KR20230015501A - 뇌에서 감마 진동을 동기화하기 위해 시각 자극을 이용한 치매 치료 - Google Patents
뇌에서 감마 진동을 동기화하기 위해 시각 자극을 이용한 치매 치료 Download PDFInfo
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Abstract
치매 또는 알츠하이머병의 치료를 요하는 대상체에서 이를 치료하기 위한 장치, 시스템 및 방법. 일 실시예에서, 전전두엽 피질(PFC) 및 해마를 포함하는, 대상체의 다수의 뇌 영역에서 감마 진동을 향상시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz, 보다 구체적으로는 약 40 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극이 대상체에게 비침습적으로 전달된다. 동조된 감마 진동은 다양한 신경보호 효과(예: 아밀로이드 플라크 및 타우 과인산화의 개선)를 유도하고 신경퇴행을 감소시키기 위해 다수의 뇌 영역에 걸쳐 신경 활성을 조절한다(예: 저 감마 주파수에서 신경 네트워크의 기능적 결합을 용이하게 함). 만성 시각 자극에 의해 매개되는 신경 활성은 소교세포 내 면역 반응을 감소시키고 막 수송, 세포내 수송, 시냅스 기능, 신경염증 및 DNA 손상 반응과 관련된 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질을 개선시킨다. 향상된 학습 및 기억을 포함하는 행동 수정(behavior modification)이 관찰된다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 다음의 미국 특허 가출원 각각에 대한 우선권의 이익을 주장한다: 제62/570,250호(2017년 10월 10일에 출원) "NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF COMBINED SENSORY STIMULATION"(변리사 문서 번호 MITX-9699/00US); 및 제62/570,929호(2017년 10월 11일에 출원) "GAMMA ENTRAINMENT BINDS HIGHER ORDER BRAIN REGIONS AND OFFERS NEUROPROTECTION"(변리사 문서 번호 MITX-0070/00US). 이들 가출원 각각은 그 전체가 참조로써 본원에 통합된다. 또한, 본 출원은 2018년 9월 19일에 출원된 PCT 출원 번호 제PCT/US18/51785호 "Systems and Methods for Preventing, Mitigating, and/or Treating Dementia"의 우선권 이익을 주장하며, 그 전체가 참조로써 본원에 통합된다.
정부 지원 진술
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 보조금 번호 RF1 AG054321 하에 미국 정부 지원을 받아 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
알츠하이머병(AD)을 포함하는 치매는 뇌 및 인지 기능의 악화(Canter)를 특징으로 하는 뇌의 치명적인 질병이다(Canter 등, 2016; Palop 및 Mucke, 2016). 여러 가지 인자가 아밀로이드-β 침착, 과-인산화 타우 축적, 소교세포- 및 성상세포-매개 염증, 및 뉴런 및 시냅스의 손실을 포함하는 AD의 발병기전에 기여한다(Ballatore 등, 2007; Huang and Mucke, 2012; Jacobsen 등, 2006; Meyer-Luehmann 등, 2008; Oakley 등, 2006; Ulland 등, 2017; Yoshiyama 등, 2007).
보다 최근의 연구는 신경 과다 흥분, 연합뉴런 기능장애, 이동된 억제/흥분 균형, 뇌전증 방전, 및 변경된 네트워트 진동과 같은 AD 병리의 생리적 양태를 더욱 조사하고 있다(Canter 등, 2016; Holth 등, 2017; Hsia 등, 1999; Palop and Mucke, 2010; Palop and Mucke, 2016; Verret 등, 2012). 이러한 연구 결과는 인간 AD에서 관찰된 네트워크 이상과 일치한다(Guillon 등, 2017; Koenig 등, 2005; Ribary 등, 1991; Stam 등, 2002). AD 마우스 모델에 대한 최근의 연구는 전증상 단계(presymptomatic stage)에서 이러한 변화가 발생했음을 강조하였다(Gillespie 등, 2016; Iaccarino 등, 2016). 신경 활동에서의 변화는 여러 마우스 모델에서 아밀로이드-β 및 타우 축적과 같은 AD 병리에 영향을 미치는 것으로 이전에 나타났다(Bero 등, 2011; Wu 등, 2016; Yamada 등, 2014). 이러한 관찰을 고려해 볼 때, 뉴런 진동을 조작하는 것이 AD 병리를 개선하는데 효과적일 수 있는지 여부를 조사하기 위해 여러 가지 접근법이 사용되었다(Iaccarino 등, 2016; Martinez-Losa 등, 2018; Verret 등, 2012).
특히, 감마 주파수 밴드(약 30~90 Hz)에서의 진동은 hAPP-J20, ApoE4, 5XFAD를 포함하는 여러 가지 AD 마우스 모델뿐만 아니라, 특히 인간 AD 환자에서도 감소되는 것으로 밝혀졌다(Gillespie 등, 2016; Guillon 등, 2017; Iaccarino 등, 2016; Koenig 등, 2005; Ribary 등, 1991; Stam 등, 2002; Verret 등, 2012). 이를 고려해 볼 때, 몇몇 최근의 연구는 감마 진동을 목표로 삼았으며, 그 연구 결과는 이것이 AD 병리를 완화시키는 유망한 전략을 나타낼 수 있음을 시사한다.
하나의 이전 접근법에서, 파브알부민-양성(PV+) 연합뉴런에 있는 전압개폐성 나트륨 채널 서브유닛 Nav1.1의 발현을 통해서, 또는 Nav1.1 과발현 연합뉴런 전구세포의 뇌 이식으로 감마 진동을 증가시키는 것은 hAPP-J20 마우스에서 감마 결핍을 완화시키고 간질성 활동 및 인지력 감퇴 모두를 감소시켰다(Martinez-Losa 등, 2018; Verret 등, 2012).
두 번째 접근법에서, 강한 감마 주파수 진동을 유도하는 것으로 나타난 40 Hz에서 PV+ 연합뉴런의 발광유전자(optogenetic) 활성(Cardin 등, 2009; Sohal 등, 2009)은 5XFAD 마우스에서 아밀로이드 부하를 감소시키고 소교세포의 형태학적 변형을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Iaccarino 등, 2016). 40 Hz 시각 자극을 이용하는 이러한 비침습적 접근법은 5XFAD 마우스의 시각 피질에서 아밀로이드 부하를 감소시키고 소교세포를 변경시키는데 있어서 유사하게 효과적이었다(Iaccarino 등, 2016). 그러나, 이러한 이전의 연구에서, 시각 피질에서의 아밀로이드 수준은 1시간 동안 급성 시각 자극 후 24시간 만에 기준선으로 복귀하였다. 그러나, 이 이전의 연구는 1시간의 시각 자극을 7일 동안 하루에 1시간의 시각 자극으로 연장하는 것이 6개월령 5XFAD 마우스의 시각 피질에서 아밀로이드 수준(Aβ1-40 및 Aβ1-42의 가용성 및 불용성 형태)뿐만 아니라, 플라크 병리도 감소시키는 것을 밝혔다(Iaccarino 등, 2016). 또한, 시각 자극은 5XAFD 마우스에서 각각, Aβ의 생성을 감소시키고 제거를 향상시키는 여러 가지 세포 유형(뉴런과 소교세포를 포함함)에 영향을 미쳤다.
2016년 11월 23일에 "SYSTEMS AND METHODS FOR PREVENTING, MITIGATING, AND/OR TREATING DEMENTIA"라는 명칭으로 출원된 미국 특허 출원 제15/360,637호(이로써 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 개시된 바와 같이, 시각 (뿐만 아니라 청각 및/또는 촉각) 자극을 통해 뇌에서 동기화된 감마 진동을 유도하면 아밀로이드 부하가 줄어들고 일부 뇌 영역에서 형태학적 변화가 나타난다. 그러나, 본 발명자들은, 치매 및 알츠하이머병을 치료하는 시스템 및 방법으로서, 학습과 기억 및 다른 고차 뇌 기능을 특히 담당하는 다수의 뇌 중추에 영향을 미치는 회로 전반의 질병을 다루는 시스템 및 방법이 여전히 필요하다는 것을 인식하고 이해하였다.
본 개시에서, "감각 시각 자극을 사용한 감마 동조(Gamma ENtrainment Using Sensory visual stimuli)"(GENUS)로 본원에서 지칭되는, 만성 비침습적 시각 자극을 통해 대상체의 뇌에서 감마 진동을 동조하기 위한 본 발명의 방법 및 도구는 시각 피질너머의 다수의 다른 뇌 영역(예를 들어, 해마, 체성 감각 및 전전두엽 피질)까지 저 감마 간섭을 확장할 뿐만 아니라, 동시에 이러한 다수의 뇌 영역에 걸쳐 저 감마 간섭을 강화시킨다는 것이 입증되었다. 또한, 만성 GENUS는 5XFAD, P301S 및 CK-p25 마우스에서 신경퇴행을 감소시켰고, 다수의 뇌 영역에 걸쳐 신경보호 효과가 뚜렷했다. 수집된 데이터는 뇌 영역 전반에서 신경세포 활성의 GENUS 매개 조절이 퇴행성 뉴런의 세포내 수송 및 시냅스 기능에 관여하는 유전자 및 단백질에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 강조한다. 이러한 결과는 대상체에서 GENUS에 의한 감마 진동, 다수의 뇌 영역에 걸친 신경 네트워크의 기능적 결합, 신경보호 그리고 행동 수행 능력 간의 연결성을 확립한다.
요약하면, 본 발명의 일 구현예는 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 A) 대상체의 적어도 전전두엽 피질(PFC) 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동조시키기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 A) 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동조시키고 대상체의 다수의 뇌 영역에서 퇴행하는 신경세포 내 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질을 개선하기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 A) 대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 30 Hz에서 50 Hz 사이의 주파수를 갖는 감마 간섭을 유의하게 증가시키기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하여 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동시에 동조시키는 단계를 포함한다.
아래에서 더욱 상세히 논의되는 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합이(이들 개념이 상호 불일치하지 않는다면) 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부로서 고려됨을 이해해야 한다. 특히, 본 개시의 끝에서 나타나는 청구된 주제의 모든 조합은, 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부로서 간주된다. 또한 본원에 참조로서 통합된 임의의 개시에서 나타날 수도 있는 용어로서, 본원에서 명시적으로 사용된 용어에는, 본원에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 함을 또한 이해해야 한다.
다음의 도면 및 상세한 설명을 검토하면, 다른 시스템, 프로세스 및 특징은 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 모든 추가적인 시스템, 공정 및 특징은 본 설명 내에 포함되고, 본 발명의 범주 내에 있고, 첨부된 청구범위에 의해 보호되도록 의도한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다.
당업자는, 도면들이 주로 예시적인 목적을 위한 것이며 본원에 기술된 본 발명의 주제의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며; 일부 경우에, 본원에 개시된 본 발명의 주제의 다양한 양태들은 도면에서 과장되거나 확대되어 상이한 특징의 이해를 용이하게 할 수 있다. 도면에서, 유사한 참조 부호는 일반적으로, 예를 들어, 유사한 특징(예: 기능적으로 유사한 요소 및/또는 구조적으로 유사한 요소)을 나타낸다.
도 1a 내지 도 1j는, 개시된 본 발명에 따라, 시각 자극이 시각 피질을 지나 대상체의 다수의 뇌 영역에서 감마 진동을 동조시키는 것을 도시한다.
도 2a 내지 도 2f는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 40 Hz(이지만 80 Hz는 아님) 시각 깜빡임 자극이 대상체의 시각 피질 너머에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 것을 도시한다.
도 3a 내지 도 3j는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 알츠하이머병 관련 병리를 개선하고 대상체의 신경퇴행을 특히 감소시키거나 예방하는 것을 도시한다.
도 4a 내지 도 4q는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 대상체의 소교세포에서 염증 반응을 감소시키는 것을 도시한다.
도 5a 내지 도 5i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 뉴런에서 시냅스 기능 및 세포내 수송을 변형시키는 것을 도시한다.
도 6a 내지 도 6i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 알츠하이머병의 다중 대상체 모델에서 행동을 변형시키는 것을 도시한다.
도 7a 내지 도 7i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 신경퇴행의 마우스 모델에서 시각 피질 너머에서 감마 진동을 동조시키는 것을 도시한다.
도 8a 내지 도 8i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 시각 피질 너머에서 5XFAD 마우스에서 AD 관련 병리를 감소시키는 것을 도시한다.
도 9a 내지 9g는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 P301S 및 CK-p25 마우스에서 AD 관련 병리를 개선하는 것을 도시한다.
도 10a 내지 도 10n은, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 소교세포를 변형시키고, 뉴런에서 세포내 수송 및 시냅스 전달을 향상시키는 것을 도시한다.
도 11a 내지 도 11j는, 개시된 본 발명에 따라, 급성 및 만성 시각 자극의 대상체에 대한 효과의 행동 특성을 도시한다.
도 12a 내지 도 12c는, 개시된 본 발명에 따라, 80 Hz에서의 만성 시각 자극이 5XFAD 마우스에서 모리스 수중 미로에 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
당업자는, 도면들이 주로 예시적인 목적을 위한 것이며 본원에 기술된 본 발명의 주제의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며; 일부 경우에, 본원에 개시된 본 발명의 주제의 다양한 양태들은 도면에서 과장되거나 확대되어 상이한 특징의 이해를 용이하게 할 수 있다. 도면에서, 유사한 참조 부호는 일반적으로, 예를 들어, 유사한 특징(예: 기능적으로 유사한 요소 및/또는 구조적으로 유사한 요소)을 나타낸다.
도 1a 내지 도 1j는, 개시된 본 발명에 따라, 시각 자극이 시각 피질을 지나 대상체의 다수의 뇌 영역에서 감마 진동을 동조시키는 것을 도시한다.
도 2a 내지 도 2f는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 40 Hz(이지만 80 Hz는 아님) 시각 깜빡임 자극이 대상체의 시각 피질 너머에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 것을 도시한다.
도 3a 내지 도 3j는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 알츠하이머병 관련 병리를 개선하고 대상체의 신경퇴행을 특히 감소시키거나 예방하는 것을 도시한다.
도 4a 내지 도 4q는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 대상체의 소교세포에서 염증 반응을 감소시키는 것을 도시한다.
도 5a 내지 도 5i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 뉴런에서 시냅스 기능 및 세포내 수송을 변형시키는 것을 도시한다.
도 6a 내지 도 6i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 알츠하이머병의 다중 대상체 모델에서 행동을 변형시키는 것을 도시한다.
도 7a 내지 도 7i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 신경퇴행의 마우스 모델에서 시각 피질 너머에서 감마 진동을 동조시키는 것을 도시한다.
도 8a 내지 도 8i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 시각 피질 너머에서 5XFAD 마우스에서 AD 관련 병리를 감소시키는 것을 도시한다.
도 9a 내지 9g는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 P301S 및 CK-p25 마우스에서 AD 관련 병리를 개선하는 것을 도시한다.
도 10a 내지 도 10n은, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 소교세포를 변형시키고, 뉴런에서 세포내 수송 및 시냅스 전달을 향상시키는 것을 도시한다.
도 11a 내지 도 11j는, 개시된 본 발명에 따라, 급성 및 만성 시각 자극의 대상체에 대한 효과의 행동 특성을 도시한다.
도 12a 내지 도 12c는, 개시된 본 발명에 따라, 80 Hz에서의 만성 시각 자극이 5XFAD 마우스에서 모리스 수중 미로에 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
하기는 고차 뇌 영역에 결합하고, 신경퇴행 및 신경염증을 감소시키며, 인지 기능을 향상시키는 시각 자극을 통해 치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법과 관련된 다양한 개념에 대한 보다 상세히 설명 및 상기 시스템 및 방법의 구현예이다. 상기에서 도입되고 하기에서 보다 상세하게 논의되는 다양한 개념은 다양한 방식으로 구현될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 특정 구현예 및 적용예의 예시는 당업자에게 명백한 구현예 및 대안을 당업자가 실시할 수 있도록 예시적인 목적으로 주로 제공된다.
아래에서 설명되는 도면 및 예시적인 구현예는 본 구현예의 범위를 단일 구현예에 한정하기 위한 것은 아니다. 설명되거나 도시된 요소의 일부 또는 전부를 교환함으로써 다른 구현예가 가능하다. 또한, 개시된 예시적인 구현예의 특정 요소가 공지된 구성 요소를 사용하여 부분적으로 또는 완전히 구현될 수 있는 경우, 일부 경우에 본 구현예를 이해하는 데 필요한 이러한 공지된 구성 요소의 부분만이 설명되고, 이러한 공지된 구성 요소의 다른 부분에 대한 상세한 설명은 본 구현예를 모호하게 하지 않도록 생략된다.
본 개시에서, 우리는 "감각 시각 자극을 사용한 감마 동조(Gamma ENtrainment Using Sensory visual stimuli)"(GENUS)로서 본원에서 지칭되는, 만성 비침습적 시각 자극으로 대상체의 치료를 포함하는 발명의 기술이 알츠하이머병(AD)을 포함하는, 치매와 관련된 증상을 해결하고, 시각 피질을 지나 뇌 영역에서의 AD 병리학에 영향을 미친다는 것을 입증한다. 예시적인 실시예에서, 우리는 Tau P301S, CK-p25, 및 연상의 5XFAD 마우스를 포함하는, 신경퇴행의 다수의 마우스 모델에서 만성 시각 GENUS의 효과를 검증하였다. 우리는 만성 시각 GENUS가 (고차 뇌 영역을 포함하는) 다수의 뇌 영역에서 감마 진동을 동조시키고 이러한 뇌 영역에 걸쳐 저 감마 주파수에서 기능적 결합을 유도하는 것을 관찰하였다. 우리가 시험한 여러 신경퇴행성 질병 마우스 모델 전반에서, 우리는 만성 시각 GENUS가 아밀로이드 플라크, 타우 과인산화 및 뇌 위축을 포함하는 다수의 AD 관련 병리를 개선시켜, 다수의 고차 뇌 영역에서 뉴런 및 시냅스 밀도 손실을 예방하는 것을 발견하였다. 전사체학적 및 단백질체학적 프로파일링은 P301S 및 CK-p25 마우스의 퇴화하는 뉴런 내 비정상적으로 변형된 막 수송, 세포내 수송 및 시냅스 기능에 관여하는 유전자 및 단백질이 개선되거나 만성 GENUS로 수선되며, 소교세포 내 면역 반응이 감소되는 것을 입증하였다. 이러한 광범위한 신경 보호 효과의 관점에서, 우리는 인식 기능에 대한 만성 일일 GENUS의 효과를 추가로 조사하였고 다수의 AD 마우스 모델에서 행동 작업의 향상된 수행 능력을 입증한다. 종합하면, 우리의 결과는 AD를 포함하여, 치매에 대해 대상체를 치료하는 데 있어서 시각 GENUS의 신경 보호 효능을 강조한다.
하기에 상세히 설명되는 바와 같이, 만성 시각 자극의 다수의 뇌 영역에 대한 영향을 평가하기 위해 여러 연구를 수행하였다. 시각 자극은 일반적으로 약 30Hz 내지 50Hz의 주파수를 가졌으며, 시각 자극용으로 40 Hz 또는 약 40Hz의 주파수에 대하여 특히 주의를 기울였다. 일부 실시예에서, 발광 다이오드(LED) 기반 장치가 시작 자극을 전달하기 위해 사용되었고, LED 기반 장치는 50%의 듀티 사이클을 갖는 구형파(square wave) 전류 패턴으로 구동되었다. 그러나, (LED 기반 장치 이외에) 다양한 유형의 장치가 본원에서 언급된 범위 내의 다양한 주파수에서 시각 자극을 효과적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 50% 이외의 듀티 사이클뿐만 아니라, 구형파 형태 이외의 파형도 본원에서 언급된 범위 내의 다양한 주파수에서 시각 자극을 효과적으로 발생시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 하루 1시간의 시각 자극에 대한 대상체 노출 시간, 및 7일, 22일(약 3주) 및 42일(약6주)의 대상체 노출 시간을 포함하는 다양한 치료 프로토콜이 본원에 기술된 여러 연구에서 사용되었다. 그러나, 본원에서 언급된 범위 내의 다양한 주파수에서 시각 자극을 전달하고 알치하이머병을 포함하는, 치매를 효과적으로 치료하기 위해 다른 대상체 노출 시간 및 대상체 노출 기간이 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 하루에 1시간을 초과하는 노출 시간(예: 1 시간 단위로 여러 번 증분, 더 짧은 단위로 증분, 또는 더 긴 단위로 증분하여 전달되는), 및/또는 3주 미만, 3주 내지 6주 사이, 6주 초과의 노출 기간이 알츠하이머병을 포함하는, 치매를 효과적으로 치료하기 위해 상이한 조합 및 순열로 사용될 수 있다.
하기에서, 우리는 먼저 실험 및 각각의 관찰에 대한 요약을 제공하고, 이어서 알츠하이머 병을 포함하는, 치매용 대상체의 치료에 대한 시각 GENUS의 효능을 도시화하기 위한 실험 프로토콜의 추가 상세를 제공한다.
시각 GENUS는 고차 뇌 영역에 영향을 준다
우리는 먼저, 야생형 C57Bl/6J 마우스에서 신경 활성의 표지자로서 c-Fos 면역조직화학 염색을 수행함으로써, 40 Hz 시각 자극이 시각 피질을 지나 뇌 영역에서 신경 활성을 조절할 수 있는지, 또는 이것이 시각 피질로 한정되었는지 결정하고자 한다(도 1a). 맞춤형 LED 장치를 사용하여 50% 듀티 사이클로 특정 주파수에서 시각 자극을 전달하였다(예: 40 Hz 자극을 위해 12.5 ms동안 점등 및 12.5 ms동안 소등)(Iaccarino 등, 2016; Singer 등, in press). 마우스를 3일 동안 그들의 환경에 익숙하게 한 다음, 1시간의 40Hz 시각 자극에 노출시켰다. 이어서, 그들을 희생시키기 1시간 전에 그들의 홈 케이지로 복귀시키고, 뇌 조각을 수집하고, 섹션화하고, c-Fos 항체로 표지하였다. 우리는 40Hz 시각 자극이 시각 피질(V1)에서 c-Fos 양성 뉴런의 유의한 증가를 나타냈음을 발견하였고(도 1a~1b), 또한 체성 감각 피질(SS1), 해마 영역 CA1, 및 전전두엽 피질의 대상 피질(CC) 영역의 유의한 증가를 주목하였다(도 1a~1b).
이들 뇌 영역에서 40 Hz 시각 자극이 진행중인 신경 활성을 어떻게 변화시킬 수 있는지를 이해하기 위해, 우리는 C57Bl/6J 마우스에 맞춤형 마이크로 드라이브(텅스텐 와이어 전극; 자세한 내용은 방법 참조)를 이식하여, 자유롭게 행동하는 마우스의 V1, SS1, CA1, 및 전전두엽 피질(PFC)의 대상 영역으로부터 동시에 국소장 전위(LFP)를 기록하였다. 탐색 행동을 감소시키기 위해 마우스를 작은 GENUS 상자(8 x 8 인치)에 가두고, 각 10분 동안 처음에는 차단됐다가 차단되지 않은 40 Hz 시각 자극에 노출되었을 때 V1, SS1, CA1, 및 전전두엽 피질(PFC)로부터 동시에 국소장 전위(LFP)를 기록하였다(도 1a, 도 7a). 급성 40Hz 시각 자극은 V1에서 40 Hz의 피크 주파수(도 1c~1d)와 CA1에서 작지만 유의한 증가(도 1c~1d)와 함께, 약 35~45Hz의 저 감마 진동의 출력을 크게 증가시켰으며, 이는 머리-억제된(head-restrained) 마우스에서의 이전의 발견과 일치한다(Iaccarino 등, 2016). 감마 출력의 작지만 유의한 증가는 또한 SS1 및 PFC에서 관찰되었고(도 1c-1d), 우리가 이러한 영역들 전반에 걸쳐 관찰한 c-Fos 양성 세포의 증가와 일치하였다(도 1b).
이러한 시각 자극 유도 진동이 시각 피질의 뇌 영역 하류에서 뉴런 흥분을 동반할 수 있는지를 평가하기 위해, 우리는 단일 유닛 활성을 기록하도록 해마 영역 CA1로 표적화된 사극관을 C57Bl/6J 마우스의 코호트에 이식하였다. 빛이 차단된 기준 조건에서, CA1 추체세포는 피크에서 우선 방전과 함께 저 감마(약 35~45 Hz)에서 강한 위상 고정을 보였고, 이는 이전의 보고와 일치한다(Bragin 등, 1995; Middleton 및 McHugh, 2016)(도 1e). 선호되는 위상을 변화시키지 않는 한편, 40 Hz에서 시각 자극은 모집단 전반에서 증가된 평균 결과 길이로 정량화하고(도 1f), 개별 뉴런의 더 강력한 위상 고정(MRL; 차단된 자극과 40 Hz 보이는 시각 자극 사이, P = 0.01)을 유도하였으며, 이는 감마 주파수 시각 자극이 보다 일시적으로 조직화된 방식으로 해마 뉴런의 모집단을 구동시키는 작용을 하는 것을 나타낸다.
손상된 뉴런 시스템에 GENUS의 적용가능성을 테스트하기 위해, C57Bl/6J 동물에서 관찰된 바와 같이, 시각 자극으로 감마 진동을 유도할 수 있는지를 검증하기 위해 신경퇴행의 여러 마우스 모델을 사용하였다. 우리는 Cdk5 활성화제 p25의 발현이 흥분성 뉴런-특이적 CaMKIIα 프로모터에 의해 유도가능한 방식으로 구동되는, CK-p25 마우스 주를 사용하였다(CaMKIIα 프로모터- tTA x TetO- p25+GFP)(Cruz 등, 2003). 먹이에서 독시사이클린을 회수한 다음, CK-p25는 6주간의 p25 유도에 의해 심각한 인지 장애와 함께 진행성 뉴런 및 시냅스 손실을 나타낸다(Cruz 등, 2003). 유도 후 6주에 이러한 결과와 일치하고, CK-p25 마우스로부터의 생체 내 LFP 기록은 V1, CA1, 및 PFC에서의 대조군 마우스에 비해 35~45 Hz에서 상당히 감소된 감마 스펙트럼 출력이 나타났다(도 7b-7c). 이러한 변화에도 불구하고, 40 Hz 시각 자극은 V1, CA1, 및 PFC에서 감마 진동을 여전히 유의하게 향상시킬 수 있었다(도 7c). 우리는 높은 수준의 인간화 돌연변이 미세소관 연관 단백질 타우를 발현하고, 5개월이라는 이른 나이에 전측두엽 치매와 연관된 타우 응집체를 갖는 Tau P301S 마우스를 추가로 조사하였다(Yoshiyama 등, 2007). 8개월령 P301S 마우스는, 시냅스 및 뉴런 손실과 인지 결함을 가지는 나이에, V1 및 PFC에서 40 Hz 시각 자극시 향상된 감마 출력을 나타냈다(도 7d~7e). 이러한 결과는 GENUS가 이들 마우스에서 뉴런 손상의 특정 방식과는 무관하게 AD 마우스에서 감마 진동을 동반시키기에 충분한 것을 나타낸다.
시각 자극의 다중 노출이 장시간 기간 후에도 감마 진동을 여전히 동조시킬 수 있도록 하기 위해, 우리는 C57Bl/6J 및 p25 유도 CK-p25 마우스가 42일(1시간/일) 동안 40 Hz 시각 자극에 노출되는 만성 GENUS 프로토콜을 사용하였다(도 7f, 도 7h). 43일차에, V1, SS1, CA1, 및 PFC로부터 기록된 LFP는, 단일 시험 급성 GENUS 적용과 일치하고, C57Bl/6J 마우스의 모든 영역에 걸쳐 상당히 강화된 40 Hz 감마 출력을 나타냈다(도 7f). 유사한 방식으로, 43일차에 CK-p25 마우스(현재 p25 유도 후 85일)도 V1, CA1, 및 PFC에서 증가된 저 감마 출력을 나타냈다(도 7h). c-Fos 면역 염색 데이터와 함께 이러한 결과는, 급성 및 만성 40 Hz 시각 자극이 시각 피질뿐만 아니라, CA1, SS1 및 PFC를 포함하는 다른 고차 피질도 보강하는 것을 나타낸다.
40 Hz 시각 자극(급성 및 만성 둘 다)은 V1, SS1, CA1 및 PFC에 걸쳐 40 Hz 출력을 동시에 향상시키기 때문에, 우리는 GENUS가 시각 피질 및 이들 다른 고차 뇌 구조 사이에서 뉴런 활성을 조정하도록 작용하는 것 또한 입증하였다. 우리는 볼륨 전도(volume conduction)를 통해 잠재적 오염을 최소화하는, 가중 위상 지연 지수(WPLI) 방법을 사용하여 차단된 광 및 차단되지 않은 광으로 40 Hz 시각 자극 동안 이들 뇌 영역에 걸친 간섭을 산출하였다(Vinck 등, 2011). V1~CA1, V1~SS1, V1~PFC, CA1~ SS1 및 CA1~PFC에 위치한 전극 쌍을 가로질러 C57Bl/6J 마우스의 LFP를 분석하였다. 평균 속도는 광 차단이 있는 상태 대 없는 상태에서 40 Hz 시각 자극 동안 기간에서 유의하게 상이하지 않았고, 운동성 활동량에서 임의의 잠재적인 차이를 무시하였다. 급성 40 Hz 시각 자극은 시각 피질 내지 구체적으로 V1~CA1, V1~SS1 & V1~PFC 사이에서 조사된 뇌 영역에서 30~50 Hz 저 감마 간섭을 유의하게 증가시켰다(도 1g, 1h).
더 넓은 뇌 구조에 걸쳐 조정된 뉴런 진동(neuronal oscillation)에 대한 만성 GENUS의 장기적인 영향을 평가하기 위해, 우리는 42시간 동안 시각 자극에 1시간/일씩 노출된 C57Bl/6J 및 p25 유도 CK-p25 마우스에서 V1, SS1, CA1, 및 PFC로부터 수집된 LFP에 대해 WPLI 분석을 적용하였다. 우리는 광 차단 조건과 비교하여 40 Hz 시각 자극 동안 V1~SS1, V1~PFC, 및 CA1~PFCV1 사이(도 7g)뿐만 아니라, V1 및 CA1 사이에서도 30 ~ 50 Hz 저 감마 WPLI의 유의한 증가를 발견하였다(도 7g). 마찬가지로, 만성 GENUS이후, CK-p25 마우스는 또한 광 차단 조건과 비교하여 V1~CA1, CA1~PFC 및 V1~PFC 사이에서 30 ~ 50 Hz 저 감마 WPLI의 유의한 증가를 나타냈다(도 7i). 전체적으로, 이들 데이터는 40 Hz 시각 자극이 마우스의 여러 고차 피질에서 조정된 뉴런 진동 활성(30 ~ 50 Hz 저 감마 WPLI)을 영역 사이뿐만 아니라 국부적(40 Hz 동조)으로도 향상시키는 것을 시사한다. 그러나, 우리가 관찰했던 변화가 저 감마 주파수 자극에 특이적인지를 입증하는 것은 중요하다. 이를 시험하기 위해, 우리는 C57Bl/6J 마우스를 80 Hz 시각 자극에 노출시켰고, 마우스가 우리의 40 Hz 자극 실험에서와 같이 유사한 광 세기 및 노출 지속시간을 받도록 하기 위해서 50% 듀티 사이클로 전달하였다(도 1i). 사전 자극 기간과 비교하여 80 Hz 시각 자극 동안 (우리가 40 Hz GENUS로 가장 큰 출력 증가를 관찰한) 시각 피질에서 80 Hz 스펙트럼 출력의 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 1i, 1j).
만성 GENUS는 시각 피질 너머에서 아밀로이드 플라크를 개선시킨다
Iaccarino 등(2016)은 급성 시간 GENUS가 어린 전증상 5XFAD 마우스의 V1에서 아밀로이드 수준을 감소시키는 반면, 더 진보된 병리를 갖는 6개월령 5XFAD 마우스에서 7일의 시각 GENUS가 아밀로이드 수준을 감소시키는 것 뿐만아니라, 아밀로이드 플라크도 개선시키는 것을 입증하였다. 우리는 따라서, 11개월령 5XFAD 마우스의 V1에서 (뿐만 아니라 CA1, SS1, 및 PFC에서도) 7일의 40 Hz 시각 자극이 아밀로이드 플라크 병리에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하는 것을 목표로 하였다. 이 목표를 향해, 우리는 마우스를 GENUS 자극 케이지에 넣고(도 8a), 그들로 하여금 7일 동안 하루 1시간씩 40 Hz 또는 80 Hz 시각 자극(40 Hz와 유사한 양의 광을 전달함)을 받게 하였으나, V1에서 감마 진동을 동조시키지는 않았고(도 1i, 1j), 아밀로이드 플라크 부하를 검사하였다(도 2a). 7일의 40 Hz 시각 자극 이후, 우리는 시각 피질에서 아밀로이드 플라크의 감소를 보았지만(도 2a, 도 2b), 무자극 마우스와 비교하여 SS1 또는 CA1에서는 차이가 발견되지 않았다(도 2a, 도 2b). LFP 분석에 의하면, 80 Hz 시각 자극을 받은 5XFAD 마우스는 V1 또는 CA1에서 아밀로이드 플라크 부하의 변화를 보이지 않았고, SS1에서 완만한 증가를 보여주었다(도 2a, 도 2b). 이들 결과는 7일의 시각 GENUS 후에 아밀로이드 플라크의 감소가 V1로 제한되고 40 Hz 시각 자극에 특이적인 것을 보여준다.
우리는 이어서, 5XFAD 마우스를 가지고 9개월령에서 시작하여, GENUS 프로토콜을 22일로 연장하고, 마우스가 약 10개월령일 때 아밀로이드 플라크를 정량하였다(도 2c). 우리는 22일의 GENUS가 V1에서 아밀로이드 플라크의 정도와 수를 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고(도 2c, 2d 및 도 8b ~ 8d), 이는 6개월령 5XFAD(Iaccarino 등, 2016) 및 11개월령 5XFAD 마우스에서 7일의 GENUS 이후 아밀로이드 플라크의 감소와 일치한다(도 2a, 2b). 중요한 것은, 22일의 GENUS가 또한 전전두엽 피질의 SS1, CA1 및 CC 영역의 플라크 정도 및 수를 감소시키기에 충분하다는 것이다(도 2d, 도 8b ~ 도 8d). 이 효과는 무자극 5XFAD 마우스와 비교하였을 때 22일의 80 Hz 자극이 5XFAD 마우스의 V1, SS1, 또는 CA1에서 아밀로이드 플라크를 바꾸지 않았기 때문에, 다시 40 Hz 자극에 대해 특이적이었다(도 2e, 2f).
우리는 이전의 연구에서 5XFAD 모델에서 뉴런과 시냅스 마커의 점진적인 손실이 약 9개월의 나이에 시작하는 것을 보여주었으므로, 장기 GENUS를 5XFAD 마우스의 9개월령부터 적용하는 것을 선택하였다(Oakley 등, 2006). 이러한 연구에 따라, 우리는 동일 연령의 야생형 한배 새끼와 비교하여, 10개월령 5XFAD 마우스의 CA1 및 CC 모두에서 뉴런 개수의 유의한 감소를 관찰하였다(도 8c, 8e). 대조적으로, 22일의 GENUS를 받는 5XFAD 마우스는, 감소된 아밀로이드 부하(도 2c, 2d 및 도 8b 내지 8d)에 추가하여, 무자극 마우스와 비교하여 유의하게 감소된 뉴런 손실을 보였다(도 8e). 유사하게, 우리는 무자극 5XAFD 마우스의 CA1 및 CC에서 바순(bassoon, 시냅스 마커 단백질) 반점(puncta)의 유의한 손실을 관찰한 반면, 22일 동안 만성 GENUS는 시냅스 손실을 감소시켰다(도 8f, 8g). 우리가 무자극 대조군에 비해 GENUS를 받은 마우스에서 전장 APP 단백질의 발현에서 아무런 차이도 발견하지 못해기 때문에, 만성 GENUS 후 감소된 신경퇴행 및 아밀로이드 병리는 변경된 APP 전이 유전자 발현의 결과가 아니었다(도 8h, 8i). 이러한 결과는 만성 시각 GENUS가 5XFAD 마우스의 여러 뇌 영역에서, 아밀로이드 플라크 부하의 감소, 및 뉴런 및 시냅스의 감소된 손실을 야기하는 것을 입증한다.
만성 GENUS는 신경퇴행을 감소시킨다
5XFAD 마우스에서 볼 수 있는 바와 같이, 질병 병리에 영향을 미치고 뉴런 손실을 감소시키는 만성 GENUS의 가능성을 추가로 탐색하기 위해(도 8c, 8e), 우리는 이어서 신경퇴행의 Tau P301S 및 CK-p25 마우스 모델을 조사하였다. 8개월의 연령에서, Tau P301S 마우스는 현저한 신경 병리를 나타낸다(Yoshiyama 등, 2007). 따라서, 우리는 Tau P301S 마우스의 코호트를 택하고, 그들로 하여금 7개월령부터 무자극 또는 22일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받게 하였으며, 약 8개월령에서 그들의 타우 인산화 수준 및 타우 연관 병리를 조사하였다(도 3a ~ 도 3e, 및 도 9a, 도 9b). 우리는 야생형 나이브(WT naive) 한배새끼와 비교하여 Tau P301S 마우스의 V1, SS1, CA1 및 CC 내 S202/T205 잔기에서 타우의 더 높은 인산화를 관찰하였다(도 3a, 3b). 그러나, 만성 GENUS를 받은 Tau P301S 마우스는 무자극 P301S 마우스에 비해 S202/T205 타우 인산화를 유의하게 감소시켰다(도 3a, 3b). AD 및 P301S 마우스에서, 타우 단백질은 다수의 잔기에서 과-인산화되고(Hanger y등, 2007; Wang 등, 2013; Foidl and Humpel, 2018; Kimura 등, 2018), 따라서 이용된 비편향 Ser/Thr(S/T) 인단백질체학 접근법은 GENUS 자극이 타우 인산화에 영향을 미칠 수 있는 정도를 조사한다. 우리는 WT 나이브 한배 새끼와 비교하여 Tau P301S 마우스에서 과인산화된 46개 S/T 잔기 및 탈인산화된 단일 잔기(S451)를 식별하였다(도 3c). 우리의 분석은 또한 만성 GENUS가 6개 S/T 부위의 타우 단백질에서 인산화를 감소시키고 S451에서 인산화를 증가시켰음을 밝혀냈고, 이는 GENUS가 여러 부위에서 타우 인산화에 영향을 미친다는 것을 나타낸다(도 3c).
우리는 다음으로 Tau P301S 마우스에서 뉴런 손실을 특징으로 나타내고, 이전에 보고된 바와 같이, 그들은 NeuN 양성 세포의 수에 의해 정량화됨에 따라 V1, CA1, SS1, 및 CC에서 뉴런 수의 유의한 감소를 표시하였다(도 3d, 3e). 22일 동안 (뉴런 손실이 시작되는 시점인) 7개월 연령부터 GENUS를 받은 Tau P301S 마우스는 무자극 대조군과 비교하여 우리가 조사했던 모든 뇌 영역에서 유의하게 감소된 뉴런 손질을 보여주었다(도 3d, 3e). 우리는 다음으로, 뇌 중량 및 측방향 뇌실 크기를 조사하였고, WT 비자극과 GENUS 자극받은 P301S 마우스 간에 아무런 차이가 관찰되지 않았다(도 9b).
우리는 이어서 6주의 p25 유도 후 뇌 위축, 피질 수축, 및 비정상적인 뇌실 팽창과 같은, AD 유사 병리학적 특징을 보여주는 CK-p25 모델로 전환하였다(Cruz 등, 2003). 만성 GENUS가 이러한 이상을 개선시킬 수 있는 정도를 조사하기 위해, 우리는 6주 동안 CK-p25 마우스에서 p25를 동시에 유도하면서 또한 그들을 매일 1시간의 GENUS에 노출시켰다(도 3f). 무자극 CK-p25 마우스는 CK 나이브 한배 새끼와 비교하여 상당히 감소된 뇌 중량 및 피질 두께를 보여주었다(CaMKIIα promoter- tTA;Cruz 등, 2003)(도 3g). 무자극 CK-p25 마우스와 비교하여 p25 유도 동안 만성 GENUS는 피질 두께감소(cortical thinning)를 유의하게 감소시켰으나 뇌 중량을 유의하게 변경시키지는 않았다(도 3g, 및 도 9d). 인간 AD 및 CK-p25 형질전환(transgenic) 모델 둘 다에서, 피질 수축은 뇌실 팽창과 밀접하게 연관되었고(Cruz 등, 2003), 우리는 또한 만성 GENUS를 받은 CK-p25 마우스에서 뇌실 팽창의 급격한 감소를 관찰하였다(도 3h 및 도 9e). 또한, p25 유도 동안 만성 GENUS를 처리한 CK-p25 마우스는 또한 무자극 대조군과 비교하여 PFC의 V1, SS1, CA1, 및 CC 영역에서 뉴런 손실이 유의하게 줄어들었다(도 3i, 3j). 이중 가닥 절단(DBS) 형태의 DNA 손상은 CK-p25 마우스에서 신경퇴행용 초기 마커를 나타내는 것이 이미 보고되어 왔다(Kim 등, 2008). 이러한 결과와 뉴런 사망(neuronal death)의 GENUS 매개 감소에 따르면, 우리는 또한 V1, SS1, 및 CA1에서 DSB의 잘 확립된 마커인, γH2AX 양성 세포의 수에 의해 분석된 바와 같이, 유의하게 감소된 것을 관찰하였다(도 9g). 총 타우 및 p25 발현(각각, P301S 및 CK-p25 마우스에서)이 GENUS와 무자극군 간에 차이가 없기 때문에, 만성 GENUS의 이러한 신경 보호 효과는 돌연변이체에서 이식 유전자 발현을 변경하는 것으로 유도되지 않았다(도 9a, 9c, 9f). 종합하면, 이러한 관찰은 만성 GENUS가 심각한 신경퇴행을 갖는 P301S 및 CK-p25 마우스 모델에서 신경 보호성인 것을 수립한다.
만성 GENUS는 염증 반응을 감소시킨다
우리는 또한, 만성 GENUS 후 Tau P301S 및 CK-p25 마우스에서 관찰한 감소된 신경퇴행이 유리한 소교세포 반응에 의해 부분적으로 매개될 수 있음을 입증하였다. 우리는 무자극 P301S 및 CK-p25 마우스 및 각각의 WT 대조군뿐만 아니라, 22일 및 42일 동안 GENUS 자극을 받은 P301S tau 및 CK-p25 마우스의 시각 피질에서 비편향된 RNA 시퀀싱을 수행하였다(도 4a). 시각 피질을 절개한 다음, 효소에 의해 소화시키고, 소교세포를 CD11b 및 CD45 면역 염색을 함으로써 식별하였고, 그 후 전술한 반와 같이 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용하여 단리하였다(Mathys 등, 2017)(도 10a, 10b). 우리는 각 마우스로부터 35,000개의 소교세포를 단리하였으며, 각 마우스로부터 별도로 전체 RNA를 추출하고 RNA-seq 전에 RNA의 품질을 확인하였다. 샘플당 평균 28.69백만 건의 판독을 얻었고, 그 중 89.42%를 정렬하였다.
CK 나이브 마우스와 비교할 때, RNA 시퀀싱은 무자극 CK-p25 마우스로부터 유래된 소교세포가 2333개의 상향조절된 유전자를 가지는 것을 밝혀냈다(도 4a). 우리는 다음으로, 유전자 온톨로지(GO) 분석을 수행하였으며, 상향조절된 유전자가 단백질 합성, 리보솜 조절 및 (바이러스성 면역 반응, 항원 제시 및 면역 반응 조절을 포함하는) 면역 반응와 관련되어 있음을 관찰하였고, 이는 이전 보고서와 일치하였다(Mathys 등, 2017)(도 4b). 비교하면, 확인된 2019개 하향 조절된 유전자는 세포 이동, 세포 형태 형성 및 맥관 구조 발달과 주로 관련되어 있었다(도 4b). 만성 GENUS 후 355개 유전자가 CK-p25 마우스에서 상향조절되었고(무자극 CK-p25와 비교하여), 이들 유전자가 단백질 합성, 유사분열 세포 주기 조절, 막 수송 및 소포 매개 수송과 연관된 것으로 밝혀진 반면, 515개의 하향 조절된 유전자는 GTPase 활성, 단백질 분해 및 (MHC-1 매개 항원 처리 제시 및 면역-적응성을 포함하는) 면역 반응과 대부분 관련이 있었다(도 4c). 이러한 결과는 만성 GENUS가 CK-p25 마우스에서 소교세포 기능에 유의하게 영향을 미치고 염증을 완화시키며 식균작용, 이동 및 단백질 분해를 될 수 있는 한 더욱 가능하게 하는 것을 나타낸다.
무자극 Tau P301S 마우스에서, 우리는 WT 나이브 한배 새끼에 비해 총 331개의 상향조절 유전자 및 292개의 하향 조절된 유전자를 발견하였다(도 10c). 유전자 온톨로지(GO) 분석이 상향 조절된 유전자를 단백질 합성 및 염증/면역 반응과 연관시키는 것에 비하여, 하향 조절된 유전자는 세포골격 조직, 세포 이동 및 뇌 발생과 더 관련이 있었다(도 10d). 만성 GENUS(22일) 후 Tau P301S 마우스에서 얻은 소교세포는 무자극 Tau P301S 마우스와 비교하여 238개의 상향 조절된 유전자 및 244개의 하향 조절된 유전자를 나타냈다. 여기서, 상향 조절된 유전자는 세포성 이화 단백질 분해, 세포 이동, 세포 형태 형성 및 유전자 발현, 번역 개시와 인터페론 반응에 관여하는 하향 조절된 유전자를 이용한 막 수송과 연관되어 있다(도 10c 및 도 10d). 따라서, 만성 GENUS를 처리한 CK-p25 마우스는 만성 GENUS를 처리한 Tau P301S 마우스와 현저하게 유사한 전사체 변화를 보였다. 종합하면, 우리의 소교세포 특이적 전사체학 분석은 만성 GENUS가 특이적 유전자 이식 모델(P301S 또는 CK-p25)과는 독립적으로, 소교세포를 형태학적으로 변형시키고, 단백질 분해를 증강시키며, 소교세포 매개 면역 반응을 감소시키는 작용을 해서, 질병 상태를 생성하는 것을 나타낸다.
이러한 발견을 추가로 입증하기 위해, 우리는 만성 GENUS(CK-p25: p25 유도하는 42일 동안 1시간/일; Tau P301S: 22일) 후 CK-p25 및 Tau P301S 마우스뿐만 아니라, 각각의 무자극 및 나이브 대조군의 뇌 조각을 사용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. CK-p25 소교세포 반응은 전술되어 있고, 초기 반응은 증가된 증식 및 MHC 클래스 II 및 인터페론 경로의 상승에 의해 표시되는 후기 반응을 특징으로 한다(Mathys 등, 2017). 우리는 먼저 면역 조직 화학 및 3차원 렌더링을 수행하기 위해 소교세포 특이적 마커 Iba1을 사용하였고, 6주간 유도된 CK-p25 마우스의 V1에서 소교세포 수의 증가 및 형태의 광범위한 변화를 밝혔다(도 4d ~ 4i 및 도 10e). CK-p25 동물의 소교세포는 전체적으로 대조군에 비해 세포 소마(soma) 용적에서 유의한 차이를 나타내지 않았지만(도 4f), 대다수는 축삭 및 말기 시냅스 변성과 관련이있는 더 복잡한 '무성한(bushy)' 수지상 패턴(화살표 머리)(도 4d; 중앙 패널 하부)을 나타냈다(Jensen 등, 1994; Jorgensen 등, 1993). 우리는 또한, 소교세포의 많은 부분이 극성 돌기 없이 가늘고 긴 막대모양 바디(화살표)(도 4d, 4i), 외상성 뇌 손상을 가진 랫트, 및 인간 대상체에서 뇌 손상을 분산시킨 후 존재하는 것으로 알려진 표현형을 나타내는 것을 주목하였다(Bachstetter 등, 2017; Taylor 등, 2014). 또한, 감소된 돌기 용적(도 4g)에도 불구하고, CK-p25의 소교세포는 소교세포 간 최소 거리를 측정함으로써 분석된 바와 같이, CK 나이브 대조군에 비해 서로 더욱 물리적으로 근접해 있었다(도 4d, 4h). 이것은 그들의 구역 손실을 나타내며, 각 소교세포가 일반적으로 인접 구역 간 거의 중첩되지 않는 그 자체의 점유 영역을 갖는 휴지 상태와 대조된다(Del Rio-Hortega, 1932; Nimmerjahn 등, 2005).
만성 GENUS는 무자극 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 소교세포 수를 유의하게 감소시켰으나, 나이브 CK 마우스에서보다 높게 남아있었다(도 4d, 4e). 만성 GENUS 후 소교세포 돌기의 총 용적은 수축이 적어서, CK-p25 및 CK 나이브군에 비해서 유의한 차이가 없는 그런 용적이었다(도 4g). 중요하게는, 만성 GENUS 후 소교세포 간 최소 거리는 CK 나이브 동물의 것과 비교할 수 있었고(도 4d, 4h), 이는 만성 GENUS로 소교세포 구역의 보존을 시사한다. 마지막으로, 만성 GENUS를 처리한 CK-p25 동물의 막대모양 소교세포의 전반적인 용적에서의 증가가 유의하게 줄었으나, CK 나이브군보다 현저히 높게 남아있었다(도 4i). 우리는 다음으로, Tau P301S 소교세포를 특징짓고 P301S에서 소교세포가 증가된 경향이 있는 것을 발견하였으나, 우리의 Iba1 면역 염색에서 통계적 유의성에 도달하지 않았다(도 4k, 4l). 또한, 소교세포 소마의 총 용적은 WT 나이브 마우스에 비해 P301S에서 차이가 없었다(도 4k, 4m). 그러나, 만성 GENUS 후 Tau P301S 마우스에서 소교세포 돌기의 총 용적은 무자극 P301S 마우스와 유의하게 상이하였고, WT 나이브 한배 새끼와 비슷하였다(도 4k, 4n). 이러한 결과는 기준선 및 질병 조건에서 소교세포의 범위를 강조하고, P301S 및 CK-p25 마우스에서 질병 관련 소교세포 형태학적 이상을 완화시키기 위한 만성 GENUS의 효과를 전반적으로 나타낸다.
우리는 다음으로 만성 GENUS에 의해 영향을 받는 것으로 나타난 면역 반응에 대한 GO 용어를 조사하였다. 인터페론 반응 유전자 CD40에 특이적인 항체를 사용한 면역 조직 화학은 이전의 보고서에 따르면, CK 나이브 마우스에 비해 CK-p25에서 현저히 증가한 것으로 나타났다(Mathys 등, 2017)(도 4d, 4j). 만성 GENUS는 CK-p25 마우스에서 CD40 신호 세기를 유의하게 감소시켰지만, CK 나이브 대조군에서보다 유의하게 높게 남아있었다(도 4d, 4j). 우리는 다음으로 소교세포 특이적 RNA-seq 실험에서 현저히 상향 조절되었고 AD 마우스 모델에서 시냅스 손실과 이전에 연관이 있는, 또다른 면역 반응 유전자인, C1q(고전적 보체 성분)을 조사하였다(Hong 등, 2016). C1q에 대한 면역 조직 화학은 무자극 CK-p25 및 Tau P301S 마우스의 V1에서 그들 각각의 나이브 대조군 한배 새끼에 비해 상승된 신호를 보였다(도 4o, 4p, 4q). 만성 GENUS는 CK-p25 마우스의 C1q에서 증가를 유의하게 감소시켰으나, C1q 세기는 CK 나이브 수준보다 높게 남아 있었다(도 4o, 4p). P301S 마우스에서, 만성 GENUS는 C1q의 증가를 약화시켜 WT 나이브 및 무자극 P301S 마우스 간에 유의한 차이가 없었다(도 4o, 4q). 전반적으로, 우리의 면역 조직 화학 결과는 만성 GENUS가 소교세포의 면역 반응 감소에 도움을 주는 것으로 일관되게 나타난다.
만성 GENUS는 뉴런에서 시냅스 전달 및 세포내 수송의 조절을 변경한다
우리는 다음으로 NeuN 양성(NeuN+) 신경핵을 단리시키고, CK-p25 마우스 및 Tau P301S의 V1에서 뉴런 내 유전자 발현에 대한 만성 GENUS의 효과를 연구하기 위해 비편향된 RNA-seq 분석을 수행하였다(도 5a, 5b 및 10f 내지 10g). 만성 GENUS(CK-p25: 42일의 p25 유도; Tau P301S: 22일) 후 마우스로부터 시각 피질을 수확하였다. 그 후에 100,000개 신경핵을 용해 완충액에 넣고 FACS에 의해 분류한 다음, RNA를 추출하고 서열 분석하였다(도 5a, 5b). 뇌 중량에 대한 연구 결과와 면역 조직 화학을 이용한 NeuN 및 피질 두께 감소를 정량화한 결과(도 3g, 3i 및 도 9d)에 따르면, 우리는 나이브 CK 한배 새끼(100 ± 3.87)와 비교할 때 무자극 CK-p25 마우스 내 NeuN+ 핵의 백분율(81.56 ± 3.29)을 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, 이는 만성 GENUS를 처리한 CK-p25 마우스(88.56 ± 4.49)에서는 분명하지 않았다(도 10f, 10h). 유사하게, 무자극 Tau P301S 마우스 내 NeuN+ 핵의 백분율은 나이브 WT 한배 새끼(100 ± 3.87)보다 유의하게 낮았지만(86.11 ± 2.26), 만성 GENUS를 처리한 Tau P301S 마우스는 우리의 면역 조직 화학 발견과 일치하는, WT 마우스(96.05 ± 3.99)(도 10g, 10h)와 상이하지 않았다(도 3e, 3j). 이러한 결과는 CK-p25 및 Tau P301S 신경퇴행성 마우스 모델 모두에서 만성 GENUS로 신경핵의 손실을 감소시키고 GENUS의 전반적인 신경 보호 효과를 가리킨다.
우리는 다음으로 이러한 FACS로 분류한 뉴런 RNA로부터 RNA-seq를 수행하였다. 샘플당 평균 18.09백만 및 22.79백만 건의 판독을 얻었고, 그 중 85.23% 및 84.45%가 CK-p25 및 P301S 마우스로부터 각각 정렬되었다. NeuN+ 핵의 비편향 전사체학적 분석은 CK-p25(618개 유전자) 및 Tau P301S(351개 유전자)에서 각각의 대조군 마우스에 비해 상향 조절된 유전자(CK-p25: 565개 유전자; Tau P301S: 229개 유전자) 보다 상대적으로 더 많은 유전자가 하향 조절된 것을 보여주었다(도 5a, 5b). 만성 GENUS는 각각의 무자극 대조군과 비교하여, CK-p25(409개 상향; 422개 하향) 및 Tau P301S(220개 상향; 221개 하향)에서 상향 조절된 유전자 대 하향 조절된 유전자의 유사한 수를 초래하였다(도 5a, 5b).
우리는 이어서 상이하게 발현된 유전자와 관련된 생물학적 기능을 조사하기 위해 GO 분석을 수행하였다. 만성 GENUS 후 CK-p25 마우스에서 뉴런 특이적 하향 조절된 유전자(618개 유전자)는 화학적 시냅스 전달, 세포내 수송, 자가 포식(autophagy), ATP 대사 과정, 트랜스-시냅스 신호 전달, 및 세포-세포 신호 전달에 관여하였다(도 5a). 흥미롭게도, GENUS는 CK-p25 마우스에서 이러한 과정들에 관여된 유전자를 유의하게 상향조절함으로써 이러한 생물학적 과정을 구제하였다(도 5a; 우측 패널). Tau P301S 내 하향 조절된 유전자(351개 유전자)는 화학적 시냅스 전달, 트랜스-시냅스 신호 전달, 소포 매개 수송을 포함하는 세포내 수송, 중뇌 발달 및 세포 자멸 과정의 조절에 관여하였다(도 5b). (소포 매개 수송, 세포내 수송, 시냅스 전달, 중뇌 발달 및 세포 자멸 과정의 조절을 포함하는) 이러한 동일 과정은 상향 조절된 유전자와 연관된 상위 생물학적 기능으로부터 드러난 바와 같이 Tau P301S 마우스에서 만성 GENUS 후에 모두 상향 조절되었다(도 5b, 및 도 10i). 반면, 일부 생물학적 과정은, γH2AX에 대한 우리의 면역 조직 화학 데이터에 따르면, DNA 이중 가닥 절단 및 DSB 수선에 관여하는 것들을 포함하여, CK-p25 및 Tau P301S 둘 다에서 (나이브 대조군과 비교하여) 상향 조절되었다(도 9g). 중요하게, 만성 GENUS 후 CK-p25 및 Tau P301S 마우스에서 하향 조절된 유전자가 DNA 손상에 반응하여 세포 자멸 경로에 필수적이라고 알려진 것들을 포함하였고, 이는 퇴행이 덜한 쪽으로 뉴런의 이동(shift)과 일치하였다. 종합하면, 이들 데이터는 기계적으로 구별되는 두 가지 신경퇴행 마우스 모델(CK-p25 및 Tau P301S)에서도, 유전자 조절의 변경된 패턴이 유사한 세포 및 (시냅스 기능, 세포내 수송 및 세포 자멸 조절의 하향 조절을 포함하는) 생물학적 기능에 수렴하여, 궁극적으로 뉴런 소멸을 촉진한다. 중요하게, 만성 GENUS 후 시냅스 전달, 시냅스 조직 및 소포 매개 수송을 포함하는 세포내 수송의 결함을 구제하는 것과 관련된 많은 유전자가 상향 조절된다(도 5a, 5b 및 도 10h).
만성 GENUS에 의해 변경되는 이러한 생물학적 과정을 추가로 특징화하고 검증하기 위해, 우리는 비편향화된 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 수행하여 CK-p25 및 Tau P301S 마우스의 V1에서 단백질의 차등 발현 및 S/T 인산화를 조사하였다(도 5c, 5d). 우리는 먼저, 조합된 CK-p25군(CK 나이브 대조군, 및 GENUS가 있거나 없는 CK-p25) 및 조합된 Tau P301S군(WT 나이브 대조군, GENUS가 있거나 없는 P301S)에서 질량 분석에 의해 확인되고, 각각의 뉴런 특이적 RNA-seq 데이터로부터 검출된 모든 RNA와 비교된 모든 단백질을 조사하였다. 우리는 조합된 CK-p25군 및 조합된 Tau P301S군에서 각각 확인된 총 단백질의 92.75% 및 91.95%가 뉴런 특이적 RNA-seq 데이터(도 5c, 5d)에서 발현된 유전자에 매핑된 것을 발견하였으며, 이는 확인된 단백질의 대부분이 뉴런 기능에 연관되는 것을 시사한다. 우리는 다음으로 CK-p25 및 Tau P301S 마우스에서 다르게 S/T 인산화된 단백질을 그들 각각의 나이브 대조군 한배 새끼와 비교하고 CK-p25 및 Tau P301S 마우스 모두에서 S/T-인산화 단백질이 전반적으로 증가하였음(도 5c, 5d; 하부 좌측 패널)을 발견하였으며, 이는 신경퇴행 마우스 모델 둘 다에서 기능성 단백질의 비정상적인 변형을 나타낸다. 만성 GENUS는 CK-p25 및 Tau P301S 마우스에서 각각의 무자극 대조군과 비교하여, 단백질의 S/T 인산화를 감소시켰다(도 5c, 5d; 우측 하단 패널). 우리의 뉴런 특이적 유전자 발현 분석(도 5a, 5b)과 일치하여, 만성 GENUS는 화학적 시냅스 전달, 수상 돌기(dendrite) 발달, 장기 강화(long-term potentiation), 소포 매개 수송의 조절, 시냅스 내 소포 매개 수송, 및 세포내 수송의 조절과 연관된 단백질을 변형하였고(도 5e 및 도 10j ~ 10m), 이는 이러한 과정이 퇴행성 뉴런에서 변형되고 만성 GENUS로 개선되는 것을 나타낸다.
소포 수송, 엔도시토시스, 및 시냅스 수송과 연관된 우리의 인단백질체학 분석으로부터 하나의 예시적 단백질은 다이나민1(DNM-1)(Armbruster 등, 2013)이고, 이것은 두 CK-p25 및 Tau P301S에서 만성 GENUS 후 상이하게 S/T-인산화된 단백질의 주석에서 여러 GO 용어와 연관되어 있다(도 5e). Ser774에서의 인산화 조절은 시냅스 소포의 엔도시토시스에 필요하고(Clayton 등, 2009), CK-p25 및 Tau P301S 마우스에서 과인산화되고 만성 GENUS로 감소하는 것으로 밝혀진 많은 잔기 중 하나이다. 우리는 면역 조직 화학 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였고, DMN-1 Ser774 인산화가 CK-p25 및 Tau P301 마우스에서 유의하게 증가되었고 만성 GENUS로 감소하였음을 발견하였다(도 5f 및 도 10m, 10n). 우리는 또한 소포 및 신경 전달 물질 수송, 시냅스 전달, 그리고 학습 및 기억력과 관련된 또 다른 단백질인, 소포성 클루탐산 수송체 1(vGlut1)에 대한 면역 조직 화학을 수행하였다(Balschun 등, 2009). 우리는 만성 GNEUS 후 CK-p25 마우스에서 유의하게 높은 vGlut1 발현(무자극 대조군에 비해서)과 함께, PFC의 V1뿐만 아니라, SS1, CA1, 및 ACC 구역에서도 vGlut1 반점이 CK 나이브 마우스(도 5g, 5h)에 비해 CK-p25 마우스에서 유의하게 감소된 것을 발견하였다(도 5g, 5h). 마찬가지로, Tau P301S 마우스에서 만성 GENUS 후, 이러한 뇌 영역들에 걸쳐 Tau P301S 마우스에서 시냅스 마커 vGlut1 반점의 감소된 발현이 줄어들었다(도 5i). 이들 데이터는 신경퇴행성 모델 둘 다에서 만성 GENUS를 사용하여 이들 뇌 영역에 걸쳐 감소된 뉴런(도 3d 및 도 3i) 및 시냅스 손실(도 4o, 4p, 4q)과 일치한다.
만성 GENUS는 행동 수행 능력을 변형시킨다
우리의 결과는 지금까지 GENUS가 CA1, SS1 및 PFC를 포함하여 V1을 훨씬 지나서 뉴런 진동을 동조시킬 수 있고, CK-p25 및 Tau P301S 마우스의 이들 뇌 영역 전부에서 아밀로이드 플라크, 타우 인산화, 시냅스 손실, 및 뉴런 손실을 포함하는 AD 연관 병리를 감소시키는 것을 보여준다. 우리의 RNA-seq 및 인단백질체학의 데이터는 보존된 시냅스 기능과 일치하는 시냅스 전달 및 세포내 수송에서 일부 질병 연관 결손을 완화하기 위한 만성 GENUS의 능력을 지지한다. 따라서, 우리는 만성 GENUS가 인지 기능 또한 개선하는지를 질문하였다. 우리는 먼저 GENUS가 임의의 인지 변화에 대한 해석을 복잡하게 할 수 있는 체계적인 행동 변화를 촉발시켰는지 확인하고자 하였다. C57Bl/6J 마우스에서 급성 GENUS 동안 또는 이후 이동한 거리에서 운동 활동량에서 차이가 없었다(도 11a ~ 11c). 또한, 피크로톡신에 의한 발작 민감성 및 신규 물체 식별은 변경되지 않았다(도 11b ~ 11c). 만성적으로 GENUS 자극(57BL6: 7일; CK-p25: p25 유도하는 42일 동안 1시간/일; Tau P301S: 22일)받은 모든 군의 동물은 무자극 대조군과 비슷한 체중을 가졌다(도 11d ~ 도 11f). 마지막으로, 7일의 GENUS는 C57Bl/6J 마우스에서 스트레스 반응 마커 혈장 코르티코스테론에 영향을 미치지 않았다(도 11i).
GENUS의 인지 이점을 평가하기 위해, 우리는 CK-p25 마우스에서 GENUS로 만성적으로 자극하면서 6주 동안 p25 발현을 유도한 후, AD의 CK-p25 마우스 모델에서 학습과 기억에 초점을 맞추었다. 마지막 주에 마우스를 오픈 필드(OF)에 노출시킨 후 신규 물체 인지(NOR) 테스트를 수행하였다(도 6a). 우리의 결과는, GENUS가 CK-p25 마우스의 불안에도 영향을 미치지 않았고(오픈 필드 아레나(arena)의 중심에서 소요된 시간으로 측정됨(도 6a, 6b)), 혈장 코르티코스테론 레벨도 변경시키지 않았음(도 11i)을 나타내고, 이는 만성 GENUS가 CK-p25 마우스에서 불안 또는 스트레스에 영향을 미치지 않았다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, GENUS 자극받은 CK-p25 마우스는, 운동 활동량에서 임의의 차이를 보이지 않은 반면, 익숙한 물체에 비해 신규 물체를 탐색하는데 유의하게 더 많은 시간이 소요되었으며(도 6a, 6c 및 도 11g), 이는 만성 GENUS가 무자극 CK-p25 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 신규 물체 인지를 향상시켰음을 나타낸다. 우리는 다음으로 6주간 모리스 수중 미로(MWM) 테스트를 수행하고 6주차의 GENUS 동안 CK-p25 마우스를 유도하였다. MWM 테스트에서, CK 나이브 마우스와 비교하여 공간 학습 부전을 나타내는 무자극 CK-p25 마우스는 훈련하는 동안 플랫폼을 찾기 위해 더 긴 대기 시간으로 표시된다(도 6d). 무자극 CK-p25 마우스는 CK 나이브군과 비교하여 탐침 시험(마지막 훈련일 24시간 후)에서 플랫폼 위치 방문 횟수 감소 및 목표 사분면에서 소요 시간 감소로 보여지는 것처럼 공간 학습 부전을 나타냈다(Fischer 등, 2005)(FIG. 6D). 이러한 부전은 만성 GENUS에 의해 유의하게 개선되었고, 그룹 전반 및 모든 훈련일에 걸쳐서 비슷하게 유지된 변경된 수영 속도의 결과는 아니었다(도 6d, 도 11j).
이 GENUS가 행동 수행 능력의 개선을 인지 장애의 근간을 이루는 단일 메커니즘으로 제한하는 것이 아니라, AD 연관 인지 감소에 보다 일반적으로 적용 가능한 것을 수립하기 위해, 우리는 여러 AD 모델 마우스를 테스트하였다. 우리는 8개월령 Tau P301S 마우스로 하여금 22일 동안 GENUS(1시간/일)를 겪게 하였고, 자극의 3주차에 마우스를 OF 및 NOR 과제로 테스트하고 동일 연령의 무자극군과 비교하였다(도 6e). CK-p25 마우스와 마찬가지로, GENUS는 P301S 마우스에서 OF 아레나의 중심에서 소요된 시간이나(도 6e, 6f), 혈장 코르티코스테론 수준(도 11i) 모두 변경시키지 않았고, 이는 만성 GENUS가 Tau P301S 마우스에서 불안 유사 행동을 변경시키지 않았음을 시시한다. 우리는 이어서 신규한 물체 인지 테스트를 수행하였고 WT 나이브 및 GNEUS 자극받은 Tau P301S 마우스가 기존 물체에 비해 신규 물체에 더 높은 선호도를 보이는 것을 관찰하였다(도 6g). 유사하게, 신규 물체 선호도는 무자극 Tau P301S 마우스에서 더 높았다(도 6g).
우리는 다음으로 Tau P301S 마우스에서 3주차 GENUS 동안 MWM 테스트를 수행하였다. WT 나이브 및 GENUS 자극받은 Tau P301S 마우스는 무자극 Tau P301S 마우스와 비교하여 MWM 훈련에서 유의하게 증가된 학습 곡선을 나타냈다(도 6h 및 도 11j). 마지막으로, 우리는 AD 아밀로이드 모델에서 행동을 개선하는 GENUS의 효과를 테스트하였다. 우리는 3주차 훈련을 하는 동안 GENUS 자극받은 5XFAD 마우스(22일 - 1시간/일)로 하여금 MWM 테스트를 겪게 하였다(도 6i). GENUS 자극받은 5XFAD 마우스는 처음 4일의 MWM 훈련동안 약간 낮은 학습 곡선을 나타내지만, 유의하게 부전인 무자극 5XFAD 마우스와는 대조적으로, 그들은 WT 한배 새끼에 비하여 여러 훈련 검정을 통해 개선되었다(도 6i 및 도 11j). 마지막으로, 80 Hz 시각 자극을 이용여, 우리가 다른 주파수를 가진 만성 자극이 행동에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다. V1에서의 생체 내 기록과 유사하게, 22일 동안 80 Hz 시각 자극을 경험한 5XFAD 마우스는 MWM에서 무자극 5XFAD 대조군과 비교하여 차이를 보이지 않았다(탐침 시험에서 플랫폼 및 목표 교차점을 찾기 위한 대기 시간으로 정량화함)(도 12a ~ 도 12c). 종합하면, 이러한 결과는 특이적으로 40 Hz에서 만성 자극이 신경퇴행의 여러 마우스 모델에서 행동 수행 능력을 개선시키는 것을 나타낸다.
많아지는 증거는 뉴런 네트워크 진동을 조작하는 것이 유망한 전략을 대신하여 병리 변화 및 신경계 장애와 연관된 행동 수행 능력 결함을 완화할 수 있다는 개념을 지지한다(Cho 등, 2015; Iaccarino 등, 2016; Kastanenka 등, 2017; Martinez-Losa 등, 2018; Verret 등, 2012). 여기서, 우리는 40 Hz 시각 자극을 통한 저 감마 진동의 만성 일일 동조가 다수의 뇌 영역에서 신경 병리를 감소시키기 위해, 진보된 신경퇴행 조건에서 조차도, 감마 진동을 동조시키는데 효과적이었음을 입증하였다. 만성 GENUS의 신경 보호 효과는 소교세포 매개 염증 반응의 감소를 포함하고, 이는 뉴런에서 시냅스 전달 및 세포내 수송을 촉진하는 유전자 및 단백질의 발현을 증가시키고, 행동 수행 능력을 향상시킨다.
만성 시각 GENUS는 뇌 영역에 걸쳐 저 감마 진동을 동조시키고 감마 간섭을 증가시킨다
우리는 40 Hz에서 급성 한 시간(1시간)의 시각 자극이 뉴런 활성을 동조시켜 감마 주파수 범위에서 진동시키고 어리고 전증상의 3개월령 5XFAD 마우스에서 AD 관련 표현형을 감소시켰음을 이전에 나타냈다(Iaccarino 등, 2016). 본 개시에서, 우리는 심각한 AD 유사 병리 및 뉴런의 손실에도 불구하고, (시각 피질(V1), 해마 CA1, 체성 감각 피질(SS1), 및 전측두엽 피질(PFC)을 포함하여) 뇌의 여러 부분에 걸쳐, GENUS가 신경퇴행을 가진 CK-p25 및 Tau P301S 마우스 모델에서 저 감마(약 35~45 Hz) 진동 출력을 유의하게 증가시켰음을 입증하였다. 운동 활동량은 감마 진동 검출에서 교란 인자가 될 수 있으나, 우리는 차단 및 가시 40 Hz 시각 자극 사이의 기록 세션 동안 속도나 총 이동 거리에서 차이를 발견하지 못했고, 이는 GENUS 동안 우리가 관찰한 저 감마 동조가 활동량 수준에 차이와 관련되어 있을 가능성을 없게 한다. 또한, CA1에서의 단일 유닛 기록 분석은 GENUS가 V1로부터 하류의 여러 뇌 영역에서 뉴런 활성을 보강할 수 있는 것을 보여주고(Martorell 및 Paulson등을 또함 참고, 동반 제출함), 비상관 노이즈 소스로부터 덜 민감한 용적 전도도인 가중 위상 지연 지수(WPLI)의 측정은 V1, CA1, SS1, 및 PFC가 강화된 저 감마 간섭을 보여서 GENUS와 더 기능적으로 결합시켰음을 보여준다. 이는, '간섭에 의한 커뮤니케이션(CTC)'이 인지 기능에 필수적인 것으로 시사된다(Fries, 2015)는 점에서 중요하며, 인간 AD 대상체가 피질 영역 사이 간섭에 결함을 보이는 것은 놀라운 일이 아니다(Stam 등, 2009).
시각 GENUS는 여러 신경퇴행 마우스 모델에서 광범위한 신경 보호를 준다
GENUS의 만성 적용이 더 넓은 뇌 영역에서 병리에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해, 우리는 시각 피질과, AD에 고도로 영향을 받는, 해마 및 전전두엽 피질(PFC)의 대상 부분과 같은, 기본 모드 네트워크의 다른 핵심 구조에 초점을 맞추었다. 우리는 먼저 고령의 5XFAD 마우스에서 7일 동안 GENUS를 적용하고, Iaccarino 등(2016)처럼, 아밀로이드 플라크가 V1에서 유의하게 감소되었음에도 불구하고, 해마에서 아밀로이드 수준을 변경하지 못한 것을 발견하였다(도 2a,2b).
따라서, 우리는 심각한 병리를 갖는 비교적 고령의 5XFAD 마우스(10개월령)를 사용하여 3주 동안 GENUS 요법을 연장하였고, 아밀로이드 플라크 부하가 V1뿐만 아니라, SS1, 해마 및 PFC를 포함하는 뇌의 다른 분포 부분에서도 유의하게 개선되었음을 보여준다. 우리는 CK-p25 모델에서 p25를 유도하는 6주 전체에서, Tau P301S 및 5XFAD 마우스에서는 3주 동안, 이들 각각의 모델에서 뉴런 손실을 시작하는 나이에서 이 연장된 GENUS 요법을 적용하였다. 우리는 CK-p25, Tau P301S, 및 5XFAD 마우스 모델 전반에서 V1뿐만 아니라, CA1, SS1, 및 CC(전전두엽 피질의 대상 부분)에 제한되지 않는 (과인산화된 타우, 시냅스 및 뉴런 손실, 및 DNA 손상을 포함하는) 각각의 병리에서 유의한 감소를 발견하였다. 뉴런 손실을 예방하기 위한 GENUS의 신경 보호 효과는, 극적인 뇌 위축, 피질 부피 수축, 및 뉴런과 그들의 길어진 돌기가 퇴화할 때 인간 AD와 연관된 상응하는 뇌실 팽창을 일반적으로 나타내는 CK-p25 마우스 모델에서 특히 명백하였다. 따라서, 우리는 GENUS가 상이한 병리학적 특징을 가진 다수의 마우스 모델에 걸쳐 광범위한 신경 보호 효과를 주는 것을 입증한다.
시각 GENUS는 시냅스 기능, 세포내 수송, 및 행동을 변경한다
분자 수준에서 GENUS의 영향을 조사하기 위해, 우리는 다음으로, 비편향된 전사체학 및 단백질체학적 분석으로 전환하였다. 단리된/정제된 Tau P301S 및 CK-p25 뉴런으로부터 우리의 데이터는 이들 신경퇴행 모델에서 이전에 보고된 변경된 뉴런 여기 및 여기/억제 균형과 일치하고, 시냅스 기능을 조절하는 여러 유전자, 단백질, 및 번역 후 변형 단백질의 현저한 조절 장애를 입증하였다(Fischer 등, 2005; Yoshiyama 등, 2007). AD는 또한 수상돌기 가지 밀도를 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 유전자 조작, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC)의 약리학적 억제, 또는 광유전학에 의해 AD 마우스에서 수상돌기 밀도를 증가시키는 것이 인지 손상을 완화시키는 것으로 밝혀졌다(Fischer 등, 2007; Graff 등, 2012; Roy 등, 2016). 또한, 우리는 만성 시각 GENUS가 CK-p25 및 Tau P301S 모델 전체에 걸쳐 이러한 유전자 발현 및 단백질 인산화 결함을 완화시키고, 시냅스 단백질에 특이적인 마커(vGlut1, bassoon)를 사용한 면역 조직 화학 분석이 각각의 대조군 마우스와 비슷한 시냅스 밀도를 입증하는 것을 발견하였다. 이러한 유전자 발현 변화와 시냅스 밀도의 구조(rescue)는, 우리가 만성 시각 GENUS에서 볼 수 있는 향상된 저 감마 간섭과 함께, 만성 GENUS가 시각 피질과 하류 뇌 영역에서 가소성을 변형시키는 것을 시사한다.
사후의 인간 AD 샘플, AD 마우스, iPSC 모델 및 일차 배양된 세포의 연구는 또한 AD에서 세포 내 수송, 소포 전달, 및 엔도솜 기능의 파괴를 의미했다(Millecamps and Julien, 2013; Small 등, 2017; Israel 등, 2012; Cataldo 등, 2000). 엔도시토시스(endocytosis)와 Aβ 생성 사이의 연결은 많은 연구에 의해 잘 문서화되어 있다(Marks and McMahon,1998; Cirrito 등, 2008; Schobel 등, 2008; Wu 및 Yao, 2009). 우리의 비편향 전사체 및 단백질체학적 데이터는 만성 GENUS가 유전자 발현 및 단백질 수준의 번역 후 변형에서 이러한 세포내 수송, 소포 전달 및 엔도시토시스 과정에 대한 변화를 언급하는 것을 보여준다. 우리의 결과는 급성 광유전학적으로 구동된 감마 진동에 따라 어린 5XFAD 마우스의 CA1 내 확대된 초기 엔도좀의 감소와 일치한다(Iaccarino 등, 2016). 또한, 우리의 데이터는 만성 GENUS가 신경퇴행의 P301S 및 CK-p25 마우스 모델 둘 다에서 S774 다이나민 1 과인산화를 감소시켰으며, 이는 엔도시토시스에서 다이나민의 역할에 영향을 끼쳤음을 보여준다(Raimondi 등, 2011; Armbruster 등, 2013).
종합하면, 우리는 만성 GENUS에 의해 향상된 뉴런 생존이 DNA 손상 반응, 자가 포식, 시냅스 전달, 세포내 수송, 소포 수송 및 감소된 신경염증을 조절하는 데 관여하는 광범위한 유전자 및 단백질의 구조(또는 "수리")에 의해 보조될 가능성이 가장 높은 것을 보여준다. 만성 시각 GENUS의 광범위한 신경 보호 효과를 지지하여 뉴런 생존을 촉진하고 뉴런 기능을 유지하며, CK-p25 마우스에서 향상된 신규 물체 인지와 공간 모리스 수중 미로 및 P301S 마우스 및 5XFAD 마우스에서 향상된 공간 수중 미로 학습 및 기억을 포함하여, 만성 GENUS 이후 여러 마우스 모델에서 행동 수행 능력의 향상을 찾았다. 우리가 개선된 행동 수행 능력을 관찰하는 동안, 만성 GENUS는 C57B1/6J, CK-p25 및 P301S 마우스에서, 마커 코르티코스테론에 의해 분석된 바와 같이 체중(도 11d~11f), 오픈 필드 탐색에 의한 불안 또는 스트레스 반응을 변경하지 않았다(도 11a, 11c, 11g~ 11i). 흥미롭게도, Zhang 등, (2015)은, 만성 2 Hz 시각 자극(4주 동안 일일 6시간)이 인지 성능을 개선하였지만, 3xTg 마우스의 대상 피질에서 Aβ1-42를 변경시키지는 않았음을 입증하였다.
시각 GENUS는 신경염증을 감소시킨다
염증 과정은 AD 및 신경퇴행에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 급성 GENUS는 소교세포의 현저한 형태학적 활성을 유도하는 것으로 이전에 밝혀졌다(Iaccarino 등, 2016). 신경퇴행에서의 소교세포의 특이적 역할은 복잡하며 (유익하거나 해로울 수 있기 때문에) 철저하게 조사되어야 하고, 최근 연구는 소교세포 표현형이 질병이 진행됨에 따라 변형될 수 있음을 밝혔다(Mathys 등, 2017; Lee 등, 2018; Ulland 등, 2017; Deczkowska 등, 2018). 본 개시에서, 우리는 만성 GENUS에 의해 영향을 받는 기본 과정을 보다 면밀하게 조사하기 위해서 면역조직 화학 및 소교세포 특이적 전사체학적 분석을 이용한 자세한 형태학적 분석을 수행하였다. 그러나, 만성 GENUS가 CK-p25 및 Tau P301S 마우스 모델 둘 다에 걸쳐 소교세포 형태, 면역 반응, 및 이화 과정을 변경시킴에도 불구하고, 다양한 형태의 표현형이 있는 것을 발견하였다.
첫째, Iba1 면역 염색은 CK-p25 마우스에서 미세 아교 세포가 매우 증식성(더 많은 소교세포; Mathys 등(2017)과 일치함)이고 함께 덩어리지는 경향이 있으며, 이는 만성 GENUS 이후에 감소된다. 총 소마 및 일차 돌기 부피가 무자극 CK-p25 마우스에서 더 높았던 막대형 소교세포의 부분 집합을 제외하고, 소교세포 돌기의 총 부피가 감소하였고, 만성 GENUS는 이러한 비정상적인 소교세포 표현형을 감소시킨다. 흥미롭게도, 막대 모양의 소교세포는 분산된 뇌 손상 랫트 뇌, 및 외상성 뇌 손상을 가진 인간 대상체에 존재하는 것으로 최근에 보고되었다(Bachstetter 등, 2017; Taylor 등, 2014). 다음으로, 소교세포는 5XFAD 마우스에서 Aβ를 흡수하기 위해 포식 작용 상태로 들어가고, 이것은 감소된 아밀로이드 플라크 수와 연관된 소교세포의 형태학적 변화와 함께, GENUS의 여러 양상(시각, 청각 또는 둘의 복합)에 대해 발생한다(Iaccarino 등, 2016; Martorell 및 Paulson 등, 동반 제출됨). 또한, 소교세포의 식균 상태는 증가된 단백질 분해(GO에 의해 확인된 바와 같은 단밸질 이화 과정)를 동반한다. 소교세포의 염증 반응은 최근에 신경퇴행 및 AD의 맥락에서 조사되었다. 우리의 데이터는, 만성 GENUS가 CK-p25 마우스에서 소교세포의 염증 반응을 감소시켰고, 신경퇴행에서 상향 조절되는 것으로 알려진 적응 면역 시스템 및 MHC 클래스 II에 관련된 것들과 같은 유전자를 하향 조절하는 것을 시사한다(Mathys 등, 2017). 아마도 이러한 감소된 염증 반응의 결과로서, 우리는 만성 GENUS와 함께 시냅스 밀도의 보존을 도시하는 시냅스 마커 vGlut1 및 바순에서의 증가와 동시에, 시냅스 가지치기(pruning)의 마커인, C1q(Hong 등, 2016)에서 감소를 볼 수 있다. 동반된 Martorell 및 Paulson 등의 논문에서, 성상세포 반응을 입증하고, 만성 청각 GENUS와 청각 및 시각 복합 GENUS 이후 성상세포 반응, 및 맥관구조 변화를 입증하는 것을 참고하는 것은 중요하다.
요약하면, 우리의 데이터는 시각적 GENUS가 전뇌의 여러 영역(SS1, CA1, PFC)으로 전파되어 여러 세포 유형(뉴런, 소교세포, 성상세포)에서 반응을 이끌어 낼 수 있음을 입증한다. 시각 자극을 이용한 감마 동조는 신경 장애에 대해 보호 효과를 제공하고 인지 기능을 개선하기 위한 비침습성 전략을 나타낸다. 우리는 만성 시각 GENUS가 뉴런 및 시냅스의 손실을 감소시켰고, 함께 관찰한 행동 개선을 지지하는 시냅스 기능과 연관된 유전자 및 단백질을 변형시켰음을 발견하였다. 본 개시는 다수의 뇌 영역 및 행동에서 AD 병리에 영향을 미치는 AD 마우스 모델에서 만성 시각 GENUS의 신경 보호 효과를 입증하여, 신경보호를 부여하는 GENUS의 전반적인 효능을 나타낸다.
도면의 상세한 설명
도 1a 내지 도 1j는, 개시된 본 발명에 따라, 시각 자극이 시각 피질을 지나 대상체의 다수의 뇌 영역에서 감마 진동을 동조시키는 것을 도시한다.
도 1a에서, 50% 듀티 사이클(12.5 ms 점등 및 12.5 ms 소등)을 갖는 40 Hz 시각 자극을 Arduino 시스템을 사용하여 전달하였다. 무자극 또는 1시간 기간 동안 40 Hz 시각 자극을 받은 C57BL/6J 마우스는, 그 후 마우스를 희생시키고 c-Fos 발현을 위해 뇌를 염색하였다. 생체 내 전기 생리학을 위해 마이크로 드라이브를 별도의 코호트에 이식하였다.
도 1b에서,
c-Fos 발현을 40 μm 두께의 관상 뇌 조각에서 정량하여 뉴런 활성을 평가하였다. 대표적인 c-Fos 면역 염색 이미지. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다. 우측: 40 Hz 시각인 자극은 무자극 마우스에 비해 시각 피질(V1; N = 4마리 마우스/군. 독립 표본 t-검정, T = -7.110, P =0.002), 체성 감각 피질(SS1; T = -5.239, P = 0.006), 해마(CA1; T = -4.989, P = 0.008) 및 전전두엽 피질(CC; T = -2.938, P = 0.01)에서 뉴런 활성 마커 c-Fos를 유의하게 증가시켰다.
도 1c에서, C57BL/6J 마우스 LFP로부터의 출력 스펙트럼을 V1, SS1, CA1 및 PFC로부터 기록하였다. 적색 선은 가시적인 40 Hz 시각 자극 프레젠테이션 동안 기록을 나타내고, 반면 청색 선은 차단된 40 Hz 광 깜박임(LED 어레이는 빛을 차단하기 위해 덮었음; 방법 참조; N = 7마리 마우스)을 나타낸다.
도 1d에서, 그룹 감마 면적 출력(40 ± 5 Hz)을 도 1c로부터 계산하였다. 40 Hz 시각 자극은 대조군 조건(LED 깜빡임이 차단됨)과 비교하여 V1(Wilcoxon-Ranksum, Z = 5.9, P = 3.1 x 10-9), SS1 (Z = 2.4, P = 0.018), CA1 (Z = 3.4, P = 6.9 x 10-4), 및 PFC (Z = 3.3, P = 9.2 x 10-4)에 걸쳐서 유의하게 증가하였다.
도 1e에서, 우리는 C57BL/6J 마우스에 맞춤형 사극관 마이크로 드라이브를 이식하고, 사극관을 CA1으로 조정하고 단일 유닛을 단리하였다. 차트는 차단된 광에서 40 Hz 위상과 40 Hz 자극 주기에 걸쳐 스파이크 확률을 도시한다.
도 1f에서, 광 차단 조건(Oc. LED)에 비해 40 Hz의 시각 자극은 평균 결과 길이(MRL)에 의해 분석된 바와 같이 국소적 LFP에 대한 추체 뉴런 스파이크의 위상 잠금 강도를 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다(N = 24 cells from 4 mice. Wilcoxon-Ranksum, Z = 2.5, P = 0.011).
도 1g에서, 구조들 간에 LFP 간섭은 가중 위상 지연 지수 방법(WPLI; N = 7마리 마우스)을 사용하여 정량화되었으며, 기록 부위를 표시하였다.
도 1h에서, 저 감마 밴드(30~50 Hz) WPLI의 그룹 변화가 도 1g와 관련하여 도시되어 있다. 40 Hz 시각 자극은 V1~CA1(Wilcoxon-Ranksum, Z = 2.2, P = 0.03), V1~SS1(P = 0.021) 및 V1~PFC(Z = 2.5, P = 0.014) 사이의 간섭에 유의한 증가를 유도하였다.
도 1i는 50% 듀티 사이클을 갖는 80 Hz LED 광 전달의 개략도이다(6.25 ms 점등 및 6.25 ms 소등).
도 1j는, 좌측에서는, 차단된 광(Oc. LED) 또는 80 Hz 시각 자극을 받는 C57Bl/6J 마우스에서 V1 LFP의 출력 스펙트럼을 보여준다. 우측에서는, 80 Hz를 중심으로 한(±5 Hz) 출력 면적은 80Hz 시각 자극과 유의한 차이가 없었다(N = 5마리 마우스, Wilcoxon-Ranksum 테스트, Z = 1.2, P=0.22).
도 2a 내지 도 2f는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 40 Hz(이지만 80 Hz는 아님) 시각 깜빡임 자극이 대상체의 시각 피질 너머에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 것을 도시한다.
도 2a는 D54D2 항체의 면역 조직 화학 염색에 의해 시각화되는 바와 같이, 무자극, 7일 동안 하루 1시간씩 40 Hz 또는 80 Hz 시각 자극에 노출된 5XFAD 마우스에서 아밀로이드 플라크 부하를 보여준다. 각각의 조건에서 V1, SS1 및 CA1의 대표적인 이미지, 스케일 바는 50 μm를 나타낸다.
도 2b는 7일 동안 하루 1시간의 GENUS가 V1에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 것을 나타내는 그룹 정량화를 도시하지만, SS1 또는 해마 영역 CA1에서는 아밀로이드 플라크가 유의하게 변경되지 않았다. 80 Hz 시각 자극 노출은 V1 또는 CA1에서 아밀로이드 플라크의 수준을 변경시키지 않은 반면, SS1에서 아밀로이드 플라크는 유의하게 증가하였다. N = 8마리 무자극, 및 40 Hz와 80 Hz군의 각각 6마리 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 51) = 5.378, P = 0.0076. 본페로니의 사후 다중 비교 테스트, *** P < 0.001, * P < 0.05.
도 2c는무자극 또는 22일(하루 1시간)로 연장된 GENUS 프로토콜에 노출된 5XFAD 마우스에서 아밀로이드 플라크 부하의 대표적인 이미지를 보여준다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다.
도 2d는 22일의 GENUS가 V1, SS1, CA1 및 CC에서 아밀로이드 플라크를 유의하게 감소시킨 것을 보여준다. N = 조건 당 6마리 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (1, 40) = 51.00, P < 0.0001. 본페로니의 다중 비교 테스트, *** P < 0.001, ** P ≤ 0.01.
도 2e는 무자극 또는 22일 동안 하루 1시간씩 80 Hz 광 깜박임에 노출된 마우스로부터 가시화되는 V1, SS1 및 CA1 내 아밀로이드 플라크의 대표적인 이미지를 나타내며, 스케일 바는 50 μm를 나타낸다.
도 2f는 도 2e와 관련되었고, V1, SS1 및 CA1에서 아밀로이드 플라크를 정량화하는 그룹 데이터를 도시한다. N 그룹 당 6마리 마우스. 양방향 ANOVA 측정 F (1, 30) = 0.0033, P = 0.9565에서 그룹 간 유의한 차이는 발견되지 않았다.
도 3a 내지 도 3j는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 알츠하이머병 관련 병리를 개선하고 대상체의 신경퇴행을 특히 감소시키거나 예방하는 것을 도시한다.
도 3a는 P301S 마우스에 무자극 또는 22일(하루 1시간) 동안 GENUS 후 면역 조직 화학 및 인단백질체학 분석을 나타내는 실험개요를 제공한다. 자극 요법을 받지 않은 WT 케이지 한배 새끼를 WT 나이브 마우스로 고려하였다.
도 3b는 시각 피질으로부터 S202/T205 인산화 타우 면역 염색을 나타내는 대표적인 이미지를 제공한다. 스케일 바 50 μm. 우측: P301S 타우 마우스는 V1, SS1, CA1 및 CC에서 더 높은 S202/T205 수준을 나타낸 반면, 22일의 GENUS는 조사된 모든 영역에서 S202/T205를 유의하게 감소시켰다. N = 7마리 WT 나이브 마우스, 8마리 무자극 P301S 마우스 및 7마리 GENUS 자극받은 P301S 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 76) = 45.35, P < 0.0001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트, **** P < 0.0001, *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.
도 3c는 시각 피질으로부터의 세린/트레오닌 인산화 타우 단백질의 인단백질체학적 분석을 도시한다. 히트 맵(Heat-map)은 WT 마우스와 비교하여 P301S에서 차등적으로 인산화되는 tau 단백질의 S/T 잔기를 나타낸다. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 322) = 2146, P < 0.0001. 모든 포스포펩티드를 방법에 기술된 바와 같이 맵핑하였다. 히트 맵에 나타낸 타우의 모든 S/T 잔기는 WT 나이브 및 무자극 P301S 사이에서 통계적으로 유의미하였다. 특정 잔기에 대한 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스 사이의 통계적 비교(P 값)가 차트에 도시되어 있다. GENUS는 6개 S/T 부위에서 타우 단백질의 인산화를 감소시켰고 S451에서는 인산화를 증가시켰다. 일반적으로 알려진 인간 tau S/T 부위가 상부에 도시되어 있다.
도 3d는 WT 나이브 및 무자극 또는 GENUS를 받은 P301S 마우스의 시각 피질에서 뉴런 마커 NeuN에 대한 대표적인 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다.
도 3e는 WT 나이브 마우스에 비해 P301S 마우스가 V1, SS1, CA1 및 CC에서 뉴런의 유의한 손실을 나타내는 그룹 데이터를 보여준다. GENUS 자극받은 P301S군은 유의하게 감소된 신경퇴행을 보였다. N = 도 3b에서와 동일함. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 76) = 19.73, P < 0.0001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트, *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.
도 3f는 CK-p25 마우스에서 42일 동안 p25 발현의 유도를 나타내는 실험 개요를 제공한다. 이것은 하나의 실험군에서 하루 1시간씩 GENUS를 동반한 것이고, 무자극 대조군은 실내 조명을 받았다. 자극 요법을 받지 않은 CK(CaMK2α-promoter x tTA) 케이지 한배 새끼를 CK 나이브 마우스로 고려하였다.
도 3g는 유도 42일 후, CK-나이브 마우스, 무자극 마우스 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 간 뇌의 정성적 차이를 보여주는 현미경 사진이다. 우측: CK 나이브 마우스에 비해 CK-p25 마우스는 감소된 뇌 중량(즉, 뇌 위축)을 나타낸 반면, 만성 GENUS는 CK-p25 마우스의 뇌 위축을 부분적으로 완화하였다. N = 13마리 CK 나이브 마우스, 무자극 및 GENUS CK-p25군에 대해 각각 10마리 마우스. ANOVA F (2, 30) = 15.46, P < 0.001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트, **** P < 0.0001, * P < 0.05.
도 3h는 측면 뇌실(외곽선)의 대표적인 이미지와 크기 정량화를 제공하고, 스케일 바는 1000 μm를 나타낸다. 우측: CK 나이브 마우스와 비교하여, CK-p25 마우스는 비정상적인 뇌실 팽창을 나타냈으며, 이는 만성 GENUS 후 유의하게 감소되었다. N = 9마리 CK 나이브와 무자극 및 GENUS CK-p25 그룹의 각각에서 6마리. ANOVA F (2, 18) = 12.36, P < 0.001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트, **** P < 0.0001, * P < 0.05. 도 9e를 또한 참조한다.
도 3i는 WT 나이브 및 무자극 또는 GENUS를 받은 CK-p25 마우스의 시각 피질에서 뉴런 마커 NeuN에 대한 대표적인 이미지를 제공한다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다.
도 3j는 CK-p25 마우스가 V1, SS1, CA1 및 CC에서 심각한 뉴런 손실을 나타내는 반면, 만성 GENUS는 CK-p25 마우스에서 뉴런 손실을 감소시켰음을 보여준다. N = 도 3g에서와 동일함. Two-way ANOVA F (2, 72) = 31.38, P < 0.0001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트 **** P < 0.001, *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.
도 4a 내지 도 4q는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 대상체의 소교세포에서 염증 반응을 감소시키는 것을 도시한다.
도 4a는 무자극 또는 42일 동안 매일 1시간씩 GENUS를 받은 CK-p25 마우스에 관한 것이다. 이어서, 시각 피질의 소교세포는 RNA를 추출하고 서열 분석한 후 서열 형광 활성 세포 분류기(FACS; CD11b 및 CD45 이중 양성 기준 사용)를 사용하여 단리 후, RNA를 추출하고 서열분석하였다. 상이하게 발현된 유전자(DEG)를 화산형 플롯에 도시한다. 그룹 비교는 하부에 도시되어 있다. 좌측: CK 나이브 및 무자극 CK-p25 마우스 간 DEG, N = 그룹 당 4마리. 우측: 무자극 및 GENUS CK-p25 마우스 간 DEG, N = 4마리 마우스 그룹.
도 4b는 식별된 DEG와 관련된 생물학적 과정에 대한 선택된 유전자 온톨로지(GO) 용어를 보여준다. 상측: CK 나이브 마우스에 비해 무자극 CK-p25 마우스에서 상향 조절된(UP) 유전자와 관련된 GO 용어. 하측: CK 나이브 마우스에 비해 무자극 CK-p25 마우스에서 하향 조절된(DOWM) 유전자와 관련된 GO 용어.
도 4c는 DEG와 관련된 선택된 GO 용어를 보여준다. 상측: 무자극 CK-p25 마우스에 비해 GENUS CK-p25 마우스에서 상향 조절된(UP) 유전자와 관련된 GO 용어. 하측: 무자극 CK-p25 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 하향 조절된(DOWM) 것과 관련된 GO 용어.
도 4d는 시각 피질으로부터의 소교세포 마커 Iba1(녹색) 및 CD40(적색) 면역염색을 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. 스케일 바 50 μm. N = 7마리 CK 나이브 마우스, 무자극 및 GENUS 그룹에 대해 각각 6마리 마우스. 화살표 및 화살표 머리는 각각 막대 형태의 수지상 돌기 및 소교세포 돌기의 가지 용적을 나타낸다.
도 4e는 무자극 CK-p25 마우스가 CK 나이브 마우스에 비해 더 많은 수의 Iba1 양성 세포를 나타냈으며, 만성 GENUS는 CK-p25 마우스에서 Iba1 세포 밀도를 유의하게 감소시켰음을 보여준다. ANOVA F (2, 16) = 17.79, P < 0.0001.
도 4f에서, 우리는 Imaris를 사용하여 소교세포의 3차원 렌더링을 수행하였고, 소교세포의 소마 및 돌기의 용적을 정량화하였다. N = 도 4d에서 처러 동일한 수의 마우스로부터 그룹당 73개 소교세포. 그룹 간 어떤 통계적 유의성도 나타내지 않은 소교세포 소마의 용적(크기)의 주파수 분포(Kruskal-Wallis test, H = 0.3529, P = 0.8382).
도 4g는 (막대모양 유사 소교세포를 제외한) 소교세포 돌기의 전체 용적이 CK 나이브 마우스에 비해 무자극 CK-p25 마우스에서 유의하게 낮았음을 보여준다. GENUS 자극받은 CK-p25 마우스는 CK 나이브 마우스에 비해 차이를 보이지 않았다(H = 9.224, P = 0.009).
도 4h는 소교세포 사이의 최소 거리의 정량화를 도시한다. N = 9마리 CK 나이브로부터 68개 소교세포, 6마리 무자극 마우스로부터 131개 소교세포 및 6마리 GENUS CK-p25 마우스로부터 95개 소교세포. 무자극 CK-p25 마우스의 소교세포는 CK 나이브 마우스에 비해 함께 응집된 반면, GENUS는 소교세포 응집을 유의하게 감소시켰다(H = 100.1, P < 0.0001).
도 4i는 막대모양 유사 소교세포의 방사형 기본 돌기의 정량화를 도시한다. N = 9마리 CK 나이브로부터 16개 소교세포, 무자극 및 GENUS CK-p25 그룹 각각 6마리로부터 그룹 당 19개 소교세포. 무자극 CK-p25 마우스에 비해 CK-p25 마우스의 GENUS 후, 로드와 유사한 소교세포의 돌기의 전체적인 용적이 유의하게 감소되었다. ANOVA F (2, 51) = 16.27, P < 0.0001.
도 4j는 CK 나이브 마우스에 비해 무자극 CK-p25 마우스가 인터페론 반응 단백질 CD40의 더 높은 신호 세기를 보인 반면, 만성 GENUS는 CK-p25 마우스에서 CD40 신호를 유의하게 감소시켰음을 보여준다. ANOVA F (2, 16) = 36.84, P < 0.0001.
도 4k는 녹색인 Iba1 및 청색인 Hoechst를 나타내는 시각 피질로부터의 대표적인 이미지를 제공한다. 스케일 바 50 μm. 화살표 머리는 소교세포 돌기의 복잡도를 나타낸다.
도 4l은 WT 마우스에 비해 P301S tau 마우스가 Iba1 양성 세포의 총 개수의 증가되는 경향을 보였으나, 통계학적으로 유의하지 않았음을 도시한다. N = 7마리 WT 나이브 마우스, 8마리 무자극 P301S 마우스 및 7마리 GENUS 마우스. ANOVA F(2,19) = 2.401, P = 0.1190.
도 4m은 소교세포 소마의 크기를 보여주는 주파수 분포 차트이다. N = 7마리 WT 나이브 마우스, 8마리 무자극 P301S 마우스 및 7마리 GENUS 마우스. 그룹 당 총 58개의 소교세포가 분석되었다. 소교세포 소마의 전체 용적은 그룹 간에 다르지 않았다. Kruskal Wallis test H = 0.04269, P = 0.9789.
도 4n은 WT 마우스에 비해 소교세포 돌기의 용적이 P301S 타우 마우스에서 더 작았던 반면, GENUS 자극받은 P301S 마우스는 WT 마우스의 것과 비슷한 돌기 길이를 나타냈다. Kruskal Wallis test H = 7.895, P = 0.0193.
도 4o는 시각 피질으로부터의 C1q (단백질을 모방하는 고전적인 보체 경로) 면역 염색을 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. 스케일 바 50 μm. 상측: N = 7마리 CK 나이브 마우스, 무자극 및 GENUS 자극받은 그룹에 대해 각각 6마리 마우스. 하측: N = 7마리 WT 나이브 마우스, 8마리 무자극 P301S 마우스 및 7마리 GENUS 마우스.
도 4p는 CK 나이브 마우스에 비해 무자극 CK-p25 마우스가 더 높은 C1q 신호 세기를 나타낸 반면, 만성 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스는 C1q 세기가 유의하게 감소하였음을 보여준다. ANOVA F (2, 16) = 13.39, P = 0.0004.
도 4q는 WT 나이브 마우스에 비해 무자극 P301S 마우스가 더 높은 C1q 신호 세기를 나타내고, 만성 GENUS는 임의의 그룹 간에 다르지 않았음을 보여준다. ANOVA F (2, 19) = 6.887, P = 0.005. e, i, j, l, p, q에서 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트 **** P < 0.0001, ** P < 0.01,* P < 0.05, n.s- 유의하지 않음.
도 5a 내지 도 5i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 뉴런에서 시냅스 기능 및 세포내 수송을 변형시키는 것을 도시한다.
도 5a에서, CK-p25 마우스는 무자극 또는 42일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받았다. 시각 피질의 NeuN 양성(100,000) 뉴럭핵을 FACS를 사용하여 단리한 후 RNA 추출 및 서열 분석을 하였다. DEG의 히트 맵. 그룹 당 마우스의 마리 수를 히트 맵에 표시한다. 좌측 상단: CK 나이브 및 무자극 CK-p25 마우스 간 DEG. 좌측 하단: 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 사이의 DEG, 유전자의 개수를 우측에 표시한다. 우측: CK 나이브 마우스와 비교하여 무자극 CK-p25 마우스에서 하향 조절된 유전자와 연관된 생물학적 돌기, 및 CK-p25 마우스에서 GENUS 후 상향 조절된 유전자와 연관된 동일한 생물학적 돌기의 중첩을 보여주는 차트.
도 5b에서, P301S 마우스는 무자극 또는 22일 동안 하루 1시간씩 GENUS 자극을 받았다. 시각 피질의 NeuN 양성(100,000) 뉴럭핵을 FACS를 사용하여 단리한 후 RNA 추출 및 서열 분석을 하였다. 상이하게 발현된 유전자의 히트 맵. 그룹 당 마우스의 마리 수를 히트 맵에 표시한다. 좌측 상단: WT 나이브 및 무자극 P301S 타우 마우스 간 DEG. 좌측 하단: 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 타우 마우스 사이의 DEG, 유전자의 개수를 우측에 표시한다. 우측: CK 나이브 마우스와 비교하여 무자극 P301S 마우스에서 하향 조절된 유전자와 연관된 생물학적 돌기, 및 P301S 마우스에서 GENUS 자극 후 상향 조절된 유전자와 연관된 동일한 생물학적 돌기의 중첩을 보여주는 차트.
도 5c에서, CK-p25 마우스는 무자극 또는 42일 동안 GENUS를 받았다. 총 단백질 발현 및 S/T 인산화 단백질 분석을 TMT 10-plex 키트 및 질량 분석기를 사용하여 시각 피질 조직에 대해 수행하였다. N = 3마리 CK 나이브 마우스, 3마리 무자극 CK-p25 마우스 및 4마리 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스. 상측: 뉴런 특이적 RNA seq(도 5b, 위)로부터 확인된 총 RNA 및 LC-MS/MS로부터 확인된 총 단백질의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. 확인된 단백질의 92.73%를 뉴런에서 발현된 것으로 발견하였다. 하측: 한배 새끼(좌측) 및 GENUS(우측) 대조군에 비해 CK-p25 마우스에서 상이하게 인산화되는 단백질의 화산형 플롯.
도 5d에서, P301S 타우 마우스는 무자극 또는 22일 동안 GENUS 자극을 받았다. 총 단백질 발현 및 S/T 인산화 단백질 분석을 탠덤 질량 태그(TMT) 10-plex 키트(방법 참조) 및 질량 분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 시각 피질 조직에 대해 수행하였다. N = 3마리 WT 나이브, 3마리 무자극 P301S 마우스 및 4마리 GENUS 자극받은 P301S 마우스. 상측: 뉴런 특이적 RNA seq(도 5a, 위)로부터 확인된 총 RNA 및 LC-MS/MS로부터 확인된 총 단백질의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. 확인된 단백질의 91.95%를 뉴런에서 발현된 것으로 발견하였다. 하측: 한배 새끼(좌측) 및 GENUS(우측) 대조군에 비해 P301S 타우 마우스에서 상이하게 인산화되는 단백질의 화산형 플롯. ± 0.2의 배수 변화와 < 0.05의 조정된 P값을 갖는 인산화된 단백질은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
도 5e는 만성 GENUS 후 CK-p25 및 P301S 타우 마우스에서 상이하게 S/T 인산화된 단백질에 대한 GO 용어를 보여준다.
도 5f는 시각 피질로부터 신경필라멘트 중쇄(NFH, 축삭에서 주로 발현되는 뉴런 마커) 및 Ser774 인산화 다이나민1 면역 염색을 보여주는 대표적인 이미지를 보여준다. NFH를 사용하여 뉴런 돌기를 표지하였다. 스케일 바 10 μm. N = 7마리 CK 나이브 마우스, 무자극 및 GENUS 자극받은 그룹에 대해 각각 6마리 마우스. 중앙: CK 나이브에 비해 CK-p25 마우스는 유의하게 더 높은 수준의 pS774-DNM1 신호 세기를 나타내는 반면, CK-p25 마우스에서 GENUS는 이러한 비정상적 인산화를 유의하게 감소시켰다. F (2, 16) = 38.551, P < 0.0001. 본페로니의 다중 비교 테스트, ***P < 0.001, **P < 0.01. 우측: WT 나이브 마우스에 비해 무자극 P301S 타우 마우스는 유의하게 더 높은 수준의 pS774-DNM1 신호 세기를 나타내는 반면, P301S 마우스에서 GENUS는 이러한 비정상적 인산화를 유의하게 감소시켰다. N = 7마리 WT 나이브 마우스, 8마리 무자극 P301S 마우스 및 7마리 GENUS 마우스. ANOVA F (2, 19) = 18.69, P < 0.0001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트 ** P < 0.01, n.s- 유의하지 않음.
도 5g는 CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스의 시각 피질으로부터 소포성 글루탐산 수송체 1(vGlut1)에 대해 면역 염색된 대표적인 뇌 조각을 보여준다. 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.
도 5h는 vGlut1 반점의 발현이 무자극 CK-p25 마우스에서 유의하게 더 낮은 반면, GENUS 자극받은 CK-p25 마우스는 V1, SS1, CA1 및 CC에서 무자극 CK-p25 마우스에 비해 더 높은 수준의 vGlut1 반점을 보여주었음을 나타낸다. N = 9마리의 CK 나이브 마우스, 및 무자극 및 GENUS CK-p25 그룹으로부터 각각 6 마리의 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 72) = 42.06, P < 0.0001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트 **** P < 0.0001, ** P < 0.01,* P < 0.05.
도 5i는, WT 나이브 마우스에 비해 시냅스 반점 vGlut1의 발현이 P301S에서 유의하게 낮았고, GENUS는 P301S의 V1, CA1 및 CC에서 vGlut1 발현을 구조하였음(rescued)을 보여준다. N = 7마리 WT 나이브 마우스, 및 8마리 무자극 P301S 마우스 및 7마리 GENUS 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 76) = 23.67, P < 0.0001. 본페로니 교정으로 사후 다중 비교 테스트 **** P < 0.0001, *** P < 0.001, ** P < 0.01,* P < 0.05.
도 6a 내지 도 6i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 알츠하이머병의 다중 대상체 모델에서 행동을 변형시키는 것을 도시한다.
도 6a에서, p25 발현은 42일 동안 CK-p25의 2개 그룹에서 유도되었고, 그 중 하나만 1시간의 일일 GENUS를 받았다(자극은 9 am~12 pm 사이에 수행되었음). 마우스는 40 일째(OF) 및 41 일째(OR) 오후(3 pm~7 pm)에 오픈 필드(OF) 및 신규 물체 인식(OR) 시험을 받았다. F 및 N은 각각 기존 및 신규 물체를 지칭한다. OF 및 OR 세션의 대표적인 점유 히트 맵을 보여줍니다. 색 수준은 아레나나 물체의 위치 주파수의 범위로 매핑된다(따뜻한 색은 더 긴 시간과 주파수를 나타내는 반면, 차가운 색은 특정 위치에서 더 짧은 시간을 나타냄).
도 6b는 만성 시각 GENUS가 CK-p25 마우스의 불안 수준에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. CK 나이브 마우스, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 간에 OF 아레나의 중심에서 소요시간은 차가움이 다르지 않았다. 그룹 간 ANOVA 효과 F (2, 49) = 1.198, P = 0.3104.
도 6c는 CK 나이브 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스에서 신규 물체에 대한 선호도가 기존 물체보다 유의하게 더 높으나, 비자극 CK-p25 마우스는 선호도를 나타내지 않았음을 보여준다. 기존 및 신규 물체 간 Two-way ANOVA 효과 F (1, 70) = 7.742, P = 0.0069. T-검정; CK 나이브, T = 4.421, P = 0.0001; CK-p25 + 무자극, T = 1.108, P = 0.0946; CK-p25 + GENUS, T = 3.306, P = 0.0017.
도 6d는 42일 동안 GENUS가 있거나 없는 p25 유도 CK-p25 마우스의 모리스 수중 미로 수행 능력을 보여준다(MWM; p25 유도의 36일째와 41일째 사이). 상측: 만성 GENUS는 무자극 CK-p25 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 훈련하는 동안 플랫폼을 찾기 위한 지연시간을 감소시켰다. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 252) = 18.64, P < 0.0001. 하측: 최종 훈련 세션 24시간 후에 수행된 탐침 검사에서 플랫폼 교차 수는 무자극 CK-p25 마우스에 비해 GENUS 자극받은 그룹에서 유의하게 더 높았다(좌측: 그룹 간 효과 F (2, 42) = 5.277, P = 0.0090). 표적 사분면에서 소모된 시간(우측; 그룹 간 효과 F (2, 42) = 6.35, P = 0.0039)이 CK 나이브 마우스에 비해 무자극 CK-p25 마우스에서 유의하게 더 낮았다.
도 6e는 무자극 또는 22일(9 am~ 12pm) 동안 하루 1시간씩 GENUS에 노출된 다음 OF(20일째; 3 ~ 7 pm) 및 OR(21일째) 테스트에서 평가받은 P301S 타우 마우스에 관한 것이다. OF 및 OR 세션의 대표적인 점유 히트 맵을 보여줍니다.
도 6f는 GENUS가 P301S 마우스의 불안 수준에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. OF 중심에서 소모된 시간은 무자극, GENUS 자극받은 P301S 및 WT 나이브 그룹 간에 다르지 않았다(ANOVA F (2, 36) = 1.189, P = 0.3163).
도 6g는 WT, 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스가 모두 신규 물체에 대해 더 높은 선호도를 나타냈음을 보여준다. 기존 및 신규 물체 간 Two-way ANOVA 효과 F (1, 80) = 88.61, P < 0.0001. T-검정; WT 나이브, T = 6.525, P < 0.00001; P301S + 무자극, T = 2.602, P = 0.0054; P301S + GENUS, T = 10.65, P < 0.00001.
도 6h는 WT 나이브, 무자극 또는 GENUS 자극받은 P301S 타우 마우스의 MWM 수행 능력을 보여준다. 상측: 만성 GENUS는 무자극 P301S 마우스에 비해 P301S 마우스에서 훈련하는 동안 플랫폼을 찾기 위한 지연시간을 감소시켰다. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 225) = 3.782, P = 0.0242. 하측: 탐침 검사에서 플랫폼 교차 수(좌측: F (2, 45) = 2.872, P = 0.067) 및 탐침 검사에서 타겟 사분면에서의 시간(우측: F (2, 45) = 3.115, P = 0.054).
도 6i에서, GENUS(22일 동안 매일 1시간)가 있거나 없이 5XFAD 마우스가 MWM 수행 능력에 대해 시험되었다. 좌측: 훈련하는 동안 플랫폼을 찾기 위한 대기 시간. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 273) = 16.97, P < 0.0001. 탐침 검사에서 플랫폼 교차 수(중앙: 그룹 간 효과 F (2, 39) = 4.702, P = 0.0148) 및 타겟 사분면에서 소모 시간(우측: 그룹 간 효과 F (2, 39) = 7.289, P = 0.0020)은 무자극 CK-p25 마우스에서 유의하게 더 낮았다.
도 7a 내지 도 7i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 신경퇴행의 마우스 모델에서 시각 피질 너머에서 감마 진동을 동조시키는 것을 도시한다.
도 7a는 주요도 1c, 1d 후-기록용으로 사용된 마우스에서 기록 부위를 확인하기 위한 전해질 병변을 보여준다. 대표적인 이미지는 V1, SS1, CA1 및 PFC로부터 기록 부위를 보여준다.
도 7b에서, CDK5 활성제 p25는 6 주 동안 CK-p25 마우스에서 유도된 후 마이크로드라이브 이식 및 LFP 기록을 하였다.
도 7c에서, 구역 출력(35~45 Hz)은 V1, CA1 및 PFC에서 동일 연령 WT 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 유의하게 더 낮았다(모든 영역 P < 0.01). 40 Hz 시각 자극은 6주간 유도된 CK-p25 마우스에서 40 Hz 광 깜박임 노출동안 V1(Wilcoxon-Rank sum; P = 0.0022), CA1(P = 0.001) 및 PFC(P = 0.002)에서 40 Hz 출력이 증가하였다.
도 7d에서, 마이크로 드라이브는 8개월령 P301S 타우 마우스에 이식되었다.
도 7e는 V1(P = 6.01E-05) 및 PFC(P = 4.11E-05)에서 40 Hz 광 자극 동안 출력(35~45 Hz)의 유의한 증가가 관찰되었음을 보여준다.
도 7f는 자극을 받지 않거나 42일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받은 C57BL6/J에 관한 것이다. 우측: 40Hz 시각 자극 동안, V1 (Wilcoxon-Ranksum 테스트; P = 1.54E-06), SS1 (P = 2.88E-04), CA1 (P = 0.04) 및 PFC (P = 3.39E-06)에서 35~45Hz 구역 출력의 유의한 증가가 관찰되었다.
도 7g에서, C57BL6/J 마우스는 자극을 받지 않거나 42일 동안 1시간/일씩 GENUS를 받았다. 마우스는 43일째에 40 Hz 시각 자극을 받았고, LFP를 수집하였다. GENUS 동안, 구역 간 유의한 증가가 V1~CA1 (P = 0.002), V1~SS1 (P = 0.008), CA1~PFC (P = 0.04), V1~PFC (P = 0.002) 사이에서 30~50 Hz 저 감마 간섭(가중 위상 지연 지수로 측정됨)이 관찰되었다. CA1 및 SS1 사이에서 저 감마 WPLI에는 차이가 없었다(P = 0.18).
도 7h에서, p25는 6주 동안 CK-p25 마우스에서 유도되었다. 6주째에 유도된 CK-p25 마우스는 (43일째부터) 무자극 또는 42일동안 1시간/일씩 GENUS를 겪었다. 우측: 저 감마 구역 출력(35~45 Hz)에서의 유의한 증가는 CK-p25 마우스[V1, P = 0.0017), CA1 (P= 0.0379), PFC (P= 0.0030)]에서 연구되 모든 뇌 구역에서 관찰되었다(85일째에 측정됨).
도 7i는 V1~CA1 (P < 0.01), CA1~PFC (P < 0.01), V1~PFC (P < 0.01) 사이에서 저 감마 간섭의 유의한 증가가 또한 분명하였음을 보여준다.
도 8a 내지 도 8i는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 시각 피질 너머에서 5XFAD 마우스에서 AD 관련 병리를 감소시키는 것을 도시한다.
도 8a는 시각 깜박임 자극 설정을 보여주는 개략도이다. 발광 다이오드(LED)들의 어레이를 케이지의 개방측에 존재시키고 Arduino 시스템을 사용하여 방형파 전류 패턴을 갖는 40 Hz의 주파수에서 깜박이도록 구동하였다. 마우스는 케이지 내에서 자유롭게 움직이기 때문에(총 바닥 면적 83 in²), 그들이 수신한 광 세기는 약 1500 내지 300 lux 범위이다.
도 8b에서, 10개월령 5XFAD 마우스는 무자극 또는 22일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받았다. 대표적인 이미지는 해마와 체성 감각 피질을 포함한 슬라이스로부터 아밀로이드 플라크는 적색 및 핵 염색 Hoechst는 청색으로 보여준다. 스케일 바 1000 μm. 주요도 2c ~ 2d와 관련된 것.
도 8c에서, 10개월령 5XFAD 마우스는 무자극 또는 22일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받았다. 대표적인 이미지는 대상 피질로부터 아밀로이드 플라크는 적색, 뉴런 마커 NeuN은 녹색 및 핵 염색 Hoechst는 청색으로 보여준다. 스케일 바 50 μm. 주요도 2c ~ 2d와 관련된 것.
도 8d는 GENUS 자극받은 5XFAD 마우스의 플라크 수가 V1, SS1, CA1 및 CC에서 무자극 5XFAD 마우스보다 유의하게 더 낮았음을 보여준다. 주요도 2c ~ 2d와 관련된 것. N = 조건 당 6마리 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (1, 40) = 30.01, P < 0.0001. *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05.
도 8e에서, 동일 연령 WT 한배 새끼에 비해 9개월령 무자극 5XFAD 마우스는 CA1 및 CC에서 뉴런 밀도의 유의미한 감소를 나타냈다. GENUS는 CC에서 5XFAD 마우스의 신경세포 손실을 유의하게 감소시켰다. N = 9마리 WT 나이브, 6마리 5XFAD + 무자극, 및 6마리 5XFAD + GENUS 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 72) = 14.93, P < 0.0001. 본페로니 다중 비교 테스트, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05.
도 8f에서, 10개월령 5XFAD 마우스는 무자극 또는 22일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받았다. 대표적인 이미지는 시냅스 마커 바순을 보여준다. 스케일 바 10 μm.
도 8g에서, 5XFAD 마우스는 CA1 및 CC에서 시냅스 마커 바순 염색에서 유의한 감소를 나타냈고, 이는 40 Hz GENUS에 의해 유의하게 감소하였다. N = 9마리 WT 나이브, 6마리 5XFAD + 무자극, 및 6마리 5XFAD + GENUS 마우스. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 72) = 16.18, P < 0.0001. 본페로니 다중 비교 테스트, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05.
도 8h는 전장 APP 단백질 및 내인성 GAPDH 대조군의 발현 수준을 보여주는 전장 면역 블롯을 제공한다. N = 5마리 WT 나이브 마우스, 3마리 무자극 5XFAD 마우스 및 4마리 GENUS 자극받은 5XFAD 마우스.
도 8i는 WT 나이브 대조군에 비해 APP 단백질 발현이 5XFAD 마우스에서 유의하게 더 높다는 것을 보여준다. 무자극 및 GENUS 자극받은 5XFAD 마우스 간 차이가 없었다. 우리가 APP 단백질의 C/N 단편을 측정하지 않았음을 주목한다. C-말단 특이적 APP 항체, one way ANOVA F (2, 9) = 4.436, P = 0.046. N-말단 특이적 APP 항체, one way ANOVA F (2, 9) = 13.194, P = 0.002. 본페로니 다중 비교 테스트, **P < 0.01.
도 9a 내지 9g는, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 P301S 및 CK-p25 마우스에서 AD 관련 병리를 개선하는 것을 도시한다.
도 9a는 무자극, GENUS 자극받은 P301S 타우 마우스, 및 동일 연령 WT 나이브 한배 새끼의 시각 피질으로부터 총 타우 단백질 및 GAPDH의 발현 수준을 보여주는 전장 면역 블롯을 제공한다. 우측: WT 나이브 마우스에 비해 P301S 타우 마우스에서 전체 타우 발현은 증가된 반면; 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스 간 타우 수준은 다르지 않았다. N = 3마리 WT 나이브, 3마리 무자극 및 4마리 GENUS 자극받은 P301S 마우스. ANOVA F (2, 7) = 173.275, P < 0.0001. 본페로니 다중 비교 테스트, ***P < 0.001.
도 9b는 WT 나이브, 무자극 P301S 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스 사이에서 뇌 중량의 차이가 없었음을 보여준다. WT 나이브 마우스에 비해 P301S 타우 마우스에서 측방향 뇌실의 비정상적인 팽창에 대한 경향이 있었다. ANOVA F(2,19) = 2.761, P = 0.079.
도 9c는 CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스의 시각 피질으로부터 p25 +GFP (융합 단백질), p25, p35 및 GAPDH의 발현 수준을 보여주는 전장 면역 블롯을 제공한다. 우측: 동일 연령의 CK 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 p25+ GFP 단백질의 유의한 증가가 있으나(one way ANOVA, F (2,12) = 13.065, P = 0.002), 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25는 p25+ GFP 발현에서 차이가 없었다. 마찬가지로, CK 나이브 마우스에 비해 p25 발현 수준은 CK-p25 마우스에서 유의하게 더 높았으나, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 간 차이는 없었다(one way ANOVA, F (2, 12) = 3.581, P = 0.025). 본페로니 다중 비교 테스트, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05.
도 9d는 CK 나이브, 무자극 CK-p25 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스에서 시각 피질의 두께를 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. 핵 염색 Hoechst는 청색 및 뉴런 마커 NeuN에 적색으로 표시되어 있다. 우측: 막대 차트는 그룹 사이의 시각 피질 두께의 차이를 보여준다. 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 36) = 12.93, P < 0.0001. 본페로니 다중 비교 테스트, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05.
도 9e는 해마 부피, 피질의 두께 및 뇌실 크기의 변화를 나타내는 CK 나이브, 무자극 및 GNEUS 자극받은 CK-p25 마우스 사이의 정성적 차이를 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. 관련된 주요도 3f ~ 3h.
도 9f는 시험된 모든 뇌 영역에 걸쳐, 무자극 CK-p25 마우스에 비해 GENUS가 p25 +GFP 융합 단백질 발현 수준(p25의 수: GFP 발현 뉴런)을 변경하지 않았고, 그룹 간 독립 표본 t-검정, P > 0.05를 나타낸다.
도 9g는 CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스에서 CA1로부터의 DNA 이중 가닥 브레이크 마커 γH2Ax의 발현을 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. CK 나이브 마우스에서 γH2Ax 양성 핵은 분명하지 않았으며, 따라서 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 사이에서 비교하였다. N = 조건 당 6마리 마우스. 스케일 바 100 μm. 우측: GENUS는 V1 (독립 표본 t-검정; T = 4.418, P = 0.0006), SS1 (T = 2.944, P = 0.013), CA1 (T = 2.664, P = 0.0143) 및 CC (T = 1.883, P = 0.055)에서 γH2Ax 양성 핵을 유의하게 감소시켰다.
도 10a 내지 도 10n은, 개시된 본 발명에 따라, 만성 시각 자극이 소교세포를 변형시키고, 뉴런에서 세포내 수송 및 시냅스 전달을 향상시키는 것을 도시한다.
도 10a는 대표적인 CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스로부터의 FACS에서의 소교세포 분리 프로파일을 보여준다. 관련 주요도 4a, 4c.
도 10b는 대표적인 WT 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 타우 마우스로부터의 FACS에서의 소교세포 분리 프로파일을 보여준다.
도 10c에서, 상이하게 발현된 유전자(DEG)를 화산형 플롯에 도시한다. 그룹 비교는 오른쪽에서 보인다. 상측: WT 나이브 및 무자극 P301S 타우 마우스 간 DEG, N = 그룹 당 5마리 마우스. 중앙 상단: 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스 간 DEG, N = 5마리 마우스 그룹.
도 10d는 확인된 DEG와 관련된 생물학적 과정에 대한 상위7개의 처리된 유전자 온톨로지(GO) 용어를 보여준다. 그룹 비교는 상부에서 보인다.
도 10e는 녹색의 Iba1 및 적색의 CD40를 보여주는 대표적인 이미지를 제공한다. 주요도 4d에 제시된 병합된 이미지는 명확성을 위해 분리되었다.
도 10f는 대표적인 CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스로부터의 FACS에서의 신경핵 분리 프로파일을 보여준다. % NeuN의 그룹 평균 및 SEM은 총 핵에 비교한다: CK 나이브, 50 ± 1.48; 무자극 CK-p25, 40.98 ± 0.719; GENUS 자극받은 CK-p25 마우스, 45.08 ±1.691. ANOVA F (2, 12) = 11.55, P = 0.0016. 본페로니 사후 테스트, CK 나이브 대 무자극 CK-p25, P = 0.001' CK 나이브 대 GENUS 자극받은 CK-p25 P = 0.0609. GENUS는 CK-p25 마우스에서 신경핵의 소실을 감소시켰다.
도 10g는 대표적인 WT 나이브, 무자극 P301S 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스로부터의 FACS에서의 신경핵 분리 프로파일을 보여준다. 발견된 NeuN 양성 핵의 백분율의 그룹 평균 및 평균의 표준 오차(SEM)는 전체 Hoechst 양성 핵과 비교한다: WT 나이브, 52.45 ± 2.03; 무자극 P301S, 45.17 ± 1.18; GENUS 자극받은 P301S, 50.38 ± 2.09. ANOVA F (2,18) = 4.97, P = 0.0191. 본페로니 사후 테스트, WT 나이브 대 무자극 P301S, P = 0.028; WT 무자극 대 GENUS 자극받은 P301S 마우스, P = 0.99. GENUS는 P301S 타우 마우스에서 신경핵의 소실을 감소시켰다.
도 10h는 도 10f 및 10g에서처럼 전체 핵에 비해 뉴런(NeuN) 양성 핵의 백분율을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 상측: WT 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스를 비교하는 막대 그래프. N = 그룹 당 7마리 마우스. ANOVA F (2, 18) = 4.971, P = 0.0191. 하측: CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스를 비교하는 막대 그래프. N = 각 그룹에 대해 5마리 마우스. ANOVA F (2, 12) = 7.72, P = 0.0070.
도 10i에서, 60개의 유전자를 갖는 신경전달 물질 수송 및 소포 매개 수송 클러스터에 기초하여 만성 GENUS 후 P301S 타우 마우스 및 CK-p25 마우스에서 상향조절된 유전자를 선택하였다. 이러한 유전자가 무자극 마우스에 비해 GENUS 후 CK-p25, P301S에서만 또는 두 마우스에서 상향조절되었음을 주목한다(metascape로 분석됨). 단백질-단백질 상호작용 네트워크 지도(Cytoscape V3.6.1 후 Strings로 분석됨; 농축 P값, 6.66E-15)가 긴밀하게 연결된 추가 기능적 농축 GO 용어로 도시되어 있다.
도 10j에서, 무자극 P301S tau-tg 마우스 및 22일동안 1시간/일씩 GENUS 자극받은 마우스로부터의 시각 피질을 S/T 인단백질체학 분석하였다. 히트 맵은 시냅스 전달 및 세포내 수송에 관여하는 무자극 및 GENUS 자극받은 P301S 마우스 사이에서 상이하게 인산화된 단백질을 보여준다.
도 10k에서, 히트 맵은 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 사이에서 시냅스 전달(화학적 시냅틱 전달, 트랜스-시냅스 신호 전달)에 관여하는 상이하게 인산화된 단백질을 나타낸다. 유전자(해당 단백질) 명칭과 특이적 인산화-부위를 나타낸다.
도 10l에서, P301S 타우 마우스는 무자극 또는 22일 동안 GENUS 자극을 받았다. 총 단백질 발현 및 S/T 인산화 단백질 분석을 탠덤 질량 태그(TMT) 10-plex 키트(방법 참조) 및 질량 분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 시각 피질 조직에 대해 수행하였다. N = 3마리 WT 나이브, 3마리 무자극 P301S 마우스 및 4마리 GENUS 자극받은 P301S 마우스. ± 0.2의 배수 변화와 < 0.05의 조정된 P값을 갖는 인산화된 단백질은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. CK-p25 및 P301S 타우 마우스에서 상이하게 S/T 인산화되는 단백질과 관련된 생물학적 과정의 GO 용어를 각각의 대조군 마우스와 비교하였다 .
도 10m -
상측: 웨스턴 블롯은 CK 나이브, 무자극 및 40 Hz GENUS 자극받은 CK-p25 마우스로부터의 pS774 DNM-1, DNM-1, DNM-3 및 GAPDH를 보여준다. pS774DNM-1 수준은 CK 나이브 마우스에 비해 CK-p25 마우스에서 유의하게 더 높은 반면, 40 Hz GENUS는 CK-p25 마우스에서 pS774DNM-1을 유의하게 감소시켰다. N = 4마리 CK 나이브 마우스, 5마리 무자극 CK-p25 마우스 및 4마리 40 Hz GENUS 자극받은 CK-p25 마우스(ANOVA F (2,12) = 5.836, P = 0.021). 하측: 막대 차트는 그룹 차이를 나타낸다. 이것이 독립적인 확인임을 주목한다. 관련된 주요도 5f.
도 10n - 상측: 웨스턴 블롯은 WT 나이브, 무자극 및 40 Hz GENUS 자극받은 P301S 마우스로부터의 pS774 DNM-1, total DNM-1, DNM-3 및 GAPDH를 보여준다. 이것이 독립적인 확인임을 주목한다. *P < 0.05. 관련된 주요도 5f.
도 11a 내지 도 11j는, 개시된 본 발명에 따라, 급성 및 만성 시각 자극의 대상체에 대한 효과의 행동 특성을 도시한다.
도 11a 상측: GENUS가 있거나 없이, 10분 빈에서 C57BL6/J 마우스 점유의 히트맵을 보여준다. 첫 10분의 사전 자극 기준 기간동안 탐색적 행동에서 차이가 분명하지 않았다. N = 그룹 당 6마리 마우스. T-검정, T = 0.3173, P = 0.7576. 유사하게, 40 Hz 자극 기간 전체에 걸쳐 속도의 체계적 변화는 무자극군과 비교했을 때 검출가능하지 않았다. 하측: 플롯은 30분 동안, 매분마다 속도를 나타낸다. Two-way 반복 측정 ANOVA: 30분 이상의 탐험, F (29, 290) = 6.747, P < 0.0001; 무자극 및 GENUS 자극받은 WT 마우스 사이의 상호작용, F (29, 290) = 0.9354, P = 0.5652.
도 11b에서, C57BL6/J 마우스(4개월령)는 무자극 또는 1시간 동안 40 Hz 광 깜빡임 자극을 한 후 즉시 피크로톡신을 주입하고 OF에 놓았다. 좌측: 피크로톡신 주입 후에 이동한 거리는 GENUS 및 무자극군 사이에 차이가 없음을 보여주었다. N = 그룹 당 4마리 마우스. 반복 측정 ANOVA F = 0.527, P = 0.717. 우측: 라시네 스코어. 0점, 정상 행동; 1점, 불이동성 및 강성; 2점, 헤드 보빙; 3점, 앞다리 간헐성 경련 및 지탱; 4점, 연속적인 지탱 및 넘어짐; 5점, 간대강직 발작; 6점, 사망. 무자극 및 GENUS군 간 발작 민감성의 차이는 분명하지 않았다. 반복 측정 ANOVA F = 0.429, P = 0.994.
도 11c에서, 신규 물체의 습관화 3일 후, WT 마우스를 NOR에 대해 시험하였다. 좌측: 30분 기간 동안 매분마다 기존 및 신규 물체를 탐색하는 데 소모된 시간. 신규 물체 식별 비율이 중첩되었다. 중간: 히스토그램은 기존 및 신규 물체의 누적(전체 30분) 탐색을 보여준다. 무자극 및 GENUS 자극받은 마우스 둘 다 기존 물체에 비해 신규 물체를 탐색하느는데 유의하게 더 긴 시간이 소모되었다. 그룹 간에 차이가 없었고, 이는 급성 40 Hz 광 깜박임이 신규 물체를 식별하기 위한 마우스의 능력에 영향을 미치지 않았음을 시사한다. N = 그룹 당 6마리 마우스. 기존 물체에 비해 누적된 신규 물체 선호도: 무자극, T (6) = -13.055, P = 0.00004; GENUS T (5) = -20.818, P = 0.000004. 그룹 간 신규 물체 선호도, t-검정 T = - 0.314, P = 0.760. 우측: GENUS가 WT 마우스에서 운동성 거동을 변경시키지 않음을 보여주는, 총 이동 거리의 히스토그램. 총 이동 거리, t-검정 T = 0.5096, P = 0.6214.
도 11d에서, C57BL6/J 마우스는 무자극 또는 7일 동안 하루 1시간씩 GENUS를 받았다. 마우스의 체중을 7일 및 자극 요법 1일 후 동안 매일 자극 패러다임 1 시간 전에 측정하였다. N = 14마리 무자극 마우스 및 12마리 GENUS 자극받은 마우스. 막대 차트는 7일 간 체중을 보여준다. 두 그룹에서 수일에 걸쳐 체중의 전반적인 증가가 있었으나(F (6,144) = 2.889, P = 0.011), 무자극 및 GENUS 자극받은 그룹 간 체중의 차이는 없었다(F (6, 144) = 1.327, P = 0.249).
도 11e는 WT 나이브 및 P301S tau 마우스 간 체중의 유의한 차이가 있었으나(그룹 간 two-way ANOVA 효과 F (2, 72) = 8.947, P = 0.0003), 무자극 P301S 타우 마우스에 비해 만성 GENUS(22일동안 1시간/일)는 P301S의 체중에 영향을 미치지 않았다. N = 13마리 WT 나이브, 14마리 무자극 및 12마리 GENUS 자극받은 P301S 마우스.
도 11f는 만성 GENUS가 무자극 CK-p25 마우스에 비해 CK-p25 마우스의 체중에 영향을 미치지 않았음을 보여준다(그룹 간 two-way ANOVA 효과 F (2, 122) = 2.487, P=0.0874). N = 25마리 CK 나이브 마우스, 21마리 무자극 및 18마리 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스.
도 11g는 주요도 6f에 관한 것이다. N = 도 6f에서와 동일함. 오픈 필드 테스트에서 총 이동 거리는 그룹 간 유의하였다. ANOVA F (2, 36) = 10.27, P = 0.0003. 그러나, 무자극 P301S에 비해 GENUS 자극받은 P301S 마우스는 차이가 없었다(P > 0.99).
도 11h는 주요도 6b에 관한 것이다. N = 도 6b에서와 동일함. 오픈 필드 테스트에서 총 이동 거리를 보여준다. 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스에서 개방 필드 동안 총 이동 거리는 차이가 없었다. ANOVA F (2, 49) = 0.01552, P = 0.9846.
도 11i - 왼쪽: 혈장 코르티코스테론 수준은 무자극 및 7일의 GENUS 자극받은 WT 마우스 간 차이가 없었다. N = 그룹 당 12마리 마우스. T = 1.17, P = 0.255. 중앙: p25가 CK-p25 마우스에서 유도되는 동안, 마우스는 무자극 또는 42일 동안 매일 1시간씩 GENUS를 받았다. 그룹 당 마우스의 마리 수를 차트에 표시한다. 혈장 코르티코스테론 수준은 CK 나이브, 무자극 및 GENUS 자극받은 CK-p25 마우스 간에 차이가 없었다(F (2, 35) = 0.4871, P = 0.6185). 우측: P301S 타우 마우스(22일 자극)에서 혈장 코르티코스테론은 WT 나이브, 무자극 P301S 및 22일 GENUS 자극받은 P301S 마우스 사이에서 또한 비교가능하였다(F (2, 35) = 0.6874, P = 0.5096). 각 그룹의 마우스 수를 그에 따라 그림에 표시한다.
도 11j는
주요도 7에 관한 것이다. 모든 실험으로부터 모리스 수중 미로 테스트에서 마우스가 수영한 평균 속도. 좌측: CK-p25 마우스에서 6일 간의 훈련 기간에 걸쳐 어떤 그룹들 사이에서도 차이가 없었다(도 7d). 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 252) = 0.3832, P = 0.6821. 중앙: P301S 타우 마우스에서 5일 간의 훈련 기간에 걸쳐 어떤 그룹들 사이에서도 차이가 없었다(도 7h). 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 225) = 0.5726, P = 0.5651. 우측: 수영 속도는 5XFAD 마우스 코호트에 있어서 유의한 차이가 있었다(도 7i). 그룹 간 Two-way ANOVA 효과 F (2, 273) = 24.24, P<0.0001. 본페로니 교정으로 다중 비교. 1일째 내지 4일째에는 차이가 없었다. 5일째: WT 나이브 대 5XFAD + 무자극, P >0.9999. WT 나이브 대 5XFAD + 40 Hz GENUS, P = 0.0022. 5XFAD + 무자극 대 5XFAD + 40 Hz GENUS, P = 0.0483. 6일째: WT 나이브 대 5XFAD + 무자극, P = 0.0005. WT 나이브 대 5XFAD + 40 Hz GENUS, P = 0.0037. 5XFAD + 무자극 대 5XFAD + 40 Hz GENUS, P > 0.9999. 7일째: WT 나이브 대 5XFAD + 무자극, P < 0.0001. WT 나이브 대 5XFAD + 40 Hz GENUS, P = 0.0043. 5XFAD + 무자극 대 5XFAD + 40 Hz GENUS, P = 0.5716.
도 12a 내지 도 12c는, 개시된 본 발명에 따라, 80 Hz에서의 만성 시각 자극이 5XFAD 마우스에서 모리스 수중 미로에 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
도 12a는 22일 동안 하루 1시간씩 80 Hz 자극에 노출된 5XFAD 마우스의 MWM에서 수행 능력을 보여준다. 그룹 당 마우스의 마리 수를 선도표 범례에 표시한다. 훈련하는 동안 플랫폼을 찾기 위한 대기시간은 무자극 및 80 Hz 자극받은 5XFAD 그룹 간 차이가 없었으나(Two-way ANOVA F (2, 180) = 13.33, P < 0.0001), 이 두 그룹은 WT 나이브 마우스에 비해 플랫폼을 찾기 위해 더 많은 시간을 요구하였다.
도 12b는 탐침 검사 동안 플랫폼 교차의 수를 나타낸다. F (2, 30) = 3.622, P = 0.0390. 본페로니 교정으로 다중 비교. *P < 0.05.
도 12c는 탐침 검사 동안 표적 사분면에 소모된 시간이 WT 나이브 마우스에 비해 무자극 및 80 Hz 자극받은 5XFAD 마우스에서 유의하게 적었음을 보여준다. F (2, 30) = 5.643, P = 0.0083. WT 나이브 마우스와 비교하여, 본페로니 교정으로 다중 비교, 자극받은- P = 0.014, 80 Hz- P = 0.0371. *P < 0.05.
실험 및 분석 세부 사항
성상 방법(STAR METHODS)
동물 모델
모든 실험은 매사추세츠 공과 대학의 비교 의학(Comparative Medicine) 부서 동물 관리위원회의 승인을 받았다. C57BL6, Tg(Camk2a-tTA), Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V), Tg(Prnp-MAPT*P301S)PS19, 및 Fos-tm1.1(cre/ERT2)을 Jackson 실험실로 부터 수득하였다. Tg(tetO-CDK5R1/GFP)은 우리 실험실에서 만들어 냈다. 모든 유전자 이식 마우스를 우리의 동물 시설에서 사육하고 유지하였다.
사용된 C57BL/6J 마우스는 3, 10 또는 17개월령이었다. CK-대조군과 및 CK-p25(tetO-CDK5R1/GFP와 함께 사육된 Camk2a-tTA) 마우스를 독시사이클린 함유 먹이로 키웠다. 정상 설치류 먹이를 제공하여 p25-GFP 이식유전자 발현을 유도하였다. 통상적으로, p25 발현을 6주 동안 유도하였다. 실험 시작 시, P301S 타우 마우스의 연령은 7개월이었고 5XFAD 마우스는 9 또는 11개월이었다. 마이크로 드라이브가 이식된 것을 제외하고 모든 마우스를 그룹에 수용하였다(케이지 당 2~ 5마리 마우스). 모든 실험은 동일 연령 한배 새끼를 사용하여 수행하였다. 면역 염색 및 전기생리학적 실험을 도 범례에 정의된 바와 같이 전체 마리 수의 마우스를 사용하여 두 번 수행하였다. 본 명세서에서 기술된 모든 행동 실험(??고 나이든 WT 마우스와 타우 P301S 마우스에서 모리스 수중 미로 제외)을 도 범례에 정의된 바와 같이 동물의 전체 마리 수를 사용하여, 한 번 수행하였다. 샘플 크기를 사전 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않은 대신, 우리는 실험실 설정(Iaccarino 등, 2016; Nott 등, 2016)에서 이전에 출판된 유사한 연구의 그룹 크기를 사용하여 그룹 간 편차가 최소로 유지되도록 선택했습니다. 도 1의 박스 플롯은 중앙, 및 상부(75%) 및 하부(25%) 사분위 범위를 나타낸다. 언급되지 않는 한, 에러 막대를 갖는 도 2 내지 도 6의 모든 플롯은 평균 ± SEM으로 보고되고 모든 샘플은 마우스의 수(N)로서 기록된다.
40 Hz 광 깜박임 자극
광 깜박임 자극은 이전에 기술된 바와 같이 전달되었다(Iaccarino 등, 2016). 마우스는 보관실에서 동일 건물의 인접한 층에 위치한 깜박임 치료실로 수송되었다. 실험을 시작하기 전에 1 시간 동안 희미한 조명 아래에서 습관화한 후, 마우스를 시험 케이지 (침구가 없는 것을 제외하면, 홈 케이지와 유사하고 세 개의 측면을 흑색 시트로 덮음)에 도입 하였다. 마우스는 케이지 안에서 자유롭게 움직일 수 있었으나, 1시간 동안 광 깜빡임 동안 음식이나 물에 접근할 수 없었다. 발광 다이오드(LED)들의 어레이를 케이지의 개방측에 존재시키고 Arduino 시스템을 사용하여 방형파 전류 패턴을 갖는 40 Hz의 주파수에서 깜박이도록 구동하였다. 1시간 동안 40 Hz 광 깜박임 노출 후, 마우스를 그들의 홈 케이지로 복귀시켰고, 다시 유지실로 수송하기 전에 추가 30분 동안 휴식을 취하도록 하였다. 정상적인 실내 조명 조절 마우스는 유사하게 음식 및 물을 제한한 유사한 케이지에 노출되었으나, 그들은 오직 정상 실내 조명만 경험하였다.
조직 준비
면역 조직 화학: 마우스를 40 ml의 빙냉 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 심근 경색시킨 후 PBS에 40 ml의 4% 파라포름알데히드를 넣었다. 브롬을 제거하고 4℃에서 4% PFA로 밤새 고정시키고, 섹션화 전에 PBS로 옮겼다.
웨스턴 블롯팅: 시각 피질을 절개하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고 처리 전까지 -80℃냉동고에 보관하였다. RIPA(50 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1% SDS) 완충제를 갖는 유리 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화하였다. 샘플의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석법을 사용하여 정량하였다. 동일한 농도의 단백질을 제조하고 SDS- 샘플 완충액을 첨가하였다.
면역 조직 화학
뇌를 준비된 초강력 접착제 및 40 μm 섹션을 사용하여 비브라톰 스테이지(Leica VT1000S)에 장착하였다. 조각을 이어서 PBS로 세척하고 0.3% Triton-X100(PBST)가 함유된 PBS에서 준비된 5% 정상 당나귀 혈청을 사용하여 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 완충액을 흡인하고, 조각을 교반기에서 4℃에서 밤새 적절한 일차 항체(신선한 차단 완충액 안에 준비됨)로 배양하였다. 그런 다음, 차단 완충액으로 3회(각각 10분) 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 알렉사 플루오르 488, 555, 594 또는 647의 접합된 이차 항체로 배양하였다. 차단 완충액으로 3회(각각 15분) 세척 및 PBS로 1회(10분) 세척한 후, 조각을 플루오로마운트-G(fluromount-G)(전자 현미경 과학)로 장착하였다.
다음의 이차 항체 조합을 사용하였다: (1) 알렉사 플루오르 488, 594 및 647, (2) 알렉사 플루오르 555 및 647, 및 (3) 알렉사 플루오르 594 및 647.
영상화 및 정량화
이미지는 모든 조건에 대해 동일한 설정에서 5, 10, 20, 40 또는 63배의 대물렌즈를 갖는 LSM 710 또는 LSM 880 공초점 현미경(Zeiss)을 이용하여 획득하였다. 이미지들은 ImageJ 1.42q 또는 Imarisx64 8.1.2(Bitplane, Zurich, 스위스)를 사용하여 정량화하였다. 각 실험 조건에 대해, 표시된 수의 동물로부터 두 개의 관상 섹션을 사용하였다. 마우스 당 두 개의 이미지로부터의 평균값을 정량화를 위해 추가로 사용하였다. 정량화는 가능한 모든 곳에서 유전자형 및 처리 조건에 대해 블라인드 된 실험자에 의해 수행하였다.
NeuN, c-Fos 및 GFP 양성 세포 카운팅: 모든 이미지들은 Z-스택으로 획득되었으며, 이미지 당 10으로 정량화되었다. 모든 두 개의 평균 및 모든 카운트의 합을 ImageJ를 사용하여 연산하였다. P301S 타우-tg 및 5XFAD로부터의 NeuN 카운팅은 처리 조건에 대해 블라인드 된 실험자에 의해 수행되었다.
γH2Ax 양성 세포 카운팅: ImageJ의 다중 지점 도구를 사용하여 세포를 카운팅하였다.
vGlut1, 바순 반점: 63배의 대물 렌즈와 3배의 추가 줌을 사용하는 LSM 880은 이미지를 획득하였다. 시각 및 체성 감각 피질, CA1 방사층으로 부터의 깊은 레이어(주로 4 및 5) 및 복측 대상피질의 레이어 5를 모두 표적화하였다. 단일 평면 이미지를 획득하였다. ImageJ의 입자 카운트 플러그인을 사용하여 vGlut1 반점 수를 정량화하였다.
pS202/T205 타우 세기: 전체 슬라이스 두께 40 μm의 40배 대물 렌즈 z-스택을 갖는 LSM 710을 사용하여(각 필드로부터 40개의 이미지) 획득하였다. 모든 이미지는 압축/축소되었고 신호 세기는 ImageJ에서 측정되었다.
pS774-DNM1 세기: 63배의 대물 렌즈와 추가 3배 줌을 사용하는 LSM 880을, 전체 조각 두께 40 μm(각 필드로부터 40개의 이미지)의 z-스택을 얻는데 사용하였다. 모든 이미지는 압축/축소되었고 반점의 신호 세기는 ImageJ에서 측정되었다.
플라크: D54D2 항체는 전체 플라크 세기를 염색하였고 플라크 수를 유전자형 및 처리 조건에 대해 블라인드 된 실험자에 의해 정량화하였다. 전체 40 μm 조각을 0.5 μm 간격으로 이미지화한 z-스택이었고, 이를 병합하고 ImageJ를 사용하여 신호 세기를 측정하였다. 플라크를 5 μm2의 임계값을 갖는 ImageJ의 입자 분석 도구를 사용하여 카운팅하였다. 모든 플라크 세기 및 플라크 개수 카운팅은 처리 조건에 대해 블라인드 된 실험자에 의해 수행되었다.
C1q 세기: 전체 슬라이스 두께 40 μm의 40배 대물 렌즈 z-스택을 갖는 LSM 710을 사용하여(각 필드로부터 40개의 이미지) 획득하였다. 모든 이미지는 압축/축소되었고 신호 세기는 ImageJ에서 측정되었다.
CD40: 63배의 대물 렌즈를 사용하는 LSM 880을, 전체 조각 두께 40 μm(각 필드로부터 40개의 이미지)의 z-스택을 얻는데 사용하였다. 모든 이미지는 압축/축소되었고 신호 세기는 ImageJ에서 측정되었다.
측방향 뇌실: 5배 대물 렌즈를 갖는 LSM 710 현미경을 사용하여 -2.0 브레그마(부리에서 꼬리)에서 완벽한 관상 조각을 이미지화하였다. ImageJ의 자유형 선택 도구를 사용하여 측방향 뇌실의 전체 영역을 덮는 윤곽선을 그리고 LV의 구역을 측정하였다.
소교세포: Iba1 면역반응성 세포는 소교세포로 간주되었다. 전체 슬라이스 두께 40 μm의 40배 대물 렌즈 z-스택을 갖는 LSM 710을 사용하여(각 필드로부터 40개의 이미지) 획득하였다. Imaris를 이미지의 3D 렌더링을 위해 사용하여 소마 및 돌기 소교세포의 전체 용적을 정량하였다. Iba1 응집 분석을 ImageJ 3D 렌더링 플러그인에서 수행하였다. Iba1 사이의 최소 거리를 이미지의 모든 소교세포마다 계산하였다. 모든 이미지를 압축/축소하고 ImageJ를 사용하여 Iba1 양성 세포의 총 수를 정량 하였다.
피질 두께: 5배 대물 렌즈를 갖는 LSM 710 현미경을 사용하여 완벽한 피질 원주(cortical columns)를 이미지화하였다. 뇌량의 외부 피질 경계와 피질 측면 사이의 거리는 ImageJ를 사용하여 측정되었다.
뇌 중량 측정: 마우스를 PBS에 이어서 4% PFA로 심혈관 관류시키고 뇌를 4% PFA로 밤새 사후 고정시켰다. 뇌를 PBS로 세척하고, 습식 실험실 고정밀 스케일(Mettler Toledo, 1 mg까지 정확)에서 칭량하기 전에 초과분을 제거하였다. 마우스의 또 다른 코호트를 희생시키고, 뇌를 액체 질소 중에 급속 냉동시키고 뇌 중량을 측정하였다. 이러한 두 가지 독립적인 측정에서 CK 나이브 뇌에 뇌 중량을 정규화하였다.
웨스턴 블롯팅
6 내지 8 μg의 단백질을 6, 8, 10 또는 15% 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고 전기영동하였다. 단백질을 아크릴아미드 겔에서 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad)으로 100 V에서 120분 동안 옮겼다. 0.1% Tween-20(PBSTw)을 포함하는 PBS에 희석된 우유(5% w/v)를 사용하여 막을 차단한 다음, 일차 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 PBSTw로 세 번 세척하고 실온에서 60분 동안 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)에 연결된 이차 항체(GE Healthcare)로 배양하였다. PBSTw로 세 번 더 세척한 후, 막을 화학 발광 기질로 처리하고 필름을 현상시켰다. 신호 세기는 ImageJ 1.46q를 사용하여 정량하고, β-액틴, GAPDH 같은 대조군 단백질 또는 인산화 단백질 분석에 상응하는 총 단백질의 값으로 정규화하였다.
마이크로 드라이브 이식 및 생체 내 전기생리학
텅스텐 와이어 전극 구동: 마이크로 드라이브는 퍼플루오로알콕시(perfluoroalkoxy) 코팅된 텅스텐 와이어 전극(50 μm 베어 직경, 101.6 코팅된 직경, A-M Systems) 및 Neuralynx 전극 인터페이스 보드(EIB-36)를 갖는 3D 프린트 드라이브 베이스를 사용하여 맞춤형으로 제작되었다. 폴리이미드 튜브를 사용하여 전극을 보호하고 전기적 소음을 감소시켰다. 전극을 시각 피질(브레그마에 대한 조정, 전방-후방(AP), -3.0; 내측-외측(ML), + 2.0), SS1(AP, -2.0; ML, + 2.3), 해마의 CA1 구역(AP, -1.8; ML, +1.5) 및 전측두엽 피질의 대상 구역(AP, +1.0; ML, +0.2)의 레이어 3 또는 4를 표적하도록 배열하였다. 기준 전극을 소뇌에 넣었다.
사극관 드라이브: 맞춤형 마이크로 드라이브에는 200 내지 250 kU의 임피던스로 금 도금(Neuralynx)된 네 개의 니크롬 사극관(14mm; California Fine Wire Company)이 포함되어 있으며, 한 줄로 배열(등측 해마의 CA3에서 CA1 축을 따라 실행)되어 등 쪽 CA1(AP, -1.8)에 이식되었다. 기준 전극을 해마 위의 섬유관에 배치하였다.
수술: 마우스를 아베르틴(avertin)으로 마취시키고, 정위(stereotactic) 기구에 구속시키고, 시각, 체성 감각 및 전전두?r 피질을 노출시키는 개두술을 실시하였다. 마이크로 드라이브를 이식하고 목표 깊이까지 천천히 하강하였다. 마우스는 4일의 기간 동안 회복하도록 하였다.
생체 내 전기 생리학: 챔버에 2~3일의 습관화 기간 후, 작은 오픈 필드에서 자유롭게 돌아다니도록 허용한 동물로 기록이 시작되었다. 기록 세션은 LED가 40 Hz에서 깜빡임이 있었으나 검정색 아크릴 폴리프로필렌 시트로 완전히 차단되었으며, 즉시 시트를 제거하고 깜빡거리는 LED에 노출된 동물과 함께 추가 10분이 뒤따르는 10~15분 기간으로 구성되었다. Neuralynx SX 시스템(Neuralynx, Bozeman, MT, USA)을 사용하여 데이터를 획득하였으며 신호를 32,556 Hz에서 샘플링하였다. 마이크로 드라이브에 부착된 적색 발광 다이오드를 사용하여 동물의 위치를 추적하였다. 실험의 결과에서, 마우스는 말단 마취를 받았고 전극 위치는 해부학적 위치를 확인하기 위해 각각의 전극을 통해 개별적으로 10초 동안 50 μA 전류로 뇌 조직의 전해 병변에 의해 표시되었다.
스파이크: SpikEsort3D 소프트웨어(Neuralynx)에 제시된, 기록된 스파이크의 3D 돌출부 주위의 클러스터 경계들을 그림으으로써 단일 유닛을 수동으로 분리하였다. 평균 스파이크 폭이 200 μs를 초과하고 복합 스파이크 지수(CSI) ≥ 5인 경우 세포를 추체 뉴런으로 간주하였다.
데이터 분석: LFP를 먼저 표적 샘플링 속도의 Nyquist 주파수에 여과한 후, 20(1628 Hz로)의 인자에 의해 다운 샘플링하였다. 출력 스펙트럼 분석은 50% 중첩을 갖는 500 ms 시간 윈도우를 사용하여 Matlab 내의 pwelch 함수를 사용하여 수행하였고, 동물 속도가 >4 cm/s로 유지되는 LFP 데이터의 세그먼트 만이 분석에 포함되었다. 작은 설치류 뇌에 더욱 적합한 간섭의 척도인, 가중 위상 지연 지수(WPLI)는 용적 전도성 신호에 의한 간섭의 임의의 잠재적 오염을 무효화하기 위해 전술한 바(Vinck 등, 2011)와 같이 사용되었다. 동물 속도가 > 4 cm/s인 기간에 대해서만, 해부학적으로 구별되는 영역에서의 전극 쌍에 대해 WPLI를 계산하였다. 모든 분석은 Matlab을 사용하여 수행하였다.
추체 세포 40 Hz 조절: 스파이크 흥분 횟수와 40 Hz LFP 위상 사이의 관계는 Circular Statistics Toolbox를 사용하여 전술된 바(Middleton and McHugh, 2016)와 같이 계산되었다. 간단히 말해서, 스파이크를 분류하고, 40 Hz를 중심으로 한 cmor 1.5-1 웨이브렛(wavelet)으로 연속 웨이브렛 변환을 사용하여 LFP 트레이스를 여과하여 순간적인 신호 위상 및 진폭을 반환하였다. 스파이크 시간을 선형으로 내삽하여 위상을 결정하고, 감마의 마루 및 골을 각각 0도 및 180도로 정의하였다. 결과적인 위상 값을 비닝하여 20도 간격마다 흥분률을 생성하였다. 세포는 균일한 것과는 유의하게 상이한 분포(P<0.05 circular Rayleigh test)를 가지고, 평균 결과 길이로서 위상 잠금 강도가 계산된 경우에만 위상-잠금 인 것으로 간주되었다.
RNA 시퀀싱
소교세포의 단리: 시각 피질을 신속하게 절개하고 빙냉한 항크스 평형 염류 완충액(Hanks' balanced salt solution)(HBSS)(Gibco by Life Technologies, catalogue number 14175-095)에 넣었다. 조직은 제조사의 프로토콜에 따라 약간의 수정으로 신경 조직 분리 키트(P)(Miltenyi Biotec, catalogue number 130-092-628)를 사용하여 효소적으로 소화되었다. 구체적으로, 조직을 35분 대신에 37℃에서 15분 동안 효소적으로 소화시키고, 생성된 세포 현탁액을 70 μm의 MACS SmartStrainer 대신에 40 μm 세포 여과기(Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, product 352340)를 통과시켰다. 이어서, 제조업자의 권고에 따라 알로피코시아닌(APC)이 접합된 CD11b 마우스 클론 M1/70.15.11.5(Miltenyi Biotec, 130-098-088) 및 피코에리트린(PE)이 접합된 CD45 항체(BD Pharmingen, 553081)를 사용하여 생성된 세포 현탁액을 염색하였다. 이어서 FACS를 사용하여 CD11b 및 CD45 양성 소교세포를 정제하였다. 표준의 엄격한 측면 산란 폭 대 면적 및 전방 산란 폭 대 면적 기준을 사용하여 이중선을 식별하고 단일 선만을 게이팅하였다. 프로피디움 요오드화물(PI)로 염색하고 PI 음성 세포만 게이팅함으로써 생존 세포를 확인하였다. CD11b 및 CD45 이중 양성 엘을 1% β- 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, catalogue number M6250)과 함께 500 μl의 RNA 용해 완충액(QIAGEN, catalogue number 74134)를 함유하는 1.5 ml 원심 분리 튜브로 분류하였다. RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN, catalogue number 74134)를 사용하여 추출하였다. RNA를 용리한 다음 전체 전사체 증폭, 라이브러리 준비 및 시퀀싱까지 -80℃에서 보관하였다.
뉴런의 단리: 시각 피질을 프로테아제 억제제를 갖는 0.5 mL 빙냉한 PBS에서 균질화시키고 현탁액을 1600 g으로 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 5 mL NF-1 저장성 완충액에 재현탁하고, 5분 동안 배양한 다음, 30 스트로크로 다운스 균질화(유봉 A)하였다. 5mL NF-1 완충액을 현탁액에 첨가하고, 10 ml NF-1 완충액으로 유봉을 세척하여 총 20mL를 합하였다. 50개의 원추형 튜브에 모두 수집하고 40 μm 메쉬 필터로 균질물을 여과하였다. 3,000 rpm(1,600 x g)에서 15분 동안 펠렛 핵. 30 mL NF-1 완충액에 재현탁시키고 잘 혼합하였다. 4℃에서 1시간 동안 락킹된 균질물(rocked homogenate). 펠렛을 20 mL NF-1 완충액으로 한 번 세척하고, 3,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하고, 20분간 얼음에서 펠렛을 건드리지 않고 2~5 mL PBS + 1% BSA + 프로테아제 억제제에 재현탁하였다. 알렉사 플루오르 488 또는 알렉사 플루오르 647 접합된 NeuN 항체(1:500)를 튜브에 첨가하고, 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 항체를 PBS + 1% BSA + 프로테아제 억제제로 현탁 및 원심 분리하여 세척하였다. 15분 동안 3,000 rpm으로 핵을 스핀 다운시키고, 0.5 mL(PBS+프로테아제 억제제)에 재현탁하고 FACS 분류를 위해 40 μm 메쉬 필터로 여과하였다. 핵 게이팅을 위해 2방울의 핵 블루 라이브 준비 프로브 시약을 첨가하였다(Thermo Fischer Scientific; Cat. No. R37605). NeuN 이중 양성 엘을 1% β- 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, catalogue number M6250)과 함께 500 μl의 RNA 용해 완충액(QIAGEN, catalogue number 74134)를 함유하는 1.5 ml 원심 분리 튜브로 분류하였다. RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN, catalogue number 74134)를 사용하여 추출하였다. RNA를 용리한 다음 전체 전사체 증폭, 라이브러리 준비 및 시퀀싱까지 -80℃에서 보관하였다.
RNA 라이브러리 준비: 추출된 총 RNA는 라이브러리 준비 전에 고급 분석-단편 분석기(Advanced Analytical-fragment Analyzer)를 사용하여 QC에 적용하였다. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit - Pico Input을 P301S 뉴런, CK-p25 뉴런 및 P301S 소교세포 RNA-seq에 사용하였다. SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit를 CK-p25 소교세포 특이적 RNA-seq에 사용하였다. 라이브러리는 제조업체의 지시에 따라 제조되었으며, MIT BioMicro Center에서 Illumina Nextseq 500 platform에 대해 시퀀싱되었다.
40-bp의 쌍으로 된 서열 시퀀싱 판독의 미가공 fastq 데이터를 STAR2.4를 사용하여 마우스 mm9 기준 게놈에 정렬하였다. 판독의 총 개수 및 정렬된 판독의 백분율은 다음과 같다: CK-p25 뉴런- 총 판독 18094674.857 ± 827050.464개; 85.323 ±0.414로 정렬된 백분율. P301S 뉴런- 총 판독 22792713.18 ± 6308817.636개; 84.45 ± 0.548로 정렬된 백분율. CK-p25 소교세포- 총 판독 28694964.5 ± 435841.6674개; 89.43 ± 0.25로 정렬된 백분율. [P301S 소교세포- 총 판독 18990369.2 ± 1667316.196개; 27.243 ± 4.04로 정렬된 백분율. 이러한 매우 낮은 맵핑률로 인해, 이 실험에는 추가 고려 사항이 필요함]. 맵핑된 판독은 mm9 참조 유전자 주석을 사용하여 Cufflinks2.2(Trapnell 등, 2012)에 의해 처리되어 fr-제2 가닥(연쇄 뉴런 데이터의 경우)으로서 라이브러리 유형을 갖는 전사체 존재비를 추정하였다. p값 < 0.05(뉴런의 경우)를 갖는 Cuffdiff 모듈을 사용하여 그룹 사이의 유전자 차등 발현 테스트를 수행하였다 . 기하학적 방법을 Cuffdiff에 대한 라이브러리 정규화 방법으로서 선택하였다. 소교세포 데이터의 경우, featureCounts 도구를 사용하여 비 가닥 RNA-Seq 데이터로부터 유전자 엑손 수를 정량하고, DESeq2를 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다. 색상 코드화된 산포플롯을 사용하여 상이하게 발현된 유전자 및 다른 유전자에 대한 그룹 FPKM값을 시각화하였다.
상이하게 발현되는 유전자에 대한 복제 발현 FPKM값의 Z-스코어는 상이한 샘플군에 대해 히트맵에서 시각화하였다. 소교세포 특이적 DEG를 위한 유전자 온톨로지는 Metascape 도구를 사용하여 수행하는 반면, 뉴런 특이적 DEG에 대한 것은 TOPPGENE를 사용하여 수행한다.
단백질체학 및 인-단백질체학
샘플 준비, 환원, 알킬화 및 트립신 소화: 시각 피질을 절개하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고 추가 사용까지 -80℃냉동고에 보관하였다. 이어서, 새로 제조된 8 M 우레아 용액과 함께 플라스틱 핸드-헬드 모터 구동 균질기를 사용하여 샘플을 균질화하였다. 샘플의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석법을 사용하여 정량하였다. 1 ml 당 1 mg의 단백질을 포함한 샘플을 준비하여, 분취하고 추가 사용할 때까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 단백질을 56℃에서 1시간 동안 10 mM 디티오트레이톨(DTT)로 환원시키고, 1 시간 동안 실온(RT)에서 50 mM 요오드아세트아미드로 알킬화시키고, pH 8.9에서 100 mM 암모늄 아세트산으로 1 M미만의 우레아로 희석하였다. RT에서 밤새 시퀀싱 등급 트립신(Promega; 50 μg 단백질 당 1 μg 트립신)을 사용하여 단백질을 소화하였다. 아세트산으로 샘플을 산성화함으로써 효소 활성을 켄칭시켰다. 펩티드 혼합물을 탈염시키고 C18 Sep-Pak Plus 카트리지(Waters)에 농축시키고 50% 아세토니트릴, 0.1% 포름산 및 0.1% 아세트산으로 용리시켰다. 용매를 SpeedVac 진공 원심분리기에서 증발시켰다. 각 샘플의 400 μg 분취량을 분취하고 5분 동안 액체 질소에서 동결시키고, -80℃에서 동결 건조하여 보관하였다.
TMT 라벨링: TMT 라벨링 및 포스포펩티드 농축: 동결건조된 펩티드를 TMT-10-plex Mass Tag Labeling Kit(Thermo)로 라벨링하였다. 각각의 TMT 멀티플렉스에 대해, 신경퇴행의 WT, 무자극 및 40 Hz 동조된 마우스 모델로부터의 동일한 양의 펩티드의 조합으로 구성한 혼주된 샘플(pooled sample)을 포함하고, 정규화 채널에 대한 상대적 정량화를 가능하게 하였다. TMT 라벨링의 경우, pH 8.5에서 9개의 마우스 펩티드 분취량 및 하나의 정규화 채널(각 채널에 대해 400 μg 펩티드)로부터의 9개 샘플을 100 μL의 70%(부피/부피) 에탄올, 30% (부피/부피) 0.5 M 트리에틸-암모늄 중탄산염에 재현탁시키고, 실온에서 1시간 동안 40 μL 무수 아세토니트릴에 재현탁된 TMT 시약과 함께 배양하였다. 샘플을 SpeedVac 진공 원심 분리기를 사용하여 농축, 결합 및 농축 건조시켰다.
펩티드 분류: TMT- 표지된 펩티드 펠렛을 고-pH 역상 HPLC를 통해 분류하였다. 펩티드를 100 uL 완충액 A(10 mM TEAB, pH 8)에 재현탁시키고 완충액 B(90% MeCN, 10 mM TEAB, pH 8)를 이용하여 1분/분의 유속으로 90분 구배를 사용하여 4.6 mm x 250 mm 300Extend-C18, 5 um 컬럼(Agilent)에서 분리하였다. 구배는 다음과 같다: 1~5% B (0~10분), 5~35% B (10~70분), 35~70% B (70~80분), 70% B (80~90분). 10분 내지 85분에서 1분 간격으로 75분에 걸쳐 분획을 수집하였다. 분획을 비 연속적으로 15개의 분획으로 연결시켰다(1+16+31+46+61, 2+17+32+47+62, 등). 그 후, 분획은 speed-vac(Thermo Scientific Savant)으로 거의 건조되었다.
포스포펩티드 농축: 포스포펩티드를 제조업체의 지침에 따라 High-Select Fe-NTA 포스포펩티드 농축 키트(Thermo)를 사용하여 15개의 분획 각각으로부터 농축하였다.
액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS): QExactive Plus 질량 분석기(Thermo)를 사용한 나노전기분무 전에 140분의 구배에 걸쳐 전치 칼럼(집에서 제조, 6 cm의 10 μm C18) 및 셀프-팩 5 μm 팁 분석 칼럼(12 cm의 5 μm C18, 신규 물체)을 사용한 역상 HPLC(Thermo Easy nLC1000)으로 펩티드를 분리하였다. 용매 A는 0.1%의 포름산이었고 용매 B는 80% MeCN/0.1% 포름산이었다. 기울기 조건은 0~10% B(0~5분), 10~30% B(5~105분), 30~40% B(105~119분), 40~60% B(119~124분), 60~100% B(124~126분), 100% B(126~136분), 100~0% B(136~138분), 0% B(138~140분)이었고, 질량분석기를 데이터 의존 모드로 작동시켰다. 전체 스캔 MS용 파라미터는 350~2000 m/z에 걸쳐 70,000의 해상도, AGC 3e6 및 최대 IT 50 ms이었다. 전체 MS 스캔은 34의 NCE와 30초의 동적 배제를 갖는 각각의 사이클에서 상위 10개의 전구체 이온에 대해 MS/MS에 의해 이어졌다. 미가공 질량 스펙트럼 데이터 파일(.raw)을 Proteome Discoverer(Thermo) 및 Mascot 버전 2.4.1(Matrix Science)을 사용하여 검색하였다. Mascot 검색 파라미터는: 전구체 이온에 대한 10 ppm 질량 허용오차; 15 mmu의 단편 이온 질량 허용오차; 트립신의 2개의 누락된 분할; 시스테인의 카바미도메틸화인 고정 변형 및 리신과 펩티드 N-말단의 TMT 10plex 변형; 메티오닌 산화, 티로신 인산화, 및 세린/트레오닌 인산화인 가변 변형이 있다. TMT 정량을 Proteome Discoverer를 사용하여 수득하고 제조업자의 지침에 따라 동위원소로 수정하였으며, 각 TMT 채널의 평균으로 정규화하였다. 25보다 크거나 같은 Mascot 점수와 30보다 작거나 같은 격리 간섭(isolation interference)을 갖는 펩티드만 데이터 분석에 포함하였다.
세척된 예비 칼럼을 전기분무 팁(약 1 μm 오리피스)이 통합된 내부 포장 분석 모세관 칼럼[50 μm ID Х 12 cm(5 μm C18 비드로 충진됨)(YMC gel, ODSAQ, 12 nm, S-5 μm, AQ12S05)]과 직렬로 연결하였다. 펩티드를 약 10,000:1의 흐름 분할로, 0.2 ml/분의 유량 속도에서 0.2 M 아세트산 중 9 내지 70%의 아세토니트릴 농도 구배를 140분(포스포펩티드) 또는 90분(총 펩티드) 사용하여 용출시켜서, 약 20 nL/분의 최종 전기 분무 유속을 산출하였다. 각 샘플로부터 총 15개 분획을 수집하였다. 다음과 같은 설정(스프레이 전압, 2 kV; 시스(sheath) 또는 보조 가스 흐름 없음, 가열된 모세관 온도, 250℃; 50%의 S-렌즈 무선 주파수 레벨)을 갖는 Thermo Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Plus 질량 분석기를 사용하여 포스포펩티드를 분석하였다. Q Exactive를 데이터 의존적 취득 모드로 작동시켰다. 전체 스캔 MS 스펙트럼[질량/전하 비율(m/z), 350 내지 2000; m/z 200에서 해상도, 70,000]을 이전의 스캔으로부터의 예측 AGC에 기초하여 3e6 목표값에서 이온의 축적 다음에 Orbitrap 분석기에서 검출하였다. 전체 스캔마다, 15개의 가장 강한 이온이 최대 300 ms의 주입시간과 35,000 해상도를 갖는 고에너지 충돌 해리(higher-energy collisional dissociation)(HCD)에 의해 단리(0.4 m/z의 단리 폭)되고 조각화(충돌 에너지(CE): 32%)되었다. 다음 설정(스프레이 전압, 2 kV; 시스(sheath) 또는 보조 가스 흐름 없음, 가열된 모세관 온도, 250℃을 갖는 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기에서 총 펩티드 분석을 수행하였다. 분석은 데이터 의존적 취득 모드로 수행하였고, 전체 스캔 질량 스펙트럼(m/z 범위 400~2000, 해상도 60,000)은 Orbitrap 분석기(이온 목표값 5x105)에서 검출되었다. 전체 스캔 마다, 10개의 가장 강한 이온이 HCD 세포에서 HCD(CE: 75%)에 의해 단리(단리 폭 3 Da)되고 조각화되었고, iTRAQ 마커 이온 정량화를 위한 Orbitrap(이온 목표값 1x105)에서 검출되었다.
질량 분석 펩티드 맵핑 데이터 분석: 미가공 질량 스펙트럼 데이터 파일을 Proteome Discoverer 버전 1.4.1.14(DB버전: 79)(Thermo)에 로딩하고 Mascot 버전 2.4(Matrix Science)를 사용하여 마우스 SwissProt 데이터베이스에 대해 검색하였다. TMT 리포터 정량을 추출하고 Proteome Discoverer에서 동위원소를 수정하였다. 탠덤 질량 스펙트럼은 전구체 덩어리에 대한 10 ppm의 초기 질량 허용오차 및 단편 이온의 경우 15 mmu와 일치하였다. 시스테인 카바미도메틸화, TMT-표지된 리신 및 단백질 N-말단을 고정된 변형으로서 검색하였다. 산화된 메티오닌, 및 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화를 가변 변형으로서 검색하였다. 최소 펩티드 길이는 7개의 아미노산이었다. 데이터 세트는 전체 펩티드에 대해 20 초과의 이온 점수로 분류되어 펩티드 식별 및 인산화 국소화에서 높은 신뢰도를 보장하고 펩티드에 대해 1% 아래의 (FDR)을 달성하였다. 조 펩티드 분석으로부터 수득된 중간 상대 펩티드 정량화에 기초하여 포스포펩티드 정량화를 표준화하여 TMT-채널 사이의 샘플 양에서 약간의 변화를 교정하였다. 각각의 포스포펩티드에 대해, 상대적 정량화를 각각의 분석된 샘플로부터의 TMT 이온 세기와 포함된 정규화 채널 사이의 비로 표시하였다.
생물정보학 분석: 유의하게 조절된 비율로 발현되고 인산화된 펩티드를 상이하게 식별하기 위해서, 우리는 < 0.05의 수정된 P 값을 가지고 ±20% 차이의 임의 컷오프를 선택하였다. 비조절된 백그라운드 풀은 0.8~1.2의 비율을 갖는 펩티드로 구성되었다. 따라서, 후속 생물정보학 분석은, 각각, 하향 조절 및 상향 조절된 것으로 여겨지는 그들의 정규화 채널에 비해 <0.8 및 >1.2의 비율을 갖는 펩티드를 포함하였다. 단백질 수탁 번호로부터 단백질의 명칭을 Uniprot ID 맵핑 검색 도구를 사용하여 유전자 목록으로 변환하였다. STRING 데이터베이스(버전 10.5)를 사용함으로써 단백질 네트워크를 수득하였다. 텍스트 마이닝(text mining)을 제외한 모든 유효한 상호 작용 소스가 포함되어 높은 신뢰도를 보장하였고, 신뢰도 점수는 0.9 이상 필요하였다. 유전자 온톨로지(GO) 용어 풍부화 분석은 우선 생물정보학 자원인 STRING(http://string-db.org), TOPPGENE(toppgene.cchmc.org) 및 Metascape(http://metascape.org)를 사용하여 생물학적 공정과 관련된 용어에 대해 수행하였고, 그 후 이러한 세 가지 자원으로부터 일반적으로 존재하는 용어를 찾기 위해 수동으로 필터링하였다. TOPPGENE에서 얻은 GO 용어를 보고하였다. 각 개별 마우스 주에 대해(C57BL6/J, CK-p25, P301S tau-tg 및 5XFAD), 분석은 상이하게 조절된 총 펩티드 또는 (상향 및 하향 조절된) S/T 포스포펩티드의 각 풀로부터 유래된 유전자 세트를 포함하였다.
행동
오픈 필드: 마우스를 오픈 필드 상자(치수: 길이 = 460 mm, 폭 = 460 mm, 및 높이 = 400 mm; TSE-시스템)내에 넣고, 아레나의 중심 및 주변 영역에서 소모된 것으로 측정된 시간과 함께 5분 동안 Noldus(Ethovision)를 사용하여 추적하였다.
증가된 십자형 미로(EPM): 마우스를 EPM(임의의 미로 치수: 팔 길이 = 35 cm, 폭 = 5 cm)의 중심 영역에 놓고 10분 동안 Noldus 프로그램을 사용하여 추적하였다. EPM의 각 팔과 중심에서 소모된 시간을 오프라인으로 산출하였다.
CK-p25 및 P301S tau 마우스에서 신규 물체 인지 : 마우스를 오픈 필드 아레나에 넣고 아레나의 중앙에서 소모된 시간을 계산한다. 다음 날, 마우스를 이제는 두 개의 기존 물체(신규 물체이나 다음 세션에서는 익숙해질 것임)가 추가로 포함된 동일한 오픈 필드 상자에 다시 넣었고, 10분 동안 물체를 탐색하도록 하였다. 다음으로, 마지막 탐색 10분 후에 동일한 아레나로 복귀하였고, 두 물체 중 하나가 신규 물체로 교체되었다. 마우스 행동을 7분 동안 모니터링하였다. 기존 및 신규 물체 둘 다를 탐색하는 데 소모된 시간을 Noldus를 사용하여 기록하였고 오프라인으로 연산하였다.
발작 민감성: 마우스에 피크로톡신(i.p 주사)을 주입하고, 오픈 필드 아레나에 놓고 Noldus 및 또한 측면 장착 카메라를 사용하여 30분 동안 기록하였다. 이동거리는 Noldus에서 오프라인으로 계산하였으며, 발작 심각도를 수동으로 채점했다.
모리스 수중 미로: MWM은 공간 학습을 평가하는 테스트이다. MWM은 시각 단서에 의존하여 개방된 수영 아레나 둘레 주변의 시작 위치에서 탐색하여 침수된 탈출 플랫폼을 찾는다. 장치는 수돗물(22℃~ 24℃)로 채워진 원형 풀(직경 122 cm)로 구성되었고, 무독성 백색 페인트를 추가하여 용액을 불투명하게 만들었다. 더 좋은 그립을 위한 무딘 돌출 모서리가있는 탈출 플랫폼(직경 10 cm)을 수위 1인치 아래에 담았습니다. 풀을 N(북), E(동), S(남) 및 W(서)로 표지된 4개의 동일한 사분면으로 나누었다. 마우스를 60초의 검정을 위해, 가장자리 부터, 검정에 걸쳐 무작위 순서로 미로에 넣었다. 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 필요한 시간(대기 시간)을 기록하였다. 탐침 시험은 잠긴 플랫폼은 제거한 마지막 훈련 검정 24시간 후에 수행되었다. 모든 훈련 및 탐침 검정 시험을 Noldus를 사용하여 기록하였다.
CK-p25, P301S 및 5XFAD 마우스로 하여금 오전(12pm 까지)에 GENUS를 겪게 하고 행동 테스트 시간을 하루에 4 시간으로 제한하는 오후(3~7pm)에 MWM에서 테스트하였다. 우리는 훈련 중에 하루에 최소 2회 및 최대 4회의 시험을 사용하여, 엄격한 암/명 주기를 또한 유지하면서 우리가 MWM에서 모든 군을 실행할 수 있도록 보장하였다. 훈련 일수의 차이에도 불구하고, MWM에 사용된 모든 AD 마우스는 비슷한 수의 총 훈련 코스를 수행하였다.
통계적 분석
통계 분석은 SPSS, Matlab 또는 Prism에서 수행하였다. 샘플 크기는 미리 결정되지 않았다. 통계적 유의성은 독립적인 샘플 t-검정, Wilcoxon Rank-sum 검정, 일방향(one-way) ANOVA 또는 본페로니 post-hoc 분석 및 Krushkal Wallis 검정을 통한 양방향(two-way) 반복 측정 ANOVA를 사용하여 계산되었다. 통계학적 유의성을 0.05로 설정하였다.
결론
본 개시의 발명의 양태는 본원에 기술된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 일치하지 않는 경우, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합이 본 개시의 발명의 범위 내에 포함된다.
또한, 다양한 본 발명의 개념이 하나 이상의 방법으로서 구현될 수 있으며, 그 중 하나가 실시예로서 제공되었다. 상기 방법의 일부로서 수행되는 작동은 임의의 적절한 방식으로 주문될 수 있다. 따라서, 구현예는 도시된 것과 상이한 순서로 작동이 수행되도록 구성될 수 있으며, 예시적인 구현예에서 순차적인 작동으로 나타나더라도, 일부 작동을 동시에 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문헌은 그 전체가 참고로 원용된다.
본원에 정의되고 사용된 모든 정의는, 사전적 정의, 참조로서 통합된 문서 내의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 통제하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 수치 값 및/또는 범위와 함께 사용될 때, 일반적으로 인용된 수치 값 및/또는 범위에 가까운 수치 값 및/또는 범위를 지칭한다. 일부 경우에서, 용어 "약" 및 "대략"은 인용된 값의 ±10% 이내를 의미할 수 있다(인용된 값 그 자체를 포함함). 예를 들어, 일부 경우에서, "약 100 [단위]"는 100의 ± 10% 이내(예를 들어, 90 내지 110)를 의미할 수 있다. 다른 경우에서, 용어 "약" 및 "대략"은 인용된 값의 ±5% 이내를 의미할 수 있다(인용된 값 그 자체를 포함함). 또 다른 경우에서, 용어 "약" 및 "대략"은 인용된 값의 ±1% 이내를 의미할 수 있다(인용된 값 그 자체를 포함함). 용어 "약" 및 "대략"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 부정관사("a" 및 "an")는, 달리 명백히 나타내지 않는 한 "적어도 하나"라는 의미로 이해해야 한다.
본원에서 사용된 "및/또는"이라는 문구는, 본 명세서 및 청구범위 내에서, 접합된, 즉 어떤 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소, 중 "둘 중 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해해야 한다. "및/또는"으로 열거된 다중 요소는 동일한 방식, 즉, 접합된 요소 중 "하나 이상의"로 해석되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소들, 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있거나 관련이 없는 다른 요소 이외의 다론 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비한정적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 언급은: 일 구현예에서 A만(선택적으로 B이외의 요소를 포함); 다른 구현예에서, B만(선택적으로 A이외의 요소를 포함); 또 다른 구현예에서는 A 및 B 둘 다(선택적으로 다른 요소를 포함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 있어서 본원에서 사용되는 바와 같이, "또는"은 위에 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 목록에서 물품을 분리할 때 "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것, 즉, 적어도 하나를 포함하되, 하나를 초과하는 숫자 또는 요소 목록, 및, 선택적으로, 추가적인 목록에 없는 물품 또한 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 반대로, 예컨대 "단지 하나의" 또는 "정확하게 하나의", 또는 청구범위에서 사용될 때, "구성되는"과 같이, 명확하게 지시된 용어들 만이, 숫자 또는 요소 목록에서 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 참조할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은, 예컨대 "어느 하나의," "중 하나의," "단지 하나의," 또는 "정확히 하나의" 와 같이 배타적인 용어가 앞에 올 때, 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 하나이되 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용되는 경우, "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같이 통상적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 있어서 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록에 관하여 "적어도 하나의"라는 어구는, 요소 목록 내의 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하되, 요소 목록에 구체적으로 나열된 각 요소 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하고, 요소 목록 내의 요소의 임의의 조합을 배제할 필요는 없다. 이러한 정의는, 또한, 구체적으로 식별된 요소 이외에 상응 요소가 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지 여부와 상관없이, 문구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에 선택적으로 존재할 수 있게 한다. 따라서, 비한정적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 등등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나," 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는: 일 구현예에서, B가 없이, 적어도 하나의 A, 선택적으로는 둘 이상(및 선택적으로 B외의 요소를 포함함); 다른 구현예에서, A가 없이, 적어도 하나의 B, 선택적으로 둘 이상(및 선택적으로 A외의 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 A, 선택적으로 둘 이상, 및 적어도 하나의 B, 선택적으로 둘 이상(및 선택적으로 다른 요소를 포함함); 등을 지칭할 수 있다.
상기 명세서에서와 같이, 청구범위에서 "포함하는(comprising/including)", "갖는(carrying/having)", "함유하는(containing)", "포함되는(involving)", "보유하는(holding)", "구성되는(composed of)" 등과 같은 전환구는, 개방형(open-ended)으로서, 즉, 포함하되 이에 한정되지 않음을 의미한다는 것을 이해해야 한다. "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"의 전환구 만이, 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼 2111.03에 기술된 바와 같이, 폐쇄형 또는 반 폐쇄형 전환구에 상응한다.
Claims (86)
- 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
A) 대상체의 적어도 전전두엽 피질(PFC) 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동조시키기(entrain) 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는, 방법.
- 제2항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 약 40 Hz의 주파수를 갖는, 방법.
- 제3항에 있어서, A)는 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 50% 듀티 사이클을 갖는, 방법.
- 제2항에 있어서, A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파(square wave) 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서,
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지고;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제7항에 있어서, A)는 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제12항에 있어서, A)는 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 대상체의 다수의 뇌 영역은 대상체의 시각 피질, 체성 감각 피질, 해마 및 전전두엽 피질을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, A)는
A1) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동시에 동조시키기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, A1)은
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 30 Hz 내지 50 Hz의 주파수를 갖는 감마 간섭을 유의하게 증가시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 대상체의 다수의 뇌 영역은 대상체의 시각 피질, 체성 감각 피질, 해마 및 전전두엽 피질을 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는, 방법.
- 제18항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 약 40 Hz의 주파수를 갖는, 방법.
- 제16항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제15항에 있어서, A1)은
A2) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 뉴런 활성을 조절하기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제24항에 있어서, A2)는
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 뉴런 활성을 조정하기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제25항에 있어서, 대상체의 다수의 뇌 영역은 대상체의 시각 피질, 체성 감각 피질, 해마 및 전전두엽 피질을 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 약 35 Hz 내지 약 45 Hz의 주파수를 갖는, 방법.
- 제27항에 있어서, A)에서, 만성 시각 자극은 약 40 Hz의 주파수를 갖는, 방법.
- 제24항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제24항에 있어서, A2)는
A3) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 신경퇴행을 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서, A3)은
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 아밀로이드 플라크를 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서, A3)은
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 타우 과인산화를 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서, A3)은
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 뉴런 및 시냅스의 손실을 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서, A3)은
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 뇌 위축을 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서, A3)은
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 뇌실 팽창을 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제40항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제41항에 있어서
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제44항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제45항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제24항에 있어서, A2)는
A3) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 신경염증을 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제47항에 있어서, A3)은
A4) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 적어도 일부 소교세포의 면역 반응을 감소시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제48항에 있어서, A4)는
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 적어도 일부 소교세포를 형태학적으로 변형시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제48항에 있어서, A4)는
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 적어도 일부 소교세포 내 단백질 분해를 증가시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제48항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제51항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제52항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제53항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지고;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제24항에 있어서, A2)는
대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 막 수송(membrane trafficking), 세포내 수송, 시냅스 기능, 신경염증, 세포 자멸 과정, 및 DNA 손상 중 적어도 하나와 관련된 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질을 개선하기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, A1)은
A2) 대상체의 학습 및 기억을 향상시키기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제56항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제58항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제59항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
A) 대상체의 적어도 전전두엽 피질(PFC) 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동조시키기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하되, A)는:
A1) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동시에 동조시키고;
A2) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 신경 활성을 조정하고;
A3) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 신경퇴행을 감소시키고;
A4) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 신경염증을 감소시키고;
A5) 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마를 포함하는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 막 수송, 세포내 수송, 시냅스 기능, 신경염증, 세포 자멸 과정, 및 DNA 손상 중 적어도 하나와 관련된 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질을 개선하고;
A5) 대상의 학습 및 기억을 향상시키기 위해, 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법. - 제61항에 있어서, A)는 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제62항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제63항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제63항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제61항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
A) 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동조시키고 대상체의 다수의 뇌 영역에서 퇴행하는 신경세포 내 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질을 개선하기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법. - 제67항에 있어서, 대상체의 다수의 뇌 영역에서 퇴행하는 신경 내 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질은 막 수송, 세포내 수송, 시냅스 기능, 신경염증, 세포 자멸 과정, 및 DNA 손상 중 적어도 하나와 관련된, 방법.
- 제68항에 있어서, 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질은 대상체의 적어도 시각 피질에서 NueN-양성 신경핵 유래의 유전자를 포함하는, 방법.
- 제69항에 있어서, A)는 대상체의 적어도 시각 피질에서 NueN-양성 신경핵의 손실을 감소시키거나, 이의 백분율을 유지하기 위해 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질은 S/T- 인산화 단백질을 포함하고, A)는 대상체의 적어도 시각 피질에서 S/T-인산화를 감소시키기 위해 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하여 S/T-인산화 단백질을 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제71항에 있어서, S/T-인산화 단백질은 다이나민1(dynamin1, DNM-1)을 포함하고, A)는 DNM-1에서 Ser774 인산화를 감소시키기 위해 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제68항에 있어서, 비정상적으로 변형된 유전자 및 단백질은 유의하게 감소된 반점(puncta)을 갖는 소포형 글루탐산 수송체 1(vGlut1)을 포함하고, A)는 대상체의 다수의 뇌 영역에서 vGlut1 반점을 유의하게 증가시키기 위해 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 제73항에 있어서, 대상체의 다수의 뇌 영역은 대상체의 시각 피질, 체성 감각 피질, 해마 및 전전두엽 피질을 포함하는, 방법.
- 제67항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제75항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제76항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제77항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 치매 또는 알츠하이머병 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
A) 대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 30 Hz에서 50 Hz 사이의 주파수를 갖는 감마 간섭을 유의하게 증가시키기 위해 대상체에게 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하여 대상체의 다수의 뇌 영역에서 동기화된 감마 진동을 동시에 동조시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제79항에 있어서, 대상체의 다수의 뇌 영역은 대상체의 시각 피질, 체성 감각 피질, 해마 및 전전두엽 피질을 포함하는, 방법.
- 제80항에 있어서, A)는 대상체의 적어도 전전두엽 피질 및 해마에서 약 40 Hz의 국소장 전위(LFP)를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제79항에 있어서, A)는 7일이 넘는 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제82항에 있어서, A)는 적어도 22일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제83항에 있어서, A)는 적어도 42일 동안 하루에 적어도 1시간씩 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제84항에 있어서,
A)는 만성 시각 자극을 생성하기 위해 구형파 전류 신호로 발광 다이오드(LED) 어레이를 구동하는 단계를 포함하고;
구형파 전류 신호는 50% 듀티 사이클을 가지며;
구형파 전류 신호의 주파수는 40 Hz이거나 대략 40 Hz인, 방법. - 제85항에 있어서, A1)은
대상체의 다수의 뇌 영역 사이에서 뉴런 활성을 조정하기 위해 약 30 Hz 내지 약 50 Hz의 주파수를 갖는 만성 시각 자극을 비침습적으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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