JP2020536643A - 脳のガンマ振動を同期化する視覚刺激を用いた認知症の治療 - Google Patents

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Abstract

その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するためのデバイス、システムおよび方法。一つの例において、約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、より具体的には約４０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を対象に非侵襲的に送達し、前頭前野皮質（ＰＦＣ）および海馬を含む、当該対象の複数の脳領域においてガンマ振動を同調させる。同調されたガンマ振動は、複数の脳領域にわたってニューロン活動を変調させ（例えば、低ガンマ周波数でのニューロンネットワークの機能的結合を促進する）、様々な神経保護作用（例えばアミロイドプラークおよびタウ過剰リン酸化の改善）を誘導し、神経変性を低下させる。慢性視覚刺激に介在されたニューロン活動は、ミクログリアの免疫反応を低下させ、膜輸送、細胞内輸送、シナプス機能、神経炎症、およびＤＮＡ損傷反応に関与する異常改変された遺伝子およびタンパク質を改善する。学習と記憶の強化を含む行動の改変も観察される。【選択図】図１Ｄ

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、以下の米国仮出願のそれぞれに対する優先権を主張する。２０１７年１０月１０日に出願され、「ＮＥＵＲＯＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＣＯＭＢＩＮＥＤ ＳＥＮＳＯＲＹ ＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ」（代理人整理番号 ＭＩＴＸ−９６９９／００ＵＳ）という表題の米国仮特許出願第６２／５７０，２５０号明細書；および２０１７年１０月１１日に出願され、「ＧＡＭＭＡ ＥＮＴＲＡＩＮＭＥＮＴ ＢＩＮＤＳ ＨＩＧＨＥＲ ＯＲＤＥＲ ＢＲＡＩＮ ＲＥＧＩＯＮＳ ＡＮＤ ＯＦＦＥＲＳ ＮＥＵＲＯＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ」（代理人整理番号 ＭＩＴＸ−００７０／００ＵＳ）という表題の米国仮特許出願第６２／５７０，９２９号明細書。これらの各仮特許出願明細書は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。本出願は、２０１８年９月１９日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ，Ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ，ａｎｄ／ｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｄｅｍｅｎｔｉａ」という表題のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１８／５１７８５に対する優先権の利益も主張する。当該出願はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。
政府の支援に関する表明
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたグラント番号ＲＦ１ ＡＧ０５４３２１に基づく米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
アルツハイマー病（ＡＤ）を含む認知症は、脳および認知機能の低下を特徴とする脳の破壊的な疾患である（Ｃａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐａｌｏｐ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ，２０１６）。複数の因子がＡＤの病態に関係し、アミロイドβの沈着、過剰リン酸化タウの蓄積、ミクログリア介在性炎症および星状細胞介在性炎症、ならびにニューロンおよびシナプスの減少が挙げられる（Ｂａｌｌａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ，２０１２；Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｅｙｅｒ−Ｌｕｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｏａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｕｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
さらに近年の研究によってＡＤ病変の生理学的な側面、例えばニューロンの過度な興奮性、介在ニューロンの機能障害、阻害／興奮バランスのシフト、てんかん性放電およびネットワーク振動の変化などが徐々に検証されるようになった（Ｃａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｈｏｌｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｈｓｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｐａｌｏｐ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ，２０１０；Ｐａｌｏｐ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ，２０１６；Ｖｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。これらの研究結果は、ヒトＡＤで観察されているネットワークの異常と合致している（Ｇｕｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｉｂａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。最近のＡＤマウスモデルの研究では、これらの変化が発症前の段階で発生していることが焦点となっている（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ニューロン活動の変化は過去にいくつかのマウスモデルにおいて例えばアミロイド−βおよびタウの蓄積といったＡＤ病変に影響を与えることが示されている（Ｂｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。これらの研究結果を鑑み、複合的な方法を採用して、ニューロン振動の操作がＡＤ病変の改善に有効であり得るかが調査された（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｖｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
特に、ガンマ周波数帯の振動（約３０〜９０Ｈｚ）が、ｈＡＰＰ−Ｊ２０、ＡｐｏＥ４、５ＸＦＡＤを含む複数のＡＤマウスモデル、そして注目すべきはヒトＡＤ患者においても減少していることが見いだされている（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇｕｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｉｂａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｖｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。こうしたことを鑑み、近年、いくつかの研究はガンマ振動を標的としており、その研究結果から、ＡＤ病変の軽減に対する有望な戦略である可能性が示唆されている。
過去の一つのアプローチでは、ｈＡＰＰ−Ｊ２０マウスにおいて、パルブアルブミン陽性（ＰＶ＋）介在ニューロン中の電位差で開閉されるナトリウムチャンネルのサブユニットＮａｖ１．１の発現を介したガンマ振動の増大、またはＮａｖ１．１を過剰発現する介在ニューロン前駆体の脳移植を用いたガンマ振動の増大が、ガンマ障害を軽減し、てんかん活動と認知低下の両方を減少させた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｖｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
二つ目のアプローチでは、安定的なガンマ周波数振動を誘導することが示されている（Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）、４０ＨｚでのＰＶ＋介在ニューロンのオプトジェネティック（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ）な活性化が、５ＸＦＡＤマウスにおいてアミロイド負荷量を減少させ、ミクログリアの形態変換を強化することが判明している（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。４０Ｈｚの視覚刺激を使用したこの非侵襲的なアプローチも同様に、５ＸＦＡＤマウスの視覚皮質においてアミロイド負荷量の減少と、ミクログリアの変化に有効であった（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかしこの過去の研究において、視覚皮質のアミロイドレベルは、１時間の急性視覚刺激の２４時間後には基準値へと戻っていた。しかしこの初期の研究からは、１時間の視覚刺激を、１日当たり１時間で７日間へと拡張させることで、６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚皮質においてアミロイドレベル（Ａβ１−４０およびＡβ１−４２の可溶性型ならびに不溶性型）だけでなく、プラーク病変も減少させることが判明した（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに視覚刺激は５ＸＦＡＤマウスにおいてニューロンおよびミクログリアを含む複数の細胞型に影響を与え、それぞれＡβの産生が減少し、Ａβのクリアランスが強化された。
２０１６年１１月２３日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＲＥＶＥＮＴＩＮＧ，ＭＩＴＩＧＡＴＩＮＧ，ＡＮＤ／ＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＤＥＭＥＮＴＩＡ」という表題の米国特許出願第１５／３６０，６３７号（その全体の参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、視覚（ならびに聴覚および／または触覚）刺激を通して脳において同期化ガンマ振動を誘導することにより、いくつかの脳領域においてアミロイド負荷量の低下と形態変化が生じた。しかし発明者らは、学習と記憶、そして他の高次脳機能の大部分を担う複数の脳中枢に影響を与える多種回路性の疾患に対処する、認知症およびアルツハイマー病の治療システムならびに治療方法が未だ必要とされていることを認識し、理解している。
本開示において、本明細書で「Ｇａｍｍａ ＥＮｔｒａｉｎｍｅｎｔ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｎｓｏｒｙ ｖｉｓｕａｌ ｓｔｉｍｕｌｉ（感覚視覚刺激を使用したガンマ同調）」（ＧＥＮＵＳ）と呼称される慢性的な非侵襲性視覚刺激を介して、対象の脳においてガンマ振動を同調させる本発明方法および本発明装置が、視覚皮質を超えて複数の他の脳領域（例えば海馬、体性感覚皮質および前頭前野皮質）にまで拡張されつつ、これら複数の脳領域全体で低ガンマコヒーレンスも強化することが示される。さらに慢性ＧＥＮＵＳは、５ＸＦＡＤマウス、Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスにおいて神経変性を低下させ、その神経保護効果は複数の脳領域にわたり明白であった。集められたデータは、脳領域全体のＧＥＮＵＳ介在性のニューロン活動の変調が、どのように変性ニューロンにおいて細胞内輸送とシナプス機能に関与する遺伝子とタンパク質に影響を与え得るかを浮かび上がらせた。これらの結果から、ＧＥＮＵＳ駆動ガンマ振動、複数の脳領域にわたるニューロンネットワークの機能的結合、対象における神経保護的および行動学的な能力の間の関連性が確立された。
まとめると、一つの本発明の実施形態は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法を目的としており、当該方法は、Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を当該対象に非侵襲的に送達し、対象の少なくとも前頭前野皮質（ＰＦＣ：ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ）および海馬を含む、対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同調させる工程を含む。
別の本発明の実施形態は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法を目的としており、当該方法は、Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を当該対象に非侵襲的に送達し、当該対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同調させ、当該対象の少なくとも複数の脳領域において、変性ニューロン中の異常改変された（ａｂｅｒｒａｎｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）遺伝子およびタンパク質を改善する工程を含む。
別の本発明の実施形態は、その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法を目的としており、当該方法は、Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を当該対象に非侵襲的に送達し、当該対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同時に同調させ、当該対象の少なくとも複数の脳領域の間で、３０Ｈｚ〜５０Ｈｚの周波数を有するガンマコヒーレンスを有意に増加させる工程を含む。
当然のことながら、前述の概念および以下でより詳細に考察する追加的概念のすべての組み合わせは（このような概念は相互に矛盾していないという前提で）、本明細書に開示する本発明の主題の一部であると考えられる。特に、本開示の最後に現れる、特許請求の範囲に記載する主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示する発明主題の一部であると考えられる。また当然のことながら、参照により組み込まれるあらゆる開示において明示的に用いられる用語には、本明細書に開示する特定の概念と最も一致する意味を与える必要がある。
以下の図表および詳細な記載を検討すると、他のシステム、プロセス、および特徴が当業者に明らかとなるであろう。このようなさらなるシステム、プロセス、および特徴すべてが、本記載内に含まれ、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
特許または出願ファイルには、色付きで作成された少なくとも一つの図面が包含されている。
当業者であれば、図面が主として例示的な目的であること、そして本明細書に記載する本発明の主題の範囲を制限することを意図していないことを理解するだろう。図面は必ずしも一定の比率ではなく、一部の例では、本明細書に開示する本発明の主題の様々な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために、図面内で誇張または拡大されて示されうる。図面では、同様の参照文字は概して、例えば同様の特徴（例えば、機能的に類似した、および／または構造的に類似した要素）を意味する。
図１Ａ〜１Ｊは、開示される本発明の主旨に従い、視覚刺激が、視覚皮質を超えて対象の複数の脳領域においてガンマ振動を同調させることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２Ａ〜２Ｆは、開示される本発明の主旨に従い、慢性４０Ｈｚ（８０Ｈｚではない）視覚明滅刺激が、対象の視覚皮質を超えてアミロイドプラークを減少させることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図３Ａ〜３Ｊは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、対象においてアルツハイマー病関連病変を改善し、神経変性を有意に減少または予防することを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４Ａ〜４Ｑは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、対象のミクログリアにおける炎症反応を減少させることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図５Ａ〜５Ｉは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、シナプス機能を改変し、ニューロン中の細胞内輸送を改変することを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図６Ａ〜６Ｉは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、アルツハイマー病の複数の対象モデルにおいて行動を改変することを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図７Ａ〜７Ｉは、開示される本発明の主旨に従い、慢性視覚刺激が、神経変性マウスモデルにおいて視覚皮質を超えてガンマ振動を同調させることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図８Ａ〜８Ｉは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、視覚皮質を超えて５ＸＦＡＤマウスにおいてＡＤ関連病変を減少させることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図９Ａ〜９Ｇは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＡＤ関連病変を改善することを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１０Ａ〜１０Ｎは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、ミクログリアを改変し、ニューロン中の細胞内輸送とシナプス伝達を改善することを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１１Ａ〜１１Ｊは、開示される本発明主旨に従い、急性および慢性の視覚刺激の対象に対する効果の行動学的特徴を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１２Ａ〜１２Ｃは、開示される本発明主旨に従い、８０Ｈｚの慢性視覚刺激では、５ＸＦＡＤマウスにおいてモリス水迷路に影響を与えなかったことを示す。 同上。
高次脳領域に結びつき、神経変性および神経炎症を減少させ、認知機能を改善する視覚刺激を介して、認知症を予防、緩和および／または治療するためのシステムならびに方法に関連した様々な主旨、およびそれらの実施形態に関する詳細な説明を記載する。上記に紹介され、下記にさらに詳細に議論された様々な概念が、多数の方法で実装されうることが理解されるべきである。特定の実装および適用の例は、当業者にとって明らかである実施および代替を可能とするよう、主に例示的な説明のために提供される。
下記に説明される図および実施例は、本願の実施の範囲を単一の実施形態に限定することを意味していない。記述または図示された要素の一部または全てを交換することによって、他の実施が可能である。さらに、開示された例示的な実施のある特定の要素が公知の構成要素を使用して部分的または完全に実施されうる場合、場合によっては、本実施の理解に必要なそのような公知の構成要素の一部のみが記載され、そのような公知の構成要素の他の部分の詳細な説明は、本実施を不明瞭にしないように省略される。
本開示において、本発明者らは、本明細書において「Ｇａｍｍａ ＥＮｔｒａｉｎｍｅｎｔ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｎｓｏｒｙ ｖｉｓｕａｌ ｓｔｉｍｕｌｉ」（感覚視覚刺激を使用したガンマ同調）（ＧＥＮＵＳ）と呼称される慢性非侵襲的視覚刺激を用いた対象の治療を含む本発明技術が、アルツハイマー病（ＡＤ）を含む認知症に関連した症状に対処し、視覚皮質を超えた脳領域においてＡＤ病変に影響を及ぼすことを示すものである。実施例において、本発明者らは、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ、ＣＫ−ｐ２５、および老齢の５ＸＦＡＤマウスを含む複数の神経変性マウスモデルにおいて慢性視覚ＧＥＮＵＳの効果を実証した。本発明者らは、慢性視覚ＧＥＮＵＳが、複数の脳領域（高次脳領域を含む）においてガンマ振動を同調させること、およびこれら脳領域全体にわたり低いガンマ周波数で機能的結合を誘導することを観察した。検証したいくつかの神経変性疾患マウスモデル全体で、本発明者らは、慢性視覚ＧＥＮＵＳが、アミロイドプラーク、タウ過剰リン酸化および脳の萎縮を含む複数のＡＤ関連病変を改善し、複数の高次脳領域においてニューロンおよびシナプスの密度低下を予防することを見出した。トランスクリプトームおよびプロテオミクスのプロファイリングにより、Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスの変性ニューロンにおいて異常改変されている膜輸送、細胞内輸送、およびシナプス機能に関与する遺伝子およびタンパク質が、慢性ＧＥＮＵＳで改善または修復され、ミクログリアの免疫反応が減少したことが示された。これら広範な神経保護的作用を鑑み、本発明者らはさらに認知機能に対する毎日の慢性ＧＥＮＵＳの効果を調査したところ、ＡＤの複数のマウスモデルにおいて行動タスクの能力改善が示された。これらをまとめると、本発明の結果から、ＡＤを含む認知症の対象の治療における視覚ＧＥＮＵＳの神経保護的効果が浮かび上がってくる。
以下で詳述されるように、いくつかの実験を行い、複数の脳領域に対する慢性視覚刺激の効果を評価した。視覚刺激は概して、約３０〜５０Ｈｚの周波数を有しており、特に視覚刺激に対しては約４０Ｈｚの周波数に関心が向けられた。一部の例では、発光ダイオード（ＬＥＤ）をベースとしたデバイスを採用して視覚刺激を送達した。ＬＥＤ系デバイスは、５０％の負荷サイクルを有する矩形波電流パターンで駆動された。しかし（ＬＥＤ系デバイス以外の）様々なタイプのデバイスを採用して、本明細書に記載される範囲内の様々な周波数の視覚刺激を効率的に送達し得ることを認識されたい。さらに矩形型以外の波形、ならびに５０％以外の負荷サイクルを採用して、本明細書に記載される範囲内の様々な周波数の視覚刺激を効率的に生成してもよい。
それに加えて、１日当たり１時間の視覚刺激に対する対象曝露時間、ならびに７日、２２日（約３週間）および４２日（約６週間）の対象曝露期間をはじめとする、本明細書に記載のいくつかの試験において様々な治療プロトコールが採用された。しかし他の対象曝露時間および対象曝露期間を採用しても、本明細書に記載の範囲内の様々な周波数の視覚刺激を送達し、アルツハイマー病を含む認知症を効率的に治療し得ることを認識されたい。例えば１日当たり１時間を超える曝露時間（例えば複数の１時間の増分、それより短い増分または長い増分で送達される）、および／または３週間よりも短い曝露期間、３週間〜６週間、および６週間よりも長い曝露期間を、様々な組み合わせと順序で採用し、アルツハイマー病を含む認知症を効率的に治療してもよい。
以下に実験および各実験結果の要約を最初に提示し、次いで実験プロトコールの詳細を提示して、アルツハイマー病を含む認知症の対象の治療に対する視覚ＧＥＮＵＳの有効性を解説する。
視覚ＧＥＮＵＳは高次脳領域に影響を及ぼす
４０Ｈｚの視覚刺激が、視覚皮質を超える脳領域においてニューロン活動を制御し得るか、または視覚皮質に限定されるかを、ニューロン活動のマーカーとしてｃ−Ｆｏｓ免疫組織化学染色を野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいて実施することで決定することを最初の目的とした（図１Ａ）。５０％負荷サイクルで特定の周波数の視覚刺激を送達するために、カスタムメイドのＬＥＤデバイスを採用した（例えば４０Ｈｚ刺激に対し、１２．５ミリ秒の間点灯し、１２．５ミリ秒の間消灯する）（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。マウスは３日間環境に慣れさせ、その後に１時間の４０Ｈｚの視覚刺激に曝露された。次いでホームケージに戻し、その１時間後に殺処分して、脳組織を採取し、切片を作製して、ｃ−Ｆｏｓ抗体で標識した。４０Ｈｚの視覚刺激により、視覚皮質（Ｖ１）（図１Ａ〜１Ｂ）でｃ−Ｆｏｓ陽性ニューロンの有意な増加が生じた。さらに体性感覚皮質（ＳＳ１）、海馬領域ＣＡ１、および前頭前野皮質の帯状皮質（ＣＣ）領域においても有意な増加が記録された（図１Ａ〜１Ｂ）。
４０Ｈｚの視覚刺激がどのようにこれら脳領域で進行中のニューロン活動を変化させ得るのかを理解するために、本発明者らはＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにカスタムメイドのマイクロドライブ（タングステン線の電極。詳細については方法を参照のこと）を移植して、自由行動中のマウスのＶ１、ＳＳ１、ＣＡ１および前頭前野皮質（ＰＦＣ）の帯状領域からの局所電場電位（ＬＦＰ）を並行して記録した。マウスは探索行動を減少させるために小さなＧＥＮＵＳボックス（８ｘ８インチ（約２０ｘ２０センチ））に閉じ込められ、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１および前頭前野皮質（ＰＦＣ）からの局所電場電位（ＬＦＰ）を同時にに記録されながら、４０Ｈｚの視覚刺激に曝露された。当該視覚刺激は最初は遮光され、その後に各１０分の間、開放された（図１Ａ、図７Ａ）。急性４０Ｈｚの視覚刺激は、約３５〜４５Ｈｚの低ガンマ振動の出力を有意に増加させ、Ｖ１では４０Ｈｚでピーク周波数となり（図１Ｃ〜１Ｄ）、ＣＡ１では小さいが有意に増加していた（図１Ｃ〜１Ｄ）。この結果は、ヘッドレストされたマウスにおける過去の研究結果と一致している（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。小さいが有意なガンマ出力の増加は、ＳＳ１およびＰＦＣでも観察された（図１Ｃ〜１Ｄ）。この結果は、これら領域全体で観察されたｃ−Ｆｏｓ陽性細胞の増加と一致した（図１Ｂ）。
これら視覚刺激誘導性の振動が、視覚皮質の下流の脳領域においてもニューロン発火を同調させることができるかを評価するために、本発明者らは、海馬領域ＣＡ１を標的として四極管をＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスコホートに移植し、単一ユニット活動を記録した。遮光された基準状態では、ＣＡ１錐体細胞は、ピークでの選択的放電を伴う低ガンマ（約３５〜４５Ｈｚ）への強い位相同期を示し、これは過去の報告と一致している（Ｂｒａｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＨｕｇｈ，２０１６）（図１Ｅ）。４０Ｈｚの視覚刺激は、選択位相を変化させずに、個々のニューロンのさらに安定的な位相同期を誘導した。これは群全体の平均合成ベクトル長（ＭＲＬ（ｍｅａｎ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ｌｅｎｇｔｈ）：遮光と４０Ｈｚ視覚刺激の間、Ｐ＝０．０１）の増加として定量された（図１Ｆ）。このことから、ガンマ周波数視覚刺激は、海馬ニューロン群をより時間的に構造化された様式で駆動するように作用することが示される。
障害を受けた神経系へのＧＥＮＵＳの適用可能性を検証するために、数種の神経変性マウスモデルを使用して、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ動物で観察されたように、視覚刺激でガンマ振動を誘導し得るかを実証した。本発明者らは、ＣＫ−ｐ２５マウスを利用した。このマウスでは、Ｃｄｋ５活性化因子ｐ２５の発現は、興奮性ニューロン特異的なＣａＭＫＩＩαプロモーターにより誘導性様式で駆動される（ＣａＭＫＩＩαプロモーター−ｔＴＡ ｘ ＴｅｔＯ−ｐ２５＋ＧＦＰ）（Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）。食餌からドキシサイクリンを除去した後、ＣＫ−ｐ２５は認知機能障害を伴う進行性のニューロンおよびシナプスの減少を呈し、６週間のｐ２５誘導で重度となる（Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらの研究結果と一致して、誘導後６週でＣＫ−ｐ２５マウスのインビボＬＦＰ記録は、対照マウスと比較してＶ１、ＣＡ１およびＰＦＣにおいて、３５〜４５Ｈｚのガンマスペクトル出力の大幅な低下を示した（図７Ｂ〜７Ｃ）。これらの変化にもかかわらず、４０Ｈｚの視覚刺激は、Ｖ１、ＣＡ１およびＰＦＣにおいて有意にガンマ振動を強化することができた（図７Ｃ）。さらに、ヒト化変異型の微小管関連タンパク質タウを高レベルで発現し、前頭側頭型認知症と関連するタウ凝集を５カ月齢の早さで有するＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウス（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００７）を検証した。８カ月齢のＰ３０１Ｓマウスは、その月齢ではシナプスとニューロンが減少し、認知障害を有しているが、４０Ｈｚの視覚刺激でＶ１およびＰＦＣにおいてガンマ出力の強化を呈した（図７Ｄ〜７Ｅ）。これらの結果から、ＧＥＮＵＳは、ＡＤマウスにおいてガンマ振動を充分に同調させること、そしてこれは、これらマウス特有のニューロン障害の様式とは無関係であることが示される。
複数回の視覚刺激への曝露が、長期間後であってもガンマ振動を同調させ得ることを確認するために、本発明者らは慢性ＧＥＮＵＳプロトコールを採用し、これに従いＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスとｐ２５誘導型ＣＫ−ｐ２５マウスを、４２日間（１時間／日）の４０Ｈｚの視覚刺激に曝露した（図７Ｆ、７Ｈ）。４３日目、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＰＦＣから記録されたＬＦＰは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの全領域にまたがる、４０Ｈｚのガンマ出力の有意な強化を示した。これは急性ＧＥＮＵＳの単回トライアル適用と一致していた（図７Ｆ）。同様に、４３日目のＣＫ−ｐ２５マウス（この時点でｐ２５誘導から８５日）も、Ｖ１、ＣＡ１およびＰＦＣにおいて低ガンマ出力の増加を生じさせた（図７Ｈ）。これらの結果とｃ−Ｆｏｓ免疫染色データをまとめると、急性および慢性の両方の４０Ｈｚ視覚刺激が、視覚皮質だけでなくＣＡ１、ＳＳ１およびＰＦＣを含む他の高次皮質も回復させることが示唆される。
４０Ｈｚ視覚刺激（急性および慢性の両方）は、Ｃ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＰＦＣにまたがり同時に４０Ｈｚ出力を強化する。そこで本発明者らはさらに、ＧＥＮＵＳが作用して、視覚皮質とこれらの他の高次脳構造の間のニューロン活動が連動することを実証した。本発明者らは、遮光された、または遮光されていない４０Ｈｚの視覚刺激中のこれら脳領域全体のコヒーレンスを、重み付け位相同期指標（ＷＰＬＩ：ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐｈａｓｅ ｌａｇ ｉｎｄｅｘ）法を使用して算出した。この方法は、体積伝導を通じた電位汚染を最小化する（Ｖｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。本発明者らは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいて、Ｖ１−ＣＡ１、Ｖ１−ＳＳ１、Ｖ１−ＰＦＣ、ＣＡ１−ＳＳ１およびＣＡ１−ＰＦＣに配置した電極ペアに伝わるＬＦＰを分析した。遮光の有無で、４０Ｈｚの視覚刺激中の期間に平均速度の有意な差はなく、自発運動における何らかの電位差は否定された。急性４０Ｈｚ視覚刺激は、視覚皮質と検証された他の脳領域との間、特にＶ１−ＣＡ１、Ｖ１−ＳＳ１、およびＶ１−ＰＦＣで（遮光期間と比較して）、３０〜５０Ｈｚの低ガンマコヒーレンスを有意に増加させた（図１Ｇ、１Ｈ）。
より広範な脳構造にわたる連動ニューロン振動に対する慢性ＧＥＮＵＳの長期的な影響を評価するために、本発明者らはＷＰＬＩ分析を、１時間／日で４２日間、視覚刺激に曝露されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスおよびｐ２５誘導ＣＫ−ｐ２５マウスのＶ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＰＦＣから収集されたＬＦＰに適用した。遮光条件と比較して、４０Ｈｚの視覚刺激中のＶ１−ＣＡ１（図７Ｇ）、ならびにＶ１−ＳＳ１、Ｖ１−ＰＦＣ、およびＣＡ１−ＰＦＣの間の３０〜５０Ｈｚの低ガンマＷＰＬＩにおいて有意な増加が観察された（図７Ｇ）。同様に、慢性ＧＥＮＵＳの後、ＣＫ−ｐ２５マウスも、遮光条件と比較して、Ｖ１−ＣＡ１、ＣＡ１−ＰＦＣおよびＶ１−ＰＦＣの間で３０〜５０Ｈｚの低ガンマＷＰＬＩにおいて有意な増加を呈した（図７Ｉ）。全体としてこれらのデータは、４０Ｈｚの視覚刺激はマウスにおいて、局所（４０Ｈｚの同調（ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ））、ならびに複数の高次皮質における連動領域間ニューロン振動活動（３０〜５０Ｈｚの低ガンマＷＰＬＩ）を強化することを示唆する。しかし観察された変化が、低ガンマ周波数刺激に特異的であるか否かを立証させることが重要である。これを検証するために、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを、５０％の負荷サイクルで送達される８０Ｈｚの視覚刺激に曝露し、４０Ｈｚの刺激実験と類似した光強度と曝露期間をマウスに確実に受けさせた（図１Ｉ）。刺激前期間と比較して、８０Ｈｚの視覚刺激中、視覚皮質（４０ＨｚのＧＥＮＵＳでは最も大きな出力増加が観察された部位）において８０Ｈｚスペクトル出力には有意な変化は観察されなかった（図１Ｉ、１Ｊ）。
慢性ＧＥＮＵＳは、視覚皮質を超えてアミロイドプラークを改善する
Ｉａｃｃａｒｉｎｏら（２０１６）は、急性視覚ＧＥＮＵＳは、若く、症状を示す前の５ＸＦＡＤマウスのＶ１においてアミロイドレベルを減少させ、一方で、より病態が進行した６カ月齢の５ＸＦＡＤマウスでは、７日間の視覚ＧＥＮＵＳがアミロイドレベルを減少させるだけでなく、アミロイドプラークも改善したことを示している。そこで本発明者らは、７日間の４０Ｈｚの視覚刺激が、１１カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて、Ｖ１のみならずＣＡ１、ＳＳ１およびＰＦＣにおいてもアミロイドプラーク病変に影響を与え得るかを調べることとした。この目的のために、本発明者らは、マウスをＧＥＮＵＳ刺激ケージ内に入れ（図８Ａ）、１時間／日で７日間、４０Ｈｚまたは８０Ｈｚ（４０Ｈｚと類似した光量を送達するが、Ｖ１（図１Ｉ、１Ｊ）においてガンマ振動を同調しない）のいずれか視覚刺激を与え、アミロイドプラーク負荷量を検証した（図２Ａ）。７日間の４０Ｈｚ視覚刺激の後、視覚皮質においてアミロイドプラークの減少が認められた（図２Ａ、２Ｂ）が、非刺激マウスと比較してＳＳ１にもＣＡ１にも差異は観察されなかった（図２Ａ、２Ｂ）。ＬＦＰ分析と一致して、８０Ｈｚの視覚刺激を受けた５ＸＦＡＤマウスは、Ｖ１もＣＡ１もアミロイドプラーク負荷量に変化は示さず、そしてＳＳ１では中程度の増加を示した（図２Ａ、２Ｂ）。これらの結果は、７日間の視覚ＧＥＮＵＳ後のアミロイドプラークの減少は、Ｖ１に限定的であり、４０Ｈｚの視覚刺激に特異的であるということを示している。
次に、ＧＥＮＵＳプロトコールを２２日に拡張させ、９カ月齢の５ＸＦＡＤマウスで開始して、マウスがおよそ１０カ月齢になったときにアミロイドプラークの定量を行った（図２Ｃ）。２２日間のＧＥＮＵＳは、Ｖ１においてアミロイドプラークの強度および数を有意に減少させた（図２Ｃ、２Ｄおよび図８Ｂ〜８Ｄ）。これは６カ月齢の５ＸＦＡＤマウス（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）および１１カ月齢の５ＸＦＡＤマウス（図２Ａ、２Ｂ）において７日間のＧＥＮＵＳ後のアミロイドプラークの減少と一致していた。重要なことは、２２日間のＧＥＮＵＳは、ＳＳ１、ＣＡ１、および前頭前野皮質のＣＣ領域においてもプラークの強度と数を充分に減少させたということである（図２Ｄ、図８Ｂ〜８Ｄ）。この効果もやはり４０Ｈｚの視覚刺激荷特異的であり、２２日間の８０Ｈｚの刺激では、非刺激５ＸＦＡＤマウスと比較して、５ＸＦＡＤマウスのＶ１、ＳＳ１そしてＣＡ１でもアミロイドプラークは変化しなかった（図２Ｅ、２Ｆ）。
過去の研究により、進行性のニューロンおよびシナプスマーカーの減少は、５ＸＦＡＤモデルではおよそ９カ月齢で始まることが示されている（Ｏａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００６）ことから、本発明者らは、９カ月齢の５ＸＦＡＤマウスで長期的ＧＥＮＵＳを適用開始することを選択した。これらの研究と一致して、１０カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて、同月齢の野生型同腹仔と比較し、ＣＡ１およびＣＣの両方においてニューロン数の有意な減少を観察した（図８Ｃ、８Ｅ）。対照的に、２２日間のＧＥＮＵＳを受けた５ＸＦＡＤマウスは、アミロイド負荷量の減少（図２Ｃ、２Ｄおよび図８Ｂ〜８Ｄ）に加えて、非刺激マウスと比較して有意なニューロン減少の低下を示した（図８Ｅ）。同様に、非刺激５ＸＦＡＤマウスではＣＡ１およびＣＣにおいてｂａｓｓｏｏｎ（シナプスマーカータンパク質）集積の有意な減少が観察された一方で、２２日間の慢性ＧＥＮＵＳは、シナプス減少を低下させた（図８Ｆおよび８Ｇ）。慢性ＧＥＮＵＳ後の神経変性およびアミロイド病変の低下は、改変ＡＰＰ導入遺伝子の発現の結果ではなく、ＧＥＮＵＳを受けたマウスと非刺激対照マウスにおいて、全長ＡＰＰタンパク質の発現に差異は検出されなかった（図８Ｈ、８Ｉ）。これらの結果から、慢性視覚ＧＥＮＵＳは、５ＸＦＡＤマウスの複数の脳領域において、アミロイドプラーク負荷量の低下を導き、そしてニューロンおよびシナプスの減少を低下させたことが示される。
慢性ＧＥＮＵＳは神経変性を低下させる
５ＸＦＡＤマウス（図８Ｃ、８Ｅ）において認められた疾患病変への影響とニューロン減少の低下における、慢性ＧＥＮＵＳの可能性をさらに探索するために、次に、神経変性のＴａｕ Ｐ３０１ＳマウスモデルおよびＣＫ−ｐ２５マウスモデルを検証した。８カ月齢では、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスは著しい神経病変を呈する（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ゆえに、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスのコホートを採用し、それらに対して非刺激、または１時間／日で２２日間のＧＥＮＵＳを７カ月齢で開始し、８カ月齢でのタウリン酸化レベルとタウ関連病変を検証した（図３Ａ〜３Ｅ、および図９Ａおよび９Ｂ）。野生型のナイーブ同腹仔（ＷＴナイーブ）と比較して、Ｔａｕ Ｐ３０１ＳマウスのＶ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣにおいて、Ｓ２０２／Ｔ２０５残基でタウのリン酸化が高いことが観察された（図３Ａ、３Ｂ）。しかし慢性ＧＥＮＵＳを受けたＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスは、非刺激Ｐ３０１Ｓマウスと比較して、Ｓ２０２／Ｔ２０５のタウリン酸化が有意に低下していた（図３Ａ、３Ｂ）。ＡＤおよびＰ３０１Ｓマウスの両方において、タウタンパク質は複数の残基で過剰にリン酸化される（Ｈａｎｇｅｒ ｙｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｆｏｉｄｌ ａｎｄ Ｈｕｍｐｅｌ，２０１８；Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。そこで非バイアスＳｅｒ／Ｔｈｒ（Ｓ／Ｔ）ホスホプロテオミクス法を利用して、ＧＥＮＵＳ刺激がタウリン酸化に影響を与え得る程度を検証した。ＷＴナイーブ同腹仔と比較して、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて、４６個のＳ／Ｔ残基が過剰リン酸化され、および単一残基（Ｓ４５１）が脱リン酸化されたことが特定された（図３Ｃ）。分析からも、慢性ＧＥＮＵＳは、６個のＳ／Ｔ部位でタウタンパク質のリン酸化を低下させ、Ｓ４５１のリン酸化を増加させたことが明らかとなった。このことから、ＧＥＮＵＳは複数の部位でタウリン酸化に影響を与えることが示唆される（図３Ｃ）。
次に、Ｔａｕ Ｐ３０１マウスにおけるニューロン減少を特徴解析した。過去に報告されているように、ＮｅｕＮ陽性細胞の数による定量を行った場合、Ｖ１、ＣＡ１、ＳＳ１、およびＣＣにおいてＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスはニューロン数に有意な低下を呈した（図３Ｄ、３Ｅ）。７カ月齢（ニューロン減少が始まるとき）から２２日間のＧＥＮＵＳを受けたＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスは、非刺激対照と比較して、検証されたすべての脳領域でニューロン減少の有意な低下を示した（図３Ｄ、３Ｅ）。次に脳の重量と、側脳室の大きさを検証したところ、ＷＴ非刺激マウスと、ＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウスの間に差異は観察されなかった（図９Ｂ）。
次に、６週間のｐ２５誘導後に脳委縮、皮質縮小および異常な脳室拡張などのＡＤ様の病理学的特徴を示すＣＫ−ｐ２５モデルに対象を移した（Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）。慢性ＧＥＮＵＳがこれらの異常性を改善し得る程度を検証するために、本発明者らは、６週間、毎日１時間のＧＥＮＵＳに曝露させつつ、ＣＫ−ｐ２５マウスにｐ２５を同時に誘導した（図３Ｆ）。非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスは、ＣＫナイーブ同腹仔（ＣａＭＫＩＩαプロモーター− ｔＴＡ；Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）と比較して脳重量と皮質の厚さの有意な低下を示した（図３Ｇ）。ｐ２５誘導中の慢性ＧＥＮＵＳは、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して皮質の菲薄化を有意に低下させたが、脳重量は有意には変化させなかった（図３Ｇおよび図９Ｄ）。ヒトＡＤおよびＣＫ−ｐ２５トランスジェニックモデルの両方において、皮質縮小は脳室拡張と密接に相関しており（Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）、慢性ＧＥＮＵＳを受けたＣＫ−ｐ２５マウスにおいても、脳室拡張の大幅な低下が観察された（図３Ｈおよび図９Ｅ）。さらにｐ２５誘導中に慢性ＧＥＮＵＳを受けたＣＫ−ｐ２５マウスも、非刺激対照と比較して、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１、およびＰＦＣのＣＣ領域において、ニューロン減少の有意な低下があった（図３Ｉ、３Ｊ）。二本鎖切断（ＤＳＢ）の形態のＤＮＡ損傷は、ＣＫ−ｐ２５マウスの神経変性に対する早期マーカーとなることが過去に報告されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）。この研究結果と、本発明者らのＧＥＮＵＳ介在性のニューロン死の低下の両方と合致して、Ｖ１、ＳＳ１およびＣＡ１において、ＤＳＢの確立されたマーカーであるγＨ２ＡＸ−陽性細胞の数により分析すると、ＤＳＢの有意な低下も観察された（図９Ｇ）。慢性ＧＥＮＵＳのこれら神経保護的な効果は、変異体の導入遺伝子発現を変化させることで誘導されたのではなく、（Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスのそれぞれにおいて）総タウとｐ２５の発現は、ＧＥＮＵＳ刺激群と非刺激群の間で差異はなかった（図９Ａ、９Ｃ、９Ｆ）。まとめると、これらの研究結果から、慢性ＧＥＮＵＳは、重度の神経変性を有するＰ３０１ＳマウスモデルおよびＣＫ−ｐ２５マウスモデルにおいて、神経保護的であることが立証される。
慢性ＧＥＮＵＳは炎症反応を低下させる
さらに、慢性ＧＥＮＵＳ後にＴａｕ Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスにおいて観察された神経変性の低下は、部分的には、有益なミクログリア反応に介在された可能性も示された。それぞれ２２日間および４２日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウス、ならびに非刺激Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウス、ならびに各ＷＴ対照の視覚皮質に対し、非バイアスＲＮＡ配列解析を実施した（図４Ａ）。過去に報告されている（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）ように、視覚皮質を解剖し、次いで酵素的に消化して、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５の免疫染色によりミクログリアを特定して、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して単離した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。各マウスから３５，０００個のミクログリアを単離し、各マウスから別個に総ＲＮＡを抽出して、ＲＮＡ−ｓｅｑの前にＲＮＡの品質をチェックした。１サンプル当たり平均で２８６９万個のリードが得られ、その８９．４２％がアライメントされた。
ＲＮＡ配列解析により、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウス由来のミクログリアは、ＣＫナイーブマウスと比較し、２３３３個の上方制御された遺伝子を有していたことが明らかとなった（図４Ａ）。次に本発明者らは、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を実施して、それら上方制御された遺伝子が、タンパク質合成、リボソーム制御、および免疫反応（ウイルス免疫反応、抗原提示および免疫反応制御を含む）に関与していることを明らかにした。この結果は過去の報告と一致している（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）（図４Ｂ）。比較により特定された２０１９個の下方制御された遺伝子は主に細胞移動、細胞形態形成および脈管系の発生に関連していた（図４Ｂ）。慢性ＧＥＮＵＳ後、３５５個の遺伝子がＣＫ−ｐ２５マウスにおいて（非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して）上方制御されていた。これらの遺伝子は、タンパク質合成、有糸分裂の細胞サイクル制御、膜輸送および小胞介在輸送と関連していることが判明し、一方で５１５個の下方制御された遺伝子は大部分が、ＧＴＰａｓｅ活性、タンパク質溶解および免疫反応（ＭＨＣ−１介在性抗原処理提示、および免疫−適応性を含む）に関連していた（図４Ｃ）。これらの結果から、慢性ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてミクログリア機能に大きな影響を与え、それらの炎症性を低下させ、そしておそらくは貪食、移動およびタンパク質分解の能力を高めることが示唆される。
非刺激のＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスでは、ＷＴナイーブ同腹仔と比較して、総数で３３１個の上方制御された遺伝子と、２９２個の下方制御された遺伝子が見いだされた（図１０Ｃ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、上方制御された遺伝子と、タンパク質合成および炎症性反応／免疫反応を関連づけ、一方で下方制御された遺伝子は、細胞骨格統合、細胞移動および脳の発生と高く関連付けられた（図１０Ｄ）。慢性ＧＥＮＵＳ（２２日）後のＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスから取得されたミクログリアは、非刺激Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスと比較して２３８個の上方制御された遺伝子と、２４４個の下方制御された遺伝子を示した。この上方制御された遺伝子は、細胞代謝的タンパク質溶解、細胞移動、細胞形態形成および膜輸送と関連し、下方制御された遺伝子は、遺伝子発現、翻訳開始およびインターフェロン反応に関与していた（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。ゆえに慢性ＧＥＮＵＳを受けたＣＫ−ｐ２５マウスは、慢性ＧＥＮＵＳを受けたＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスと非常に似たトランスクリプトームの変化を示した。まとめると、ミクログリア特異的トランスクリプトーム解析から、慢性ＧＥＮＵＳは、疾患状態を生じさせる特定のトランスジェニックモデル（Ｐ３０１ＳまたはＣＫ−ｐ２５）に依存せず、ミクログリアが形態変換し、タンパク質分解が強化され、そしてミクログリア介在性免疫反応が減少するように作用する。
これらの研究結果をさらに実証するために、慢性ＧＥＮＵＳ（ＣＫ−ｐ２５：ｐ２５誘導中、１時間／日で４２日間；Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ：２２日間）後のＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスの脳切片、ならびにそれら各々の非刺激対照群およびナイーブ対照群の脳切片を使用して免疫組織化学染色を実施した。ＣＫ−ｐ２５のミクログリア反応は、増殖の増大を特徴とする早期反応と、ＭＨＣクラスＩＩおよびインターフェロン経路の上昇を特徴とする後期反応が過去に報告されている（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ミクログリア特異的マーカーのＩｂａ１を最初に使用して、免疫組織化学法および３次元レンダリングを実施した。これにより６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスのＶ１における、ミクログリア数の大幅な増加と、形態の著しい変化が明らかとなった（図４Ｄ〜４Ｉおよび図１０Ｅ）。ＣＫ−ｐ２５マウスのミクログリアは、対照と比較し、全体的には細胞体の体積に有意差を示さなかった（図４Ｆ）。しかし多くが、軸索および末端シナプスの変性と関連する（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、複雑な「ボサボサした」分枝パターンを呈した（矢頭）（図４Ｄ；下側真ん中のパネル）。さらに大多数のミクログリアが、突起の分極を伴わない伸長された棒状体を呈したことが記録された（矢印）（図４Ｄ、４Ｉ）。これはラットでびまん性脳損傷後に、ヒト対象で外傷性脳損傷後に現れることが知られている表現型である（Ｂａｃｈｓｔｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。さらに突起体積が減少したにもかかわらず（図４Ｇ）、ミクログリア間の最小距離を計測して分析したところ、ＣＫ−ｐ２５のミクログリアは、ＣＫナイーブ対照と比較し互いに物理的に近くにあった（図４Ｄ、４Ｈ）。このことから、ミクログリアが自身のテリトリーを失っており、静止状態では通常、各ミクログリア細胞は自身の占有領域を有し、隣接テリトリー間に重複がほとんどないこととは対照的であることが示唆される（Ｄｅｌ Ｒｉｏ−Ｈｏｒｔｅｇａ，１９３２；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
慢性ＧＥＮＵＳは、非刺激マウスと比較してＣＫ−ｐ２５マウスで有意にミクログリア数を減少させたが、それでもナイーブＣＫマウスよりは高いままであった（図４Ｄ、４Ｅ）。慢性ＧＥＮＵＳ後のミクログリア突起の総体積は、退縮が少ないことが明らかとなり、ＣＫ−ｐ２５群およびＣＫナイーブ群のいずれと比較しても有意差はなかった（図４Ｇ）。重要なことは、慢性ＧＥＮＵＳ後のミクログリア間の最小距離は、ＣＫナイーブ動物と同等であり（図４Ｄ、４Ｈ）、このことからは、慢性ＧＥＮＵＳではミクログリアのテリトリーは維持されていることが示唆される。最後に、慢性ＧＥＮＵＳを受けたＣＫ−ｐ２５動物における棒状ミクログリアの全体的な体積の増加は有意に少ないが、ＣＫナイーブ群よりは有意に高いままであった（図４Ｉ）。次にＴａｕ Ｐ３０１Ｓミクログリアを特徴解析し、Ｐ３０１Ｓではミクログリア増加の傾向があったが、Ｉｂａ１免疫染色では統計的な有意差には達しなかったことが判明した（図４Ｋ、４Ｌ）。ミクログリア細胞体の総体積にも、ＷＴナイーブマウスと比較してＰ３０１Ｓに差はなかった（図４Ｋ、４Ｍ）。しかしながら、慢性ＧＥＮＵＳの後のＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスのミクログリア突起の総体積は、非刺激Ｐ３０１Ｓマウスと有意に差があり、ＷＴナイーブ同腹仔と同等であった（図４Ｋ、４Ｎ）。これらの結果から、基準および疾患状態における様々なミクログリアの状態が浮上し、全体として、Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスにおける、疾患関連性のミクログリアの形態機能障害を軽減する慢性ＧＥＮＵＳの効果が示唆される。
次に、慢性ＧＥＮＵＳにより影響を受けることが示されている免疫反応に対するＧＯ用語（ＧＯ ｔｅｒｍ）を検証した。インターフェロン反応性遺伝子のＣＤ４０に特異的な抗体を使用した免疫組織化学法により、ＣＫナイーブマウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスに有意な上昇があったことが明らかとなり（図４Ｄ、４Ｊ）、過去の報告と一致していた（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。慢性ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＣＤ４０シグナル強度の有意な低下を生じさせたが、ＣＫナイーブ対照よりは有意に高いままであった（図４Ｄ、４Ｊ）。次に別の免疫反応性遺伝子であるＣ１ｑ（古典的補体成分）を検証したところ、ミクログリア特異的なＲＮＡ−ｓｅｑ実験において有意に上方制御されていた。Ｃ１ｑは過去にＡＤマウスモデルでシナプス減少に関与していた（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｃ１ｑの免疫組織化学法からは、非刺激のＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１ＳマウスのＶ１において、各ナイーブ対照同腹仔と比較してシグナル上昇が示された（図４Ｏ、４Ｐ、４Ｑ）。慢性ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＣ１ｑの増加を有意に低下させたが、Ｃ１ｑの強度はＣＫナイーブの値よりも高いままであった（図４Ｏ、４Ｐ）。Ｐ３０１Ｓマウスにおいて、慢性ＧＥＮＵＳは、Ｃ１ｑの増加を減弱させ、ＷＴナイーブマウスと非刺激のＰ３０１Ｓマウスの間に有意差はなかった（図４Ｏ、４Ｑ）。全体として、免疫組織化学法の結果は一貫して、慢性ＧＥＮＵＳがミクログリアの免疫反応の低下を支援していることを示唆している。
慢性ＧＥＮＵＳは、シナプス伝達、およびニューロンの細胞内輸送を改変する
次に、ＮｅｕＮ陽性（ＮｅＵｎ＋）ニューロン核を単離して非バイアスＲＮＡ−ｓｅｑ分析を実施し、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１ＳのＶ１中のニューロンの遺伝子発現に対する慢性ＧＥＮＵＳの効果を研究した（図５Ａ、５Ｂおよび図１０Ｆ〜１０Ｇ）。慢性ＧＥＮＵＳ（ＣＫ−ｐ２５：ｐ２５誘導の４２日間；Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ：２２日間）の後、視覚皮質をマウスから採取した。続いて１００，０００個のニューロン核をＦＡＣＳにより溶解緩衝液中へとソーティングし、その後、ＲＮＡを抽出して配列解析を実施した（図５Ａ、５Ｂ）。脳重量に対する研究結果、および免疫組織化学法を使用したＮｅｕＮ定量および皮質菲薄化の研究結果と一致して（図３Ｇ、３Ｉおよび図９Ｄ）、ナイーブＣＫ同腹仔（１００±３．８７）と比較し、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスのＮｅｕＮ＋核の割合（８１．５６±３．２９）は有意に低下していたことが判明した。これは、慢性ＧＥＮＵＳを受けたＣＫ−ｐ２５マウスでは明白ではなかった（８８．５６±４．４９）（図１０Ｆ、１０Ｈ）。同様に、非刺激のＴａｕ Ｐ３０１ＳマウスにおけるＮｅｕＮ＋核の割合は、ナイーブＷＴ同腹仔（１００ ± ３．８７）よりも有意に低く（８６．１１ ± ２．２６）、慢性ＧＥＮＵＳを受けたＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスは、ＷＴマウス（９６．０５ ± ３．９９）とは変わらなかった（図１０Ｇ、１０Ｈ）。この結果は免疫組織化学法の結果と一致していた（図３Ｅ、３Ｊ）。これらの結果は、ＣＫ−ｐ２５マウスとＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスの神経変性マウスモデルの両方において、慢性ＧＥＮＵＳを受けたニューロン核の減少の低下を示しており、ＧＥＮＵＳの全体的な神経保護効果を示すものである。
次にこれらＦＡＣＳソーティングされたニューロンＲＮＡからＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。ＣＫ−ｐ２５マウスとＰ３０１Ｓマウスのそれぞれにおいて１サンプルあたり平均で１８０９万個および２２７９万個のリードが得られ、それらのうち８５．２３％および８４．４５％がアライメントされた。ＮｅｕＮ＋核の非バイアストランスクリプトーム解析により、それぞれの対照マウスと比較して、上方制御された遺伝子（ＣＫ−ｐ２５：５６５個の遺伝子；Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ：２２９個の遺伝子）よりもＣＫ−ｐ２５（６１８個の遺伝子）およびＴａｕ Ｐ３０１Ｓ（３５１個の遺伝子）において相対的に多くの遺伝子が下方制御されていたことが明らかとなった（図５Ａ、５Ｂ）。慢性ＧＥＮＵＳでは、それぞれの非刺激対照と比較して、ＣＫ−ｐ２５（４０９個が上方制御；４２２個が下方制御）およびＴａｕ Ｐ３０１Ｓ（２２０個が上方制御；２２１個が下方制御）において、上方制御された遺伝子と下方制御された遺伝子の数は同等であった（図５Ａ、５Ｂ）。
続いてＧＯ解析を実施して、差次的に発現された遺伝子と関連した生物機能を検証した。慢性ＧＥＮＵＳ後にＣＫ−ｐ２５マウスにおいてニューロン特異的に下方制御された遺伝子（６１８個の遺伝子）は、化学的シナプス伝達、細胞内輸送、オートファジー、ＡＴＰ代謝プロセス、トランス−シナプスシグナル伝達、および細胞−細胞シグナル伝達に関与していた（図５Ａ）。興味深いことには、ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスのニューロン中でこれらプロセスに関与する遺伝子を有意に上方制御することで、これら生物プロセスを回復させた（図５Ａ；右パネル）。Ｔａｕ Ｐ３０１において下方制御された遺伝子（３５１個の遺伝子）は、化学的シナプス伝達、トランス−シナプスシグナル伝達、小胞介在輸送を含む細胞内輸送、中脳の発生、およびアポトーシスプロセスの制御に関与していた（図５Ｂ）。小胞介在輸送、細胞内輸送、シナプス伝達、中脳発生およびアポトーシスプロセスの制御をはじめとするこれら同じプロセスが、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて慢性ＧＥＮＵＳ後にすべて上方制御されていたことが、上方制御遺伝子と関連した上位の生物機能から明らかとなった（図５Ｂおよび図１０Ｉ）。他方で、ＤＮＡ二本鎖切断およびＤＳＢ修復に関与するプロセスを含む一部の生物プロセスは、（ナイーブ対照と比較して）ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスの両方において上方制御されており、γＨ２ＡＸの免疫組織化学法のデータと一致していた（図９Ｇ）。重要なことは、慢性ＧＥＮＵＳ後にＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて下方制御されていた遺伝子には、ＤＮＡ損傷に反応するアポトーシス経路に必須であることが知られている遺伝子が含まれていたことであり、ニューロンが、低変性状態へとシフトしたことと一致していた。まとめると、これらのデータからは、２種の機構的に別個の神経変性マウスモデル（ＣＫ−ｐ２５およびＴａｕ Ｐ３０１Ｓ）においてさえも、遺伝子調節のパターン変化が、最終的にはニューロンの死を促進するシナプス機能、細胞内輸送およびアポトーシス制御の下方制御をはじめとする同様の細胞機能および生物機能に集結するということが示唆される。重要なことは、慢性ＧＥＮＵＳ後、シナプス伝達、シナプス統合および小胞介在輸送を含む細胞内輸送における欠陥の回復に関与する多くの遺伝子が、上方制御されていたことである（図５Ａ、５Ｂおよび図１０Ｈ）。
慢性ＧＥＮＵＳによって改変されたこれらの生物プロセスをさらに特徴解析し、実証するために、本発明者らは非バイアス液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を実施して、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１ＳマウスのＶ１中のタンパク質の差次的発現およびＳ／Ｔリン酸化を探索した（図５Ｃ、５Ｄ）。最初に、混合ＣＫ−ｐ２５群（ＣＫナイーブ対照、およびＧＥＮＵＳを受けた、または受けていないＣＫ−ｐ２５）、および混合Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ群（ＷＴナイーブ対照、およびＧＥＮＵＳを受けた、または受けていないＰ３０１Ｓ）において質量分析により特定されたすべてのタンパク質を検証し、それぞれのニューロン特異的ＲＮＡ−ｓｅｑデータから検出された全ＲＮＡと比較した。混合ＣＫ−ｐ２５群および混合Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ群において特定された総タンパク質のそれぞれ９２．７５％および９１．９５％が、ニューロン特異的ＲＮＡ−ｓｅｑデータ中の発現遺伝子にマッピングされた（図５Ｃ、５Ｄ）。このことから、特定されたタンパク質の大部分が、ニューロン機能に関与していたことが示された。次に、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて差次的にＳ／Ｔリン酸化されたタンパク質を、それぞれのナイーブ対照同腹仔と比較したところ、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスの両方でＳ／Ｔリン酸化タンパク質に全体的な増加があったことが判明した（図５Ｃ、５Ｄ、左下のパネル）。このことから、両方の神経変性マウスモデルにおける、機能性タンパク質の異常な改変が示唆される。慢性ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスの両方において、それぞれの非刺激対照と比較して、タンパク質のＳ／Ｔリン酸化の低下を生じさせた（図５Ｃ、５Ｄ、右下のパネル）。ニューロン特異的遺伝子発現解析の結果（図５Ａ、５Ｂ）と一致して、慢性ＧＥＮＵＳは、化学的シナプス伝達、樹状突起発達、長期増強電位、小胞介在輸送の制御、シナプス中の小胞介在輸送、および細胞内輸送の制御に関与するタンパク質を改変した（図５Ｅ、および図１０Ｊ〜１０Ｍ）。このことから、これらプロセスが変性ニューロン中で変化し、慢性ＧＥＮＵＳで改善されたことが示唆される。
小胞輸送、エンドサイトーシスおよびシナプス伝達に関与するホスホプロテオミクス解析からのタンパク質の一つの例は、ダイナミン１（ＤＮＭ−１：ｄｙｎａｍｉｎ１）（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）であり、ダイナミン１はＣＫ−ｐ２５およびＴａｕ Ｐ３０１Ｓの両方で、慢性ＧＥＮＵＳ後の差次的Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質のアノテーションにおいて、複数のＧＯ用語と関連していた（図５Ｅ）。Ｓｅｒ７７４のリン酸制御はシナプス小胞のエンドサイトーシスに必須であり（Ｃｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて過剰リン酸化されていることが判明している多くの残基の内の一つであり、慢性ＧＥＮＵＳで低下する。本発明者らは免疫組織化学法およびウェスタンブロッティングを実施し、ＤＭＮ−１ Ｓｅｒ７７４リン酸化がＣＫ−ｐ２５マウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて有意に増加していること、および慢性ＧＥＮＵＳで低下することを見出した（図５Ｆおよび図１０Ｍ、１０Ｎ）。さらに小胞輸送および神経伝達輸送、シナプス伝達、ならびに学習および記憶に関与するもう一つのタンパク質である小胞グルタミン酸トランスポーター１（ｖＧｌｕｔ１：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）（Ｂａｌｓｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）の免疫組織化学を実施した。ｖＧｌｕｔ１集積は、ＣＫナイーブマウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に低下しており（図５Ｇ、５Ｈ）、慢性ＧＥＮＵＳ後（非刺激対照と比較して）、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、Ｖ１だけでなく、ＳＳ１、ＣＡ１、およびＰＦＣのＡＣＣ領域においてもｖＧｌｕｔ１発現は有意に高くなった（図５Ｇ、５Ｈ）。同様にＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおける、これら脳領域全体にわたるシナプスマーカーｖＧｌｕｔ１集積の発現減少は、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて慢性ＧＥＮＵＳ後に軽減されていた（図５Ｉ）。これらのデータは、両方の神経変性モデルにおいて、慢性ＧＥＮＵＳを受けたこれら脳領域全体にわたるニューロン（図３Ｄおよび３Ｉ）およびシナプスの減少（図４Ｏ、４Ｐ、４Ｑ）の低下と一致している。
慢性ＧＥＮＵＳは、行動力を改変する
これまでのところ、これらの結果からは、ＧＥＮＵＳが、Ｖ１をはるかに超えてＣＡ１、ＳＳ１およびＰＦＣを含み、ニューロン振動を同調させ得ること、そしてＣＫ−ｐ２５マウスとＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスのこれら脳領域のすべてにおいてアミロイドプラーク、タウ過剰リン酸化、シナプス減少およびニューロン減少をはじめとするＡＤ関連病変を低下させることが示される。ＲＮＡ−ｓｅｑデータおよびホスホプロテオミクスデータは、慢性ＧＥＮＵＳの、シナプス伝達および細胞内輸送における一部の疾患関連性の障害を軽減する能力をサポートするものであり、シナプス機能の保存と一致している。ゆえに、慢性ＧＥＮＵＳは認知機能も改善するかを検討した。最初に、ＧＥＮＵＳが、任意の認知変化の解釈を困難にさせ得る、何らかの規則的な行動変化を誘発し得るかの決定を試みた。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいて、急性ＧＥＮＵＳ中の自発運動または急性ＧＥＮＵＳ後に移動した距離に明白な差異はなかった（図１１Ａ〜１１Ｃ）。さらにピクロトキシンによる発作感受性、および新規物体識別の両方とも変化しなかった（図１１Ｂ〜１１Ｃ）。ＧＥＮＵＳで慢性的に刺激された全群の動物（Ｃ５７Ｂｌ６：７日；ＣＫ−ｐ２５：ｐ２５誘導中の４２日間、１時間／日；Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓ：２２日）が、非刺激対照と同等の体重を有していた（図１１Ｄ〜１１Ｆ）。最後に、７日間のＧＥＮＵＳは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいてストレス反応マーカーである血漿コルチコステロンに影響を与えなかった（図１１Ｉ）。
ＧＥＮＵＳの認知的な利益を評価するために、ＣＫ−ｐ２５マウスにＧＥＮＵＳの慢性的刺激を与えながら６週間、ｐ２５発現を誘導した後のＡＤのＣＫ−ｐ２５マウスモデルにおける学習と記憶に焦点を合わせた。最後の週に、マウスをオープンフィールド（ＯＦ）に曝し、次いで新規物体認識（ＮＯＲ）検査を実施した（図６Ａ）。その結果から、ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、オープンフィールドアリーナの中心で過ごした時間で測定される、不安感に影響を与えなかった（図６Ａ、６Ｂ）。そして血漿コルチコステロン値にも変化せず（図１１Ｉ）、これらのことから慢性ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて不安感またはストレスには影響を与えなかったことが示される。興味深いことに、ＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウスは自発運動に差異は何も示さなかったが、慣れた物体と比較して、新規物体の探索に有意に長い時間を費やした（図６Ａ、６Ｃ、および図１１Ｇ）。このことから、慢性ＧＥＮＵＳは、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて新規物体認識を改善したことが示唆される。次にモリス水迷路（ＭＷＭ）検査を、６週目のＧＥＮＵＳを行いながら、６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスにおいて実施した。ＭＷＭ検査において、ＣＫナイーブマウスと比較して非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスは空間学習の低下を呈し、トレーニング中にプラットフォームを発見するまで、より長い潜時を要した（図６Ｄ）。非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスは、ＣＫナイーブ群と比較して空間記憶の低下も呈し、探索試験（最後のトレーニング日の２４時間後）においてプラットフォーム位置の訪問回数の減少と、標的四分円で過ごした時間の減少が示された（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）（図６Ｄ）。これらの低下は、慢性ＧＥＮＵＳにより有意に改善され、そしてこの改善は遊泳速度の変化の結果ではなく、遊泳速度は群全体で、そして全トレーニング日で同等であった（図６Ｄ、および図１１Ｊ）。
このＧＥＮＵＳ介在性の行動力の改善が、認知機能の基盤にある一つのメカニズムに限定されず、より広くＡＤ関連の認知低下に適用可能であることを立証するために、複数のＡＤモデルマウスを検証した。８ヵ月齢のＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスに２２日間（１時間／日）のＧＥＮＵＳを実施し、刺激を与えて３週目にマウスをＯＦおよびＮＯＲタスクにおいて検査し、同月齢の非刺激群と比較した（図６Ｅ）。ＣＫ−ｐ２５マウスと同様に、ＧＥＮＵＳは、Ｔａｕ Ｐ３０１ＳマウスにおいてＯＦアリーナの中心で過ごした時間を変化させず（図６Ｅ、６Ｆ）、そして血漿コルチコステロン値も変化させなかった（図１１Ｉ）。このことから、慢性ＧＥＮＵＳは、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて不安感様行動を変化させなかったことが示唆される。次に、新規物体認識検査を実施し、ＷＴナイーブマウス、およびＧＥＮＵＳ刺激Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスが、慣れた物体と比較して新規物体に対し高い選好を示したことが観察された（図６Ｇ）。同様に、非刺激タウＰ３０１Ｓマウスにおいても新規物体選好は高かった（図６Ｇ）。
次にＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスにおいて、ＧＥＮＵＳの３週目の間にＭＷＭ検査を実施した。ＷＴナイーブ、およびＧＥＮＵＳ刺激Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスは、非刺激Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスと比較して、ＭＷＭトレーニングにおいて有意に高い学習曲線を呈した（図６Ｈ、および図１１Ｊ）。最後に、ＡＤのアミロイドモデルにおける行動改善に対するＧＥＮＵＳの有効性を検証した。ＧＥＮＵＳ刺激５ＸＦＡＤマウス（２２日間−１時間／日）に、トレーニングの３週目の間にＭＷＭ検査を実施した（図６Ｉ）。ＧＥＮＵＳ刺激５ＸＦＡＤマウスは、ＭＷＭトレーニングの最初の４日間はわずかに低い学習曲線を示したが、ＷＴ同腹仔と比較して複数回のトレーニングトライアルで改善した。対照的に、非刺激５ＸＦＡＤマウスは有意に低下した（図６Ｉおよび図１１Ｊ）。最後に８０Ｈｚの視覚刺激を採用し、他の周波数の慢性刺激が行動に影響を与え得るかを調査した。Ｖ１のインビボ記録と同様に、２２日間の８０Ｈｚの視覚刺激を受けた５ＸＦＡＤマウスは、非刺激５ＸＦＡＤマウスと比較してＭＷＭにおいて差異を示さなかった（プラットフォームを発見するまでの潜時、および探索試験における標的交差として定量された）（図１２Ａ〜１２Ｃ）。まとめるとこれらの結果は、特に４０Ｈｚの慢性刺激が、神経変性の複数のマウスモデルにおいて行動力を改善することが示している。
ニューロンネットワークの振動の操作は、神経障害と関連する病変変化と行動力の障害を緩和する有望な戦略であり得るという見解をサポートする証拠が増加している（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋａｓｔａｎｅｎｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｖｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。本明細書において、本発明者らは、４０Ｈｚの視覚刺激を介した低ガンマ振動の慢性的な毎日の同調（ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ）が、ガンマ振動の同調に有効であり、たとえ進行性の神経変性の状態であっても、複数の脳領域において神経病変を低下させることを実証する。慢性ＧＥＮＵＳの神経保護作用には、ミクログリア介在性炎症反応の低下、シナプス伝達およびニューロン中の細胞内輸送を促進する遺伝子ならびにタンパク質の発現のブースト、ならびに行動力の改善が含まれる。
慢性的な視覚ＧＥＮＵＳが、低ガンマ振動を同調させ、脳領域全体にわたるガンマコヒーレンスを増加させる
本発明者らは過去に、急性の１時間の４０Ｈｚの視覚刺激が、ニューロン活動を同調させてガンマ周波数の範囲で振動させ、若い症状を示す前の３カ月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいてＡＤ関連表現型を低下させることを示している（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本開示において本発明者らは、ＧＥＮＵＳが、神経変性を有するＣＫ−ｐ２５マウスモデルおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスモデルにおいて、重度のＡＤ様病変があり、ニューロンが減少しているにもかかわらず、視覚皮質（Ｖ１）、海馬ＣＡ１、体性感覚皮質（ＳＳ１）および前頭前野皮質（ＰＦＣ）を含む脳の複数の部分にわたり、低ガンマ（約３５〜４５Ｈｚ）振動の出力を増加させたことを示す。自発運動は、ガンマ振動検出の交絡因子であり得るが、記録セッション中の速度および総距離において、遮光および可視状態の４０Ｈｚの視覚刺激の間に差異は検出されず、ＧＥＮＵＳ中に観察された低ガンマ同調が、活動レベルにおける差異に関連した可能性は低いと思われた。さらにＣＡ１における単一ユニット記録の解析から、ＧＥＮＵＳは、Ｖ１から下流の複数の脳領域においてニューロン活動を回復させ得ること（Ｍａｒｔｏｒｅｌｌ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、添付の提出書類も参照のこと）が示され、および重み付け位相同期指標（ＷＰＬＩ：ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐｈａｓｅ ｌａｇ ｉｎｄｅｘ）の測定値は、非相関ノイズ源からの体積伝導の影響を受けにくく、Ｖ１、ＣＡ１、ＳＳ１およびＰＦＣが低ガンマコヒーレンスを増強し、ＧＥＮＵＳとより機能的に結び付くことを示している。これは、「コヒーレンスを介したコミュニケーション（ＣＴＣ：ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）」が認知機能に必須であると提唱されており（Ｆｒｉｅｓ，２０１５）、そして驚くべきことではないが、ヒトＡＤ対象が皮質領域間のコヒーレンスに欠落を示していることからも重要である（Ｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
視覚ＧＥＮＵＳは、複数の神経変性マウスモデルで広範な神経保護に寄与する
ＧＥＮＵＳの慢性的な適用が広範な脳領域に影響を与え得るかを決定するために、本発明者らは、視覚皮質と、デフォルトモードネットワークの他の重要構造であり、ＡＤに強く影響を受ける、例えば海馬および前頭前野皮質（ＰＦＣ）の帯状部分などに焦点を当てた。最初に高齢の５ＸＦＡＤマウスに７日間のＧＥＮＵＳを適用したところ、Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）に報告されるように、Ｖ１においてアミロイドプラークは有意に低下したが、海馬のアミロイドレベルは変化しなかったことが判明した（図２Ａ、２Ｂ）。
そこで本発明者らは、重度病変を有する比較的高齢の５ＸＦＡＤマウス（１０カ月齢）を使用してＧＥＮＵＳレジームを３週間延長し、アミロイドプラーク負荷量がＶ１だけでなく、ＳＳ１、海馬およびＰＦＣを含む脳の他の分布部分でも有意に改善されたことを示した。本発明者らはこの延長ＧＥＮＵＳレジームを、ＣＫ−ｐ２５マウスモデルにおいてｐ２５誘導の全６週間、およびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスおよび５ＸＦＡＤマウスにおいて、ニューロン減少が各モデルで始まる齢で３週間適用した。過剰リン酸化タウ、シナプス減少およびニューロン減少、ならびにＤＮＡ損傷を含む、各病変において有意な低下が見いだされ、これはＣＫ−ｐ２５マウスモデル、Ｔａｕ Ｐ３０１Ｓマウスモデルおよび５ＸＦＡＤマウスモデルにわたり、Ｖ１に限定されず、ＣＡ１、ＳＳ１、およびＣＣ（前頭前野皮質の帯状部分）でも明白であった。ニューロン減少を予防するＧＥＮＵＳの神経保護作用は、ＣＫ−ｐ２５マウスモデルにおいて特に明白であり、このマウスモデルは通常、劇的な脳委縮、皮質体積の縮小および対応する脳室の拡張を呈する。これらはニューロンおよびその伸長突起が変性した場合のヒトのＡＤと関連する。したがって、本発明者らは、ＧＥＮＵＳが様々な病理学的特徴を有する複数のマウスモデルに広範な神経保護作用を付与することを実証した。
視覚ＧＥＮＵＳはシナプス機能、細胞内輸送、および行動を改変する
分子レベルでのＧＥＮＵＳの影響を調べるために、次に非バイアス型のトランスクリプトーム解析およびプロテオミクス解析を実施した。単離／精製されたＴａｕ Ｐ３０１ＳおよびＣＫ−ｐ２５のニューロンのデータは、シナプス機能を制御する複数の遺伝子、タンパク質および翻訳後修飾タンパク質の著しい制御異常が実証されており、これは、これら神経変性モデルにおいて過去に報告されたニューロンの興奮性および興奮性／抑制性のバランスの変化（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｙｏｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００７）と一致している。ＡＤも樹状突起棘密度の低下を生じさせることが知られており、遺伝子操作、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の薬理学的阻害、またはオプトジェネティクスのいずれかによりＡＤマウスで突起棘密度を増加させることで、認知機能障害が軽減することが示されている（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに本発明者らは、慢性視覚ＧＥＮＵＳが、ＣＫ−ｐ２５モデルおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓモデルにおいて、これら遺伝子の発現およびタンパク質リン酸化の瑕疵を軽減することを見出しており、シナプスタンパク質に特異的なマーカー（ｖＧｌｕｔ１、ｂａｓｓｏｏｎ）を用いた免疫組織化学解析により、シナプス密度が各対照マウスと同等であることが確認されている。これらの遺伝子発現の変化およびシナプス密度の回復は、慢性視覚ＧＥＮＵＳで認められた低ガンマコヒーレンスの強化と共に、慢性ＧＥＮＵＳが、視覚皮質およびその下流脳領域の可塑性を改変することを示唆する。
死後のヒトＡＤサンプル、ＡＤマウス、ｉＰＳＣモデル、および初代培養細胞の研究からも、ＡＤにおける細胞内輸送、小胞輸送およびエンドソーム機能の混乱が示唆されている（Ｍｉｌｌｅｃａｍｐｓ ａｎｄ Ｊｕｌｉｅｎ，２０１３；Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃａｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。エンドサイトーシスとＡβ産生の間の繋がりは、多くの研究により詳細に報告されている（Ｍａｒｋｓ ａｎｄ ＭｃＭａｈｏｎ，１９９８；Ｃｉｒｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｃｈｏｂｅｌ ｅｔ ａ．，２００８；Ｗｕ ａｎｄ Ｙａｏ，２００９）。非バイアス型のトランスクリプトームデータおよびプロテオミクスデータから、慢性ＧＥＮＵＳは、これら細胞内輸送、小胞輸送およびエンドサイトーシスプロセスに、遺伝子発現レベルおよびタンパク質の翻訳後修飾レベルで変化を誘発することが示される。本発明の結果は、急性オプトジェネティクス誘導性ガンマ振動後の若い５ＸＦＡＤマウスのＣＡ１における、拡張早期エンドソームの低下と一致している（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに本発明データは、神経変性のＰ３０１ＳマウスモデルおよびＣＫ−ｐ２５マウスモデルの両方において、エンドサイトーシスにおけるダイナミンの作用に影響を及ぼすＳ７７４のダイナミン１の過剰リン酸化（Ｒａｉｍｏｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を、慢性ＧＥＮＵＳが低下させることを示している。
これらをまとめると、慢性ＧＥＮＵＳによるニューロン生存の強化は、ＤＮＡ損傷反応、オートファジー、シナプス伝達、細胞内輸送、小胞輸送および神経炎症の低下の制御に関与する広範な遺伝子ならびにタンパク質の回復（または修復）により支援されている可能性が最も高い。ニューロン生存を促進し、ニューロン機能を維持する、慢性視覚ＧＥＮＵＳの広範な神経保護作用を支持するように、ＣＫ−ｐ２５マウスにおける新規物体認識の改善および空間モリス水迷路の改善、およびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスおよび５ＸＦＡＤマウスにおける空間水迷路の学習と記憶の強化を含む、慢性ＧＥＮＵＳ後の複数のマウスモデルにおける行動力の改善が判明した。行動力の改善が観察されたが、慢性ＧＥＮＵＳは体重を変化させず（図１１Ｄ〜１１Ｆ）、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＰ３０１Ｓマウスにおいて、オープンフィールド探索による不安感、そしてマーカーのコルチコステロンにより分析されたストレス反応も変化させなかった（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｇ〜１１Ｉ）。興味深いことに、Ｚｈａｎｇら（２０１５）は、慢性２Ｈｚ視覚刺激（１日６時間で４週間）が認知能力を改善したが、３ｘＴｇマウスの帯状皮質のＡβ１−４２は変化させなかったことを示している。
視覚ＧＥＮＵＳは神経炎症を低下させる
炎症プロセスはＡＤおよび神経変性において重要な役割を果たすことが指摘されており、急性ＧＥＮＵＳはミクログリアの顕著な形態活性化を誘導することが過去に示されている（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。神経変性におけるミクログリア固有の役割は複雑であり（有益にも有害にもなり得るため）、完全には解明されていない。近年の研究により、ミクログリアの表現型は、疾患が進行するに伴い変化し得ることが明らかとなった（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｕｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｄｅｃｚｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。本開示において、免疫組織化学を用いた詳細な形態解析およびミクログリア特異的なトランスクリプトーム解析を実施し、慢性ＧＥＮＵＳに影響を受ける基盤プロセスをさらに詳細に検証した。慢性ＧＥＮＵＳはＣＫ−ｐ２５マウスモデルおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスモデルにおいてミクログリアの形態、免疫反応および代謝プロセスを改変するが、幅広い形態表現型が存在することが判明した。
第一に、Ｉｂａ１免疫染色により、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、ミクログリアは非常に増殖性で（より多くのミクログリア；Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）と一致する）、凝集する傾向があり、そしてこの傾向は慢性ＧＥＮＵＳ後に低下していたことが明らかとなった。ミクログリア突起の総体積は、棒状ミクログリアのサブセット以外は減少した。棒状ミクログリアサブセットの総細胞体体積および主要突起体積は、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスで高く、慢性ＧＥＮＵＳではこれらの異常なミクログリア表現型は低下した。興味深いことに、棒型のミクログリアは近年、びまん性脳損傷を受けたラットの脳、および外傷性脳損傷を受けたヒト対象に存在していることが報告されている（Ｂａｃｈｓｔｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。次に、５ＸＦＡＤマウスにおいてミクログリアは貪食状態になり、Ａβを取り込む。これはＧＥＮＵＳのいくつかのモダリティ（視覚、聴覚または視覚と聴覚の組み合わせ）で発生しており、ミクログリアの形態変化は、アミロイドプラーク数の減少と相関している（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｍａｒｔｏｒｅｌｌ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、付随の提出書面）。さらにミクログリアの貪食状態は、タンパク質分解（ＧＯにより特定されるタンパク質代謝プロセス）の増加が付随している。神経変性およびＡＤを背景としたミクログリアの炎症反応が近年研究されている。本発明のデータは、慢性ＧＥＮＵＳが、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてミクログリアの炎症反応を低下させ、例えば神経変性で上方制御されることが知られている（Ｍａｔｈｙｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）適合免疫系およびＭＨＣクラスＩＩに関与する遺伝子を下方制御することを示すものである。おそらくこの炎症反応の低下の結果として、シナプス刈り込みのマーカー、Ｃ１ｑ（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）において減少がみられ、それと同時にシナプスマーカーのｖＧｌｕｔ１およびｂａｓｓｏｏｎの増加が発生する。これらにより、慢性ＧＥＮＵＳによるシナプス密度の保全が解説される。付随の論文、ＭａｒｔｏｒｅｌｌおよびＰａｕｌｓｏｎらが、慢性聴覚ＧＥＮＵＳ、および聴覚ＧＥＮＵＳと視覚ＧＥＮＵＳの組み合わせの後の星状細胞反応と脈管系の変化を実証しているという点に留意されたい。
要約すると、本発明のデータは、視覚ＧＥＮＵＳは前脳の複数の領域（ＳＳ１、ＣＡ１、ＰＦＣ）に伝播することができ、そして複数の細胞型（ニューロン、ミクログリア、星状細胞）からの反応を惹起させ得ることを実証するものである。視覚刺激を使用したガンマ同調は、神経障害に対して保護的作用をもたらし、認知機能を改善する非侵襲的戦略である。慢性視覚ＧＥＮＵＳは、ニューロンおよびシナプスの減少を低下させ、シナプス機能と関連する遺伝子およびタンパク質を改変し、それらが共に、観察された行動的改善をサポートすることが判明した。本開示は、ＡＤマウスモデルにおける、複数の脳領域のＡＤ病変および行動に影響を与える慢性視覚ＧＥＮＵＳの神経保護作用を実証するものであり、神経保護に寄与するＧＥＮＵＳの全体的な有効性を示すものである。
発明の詳細
図１Ａ〜１Ｊは、開示される本発明の主旨に従い、視覚刺激が、視覚皮質を超えて対象の複数の脳領域においてガンマ振動を同調させることを示す。
図１Ａにおいて、５０％の負荷サイクルの４０Ｈｚの視覚刺激（１２．５ミリ秒の点灯と１２．５ミリ秒の消灯）は、Ａｒｄｕｉｎｏシステムを使用して送達された。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに、非刺激または４０Ｈｚの視覚刺激のいずれかを１時間与え、その後、マウスを殺処分し、脳をｃ−Ｆｏｓ発現に対して染色した。マイクロドライブを、インビボでの電気生理学実験のために別個のコホートに移植した。
図１Ｂにおいて、４０μｍの厚さの冠状脳切片中でｃ−Ｆｏｓ発現が定量され、ニューロン活動が評価された。代表的なｃ−Ｆｏｓ免疫染色画像。スケールバーは、５０μｍを示す。右：４０Ｈｚの視覚刺激は、視覚皮質（Ｖ１；Ｎ＝４匹のマウス／群。独立標本ｔ検定、Ｔ＝−７．１１０、Ｐ＝０．００２）、体性感覚皮質（ＳＳ１；Ｔ＝−５．２３９、Ｐ＝０．００６）、海馬（ＣＡ１；Ｔ＝−４．９８９、Ｐ＝０．００８）、および前頭前野皮質（ＣＣ；Ｔ＝−２．９３８、Ｐ＝０．０１）において、非刺激マウスと比較してニューロン活動マーカーのｃ−Ｆｏｓを有意に増加させた。
図１Ｃにおいて、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＰＦＣから、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＬＦＰからの出力スペクトルが記録された。赤い線は、可視の４０Ｈｚ視覚刺激提示中の記録を示し、一方で青い線は、遮光された４０Ｈｚ光明滅を示す（ＬＥＤアレイは光を遮るように覆われた。方法を参照のこと。Ｎ＝７匹のマウス）。
図１Ｄにおいて、群のガンマ帯域出力（４０±５Ｈｚ）が図１Ｃから計算された。４０Ｈｚの視覚刺激は、Ｖ１（ウィルコクソン順位和検定、Ｚ＝５．９、Ｐ＝３．１×１０−９）、ＳＳ１（Ｚ＝２．４、Ｐ＝０．０１８）、ＣＡ１（Ｚ＝３．４、Ｐ＝６．９×１０−４）、およびＰＦＣ（Ｚ＝３．３、Ｐ＝９．２×１０−４）にわたり、対照条件（ＬＥＤ明滅が遮られている）と比較して、ガンマ出力を有意に増加させた。
図１Ｅにおいて、カスタムメイドの四極管マイクロドライブをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに移植し、四極管をＣＡ１に合致させて、単一ユニットを単離させた。チャートは、遮光された、および４０Ｈｚ刺激期間中の４０Ｈｚの位相のスパイク確率を示す。
図１Ｆにおいて、平均合成ベクトル長（ＭＲＬ：ｍｅａｎ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ｌｅｎｇｔｈ）により分析したところ、遮光条件（Ｏｃ．ＬＥＤ）と比較して、４０Ｈｚの視覚刺激は、局所ＬＦＰに対する錐体ニューロンのスパイクの位相同期強度を有意に増加させたことを示している（４匹のマウスからのＮ＝２４個の細胞、ウィルコクソン順位和検定、Ｚ＝２．５、Ｐ＝０．０１１）。
図１Ｇにおいて、構造間のＬＦＰコヒーレンスは、重み付け位相同期指標法（ＷＰＬＩ：Ｎ＝７匹のマウス）を使用して定量され、記録部位が示されている。
図１Ｈにおいて、図１Ｇに関連した、低ガンマ帯（３０〜５０Ｈｚ）ＷＰＬＩの群変化が図示されている。４０Ｈｚ視覚刺激は、Ｖ１−ＣＡ１（ウィルコクソン順位和検定、Ｚ＝２．２、Ｐ＝０．０３）、Ｖ１−ＳＳ１（Ｐ＝０．０２１）およびＶ１−ＰＦＣ（Ｚ＝２．５、Ｐ＝０．０１４）の間のコヒーレンスの有意な増加を誘導した。
図１Ｉは、５０％の負荷サイクルでの８０ＨｚのＬＥＤ光送達（６．２５ミリ秒の点灯および６．２５ミリ秒の消灯）の概略図である。
図１Ｊの左側は、遮光された（Ｏｃ．ＬＥＤ）または８０Ｈｚの視覚刺激を受けたＣ５７Ｂｌ／６ＪマウスのＶ１ ＬＦＰの出力スペクトルを示す。右側の８０Ｈｚ（±５Ｈｚ）を中心とする帯域出力は、８０Ｈｚの視覚刺激では有意に異ならなかったことを示す（Ｎ＝５匹のマウス、ウィルコクソン順位和検定、Ｚ＝１．２、Ｐ＝０．２２）。
図２Ａ〜２Ｆは、開示される本発明の主旨に従い、慢性４０Ｈｚ（８０Ｈｚではない）視覚明滅刺激が、対象の視覚皮質を超えてアミロイドプラークを減少させることを示す。
図２Ａは、非刺激、４０Ｈｚ、または８０Ｈｚの視覚刺激を１日当たり１時間で７日間受けた５ＸＦＡＤマウス中のアミロイドプラーク負荷量を示す。Ｄ５４Ｄ２抗体の免疫組織化学染色により可視化された。各条件における、Ｖ１、ＳＳ１およびＣＡ１の代表的な画像。スケールバーは、５０μｍを表す。
図２Ｂは、１日当たり１時間で７日間のＧＥＮＵＳが、Ｖ１においてアミロイドプラークを減少させたが、ＳＳ１または海馬領域のＣＡ１においてはアミロイドプラークを有意には変化させなかったことを示す群定量を示す。８０Ｈｚの視覚刺激曝露は、Ｖ１またはＣＡ１においてはアミロイドプラークのレベルを変化させなかったが、ＳＳ１においてはアミロイドプラークを有意に増加させた。非刺激群はＮ＝８、ならびに４０Ｈｚ群および８０Ｈｚ群からはそれぞれＮ＝６匹のマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、５１）＝５．３７８、Ｐ＝０．００７６。ボンフェローニ事後多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。
図２Ｃは、非刺激、または２２日間（１日当たり１時間）の延長ＧＥＮＵＳプロトコールを受けた５ＸＦＡＤマウスにおけるアミロイドプラーク負荷量の代表的な画像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
図２Ｄは、２２日間のＧＥＮＵＳが、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣにおいてアミロイドプラークを有意に減少させたことを示す。１条件あたり、Ｎ＝６匹のマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（１，４０）＝５１．００、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ≦０．０１．
図２Ｅは、無刺激、または１日当たり１時間で２２日間の８０Ｈｚ光明滅刺激を受けたマウスの可視化されたＶ１、ＳＳ１およびＣＡ１中のアミロイドプラークの代表的な画像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
図２Ｆは、図２Ｅに関連して、Ｖ１、ＳＳ１およびＣＡ１中のアミロイドプラークを定量した群データを示す。１群当たりＮ＝６匹のマウス。二元配置ＡＮＯＶＡ測定Ｆ（１、３０）＝０．００３３、Ｐ＝０．９５６５において、群間の有意差は見出されなかった。
図３Ａ〜３Ｊは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、対象においてアルツハイマー病関連病変を改善し、神経変性を有意に減少または予防することを示す。
図３Ａは、Ｐ３０１Ｓマウスが、無刺激、または２２日間のＧＥＮＵＳ（１日当たり１時間）を受けた後、免疫組織化学解析およびホスホプロテオミクス解析を受けたことを示す実験のアウトラインを提示する。刺激レジメンを受けなかったＷＴケージの同腹仔は、ＷＴナイーブマウスとみなされた。
図３Ｂは、視覚皮質のＳ２０２／Ｔ２０５リン酸化タウ免疫染色を示す代表的な画像を提示する。スケールバーは、５０μｍ。右：Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスは、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣにおいて高いＳ２０２／Ｔ２０５レベルを示したが、２２日間のＧＥＮＵＳは検証したすべての領域でＳ２０２／Ｔ２０５を有意に減少させた。Ｎ＝７匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝８匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝７匹のＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７６）＝４５．３５、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図３Ｃは、視覚皮質のセリン／スレオニンリン酸化タウタンパク質のホスホプロテオミクス解析を示す。ヒートマップは、Ｐ３０１Ｓにおいて、ＷＴマウスと比較して差次的にリン酸化を受けたタウタンパク質のＳ／Ｔ残基を示す。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，３２２）＝２１４６、Ｐ＜０．０００１。すべてのホスホペプチドは、方法に記載されるようにマッピングされた。ヒートマップ中に示されるタウの全てのＳ／Ｔ残基が、ＷＴナイーブと非刺激Ｐ３０１Ｓの間で統計的に有意であった。特定の残基に対する、非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓマウスの間の統計的比較（Ｐ値）をチャートに示す。ＧＥＮＵＳは６個のＳ／Ｔ部位でタウタンパク質のリン酸化を減少させ、Ｓ４５１でリン酸化を増加させた。普遍的に知られているヒトのタウＳ／Ｔ部位を上部に示す。
図３Ｄは、非刺激またはＧＥＮＵＳを受けたＷＴナイーブマウスおよびＰ３０１Ｓマウスの視覚皮質中のニューロンマーカーＮｅｕＮの代表的な画像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
図３Ｅは、ＷＴナイーブマウスと比較して、Ｐ３０１Ｓマウスは、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣ中のニューロンの有意な減少を示したことを示唆する群データを示す。ＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓ群は、神経変性の有意な減少を示した。Ｎは、図３Ｂと同じである。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７６）＝１９．７３、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図３Ｆは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおける、４２日間のｐ２５誘導の実験の概略を提示する。この誘導実験には、一つの実験群において１日当たり１時間のＧＥＮＵＳ、室内灯で照らされた非刺激対照群が付随した。刺激レジメンを受けなかったＣＫ（ＣａＭＫ２α−プロモーター ｘ ｔＴＡ）ケージの同腹仔は、ＣＫナイーブマウスとみなされた。
図３Ｇは、誘導後４２日のＣＫ−ナイーブ、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウスの脳における定量的差異を示す顕微鏡写真である。右：ＣＫ−ｐ２５マウスは、ＣＫナイーブマウスと比較して脳重量の減少を呈し（すなわち脳萎縮）、一方で慢性ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて脳萎縮を部分的に緩和した。ＣＫナイーブマウスはＮ＝１３匹のマウス、非刺激群およびＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５群はそれぞれＮ＝１０匹のマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、３０）＝１５．４６、Ｐ＜０．００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５。
図３Ｈは、側脳室（輪郭強調）の代表的な画像およびサイズ定量を提示している。スケールバーは１０００μｍを表す。右：ＣＫナイーブマウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスは異常な脳室拡張を呈したが、慢性ＧＥＮＵＳ後に有意に減少した。ＣＫナイーブマウスはＮ＝９匹のマウス、非刺激群およびＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５群はそれぞれＮ＝６匹のマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、１８）＝１２．３６、Ｐ＜０．００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５。図９Ｅも参照のこと。
図３Ｉは、非刺激またはＧＥＮＵＳを受けたＣＫナイーブマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスの視覚皮質中のニューロンマーカーＮｅｕＮの代表的な画像を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。
図３Ｊは、ＣＫ−ｐ２５マウスが、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣにおいて重度のニューロン減少を呈したが、慢性ＧＥＮＵＳが、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてニューロン減少を低下させたことを示す。Ｎは、図３Ｇと同じである。二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、７２）＝３１．３８、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図４Ａ〜４Ｑは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、対象のミクログリアにおける炎症反応を減少させることを示す。
図４Ａは、無刺激、または１日当たり１時間で４２日間のＧＥＮＵＳを受けたＣＫ−ｐ２５マウスに関する。次いで蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５のダブルポジティブ基準を使用）視覚皮質からミクログリアを単離し、その後、ＲＮＡを抽出し、配列解析した。差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ：ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ）をボルケーノプロットに示す。群比較は、下部に示される。左：ＣＫナイーブマウスと非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスの間のＤＥＧ、１群当たりＮ＝４匹のマウス。右：非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスとＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５マウスの間のＤＥＧ、１群当たりＮ＝４匹のマウス。
図４Ｂは、特定されたＤＥＧに関連する生物プロセスに対して選択された遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語を示す。上：非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、ＣＫナイーブマウスと比較して上方制御された（ＵＰ）遺伝子と関連するＧＯ用語。下：非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、ＣＫナイーブマウスと比較して下方制御された（ＤＯＷＮ）遺伝子と関連するＧＯ用語。
図４Ｃは、ＤＥＧと関連した、選択されたＧＯ用語を示す。上：ＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して上方制御された（ＵＰ）遺伝子と関連するＧＯ用語。下：ＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して下方制御された（ＤＯＷＮ）遺伝子と関連するＧＯ用語。
図４Ｄは、視覚皮質のミクログリアマーカーのＩｂａ１（緑）とＣＤ４０（赤）の免疫染色を示す代表的な画像を提示する。スケールバーは、５０μｍ。ＣＫナイーブマウスはＮ＝７匹のマウス、非刺激群およびＧＥＮＵＳ群はそれぞれＮ＝６匹のマウス。矢印と矢頭はそれぞれ、棒状の分枝突起と、ミクログリア突起の分枝の豊富さを示す。
図４Ｅは、非刺激のＣＫ−ｐ２５マウスは、ＣＫナイーブマウスと比較して多くのＩｂａ１陽性細胞を呈したこと、慢性ＧＥＮＵＳがＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＩｂａ１細胞の密度を有意に低下させたことを示す。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、１６）＝１７．７９、Ｐ＜０．０００１。
図４Ｆにおいて、Ｉｍａｒｉｓを使用してミクログリアの３次元レンダリングを行い、ミクログリアの細胞体体積と突起体積を定量した。図４Ｄと同数のマウスから、１群当たりＮ＝７３個のミクログリア。ミクログリア細胞体の体積（大きさ）の頻度分布は、群間で統計的有意差は何も示さなかった（クラスカル−ウォリス検定、Ｈ＝０．３５２９、Ｐ＝０．８３８２）。
図４Ｇは、ミクログリア突起の全体積（棒状ミクログリアは除く）は、ＣＫナイーブマウスと比較して、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に低かったことを示す。ＧＥＮＵＳ刺激されたＣＫ−ｐ２５マウスは、ＣＫナイーブマウスと比較して差異は示さなかった（Ｈ＝９．２２４、Ｐ＝０．００９）。
図４Ｈは、ミクログリア間の最小距離の定量を図示する。９匹のＣＫナイーブマウスからＮ＝６８個のミクログリア、６匹の非刺激マウスから１３１個のミクログリア、６匹のＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５マウスから９５個のミクログリア。非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスのミクログリアは、ＣＫナイーブマウスと比較し、凝集していた。一方でＧＥＮＵＳはミクログリア凝集を有意に低下させた（Ｈ＝１００．１、Ｐ＜０．０００１）。
図４Ｉは、棒状ミクログリアの放射状主要突起の定量を図示する。９匹のＣＫナイーブマウス群からＮ＝１６個のミクログリア、非刺激マウス群およびＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５マウス群からの各々６匹から１群あたり１９個のミクログリア。棒状ミクログリアの突起の全体積は、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して、ＧＥＮＵＳ後のＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に低下した。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、５１）＝１６．２７、Ｐ＜０．０００１。
図４Ｊは、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスが、ＣＫナイーブマウスと比較して高いシグナル強度のインターフェロン応答性タンパク質ＣＤ４０を呈し、一方で慢性ＧＥＮＵＳはＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＣＤ４０シグナルを有意に低下させたことを示す。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、１６）＝３６．８４、Ｐ＜０．０００１。
図４Ｋは、緑色のＩｂａ１、および青色の核Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を示す、視覚皮質の代表的画像を提示する。スケールバーは、５０μｍ。矢頭は、ミクログリア突起の複雑さを示す。
図４Ｌは、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスは、Ｉｂａ１陽性細胞総数の増加傾向を示しているが、ＷＴマウスと比較して統計的に有意ではなかったことを図示する。Ｎ＝７匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝８匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝７匹のＧＥＮＵＳマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１９）＝２．４０１、Ｐ＝０．１１９０。
図４Ｍは、ミクログリア細胞体の大きさを示す頻度分布である。Ｎ＝７匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝８匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝７匹のＧＥＮＵＳマウス。総数で１群あたり５８個のミクログリアを解析した。ミクログリア細胞体の全体積は、群間で差異がなかった。クラスカルウォリス検定Ｈ＝０．０４２６９、Ｐ＝０．９７８９。
図４Ｎは、ミクログリア突起の体積が、ＷＴマウスと比較してＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスにおいて小さいこと、一方でＧＥＮＵＳ刺激されたＰ３０１Ｓマウスは、ＷＴマウスと同等の突起長を示したことを示す。クラスカルウォリス検定Ｈ＝７．８９５、Ｐ＝０．０１９３。
図４Ｏは、視覚皮質からのＣ１ｑ（古典的補体経路再現タンパク質）の免疫染色を示す代表的画像を提示する。スケールバーは、５０μｍ。上：ＣＫナイーブマウスはＮ＝７匹のマウス、非刺激群およびＧＥＮＵＳ刺激群はそれぞれＮ＝６匹のマウス。下：Ｎ＝７匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝８匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝７匹のＧＥＮＵＳマウス。
図４Ｐは、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスが、ＣＫナイーブマウスと比較して高いＣ１ｑシグナル強度を呈し、一方で慢性ＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウスは、Ｃ１ｑ強度の有意な低下を示したことを示す。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、１６）＝１３．３９、Ｐ＝０．０００４。
図４Ｑは、非刺激Ｐ３０１Ｓマウスが、ＷＴナイーブマウスと比較して高いＣ１ｑシグナル強度を呈し、一方でＧＥＮＵＳはいずれの群間でも差異はなかったことを示す。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、１９）＝６．８８７、Ｐ＝０．００５。Ｅ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｐ、Ｑにおける、ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ−有意ではない。
図５Ａ〜５Ｉは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、シナプス機能を改変し、ニューロン中の細胞内輸送を改変することを示す。
図５Ａにおいて、ＣＫ−ｐ２５マウスは、無刺激、または１日当たり１時間で４２日間のＧＥＮＵＳを受けた。視覚皮質のニューロンのＮｅｕＮ陽性（１００，０００個）の核が、ＦＡＣＳにより単離され、次いでＲＮＡ抽出が行われ、配列解析された。ＤＥＧのヒートマップ。ヒートマップ中に１群当たりのマウス数が示されている。左上：ＣＫナイーブマウスと非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスの間のＤＥＧ。左下：非刺激とＧＥＮＵＳ刺激のＣＫ−ｐ２５マウスの間のＤＥＧ、遺伝子数が右側に示されている。右：ＣＫナイーブマウスと比較し、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて下方制御された遺伝子と関連する生物学的プロセス、およびＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＧＥＮＵＳ後に上方制御された遺伝子と関連する同じ生物学的プロセスの重複を示すチャート。
図５Ｂにおいて、Ｐ３０１Ｓマウスは、無刺激、または１日当たり１時間で２２日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けた。視覚皮質のニューロンのＮｅｕＮ陽性（１００，０００個）の核が、ＦＡＣＳにより単離され、次いでＲＮＡ抽出が行われ、配列解析された。差次的発現された遺伝子のヒートマップ。ヒートマップ中に１群当たりのマウス数が示されている。左上：ＷＴナイーブマウスと非刺激Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスの間のＤＥＧ。左下：非刺激とＧＥＮＵＳ刺激のＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスの間のＤＥＧ、遺伝子数が右側に示されている。右：ＣＫナイーブマウスと比較し、非刺激Ｐ３０１Ｓマウスにおいて下方制御された遺伝子と関連する生物学的プロセス、およびＰ３０１ＳマウスにおいてＧＥＮＵＳ刺激後に上方制御された遺伝子と関連する同じ生物学的プロセスの重複を示すチャート。
図５Ｃにおいて、ＣＫ−ｐ２５マウスは、無刺激、または４２日間のＧＥＮＵＳを受けた。ＴＭＴ １０−ｐｌｅｘキットおよび質量分析法を使用して、視覚皮質組織に対し、総タンパク質発現解析およびＳ／Ｔリン酸化タンパク質解析を実施した。Ｎ＝３匹のＣＫナイーブマウス、Ｎ＝３匹の非刺激ＣＫ−ｐ２５マウス、およびＮ＝４匹のＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウス。上：ニューロン特異的ＲＮＡ−ｓｅｑから特定された総ＲＮＡ（図５Ｂ、上述）とＬＣ−ＭＳ／ＭＳから特定された総タンパク質の重複を示すベン図。特定されたタンパク質の９２．７３％がニューロンで発現されることが判明した。下：対照同腹仔（左）およびＧＥＮＵＳ（右）と比較した、ＣＫ−ｐ２５マウスにおける差次的Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質のボルケーノプロット。
図５Ｄにおいて、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスは、無刺激、または２２日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けた。ＴＭＴ １０−ｐｌｅｘキット（方法を参照）および質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して、視覚皮質組織に対し、総タンパク質発現解析およびＳ／Ｔリン酸化タンパク質解析を実施した。Ｎ＝３匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝３匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝４匹のＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウス。上：ニューロン特異的ＲＮＡ−ｓｅｑから特定された総ＲＮＡ（図５Ａ、上述）とＬＣ−ＭＳ／ＭＳから特定された総タンパク質の重複を示すベン図。特定されたタンパク質の９１．９５％がニューロンで発現されることが判明した。下：対照同腹仔（左）およびＧＥＮＵＳ（右）と比較した、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスにおける差次的Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質のボルケーノプロット。±０．２の倍数変化と０．０５未満の調整Ｐ値を有するリン酸化タンパク質は、統計的に有意であるとみなされた。
図５Ｅは、慢性ＧＥＮＵＳ後のＣＫ−ｐ２５マウスおよびＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスにおける、差次的Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質に対するＧＯ用語を示す。
図５Ｆは、視覚皮質のニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ、主に軸索で発現されるニューロンマーカー）とＳｅｒ７７４リン酸化ダイナミン１の免疫染色を示す代表的画像を示す。ＮＦＨを使用して、ニューロン突起を標識した。スケールバーは、１０μｍ。ＣＫナイーブマウスはＮ＝７匹のマウス、非刺激群およびＧＥＮＵＳ刺激群はそれぞれＮ＝６匹のマウス。真ん中：ＣＫ−ｐ２５マウスは、ＣＫナイーブマウスと比較して有意に高いレベルのｐＳ７７４−ＤＮＭ１シグナル強度を呈した。一方でＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてこの異常リン酸化を有意に低下させた。Ｆ（２、１６）＝３８．５５１、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１。右：非刺激Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスは、ＷＴナイーブマウスと比較して有意に高いレベルのｐＳ７７４−ＤＮＭ１シグナル強度を呈した。一方でＧＥＮＵＳは、Ｐ３０１Ｓマウスにおいてこの異常リン酸化を有意に低下させた。Ｎ＝７匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝８匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝７匹のＧＥＮＵＳマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１９）＝１８．６９、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ−有意ではない。
図５Ｇは、ＣＫナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激されたＣＫ−ｐ２５マウスの視覚皮質の小胞グルタミン酸トランスポーター１（ｖＧｌｕｔ１）を免疫染色した代表的な脳切片を示す。スケールバーは、１０μｍを示す。
図５Ｈは、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてｖＧｌｕｔ１集積の発現が有意に低かった一方で、ＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスは、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣにおいて非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較し高いレベルのｖＧｌｕｔ１集積を呈したことを示す。ＣＫナイーブマウスはＮ＝９匹のマウス、非刺激群およびＧＥＮＵＳ ＣＫ−ｐ２５群からはそれぞれＮ＝６匹のマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７２）＝４２．０６、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図５Ｉは、ＷＴナイーブマウスと比較して、Ｐ３０１ＳマウスはｖＧｌｕｔ１シナプス集積の発現が有意に低かったこと、ＧＥＮＵＳがＰ３０１ＳマウスにおいてＶ１、ＣＡ１およびＣＣのｖＧｌｕｔ１発現を回復させたことを示す。Ｎ＝７匹のＷＴナイーブマウス、およびＮ＝８匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝７匹のＧＥＮＵＳマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７６）＝２３．６７、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を用いた事後多重比較、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図６Ａ〜６Ｉは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、アルツハイマー病の複数の対象モデルにおいて行動を改変することを示す。
図６Ａでは、ｐ２５発現は、４２日間、２群のＣＫ−ｐ２５マウスにおいて誘導され、そのうちの１群のみが毎日１時間のＧＥＮＵＳを受けた（刺激は９ａｍから１２ｐｍの間に実施された）。マウスは、オープンフィールド（ＯＦ）検査および新規物体認識（ＯＲ）検査を、４０日目（ＯＦ）および４１日目（ＯＲ）の午後（３ｐｍ〜７ｐｍ）に受けた。ＦおよびＮはそれぞれ慣れた物体と新規の物体を示す。ＯＦセッションおよびＯＲセッションからの代表的な占有ヒートマップを示す。色レベルは、アリーナまたは物体中の位置頻度範囲に対してマッピングされた。暖色は特定位置における長い時間および高い頻度を表し、寒色は短い時間を表す。
図６Ｂは、慢性視覚ＧＥＮＵＳが、ＣＫ−ｐ２５マウスの不安感レベルに影響を及ぼさなかったことを示す。ＯＦアリーナの中心で過ごした時間は寒色であったが、ＣＫナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウスの間で差異はなかった。群効果間のＡＮＯＶＡ Ｆ（２，４９）＝１．１９８、Ｐ＝０．３１０４。
図６Ｃは、ＣＫナイーブマウスおよびＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおける新規物体に対する選好を示しており、慣れた物体よりも有意に高かった。しかし非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスは選好を示さなかった。二元配置ＡＮＯＶＡ慣れた物体と新規物体の間の影響Ｆ（１，７０）＝７．７４２、Ｐ＝０．００６９。Ｔ−検定；ＣＫナイーブ、Ｔ＝４．４２１、Ｐ＝０．０００１；ＣＫ−ｐ２５＋非刺激、Ｔ＝１．１０８、Ｐ＝０．０９４６；ＣＫ−ｐ２５＋ＧＥＮＵＳ、Ｔ＝３．３０６、Ｐ＝０．００１７。
図６Ｄは、４２日間のＧＥＮＵＳを受けた、または受けていないｐ２５誘導ＣＫ−ｐ２５マウスのモリス水迷路の成績を示す（ＭＷＭ；ｐ２５誘導の３６日目と４１日目の間）。上：慢性ＧＥＮＵＳは、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてトレーニング中にプラットフォームを発見するまでの潜時を減少させた。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，２５２）＝１８．６４、Ｐ＜０．０００１。下：最後のトレーニングセッションの２４時間後に実施された探索試験中にプラットフォームを交差した回数は、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して、ＧＥＮＵＳ刺激群で有意に高かった（左：群効果間Ｆ（２，４２）＝５．２７７、Ｐ＝０．００９０）。標的四分円で過ごした時間（右：群効果間Ｆ（２，４２）＝６．３５、Ｐ＝０．００３９）は、ＣＫナイーブマウスと比較して、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に短かった。
図６Ｅは、非刺激、または１日当たり１時間（９ａｍ〜１２ｐｍ）で２２日間のＧＥＮＵＳを受け、そのときにＯＦ（２０日目；３ｐｍ〜７ｐｍ）検査およびＯＲ（２１日目）検査で評価されたＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスに関する。ＯＦセッションおよびＯＲセッションからの代表的な占有ヒートマップを示す。
図６Ｆは、ＧＥＮＵＳが、Ｐ３０１Ｓマウスの不安感レベルに影響を及ぼさなかったことを示す。ＯＦ中心で過ごした時間は、非刺激群、ＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓ群およびＷＴナイーブ群の間で差異はなかった（ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，３６）＝１．１８９、Ｐ＝０．３１６３）。
図６Ｇは、ＷＴ、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウスがすべて、新規物体に対して高い選好を呈したことを示す。二元配置ＡＮＯＶＡ慣れた物体と新規物体の間の影響 Ｆ（１，８０）＝８８．６１、Ｐ＜０．０００１。Ｔ−検定；ＷＴナイーブ、Ｔ＝６．５２５、Ｐ＜０．００００１；Ｐ３０１Ｓ＋非刺激、Ｔ＝２．６０２、Ｐ＝０．００５４；Ｐ３０１Ｓ＋ＧＥＮＵＳ、Ｔ＝１０．６５、Ｐ＜０．００００１。
図６Ｈは、ＷＴナイーブ、非刺激またはＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスのＭＷＭの成績を示す。上：慢性ＧＥＮＵＳは、非刺激Ｐ３０１Ｓマウスと比較して、Ｐ３０１Ｓマウスにおいてトレーニング中にプラットフォームを発見するまでの潜時を減少させた。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，２２５）＝３．７８２，Ｐ＝０．０２４２。下：探索試験中にプラットフォームを交差した回数（左：Ｆ（２，４５）＝２．８７２，Ｐ＝０．０６７）およびプローブ検査中に標的四分円にいた時間（右：Ｆ（２，４５）＝３．１１５、Ｐ＝０．０５４。
図６Ｉにおいて、ＧＥＮＵＳ（１日当たり１時間で２２日間）を受けた、または受けていない５ＸＦＡＤマウスに、ＭＷＭ能力について検査を行った。左：トレーニング中にプラットフォームを発見するまでの潜時。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，２７３）＝１６．９７、Ｐ＜０．０００１。探索試験中にプラットフォームを交差した回数（真ん中：群効果間 Ｆ（２，３９）＝４．７０２、Ｐ＝０．０１４８）、および標的四分円で過ごした時間（右：群効果間 Ｆ（２，３９）＝７．２８９、Ｐ＝０．００２０）は、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に低かった。
図７Ａ〜７Ｊは、開示される本発明の主旨に従い、慢性視覚刺激が、神経変性マウスモデルにおいて視覚皮質を超えてガンマ振動を同調させることを示す。
図７Ａは、主に図面の１Ｃ、１Ｄに使用されたマウスにおける、記録部位を記録後に検証するための電解病変を示す。代表的な画像により、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＰＦＣからの記録部位を示す。
図７Ｂにおいて、ＣＤＫ５活性化因子ｐ２５は、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて６週間誘導され、その後、マイクロドライブ移植とＬＦＰ記録が実施された。
図７Ｃにおいて、帯域出力（３５〜４５Ｈｚ）は、Ｖ１、ＣＡ１およびＰＦＣにおいて、同月齢ＷＴマウスと比較し、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に低かった（すべての領域でＰ＜０．０１）。６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、４０Ｈｚの視覚刺激は、４０Ｈｚの光明滅曝露中、Ｖ１（ウィルコクソン順位和検定；Ｐ＝０．００２２）、ＣＡ１（Ｐ＝０．００１）およびＰＦＣ（Ｐ＝０．００２）で、４０Ｈｚ出力を増加させた。
図７Ｄにおいて、マイクロドライブは、８カ月齢のＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスに移植された。
図７Ｅは、Ｖ１（Ｐ＝６．０１Ｅ−０５）およびＰＦＣ（Ｐ＝４．１１Ｅ−０５）において、４０Ｈｚの光刺激中、出力（３５〜４５Ｈｚ）に有意な増加が観察されたことを示す。
図７Ｆは、非刺激、または１日当たり１時間で４２日間のＧＥＮＵＳを受けたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに関する。右：４０Ｈｚの視覚刺激中、Ｖ１（ウィルコクソン順位和検定；Ｐ＝１．５４Ｅ−０６）、ＳＳ１（Ｐ＝２．８８Ｅ−０４）、ＣＡ１（Ｐ＝０．０４）およびＰＦＣ（Ｐ＝３．３９Ｅ−０６）において３５〜４５Ｈｚの帯域出力に有意な増加が観察された。
図７Ｇにおいて、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、非刺激、または１日当たり１時間で４２日間のＧＥＮＵＳを受けた。マウスは４３日目に４０Ｈｚの視覚刺激を受け、ＬＦＰが収集された。ＧＥＮＵＳ中、Ｖ１−ＣＡ１（Ｐ＝０．００２）、Ｖ１−ＳＳ１（Ｐ＝０．００８）、ＣＡ１−ＰＦＣ（Ｐ＝０．０４）、Ｖ１−ＰＦＣ（Ｐ＝０．００２）の間に、３０〜５０Ｈｚの低ガンマコヒーレンス（重み付け位相同期指標として測定される）において、領域間の有意な増加が観察された。ＣＡ１とＳＳ１の間の低ガンマＷＰＬＩには差異はなかった（Ｐ＝０．１８）。
図７Ｈで、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、ｐ２５は６週間誘導された。６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスは、（４３日目から）非刺激、または１日当たり１時間で４２日間のＧＥＮＵＳを受けた。右：ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、試験されたすべての脳領域に、低ガンマ帯域出力（３５〜４５Ｈｚ）の有意な増加が観察された［Ｖ１，Ｐ＝０．００１７）、ＣＡ１（Ｐ＝０．０３７９）、ＰＦＣ（Ｐ＝０．００３０）］（８５日目に測定）。
図７Ｉは、Ｖ１−ＣＡ１（Ｐ＜０．０１）、ＣＡ１−ＰＦＣ（Ｐ＜０．０１）、Ｖ１−ＰＦＣ（Ｐ＜０．０１）の間の低ガンマコヒーレンスでも、有意な増加が明白であったことを示す。
図８Ａ〜８Ｉは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、視覚皮質を超えて５ＸＦＡＤマウスにおいてＡＤ関連病変を減少させることを示す。
図８Ａは、視覚明滅刺激の設定を示す概略である。発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイをケージの開いた側に設置し、Ａｒｄｕｉｎｏシステムを使用して、矩形波電流パターンを伴う４０Ｈｚの周波数で明滅するよう駆動させた。マウスはケージ中で自由に移動し（合計床面積は８３ｉｎ２（約５３５ｃｍ２）、マウスが受けた光量は約１５００〜３００ｌｕｘの範囲である。
図８Ｂにおいて、１０カ月齢の５ＸＦＡＤマウスは、非刺激、または１日当たり１時間で２２日間のＧＥＮＵＳを受けた。代表的な画像は、海馬と体性感覚皮質を含む切片からの赤色のアミロイドプラーク、そして青色の核Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を示している。スケールバーは、１０００μｍ。主に図面２Ｃ〜２Ｄに関する。
図８Ｃにおいて、１０カ月齢の５ＸＦＡＤマウスは、非刺激、または１日当たり１時間で２２日間のＧＥＮＵＳを受けた。代表的な画像は、帯状皮質からの赤色のアミロイドプラーク、緑色のニューロンマーカーＮｅｕＮ、そして青色の核Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を示す。スケールバーは、５０μｍ。主に図面２Ｃ〜２Ｄに関する。
図８Ｄは、Ｖ１、ＳＳ１、ＣＡ１およびＣＣにおいて、ＧＥＮＵＳ刺激を受けた５ＸＦＡＤマウスのプラーク数は、非刺激５ＸＦＡＤマウスよりも有意に少なかったことを示す。主に図面２Ｃ〜２Ｄに関する。１条件あたり、Ｎ＝６匹のマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（１，４０）＝３０．０１、Ｐ＜０．０００１。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図８Ｅにおいて、９カ月齢の非刺激５ＸＦＡＤマウスは、同月齢のＷＴ同腹仔と比較して、ＣＡ１およびＣＣにおいてニューロン密度が有意に減少していたことを示す。ＧＥＮＵＳは、ＣＣにおいて、５ＸＦＡＤマウスのニューロン減少を有意に低下させた。Ｎ＝９匹のＷＴナイーブマウス、６匹の５ＸＦＡＤ＋非刺激マウス、および６匹の５ＸＦＡＤ＋ＧＥＮＵＳマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７２）＝１４．９３、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図８Ｆにおいて、１０カ月齢の５ＸＦＡＤマウスは、非刺激、または１日当たり１時間で２２日間のＧＥＮＵＳを受けた。代表的な画像は、シナプスマーカーのｂａｓｓｏｏｎを示す。スケールバーは、１０μｍ。
図８Ｇにおいて、ＣＡ１およびＣＣにおいて５ＸＦＡＤマウスはシナプスマーカーのｂａｓｓｏｏｎ染色の有意な低下を呈したが、これは４０ＨｚのＧＥＮＵＳにより有意に低下した。Ｎ＝９匹のＷＴナイーブマウス、６匹の５ＸＦＡＤ＋非刺激マウス、および６匹の５ＸＦＡＤ＋ＧＥＮＵＳマウス。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７２）＝１６．１８、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図８Ｈは、全長ＡＰＰタンパク質および内因性ＧＡＰＤＨ対照の発現レベルを示す全長イムノブロットを提示する。Ｎ＝５匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝３匹の非刺激５ＸＦＡＤマウス、およびＮ＝４匹のＧＥＮＵＳ刺激５ＸＦＡＤマウス。
図８Ｉは、ＡＰＰタンパク質発現が、ＷＴナイーブ対照と比較し、５ＸＦＡＤマウスにおいて有意に高かったことを示す。非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けた５ＸＦＡＤマウスの間では異なっていなかった。ＡＰＰタンパク質のＣ／Ｎ断片は測定されなかったことに注意されたい。Ｃ末端特異的ＡＰＰ抗体、一元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、９）＝４．４３６、Ｐ＝０．０４６。Ｎ末端特異的ＡＰＰ抗体、一元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２、９）＝１３．１９４、Ｐ＝０．００２。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊Ｐ＜０．０１。
図９Ａ〜９Ｇは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、Ｐ３０１ＳマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスにおいてＡＤ関連病変を改善することを示す。
図９Ａは、非刺激、ＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓ ｔａｕマウス、および同月齢のＷＴナイーブ同腹仔の視覚皮質の総タウタンパク質およびＧＡＰＤＨの発現レベルを示す全長イムノブロットを提示する。右：Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスの総タウ発現は、ＷＴナイーブマウスと比較して増加していたが、タウのレベルは、非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓマウスの間で差異はなかった。Ｎ＝３匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝３匹の非刺激マウス、およびＮ＝４匹のＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，７）＝１７３．２７５、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図９Ｂは、ＷＴナイーブ、非刺激Ｐ３０１ＳマウスおよびＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウスの間で、脳重量に差異はなかったことを示す。ＷＴナイーブマウスと比較して、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスの側脳室に異常拡張の傾向があった。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１９）＝２．７６１、Ｐ＝０．０７９。
図９Ｃは、ＣＫナイーブ、非刺激、およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの視覚皮質のｐ２５＋ＧＦＰ（融合タンパク質）、ｐ２５、ｐ３５およびＧＡＰＤＨの発現レベルを示す全長イムノブロットを提示する。右：同月齢のＣＫナイーブマウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスのｐ２５＋ＧＦＰタンパク質は有意に増加した（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（２，１２）＝１３．０６５、Ｐ＝０．００２）が、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスは、ｐ２５＋ＧＦＰ発現において差異はなかった。同様に、ＣＫナイーブマウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスのｐ２５発現は有意に高かったが、非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの間には差異はなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ（２，１２）＝３．５８１、Ｐ＝０．０２５）。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図９Ｄは、ＣＫナイーブマウス、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウス、およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの視覚皮質の厚さを示す代表的な画像を提示する。核Ｈｏｅｃｈｓｔ染色を青色で、ニューロンマーカーＮｅｕＮを赤色で示す。右：棒グラフは、群間の視覚皮質の厚さの差異を示す。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，３６）＝１２．９３、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
図９Ｅは、ＣＫナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの間の定性的な差異を示す代表的な画像を提示する。海馬体積、皮質の厚さおよび脳室の大きさの変化を詳述している。主に図３Ｆ〜３Ｈに関連する。
図９Ｆは、検証された全脳領域にわたり、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して、ＧＥＮＵＳは、ｐ２５＋ＧＦＰ融合タンパク質の発現レベル（ｐ２５：ＧＦＰ発現ニューロンの数）を変化させなかったことを示す。群間の独立標本ｔ検定、Ｐ＞０．０５。
図９Ｇは、ＣＫナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウス中のＣＡ１のＤＮＡ二本鎖切断マーカーのγＨ２Ａｘの発現を示す代表的な画像を提示する。ＣＫナイーブマウスではγＨ２Ａｘ陽性核が存在しないことが明白であったため、比較は、非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの間で行われた。１条件あたり、Ｎ＝６匹のマウス。スケールバーは、１００μｍ。右：ＧＥＮＵＳは、Ｖ１（独立標本ｔ検定；Ｔ＝４．４１８、Ｐ＝０．０００６）、ＳＳ１（Ｔ＝２．９４４、Ｐ＝０．０１３）、ＣＡ１（Ｔ＝２．６６４、Ｐ＝０．０１４３）およびＣＣ（Ｔ＝１．８８３、Ｐ＝０．０５５）においてγＨ２Ａｘ陽性核を有意に低下させた。
図１０Ａ〜１０Ｎは、開示される本発明主旨に従い、慢性視覚刺激が、ミクログリアを改変し、ニューロン中の細胞内輸送とシナプス伝達を改善することを示す。
図１０Ａは、代表的なＣＫナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスからのＦＡＣＳにおけるミクログリア分離プロファイルを示す。主に図４Ａ ４Ｃに関連する。
図１０Ｂは、代表的なＷＴナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスからのＦＡＣＳにおけるミクログリア分離プロファイルを示す。
図１０Ｃにおいて、差次的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）をボルケーノプロットに示す。群比較は、右側に示される。上：ＷＴナイーブマウスと非刺激Ｐ３０１Ｓマウスの間のＤＥＧ。１群あたりＮ＝５匹のマウス。真ん中上部：非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓマウスの間のＤＥＧ、１群当たりＮ＝５匹のマウス。
図１０Ｄは、特定されたＤＥＧに関連する生物プロセスに対する、上位７個の処理済み遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語を示す。群比較は、上部に示される。
図１０Ｅは、Ｉｂａ１を緑色で、ＣＤ４０を赤色で示す代表的な画像を提示する。主に４Ｄにおいて提示された統合画像を、明白性を目的として分離させた。
図１０Ｆは、代表的なＣＫナイーブマウス、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスからのＦＡＣＳにおけるニューロン核分離プロファイルを示す。ＮｅｕＮ％の群平均とＳＥＭを、総核と比較する：ＣＫナイーブ、５０±１．４８；非刺激ＣＫ−ｐ２５、４０．９８±０．７１９；ＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウス、４５．０８±１．６９１。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１２）＝１１．５５、Ｐ＝０．００１６．ボンフェローニの事後検定、ＣＫナイーブと非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスを比較、Ｐ＝０．００１’ＣＫナイーブとＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウスを比較Ｐ＝０．０６０９。ＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてニューロン核の減少を低下させた。
図１０Ｇは、代表的なＷＴナイーブマウス、非刺激Ｐ３０１ＳマウスおよびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１ＳマウスからのＦＡＣＳにおけるニューロン核分離プロファイルを示す。判明したＮｅｕＮ陽性核の百分率の群平均および平均標準誤差（ＳＥＭ）を総Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性核と比較する：ＷＴナイーブ、５２．４５±２．０３；非刺激Ｐ３０１Ｓ、４５．１７±１．１８；ＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓ、５０．３８±２．０９。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１８）＝４．９７、Ｐ＝０．０１９１。ボンフェローニの事後検定、ＷＴナイーブと非刺激Ｐ３０１Ｓマウスを比較、Ｐ＝０．０２８；ＷＴナイーブとＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウスを比較、Ｐ＝０．９９。ＧＥＮＵＳは、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスにおいてニューロン核の減少を低下させた。
図１０Ｈは、図１０Ｆおよび１０Ｇと同様に、総核と比較した総ニューロン（ＮｅｕＮ）陽性核の百分率を示す棒グラフを提示する。上：ＷＴナイーブ、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓマウスを比較する棒グラフ。１群当たりＮ＝７匹のマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１８）＝４．９７１、Ｐ＝０．０１９１。下：ＣＫナイーブ、非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスを比較する棒グラフ。各群に対しＮ＝５匹のマウス。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１２）＝７．７２、Ｐ＝０．００７０。
図１０Ｉにおいて、慢性ＧＥＮＵＳ後のＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスおよびＣＫ−ｐ２５マウスで上方制御された遺伝子は、神経伝達物質輸送および小胞介在輸送の６０個の遺伝子を伴うクラスターに基づき選択された。これら遺伝子は、非刺激マウスと比較し、ＣＫ−ｐ２５マウス、Ｐ３０１Ｓマウス、またはＧＥＮＵＳ後の両マウスにおいてのみ上方制御されていたことに留意されたい（ｍｅｔａｓｃａｐｅにより解析）。タンパク質−タンパク質の相互作用ネットワークマップ（Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ Ｖ３．６．１、続いてＳｔｒｉｎｇｓで解析；エンリッチメントＰ値、６．６６Ｅ−１５）を、緊密に関連する、さらなる機能性エンリッチメントＧＯ用語とともに示す。
図１０Ｊにおいて、非刺激Ｐ３０１Ｓ ｔａｕ−ｔｇマウス、および１時間／日で２２日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けたマウスの視覚皮質に、Ｓ／Ｔホスホプロテオミクス解析を実施した。ヒートマップは、非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１Ｓマウスの間で差次的にリン酸化されたタンパク質を示しており、それらはシナプス伝達と細胞内輸送に関与していた。
図１０Ｋにおいて、ヒートマップは、非刺激とＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの間で差次的にリン酸化されたタンパク質が、シナプス伝達（化学的シナプス伝達、トランス−シナプスシグナル伝達）に関与していたことを示す。遺伝子（対応するタンパク質）の名称および個別のホスホ部位を示す。
図１０Ｌにおいて、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスは、非刺激、または２２日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けた。ＴＭＴ １０−ｐｌｅｘキット（方法を参照）および質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して、視覚皮質組織に対し、総タンパク質発現解析およびＳ／Ｔリン酸化タンパク質解析を実施した。Ｎ＝３匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝３匹の非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、およびＮ＝４匹のＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウス。±０．２の倍数変化と０．０５未満の調整Ｐ値を有するリン酸化タンパク質は、統計的に有意であるとみなされた。ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスにおいて、各対照マウスと比較して差次的にＳ／Ｔリン酸化されたタンパク質と関連する生物学的プロセスのＧＯ用語。
図１０Ｍ−上：ウェスタンブロットは、ＣＫナイーブ、非刺激および４０ＨｚのＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスからのｐＳ７７４ ＤＮＭ−１、ＤＮＭ−１、ＤＮＭ−３およびＧＡＰＤＨを示す。ｐＳ７７４ＤＮＭ−１のレベルは、ＣＫナイーブマウスと比較し、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて有意に高かった。一方で４０ＨｚのＧＥＮＵＳは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてｐＳ７７４ＤＮＭ−１を有意に低下させた。ＣＫナイーブマウスはＮ＝４匹のマウス、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスはＮ＝５匹のマウス、および４０ＨｚのＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスはＮ＝４匹のマウス（ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１２）＝５．８３６、Ｐ＝０．０２１）。下：棒グラフは、群の差異を示す。これは独立した検証であることに留意されたい。主に図５Ｆに関連する。
図１０Ｎ−上：ウェスタンブロットは、ＷＴナイーブ、非刺激および４０ＨｚのＧＥＮＵＳ刺激を受けたＰ３０１ＳマウスからのｐＳ７７４ ＤＮＭ−１、総ＤＮＭ−１、ＤＮＭ−３およびＧＡＰＤＨを示す。これは独立した検証であることに留意されたい。＊Ｐ＜０．０５。主に図５Ｆに関連する。
図１１Ａ〜１１Ｊは、開示される本発明主旨に従い、急性および慢性の視覚刺激の対象に対する効果の行動学的特徴を示す。
図１１Ａ−上：ＧＥＮＵＳを伴う、または伴わない、１０分のビンにおけるＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの占有に関するヒートマップを示す。最初の１０分の刺激前基準期間中の探索行動において、差異は明白ではなかった。１群当たりＮ＝６匹のマウス。Ｔ検定、Ｔ＝０．３１７３、Ｐ＝０．７５７６。同様に、４０Ｈｚ刺激期間中の速度において、非刺激群と比較して規則的な変化は検出できなかった。下：プロットは、３０分間の１分毎の速度を示す。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ：３０分間にわたる探索、Ｆ（２９、２９０）＝６．７４７、Ｐ＜０．０００１；非刺激およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＷＴマウス間の相互作用、Ｆ（２９、２９０）＝０．９３５４、Ｐ＝０．５６５２。
図１１Ｂにおいて、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（４カ月齢）に、非刺激または４０Ｈｚの光明滅刺激を１時間行い、その直後にピクロトキシンを注射し、ＯＦに置いた。左：ピクロトキシン注射後に移動した距離において、ＧＥＮＵＳ刺激群と非刺激群の間で明白な差異はなかった。１群当たりＮ＝４匹のマウス。反復測定ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．５２７、Ｐ＝０．７１７。右：ラシーヌスコア。スコア０、正常な動作；スコア１、不動および硬直；スコア２、頭部上下運動；スコア３、前肢のクローヌスおよび棒立ち；スコア４、継続的な棒立ちおよび転倒；スコア５、慢性的な強直発作；スコア６、死亡。非刺激群およびＧＥＮＵＳ刺激群の間で、発作感受性における差異は明白ではなかった。反復測定ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．４２９、Ｐ＝０．９９４。
図１１Ｃにおいて、新規物体に対する３日間の馴化の後、ＷＴマウスをＮＯＲに対して検査した。左：３０分間で１分毎の、慣れた物体および新規物体を探索して費やされた時間。新規物体識別の百分率を重ね合わせている。真ん中：ヒストグラムは、慣れた物体および新規物体の累積（全３０分）探索時間を示す。非刺激マウスおよびＧＥＮＵＳ刺激マウスの両方ともが、慣れた物体と比較し、新規物体の探索に有意に長い時間を費やした。群間に差異はなく、このことから、急性４０Ｈｚの光明滅曝露は、新規物体を識別するマウスの能力に影響を与えなかったことが示される。１群当たりＮ＝６匹のマウス。慣れた物体と比較した、累積新規物体選好：非刺激、Ｔ（６）＝−１３．０５５、Ｐ＝０．００００４、ＧＥＮＵＳ Ｔ（５）＝−２０．８１８、Ｐ＝０．０００００４。群間の新規物体選好、ｔ検定 Ｔ＝−０．３１４、Ｐ＝０．７６０。右：移動した総距離のヒストグラム。ＧＥＮＵＳがＷＴマウスの運動行動を変化させないことを示す。移動した総距離、ｔ−検定 Ｔ＝０．５０９６、Ｐ＝０．６２１４。
図１１Ｄにおいて、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、非刺激、または１日当たり１時間で７日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けた。７日の間は毎日、刺激パラダイムの１時間前に、そして刺激レジメンの１日後にマウスの体重を測定した。Ｎ＝１４匹の非刺激マウス、およびＮ＝１２匹のＧＥＮＵＳ刺激マウス。棒グラフは、７日間にわたる体重を示す。両群において、日々の体重に全体的な増加があった（Ｆ（６，１４４）＝２．８８９、Ｐ＝０．０１１）。ただし非刺激群とＧＥＮＵＳ刺激群の間に、体重に差異はなかった（Ｆ（６、１４４）＝１．３２７、Ｐ＝０．２４９）。
図１１Ｅは、ＷＴナイーブおよびＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスの間で、体重に有意差が存在した（二元配置ＡＮＯＶＡ 群間効果 Ｆ（２、７２）＝８．９４７、Ｐ＝０．０００３）が、慢性ＧＥＮＵＳ（１時間／日で２２日間）は、非刺激Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスと比較して、Ｐ３０１Ｓマウスの体重に影響を与えなかったことを示す。Ｎ＝１３匹のＷＴナイーブマウス、Ｎ＝１４匹の非刺激マウス、およびＮ＝１２匹のＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウス。
図１１Ｆは、慢性ＧＥＮＵＳが、非刺激ＣＫ−ｐ２５マウスと比較して、ＣＫ−ｐ２５マウスの体重に影響を与えなかったことを示す（二元配置ＡＮＯＶＡ 群間効果Ｆ（２、１２２）＝２．４８７、Ｐ＝０．０８７４）。Ｎ＝２５匹のＣＫナイーブマウス、Ｎ＝２１匹の非刺激ＣＫ−ｐ２５マウス、およびＮ＝１８匹のＧＥＮＵＳ刺激ＣＫ−ｐ２５マウス。
図１１Ｇは、主に図６Ｆに関する。Ｎは、図６Ｆと同じである。オープンフィールド検査で移動した総距離は群間で有意であった。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，３６）＝１０．２７、Ｐ＝０．０００３。しかしＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウスは、非刺激Ｐ３０１Ｓと比較して差異はなかった（Ｐ＞０．９９）。
図１１Ｈは、主に図６Ｂに関する。Ｎは、図６Ｂと同じである。オープンフィールド検査で移動した総距離を示す。非刺激、およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、オープンフィールド検査中に移動した総距離に差異はなかった。ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，４９）＝０．０１５５２、Ｐ＝０．９８４６。
図１１Ｉ−左：血漿コルチコステロンレベルは、非刺激と、７日間のＧＥＮＵＳ刺激を受けたＷＴマウスの間で差異はなかった。１群当たりＮ＝１２匹のマウス。Ｔ＝１．１７、Ｐ＝０．２５５。真ん中：ＣＫ−ｐ２５マウスにおいてｐ２５が誘導されつつ、マウスは刺激を受けないか、または１日当たり１時間で４２日間のＧＥＮＵＳを受けた。チャート中に１群当たりのマウス数が示されている。血漿コルチコステロンレベルは、ＣＫナイーブ、非刺激、およびＧＥＮＵＳ刺激を受けたＣＫ−ｐ２５マウスの間に差異はなかった（Ｆ（２，３５）＝０．４８７１、Ｐ＝０．６１８５）。右：Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウス（２２日刺激）の血漿コルチコステロンも、ＷＴナイーブ、非刺激Ｐ３０１Ｓマウス、および２２日のＧＥＮＵＳ刺激Ｐ３０１Ｓマウスの間で同等であった（Ｆ（２，３５）＝０．６８７４、Ｐ＝０．５０９６）。各群のマウス数は、図面中に適宜提示されている。
図１１Ｊは、主に図７に関連する。モリス水迷路検査においてマウスが泳いだ全実験からの平均スピード。左：ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて、全６日間のトレーニング期間にわたり、いずれの群間にも差異は明白ではなかった（図７Ｄ）。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，２５２）＝０．３８３２、Ｐ＝０．６８２１。真ん中：Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスにおいて、全５日間のトレーニング期間にわたり、群間に差異はなかった（図７Ｈ）。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，２２５）＝０．５７２６、Ｐ＝０．５６５１。右：遊泳速度において、５ＸＦＡＤマウスコホートに有意差があった（図７Ｉ）。群効果間の二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，２７３）＝２４．２４、Ｐ＜０．０００１。ボンフェローニ補正を伴う多重比較。１日目〜４日目に差異はなかった。５日目：ＷＴナイーブと５ＸＦＡＤ＋非刺激の比較、Ｐ＞０．９９９９。ＷＴナイーブと５ＸＦＡＤ＋４０ＨｚのＧＥＮＵＳの比較、Ｐ＝０．００２２。５ＸＦＡＤ＋非刺激と５ＸＦＡＤ＋４０ＨｚのＧＥＮＵＳの比較、Ｐ＝０．０４８３。６日目：ＷＴナイーブと５ＸＦＡＤ＋非刺激の比較、Ｐ＝０．０００５。ＷＴナイーブと５ＸＦＡＤ＋４０ＨｚのＧＥＮＵＳの比較、Ｐ＝０．００３７。５ＸＦＡＤ＋非刺激と５ＸＦＡＤ＋４０ＨｚのＧＥＮＵＳの比較、Ｐ＞０．９９９９。７日目：ＷＴナイーブと５ＸＦＡＤ＋非刺激の比較、Ｐ＜０．０００１。ＷＴナイーブと５ＸＦＡＤ＋４０ＨｚのＧＥＮＵＳの比較、Ｐ＝０．００４３。５ＸＦＡＤ＋非刺激と５ＸＦＡＤ＋４０ＨｚのＧＥＮＵＳの比較、Ｐ＝０．５７１６。
図１２Ａ〜１２Ｃは、開示される本発明主旨に従い、８０Ｈｚの慢性視覚刺激では、５ＸＦＡＤマウスにおいてモリス水迷路に影響を与えなかったことを示す。
図１２Ａは、１日当たり１時間で２２日間の８０Ｈｚの刺激に曝露された５ＸＦＡＤマウスのＭＷＭにおける成績を示す。折れ線グラフの説明中に１群当たりのマウス数が示されている。トレーニング中にプラットフォームを見出すまでの潜時は、非刺激群と８０Ｈｚの刺激を受けた５ＸＦＡＤ群の間で差異はなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ Ｆ（２，１８０）＝１３．３３、Ｐ＜０．０００１）。しかしこれら両群ともに、ＷＴナイーブマウスと比較してプラットフォームを発見するまでより長い時間を必要とした。
図１２Ｂは、探索試験中にプラットフォームを交差した回数を示す。Ｆ（２，３０）＝３．６２２、Ｐ＝０．０３９０。ボンフェローニ補正を伴う多重比較。＊Ｐ＜０．０５。
図１２Ｃは、探索試験中に標的四分円で過ごした時間が、ＷＴナイーブマウスと比較して、非刺激および８０Ｈｚで刺激された５ＸＦＡＤマウスにおいて有意に短かったことを示す。Ｆ（２，３０）＝５．６４３、Ｐ＝０．００８３。ボンフェローニ補正を伴う多重比較、ＷＴナイーブマウスとの比較。非刺激−Ｐ＝０．０１４、８０ Ｈｚ−Ｐ＝０．０３７１。＊Ｐ＜０．０５。
実験および解析の詳細
ＳＴＡＲ法
動物モデル
すべての実験は、マサチューセッツ工科大学比較医学部門の実験動物委員会の承認を受けた。Ｃ５７ＢＬ６、Ｔｇ（Ｃａｍｋ２ａ−ｔＴＡ）、Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）、Ｔｇ（Ｐｒｎｐ−ＭＡＰＴ＊Ｐ３０１Ｓ）ＰＳ１９、およびＦｏｓ−ｔｍ１．１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）は、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から入手された。Ｔｇ（ｔｅｔＯ−ＣＤＫ５Ｒ１／ＧＦＰ）は本発明者らの実験室で作製された。すべてのトランスジェニックマウスは、本発明者らの動物施設で飼育され、維持された。
使用されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、３カ月齢、１０カ月齢または１７カ月齢であった。ＣＫ対照マウス、およびＣＫ−ｐ２５（ｔｅｔＯ−ＣＤＫ５Ｒ１／ＧＦＰと交配されたＣａｍｋ２ａ−ｔＴＡ）マウスは、ドキシサイクリン含有の食物で飼育された。通常のげっ歯類の餌は、ｐ２５−ＧＦＰ導入遺伝子の発現を誘導するために与えられた。典型的には、ｐ２５発現は、６週間誘導された。実験の開始時、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスは７カ月齢であり、５ＸＦＡＤマウスは９カ月齢または１１カ月齢であった。すべてのマウスは、マイクロドライブを移植されたマウスを除き、集団飼育された（１ケージあたり２〜５匹）。すべての実験は、齢を合致させた同腹仔を使用して実施された。免疫染色実験および電気生理学的実験は、図の解説に規定される総数までマウスを使用して２回行われた。本明細書に記載されるすべての行動実験（若い、および加齢したＷＴマウスおよびＴａｕ Ｐ３０１Ｓマウスを除く）は、図の解説に記載される総数の動物を使用して、１回行われた。サンプルサイズを前もって決定するための統計的手法は使用していない。その代わりに本発明者らは、本発明者らの研究室で過去に発表された研究（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）と同等のサイズの群を使用することを選択して、群間の分散を最小に維持した。図１の箱ひげ図はメジアン、ならびに上位（７５％）および下位（２５％）の四分位範囲を示す。記載されない限り、図２〜図６のエラーバーを伴うすべてのプロットは、平均±ＳＥＭとして報告されており、すべてのサンプルは、マウス数（Ｎ）として報告されている。
４０Ｈｚの光明滅刺激
光明滅刺激は、過去に報告されたように送達された（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。待機室から、同じビルの隣接フロアにある明滅処置室へとマウスを運んだ。実験開始の１時間前に薄暗い光で馴化させ、その後にマウスを検査ケージ（ホームケージと似ているが、寝床が無く、３面が黒いシートで覆われている）に入れた。マウスは自由にケージ内を移動することができたが、１時間の光明滅中、食物または水は与えられなかった。発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイをケージの開いた側に設置し、Ａｒｄｕｉｎｏシステムを使用して、矩形波電流パターンを伴う４０Ｈｚの周波数で明滅するよう駆動させた。４０Ｈｚの光明滅曝露の１時間後、マウスをホームケージに戻し、さらに３０分間休息させて、その後に待機室へと戻した。通常の部屋の光制御を受けるマウスは、同じように食物と水を制限した同じようなケージに曝された。この場合、マウスは通常の部屋の光のみを経験している。
組織調製
免疫組織化学法：４０ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でマウスを経心臓かん流し、次いで４０ｍｌの４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液でかん流した。脳を採取し、４％ＰＦＡ中、４℃でポストフィックスして、ＰＢＳに移し、切片作製を行った。
ウェスタンブロッティング：視覚皮質を切り出し、液体窒素で瞬間凍結して、処理を行うまで−８０℃の冷凍庫で保存した。サンプルは、ＲＩＰＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈｃｌ ｐＨ ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）緩衝液を用いて、ガラスホモジナイザーを使用してホモジナイズした。サンプル中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを使用して定量された。等濃度のタンパク質を調製し、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加した。
免疫組織化学法
脳は、強力瞬間接着剤を使用してビブラトームステージ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ）上に封入され、４０μｍの切片を調製した。続いて切片をＰＢＳで洗浄し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有のＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で調製された５％正常ロバ血清を使用して２時間、室温でブロッキングした。ブロッキング緩衝液を吸引し、切片を適切な一次抗体（新鮮なブロッキング緩衝液中で調製）とともに一晩、４℃、振とう機上でインキュベートした。次いで切片をブロッキング緩衝液を用いて３回洗浄し（各１０分）、その後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５５５、５９４または６４７が結合した二次抗体と室温で２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を用いて３回洗浄し（各１５分）、ＰＢＳを用いて最終洗浄を１回（１０分間）行い、切片をｆｌｕｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて封入した。
以下の二次抗体の組み合わせを使用した：（１）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５９４および６４７、（２）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５および ６４７、ならびに（３）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４および６４７。
画像化および定量
画像は、ＬＳＭ ７１０またはＬＳＭ ８８０のいずれか共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を使用し、全条件に対し同一設定で、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、または６３ｘの対物レンズで取得した。画像は、ＩｍａｇｅＪ １．４２ｑまたはＩｍａｒｉｓｘ６４ ８．１．２（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、スイス、チューリッヒ）のいずれかを使用して定量された。各実験条件に対し、指定される動物数からの二つの冠状切片を使用した。マウス１匹当たり２枚の画像からの平均値をさらに定量に使用した。定量は、可能な限り遺伝子型と治療条件に対して盲検化された実験者により実施された。
ＮｅｕＮ、ｃ−ＦｏｓおよびＧＦＰ陽性細胞の計数：すべての画像は、１画像あたり、Ｚ−スタック−１０で取得され、定量された。各二つの平均値、全計数の合計は、ＩｍａｇｅＪを使用して計算された。Ｐ３０１Ｓ ｔａｕマウスおよび５ＸＦＡＤマウスのＮｅｕＮ計数は、処置条件に対して盲検化された実験者により行われた。
γＨ２Ａｘ陽性細胞の計数：ＩｍａｇｅＪのマルチ−ポイントツールを使用して細胞を計数した。
ｖＧｌｕｔ１、ｂａｓｓｏｏｎ集積：６３ｘの対物レンズと、３倍ズームをさらに備えたＬＳＭ８８０を使用して、画像を取得した。視覚皮質および体性感覚皮質の深層（主に４および５）、ＣＡ１放射状層、および前帯状皮質の第５層をすべて標的とした。一平面画像が取得された。ＩｍａｇｅＪの粒子カウントプラグインを使用して、ｖＧｌｕｔ１集積の数を定量した。
ｐＳ２０２／Ｔ２０５タウ強度：４０ｘの対物レンズを備えたＬＳＭ７１０を使用して、全切片の厚さが４０μｍのｚ−スタック（各フィールドから４０枚の画像）が取得された。すべての画像を圧縮／折り畳み、シグナル強度をＩｍａｇｅＪで計測した。
ｐＳ７７４−ＤＮＭ１強度：６３ｘの対物レンズおよびさらに３ｘのズームを備えたＬＳＭ８８０を使用して、全切片の厚さが４０μｍのｚ−スタック（各フィールドから４０枚の画像）が取得された。すべての画像を圧縮／折り畳み、集積のシグナル強度をＩｍａｇｅＪで計測した。
プラーク：Ｄ５４Ｄ２抗体で染色された全体的なプラーク強度およびプラーク数は、遺伝子型および処置条件に対して盲検化された実験者により定量された。全４０μｍ切片は、０．５μｍ間隔でｚ−スタック画像化された。次いでこれらを重ね合わせ、シグナル強度をＩｍａｇｅＪを使用して測定した。プラークはＩｍａｇｅＪの粒子解析ツールを使用し、５μｍ２の閾値で計数された。すべてのプラーク強度およびプラーク数の計数は、処置条件に対して盲検化された実験者により行われた。
Ｃ１ｑ強度：４０ｘの対物レンズを備えたＬＳＭ７１０を使用して、全切片の厚さが４０μｍのｚ−スタック（各フィールドから４０枚の画像）が取得された。すべての画像を圧縮／折り畳み、シグナル強度をＩｍａｇｅＪで計測した。
ＣＤ４０：６３ｘの対物レンズを備えたＬＳＭ８８０を使用して、全切片の厚さが４０μｍのｚ−スタック（各フィールドから４０枚の画像）が取得された。すべての画像を圧縮／折り畳み、シグナル強度をＩｍａｇｅＪで計測した。
側脳室：５ｘ対物レンズを備えたＬＳＭ７１０顕微鏡を使用して、−２．０ブレグマ（吻側〜尾側）で完全冠状切片を画像化した。側脳室の領域全体をカバーする輪郭線は、ＩｍａｇｅＪのフリーハンド選択ツールを使用して引かれ、ＬＶの面積が測定された。
ミクログリア：Ｉｂａ１免疫反応性細胞は、ミクログリアとみなされた。４０ｘの対物レンズを備えたＬＳＭ７１０を使用して、全切片の厚さが４０μｍのｚ−スタック（各フィールドから４０枚の画像）が取得された。画像の３ＤレンダリングにＩｍａｒｉｓを使用して、ミクログリアの細胞体および突起の総体積を定量した。Ｉｂａ１凝集解析は、ＩｍａｇｅＪの３Ｄレンダリングプラグインで実施された。Ｉｂａ１間の最小距離は、画像からミクログリアごとに算出された。すべての画像が圧縮／折り畳まれ、ＩｍａｇｅＪを使用して、Ｉｂａ１陽性細胞の総数が定量された。
皮質の厚さ：５ｘ対物レンズを備えたＬＳＭ７１０顕微鏡を使用して、完全皮質柱を画像化した。外側皮質境界と、脳梁の皮質側の間の距離は、ＩｍａｇｅＪを使用して測定された。
脳重量の測定：ＰＢＳ、次いで４％ＰＦＡを用いてマウスを経心臓かん流し、脳を一晩、４％ＰＦＡ中でポストフィックスした。脳をＰＢＳ中で洗浄し、余剰分をすべて除去し、その後にｗｅｔ ｌａｂ ｈｉｇｈ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｓｃａｌｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ社、１ｍｇの精度）で計量した。別のコホートのマウスを殺処分し、脳を液体窒素中で瞬間凍結して、脳重量を測定した。脳重量は、これら二つの独立測定の各々で、ＣＫナイーブ脳に対して正規化された。
ウェスタンブロット
６〜８μｇのタンパク質を、６、８、１０、または１５％のポリアクリルアミドゲルのいずれかにロードして、電気泳動した。タンパク質を、アクリルアミドゲルから、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）へと、１００Ｖで１２０分間トランスファーした。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴｗ）中で希釈したミルク（５％ｗ／ｖ）を使用して膜をブロッキングした。その後、一次抗体中で一晩、４℃でインキュベートした。翌日、ＰＢＳＴｗを用いて３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）とともに室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳＴｗでさらに３回洗浄した後、膜を、化学発光基質で処置し、フィルムを発色させた。シグナル強度は、ＩｍａｇｅＪ １．４６ｑを使用して定量し、例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤＨなどの対照タンパク質の値、または対応するリン酸化タンパク質解析の総タンパク質の値に対して正規化された。
マイクロドライブ移植およびインビボ電気生理学
タングステンワイヤー電極ドライブ：マイクロドライブは、ペルフルオロアルコキシ被覆されたタングステンワイヤー電極（５０μｍのベア（ｂａｒｅ）直径、１０１．６μｍのコート直径、Ａ−Ｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＮｅｕｒａｌｙｎｘ電極インターフェースボード（ＥＩＢ−３６）を備えた、３Ｄプリントされたドライブベースを使用してカスタム構築された。ポリイミドチューブを使用して電極を保護し、電気ノイズを減少させた。電極は、視覚皮質の第３層または第４層（ブレグマに対する座標、前−後（ＡＰ）、−３．０、内側−外側（ＭＬ）、＋２．０）、ＳＳ１（ＡＰ、−２．０；ＭＬ、＋２．３）、海馬のＣＡ１領域（ＡＰ、−１．８；ＭＬ、＋１．５）および前頭前野皮質の帯状領域（ＡＰ、＋１．０；ＭＬ、＋０．２）を標的とするように配置された。基準電極は、小脳内に配置した。
四極管ドライブ：カスタムマイクロドライブは、２００〜２５０ｋＵのインピーダンスに金めっき（Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ社）され、１列に配置される（背側海馬のＣＡ３〜ＣＡ１軸に沿って連続する）四つのニクロム四極管（１４ｍｍ；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｆｉｎｅ Ｗｉｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ社）を含み、背側ＣＡ１（ＡＰ、−１．８）に移植された。基準電極は、海馬の上の線維束中に配置した。
外科手術：マウスはアバチンで麻酔され、定位固定器具に固定され、開頭術が行われて、視覚皮質、体性感覚皮質および前頭前野皮質が露出された。マイクロドライブを移植し、標的深度までゆっくりと下げた。マウスを４日間、回復させた。
インビボ電気生理学 ２〜３日のチャンバー馴化期間の後、小さなオープンフィールド中で自由に動く動物を用いて記録が開始された。記録セッションは、１０〜１５分間で構成され、その期間、ＬＥＤは４０Ｈｚで明滅したが、黒いアクリルポリプロピレンシートで完全に塞がれた。その直後、シートを取り除いてさらに１０分続けて、動物は明滅するＬＥＤに曝露された。データは、Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ ＳＸ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ社、米国モンタナ州、ボーズマン）を使用して取得され、シグナルは、３２，５５６Ｈｚで収集された。動物の位置は、マイクロドライブに固定された赤色発光ダイオードを使用して追跡された。実験終了時、マウスに神経終末麻酔を行い、電極の位置は、個々の各電極まで脳組織の電解損傷を５０−μＡの電流を用いて１０秒間与えることによりマークして、その解剖学的位置を確認した。
スパイク：単一ユニットは、ＳｐｉｋｅＳｏｒｔ３Ｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ社）中に提示される、記録されたスパイクの３Ｄ投影周囲にクラスター境界を描画することにより手動で単離した。平均スパイク幅が２００μ秒を超え、５以上の複合スパイクインデックス（ＣＳＩ：ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｐｉｋｅ ｉｎｄｅｘ）を有する場合に、細胞は錐体ニューロンとみなされた。
データ解析：ＬＦＰは最初に標的サンプリングレートのＮｙｑｕｉｓｔ周波数に対してフィルタリングされ、次いで２０倍にダウンサンプルされた（１６２８Ｈｚまで）。出力スペクトル分析は、５０％重複を伴う５００ミリ秒の時間ウィンドウを使用して、Ｍａｔｌａｂのｐｗｅｌｃｈ関数を使用して実施された。動物の速度が＞４ｃｍ／秒に維持されたＬＦＰデータのセグメントのみを分析に含めた。重み付け位相同期指標（ＷＰＬＩ）は、小さなげっ歯類の脳に適したコヒーレンスの測定尺度であり、これを過去に報告された（Ｖｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）ように使用して、体積伝導シグナルによるコヒーレンスの電位汚染を無効化した。ＷＰＬＩは、動物のスピードが＞４ｃｍ／秒であった期間に対してのみ、解剖学的に別個の領域の電極のペアに対して計算された。すべての分析は、Ｍａｔｌａｂを使用して実施された。
錐体細胞の４０Ｈｚ変調：スパイク発火時間と、４０ＨｚのＬＦＰ位相の間の関係性は、Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｂｏｘを使用して、過去に報告された（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＨｕｇｈ，２０１６）ように計算された。簡潔に述べると、スパイクをソーティングし、ＬＦＰトレースを、４０Ｈｚを中心とするｃｍｏｒ１．５−１のウェーブレットを用いた連続ウェーブレット変換を使用してフィルタリングし、瞬間的なシグナルの位相および振幅を返した。スパイク時間を直線的に補間して、ガンマのピークおよび谷をそれぞれ０度および１８０度と規定した位相を決定した。得られた位相値をビニングして、２０度の間隔ごとに発火確率を生成した。細胞は、均一とは有意に異なる分布を有した場合にのみ（Ｐ＜０．０５、環状レイリー検定）、位相同期されたとみなされた。位相同期の強度は、平均合成ベクトル長として算出された。
ＲＮＡ配列解析
ミクログリアの単離：視覚皮質を素早く解剖し、氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号 １４１７５−０９５）中に置いた。組織は、メーカーのプロトコールに軽微な改変を行い、Ｎｅｕｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、カタログ番号１３０−０９２−６２８）を使用して酵素的に消化した。具体的には、組織は３７℃で、３５分間の代わりに１５分間、酵素的に消化され、得られた細胞懸濁液は、ＭＡＣＳ ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒ、７０μｍの代わりに４０μｍのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒｓ、滅菌、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、製品３５２３４０）を通した。次いで、得られた細胞懸濁液を、メーカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）の推奨に従い、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＣＤ１１ｂマウスクローンＭ１／７０．１５．１１．５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０−０９８−０８８）およびフィコエリスリン（ＰＥ）結合ＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、５５３０８１）を使用して染色した。次いでＦＡＣＳを使用して、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５陽性ミクログリア細胞を精製した。標準的な完全側方散乱の幅と面積、および前方散乱の幅と面積の比較基準を使用して、ダブレットを識別し、シングレットのみをゲーティングした。生きた細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた染色で特定され、ＰＩ−陰性細胞のみをゲーティングした。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５の二重陽性細胞を、１％β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号Ｍ６２５０）とともに５００μｌのＲＮＡ溶解緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号７４１３４）を含む１．５ｍｌの遠心管内にソーティングした。ＲＮＡは、メーカーのプロトコールに従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号７４１３４）を使用して抽出された。ＲＮＡを溶出し、その後、全トランスクリプトーム増幅、ライブラリー調製および配列解析を実施するまで−８０℃で保存した。
ニューロンの単離：視覚皮質を、プロテアーゼ阻害剤を含む０．５ｍＬの氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズし、懸濁液を１６００ｇで１０分間、遠心分離した。沈殿物を５ｍＬのＮＦ−１低張緩衝液中に再懸濁し、５分間インキュベートして、次いで３０ストロークでＤｏｕｎｃｅ−ホモジナイズを行った（乳棒Ａ）。５ｍＬのＮＦ−１緩衝液を懸濁液に加えて、乳棒を１０ｍｌのＮＦ−１緩衝液で洗浄し、合わせて２０ｍＬとした。すべてを５０本のコニカルチューブに集め、４０μｍのメッシュフィルターを用いてホモジネートをろ過した。３，０００ｒｐｍ（１，６００ｘｇ）で１５分間、核を沈殿させた。３０ｍＬのＮＦ−１緩衝液中に再懸濁させ、よく混合した。４℃で１時間、ホモジネートを揺らした。２０ｍＬのＮＦ−１緩衝液で１回、沈殿物を洗浄し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして２〜５ｍＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋プロテアーゼ阻害剤中に、沈殿物を乱すことなく氷上で２０分間再懸濁させた。Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８またはＡｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ６４７が結合したＮｅｕＮ抗体（１：５００）をチューブに加え、４℃で２０分間インキュベートした。非結合抗体を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ ＋プロテアーゼ阻害剤を用いた懸濁および遠心分離で洗い流した。３，０００ｒｐｍで１５分間、核をスピンダウンさせ、０．５ｍＬ（ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁し、ＦＡＣＳソーティング用に４０μｍのメッシュフィルターを用いてろ過した。２滴のｎｕｃｂｌｕｅ ｌｉｖｅ ｒｅａｄｙ ｐｒｏｂｅｓ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；カタログ番号Ｒ３７６０５）を加えて核ゲーティングを行った。ＮｅｕＮ陽性細胞を、１％β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号Ｍ６２５０）を含む５００μｌのＲＮＡ溶解緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号７４１３４）が入った１．５ｍｌの遠心管内にソーティングした。ＲＮＡは、メーカーのプロトコールに従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号７４１３４）を使用して抽出された。ＲＮＡを溶出し、その後、全トランスクリプトーム増幅、ライブラリー調製および配列解析を実施するまで−８０℃で保存した。
ＲＮＡライブラリー調製：抽出された総ＲＮＡに、 Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ−ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してＱＣを行い、その後にライブラリー調製を行った。ＳＭＡＲＴｅｒ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｋｉｔ − Ｐｉｃｏ Ｉｎｐｕｔを使用して、Ｐ３０１Ｓニューロン、ＣＫ−ｐ２５ニューロン、およびＰ３０１ＳミクログリアのＲＮＡ−ｓｅｑを行った。ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔは、ＣＫ−ｐ２５ミクログリア特異的ＲＮＡ−ｓｅｑに使用した。ライブラリーはメーカーの説明書に従い調製され、ＭＩＴ ＢｉｏＭｉｃｒｏ ＣｅｎｔｅｒでＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００ ｐｌａｔｆｏｒｍ上で配列解析された。
４０ｂｐのペア−エンドシーケンスリードの生ｆａｓｔｑデータを、ＳＴＡＲ２．４を使用してマウスｍｍ９基準ゲノムにアライメントした。リードの総数およびアライメントされたリードの割合は以下であった：ＣＫ−ｐ２５ニューロン−総リード１８０９４６７４．８５７±８２７０５０．４６４；アライメントされた割合８５．３２３±０．４１４。Ｐ３０１Ｓニューロン−総リード２２７９２７１３．１８±６３０８８１７．６３６；アライメントされた割合８４．４５±０．５４８。ＣＫ−ｐ２５ミクログリア−総リード２８６９４９６４．５±４３５８４１．６６７４；アライメントされた割合８９．４３±０．２５。［Ｐ３０１Ｓミクログリア−総リード１８９９０３６９．２±１６６７３１６．１９６；アライメントされた割合２７．２４３±４．０４。マッピング率が非常に低かったため、この実験にはさらなる検討が必要である］。マッピングされたリードは、ｍｍ９基準遺伝子アノテーションを使用してＣｕｆｆｌｉｎｋｓ２．２（Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）により処理され、ｆｒ−ｓｅｃｏｎｄｓｔｒａｎｄとしてライブラリー型を用いて転写物量を推定した（ストランド化ニューロンデータ）。群間の遺伝子差次的発現の検証は、＜０．０５のｐ値でＣｕｆｆｄｉｆｆモジュールを使用して実施された（ニューロンデータ）。Ｃｕｆｆｄｉｆｆに対するライブラリー正規化法として、幾何学的方法が選択された。ミクログリアデータについては、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓツールを使用して、非ストランド化ＲＮＡ−ｓｅｑデータからの遺伝子エクソン数を定量し、ＤＥＳｅｑ２を採用して、統計的有意性を算出した。色分けされたスキャッタープロットを使用して、差次的に発現された遺伝子、および他の遺伝子について、群ＦＰＫＭ値を可視化した。
差次的に発現した遺伝子に対する反復発現ＦＰＫＭ値のＺ−スコアは、様々なサンプル群に対し、ヒートマップ中に可視化された。ミクログリア特異的ＤＥＧに対する遺伝子オントロジーは、Ｍｅｔａｓｃａｐｅツールを使用して実施された。一方でニューロン特異的ＤＥＧについては、ＴＯＰＰＧＥＮＥを使用して実施された。
プロテオミクスおよびホスホプロテオミクス
サンプル調製、還元、アルキル化およびトリプシン消化：視覚皮質を切り出し、液体窒素で瞬間凍結して、次に使用するまで−８０℃の冷凍庫で保存した。続いてサンプルは、プラスチックの携帯モーター駆動ホモジナイザーを使用し、新たに調製された８Ｍ尿素溶液とともにホモジナイズされた。サンプル中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを使用して定量された。１ｍｌあたり１ｍｇのタンパク質を含むサンプルを調製し、分注して次に使用するまで−８０℃で保存した。１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）でタンパク質を１時間、５６℃で還元し、５０ｍＭのヨードアセトアミドで１時間、室温（ＲＴ）でアルキル化して、１００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ８．９を用いて１Ｍ尿素未満に希釈した。シーケンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、５０μｇタンパク質あたり、１μｇのトリプシン）を使用して一晩、ＲＴでタンパク質を消化した。酵素活性は、酢酸でサンプルを酸性化することによりクエンチした。ペプチド混合物を脱塩し、Ｃ１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社）上で濃縮して、５０％のアセトニトリル、０．１％のギ酸および０．１％の酢酸で溶出した。溶媒をＳｐｅｅｄＶａｃ真空遠心分離機中で蒸発させ、各サンプルの４００μｇ分注物を分注し、５分間液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、そして−８０℃で保存した。
ＴＭＴ標識：ＴＭＴ標識およびホスホペプチド濃縮：凍結乾燥ペプチドは、ＴＭＴ−１０−ｐｌｅｘ Ｍａｓｓ Ｔａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で標識された。各ＴＭＴマルチプレックスに対し、ＷＴ、神経変性の非刺激および４０Ｈｚ同調されたマウスモデルからの等量のペプチドの組み合わせからなる、プールされたサンプルが含まれ、正規化チャンネルに対する相対的定量を行った。ＴＭＴ標識については、９個のマウスペプチド分注物からの９個のサンプル、および一つの正規化チャンネル（各チャンネルに対し、４００μｇのペプチド）が、１００μＬの７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）０．５Ｍトリエチル−アンモニウム重炭酸塩、ｐＨ８．５中に再懸濁され、４０μＬの無水アセトニトリル中に再懸濁されたＴＭＴ試薬とともにＲＴで１時間、インキュベートされた。サンプルを濃縮し、一つにまとめて、ＳｐｅｅｄＶａｃ真空遠心分離機を使用して乾燥するまで濃縮した。
ペプチド分別：ＴＭＴ標識ペプチド沈殿物を、高ｐＨ逆相ＨＰＬＣを介して分別した。１００ｕＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ８）中にペプチドを再懸濁し、４．６ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ ３００Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８、５ｕｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）上で、緩衝液Ｂ（９０％ ＭｅＣＮ、１０ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ８）を用いた９０分間の勾配を使用して、１ｍｌ／分の低速でペプチドを分離した。勾配は以下のとおりであった：１〜５％ Ｂ（０〜１０分）、５〜３５％ Ｂ（１０〜７０分）、３５〜７０％ Ｂ（７０〜８０分）、７０％ Ｂ（８０〜９０分）。画分を１０分〜８５分の間に１分間隔で、７５分にわたり収集した。分画は、非連続的に１５の分画に連結された（１＋１６＋３１＋４６＋６１、２＋１７＋３２＋４７＋６２など）。次いで分画にｓｐｅｅｄ−ｖａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｖａｎｔ社）を行い、ほぼ乾燥させた。
ホスホペプチドの濃縮：ホスホペプチドは、メーカーの説明書に従い、Ｈｉｇｈ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｆｅ−ＮＴＡ ホスホペプチド濃縮キット（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して１５の分画のそれぞれから濃縮された。
液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）： ペプチドは、逆相ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅａｓｙ ｎＬＣ１０００）により、１４０分の勾配にわたり、プレカラム（自作、６ｃｍの１０μｍ Ｃ１８）およびセルフパックの５μｍチップ分析カラム（１２ｃｍの５μｍ Ｃ１８、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社）を使用して分離された。その後、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用してナノエレクトロスプレーを実施した。溶媒Ａは０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂは８０％ ＭｅＣＮ／０．１％ギ酸であった。勾配条件は、０〜１０％ Ｂ（０〜５分）、１０〜３０％Ｂ（５〜１０５分）、３０〜４０％Ｂ（１０５〜１１９分）、４０〜６０％Ｂ（１１９〜１２４分）、６０〜１００％Ｂ（１２４〜１２６分）、１００％ Ｂ（１２６〜１３６分）、１００−０％ Ｂ（１３６〜１３８分）、０％ Ｂ（１３８〜１４０分）であり、質量分析計は、データ依存性モードで操作された。フルスキャンＭＳのパラメーターは以下であった：３５０〜２０００ｍ／ｚにわたり、７０，０００の分解能、ＡＧＣ ３ｅ６および最大ＩＴ ５０ミリ秒。フルＭＳスキャンに続いて、各サイクルの上位１０個のプリカーサーイオンに対するＭＳ／ＭＳを実施し、３４のＮＣＥ、および３０秒の動的除外が行われた。質量スペクトルの生データファイル（．ｒａｗ）は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社）およびＭａｓｃｏｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４．１（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して検索された。Ｍａｓｃｏｔ検索パラメーターは以下であった：プリカーサーイオンに対し、１０ｐｐｍの質量許容差；断片イオン質量許容差に対し１５ｍｍｕ；２のトリプシン不完全切断；固定修飾（ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、システインのカルバミドメチル化ならびにリシンのＴＭＴ １０ｐｌｅｘ修飾およびペプチドＮ末端；変動修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、メチオニン酸化、チロシンリン酸化、およびセリン／スレオニンリン酸化。ＴＭＴ定量は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用して取得され、メーカーの説明書に従い同位体補正され、各ＴＭＴチャンネルの平均に対して正規化された。２５以上のＭａｓｃｏｔスコア、および３０以下の単離干渉（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を有するペプチドのみが、データ解析に含まれた。
洗浄したプレカラムを、統合エレクトロスプレーチップ（〜１μｍオリフィス）を備えた自作のパック済み分析キャピラリーカラム［５μｍ Ｃ１８ビーズとパックされた５０ μｍ ＩＤ ｘ １２ｃｍ（ＹＭＣゲル、ＯＤＳＡＱ、１２ｎｍ、Ｓ−５μｍ、ＡＱ１２Ｓ０５）］と直列に接続した。ペプチドは、９〜７０％アセトニトリルの０．２Ｍ酢酸溶液の１４０分（ホスホペプチド）または９０分（総ペプチド）の勾配を使用し、０．２ｍｌ／分の流速、約１０，０００：１のフロースプリット（ｆｌｏｗ ｓｐｌｉｔ）で溶出して、約２０ｎＬ／分の最終エレクトロスプレー流速が得られた。各サンプルから総計で１５の分画が収集された。ホスホペプチドは、以下の設定で、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｐｌｕｓ質量分析計を使用して分析された：スプレー電圧、２ｋＶ；シース無しまたは補助ガス流、加熱キャピラリー温度、２５０℃；５０％のＳ−レンズ高周波レベル。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅは、データ依存性の取得モードで操作された。フルスキャンＭＳスペクトル［質量／電荷比（ｍ／ｚ）、３５０〜２０００；分解能、ｍ／ｚ ２００で７０，０００］は、過去のスキャンから得られた予測ＡＧＣに基づく３ｅ６標的値でのイオン蓄積の後、Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析計で検出された。フルスキャンごとに、１５個の最も強いイオンが単離され（単離幅は０．４ｍ／ｚ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）によって断片化され（衝突エネルギー（ＣＥ）：３２％）、最大注入時間は３００ミリ秒、および分解能は３５，０００であった。総ペプチド分析は、以下の設定を用いてＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計上で実施された：スプレー電圧、２ｋＶ；シース無し、または補助ガス流、加熱キャピラリー温度、２５０℃。分析は、データ依存性取得モードで実施された。フルスキャン質量スペクトル（ｍ／ｚは４００〜２０００の範囲、分解能は６０，０００）は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析計で検出された（イオン標的値 ５ｘ１０５）。フルスキャンごとに、１０個の最も強いイオンが単離され（単離幅は３Ｄａ）、ＨＣＤセル中でＨＣＤ（ＣＥ：７５％）により断片化され、次いでＯｒｂｉｔｒａｐ中で検出が行われ（イオン標的値 １ｘ１０５）、ｉＴＲＡＱマーカーイオン定量が実施された。
質量分析ペプチドマッピングデータ分析：質量スペクトルの生データファイルは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４．１．１４（ＤＢｖｅｒｓｉｏｎ：７９）（Ｔｈｅｒｍｏ社）にロードされ、Ｍａｓｃｏｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用してマウスＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対して検索された。ＴＭＴレポーター定量が抽出され、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒにおいて同位体補正された。タンデム質量スペクトルは、プリカーサー質量に対し１０ｐｐｍ、断片イオンに対し１５ｍｍｕの初期質量許容差でマッチングされた。システインカルバミドメチル化、ＴＭＴ標識リシン、およびタンパク質Ｎ末端を固定修飾として検索した。酸化メチオニン、ならびにセリン、スレオニン、およびチロシンのリン酸化を変動修飾として検索した。最小ペプチド長は、７アミノ酸であった。全ペプチドに対し、＞２０のイオンスコアによりデータセットをフィルタリングすることで、ペプチド識別およびリン酸化位置の高い信頼性を確保し、ペプチドに対し１％未満の（ＦＤＲ）を実現した。ホスホペプチド定量は、粗ペプチド分析から取得されたメジアン相対的ペプチド定量に基づき正規化され、ＴＭＴチャンネル間のサンプル量のわずかな変動に対して補正された。各ホスホペプチドについては、相対的定量は、各分析サンプルからのＴＭＴイオン強度と、含有される正規化チャンネルの間の比率として表された。
バイオインフォマティクス分析：有意に制御された比率で差次的に発現され、リン酸化されたペプチドを特定するために、＜０．０５の調整Ｐ値を有する±２０％の差異の任意のカットオフを選択する。非制御バックグラウンドのプールは、０．８〜１．２の比率のペプチドからなる。ゆえに、それに続くバイオインフォマティクス分析には、その正規化チャンネルに対して、＜０．８および＞１．２の比率を有するペプチドが含まれ、それぞれ下方制御された、および上方制御されたとみなされた。タンパク質アクセッション番号からのタンパク質の名称は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤマッピング検索ツールを使用して遺伝子リストに変換された。タンパク質ネットワークは、ＳＴＲＩＮＧデータベース（バージョン１０．５）を使用して取得された。テキストマイニングを除き、すべてのアクティブな相互作用ソースが含まれ、高い信頼性を確保するために、０．９を超える信頼性スコアが必要とされた。遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語のエンリッチメント分析は、最初にＳＴＲＩＮＧ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｉｎｇ−ｄｂ．ｏｒｇ）、ＴＯＰＰＧＥＮＥ（ｔｏｐｐｇｅｎｅ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ）およびＭｅｔａｓｃａｐｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａｓｃａｐｅ．ｏｒｇ）バイオインフォマティクスリソースを使用して生物学的プロセスに関連する用語に対して実施され、その後に手動でフィルタリングを行い、これら三つのリソースから普遍的に存在する用語を探した。ＴＯＰＰＧＥＮＥで取得されたＧＯ用語が報告された。個々のマウス系統（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、ＣＫ−ｐ２５、Ｐ３０１Ｓ ｔａｕ−ｔｇおよび５ＸＦＡＤ）それぞれについて、分析には、差次的に制御された総ペプチドまたはＳ／Ｔホスホペプチド（上方制御および下方制御）の各プールから導かれた遺伝子セットが含まれた。
行動
オープンフィールド：マウスをオープンフィールドボックス（寸法：長さ＝４６０ｍｍ、幅＝４６０ｍｍ、および高さ＝４００ｍｍ、ＴＳＥ−Ｓｙｓｔｅｍｓ社）に入れ、５分間、Ｎｏｌｄｕｓ（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ社）を使用して追跡し、アリーナの中心および周辺領域で過ごした時間が測定された。
高架式十字迷路法（ＥＰＭ：Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ）：マウスをＥＰＭ（ＡＮＹ−Ｍａｚｅ 寸法：アーム長＝３５ｃｍ、幅＝５ｃｍ）の中心領域に入れ、１０分間、Ｎｏｌｄｕｓプログラムを使用して追跡した。各アームおよびＥＰＭの中心で過ごした時間は、オフラインで算出された。
ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＰ３０１Ｓ ｔａｕマウスの新規物体認識：マウスをオープンフィールドアリーナに入れ、アリーナの中心で過ごした時間が算出される。翌日、マウスを再び同じオープンフィールドボックスに入れる。このとき、ボックスには追加で二つの慣れた物体（新規物体であるが、次のセッションでは慣れる）が入れられ、１０分間、当該物体の探索が行われた。これに続き、最後の探索の１０分後に同じアリーナにマウスを戻し、二つの物体のうちの一つを新しい物体に置き換えた。マウスの行動を７分間モニタリングした。慣れた物体と新規物体の両方の探索に費やされた時間がＮｏｌｄｕｓを使用して記録され、オフラインで計算された。
けいれん感受性：マウスにピクロトキシンを注射し（腹腔内注射）、オープンフィールドアリーナに置いて、３０分間、Ｎｏｌｄｕｓを使用して記録を行い、サイドに取り付けられたカメラからも記録された。移動した距離はＮｏｌｄｕｓでオフラインで計算され、けいれんの重大性は手動でスコア化された。
モリス水迷路：ＭＷＭは、空間学習を評価するための検査である。ＭＷＭは、視覚的な目印を頼りにオープン遊泳アリーナの周囲にある開始位置から泳ぎ、水中の脱出プラットフォームを見つけ出すものである。装置は、水道水（２２℃〜２４℃）と溶液を不透明にするために添加された非毒性の白色塗料で満たされた環状のプール（直径１２２ｃｍ）から構成された。脱出プラットフォーム（直径１０ｃｍ）には、しっかり掴むための平滑な隆起したへりがあり、水面下１インチ（約２．５ｃｍ）に沈んでいた。このプールを四つの均等な四分円に分割し、Ｎ（北）、Ｅ（東）、Ｓ（南）およびＷ（西）とラベリングした。６０秒間のトライアルについて、試験全体で無作為な順序でマウスをへりから迷路に入れた。隠れたプラットフォームを見つけるために必要とした時間（潜時）が記録された。探索試験は、最後のトレーニングトライアルの２４時間後に実施され、水中のプラットフォームは取り除かれた。すべてのトレーニングおよび探索試験のトライアルは、Ｎｏｌｄｕｓを使用して記録された。
ＣＫ−ｐ２５マウス、Ｐ３０１Ｓマウスおよび５ＸＦＡＤマウスに、朝（１２ｐｍまで）にＧＥＮＵＳを施し、午後（３〜７ｐｍ）にＭＷＭで検査した。このため、行動検査時間は、１日あたり４時間のみに限定された。１日あたり最小で２回、最大で４回のトライアルをトレーニング中に行うことで、厳密な暗／明サイクルを維持しながらも、すべての群にＭＷＭを実施することを確保した。トレーニング日数に差があったが、ＭＷＭで使用されたすべてのＡＤマウスは、同等な回数の総トレーニングトライアルを行った。
統計解析
統計解析は、ＳＰＳＳ、ＭａｔｌａｂまたはＰｒｉｓｍで実施された。サンプルサイズは予め決められていなかった。統計的有意性は、独立標本ｔ検定、ウィルコクソン順位和検定、一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを、ボンフェローニの事後分析およびクラスカルウォリス検定とともに使用して計算された。統計的有意性は、０．０５で設定された。
結論
本開示の発明に関する態様は、本明細書に記載する個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、二つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
また、様々な発明の概念が、一つ以上の方法として具現化されてもよく、その例を提供してきた。方法の一部として行われる行為は、任意の適切な手段で順序付けられうる。したがって、行為が例示するものとは異なる順序で行われる実施形態を構築してもよく、それは、例示的実施形態に連続する行為として示す場合であっても、一部の行為を同時に行うことを含みうる。
本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本明細書で定義および使用するすべての定義は、辞書定義、参照により組み込まれる文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味を統制するものと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、数値および／または範囲と併せて使用されるときの「約」および「およそ」という用語は、概して、列挙された数値および／または範囲の近くの数値および／または範囲を指す。一部の例では、「約」および「およそ」という用語は、列挙された値の±１０％以内を意味する場合がある（列挙された値自体を包含する）。例えば一部の例では、「約１００［単位］」は、１００の±１０％（例えば、９０〜１１０）以内を意味する場合がある。他の例では、「約」および「およそ」という用語は、列挙された値の±５％以内を意味する場合がある（列挙された値自体を包含する）。さらに他の例では、「約」および「およそ」という用語は、列挙された値の±１％以内を意味する場合がある（列挙された値自体を包含する）。「約」および「およそ」という用語は相互交換可能に使用され得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確にそうでないと示されない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「および／または」という語句は、結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味し、すなわち、一部の場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で挙げられる複数の要素は、同じ形式、すなわち、等位接続される要素のうちの「一つ以上」と解釈されるべきである。他の要素は、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に、随意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「備える」などの制限のない語法と連動して使われるときに、一実施形態においては、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢと両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的なもの、すなわち、多数の要素または要素のリスト、および随意にリストに無い追加の項目のうちの少なくとも一つを含むが、二つ以上も含むと解釈されるものとする。反対であると明確に示される用語のみ、例えば、「〜のうちの一つのみ」もしくは「〜のうちの正確に一つ」、または特許請求の範囲において使用するときの「〜からなる」は、例えば多数の要素またはリストの要素のうちの正確に一つの要素の包含とみなす。概して、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの一つ」、「のうちの一つのみ」、または「のうちの正確に一つ」など、排他性の用語が先行するときには、排他的な選択肢（すなわち、「両方ともでなくどちらか一方」）を示すとのみ解釈されるものとする。「から基本的に成る」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、一つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも一つ」という語句は、要素のリストの中の要素のいずれか一つ以上から選択される、少なくとも一つの要素を意味するが、要素のリスト内で具体的に列挙したありとあらゆる要素のうちの、少なくとも一つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストのいかなる要素の組み合せも除外するものではない、と理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも一つ」という語句が指す、要素のリスト内で具体的に識別される以外の要素が、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に存在しうることを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも一つ」（または、等価的に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一つ」、もしくは、等価的に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一つ」）は、一実施形態においては、Ｂは存在せず、任意選択的に二つ以上のＡを含む、少なくとも一つのＡ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態においては、Ａは存在せず、任意選択的に二つ以上のＢを含む、少なくとも一つのＢ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、また別の実施形態においては、任意選択的に二つ以上のＡを含む、少なくとも一つのＡ、および任意選択的に二つ以上のＢを含む、少なくとも一つのＢ（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書で、すべての移行句、例えば、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「持つ（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保つ（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」、および類似のものは制限がないと理解され、すなわち、含むがそれに限定はされないということを意味する。「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から基本的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみが、米国特許局の特許審査手続便覧、セクション２１１１．０３に記載されている、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句であるものとする。

Claims (86)

  1. その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
    Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも前頭前野皮質（ＰＦＣ）および海馬を含む、前記対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同調させることを含む、方法。
  2. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数を有する、請求項１に記載の方法。
  3. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、約４０Ｈｚの周波数を有する、請求項２に記載の方法。
  4. Ａ）が、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬において約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導することを含む、請求項３に記載の方法。
  5. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、５０％の負荷サイクルを有する、請求項２に記載の方法。
  6. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含む、請求項２に記載の方法。
  7. 前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項６に記載の方法。
  8. Ａ）が、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬において約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導することを含む、請求項７に記載の方法。
  9. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項２に記載の方法。
  10. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項１０に記載の方法。
  13. Ａ）が、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬において約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導することを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記対象の前記複数の脳領域が、前記対象の視覚皮質、体性感覚皮質、海馬および前頭前野皮質を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. Ａ）が、
    Ａ１）前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同時に同調させることを含む、請求項１に記載の方法。
  16. Ａ１）が、
    前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の複数の脳領域間で、３０Ｈｚ〜５０Ｈｚの周波数を有するガンマコヒーレンスを有意に増加させることを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記対象の前記複数の脳領域が、前記対象の視覚皮質、体性感覚皮質、海馬および前頭前野皮質を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数を有する、請求項１７に記載の方法。
  19. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、約４０Ｈｚの周波数を有する、請求項１８に記載の方法。
  20. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項１６に記載の方法。
  21. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項２２に記載の方法。
  24. Ａ１）がさらに、
    Ａ２）前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域間のニューロン活動を変調させることを含む、請求項１５に記載の方法。
  25. Ａ２）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域間のニューロン活動を連動させることを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記対象の前記複数の脳領域が、前記対象の視覚皮質、体性感覚皮質、海馬および前頭前野皮質を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの周波数を有する、請求項２６に記載の方法。
  28. Ａ）において、前記慢性視覚刺激が、約４０Ｈｚの周波数を有する、請求項２７に記載の方法。
  29. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項２４に記載の方法。
  30. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項２５に記載の方法。
  31. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項２６に記載の方法。
  32. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項２７に記載の方法。
  33. Ａ２）がさらに、
    Ａ３）前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の神経変性を低下させることを含む、請求項２４に記載の方法。
  34. Ａ３）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中のアミロイドプラークを低下させることを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. Ａ３）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中のタウの過剰リン酸化を低下させることを含む、請求項３３に記載の方法。
  36. Ａ３）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中のニューロンおよびシナプスの減少を低下させることを含む、請求項３３に記載の方法。
  37. Ａ３）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の脳委縮を低下させることを含む、請求項３３に記載の方法。
  38. Ａ３）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の脳室拡張を低下させることを含む、請求項３３に記載の方法。
  39. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項３３に記載の方法。
  40. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項４１に記載の方法。
  43. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  44. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項４５に記載の方法。
  47. Ａ２）がさらに、
    Ａ３）前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の神経炎症を低下させることを含む、請求項２４に記載の方法。
  48. Ａ３）がさらに、
    Ａ４）前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の少なくとも一部のミクログリアの免疫反応を低下させることを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. Ａ４）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の前記少なくとも一部のミクログリアを形態変換させることを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. Ａ４）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の前記少なくとも一部のミクログリアにおいてタンパク質分解を増加させることを含む、請求項４８に記載の方法。
  51. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項４８に記載の方法。
  52. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項５３に記載の方法。
  55. Ａ２）がさらに、
    前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の膜輸送、細胞内輸送、シナプス機能、神経炎症、アポトーシスプロセス、およびＤＮＡ損傷のうちの少なくとも一つに関与する異常改変された遺伝子およびタンパク質を改善することを含む、請求項２４に記載の方法。
  56. Ａ１）がさらに、
    Ａ２）前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の学習および記憶を強化することを含む、請求項１５に記載の方法。
  57. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項５９に記載の方法。
  61. その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
    Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の少なくとも前頭前野皮質（ＰＦＣ）および海馬を含む、前記対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同調させることを含み、Ａ）が、前記約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を、前記対象に非侵襲的に送達して、
    Ａ１）前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同時に同調させること、
    Ａ２）前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域間のニューロン活動を連動させること、
    Ａ３）前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の神経変性を低下させること、
    Ａ４）前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の神経炎症を低下させること、
    Ａ５）前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬を含む、前記対象の前記複数の脳領域中の膜輸送、細胞内輸送、シナプス機能、神経炎症、アポトーシスプロセス、およびＤＮＡ損傷のうちの少なくとも一つに関与する異常改変された遺伝子およびタンパク質を改善すること、および
    Ａ５）前記対象の学習および記憶を強化すること、を含む、方法。
  62. Ａ）が、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬において約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導することを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項６３に記載の方法。
  66. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項６１に記載の方法。
  67. その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
    Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同調させ、前記対象の複数の脳領域において変性ニューロン中の異常改変された遺伝子およびタンパク質を改善することを含む、方法。
  68. 前記対象の前記複数の脳領域において、前記変性ニューロン中の前記異常改変された遺伝子およびタンパク質が、膜輸送、細胞内輸送、シナプス機能、神経炎症、アポトーシスプロセス、およびＤＮＡ損傷のうちの少なくとも一つに関与する、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記異常改変された遺伝子およびタンパク質が、前記対象の少なくとも視覚皮質中のＮｕｅＮ−陽性ニューロン核からの遺伝子を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. Ａ）が、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の少なくとも視覚皮質中のＮｕｅＮ−陽性ニューロン核の減少を低下させる、または割合を維持することを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記異常改変された遺伝子およびタンパク質が、Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質を含み、Ａ）が、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質を改変し、前記対象の少なくとも視覚皮質中のＳ／Ｔリン酸化を低下させることを含む、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記Ｓ／Ｔリン酸化タンパク質が、ダイナミン１（ＤＮＭ−１）を含み、Ａ）が、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、ＤＮＭ−１中のＳｅｒ７７４リン酸化を低下させることを含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記異常改変された遺伝子およびタンパク質が、有意に集積が低下した小胞グルタミン酸トランスポーター１（ｖＧｌｕｔ１）を含み、Ａ）が、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の前記複数の脳領域においてｖＧｌｕｔ１集積を有意に増加させることを含む、請求項６８に記載の方法。
  74. 前記対象の前記複数の脳領域が、前記対象の視覚皮質、体性感覚皮質、海馬および前頭前野皮質を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項６７に記載の方法。
  76. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項７７に記載の方法。
  79. その必要のある対象において認知症またはアルツハイマー病を治療するための方法であって、
    Ａ）約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する慢性視覚刺激を前記対象に非侵襲的に送達し、前記対象の複数の脳領域において同期化ガンマ振動を同時に同調させ、前記対象の前記複数の脳領域の間で、前記３０Ｈｚ〜５０Ｈｚの周波数を有するガンマコヒーレンスを有意に増加させることを含む、方法。
  80. 前記対象の前記複数の脳領域が、前記対象の視覚皮質、体性感覚皮質、海馬および前頭前野皮質を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. Ａ）が、前記対象の少なくとも前頭前野皮質および海馬において約４０Ｈｚの局所電場電位（ＬＦＰ）を誘導することを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. Ａ）が、７日よりも長く、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項７９に記載の方法。
  83. Ａ）が、少なくとも２２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. Ａ）が、少なくとも４２日間、少なくとも１日あたり１時間、前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達することを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. Ａ）が、矩形波電流シグナルを伴う発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイを駆動させ、前記慢性視覚刺激を生成することを含み、
    前記矩形波電流シグナルが、５０％負荷サイクルを有し、および
    前記矩形波電流シグナルの周波数が、４０Ｈｚと等しいか、またはおよそ４０Ｈｚである、請求項８４に記載の方法。
  86. Ａ１）がさらに、
    約３０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの周波数を有する前記慢性視覚刺激を非侵襲的に送達して、前記対象の前記複数の脳領域間のニューロン活動を連動させることを含む、請求項８５に記載の方法。
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A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

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C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

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A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

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C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

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