혈관 질환 (가령, 대뇌 반구의 경색)을 지칭하는데, 이들은 일반적으로, 향상 및 단계별 악화의 기간으로 변동하는 코스를 갖는다. 혈관 치매는 방향감각상실의 하나 또는 그 이상의 증상, 손상된 기억 및/또는 손상된 판단을 포함할 수 있다. 혈관 치매는 구별된 복수 경색, 또는 예로서, 전신성 홍반성 루푸스; 감염성 혈관염, 예를 들면, 라임병; 재발성 뇌내 출혈; 및/또는 뇌졸중에서 발견되는 것과 같은 자가면역 혈관염을 비롯한 다른 혈관 원인에 의해 유발될 수 있다.
전두 측두 치매 (FTD)는 진행성 신경변성 장애이다. FTD를 앓는 개체는 일반적으로, 언어 장애를 종종 동반하는 두드러진 행동 및 인격 변화를 전시한다.
루이체 치매는 AD의 특질; 파킨슨병의 특질의 발달; 및/또는 환각의 초기 발달과 중복되는 특질을 갖는 치매의 발달의 하나 또는 그 이상의 증상에 의해 특징된다. 루이체 치매는 일반적으로, 증상의 심각도에서 일별 변동에 의해 특징된다.
일부 양상에서, 본 발명은 개체의 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하는, 개체에서 치매를 예방하고, 경감하고 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 신경학적 질환 또는 장애 또는 연령-관련된 감퇴로 고통받는 개체에서 감마 진동의 유도는 상기 질환 또는 장애 또는 연령-관련된 감퇴의 결과로서 또는 이것과 관련하여 개체에서 교란되는 감마 진동 리듬을 복원하는 행동을 한다.
일부 구체예에서, 감마 진동의 유도는 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 산출을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 감마 진동의 유도는 개체의 뇌로부터 Aβ (가령, 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 - 42)의 소실을 증강한다. 일부 구체예에서, 감마 진동의 유도는 개체의 뇌에서 Aβ의 축적을 예방한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 치료에 앞서 개체의 뇌에서 Aβ의 수준에 비하여, 개체의 뇌에서 Aβ의 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 구체예에서, 개체의 뇌에서 Aβ의 수준은 치료에 앞서 개체의 뇌에서 Aβ의 수준에 비하여 최소한 약 50% 감소된다.
일부 구체예에서, 개체의 뇌에서 Aβ의 수준은 개체의 뇌에서 APP의 개열에서 감소를 통해 감소된다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 개체의 뇌에서 APP의 개열을 치료에 앞서 개체의 뇌에서 APP 개열의 수준에 비하여, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 구체예에서, 개체의 뇌에서 APP 개열의 수준은 치료에 앞서 개체의 뇌에서 APP 개열의 수준에 비하여 최소한 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, APP 개열의 수준은 개체의 뇌에서 C 말단 단편 β (β-CTF)의 수준에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, 뇌에서 APP 개열의 수준은 β- 및/또는 γ-세크레타아제의 저해를 통해, 예를 들면, β- 및/또는 γ-세크레타아제 활성의 저해의 수준을 증가시킴으로써 감소된다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 개체의 뇌에서 Aβ 플라크의 응집을 감소시킨다.
일부 구체예에서, 이들 방법은 개체에서 인지 능력 및/또는 기억을 향상시킨다.
다른 양상에서, 본 발명은 개체의 뇌에서 신경보호 프로필 또는 신경보호 환경을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 개체의 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 신경보호 프로필은 신경보호 소교세포 프로필과 연관된다. 추가 구체예에서, 신경보호 프로필은 M-CSF 경로의 활성에서 증가에 의해 유도되거나 또는 이것과 연관된다. 일부 구체예에서, 신경보호 환경은 항염증성 신호전달 경로와 연관된다. 가령, 일부 구체예에서, 항염증성 신호전달 경로는 항염증성 소교세포 신호전달 경로이다.
일부 구체예에서, 신경보호 프로필은 친염증성 신경아교 세포 활성에서 감소 또는 이것의 결여와 연관된다. 친염증성 신경아교 세포 활성은 소교세포에서 M1 표현형과 연관되고, 그리고 반응성 산소 종 (ROS), 신경분비 단백질 크로모그라닌 A, 분비성 보조인자 시스타틴 C, NADPH 옥시다아제, 산화질소 신타아제 효소, 예를 들면, iNOS, NF-κB-의존성 염증 반응 단백질, 그리고 친염증성 사이토킨 및 케모킨 (가령, TNF, IL-1β, IL-6 및 IFNγ)의 생산을 포함한다.
대조적으로, 소교세포의 M2 표현형은 염증의 하향조절 및 염증-유도된 피해의 수복과 연관된다. 항염증성 사이토킨 및 케모킨 (IL-4, IL-13, IL-10 및/또는 TGFβ)뿐만 아니라 식균 활성에서 증가는 M2 표현형과 연관된다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 소교세포에서 신경보호 M2 표현형을 이끌어낸다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 개체의 뇌에서 식균 활성을 증가시킨다. 가령, 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 Aβ의 소실이 증가되도록, 소교세포의 식균 활성을 증가시킨다.
감마 진동은 약 20 Hz 내지 약 100 Hz를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 개체에서 치매를 예방하거나, 경감하거나, 또는 치료하기 위한 방법을 제공하는데, 이들 방법은 개체의 뇌에서 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 또는 약 30 내지 약 60 Hz, 또는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 감마 진동을 유도하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 감마 진동은 약 40 Hz이다.
자극은 최소한 하나의 뇌 영역에서 감마 진동을 직접적으로 또는 궁극적으로 유도하는, 개체의 내부 또는 외부 환경에서 임의의 검출가능한 변화를 포함할 수 있다. 가령, 자극은 전자파 방사선 수용체 (가령, 광수용기, 적외선 수용체 및/또는 자외선 수용체), 기계수용기 (가령, 기계적 스트레스 및/또는 긴장), 통각수용기 (다시 말하면, 통증), 소리 수용체, 전기수용기 (가령, 전기장), 자기수용기 (가령, 자기장), 히드로수용기, 화학수용체, 온도수용기, 삼투수용기 및/또는 고유감각기 (다시 말하면, 위치 감각)를 자극하도록 설계될 수 있다. 수용체로부터 반응을 이끌어내는데 필요한 감각의 절대적 역치 또는 최소량은 자극의 유형 및 개체에 근거하여 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극은 개별 감수성에 근거하여 조정된다.
일부 구체예에서, 감마 진동은 뇌 영역 특이적 방식으로 유도된다. 가령, 일부 구체예에서, 감마 진동은 해마, 시각 피질, 배럴 피질, 청각 피질, 또는 이들의 임의의 조합에서 유도된다. 실례로서, 일부 구체예에서, 감마 진동은 섬광등을 이용하여 시각 피질에서 유도되고; 그리고 다른 구체예에서, 감마 진동은 특정 주파수에서 청각 자극을 이용하여 청각 피질에서 유도된다. 일부 구체예에서, 감마 진동은 시각, 청각 및/또는 다른 자극의 조합을 동시에 이용하여 복수 뇌 영역에서 유도된다. 일부 구체예에서, 감마 진동은 가상 현실 시스템에서 유도된다.
일부 구체예에서, 개체는 감마 진동을 유도하도록 설정된 환경, 예를 들면, 관련 없는 자극을 수동적으로 또는 능동적으로 차단하는 챔버 (가령, 광 차단 또는 잡음 상쇄)를 통해 자극을 제공받는다. 대안으로 또는 이에 더하여, 개체는 예로서, 광 차단 또는 잡음 상쇄 양상을 포함하는 시스템을 통해 자극을 제공받을 수 있다. 일부 구체예에서, 개체는 자극을 전달하도록 설계된 자극-방출 장치, 예를 들면, 안경류를 통해 시각 자극을 제공받는다. 상기 장치는 다른 광을 차단할 수 있다. 일부 구체예에서, 개체는 자극을 전달하도록 설계된 자극-방출 장치, 예를 들면, 헤드폰을 통해 청각 자극을 제공받는다. 상기 장치는 다른 잡음을 상쇄할 수 있다.
자극을 방출하기 위한 최소한 하나의 인터페이스에 더하여, 일부 구체예는 최소한 하나의 프로세서 (가령, 자극을 산출하고, 자극의 방출을 제어하고, 자극/결과의 방출을 모니터링하고 및/또는 자극/결과에 관한 피드백을 처리하기 위한), 최소한 하나의 메모리 (가령, 프로세서-이행가능 명령, 최소한 하나의 자극, 자극 산출 정책, 피드백 및/또는 결과를 보관하기 위해), 최소한 하나의 통신 인터페이스 (가령, 개체, 건강 관리 제공자, 관리인, 임상 연구 조사관, 데이터베이스, 모니터링 애플리케이션 등과 통신하기 위해) 및/또는 검출 장치 (가령, 감마 진동이 유도되는 지의 여부, 개체 감수성, 인지 기능, 물리적 또는 화학적 변화, 스트레스, 안전성 등을 비롯하여, 자극 및/또는 개체를 검출하고 이들에 관한 피드백을 제공하기 위해)를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 감마 진동은 시각 자극, 예를 들면, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz에서 섬광등에 의해 유도된다. 특정한 구체예에서, 감마 진동은 약 20 Hz 내지 약 50 Hz에서 섬광등에 의해 유도된다. 추가 구체예에서, 감마 진동은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz에서 섬광등에 의해 유도된다. 또 다른 추가 구체예에서, 감마 진동은 약 40 Hz에서 섬광등에 의해 유도된다. 일부 구체예에서, 개체는 약 20 Hz 내지 약 100 Hz 섬광등, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz 섬광등 또는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz 섬광등, 또는 약 40 Hz 섬광등을 제공받는다 (가령, 상기 섬광등을 방출하는 광 차단 장치가 있는 챔버에서 배치되거나 또는 이것을 착용한다).
일부 구체예에서, 감마 진동은 청각 자극, 예를 들면, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 또는 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 또는 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 주파수에서 소리에 의해 유도된다. 일부 구체예에서, 개체는 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 약 20 Hz 내지 약 80 Hz, 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 약 35 Hz 내지 약 45 Hz, 또는 약 40 Hz의 청각 자극을 제공받는다 (가령, 상기 청각 자극을 방출하는 잡음 상쇄 장치가 있는 챔버에서 배치되거나 또는 이것을 착용한다)
일부 구체예에서, 개체는 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 또는 그 이상 동안 시각 및/또는 청각 자극을 제공받는다 (가령, 상기 자극을 방출하는 광 차단 장치가 있는 챔버에서 배치되거나 또는 이것을 착용한다). 일부 구체예에서, 개체는 약 6 시간 이내, 약 5 시간 이내, 약 4 시간 이내, 약 3 시간 이내, 약 2 시간 이내, 또는 약 1 시간 이내 동안 자극을 제공받는다 (가령, 상기 자극을 방출하는 광 차단 장치가 있는 챔버에서 배치되거나 또는 이것을 착용한다). 일부 구체예에서, 개체는 1 시간 보다 적은 시간 동안 자극을 제공받는다 (가령, 상기 자극을 방출하는 광 차단 장치가 있는 챔버에서 배치되거나 또는 이것을 착용한다).
일부 구체예에서, 개체는 본원에서 제공된 방법을 겪는다. 다른 구체예에서, 개체는 복합적인 별개의 경우에서 본원에서 제공된 방법으로 치료를 겪는다. 개체는 규칙적인 일정에서 또는 증상이 발생하거나 또는 더욱 악화될 때 치료될 수 있다. 일부 구체예에서, 장기 치료는 가용성 Aβ 펩티드 및/또는 불용성 Aβ 펩티드 (다시 말하면, 플라크)를 감소시키는데 효과적일 수 있다.
일부 구체예에서, 감마 진동은 세포 유형 특이적 방식으로 유도된다. 일부 구체예에서, 감마 진동은 FS-PV-개재뉴런에서 유도된다. 한 부류의 뉴런을 설명하는데 이용될 때, 용어 "빠른-스파이킹" (FS)은 스파이크 주파수 적응 또는 스파이크 높이에서 약화가 거의 없이, 긴 기간 동안 높은 비율에서 방출하는 뉴런의 능력을 지칭한다. 따라서, 이들 뉴런은 유의미한 적응 없이, 고주파 (가령, 약 100 Hz 또는 약 150 Hz와 동등하거나 또는 이보다 큰) 방출을 지속할 수 있다. FS 뉴런의 이러한 성질은 빠른 지연된 정류기 통로, 다시 말하면, 매우 빠르게 활성화되고 불활성화되는 통로의 발현에 상당히 기인한다.
한 양상에서, 자극은 비침습성일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "비침습성"은 신체의 외과적 개입 또는 조작, 예를 들면, 조성물 또는 장치의 주입 또는 이식을 필요로 하지 않는 장치, 방법 및 시스템을 지칭한다. 가령, 자극은 시각 (가령, 깜박거리는 불빛), 청각 (가령, 소리 진동) 및/또는 촉각 (힘, 진동 또는 운동으로 기계적 자극)일 수 있다.
다른 양상에서, 자극은 침습성 또는 최소한 부분적으로 침습성일 수 있다. 가령, 시각, 청각 및/또는 촉각 자극은 조성물 (가령, 광-민감성 단백질) 또는 장치 (가령, 통합된 광섬유 및 고체-상태 광원)의 주입 또는 이식과 합동될 수 있다.
실험 데이터
감마 진동은 질환에서 초기에 5XFAD 생쥐에서 해마 SWR 동안 감소된다.
감마에서 결손은 AD를 앓는 인간 환자에서 자발적 감마 동기화에서 감소를 비롯한 여러 신경학적 및 정신의학적 장애에서 복수의 뇌 영역에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 감소된 자발적 감마는 또한, 생체내에서 AD의 2가지 생쥐 모형 (인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP) Tg 생쥐 및 아포지질단백질 E4 대립형질 (APOE4) 녹인 생쥐)에서 및 다른 생쥐 모형 (Tg CRND8 생쥐)에서 시험관내 슬라이스 연구에서 발견되었다. 하지만, 감마 진동이 AD의 다른 생쥐 모형에서 변경되는 지의 여부, 이것이 질환 진행에서 초기에 발생하는 지의 여부, 그리고 감마 붕괴가 질환 진행에 영향을 주는 지의 여부는 불명확하다.
이들 문제를 다루기 위해, 5개의 가족성 AD 돌연변이를 보유하는 AD의 충분히 확립된 모형인 깨어 있고 행동하는 5XFAD 생쥐로부터 신경 활성이 기록되었다. 특히, 5XFAD 생쥐는 APP KM670/671NL (Swedish), APP I716V (Florida), APP V717I (London), PSEN1 M146L (A>C) 및 PSEN1 L286V를 포함하는 가족성 AD의 5가지 상이한 대립형질을 발현한다. 따라서, 5XFAD 생쥐는 AD 아밀로이드 병리의 모형으로서 이용되었다. 일부 구체예에서, 신경 활성은 이들 생쥐가 상승된 수준의 Aβ를 갖는 거의 3 개월의 연령에서, 하지만 주요 플라크 축적의 개시 및 학습과 기억 결손의 현성 전에 이들로부터 기록된다. 도면 1은 일부 구체예에 따라서, 구형 트레드밀에서 가상의 선형 미로를 통해 움직이는 생쥐를 도해하는 계통도이다. 사료-제한된 생쥐는 구형 트레드밀에서 가상의 선형 미로를 통해 앞뒤로 이동하는 것에 대한 보상을 제공받을 수 있다.
해마 하위영역 CA1로부터 신경 활성은 기록될 수 있다. 도면 2A 및 2B는 일부 구체예에 따라서, 해마 CA1로부터 기록된 전기 트레이스이고, 그리고 세타 진동 및 예파 연흔 (SWRs)을 도해한다. 일부 구체예에서, CA1에서 감마 진동은 상이한 활동 기간 동안, 예를 들면, 도면 2A에서 예시된 바와 같이 세타 진동 (4-12 Hz)이 관찰되는 이동 동안, 그리고 도면 2B에서 예시된 바와 같이 SWRs가 발생하는 정지 및 탐색 행동 동안 존재할 수 있다.
세타 진동 동안 파워 스펙트럼 밀도가 조사되었고, 그리고 5XFAD 생쥐 및 WT 한배 새끼 사이에 느린 감마 파워 (20 Hz 내지 50 Hz 범위)에서 명백한 차이가 발견되지 않았다. 도면 3A 및 3B는 일부 구체예에 따라서, 3-개월령 Tg 5XFAD 및 WT 생쥐에서 세타 기간 동안 정규화된 파워 스펙트럼 및 정규화된 파워 스펙트럼 밀도의 평균 및 표준 편차를 도해하는 플롯이다. 도면 3A는 3-개월령 5XFAD (n = 6마리 생쥐) 및 WT (n = 6마리 생쥐) 생쥐에서 세타 기간 동안 정규화된 파워 스펙트럼의 평균 및 표준 편차를 도해한다. 일부 구체예에서, 각 동물의 파워 스펙트럼 밀도는 이의 피크 (세타에서)에 정규화될 수 있다. 도면 3B는 3-개월령 5XFAD (n =6마리 생쥐) 및 WT (n =6마리 생쥐) 생쥐에서 세타 기간 동안 정규화된 파워 스펙트럼 밀도를 도해한다
다음 단계로서, 일부 구체예에서, 약 50-100 ms 동안 지속되는 150-250 Hz의 고주파 진동인, SWRs 동안 감마 진동이 조사되었다. SWRs는 스파이킹 활성의 패턴이 해마를 교차하여 재현되는 개체군 활동의 폭발과 연관된다. 이전 작업은 느린 감마가 SWRs 동안 상승되고 CA3 및 CA1을 교차하여 동기화된다는 것을 보여주었다. 결과적으로, 뉴런은 이들 해마 하위영역을 교차하여, SWRs 동안 함께 점화할 가능성이 더욱 높은데, 그 이유는 뉴런이 감마에 잠금된 위상을 점화할 가능성이 더욱 높기 때문이다. SWRs (리플 밴드, 약 150 Hz 내지 약 250 Hz에서 파워가 평균을 넘어 4 표준 편차를 초과한 기간으로서 규정됨)이 확인되고, 그리고 분광상이 이들 SWRs 동안 다양한 주파수를 교차하여 파워를 조사하기 위해 플롯팅되는 연구가 수행되었다. 분광상에서, SWRs에 특유한 고주파 진동을 지시하는 100 Hz를 넘는 증가된 파워뿐만 아니라 감마 파워에서 동시 증가를 지시하는 대략 50 Hz 미만의 증가된 파워가 관찰될 수 있다.
도면 4A 및 4B는 일부 구체예에 따라서, WT 생쥐 및 5XFAD 생쥐에 대한 SWRs를 도해하는 분광상이다. 도면 4A는 1마리 WT 생쥐에 대한 평균 SWR-촉발된 분광상이 오른쪽 플롯에서 확대된 80Hz 미만의 주파수에서 SWRs 404 동안, 감마 밴드 402에서 증가를 보여준다는 것을 도해한다. 도면 4B는 1마리 5XFAD 생쥐에 대한 평균 SWR-촉발된 분광상이 SWRs 동안 감마 밴드에서 증가를 보여준다는 것을 도해하는데, 하지만 이러한 증가는 도면 4A에서 예시된 바와 같이 WT 생쥐에서보다 낮다.
일부 구체예에서, 상기 연구는 이들 더욱 느린 진동의 순간 주파수 (10-50 Hz 범위, 본원에서 더욱 설명된 바와 같이)가 약 40 Hz에 중심된 단일모드 분포라는 것을 발견하였다. 도면 5A-5C는 일부 구체예에 따라서, SWRs 동안 순간 감마 주파수의 분포를 묘사하는 플롯이다. 도면 5A는 약 40 Hz에서 도면 4A 피크에서 도시된 동일한 생쥐에 대한 SWRs (n = 370 SWRs) 동안 순간 감마 주파수의 분포를 도해한다. 도면 5B는 5XFAD 및 WT 생쥐에서 SWRs 동안 순간 감마 주파수의 분포가 각 기록 세션 동안 약 40 Hz에서 분포를 보여준다는 것을 도해하고, 그리고 도면 5C는 동물 (6마리 5XFAD 동물에서 세션마다 n = 820, 800, 679, 38, 1875, 57 감마 주기, 그리고 6마리 WT 동물에서 세션마다 181, 1075, 919, 1622, 51, 1860, 1903 감마 주기)을 교차하여 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 도해한다.
일부 구체예에서, WT 생쥐에서 SWRs 동안 이들 감마 진동은 이후, 5XFAD 한배 새끼에서 것들과 비교되었고, 그리고 결손이 SWRs 동안 감마에서 발견되었다: 반면 감마 파워는 5XFAD 생쥐에서 SWRs 동안 기준선으로부터 증가하였고, SWRs 동안 감마 파워는 본원에서 더욱 설명된 바와 같이, WT 생쥐에서보다 5XFAD에서 훨씬 작았다.
도면 6A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐 각각에서 SWRs의 피크로부터 시간의 함수로서 Z-채점된 감마 파워를 묘사하는 일련의 그래프이다. 도면 6A는 평균 및 SEM을 보여주고, 그리고 기준선에 비하여, SWRs 동안 감마 파워 증가를 도해한다.
도면 6B는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD 및 WT 생쥐에서 SWRs 동안 감마 파워의 누적 분포를 묘사하는 플롯이다. SWRs 동안 감마 파워의 누적 분포는 WT 생쥐보다 5XFAD에서 훨씬 작은 증가를 보여준다 (순위 합계 검증, p < 10-5; n = 6마리 5XFAD 생쥐에서 2166 SWRs 및 6마리 WT 생쥐에서 3085 SWRs; 5XFAD 생쥐에서 z-점수 중앙 1.02 (0.39-1.87, 25번째-75번째 백분위수) 및 WT 생쥐에서 z-점수 중앙 1.18 (0.53-2.15, 25번째-75번째 백분위수)).
도면 6C 및 6D는 일부 구체예에 따라서, WT 생쥐 606 및 5XFAD 생쥐 608에 대한 SWRs의 피크 주변에서 100 ms 동안 z-채점된 감마 파워의 누적 분포, 그리고 동물 (n = 6마리 5XFAD 동물에서 세션마다 514, 358, 430, 22, 805, 37 SWRs 및 6마리 WT 동물에서 세션마다 82, 311, 370, 776, 18, 710, 818 SWRs)을 교차하여 평균 및 SEM (음영된)을 묘사하는 플롯이다.
도면 6E는 일부 구체예에 따라서, WT 생쥐 614 및 5XFAD 생쥐 616에서 큰 SWRs의 피크 주변에 100 ms 동안 z-채점된 감마 파워의 누적 분포 (평균을 넘어 6 표준 편차보다 큰 검출 역치)를 묘사하는 플롯이다. 순위 합계 검증이 본원에서 더욱 설명된 바와 같이, 정상적으로 분포되지 않은 데이터 전역에서 수행되었다. 도면 6E는 WT 생쥐 614 및 5XFAD 생쥐 616에서 훨씬 작은 증가를 보여준다 (순위 합계 검증, p < 10-5, n = 6마리 5XFAD 생쥐에서 1000 SWRs 및 6마리 WT 생쥐에서 1467 SWRs).
일부 구체예에서, 스파이킹은 양쪽 군에서 이들 감마 진동에 의해 위상 변조되었지만, 감마상에 의한 스파이킹의 변조는 WT 동물에서보다 5XFAD에서 더욱 약하였다. 상기 연구는 변조의 깊이가 WT 동물에서보다 5XFAD에서 훨씬 작을 수 있다는 것을 발견하였다.
일부 구체예에 따라서, 도면 7A는 감마 진동의 위상의 함수로서 스파이크의 분율을 묘사하는 플롯이고, 그리고 도면 7B는 3-개월령 5XFAD (n = 6 생쥐) 및 WT (n = 6 생쥐) 생쥐에서 SWRs 동안 감마상의 함수로서 SWRs 동안 스파이킹의 변조의 깊이를 묘사하는 플롯이다 (순위 합계 검증, 부트스트랩 재표본추출, p < 10-5, 이것은 다중 비교를 위해 대조할 때 유의미하다, n = 2500 5XFAD 스파이크-감마상 분포 및 3000 WT 분포, 5XFAD 생쥐에서 변조의 깊이 중앙 0.35 (0.21-0.44, 25번째-75번째 백분위수) 및 WT 생쥐에서 변조의 깊이 중앙 0.38 (0.29-0.47, 25번째-75번째 백분위수)). 오차 막대는 평균 +/- SEM을 지시한다. 플롯 704는 스파이킹의 변조의 깊이의 히스토그램을 도해한다.
도면 7C 및 7D는 일부 구체예에 따라서, 각 동물에 대한 5XFAD 및 WT 동물에서 감마 진동의 위상의 함수로서 SWRs 동안 해마 CA1에서 스파이크의 분율, 그리고 동물 (n = 6마리 5XFAD 동물에서 세션마다 SWRs 동안 2475, 1060, 3092, 25, 6521, 123 스파이크 및 6마리 WT 동물에서 세션마다 SWRs 동안 360, 4741, 1564, 2961, 88, 3058, 4270 스파이크)을 교차하여 평균 및 SEM을 도해하는 플롯이다.
일부 구체예에 따라서, 도면 7E는 감마 진동의 위상의 함수로서 스파이크의 분율을 묘사하는 플롯이고, 그리고 도면 7F는 3-개월령 5XFAD (n = 6 생쥐) 및 WT (n = 6 생쥐) 생쥐에서 큰 SWRs 동안 스파이킹의 변조의 깊이 (본원에서 더욱 설명된 바와 같이, 평균을 넘어 6 표준 편차보다 큰 검출 역치)를 묘사하는 플롯이다 (순위 합계 검증, 부트스트랩 재표본추출 1개 별표는 p < 10-10을 지시한다, n = 2500 5XFAD 스파이크-감마상 분포 및 3000 WT 분포). 오차 막대는 평균 +/- SEM을 지시한다.
상기 연구는 또한, WT와 비교하여 5XFAD 생쥐에서 비-세타 기간 동안 시간당 더욱 적은 SWRs가 있을 수 있고 (순위 합계 검증, p < 10-5, n = 6마리 5XFAD 생쥐에서 634 비-세타 기간 및 6마리 WT 생쥐에서 750 비-세타 기간, 5XFAD 생쥐에서 중앙 0.07 Hz (0-0.17, 25번째-75번째 백분위수) 및 WT 생쥐에서 중앙 0.12 Hz (0-0.24, 25번째-75번째 백분위수)), 감마 파워가 상기에 개시된 바와 같이 상승될 때 이들 기간이 더욱 감소될 수 있다는 것을 발견하였다.
도면 8A 및 8B는 일부 구체예에 따라서, 각 동물 (도면 8A) 및 합동된 모든 동물 (도면 8B)에 대한 5XFAD 생쥐 802 및 WT 생쥐 804 동물에서 비-세타 기간마다 SWR 비율을 묘사하는 플롯이다 (순위 합계 검증, p < 10-10, n = 6마리 5XFAD 동물에서 세션마다 117, 210, 151, 55, 100, 1 비-세타 기간 및 6마리 WT 동물에서 세션마다 80, 68, 115, 95, 15, 159, 218 비-세타 기간). 이들 결과는 주요 아밀로이드판 축적의 발달 및 인지 결손의 증거에 앞서 AD의 생쥐 모형에서 해마 CA1 스파이킹의 감마 진동 및 변조에서 결손을 드러낸다.
감마 주파수에서
FS
-
PV
-개재뉴런의
광유전학적
자극은 해마의
CA1 영역에서 감마 진동을 주동하였다.
AD의 이러한 생쥐 모형에서 상기 질환의 진행에서 초기에 SWRs 동안 감마 결손의 관찰은 감마 진동이 분자 및 세포 AD 병태생리학에 영향을 줄 수 있었는 지의 문제를 촉발한다. 이것을 시험하기 위해, 감마 진동이 2.5-개월령 5XFAD/PV-Cre 이중-유전자도입 생쥐의 해마 CA1 내에 FS-PV-개재뉴런에서 이중-플록스트 반전된 개방 해독틀 (DIO) ChR2-EYFP 아데노 연관된 바이러스 (AAV)를 이용한 Cre-의존성 방식으로 ChR2를 발현함으로써 광유전학적으로 주동되었다. 생쥐에서 해마 감마 진동의 유전자 유도가 AD의 생쥐 모형에서 분자 병리에 영향을 주는 지를 결정하기 위한 연구가 수행되었다. 해마 감마 진동은 깨어 있고, 행동하는 WT 및 5XFAD 생쥐에서 유전적으로 유도되었다.
EF1α 프로모터에 의해 주동된 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP)에 연계된 이중-플록스트, 반전된, 개방 해독틀 (DIO) ChR2을 갖는 아데노 연관된 바이러스 (즉, AAV5 바이러스)가 산출되었다. 도면 9는 일부 구체예에 따라서, 개체의 뇌에서 특정한 세포 유형의 활성화를 조절하기 위한 바이러스 벡터 (즉, AAV5-DIO-ChR2-EYFP)를 도해하는 계통도이다. 바이러스 발현은 세포 유형-특이적 방식으로 해마의 CA1 영역에 표적화되었다. Cre-재조합효소의 존재에서, 2개의 양립할 수 없는 loxP 변이체 중에서 하나가 뒤집어져 ChR2의 발현을 허용한다.
5XFAD 생쥐의 해마의 CA1 영역은 바이러스 감염의 정밀한 영역 표적화를 허용하는 정위 바이러스 주입 방법을 이용하여 AAV-DIO-ChR2-EYFP 또는 EYFp-단독 구조체로 감염되었다. 한 구체예에서, 주입의 시점에서, 광섬유 케이블을 내포하는 페룰 (백색 막대)이 표적화된 뇌 영역으로부터 약 0.3 mm 위에 배치되었다. 2 주 후 (이것은 생쥐가 회복하고 바이러스가 PV 세포에서 발현할 수 있는 시간을 제공하였다), CA1 개재뉴런이 광유전학적으로 조작되었다.
도면 10A 및 10B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에 신호의 전달을 도해하는 계통도이다. 도면 10A에서, 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 해마에서 광유전학 기술을 통한 감마 자극을 겪는 동안, 미로를 통해 볼을 이동시키는 것이 도시된다. 도면 10A 및 10B에서 보여 지는 바와 같이, 화살표 1000은 뇌 영역을 활성화시키기 위해 약 40 Hz에서 깜박거리는 청색광을 지시한다.
실례에서, 200-mW 493-nm DPSS 레이저가 각 단부에 섬유 통로/물리적 접촉 연결기가 있는 패치 코드에 연결되었다. 실험 동안, 약 1 mW의 광학적 자극이 약 1 시간 동안 전달되었다. 더욱 특정하게는, 청색광 (가령, 473nm)이 해마의 CA1 영역 바로 위에 배치된 광학 섬유를 통해, 세타 (가령, 약 8 Hz), 감마 (가령, 약 40 Hz)를 비롯한 다양한 주파수에서, 그리고 또한, 약 40 Hz에서 무작위로 전달되었다. 일부 구체예에서, 어떤 자극 조건도 시험되지 않았다. 일부 구체예에 따라서, 세타 조건은 주파수 대조로서 역할을 하였고, 그리고 무작위 조건은 리듬성 특이성에 대해 제어되었다.
1-시간 자극의 완결 이후에, 뇌 조직은 절개되고, 그리고 염색 및 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 분석을 위해 -80℃에서 동결되었다. 도면 11은 일부 구체예에 따라서, ChR2 및 DAPI로 개체에서 신경 조직의 면역염색을 도해하는 면역형광 이미지이다. 실례에서, 도면 11은 해마에서 DAPI (핵) 및 ChR2 염색을 보여준다.
도면 12A는 일부 구체예에 따라서, PV+ 개재뉴런에서 발현된 ChR2-EYFP를 도해하는 면역형광 이미지이다. 도면 12A는 ChR2-EYFP가 3-개월령 5XFAD/PV-Cre 생쥐의 CA1 내에 PV+ 개재뉴런에서 강하게 발현되었다는 것을 보여준다 (눈금자 = 100 μm). 도면 12B는 PV+ 세포에서만 EYFP 발현을 보여주는 AAV DIO ChR2-EYFP를 발현하는 3-개월령 5XFAD/PV-Cre CA1에서 항-EYFP 및 항-PV 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (눈금자 = 50 μm). 5XFAD 및 WT 생쥐를 비교하기 위해, ChR2는 5XFAD-음성 한배 새끼에서 FS-PV-개재뉴런에서 발현되었다. 광 자극의 비특이적 효과에 대한 대조로서, EYFP만을 내포하는 AAV-DIO를 발현하는 5XFAD/PV-Cre 이중-유전자도입 생쥐가 이용되었다. 이들 생쥐에서, 동일한 유전자 배경 및 광 전달 조건 하에, 광 전달은 광유전학적 자극을 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, 40 Hz에서 FS-PV-개재뉴런이 2가지 이유로 선택되었다. 첫 번째, 이전 연구에서 40 Hz에서 FS-PV-개재뉴런을 주동하는 것이 가장 큰 LFP 반응을 산출하는 것으로 밝혀졌다. 두 번째, 일부 구체예에서, SWRs 동안 감마에서 결손이 밝혀졌고, 그리고 SWRs 동안 순간 감마 주파수가 도면 5A-5C에서 도해된 바와 같이 약 40 Hz에 중심된 분포를 형성하였다. 일부 구체예에서, 전기생리학적 기록을 위해, 40-Hz 자극의 기간은 자극 없음의 기간, 또는 본원에서 더욱 설명된 바와 같이 40 Hz에서 중심된 포아송 분포에서 선택되는 무작위화된 간격에서 전달된 자극의 기간이 끼워 넣어졌다.
도면 13A 및 13B는 일부 구체예에 따라서, 연구의 계통도, 지역장 전위의 전기 트레이스, 그리고 FS-PV-개재뉴런의 파워 스펙트럼 밀도를 포함한다. 도면 13A를 참조하면, 1302는 FS-PV-개재뉴런의 40 Hz 광유전학적 주동 이전 및 동안 CA1에서 지역장 전위의 전기 트레이스이다. 플롯 1304는 CA1 (n = 4마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐)에서 FS-PV-개재뉴런의 40-Hz 자극, 무작위 자극 (40 Hz에서 중심된 포아송 분포에서 선택되는 무작위화된 간격에서 자극), 또는 자극 없음 동안 파워 스펙트럼 밀도의 평균 및 표준 편차를 도해한다. 도면 13B는 각 생쥐에 대한 CA1에서 FS-PV-개재뉴런의 40-Hz 자극 1306, 무작위 자극 1308, 또는 자극 없음 1310 동안 파워 스펙트럼 밀도를 도해한다 (n = 동물마다 169, 130, 240, 73 40 Hz, 143, 129, 150, 72 무작위, 그리고 278, 380, 52, 215 자극 없음 기간을 갖는 4마리 5XFAD 생쥐; 및 n = 동물마다 65, 93, 91 40 Hz, 64, 93, 90 무작위, 그리고 187, 276, 270 자극 없음 기간을 갖는 3마리 WT 생쥐). 40 Hz에서 1 ms의 473-nm-광 펄스를 전달하는 것은 도면 13A에서 및 도면 13B의 플롯 1306에서 예시된 바와 같이 LFPs에서 40 Hz에서 증가된 파워를 유발하였고, 반면 무작위 자극은 도면 13A에서 및 도면 13B의 플롯 1308에서 예시된 바와 같이 40-Hz에서 증가된 파워를 유발하지 않았다.
게다가, 일부 구체예에서, 광 펄스는 광 개시 후 2-3 ms에 스파이크를 효과적으로 주동하였고, 그리고 펄스마다 스파이크는 무작위 및 40-Hz 조건 둘 모두에서 유사하였다. 도면 14A 및 14B는 일부 구체예에 따라서, 미가공 전기 트레이스, 광유전학적 자극 후 스파이크에 대해 필터링된 트레이스, 그리고 1ms 레이저 펄스의 개시 후 스파이크 확률의 플롯을 포함한다. 도면 14A는 실례 미가공 트레이스 1402 및 광유전학적 자극 1406 후 스파이크 (300-6000 Hz) 1404에 대해 필터링된 트레이스를 도해한다. 플롯 1408은 40-Hz 자극, 무작위 자극, 또는 자극 없음 동안 1ms 레이저 펄스의 개시 후 펄스마다 스파이크의 히스토그램을 도해한다 (n = 4마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐에서 552 40-Hz 자극, 543 무작위 자극 및 1681 자극 없음 기간과 최소한 500 ms 이격된 345762 40-Hz 자극, 301559 무작위 펄스 자극 및 32350 자극 없음 시간). 도면 14B는 40-Hz 자극 1412, 무작위 자극 1414, 또는 자극 없음 1410에 대한 응답으로 1 ms 레이저 펄스의 개시 후 스파이크 확률을 보여주는데, 스파이킹이 레이저 펄스 개시 후 약 2-3 ms에 증가한다 (n = 동물마다 87, 130, 8, 73 40-Hz 자극, 85, 129, 5, 72 무작위 자극, 그리고 251, 379, 15, 215 자극 없음 기간을 갖는 4마리 5XFAD; 및 n = 동물마다 65, 93, 91 40-Hz 자극 기간, 동물마다 64, 93, 90 무작위 자극 기간, 그리고 동물마다 187, 277, 270 자극 없음 기간을 갖는 3마리 WT). 오차 막대는 평균 +/- SEM을 보여준다.
따라서, CA1에서 40-Hz 진동은 FS-PV-개재뉴런의 광유전학적 자극을 통해 효과적으로 주동되었다. 이전 연구는 Aβ 펩티드 수준이 신경 활성에서 증가 이후에 상승되고 신경 활성의 침묵 이후에 감소된다는 것을 보여주었다. 일부 구체예에서, 무작위 자극 조건이 자극에 의해 유발된 스파이킹 활성에서 전반적인 변화를 제어하는데 이용되었다. 일부 구체예에서, 40 Hz 및 무작위 자극의 끼워 넣어진 기간 동안 멀티유닛 점화율이 비교되었고, 그리고 이들 조건에서 점화율 사이에 유의미한 차이 없음이 밝혀졌다.
도면 15A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극 및 무작위 자극 기간 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다. 도면 15A는 자극의 양쪽 유형이 유사한 양의 스파이킹 활성을 이끌어낸다는 것을 보여준다 (제로 중앙에 대한 윌콕슨 부호 순위 검증, p > 0.6, n = 4마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐로부터 538 자극 기간, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시한다). 모든 생쥐에 대해 함께 40 Hz 및 무작위 자극 동안 점화율 사이에 차이의 분포의 제로 중앙에 대한 윌콕슨 부호 순위 검증 p > 0.6: 중앙 -1.75x10-5 Hz (-1.28-1.18 Hz, 25번째-75번째 백분위수) n = 538 자극 기간.
도면 15B는 각 동물에 대한 40-Hz 자극 1512, 무작위 자극 1514 및 자극 없음 1510 기간마다 멀티유닛 점화율을 도해하는 막대 그래프이다 (각 동물, 3마리 WT 및 4마리 5XFAD 생쥐에 대한 순위 합계 검증, p > 0.09, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 생쥐마다 87, 130, 8, 65, 93, 91, 73 40-Hz 자극 기간 및 85, 129, 5, 64, 93, 90, 72 무작위 자극 기간). 상자 및 위스커 플롯은 중앙 (상자에서 백색 라인) 및 사분위수 (상자의 위쪽 및 아래쪽)를 보여준다. 모든 동물에서 40 Hz 및 무작위 자극 사이에 점화율은 유의미하게 상이하지 않았는데, 이것은 무작위 자극 조건이 스파이킹 활성에 대한 대조로서 역할을 한다는 것을 증명한다 (각 동물, 3마리 WT 및 4마리 5XFAD 생쥐에 대한 순위 합계 검증, p > 0.09, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 동물마다 87, 130, 8, 65, 93, 91, 73 40-Hz 자극 기간 및 85, 129, 5, 64, 93, 90, 72 무작위 자극 기간). 40-Hz 자극이 자극 없음에 비하여 뉴런 과다활동을 유발하는 지의 여부 또한 조사되었다. 대부분의 동물에서 40 Hz 또는 무작위 자극 및 자극 없음 사이에 점화율은 유의미하게 상이하지 않았고 (각 동물, 2마리 WT 및 2마리 5XFAD에 대한 순위 합계 검증, p > 0.25, n = 동물마다 8, 93, 91, 73 40-Hz 자극 기간 및 15, 277, 270, 215 기준선 기간), 또는 40-Hz 또는 무작위 자극 동안 점화율은 자극 없음 동안보다 낮았는데 (각 동물, 1마리 WT 및 1 5XFAD에 대한 순위 합계 검증, p < 10-5, 이것은 다중 비교를 수행하기 위해 교정될 때 유의미하다, n = 동물마다 130, 65 40-Hz 자극 기간 및 379, 187 기준선 기간), 이것은 40-Hz 자극이 뉴런 과다활동을 유발하지 않았다는 것을 지시한다. 1마리 동물에서 기준선 동안보다 40 Hz 또는 무작위 자극에서 훨씬 높은 활성이 있었다 (1마리 5XFAD 생쥐에 대한 순위 합계 검증, p < 10-5, n = 동물마다 87 40-Hz 자극 기간 및 251 기준선 기간). 이런 이유로, 7마리 동물 중에서 6마리에서 FS-PV-개재뉴런의 40 Hz 광유전학적 자극이 과다활동을 유발한다는 어떤 증거도 없다. 이런 이유로, 무작위 조건이 감마 진동을 유도하지 않은 일부 구체예에서, 이것은 도면 15A에서 예시된 바와 같이 유사한 양의 멀티유닛 스파이킹 활성을 유발하였다.
도면 16A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극에서 주파수-특이적 증가 동안 개체의 해마로부터 기록된 전기 트레이스이다. 더욱 특정하게는, 도면 16A는 일부 구체예에 따라서, FSPV+ (다시 말하면, 감마 조건)의 자극에서 주파수-특이적 증가 동안 개체의 해마로부터 기록되었다.
도면 16B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극에서 지역장 전위 파워에서 주파수-특이적 증가를 도해하는 파워 스펙트럼 밀도의 플롯이다. 특히, 도면 16B에서 파워 스펙트럼 밀도 그래프는 자극의 특이성을 실증한다. 지역장 전위 (LFP) 파워는 FS-PV+가 40-Hz 청색광 펄스에 의해 활성화될 때, 감마 자극 조건 동안 40 Hz 밴드 1600에서만 증강되었다 (n = 군마다 4마리 생쥐). 기준선 및 무작위 자극 조건 중에서 어느 것도 이러한 주파수 1600에서 증강을 보여주지 않았다.
감마 자극은 해마의 CA1 영역에서 Aβ 생산을 감소시켰다.
Aβ의 축적은 AD 병리에 전형적인 복수의 신경독성 사건을 개시할 수 있다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 감마 자극은 조사된 5XFAD 생쥐에서 전반적인 Aβ 펩티드 수준에 영향을 준다. 3 개월령인 생쥐가 이용되었는데, 그 이유는 플라크가 이러한 시기에 이들 생쥐의 해마에서 존재하지 않아서, 가용성 Aβ 동역학이 플라크 부하와는 관계없이 조사될 수 있기 때문이다. 일부 구체예에서, FS-PV-개재뉴런의 1 시간 자극은 Aβ ELISA 분석에 의해 계측될 때, 해마의 CA1 영역에서 EYFP 대조군과 비교하여 40 Hz 군에서 Aβ1 -40을 53.22% 감소시키고 Aβ1 -42를 44.62% 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
도면 17A 및 17B는 일부 구체예에 따라서, 모든 생쥐를 함께 군화하는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의한 5XFAD/PV-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = Aβ1 -40의 경우 8 EYFP 생쥐 및 740 Hz 생쥐, n = Aβ1 -42의 경우 군마다 4마리 생쥐). 도면 17A에서 막대 그래프는 각 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -40 수준을 나타낸다. 막대 그래프에서 막대에 중첩된 원 1702는 각 군에서 개별 데이터 포인트를 지시한다 (n = 8 EYFP, n = 7 40Hz, n = 4 8Hz, n = 군마다 6마리 무작위 5XFAD/PV-Cre 생쥐). 이러한 도면에서 모든 막대 그래프에 대해 표기법 "n.s." 1704는 유의미하지 않음을 지시하고, 별표 1706은 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고, 이중 별표 1708은 p < 0.01을 지시한다. 도면 17B는 각 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre CA1의 상대적인 Aβ1 -42 수준을 나타낸다 (n = 4 EYFP, n = 4 40-Hz, n = 3 8Hz, n = 군마다 3마리 무작위 5XFAD/PV-Cre 생쥐). 도면 17A 및 17B는 평균 및 SEM을 보여준다.
표 1 (아래)은 상이한 조건을 제공받는 동일한 한배 새끼로부터 생쥐가 비교될 때, 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하게 상이한 p < 0.05, 미가공 농도 (pg/ml) 값을 묘사한다. 표 1은 각 실험군에 대한 ELISA 희석에서 미가공 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 전시한다.
| 처리 | 희석 인자 | 평균 Aβ 1 -40 농도 ( pg /ml) | 평균 Aβ 1 -42 농도 ( pg /ml) |
| 광유전학 기술 | |||
| PV-Cre EYFP | 1:2 | 100.01, 61.598, 65.462, 82.509, 69.023, 70.831, 82.152, 74.314 | 58.777, 54.546, 30.585 |
| PV-Cre 40 Hz | 1:2 | 46.604, 31.041, 26,639, 55.612, 69.326, 17.711, 3.9951 | 27.271, 41.950, 18.790, 18.262 |
| PV-Cre 8 Hz | 1:2 | 101.268, 54.283, 90.190, 151.690 | 50.699, 122.85, 35.507 |
| PV-Cre 무작위 | 1:2 | 235.68, 89.962, 157.37, 323.902, 451.78, 241.63 | 54.029, 137.78, 144.63 |
| αCaMKII-Cre EYFP | 1:2 | 45.813, 59.069, 40.404, 66.810 | 72.052, 36.573, 67.243, 59.295 |
| αCaMKII-Cre 40 Hz | 1:2 | 55.942, 44.270, 57.498, 47.382, 115.08, 75.673 | 70.847, 79.683, 61.429 |
| αCaMKII-Cre 8 Hz | 1:2 | 52.829, 46.604, 57.720 | 95.939, 21.640, 102.987 |
| αCaMKII-Cre 무작위 | 1:2 | 218.00, 191.72, 159.07 | 66.203, 168.867, 176.404 |
| 광 플리커 | |||
| 어두운 1 시간 VC | 1:2 | 343.8, 245.3, 210.6, 343.8, 588.4, 394.9, 151.5, 334.4, 301.1, 185.6 | 449.5, 320.7, 275.2, 449.5, 769.2, 516.2 |
| 밝은 1 시간 VC | 1:2 | 366.9, 632.4, 378.2, 314.1, 266.9, 264.1 | 616.4, 592.3, 802.9, 394.5, 330.7, 337.8 |
| 20 Hz 1 시간 VC | 1:2 | 944.4, 313.2, 595.9, 530.9, 456.5, 289.9 | 1624, 302.4, 816.9, 687.2, 676.6, 343.0 |
| 40 Hz 1 시간 VC | 1:2 | 146.4, 143.6, 104.9, 99.6, 179.7, 219.8, 100.4, 98.46, 71.96, 68.31, 123.3, 150.7 | 191.4, 187.7, 137.2, 130.2, 234.9, 287.3 |
| 80 Hz 1 시간 VC | 1:2 | 332.5, 328.7, 363.5, 390.6, 530.0, 673.3 | 558.3, 418.9, 510.7, 609.5, 1186, 921.9 |
| 40 Hz + PTX 1 시간 VC | 1:2 | 367.2, 431.4, 445.2, 392.4, 386.7, 445.2 | 396.6, 540.5, 532.7, 705.0, 104.5, 104.5 |
| 무작위 1 시간 VC | 1:2 | 461.8, 100.2, 9.819, 416.6 | 423.9, 157.9, 389.9, 841.5 |
| 어두운 1 시간 HPC | 1:2 | 97.949, 107.33, 119.92, 139.33 | 499.30, 355.13, 469.53, 598.03 |
| 40 Hz 1 시간 HPC | 1:2 | 88.136, 104.78, 161.52, 197.36 | 364.53, 408.41, 436.62, 873.83 |
| 무작위 1 시간 HPC | 1:2 | 95.816, 136.77, 70.004, 125.47 | 466.39, 500.87, 311.26, 582.355 |
| 어두운 7 일 가용성 | 1:50 | 1216.9, 1181.3, 1173.4, 1199.5, 134.73, 151.34, 113.26, 145.14, 127.91, 127.48, 143.02, 127.48, 141.07 | 5217.2, 8057.9, 9051.3, 6773.7, 244.11, 236.96, 235.38, 240.62, 286.19, 8.382, 11.21, 14.03, 13.56 |
| 어두운 7 일 불용성 | 1:100 | 1173.2, 1208.2, 1205.3, 1214.6, 994.86, 1059.2, 1176.6, 1065.4, 1002.9, 306.16, 690.70, 3442.7, 152.73 | 8572.7, 9127.1, 6349.3, 10138, 6852.2, 7056.7, 7039.7, 7094.2, 7289.0, 748.21, 1117.1, 1055.5, 504.95 |
| 40 Hz 7 일 가용성 | 1:50 | 476.71, 283.83, 336.87, 237.22, 7.0175, 4.1480, 4.0580, 1.5205, 91.864, 152.73, 148.84, 141.07, 162.44 | 419.7, 248.1, 242.7, 90.974, 95.626, 56.936, 67.577, 47.586, 200.87, 13.56, 9.794, 15.44, 3.677 |
| 40 Hz 7 일 불용성 | 1:100 | 281.97, 270.37, 86.199, 239.71, 23.557, 15.166, 22.714, 1038.9, 1099.8, 1760.8, 1558.8, 187.69, 22.64 | 202.96, 130.71, 195.73, 193.70, 1646.89, 1579.1, 503.44, 1400.0, 7536.62, 955.23, 1208.8, 694.57, 784.91 |
| 어두운 1 시간 BC | 1:2 | 81.874, 18.343, 86.554 | 391.95, 883.69, 604.97 |
| 40 Hz 1 시간 BC | 1:2 | 81.307, 27.986, 30.113 | 300.34, 1152.5, 616.92 |
| 40 Hz 1 시간 대기 4 시간 | 1:2 | 91.06, 141.8, 111.2, 12.30 | 108.0, 168.1, 157.3, 35.158 |
| 40 Hz 1 시간 대기 12 시간 | 1:2 | 167.2, 101.6, 89.31, 119.9 | 236.1, 134.6, 124.8, 152.4 |
| 40 Hz 1 시간 대기 24 시간 | 1:2 | 246.7, 177.6, 281.2, 175.0, 257.3, 204.2 | 231.8, 107.0, 402.7, 184.6, 245.1, 179.7 |
| 어두운 APP/PS1 | 1:2 | 1050.16, 1085.25, 1522.45, 1153.69, 1750.77 | 19.22, 30.68, 28.08, 14.25, 25.30 |
| 40 Hz APP/PS1 | 1:2 | 512.42, 947.80, 850.45, 793.63 | 18.85, 15.58, 18.92, 11.44 |
| 어두운 WT | 1:1 | 0.038, 0.813, 2.016, 1.913, 0.313, 4.11, 7.23, 20.2, 40.4, 38.7, 11.9 | N/A |
| 40 Hz WT | 1:1 | 0.139, 0.325, 0.346, 0.390, 8.92, 12.1, 6.34, 12.4, 13.1 | N/A |
일부 구체예에서, 대조 실험의 포괄적인 세트가 상기 효과가 주파수, 세포 유형 및/또는 리듬성에 특이적인지를 결정하기 위해 수행되었다. 주파수 특이성을 결정하기 위해, 8Hz에서 5XFAD/PV-Cre 이중-유전자도입 생쥐의 FS-PV-개재뉴런이 주동되었고, 그리고 Aβ 수준에서 어떤 변화도 관찰되지 않았다. 이후, FS-PV-개재뉴런은 무작위로 주동되었고, 그리고 상기 효과는 리듬성 자극에 특이적이었다. 실제로, 아밀로이드 수준은 무작위 자극 이후에 감소되지 않았고, 그리고 실제로, 그 대신에 Aβ1 -40은 230.1% 증가하였고 Aβ1 -42는 133.8% 증가하였다 (가령, 도면 17A 및 17B를 참조한다, 모든 생쥐를 함께 군화하는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.01, Aβ1 -40의 경우 n = 8마리 EYFP 생쥐 및 n = 4마리 무작위 생쥐, Aβ1 -42의 경우 n = 군마다 3마리 생쥐. 상이한 조건을 제공받은 동일한 한배 새끼로부터 생쥐가 비교되었고 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하게 상이한 p < 0.01이 관찰되었다.
최종적으로, 5XFAD/αCamKII-Cre 이중-유전자도입 생쥐를 이용하여 해마 CA1에서 CamKII+ 흥분성 뉴런에서 8 Hz 및 40 Hz에서 자극함으로써 상기 효과의 세포 유형 특이성이 시험되었다. 도면 18A 및 18B는 일부 구체예에 따라서, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의한 5XFAD/αCamKII-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 18A는 각 시뮬레이션 조건에서 5XFAD/αCamKII-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -40 수준을 나타낸다. 막대 그래프에서 막대에 중첩된 원 1802는 각 군에서 개별 데이터 포인트를 지시한다 (n = 6 40-Hz, n = 3 8-Hz, n = 군마다 3마리 무작위 5XFAD/αCamKII-Cre 생쥐, 표기법 "n.s." 1804는 유의미하지 않음을 지시하고, 별표 1806은 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.001을 지시한다).
도면 18B는 각 시뮬레이션 조건에서 5XFAD/αCamKII-Cre CA1의 상대적 Aβ1 -42 수준을 나타낸다 (n = 군마다 3마리 αCamKII-Cre 생쥐). 일부 구체예에서, 8 Hz 또는 40 Hz에서 CamKII+ 흥분성 뉴런을 주동하는 것은 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준에서 유의미한 차이를 산출하지 못하는 것으로 밝혀졌다 (가령, 도면 18A 및 18B, 오른쪽을 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p > 0.05, n = 6마리 40 Hz 생쥐 및 3마리 8 Hz 생쥐 (Aβ1 -40), n = 군마다 3마리 생쥐 (Aβ1 -42). 상이한 조건을 제공받았던 동일한 한배 새끼로부터 생쥐가 비교되면, 이들은 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하게 상이하지 않았다 (p > 0.05). 5XFAD/PV-Cre 생쥐와 유사하게, 무작위 자극으로 CamKII+ 뉴런을 주동하는 것은 또한, Aβ1 -40의 257.6% 상승 및 Aβ1 -42의 133.3% 증가를 유발하였다(가령, 도면 18A 및 18B, 오른쪽을 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.001, n = Aβ1 -40의 경우 5마리 40 Hz 생쥐 및 3마리 무작위 생쥐, n = Aβ1 -42의 경우 군마다 3마리 생쥐. 상이한 조건을 제공받았던 동일한 한배 새끼로부터 생쥐가 비교되면, Aβ1 -40은 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하게 상이한 p < 0.001이고, 그리고 Aβ1 -42는 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하게 상이한 p = 0.13이다.
따라서, 40-Hz 자극 이후에 Aβ 펩티드 수준의 감소는 FS-PV-개재뉴런을 주동하는데 특이적일 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 ELISA 조사 결과를 면역조직화학으로 확증하기 위해, CA1에서 APP와 교차반응하지 않는 β-아밀로이드 C 말단 단부-특이적 항체를 이용하여 Aβ-표지화가 수행되었다.
도면 19A는 일부 구체예에 따라서, 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 및 항-EEA1 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 이미지이다. 특히, 도면 19A는 EYFP, 40-Hz 및 무작위 시뮬레이션 조건에서 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 1902 (D54D2) 및 항-EEA1 1904 (610457) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (눈금자 = 50μm). 도면 19B는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 묘사하는 일련의 막대 그래프이다. 특히, 도면 19B는 EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 도해한다 (n = 군마다 4마리 생쥐, 1908은 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고 1920은 p < 0.01을 지시한다).
도면 20A는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 특히, 도면 20A는 EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 항-Aβ 2002 (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (눈금자 = 50 μm). 도면 20B는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다. 특히, 도면 20B는 EYFP에 정규화된 Aβ의 상대적 면역반응성을 도해한다 (n = 군마다 4마리 생쥐, 2004는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고 2006은 p < 0.001을 지시한다). Aβ-표지화의 강도는 3-개월령 5XFAD/PV-Cre 이중-유전자도입 생쥐에서 FS-PV-개재뉴런의 40-Hz 자극 이후에 39.5% 감소되었고, 그리고 EYFP 군과 비교할 때, 무작위 자극 이후에 유의미하게 187.0% 증가되었다 (가령, 도면 19A, 19B, 20A 및 20B를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05 및 p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐).
뇌 아밀로이드 농도는 Aβ 생산 및 청소율에 의존할 수 있다. 일부 구체예에서, Aβ 펩티드는 β- 및 γ-세크레타아제에 의한 APP의 순차적 단백질분해 개열에 의해 생산된다. BACE1이 APP 홀로단백질을 개열할 때, APP의 CTFs 및 NTFs가 생산될 수 있다. 일부 구체예에서, 40-Hz 자극이 Aβ 수준을 어떻게 감소시키는 지를 석명하기 위해, 감마 영향을 받은 APP 개열이 FS-PV-개재뉴런 자극 이후에, APP, CTFs 및 NTFs의 개열 중간체의 수준을 계측함으로써 조사되었다. 40-Hz 자극 이후에, CTFs는 EYFP 군과 비교하여 18.6% 및 40-Hz 자극 이후에 무작위 군과 비교하여 19.7%의 유의미한 감소가 밝혀졌다 (일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05 및 p < 0.01, n = 군마다 6마리 생쥐).
도면 21A는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 무작위 및 40-Hz 자극 조건, 레인마다 1마리 생쥐, 각 조건의 2개 생물학적 복제에서 CA1에서 APP (CT695), APP NTF (A8967), APP CTFs (CT695) 및 β-액틴 (A5316) (부하 대조)의 수준을 묘사하는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도면 21B는 일부 구체예에 따라서, APP CTFs의 상대적 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다. 특히, 도면 21B는 EYFP 및 무작위 조건과 대비하여 40-Hz에서 APP CTFs의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 도해한다 (n = 군마다 6마리 생쥐, 1개 별표 2102는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고, 2개 별표 2104는 p < 0.01을 지시한다). 도면 21C는 일부 구체예에 따라서, CA1에서 전장 APP 2106 (CT695), APP CTFs 2108(CT695) 및 β-액틴 2112 (A5316, 부하 대조)의 수준을 묘사하는 일련의 웨스턴 블롯이다. 특히, 도면 21C는 EYFP, 무작위 및 40-Hz 자극 조건, 레인마다 1마리 생쥐, 각 조건의 2개 생물학적 복제에서 CA1에서 전장 APP 2106 (CT695), APP CTFs 2108(CT695) 및 β-액틴 2112 (A5316, 부하 대조)의 수준을 도해한다.
도면 22A는 EYFP 및 무작위 조건과 대비하여 40-Hz에서 APP NTFs의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 6마리 생쥐, 표기법 "n.s" 2204는 유의미하지 않음을 지시하고, 2202는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시한다). 도면 22B는 EYFP, 무작위 및 40-Hz 조건에서 전장 APP의 상대적 (액틴에 정규화된) 면역반응성을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 군마다 6마리 생쥐).
일부 구체예에서, 40-Hz 자극 이후에, APP NTF 수준은 EYFP 군과 비교하여 28.5% 및 무작위 군과 비교하여 28.2%의 유의미한 감소가 밝혀졌다 (가령, 도면 21A, 22A 및 21C를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05, n = 군마다 6마리 생쥐). 게다가, 전장 APP의 수준은 다양한 군 사이에서 유사한 것으로 나타났는데, 이것은 Aβ에서 감소가 전구체 수준에서 변화에 기인하지 않는다는 것을 증명하였다 (가령, 도면 21A, 22B, 21C를 참조한다, n = APP 실험에서 군마다 6마리 생쥐). 일부 구체예에서, 이러한 생쥐 모형에서 개열 산물과 비교하여 APP의 상대적으로 높은 존재비 때문에, 전장 APP에서 변화는 검출하기 어려울 수 있다.
일부 구체예에서, APP의 처리는 소포성 트래피킹 경로 내에서 발생하고, 그리고 이전 작업은 APP가 활성 자극 이후에 재활용 엔도솜 내로 수송된다는 것을 증명하였다. 게다가, 확대된 초기 엔도솜이 AD 환자로부터 뇌 조직에서 및 AD 환자로부터 유래된 인간 뉴런에서 관찰되었다. 일부 구체예에서, 감마 자극이 실험 동물에서 엔도솜 존재비에 영향을 주는 지를 시험하기 위해, 초기 엔도솜이 2가지 마커, EEA1 (초기 엔도솜 항원 1) 및 Rab5 (RAB5A 유전자에 의해 인코딩된 Ras-관련된 단백질)를 이용하여 40 Hz 및 무작위 자극 이후에 CA1에서 특징화되었다. 도면 23은 EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 3-개월령 5XFAD/PV-Cre 생쥐에서 항-Rab5 (ADI-KAp -GP006-E) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (척도화된 막대 = 50 μm).
도면 24A는 일부 구체예에 따라서, EYFP에 정규화된 EEA1의 상대적 면역반응성을 나타내는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐, 1개 별표 2402는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고, 2개 별표 2402는 p < 0.01을 지시한다). 도면 24B는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건 하에 5XFAD/PV-Cre로부터 CA1의 상대적 Rab5 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 3마리 생쥐, 3개 별표 2408은 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.001을 지시한다). 일부 구체예에서, EEA1 염색은 초기 엔도솜에 전형적인, 뉴런 세포체에서 점상 세포질 및 막근접 패턴을 산출하였다 (가령, 도면 19A를 참조한다). 일부 구체예에서, Rab5 표지화는 주로, 엔도솜 및 막 구획 내에 농축된 작고, 얇은 부점에 의해 대표되는 세포체 및 원형질막에 한정되었다 (가령, 도면 23을 참조한다). 종합하면, CA1 뉴런의 초기 엔도솜 표지화는 EYFP 대조와 비교하여, 40-Hz 자극 이후에 EEA1 (39.7%) 및 Rab5 (40.1%) 염색 강도 둘 모두에서 유의미한 감소를 증명하였다 (가령, 도면 19A, 23, 24A를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05 및 p < 0.001, n = 군마다 3마리 생쥐로부터 2개 섹션). 대조적으로, FS-PV-개재뉴런의 무작위 자극은 EYFP 대조와 비교하여, EEA1 염색 강도를 122% 증가시켰다 (가령, 도면 19A 및 24A를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.01, n = 군마다 3마리 생쥐로부터 2개 섹션). 일부 구체예에서, EEA1 염색 강도에서 처리-의존성 변화는 CA1에서 Aβ의 것들과 매우 유사하였다 (가령, 도면 19A-B, 20A-B, 23 및 24A-B를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05, n = 군마다 3마리 생쥐로부터 2개 섹션). 이들 결과는 CTFs에서 관찰된 변화에 더하여, 40-Hz 자극이 EEA1 및 Rab5를 변경한다는 것을 암시하고, 전반적인 엔도솜 처리에서 차이를 지시한다.
도면 25A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40의 수준을 묘사하는 막대 그래프이다. 실험에서, 약 40 Hz 502에서 FS-PV+의 1 시간 광유전학적 자극은 해마 CA1에서 Aβ1 -40 수준을 감소시켰다. 8 Hz 506에서 흥분성 피라미드 자극 및 40 Hz 508에서 흥분성 피라미드 자극은 Aβ1 -40 수준에 유의미하게 영향을 주지 않았다. 무작위 40-Hz 자극 504, 그리고 특히, 무작위 흥분성 피라미드 자극 510은 Aβ1 -40 수준을 유의미하게 증가시켰다 (n = 군마다 4-9마리 동물).
도면 25B는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42에서 감소를 묘사하는 막대 그래프이다. 실험에서, 약 40 Hz 516에서 FS-PV+의 1 시간 광유전학적 자극은 해마 CA1에서 Aβ1 -42 수준을 감소시켰다 (n = 군마다 2-4마리 동물). 8 Hz 520에서 자극, 40 Hz 522에서 흥분성 피라미드 자극, 그리고 8 Hz 524에서 흥분성 피라미드 자극은 Aβ1 -42 수준을 증가시켰다. 무작위 40-Hz 자극 518, 그리고 특히, 무작위 흥분성 피라미드 자극 526은 Aβ1-42 수준을 유의미하게 증가시켰다.
도면 25C는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 해마의 CA1 영역에서 특정한 세포 유형의 자극 이후에, 전장 APP 528, 534의 수준에서 증가 (액틴 532에 정규화된) 및 CTFs (가령, βCTF) 530, 536의 수준에서 감소 (액틴 532에 정규화된)를 도해하는 일련의 이미지이다. 무작위 40-Hz 대조 조건과 비교하여, 40-Hz에서 FS-PV+ 자극은 APP β-CTF 수준을 감소시키고 전장 APP 수준을 증가시켰다 (n = 군마다 4-6마리 동물). β-CTF가 BACE1에 의한 APP의 아밀로이드형성 개열 동안 생산된 APP 유도체이기 때문에, 더욱 높은 β-CTF 수준은 증가된 Aβ 생산을 나타낸다.
도면 26A-26B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, 엔도솜 수준 (EEA1 수준에 근거된)을 도해하는 면역형광 이미지이다. 특히, 도면 26A에 도면 26B의 비교는 FS-PV+ 40-Hz 자극을 통한 감마 진동의 유도가 면역형광에 의해 계측될 때, 무작위 FS-PV+ 자극 900과 비교하여 EEA1 수준 (엔도솜 수준에 대한 마커)을 감소시킨다는 것을 보여준다 (n = 군마다 3마리 생쥐, p = 0.007). 세포에서 감소된 엔도솜 수준은 APP 및 β-세크레타아제 사이에 감소된 상호작용을 지시하는데, 이것은 감소된 APP 개열 및 Aβ 생산을 유발한다. 따라서, 상기 연구는 증가된 엔도솜 수준이 증가된 APP 처리 및 이런 이유로, Aβ 생산을 지시하기 때문에, 감마 진동이 AD 생쥐 모형에서 AP 생산을 감소시킨다는 것을 보여주었다.
도면 27은 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, 도면 26A-26B에서 면역형광 이미지에 대한 평균 강도 값 (FAD에 정규화된)을 묘사하는 막대 그래프이다.
감마 자극은 소교세포의 형태학적 형질전환을 유도하였다.
일부 구체예에서, 40-Hz 자극의 세포 및 분자 효과를 선입견 없는 방식으로 더욱 탐색하기 위해, 5XFAD/PV-Cre 이중-유전자도입 생쥐의 1 시간 40-Hz FS-PV-개재뉴런 자극, 또는 자극 없음 (EYFP) 이후에 해마 CA1 조직의 유전체-너비 RNA-seq가 수행되었다. RNA-seq 실험에서, 평균 26,518,345개의 서열 리드가 3마리 자극된 생쥐 및 3마리 비-자극된 생쥐로부터 획득되었다. 데이터 QC 분석은 엑손/인트론 비율의 경우 183의 평균 값, 엑손/유전자간 비율의 경우 272의 평균 값, 그리고 리보솜 RNA 리드의 백분율의 경우 3.6%의 평균 값을 드러냈다. 상기 분석은 523개의 차별적으로 발현된 유전자 (DEGs)를 확인하였는데, 이들 중에서 130개는 40-Hz 자극에 대한 응답으로 상향조절되고, 그리고 393개는 하향조절되었다.
도면 28은 40-Hz 자극이 있는 경우와 없는 경우의 생쥐 해마 CA1 영역의 전체 전사체 RNA-seq에 의해 결정된 차별적으로 발현된 유전자를 나타내는 히트맵이다. 정규화된 z-점수 값이 각 차별적으로 발현된 유전자 (열)에 대해 계산되었다. 컬러는 상대적으로 낮은 및 높은 수준의 유전자 발현을 나타낸다. 표 2 (아래)는 40-Hz FS-PV-개재뉴런 자극에 의해 상향조절된 130개 유전자를 제시한다 (Cufflinks 2.2 소프트웨어 (전사체를 조립하고, 그들의 존재비를 추정하고, 그리고 RNA-seq 표본에서 차별적 발현 및 조절을 시험하기 위해, the University of Washington, Seattle, Washington에서 the Trapnell Lab으로부터 가용)를 이용하여 p < 0.05).
| 40-Hz FS-PV-개재뉴런 자극에 의해 상향조절된 유전자 | |
| 2010002N04Rik | Junb |
| 2010300C02Rik | Kcnc4 |
| 2410018L13Rik | Kcnh3 |
| Adra2c | Kcnj4 |
| Agfg2 | Klf16 |
| Agxt2I1 | Lag3 |
| Arc | Lcat |
| Atf3 | Lefty1 |
| B2m | Lgals3bp |
| BC018242 | Lingo3 |
| Beta-s | Lrg1 |
| Bst2 | Ltbp4 |
| C1ga | Lyz2 |
| C1gb | Metrn |
| C1gc | Mmp12 |
| C1ql2 | Mpped1 |
| C1qtnf4 | Mt1 |
| C3ar1 | Mt2 |
| C4b | Mtap1s |
| Car7 | Npy |
| Card10 | Nr1d1 |
| Cd68 | Nr4a1 |
| Cebpb | Oasl2 |
| Cebpd | Palm |
| Cirbp | Parp14 |
| Cnn2 | Pcsk1n |
| Cotl1 | Pdzd2 |
| Crip2 | Pgls |
| Cst3 | Phyhd1 |
| Ctxn1 | Pitpnm2 |
| Cyp2d22 | Plekhg5 |
| Dcakd | Pnpla7 |
| Egr4 | Pou3f1 |
| Erf | Ppp1r1a |
| F730043M19Rik | Prr7 |
| Fam107a | Prrt1 |
| Fam163b | Rab40b |
| Fmo2 | Rara |
| Fn1 | Rasl11b |
| Gbp3 | Rbm3 |
| Gldc | Rpph1 |
| Gm129 | Rprml |
| Gm2115 | Sbk1 |
| Gng7 | Scara3 |
| Gpnmb | Sh3bgrl3 |
| Gpr25 | Slc12a9 |
| Gpr37l1 | Slc25a34 |
| Grm2 | Slc29a4 |
| Gstm1 | Spp1 |
| Gstm6 | Spsb1 |
| H1fx | Ssbp4 |
| H2-D1 | Sstr4 |
| H2-k1 | Tfcp2l1 |
| Hipk4 | Thbs4 |
| Hmox1 | Thrsp |
| I830012O16Rik | Tmem198 |
| Icam1 | Tpst2 |
| Icam5 | Trim30a |
| Ifit1 | Ttr |
| Ifit3 | Unc5a |
| Igfbp4 | Ugcr11 |
| Igfbpl1 | Usp18 |
| Irf7 | Vwf |
| Irf9 | Wfs1 |
| Itpka | Xdh |
표 3 (아래)은 40-Hz FS-PV-개재뉴런 자극에 의해 하향조절된 393개 유전자를 제시한다 (Cufflinks 2.2 소프트웨어 (the University of Washington, Seattle, Washington에서 the Trapnell Lab으로부터 가용)에 의해 p < 0.05).
일부 구체예에서, 상향조절된 유전자는 일반적으로, 하향조절된 유전자보다 더욱 높은 발현 값을 가졌다. 도면 29는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 조건에서 상향- 및 하향-조절된 유전자의 FPKM 값을 도해하는 상자 플롯이다. 상기 상자는 중앙 (상자에서 흑색 라인) 및 사분위수 (상자의 위쪽 및 아래쪽)를 보여주고, 위스커는 최소 및 최대 값을 나타내고, 그리고 원은 이상점을 나타낸다. 상향조절된 유전자는 소교세포에서 고도로 농축될 수 있었다. 구체적으로, 모든 상향조절된 유전자 중에서 약 35%가 소교세포에서 그들의 가장 높은 발현을 가졌다 (뉴런에서 약 19%, 내피 세포에서 약 17%, 별아교세포에서 약 14%, 수초성 희소돌기아교세포에서 약 9%, 희소돌기아교세포 전구체 세포에서 약 5%, 그리고 새로 형성된 희소돌기아교세포에서 약 1%).
도면 30은 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 자극 이후에, 확인된 상향조절된 유전자의 세포 유형 특이적 발현 패턴을 도해하는 파이 도표이다. 유전자 FPKM 값은 별아교세포, 내피 세포, 소교세포, 수초성 희소돌기아교세포 (MO), 뉴런, 새로 형성된 희소돌기아교세포 (NFo) 및 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPC)를 비롯한 상이한 뇌 세포 유형으로부터 공개적으로 가용한 RNA-seq 데이터로부터 계산되었다. 따라서, RNA-seq 분석은 FS-PV-개재뉴런의 1 시간의 40-Hz 자극이 소교세포의 세포 상태의 변경을 유발하였다는 것을 강하게 암시하는데, 이것은 이들 세포가 AD 병리에서 일정한 역할을 수행한다는 축적된 증거를 고려하면, 유의미하다.
일부 구체예에서, 소교세포에 대한 40-Hz 자극의 잠재적 효과를 더욱 탐색하기 위해, 상이한 화학적 및 유전자 섭동 하에 소교세포, 말초 대식세포 및 뉴런으로부터 일련의 공개적으로 가용한 RNA-seq 데이터세트가 유전자 세트 증폭 분석을 이용하여 본원의 일부 구체예에서 설명된 특징화로부터 유전자 목록과 비교되었다. 표 4 (아래)는 40-Hz 자극에 의해 상향- 또는 하향-조절된 유전자 및 상이한 화학적 및 유전자 섭동 하에 공개적으로 가용한 뉴런, 소교세포 및 대식세포 특이적 RNA-seq 데이터 사이에 상관의 GSEA-기초된 통계학적 유의성을 예증한다.
| 섭동된 전사체의 명칭 | NES | 명목상 p -값 | FDR q -값 |
| MCSF 처리된 소교세포 | 1.76 | 0.000 | 0.000 |
| NMDA 처리된 뉴런 | 1.62 | 0.000 | 0.000 |
| IL34 처리된 소교세포 | 1.59 | 0.000 | 0.000 |
| GMCSF 처리된 소교세포 | 1.49 | 0.005 | 0.004 |
| 비큐큘린 처리된 뉴런 | 1.49 | 0.016 | 0.013 |
| ALS SOD1 돌연변이체 소교세포 | -1.26 | 0.050 | 0.028 |
| LPS&IFNg 처리된 대식세포 (M1) | 1.18 | 0.122 | 0.081 |
| MeCP2 공백 소교세포 | 1.16 | 0.164 | 0.127 |
| IL4 처리된 대식세포 (M2) | -1.19 | 0.101 | 0.147 |
| Huntington HTT 돌연변이체 소교세포 | 1.03 | 0.371 | 0.361 |
| 무균 소교세포 | 0.94 | 0.604 | 0.667 |
| 테트로도톡신 처리된 뉴런 | -0.76 | 0.941 | 0.970 |
흥미롭게도, 40-Hz 자극 이후에 전사체학적 변화는 증가된 신경 활성 (NMDA 및 비큐큘린에 의한)으로 인한 것들과 더욱 유사하고 침묵 활성 (테트로도톡신에 의한)으로 인한 것들과 덜 유사하였다. 이들 조사 결과는 FS-PV-개재뉴런의 40-Hz 자극이 뉴런 활성을 감소시키지 않는다는 관찰 결과를 더욱 뒷받침한다. 게다가, 뉴런 활성에 의해 상향조절되는 것으로 알려져 있는 극초기 유전자 Nr4a1 , Arc 및 Npas4는 RNA-seq 및 RT-qPCR 둘 모두에 의해 도시된 1 시간의 40-Hz 자극 이후에 상승되었다. 도면 31은 일부 구체예에 따라서, RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 도해하는 막대 그래프이다. 상기 막대 그래프는 EYFP 3102 및 40-Hz 자극 3104 조건으로부터 상대적 RNA 수준 (배수적 변화)을 보여준다 (1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05를 지시하고, 2개 별표는 p < 0.01을 지시하고, 3개 별표는 p < 0.001을 지시한다, n = 군마다 3마리 생쥐). 상위 하향조절된 유전자는 Grin4 및 Camk2d이었다 (가령, 도면 31을 참조한다, p < 0.05, n = 군마다 3마리 생쥐).추가적으로, 전사체학적 결과는 소교세포의 더욱 식균 상태를 암시한다. 일부 구체예에서, 상향조절된 유전자는 소교세포 Aβ 흡수를 증진하는 것으로 알려진 대식세포 집락 자극 인자 (MCSF) 및 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GMCSF) 둘 모두에 의해 유도된 유전체 변화와 긍정적으로 상관하였다. 도면 32A 및 32B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 동안 뇌 위에서 기록된 지역장 전위의 파워 스펙트럼 밀도를 도해하는 플롯이다. 도면 32A 및 32B는 40 Hz에서 파워에서 증가 없음을 보여주고, 이런 이유로 상기 효과는 기록 설비 또는 전기 잡음에 대한 광전 효과에 기인하지 않는다 (n = 시각 피질 기록을 겪는 3마리 5XFAD 동물에서 4 기록 세션으로부터 및 해마 기록을 겪는 2마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐에서 5 기록 세션으로부터 4, 2, 1, 1, 17, 42, 36, 55, 53 40-Hz 플리커 기간). 기록을 교차하여 평균 (실선) 및 표준 편차 (음영된 구역)은 왼쪽에서 도시되고 (도면 32A), 그리고 동물마다 평균 및 표준편차는 오른쪽에 도시된다 (도면 32B). 3보다 적은 플리커 기간 3202를 갖는 기록은 더욱 많은 데이터 3204를 갖는 기록보다 더욱 시끄러운 파워 스펙트럼 밀도를 유발하지만, 어느 것도 40 Hz에서 피크의 증거를 보여주지 않았다. 일부 구체예에서, 공지된 소교세포 기능에 관련된 상향조절된 유전자를 검증하기 위해 RT-qPCR이 실행되었다. Cd68, B2m , Bst2 , Icam1 및 Lyz2를 비롯하여, 소교세포 탐식과 연관된 유전자가 40-Hz 자극 이후에 해마 CA1 영역에서 상향조절되는 것으로 확증되었다.
도면 33은 일부 구체예에 따라서, RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 33은 EYFP 3302 및 40-Hz 자극 3304 조건에서 상대적 RNA 수준 (배수적 변화)을 보여준다 (1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05를 지시하고 2개 별표는 p < 0.01을 지시한다, n = 군마다 6마리 생쥐). 다른 주목할 만한 상향조절된 유전자는 소교세포-농축된 전사 조절인자 Irf7, 세포 부착 및 이주 조절인자 Spp1뿐만 아니라 소교세포 증식 마커 Csf1r 및 Csf2ra를 포함하였다 (가령, 도면 33을 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05 및 p < 0.01, n = 군마다 6마리 생쥐). RT-qPCR은 친염증성 유전자 Il6, Il1b (Il1 -β), Itgam (CD11-b) 및 항염증성 유전자 Igf1의 발현 수준이 변화되지 않는다는 것을 또한 보여주었다 (가령, 도면 33을 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p > 0.05, n = 군마다 6마리 생쥐). 따라서 본원에서 설명된 전사체학적 결과는 40 Hz 뉴런 자극이 소교세포를 흡수를 증진하는 상태로 유도했다는 것을 암시한다.
40-Hz 자극이 식균작용-관련된 및 이주/세포 부착-관련된 유전자 둘 모두를 상향조절했다는 관찰 결과를 고려하여, 소교세포 활성화의 형태학적 특질이 조사되었다. 일부 구체예에서, 1 시간의 40 Hz, 무작위 또는 자극 없음 (EYFP 생쥐) 후 5XFAD/PV-Cre 생쥐로부터 해마 CA1 섹션에서 소교세포를 표지화하기 위한 소교세포 마커 Iba1을 인식하는 항체가 이용되었다. 도면 34는 EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre 생쥐의 해마 CA1 영역에서 항-Iba1 3402 (019-19741) 및 항-Aβ 3404 (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 이미지는 40x 대물렌즈 (눈금자 = 50μm)로 촬영되었다. 화살표는 세포체에서 +Iba1/+Aβ 신호를 지시한다.
도면 35A는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 조건에서 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 도면 35B는 일부 구체예에 따라서, EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건에서 EYFP에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 도면 35C는 EYFP, 40-Hz 및 무작위 자극 조건 EYFP, 40 Hz 및 무작위에서 EYFP에 정규화된 소교세포 일차 돌기 또는 돌출의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 35D는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 또한 Aβ-양성인 Iba1-양성 (소교세포) 세포체의 퍼센트를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 4마리 생쥐 군으로부터 2개 섹션). 표기법 "n.s." 3502는 유의미하지 않음을 지시하고, 2개 별표 3504는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.01을 지시하고, 3개 별표 3506은 p < 0.001을 지시하고, 4개 별표 3508은 p < 0.0001을 지시한다.
첫 번째, 조건마다 6마리 동물에서 Iba1+ 소교세포의 숫자가 계수되었고, 그리고 자극되지 않은 EYFP 조건 (ROI마다 평균 8개 소교세포)과 비교하여 (가령, 도면 34 및 35A를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션) 및 무작위 조건 (ROI마다 평균 10개 소교세포)과 비교하여 (가령, 도면 34 및 35A를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션), 40 Hz 군에서 거의 2배 많은 소교세포 (212.55 μm x 212.55 μm 관심 영역 (ROI)마다 15개 소교세포)가 관찰되었다. 이전 연구는 식균 소교세포의 2가지 일차 특징이 증가된 세포체 크기 및 감소된 돌기 길이라는 것을 증명할 수 있었고, 이런 이유로 이들 특징이 40-Hz 자극에 의해 어떻게 영향을 받는 지가 조사되었다. 일부 구체예에서, 시계에서 각 명확하게 표지화된 Iba1+ 세포체의 직경이 계측되었다. 40-Hz 자극 이후에 소교세포 세포체 직경은 자극 없음과 비교하여 135.3% 및 무작위 조건과 비교하여 138.7% 증가하는 것으로 밝혀졌다 (가령, 도면 34 및 35B를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.0001, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 각 조건에서 소교세포의 일차 돌기의 길이가 계측되었고, 그리고 40-Hz 자극 조건에서 일차 소교세포 돌기 길이는 EYFP 대조와 비교하여 54.0% 감소 및 무작위 자극과 비교하여 38.5% 감소가 관찰되었다 (가령, 도면 34 및 35C를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.0001, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 이들 조사 결과는 Iba1 수준에 의해 영향을 받지 않았는데, 그 이유는 조건 사이에 Iba1 발현에서 차이가 본원에서 설명된 유전자 발현 분석에서 관찰되지 않았기 때문이다 (가령, 표 2 및 3을 참조한다). 따라서, 40-Hz 자극 후 관찰된 세포체 크기에서 증가 및 돌기 길이에서 감소는 이들 소교세포에 대한 식균 상태를 향한 이동과 일치하는 형태학적 변화이다. Aβ 항체 (12F4, 이것은 APP와 교차반응하지 않는다)와 동시면역염색 시에, 소교세포 내에서 Aβ의 잠재적 동시국지화는 소교세포 Aβ 흡수를 평가하기 위한 수단으로서 평가되었다. Iba1+ 세포가 일차적으로 위치되는 CA1 신경망에서, 40-Hz 자극 이후에 소교세포의 총수에 대한 세포체에서 Aβ/Iba1 동시국지화 (ImageJ, Fuji 동시국지화 플러그인)를 갖는 소교세포의 숫자의 비율은 EYFP 대조와 비교하여 54.9% 및 무작위 조건과 비교하여 50.3% 증가하였다 (가령, 도면 34 및 35D를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 소교세포 돌기에서 Iba1/ Aβ 신호 중복은 잠재적으로 무작위, 비-탐식 동시국지화를 포함하는 것을 방지하기 위해 배제되었다.
일부 구체예에서, 소교세포 내에서 Aβ 신호의 존재의 더욱 우수한 분해능을 제공하기 위해, 이러한 조직으로부터 소교세포의 3D 렌더링 및 이들 렌더링으로부터 비디오가 창출되었다. 도면 36은 일부 구체예에 따라서, 0도 3602, Y-축 주변에 -25도 3604 및 X 축 주변에 30도 3606 회전된 도면 34로부터 면역형광 이미지를 합병함으로써 형성된 일련의 3D 렌더링이다. 이미지는 40x 대물렌즈 (눈금자 = 50μm)로 촬영되었다. 종합하면, 유전자 발현 및 형태학적 분석은 40-Hz 자극이 자극 부위에 소교세포의 모집을 증가시키고 이들의 탐식 활성을 증강하여, Aβ와의 증가된 연관을 야기함으로써 소교세포 활성에 영향을 준다는 것을 암시한다. 중요하게는, 일부 구체예에서, Hoechst로 핵 염색을 이용하여 CA1 세포 층의 두께를 계측함으로써 뉴런 상실의 증거가 발견되지 않았다. 평균 CA1 용적은 EYFP 및 40-Hz 자극 군 사이에 유의미하게 상이하지 않았다.
도면 37A는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre의 해마 CA1 영역에서 Hoechst를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 37B는 일부 구체예에 따라서, EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 5XFAD/PV-Cre의 추정된 CA1 두께를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐, "n.s."는 스튜던트 t 검증에 의해 유의하지 않음을 지시한다).
그 다음, AAV-DIO-ChR2-EYFP로 감염되고 40-Hz FS-PV+ 자극 (TREAT) 또는 대조 자극 (CTRL)으로 자극된 5XFAD 생쥐에서 차별적 유전자 발현이 일부 구체예에 따라서, 1 시간의 자극 후 해마 CA1의 유전체-너비 RNA-seq에 의해 사정되었다. 도면 38A는 일부 구체예에 따라서, 처리 (TREAT) 또는 대조 (CTRL) 시에 해마 CA1의 유전체-너비 RNA-seq에 의해 결정된 523개의 차별적으로 발현된 유전자 (DEGs)를 전시하는 히트맵이다. 도면 38A에서 각 열은 DEG를 나타내고, 그리고 도면 38A에서 칼럼은 3마리 개별 대조 동물 및 3마리 개별 처리된 (40-Hz FS=PV+ 자극된) 동물의 전사체학적 프로필을 나타낸다.
도면 38B는 일부 구체예에 따라서, 도면 38A에서 처리 조건에서 상향조절된 DEGs 사이에 중복을 도해하는 차트이다. 도면 38B에서, FS-PV+ 40-Hz 자극을 통한 감마 진동의 유도는 면역형광에 의해 계측될 때, 무작위 FS-PV+ 자극과 비교하여 Iba1 수준을 감소시킨다 (n = 군마다 3마리 생쥐, p = 0.006). 도면 38B는 처리 조건에서 상향조절된 유전자가 항염증성 소교세포 활성화에 의해 상향조절된 소교세포 유전자 (즉, MCSF 유전자)와 유의미하게 및 특이적으로 중복된다는 것을 보여준다. 유전자는 별아교세포, 내피 세포, 수초성 희소돌기아교세포 (MOs), 뉴런, 새로 형성된 희소돌기아교세포 (NFOs) 및 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)에서보다 더욱 큰 정도로 소교세포에서 상향조절되었다. 표 5 (아래)는 상향조절된 유전자에 대한 소교세포/대식세포 경로를 제시한다.
| 섭동된 전사체의 명칭 | NES | 명목상 p -값 | FDR q -값 |
| MCSF 처리된 소교세포 | 1.76 | 0.000 | 0.000 |
| IL34 처리된 소교세포 | 1.59 | 0.000 | 0.000 |
| GMCSF 처리된 소교세포 | 1.49 | 0.005 | 0.004 |
| LPS&IFNg 처리된 대식세포 (M1) | 1.18 | 0.122 | 0.081 |
| IL4 처리된 대식세포 (M2) | -1.2 | 0.101 | 0.147 |
일부 구체예에 따라, RNA-seq 데이터 세트로부터 특정한 유전자 표적을 실증하기 위해 RT-qPCR이 수행되었다. 도면 39는 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 RNA-seq 데이터 세트에서 특이적 유전자 표적의 RT-qPCR 실증을 묘사하는 막대 그래프이다. 특히, 도면 39는 유전자 CSF1, CSF1R, ll-6, ll1-베타, CD11-b, CYBA, Hmox1, H2-K1, Lgals3 및 Icam1을 비롯하여, 대조 및 처리된 조건에서 특정한 유전자 표적의 배수적 변화 (GAPDH에 정규화된)를 보여준다.도면 40은 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 상향조절된 유전자가 관련되는 생물학적 과정을 도해하는 플롯이다. 중요하게는, 도면 40에서 상향조절된 유전자는 면역-관련된 과정과 특이적으로 연관된다. 상향조절된 유전자는 림프구-매개된 과정, 적응성 면역 과정 및 면역글로불린-매개된 과정을 비롯한 면역-관련된 생물학적 과정에 속하였다. 도면 41은 일부 구체예에 따라서, 도면 38A의 하향조절된 유전자가 관련되는 생물학적 과정을 도해하는 플롯이다. 하향조절된 유전자는 도면 41에서 보여 지는 바와 같이, 세포 운동, 세포-세포 신호전달, 시냅스 전달, 운동 행동 및 뉴런 돌출을 비롯한 생물학적 과정에 속하였다.
도면 42A는 일부 구체예에 따라서, 개체의 해마의 CA1 영역의 상이한 유형의 자극 이후에, Iba1의 수준을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 도면 42B는 일부 구체예에 따라서, 도면 42A에서 면역형광 이미지에 대한 평균 강도 값을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 42A는 엔도솜 수준이 감마 리듬의 광유전학적 증강에 의해 감소된다는 것을 보여준다. FSPV+ 40-Hz 자극을 통한 감마 진동의 유도는 면역형광에 의해 계측될 때 EEA1 (엔도솜에 대한 마커)의 수준을 감소시켰다 (n = 군마다 3마리 생쥐, p = 0.08). 이들 결과는 증가된 엔도솜 수준이 증가된 APP 처리 및 이런 이유로, Aβ 생산을 지시하기 때문에, 감마 진동이 AD 생쥐 모형에서 Aβ 생산을 감소시킨다는 것을 보여주었다.
종합하면, 상기 연구의 결과는 감마 리듬의 수복 또는 유도가 AD의 생쥐 모형에서 분자 병리를 회복시킨다는 것을 보여주었다. 광유전학 기술을 통한 감마 진동의 세포 유형 특이적 및 일시적으로 정밀한 재도입은 응집하면 AD 신경병리에 관련된 많은 변성 연쇄 반응을 개시하는 펩티드인 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 산출을 감소시킬 뿐만 아니라 소실을 증강하였다. 게다가, 이러한 처리는 항염증성 소교세포 신호전달 경로를 유도하고, 신경변성에 연결된 면역 기전을 상쇄시켰다.
일부 구체예에 따라, 세포 유형 특이적 및 일시적으로 제어된 감마 진동은 광유전학 기술 없이 해마, 시각 피질, 배럴 피질 및/또는 청각 피질에서 유도될 수 있다.
감마 주파수에서 시각 자극은 시각 피질에서 감마 진동을
비침습성으로
주동하였다.
40 Hz에서 광유전학적 자극에 의한 Aβ 수준의 심대한 감소는 이러한 효과가 광유전학적 조작 또는 침습성 시술에 어떻게 해서든 특이적이지 않도록 담보하기 위해, 뇌에서 40-Hz 진동을 유도하는 다른 방식을 탐구하도록 야기하였다. 광 깜박거림이 시각 피질에서 40-Hz 진동을 유도하는 비침습성 접근법으로서 이용될 수 있는 지를 조사하기 위해, 일부 구체예에서, 동물은 어둠의 기간이 끼워 넣어진, 40 Hz 또는 무작위 깜박거림 및 연속광의 기간에 노출되었다.
도면 43A는 일부 구체예에 따라서, 광 플리커 자극에 노출된 생쥐를 도해하는 계통도이다. 이러한 광 깜박거림이 Aβ를 변화시키는 지를 결정하기 위해, 이들 동물은 본원에서 설명된 바와 같이 Aβ를 감소시키는 광유전학적 자극의 지속 기간과 일치하는 1 시간 동안 40-Hz 광 깜박거림에 노출되었다. 광 깜박거림은 동물의 전체 시계를 커버하였다. 분자 및 세포 검정에 대한 대조로서, 3-개월령 5XFAD 생쥐는 3 일 동안 일정한 어둠에서 유지되거나, 또는 일정한 광 또는 20-Hz 깜박거리는 불빛, 또는 80-Hz 깜박거리는 불빛으로 1 시간 동안 처리되었다 (가령, 도면 43A를 참조한다).
도면 43B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 이전 및 동안 시각 피질에서 지역장 전위 트레이스, 그리고 파워 스펙트럼 밀도의 플롯을 포함한다. 파워 스펙트럼 밀도의 평균 (실선) 및 표준 편차 (음영된 구역)는 시각 피질에서 40-Hz 광 플리커 4302, 무작위 광 플리커 4304, 또는 어둠 4306 동안 표시된다 (n = 5 기록 세션으로부터 4 5FXFAD 생쥐). 도면 43C-43F는 일부 구체예에 따라서, 각 생쥐에 대한 각 기록 세션에 대해 각각, 40-Hz 광 플리커, 무작위 광 플리커, 일정한 어둠 및 일정한 광 동안 시각 피질에서 지역장 전위의 파워 스펙트럼 밀도를 묘사하는 플롯이다 (n = 47, 51, 61, 49, 16 40-Hz 플리커, 47, 50, 64, 50, 16 무작위 플리커, 279, 302, 382, 294, 93 어둠 및 47, 50, 64, 49, 15 광 기간을 갖는 4마리 5XFAD 생쥐로부터 5 기록). 시각 피질에서, 40 Hz에서 광 깜박거림은 40 Hz에서 LFPs에서 파워를 증가시키고 (가령, 도면 43B 및 43C를 참조한다), 반면 무작위 간격 광 깜박거림 및 어둠은 그렇지 않은 (가령, 도면 43B, 43D 및 43E를 참조한다) 것으로 밝혀졌다.
도면 44A는 일부 구체예에 따라서, 4 주기의 40-Hz 광 플리커 및 동등한 기간의 무작위 광 플리커에 대한 시간의 함수로서 시각 피질에서 스파이크의 분율을 묘사하는 일련의 히스토그램이다. 도면 44A는 4 주기의 40-Hz 광 플리커 4402 또는 동등한 기간의 무작위 광 플리커 4404에 대한 시간의 함수로서 시각 피질에서 스파이크의 분율의 히스토그램을 도해한다 (n = 5 기록 세션으로부터 4마리 5XFAD 생쥐, 막대는 평균을 지시하고, 그리고 오차 막대는 동물을 교차하여 SEM을 지시한다). 위쪽 막대는 광이 켜져 있을 때 4406 또는 꺼져 있을 때 4408를 지시한다. 일부 구체예에서, 광이 켜지고 꺼짐에 따라서 스파이킹이 증가하고 감소하여, 40-Hz 자극 (도면 44A에서 히스토그램 4402) 동안 40-Hz 주파수에 잠금된 스파이킹 시기를 유발하지만, 무작위 자극 동안에는 어떤 명백한 주파수도 부상하지 않았다 (도면 44A에서 히스토그램 4404).
도면 44B는 일부 구체예에 따라서, 광 플리커 동안 뇌 위에서 기록된 지역장 전위의 일련의 전기 트레이스이다. 일부 구체예에서, 뇌 바로 위에 식염수로부터 기록될 때, 40-Hz 플리커 동안 40 Hz 파워에서 어떤 증가도 발견되지 않았는데, 이것은 이러한 효과가 광전 효과 또는 전기 잡음에 기인하지 않았다는 것을 증명한다 (가령, 도면 32 및 44B를 참조한다). 광유전학적 자극에서처럼, 무작위 플리커는 광 플리커로 인한 활성에서 전반적인 변화에 대한 대조를 제공하였다.
도면 45A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 및 무작위 광 플리커 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다 (n = 4마리 5XFAD 생쥐에서 5 기록 세션으로부터 226 자극 기간). 도면 45B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커, 무작위 광 플리커, 어둠 및 광 기간 동안 시각 피질에서 멀티유닛 점화율을 도해하는 플롯이다. 도면 45B는 시각 피질에서 멀티유닛 점화율을 도해한다. 상자 및 위스커 플롯은 중앙 (상자에서 백색 라인) 및 사분위수 (상자의 위쪽 및 아래쪽)를 보여준다. 모든 동물에서 40-Hz 플리커 및 무작위 플리커 조건 사이에 점화율은 유의미하게 상이하지 않았는데, 이것은 무작위 자극 조건이 스파이킹 활성에 대한 대조로서 역할을 한다는 것을 보여준다 (4마리 5XFAD 생쥐로부터 5 기록 세션 각각에 대한 순위 합계 검증, p > 0.06, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 기록마다 47, 51, 64, 49,16 40-Hz 플리커 기간 및 47, 50, 64, 50, 16 무작위 플리커 기간). 40-Hz 플리커 및 광 조건 사이에 점화율에서 어떤 유의미한 차이도 없었는데, 이것은 40-Hz 광 플리커가 일반적으로 뉴런 과흥분성을 유발하지 않는다는 것을 지시하였다 (4마리 5XFAD 생쥐로부터 5 기록 세션 각각에 대한 순위 합계 검증, 4 기록 세션의 경우 p > 0.2, 1 기록 세션의 경우 p < 0.01, 이것은 다중 비교를 수행하기 위해 교정될 때 유의미하지 않다, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 기록마다 47, 51, 64, 49, 16 40 Hz 기간 및 47, 50, 64, 49, 16 광 기간). 한 세션에서, 어둠 조건에서보다 40-Hz 자극에서 더욱 많은 활성이 있었다. 40 Hz 및 무작위 플리커 기간 사이에 멀티유닛 점화율에서 차이는 제로에 근접하는 경향이 있었다 (가령, 45A를 참조한다); 그리고 동물 내에서 이들 기간을 비교할 때, 어떤 유의미한 차이도 발견되지 않았다 (가령, 도면 45B를 참조한다, 4마리 5XFAD 생쥐로부터 5 기록 세션 각각에 대한 순위 합계 검증, p > 0.06, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 기록마다 47, 51, 64, 49, 16 감마 플리커 기간 및 47, 50, 64, 50, 16 무작위 플리커 기간).
감마 주파수에서 시각 자극은 시각 피질에서 Aβ 수준을 감소시켰다.
광유전학적 방법의 효력을 고려하여, 번역, 비침습성 아밀로이드 감소 처리가 설계되었다. 도면 46A는 일부 구체예에 따라서, 실험적 패러다임을 도해하는 계통도이다. 도면 46A에서 보여 지는 바와 같이, AD 모형 생쥐의 첫 번째 부분집합은 40-Hz 섬광등이 있는 첫 번째 챔버 4600에서 배치되었고, 그리고 AD 모형 생쥐의 두 번째 부분집합은 어둡게 유지된 두 번째 챔버 4602에서 배치되었다. 첫 번째 챔버 4600에서 동물은 약 1 시간 동안 40-Hz 섬광등에 노출되었다.
도면 46B 및 46C는 일부 구체예에 따라서, 도면 46A에서 실험적 패러다임에 따라서, Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 각각의 기준선 수준에서 변화를 더욱 도해하는 플롯이다. 도면 46B는 5XFAD 생쥐의 시각 피질 V1에서 40-Hz 광 노출이 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 유의미하게 감소시켰다는 것을 보여준다. Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 수준은 pg/mL (n = 군마다 6마리 동물)로서 표시된다.
40-Hz 광 플리커가 일차 시각 피질에서 40-Hz 진동을 주동하고 40-Hz 진동의 광유전학적 유도가 해마 Aβ 수준을 감소시킨 점을 고려하면, 목적은 40-Hz 광 플리커가 시각 피질에서 Aβ 수준을 감소시킬 수 있는 지를 결정하는 것이었다. 이들 실험을 위해, 일부 구체예에서, 증상전 3-개월령 5XFAD 생쥐가 이용되었다. 이들 생쥐는 어두운 상자에서 배치되고, 그리고 1 시간 동안 40-Hz 광 플리커, 일정한 점등 (광), 또는 일정한 소등 (어둠)에 노출되었다.
도면 47A 및 47B는 일부 구체예에 따라서, 어둠, 광, 40-Hz 플리커, 20-Hz 플리커, 80Hz 플리커, 피크로톡신 (PTX)과 함께 40-Hz 플리커 및 무작위 플리커 조건에서 5XFAD 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 각각의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 어둠의 경우 군마다 12마리 생쥐; n = 광, 40Hz 플리커, 20Hz 플리커, 80Hz 플리커 및 PTX의 경우 군마다 6마리 생쥐; n = 무작위 플리커의 경우 군마다 4마리 생쥐; "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, 1개 별표는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고, 2개 별표는 p < 0.01을 지시한다). 도면 47A 및 47B는 평균 및 SEM을 보여준다. 막대 그래프에서 막대에 중첩된 원은 각 군에서 개별 데이터 포인트를 지시한다. 광 노출 후 1 시간 이후에, 시각 피질에서 Aβ1 -40 수준은 어둠 조건과 비교하여 57.96% 감소되고 Aβ1 -42 수준은 57.97% 감소하는 것으로 관찰되었다 (Aβ ELISA에 의해 계측될 때, 가령, 도면 47A 및 47B를 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05, n = 군마다 6마리 생쥐). 광 대조와 비교하여, 아밀로이드 수준은 1 시간의 40-Hz 플리커 이후에 62.47% (Aβ1 -40) 및 68.55% (Aβ1 -42) 감소되었다 (Aβ ELISA에 의해 계측될 때, 가령, 도면 47을 참조한다, 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05, n = 군마다 6마리 생쥐). 게다가, 상기 효과는 40-Hz 플리커에 특이적이었는데, 그 이유는 20Hz, 80Hz 및 무작위 플리커 중에서 어느 것도 어둠 및 광 대조와 비교하여 Aβ 수준을 유의미하게 감소시키지 못했기 때문이다 (가령, 도면 47을 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 6마리 생쥐).
일부 구체예에서, 영역 특이성을 시험하기 위해 체성 감각 배럴 피질 (BC)에서 Aβ 수준이 조사되었고, 그리고 유의미한 차이 없음이 밝혀졌다. 도면 48A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 5XFAD 배럴 피질의 상대적 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 3마리 생쥐; "n.s."는 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하지 않음을 지시한다). 5XFAD 생쥐가 저용량 GABA-A 길항제 (피크로톡신, 0.18 mg/kg, 이것은 간질 활성을 유도하지 않는다)로 사전 처리될 때, Aβ 수준에 대한 40-Hz 플리커의 효과가 완전하게 제거되었는데, 이것은 아마도 FS-PV-개재뉴런으로부터 GABA성 신호전달이 이러한 효과에 필요하다는 것을 지시한다 (가령, 도면 47을 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 6마리 생쥐).
상기 효과가 5XFAD 생쥐에 특이적이지 않았다는 것을 증명하기 위해, 이러한 결과는 상이한 AD 모형, 2개의 가족성 AD 돌연변이를 갖는 충분히 검증된 모형인 APP/PS1 생쥐 (APP Swedish 및 PSEN1 deltaE9)에서 반복되었다. 도면 48B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 APP/PS1 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 어둠의 경우 군마다 5마리 생쥐 및 n = 40-Hz 플리커 조건의 경우 군마다 4마리 생쥐; "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, 1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05를 지시한다).
도면 48C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 WT 시각 피질에서 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42의 기준선 수준에서 변화를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 어둠의 경우 군마다 11마리 생쥐 및 n = 40-Hz 플리커 조건의 경우 군마다 9마리 생쥐; 1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05를 지시한다). 일부 구체예에서, 40-Hz 플리커 처리 이후에 APP/PS1 생쥐에서, 유의미하게 20.80% 감소된 Aβ1 -40 및 37.68% 감소된 Aβ1 -42의 경향이 밝혀졌는데, 하지만 후자는 어둠 조건과 유의미하게 상이하지 않았다 (가령, 도면 48B를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 Aβ1 - 40 p < 0.05, Aβ1 - 42 p < 0.09 - 유의미하지 않음, n = 어둠의 경우 군마다 5마리 생쥐, n = 40-Hz 플리커의 경우 군마다 4마리 생쥐). 이에 더하여 늙은 WT 생쥐에서, 1 시간 40-Hz 플리커 이후에 내인성 생쥐 Aβ1 -40에서 58.2% 감소가 밝혀졌다 (가령, 도면 48C를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05, n = 11 어둠 생쥐 및 n = 9 40-Hz 플리커 생쥐). Aβ1 -42는 이들 동물에서 플리커 및 대조군 둘 모두에 대해 검출가능한 수준 미만이었다. WT 동물에서 내인성 생쥐 Aβ1 -40의 감소는 이들 결과가 Tg APP 발현 또는 돌연변이체 APP에 한정될 수 없다는 것을 드러낸다; 오히려 이들은 발현이 내인성 프로모터에 의해 주동된 APP로부터 생산된 Aβ까지 확장될 수 있다. 도면 48A-48C는 평균 및 SEM을 보여준다.
그 다음, 일부 구체예에서, 40 Hz 광유전학적 FS-PV-개재뉴런 자극이 해마 CA1 소교세포를 변화시키는 것과 동일한 방식으로 40-Hz 플리커가 시각 피질에서 소교세포 활성을 변화시키는 지에 관한 조사가 수행되었다. 도면 49는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 5XFAD 시각 피질에서 항-Iba1 (019-19741) 및 항-Aβ 4904 (12F4) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 이미지는 40x 대물렌즈 (눈금자 = 50μm)로 촬영되었다. 오른쪽: 120X 확대; 화살표는 세포체에서 +Iba1/+Aβ 신호를 지시한다.
도면 50A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건에서 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션; "n.s."는 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하지 않음을 지시한다). 도면 50B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건에서 대조에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션; 2개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01을 지시한다). 도면 50C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건에서 대조에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션; 4개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001을 지시한다). 도면 50D는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 또한 Aβ-양성인 Iba1-양성 (소교세포) 세포체의 퍼센트를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션; 2개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01을 지시한다). 도면 50A-50D는 평균 및 SEM을 보여준다.
일부 구체예에서, Iba1이 1 시간의 40-Hz 플리커 또는 어둠 조건 후 5XFAD 생쥐의 시각 피질 섹션에서 소교세포를 표지화하는데 이용되었다 (가령, 도면 49를 참조한다). 소교세포 숫자는 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 사이에 상이하지 않았고 (가령, 도면 49 및 50A를 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션), 반면 소교세포 세포체 직경은 어둠 대조와 비교하여 시각 피질에서 40-Hz 플리커 이후에 65.8% 증가하였다 (가령, 도면 49 및 50B를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 소교세포 일차 돌기의 길이는 어둠 대조와 비교하여 40-Hz 플리커 조건에서 37.7% 감소되었다 (가령, 도면 49 및 50C를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 시각 피질에서 소교세포가 증강된 탐식 활성을 지시하는 형태를 가졌기 때문에, 일부 구체예에서, Aβ-보유 소교세포의 숫자가 조사되었다. 이러한 실험을 위해, 시각 피질 섹션은 Iba1 및 Aβ (12F4) 항체로 동시표지화되었다. 세포체에서 Aβ/Iba1 동시국지화는 40-Hz 플리커 조건에서 33.5% 증가되었는데, 이것은 40-Hz 플리커가 어둠 대조 조건보다 더욱 많은 Aβ-보유 소교세포를 유발한다는 것을 지시하였다 (가령, 도면 49 및 50D를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션).
일부 구체예에서, 소교세포에서 형태학적 변화의 더욱 우수한 분해능을 제공하기 위해, CLARITY가 시각 피질의 100 μm 섹션으로부터 소교세포의 3D 렌더링을 창출하는데 이용되었고, 그리고 비디오가 이들 렌더링으로부터 창출되었다. 도면 51은 0° 5102, X 축 주변에 45° 5104 및 Y 축 주변에 45° 5106 회전된 CLARITY-처리된 100 μm 조직 섹션으로부터 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 Iba+ 소교세포의 일련의 3D 렌더링 (면역형광 이미지로부터)이다. 이미지는 63x 대물렌즈 (눈금자 = 15μm)로 촬영되었다. 최종적으로, 소교세포가 5XFAD 생쥐에서 Aβ를 실제로 탐식한다는 것을 증명하기 위해, 5XFAD 및 WT 동물로부터 소교세포가 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 정제되었고, 그리고 Aβ 수준이 ELISA를 통해 분석되었다.
도면 52A는 일부 구체예에 따라서, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 시각 피질로부터 소교세포를 단리하는 방법을 도해하는 흐름 도표이다. 시각 피질이 절개되었고, 그리고 이후, 단일 세포가 현탁되고 CD11b 및 CD45 항체로 표지화되었다. 차후에, 세포는 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 통해 분류되고 용해되었다. Aβ1 -40 수준은 ELISA에 의해 분석되었다. 도면 52B는 일부 구체예에 따라서, 도면 52A의 방법을 이용하여 3-개월령 5XFAD 및 WT 대조 동물의 시각 피질로부터 단리된 소교세포에서 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 5XFAD의 경우 군마다 8마리 생쥐 및 n = WT 생쥐의 경우 군마다 4마리 생쥐; 1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05를 지시한다). 막대 그래프에서 막대에 중첩된 원은 각 군에서 개별 데이터 포인트를 지시한다.
도면 53A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 3-개월령 5XFAD 시각 피질에서 시냅토피신을 검출하기 위한 SVP38 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 이미지는 40x 대물렌즈 (눈금자 = 50μm)로 촬영되었다. 오른쪽: 100X의 어둠 및 40-Hz 플리커 조건. 도면 53B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40 Hz 플리커 조건 후 5XFAD 시각 피질의 상대적 SVP38 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐; "n.s."는 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하지 않음을 지시한다).
Aβ의 소교세포-특이적 수준은 5XFAD 생쥐에서 27.2 pg/104 소교세포 및 WT 대조 생쥐에서 9.78 pg/104 소교세포에서 수준으로 WT 대조보다 5XFAD 동물에서 훨씬 높은 것으로 밝혀졌다 (가령, 도면 52A 및 52B를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05, n = 5XFAD의 경우 8 및 n = WT 생쥐의 경우 4). Aβ1 -42는 이들 동물에서 플리커 및 대조군 둘 모두에 대해 검출가능한 수준 미만이었다. 전반적으로, 40-Hz 자극에 의해 유도된 시각 피질에서 소교세포의 형질전환은 해마 CA1에서 일어나는 것과 유사한 것으로 나타났다. 추가적으로, 시냅토피신 수준이 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 사이에서 변하지 않았는데, 이것은 소교세포 활성화가 시냅스의 탐식을 유의미하게 증가시키지 않았다는 것을 지시한다 (가령, 도면 53A 및 53B를 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션). 종합하면, 본원에서 개시된 데이터는 감각 자극을 통해 비침습성으로 유도된 40-Hz 진동이 AD 생쥐 모형에서 Aβ 존재비를 효과적으로 감소시키고 소교세포 / Aβ 상호작용을 증진할 수 있다는 것을 증명한다. 게다가 40-Hz 자극은 2개의 상이한 뇌 회로에서 Aβ를 감소시킬 수 있는데, 이것은 감마 진동이 아밀로이드 존재비를 감소시키고 다양한 뇌 영역에서 소교세포 식균작용을 증강하는 일반적인 기전을 암시한다.
추가 실험에서, Aβ1 -42 수준은 어둠 (광 없음), 20-Hz 섬광등, 40-Hz 섬광등, 또는 80-Hz 섬광등에 1 시간의 노출 이후에 사정되었는데, 여기서 20 Hz 및 80 Hz는 40 Hz의 고조파이다. 하지만, 단지 40-Hz 섬광 광 플리커만 Aβ1 -42 수준을 유의미하게 감소시켰다. 도면 54A는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 시각 피질의 자극 이후에 Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42에서 감소를 도해하는 막대 그래프이다.
Aβ1 -42 수준의 감소의 타이밍을 사정하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 1 시간 동안, 생쥐는 광 없음 또는 40-Hz 섬광등에 노출되었다. Aβ1 -42 수준은 1 시간의 처리 이후에 및 처리 완결 후 24 시간에 다시 한 번 결정되었다. 도면 54B는 일부 구체예에 따라서, 감마 진동으로 개체의 시각 피질의 자극 후 및 상기 자극 후 24 시간에 다시 한 번, Aβ 펩티드 동종형 Aβ1 -42의 수준을 도해하는 막대 그래프이다. 비록 Aβ 수준이 처리 후 24 시간에 감소된 상태로 남아있긴 했지만, 이러한 감소는 처리 직후보다 작았다.
감마 주파수에서 시각 자극은 해마에서 Aβ 수준에 영향을 주지 않았다.
광 플리커에 의한 시각 자극이 AD에 연루된 뇌 회로에 영향을 줄 수 있었는 지를 결정하기 위해, 일부 구체예에서, 인간에서 AD의 코스에서 초기에 영향을 받는 뇌 영역 중에서 하나인 해마에 대한 광 플리커의 효과가 조사되었다. 도면 55A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 5502 이전 및 동안 해마에서 지역장 전위의 전기 트레이스, 그리고 파워 스펙트럼 밀도의 플롯을 포함한다. CA1에서 어둠 5504, 40-Hz 광 플리커 5506 및 무작위 광 플리커 5508 동안 파워 스펙트럼 밀도의 평균 (실선) 및 표준 편차 (음영된 구역) (n = 2마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐).
도면 55B는 일부 구체예에 따라서, 4 주기의 40-Hz 광 플리커 5510 및 동등한 기간의 무작위 광 플리커 5512 각각에 대한 시간의 함수로서 해마에서 스파이크의 분율의 일련의 히스토그램이다 (n = 2마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐, 막대는 평균을 지시하고, 그리고 오차 막대는 동물을 교차하여 SEM을 지시한다). 위쪽 막대는 광이 켜져 있을 때 (흰색) 또는 꺼져 있을 때 (검은색)를 지시한다. 무작위 자극의 경우에, 스파이킹이 점등의 시작에 맞춰 정렬되었고, 광을 이용한 부가 기간이 회색에 의해 지시된 무작위 간격에서 일어났다. 시각 피질에서 본원에서 개시된 바와 같이 CA1에서 광 플리커의 효과를 조사하기 위한 동일한 접근법을 이용하여, 40 Hz에서 광 깜박거림은 40 Hz에서 기록된 LFPs에서 파워를 증가시키고 (가령, 도면 55A 및 도면 55B에서 그래프 5510을 참조한다), 반면 무작위 간격 광 깜박거림 (무작위 플리커) 및 어둠은 그렇지 않은 (가령, 도면 50D 및 도면 43C에서 그래프 4310을 참조한다) 것으로 밝혀졌다. 스파이킹은 또한, 40 H 자극 동안 40-Hz 플리커 주파수에 의해 변조되었지만, 이러한 변조는 시각 피질에서보다 작은 것으로 나타났다 (가령, 도면 55B, 해마 , 도면 44A, 시각 피질을 참조한다).
도면 56A는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 및 무작위 광 플리커 사이에 점화율에서 차이를 도해하는 히스토그램이다 (아래쪽 n = 2마리 5XFAD 및 3마리 WT 생쥐에서 5 기록 세션으로부터 168 자극 기간). 도면 56B는 일부 구체예에 따라서, 40-Hz 광 플리커 5604, 무작위 광 플리커 5605, 어둠 5602, 또는 광 5608 기간 동안 CA1에서 멀티유닛 점화율을 도해하는 플롯이다. 상자 및 위스커 플롯은 중앙 (상자에서 백색 라인) 및 사분위수 (상자의 위쪽 및 아래쪽)를 보여준다. 모든 동물에서 40-Hz 플리커 및 무작위 플리커 조건 사이에 점화율은 유의미하게 상이하지 않았는데, 이것은 무작위 자극 조건이 스파이킹 활성에 대한 대조로서 역할을 한다는 것을 보여준다 (2마리 5XFAD 및 3마리 WT 동물로부터 5 기록 각각에 대한 순위 합계 검증, p > 0.2, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 기록마다 22, 54, 42, 71, 55 40-Hz 플리커 기간 및 12, 34, 32, 54, 36 무작위 플리커 기간). 40-Hz 플리커 및 광 조건 사이에 점화율에서 어떤 유의미한 차이도 없었는데, 이것은 40-Hz 광 플리커가 일반적으로 뉴런 과다흥분성을 유발하지 않는다는 것을 지시하였다 (2마리 5XFAD 및 3마리 WT 동물로부터 5 기록 각각에 대한 순위 합계 검증, p > 0.3, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 기록마다 22, 54, 42, 71, 55 40 Hz 기간 및 12, 34, 33, 54, 35 광 기간).
시각 피질에서처럼, 40 Hz 및 무작위 플리커 기간 사이에 멀티유닛 점화율에서 차이는 제로에 근접하는 경향이 있었다 (가령, 도면 56A를 참조한다); 그리고 동물 내에서 이들 기간을 비교할 때, 어떤 유의미한 차이도 발견되지 않았다 (가령, 도면 56B를 참조한다, 4마리 5XFAD 생쥐로부터 5 기록 세션 각각에 대한 순위 합계 검증, p > 0.06, 도면에서 도시된 중앙 및 사분위수, n = 기록마다 22, 54, 42, 71, 55 40-Hz 플리커 기간 및 12, 34, 32, 54, 36 무작위 플리커 기간).
일부 구체예에서, 해마에서 Aβ의 수준에 대한 시각 광 플리커의 효과가 시각 피질에서 이용된 동일한 접근법을 이용하여 조사되었다. 일부 구체예에 따라서, 도면 57A는 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 묘사하는 막대 그래프이고, 그리고 도면 57B는 5XFAD 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -42 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 4마리 생쥐; "n.s."는 유의미하지 않음을 지시한다). 시각 피질에서 관찰된 것과 대조적으로, CA1에서 40-Hz 플리커 또는 무작위 자극 후 1 시간에 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준에서 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 40-Hz 플리커 또는 무작위 플리커 이후에 Aβ 수준은 어둠 조건과 유의미하게 상이하지 않았다: Aβ1-40 수준은 40 Hz 및 무작위 플리커 이후에 각각, 어둠 조건의 108.4% 및 96.82%이었고, 그리고 Aβ1 -42 수준은 40Hz 및 무작위 플리커 이후에 각각, 어둠 조건의 118.8% 및 92.15%이었다 (가령, 도면 57A 및 57B를 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 4마리 생쥐). 따라서, 1 시간의 40-Hz 광 플리커는 해마에서 Aβ의 수준을 유의미하게 감소시키지 않았다.
감마 주파수에서 장기 시각 자극은 시각 피질에서 플라크 부하를 감소시키지 않았다.
40-Hz 진동이 광유전학적으로 또는 광 플리커를 통한 시각 자극에 의해 주동될 때, 프리-플라크 5XFAD 생쥐에서 영향을 받은 아밀로이드 존재비가 조사되고 본원에서 개시되었다. 그 다음, 목적은 이러한 처리가 플라크 부하를 이미 보여주는 동물에서 효과적인 지를 결정하는 것이었다. 이를 위해, 일부 구체예에서, 6-개월령 5XFAD 생쥐가 이용되었는데, 그 이유는 이들이 시각 피질을 비롯한 많은 뇌 영역에서 광범위한 아밀로이드판 병리가 발달하기 때문이다. 비침습성 감마 자극 이후에, 진행된 Aβ-관련된 병리에 무엇이 발생하는 지를 알아보기 위한 시험이 수행되었다. 1 시간의 40-Hz 플리커에 대한 응답으로 Aβ 감소의 지속 기간을 조사하기 위해, 일부 구체예에서, Aβ 수준이 1 시간의 40-Hz 플리커 또는 어둠 조건 후 4, 12 및 24 시간에 시각 피질에서 계측되었다.
도면 58A 및 58B는 일부 구체예에 따라서, 1 시간의 어둠 또는 40-Hz 플리커 처리 이후에 1, 4, 12 및 24 시간에 5XFAD 시각 피질의 상대적 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 각각 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 4 및 12 시간 대기의 경우 군마다 4마리 생쥐, n = 1 및 24 시간 대기의 경우 6, n = 어둠의 경우 12; "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, 1개 별표는 일원 변량분석 (ANOVA)에 의해 p < 0.05를 지시하고, 2개 별표는 p < 0.01을 지시한다). 이들 결과는 4 시간 후, Aβ1 -40 수준이 어둠 대조와 비교하여 63.4% 감소되고 Aβ1 -42 수준이 63.2% 감소된다는 것을 보여주었다 (가령, 도면 58을 참조한다, p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐). 12 시간까지, Aβ1 -40 수준은 50.9% 감소되었고, 반면 Aβ1 -42 수준은 어둠 대조와 유의미하게 상이하지 않았다 (가령, 도면 58을 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, p < 0.01, n = 군마다 4마리 생쥐). 최종적으로, 1 시간의 40-Hz 플리커 처리 이후에 24 시간에, 가용성 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준은 어둠 대조 조건과 비교하여 40-Hz 플리커에서 유의미하게 상이하지 않았다 (가령, 도면 58을 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 24 시간의 경우 군마다 6마리 생쥐 및 n = 어둠의 경우 군마다 4마리 생쥐). 이들 결과는 40-Hz 플리커 처리의 효과가 일시적이라는 것을 지시한다.
이런 이유로, 진행된 플라크 병리를 붕괴시키기 위해, 일부 구체예에서, 생쥐는 7 일 동안 매일 1 시간 동안 40-Hz 플리커로, 또는 대조의 경우, 어둠 조건으로 처리되었다. 도면 59A는 일부 구체예에 따라서, 7 일 동안 하루에 1 시간의 플리커에 노출된 6-개월령 생쥐를 묘사하는 계통도이다. 도면 59B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -42 수준을 도해하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 13마리 생쥐, 2개 별표는 p < 0.01을 지시하고, 3개 별표는 p < 0.001을 지시한다, 스튜던트 t 검증). 도면 59C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 상대적 Aβ1 -40 수준을 도해하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 13마리 생쥐, 1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01을 지시하고, 2개 별표는 p < 0.01을 지시한다). 도면 59B 및 59C는 평균 및 SEM을 보여준다. 막대 그래프에서 막대에 중첩된 원은 각 군에서 개별 데이터 포인트를 지시한다.
7-일 기간의 종결 시점에서, 시각 피질이 ELISA 및 면역염색에 의해 분석되었다. 일부 구체예에서, 상기 조직은 PBS 가용성 Aβ 분획물을 추출하기 위해 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 용해되고, 그리고 7 일의 1 시간 40-Hz 플리커가 ELISA에 의해 계측될 때, 6-개월령 5XFAD 생쥐에서 가용성 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 수준을 각각 60.5% 및 51.7% 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (가령, 도면 59B 및 59C를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05 및 p < 0.01, n = 군마다 13마리 생쥐). 조직은 불용성 Aβ1 -40 및 Aβ1 -42 분획물을 추출하기 위해 구아니딘 염화수소산 (HCl)으로 더욱 처리되었는데, 상기 분획물은 응집된 아밀로이드판을 구성한다. 불용성 Aβ1-40 및 Aβ1 -42 수준은 각각 43.7% 및 57.9% 감소되었는데, 이것은 40-Hz 플리커가 6-개월령 생쥐에서 이미 형성된 불용성 Aβ 응집체를 붕괴시킨다는 것을 지시하였다 (가령, 도면 59B 및 59C를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01 및 p < 0.001, n = 군마다 13마리 생쥐).
플라크 부하가 어떻게 특이적으로 영향을 받았는 지를 결정하기 위해, 일부 구체예에서, Aβ 항체 (Cell Signaling Technology; D54D2)를 이용한 면역조직화학 특징화가 수행되었다. 도면 60A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 (위쪽) 또는 40-Hz 플리커 (아래쪽) 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 항-Aβ (D5452) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (눈금자 = 50 μm). 세포내에서 나타나는 Aβ 신호는 배제되었다. 도면 60B는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 Aβ-양성 플라크 침착물의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐, 3개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.001을 지시한다). 도면 60C는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD 생쥐의 시각 피질에서 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 Aβ-양성 플라크의 구역을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; 2개 별표는 만 휘트니 검증에 의해 p < 0.01을 지시한다). 도면 60B 및 60C는 평균 및 SEM을 보여준다.
플라크 존재비는 직경에서 약 10 μm보다 크거나 또는 이와 동등한 Aβ+ 침착물의 숫자를 계수함으로써 정량되었다. 40-Hz 플리커는 플라크 숫자를 어둠 대조에서 33.5와 비교하여 11.0까지 감소시켰다 (가령, 도면 60A 및 60B를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01, n = 군마다 8마리 생쥐). 이에 더하여, 1 주의 40-Hz 플리커 처리 후 플라크 크기 (조밀한 플라크 영역의 면적으로서 계측됨)는 어둠 대조와 비교하여 거의 63.7% 감소하였다 (가령, 도면 60A 및 60C를 참조한다, 만 휘트니 검증에 의해 p < 0.01, n = 군마다 8마리 생쥐). 종합하면, 이들 실험은 아밀로이드판 병리에 대한 심대한 효과를 갖는 완전하게 비침습성 치료법을 확인하였다.
40-Hz 플리커가 다른 핵심 AD-관련된 병리를 향상시키는 지를 결정하기 위해, TauP301S 타우병증 생쥐 모형을 이용하여 타우 인산화가 조사되었다. 4-개월령 TauP301S Tg 생쥐 (이들은 이러한 연령에서 세포체에 국부화된 인산화된 타우를 보여준다)는 7 일 동안 매일 1 시간 동안 40-Hz 플리커 또는 어둠 대조 조건으로 처리되었다. 40-Hz 플리커가 타우 인산화를 어떻게 변화시키는 지를 조사하기 위해, pTau의 3개의 상이한 에피토프에 대한 pTau 항체 (S202, S396 및 S400/T403/S404; 11834S, 9632S, 11837S) 및 대조로서 수지상 마커 MAP2를 이용하여 시각 피질의 면역조직화학 특징화가 수행되었다.
도면 61A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 또는 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6102 (S202) 및 항-MAP2 6104 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 이미지는 40x 대물렌즈 (눈금자 = 50μm)로 촬영되었다; 삽도는 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 대표적인 세포체의 100X 렌더링을 포함한다). 도면 61B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S202) 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; 1개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.05를 지시한다). 도면 61C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 MAP2 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; "n.s."는 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하지 않음을 지시한다). 도면 61B 및 61C는 평균 및 SEM을 보여준다.
도면 62A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6202(S404) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (눈금자 = 50 μm). 도면 62B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S400/T403/S404) 형광 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; 2개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01을 지시한다). 도면 62B는 평균 및 SEM을 보여준다.
도면 63A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-pTau 6302 (S396) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다 (눈금자 = 50 μm). 도면 63B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 P301S 시각 피질의 상대적 pTau (S396) 형광 강도 수준을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; 4개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001을 지시한다).
이들 결과는 pTau(S202)의 신호 강도가 어둠 대조와 비교하여 40-Hz 플리커 조건에서 41.2% 감소되고 pTau(S400/T403/S404)의 신호 강도가 42.3% 감소되고 (가령, 도면 61A-B, 62A-B를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.01, n = 군마다 8마리 생쥐로부터 2개 섹션), 반면 MAP2 수준은 변화가 없다는 (가령, 도면 61A 및 61C를 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 4마리 생쥐로부터 2개 섹션) 것을 보여주었다. pTau에 대한 항체 (S396)로 염색은 동일한 방향에서 경향을 보여주었다: 40-Hz 플리커는 어둠 대조와 비교하여 pTau (S396) 수준을 14.4% 감소시켰다 (가령, 도면 63A-B를 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 8마리 생쥐로부터 2개 섹션). 게다가, 어둠 대조와 비교하여 40-Hz 플리커에 대한 응답으로 pTau 신호의 더욱 적은 점상 및 세포체 국부화가 관찰되었다. 비록 타우 인산화에서 유의미한 변화가 목격되긴 했지만, 40-Hz 플리커 처리된 군 및 어둠 대조군 사이에 불용성 타우의 수준에서 어떤 식별가능한 차이도 관찰되지 않았다.
TauP301S 생쥐 모형에서 소교세포에서 40-Hz 플리커의 결과가 평가되었다. 도면 64는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 4-개월령 P301S 생쥐에서 항-Iba1 (019-19741) 항체를 이용한 면역조직화학을 도해하는 일련의 면역형광 이미지이다. 이미지는 40x 대물렌즈 (눈금자 = 50μm)로 촬영되었다; 삽도는 EYFP 및 40-Hz 자극 조건에서 대표적인 소교세포의 100X 렌더링을 포함한다.
도면 65A는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 소교세포의 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; "n.s."는 스튜던트 t 검증에 의해 유의미하지 않음을 지시한다). 도면 65B는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 대조에 정규화된 소교세포 세포체의 직경을 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; 4개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001을 지시한다). 도면 65C는 일부 구체예에 따라서, 어둠 및 40-Hz 플리커 조건 하에 1 시간/일의 7 일 후 대조에 정규화된 소교세포 일차 돌기의 평균 길이를 묘사하는 막대 그래프이다 (n = 군마다 8마리 생쥐; 4개 별표는 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001을 지시한다).
일부 구체예에서, TauP301S 생쥐의 시각 피질 섹션에서 항-Iba1 항체를 갖는 소교세포는 매일 1 시간 40-Hz 플리커 또는 어둠 조건의 7 일 이후에 표지화되었다 (가령, 도면 64를 참조한다). 일부 구체예에서, 어둠 대조와 비교하여 40-Hz 플리커 조건에서 소교세포 숫자에서 29.50% 증가의 경향이 관찰되었는데 (가령, 도면 64 및 65A를 참조한다, "n.s."는 유의미하지 않음을 지시하고, n = 군마다 3마리 생쥐), 이것은 5XFAD 모형에서 이루어진 관찰 결과와 일치한다 (가령, 도면 50A를 참조한다). 이에 더하여, 소교세포 세포체 직경은 시각 피질에서 어둠 대조와 비교하여, 40-Hz 플리커 이후에 49.00% 증가하였다 (가령, 도면 64 및 65B를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001, n = 군마다 3마리 생쥐). 소교세포 일차 돌기의 길이는 어둠 대조와 비교하여 40-Hz 플리커 군에서 39.08% 감소되었다 (가령, 도면 64 및 65C를 참조한다, 스튜던트 t 검증에 의해 p < 0.0001, n = 군마다 3마리 생쥐).
종합하면, AD 병리의 복수 모형으로부터 및 WT 동물에서 이들 데이터는 40-Hz 진동이 Aβ 수준에서 감소에 의해 계측될 때, 아밀로이드 병리를 경감할 수 있고, 그리고 타우 인산화를 감소시킬 수 있다는 것을 증명한다. 게다가, 40 Hz 시각 플리커는 AD 병리의 아밀로이드증 및 타우병증 모형 둘 모두에서 소교세포의 상이한 형태학적 변환을 주동할 수 있다.
다른 실험에서, 늙은 생쥐 (다시 말하면, 6 개월령)의 부분집합이 7 일 동안 시각 감마 자극에 노출되었다. 나머지 생쥐는 어둠 하에 유지되었다. 도면 66은 이들 생쥐의 시각 피질에서 가용성 Aβ 펩티드 및 불용성 Aβ 펩티드 (다시 말하면, 플라크) 둘 모두의 수준을 도해하는 플롯이다. 도면 66에서 보여 지는 바와 같이, 가용성 동종형 Aβ1 -40 6600, 가용성 동종형 Aβ1 -42 6602, 불용성 동종형 Aβ1 -40 6604 및 불용성 동종형 Aβ1 -42 6606 각각의 수준은 시각 감마 자극에 노출된 생쥐에서 현저하게 감소되었다.
도면 67A-67B는 일부 구체예에 따라서, 개체의 머리뼈경유 감마 자극이 있는 경우와 없는 경우의 Aβ 펩티드 수준을 도해하는 플롯이다. 도면 67A에서, 전뇌 Aβ 펩티드 수준은 자극 없음 6700과 동일한 수준에 머무르지만, 1 시간의 머리뼈경유 감마 자극 6702 이후에 하락하였다 (n = 군마다 1마리 동물). 도면 67B에서, 전뇌 Aβ 펩티드 수준은 일부 구체예에 따라서, 5xFAD 생쥐의 해마 6704에서 및 피질 6706에서 40z 머리뼈경유 자극 이후에 감소되었다.
감마 진동은 오랫동안, 더욱 높은 인지 기능 및 감각 반응과 연관되는 것으로 생각되었다. 일부 구체예에서, 광유전학적 방법을 이용하여 FS-PV-개재뉴런을 주동하는 것은 생쥐에서 40 Hz에서 LFPs를 증강하였다. 본원에서 개시된 바와 같이, 일부 구체예에서, 5XFAD 생쥐 모형에서 광유전학 기술 또는 비침습성 광 깜박거림 처리를 이용하여 40-Hz 진동 및 위상 잠금된 스파이킹을 주동하는 것은 최소한 2개의 상이한 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 현저한 감소를 유발하는 것으로 증명되었다. 이러한 감소는 감소된 스파이킹 활성에 기인하지 않았는데, 그 이유는 Aβ 펩티드 수준이 40-Hz 진동을 증강하지 않으면서 유사한 양의 멀티유닛 스파이킹 활성을 산출하는 무작위 자극 조건보다 40-Hz 자극에 대한 응답으로 훨씬 낮았기 때문이다. 피라미드 세포 점화율은 이들 조건 사이에서 상이할 수 있지만, FS-PV-개재뉴런 또는 다른 세포 유형의 점화는 이러한 변화를 차폐하였다. 일부 구체예에서, FS-PV-개재뉴런의 무작위 광유전학적 자극은 FS-PV-개재뉴런의 동일한 양의 직접적인 자극을 제공하지만, 아밀로이드를 감소시키지는 못하였다. 실제로, 광유전학적 확률적 자극은 아밀로이드 수준을 3배 이상 증가시키고, 반면 확률적 시각 플리커는 어떤 유의미한 변화도 발생시키지 않았는데, 이것은 무작위 자극의 일부 양상이 신경독성 효과를 갖는다는 것을 지시할 수 있다. 일부 구체예에서, 무작위 자극이 증가된 감마 파워를 유발하진 않지만, 파워에서 작은 증가의 경향이 대략 20 Hz로부터 60 Hz 이상까지 넓은 범위의 주파수에서 목격되었다. 일부 구체예에서, 20-Hz 및 80-Hz 광 플리커에서 증가된 아밀로이드 수준의 경향이 목격되었다. 종합하면, 이들 결과는 40 Hz 미만 또는 초과의 일부 주파수에서 활성을 주동하는 것이 아밀로이드 수준을 증가시킬 수 있다는 것을 암시할 수 있다. 이들 결과는 스파이킹 활성의 패턴이 분자 경로 및 질환 병리에 어떻게 영향을 주는 지를 이해해야 하는 필요성을 지적한다.
전체 아밀로이드 수준의 견실한 감소는 아마도, 감소된 EEA1/Rab5-양성 초기 엔도솜을 수반하는 감소된 아밀로이도제네시스, 그리고 소교세포에 의한 아밀로이드의 증가된 세포내섭취 둘 모두에 의해 매개된다. 중요하게는, 본원에서 개시된 유전자 세트 증폭 분석 (GSEA) 통계학적 분석 (The Broad Institute, Cambridge, Massachusetts)은 고전적 대식세포 친염증성 M1 또는 항염증성 M2 세포 상태가 40-Hz 진동에 의한 뉴런 자극 이후에 상향- 또는 하향-조절된 유전자 발현 프로필과 상관하지 않는다는 것을 보여주었다. 실제로, 친염증성 유전자 Il6 , Il1b , Itgam 및 항염증성 유전자 Igf1의 발현 수준은 자극 후 변화되지 않았다. 그 대신에, 다수의 소교세포 프로-식균 유전자뿐만 아니라 세포 부착/이주 조절인자 Spp1이 40-Hz 자극 시에 활성화되었다. 따라서, 40 Hz 감마 진동을 주동하는 것은 뉴런 및 소교세포 둘 모두를 모집함으로써 전반적인 신경보호 반응을 유도하는 것으로 보인다. GABA-A 길항제 처리가 Aβ 수준을 감소시키는 40-Hz 자극의 효과를 완전하게 제거했다는 사실은 아마도 FS-PV-개재뉴런을 수반하는 GABA성 신호전달이 이들 효과에 대해 결정적이라는 것을 강하게 암시한다. 게다가, 일부 구체예에서, 40-Hz 플리커 자극은 5XFAD 생쥐에 더하여 APP/PS1 및 WT 생쥐를 비롯한 복수 생쥐 모형에서 Aβ를 감소시켰다. 복수 생쥐 모형에서 이러한 반복은 이들 조사 결과가 하나의 동물 모형에만 특정하지 않을 수 있고, 그리고 중요하게는, APP가 이의 생리학적 프로모터에 의해 발현되고 Aβ가 WT 동물에서처럼 내인성 APP로부터 산출되는 환경까지 확장될 수 있다는 것을 보여준다. 이에 더하여, 일부 구체예에서, 40-Hz 진동은 타우병증의 생쥐 모형, TauP301S에서 pTau를 감소시키는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 감마 자극의 보호 효과가 다른 생쥐 모형뿐만 아니라 다른 병원성 단백질까지 일반화된다는 것을 보여준다. 요약하면, 본원에서 개시된 이들 조사 결과는 감마 진동에 의해 매개되는 이전에 알려지지 않은 세포 및 분자 과정을 드러내고, 그리고 뇌 감마 리듬, 소교세포 기능 및 AD-관련된 병리 사이에 기능적 결합을 확립한다. 일부 구체예에서, 감마 진동에서 결손의 조사 결과는 AD의 상이한 생쥐 모형 (hAPP 및 apoE4)에서 감마 결손의 증거와 수렴하고, 그리고 감마가 AD를 앓는 인간에서 변화된다는 것을 보고한다. Tg 및 녹인 모형을 비롯한 AD의 복수 생쥐 모형으로부터 수렴하는 증거를 모색함으로써, 이들 결과는 도입유전자의 과다발현 또는 한 모형에 특정한 다른 부작용에만 기인하지는 않는 것으로 증명될 수 있다. 종합하면, 생쥐 및 인간으로부터 이들 결과는 Aβ 병리에 기여하는 복수 분자 경로가 수렴하여 AD에서 감마 진동을 변화시킨다는 것을 보여준다. 본원에서 개시된 이들 조사 결과는 AD에 대한 신규한 치료적 개입에 대한 희망을 품게 한다.
AD 발병의 한 가지 이론은 소교세포 기능부전, 구체적으로 소교세포가 병리학적 분자를 청소하는데 실패하는 것을 질환 진행의 핵심 기전으로서 지적한다. 이런 이유로, 40-Hz 자극이 그러한 것처럼 세포내섭취 상태로 되돌아간 소교세포를 모집하는 개입은 강한 치료 잠재력을 갖는다. 본원에서 더욱 설명된 실험에서, 감마 진동을 광유전학적으로 또는 광 플리커를 통해 주동하는 것은 뉴런 과다활동을 유발하지 않았다. 이러한 접근법이 이전 AD 요법과 근본적으로 상이하기 때문에, 이런 패턴화된 신경 활성을 주동하여 내인성 수복을 촉발하는 것은 AD에 대한 신규한 치료적 접근법을 제공할 것이다.
감마 주파수에서 시각 자극은 개체 행동에 대한 긍정적인 효과를 가졌다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에게 스트레스를 유발하는 지를 조사하기 위한 연구가 수행되었다. 도면 68A는 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 68A에서 6800에서 보여 지는 바와 같이, WT 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 7 연속일, 1-7 일자 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 (N = 8) 또는 40-Hz 광 플리커 (N =8)에 노출되었다. 8 일자에, 6802에서 보여 지는 바와 같이, 혈액이 생쥐로부터 수집되었고, 그리고 코르티코스테론 수준을 조사하기 위해 혈액 혈장이 분리되었다. 생쥐에서, 코르티코스테론은 스트레스 반응에 관련된 주요 글루코코르티코이드이다.
도면 68B는 정상적인 실내전등 (NRL)에 노출된 8마리 생쥐 및 40Hz 광 플리커 (40-Hz)에 노출된 8마리 생쥐로부터 수집된 혈장에서 코르티코스테론 (CORT)의 수준 (pg/ml)을 묘사하는 막대 그래프이다. 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐에서 코르티코스테론의 어떤 증가도 관찰되지 않았다. 그 대신에, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐의 군은 대조군과 비교하여 더욱 낮은 수준의 코르티코스테론을 가졌다. 군마다 N =8 독립 변수에 대해, 코르티코스테론 수준에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(14) = 0.827; p = 0.422 (1)
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 불안을 감소시키는 지를 조사하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 도면 69A는 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 69A에서 6900에서 보여 지는 바와 같이, WT 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 7 연속일, 1-7 일자 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 (N = 10) 또는 40-Hz 광 플리커 (N =10)에 노출되었다. 8 일자에, 6902에서 보여 지는 바와 같이, 상승된 플러스 미로의 10-분 세션이 수행되었다.
상승된 플러스 미로는 실험 동물에서 불안을 계측하는데 이용되는 시험이다. 상기 행동 모형은 열린 공간에 대한 설치류의 일반적인 혐오에 근거되는데, 이것은 밀폐된 공간 내에 또는 경계를 이루는 공간의 가장자리에 가깝게 남아있는 것을 선호하는 접촉주성을 야기한다. 도면 69B는 상승된 플러스 미로 기구를 도해하는 이미지이다. 상기 기구는 2개 열린 팔 (수직) 및 2개 닫힌 팔 (수평)을 갖는 플러스-모양이다. 불안은 동물이 닫힌 팔에서 더욱 많은 시간을 소모하는 것으로 표현된다.
도면 69C 및 69D는 상승된 플러스 미로 세션 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다. 일부 구체예에 따라서, 도면 69C에서, 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐는 닫힌 팔 내에 머무르려는 경향이 있는데, 이것은 더욱 많은 불안을 지시하고, 반면 도면 69D에서, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 열린 팔 및 닫힌 팔 둘 모두를 탐색하였는데, 이것은 상대적으로 더욱 적은 불안을 지시한다.
도면 70은 일부 구체예에 따라서, 정상적인 실내전등에 노출된 10마리 생쥐 (NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 10마리 생쥐 (40-Hz)에 의해, 열린 팔 및 닫힌 팔에서 탐색하는데 소모된 전체 시간을 묘사하는 막대 그래프이다. 일부 구체예에 따라서, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 닫힌 팔에 더욱 적은 전체 시간 및 열린 팔에서 더욱 많은 전체 시간을 소모하였는데, 이것은 대조군과 비교하여 더욱 적은 불안을 지시한다. 군마다 N =10 독립 변수에 대해, 닫힌 팔을 탐색하는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(18) = -1.652; p = 0.11 (2)
군마다 N =10 독립 변수에 대해, 열린 팔을 탐색하는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(18) = -2.136; p = 0.047 (3)
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 스트레스 및/또는 불안을 감소시키는 지를 조사하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 도면 71A는 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 71A에서 7100에서, WT 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 7 연속일, 1-7 일자 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 (N = 8) 또는 40-Hz 광 플리커 (N =8)에 노출되었다. 8 일자에, 7102에서 보여 지는 바와 같이, 5-분 오픈 필드 시험이 수행되었다.
오픈 필드 시험은 실험 동물에서 전반적인 운동 활성 수준 및 불안을 검정하는데 이용되는 실험이다. 상기 행동 모형은 밝게 켜진 구역을 회피하지만, 지각된 위협적인 자극을 또한 탐색하려는 설치류의 갈등 추동에 의해 유발된 불안에 근거된다. 도면 71B는 오픈 필드 아레나를 도해하는 이미지이다. 오픈 필드 아레나는 도피를 방해하는 벽이 있고, 그리고 격자로 표시되거나 또는 소프트웨어 시스템과 통합된 적외선 빔 또는 비디오 카메라를 이용하여 모니터링될 수 있다. 일부 구체예에 따라서, 증가된 불안은 더욱 적은 활동 움직임 및 필드의 가장자리에 대한 선호를 유발할 것이고, 반면 감소된 불안은 증가된 탐색 행동을 야기한다.
도면 71C 및 71D는 오픈 필드 시험 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다. 일부 구체예에 따라서, 도면 71C에서, 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐는 아레나의 가장자리를 선호하는 경향이 있었는데, 이것은 더욱 많은 스트레스 및/또는 불안을 지시하고, 반면 도면 71D에서, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 아레나의 중심을 더욱 탐색하였는데, 이것은 상대적으로 더욱 적은 스트레스 및/또는 불안을 지시하였다.
도면 72A 및 72B는 일부 구체예에 따라서, 정상적인 실내전등에 노출된 8마리 생쥐 (NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 8마리 생쥐 (40-Hz)에 의한, 오픈 필드 아레나의 중심 및 주변을 탐색하는데 소모된 전체 시간을 묘사하는 그래프이다. 도면 72A는 각 5 분 동안 아레나의 중심에서 소모된 초의 평균량의 플롯이다. 도면 72B는 각 분에 대해 평균화된, 전체 5-분 지속 기간 동안 아레나의 주변에서 소모된 전체 시간의 막대 그래프이다.
평균적으로, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 유의미하게는 2, 4 및 5 분 동안 아레나의 중심에서 더욱 많은 시간을 소모하고, 따라서 대조군과 비교하여 더욱 적은 스트레스 및/또는 불안을 지시하였는데, 이것은 또한, 일부 구체예에 따라서 상승된 플러스 미로 결과와 일치한다. 반복 측정 분산 분석 (RM ANOVA)이 수행되었다. 군마다 N =8 독립 변수에 대해, 오픈 필드 아레나를 탐색하는데 소모된 평균 시간에 대한 F-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
F(1,14) = 4.860; p = 0.045 (4)
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 선천적 신기성 탐색 행동을 변화시키는 지를 조사하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 도면 73A 및 73B는 신기한 인식 과제를 이용하는 상기 연구를 도해하는 계통도이다. 도면 73A에서, 2개 신기한 물체가 익숙한 아레나에서 제공된다. 도면 73B에서, 1개의 익숙한 물체 및 1개의 신기한 물체가 익숙한 아레나에서 제공된다. 야생형 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 7 연속일, 1-7 일자 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 (N = 8) 또는 40-Hz 광 플리커 (N =8)에 노출되었다.
8 일자에, 생쥐는 도면 73A에서 시나리오, 익숙한 아레나에서 2개의 신기한 물체에 5 분 동안 노출되었다. 도면 73C는 일부 구체예에 따라서, 정상적인 실내전등에 노출된 8마리 생쥐 (NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 8마리 생쥐 (40-Hz)에 대한 새로운 물체 A를 탐색하는데 소모된 시간의 백분율 대 새로운 물체 B를 탐색하는데 소모된 시간의 백분율을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 73C에 의해 도해된 바와 같이, 각 군에 의해 각 물체에 대한 동등한 선호가 밝혀졌다. 다시 말하면, 군 간에 물체 탐색에서 차이 없음이 관찰되었다.
이후, 생쥐는 도면 73B에서 시나리오, 익숙한 아레나에서 1개의 익숙한 물체 및 1개의 신기한 물체에 5 분 동안 노출되었다. 도면 74는 각 5 분 동안 신기한 물체를 탐색하는데 소모된 초의 평균량을 묘사하는 플롯이다. 평균적으로, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 특히, 1-3 및 5 분 동안 신기한 물체를 탐색하는 훨씬 많은 양의 시간을 소모하고, 따라서 일부 구체예에 따라서, 대조군과 비교하여 증가된 신기성 탐색 행동을 지시하였다. Friedman의 비파라미터 RM ANOVA가 수행되었다. 군마다 N =8 독립 변수에 대해, 신기한 물체를 탐색하는데 소모된 평균 시간에 대한 시험 통계 χ 2 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
χ 2 (4, n =16) = 16.088; p = 0.003 (5)
3 분 동안 신기한 물체를 탐색하는데 소모된 평균 시간에 대한 Mann-Whitney U 시험이 수행되었다. 군마다 N =8 독립 변수에 대해, U-값, Z-값, 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
U = 58.00; Z = 2.731; p = 0.005 (6)
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 학습 및/또는 기억에 충격을 주는 지를 조사하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 도면 75A는 두려움 조건화 패러다임을 이용하여 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 75A에서 7500에서 보여 지는 바와 같이, WT 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 7 연속일, 1-7 일자 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 또는 40-Hz 광 플리커에 노출되었다. 8 일자에, 7502에서 보여 지는 바와 같이, 생쥐는 경미한 2-색조-쇼크 대합에 종속되었다. 구체적으로, 생쥐는 새로운 아레나 내로 도입되었는데, 여기서 첫 번째 색조 (tone)가 발 쇼크와 대합되었다. 생쥐는 맥락 (다시 말하면, 색조)을 혐오 경험 (다시 말하면, 발 쇼크)과 연관시키도록 조건화되었다. 이러한 본래 맥락에 대해, 꼼짝도 하지 않는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(24) = 0.577; p = 0.569 (7)
9 일자에, 7504에서 보여 지는 바와 같이, 색조 시험이 변경된 맥락에서 수행되었다. 도면 75B는 첫 번째-색조 맥락 7506, 첫 번째-색조 후 맥락 7508, 두 번째-색조 맥락 7510 및 두 번째-색조 후 맥락 7512을 포함하는, 시간의 함수로서 색조 시험을 도해하는 자극 다이어그램이다. 상기 시험을 위해, 생쥐는 첫 번째 색조가 발 쇼크와 대합되는 아레나로 복귀되었다. 첫 번째-색조 맥락 7506이 적용될 때, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 아마도 발 쇼크를 예상하고, 꼼짝도 하지 않는데 더욱 많은 시간을 소모하고, 따라서 기억의 척도를 지시하였다. 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 또한, 대조군보다 두 번째-색조 맥락 7510 동안 꼼짝도 하지 않는데 더욱 많은 시간을 소모하지만, 어느 한쪽 색조 후 맥락 동안 꼼짝도 하지 않는데 더욱 적은 시간을 소모하였다.
도면 76A 및 76B는 일부 구체예에 따라서, 증강된 기억을 증명하는 막대 그래프이다. 도면 76A에서 보여 지는 바와 같이, 첫 번째-색조 맥락 7506 및 두 번째-색조 맥락 7510 동안 꼼짝도 하지 않는데 소모된 시간의 백분율은 대조군과 비교하여 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐의 경우에 더욱 큰데, 이것은 일부 구체예에 따라서, 증강된 기억 연상을 지시하였다. 이에 더하여, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 더욱 강한 소거 색조 후 표현을 전시하였다. 도면 76B에서 보여 지는 바와 같이, 첫 번째-색조 후 맥락 7506 및 두 번째-색조 후 맥락 7510 동안 꼼짝도 하지 않는데 소모된 시간의 백분율은 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐와 비교하여 대조군의 경우에 더욱 큰데, 이것은 일부 구체예에 따라서, 증강된 기억 특이성을 지시하였다.
색조 전 맥락에 대해, RM ANOVA가 군 간에 수행되었고, 그리고 꼼짝도 하지 않는데 소모된 평균 시간에 대한 F-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
F(1,24) = 3.106; p = 0.091 (8)
첫 번째-색조 맥락에 대해, 꼼짝도 하지 않는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값이 아래와 같이 계산되었다:
T(24) = -2.155; p = 0.041 (9)
두 번째-색조 맥락에 대해, 꼼짝도 하지 않는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(24) = -1.433; p = 0.164 (10)
색조 맥락에 대해, RM ANOVA가 군 간에 수행되었고, 그리고 꼼짝도 하지 않는데 소모된 평균 시간에 대한 F-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
F(1,24) = 4.559; p = 0.043 (11)
첫 번째-색조 후 맥락에 대해, 꼼짝도 하지 않는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(24) = 1.874; p = 0.073 (12)
두 번째-색조 후 맥락에 대해, 꼼짝도 하지 않는데 소모된 전체 시간에 대한 T-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
T(24) = 2.223; p = 0.036 (13)
색조 후 맥락에 대해, RM ANOVA가 군 간에 수행되었고, 그리고 꼼짝도 하지 않는데 소모된 평균 시간에 대한 F-분포 및 p-값은 아래와 같이 계산되었다:
F(1,24) = 6.646; p = 0.017 (14)
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 기억을 향상시키는 지를 조사하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 도면 77A는 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 77A에서 7700에서 보여 지는 바와 같이, WT 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 7 연속일, 1-7 일자 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 또는 40-Hz 광 플리커에 노출되었다. 8 일자에, 7702에서 보여 지는 바와 같이, Morris 수중 미로 시험이 수행되었다.
Morris 수중 운항 과제 또는 미로는 실험 동물에서 공간 기억 및 학습을 연구하는데 이용되는 시험이다. 상기 행동 절차는 실천적 전략 (플랫폼에 도달하는데 필요한 움직임을 기억하는), 주성 전략 (플랫폼의 위치를 찾기 위해 시각 단서를 이용하는), 또는 공간적 전략 (원위 단서를 참조점으로서 이용하는)을 이용하여, 개체가 물을 탈출하도록 허용하는 보이지 않는 또는 가시적인 플랫폼을 갖는 큰 환상 풀에 개체를 배치하는 것을 수반한다. 도면 77B는 Morris 수중 미로를 도해하는 다이어그램이다. 상기 미로는 지향성 사분면으로 나눠진 물의 환상 풀 및 남쪽-서쪽 (SW) 사분면에 숨겨진 플랫폼 7704를 포함한다.
약한 훈련을 위해, Morris 수중 미로 시험이 4 연속일, 8-11 일자 동안 하루 2회 반복되었다. 도면 78A는 일부 구체예에 따라서, 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐 (NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐 (40-Hz)에 의한, 플랫폼을 발견하는 잠재기를 묘사하는 플롯이다.
12 일자에, 프로브 시험이 Morris 수중 미로로부터 숨겨진 플랫폼을 제거함으로써 수행되었다. 도면 77C 및 77D는 상기 프로브 시험 동안 개체의 대표적인 트랙을 도해하는 이미지이다. 일부 구체예에 따라서, 도면 77C에서, 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐는 풀 전역에서 플랫폼을 찾는 것으로 보이고, 반면 도면 77D에서, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 SW 사분면을 더욱 조직적으로 및 일차적으로 찾는 것으로 보인다. 도면 78B는 표적 사분면 (다시 말하면, SW 사분면)에서 플랫폼을 찾는데 소모된 전체 시간 (각 절반 분마다 초)을 묘사하는 플롯이고, 반면 도면 78C는 반대의 사분면 (다시 말하면, NE 사분면)에서 플랫폼을 찾는데 소모된 전체 시간 (각 절반 분마다 초)을 묘사하는 플롯이다. 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 표적 사분면을 탐색하는데 대조군보다 더욱 많은 시간 및 반대의 사분면을 탐색하는데 대조군보다 더욱 적은 시간을 소모하는데, 이것은 일부 구체예에 따라서, 공간 기억의 증강을 지시하였다.
Morris 수중 미로 시험 및 프로브 시험으로부터 동일한 생쥐 군을 이용하여 역전 학습이 수행되었다. 도면 79A는 상기 시험에서처럼 SW 사분면에 플랫폼 7900이 숨겨진 Morris 수중 미로를 도해하는 다이어그램이다. 도면 79B는 역전 학습을 위해 반대의 NE 사분면에 플랫폼 7902가 숨겨진 Morris 수중 미로를 도해하는 다이어그램이다.
약한 훈련을 위해, 역전 학습이 4 연속일, 14-17 일자 동안 하루 2회 반복되었다. 도면 79C는 일부 구체예에 따라서, 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐 (NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐 (40-Hz)에 의한, 플랫폼을 발견하는 잠재기를 묘사하는 플롯이다. 7 일자 후 추가 40Hz 노출을 제공받지 않음에도 불구하고, 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 증가된 행동 유연성을 보여주었다.
일부 구체예에 따른 장기 감마 노출 및/또는 투여가 개체에서 공간 학습 및 기억에 영향을 주는 지를 조사하기 위해 다른 연구가 수행되었다. 도면 80A는 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 80A에서 8000에서 보여 지는 바와 같이, C57BL/6 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 2 주 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 (N = 7) 또는 40-Hz 광 플리커 (N =7)에 노출되었다. 세 번째 주 동안, 8002에서 보여 지는 바와 같이, 이들 생쥐는 매일 아침 1 시간 동안 정상적인 실내전등 또는 40Hz 광 플리커에 계속 노출되고, 그리고 이후 또한, 매일 오후 Morris 수중 미로 시험에 종속되었다.
도면 80B는 세 번째 주의 1-4 일자에 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐(NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐 (40-Hz)에 의한, 플랫폼을 발견하는 잠재기를 묘사하는 플롯이다. 세 번째 주 이후에, 프로브 시험이 숨겨진 플랫폼을 제거함으로써 수행되었다. 도면 80C는 프로브 시험 동안 표적 사분면에서 플랫폼을 찾는데 소모된 전체 시간 (30-초 시험마다 초)을 묘사하는 막대 그래프이다. 1 주의 처리와 유사하게, 장기 3 주 처리는 일부 구체예에 따라서, 공간 학습을 증강하였다.
역전 학습이 도면 80A-80C로부터 동일한 생쥐 군을 이용하여 수행되었다. 도면 81A는 확대된 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 81A에서 8100에서 보여 지는 바와 같이, C57BL/6 생쥐는 일부 구체예에 따라서, 2 주 동안 하루 1 시간 동안 정상적인 실내전등 또는 40-Hz 광 플리커에 노출되었다. 세 번째 주 동안, 8102에서 보여 지는 바와 같이, 이들 생쥐는 매일 아침 1 시간 동안 정상적인 실내전등 또는 40-Hz 광 플리커에 계속 노출되고, 그리고 이후 또한, 매일 오후 Morris 수중 미로 시험에 종속되었다. 네 번째 주 동안, 8104에서 보여 지는 바와 같이, 이들 생쥐는 매일 아침 1 시간 동안 정상적인 실내전등 또는 40-Hz 광 플리커에 계속 노출되고, 그리고 이후 또한, 매일 오후 Morris 수중 미로 역전 시험에 종속되었다. 도면 81B는 일부 구체예에 따라서, 네 번째 주의 1-4 일자에 정상적인 실내전등에 노출된 생쥐 (NRL) 및 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐 (40-Hz)에 의한, 플랫폼을 발견하는 잠재기를 묘사하는 플롯이다.
네 번째 주 이후에, 프로브 시험이 숨겨진 플랫폼을 제거함으로써 수행되었다. 도면 82A는 프로브 시험 동안 표적 사분면에서 플랫폼을 찾는데 소모된 전체 시간 (30-초 시험마다 초)을 묘사하는 막대 그래프이다. 도면 82B는 프로브 시험 동안 반대의 사분면에서 소모된 시간을 묘사하는 막대 그래프이다. 40Hz 광 플리커에 노출된 생쥐는 강한 인지 유연성을 보여주었다.
감마 주파수에서 시각 자극은 해부학적, 형태, 세포 및 분자 유익성을 제공하였다.
개체의 시각 피질에서 DNA 피해 및 뉴런 상실에 대한 일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여의 효과를 조사하기 위한 연구가 수행되었다. 상기 연구를 위해, p25 축적의 유도성 생쥐 모형 (다시 말하면, 크레아틴 키나아제 카르복실 말단 단편 p25 Tg 생쥐 (CK-p25 Tg 생쥐))이 이용되었다. CK-p25 Tg 생쥐 모형은 전뇌에서 심대한 뉴런 상실, 증가된 Aβ 펩티드 생산, 타우 병리, DNA 손상 및 심각한 인지 장애를 비롯하여, AD의 핵심 병리학적 홀마크를 전시한다. 이러한 모형에서, 증가된 Aβ 펩티드 수준이 뉴런 상실에 앞서 관찰된다; 게다가, Aβ 펩티드 생산을 감소시키는 것은 CK-p25 Tg 생쥐 모형에서 기억 결손을 개선하는데, 이것은 이러한 사건이 카르복실 말단 단편 p25와 상승적으로 작동하고, 신경변성 및 기억 장애의 현성을 야기한다는 것을 지시한다.
도면 83은 CK-p25 Tg 생쥐에서 변화를 도해하는 시각표 다이어그램 8300이다. 2 주 후 8302, 생쥐는 DNA 손상 (가령, 생물마커 γH2AX), 증가된 Aβ 펩티드 및 소교세포 활성화를 전시한다. 6 주 후 8304, 이들 생쥐는 시냅스 상실, 뉴런 상실, 타우 과인산화, 장기 강화작용 결손 및 기억 장애를 전시한다. 상이한 치료 섭생 하에 생쥐의 군을 비교하기 위한 연구가 수행되었다.
도면 84는 CK-대조 생쥐 8400, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 8402, 메만틴 (10 mg/kg 매일)으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 8404, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커 (6 주 동안 매일 1 시간)에 노출된 CKp25 Tg 생쥐 8406, 그리고 메만틴으로 처리되고 40-Hz 광 플리커 8408에 또한 노출된 CK-p25 Tg 생쥐를 포함하는 군의 다이어그램이다. 메만틴은 NMDA 수용체를 차단하고, 따라서 글루타민산성 시스템에 작용함으로써 심각한 AD를 치료하는데 이용되는 약제인데, 성공이 제한적이다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 뇌 해부구조에 대한 변화를 보존하고 및/또는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 감마 노출은 뇌 중량의 CKp-25-유도된 상실을 감소시키고 및/또는 예방하였다. 도면 85는 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 뇌 중량 변화를 비교하는 막대 그래프이다. 뇌 중량 감소는 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 확연하였다. 하지만, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐는 더욱 많은 뇌 중량을 유지하였다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 뇌 형태에 대한 변화를 보존하고 및/또는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 감마 노출은 개체에서 CKp-25-유도된 비정상적인 측 뇌실 확대를 감소시키고 및/또는 예방하였다. 도면 86은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 측 뇌실 확대의 배수적 변화를 기준선으로서 CK-대조 생쥐에서 확대와 비교하는 막대 그래프이다. 측 뇌실 확대는 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 확연하였다. 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐에서 측 뇌실은 다른 CK-p25 Tg 생쥐에서 측 뇌실보다 훨씬 적게 확대되었다.
도면 87A-87E는 각 군에서 개체를 나타내는 측 뇌실을 도해하는 이미지이다. 측 뇌실은 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 87A), 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 87B), 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 87C)에서 가장 컸다. 도면 87D에서 보여 지는 바와 같이, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐의 측 뇌실은 훨씬 적게 확대되었다. 도면 87E는 CK-대조 생쥐에서 기준선 측 뇌실 크기의 실례이다.
도면 88A-88C는 일부 구체예에 따라서, 분자 특징화를 위한 뇌 관심 영역을 도해하는 뇌 해부학 다이어그램이다. 도면 88A는 시각 피질 (V1) 8800, 체성 감각 피질 (SS1) 8802, 해마 8804 및 도피질 8806을 포함한다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 시각 피질에서 피질층 및 뉴런층에 대한 변화를 보존하고 및/또는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 감마 노출은 개체의 시각 피질에서 CKp-25-유도된 피질층 및 뉴런층 상실을 감소시키고 및/또는 예방하였다.
피질층 상실은 Hoechst 표지 (다시 말하면, DNA를 염색하는데 이용되는 청색 형광 염료)로 핵 염색을 이용하여 측정되었다. 뉴런층 상실은 뉴런에 대한 생물마커로서 통상적으로 이용되는 뉴런 핵 항원인 NeuN을 이용하여 측정되었다. 도면 89는 각 군에서 V1-피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이고, 그리고 도면 90은 각 군에서 V1-NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 91A-91E는 각 군에서 개체를 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다. 도면 91A는 CK-대조 생쥐에서 기준선 V1-피질층 (가령, 837 ± 9 μM) 및 V1-뉴런층 (가령, 725 ± 7 μM)의 두께의 실례이다.
V1-피질층은 일부 구체예에 따른 40Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91D, 가령, 855 ± 9 μM); 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91E, 가령, 821 ± 22 μM); 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91B, 가령, 792 ± 13 μM); 및 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91C, 가령, 788 ± 9 μM)에서 점진적으로 더욱 얇았다.
일부 구체예에 따른 40Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐에서 V1-뉴런층은 CK-대조 생쥐에서보다 실질적으로 더욱 두꺼웠지만 (도면 91D, 가령, 743 ± 9 μM), 이후 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91E, 가령, 691 ± 20 μM); 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91B, 가령, 666 ± 14 μM); 및 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 91C, 가령, 660 ± 7 μM)에서 CK-대조 생쥐에서보다 점진적으로 더욱 얇았다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 체성 감각 피질에서 피질층 및 뉴런층에 대한 변화를 보존하고 및/또는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 감마 노출은 개체의 체성 감각 피질에서 CKp-25-유도된 피질층 및 뉴런층 상실을 감소시키고 및/또는 예방하였다.
도면 92는 각 군에서 SS1-피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이고, 그리고 도면 93은 각 군에서 SS1-NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 94A-94E는 각 군에서 개체를 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다. 도면 94A는 CK-대조 생쥐에서 기준선 SS1-피질층 (가령, 846 ± 10 μM) 및 SS1-뉴런층 (가령, 707 ± 8 μM)의 두께의 실례이다.
SS1-피질층은 일부 구체예에 따른 40Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 94D, 가령, 834 ± 9 μM); 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CKp25 Tg 생쥐 (도면 94E, 가령, 778 ± 13 μM); 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 94B, 가령, 762 ± 17 μM); 및 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 94C, 가령, 756 ± 11 μM)에서 점진적으로 더욱 얇았다.
일부 구체예에 따른 40Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐에서 SS1-뉴런층은 CK-대조 생쥐 (도면 94D, 가령, 705 ± 15 μM)에서와 거의 동일한 두께이었다. 하지만, SS1-뉴런층은 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 94E, 가령, 650 ± 11 μM); 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 94B, 가령, 630 ± 13 μM); 및 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 94C, 가령, 629 ± 9 μM)에서 점진적으로 더욱 얇았다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 도피질에서 피질층 및 뉴런층에 대한 변화를 보존하고 및/또는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 감마 노출은 개체의 도피질에서 CKp-25-유도된 피질층 및 뉴런층 상실을 감소시키고 및/또는 예방하였다.
도면 95는 각 군에서 도피질의 피질층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이고, 그리고 도면 96은 각 군에서 도피질의 NeuN-양성 세포 층의 평균 두께를 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 97A-97E는 각 군에서 개체를 나타내는 Hoechst 표지 및/또는 NeuN 표지를 갖는 세포를 도해하는 이미지이다. 도면 97A는 CK-대조 생쥐에서 도피질의 기준선 피질층 (가령, 1134 ± 10 μM) 및 뉴런층 (가령, 1010 ± 11 μM)의 두께의 실례이다.
피질층은 일부 구체예에 따른 40Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97D, 가령, 1079 ± 20 μM); 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97C, 가령, 983 ± 12 μM); 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CKp25 Tg 생쥐 (도면 97E, 가령, 965 ± 16 μM); 및 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97B, 가령, 764 ± 27 μM)의 도피질에서 점진적으로 더욱 얇았다.
뉴런층은 일부 구체예에 따른 40Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97D, 가령, 953 ± 17 μM); 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97B, 가령, 861 ± 30 μM); 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97C, 가령, 850 ± 18 μM); 및 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐 (도면 97E, 가령, 848 ± 15 μM)의 도피질에서 점진적으로 더욱 얇았다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 뉴런의 숫자 및/또는 DNA의 손상에 대한 변화를 보존하고 및/또는 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 감마 노출은 개체의 시각 피질에서 CKp-25-유도된 뉴런 상실 및 DNA 손상을 감소시켰다.
도면 98은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 NeuN-양성 세포의 백분율로서 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. 따라서, CK-대조 생쥐 NeuN-양성 세포의 백분율은 CK-대조 생쥐에서 100%이지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 단지 약 80%인데, 이것은 CK-p25 Tg 생쥐 모형에서 뉴런 상실을 확증한다. 메만틴으로 처리는 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 일부 뉴런 상실을 예방하였다. 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출은 CK-p25 Tg 생쥐에서 대부분의 뉴런 상실을 예방하였다. 따라서, 도면 98은 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 시각 피질에서 뉴런을 어떻게 보존할 수 있는 지를 도해한다. 하지만, 메만틴 및 40-Hz 광 플리커에 노출의 조합은 가능한 많은 뉴런 상실을 예방하는데 실패하였다.
DNA 이중 가닥 절단 (DSB)은 유전체 불안정을 유발하고, 종양발생 및 아마도 가속된 노화를 야기하는, 진핵 세포에서 DNA 손상의 한 가지 실례이다. 인산화된 히스톤 H2AX (γH2AX)가 DSB에 대한 세포 반응의 생물마커로서 이용되었다. 도면 99는 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. γH2AX에 대해 양성인 세포는 CK-대조 생쥐에서 거의 존재하지 않지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 매우 높게 존재하는데, 이것은 많은 양의 DSB 및 다른 DNA 손상을 암시하였다. 메만틴으로 처리는 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 감소시켰다. 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 훨씬 큰 감소를 유발하였다. 따라서, 도면 99는 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 시각 피질에서 DNA 손상을 어떻게 감소시킬 수 있는 지를 도해한다. 하지만, 메만틴 및 40-Hz 광 플리커에 노출의 조합은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 숫자를 유의미하게 증가시켰다.
도면 100은 Hoechst 염색 (피질 세포를 표시), 녹색 형광 단백질 또는 GFP (CK-p25를 표시), γH2AX (DSB를 표시), 또는 NeuN (뉴런을 표시)으로 표지화된 각 군에서 개체를 나타내는 시각 피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
감마 노출은 또한, 개체의 체성 감각 피질에서 CKp-25-유도된 뉴런 상실 및 DNA 손상을 감소시켰다. 도면 101은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 NeuN-양성 세포의 백분율로서 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. 따라서, CK-대조 생쥐 NeuN-양성 세포의 백분율은 CK-대조 생쥐에서 100%이지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 80%에 더욱 가까운데, 이것은 CK-p25 Tg 생쥐 모형에서 뉴런 상실을 확증한다. 메만틴으로 처리는 CK-p25 Tg 생쥐에서 대부분의 뉴런 상실을 예방한, 40-Hz 광 플리커에 노출과 합동하는 경우를 제외하고, 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 임의의 뉴런 상실을 예방하는데 실패하였다. 따라서, 도면 101은 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 체성 감각 피질에서 뉴런을 어떻게 보존할 수 있는 지를 도해한다.
도면 102는 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. γH2AX에 대해 양성인 세포는 CK-대조 생쥐에서 존재하지 않지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 매우 높게 존재하는데, 이것은 많은 양의 DSB 및 다른 DNA 손상을 암시하였다. 메만틴으로 처리는 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 감소시켰다. 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 훨씬 큰 감소를 유발하였다. 따라서, 도면 102는 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 체성 감각 피질에서 DNA 손상을 어떻게 감소시킬 수 있는 지를 도해한다. 하지만, 메만틴 및 40-Hz 광 플리커에 노출의 조합은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 숫자를 유의미하게 증가시켰다.
도면 103은 NeuN (뉴런을 표시), γH2AX (DSB를 표시), GFP (CK-p25를 표시) 및/또는 Hoechst 염색 (피질 세포를 표시)으로 표지화된 각 군에서 개체를 나타내는 체성 감각 피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
감마 노출은 또한, 개체의 도피질에서 CKp-25-유도된 뉴런 상실 및 DNA 손상을 감소시켰다. 도면 104는 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 NeuN-양성 세포의 백분율로서 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. 따라서, CK-대조 생쥐 NeuN-양성 세포의 백분율은 CK-대조 생쥐에서 100%이지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 80%에 더욱 가까운데, 이것은 CK-p25 Tg 생쥐 모형에서 뉴런 상실을 확증한다. 메만틴으로 처리는 CK-p25 Tg 생쥐에서 최소 뉴런 상실을 예방한, 40-Hz 광 플리커에 노출과 합동하는 경우를 제외하고, 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 일부 뉴런 상실을 예방하였다. 따라서, 도면 104는 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 도피질에서 뉴런을 어떻게 보존할 수 있는 지를 도해한다.
도면 105는 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. γH2AX에 대해 양성인 세포는 CK-대조 생쥐에서 존재하지 않지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 매우 높게 존재하는데, 이것은 많은 양의 DSB 및 다른 DNA 손상을 암시하였다. 메만틴으로 처리는 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 감소시켰다. 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 유사한 감소를 유발하였다. 따라서, 도면 105는 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 도피질에서 DNA 손상을 어떻게 감소시킬 수 있는 지를 도해한다. 하지만, 메만틴 및 40-Hz 광 플리커에 노출의 조합은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 숫자를 유의미하게 증가시켰다.
도면 106은 NeuN (뉴런을 표시), γH2AX (DSB를 표시), GFP (CK-p25를 표시), 또는 Hoechst 염색 (피질 세포를 표시)으로 표지화된 각 군에서 개체를 나타내는 도피질 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
감마 노출은 또한, 개체의 해마에서 CKp-25-유도된 뉴런 상실 및 DNA 손상을 감소시켰다. 도면 107은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 NeuN-양성 세포의 백분율로서 NeuN-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. 따라서, CK-대조 생쥐 NeuN-양성 세포의 백분율은 CK-대조 생쥐에서 100%이지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 80%에 더욱 가까운데, 이것은 CK-p25 Tg 생쥐 모형에서 뉴런 상실을 확증한다. 40-Hz 광 플리커에 노출이 있거나 또는 없는 메만틴으로 처리는 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 일부 뉴런 상실을 예방하였는데, 이것은 CK-p25 Tg 생쥐에서 최소 뉴런 상실을 예방하였다. 따라서, 도면 107은 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 해마에서 뉴런을 어떻게 보존할 수 있는 지를 도해한다.
도면 108은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 비교하는 막대 그래프이다. γH2AX에 대해 양성인 세포는 CK-대조 생쥐에서 존재하지 않지만, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐에서 매우 높게 존재하는데, 이것은 많은 양의 DSB 및 다른 DNA 손상을 암시하였다. 메만틴으로 처리는 처리되지 않은 군과 비교하여 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 양을 감소시켰다. 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 더욱 우수한 감소를 유발하였다. 따라서, 도면 108은 일부 구체예에 따른 40-Hz 시각 플리커 처리가 해마에서 DNA 손상을 어떻게 감소시킬 수 있는 지를 도해한다. 하지만, 메만틴 및 40-Hz 광 플리커에 노출의 조합은 CK-p25 Tg 생쥐에서 γH2AX-양성 세포의 숫자를 유의미하게 증가시켰다.
도면 109는 Hoechst 염색 (피질 세포를 표시), GFP (CK-p25를 표시), γH2AX (DSB를 표시), 또는 NeuN (뉴런을 표시)으로 표지화된 각 군에서 개체를 나타내는 해마 표본을 도해하는 일련의 이미지이다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여는 시냅스를 보존하고 및/또는 시냅스 상실을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 시냅스 연결성에서 변화는 글루타민산성 시냅스 (가령, VGluT1, VGluT2, PSD95 및 GluR2) 및 GABA성 시냅스 (가령, GAD 및 VGAT)에 대한 특정한 마커를 이용하여 정량될 수 있다.
가령, 감마 노출은 개체의 시각 피질에서 CKp-25-유도된 시냅스 상실을 감소시켰다. 도면 110은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 기준선 시냅스 부점 밀도의 백분율로서 글루타민산성 시냅스 (VGluT1을 이용) 및 GABA성 시냅스 (GAD65를 이용)의 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
감마 노출은 또한, 개체의 체성 감각 피질에서 CKp-25-유도된 시냅스 상실을 감소시키고 시냅스 부점 밀도를 심지어 증가시켰다. 도면 111은 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 기준선 시냅스 부점 밀도의 백분율로서 글루타민산성 시냅스 (VGluT1을 이용) 및 GABA성 시냅스 (GAD65를 이용)의 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
감마 노출은 또한, 개체의 도피질에서 CKp-25-유도된 시냅스 상실을 감소시켰다. 도면 112는 CK-대조 생쥐, 처리되지 않은 CK-p25 Tg 생쥐, 메만틴으로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐, 일부 구체예에 따른 40-Hz 광 플리커에 노출된 CK-p25 Tg 생쥐, 그리고 메만틴 및 40-Hz 광 플리커 둘 모두로 처리된 CK-p25 Tg 생쥐에 대한 CK-대조 생쥐에서 기준선 시냅스 부점 밀도의 백분율로서 글루타민산성 시냅스 (VGluT1을 이용) 및 GABA성 시냅스 (GAD65를 이용)의 부점 밀도를 비교하는 막대 그래프이다.
도면 113A는 Hoechst 염색 (피질 세포를 표시)을 갖는 대표적인 표본을 도해하는 이미지이다. 도면 113B는 대표적인 표본에서 VGluT1 (글루타민산성 시냅스를 표시)을 도해하는 이미지이다. 도면 113C는 대표적인 표본에서 GAD65 (GABA성 시냅스를 표시)을 도해하는 이미지이다. 도면 113D는 대표적인 표본에서 Hoechst 염색, VGluT1 및 GAD65를 도해하는 합병된 이미지이다. 도면 113E 및 113F는 GAD65를 이용한 부점 정량의 방법을 도해한다. 도면 113E는 도면 113C로부터 전환된 GAD65의 이진 이미지이다. ImageJ 소프트웨어 (the U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland로부터 가용)가 도면 113F에서 보여 지는 바와 같이, 이진 이미지를 정량하는데 이용되었다.
일부 구체예에 따른 감마 노출 및/또는 투여가 뇌 맥관구조에 영향을 주는 지를 조사하기 위한 연구가 수행되었다. 생쥐는 어두운 상자에 배치되고, 그리고 1 시간 동안 40-Hz 발광 다이오드 (LED) 플리커 또는 일정한 소등 (어둠)에 노출되었다. 자극 이후에, 생쥐는 희생되고 관류되었다. 뇌 섹션은 혈관을 형광으로 태깅하기 위해 형광단에 연결된 렉틴으로 염색되었다. 공초점 영상화를 이용하여, 맥관구조 크기 (다시 말하면, 혈관 직경)에서 변화가 계측되었다. 혈관확장이 1 시간의 40-Hz LED 플리커 이후에 관찰되었다.
도면 128A는 일부 구체예에 따라서, 시각 피질 내에 확대된 맥관구조를 도해하는 일련의 대표적인 면역형광 이미지이다. 도면 128B는 시각 피질 내에 혈관 직경을 묘사하고, 그리고 일부 구체예에 따른 감마 노출 이후에 혈관 직경에서 증가를 도해하는 막대 그래프이다.
따라서, 감마 노출 및/또는 투여는 해부학적 유익성 (가령, 뇌 중량 감소의 예방 및/또는 감소 및 맥관구조의 확대), 형태 유익성 (가령, 일탈적 심실 확대 및 피질층 두께 상실의 예방 및/또는 감소), 세포 유익성 (가령, 뉴런 상실의 예방 및/또는 감소), 그리고 분자 유익성 (가령, DNA 손상 및 시냅스 상실의 예방 및/또는 감소)을 제공하는 것으로 증명되었다.
게다가, 감마 노출 및/또는 투여는 신경보호성인 것으로 밝혀졌다. 감마 처리 이후에, CK-p25 Tg 생쥐 모형 - 만약 그렇지 않으면, 증가된 Aβ 펩티드 수준, 심대한 뉴런 상실, DNA 손상, 시냅스 상실, 타우 과인산화, 장기 강화작용 결손, 그리고 심각한 인지/기억 장애를 전시한다 - 은 뉴런 구조 및/또는 기능의 상대적 보존 (가령, 질환 척도의 유지/예방 및/또는 감소된/느려진 질환 진행)을 보여주고, 그리고 일부 경우에, 뉴런 구조 및/또는 기능의 향상을 암시하였다.
감마 주파수에서 청각 자극은 개체에서 소교세포 변화를
비침습성으로
유도하였다.
일부 구체예에서, 감마 노출 및/또는 투여는 청각 자극을 포함한다. 청각 자극은 소리 펄스 또는 클릭을 포함할 수 있다. 소리 자극은 초당 약 35 소리 펄스 또는 클릭 (클릭/s) 내지 약 45 클릭/s의 클릭 훈련을 포함할 수 있다. 도면 114는 일부 구체예에 따라서, 클릭-훈련 자극을 도해하는 자극 다이어그램이다. 도면 114에서 자극은 각 클릭 사이에 25 ms로 40 클릭/s의 클릭 빈도를 갖고, 그리고 각 클릭은 1 ms의 지속 기간을 갖는다.
일부 구체예에서, 소리 자극은 약 10 Hz 내지 약 100 kHz, 약 12 Hz 내지 약 28 kHz, 약 20 Hz 내지 약 20 kHz 및/또는 약 2 kHz 내지 약 5 kHz의 주파수를 가질 수 있다. 가령, 클릭 훈련에서 각 소리 펄스 또는 클릭은 약 10 kHz의 주파수를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 소리 자극은 약 0 dB 내지 약 85 dB, 약 30 dB 내지 약 70 dB 및/또는 약 60 dB 내지 약 65 dB의 음압 수준을 갖는다. 가령, 클릭 훈련에서 각 소리 펄스 또는 클릭은 약 65 dB의 음압 수준을 가질 수 있다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 소교세포-상태 변화를 유도하는 것으로 나타났다. 일부 구체예에 따른 청각 감마 노출 및/또는 투여가 개체의 청각 피질에서 소교세포 활성화를 유도하는 지를 조사하기 위한 연구가 수행되었다. 도면 114와 유사한 40-Hz 클릭-훈련 자극이 이용되었는데, 상기 자극은 약 40 클릭/s의 클릭 빈도를 갖고, 각 클릭은 약 10 kHz 및 약 60-65 dB의 어조 (tone)에서 약 1 ms의 지속 기간을 갖는다. 클릭-훈련 자극은 청각 피질에서 PV+ 개재뉴런을 연행하고, 따라서 청각 피질에서 감마 진동을 외인성으로 조절하는 것으로 가정되었다.
도면 115는 상기 연구를 도해하는 흐름 도표이다. 도면 115에서, WT 생쥐는 그들의 홈 케이지 11500에서 수용되었다. 7 연속일 (1-7 일자) 동안 하루에 1 시간 동안, 생쥐는 행동 상자 (다시 말하면, 방음 챔버) 11502로 이동되었다. 행동 상자 11502에서 생쥐의 첫 번째 군은 침묵에 노출되었고, 그리고 생쥐의 두 번째 군은 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출되었다. 행동 상자 11502에서 매 시간 후, 생쥐는 그들의 홈 케이지 11500으로 복귀되었다. 8 일자에, 생쥐는 조직 수집 및 염색 11504을 위해 희생되었다.
조직은 소교세포의 수준, 소교세포에서 형태적 변화, 그리고 세포체 크기에 의해 지시된 바와 같은 소교세포 활성화에 대해 조사되었다. 도면 116A는 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐와 비교하여 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐에서 소교세포의 평균 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 더욱 많은 소교세포가 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 관찰되었다. 도면 116B는 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐와 비교하여 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐에서 소교세포의 돌출 길이의 평균 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 소교세포 돌출의 길이의 평균 배수적 변화는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 훨씬 적었다. 도면 116C는 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐와 비교하여 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐에서 소교세포의 세포체 크기의 평균 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 소교세포의 세포체 크기의 평균 배수적 변화는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 훨씬 큰데, 이것은 더욱 큰 소교세포 활성화를 지시하였다.
도면 117A는 침묵에 노출된 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 도면 117B는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 소교세포의 돌출 및 세포체는 일부 구체예에 따라서, 도면 117A 및 도면 117B 사이에서 시각적으로 상이하다. 도면 118A는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐로부터 소교세포의 도면 117B로부터 확대된 이미지이다. 소교세포의 하나의 돌출 11800이 강조되었다. 한편, 도면 118B는 침묵에 노출된 생쥐로부터 소교세포의 도면 117A로부터 확대된 이미지이다. 소교세포의 하나의 돌출 11802가 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐로부터 소교세포의 비교적 더욱 짧은 돌출 11800에 비하여 이의 길이를 보여주기 위해 강조되었다.
도면 119A는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐로부터 소교세포의 도면 117B로부터 확대된 이미지이다. 소교세포의 세포체 11900의 구역이 강조되었다. 한편, 도면 119B는 침묵에 노출된 생쥐로부터 소교세포의 도면 117A로부터 확대된 이미지이다. 소교세포의 세포체 11902의 구역이 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐로부터 소교세포의 비교적 더욱 큰 세포체 11900에 비하여 이의 크기를 보여주기 위해 강조되고, 따라서 더욱 큰 소교세포 활성화를 지시하였다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 소교세포 활성화-유사 표현형을 유도하는 것으로 나타났다. 도면 115의 연구는 일부 구체예에 따라서, 5XFAD Tg 생쥐로 반복되었다. 조직은 소교세포의 수준, 소교세포에서 형태적 변화 (가령, 돌출 길이), 그리고 소교세포 활성화 (가령, 세포체 크기에 의해 지시된 바와 같이)에 대해 조사되었다. 도면 120A는 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐와 비교하여 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐에서 이미지 필드마다 소교세포의 평균 숫자를 묘사하는 막대 그래프이다. 훨씬 많은 소교세포가 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 관찰되었다. 도면 120B는 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐와 비교하여 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐에서 소교세포의 세포체 크기에서 평균 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 세포체 크기에서 평균 배수적 변화는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 훨씬 큰데, 이것은 더욱 큰 소교세포 활성화를 지시하였다. 도면 120C는 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐와 비교하여 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐에서 소교세포의 돌출 길이에서 평균 배수적 변화를 묘사하는 막대 그래프이다. 돌출 길이에서 평균 배수적 변화는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 훨씬 적었다.
도면 121A는 침묵에 노출된 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 도면 121B는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 소교세포의 돌출 및 세포체는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐로부터 소교세포에서 비교적 더욱 짧은 돌출 길이 및 더욱 큰 세포체 크기로, 도면 121A 및 도면 121B 사이에서 시각적으로 상이하다.
감마 주파수에서 청각 자극은 개체의 청각 피질 및 해마에서
Aβ를
비침습성으로
감소시킨다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 Aβ의 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 도면 115의 연구는 일부 구체예에 따라서, 6-개월령 5XFAD Tg 생쥐로 반복되었다. 8 일자에, 청각 피질 및 해마가 절개되었다. ELISA가 동종형 Aβ1 -40 펩티드 및 동종형 Aβ1 -42 펩티드를 비롯한 가용성 및 불용성 Aβ 동종형의 수준을 계측하는데 이용되었다. 불용성 Aβ는 플라크를 가용화시키기 위해, 3 시간 동안 5M 구아니딘-HCl로 처리되었다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 가용성 Aβ의 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 도면 122A는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 가용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 가용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 122B는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 가용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 가용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 122C는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 해마에서 가용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 해마에서 가용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 122D는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 해마에서 가용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 해마에서 가용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 불용성 Aβ의 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 도면 123A는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 불용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 불용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 123B는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 불용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 청각 피질에서 불용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 123C는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 해마에서 불용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 해마에서 불용성 동종형 Aβ1 -42 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 123D는 일부 구체예에 따라서, 침묵 (Stim 없음)에 노출된 생쥐의 해마에서 불용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 수준에 비하여 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐의 해마에서 불용성 동종형 Aβ1 -40 펩티드의 훨씬 적은 수준을 묘사하는 막대 그래프이다.
도면 124A는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 5XFAD 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 도면 124B는 침묵에 노출된 5XFAD 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 소교세포의 돌출 및 세포체는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 5XFAD 생쥐로부터 소교세포에서 비교적 더욱 짧은 돌출 길이 및 더욱 큰 세포체 크기로, 도면 124A 및 도면 124B 사이에서 시각적으로 상이하다.
도면 124C는 침묵에 노출된 WT 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 도면 124D는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 WT 생쥐에서 소교세포의 대표적인 이미지이다. 소교세포의 돌출 및 세포체는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 WT 생쥐로부터 소교세포에서 비교적 더욱 짧은 돌출 길이 및 더욱 큰 세포체 크기로, 도면 124C 및 도면 124D 사이에서 시각적으로 상이하다.
따라서, 일부 구체예에 따라서, 감마 주파수에서 비침습성 청각 자극은 청각 피질 및 해마에서 감마 진동 및 AD-연관된 병리의 심대한 감소를 증진하였다.
감마 주파수에서 청각 자극은 개체 행동에 대한 긍정적인 효과를 가졌다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 인식을 향상시키는 것으로 나타났다. 도면 125A는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 5XFAD 생쥐 및 침묵에 노출된 5XFAD 생쥐를 이용하여 수행된 신기한 물체 인식 시험을 도해하는 흐름 도표이다. 상기 시험은 익숙한 물체보다는 신기한 물체를 탐색하는데 더욱 많은 시간을 소모하는 설치류의 성향에 근거하여, 익숙한 물체로부터 신기한 물체를 인식하는 개체의 능력 (다시 말하면, 인식 기억)을 사정한다. 인식 지수 RI가 개체를 비교하는데 이용되었다:
도면 125A에서, 5XFAD 생쥐는 환경 12500에 길들여졌다. 시간 T1에서, 2개의 신기한 물체가 도입되었다 12502. 이후, 시간 T2에서, 1 시간의 안정 이후에, 생쥐는 1 시간 동안 1개의 익숙한 물체 및 1개의 신기한 물체 12504, 12506에 노출되었다. 도면 125B는 일부 구체예에 따라서, 신기한 물체 인식 시험의 결과를 묘사하는 막대 그래프인데, 여기서 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐는 더욱 높은 RI를 가졌는데, 이것은 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐가 더욱 우수한 인식 기억으로 인해, 익숙한 물체보다는 새로운 물체에 훨씬 많은 시간을 소모했다는 것을 지시한다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 식별을 향상시키는 것으로 나타났다. 도면 126A는 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 5XFAD 생쥐 및 침묵에 노출된 5XFAD 생쥐를 이용하여 수행된 신기한 물체 위치 시험을 도해하는 흐름 도표이다. 상기 시험은 새로 위치된 물체를 탐색하는데 더욱 많은 시간을 소모하는 설치류의 성향에 근거하여, 공간 기억 및/또는 식별을 사정한다. 인식 지수 RI가 개체를 비교하는데 이용되었다:
도면 126A에서, 5XFAD 생쥐는 환경 12600에 길들여졌다. 시간 T1에서, 2개의 물체가 첫 번째 위치 12602에서 도입되었다. 이후, 시간 T2에서, 1 시간의 안정 이후에, 생쥐는 1 시간 동안 첫 번째 위치에서 물체 및 새로운 두 번째 위치에서 위치된 다른 물체 12604, 12606 중에서 하나에 노출되었다. 도면 126B는 일부 구체예에 따라서, 신기한 물체 위치 시험의 결과를 묘사하는 막대 그래프인데, 여기서 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐는 더욱 높은 RI를 가졌는데, 이것은 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐가 더욱 우수한 공간 기억 및/또는 식별로 인해, 동일한 위치에서 머물러 있는 물체보다는 이동된 물체에서 훨씬 많은 시간을 소모한다는 것을 지시하였다.
청각 감마 자극은 일부 구체예에 따라서, 개체에서 공간 기억을 향상시키는 것으로 나타났다. 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 5XFAD 생쥐 및 침묵에 노출된 5XFAD 생쥐를 이용하여 Morris 수중 미로 시험이 수행되었다. 앞서 설명된 바와 같이, 상기 시험은 열린 수영 아레나의 시야계 주변에 시작 위치로부터 항행하여 침수된 도피 플랫폼의 위치를 찾기 위해, 개체에 의해 이용된 원위 단서에 근거하여 공간 기억 및/또는 참고 기억을 사정한다. 상기 시험은 반복 시험을 교차하여 사정되었고, 그리고 공간 및/또는 참고 기억은 플랫폼이 부재할 때 플랫폼 구역에 대한 선호에 의해 결정되었다.
도면 127A는 일부 구체예에 따라서 매일, 침묵에 노출된 생쥐 (Stim 없음) 및 클릭-훈련 자극 (Stim)에 노출된 생쥐에 의한 플랫폼을 발견하는 평균 잠재기를 묘사하는 플롯이다. 도면 127B는 플랫폼이 제거된 프로브 시험의 결과를 묘사하는 막대 그래프이다. 일부 구체예에 따른 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐는 침묵에 노출된 생쥐보다 표적 사분면에서 사라져버린 플랫폼을 찾는데 더욱 많은 시간을 소모하고, 따라서 클릭-훈련 자극에 노출된 생쥐가 더욱 우수한 공간 및/또는 참고 기억을 갖는다는 것을 지시하였다.
따라서, 일부 구체예에 따라서, 감마 주파수에서 비침습성 청각 자극은 소교세포 활성화, 감소된 AD-연관된 (가령, Aβ) 병리, 그리고 유의미하게 개선된 인지 결손 (가령, 인식, 식별 및 공간 기억)을 유도하였다. 투여 (자가-투여 포함)를 위한 쉽고 접근가능한 옵션으로, 청각 감마 자극은 가정 또는 휴대 이용을 위한 적용 (가령, 잡음-상쇄 헤드폰을 이용)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 방대한 상업적인 적용을 위한 가능성을 갖는다. 자가-투여 가능성에 더하여, 임상의 및/또는 연구자는 일부 구체예에 따라서, 동물 모형에서부터 인간 환자까지의 범위에서 변하는 개체에 자극 패러다임을 투여할 수 있다. 임상의 및/또는 연구자는 청각 감마 자극을 다양한 형태의 모니터링과 합동하는 것이 유용하다는 것을 발견할 수 있다. 가령, 치료적 세션은 개체를 방음실에 위치시키거나, 또는 개체에게 잡음-상쇄 헤드폰 또는 간섭을 제한하는 다른 장치를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 개체는 자극 동안 예로서, 기능적 자기 공명 영상 (fMRI)을 이용하여, 임의의 유익한 뇌-상태 변화에 대해 모니터링될 수 있다.
실험 방법
동물
모든 동물 작업은 the Committee for Animal Care of the Division of Comparative Medicine (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts)에 의해 승인되었다. 성체 (3-개월령) 수컷 이중 Tg 5XFAD Cre 생쥐는 5XFAD Tg 생쥐를 Tg PV 또는 CW2 프로모터 주동된 Cre 라인과 교배함으로써 생산되었다. 성체 (5-개월령) 수컷 및 암컷 APP/PS1 생쥐는 the Tonegawa Laboratory (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts)로부터 선물되었다. 성체 (4-개월령) 수컷 TauP301S 생쥐는 the Jackson Laboratory로부터 획득되었다. 늙은 WT 생쥐 (8-개월령, C57Bl/6)는 the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)로부터 획득되었다. 생쥐는 표준 12 시간 밝음 / 12 시간 어둠 주기에서 3-5마리의 군에서 수용되었고, 그리고 모든 실험은 밝음 주기 동안 수행되었다. 사료 및 물은 달리 언급되지 않으면 무제한으로 제공되었다. 한배 새끼는 실험자에 의해 각 조건에 무작위로 배정되었다. 실험자는 조직 처리 및 전기생리학적 기록과 분석 동안 동물 유전자형에 맹검이었다. 어떤 동물도 분석으로부터 배제되지 않았다.
AAV 벡터
혈청형 5의 아데노 연관된 바이러스 입자는 the Vector Core Facility (The University of North Carolina, Chapel Hill, North Carolina)로부터 획득되었다. AAV5 바이러스는 EF1α 프로모터에 의해 주동된 이중-플록스트, 반전된, 개방 해독틀 (DIO)에서 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP)에 융합된 ChR2를 내포하였다 (가령, 도면 9를 참조한다). AAV DIO EYFP 구조체는 대조로서 이용되었다.
외과 시술
3-개월령 5XFAD/PV-Cre 또는 CW2 생쥐는 케타민 (1.1 mg kg-1) 및 자일라진 (0.16 mg kg- 1)의 혼합물의 복강내 주사로 마취되었다. 정수리점에서 뒤쪽으로 2.0 mm 및 중심선에서 왼쪽 편측으로 1.8 mm 지점에 작은 개두가 만들어졌다. 바이러스는 Quintessential Stereotaxic Injector™ (Stoelting Co., Wood Dale, Illinois로부터 가용)에 부착된 유리 미량피펫에 의한 작은 경막 절개를 통해 전달되었다. 유리 미량피펫은 뇌 표면 아래 1.2 mm까지 내려갔다. 1 μl의 바이러스의 일시 주사 (AAV DIO ChR2 - EYFP 또는 AAV DIO EYFP; ml당 2 X 1012 바이러스 분자)가 0.075 μl 분-1에서 해마의 CA1 영역 내로 주사되었다. 피펫은 뇌로부터 후퇴되기 전, 주사 이후에 5 분 동안 그대로 유지되었다. 편측성 광학 섬유 이식물 (300 μm 코어 직경, Thorlabs Inc., Newton, New Jersey로부터 가용)은 주사 부위 근처에서 뇌 표면 아래에 0.9 mm까지 내려갔다. 수술 부위의 앞쪽 및 뒤쪽 가장자리에서 고정된 2개의 작은 스크류가 이식물을 제자리에 확보하기 위해 치아 접착제와 결합되었다. 전기생리학적 기록을 위해, 성체 (3-개월령) 수컷 5XFAD/PV-Cre 이중-유전자도입 생쥐 및 5XFAD 음성 한배 새끼 (CA1 기록의 경우), 또는 5XFAD 및 이들의 WT 한배 새끼 (시각 피질 기록의 경우) 생쥐가 이소플루란을 이용하여 마취되고 정위적 프레임 내에 배치되었다. 두피는 제모되었고, 안과 연고 (가령, Puralube® Vet Ointment (Dechra Pharmaceuticals PLC, Northwich, United Kingdom))가 눈에 적용되었고, 그리고 Betadine® 방부제 (Purdue Products L.P., Stamford, Connecticut로부터 가용) 및 70% 에탄올이 수술 구역을 살균하는데 이용되었다. CA1 기록을 위해, 1μL의 바이러스를 CA1에 전달하기 위해 개두 (mm에서, 정수리점으로부터: -2 A/P, 1.8 M/L)가 개방되었다 (앞서 설명된 바와 같이). LFP 기록을 위한 표적 개두술 부위는 두개골 상에 표시되었고 (mm에서, 정수리점으로부터: CA1의 경우 -3.23 A/P, 0.98 M/L 및 시각 피질의 경우 2.8 A/P, 2.5 M/L), 3개 자가-태핑 스크류 (가령, F000CE094, Morris Precision Screws and Parts, Southbridge, Massachusetts로부터 가용)가 두개골에 부착되었고, 그리고 맞춤 스테인리스강 헤드 플레이트가 치과용 시멘트 (가령, C&B Metabond®, Parkell Inc., Edgewood, New York으로부터 가용)를 이용하여 부착되었다. 첫 번째 기록 세션의 일자에, 치아 천공기가 먼저, 대략 100 μm 두께 때까지 두개골을 얇게 만들고, 그리고 이후, 30 게이지 바늘을 이용하여 작은 구멍을 만듦으로써, LFP 개두 (가령, 300-400 μm 직경)를 개방하는데 이용되었다. 개두는 이후, 상기 일자 및 기록 세션 중간에 기록 때까지, 무균 실리콘 탄성중합체 (가령, Kwik-Sil™ 접착제, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Florida로부터 가용)로 밀봉되었다.
광유전학적 자극 프로토콜
생쥐가 회복하고 전기생리학에 이용되는 동물에 대한 행동 훈련을 받고, 그리고 바이러스가 뉴런에서 발현하는 시간을 제공하는, 바이러스 주사 및 이식물 배치 후 2 내지 4 주에, 해마 CA1 뉴런이 광유전학적으로 조작되었다. 200 mW 4793 nm DPSS 레이저가 각 단부에서 섬유 통로/물리적 접촉 연결기를 갖는 패치 코드에 연결되었다. 실험 동안, 1 mW (섬유의 단부로부터 계측된)의 광학적 자극이 1 시간 동안 전달되었다. 분자 및 생화학적 분석을 위해, 각 동물은 3가지 자극 프로토콜: 8 Hz, 40 Hz, 또는 무작위 자극 (광 펄스가 40 Hz의 평균 주파수에서 Poisson 과정에 의해 결정된 무작위 간격으로 전달되었다) 중에서 한 가지를 제공받거나, 또는 전기생리학적 기록의 경우, 각 동물은 기록 동안 끼워 넣어진 모든 자극 조건을 제공받았다.
시각 자극 프로토콜
실험에 앞서 15 분에, 5XFAD 생쥐는 식염수 (대조) 또는 피크로톡신 (0.18 mg/kg)으로 처리되었다. 분자 및 생화학적 분석을 위해, 생쥐는 이후, LED 벌브에 의해 조명된 어두운 챔버 내에 배치되고, 그리고 1 시간 동안 5가지 자극 조건: 어둠, 광, 20-Hz 플리커, 40-Hz 플리커, 또는 80-Hz 플리커 (12.5 ms 점등, 12.5 ms 소등) 중에서 한 가지에 노출되었다 (가령, 도면 43A를 참조한다). 전기생리학적 기록을 위해, 각 동물은 어둠, 광, 40-Hz 플리커, 또는 기록 동안 10 s 블록에서 끼워 넣어진 무작위 (광 펄스가 40 Hz의 평균 간격에서 Poisson 과정에 의해 결정된 무작위 간격으로 전달되었다) 자극 조건을 제공받았다.
전기생리학을 위한 행동 훈련 및 가상 현실 환경 (VR)
CA1 기록을 위해, 머리 고정된 동물은 Harvey 등에서 설명된 바와 같이, 가상 현실 환경을 통해 공기 쿠션에 의해 지지된 8" 구형 트레드밀에서 이동하였다. 구형 트레드밀의 움직임은 광마우스에 의해 계측되고, 그리고 MATLAB® 컴퓨팅 환경 (소프트웨어 버전 2013b, MathWorks, Natick, Massachusetts로부터 가용)에서 작동하는 가상 현실 소프트웨어 내로 제공되었다. 가상 환경은 동물이 몸을 돌릴 수 있는 단부에서 2개의 작은 인클로저가 있는 선형 트랙으로 구성되었다. 동물은 트랙의 각 단부에 교대성 방문을 위해 트랙의 각 단부에서 가당 연유 (물에서 1:2 희석됨)로 보상을 받았다. 동물은 대략 1 주에 걸쳐 가상의 선형 트랙에서 이동하도록 학습되었다. 이들 동물은 1 주 동안 수술로부터 회복하도록 방치되고, 그리고 행동 훈련이 시작되기 전 1 내지 2 일 동안 핸들링에 익숙해졌다. 트레드밀에서 기동하고 시험 환경에서 편안해지도록 학습하기 위해, 훈련의 첫 2 일에, 이들 동물은 가상 현실 시스템이 꺼진 구형 트레드밀 상에 배치되고 희석되지 않은 가당 연유로 보상을 받았다. 구형 트레드밀에서 훈련의 두 번째 일자에, 동물의 사료는 이들이 이동하도록 동기를 부여하기 위해 제한되었다. 동물은 그들의 기준선 체중의 85% 이내로 제한되고, 그리고 전형적으로, 그들의 기준선 체중의 88% 위에서 계량되었다. 세 번째 일자로부터 훈련이 끝날 때까지 (전형적으로 5-7 일), 이들 동물은 VR 선형 트랙에서 이동하는 시간의 양을 증가시키기 위해 (30 분에서 2 시간으로) 트레드밀 상에 배치되었다. 동물은 트랙의 길이를 횡단한 후, 선형 트랙의 단부에서 희석된 (1:2) 가당 연유로 보상을 받았다. 기록 세션 사이에, 동물은 행동 성과를 유지하기 위한 보습 훈련 세션이 제공되었다. 시각 피질 기록을 위해, 동물은 어둠, 광, 또는 광 깜박거림 조건 (아래의 데이터 획득에서 설명됨)에 노출되는 동안 구형 트레드밀에서 이동하였다. 기록에 앞서 동물은 구형 트레드밀 (가상 현실 시스템이 꺼짐) 상에 배치되고 희석되지 않은 가당 연유의 보상을 제공받음으로써 트레드밀에서 기동하고 시험 환경에서 편안해지도록 학습되었다.
전기생리학 데이터 획득
기록 동안 CA1의 광유전학적 자극을 위해, 300 μm 코어 광학 섬유가 바이러스를 뇌 내로 900 μm의 깊이까지 CA1에 전달하는데 이용된 개두를 통해 전진되었다. 1 ms 및 1 mW (섬유의 단부로부터 계측된)인 광 펄스가 473 nm DPSS (다이오드 펌핑된 고체 상태) 레이저를 통해 전달되었다 (앞서 설명된 바와 같이). 광전 인공물을 방지하기 위해, 신경 활성은 유리 전극으로 기록되었다. LFP 전극은 필라멘트-기초된 미량피펫 풀러 (가령, P-97 Flaming/Brown™ 미량피펫 풀러, Sutter Instrument Co., Novato, California로부터 가용) 상에서 붕규산염 유리 피펫 (가령, Warner Instruments, Hamden, Connecticut로부터 가용)으로부터 미세한 첨단부로 끌어당겨졌고, 이것은 이후, 거의 10-20 μm의 직경까지 수동으로 파괴되고, 그리고 이후, 무균 식염수로 충전되었다. CA1 기록을 위해, LFP 전극이 해마 층 피라미드 층의 명백한 전기생리학적 서명이 관찰될 때까지, 관상면 뒤쪽으로 60도 각도 및 수평면 아래쪽으로 45도 각도에서 LFP 기록 개두를 통해 전진되었다 (동물이 이동하는 동안 대략 600-1000 μV 세타파, 부동 동안 명확하게 식별가능한 SWR, 150 μV보다 큰 복수 스파이크, 가령, 도면 2A-2B를 참조한다). 시각 피질 기록을 위해, LFP 전극이 600-900 μm의 깊이까지 LFP 기록 개두를 통해 수직으로 전진되었고, 그리고 150 μV보다 큰 복수 스파이크가 관찰되었다. 데이터는 20 kHz 및 대역 필터링된 1 Hz-1 kHz의 표본추출률에서 획득되었다. 동물은 구형 트레드밀에서 이동하거나 또는 연장된 기간 동안 휴식하였다. 광유전학적 시뮬레이션 세션을 위해, 임의의 자극이 시작되기 전 30 분 동안 데이터가 기록되었다. 이후, 자극이 10 s 기준선 기간 (자극 없음)이 끼워 넣어진 10 s 기간 동안 감마 (40 Hz), 무작위 (광유전학적 자극 하에 설명된 바와 같이), 또는 세타 (8 Hz) 주파수에서 전달되었다. 2마리 동물에서, 각 유형 또는 기준선의 자극이 10 s 기간 대신에 5 분 기간 동안 전달되었다. 각 30 분의 자극 기록은 자극 없음에서 5-30 분의 기록이 뒤따랐다. 가시광선 플리커 시뮬레이션 세션을 위해, 동물을 둘러싸는 LED 스트립 광이 10 s 기간 동안 감마 (40 Hz), 무작위 (시각 자극 프로토콜에서 앞서 설명됨), 세타 (8 Hz), 또는 20 Hz 주파수에서 깜박거리거나, 또는 소등된 10 s 기간이 끼워 넣어진 10 s 기간 동안 연속적으로 점등되었다. 몇몇 기록은 이들 광이 기록 동안 전기 또는 광전 잡음을 창출하지 않도록 담보하기 위해, 광 플리커 동안 뇌 표면 위에서 이루어졌다. 기록 세션은 대략 3-5 시간 후 종결되었다. 동물은 기록의 시점에서 3-4 개월령이었다. 전기생리학 기록의 분석
스파이크 검출
스파이크는 300-6000 Hz 대역 통과된 신호를 임계화함으로써 검출되었다. 역치는 스파이크에 의한 표준 편차 척도의 오염을 방지하기 위해, 필터링된 신호의 중앙 플러스 필터링된 신호의 표준 편차의 견실한 추정값의 5배 (중앙/0.675)이었다 (가령, Rossant et al., "Spike Sorting for Large, Dense Electrode Arrays," bioRxiv doi: dx_doi_org_10.1101_015198 (Feb. 16, 2015)을 참조한다).
지역장 전위 (LFP)
기록된 트레이스는 2 kHz까지 다운샘플링되고, 그리고 이후, 1 내지 300 Hz 사이에 대역-필터링되었다.
세타 및 SWR 검출
해마 네트워크를 교차하여 활성은 동물이 이동하거나 또는 조용히 앉아있을 때 현저하게 변하고, 그리고 이들 변화는 상이한 네트워크 상태로서 종종 지칭된다. 이들 네트워크 상태는 상이한 주파수 밴드에서 LFP 진동의 존재 또는 부재에 의해 명확하게 식별가능하다. 동물이 이동할 때, 다른 것들이 그러한 것처럼 CA1에서 큰 세타 (4-12 Hz) 진동이 관찰되었다 (가령, 도면 2A를 참조한다). 동물이 조용히 앉아 있을 때, 세타 진동은 더 이상 가시적이지 않고, 그리고 대략 50-100 ms 지속되고 개체군 활동의 폭발 (가령, 도면 2B를 참조한다)과 연관되는 150-250 Hz의 고주파 진동인 SWRs가 기록되었다. SWRs는 필터링된 트레이스의 포락선 진폭이 최소한 15 ms 동안 평균을 넘어 4 표준 편차보다 클 때 검출되었다 (가령, 도면 4A, 4B, 5A, 5B, 6A, 6B, 7B 및 8을 참조한다). 포락선 진폭은 필터링된 LFP의 힐버트 변환의 절대값을 취함으로써 계산되었다. 본원에서 개시된 결과는 더욱 큰 SWRs를 검출하는, SWR 검출에 대한 더욱 높은 역치인 평균을 넘어 6 표준 편차를 이용할 때 유지되는 것으로 확증되었다 (가령, 도면 6C 및 7C를 참조한다). 세타 (가령, 도면 3A 및 3C를 참조한다)를 검출하기 위해, LFP는 FIR 에퀴리플 필터를 이용하여 세타 (4-12 Hz), 델타 (1-4 Hz) 및 베타 (12-30 Hz)에 대해 대역 필터링되었다. 세타 대 델타 및 베타의 비율 ('세타 비율')은 델타 및 베타 포락선 진폭의 합에 의해 나눗셈된 세타 포락선 진폭으로서 연산되었다. 세타 기간은 세타 비율이 최소한 2 초 동안 평균을 넘어 1 표준 편차보다 크고, 그리고 상기 비율이 평균을 넘어 최소한 2 표준 편차의 피크에 도달할 때 이와 같이 분류되었다. 비-세타 기간은 세타 비율이 최소한 2 초 동안 1보다 적을 때 이와 같이 분류되었다. SWRs, 세타 기간 및 비-세타 기간은 이들 규준이 SWRs, 세타 기간 및 비-세타 기간을 각각 정확하게 검출하도록 담보하기 위해 시각적으로 검사되었다.
파워 스펙트럼
스펙트럼 분석은 멀티테이퍼 방법 (가령, Chronux 오픈 소스 소프트웨어, the Mitra Lab in Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York으로부터 가용, 시간-대역폭 산물 = 3, 테이퍼의 숫자 = 5)을 이용하여 수행되었다. 자극 없는 파워 스펙트럼을 조사하기 위해 (가령, 도면 3A 및 3C를 참조한다), 단지 세타 기간만 포함되었다: 5 초보다 긴 세타 기간은 5 초 시험으로 나누어졌고, 그리고 이들 시험 동안 각 동물에 대한 평균 파워 스펙트럼 밀도가 연산되었다. 광유전학적 자극 (가령, 도면 13A 및 6C를 참조한다) 및 시각 자극 (가령, 도면 43B 및 43C를 참조한다) 동안 파워 스펙트럼을 조사하기 위해, 데이터는 각 자극 조건 또는 기준선 기간의 10 초 시험으로 나누어졌고, 그리고 이들 시험 동안 각 동물에 대한 평균 파워 스펙트럼 밀도가 연산되었다.
SWRs 동안 감마
분광상은 멀티테이퍼 방법 (가령, Chronux 오픈 소스 소프트웨어, the Mitra Lab in Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York으로부터 가용)을 이용하여 연산되었다. 분광상은 SWR의 피크 전후에 400 ms의 윈도우를 포함하는 각 SWR에 대해 연산되었다. 이후, z-채점된 분광상이 표준 편차의 단위에서 파워의 정규화된 척도를 창출하기 위해 전체 기록 세션을 교차하여 연산된 분광상의 평균 및 표준 편차를 이용하여 각 주파수 밴드에서 연산되었다 (가령, 도면 4A, 4B, 5A 및 5B를 참조한다). SWRs 동안 감마 진동의 순간 주파수는 LFP를 10-50 Hz에 대해 대역 필터링하고, 힐버트 변환을 취하고, 이후 변환된 신호의 피크에서 차이의 역수를 취함으로써 연산되었다 (가령, 도면 4A, 5A 및 6B를 참조한다). SWRs 이전, 동안 및 이후 감마 파워는 LFP를 낮은 감마 (20-50 Hz)에 대해 필터링하고 힐버트 변환의 포락선의 진폭을 취하여 SWR 피크에 중심된 100 ms 빈 (bin)에서 평균 감마 파워를 획득함으로써 연산되었다. 이것은 각 SWR 주변에 각 빈에 대한 z-채점된 감마 파워를 획득하기 위한 전체 기록 세션 동안 포락선의 진폭의 평균 및 표준 편차에 의해 정규화되었다 (가령, 도면 6A 및 7B를 참조한다). SWRs 동안 감마에 의한 위상 변조는 LFP를 감마 (20-50 Hz)에 대해 대역 필터링하고, 힐버트 변환을 취하고, 그리고 SWRs 동안 일어난 각 스파이크에 대한 결과의 신호의 위상을 결정함으로써 연산되었다 (가령, 도면 7E를 참조한다). 5XFAD 및 WT 동물 사이에 위상 변조에서 차이를 계측하기 위해, 복원 재표본추출법이 이용되었다: 각 기록으로부터 100 스파이크의 부분집합이 위상 변조 분포를 창출하기 위해 무작위로 선별되었고, 그리고 각 기록을 위해 이것이 500 회 반복되었다 (가령, 도면 6C 및 7A를 참조한다). 변조의 깊이는 이후, 각 분포에 대한 피크 및 트로프의 합에 의해 나눗셈된, 피크 및 트로프 사이의 차이를 연산함으로써 스파이크-감마상 분포에 대해 계측되었다 (가령, 도면 6C 및 7A를 참조한다). 자극 동안 점화에서 차이: 자극-유발된 멀티유닛 점화 히스토그램을 플롯팅하기 위해, 스파이크가 각 점등 펄스의 시작 후 100 ms 동안 2.5 ms 빈에서 비닝되었고, 그리고 각 빈에서 스파이크의 분율이 연산되었다. 평균 및 SEM이 이후, 모든 점등 기간을 교차하여 연산되었다. 조건 사이에 멀티유닛 점화율에서 차이를 연산하기 위해, 점화율이 자극 또는 기준선의 각 10 초 기간 동안 연산되었다 (기간의 지속 기간에 의해 나눗셈된 스파이크의 총수). 점화율에서 차이는 유관한 유형의 자극의 근접한 기간 사이에서 취해졌다 (광유전학적 자극의 경우 감마 자극 기간 마이너스 기준선 또는 무작위 기간에서 점화율, 광 플리커 자극의 경우 감마 자극 기간 마이너스 기준선, 연속 또는 무작위 기간에서 점화율). 모든 동물로부터 차이는 히스토그램에서 플롯팅되었고 (가령, 도면 14A 및 44A를 참조한다), 그리고 동물마다 차이의 중앙 및 사분위수는 상자 그림에서 플롯팅되었다 (가령, 도면 13B 및 44A를 참조한다).
면역조직화학
생쥐는 깊은 마취 하에 4% 파라포름알데히드로 관류되었고, 그리고 뇌가 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 동안 후위-고정되었다. 뇌는 비브라톰 (가령, Leica VT100S, Leica Biosystems, Buffalo Grove, Illinois으로부터 가용)을 이용하여 40 μm 절개되었다. 섹션은 투과화되고, 그리고 실온에서 1 시간 동안 0.2% Triton X-100 및 10% 정상적인 당나귀 혈청을 내포하는 PBS에서 차단되었다. 섹션은 0.2% Triton X-100 및 10% 정상적인 당나귀 혈청을 포함하는 PBS에서 일차 항체에서 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 일차 항체는 항-EEA1 (BD Transduction Laboratories™ EEA1 (641057), BD Biosciences, San Jose, California로부터 가용), 항-β-아밀로이드 (가령, β-아밀로이드 (D54D2) XP®, Cell Signaling Technology, Danvers, MA로부터 가용), 항-Iba1 (가령, 019-19741, Wako Chemicals, Richmond, Virginia로부터 가용), 항-파브알부민 (가령, ab32895, Abcam, Cambridge, Massachusetts로부터 가용), 항-Rab5 (ADI-KAp -GP006-E, Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, New York으로부터 가용)이었다. ELISA 실험을 확증하기 위해, 항-Aβ 항체 D54D2가 이용되었는데, 그 이유는 이것이 EEA1로 공동표지화를 허용하였기 때문이고, 그리고 항-Aβ 항체 12F4가 이용되었는데, 그 이유는 이것이 APP와 반응하지 않고 상기 표지화가 Aβ에 특이적인 지에 관한 결정을 허용하였기 때문이다. 공동표지화 실험을 위해, 항-Aβ 항체 12F4 (805501, BioLegend, San Diego, California로부터 가용)가 이용되었다. 일차 항체는 Alexa-Fluor 488 및 Alex-Fluor 647 이차 항체 (Molecular Probes)로 가시화되었고, 뉴런 핵은 Hoechst 33342 (94403, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri로부터 가용)로 가시화되었다. 이미지는 모든 조건에 대해 동일한 세팅에서 공초점 현미경 (LSM 710; Zeiss™)을 이용하여 획득되었다. 이미지는 처리군에 맹검인 실험자에 의해 ImageJ 1.42q를 이용하여 정량되었다. 각 실험적 조건에 대해, 최소한 3마리 동물로부터 최소한 2개의 두정 섹션이 정량에 이용되었다. 해마 CA1 영상화를 위해, 분석은 적절한 숫자의 세포를 영상화하기 위해 전체 시계가 필요했던 Iba1+ 세포 분석의 경우를 제외하고, 피라미드 세포 층에 한정되었다. ImageJ가 Iba1+ 세포체의 직경을 계측하고 길이 계측을 위해 과정을 추적하는데 이용되었다. 이에 더하여, Coloc2 플러그인이 Iba1 및 Aβ의 동시국지화를 계측하는데 이용되었다. Imaris x64 8.1.2 (Bitplane, Belfast, United Kingdom으로부터 가용)가 3-D 렌더링에 이용되었다. "플라크 숫자"를 계수하기 위해, 10 μm보다 크거나 또는 이와 동등한 침착물이 포함되었다.
CLARITY
고정된 뇌는 1XPBS에서 비브라톰 (가령, Leica VT100S, Leica Biosystems, Buffalo Grove, Illinois로부터 가용)에서 100 uM 두정 섹션으로 잘라졌다. Allen Mouse Brain Atlas를 참조하여, 시각 피질을 내포하는 섹션이 선택되었고, 그리고 청소 완충액 (pH 8.5-9.0, ddH2O에서 200mM 나트륨 도데실술페이트, 20mM 수산화리튬 일수화물, 4mM 붕산)에서 2 시간 동안 배양되고, 55℃에서 진탕되었다. 청소된 섹션은 1XPBST (0.1% Triton-X100/1XPBS)에서 3 x10 분 세척되고, 그리고 실온에서 진탕하면서, 차단 용액 (2% 소 혈청 알부민/1XPBST) 내로 하룻밤 동안 집어넣어졌다. 차후에, 실온에서 진탕하면서, 1X. PBST에서 3회 1 시간 세척이 수행되었다. 섹션은 이후, 4℃에서 2 일 동안 배양되고, 항-β-아밀로이드 (805501, BioLegend, San Diego, California로부터 가용) 및 항-Iba1 (Wako Chemicals, Richmond, Virginia; 019-19741) 일차 항체와 함께 진탕되고, 1X PBST에서 1:100으로 희석되었다. 1XPBST에서 3x1 h 세척의 다른 세트가 수행되었고, 그 후 섹션이 9 시간 동안 배양되고, 실온에서, 1:100 1X PBS 희석된 이차 항체 혼합물에서 진탕되었다. 단편화된 당나귀 항토끼 Alexa Fluor® 488 (ab175694) 및 항생쥐 568 (ab150101) 이차 항체 (둘 모두 Abcam, Cambridge, Massachusetts로부터 가용)가 일차 항체 표지화를 가시화하는데 이용되었다. 이러한 배양 기간의 중간쯤에, Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich; 94403)이 1:250 최종 희석에서 각 표본 내로 스파이크되었다. 섹션은 이후, 실온에서 진탕하면서, 1xPBS에서 하룻밤 동안 세척되었다. 영상화를 위한 표본제작에 앞서, 슬라이스가 실온에서 진탕하면서, 1 시간 동안 RIMS (굴절률 정합 용액: 75g 히스토덴즈, 20mL 0.1M 인산염 완충액, 60mL ddH2O)에서 배양되었다. 조직 섹션은 Fluoromount G 봉입제 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)를 이용하여, 커버슬립이 있는 현미경검사 슬라이드 (가령, VistaVision™, VWR International, LLC, Radnor, PA로부터 가용) 위에 적재되었다. 이미지는 Zen Black 2.1 소프트웨어 (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany)를 수반하는 Zeiss™ LSM 880 현미경에서 획득되었다. 3-D 재건에 이용된 섹션 개요 및 세포 수준 이미지는 Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC 대물렌즈를 이용하여 촬영되었다. Imarisx64 8.1.2 (Bitplane™ (Zurich, Switzerland)가 3-D 렌더링 및 분석에 이용되었다.
웨스턴 블롯
해마 CA1 전체 세포 용해물은 3-개월령 수컷 5XFAD/PV-Cre 생쥐로부터 조직을 이용하여 준비되었다. 조직은 1 ml RIPA (50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Np -40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 완충액에서 손 균질기 (Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri))로 균질화되고, 얼음 위에서 15 분 동안 배양되고, 그리고 4℃에서 30 분 동안 회전되었다. 세포 조직파편은 10 분 동안 14,000 rpm에서 원심분리에 의해 단리되고 폐기되었다. 용해물은 나노드롭을 이용하여 정량되었고, 그리고 25 μg 단백질이 10% 아크릴아미드 겔 위에 부하되었다. 단백질은 100 V에서 120 분 동안 아크릴아미드 겔로부터 PVDF 막 (가령, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts로부터 가용)으로 이전되었다. 막은 TBS:Tween에서 희석된 소 혈청 알부민 (5% w/v)을 이용하여 차단되었다. 막은 4 ℃에서 하룻밤 동안 일차 항체 및 실온에서 90 분 동안 이차 항체에서 배양되었다. 일차 항체는 항-APP (Invitrogen™ PAD CT695, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts로부터 가용), 항-APP (A8967, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri로부터 가용), 항-β-액틴 (ab9485, Abcam, Cambridge, Massachusetts로부터 가용)이었다. 이차 항체는 양고추냉이 과산화효소-연결되었다 (가령, GE Healthcare, Marlborough, Massachusetts로부터 가용). 신호 강도는 ImageJ 1.46a를 이용하여 정량되고 β-액틴의 값에 정규화되었다. 타우 단백질 용해도는 순차적 단백질 추출을 이용하여 조사되었다. 세정제 불용성 타우 분획물은 Tau5에 대한 항체 (가령, AHB0042, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts로부터 가용)를 이용하여 탐침되었다.
ELISA
해마 CA1 또는 VC는 수컷 생쥐로부터 단리되고, PBS 또는 5M 구아니딘 HCl로 용해되고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서 생쥐/인간 Aβ1 -40 또는 Aβ1 -42 ELISA 키트 (가령, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts로부터 가용)를 이용한 Aβ 계측에 종속되었다. 조직은 PBS 가용성 Aβ 분획물을 추출하기 위해 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 용해되었다. 가용성 Aβ 분획물은 아마도, 단위체성 및 올리고머성 Aβ를 내포하였다. 조직은 불용성 Aβ 분획물을 추출하기 위해 구아니딘 염화수소산 (HCl)으로 더욱 처리되었다.
유전체-너비 RNA 염기서열결정
전체 RNA는 RNeasy® 키트 (Qiagen, Hilden, Germany로부터 가용)를 이용하여 해마 CA1 분리물로부터 추출되었다. 정제된 mRNA는 제조업체의 사용설명서에 따라서 BIOO NEXTflex™ 키트 (BIOO# 5138-08)를 이용하여 RNA-seq 라이브러리 제조에 이용되었다. 간단히 말하면, 1 μg의 전체 mRNA가 폴리-A 정제, 단편화, 첫 번째 플렉스 가닥 및 두 번째 가닥 합성, DNA 단부-아데닐화 및 어댑터 결찰의 순차적 작업 흐름에 종속되었다. 이들 라이브러리는 15 주기의 PCR 반응에 의해 농축되고 Agencourt® AMPure XP 자성 비드 (Beckman Coulter Genomics, Danvers, Massachusetts로부터 가용)로 청소되었다. 라이브러리의 품질은 진전된 분석적-단편 분석기를 이용하여 사정되었다. 바코드화된 라이브러리는 MIT BioMicro Center (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts)에서 Illumina HiSeq 2000 플랫폼 상에서 단일 레인에서 염기서열결정을 위해 동등하게 혼합되었다. 50-bp 단일 단부 서열 리드의 미가공 fastq 데이터가 TopHat 2.0 소프트웨어 (the Center for Computational Biology at Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland로부터 가용, 초-고처리량 짧은 리드 얼라이너 Bowtie를 이용하여 RNA-seq 리드를 포유류-크기산정된 유전체에 맞춰 정렬하고, 그리고 이후, 지도화 결과를 분석하여 엑손 사이에 스플라이스 접합부를 확인하기 위해)를 이용하여 생쥐 mm9 참고 유전체에 맞춰 정렬되었다. 지도화된 리드는 전사체 존재비를 추정하고 차별적 발현을 시험하기 위한 UCSC mm9 참고 유전자 주해로 Cufflinks 2.2 소프트웨어 (the Trapnell Lab at the University of Washington, Seattle, Washington으로부터 가용)에 의해 처리되었다. 전사체의 상대적 존재비는 지도화된 백만 개 단편당 엑손의 킬로베이스당 단편 (FPKM)에 의해 계측되었다. 처리된 군 및 처리되지 않은 군 사이에 유전자 차별적 발현 시험은 통계학적 유의성을 위한 조정된 p-값<0.05에서 Cuffdiff 모듈 (Cufflinks 2.2 소프트웨어 (the Trapnell Lab at the University of Washington, Seattle, Washington으로부터 가용))의 일부로서 포함된, 전사체 발현, 스플라이싱 및 프로모터 이용에서 유의미한 변화를 발견하기 위한)을 이용하여 수행되었다 (GEO 수탁: GSE77471).
RNA-seq 데이터로부터 세포 및 분자 기전을 이해하기 위해, 공개적으로 가용한 RNA-seq 데이터세트 중에서 14개가 세포 유형 특이적 분석을 위해 처리되었다. 추가적으로, 상이한 화학적 및 유전적 섭동 하에 60개의 공개적으로 가용한 뉴런-, 소교세포- 및 대식세포-특이적 RNA-seq 데이터세트가 다운로드되고, 그리고 GSEA 통계학적 분석을 위해 TopHat Cufflinks 2.2 소프트웨어 (the Trapnell Lab at the University of Washington, Seattle, Washington으로부터 가용)를 이용하여 처리되었다. 유전자 세트 증폭 분석 (GSEA)은 RNA-seq 데이터로부터 규정된 유전자 세트가 특정 섭동 연구로부터 순위매겨진 유전자 목록의 어느 한쪽 방향에서 유의미하게 강화되는 지를 결정하는데 이용되었다. 공개 RNA-seq 데이터세트에서 검출된 유전자는 양성 값으로부터 음성 값으로, 배수적 변화 (대조와 대비하여 사례)의 log2 값에 의해 순위매겨졌다. 규정된 유전자 세트 (이 경우에 있어서, 감마 처리 시에 상향- 또는 하향-조절된 유전자)는 명목상 p-값 및 FDR q-값 둘 모두 0.05보다 적을 때, 섭동-유도된 전사체학 변화 (상향- 또는 하향-조절)와 유의미하게 상관되는 것으로 고려되었다. 계산된 정규화된 강화 점수 (NES)의 신호는 유전자 세트가 순위매겨진 목록의 위쪽 또는 아래쪽에서 강화되는 지를 지시한다. 차별적으로 발현된 유전자에 대한 히트맵은 맞춤 R 스크립트를 이용하여 산출되었고, 그리고 각 유전자에 대한 모든 라이브러리를 교차하여 z-점수 값은 유전자 FPKM 값에 근거하여 계산되었다. 세포 유형 특이성 분석을 위한 상자 플롯 역시 유전자 FPKM 값에 근거하여, R 프로그램에 의해 산출되었다.
정량적 RT-PCR
CA1은 3-개월령 수컷 5XFAD/PV-Cre 생쥐의 해마로부터 단리되었다. 조직은 액체 질소를 이용하여 급속히 동결되고 -80 ℃에서 보관되고, 그리고 RNA가 제조업체의 프로토콜 (Qiagen(Hilden, Germany))에 따라서 RNeasy 키트를 이용하여 추출되었다. RNA (3 μg)는 DNase I 처리되고 (4 U, Worthington Biochemical Corporation (Lakewood, New Jersey)), 제조업체의 사용설명서에 따라서 RNA Clean and Concentrator-5 키트 (Zymo Research (Irvine, California))를 이용하여 정제되고, 14 μl DEPC-처리된 물로 용리되었다. 각 표본에 대해, 1 μg RNA가 50 ℃에서 1 시간 동안, 무작위 헥사머 혼합물 및 Superscript III 역전사효소 (50 U, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts로부터 가용)를 내포하는 20 μl 반응 용적에서 역전사되었다. 첫 번째 가닥 cDNAs는 1:10 희석되었고, 그리고 1 μl가 프라이머 (0.2 μM)를 내포하는 20 μl 반응물 (SsoFast™ EvaGreen® Supermix, Bio-Rad)에서 RT-qPCR 증폭에 이용되었다. 유전자 발현에서 상대적 변화는 2-△△Ct 방법을 이용하여 사정되었다.
시각 피질로부터 소교세포의 단리. V1 영역은 급속히 절개되고 얼음같이 차가운 Hanks 균형 염 용액 (HBSS) (Gibco™ 14175-095, Life Technologies로부터 가용) 내에 배치되었다. 조직은 이후, 약간 변형된 제조업체의 프로토콜에 따라서 신경 조직 분리 키트 (P) (130-092-628, Miltenyi Biotec, Cambridge, Massachusetts)를 이용하여 효소적으로 소화되었다. 구체적으로, 조직은 35 분 대신에, 15 분 동안 37 ℃에서 효소적으로 소화되었고, 그리고 결과의 세포 현탁액은 MACS® SmartStrainer, 70 μm 대신에, 40 μm 셀 스트레이너 (352340, Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, New York)에 통과되었다. 결과의 세포 현탁액은 이후, 알로피코시아닌 (APC)-접합체 CD11b 생쥐 클론 M1/70.15.11.5 (130-098-088, Miltenyi Biotec, Cambridge, Massachusetts) 및 피코에리트린 (PE)-접합된 CD45 항체 (가령, BD Pharmingen™, 553081)를 이용하여 염색되었다. 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)가 이후, CD11b 및 CD45 양성 소교세포를 정제하는데 이용되었다. 이들 세포는 1XPBS 내로 직접적으로 분류되었다 (가령, 도면 52A를 참조한다).
통계
정상적으로 분포되지 않은 전기생리학적 데이터의 경우에, 결과는 달리 언급되지 않으면 중앙 및 사분위수로서 표시된다. 동등한 중앙에 대한 양쪽 윌콕슨 순위 합계 검증이 분포가 유의미하게 상이한 지를 결정하기 위해 수행되거나 또는 윌콕슨 부호 순위 검증이 분포가 제로와 유의미하게 상이한 지를 결정하기 위해 수행되었는데, 그 이유는 이들은 데이터가 정상적으로 분포된 것으로 가정하지 않기 때문이다. 가변성은 통계학적으로 비교되는 군 간에 유사하였다. 본페로니 방법이 다중 비교를 교정하는데 이용되었다. 분자 및 생화학적 결과는 평균 및 SEM으로서 표시된다. 본 발명에서 진술된 백분율은 군 평균이다. 모든 통계학적 분석은 Prism GraphPad software (GraphPad software Inc., La Jolla, California)를 이용하여 수행되었다. 정규성은 D'Agostino & Pearson omnibus 정규성 시험을 이용하여 결정되었다. 가변성은 통계학적으로 비교되는 군 간에 유사하였다. 2개 군으로 구성되는 정상적으로 분포된 데이터에 대한 비교 데이터는 양측 비대칭 t 검증에 의해 분석되었다. 3개 또는 그 이상 군으로 구성되는 정상적으로 분포된 데이터에 대한 데이터의 비교는 일원 변량분석 (ANOVA), 그 이후에 Tukey의 다중 비교 검증에 의해 분석되었다. 비-정상적으로 분포된 데이터에 대한 비교 데이터는 만 휘트니 검증을 이용하여 실행되었다. 각 실험에 대한 통계학적 검증, 정확한 P 값 및 표본 크기 (n)는 도면 범례에서 특정된다. 분자 및 생화학적 분석은 조건마다 최소한 3개의 생물학적 복제물을 이용하여 수행되었다.
청각 감마 자극 산출
MATLAB® 프로그래밍 언어 (MathWorks, Natick, Massachusetts로부터 가용)로 작성된 다음의 스크립트는 일부 구체예에 따른 청각 클릭-훈련 자극을 산출하는 한 가지 방식을 예시한다:
click_freq=input('Specify Number of Clicks Per Second: ');%Obtain desired number of clicks per second from the keyboard
click_duration =input('Specify Click Duration in Milliseconds: ');%Obtain desired click duration from the keyboard
sound_freq=input('Specify Sound Frequency in Hertz: ');%Obtain desired sound frequency in Hertz from the keyboard
sound_duration =input ('Specify Sound Duration in Seconds: ');%Obtain desired sound duration from the keyboard
%audio_sample_rate=input ('Specify Audio Sample Rate in Hertz: ');%Obtain desired audio sample rate from the keyboard
audio_file_name =input ('Specify Audio File Name and Extension: ');%Obtain desired audio file name from the keyboard
rfreq=2*pi*sound_freq;%Convert sound frequency to radian frequency
%% audio_sample_rate = double(sound_freq*8);
%%
%% if audio_sample_rate < 8192
%% audio_sample_rate = 8192
%% end
audio_sample_rate = 200000;
%Ts=linspace (0, sound_duration,audio_sample_rate*sound_duration);%Specify sample times over 4 seconds (default sample rate in 8192 Hz)
Ts=0:1/audio_sample_rate:sound_duration;
sound_signal=cos(rfreq*Ts);%Calculate the cosine for the entire sound duration
pulse_width = click_duration/1000;% pulse width
D_1 = pulse_width/2:1/click_freq:max(Ts);% 50Hz repetition freq; note: starting D at width/2 instead of 0 to shift the pulse train to the right by width/2 and thus start the train at 0
pulse_train_mask = pulstran(Ts, D_1, 'rectpuls', pulse_width):
%Mask the sound signal with the pulse train mask
sound_signal_masked = sound_signal.*pulse_train_mask;
%Play the click sound
soundsc(sound_signal_masked, audio_sample_rate);
%Save the audio file
audiowrite(audio_file_name, sound_signal_masked, audio_sample_rate);
결론
다양한 발명 구체예가 본원에서 설명되고 예시되긴 했지만, 당업자는 기능을 수행하고 및/또는 본원에서 설명된 결과 및/또는 하나 또는 그 이상의 이점을 획득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이고, 그리고 이런 변이 및/또는 변형 각각은 본원에서 설명된 발명 구체예의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본원에서 설명된 모든 파라미터, 치수, 재료 및 형상이 예시적인 것으로 의미되고, 그리고 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 형상이 발명의 교시가 이용되는 특정한 적용 또는 적용들에 의존할 것이라는 것을 쉽게 인지할 것이다. 당업자는 본원에서 설명된 특정한 발명 구체예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 단지 일과적인 실험만을 이용하여 확인할 수 있을 것이다. 이런 이유로, 전술한 구체예는 단지 실례로서 제시되고, 그리고 첨부된 청구항 및 이의 등가물의 범위 내에서, 발명 구체예는 특정적으로 설명되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 발명 구체예는 본원에서 설명된 각 개별 특질, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관계한다. 이에 더하여, 이런 특질, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 상호간에 모순되지 않는다면, 2개 또는 그 이상의 이런 특질, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 발명의 발명 범위 내에 포함된다.
전술한 구체예는 다양한 방식 중에서 한 가지에서 실행될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 구체예는 하드웨어, 소프트웨어 또는 이들의 조합을 이용하여 실행될 수 있다. 소프트웨어에서 실행될 때, 소프트웨어 코드는 단일 컴퓨터에서 제공되거나 또는 복수 컴퓨터 사이에서 분산되는 지에 상관없이, 임의의 적합한 프로세서 또는 프로세서의 컬렉션에서 실행될 수 있다.
게다가, 컴퓨터는 다수의 형태 중에서 한 가지, 예를 들면, 선반-적재된 컴퓨터, 데스크톱 컴퓨터, 랩톱 컴퓨터, 또는 태블릿 컴퓨터에서 구현될 수 있는 것으로 인지되어야 하다. 추가적으로, 컴퓨터는 개인 휴대용 단말기 (PDA), 스마트폰 또는 임의의 다른 적합한 이동식 또는 고정식 전자 장치를 비롯하여, 일반적으로 컴퓨터로서 간주되지 않지만 적합한 처리 능력을 갖는 장치에서 내장될 수 있다.
또한, 컴퓨터는 하나 또는 그 이상의 입력 및 출력 장치를 가질 수 있다. 이들 장치는 그 중에서도 특히, 사용자 인터페이스를 제공하는데 이용될 수 있다. 사용자 인터페이스를 제공하는데 이용될 수 있는 출력 장치의 실례는 출력의 시각 표현을 위한 프린터 또는 디스플레이 스크린, 그리고 출력의 가청 표현을 위한 스피커 또는 다른 소리 발생 장치를 포함한다. 사용자 인터페이스에 이용될 수 있는 입력 장치의 실례는 자판 및 위치 결정 장치, 예를 들면, 마우스, 터치 패드 및 디지타이징 태블릿을 포함한다. 다른 실례로서, 컴퓨터는 언어 인식을 통해 또는 다른 가청 형식으로 입력 정보를 제공받을 수 있다.
이런 컴퓨터는 근거리 통신망 또는 광역 통신망, 예를 들면, 기업 네트워크 및 인텔리전트 네트워크 (IN) 또는 인터넷을 비롯하여, 임의의 적합한 형태에서 하나 또는 그 이상의 네트워크에 의해 상호 연결될 수 있다. 이런 네트워크는 임의의 적합한 기술에 근거될 수 있고, 그리고 임의의 적합한 프로토콜에 따라 작동할 수 있다, 그리고 무선 네트워크, 유선 네트워크 또는 광섬유 네트워크를 포함할 수 있다.
본원에서 개설된 다양한 방법 또는 과정은 다양한 운영 체계 또는 플랫폼 중에서 한 가지를 이용하는 하나 또는 그 이상의 프로세서에서 실행가능한 소프트웨어로서 암호화될 수 있다. 추가적으로, 이런 소프트웨어는 다수의 적합한 프로그래밍 언어 및/또는 프로그래밍 또는 스크립팅 도구 중에서 한 가지를 이용하여 작성될 수 있고, 그리고 또한, 프레임워크 또는 가상의 기계에서 실행되는 실행가능한 기계 언어 코드 또는 중간 코드로서 편집될 수 있다.
또한, 다양한 발명 개념은 하나 또는 그 이상의 방법으로서 구현될 수 있는데, 이의 실례가 제공되었다. 방법의 일부로서 수행된 행위는 임의의 적합한 방식으로 정연할 수 있다. 따라서, 행위가 예시된 것과 상이한 순서로 수행되는 구체예가 구성될 수 있는데, 이것은 비록 예시적인 구체예에서 순차적인 행위로서 도시된다 하더라고, 일부 행위를 동시에 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전체적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 규정되고 이용된 바와 같은 모든 정의는 사전 정의, 참조로서 편입된 문서에서 정의 및/또는 규정된 용어의 일상적인 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 하다.
본원에서 이용된 바와 같이, 부정 관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 및 청구항에서, 명확하게 반대로 지시되지 않으면, "최소한 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "및/또는"는 본 명세서에서 및 청구항에서, 그렇게 연합된 요소, 다시 말하면, 일부 사례에서 결합하여 존재하고 다른 사례에서 분리적으로 존재하는 요소 중에서 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 복수 요소는 동일한 방식으로, 다시 말하면, 그렇게 연합된 요소 중에서 "하나 또는 그 이상"인 것으로 해석되어야 하다. 특정적으로 확인된 요소에 관련되는 지 또는 관련 없는 지에 상관없이, "및/또는" 조항에 의해 특정적으로 확인된 요소 이외에 다른 요소가 임의선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 무제한적 실례로서, 개방형 언어, 예를 들면, "포함하는"과 함께 이용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 구체예에서, A 단독 (B 이외에 요소를 임의선택적으로 포함); 다른 구체예에서, B 단독 (A 이외에 요소를 임의선택적으로 포함); 또 다른 구체예에서, A 및 B 둘 모두 (다른 요소를 임의선택적으로 포함); 기타 등등을 지칭할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "또는"은 본 명세서에서 및 청구항에서, 상기 규정된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 하다. 가령, 목록 내에 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인, 다시 말하면, 요소의 숫자 또는 목록 중에서 최소한 하나, 하지만 또한, 하나 이상을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 명확하게 반대로 지시되는 유일 용어, 예를 들면, "중에서 단지 한 가지만" 또는 "중에서 정확하게 한 가지", 또는 청구항에서 이용될 때, "구성되는"은 가령, 요소의 숫자 또는 목록 중에서 정확하게 한 가지 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "또는"은 배타성의 용어, 예를 들면, "어느 한쪽", "중에서 한 가지", "중에서 단지 한 가지만" 또는 "중에서 정확하게 한 가지"가 선행할 때, 배타적인 대안 (다시 말하면, "한 가지 또는 다른 것, 하지만 둘 모두는 아님")을 지시하는 것으로서 해석될 것이다. 청구항에서 이용될 때 "본질적으로 구성되는"은 특허법의 분야에서 이용된 바와 동일한 통상적인 의미를 가질 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 요소의 목록에 관하여 관용구 "최소한 하나"는 본 명세서에서 및 청구항에서, 요소의 목록 내에 요소 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상에서 선택되는 최소한 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에서 특정적으로 열거된 각각의 모든 요소 중에서 최소한 하나를 반드시 포함하는 것은 아니고 요소의 목록 내에 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 특정적으로 확인된 요소에 관련되는 지 또는 관련 없는 지에 상관없이, 관용구 "최소한 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 특정적으로 확인된 요소 이외에 요소가 임의선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 무제한적 실례로서, "A 및 B 중에서 최소한 하나" (또는, 동등하게는, "A 또는 B 중에서 최소한 하나" 또는 동등하게는, "A 및/또는 B 중에서 최소한 하나")는 한 구체예에서, B가 존재하지 않으면서, 하나 이상을 임의선택적으로 포함하는 최소한 하나의 A (및 B 이외에 요소를 임의선택적으로 포함); 다른 구체예에서, A가 존재하지 않으면서, 하나 이상을 임의선택적으로 포함하는 최소한 하나의 B (및 A 이외에 요소를 임의선택적으로 포함); 또 다른 구체예에서, 하나 이상을 임의선택적으로 포함하는 최소한 하나의 A 및 하나 이상을 임의선택적으로 포함하는 최소한 하나의 B (및 다른 요소를 임의선택적으로 포함); 기타 등등을 지칭할 수 있다.
청구항에서뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 이행성 관용구, 예를 들면, "포함하는", "포함하는", "보유하는", "갖는", "내포하는", "수반하는", "유지하는", "구성된" 등은 개방형, 다시 말하면, 포함하지만 한정되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 유일 이행성 관용구 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"은 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에서 진술된 바와 같이, 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 이행성 관용구일 것이다.
Claims (81)
- 개체에서 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하도록 개체에 비침습성 자극을 투여하기 위해 설정된 장치로서, 상기 장치는 개체에서 치매를 치료하기 위해 추가로 설정되는 장치.
- 청구항 1에 있어서,
상기 동기화된 감마 진동은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는 장치. - 청구항 2에 있어서,
상기 동기화된 감마 진동은 약 40 Hz의 주파수를 갖는 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 세포 유형 특이적 방식으로 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하여 개체에 비침습성 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 4에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 빠른-스파이킹-파브알부민(FS-PV)-개재뉴런의 동기화된 활성화를 유도하는 것을 포함하여 개체에 비침습성 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 뇌-영역 특이적 방식으로 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하여 개체에 비침습성 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 6에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 해마 영역 및 감각 피질 영역 중에서 최소한 하나에서 동기화된 활성화를 유도하는 것을 포함하여 개체에 비침습성 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 치매는 알츠하이머병, 혈관 치매, 전두 측두 치매, 루이체 치매, 및 나이 관련 인지 저하 중에서 최소한 하나와 연관되는 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 개체는 인간인 장치. - 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 생체내 동기화된 감마 진동을 유도하도록 자극 방출 장치를 제어하여 감마 진동을 갖는 자극을 방출하기 위한 자극 방출 장치로서, 상기 자극은 비침습적 투여를 위한 것인 자극 방출 장치;
자극 파라미터 및 프로세서 실행가능한 명령을 저장하기 위한 최소한 하나의 메모리; 및
상기 자극 방출 장치 및 상기 최소한 하나의 메모리에 통신가능하게 연결된 최소한 하나의 프로세서;를 포함하는 시스템으로서,
상기 프로세서 실행가능한 명령의 실행 시에, 상기 최소한 하나의 프로세서는 상기 자극 방출 장치를 제어하여 상기 자극 파라미터에 따라 자극을 방출하고, 상기 파라미터는 그 주파수에서 뇌 영역을 동기적으로 활성화하기 위한 주파수를 포함하고,
상기 시스템은 개체에서 치매를 치료하기 위해 추가로 설정되는 시스템. - 청구항 10에 있어서,
상기 자극의 감마 진동은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는 시스템. - 청구항 11에 있어서,
상기 자극의 감마 진동은 약 40 Hz의 주파수를 갖는 시스템. - 청구항 10에 있어서,
상기 자극 방출 장치는 촉각 장치, 발광 장치, 및 소리 방출 장치 중에서 최소한 한 가지인 시스템. - 자극에 대한 반응으로 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 양을 유지 또는 감소시키기 위하여 개체에 감마 진동을 갖는 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 설정된 장치로서,
상기 장치는 개체에서 치매를 치료하기 위하여 추가로 설정되는 장치. - 청구항 14에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 생산을 감소시키는 것을 포함하여 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 15에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 C 말단 단편(CTF) 및 N 말단 단편(NTF) 중에서 최소한 하나의 양을 감소시키는 것을 포함하여 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 16에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 β-세크레타아제(BACE1) 및 γ-세크레타아제 중에서 최소한 하나에 의한 APP의 CTF 및 NTF로의 개열을 감소시키는 것을 포함하여 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 15에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 엔도솜의 숫자를 감소시키는 것을 포함하여 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 14에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 소실을 증진하는 것을 포함하여 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 19에 있어서,
상기 장치는 치매를 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포에 의한 Aβ 펩티드의 흡수를 증가시키는 것을 포함하여 최소한 하나의 자극을 투여하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위해 설정된 장치로서,
동기화된 감마 진동을 유도하는 것은 개체에 대략 35 Hz 내지 대략 45 Hz의 주파수를 갖는 시각 또는 청각 신호를 비침습성으로 전달하는 것을 포함하고, 상기 장치는 개체에서 알츠하이머병을 치료하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 동기화된 감마 진동은 약 40 Hz의 주파수를 갖는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 세포 유형 특이적 방식으로 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 23에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 빠른-스파이킹-파브알부민(FS-PV)-개재뉴런의 동기화된 활성화를 유도하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 뇌-영역 특이적 방식으로 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 25에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 해마 영역 및 감각 피질 영역 중에서 최소한 하나에서 동기화된 활성화를 유도하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 26에 있어서,
상기 감각 피질 영역은 시각 피질 또는 청각 피질을 포함하는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 개체는 인간인 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 양을 유지 또는 감소시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되고, 상기 Aβ 펩티드는 동종형 Aβ1-40 펩티드 및 동종형 Aβ1-42 펩티드 중에서 최소한 하나를 포함하는 장치. - 청구항 29에 있어서,
상기 Aβ 펩티드는 가용성 Aβ 펩티드 및 불용성 Aβ 펩티드 중에서 최소한 하나를 포함하는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 생산을 감소시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 31에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 C 말단 단편(CTF) 및 N 말단 단편(NTF) 중에서 최소한 하나의 양을 감소시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 32에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 β-세크레타아제(BACE1) 및 γ-세크레타아제 중에서 최소한 하나에 의한 APP의 CTF 및 NTF로의 개열을 감소시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 31에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 엔도솜의 숫자를 감소시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 34에 있어서,
상기 엔도솜은 초기 엔도솜 항원 1(EEA1) 및 RAB5A 유전자에 의해 인코딩된 Ras-관련된 단백질(Rab5) 중에서 최소한 하나에 대해 양성인 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 Aβ 펩티드의 소실을 증진하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 36에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포에 의한 Aβ 펩티드의 흡수를 증가시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포의 활성에 관련된 최소한 하나의 차별적으로 발현된 유전자를 상향조절하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 38에 있어서,
상기 최소한 하나의 차별적으로 발현된 유전자는 Nr4a1, Arc, Npas4, Cd68, B2m, Bsr2, Icam1, Lyz2, Irf7, Spp1, Csf1r, 및 Csf2ra 중에서 최소한 하나를 포함하는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포의 숫자를 증가시키거나, 신경보호 상태와 일치하는 소교세포에서 형태적 변화를 유도하거나, 소교세포의 활성을 증진하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되고, 상기 신경보호 상태와 일치하는 소교세포에서 형태적 변화는 세포체 크기에서의 증가 및 돌기 길이에서의 감소 중에서 최소한 하나를 포함하는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 개체를 복수의 광 펄스로 자극함으로써 개체의 시각 피질에서 동기화된 감마 진동을 유도하거나; 개체를 복수의 소리 펄스로 자극함으로써 개체의 해마 및/또는 청각 피질에서 동기화된 감마 진동을 유도하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 약 1 시간 동안 시각 또는 청각 신호를 전달하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상가 장치는 기간에 걸쳐 하루 최소한 1회 시각 또는 청각 신호를 반복 전달하는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되고, 상기 기간은 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 및 1 개월 중에서 최소한 하나인 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 자극-방출 장치는 촉각 장치, 발광 장치, 및 소리-방출 장치 중에서 최소한 한 가지인 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 자극-방출 장치는 발광 장치 및 소리-방출 장치 중에서 최소한 한 가지이고;
상기 발광 장치는 개체의 최소한 하나의 눈에 대한 환경 광을 감소시키기 위한 광 폐쇄 장치를 포함하고, 상기 광 폐쇄 장치는 개체의 시각 피질 및 해마 중에서 최소한 하나에서 동기화된 감마 진동을 유도하도록 개체의 최소한 하나의 눈에 대한 시각 신호를 방출하기 위한 발광 유닛을 포함하고; 및
상기 소리-방출 장치는 개체의 최소한 하나의 귀에 대한 환경 잡음을 감소시키기 위한 잡음-상쇄 장치를 포함하고, 상기 잡음-상쇄 장치는 개체의 청각 피질 및 해마 중에서 최소한 하나에서 동기화된 감마 진동을 유도하도록 개체의 최소한 하나의 귀에 청각 신호를 방출하기 위한 스피커 유닛을 포함하는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 타우 인산화를 감소시키는 것을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 청구항 21에 있어서,
상기 장치는 알츠하이머병을 치료하기 위하여
a) 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드의 양을 유지 또는 감소시키는 것;
b) 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 소교세포의 숫자를 증가시키거나, 신경보호 상태와 일치하는 소교세포에서 형태적 변화를 유도하거나, 소교세포의 활성을 증진하는 것; 및
c) 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 타우 인산화를 감소시키는 것; 중 하나 이상을 포함하여 개체에 시각 또는 청각 신호를 전달하기 위해 추가로 설정되는 장치. - 개체에 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는 비침습성 자극을 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도함으로써 개체에서 인지 기능을 향상시키기 위해 설정된 장치.
- 개체에 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는 비침습성 자극을 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도함으로써 개체에서 기억 연상을 유지 또는 증강하기 위해 설정된 장치.
- 개체에 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는 비침습성 자극을 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도함으로써 개체에서 인지 유연성을 유지 또는 증강하기 위해 설정된 장치.
- 개체에 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는 비침습성 자극을 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도함으로써 개체에서 불안을 감소시키기 위해 설정된 장치.
- 청구항 48 내지 청구항 51 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동기화된 감마 진동은 약 40 Hz의 주파수를 갖는 장치. - 청구항 48 내지 청구항 51 중 어느 한 항에 있어서,
상기 개체는 인간인 장치. - 대략 35 Hz 내지 대략 45 Hz의 주파수를 갖는 신호를 발생시키기 위한 신호 발생기; 및
상기 신호 발생기에 의해 발생된 신호에 기반하여 개체에 신호를 비침습성으로 투여하여 상기 자극에 대한 반응으로 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위하여 상기 신호 발생기에 커플링된 방출체;를 포함하는 장치. - 청구항 54에 있어서,
상기 방출체는 광 방출체인 장치. - 청구항 55에 있어서,
상기 광 방출체는 광섬유 기반 방출체 및 고체-상태 방출체로 이루어진 군으로부터 선택되는 장치. - 청구항 56에 있어서,
상기 광 방출체는 고체-상태 방출체이고, 최소한 하나의 발광 다이오드(LED)를 포함하는 장치. - 청구항 55에 있어서,
상기 방출체는 디스플레이 스크린을 포함하는 장치. - 청구항 54에 있어서,
상기 방출체는 소리 방출체인 장치. - 청구항 59에 있어서,
상기 자극은 가청 클릭 훈련인 장치. - 청구항 54에 있어서,
상기 방출체는 촉각 방출체이고, 상기 자극은 촉각 자극인 장치. - 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위해 설정된 장치로서,
상기 장치는 장치를 사용하는 동안에 개체에 비침습성 자극을 투여하기 위해 설정되고, 상기 비침습성 자극은 대략 35 Hz 내지 대략 45 Hz의 주파수를 갖는 장치. - 청구항 62에 있어서,
상기 장치는
신호를 발생시키기 위한 신호 발생기; 및
상기 신호 발생기에 의해 발생된 신호에 기반하여 개체에 비침습성 신호를 비침습성으로 투여하여 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위하여 상기 신호 발생기에 커플링된 방출체;를 포함하는 장치. - 청구항 63에 있어서,
상기 방출체는 광 방출체인 장치. - 청구항 64에 있어서,
상기 광 방출체는 광섬유 기반 방출체 및 고체-상태 방출체로 이루어진 군으로부터 선택되는 장치. - 청구항 65에 있어서,
상기 광 방출체는 고체-상태 방출체이고, 최소한 하나의 발광 다이오드(LED)를 포함하는 장치. - 청구항 63에 있어서,
상기 방출체는 디스플레이 스크린을 포함하는 장치. - 청구항 63에 있어서,
상기 방출체는 소리 방출체인 장치. - 청구항 68에 있어서,
상기 자극은 가청 클릭 훈련인 장치. - 청구항 66에 있어서,
상기 자극은 촉각 자극인 장치. - 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위해 설정된 방출체로서,
상기 방출체는 자극에 대한 반응으로 개체의 최소한 하나의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 유도하기 위하여 개체를 방출체에 의해 발생되고 대략 35 Hz 내지 대략 45 Hz의 주파수를 갖는 비침습성 자극에 노출시키기 위해 설정되는 방출체. - 청구항 71에 있어서,
상기 방출체는 광 방출체이고, 상기 방출체는 개체를 비침습성 자극으로서 광 자극에 노출시키기 위해 추가로 설정되는 방출체. - 청구항 71에 있어서,
상기 방출체는 소리 방출체이고, 상기 방출체는 개체를 비침습성 자극으로서 소리 자극에 노출시키기 위해 추가로 설정되는 방출체. - 청구항 71에 있어서,
상기 방출체는 촉각 방출체이고, 상기 방출체는 개체를 비침습성 자극으로서 촉각 자극에 노출시키기 위해 추가로 설정되는 방출체. - 청구항 71에 있어서,
상기 방출체는 비침습적 자극을 발생시키기 위하여 하나 이상의 컴퓨터-실행가능한 명령을 실행하기 위해 추가로 설정되는 방출체. - 삭제
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