KR20210013014A - 뇌 신호 및 유전자 발현을 제어하기 위해 신경 활동을 유도하는 시스템 및 방법 - Google Patents
뇌 신호 및 유전자 발현을 제어하기 위해 신경 활동을 유도하는 시스템 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
개체에서 뇌 활동을 제어하는 방법이 여기에 설명되어 있다. 예시적인 방법은 개체에게 자극을 전달하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 자극은 개체의 뇌에서 신경 활성을 유도하고 세포 활성의 적어도 하나의 가용성 매개체 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인 및 / 또는 성장)의 발현을 조절하고, 자극은 1 시간 미만 동안 개체에게 전달된다.
Description
본 출원은 2018 년 3 월 9 일에 출원된 미국 가출원 제 62 / 640,736 호의 혜택을 주장하며 "뇌 면역 신호를 제어하기 위한 신경 활동을 유도하기 위한 시스템 및 방법" 및 2018 년 3 월 27 일에 출원된 미국 가출원 번호 62 / 648,472, "심부 뇌 영역에서 뇌 리듬을 동반하기 위한 감각 자극"이라는 제목으로, 이들의 개시 내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 수여하는 Grant no. 2T32 NS 007480-18에 따라 정부의 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
뇌 염증은 신경 퇴행성 질환, 외상성 뇌 손상 (TBI), 정상 노화 및 정신 분열증 및 자폐증과 같은 발달 장애를 포함한 여러 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 뇌 염증과 유전자 및 단백질 발현을 정확하고 비 침습적으로 조절하는 새로운 방법을 확인하면 질병을 치료하고 뇌 기능의 염증 및 면역 조절 신호를 연구하며 건강한 노화를 촉진하는 능력을 근본적으로 변화시킬 것이다.
감마 활성(예를 들어, 20-80Hz 신경 활성)은 세포가 짧은 시간에 함께 발화하도록 유도함으로써 신경 통신, 시냅스 가소성, 많은 뉴런(신경 코드)에 걸친 정보 코딩을 용이하게 하는 것으로 오랫동안 이론화되어 왔다. 최근 감마 활동에 대한 놀라운 새로운 역할이 발견되었다. 감마 주파수 활동을 유도하면 알츠하이머 병 (AD) 마우스 모델에서 미세 아교 세포 침투 및 아밀로이드 베타 (Aβ) 제거가 모집된다. 중요한 것은 알츠하이머 병 마우스 모델에서 행동 적자, 세포 사멸 및 심각한 플라크 축적 이전에 감마 감쇠가 발견되어 감마 적자가 AD 병리의 필수 구성 요소임을 시사한다. 이때까지 감마 활동이 면역 세포에 미치는 영향은 알려지지 않았다. 감마 활동을 유도하는 것이 뇌의 면역 세포인 미세 아교 세포를 동원한다는 발견은 신경 전기 활동과 뇌의 면역 체계 사이의 가교 역할을 한다. 그러나 이 이전 연구는 감마 활동을 유도한 결과 면역 조절 신호에 변화가 없음을 보여주었다. 또한, 이 이전 작업은 세포 내 수준에서 발생하는 활동을 보여주지 않았다.
본원에 개시된 한 측면에서, 개체에게 자극을 전달하는 단계를 포함하는 개체에서 뇌 활성을 제어하는 방법이 제공되며, 여기서 자극은 개체의 뇌에서 신경 활성을 유도하고 세포 활성의 적어도 하나의 가용성 매개체의 발현을 조절한다 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 및 / 또는 성장 인자와 같은), 자극은 1 시간 미만 동안 개체에게 전달된다. 한 측면에서, 자극은 30 분, 10 분 또는 5 분 미만 동안 개체에게 전달될 수 있다.
또한 자극은 비 침습적 자극 (예를 들어, 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극, 지속적인 감각 자극 또는 이들의 조합). 한 측면에서, 비 침습적 자극은 시각 또는 청각 자극일 수 있다.
한 측면에서, 본원에 개시된 임의의 선행 측면의 뇌 활성을 제어하는 방법은 다음을 추가로 포함한다 : 조절할 단백질을 선택하는 단계; 및 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극 또는 선택된 단백질을 조절하는 일정한 감각 자극 중 하나를 선택하는 단계를 포함한다.
또한 자극이 40Hz 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7 (IL-7), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨-12 p70 (IL-12p70), 인터루킨-12 p40 (IL-12p40), 인터페론 -γ (IFN-γ), LIF, 종양 괴사인자-α (TNF-α), 대식세포 염증성 단백질 1β (MIP-1β) 및 / 또는 에오탁신(Eotaxin)을 포함하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 자극이 무작위 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-10 (IL-10)을 포함하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 자극이 일정한 감각 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-9 (IL-9) 및 / 또는 대식세포 염증성 단백질 1α (MIP-1α)를 포함하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활성을 제어하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 자극이 40Hz 감각 미광 자극 및 무작위 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 감마 인터페론 (MIG), 성장 조절 종양 유전자 -α (GRO-α), LIX (CXCL5), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터루킨-1β (IL-1β, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-15 (IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES) 및 / 또는 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 에 의해 유도된 모노카인을 포함하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하기 위한 방법이 본원에 개시된다.
또한 자극은 40Hz 감각 미광 자극 및 일정한 감각 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체는 인터루킨-13(IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질 1(MCP-1) 및 / 또는 인터루킨-1α(IL-1α)를 포함하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하기 위한 방법이 본원에 개시되어 있다.
또한 자극이 20Hz 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-12 p70(IL-12p70), 인터루킨-12 p40(IL-12p40), 인터페론-γ(IFN-γ), LIF, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 대식세포 염증 단백질 1β(MIP-1β), 에오탁신(Eotaxin), 인터루킨-10(IL-10), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-9(IL-9), 대식세포 염증성 단백질 1α (MIP-1α), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노 카인(MIG), 성장 조절 종양 유전자-α(GRO-α), LIX (CXCL5), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-15(IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 인터루킨-13(IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질(MCP-1) 1 및 / 또는 인터루킨-1α(IL-1α)를 포함하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시되어 있다.
또한 자극이 감각 미광 자극인 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 감각 미광 자극은 시각적 미광 자극 또는 청각 미광 자극 중 적어도 하나인, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하기 위한 방법이 본원에 개시된다.
또한 감각 미광 자극은 시각 및 청각 미광 자극이 결합된, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하기 위한 방법이 본원에 개시된다.
또한 자극이 경두개 전기 자극 또는 경두개 자기 자극인 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시된다.
또한, 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 뇌 활동은 감각 피질 또는 심부 뇌 구조(예 : 해마, 내측 측두엽 또는 전두엽 중 하나) 중 적어도 하나에서 유도된다.
한 측면에서, 자극이 개체의 뇌에서 신경 활동(예를 들어, 감마 신경 활동 및 / 또는 약 20 ~ 80Hz 범위의 신경 활동)을 유도하는 임의의 선행 측면의 뇌 활동을 제어하는 방법이 본원에 개시된다.
한 측면에서, 본원에는 임의의 선행 측면의 뇌 활성을 제어하는 방법이 개시되며, 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체의 뇌에서 질환, 손상, 상태, 감염 또는 정상 노화 중 적어도 하나를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 질환은 신경 퇴행성 질환 (예를 들어, 정신 분열증, 간질, 전측두엽 치매, 혈관성 치매, 양극성 장애, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 자폐증, 근위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 양극성 장애, 허혈 재관류 손상, 다발성 경화증 및 / 또는 우울증)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 신경 퇴행성 질환의 결과로 인한 염증으로 인한 손상. 한 측면에서, 방법은 개체 내에서 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절함으로써 개체의 상태를 치료하는 것을 추가로 포함하는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다.
또한, 임의의 선행 측면의 뇌 활성을 제어하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 방법은 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체의 뇌의 신경 가소성을 유도하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 단백질의 조절이 일시적 이도록 자극의 전달.
한 측면에서, 자극이 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로(예를 들어, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로, 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 (NFκB) 경로, 사이클로옥시게나제(Cyclooxygenase)-2 (COX-2) 경로, 핵 인자 (적혈구-유래 2) 유사 2 (Nrf2) 경로, 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스포스페이트(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) 3- 키나아제 (PI3K) / Akt 경로 또는 야누스 키나아제 (JAK)-신호 변환기 및 전사 활성화제 (STAT) 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 키나아제 경로)를 상향 조절하는, 임의의 선행 측면의 뇌 활성을 제어하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 세포 내 신호 전달에 대한 자극 효과는 적어도 하나의 즉각적인 초기 유전자 (예 : 활성 조절 세포 골격 관련 단백질 (ARC) 또는 Fos 원종양 유전자(C-Fos))의 발현 또는 활성을 조절 (예 : 상향 조절 또는 감소)한다.
한 측면에서, 개체를 자극에 노출시키는 단계를 포함하는, 개체에서 신경학적 상태(예를 들어 정신 분열증, 간질, 전두측두엽 치매, 혈관성 치매, 양극성 장애, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 근위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 및 / 또는 우울증)를 치료하는 방법으로서; 상기 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도하고 개체 내에서 세포 활동의 하나 이상의 가용성 매개체의 발현을 조절하며 자극은 한 시간 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 개체에서 신경학적 상태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
한 측면에서, 자극은 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극, 일정한 감각 자극, 또는 이들의 조합을 포함하는, 임의의 선행 측면의 신경 질환, 손상, 상태 또는 감염을 치료하는 방법이 본원에 개시되어있다.
예를 들어, 한 측면에서, 임의의 선행 측면의 신경 질환, 손상, 상태 또는 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 자극은 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극을 포함하며, 상기 신경학적 상태는 노화, 외상성 뇌 손상, 스트레스, 정신 분열증 및 / 또는 우울증으로 인한 염증성 손상을 포함하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 한 측면에서, 자극이 20Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극을 포함하는, 임의의 선행 측면의 신경학적 질환, 손상, 상태 또는 감염을 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
또한, 개체를 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극, 일정한 감각 자극, 또는 이들의 조합에 노출시키는 것을 포함하는 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 본원에는 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 40Hz 감각 미광 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 상기 세포의 가용성 매개체 활성은 IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-12p70, IL-12p40, IFN-γ, LIF, TNF-α, MIP-1β, 에오탁신(Eotaxin), MIG, GRO-α, IL-13, MCP-1, IL-1α,LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 무작위 감각 미광 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 상기 세포의 가용성 매개체 활성은 IL-10, MIG, GRO-α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 일정한 감각 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 상기 세포의 가용성 매개체 활성은 VEGF, IL-2, IL-5, IL-9, IL-13, MCP-1, IL-1α 및 / 또는 MIP-1α를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 상기 세포 활성의 가용성 매개체는 MIG, GRO-α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES, 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 40Hz 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 상기 세포 활성의 가용성 매개체는 IL-13, MCP-1 및 / 또는 IL-1α을 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
또한, 개체를 20Hz에서 일정하거나 깜박이는 빛에 노출시키는 것을 포함하는 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
개체에서 뇌 면역 조절 신호 전달을 제어하기 위한 또 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어있다. 이 방법은 개체에게 자극을 전달하는 것을 포함할 수 있다. 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도 할 수 있다. 추가로, 자극은 개체 내 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절할 수 있다. 선택적으로, 자극은 분화를 조절하는 세포 내 신호 전달을 조절할 수도 있다.
일부 구현에서, 자극은 비 침습적 자극이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 자극은 비 약리적이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도한다. 대상 뇌의 신경 활동은 적어도 하나의 감각 피질에서 유도 될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 개체의 뇌에서 신경 활동은 해마, 내측 측두엽, 전두엽, 피질 하 구조, 시상, 시상 하부 또는 뇌간 중 적어도 하나와 같은 심부 뇌 구조에서 유도될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 신경 활동은 감마 신경 활동일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 개체의 뇌에서 신경 활동은 약 20 ~ 80Hz 범위의 신경 활동일 수 있다. 선택적으로 개체의 뇌의 신경 활동은 약 40Hz에서의 신경 활동이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체의 뇌에서 질병, 손상, 감염 또는 정상 노화 중 적어도 하나를 치료하는 것을 포함 할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 개체에게 전달되는 자극을 사용하여 신경 퇴행성 질환을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 신경 퇴행성 질환에는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 치매, 전측두엽성 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 다발성 경화증 (MS)이 포함 되나 이에 국한되지 않는다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 방법은 개체 내 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절함으로써 개체의 상태를 치료하는 것을 포함 할 수 있다. 이 질환에는 간질, 정신 분열증, 자폐증, 외상성 뇌 손상 (TBI) 또는 정상 노화가 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체 뇌의 신경 가소성을 유도하는 것을 포함 할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 자극은 약 1 시간 이내에 개체 내에서 면역 조절 신호 전달 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 자극은 약 60 분 이하, 30 분 이하, 또는 5 분 이하 내에 개체 내에서 면역 조절 신호 전달 반응을 유발할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 방법은 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 변조가 일시적 이도록 자극 전달을 제어하는 것을 포함 할 수 있다.
일부 구현에서, 자극은 감각 미광 자극 일 수 있다. 선택적으로 감각 미광 자극의 주파수는 약 40 헤르츠 (Hz)이다. 감각 미광 자극은 시각적 미광 자극 일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 감각 미광 자극은 청각 미광 자극 일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 감각 미광 자극은 결합 된 시각 및 청각 미광 자극 일 수 있다.
대안적으로, 일부 구현에서, 자극은 경두개 전기 자극 또는 경두개 자기 자극 일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 자극은 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로를 상향 조절할 수 있다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로는 표준 키나아제 경로이다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로, 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 (NFκB) 경로, 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 경로, 핵 인자 (적혈구 유래 2)-유사 2 (Nrf2) 경로, 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나아제 (PI3K) / Akt 경로 또는 야누스 키나아제 (JAK)-신호 변환기 및 전사 활성화 자 (STAT) 경로이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 자극은 적어도 하나의 면역 조절 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자의 발현을 변경할 수 있다. 하나 이상의 면역 조절 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자는 단핵구 염증성 단백질 2(MIP-2, 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2, CXCL2), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF, 콜로니 자극 인자 3, CSF3), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5, CCL5) 또는 인터페론 감마 (IFN-γ)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로 또는 추가적으로, 세포 내 신호 전달에 대한 자극 효과는 적어도 하나의 즉각적인 초기 유전자의 발현 또는 활성을 조절 (예를 들어, 상향 조절 또는 감소) 할 수 있다. 적어도 하나의 즉각적인 초기 유전자는 활성 조절된 세포 골격 관련 단백질 (ARC) 또는 Fos 원종양 유전자 (C-Fos)를 포함 할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
다른 시스템, 방법, 특징 및 / 또는 이점은 다음 도면 및 상세한 설명을 검토 할 때 당업자에게 명백하거나 명백해질 수 있다. 이러한 모든 추가 시스템, 방법, 특징 및 / 또는 이점이 이 설명 내에 포함되고 첨부된 청구 범위에 의해 보호되도록 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질은 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수있다. 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 및 그의 변형은 용어 "포함하는" 및 그의 변형과 동의어로 사용되며 개방적이고 비 제한적인 용어이다.
본 명세서에서 사용된 "선택적" 또는 "선택적으로"라는 용어는 이후에 설명되는 특징, 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하며, 설명에는 상기 특징, 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값 및 / 또는 "약" 다른 특정 값으로 표현 될 수 있다. 그러한 범위가 표현될 때, 또 다른 실시 양태는 하나의 특정 값으로부터 및 / 또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행 "약"을 사용하여 근사치로 표현될 때, 특정 값이 또 다른 실시 양태를 형성함을 이해할 것이다. 각 범위의 끝점은 다른 끝점과 관련하여 그리고 다른 끝점과 독립적으로 모두 중요하다는 것이 더 이해 될 것이다. 또한 본원에 개시된 다수의 값이 있고, 각각의 값이 또한 값 자체에 추가하여 특정 값을 "약"으로 본원에 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면 "약 10"도 개시된다. 또한, 값이 "작거나 같음" 값이 개시될 때, "값보다 크거나 같음" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 개시된다는 것이 이해된다. 예를 들어, 값 "10" 이 공개되면 "10보다 작거나 같음" 뿐만 아니라 "10 이상"도 공개된다. 또한 애플리케이션 전체에서 데이터는 다양한 형식으로 제공되며 이 데이터는 데이터 포인트의 모든 조합에 대한 끝점과 시작점 및 범위를 나타낸다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 15가 공개되면, 10 및 15보다 크거나, 크거나 같거나, 작거나, 같거나, 같은 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 2 개의 특정 단위 사이의 각 단위도 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10과 15가 공개되면 11, 12, 13 및 14도 공개된다.
용어 "개체"는 영장류 (예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 쥐, 마우스 및 같은. 일부 구현 예에서, 개체는 인간이다.
"증가"는 더 작은 유전자 발현, 단백질 발현, 증상의 양, 질병, 구성, 상태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭 할 수 있다. 물질이 있는 유전자 산물의 유전적 출력이 물질이 없는 유전자 산물의 출력에 비해 상대적으로 적을 때 물질은 또한 유전자의 유전적 출력을 증가시키는 것으로 이해된다. 또한, 예를 들어, 증가는 증상이 이전에 관찰된 것보다 적도록 장애 증상의 변화일 수 있다. 증가는 통계적으로 유의한 양의 상태, 증상, 활동, 구성의 개인, 중앙값 또는 평균 감소 일 수 있다. 따라서 감소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 % 증가가 될 수 있다 (통계적으로 유의미한 경우).
"감소"는 더 작은 유전자 발현, 단백질 발현, 증상의 양, 질병, 구성, 상태 또는 활성을 초래하는 임의의 변화를 지칭할 수 있다. 물질이 있는 유전자 산물의 유전적 산출물이 물질이 없는 유전자 산물의 산출물에 비해 상대적으로 적을 때 물질은 또한 유전자의 유전적 산출물을 감소시키는 것으로 이해된다. 또한, 예를 들어, 감소는 증상이 이전에 관찰된 것보다 적도록 장애 증상의 변화 일 수 있다. 감소는 통계적으로 유의한 양의 상태, 증상, 활동, 구성의 개인, 중앙값 또는 평균 감소 일 수 있다. 따라서 감소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 % 감소가 될 수 있다(통계적으로 유의미한 경우).
"억제", "억제" 및 "억제"는 활성, 반응, 상태, 질병 또는 기타 생물학적 매개 변수를 감소시키는 것을 의미한다. 여기에는 활동, 반응, 상태 또는 질병의 완전한 절제가 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 이것은 또한 예를 들어 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활동, 반응, 상태 또는 질병의 10 % 감소를 포함 할 수 있다. 따라서, 감소는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 %, 또는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 그 사이의 임의의 감소량일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는", "예방" 및 이의 문법적 변형은 질병 및 / 또는 다음 중 하나 이상의 발병 또는 재발을 부분적으로 또는 완전히 지연 또는 예방하는 방법을 지칭한다. 수반되는 증상 또는 개체가 질병을 습득 또는 재획득하는 것을 금지하거나 개체가 질병 또는 그에 수반되는 하나 이상의 증상을 습득 또는 재취득할 위험을 줄인다.
본 명세서 및 이어지는 청구 범위에서, 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 정의 될 다수의 용어가 참조될 것이다.
이 응용 프로그램 전체에서 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 전체 내용은 이것이 속하는 최신 기술을보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참조로 포함된다. 개시된 참고 문헌은 또한 참고 문헌이 의존하는 문장에서 논의되는 그 안에 포함된 자료에 대해 개별적으로 그리고 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
전술한 바와 같이, 감마 주파수 활성을 유도하는 것은 알츠하이머 병 (AD) 마우스 모델에서 미세 아교 세포 침윤 및 Aβ의 제거를 동원한다. 그리고 감마 결핍은 AD 병리학의 필수 구성 요소가 될 수 있다. 이러한 발견은 감마 진동이 신경 활동과 신경 면역 기능을 촉진하고 조정하는 데 중요한 이중 역할을 한다는 것을 나타낸다. 그러나 감마 활동이 신경 코딩과 신경 면역에서 이러한 이중 역할을 할 수있는 메커니즘은 이전에 완전히 알려지지 않았다. 또한 이전 연구에서는 감마 주파수 활동을 유도한 결과 면역 조절 신호에 변화가 없음을 보여주었다. 본원에 기술된 바와 같이, 감마 진동이 면역 활성과 시냅스 가소성을 모두 조절하는 분자 메커니즘이 확인되었다. 감마 활동은 AD 1-4의 인간과 동물 모델 모두에서 기능 장애를 일으키기 때문에 감마 활동의 역할과 메커니즘을 이해해야 할 충족되지 않은 필요가 있다.
아래에 설명된 예에서, 감마 활성은 동물 (예를 들어, 마우스)에 40Hz 감각 깜박임 (빠른 스트로브 광) 자극을 제공함으로써 비 침습적으로 구동될 수 있다 . 감각 미광 자극은 신경 및 면역 기능을 조절하고 감마 자극에 대한 반응으로 신경 전기 활동을 특성화하는 세포 내 및 세포 외 신호 단백질을 프로파일링하는 기술과 결합된다. 예를 들어, 시각 피질의 세포 내 신호 전달 경로와 면역 조절 사이토카인은 동물을 가벼운 깜박임에 노출시킨 후 프로파일링 되었다. 감각 깜박임은 경로의 하위 집합 (예 : MAPK, NFκB)에서 빠른 스파이크 (예 : 5 분 미만)를 유발하고 한 시간 내에 미세 아교 세포를 조절하는 것으로 알려진 사이토카인의 생산을 증가시킨다. 비슷한 시간 동안 감각 깜박임 노출이 진행되는 동안 신경 전기 활동이 극적으로 증가하여 신경 회로가 가소성을 겪고 있음을 시사한다. 이러한 데이터는 감마 진동이 면역 기능과 시냅스 가소성을 모두 제어하는 유전자를 유도하는 일반적인 세포 내 경로를 유발함을 시사한다 (예 : Fig. 4).
염증, 세포 생존, 가소성 및 기타 세포 기능을 지배하는 신호를 변경하기 위해 뉴런의 전기적 활성을 유도하는 예가 이제 설명된다. 깜빡이는 빛 기술을 사용하여 마우스 뇌의 시각 피질에서 감마 신경 활동을 유도하고 염증 신호에 미치는 영향을 평가했다. 시각 피질 조직의 시스템 분석을 사용하여 수많은 세포 내 염증 신호에 대한 깜박임의 영향을 조사하였다. 40Hz에서의 깜박임(flicker)은 염증 경로의 하위 집합에서 급격한 스파이크 (<5 분)를 유발 한 다음 한 시간 내에 미세 아교 세포를 조절하는 것으로 알려진 염증성 사이토카인의 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는 신경 활동을 유도하는 (및 일부 구현에서 비 침습적으로 신경 활동을 유도하는) 염증을 제어하는 뇌에서 분자 신호를 조작하는 방법으로 사용될 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이러한 염증 경로와 그들이 조절하는 다운스트림 서열 유전자는 생존, 증식, 분화, 가소성 및 신경 발생을 포함한 다양한 유익한 세포 기능을 제어한다. 따라서 뇌 염증을 조절하는 이 접근법은 많은 뇌 질환, 뇌 손상, 감염 및 정상적인 뇌 노화의 영향을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 발견은 임상 및 기초 과학 수준 모두에서 광범위한 영향을 미친다. 예를 들어, 신경 활동을 유도하여 염증 신호를 조절하는 것은 신경 퇴행성 질환 (예 : 알츠하이머 병)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한 염증 신호를 조절하기 위해 신경 활동을 유도하는 것은 염증 신호 (예 : 정신 분열증), 뇌의 면역 반응 및 / 또는 신경 활동과 관련된 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다.
본원에 기재된 연구에 의해 수집된 데이터는 처음으로 감각 자극이 염증 및 세포 생존, 증식 및 분화를 조절하는 세포 내 신호 전달의 변화를 유발한다는 것을 보여준다. 또한, 이 데이터는 감각 깜박임이 빠른 면역 반응을 유도한다는 첫 번째 증거 (몇 분 이내에 시작됨)가 표준 제약 방법보다 훨씬 빠르게 염증 신호를 조작 할 수 있다는 것을 보여준다. 즉, 이 데이터는 염증 신호와 다운스트림 염증 단백질이 시간이 지남에 따라 깜박임에 어떻게 반응하는지 보여준다.
감마 주파수에서 깜박이는 빛은 시각 피질에서 강한 리드미컬 한 신경 활동을 유도하는 데 사용되었다. 빛 깜박임을(flicker) 사용하여 시각 피질에서 감마를 구동하는 야생형 C57Bl / 6 마우스는 감마 신경 활동에 대한 염증 신호 반응을 특성화하기 위해 서로 다른 주파수(즉, 테스트 그룹)에서 빛 깜박임(flicker) 또는 일정한 빛 또는 어두운 챔버(즉, 대조군)에 여러 시간 동안 노출되었다. 도 1A의 예에서 마우스를 5 분, 10 분, 30 분 또는 60 분 동안 깜박임이나 어둠에 노출시킨 다음 뇌를 마우스에서 빠르게 제거하고 시각 피질과 해마를 미세 해부하고 용해시켜 단백질을 추출하십시오. 이것은 도 1B에 나와 있다. 시각 피질은 빛 깜박임에 매우 민감한 것으로 알려져 있지만 해마는 그렇지 않아 내부 통제 역할을 한다.
미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 활성화 된 B 세포 (NFκB) 경로의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서의 변화가 관찰되었다. 이러한 세포 내 경로는 유전자 발현과 단백질 합성을 조절하여 염증을 강력하게 조절한다. 이것은 도 2에 나와 있다. 또한 MAPK 및 NFκB 경로는 세포 생존, 증식 및 세포 분화를 촉진하는 기능도 가지고 있다. 다중 면역 분석 (예 : 텍사스 오스틴의 LUMINEX CORP. 및 EMD MILLIPORE의 다중 분석 시스템 사용)을 사용하여 깜박임 또는 제어 조건에 따른 MAPK 및 NFκB 경로 내의 단백질 인산화를 정량화하였다.
그 결과, 염증 신호에 대한 미광 자극의 여러 주요 효과가 발견되었다. 첫째, 깜박임(flicker) 전 염증 신호 전달은 Atf-2 및 Jnk (Jun kinase)의 인산화가 급격히 일시적으로 (~ 5 분) 증가한 후 신호가 지속적으로 감소한다. 이러한 효과는 도. 3a 및 3b. 도 3b는 자극 60 분 후 MAPK 경로의 명백한 지속적인 감소를 보여준다. 둘째, 깜박임(flicker) 노출 후 약 30 분 이내에 염증성 사이토카인이 증가하고 깜박임(flicker) 시작 후 2 시간 동안 계속 증가한다. 이러한 효과는 도. 3c 및 3d. MAPK 및 NFκB 경로 내의 신호 전달은 사이토카인 발현에 선행하며 면역 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 초기 세포 내 신호는 사이토카인 발현을 촉진하고 후속 신경 염증을 조절하는 메커니즘일 가능성이 높다.
깜박임(flicker) (예를 들어, RANTES, MIP-2 등)에 반응하여 발현되는 사이토카인은 면역 조절 조절제이다. 또한 G-CSF와 같이 깜박임에 반응하여 증가하는 다른 요인은 신경 영양성이다. 따라서 이러한 결과는 감각 깜박임이 뇌 면역 반응뿐만 아니라 세포 생존, 증식, 분화, 가소성 및 신경 발생과 관련된 일련의 신호 전달을 유도한다는 것을 보여준다.
감마 깜박임은 신경 염증, 세포 생존 및 가소성을 제어하는 세포 내 신호 전달을 자극한다. 이러한 기능은 정상적인 뇌 기능에 중요하며 부상 및 질병과 관련된 신경 학적 상태에서 조절이 어렵다. 따라서 이러한 경로의 감마 자극 변조는 수많은 조건에 개입하고 뇌 건강을 촉진하는 강력한 도구이다.
도면의 구성 요소는 반드시 서로에 대해 축척될 필요는 없다. 유사한 참조 번호는 여러 도면에서 대응하는 부분을 나타낸다.
도 1a-1b는 본 명세서에 설명된 구현에 따른 예시적인 실험 프로토콜을 도시한다. 도 1a는 마우스의 테스트 그룹 (위) 및 대조군 (아래)을 예시한다. 도 1b는 예시적인 실험 프로토콜을 예시한다.
도 2는 MAPK 및 NFκB 경로를 예시하는 다이어그램이다. 이러한 경로는 사이토카인 및 성장 인자와 같은 염증 및 세포 행동을 조절하는 단백질을 포함하여 세포 생존 및 단백질 합성을 조절한다.
도 3a-3d는 감각 깜박임이 초기에 어떻게 세포 내 신호 전달을 자극하고 억제하여 사이토카인 및 성장 인자의 발현을 유도 하는지를 보여주는 다이어그램이다. 도 3a는 5-10 분 동안 깜박임에 노출된 마우스에 대한 결과를 예시한다. 이 다이어그램은 해마가 아닌 시각 피질에서 MAPK 경로 및 NFκB에서 Atf-2 및 Jnk (Jun kinase)의 향상된 인산화를 보여준다. 더욱이, MAPK 경로 시그널링은 도 3b에 나타낸 바와 같이 60 분 (분)의 깜박임 후에 억제되었다. 모든 데이터는 z 점수이다. 각 행은 하나의 마우스를 나타내고 각 열은 하나의 분석 물질을 나타낸다. 도 3c 및 3d는 30 분 (도 3c) 또는 60 분 (도 3d) 동안 깜박임에 노출된 마우스에 대한 결과를 나타내며, 이는 특히 MIP-2 및 RANTES를 포함한 다중 면역 조절 사이토카인의 발현 증가를 보여 주었다. 깜박임 60 분 후 MAPK 세포 내 신호 전달이 감소하고 사이토카인 발현이 증가한다. 모든 데이터는 z 점수이다. 각 행은 하나의 마우스를 나타내고 각 열은 하나의 분석 물질을 나타낸다.
도 4는 감마 진동이 세포 생존, 미세 아교 세포 모집 및 학습 및 기억에 필수적인 신경 코드를 포함하는 다양한 기능을 지배하는 유전자를 유도하는 일반적인 세포 내 경로 (예를 들어, MAPK 및 NFκB 경로)를 어떻게 유발 하는지를 보여주는 다이어그램이다.
도 5는 미세 아교 세포를 변형시키고 시각 피질에서 아밀로이드 베타를 감소시키는 감마 시각 깜박임을 예시하는 다이어그램이다. 도 5는 40Hz에서 깜박이는 빛에 노출된 마우스를 보여 주며, 이는 빛이 꺼졌다 켜질때 시각 피질의 신경 스파이 킹을 40Hz (Hz)에서 증가 및 감소시킨다.
도 6a는 별표로 표시된 스파이킹 속도 피크(도 6a, 왼쪽), 자극 또는 미광 자극이 없는 주기적 응답이있는 기록 사이트 백분율(도 6a, 중앙) 및 자극 동안 주기적 기록 사이트에 대한 변조 깊이(도 6a, 오른쪽, n = 772) 분포를 갖는 CA1에서 청각 깜박임의 함수로서 스파이크의 비율을 보여준다. 도 6b는 별표로 표시된 스파이킹(spiking) , 자극 또는 미광 자극이 없는 주기적 응답을 갖는 기록 사이트 백분율(도 6b, 가운데), 자극 동안 주기적 기록 사이트에 대한 변조 깊이 분포를 갖는 CA1의 청각 및 빛 미광 자극에 의한 스파이크 변조를 보여준다(도 6b, 오른쪽, n = 928). 기록 사이트는 주기적 또는 비 주기적 응답을 갖는 것으로 결정되었으며, 주기적 기록 사이트는 스파이킹 속도 피크 (왼쪽 플롯) 사이의 모든 간격이 22.5 - 27.5ms 사이에있는 것으로 정의되었다. **** p <0.0001, 윌콕슨 랭섬(ranksum) 테스트. 4 마리 마우스의 9 개 세션에서 CA1의 12 개 기록 깊이에서 기록 된 데이터.
도 7a-7c는 마우스가 감각적 시각 깜박임에 노출된 후 사이토카인 단백질 발현이 상향 조절됨을 보여주는 다이어그램이다. 도 7a는 60 분의 시각적 깜박임 또는 어둡게 노출된 마우스의 시각 피질에서 정량화 된 32 개의 사이토카인의 히트맵이다 (데이터는 z- 점수). 도 7b는 시각적 깜박임과 어두운 동물을 구별하는 사이토카인 LV1의 축을 식별 할 수 있는 다변량 판별 부분 최소 제곱 회귀 (D-PLSR)의 플롯이다. 도 7c는 깜박임 동물과 어둠을 구별하는 축 LV1을 도시하며, 시각적 깜박임 또는 어둠과 관련되는 사이토카인의 프로파일로 구성된다. 각 막대의 크기가 클수록 상관관계가 커진다.
도 8a-8c는 마우스를 감각적 시각 깜박임에 노출시킨 후 전 염증성 세포 내 신호 전달 상향 조절을 예시하는 다이어그램이다. 도 8a에서 볼 수 있듯이 시각 감각 깜박임 5분 후 MAPK 및 NFκB 경로 내의 신호 증가가 시각 피질에서 관찰되지만 해마에서는 관찰되지 않는다. 도 8b는 다변량 판별 부분 최소 제곱 회귀 (D-PLSR)의 플롯이다. D-PLSR은 시각 피질의 5 분 깜박임과 HPC를 구별하는 LV1 신호 축을 식별한다. 축은 시각적 깜박임과 관련된 MAPK 및 NFκB 신호로 구성되었다. 10 분까지 LV1의 신호는 HPC의 신호와 유사하게 감소하였다. 도 8c는 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 보여준다. IHC는 포스포(phospho)-NFκB가 NeuN 표지된 뉴런 (파란색 : Dapi, 녹색 : NeuN, 빨간색 : NFκB)에 국한된 것으로 나타났다.
도 9a 및 9b는 해마에서 리듬 활동의 특정 주파수를 유도하기 위해 감각 미광 자극을 사용하는 방법을 보여준다. 도 9a에서 동물은 해마에서 신경 활동을 유도하는 감각 깜박임 방법을 최적화하기 위해 많은 세포의 신경 기록을 수행하면서 다양한 형태의 감각 깜박임에 노출된다. 도 9b는 장기간의 감각 깜박임이 미세 아교 세포, 뉴런 간의 기능적 연결, 신경 코드 및 AD 마우스의 결손을 어떻게 변화시키는 지 결정되었음을 보여준다.
도 10a-10d는 5XFAD 마우스에서 감마 결손을 보여준다. 5XFAD 마우스의 SWR 및 감마 활성 결핍은 인지 결핍 및 플라크 축적 (3 개월령)의 증거 이전이다. 이 결손은 APOE3 마우스에 비해 APOE4 마우스의 SWR 동안 감마에서 발견되는 결손과 현저하게 유사하지만 해당 연구에서는 스파이크가 기록되지 않았다 (Gillespie et al. 2016). 도 10a는 5XFAD 마우스 (녹색) 및 WT 한배 새끼 (검은 색)에 대한 시간당 SWR을 보여주고, 도 10b는 SWR 동안 감마가 WT(파란색 영역, 왼쪽), (10C), SWR 동안 감마 전력보다 5XFAD(노란색 영역, 왼쪽)에서 더 강함을 보여주는 평균 SWR 트리거 스펙트로그램을 보여주며, 위 : 감마 위상의 함수로서 SWR 중 스파이크 비율 (평균 +/- sem). 아래 : SWR 동안 감마 스파이킹 변조의 깊이. 모든 통계 테스트는 윌콕슨 순위 합계 검정이였다.
도 11a-11c는 헤드 고정 기록 및 행동 방법을 보여준다. 도 11a는 가상 현실 (VR) 행동 패러다임에서 머리 고정 마우스가 구형 트레드밀에서 실행되는 동안 가상 환경이 그의 주변 화면에 투영되고 그의 움직임에 따라 업데이트 되는 것을 보여준다. 헤드 고정 방식은 높은 처리량의 신경 기록을 용이하게 한다. 도 11b는 각 채널 (오른쪽)에서 기록된 스파이크(spikes)가 있는 단일 생크(shank) 32 채널 실리콘 프로브 (왼쪽)와 다른 색상으로 표시된 다른 단일 셀을 보여준다. 도 11c는 전형적인 LFP 트레이스를 보여준다. 이 접근 방식을 사용하여 로컬 필드 전위가 기록되어 (SWR, 감마 및 기타 진동을 감지하기 위해) 많은 단일 세포가 동시에 급증하고 이러한 기록을 광 유전학적 자극과 결합하였다.
도 12a-12c는 단일 뉴런에서 스파이킹 활성의 전기 생리학적 기록을 보여준다. 도 12a는 32 채널 실리콘 프로브를 사용하는 하나의 HPC 기록에서 전형적인 스파이크 (점) 클러스터를 보여준다. 이 기록은 54개의 잘 분리된 클러스터를 산출했다. 각각 다른 색상의 다섯 가지 예제 클러스터가 표시된다. 도 12b는 4개의 예시적인 클러스터에 대해 여기에 도시된 시간 경과에 따른 발사 속도가 60 분 기록 동안 안정적임을 보여준다. 도 12c는 스파이크 파형 폭과 평균 발사 속도를 기준으로 추정되는 인터뉴런과 피라미드 형 세포를 구별할 수 있음을 보여준다. 추정 피라미드 세포는 더 넓은 스파이크 폭과 더 낮은 발사 속도 (플롯의 오른쪽 하단에 있는 점)를 갖는 반면, 추정 인터뉴런은 좁은 스파이크 폭과 넓은 범위의 발사 속도 (플롯 왼쪽에 있는 점)를 가지고 있다. 플롯은 추정 내부 뉴런과 피라미드 세포의 두 가지 분명하게 구별되는 분포를 보여준다. 추정 PV 인터 뉴런은 빠르게 급증하며 이 기록은 추정 PV 인터뉴런 2 개 (왼쪽 상단에 두 개의 점) 만 산출했다. 뉴런 유형은 광 유전학적 태깅으로 확인된다.
도 13은 신경 활동을 동반하기 위해 다양한 형태의 감각 깜박임을 테스트하는 것을 보여준다. 동물은 청각 깜박임만, 시각적 깜박임만, 두 자극이 동시에 켜지는 (동상 다중 모드 깜박임) 청각 및 시각적 깜박임과 청각 및 빛 자극이 주기의 절반만큼 상쇄되는 청각 및 시각적 깜박임에 노출된다. (오프셋 위상 다중 모드 깜박임).
도 14는 감각 깜박임의 상이한 주파수의 효과를 보여준다. 예비 연구에서 HPC의 스파이 킹은 깜박임 없음 (오른쪽 끝) 또는 무작위 깜박임 제어에 비해 20Hz (왼쪽 끝), 40Hz (왼쪽 가운데) 및 80Hz (오른쪽 가운데)에서 결합된 청각 및 시각적 깜박임에 의해 변조된다. 히스토그램은 빛과 톤의 기능으로 스파이크의 비율을 보여준다 (위). 피크는 별표로 표시된다. 모든 연구에서 동물은 10, 20, 40, 60, 80, 100Hz 깜박임의 10 초 블록에 노출된다.
도 15a-15d는 VR 학습 패러다임을 보여준다. 동물이 보상을 받기 위해 올바른 위치 또는 보상 구역을 핥아야하는 새로운 VR 행동 패러다임이 개발되었다 (15a 및 15b). 동물은 훈련보다 보상을 찾을 수 있는 올바른 장소를 배우고 (보상 구역에서 더 많이 핥고 (15c), 시각적 신호를 사용하여 작업을 해결한다 (시각적 신호없이 더 나쁘게 수행함, (15d)). 도 15a는 흰색 화살표로 표시된 보상 구역이 있는 트랙을 보여준다. 도 15b는 훈련 첫날 (왼쪽)과 6 일 (오른쪽)에 시간에 따른 동물의 위치를 보여 주며, 동물이 시간당 더 많은 시험을 수행하고 6 일에 보상 구역에서 더 자주 핥았음을 보여준다. 도, 15c는 7 일 동안의 훈련 (n = 5 마리 마우스) 동안 보상 영역에서 핥는 비율을 보여준다. 도 15d는 시각적 신호가 있는 (위) 및없는 (아래) (왼쪽) 트랙을 보여준다. 보상 영역에서 핥는 비율은 시각적 신호가 있는 트랙에서 없는 것보다 훨씬 높았다 (오른쪽, n = 5 마우스, p <0.05). 오차 막대, 평균 +/- s.e.m.
도 16은 유전자 발현에서 깜박임-유도된 변화의 메커니즘을 보여준다. 1 시각 피질에서 유전자 발현 패턴을 유발하는 자극에 대한 다양한 패턴의 효과. 2 개의 동시 시청각 깜박임이 알츠하이머 병과 관련된 해마와 같은 심부 뇌 영역의 유전자 발현 변화를 유도한다.
도 17a 및 17b는 시각적 깜박임이 시각 피질에서 사이토카인 발현을 자극함을 보여준다. 도 17a는 1 시간의 감각 깜박임 (z- 점수) 후 시각 피질에서 32 개의 사이토카인의 단백질 발현을 보여준다. 도 17b는 40Hz 깜박임이 특정 사이토카인 (예 : MIG)의 발현을 촉진하는 반면, 무작위 깜박임은 IL-10의 발현을 촉진하고 일정한 빛이 VEGF를 촉진함을 보여준다 (17a의 화살표).
도 18은 자극-유전자 발현맵 (StG Map)의 개념화를 보여준다. 이 지도는 다른 기능적 유전자 세트 ( "모듈")의 활성화를 촉진하는 자극 요법을 식별한다.
도 19는 RNAseq가 경로 및 세포 유형 특이적 유전자 발현을 확인함을 보여준다. 도 19는 40Hz 깜박임 1 시간 후 GSEA가 31 개의 유의하게 풍부한 유전자 세트 (492 개)를 확인했음을 보여준다.
도 20a-20d. MAPK 및 NFκB 인광 신호는 마우스가 감각적인 시각적 깜박임에 노출된 후 상향 조절된다. 도 20a는 뉴런에서의 감마 활성이 시냅스 연결 및 미세 아교 세포 변환을 함께 조절하는 MAPK 및 NFκB 신호 전달을 자극한다는 것을 보여준다. 도 20b는 Luminex 다중 면역 분석에서 무작위 자극 또는 어둠 속에 보관된 마우스와 비교하여 40Hz 깜박임의 5 분 후 시각 피질에서 MAPK 및 NFκB 경로 내에서 증가 된 신호 전달이 밝혀졌음을 보여준다 (데이터는 z- 점수). 도 20c는 40Hz 깜박임이 Erk 인산화를 상당히 증가 시켰음을 보여 주며, 이는 혈액-뇌 장벽 침투성 소분자 (100mg / kg SL327)를 사용하여 Mek의 업스트림 억제에 의해 억제되었다 (사후 보정을 통한 단방향 ANOVA). 도 20d는 IHC가 5 분 동안 40Hz 깜박임 (파란색 : Dapi, 녹색 : NeuN, 빨간색 : NFκB) 후 NeuN 표지된 뉴런에 국한된 phospho-NFκB를 보여준다.
도 21은 40Hz 감각 시각적 깜박임이 소분자 MAPK 또는 NFκB 억제제에 의해 억제되는 사이토카인 단백질 발현을 자극함을 보여준다. 도 21은 60 분의 시각적 40Hz 깜박임, 무작위 깜박임, 20Hz 깜박임 또는 일정한 빛에 노출된 마우스의 시각 피질에서 32 개의 사이토카인을 정량화하기 위해 Luminex 분석을 사용했음을 보여준다. 막대 그래프는 선택된 유의미한 사이토카인을 보여준다.
도 22 IHC는 40Hz 감각적 시각적 깜박임의 1 시간 후에 M-CSF가 NeuN과 공동-표지한다는 것을 보여준다. 파란색 : DAPI, 녹색 : NeuN, 빨간색 : M-CSF
도 23a-23r은 40Hz 청각 자극이 AC, CA1 및 mPFC에서 스파이킹 활동을 조절 함을 보여준다. 도 23a는 좌측 100ms마다 랩(wrapped)된 다수의 10 초 자극 블록으로 40Hz 청각 자극에 대한 예시적인 단일 유닛 스파이킹 응답을 보여준다. 4 개의 연속 펄스에 대한 스파이킹 응답의 예, 오른쪽. 도 23b는 AC에서 40Hz 청각 (파란색) 및 무작위 자극 (주황색) 동안 A에 표시된 유닛의 발사 속도 변조를 보여준다. 푸른 진드기, 청각 펄스; 연한 파란색 막대, 무작위로 분포 된 펄스. 도 23c는 모든 단일 유닛에 대해 없음 (회색, 자극 없음으로 라벨링 됨), 무작위 (주황색, 무작위로 라벨링 됨) 및 40Hz 청각 자극 (진한 파란색, 40Hz 자극으로 라벨링 됨) 조건에 대한 AC에서 발사 속도의 피크 사이의 간격을 보여준다(n = 5 개의 마우스에서 9 개의 기록 세션에서 292 개 단위). 자극 간 간격 주변의 간격 비율 : P = 0 40Hz 대 자극 없음, P = 0 40Hz 대 무작위; 두 비율에 대한 z- 검정. 보고된 모든 통계에 대해 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어 한 후 결과가 유의미하다. 도 23d는 40Hz 청각 자극 (왼쪽, 0에서 자극 시작) 동안 자극 시작에 대한 발사 속도 변조의 예시적인 폴라(polar) 플롯, 40Hz 청각, 무작위 및 무자극 동안 단일 유닛 발사 속도 변조의 벡터 강도 (중앙 , **** P <0.00005 40Hz 대 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 9 개 단위는 0.25보다 큰 40Hz 자극 VS 값을 가졌다. 6 개 단위는 무작위 자극 VS 값이 0.25보다 큼) 및 단일 단위 발사 속도 변조의 Rayleigh 통계값 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. 자극 없음, 40Hz vs. 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 40 개 단위는 30보다 큰 40Hz 자극 RS 값을 가졌고, 2 개 단위는 30보다 큰 임의 자극 RS 값을 가졌다). 도 23e는 20Hz, 40Hz 및 80Hz 청각 자극에 대해 AC의 단일 유닛으로부터 스파이 킹 응답을 갖는 펄스의 비율을 보여준다. 도 23f는 AC에서 자극 조건 사이의 평균 발사 속도를 보여준다. 도 23g는 CA1에 대한 (23a)와 동일하다. 도 23h는 CA1에 대한 (23b)와 동일하다. 도 23i는 CA1에 대한 (23c)와 동일하다 (5 마리 마우스에서 10 회 기록 세션에서 n = 338 개 단위. P = 0 40Hz 대 자극 없음, P = 0 40Hz 대 무작위, 두 비율에 대한 z- 테스트 ). 도 23j는 CA1에 대한 (23d)와 동일함을 보여준다 (중앙, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 11 개 단위 및 2 개 단위의 VS 값> 0.25 각각 40Hz 또는 무작위 동안; 오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 7 개 단위의 40Hz 자극 RS 값> 30). 도 23k는 CA1의 (23e)와 동일하다. 도 23l은 CA1의 (23f)와 동일하다. 도 23m은 mPFC에 대한 (23a)와 동일하다. 도 23n은 mPFC에 대한 (23b)와 동일하다. 도 23o는 mPFC에 대한 (23c)와 동일함을 보여준다 (4 마리 마우스에서 7 회 기록 세션에서 n = 115 단위. P = 0 40Hz 대 자극 없음, P = 0 40Hz 대 무작위, 두 비율에 대한 z- 테스트 ). 도 23P는 mPFC (중앙, **** P <0.00005 40Hz 대 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 오른쪽, **** P <0.00005 40 Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 2 개 단위는 40Hz 자극 RS 값> 30을 가짐). 도 23q는 mPFC의 (23e)와 동일하다. 도 23r은 mPFC의 (23f)와 동일하다.
도 24a-24u는 20Hz 및 80Hz 청각 자극이 AC, CA1 및 mPFC에서 활동을 조절 함을 보여준다. 도 24a는 청각 피질을 검출하기 위해 사용된 청각 매핑(mapping) 톤(tones)에 대한 평균 LFP 응답을 보여준다 (왼쪽). 파란색 영역은 50ms 매핑 톤이 재생되었음을 나타낸다. 클러스터된 추정 단일 단위의 예 (오른쪽). 도 24b는 40Hz 청각 미광 자극에 대한 전력 스펙트럼 밀도 (PSD) 응답을 보여 주며, 기록 일에 걸친 평균 및 표준 편차 (왼쪽), AC (기록 사이트)에서 모든 기록 일의 청각 깜박임에 대한 전력 스펙트럼 LFP 응답을 보여준다. 기록(recording) 깊이 당 40Hz 청각 깜박임 동안 최대 40Hz 피크가 표시된다. 방법 참조) (오른쪽).
도 24c는 20Hz 오디오 미광 자극 (왼쪽, 녹색) 및 80Hz 청각 깜박임 (오른쪽, 보라색)에 응답하는 추정 단일 유닛의 발사 속도 변조를 보여준다. 도 24d는 0Hz 주변의 AC 중심에서 단일 장치의 다중 자극 조건 간의 평균 발사 속도 차이를 보여준다 (P> 0.01 20Hz - 40Hz, 5 회 비교 제어 후 ns; **** P <0.00002 40Hz - 자극 없음 ; 다른 모든 ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 모든 통계 테스트에서 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어 한 후에도 유의성이 유지된다. 도 24e는 무작위, 20Hz, 40Hz 및 80Hz 청각 자극에 대한 AC의 모든 격리 된 단일 유닛의 발사 속도 응답을 보여준다. 4 회 연속 자극주기에 대한 Z 점수 응답이 표시된다. 단위는 분석 된 4 개 사이클에서 평균 자극 단계 선호도에 따라 정렬된다. 흰색 점선은 청각 펄스 타이밍을 나타낸다. 도 24F는 20Hz 및 80Hz 청각 자극 대 자극 없음 조건의 벡터 강도 분포를 보여준다 (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 11 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다; 6 개 단위는 80Hz 자극 VS 값이 0.25보다 큼) 20Hz 및 80Hz 청각 자극 대 자극 없음의 Rayleigh 통계 분포 (오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 74 개 유닛은 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 41 개 유닛은 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 24g는 청각 자극의 모든 주파수 (왼쪽, **** P <0.000025 20Hz-80Hz, 20Hz - 40Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80) 간의 벡터 강도 값의 세포 내 차이 분포를 보여준다. Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 청각 자극의 모든 주파수 간의 Rayleigh 통계 값의 세포 내 차이 (오른쪽, **** P <0.000025 20Hz-80Hz, 20Hz - 40Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80Hz ns, 윌콕슨 부호 순위) 중앙값이 0인지 테스트). 도 24h는 CA1을 검출하는데 사용되는 해마의 특징인 세타 리듬의 예를 보여준다. 도 24i는 CA1에 대한 (24B)와 동일하다. 도 24J는 CA1의 (24C)와 동일하다. 도 24k는 CA1에 대한 (24d)와 동일함을 보여준다 (P> 0.01 40Hz - 자극 없음, n.s. 5 회 비교 제어 후, 다른 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 24l은 CA1의 (24e)와 동일하다. 도 24m은 CA1에 대한 (24f) (왼쪽, **** P <0.00005, 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음); Kolmogorov-Smirnov 테스트; 12 개 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다. 10 개 단위는 0.25보다 큰 80Hz 자극 VS 값을 가졌다. 오른쪽, **** P <0.00005, 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 4 개 장치는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 5 개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 24n은 CA1 (왼쪽, ** P <0.0025 20Hz - 80Hz, *** P <0.00025 20Hz - 40Hz, **** P <0.000025 40Hz - 임의, 40Hz - 80Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정; 오른쪽, P> 0.0125 20Hz-80Hz, n.s. 네 가지 비교를 제어 한 후; ** P <0.0025 20Hz - 40Hz, **** P <0.000025 40Hz - 랜덤, 40Hz - 80Hz n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 24o는 mPFC에서 프로브 추적 및 기록 위치를 보여주는 조직학 이미지를 보여준다. 빨간색 화살표는 녹화 위치를 나타낸다. 도 24P는 mPFC에 대한 (24b)와 동일하다. 도 24q는 mPFC의 (24c)와 동일하다. 도 24r은 mPFC에 대한 (24d)와 동일하다 (오른쪽, n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 24s는 mPFC에 대한 (24e)와 동일하다. 도 24t는 mPFC (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz vs. No Stim, 80Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov 테스트, 4 개 장치의 20Hz 자극 VS 값이 더 큼)와 동일함을 보여준다. 0.25보다; 오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 5 개 단위는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 3개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 24u는 mPFC에 대한 (24g)와 동일함을 보여준다 (왼쪽, **** P <0.000025 40Hz - 임의, 기타 모든 ns, 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정, 오른쪽, **** P <0.000025 40Hz). - 무작위, 다른 모든 ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정.
도 25a-25c는 결합 된 청각 및 시각 속 GENUS가 미세 아교 세포(microglia)에 의한 클러스터링(clustering) 표현형 반응을 유도함을 보여준다. 도 25a 40Hz 시청각 자극 동안 단일 장치의 발사 속도 변조 (왼쪽). 40Hz A + V 자극, 무작위 A + V 자극 및 자극 없음 기간에 대한 반응의 벡터 강도 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. 자극 없음, 40Hz vs. 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 9 개 단위는 0.25보다 큰 40Hz 자극 VS 값을 가졌다. 3 개의 단위는 0.25보다 큰 무작위 자극 VS 값을 가졌다. 패널 A-C에 대한 모든 통계 테스트에서 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어 한 후 결과가 유의미하다. 도 25b는 CA1에 대한 A와 동일함을 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 8 개 단위 및 3 개 단위는 40에 대해> 0.25 인 VS 값을 가짐 Hz 또는 무작위 자극). 도 25c는 mPFC에 대한 A와 동일 함을 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz 대 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 5 개 단위는 40Hz 자극 VS 값> 0.25).
도 26a-26u. 40Hz의 결합된 청각 및 시각 자극은 AC, CA1 및 mPFC에서 스파이킹 활동을 조절한다. 도 26a는 40Hz 시청각 미광 자극에 대한 전력 스펙트럼 밀도 (PSD) 반응을 보여 주며, 모든 기록 일의 시청각 미광 자극에 대한 전력 스펙트럼 LFP 반응, 기록 일에 걸쳐 평균 및 표준 편차 (왼쪽) AC (기록 깊이 당 40Hz 시청각 깜박임 동안 최대 40Hz 피크가 있는 기록 사이트가 표시됨, 방법) (오른쪽). 도 26b는 시청각 무작위 자극에 대한도 6a에 도시된 추정 단일 유닛의 발사 속도 변조, 40Hz 시청각 자극에 대한 단일 유닛 반응의 레일리 통계 분포를 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 40 유닛은 30보다 큰 45Hz 자극 RS 값을 가졌다. 5 개 단위는 30보다 큰 무작위 자극 RS 값을 가졌다. 모든 통계 테스트에서 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어한 후에도 유의성이 남아 있다). 도 26c는 20Hz 시청각 미광 자극 (왼쪽, 녹색) 및 80Hz 시청각 미광 자극 (오른쪽, 보라색)에 응답하는 추정 단일 유닛의 발사 속도 변조를 보여준다. 도 26d는 약 0Hz (P> 0.01 40Hz-자극 없음, n.s. 5 개의 비교를 제어한 후)에서 AC 중심에서 다중 자극 조건 사이의 단일 유닛의 평균 발사 속도 차이를 보여준다. 기타 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26e는 무작위, 20Hz, 40Hz 및 80Hz 시청각 자극에 대해 AC에서 분리된 각 단일 유닛의 발사 속도 응답을 보여준다. 4 회 연속 자극주기에 대한 Z 점수 응답이 표시된다. 단위는 분석된 4 개 사이클에서 평균 자극 단계 선호도에 따라 정렬된다. 흰색 점선은 청각 펄스 타이밍을 나타낸다. 도 26f는 20Hz 및 80Hz 시청각 자극 대 자극 없음 조건의 벡터 강도 분포를 보여준다 (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트 12 개 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다; 10 개 단위는 80Hz 자극 VS 값이 0.25보다 큼), Rayleigh 통계 분포는 20Hz 및 80Hz 시청각 자극 대 자극 없음 (오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz) 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 86 개 장치는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌으며 35 개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가짐). 도 26G는 청각 자극의 모든 주파수 (왼쪽, *** P <0.00025 20Hz - 40Hz, **** P <0.000025 20Hz - 80Hz, 40Hz) 간의 벡터 강도 값의 세포 내 차이 분포를 보여준다. - 랜덤, 40Hz - 80Hz ns, 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 모든 청각 자극 주파수 사이의 Rayleigh 통계 값의 세포 내 차이 (오른쪽, *** P <0.00025 20Hz-80Hz; **** P <0.000025 20Hz - 40Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80 Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 도 26h는 CA1의 (26a)와 동일하다. 도 26i는 CA1에 대한 26b와 동일함을 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 8 개 유닛은 30보다 큰 40Hz 자극 RS 값을 가짐). 도 26J는 CA1에 대한 26c와 동일하다. 도 26k는 CA1에 대한 26D와 동일함을 보여준다 (P> 0.01 40Hz - 자극 없음, n.s. 5 회 비교 제어 후, 다른 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26l은 CA1의 (26e)와 동일하다. 도 26m은 CA1에 대한 (26f)와 동일함을 보여준다 (왼쪽, **** P <0.0005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 16 개 장치는 20Hz 자극 VS 값이 더 큼 0.25 이상; 7 개 단위는 0.25보다 큰 80Hz 자극 VS 값을 가짐; 오른쪽, **** P <0.0005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 21 개 단위는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 3 개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 26n은 CA1의 (26g)와 동일함을 보여준다 (왼쪽, *** P <0.00025 20Hz - 40Hz, **** P <0.00025 20Hz - 80Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정; 오른쪽, ** P <0.0025 20Hz - 40Hz; **** P <0.000025 40 Hz - 무작위; 기타 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26o는 mPFC에 대한 (26a)와 동일하다. 도 26p는 mPFC (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트)에 대한 (26b)와 동일함을 보여준다 .1 유닛은 40Hz 자극 RS 값이 더 크다. 30 이상). 도 26q는 mPFC의 경우 (26c)와 동일하다. 도 26r은 mPFC에 대한 (26d)와 동일함을 보여준다 (P> 0.01 40Hz - 자극 없음, n.s. 5 개의 비교를 제어 한 후; 다른 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26s는 mPFC에 대한 (26e)와 동일하다. 도 26t는 mPFC (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음)에 대한 (26f)와 동일함을 보여준다. Kolmogorov-Smirnov 테스트; 4 개 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다. 1 개 단위는 0.25보다 큰 80Hz 자극 VS 값을 가졌다. 오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 5 개 단위는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 1 유닛은 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 26u는 mPFC (왼쪽, **** P <0.000025 40Hz - 랜덤, 다른 모든 n.s., 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정)에 대한 (26g)와 동일하다. 오른쪽, **** P <0.000025 40 Hz - 무작위; 기타 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정).
도 27은 상이한 자극 빈도가 특정 사이토카인 또는 사이토카인 그룹을 어떻게 증가 또는 감소시키는지를 설명하는, 어떤 조건에서 어떤 사이토카인이 상승되는지를 보여주는 벤 다이어그램을 예시한다. 벤 다이어그램의 특정 부분에 나열된 사이토카인은 해당 조건에서 해당 사이토카인이 상승함을 의미한다. 이와 같은 벤 다이어그램 (또는 인 단백질(phosphoprotein)에 대한 자극 또는 유전자지도에 대한 자극)을 사용하여 치료는 어떤 사이토카인이 증가하는 것이 가장 바람직한 지에 따라 특정 상태 또는 환자를 대상으로 한다.
도 1a-1b는 본 명세서에 설명된 구현에 따른 예시적인 실험 프로토콜을 도시한다. 도 1a는 마우스의 테스트 그룹 (위) 및 대조군 (아래)을 예시한다. 도 1b는 예시적인 실험 프로토콜을 예시한다.
도 2는 MAPK 및 NFκB 경로를 예시하는 다이어그램이다. 이러한 경로는 사이토카인 및 성장 인자와 같은 염증 및 세포 행동을 조절하는 단백질을 포함하여 세포 생존 및 단백질 합성을 조절한다.
도 3a-3d는 감각 깜박임이 초기에 어떻게 세포 내 신호 전달을 자극하고 억제하여 사이토카인 및 성장 인자의 발현을 유도 하는지를 보여주는 다이어그램이다. 도 3a는 5-10 분 동안 깜박임에 노출된 마우스에 대한 결과를 예시한다. 이 다이어그램은 해마가 아닌 시각 피질에서 MAPK 경로 및 NFκB에서 Atf-2 및 Jnk (Jun kinase)의 향상된 인산화를 보여준다. 더욱이, MAPK 경로 시그널링은 도 3b에 나타낸 바와 같이 60 분 (분)의 깜박임 후에 억제되었다. 모든 데이터는 z 점수이다. 각 행은 하나의 마우스를 나타내고 각 열은 하나의 분석 물질을 나타낸다. 도 3c 및 3d는 30 분 (도 3c) 또는 60 분 (도 3d) 동안 깜박임에 노출된 마우스에 대한 결과를 나타내며, 이는 특히 MIP-2 및 RANTES를 포함한 다중 면역 조절 사이토카인의 발현 증가를 보여 주었다. 깜박임 60 분 후 MAPK 세포 내 신호 전달이 감소하고 사이토카인 발현이 증가한다. 모든 데이터는 z 점수이다. 각 행은 하나의 마우스를 나타내고 각 열은 하나의 분석 물질을 나타낸다.
도 4는 감마 진동이 세포 생존, 미세 아교 세포 모집 및 학습 및 기억에 필수적인 신경 코드를 포함하는 다양한 기능을 지배하는 유전자를 유도하는 일반적인 세포 내 경로 (예를 들어, MAPK 및 NFκB 경로)를 어떻게 유발 하는지를 보여주는 다이어그램이다.
도 5는 미세 아교 세포를 변형시키고 시각 피질에서 아밀로이드 베타를 감소시키는 감마 시각 깜박임을 예시하는 다이어그램이다. 도 5는 40Hz에서 깜박이는 빛에 노출된 마우스를 보여 주며, 이는 빛이 꺼졌다 켜질때 시각 피질의 신경 스파이 킹을 40Hz (Hz)에서 증가 및 감소시킨다.
도 6a는 별표로 표시된 스파이킹 속도 피크(도 6a, 왼쪽), 자극 또는 미광 자극이 없는 주기적 응답이있는 기록 사이트 백분율(도 6a, 중앙) 및 자극 동안 주기적 기록 사이트에 대한 변조 깊이(도 6a, 오른쪽, n = 772) 분포를 갖는 CA1에서 청각 깜박임의 함수로서 스파이크의 비율을 보여준다. 도 6b는 별표로 표시된 스파이킹(spiking) , 자극 또는 미광 자극이 없는 주기적 응답을 갖는 기록 사이트 백분율(도 6b, 가운데), 자극 동안 주기적 기록 사이트에 대한 변조 깊이 분포를 갖는 CA1의 청각 및 빛 미광 자극에 의한 스파이크 변조를 보여준다(도 6b, 오른쪽, n = 928). 기록 사이트는 주기적 또는 비 주기적 응답을 갖는 것으로 결정되었으며, 주기적 기록 사이트는 스파이킹 속도 피크 (왼쪽 플롯) 사이의 모든 간격이 22.5 - 27.5ms 사이에있는 것으로 정의되었다. **** p <0.0001, 윌콕슨 랭섬(ranksum) 테스트. 4 마리 마우스의 9 개 세션에서 CA1의 12 개 기록 깊이에서 기록 된 데이터.
도 7a-7c는 마우스가 감각적 시각 깜박임에 노출된 후 사이토카인 단백질 발현이 상향 조절됨을 보여주는 다이어그램이다. 도 7a는 60 분의 시각적 깜박임 또는 어둡게 노출된 마우스의 시각 피질에서 정량화 된 32 개의 사이토카인의 히트맵이다 (데이터는 z- 점수). 도 7b는 시각적 깜박임과 어두운 동물을 구별하는 사이토카인 LV1의 축을 식별 할 수 있는 다변량 판별 부분 최소 제곱 회귀 (D-PLSR)의 플롯이다. 도 7c는 깜박임 동물과 어둠을 구별하는 축 LV1을 도시하며, 시각적 깜박임 또는 어둠과 관련되는 사이토카인의 프로파일로 구성된다. 각 막대의 크기가 클수록 상관관계가 커진다.
도 8a-8c는 마우스를 감각적 시각 깜박임에 노출시킨 후 전 염증성 세포 내 신호 전달 상향 조절을 예시하는 다이어그램이다. 도 8a에서 볼 수 있듯이 시각 감각 깜박임 5분 후 MAPK 및 NFκB 경로 내의 신호 증가가 시각 피질에서 관찰되지만 해마에서는 관찰되지 않는다. 도 8b는 다변량 판별 부분 최소 제곱 회귀 (D-PLSR)의 플롯이다. D-PLSR은 시각 피질의 5 분 깜박임과 HPC를 구별하는 LV1 신호 축을 식별한다. 축은 시각적 깜박임과 관련된 MAPK 및 NFκB 신호로 구성되었다. 10 분까지 LV1의 신호는 HPC의 신호와 유사하게 감소하였다. 도 8c는 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 보여준다. IHC는 포스포(phospho)-NFκB가 NeuN 표지된 뉴런 (파란색 : Dapi, 녹색 : NeuN, 빨간색 : NFκB)에 국한된 것으로 나타났다.
도 9a 및 9b는 해마에서 리듬 활동의 특정 주파수를 유도하기 위해 감각 미광 자극을 사용하는 방법을 보여준다. 도 9a에서 동물은 해마에서 신경 활동을 유도하는 감각 깜박임 방법을 최적화하기 위해 많은 세포의 신경 기록을 수행하면서 다양한 형태의 감각 깜박임에 노출된다. 도 9b는 장기간의 감각 깜박임이 미세 아교 세포, 뉴런 간의 기능적 연결, 신경 코드 및 AD 마우스의 결손을 어떻게 변화시키는 지 결정되었음을 보여준다.
도 10a-10d는 5XFAD 마우스에서 감마 결손을 보여준다. 5XFAD 마우스의 SWR 및 감마 활성 결핍은 인지 결핍 및 플라크 축적 (3 개월령)의 증거 이전이다. 이 결손은 APOE3 마우스에 비해 APOE4 마우스의 SWR 동안 감마에서 발견되는 결손과 현저하게 유사하지만 해당 연구에서는 스파이크가 기록되지 않았다 (Gillespie et al. 2016). 도 10a는 5XFAD 마우스 (녹색) 및 WT 한배 새끼 (검은 색)에 대한 시간당 SWR을 보여주고, 도 10b는 SWR 동안 감마가 WT(파란색 영역, 왼쪽), (10C), SWR 동안 감마 전력보다 5XFAD(노란색 영역, 왼쪽)에서 더 강함을 보여주는 평균 SWR 트리거 스펙트로그램을 보여주며, 위 : 감마 위상의 함수로서 SWR 중 스파이크 비율 (평균 +/- sem). 아래 : SWR 동안 감마 스파이킹 변조의 깊이. 모든 통계 테스트는 윌콕슨 순위 합계 검정이였다.
도 11a-11c는 헤드 고정 기록 및 행동 방법을 보여준다. 도 11a는 가상 현실 (VR) 행동 패러다임에서 머리 고정 마우스가 구형 트레드밀에서 실행되는 동안 가상 환경이 그의 주변 화면에 투영되고 그의 움직임에 따라 업데이트 되는 것을 보여준다. 헤드 고정 방식은 높은 처리량의 신경 기록을 용이하게 한다. 도 11b는 각 채널 (오른쪽)에서 기록된 스파이크(spikes)가 있는 단일 생크(shank) 32 채널 실리콘 프로브 (왼쪽)와 다른 색상으로 표시된 다른 단일 셀을 보여준다. 도 11c는 전형적인 LFP 트레이스를 보여준다. 이 접근 방식을 사용하여 로컬 필드 전위가 기록되어 (SWR, 감마 및 기타 진동을 감지하기 위해) 많은 단일 세포가 동시에 급증하고 이러한 기록을 광 유전학적 자극과 결합하였다.
도 12a-12c는 단일 뉴런에서 스파이킹 활성의 전기 생리학적 기록을 보여준다. 도 12a는 32 채널 실리콘 프로브를 사용하는 하나의 HPC 기록에서 전형적인 스파이크 (점) 클러스터를 보여준다. 이 기록은 54개의 잘 분리된 클러스터를 산출했다. 각각 다른 색상의 다섯 가지 예제 클러스터가 표시된다. 도 12b는 4개의 예시적인 클러스터에 대해 여기에 도시된 시간 경과에 따른 발사 속도가 60 분 기록 동안 안정적임을 보여준다. 도 12c는 스파이크 파형 폭과 평균 발사 속도를 기준으로 추정되는 인터뉴런과 피라미드 형 세포를 구별할 수 있음을 보여준다. 추정 피라미드 세포는 더 넓은 스파이크 폭과 더 낮은 발사 속도 (플롯의 오른쪽 하단에 있는 점)를 갖는 반면, 추정 인터뉴런은 좁은 스파이크 폭과 넓은 범위의 발사 속도 (플롯 왼쪽에 있는 점)를 가지고 있다. 플롯은 추정 내부 뉴런과 피라미드 세포의 두 가지 분명하게 구별되는 분포를 보여준다. 추정 PV 인터 뉴런은 빠르게 급증하며 이 기록은 추정 PV 인터뉴런 2 개 (왼쪽 상단에 두 개의 점) 만 산출했다. 뉴런 유형은 광 유전학적 태깅으로 확인된다.
도 13은 신경 활동을 동반하기 위해 다양한 형태의 감각 깜박임을 테스트하는 것을 보여준다. 동물은 청각 깜박임만, 시각적 깜박임만, 두 자극이 동시에 켜지는 (동상 다중 모드 깜박임) 청각 및 시각적 깜박임과 청각 및 빛 자극이 주기의 절반만큼 상쇄되는 청각 및 시각적 깜박임에 노출된다. (오프셋 위상 다중 모드 깜박임).
도 14는 감각 깜박임의 상이한 주파수의 효과를 보여준다. 예비 연구에서 HPC의 스파이 킹은 깜박임 없음 (오른쪽 끝) 또는 무작위 깜박임 제어에 비해 20Hz (왼쪽 끝), 40Hz (왼쪽 가운데) 및 80Hz (오른쪽 가운데)에서 결합된 청각 및 시각적 깜박임에 의해 변조된다. 히스토그램은 빛과 톤의 기능으로 스파이크의 비율을 보여준다 (위). 피크는 별표로 표시된다. 모든 연구에서 동물은 10, 20, 40, 60, 80, 100Hz 깜박임의 10 초 블록에 노출된다.
도 15a-15d는 VR 학습 패러다임을 보여준다. 동물이 보상을 받기 위해 올바른 위치 또는 보상 구역을 핥아야하는 새로운 VR 행동 패러다임이 개발되었다 (15a 및 15b). 동물은 훈련보다 보상을 찾을 수 있는 올바른 장소를 배우고 (보상 구역에서 더 많이 핥고 (15c), 시각적 신호를 사용하여 작업을 해결한다 (시각적 신호없이 더 나쁘게 수행함, (15d)). 도 15a는 흰색 화살표로 표시된 보상 구역이 있는 트랙을 보여준다. 도 15b는 훈련 첫날 (왼쪽)과 6 일 (오른쪽)에 시간에 따른 동물의 위치를 보여 주며, 동물이 시간당 더 많은 시험을 수행하고 6 일에 보상 구역에서 더 자주 핥았음을 보여준다. 도, 15c는 7 일 동안의 훈련 (n = 5 마리 마우스) 동안 보상 영역에서 핥는 비율을 보여준다. 도 15d는 시각적 신호가 있는 (위) 및없는 (아래) (왼쪽) 트랙을 보여준다. 보상 영역에서 핥는 비율은 시각적 신호가 있는 트랙에서 없는 것보다 훨씬 높았다 (오른쪽, n = 5 마우스, p <0.05). 오차 막대, 평균 +/- s.e.m.
도 16은 유전자 발현에서 깜박임-유도된 변화의 메커니즘을 보여준다. 1 시각 피질에서 유전자 발현 패턴을 유발하는 자극에 대한 다양한 패턴의 효과. 2 개의 동시 시청각 깜박임이 알츠하이머 병과 관련된 해마와 같은 심부 뇌 영역의 유전자 발현 변화를 유도한다.
도 17a 및 17b는 시각적 깜박임이 시각 피질에서 사이토카인 발현을 자극함을 보여준다. 도 17a는 1 시간의 감각 깜박임 (z- 점수) 후 시각 피질에서 32 개의 사이토카인의 단백질 발현을 보여준다. 도 17b는 40Hz 깜박임이 특정 사이토카인 (예 : MIG)의 발현을 촉진하는 반면, 무작위 깜박임은 IL-10의 발현을 촉진하고 일정한 빛이 VEGF를 촉진함을 보여준다 (17a의 화살표).
도 18은 자극-유전자 발현맵 (StG Map)의 개념화를 보여준다. 이 지도는 다른 기능적 유전자 세트 ( "모듈")의 활성화를 촉진하는 자극 요법을 식별한다.
도 19는 RNAseq가 경로 및 세포 유형 특이적 유전자 발현을 확인함을 보여준다. 도 19는 40Hz 깜박임 1 시간 후 GSEA가 31 개의 유의하게 풍부한 유전자 세트 (492 개)를 확인했음을 보여준다.
도 20a-20d. MAPK 및 NFκB 인광 신호는 마우스가 감각적인 시각적 깜박임에 노출된 후 상향 조절된다. 도 20a는 뉴런에서의 감마 활성이 시냅스 연결 및 미세 아교 세포 변환을 함께 조절하는 MAPK 및 NFκB 신호 전달을 자극한다는 것을 보여준다. 도 20b는 Luminex 다중 면역 분석에서 무작위 자극 또는 어둠 속에 보관된 마우스와 비교하여 40Hz 깜박임의 5 분 후 시각 피질에서 MAPK 및 NFκB 경로 내에서 증가 된 신호 전달이 밝혀졌음을 보여준다 (데이터는 z- 점수). 도 20c는 40Hz 깜박임이 Erk 인산화를 상당히 증가 시켰음을 보여 주며, 이는 혈액-뇌 장벽 침투성 소분자 (100mg / kg SL327)를 사용하여 Mek의 업스트림 억제에 의해 억제되었다 (사후 보정을 통한 단방향 ANOVA). 도 20d는 IHC가 5 분 동안 40Hz 깜박임 (파란색 : Dapi, 녹색 : NeuN, 빨간색 : NFκB) 후 NeuN 표지된 뉴런에 국한된 phospho-NFκB를 보여준다.
도 21은 40Hz 감각 시각적 깜박임이 소분자 MAPK 또는 NFκB 억제제에 의해 억제되는 사이토카인 단백질 발현을 자극함을 보여준다. 도 21은 60 분의 시각적 40Hz 깜박임, 무작위 깜박임, 20Hz 깜박임 또는 일정한 빛에 노출된 마우스의 시각 피질에서 32 개의 사이토카인을 정량화하기 위해 Luminex 분석을 사용했음을 보여준다. 막대 그래프는 선택된 유의미한 사이토카인을 보여준다.
도 22 IHC는 40Hz 감각적 시각적 깜박임의 1 시간 후에 M-CSF가 NeuN과 공동-표지한다는 것을 보여준다. 파란색 : DAPI, 녹색 : NeuN, 빨간색 : M-CSF
도 23a-23r은 40Hz 청각 자극이 AC, CA1 및 mPFC에서 스파이킹 활동을 조절 함을 보여준다. 도 23a는 좌측 100ms마다 랩(wrapped)된 다수의 10 초 자극 블록으로 40Hz 청각 자극에 대한 예시적인 단일 유닛 스파이킹 응답을 보여준다. 4 개의 연속 펄스에 대한 스파이킹 응답의 예, 오른쪽. 도 23b는 AC에서 40Hz 청각 (파란색) 및 무작위 자극 (주황색) 동안 A에 표시된 유닛의 발사 속도 변조를 보여준다. 푸른 진드기, 청각 펄스; 연한 파란색 막대, 무작위로 분포 된 펄스. 도 23c는 모든 단일 유닛에 대해 없음 (회색, 자극 없음으로 라벨링 됨), 무작위 (주황색, 무작위로 라벨링 됨) 및 40Hz 청각 자극 (진한 파란색, 40Hz 자극으로 라벨링 됨) 조건에 대한 AC에서 발사 속도의 피크 사이의 간격을 보여준다(n = 5 개의 마우스에서 9 개의 기록 세션에서 292 개 단위). 자극 간 간격 주변의 간격 비율 : P = 0 40Hz 대 자극 없음, P = 0 40Hz 대 무작위; 두 비율에 대한 z- 검정. 보고된 모든 통계에 대해 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어 한 후 결과가 유의미하다. 도 23d는 40Hz 청각 자극 (왼쪽, 0에서 자극 시작) 동안 자극 시작에 대한 발사 속도 변조의 예시적인 폴라(polar) 플롯, 40Hz 청각, 무작위 및 무자극 동안 단일 유닛 발사 속도 변조의 벡터 강도 (중앙 , **** P <0.00005 40Hz 대 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 9 개 단위는 0.25보다 큰 40Hz 자극 VS 값을 가졌다. 6 개 단위는 무작위 자극 VS 값이 0.25보다 큼) 및 단일 단위 발사 속도 변조의 Rayleigh 통계값 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. 자극 없음, 40Hz vs. 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 40 개 단위는 30보다 큰 40Hz 자극 RS 값을 가졌고, 2 개 단위는 30보다 큰 임의 자극 RS 값을 가졌다). 도 23e는 20Hz, 40Hz 및 80Hz 청각 자극에 대해 AC의 단일 유닛으로부터 스파이 킹 응답을 갖는 펄스의 비율을 보여준다. 도 23f는 AC에서 자극 조건 사이의 평균 발사 속도를 보여준다. 도 23g는 CA1에 대한 (23a)와 동일하다. 도 23h는 CA1에 대한 (23b)와 동일하다. 도 23i는 CA1에 대한 (23c)와 동일하다 (5 마리 마우스에서 10 회 기록 세션에서 n = 338 개 단위. P = 0 40Hz 대 자극 없음, P = 0 40Hz 대 무작위, 두 비율에 대한 z- 테스트 ). 도 23j는 CA1에 대한 (23d)와 동일함을 보여준다 (중앙, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 11 개 단위 및 2 개 단위의 VS 값> 0.25 각각 40Hz 또는 무작위 동안; 오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 7 개 단위의 40Hz 자극 RS 값> 30). 도 23k는 CA1의 (23e)와 동일하다. 도 23l은 CA1의 (23f)와 동일하다. 도 23m은 mPFC에 대한 (23a)와 동일하다. 도 23n은 mPFC에 대한 (23b)와 동일하다. 도 23o는 mPFC에 대한 (23c)와 동일함을 보여준다 (4 마리 마우스에서 7 회 기록 세션에서 n = 115 단위. P = 0 40Hz 대 자극 없음, P = 0 40Hz 대 무작위, 두 비율에 대한 z- 테스트 ). 도 23P는 mPFC (중앙, **** P <0.00005 40Hz 대 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 오른쪽, **** P <0.00005 40 Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 2 개 단위는 40Hz 자극 RS 값> 30을 가짐). 도 23q는 mPFC의 (23e)와 동일하다. 도 23r은 mPFC의 (23f)와 동일하다.
도 24a-24u는 20Hz 및 80Hz 청각 자극이 AC, CA1 및 mPFC에서 활동을 조절 함을 보여준다. 도 24a는 청각 피질을 검출하기 위해 사용된 청각 매핑(mapping) 톤(tones)에 대한 평균 LFP 응답을 보여준다 (왼쪽). 파란색 영역은 50ms 매핑 톤이 재생되었음을 나타낸다. 클러스터된 추정 단일 단위의 예 (오른쪽). 도 24b는 40Hz 청각 미광 자극에 대한 전력 스펙트럼 밀도 (PSD) 응답을 보여 주며, 기록 일에 걸친 평균 및 표준 편차 (왼쪽), AC (기록 사이트)에서 모든 기록 일의 청각 깜박임에 대한 전력 스펙트럼 LFP 응답을 보여준다. 기록(recording) 깊이 당 40Hz 청각 깜박임 동안 최대 40Hz 피크가 표시된다. 방법 참조) (오른쪽).
도 24c는 20Hz 오디오 미광 자극 (왼쪽, 녹색) 및 80Hz 청각 깜박임 (오른쪽, 보라색)에 응답하는 추정 단일 유닛의 발사 속도 변조를 보여준다. 도 24d는 0Hz 주변의 AC 중심에서 단일 장치의 다중 자극 조건 간의 평균 발사 속도 차이를 보여준다 (P> 0.01 20Hz - 40Hz, 5 회 비교 제어 후 ns; **** P <0.00002 40Hz - 자극 없음 ; 다른 모든 ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 모든 통계 테스트에서 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어 한 후에도 유의성이 유지된다. 도 24e는 무작위, 20Hz, 40Hz 및 80Hz 청각 자극에 대한 AC의 모든 격리 된 단일 유닛의 발사 속도 응답을 보여준다. 4 회 연속 자극주기에 대한 Z 점수 응답이 표시된다. 단위는 분석 된 4 개 사이클에서 평균 자극 단계 선호도에 따라 정렬된다. 흰색 점선은 청각 펄스 타이밍을 나타낸다. 도 24F는 20Hz 및 80Hz 청각 자극 대 자극 없음 조건의 벡터 강도 분포를 보여준다 (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 11 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다; 6 개 단위는 80Hz 자극 VS 값이 0.25보다 큼) 20Hz 및 80Hz 청각 자극 대 자극 없음의 Rayleigh 통계 분포 (오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 74 개 유닛은 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 41 개 유닛은 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 24g는 청각 자극의 모든 주파수 (왼쪽, **** P <0.000025 20Hz-80Hz, 20Hz - 40Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80) 간의 벡터 강도 값의 세포 내 차이 분포를 보여준다. Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 청각 자극의 모든 주파수 간의 Rayleigh 통계 값의 세포 내 차이 (오른쪽, **** P <0.000025 20Hz-80Hz, 20Hz - 40Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80Hz ns, 윌콕슨 부호 순위) 중앙값이 0인지 테스트). 도 24h는 CA1을 검출하는데 사용되는 해마의 특징인 세타 리듬의 예를 보여준다. 도 24i는 CA1에 대한 (24B)와 동일하다. 도 24J는 CA1의 (24C)와 동일하다. 도 24k는 CA1에 대한 (24d)와 동일함을 보여준다 (P> 0.01 40Hz - 자극 없음, n.s. 5 회 비교 제어 후, 다른 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 24l은 CA1의 (24e)와 동일하다. 도 24m은 CA1에 대한 (24f) (왼쪽, **** P <0.00005, 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음); Kolmogorov-Smirnov 테스트; 12 개 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다. 10 개 단위는 0.25보다 큰 80Hz 자극 VS 값을 가졌다. 오른쪽, **** P <0.00005, 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 4 개 장치는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 5 개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 24n은 CA1 (왼쪽, ** P <0.0025 20Hz - 80Hz, *** P <0.00025 20Hz - 40Hz, **** P <0.000025 40Hz - 임의, 40Hz - 80Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정; 오른쪽, P> 0.0125 20Hz-80Hz, n.s. 네 가지 비교를 제어 한 후; ** P <0.0025 20Hz - 40Hz, **** P <0.000025 40Hz - 랜덤, 40Hz - 80Hz n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 24o는 mPFC에서 프로브 추적 및 기록 위치를 보여주는 조직학 이미지를 보여준다. 빨간색 화살표는 녹화 위치를 나타낸다. 도 24P는 mPFC에 대한 (24b)와 동일하다. 도 24q는 mPFC의 (24c)와 동일하다. 도 24r은 mPFC에 대한 (24d)와 동일하다 (오른쪽, n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 24s는 mPFC에 대한 (24e)와 동일하다. 도 24t는 mPFC (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz vs. No Stim, 80Hz vs. No Stim; Kolmogorov-Smirnov 테스트, 4 개 장치의 20Hz 자극 VS 값이 더 큼)와 동일함을 보여준다. 0.25보다; 오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 5 개 단위는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 3개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 24u는 mPFC에 대한 (24g)와 동일함을 보여준다 (왼쪽, **** P <0.000025 40Hz - 임의, 기타 모든 ns, 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정, 오른쪽, **** P <0.000025 40Hz). - 무작위, 다른 모든 ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정.
도 25a-25c는 결합 된 청각 및 시각 속 GENUS가 미세 아교 세포(microglia)에 의한 클러스터링(clustering) 표현형 반응을 유도함을 보여준다. 도 25a 40Hz 시청각 자극 동안 단일 장치의 발사 속도 변조 (왼쪽). 40Hz A + V 자극, 무작위 A + V 자극 및 자극 없음 기간에 대한 반응의 벡터 강도 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. 자극 없음, 40Hz vs. 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 9 개 단위는 0.25보다 큰 40Hz 자극 VS 값을 가졌다. 3 개의 단위는 0.25보다 큰 무작위 자극 VS 값을 가졌다. 패널 A-C에 대한 모든 통계 테스트에서 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어 한 후 결과가 유의미하다. 도 25b는 CA1에 대한 A와 동일함을 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 8 개 단위 및 3 개 단위는 40에 대해> 0.25 인 VS 값을 가짐 Hz 또는 무작위 자극). 도 25c는 mPFC에 대한 A와 동일 함을 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz 대 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 5 개 단위는 40Hz 자극 VS 값> 0.25).
도 26a-26u. 40Hz의 결합된 청각 및 시각 자극은 AC, CA1 및 mPFC에서 스파이킹 활동을 조절한다. 도 26a는 40Hz 시청각 미광 자극에 대한 전력 스펙트럼 밀도 (PSD) 반응을 보여 주며, 모든 기록 일의 시청각 미광 자극에 대한 전력 스펙트럼 LFP 반응, 기록 일에 걸쳐 평균 및 표준 편차 (왼쪽) AC (기록 깊이 당 40Hz 시청각 깜박임 동안 최대 40Hz 피크가 있는 기록 사이트가 표시됨, 방법) (오른쪽). 도 26b는 시청각 무작위 자극에 대한도 6a에 도시된 추정 단일 유닛의 발사 속도 변조, 40Hz 시청각 자극에 대한 단일 유닛 반응의 레일리 통계 분포를 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. 자극 없음, 40Hz 대 무작위; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 40 유닛은 30보다 큰 45Hz 자극 RS 값을 가졌다. 5 개 단위는 30보다 큰 무작위 자극 RS 값을 가졌다. 모든 통계 테스트에서 달리 명시되지 않는 한 Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 제어한 후에도 유의성이 남아 있다). 도 26c는 20Hz 시청각 미광 자극 (왼쪽, 녹색) 및 80Hz 시청각 미광 자극 (오른쪽, 보라색)에 응답하는 추정 단일 유닛의 발사 속도 변조를 보여준다. 도 26d는 약 0Hz (P> 0.01 40Hz-자극 없음, n.s. 5 개의 비교를 제어한 후)에서 AC 중심에서 다중 자극 조건 사이의 단일 유닛의 평균 발사 속도 차이를 보여준다. 기타 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26e는 무작위, 20Hz, 40Hz 및 80Hz 시청각 자극에 대해 AC에서 분리된 각 단일 유닛의 발사 속도 응답을 보여준다. 4 회 연속 자극주기에 대한 Z 점수 응답이 표시된다. 단위는 분석된 4 개 사이클에서 평균 자극 단계 선호도에 따라 정렬된다. 흰색 점선은 청각 펄스 타이밍을 나타낸다. 도 26f는 20Hz 및 80Hz 시청각 자극 대 자극 없음 조건의 벡터 강도 분포를 보여준다 (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트 12 개 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다; 10 개 단위는 80Hz 자극 VS 값이 0.25보다 큼), Rayleigh 통계 분포는 20Hz 및 80Hz 시청각 자극 대 자극 없음 (오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz) 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 86 개 장치는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌으며 35 개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가짐). 도 26G는 청각 자극의 모든 주파수 (왼쪽, *** P <0.00025 20Hz - 40Hz, **** P <0.000025 20Hz - 80Hz, 40Hz) 간의 벡터 강도 값의 세포 내 차이 분포를 보여준다. - 랜덤, 40Hz - 80Hz ns, 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 모든 청각 자극 주파수 사이의 Rayleigh 통계 값의 세포 내 차이 (오른쪽, *** P <0.00025 20Hz-80Hz; **** P <0.000025 20Hz - 40Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80 Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정. 도 26h는 CA1의 (26a)와 동일하다. 도 26i는 CA1에 대한 26b와 동일함을 보여준다 (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 8 개 유닛은 30보다 큰 40Hz 자극 RS 값을 가짐). 도 26J는 CA1에 대한 26c와 동일하다. 도 26k는 CA1에 대한 26D와 동일함을 보여준다 (P> 0.01 40Hz - 자극 없음, n.s. 5 회 비교 제어 후, 다른 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26l은 CA1의 (26e)와 동일하다. 도 26m은 CA1에 대한 (26f)와 동일함을 보여준다 (왼쪽, **** P <0.0005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 16 개 장치는 20Hz 자극 VS 값이 더 큼 0.25 이상; 7 개 단위는 0.25보다 큰 80Hz 자극 VS 값을 가짐; 오른쪽, **** P <0.0005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 21 개 단위는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 3 개 장치는 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 26n은 CA1의 (26g)와 동일함을 보여준다 (왼쪽, *** P <0.00025 20Hz - 40Hz, **** P <0.00025 20Hz - 80Hz, 40Hz - 무작위, 40Hz - 80Hz ns; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정; 오른쪽, ** P <0.0025 20Hz - 40Hz; **** P <0.000025 40 Hz - 무작위; 기타 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26o는 mPFC에 대한 (26a)와 동일하다. 도 26p는 mPFC (오른쪽, **** P <0.00005 40Hz vs. No Stim, 40Hz vs. Random; Kolmogorov-Smirnov 테스트)에 대한 (26b)와 동일함을 보여준다 .1 유닛은 40Hz 자극 RS 값이 더 크다. 30 이상). 도 26q는 mPFC의 경우 (26c)와 동일하다. 도 26r은 mPFC에 대한 (26d)와 동일함을 보여준다 (P> 0.01 40Hz - 자극 없음, n.s. 5 개의 비교를 제어 한 후; 다른 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정). 도 26s는 mPFC에 대한 (26e)와 동일하다. 도 26t는 mPFC (왼쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음)에 대한 (26f)와 동일함을 보여준다. Kolmogorov-Smirnov 테스트; 4 개 단위는 0.25보다 큰 20Hz 자극 VS 값을 가졌다. 1 개 단위는 0.25보다 큰 80Hz 자극 VS 값을 가졌다. 오른쪽, **** P <0.00005 20Hz 대 자극 없음, 80Hz 대 자극 없음; Kolmogorov-Smirnov 테스트; 5 개 단위는 30보다 큰 20Hz 자극 RS 값을 가졌다. 1 유닛은 30보다 큰 80Hz 자극 RS 값을 가졌다. 도 26u는 mPFC (왼쪽, **** P <0.000025 40Hz - 랜덤, 다른 모든 n.s., 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정)에 대한 (26g)와 동일하다. 오른쪽, **** P <0.000025 40 Hz - 무작위; 기타 모든 n.s .; 중앙값이 0 인 윌콕슨 부호 순위 검정).
도 27은 상이한 자극 빈도가 특정 사이토카인 또는 사이토카인 그룹을 어떻게 증가 또는 감소시키는지를 설명하는, 어떤 조건에서 어떤 사이토카인이 상승되는지를 보여주는 벤 다이어그램을 예시한다. 벤 다이어그램의 특정 부분에 나열된 사이토카인은 해당 조건에서 해당 사이토카인이 상승함을 의미한다. 이와 같은 벤 다이어그램 (또는 인 단백질(phosphoprotein)에 대한 자극 또는 유전자지도에 대한 자극)을 사용하여 치료는 어떤 사이토카인이 증가하는 것이 가장 바람직한 지에 따라 특정 상태 또는 환자를 대상으로 한다.
예시적인 실시 양태
상술한 바와 같이, 감마 주파수 활성을 유도하는 것은 알츠하이머 병 (AD) 마우스 모델에서 미세 아교 세포 침윤 및 Aβ의 제거를 동원한다. 그리고 감마 결핍은 AD 병리학의 필수 구성 요소가 될 수 있다. 이러한 발견은 감마 진동이 신경 활동과 신경 면역 기능을 촉진하고 조정하는 데 중요한 이중 역할을 한다는 것을 나타낸다. 그러나 감마 활동이 신경 코딩과 신경 면역에서 이러한 이중 역할을 할 수있는 메커니즘은 이전에 완전히 알려지지 않았다. 또한 이전 연구에서는 감마 주파수 활동을 유도 한 결과 면역 조절 신호에 변화가 없음을 보여주었다. 본원에 기술 된 바와 같이, 감마 진동이 면역 활성과 시냅스 가소성을 모두 조절하는 분자 메커니즘이 확인되었다. 감마 활동은 AD의 인간과 동물 모델 모두에서 기능을 상실하기 때문에 감마 활동의 역할과 메커니즘을 이해해야 할 충족되지 않은 필요가 있다.
아래 설명된 예에서, 감마 활성은 동물 (예를 들어, 마우스)에 40Hz 감각 깜박임 (빠른 스트로브 광) 자극을 제공함으로써 비 침습적으로 구동될 수 있다. 감각 미광 자극은 신경 및 면역 기능을 조절하고 감마 자극에 대한 반응으로 신경 전기 활동을 특성화하는 세포 내 및 세포 외 신호 단백질을 프로파일링하는 기술과 결합된다. 예를 들어 시각 피질의 세포 내 신호 전달 경로와 면역 조절 사이토카인은 동물을 빛 깜박임에 노출시킨 후 프로파일링 되었다. 감각 깜박임 경로의 하위 집합 (예 : MAPK, NFκB)에서 빠른 스파이크 (예 : 5 분 미만)를 유발하고 한 시간 내에 미세 아교 세포를 조절하는 것으로 알려진 사이토카인의 생산을 증가시킨다. 비슷한 시간 동안 감각 깜박임 노출이 진행되는 동안 신경 전기 활동이 극적으로 증가하여 신경 회로가 가소성을 겪고 있음을 시사한다. 이러한 데이터는 감마 진동이 면역 기능과 시냅스 가소성을 모두 제어하는 유전자를 유도하는 일반적인 세포 내 경로를 촉발함을 시사한다 (예 : 도 4 참조).
염증 및 생존 및 가소성과 같은 다른 세포 기능을 지배하는 신호를 변경하기 위해 뉴런의 전기적 활동을 유도하는 예가 이제 설명된다. 깜빡이는 빛 기술을 사용하여 마우스 뇌의 시각 피질에서 감마 신경 활동을 유도하고 염증 신호에 미치는 영향을 평가했다. 시각 피질 조직의 시스템 분석을 사용하여 수많은 세포 내 염증 신호에 대한 깜박임의 영향을 조사했다. 깜박임 염증 경로의 하위 집합에서 급격한 스파이크 (<5 분)를 유발한 다음 한 시간 내에 미세 아교 세포를 조절하는 것으로 알려진 염증성 사이토카인의 생성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는 신경 활동을 유도하는 (및 일부 구현에서 비 침습적으로 신경 활동을 유도하는) 염증을 제어하는 뇌에서 분자 신호를 조작하는 방법으로 사용될 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이러한 염증 경로와 그들이 조절하는 다운스트림 유전자는 생존, 증식, 분화, 가소성 및 신경 발생을 포함한 다양한 유익한 세포 기능을 제어한다. 따라서 뇌 염증을 조절하는 이 접근법은 많은 뇌 질환, 뇌 손상, 감염 및 정상적인 뇌 노화의 영향을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 발견은 임상 및 기초 과학 수준 모두에서 광범위한 영향을 미친다. 예를 들어, 신경 활동을 유도하여 염증 신호를 조절하는 것은 신경 퇴행성 질환 (예 : 알츠하이머 병)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한 염증 신호를 조절하기 위해 신경 활동을 유도하는 것은 염증 신호 (예 : 정신 분열증), 뇌의 면역 반응 및 / 또는 신경 활동과 관련된 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다.
본원에 기재된 연구에 의해 수집된 데이터는 처음으로 감각 자극이 염증 및 세포 생존, 증식 및 분화에 관련된 유전자의 발현을 광범위하게 조절하는 세포 내 신호 전달의 변화를 유발한다는 것을 보여준다. 또한, 이 데이터는 감각 깜박임이 빠른 면역 반응을 유도한다는 첫 번째 증거 (몇 분 이내에 시작됨)가 표준 제약 방법보다 훨씬 빠르게 염증 신호를 조작 할 수 있다는 것을 보여준다. 즉, 이 데이터는 염증 신호와 다운스트림 염증 단백질이 시간이 지남에 따라 깜박임에 어떻게 반응하는지 보여준다.
감마 주파수에서 깜박이는 빛은 시각 피질에서 강력한 감마 진동을 유도하는 데 사용되었다. 빛 깜박임을 사용하여 시각 피질에서 감마를 구동하고, 야생형 C57Bl / 6 마우스를 감마 신경 활동에 대한 염증 신호 반응을 특성화하기 위해 다양한 기간 동안 빛 깜박임(즉, 테스트 그룹) 또는 어두운 챔버(즉, 대조군)에 노출되었다. 이것은 도 1a에 나와 있다. 마우스를 5 분, 10 분, 30 분 또는 60 분 동안 깜박임이나 어둠에 노출시킨 후 빠르게 뇌를 마우스에서 제거하고 시각 피질과 해마를 미세 해부하고 용해하여 단백질을 추출했다. 이것은 도 1B에 나와 있다. 시각 피질은 빛 깜박임에 매우 민감한 것으로 알려져 있지만 해마는 그렇지 않아 내부 통제 역할을 한다.
미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 활성화 된 B 세포 (NFκB) 경로의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서의 변화가 관찰되었다. 이러한 세포 내 경로는 유전자 발현과 단백질 합성을 조절하여 염증을 강력하게 조절한다. 이것은 도 2에 나와 있다. 또한 MAPK 및 NFκB 경로는 세포 생존, 증식 및 세포 분화를 촉진하는 기능도 가지고 있다. 다중 면역 분석 (예 : 텍사스 오스틴의 LUMINEX CORP. 및 EMD MILLIPORE의 다중 분석 시스템 사용)을 사용하여 깜박임 또는 제어 조건에 따른 MAPK 및 NFκB 경로 내의 단백질 인산화를 정량화하였다.
그 결과, 염증 신호에 대한 미광 자극의 여러 주요 효과가 발견되었다. 첫째, 깜박임 전 염증 신호 전달은 Atf-2 및 Jnk (Jun kinase)의 인산화가 급격히 일시적으로 (~ 5 분) 증가한 후 신호가 지속적으로 감소한다. 이러한 효과는 도 3a 및 3b에 나와 있다. 도 3b는 자극 60 분 후 MAPK 경로의 명백한 지속적인 감소를 보여준다. 둘째, 깜박임 노출 후 약 30 분 이내에 염증성 사이토카인이 증가하고 깜박임 시작 후 2 시간 동안 계속 증가한다. 이러한 효과는 도 3C 및 3D에 표시된다. MAPK 및 NFκB 경로 내의 신호 전달은 사이토카인 발현에 선행하며 면역 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 초기 세포 내 신호는 사이토카인 발현을 촉진하고 후속 신경 염증을 조절하는 메커니즘일 가능성이 높다.
깜박임 (예를 들어, RANTES, MIP-2 등)에 반응하여 발현되는 사이토카인은 면역조절 조절제이다. 또한 G-CSF와 같이 깜박임에 반응하여 증가하는 다른 요인은 신경 영양성이다. 따라서 이러한 결과는 감각 깜박임이 뇌 면역 반응뿐만 아니라 세포 생존, 증식, 분화, 가소성 및 신경 발생과 관련된 일련의 신호 전달을 유도한다는 것을 보여준다.
감마 깜박임은 신경 염증, 세포 생존 및 가소성을 제어하는 세포 내 신호 전달을 자극한다. 이러한 기능은 정상적인 뇌 기능에 중요하며 부상 및 질병과 관련된 신경 학적 상태에서 조절이 어렵다. 따라서 이러한 경로의 감마 자극 변조는 수많은 조건에 개입하고 뇌 건강을 촉진하는 강력한 도구이다.
개체에서 뇌 면역 조절 신호 전달을 제어하기 위한 예시적인 방법이 아래에 설명된다. 이 방법은 개체에게 자극을 전달하는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로 자극은 감각 자극과 같은 비 침습적 자극이며, 아래에서 자세히 설명한다. 또한 자극은 비 약리적 일 수 있다. 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도한다. 특히 자극은 개체의 뇌에서 감마 활동을 유도할 수 있다. 감마 활동은 20Hz에서 100Hz 사이의 주파수를 갖는 신경 진동이다. 일부 구현에서, 감마 활동은 20Hz와 80Hz 사이 범위의 신경 진동이다. 선택적으로 감마 활동은 약 40Hz에서 신경 진동이다. 감마 활성은 당 업계에 공지되어 있으므로 여기에서 더 자세히 설명하지 않는다. 감마 활동은 개체 뇌의 감각 피질에서 유도될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 감마 활성은 해마, 내측 측두엽, 전두엽, 피질 하 구조, 시상, 시상 하부 또는 뇌간과 같은 심부 뇌 영역에서 유도 될 수 있다. 본 개시 내용은 감마 활성이 다른 뇌 영역 또는 신경계의 일부에서 유도될 수 있음을 고려한다. 즉, 감각 피질, 해마, 내측 측두엽 및 / 또는 전두엽에서 감마 활성을 유도하는 것은 예로서 만 제공된다.
전술한 바와 같이, 자극은 선택적으로 감각 미광 자극 (본 명세서에서 "감각 깜박임"라고도 함) 일 수 있다. 감마 활동 (예 : 약 40Hz 신경 진동)을 유도하기 위해 감각 깜박임 (예 : 시각, 청각 등)이 사용된다. 일부 구현에서, 감각 미광 자극은 시각적 깜박임이다. 감마 주파수에서 깜박이는 빛은 뇌의 시각 피질에서 감마 진동을 일으키는 것으로 알려져 있다. 그리고 효과는 약하지만 감마 주파수에서 깜박이는 빛은 해마 (HPC)에서 감마 진동을 일으키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 시각적 미광 자극은 25ms마다 12.5 밀리 초 (ms) 동안 빛 (예 : 백색광)을 깜박임으로써 선택적으로 생성 할 수 있다. 시각적 미광 자극의 색상 및 / 또는 매개 변수 (예 : 주파수,주기, 듀티 사이클 등)는 예로서만 제공되며 감마 활동을 유도하면서 다른 특성 / 값을 가질 수 있음을 이해해야한다. 다른 구현에서, 감각 미광 자극은 청각 깜박임이다. 청각 감각 깜박임은 HPC에서 감마 진동을 유발할 수 있다. 예를 들어, 청각 미광 자극은 25ms마다 1ms 길이의 10kHz 톤을 울림으로써 선택적으로 생성할 수 있다. 청각 미광 자극의 음조 주파수 및 / 또는 매개 변수 (예 : 주파수,주기, 듀티 사이클 등)는 예로서만 제공되며 감마 활동을 유도하면서 다른 특성 / 값을 가질 수 있음을 이해해야한다. 또 다른 구현에서, 감각 깜박임은 시각 및 청각 깜박임과 결합 될 수 있다. 예를 들어, 결합된 시각 및 청각 미광 자극은 선택적으로 조명을 깜박이고 25ms마다 톤을 울림으로써 생성될 수 있다.
대안적으로, 자극은 경두개 전기 자극 (TES) 일 수 있다. TES는 하나 이상의 전극을 통해 뇌에 전류를 전달한다. 전류는 자극기에 의해 공급된다. 전류는 뇌의 신경 활동을 유도하는 전기장을 생성한다. TES는 당 업계에 공지되어 있으므로 아래에서 자세히 설명하지 않는다. 또는 자극은 경두개 자기 자극 (TMS) 일 수 있다. TMS는 다양한 자기장을 사용하여 전자기 유도를 통해 뇌의 전기 활동을 유도한다. TMS는 개체의 머리 근처에 자기장 발생기 (예 : 코일)를 배치하여 제공된다. 자극기에 의해 코일에 다양한 전류가 공급된다. TMS는 당 업계에 공지되어 있으므로 아래에서 자세히 설명하지 않는다. 감각 자극 (예를 들어, 청각 및 / 또는 시각적 깜박임), TES 및 TMS는 예시 자극 기술로서만 제공된다는 것을 이해해야한다. 본 개시 내용은 광유전적 자극, 자기 유전적 자극, 침습성 전기 자극, 기계적 자극, 집중 초음파 또는 말초 신경 자극을 포함하지만 이에 제한되지 않는 자극을 개체에게 전달하기 위한 다른 기술을 사용하는 것을 고려한다.
추가적으로, 자극은 개체 내 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절할 수 있다. 면역 조절 신호에는 전 염증 또는 항 염증 신호가 포함될 수 있다. 자극은 또한 분화를 조절하는 세포 내 신호 전달을 조절할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 자극은 신경 염증 (예를 들어, 전 염증 또는 항 염증), 세포 생존 및 분화를 포함 하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달을 조절한다. 신경 염증, 세포 생존 및 분화는 본원에 기재된 자극에 의해 조절되는 세포 내 신호 전달에 의해 조절되는 세포 기능의 예로서만 제공된다. 선택적으로, 자극의 전달은 면역 조절 신호 전달 및 / 또는 세포 생존 신호 전달 조절이 일시적이도록 제어될 수 있다. 즉, 면역 조절 신호 및 / 또는 세포 생존 신호가 켜지고 꺼지도록 자극이 제어된다. 만성적으로 활성화된 면역 반응은 대부분의 경우 바람직하지 않다는 것을 이해해야한다. 자극은 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로를 상향 조절할 수 있다. 이것은 감각 깜박임에 대한 MAPK 및 NFκB 신호 반응을 보여주는 도 2, 3a 및 3b에 표시된다. 일부 구현에서, 세포 내 신호 전달 경로는 표준 키나아제 경로 일 수 있다. 일부 구현에서, 세포 내 신호 전달 경로는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로, 활성화 된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 (NFκB) 경로, 사이클로옥시게나제(Cyclooxygenase)-2 (COX-2) 경로, 핵 인자 (적혈구 유래 2)-유사 2 (Nrf2) 경로, 포스파티딜이노시톨(Phosphatidylinositol) -4,5- 비스포스페이트(bisphosphate) 3- 키나아제 (PI3K) / Akt 경로, 또는 야누스 키나아제 (JAK)-신호 변환기 및 전사 활성자 (STAT) 경로일 수 있다. 본원에 기재된 세포 내 신호 전달 경로는 단지 예로서 제공된다는 것을 이해해야한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 자극은 적어도 하나의 면역 조절 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자의 발현을 변경할 수 있다. 이것은 감각 깜박임에 대한 반응으로 염증을 조절하는 사이토카인의 증가된 발현을 보여주는 도 3C 및 3D에 의해 표시된다. 예를 들어, 적어도 하나의 면역 조절 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자는 MIP-2, G-CSF, RANTES 또는 IFN-γ이다. 본원에 기재된 면역 조절 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자는 단지 예로서 제공된다는 것을 이해해야한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 세포 내 신호 전달에 대한 자극 효과는 적어도 하나의 즉각적인 초기 유전자의 발현 또는 활성을 조절 (예를 들어, 상향 조절 또는 감소) 할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 즉각적인 초기 유전자는 활성 조절 세포 골격 관련 단백질 (ARC) 또는 Fos 원종양 유전자 (C-Fos)를 포함 할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기술된 즉각적인 초기 유전자는 단지 예로서 제공된다는 것을 이해해야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 자극은 통상적인 방법에 비해 더 빠른 면역 조절 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 주사를 통해 염증 신호를 변경하는 데 사용되는 약리학적 제제 (즉, 약물)는 뇌에 도달하고 면역 조절 신호를 변경하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있다. 더욱이, 본원에 기술된 자극 방법은 많은 약리학적 제제와 마찬가지로 혈액-뇌 장벽에 의해 제한되지 않는다. 일부 구현에서, 본원에 기재된 감각 자극은 약 1 시간 이내에 개체 내 면역 조절 신호 전달 반응을 유발할 수 있다 (예를 들어,도 3B에서 MAPK 경로의 지속적인 감소;도 3D에서 사이토카인 발현 증가). 일부 경우에, 자극은 약 30 분 이내에 개체 내에서 면역 조절 신호 전달 반응을 유발할 수 있다 (예를 들어,도 3C에서 증가된 사이토카인 발현). 또 다른 경우에, 자극은 약 5 분 이내에 개체 내에서 면역 조절 신호 전달 반응을 유발할 수 있다 (예를 들어,도 3a에서 Atf-2 및 Jnk의 인산화의 급속한 일시적인 증가).
본원에 기재된 방법은 신경 활성을 유도함으로써 신경 염증 및 또한 세포 생존, 증식 및 분화를 조절하는 세포 내 신호 전달을 조절하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 방법은 개체에게 전달되는 자극을 사용하여 개체의 뇌에서 질병, 상해, 감염 또는 정상 노화 중 적어도 하나를 치료하는 것을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 방법은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 것을 포함 할 수있다. 신경 퇴행성 질환에는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 치매, 전측두엽 성 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 다발성 경화증 (MS)이 포함 되나 이에 국한되지 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 자극이 개체 내에서 염증 신호를 조절할 수 있기 때문에 새로운 부류의 상태가 치료 될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 방법은 간질, 정신 분열증, 자폐증, 외상성 뇌 손상 (TBI) 또는 정상 노화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 염증 신호 전달을 포함하는 상태를 치료하는 것을 포함 할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체 뇌의 신경 가소성을 유도하는 것을 포함 할 수 있다. 본원에 기재된 방법으로 상향 조절되는 것으로 나타난 세포 내 경로 중 하나 인 MAPK 경로는 시냅스 가소성의 주요 조절자인 것으로 알려져 있다.
뇌 활동을 제어하기 위한 추가 방법이 아래에 설명되어 있다. 본 명세서에 기술 된 바와 같이, 자극(예를 들어, 시각 및 / 또는 청각 감각 자극)은 개체에게 전달 될 수 있다. 일부 구현에서, 자극은 선택적으로 감각 미광 자극이다. 감각 미광 자극(예 : 40Hz 미광 자극)은 시냅스 가소성, 신진 대사, 증식, 유전자 발현, 분화, 유사 분열, 세포 생존 및 / 또는 아폽토시스를 포함한 많은 뇌 기능을 담당하는 유전자의 발현을 제어하는 세포 내 신호 전달(예 : MAPK, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 경로 및 NFκB, 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 경로)을 유발할 수 있다. 감각 미광 자극은 뉴런 내에서 이러한 경로를 조절하여 사이토카인과 같은 주요 분비 인자의 뉴런 발현을 유발하여 내피 세포, 희소 돌기 아교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포를 포함하여 뇌의 다른 모든 세포 유형에 영향을 미친다. 따라서 감각 미광 자극은 MAPK 및 NFκB 경로를 제어하는 신경 활동을 유도하여 궁극적으로 성상 세포의 리소좀 기능 장애, 수초화, 활성화 및 포도당 대사 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 신경 퇴행성 및 신경계 질환과 관련된 다양한 기능의 변화를 유도한다. 혈액-뇌 장벽 기능, 뇌 혈관 성장, 지질 및 금속 대사. 감각 미광 자극 (예 : VEGF, MIG)에 대한 반응으로 발현되는 특정 사이토카인이 주어지면 중추 신경계 외부의 세포, 예를 들어 말초 면역 세포 침윤을 제어 할 수 있다.
후술되는 일부 구현에서, 상이한 자극 매개 변수 (예를 들어, 자극 빈도 및 / 또는 자극 기간)는 이들 경로에 의해 조절되는 단백질 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 등)의 발현에 차별적으로 영향을 미치기 위해 사용된다. 즉, 자극의 지속 시간 및 / 또는 빈도와 같은 매개 변수를 사용하여 자극 효과를 조정할 수 있다. 예를 들어, 40Hz 깜박임이 5분이면 MAPK 경로의 단백질인 ERK 인산화가 증가하고, 40Hz 깜박임이 30분 이상이면 ERK 인산화가 감소한다. 또한 1 시간 동안 20Hz 깜박임은 사이토카인 수준을 낮추고 40Hz 깜박임은 사이토카인 수준을 높이고 일정한 빛 자극은 둘 사이의 사이토카인 수준을 초래한다. 이는 두 가지 예로서 만 제공된다. 다른 예시적인 차별적 효과는 도 17과 27에 나와 있다.
일부 구현에서, 자극 매개 변수 (예를 들어, 기간, 빈도 등)와 단백질 발현 사이의 이러한 관계를 사용하여 특정 환자 또는 질병 상태에 대한 치료법을 개별화 할 수 있다. 이 관계는 자극-유전자 발현 (StG) 맵이라고 할 수 있다. 따라서 자극은 필요에 따라 개인에 따라 다른 효과를 생성하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 질병 또는 개인에서 RANTES (다른 사이토카인)를 증가시키면서 TNF- 알파 (특정 사이토카인)를 감소시키는 것이 바람직 할 수 있다. 이 효과를 얻기 위해 이러한 효과를 생성하는 특정 자극 조건을 찾아 환자에게 적용하고 대뇌 척수액의 효과를 읽을 수 있다. 그런 다음 환자의 반응 또는 시간 경과에 따른 개인의 변화에 따라 자극 매개 변수를 미세 조정할 수 있다.
개체에서 뇌 활동을 제어하는 예시적인 방법이 설명된다. 이 방법에 따르면 자극은 짧은 시간 동안 전달된다. 첫 번째 단계에서, 자극이 개체에게 전달되고, 자극이 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도하고 개체 내에서 세포 활동의 적어도 하나의 가용성 매개체의 발현을 조절한다. 본원에 기재된 바와 같이, 개체 내 세포 활성의 하나 이상의 가용성 매개체는 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자 일 수 있다. 또한 자극은 1 시간 미만 동안 개체에게 전달될 수 있다. 선택적으로, 자극은 약 30분 미만 동안 개체에게 전달될 수 있다 (예 : 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 분). 선택적으로, 자극은 약 10 분 미만 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 분) 동안 개체에게 전달 될 수 있다. 선택적으로, 자극은 약 5 분 미만 (예 : 5, 4, 3, 2, 1 분) 동안 개체에게 전달 될 수 있다. 일반적으로 면역 기능을 조작하는 기술은 효과를 보기까지 1 시간 이상 걸린다. 대조적으로, 그리고 본원에 기술된 바와 같이, MAPK 및 NFκB 경로는 본원에 기술된 방법을 사용하여 빠르게 ON / OFF (예를 들어, 5 분에 증가 및 10 분에 감소)하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 일시적인 면역 반응이 종종 바람직하며, 이는 바람직하지 않거나 부적응 할 수 있는 만성 면역 반응과 대조된다. 또한, 기존 기술을 사용하여 발생하는 지속적인 경로 활성화는 유전자 발현 및 기타 메커니즘에 의해 조절되는 피드백을 통한 부정적인 조절로 이어질 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 단기간 자극 기술은 다양한 유전자의 발현을 "정확하게" 조절하는 능력을 가능하게 하는 경로 활성화를 유도할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 뇌 활동을 제어하기 위한 통상적인 기술과 비교하여 상기 열거된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이점을 갖는다.
일부 구현에서, 자극은 비 침습적 자극 일 수 있다. 일부 구현에서, 자극은 경두개 전기 자극 또는 경두개 자기 자극 일 수 있다. 다른 구현에서, 자극은 시각적 자극, 청각 자극 또는 이들의 조합 일 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 시각적 자극은 빛 (예 : 백색광)으로 생성 될 수 있고 청각 자극은 소리로 생성 될 수 있다. 선택적으로 자극은 감마 활동을 유도하는 데 사용되는 감각 깜박임 일 수 있다. 예를 들어, 자극은 20Hz 감각 미광 자극 일 수 있다. 또는 자극은 40Hz 감각 미광 자극 일 수 있다. 시각적 미광 자극은 원하는 주파수 (예 : 40Hz의 경우 25ms마다 12.5 밀리 초 (ms) ON, 20Hz의 경우 50ms마다 25ms ON)로 빛을 깜박임으로써 생성 할 수 있다. 본 개시는 4-50 % 사이의 듀티(duty) 사이클이 시각적 미광 자극에 사용될 수 있음을 고려한다. 시각적 미광 자극의 색상 및 / 또는 매개 변수 (예 : 주파수,주기, 듀티 사이클 등)는 예로서만 제공되며 감마 활동을 유도하면서 다른 특성 / 값을 가질 수 있음을 이해해야한다. 청각 미광 자극은 25ms마다 1ms 길이의 10kHz 톤을 울리면 생성 할 수 있다. 청각 미광 자극의 음조 주파수 및 / 또는 매개 변수 (예 : 주파수,주기, 듀티 사이클 등)는 예로서 만 제공되며 감마 활동을 유도하면서 다른 특성 / 값을 가질 수 있음을 이해해야한다. 일부 구현에서, 자극은 임의의 감각 미광 자극 일 수 있다. 임의의 감각 깜박임은 가변 인터 펄스 (예 : 빛 또는 소리) 간격으로 달성 할 수 있다. 예를 들어 다음 빛 또는 소리 펄스가 켜지기 전에 빛 또는 소리 펄스가 꺼지는 시간 사이의 시간을 변경한다. 대안으로, 자극은 일정한 감각 자극 (미광 자극과 반대), 예를 들어 일정한 빛 자극 일 수 있다.
자극을 전달함으로써 감각 피질 중 하나 이상에서 뇌 활동을 유도 할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 뇌 활동은 해마, 내측 측두엽 또는 전두엽 중 적어도 하나와 같은 심부 뇌 영역에서 유도 될 수 있다. 선택적으로 일부 구현에서는 자극이 개체의 뇌에서 감마 신경 활동을 유도한다.
선택적으로, 다음 단계에서, 개체의 질병 또는 상태는 개체에게 전달된 자극을 사용하여 치료된다. 일부 구현에서, 개체의 뇌에서 질병, 부상, 감염 또는 정상적인 노화가 치료된다. 다른 구현에서, 신경 퇴행성 질환이 치료된다. 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 치매, 전측두엽 성 치매, 혈관성 치매, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 다발성 경화증 (MS)을 포함 할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 구현에서, 개체의 상태는 개체 내 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절함으로써 치료된다. 질환은 간질, 정신 분열증, 자폐증, 외상성 뇌 손상 (TBI), 양극성 장애, 뇌졸중 또는 우울증을 포함 할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
한 측면에서, 개시된 방법에서 자극이 1 시간 미만 동안 전달 될 수 있음이 이해되고 본원에서 고려된다. 한 측면에서, 1 시간 미만의 자극은 단일 노출로 또는 하루에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 150회 또는 그 이상의 투여 노출로 전달 될 수 있다. 추가로, 자극 치료는 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 시간에 한번 이상, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 일에 한번 이상, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월에 한 번 이상 투여될 수 있음이 이해되고 본원에서 고려된다. 한 측면에서, 치료는 신경학적 질환 또는 상태를 치료하기 위해 필요에 따라 또는 1 회 투여 될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 치료는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60 일, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 개월, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 년 또는 그 이상 발생할 수 있다. 한 측면에서, 치료는 개체의 나머지 수명 동안 계속된다.
개체의 뇌 활동을 제어하기 위한 또 다른 예시적인 방법이 설명된다. 이 방법에 따르면, 자극 매개 변수와 단백질 발현 사이의 관계는 특정 환자 및 / 또는 질병 상태에 대한 치료법을 개별화하는 데 사용된다. 첫 번째 단계에서, 조절하려는 개체 내 세포 활성의 적어도 하나의 가용성 매개체 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인 또는 성장인자)가 선택된다. 이는 예를 들어 특정 개체 및 / 또는 질병의 치료와 관련된 단백질을 선택함으로써 달성 될 수 있다.
다음 단계에서, 세포 활성의 선택된 적어도 하나의 가용성 매개체를 조절하는 유형의 자극이 선택 될 수 있다. 자극 매개 변수 (예 : 유형, 빈도, 기간 등)는 조절될 세포 활동의 가용성 매개체에 따라 변경되거나 선택 될 수 있다. 예를 들어, 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극 중 하나를 선택할 수 있다. 세포 활성의 선택된 가용성 매개체를 조절하는 자극은 예를 들어 원하는 효과를 생성하는 특정 자극 조건을 조사함으로써 선택 될 수 있다. 일부 구현에서, 다른 자극 주파수는 다른 효과를 생성한다. 일부 구현에서, 다른 자극 기간은 단순한 용량 의존 곡선이 아닌 방식으로 다른 효과를 생성한다 (예 : 더 긴 자극 = 더 큰 효과), 예를 들어 MAPK는 40Hz의 5 분에 상승하고 30 분에 하락하는 반면 사이토카인은 40Hz의 1 시간에 상승한다. 상이한 자극 파라미터의 다른 예시적인 차동 효과가 도 17 및 27에 도시되어있다. 예시 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극 및 일정한 감각 자극이 위에 설명되어있다. 위에 제공된 감각 깜박임 주파수 (예를 들어, 20Hz 및 40Hz)는 단지 예로서 제공되며 다른 주파수가 여기에 설명된 기술과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해해야한다.
20Hz 감각 미광 자극은 세포 활동의 가용성 매개체를 조절할 수 있다. 한 측면에서, 20Hz 감각 미광 자극은 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-7 (IL-7), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨-12p70 (IL-12p70)을 조절할 수 있다. ), 인터루킨-12p40 (IL-12p40), 인터페론-γ(IFN-γ), LIF, 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 대식세포 염증 단백질 1β(MIP-1b), 에오탁신, 인터루킨-10 (IL-10), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-9 (IL-9), 대식세포 염증 단백질 1α (MIP-1α), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노카인 (MIG), 성장 조절 종양 유전자 (GRO-α), LIX (CXCL5라고도 함), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터루킨-1β (IL-1β), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-15 (IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES), 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF), 인터루킨-13 (IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질 1 (MCP-1), 및/또는 인터루킨-1α (IL-1α). 40Hz 감각 미광 자극은 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-7 (IL-7), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨-12p70 (IL-12p70), 인터루킨-12p40 (IL-12p40), 인터페론-γ (IFN-γ), LIF, 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 대식세포 염증 단백질 1β (MIP-1β) 및 / 또는 에오탁신을 조절할 수 있다. 무작위 감각 미광 자극은 IL-10을 조절할 수 있다. 일정한 감각 자극은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-9 (IL-9) 및 / 또는 대식세포 염증성 단백질 1α ( MIP-1α)를 조절할 수 있다. 한 측면에서, 자극은 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 깜박임 일 수 있다. 자극이 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 깜박임인 경우, 자극은 종양 유전자-α (GRO-α), LIX (CXCL5), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터루킨 -1β (IL -1β), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-15 (IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES) 및 / 또는 대식세포 콜로니 자극인자 (M-CSF)를 조절할 수 있다. 다른 측면에서, 자극은 40Hz 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극일 수있다. 자극이 40Hz 감각 미광 자극 또는 지속적인 감각 자극인 경우 자극은 인터루킨-13 (IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질 1 (MCP-1) 및 / 또는 인터루킨 -1α (IL-1α)을 조절할 수 있다.
다음 단계에서, 선택된 감각 자극은 개체에게 전달되고, 감각 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도한다.
선택적으로, 다음 단계에서, 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체의 질환 또는 상태가 치료된다. 일부 구현에서, 개체의 뇌에서 질병, 부상, 감염 또는 정상적인 노화가 치료된다. 다른 구현에서, 신경 퇴행성 질환이 치료된다. 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 치매, 전측두엽 성 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 다발성 경화증 (MS)을 포함 할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 구현에서, 개체의 상태는 개체 내 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절함으로써 치료된다. 질환은 간질, 정신 분열증, 자폐증, 외상성 뇌 손상 (TBI), 양극성 장애, 뇌졸중 또는 우울증을 포함 할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1.
아래의 예는 감마 진동이 알츠하이머 병에서 뇌 면역 활성을 조절하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. 데이터는 감마 진동 형태의 신경 활동이 MAPK 및 NFκB 경로 내에서 신호를 빠르게 자극함으로써 신경 면역 활동을 촉진 할 수 있음을 보여준다. 자극된 활성은 여러 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 발현을 유도하며, 이는 미세 아교 세포를 모집하고 생존, 증식, 분화, 가소성 및 신경 발생 등 다양한 유익한 세포 기능을 제어하는 것으로 알려져 있다.
방법. 마우스에게 시각 또는 청각 40Hz 감각 깜박임을 제시함으로써 마우스 뇌의 여러 부분에서 감마 진동을 유도하는 프로토콜이 개발되었다. 또한 통합 시스템 분석을 사용하여 세포 내 신호 전달 경로를 프로파일링하고 감마 유도와 밀접하게 관련된 후보 신호 및 경로를 식별했다. 이 학제 간 접근 방식은 감마 활동, 신경 기능 및 면역 활동 간의 복잡한 관계를 특성화 할 수 있는 전례없는 기회를 제공한다. 알츠하이머 병 환자의 감마 활동 결핍이 보고된 것을 감안할 때, 이 연구는 알츠하이머 병에서 이러한 손실의 의미에 대한 중요한 새로운 이해에 기여한다.
청각 깜박임과 결합된 청각 및 시각적 깜박임이 해마에서 감마를 유도한다.
감마 주파수 (예를 들어, 약 40Hz)에서 신경 활성을 유도하는 것이 형태 학적으로 변형된 미세 아교 세포를 동원하여 AD에서 신경 독성 이벤트를 시작하는 것으로 생각되는 단백질인 아밀로이드 베타의 삼킴을 증가 시킨다는 것이 최근 발견되었다 (도 5). 40Hz 신경 활동을 1시간 동안 구동하면 아밀로이드 베타가 40 % 감소했다. 처음에는 침습성 광 유전학이 감마를 유도하는 데 사용되었다. 침습성 광 유전학은 레이저 광으로 신경 활동을 유도하기 위해 바이러스 감염 및 섬유 이식이 필요하다. 감마를 비 침습적으로 구동하는 방법이 개발되었다: 40Hz에서 깜박이는 불빛. 감마 주파수에서 깜박이는 빛은 시각 피질에서 강한 감마 진동을 유발하지만 공간 및 경험적 기억에 필수적인 뇌 영역 인 해마 (HPC)에서는 효과가 약하다.
40Hz에서의 청각 감각 깜박임은 또한 HPC에서 40Hz 신경 활동을 유도한다 (도 6A-6B). 이 발견은 학습과 기억에 필수적인 해마 신경 코드에 비 침습적으로 감마를 운전하는 효과를 연구 할 수 있게 한다. 전기 생리학적 기록은 구형 트레드밀에서 달리거나 쉬고 있는 야생형 (C57BL6J) 마우스의 해마 CA1 하위 영역 (HPC)에서 32 채널 실리콘 프로브를 사용하여 수행되었다. 신경 활동이 기록되는 동안 동물에게 (1) 조용한 어둠, (2) 40Hz에서 켜지고 꺼지는 톤 (25ms마다 재생되는 1ms 길이의 10kHz 톤, 아래에서 청각 미광 자극이라고 함) 및 (3) 40Hz에서 켜지고 꺼지는 톤 및 조명 (25ms마다 1ms 길이의 10kHz 톤 및 12.5ms 길이의 흰색 조명, 아래에서는 다중 모드 미광 자극이라고 함). 시각적 깜박임, 청각적 깜박임 및 다중 모드 미광 자극은 또한 본 명세서에서 때때로 시각적 깜박임, 청각적 깜박임 및 결합된 시각 및 청각적 깜박임으로 지칭된다. 추가로, 이러한 자극은 여기에 설명 된 감각 깜박임의 예시이다. 감각 자극에 대한 응답으로 스파이킹은 톤과 함께 주기적으로 증가 및 감소하여 40Hz 청각 또는 다중 모드 미광 자극 동안 신경 활동이 40Hz로 동반된다 (도 6A-6B). 40Hz 청각 깜박임 동안 스파이킹 속도의 피크간 간격은 대부분의 기록 사이트에서 약 25ms (40Hz에 해당)였다. 청각 자극 동안, 기록 사이트의 평균 55 %가 주기적인 스파이킹 반응을 보였고 청각 + 시각적 자극 동안 CA1 기록 사이트의 61 %는 기준 기간 동안 기록 사이트의 1 %에 비해 주기적인 스파이크를 가졌다 (도 6A-6B). 따라서 40Hz 청각 또는 청각 및 시각적 미광 자극은 CA1에서 강력한 40Hz 동반을 유도했다. 또한, 7 일 동안 1 시간 / 일 동안 청각 깜박임 또는 복합 청각 및 시각 깜박임에 동물을 노출 시키면 미세 아교 세포를 모집하고 HPC에서 아밀로이드 베타 부하를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 감마를 비 침습적으로 구동하는 결합된 청각 및 시각적 깜박임 방법은 감마가 미세 아교 세포 활동 및 신경 코딩을 조절하는 메커니즘을 확인하고 감마 처리가 AD 마우스를 치료하는 데 얼마나 효과적 일 수 있는지 보여주기 위해 아래에 사용되었다.
감각 깜박임은 시각 피질에서 염증성 사이토카인의 발현을 상향 조절한다.
깜박임에 의해 활성화된 면역 신호를 확인하기 위해, 다중 면역 분석 (예 : 텍사스 오스틴에 있는 LUMINEX CORP. 및 EMD MILLIPORE의 다중 분석 시스템)을 사용하여 시각 피질 내에서 32 개의 사이토카인 및 성장 인자 단백질의 발현을 정량화했다. 마우스에게 30 분 또는 60 분 동안 시각적 깜박임이 표시되었다. 분석 결과 특정 사이토카인이 30 분까지 미묘하게 증가하고 (데이터는 표시되지 않음), 미세 아교 세포(microglial) 모집 및 활성화에 관련된 사이토카인이 60 분까지 현저하게 증가한 것으로 나타났다 (도 7A). 데이터의 다차원적 특성을 설명하기 위해 깜박임과 가장 강한 상관 관계가 있는 사이토카인을 식별하기 위한 편향되지 않은 전략으로 판별 부분 최소 제곱 회귀 (D-PLSR)를 사용했다. D-PLSR은 주성분 분석과 유사하지만 그룹 간의 최대 차이를 식별한다. 분석은 어두운 마우스와 깜박임을 가장 잘 구별하는 사이토카인 LV1의 프로필을 확인했다 (도 7B). 축 LV1은 시각 피질의 깜박임 또는 어두운 동물과 상관 관계가 있는 사이토카인 (도 7C)의 프로필로 구성되었다. 중요한 것은 깜박임과의 상위 상관 관계가 MIP-2, IL-3, RANTES 및 IFN-γ였으며, 이는 미세 아교 세포 모집 및 활성화 / 분극에 관여한다. 이러한 데이터는 세포 외 사이토카인 / 케모카인 신호 전달이 깜박임에 대한 반응으로 미세 아교 세포 활성을 담당 할 수 있음을 시사한다.
감각 깜박임은 시각 피질에서 세포 내 MAPK 및 NFκB 신호 전달을 상향 조절한다.
면역 활성은 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 (NFκB) 경로를 포함하는 여러 표준 키나아제 경로 내에서 세포 내 신호 전달에 의해 중앙에서 조절된다. 이러한 경로는 미세 아교 세포의 모집 및 활성화에 관여하는 사이토카인을 포함한 수많은 인자의 다운스트림 발현을 조절한다. 또한, 이러한 경로는 신경 활동을 조절하는 Arc 및 C-Fos를 포함하여 즉각적인 초기 유전자의 발현과 활동을 조절한다. 이러한 경로는 또한 뉴런 및 기타 세포 유형 내에서 생존 신호를 조절하고 촉진한다. 따라서, 그들은 전기 감마 활동과 미세 아교 세포 및 성상 세포 모집 및 활성화, 신경 세포 건강 및 생존과 같은 광범위한 면역 반응 사이의 자연스러운 다리를 나타낸다. 중요한 것은 미세 아교 세포 활성화와 같은 세포 반응 표현형이 세포 내 신호 전달 (~ 분)보다 훨씬 긴 시간 척도 (~ 시간-일)에서 발생한다 . 따라서 시각 피질은 5 분 또는 10 분의 시각적 깜박임 후 짧은 시점에 분석되었다. 마우스를 깜박임에 노출시킨 다음 즉시 안락사시키고, 안락사 후 3 분 이내에 뇌 조직을 수집하고 용해시켰다. 루미넥스(Luminex) 분석이 다시 사용되었지만 이번에는 MAPK 경로 내의 5 개의 인 단백질과 NFκB 경로 내의 2 개의 인 단백질을 정량화했다 (도 8A). D-PLSR 분석을 사용하여 시각 피질의 5 분 깜박임 샘플을 인산 단백질 LV1의 축을 따라 HPC 깜박임 샘플 (도 8B)에서 분리했다. 이 경우 LV1은 Atf-2, Jnk, IκB 및 NFκB를 포함하는 인 단백질의 프로파일로 구성되었으며, 시각 피질에서 5 분 시점에 상향 조절되었지만 해마는 아니다. 또한, 이러한 신호 증가는 시각 피질에서 10 분 시점까지 손실되었다 (도 8B). 흥미롭게도, 상향 조절된 모든 신호는 경로에서 상대적으로 다운스트림에 있으며, 이는 업스트림 인산화가 더 이른 시점에 발생할 수 있음을 시사한다. 또한, 이러한 경로는 알려진 키나아제 신호 전달의 일시적인 것과 일치하는 30 분 또는 60 분 시점 (표시되지 않음)에서 상향 조절되는 것으로 밝혀지지 않았다. 마지막으로, 사이토카인 데이터는 세포 외 사이토카인 신호가 감마 후 미세 아교 세포 활성에 관여 할 수 있음을 시사하기 때문에 면역 조직 화학 (IHC)을 사용하여 NFκB 신호 전달이 발생하는 세포 유형을 결정하였다. 공동 표지에 의해 NFκB가 뉴런 마커 NeuN과 공동 국 재화되었음을 발견했다(도 8c). Iba1 + microglia와 NFκB의 공동 표지는 확인되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 사이토카인 데이터와 결합된 이러한 신호 전달 데이터는 감마 진동이 신경 세포 내 신호 전달을 유도하여 사이토카인과 같은 면역 조절 인자의 다운 스트림 발현을 자극하고 미세 아교 세포 활성을 자극함을 시사한다.
감마 결핍은 알츠하이머 병 마우스에서 발견된다.
감마 진동의 결함은 형질전환 5xFAD 아밀로이드 마우스 모델을 포함하여 알츠하이머의 마우스 모델에서 발견되었다. 특히, 감마 진동의 강도 부족과 스파이크가 감마 진동에 의해 얼마나 잘 조절되는지는 건강한 마우스의 공간 학습 및 기억에 필수적인 활동 인 SWR (sharp wave ripple) 중에 확인되었다. 이러한 적자는 행동 적자 (3 개월령에 처음 발견됨) 이전에 질병 초기에 시작된다. 또한, 감마 활성을 유도하면 아밀로이드 베타 수준이 크게 감소하고 아밀로이드의 삼킴을 증가시키기 위해 미세 아교 세포를 모집했다 (도 5). 이러한 결과는 신경 활동의 결핍이 학습 및 기억력 결핍으로 이어질뿐만 아니라 알츠하이머 병의 분자 및 세포 병리학에도 기여할 수 있음을 시사한다. 5xFAD 마우스에서 발견된 결함은 APOE4 마우스에서 발견된 결함과 놀랍도록 유사하지만 이러한 동물 모델은 근본적인 병리가 매우 다르다. 또한, 5xFAD 마우스에서 발견된 결손은 다른 마우스 모델 인 hAPP 및 AD를 가진 인간에서보고 된 결손과 약간 유사하다. 이러한 결과는 여러 AD 모델에서 SWR과 감마가 변경되어 이 활동을 생성하는 세포와 회로가 특히 AD 병리에 취약 할 수 있음을 보여준다. 따라서, 여기에 설명된 감각 자극은 알츠하이머 병, 가장 흔한 치매 또는 리듬 활동이 부족한 기타 질병에 대한 새로운 치료법으로 이어질 가능성이 있다. 결과적으로, 본원에 기술된 특정 패턴의 리듬 활동을 유도하는 비 침습적 방법은 신경 활동을 구제하고 분자 병리에 영향을 미치는 광범위한 임상 적용을 가질 수 있다.
데이터는 5xFAD 알츠하이머 마우스가 감소 된 감마 활성을 겪고 있음을 입증한다. 더욱이, 감마 진동은 자극 후 몇 분 이내에 MAPK 및 NFκB 경로 내에서 세포 내 신호 전달을 유도하고, 1 시간 내에 수많은 면역 조절 사이토카인의 발현 향상, 1 시간 후 미세 아교 세포 활성화의 변화, 1 주 동안 아밀로이드 부하가 감소하는 것으로 밝혀졌다.
세포 내 MAPK 및 NFκB 신호 전달 경로는 미세 아교 세포 표현형에 대한 감마 활성의 효과를 매개한다
데이터는 깜박임-유도 감마 진동이 MAPK 및 NFκB 경로 (도 8A-8C) 내에서 시그널링(signaling)의 빠른 (<5 분) 상향 조절을 자극한 다음 전 염증성 사이토카인의 발현을 증가 시킨다는 것을 시사한다 (도 7A-7C). 또한, 발표 된 데이터에 따르면 감마는 일주일에 걸쳐 5xFAD 마우스에서 미세 교세포 활성과 Aβ 제거를 촉진한다. 주변과 뇌에서 이러한 경로에 대한 알려진 전 염증 역할을 감안할 때 이러한 데이터의 시간적 관계는 MAPK 및 NFκB 경로가 감마 유도 신경 면역 활동의 조절 자임을 시사한다 (예 : 도 4 참조).
중요하게도, 5xFAD 마우스 모델 및 알츠하이머 병 환자는 이미 두꺼워진 과정을 가진 Iba1 + 활성화 된 미세 아교 세포, 수많은 전 염증성 사이토카인, 활성 산소 종으로 구성된 신경 염증 미세 환경을 이미 보유하고 있다. 더욱이, 만성 신경 염증 환경은 이제 병인을 촉진하는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 데이터는 감마 깜박임이 면역 조절 신호를 유도하고 미세 아교 세포 활성과 Aβ 제거를 촉진 함을 시사한다 (도 5). 이 데이터와 다른 연구는 면역 조절 활성이 단순히 전 염증 대 소염 또는 능동 대 수동으로 분류 될 수 없음을 시사한다. AD 미소서식환경과 깜박임 모두 소교세포의 활동을 자극하지만 잠재적으로 다른 방식으로 또는 다른 기능적 표현형으로 전환된다.
위에서 논의된 바와 같이, 고전적인 미세 아교 세포 활성화 마커는 신경 염증성 미세 환경에 대한 신호 억제의 효과를 완전히 설명 할 수 없다. 따라서 루미넥스(Luminex) 분석을 통한 32 개의 사이토카인 / 케모카인의 단백질 정량은 신뢰할 수 있다. 미세 아교 세포 활성에 대한 폭 넓은 관점을 얻기 위해, 분리된 미세 아교 세포의 광범위한 RNAseq 기반 프로파일링과 함께 면역 조직 화학 (IHC)을 통한 Iba1과 같은 두 가지 고전적 마커를 모두 사용할 수 있다.
깜박임에 대한 면역 조절 신호 전달 및 미세 아교 세포 활성의 시간적 분석이 아래에 설명된다. 야생형 (WT) 및 5xFAD 한배 생쥐는 40Hz 청각 및 시청각 깜박임 (40Hz), 임의의 감각 깜박임 또는 깜박임 없음 (Sham)에 2 시간, 1 시간 / 1일씩 1주, 또는 1 시간/ 1일씩 1 개월 동안 노출 될 수 있다. 무작위 및 깜박임 없음 Sham 그룹은 컨트롤로 사용할 수 있다. 무작위 깜박임 동안 조명과 소리는 평균 40Hz의 무작위 간격으로 표시 될 수 있다. 감마 주파수 신경 활동은 증가하지 않지만 노출 기간 동안 평균적으로 동일한 수의 자극이 전달되기 때문에 무작위 자극이 대조군 역할을 한다. 동물을 실험실로 가져와 1 시간 동안 조용한 방에 앉아 깨끗한 빈 노출 상자에 넣고 정해진 시간 동안 깜박임에 노출되거나 자극이 없을 수 있다. 며칠 동안 깜박임에 노출된 동물의 경우이 절차를 매일 같은 시간에 반복 한 다음 동물을 동물 시설로 되돌릴 수 있다. 마지막 깜박임 노출 후에 동물을 희생 할 수 있다.
이 분석은 감마 깜박임-유도 면역 활성의 시간적 진화를 완전히 특성화하고 건강한 WT와 5xFAD 병에 걸린 마우스 사이에이 활성에 차이가 있는지 여부를 결정한다.
결합된 오디오 / 시각적 깜박임은 5xFAD 마우스 및 야생형 littermate 컨트롤에서 사용할 수 있다. 반응은 미세 아교 세포 및 성상 세포 활성화 마커(Iba1 및 GFAP))의 조직학적 분석을 통해, 그리고 조직에서 분류된 미세 아교 세포의 RNAseq 분석을 통해 32 개의 면역조절 사이토카인의 루미넥스(Luminex) 단백질 발현 측면에서 2 시간, 1 주 및 1 개월 시점에서 평가할 수 있다. 각 유전자형 내에서 1) 40 Hz, 2) Sham, 3) 감마를 유도하지 않는 Random flicker로 구성된 실험군을 사용할 수 있다. Iba1 + 미세 아교 세포의 크기 1의 차이를 기반으로, 미광 자극된 뇌 영역과 비자극된 뇌 영역 간의 포스포(phospho)-Atf2에서 발견된 차이 (도 8A-8C), 깜박이는 동물과 Sham 어두운 동물 간의 MIP-2 차이 (도 7A-7C) ), 전력 분석 (양쪽 꼬리, 80 % 전력, α = 0.05)은 40Hz와 두 대조군 간의 차이를 확인하기 위해 실험 군당 N = 10 마우스가 필요함을 보여준다. 단백질 차이를 분석하려면 총 180 마리의 마우스가 필요하다 (10 마리 / 그룹 x 3 개 그룹 x 3 개 시점 x 2 개 genotpyes).
Iba1 + 미세 아교 세포 크기 1의 차이, 미광 자극된 뇌 영역과 비자극 된 뇌 영역 간의 포스포(phospho)-Atf2 차이, 깜박이는 동물과 가짜(Sham) 어두운 동물 간의 MIP-2 차이를 기반으로 전력 분석 결과 N = 10 마우스가 40Hz와 두 대조군 간의 차이를 확인하기 위해 실험 그룹당 필요하다. 단백질 차이를 분석하려면 총 180 마리의 마우스가 필요하다 (10 마리 / 그룹 x 3 개 그룹 x 3 개 시점 x 2 개 유전자형).
신경 염증 반응의 정량화 및 통계 분석
분자 분석에 사용되는 모든 마우스에서 마우스를 마취 (이소플루란(isoflurane))하고 안락사시키고 뇌를 제거 할 수 있다. 오른쪽 반구는 10 % 포르말린으로 고정 할 수 있고 왼쪽 반구는 미세 해부하여 시각 피질, 해마 및 선조체를 분리할 수 있다. 각각의 분리된 조직 세그먼트는 루미넥스(Luminex) 분석 및 웨스턴 블롯팅과 호환되는 Bio-Plex 용해 완충액 (Bio-Rad)에서 용해 될 수 있다. Luminex 분석 (Millipore)은 각 영역 (도 7A-7C) 및 7 개 단백질의 인산화 (도 8A-8C)에서 발현 된 32 개의 사이토카인 패널을 정량화하는 데 사용할 수 있다. 우뇌 절편의 면역 조직 화학 (IHC)은 Aβ 플라크 (6E10 항체, Biolegend)의 수 측면에서 Aβ 병리를 정량화하는 데 사용할 수 있다. IHC는 또한 각 뇌 영역에서 Iba-1 + 미세아교세포(microglia) (Waco) 및 GFAP + (Novus Biologicals) 성상 세포의 수를 정량화하는 데 사용할 수 있다. 활성화 마커 또는 개별 인 단백질 또는 그룹 간의 사이토카인의 차이는 Schaffe 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 평가할 수 있다. Luminex 데이터는 식별 부분 최소 제곱법 (D-PLSR)을 사용하여 분석 할 수도 있다. 역 Х2 분포를 사용하여 2 차원 공간에서 통계 테스트를 수행 할 수 있다.
전사체 미세 아교 표현형 : 사이토카인 데이터 및 성상 세포 및 미세 아교 세포 마커 분석은 깜박임에 대한 염증성 미세 아교 세포 반응에 대한 상세하지만 좁은 시야를 제공 할 수 있다. 2 시간 및 1 개월에 미세 아교 세포 표현형에 대한 감각 깜박임의 효과를 결정하기 위해 이전에 설명한 바와 같이 식염수 심장 관류 후 퍼콜 그라데이션(Percol gradient) 접근 방식을 사용할 수 있다. 그런 다음 CD11b + 세포를 FACS로 분류하고 RNAseq 분석을 위해 TRIzol (Thermo Fisher)에 직접 수집 할 수 있다. TruSeq Stranded RNA Library Prep Kit(Illumina)를 사용하여 분석을 위해 mRNA를 준비하고 Illumina NextSeq 500에서 고출력 모드로 시퀀싱 할 수 있다. 시퀀싱 데이터는 TopHat 소프트웨어를 사용하여 정렬 할 수 있으며 읽기 수는 킬로베이스 당 조각 수(FPKM) (킬로베이스 / 백만 개당 엑손)로 보고된다.
데이터는 감각 깜박임에 노출 된 마우스에서 분자 염증 신호 전달 및 신경교(glial) 면역 활성의 상세한 시간적 진화를 확립하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 경로 억제 연구는 MAPK 및 / 또는 NFκB 경로가 감마 유도 면역 조절 및 자극에 책임이 있음을 보여주기 위해 사용될 수 있다. 전체적으로 이러한 데이터는 감각 자극, 신경 활동 및 면역 세포 활동을 연결하는 데 사용될 수 있다. 또한, 장기간 1 개월 시점을 사용하여 감각 깜박임 유지가 5xFAD 마우스 모델에서 미세 아교 세포 활동 및 아밀로이드 클리어런스를 유지할 수 있는지 확인할 수 있다.
MAPK 및 NFκB 경로 모두 시각적 깜박임에 대한 반응으로 상향 조절 되었기 때문에, 이러한 경로 모두 신경 염증성 미세 환경에 기여할 수 있다. 따라서, 사이토카인, 아교 활성화 마커 또는 미세 아교 세포 전사체의 유의 한 조절은 하나의 경로 만 억제함으로써 발견되지 않을 수 있다. 이 경우 두 경로를 동시에 억제 할 수 있다. 또한, 이전 연구는 예를 들어 MAPK 경로 내에서 표적화된 억제가 PI3K / Akt와 같은 다른 경로 내에서 반응성 신호를 유발할 수 있음을 보여준다. 따라서 면역 조절의 명확한 징후가 보이지 않으면 Luminex 분석 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 다른 경로 내에서 활성화를 확인할 수 있다. 마지막으로, MAPK 및 NFκB 경로는 뉴런 및 기타 세포 유형에서 영양 지원 기능을 제공하기 때문에 이러한 약물의 일일 투여시 신경 세포 사멸, 시냅스 손실 또는 기타 인공물이 발견될 수 있다. 가능성은 낮지만 설명 할 수없는 약물의 병리학적 인공물이 발견되면 약물 용량을 줄이거나 감마 치료 패러다임을 격일로 변경할 수 있다.
데이터는 신경 활동이 뇌 내의 염증 신호를 변경함으로써 분자 메커니즘을 확립한다. 이러한 발견은 알츠하이머 또는 기타 뇌 질환 환자를 감각 깜박임에 노출시켜 치료하는 신속하게 번역 가능한 전략으로 이어질 수 있다. 이 발견은 또한 기능 간의 인과적 분자 연결을 입증하고 비 침습적 자극을 통해 뇌 내의 여러 세포 유형의 활동을 조절하는 새로운 도구를 제공함으로써 신경 과학 및 신경 염증 / 아교 활동 분야에 영향을 미칠 수 있다. 본원에서 정량화된 염증 프로파일은 또한 뇌척수액 및 혈액의 분석을 통해 인간에서 테스트 될 수 있다. 따라서 이 연구는 장기적인 감각 깜박임이 인간에 미치는 영향에 대한 임상 적으로 실행 가능한 테스트의 토대를 마련한다.
실시예 2.밀리 초 단위의 정밀도로 신경 활동을 유도하는 비 침습적 방법
배경 : 감마 주파수 (40Hz)에서 깜박이는 빛이 시각 피질에서 감마 주파수 신경 활동을 유도하고 알츠하이머 병 (AD)의 마우스 모델에서 병원성 단백질을 삼키기 위해 미세 아교 세포를 모집한다는 것이 최근에 발견되었다. 이 비 침습적 감각 자극은 신경 활동을 조작하고 신경 퇴행성 질환을 치료하기 위해 뇌의 면역 체계를 모집 할 수 있다. 이 새로운 자극 접근법은 또한 인간의 감마 활동의 인과 적 효과와 질병 진행에서 미세 아교 세포의 가설된 역할에 대한 조사를 가능하게한다. 그러나 감각 자극을 사용하여 감마를 유도하고 시각 피질 외부의 미세 아교 세포를 모집하는 방법은 아직 알려지지 않았다. 치매의 가장 흔한 형태인 알츠하이머 병을 치료하기 위해 기존의 시간적으로 정밀한 비 침습적 자극 방법으로는 도달 할 수없는 해마와 같은 심부 뇌 구조를 목표로 하는 새로운 형태의 감각 자극이 개발되었다. 개발된 감각 깜박임은 신경 활동을 동반하고, 면역 세포를 모집하고, 학습과 기억에 필수적이며 AD 초기에 영향을 받는 해마의 뉴런 간의 기능적 연결을 변경하는 도구로 사용할 수 있다.
이전의 감각 자극 방법인 깜박이는 빛은 시각 피질에서 시간적으로 정밀한 신경 활동을 유도했지만 해마에만 약한 영향을 미쳤다. 청각 감각 깜박임이 해마에서 리드미컬 한 신경 활동을 유도하는 것으로 밝혀졌으며 이 접근법은 더욱 발전되었다. 추가 특성화는 감각 자극 유형 (청각, 시각 또는 둘 다)이 해마에서 가장 강한 리듬 활동을 유도하고 리듬 감각 자극이 내인성 진동 활동과 유사한 방식으로 신경 세포 유형을 유도 하는지를 결정한다. 데이터는 청각 자극이 해마 미세 아교 세포를 모집하여 형태학적으로 그들을 변형시켜 단백질의 삼킴을 증가 시킨다는 것을 보여준다. 이 과정은 질병에서 병원체의 제거와 건강한 뇌의 시냅스 가소성과 관련된 과정이다. 다음으로, 감마를 운전하면 미세 아교 세포, 뉴런 간의 연결 및 해마의 기억에 필수적인 신경 활동이 어떻게 변경되는지 추정된다. 여기에 있는 데이터는 세 가지 주요 미충족 요구를 다룬다. (1) 심부 뇌 구조에서 시간적으로 정확한 신경 활동을 유도하는 비 침습적 방법, (2) 성형에 적극적인 역할을 하는 뇌의 면역 세포인 미세 아교 세포를 모집하는 비 침습적 방법 신경 회로와 병원체 제거, 그리고 (3) AD 치료를 위한 새로운 접근법.
혁신적인 감각 자극 및 대규모 기록을 통합 한 제안 된 연구는 처음으로 밀리 초 단위의 정밀도로 리드미컬한 신경 활동을 유도하고 심부 뇌 구조에서 미세 아교 세포를 모집하는 비 침습적 방법을 제공된다. 리듬 뇌 활동과 미세 아교 세포는 알츠하이머 병에서 간질, 정신 분열증에 이르기까지 다양한 신경 질환과 관련이 있으며 학습과 기억에 중요한 역할을하는 것으로 가정된다. 따라서 이러한 결과는 여러 질병에 대한 새로운 치료 접근법을 촉진하고 광범위한 영향으로 새로운 기초 과학 연구를 활성화한다.
이 연구는 신경 활동을 동반하고, 면역 세포를 모집하고, 해마에서 뉴런 사이의 기능적 연결을 변경하기 위한 감각 깜박임의 발달을 보여준다 (도 9). 이 연구는 AD 초기에 영향을 받는 학습과 기억에 필수적인 깊은 뇌 구조이기 때문에 해마 (HPC)에 중점을 둔다. HPC에서 리드미컬한 신경 활동을 유도하는 비 침습적 방법이 먼저 개발되고 최적화된다. 그런 다음 HPC에서 비 침습적으로 감마 활동을 유도하는 방법이 미세 아교 세포에 영향을 미치고 신경 활동이 결정되며, 이는 AD의 마우스 모델에서 뉴런 간의 시냅스 효능과 신경 활동 결핍을 포함하여 학습 및 기억에 필수적이다. 이러한 데이터는 리드미컬한 신경 활동을 유도하고, 면역 세포를 모집하고, 심부 뇌 영역에서 시냅스 연결의 강도를 변경하는 구현하기 쉬운 도구를 만든다. 이러한 데이터는 또한 향후 연구에서 알츠하이머 병 및 기타 신경 및 정신 질환을 앓고 있는 인간의 치료제로서 감각 깜박임을 테스트 할 수 있는 기반을 제공한다.
심부 뇌 영역을 표적으로 하는 방법으로서 감각 깜박임을 평가하기 위해, 세 가지 이유로 특징화된 해마 활동. 첫째, 해마는 인간의 뇌 깊숙이 있기 때문에 경두개 자기 자극과 같은 기존의 뇌 자극 방법으로는 특히 표적이 되기 어렵다. 따라서 해마 활동을 조작 할 수 있는 접근법이 절실히 필요하다. 둘째, HPC는 공간 및 경험 기억에 필수적이며 해마 활동의 조작은 학습과 기억을 향상시킬 수 있다. 감마 주파수 감각 자극이 신경 활동에 미치는 영향을 이해하기 위해 우리의 연구는 해마 신경 활동이 공간 학습 및 기억의 기초가 되는 방법을 확립 한 설치류에 대한 광범위한 사전 연구를 활용한다. 셋째, HPC는 AD 초기에 영향을 받는 뇌 영역 중 하나이며, 가장 흔한 치매 형태이며, HPC는 간질, 우울증 및 불안 장애와 같은 여러 다른 질병과 관련이 있다. 따라서 HPC에서 신경 활동을 비 침습적으로 조작하는 새로운 방법은 여러 질병에 대한 새로운 치료법으로 이어진다.
이 방법의 영향은 시간적으로 정확한 신경 활동을 유도하고, 미세 아교 세포를 모집하고, 심부 뇌 구조에서 뉴런 사이의 연결 강도를 변경하기 위한 구현하기 쉬운 비 침습적 방법을 개발하는 데서 비롯된다. 초기 감각 자극 방법인 고속 스트로브 조명과 유사한 특정 주파수에서 깜박이는 조명은 시각 피질에서 시간적으로 정확한 신경 활동을 유도했지만 HPC에 약한 영향을 미쳤다. 따라서 새로운 접근 방식이 필요하다. 따라서 HPC에서 리드미컬 한 신경 활동을 유도하기 위한 최적의 감각 깜박임 유형이 먼저 설정된다. 연구에 따르면 청각 감각 깜박임 (켜고 끄는 톤)이 깜박임과 동일한 주파수로 HPC 신경 스파이킹을 유도하는 것으로 나타났다 (신경 활동 동반이라고 함) (도 9). 다음으로 청각, 시각 및 결합 된 청각 및 시각 깜박임의 효과를 테스트한다. 깨어 있고 행동하는 동물의 여러 유형의 많은 단일 세포가 동시에 기록된다. 연구는 또한 감각 깜박임의 형태가 신경 활동의 가장 큰 동반을 생성하고 어떤 깜박임 주파수가 신경 활동을 동반 할 수 있는지를 결정한다. 또한 여러 연구 및 임상 환경에서 이러한 자극을 전달하는 휴대용 시스템이 개발되었다. 따라서 데이터는 인간에게 쉽게 적용될 수 있는 심부 뇌 영역에서 시간적으로 정확한 신경 활동을 동반하는 간단한 비 침습적 도구를 보여준다.
깨어 있고 행동하는 동물에서 여러 유형의 많은 단일 세포가 동시에 기록된다. 연구는 또한 감각 깜박임의 형태가 신경 활동의 가장 큰 동반을 생성하고 어떤 깜박임 주파수가 신경 활동을 동반 할 수 있는지를 결정한다. 또한 여러 연구 및 임상 환경에서 이러한 자극을 전달하는 휴대용 시스템이 개발되었다. 따라서 데이터는 인간에게 쉽게 적용될 수 있는 심부 뇌 영역에서 시간적으로 정확한 신경 활동을 동반하는 간단한 비 침습적 도구를 보여준다.
짧은 시간 척도로 함께 발사하도록 뉴런을 구동함으로써, 감마 진동은 광범위한 행동 동안 뉴런과 신경 코드 사이의 시냅스 연결을 강화하는 것으로 생각된다. 미세 아교 세포는 또한 시냅스를 삼켜 시냅스 가소성에 적극적인 역할을 한다. 감마 감각 자극은 뉴런이 함께 발화하도록 유도하고 미세 아교 세포 침윤을 유도하기 때문에, 연구는 깜박임이 중지 된 후에도이 감각 자극이 뉴런 간의 기능적 연결을 변화시켜 내인성 감마 활동과 신경 코드의 변화를 유발하는지 이해하는 데 중점을 둔다. 또한, 감마를 공급하면(driving) AD 병원균이 감소하기 때문에 감마 감각 깜박임이 AD 마우스의 신경 활동 결핍을 개선하는 것으로 나타났다. 따라서 이 새로운 발견은 40Hz 감각 깜박임이 HPC에서 신경 활동을 비 침습적으로 유도하여 건강한 마우스와 AD 마우스의 학습 및 기억에 필수적인 미세 아교 세포, 신경 연결 및 신경 코드에 대한 감마 구동의 기능적 효과를 결정한다는 것을 나타낸다. 첫째, 미세 아교 세포에 대한 청각 또는 결합 된 청각 및 시각 깜박임의 효과가 확립된다. 데이터는 동물을 7 일의 청각 깜박임에 하루 1 시간 동안 노출 시키면 미세 아교 세포의 형태학적 변형과 마우스 HPC에서 아밀로이드 베타의 미세 아교 세포 침윤을 유도한다는 것을 보여준다. 둘째, 생체 내에서 뉴런 사이의 기능적 연결에 대한 40Hz 깜박임의 효과를 2 시간 동안 깜박임 동안 테스트한다. 생체 내에서 기능적 연결을 측정하면 깜박임 노출 과정에서 실시간으로 뉴런 간의 시냅스 효능 변화를 검사 할 수 있다. 행동 중 기능적 연결을 조사하기 위해, 한 뉴런의 발사가 짧은 시간 (<3ms)에서 다른 뉴런을 얼마나 잘 구동하는지 측정하는 단일 시냅스 강도 분석이다. 이전 데이터에 따르면 HPC 신경 반응은 약 10 분 동안 깜박임 노출에 걸쳐 변화하며, 이는 깜박임 동안 뉴런이 함께 발화 한 결과 기능적 연결의 변화 때문일 수 있다. 40Hz 깜박임은 빠르게 솟아오르는 인터 뉴런과 피라미드 뉴런 사이의 기능적 연결을 변화시키는 것으로 나타났다. 이러한 세포 유형은 감마 리듬에 의해 관여하기 때문이다. 마지막으로, 깜박임이 SWR (sharp-wave ripple) 및 SWR 재생 중에 감마에 미치는 영향이 결정되며, 이는 학습 및 기억에 필수적인 신경 코드이다. 장기간 깜박임이 SWR 동안 내인성 감마 진동을 향상시키고 결과적으로 재생 충실도를 증가시키는 것으로 나타났다. 그리고 장기간의 감각 깜박임은 AD의 마우스 모델에서와 같이 SWR 결핍을 구제한다. 따라서, 장기간 깜박임이 미세 아교 세포, 시냅스 연결의 강도 및 AD 마우스 모델의 HPC에서 신경 결손에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
심부 뇌 영역에서 비 침습적으로 리드미컬한 뇌 활동을 유도하는 임상적 의미
비 침습적으로 뇌 리듬을 구동하는 새로운 방법의 개발은 질병이 없는 신경 활동을 유도하고 병원균을 제거하기 위해 미세 아교 세포를 모집함으로써 인간 질병에 대한 새로운 치료법으로 이어질 수 있다. 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 정신 분열증 및 간질을 포함한 많은 질병에서 변화된 리듬 활동이 관찰되었다. AD의 마우스 모델과 AD를 가진 인간의 감마 결핍이 나타났다. 5XFAD 마우스에서 SWR 동안 감마 결핍이 추가로 결정되며, 이는 5 개의 가족 성 AD 돌연변이를 운반하는 잘 확립 된 AD 모델이다. SWR 활동은 공간 학습 및 기억에 중요한 역할을 한다. SWR이 중단되면 동물은 공간 기억 작업에서 훨씬 더 나빠진다. SWR은 학습 후 활동 시퀀스를 여러 번 반복하기 때문에 시냅스 가소성을 유도하는 데 적합하다. SWR 동안 감마 진동은 많은 뉴런에서 이 재생을 조정한다. 5XFAD 마우스는 시간당 SWR이 더 적고 SWR 동안 감마가 약했다. 이 마우스에서 이전 (3 개월)과 이후 (6 개월)인지 결핍이 보고되었다 (도 10). 또한, 감마 진동을 유도하면 아밀로이드 베타의 침윤을 증가시키기 위해 미세 아교 세포를 상당히 모집한 것으로 나타났다. 5XFAD 마우스는 시간당 SWR이 더 적고 SWR 동안 감마가 약했다. 이 마우스에서 이전 (3 개월)과 이후 (6 개월)인지 결핍이 보고되었다 (도 10). 또한, 감마 진동을 유도하면 아밀로이드 베타의 침윤을 증가시키기 위해 미세한 세포를 상당히 모집한 아교 세포를 상당히 모집한다. 여기에서 개발 된 비 침습적 자극 방법은 신경 활동의 결핍을 개선하고 미세 아교 세포를 모집하여 알츠하이머 및 기타 질병에 대한 새로운 치료법의 토대를 형성하는 병원균을 제거 할 수 있다. 결과적으로, 리듬 활동을 유도하는 이 새로운 비 침습적 방법은 신경 활동을 구제하고 병리를 명확하게 하기 위한 광범위한 임상적 용도를 가지고 있다.
방법 및 재료
방법론적 : 마우스에서 신경 활동을 관찰하고 조작하기 위해, 행동 동안 신경 활동을 기록하기 위해 혁신적인 접근 방식이 사용된다 : 마우스가 가상 현실 환경을 탐색할 때 뇌 활동이 기록된다. 머리가 고정된 마우스가 가상 환경을 탐색하는 이 패러다임 (도 11)은 몇 가지 주요 실험을 수행 할 수 있다. 첫째, 행동 중 신경 활동을 검사하여 신경 코드에 대한 감각 자극의 효과를 특성화 할 수 있다. 실제 현실과 가상 현실 사이에는 차이가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 예를 들어 가상 현실에서 셀프 모션 단서가 부족하다. 그러나 실제 및 가상 현실에서 매우 유사한 해마 SWR 및 감마 활동이 발견되어 여기에 개시된 방법에 대한 강력한 지원을 제공한다. 둘째, 이 접근법을 사용하면 특정 세포 유형에 대한 감각 자극의 효과와 뉴런 간의 상호 작용을 조사하기 위해 서로 다른 세포 유형의 많은 단일 세포가 기록된다. 셋째, 이 접근법은 AD의 주요 동물 모델인 마우스에서 기록하는 데 적합하다. 동물이 머리에 고정된 기록 장치 인 경우 마우스가 휴대할 수 있을 만큼 작을 필요가 없기 때문이다.
모델 시스템의 선택 : 이 연구는 건강한 마우스와 AD 마우스에서 신경 활동, 신경 연결 및 미세 아교 세포에 대한 감각 미광 자극의 효과를 조사한다. 신경 활성이 기록되고 미세 아교 세포는 AD 및 야생형 마우스 (WT) 한배의 5XFAD 마우스 모델에서 SWR 결핍이 감지되고 감마 깜박임이 미세 아교 세포를 모집하고 아밀로이드 수준을 감소시키는 것으로 발견되는 3 개월령에 평가된다. 이미 이전 데이터는 5XFAD 마우스 모델에서 APOE4 및 hAPP 마우스 모델과 AD가있는 인간에서 보고된 결손과 일부 유사성을 갖는 신경 활동의 결손을 보여준다. 중요한 것은 감마와 SWR과이 활성을 생성하는 회로가 생쥐, 쥐, 인간이 아닌 영장류 및 인간을 포함한 종 전반에 걸쳐 보존되므로 동물 모델에서 발견 된 감마 및 SWR 변경이 인간까지 확장된다는 것이다.
HPC에서 특정 주파수의 신경 활동을 유도하는 감각 깜박임 방법을 개발하고 최적화한다.
데이터는 HPC에서 시간적으로 정확한 신경 활동을 유도하는 새로운 비 침습적 방법을 보여준다. 첫째, 야생형 (C57BL6J) 마우스의 해마 CA1 하위 영역에서 구형 트레드밀에서 달리거나 쉬고 있는 32 채널 실리콘 프로브를 사용하여 전기 생리 학적 기록을 수행했다. 신경 활동이 기록되는 동안 동물에게 (1) 조용한 어둠, (2) 40Hz에서 켜고 끄는 톤(25ms마다 1ms 길이의 10kHz 톤 재생, 이후 청각 미광 자극이라고 함), (3) 40Hz에서 켜고 끄는 톤과 조명(25ms마다 1ms 길이의 10kHz 톤 및 12.5ms 길이의 흰색 조명, 이후 멀티 모달 미광 자극이라고 함)의 인터리브(interleaved) 기간이 제시되었다. 스파이킹은 톤과 함께 주기적으로 증가 및 감소하여 40Hz 청각 또는 다중 모드 미광 자극 동안 신경 활동이 40Hz까지 동반되었다 (도 12). 40Hz 청각 깜박임 동안 스파이킹 속도의 피크 간 간격은 대부분의 기록 사이트에서 약 25ms (40Hz에 해당)였다. 청각 자극 동안, 기록 사이트의 평균 55 %가 주기적인 스파이킹 반응을 보였고 청각 및 시각적 자극 동안 CA1 기록 사이트의 61 %가 베이스 라인 기간 동안 기록 사이트의 1 %에 비해 주기적으로 스파이 킹을 보였다 (도 12). 0 (변조 없음)에서 1 (최대 변조)까지의 범위 인 변조 깊이, 스파이킹 변조의 진폭 측정값은 40Hz 청각 깜박임 동안 0.057 - 0.391이었고 40Hz 청각 + 시각적 자극 동안 0.049 - 0.333이었다 (25-75 번째 백분위 수, 도 6). CA1의 로컬 필드 전위는 40Hz 청각 자극 동안 40Hz에서 상승된 전력을 보였지만 효과는 기록 위치와 세션간에 다양했다. 따라서 40Hz 청각 미광 자극은 CA1에서 강력한 40Hz 동반을 유도했다. 둘째, 추정 피라미드 세포와 신경 세포를 포함하여 깨어있는 행동 동물에서 실리콘 프로브를 사용하여 많은 단일 단위가 기록되었다. 일반적으로 30-50 개의 잘 분리된 장치는 32 채널 실리콘 프로브에 기록되며 128 채널 프로브를 사용하여 수율을 향상시킬 것이다 (도 12). 세포 유형 분류는 기록의 하위 집합에서 광 유전학적 자극을 사용하여 확인된다. 광 유전학적 자극 및 신경 기록은 이전에 마우스에서 결합되었다 (도 12a, b).
실험 절차: 먼저, 3 개월된 WT 및 5XFAD 마우스에서 HPC에서 가장 큰 감마 동행을 유도하는 요인을 결정하기 위해 다양한 유형의 감각 깜박임을 테스트한다 도 13). 위에서 설명한 연구에서와 유사한 접근 방식을 사용하여 HPC의 신경 활동이 기록되는 반면 동물은 다른 청각, 시각 또는 다중 모드 깜박임으로 표시된다. 동물은 기록 내에서 각 자극의 효과를 비교하기 위해 자극 (기준선) 및 미광 자극 (청각, 시각 및 다중 모드 깜박임 사이의 교대)의 인터리브 된 10 초 블록을 제공한다. 멀티모달(multimodal) 깜박임의 경우 조명과 사운드가 동시에 켜지거나 (동상 멀티모달 플리커) 사이클의 절반만큼 오프셋이 켜지는 (오프셋 위상 멀티모달 플리커, 도 13) 자극을 테스트한다. 동물은 이전 연구 및 이전 인간 연구에 따라 듀티 사이클 (자극이 켜져있는 주기의 백분율)을 사용하는 40Hz 깜박임, 즉 각 25ms주기에서 1ms 동안 청각 자극 및 12.5ms 동안 시각 자극으로 존재한다. 별도의 실험 세트에서 이러한 듀티 사이클은 다양하여 동물이 4 % 듀티 사이클 (1ms 동안 켜짐) 또는 50 % 듀티 사이클 (12.5ms 동안 켜짐)으로 시각 및 청각 자극에 모두 노출된다. 모든 자극에 대해 스파이킹 속도의 피크와 스파이킹 속도 변조의 깊이 사이의 간격을 포함하여 리드미컬한 신경 동반이 측정된다 (도 12). 청각, 시각, 동 위상 다중 모드 및 오프셋 위상 다중 모드 깜박임의 효과는 일부 결과가 정규 분포를 따르지 않을 것으로 예상되기 때문에 다중 비교를 수정하기 위해 윌콕슨 순위 합계 테스트 및 본페로니(Bonferroni) 방법을 사용하여 비교된다. 또한 레일리(Rayleigh)의 순환 통계 테스트를 사용하여 스파이 킹이 미광 자극의 특정 단계에 크게 고정되었는지 여부를 평가한다. 그런 다음 윌콕슨 순위 합계 테스트 및 본페로니 방법을 사용하여 청각, 시각, 동 위상 다중 모드 또는 오프셋 위상 다중 모드 깜박임에 상당히 위상 고정 된 세포 수에 대해 비교하여 다중 비교를 수정한다. 동일한 통계 분석 접근 방식을 사용하여 서로 다른 듀티 사이클의 효과를 비교한다. 또한 전력 스펙트럼 밀도는 로컬 필드 전위에 사용된다.
둘째, 첫 번째 실험에서 가장 큰 반응을 일으키는 미광 자극을 사용하여 미광 자극의 주파수를 변화시켜 감각 깜박임이 신경 활동을 동반하는 주파수 범위를 결정한다. 위와 동일한 접근 방식을 사용하여 동물은 10, 20, 40, 60, 80, 100Hz 깜박임의 10 초 블록에 노출된다 (도 14). 신경 반응과 신뢰도는 위에서 설명한대로 측정된다. 그룹당 8 마리의 수컷 및 8 마리의 암컷 마우스의 샘플 크기 (동물 당 2 회 기록)는 깜박임과 기준 기간 사이의 주기적 기록 사이트 비율과 80 % 이상 및 p<0.05의 전력에서 깜박임의 다른 주파수 사이의 상당한 차이를 감지하기에 충분하다.
실시예 3. 감각 깜박임에 의해 생성된 뇌 활동의 특정 빈도와 알츠하이머 병에서 뇌 건강을 촉진하는 다양한 세포 기능에 미치는 영향 사이에 생성 된 포괄적 인지도
여기서, 감각 깜박임에 의해 생성되는 특정 뇌 활동 빈도와 알츠하이머 병에서 뇌 건강을 촉진하는 다양한 세포 기능에 미치는 영향 사이에 포괄적인 맵이 생성된다. 자극의 뚜렷한 빈도와 기간이 다음과 같은 정확한 유전자 발현 패턴을 유발하는 것으로 나타났다.
1. 기억, 시냅스 밀도 및 신경 생존 향상
2. 신경 건강을 촉진하는 영양 인자 생성
3. 아밀로이드 베타 플라크 및 신경 섬유 엉킴을 제거 할 수 있는 신경교(glial) 활성화를 포함하여 건강한 신경 면역 기능을 촉진하는 요인의 발현을 자극한다.
따라서 이 연구는 알츠하이머 병리의 5xFAD 마우스 모델을 사용하여 "유전자에 대한 자극 발현 맵 (StG Map)"을 산출한다. 이것은 알츠하이머 병의 세포 기능 및 기능 장애를 제어하는 근본적인 새로운 방법의 기초이다.
이 자극-유전자 발현 (StG)지도는 알츠하이머 병에 대한 뇌의 반응을 수정하기 위해 우리가 개발하는 접근 방식을 변환 할 가능성이 있다. 다음과 같은 혁신이 확인되었다.
1. 시청각 감각 깜박임 기술은 완전히 비 침습적이다. 이것은 감각 깜박임이 기억과 관련된 뇌 심부 영역의 유전자 발현을 어떻게 변화시키는 지 확인하는 첫 번째 연구이다.
2. 40Hz 감마 자극이 이전에는 몇 초 단위로 신경 전기적 활동을 변화시키는 데 사용되었지만, 이것은 몇 분부터 몇 시간까지 여러 시간 단위로 뇌의 유전자 발현에 대한 다양한 자극 빈도의 영향을 조사한 최초의 연구이다. 따라서 이 연구는 1 시간 동안 40Hz가 면역 유전자의 발현을 유도 할 수 있다는 이전의 발견을 극적으로 확장한다 (도 19).
3. 새로운 유전자 클러스터링 접근 방식은 전체 조직의 RNAseq 데이터를 사용하여 다른 세포 유형에서 유전자 발현 시그니처를 분리하는 데 사용된다.
이러한 혁신은 우리가 신경 건강, 학습 및 기억, 보호 미세 아교 세포 활동, 알츠하이머 아밀로이드 병리의 개선을 촉진하는 비 침습적 자극 패턴을 식별 할 수 있는 최초의 StG 맵을 생성한다. 이 지도는 보호 자극 요법을 식별할 수 있을뿐만 아니라 연구원이 미광 자극의 효과와 관련된 수많은 메커니즘 및 경로를 조사 할 수 있도록 한다.
시각적 깜박임은 자극 의존 방식으로 사이토카인 발현을 자극한다 : 40Hz 감마 시각적 깜박임은 미세 아교 세포 변환 및 MAPK 및 NFkB 신호 전달을 촉진하므로 (도 20), 이는 사이토카인을 포함한 신경 염증의 전사, 32 개의 사이토카인의 단백질 발현을 강력하게 조절한다. 시각 피질의 케모카인은 시각적 깜박임 1 시간 후에 정량화된다. 데이터는 40Hz 깜박임이 일정한 빛, 20Hz 깜박임 또는 무작위 깜박임을 사용한 자극에 비해 수많은 사이토카인의 발현을 강력하게 촉진했음을 보여준다 (도 17a). 중요한 것은 각 미광 자극 그룹이 고유한 사이토카인 발현 패턴을 가지고 있다는 것이다. 예를 들어, 항염증 IL-10은 특히 무작위 깜박임, VEGF에 의해 자극되었고, 일정한 빛으로 가장 많이 자극되었으며, 20Hz 깜박임은 다른 그룹에 비해 모든 사이토카인을 강력하게 억제했다(도 17a, b). 이러한 데이터는 다양한 자극 패턴이 건강한 신경 면역을 수정하고, 병리를 제거하고, 신경 건강을 촉진하는 데 중요한 고유 한 유전자의 발현을 생성함을 보여준다. 이러한 데이터는 자극을 유전자 발현과 관련시키기 위한 StG 맵 생성의 중요성을 강력하게 뒷받침한다.
상이한 자극 패턴이 뚜렷한 사이토카인 단백질 발현 프로파일을 생성하는 것으로 밝혀졌다 (도 17a, b, 화살표). 다음으로, 자극의 기간과 빈도가 뇌 내에서 다른 유전자 발현 패턴을 생성하는 핵심 "지표"라는 것이 밝혀졌다 (도 18에서 개념화 됨). 여기에는 1) 신경 세포 생존 및 영양 지원, 2) 시냅스 가소성, 3) 미세 아교 세포 변형 및 신경 면역이 포함된다.
결합된 시청각 미광 자극을 사용하면 시각 피질과 해마에서 감마를 동반 할 수 있다. StG는 먼저 시각 피질의 유전자 발현을 분석하여 생성한 다음 해마에서 동반자지도를 생성하여 알츠하이머 병에 대한 번역 관련성을 향상시킨다.
마우스 코호트 : 조지아 공대 (Georgia Tech)의 공동 Singer / Wood 마우스 콜로니에서 사육 및 수용된 수컷 5xFAD 마우스 코호트. 5xFAD 마우스는 가용성 Aβ 수준이 2 개월까지 증가하고 강력한 플라크가 6 개월까지 형성된다. 초기 알츠하이머 병리의 치료 관련 맥락에서 깜박임 요법의 효과를 확인하기 위해 3mo 5xFAD 마우스가 현재 연구에 사용되었다.
비 침습성 감마 감각 미광 자극 : 5xFAD 마우스는 깜박임 주파수 Hz의 확산 및 노출 기간 [0.5, 1, 2, 4, 8] 시간에 노출된다. 주파수의 확산은 40Hz 깜박임으로 인해 우리의 예비 데이터에서 강력한 면역 반응을 일으키고 상당히 낮고 높은 주파수가 신경계 (예 : 가소성(plasticity))에 반대 영향을 미칠 수 있기 때문에 확인되었다. 기간의 범위는 0.5 시간의 40Hz 자극이 사이토카인 발현에 변화를 가져오고 4-8 시간이 유전자 발현 경로 내에서 음성 피드백과 연관된 시간 상수임을 보여주는 이전 연구를 기반으로 선택되었다. 자극하는 동안 동물을 실험실로 가져와 1 시간 동안 조용한 방에 앉아 깨끗한 빈 노출 상자에 넣고 규정 된 시간 동안 동시 시청각 깜박임에 노출된다. 깜박임 노출 후 동물을 희생시키고 뇌를 빠르게 제거 (2 분 미만)하고 미세 해부하고 RNA 추출을 위해 시각 피질과 해마를 분리한다. 기준선을 설정하기 위해 N = 5 마우스의 조직을 수집하고 1 시간 동안 일정한 빛을 유지한다.
RNAseq 데이터 수집 : 염증 반응 및 / 또는 세포 사멸을 담당하는 유전자 세트 / 경로를 광범위하게 이해하기 위해, TRIzol (Thermo Fisher)을 사용하여 각 뇌 영역 (시각 피질, 해마)에서 RNA를 분리한다. RNA 품질은 Bioznalyzer 2100을 사용하여 확인되며 RIN> 6 인 샘플만 실행된다. 그런 다음 Nextera XT 인덱스 키트 v2를 사용하여 분석을 위해 RNA를 준비하고 Illumina NextSeq 500 (IBB, Georgia Tech Molecular Evolution 및 High Throughput Sequencing Core)에서 고출력 모드로 시퀀싱한다. 시퀀싱 데이터는 TopHat을 사용하여 정렬되며 읽기 수는 킬로베이스 당 조각 수 (FPKM)로 보고된다. 각 뇌 영역의 샘플은 단일 배치로 실행되므로 배치 효과가 예상되지 않는다. 이 전사체(transcriptome)-wide 데이터 세트는 내용이 풍부하므로 데이터는 저널 원고에 빠르게 보고되고 아래에 설명된 StG Map과 함께 게시된다.
StG 매핑 : StG 맵은 동종 최초이다. 따라서 지도를 구성하기 위해 세 가지 보완 매핑 접근 방식이 사용된다.
1. 유전자 세트 강화 : Broad Molecular Signatures Database에서 선별된 기존 유전자 세트를 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)과 함께 사용하여 각 자극 빈도 / 기간에 대한 반응으로 각 유전자 세트의 농축을 확인한다. 이 분석의 주요 적용 증명은 1 시간 동안 40Hz 깜박임 또는 일정한 빛에 노출 된 마우스에서 수집 된 RNAseq 데이터에 수행된다 (도 19). 이 분석은 거짓 발견 비율로 조정된 q- 값 <0.25로 상당히 풍부한 31 개의 유전자 세트를 확인했다. 자극의 주파수와 기간을 훑어보고 각각을 일정한 조명 제어와 비교함으로써 도 18에 개념화된 맵이 생성된다.
감각 깜박임은 신경 MAPK 및 NFκB 신호를 상향 조절한다.
면역 활성은 MAPK (mitogen Activated protein kinase) 및 NFκB (activated B cells) 경로의 핵 인자 kappa-light-chain-enhancer를 포함한 여러 표준 키나아제 경로 내에서 세포 내 신호 전달에 의해 중앙에서 조절된다. 이러한 경로는 미세 아교 세포의 모집 및 활성화에 관여하는 사이토카인을 포함한 수많은 인자의 다운스트림 발현을 조절한다 (도 20a). 또한 이러한 경로는 시냅스 가소성을 담당하는 즉각적인 초기 유전자 (예 : Arc, cFos)를 조절한다. 다음으로 뉴런 칼슘 유입에 의해 조절되는 MAPK 및 NFκB 경로가 깜박임의 이중 시냅스 및 면역 활동의 메커니즘임을 보여준다. 40Hz 깜박임에 의한 이러한 경로의 자극을 테스트하기 위해 루미넥스(Luminex) 다중 ELISA 패널 (Millipore)을 사용하여 전체 조직 시각 피질의 각 경로에서 6 개의 인 단백질을 정량화한다. 포스포(phospho)-시그널링 경로의 활동은 유전자 또는 단백질 발현보다 훨씬 빠르게 발생하기 때문에 조직은 시각적 깜박임 5 분 후에 수집되고 안락사 2 분 이내에 빠르게 뇌를 수집한다. 분석은 두 경로 (예 : 인산화된 Mek, Erk, Jnk, NFκB)가 무작위 자극에 노출되거나 어둠 속에 보관 된 마우스에 비해 40Hz 깜박임에서 상향 조절되었음을 보여주었다 (도 20b).
MAPK 경로 신호 전달을 조절하기 위해, 마우스에 혈액-뇌 장벽 침투성 소분자 Mek 억제제 SL327을 복강 내 (IP) 주사하였다. 다운 스트림 Erk 인산화 측면에서 약물의 활성을 평가하면 (도 20c), 40Hz 깜박임이 무작위 깜박임에 비해 포스포(phospho)-Erk를 크게 증가 시켰으며 약물이 포스포(phospho)-Erk를 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. 매개체(vehicle)의 유의한 영향은 확인되지 않았다 (33 % DMSO, 33 % PEG, 33 % 식염수; 회색 대 검은 점, 도 20c). 전체적으로 이러한 데이터는 40Hz 감마 깜박임이 신경 세포 내 신호를 유도하며, 이는 소분자 억제제를 사용하여 조절할 수 있음을 보여준다.
40Hz 깜박임은 MAPK 및 NF 시그널링에 의해 매개되는 사이토카인 발현을 유도한다. 40Hz 깜박임 및 관련 MAPK / NFκB 신호 전달, 모집 및 변환 미세 아교 세포에 의해 가능한 분자 메커니즘을 확인하기 위해 루미넥스를 사용하여 마우스가 30 분 또는 60 분 동안 시각적 깜박임이 나타난 후 시각 피질 내 32 개의 사이토카인 단백질의 발현을 정량화했다. 40Hz 깜박임에 대한 반응으로 이 분석은 일정한 빛, 20Hz 깜박임 또는 무작위 깜박임에 노출된 마우스에 비해 특정 사이토카인이 30 분까지 미묘하게 증가하고 미세 아교 세포 모집과 관련된 사이토카인이 60 분까지 현저하게 증가한 것으로 나타났다 (도 21). 막대 그래프는 20Hz 깜박임에 비해 40Hz 깜박임에서 크게 증가한 선별된 사이토카인을 보여준다. 또한 식별 부분 최소 제곱 회귀 (D-PLSR)를 사용하여 40Hz 깜박임과 강력한 상관 관계가 있는 복합 사이토카인 프로파일을 식별했다. 이 복합 사이토카인 프로파일은 그룹 간의 명확한 차이를 보여주었다 (도 21). 마지막으로, IHC는 미세 아교 세포 활성화에 관여하는 사이토카인인 M-CSF가 뉴런 마커 NeuN에 국한되었음을 보여준다 (도 22).
다음으로, MAPK 및 NFκB 신호 전달이 40Hz 깜박임에 대한 반응으로 사이토카인 발현을 매개하는 것으로 나타났다 (도 20a). 이를 위해 마우스는 깜박임이 시작되기 30 분 전에 각 경로에 대해 소분자 억제제를 IP 주사한다. 경로 억제가 사이토카인에 영향을 미치는지 확인하기 위해 Mek 및 Jnk의 MAPK 억제제를 공동 투여하여 한 그룹의 마우스에서 MAPK 경로를 억제하고 IKKβ 및 NFκB의 NFκB 억제제를 공동 투여했다 (커큐민, Nrf2도 활성화). 다른 그룹의 마우스에서 NFκB 경로를 억제한다. 흥미롭게도, 두 경로의 억제는 40Hz 깜박임에 대한 반응으로 사이토카인 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 포스포-시그널링 데이터와 함께 이 데이터는 40Hz 깜박임이 MAPK 및 NFκB 경로 신호를 자극하여 미세 아교 세포 활성화 및 모집을 조절하는 것으로 알려진 다양한 사이토카인의 발현을 매개한다는 것을 보여준다.
알츠하이머 병의 마우스 모델은 생체 내 감마 결핍을 가지고 있다. 이전 연구는 유전자 변형 5XFAD 아밀로이드 마우스 모델을 포함하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 감마 진동에 결함이 있음을 보여주었다. 특히, 감마 진동의 강도와 건강한 마우스의 공간 학습 및 기억에 필수적인 활동 인 SWR (sharp wave ripple) 동안 감마 진동에 의해 스파이크가 얼마나 잘 조절 되는지에서 적자가 확인되었다. 이러한 적자는 행동 적자 (3 개월령에 처음 발견됨) 이전에 질병 초기에 시작된다. 더욱이, 감마 활성을 유도하는 것은 아밀로이드 베타 수준을 상당히 감소시키고 아밀로이드의 삼킴을 증가시키기 위해 미세 아교 세포를 모집하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 신경 활동의 결핍이 학습 및 기억력 결핍으로 이어질뿐만 아니라 알츠하이머 병의 분자 및 세포 병리학에도 기여한다는 것을 보여준다. 5XFAD 마우스에서 발견 된 결손은 인간, hAPP 및 APOE4 마우스에서 발견되는 것과 놀랍도록 유사하다. 따라서 여기에서 개발된 비 침습적 자극은 알츠하이머 병, 가장 흔한 치매 또는 리듬 활동이 부족한 기타 질병에 대한 새로운 치료법으로 이어질 가능성이 있다. 결과적으로, 리듬 활동의 특정 패턴을 유도하는 이 새로운 비 침습적 방법은 신경 활동을 조절하고 분자 병리에 영향을 미치는 광범위한 임상 응용 프로그램을 가지고 있다. 이 단순한 비 침습적 감각 자극은 인간에서 쉽게 테스트 할 수 있다. 다음으로, 우리는 AD로 인간 개체에서 발견한 것을 테스트한다.
예비 데이터는 5XFAD 알츠하이머 병 마우스가 감소 된 감마 활성을 겪는다는 것을 입증했다. 더욱이, 감마 진동은 자극 후 몇 분 이내에 MAPK 및 NFκB 경로 내에서 세포 내 신호 전달을 유도하고, 1 시간 내에 수많은 면역 조절 사이토카인의 발현을 향상시키고, 1 시간 후 미세 아교 세포 활성화를 변경하고, 일주일 동안 아밀로이드 부하를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
다음으로, (1) MAPK 및 / 또는 NFκB 경로가 감마가 신경 면역 활동을 조절하는 메커니즘 및 (2) 감마 자극 및 이러한 동일한 분자 경로의 유도가 AD의 마우스 모델에서 확인 된 시냅스 효능의 결함에 어떻게 영향을 미치는지를 보여준다.
이것은 신경 면역 상호 작용의 분자 메커니즘을 조사하는 첫 번째 작업이므로. 조직 반응에 대한 광범위한 세포 유형별 분석과 함께 이러한 경로의 약리학 적 섭동은 40Hz 감마를 소교 신경 면역 반응 및 학습 및 기억과 연결하는 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 제공한다.
5XFAD 및 APP / PS1 코호트의 생성 : 3-4 개월된 수컷 및 암컷 5XFAD 마우스 및 5-6 개월된 APPswe / PS1dE9 (APP / PS1) 마우스가 사용된다. 5XFAD 마우스는 아밀로이드 전구체 단백질에서 3 개의 돌연변이와 프레세닐린 1(presenilin 1)에서 2 개의 돌연변이를 반 접합 적으로 보유하며, 각각은 인간에서 유전된 AD를 개별적으로 담당한다. APP / PS1은 인간의 가족성 AD를 담당하는 APP 및 PS1에 각각 단일 돌연변이를 반 접합한다. 둘 다 CNS 뉴런으로 향했다.
5XFAD 마우스는 2mo까지 증가된 가용성 Aβ 및 6mo까지 강력한 플라크 형성을 나타낸다. 40Hz 깜박임이 이 모델에서 Aβ 클리어런스를 촉진하는 것으로 나타났다.
깜박임에 대한 면역 조절 신호 및 미세 아교 세포 활성의 시간적 분석 : 야생형 (WT) 및 5XFAD 한배 생쥐는 다중 모드 오디오 / 시각적 깜박임 (깜박임이라고 함)에 노출된다. 마우스는 1 주일 동안 하루에 5 분, 1 시간 또는 1 시간 동안 40Hz 깜박임, 20Hz 깜박임 또는 무작위 감각 깜박임에 노출된다. 무작위 및 20Hz 그룹이 컨트롤 역할을 한다. 무작위로 깜박이는 동안 조명과 소리는 평균 40Hz의 무작위 간격으로 표시된다. 무작위 자극은 감마 주파수 신경 활동이 증가하지 않기 때문에 대조군 역할을 하지만 노출 기간 동안 평균적으로 동일한 수의 자극이 전달된다. 동물을 실험실로 가져와 1 시간 동안 조용한 방에 앉아 깨끗한 빈 노출 상자에 넣고 정해진 시간 동안 깜박임이나 일정한 빛에 노출된다. 며칠 동안 깜박임에 노출된 동물의 경우 이 절차를 매일 같은 시간에 반복한 다음 동물을 동물 시설로 돌려보낸다. 마지막 깜박임 노출 후 동물이 희생된다.
감각 깜박임에 대한 반응으로 야생형 및 5XFAD 마우스에서 포스포 신호, 사이토카인 발현 및 미세 아교 세포 표현형의 시간적 진화. 첫 번째 부분에서 깜박임에 대한 반응은 5XFAD 마우스와 야생형 한배 새끼 모두에서 5 분, 1 시간 및 1 주 시점에서 정량화된다. 이러한 시점은 포스포 시그널링 (도 20, 5 분), 사이토카인 발현 (도 21, 1 시간)의 변화를 식별하는 표시된 데이터 및 1 주가 미세 아교 세포 형태 및 표현형을 변환한다는 발표된 발견에 해당하기 때문에 선택된다.
실험군 : 각 유전자형 내에서 1) 40Hz, 2) 20Hz, 3) 랜덤 깜박임으로 구성된 실험군이 필요하다. 20Hz 또는 무작위 그룹은 감마를 유도하지 않는다. Iba1 + 미세 아교 세포 크기의 차이를 기반으로 40Hz 깜박임와 무작위 동물 간의 포스포-Erk 차이 (도 20), 40Hz와 20Hz 동물 간의 M-CSF 차이 (도 21), 전력 분석 (2-꼬리(tailed), 80 % 전력, α = 0.05)는 실험 군당 N = 10 마우스가 40Hz와 두 대조군 간의 차이를 확인하는 데 필요함을 보여준다.
시그널링 및 사이토카인 : 자극 후, 왼쪽 반쪽은 미세 해부이고 Luminex는 시각 피질과 해마 모두에서 모든 시점에서 MAPK 및 NFκB 경로에서 12 개의 단백질과 32 개의 사이토카인 / 케모카인의 인산화를 정량화하는 데 사용된다.
면역 조직 화학 (IHC) 및 형광 제자리 혼성화 (FISH) : 오른쪽 반구는 4 % 파라포름 알데히드에 고정되고 IHC를 사용하여 고전적인 활성화 마커 Iba1 (미세 아교 세포, 그러나 비특이적) 및 GFAP (성상 세포)를 정량화한다. 또한 IHC는 뉴런에서 발현 수준을 결정하기 위해 뉴런 마커인 NeuN (Novus)과 함께 최고 인산 단백질 (예 : 포스포 -NFκB) 및 사이토카인 (예 : MIG)을 공동 라벨링하는 데 사용된다. FISH (Thermo Fisher)는 또한 주요 사이토카인에 대한 mRNA 공동 국소화를 확인하는 데 사용된다.
RNAseq를 통한 미세 아교 표현형 : 분리된 미세 아교 세포의 RNAseq 분석의 경우, FACS 관련 미세 아교 세포 활성화를 피하기 위해 CD11b + 컬럼을 사용하여 전체 뇌로부터 미세 아교 세포를 분리하여 동물을 보존하기 위해 1 시간 및 1 주 시점에이 분석을 수행한다.
사이토카인 및 Aβ의 정량화 : 사이토카인 및 Aβ는 위에서 설명한 방법을 사용하여 정량화된다. 미세 아교 세포 반응을 정량화하기 위해 최근 AD 환자의 염증성 및 기타 생리학적 차이를 분리하는 데 사용되었으며 알츠하이머의 미세 아교 세포 유전자 발현 시그니처를 분리하는 데 사용된 WGCNA (Weighted Gene Co-expression Network Analysis)가 사용된다. WGCNA를 사용하여 감각 깜박임에 대한 각 유전자 모듈이 어떻게 변하는지 결정한다. 피셔(Fisher) 정확도 검정을 사용하여 그룹 간의 중요한 변화를 평가한다.
AD 마우스에서 시냅스 효능의 결함 : AD의 두 마우스 모델에서 피라미드 세포와 인터뉴런 간의 연결이 변경되었는지 여부를 테스트하기 위해 단일 단위를 추정 흥분성 피라미드 세포 및 억제성 인터 뉴런으로 분류한다. 스파이크 폭과 자기 상관도의 질량 중심을 사용하여 분류한다. 추정 모노 시냅스 연결 및 밀리 초 동기 단위는 지터 방법을 사용하여 식별된다. 시냅스 효능 또는 강도를 측정하기 위해, 셔플된 평균과 비교하여 세포 쌍의 교차 상관도에서 1-3ms 지연에서 상당한 피크 또는 최저점을 감지하여 추정 된 단일 시냅스 연결 단위를 식별한다. 추정 동기 단위는 셔플된 평균과 비교하여 셀 쌍의 교차 상관도에서 0ms 지연에서 상당한 피크를 감지하여 식별된다. AD 마우스와 WT 한배 새끼간에 시냅스 연결이 다른지 여부는 연결 강도 또는 기능적 시냅스 효능을 정량화하여 비교된다. 이것은 정규화된 교차 상관도의 0 - 3ms 범위 피크의 진폭으로 정의된다. 흥미롭게도, 데이터는 피라미드 대 뉴런 연결의 연결 강도가 WT 한배 새끼에 비해 5XFAD 마우스에서 현저히 낮다는 것을 보여준다 (도 29a, b). 동조성을 조사하면 인터뉴런-인터뉴런(interneuron-interneuron) 쌍 사이에 상당히 낮은 동조성(synchrony)이 있었지만 다른 세포 유형은 없었다(도 29c, d).
실시예 4. 비 침습성 감각 자극은 깨어있는 마우스의 심부 뇌 구조를 표적으로한다.
결과.
40Hz 청각 자극은 AC, CA1 및 mPFC에서 스파이킹 활동을 조절한다. 청각 톤 자극이 AC, HPC의 CA1 영역 및 mPFC에서 GENUS를 생성할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 동물은 20Hz, 40Hz, 80Hz에서 반복되는 톤의 연속 또는 무작위 간격의 톤 (1ms 길이 , 10kHz 톤은 12.5ms, 25ms, 50ms마다 또는 임의의 톤 간 간격으로 재생되며, 이후에는 "청각 자극", 방법)이라고 한다. 톤 프리젠테이션 동안 AC, CA1 또는 mPFC의 신경 활동은 3 ~ 8 개월 된 수컷 야생형 (C57BL6J) 마우스에서 32 채널 실리콘 프로브를 사용하여 구형 트레드밀에서 달리거나 쉴 때 기록했다. 추정되는 단일 유닛의 발사 속도는 각 톤에 따라 주기적으로 증가 및 감소하여 40Hz 청각 자극을 동반한다 (도 23A, G 및 M; 도 23B, H 및 N, 파란색). 단위는 또한 무작위 자극에 의해 변조되었다. 모든 무작위 펄스가 정렬되었을 때, 자극에 따라 발사 속도 변조에 변화가 있었는데, 이는 단일 단위가 무작위 자극 펄스에 반응했음을 나타낸다. 그러나, 청각 톤의 무작위 트레인(train)은 자극 자체가 주기적이지 않았기 때문에 주기적인 발화 변조를 유도하지 않았다 (도 23B, H 및 N, 주황색). 청각 자극에 대한 동행은 위상 분포와 진폭 모두에서 단일 단위간에 다양했다. 청각 자극 동안 뉴런은 자극의 기능으로 발화되었지만 모든 주기에서 발화하지 않았으며 종종 광범위한 단계에서 발화했다: 40Hz 청각 자극에 대한 응답으로 대부분의 뉴런은 AC에서 0-22 펄스, CA1에서 0-30 펄스 및 mPFC에서 0-34 펄스마다 발화했다 (보고된 1 ~ 3 사 분위수; 도 23B, H 및 N; 도 23E , K 및 Q), 대부분의 단일 장치 (도 23C, I 및 O)에서 발사 속도의 피크 사이의 간격은 약 25ms (40Hz에 해당)였다. 대조적으로, 톤이 없는 베이스 라인 기간과 무작위 톤이 있는 기간 동안 피크 사이의 간격은 약 25ms의 넓은 분포를 가졌다 (즉, 발사 속도는 40Hz에서 변조되지 않았다; 도 23C, I 및 O). 변조 강도는 단일 단위 발사 속도를 자극 단계의 함수로 고려하고 벡터 강도 (VS)를 계산하여 정량화했다 (도 23D, J 및 P, 왼쪽). 벡터 강도 값 범위는 0 ~ 1 : 0은 자극에 의해 변조되지 않은 균일한 발사 분포 (VS = 0)를 나타내고 1은 뉴런이 특정 자극 단계 (VS = 1)까지만 발사된 분포를 나타낸다. 40Hz 청각 자극에 대한 단일 단위 반응의 벡터 강도 분포는 무자극 및 무작위 자극보다 상당히 높았다 (도 23D, J 및 P, 중앙). 무작위 자극 벡터 강도는 자극이 없는 것보다 훨씬 높았지만 (벡터 강도는 자극에 의한 변조를 측정하기 때문에)주기적인 발사 변조를 유도하지 않았다. 유사하게, 40Hz 청각 자극 동안 단일 단위에 대한 레일리 통계의 분포는 무자극 및 무작위 자극 제어의 분포보다 상당히 높았다 (도 23D, J 및 P, 오른쪽). 단일 단위 내 자극 조건 간의 벡터 강도 및 레일리 통계의 차이는 뉴런이 주기적 자극에 의해 더 강하게 변조되고 단일 단위가 더 낮은 자극 주파수에 의해 훨씬 더 강하게 변조되었음을 보여준다 (도 24G, N 및 U). 단일 뉴런의 평균 발사 속도는 40Hz 청각 자극과 무 자극, 무작위 자극, 20Hz 및 80Hz 청각 자극 컨트롤간에 유사했다 (도 23F, L 및 R, 도 24D, K 및 R). AC의 로컬 필드 전위는 40Hz 청각 자극 동안 40Hz에서 상승된 전력을 표시했지만, 그 효과는 기록 위치, 기록 세션 및 매핑 톤에 대한 응답 대기 시간에 따라 다르다 (도 24B, I 및 P). 이러한 결과는 40Hz 청각 자극이 AC, CA1 및 mPFC에서 GENUS를 강력하게 유도함을 시사한다.
결합된 청각 및 시각 속 GENUS는 미세 아교 세포에 의한 클러스터링 표현형 반응을 유도한다. GENUS가 시각 (Iaccarino et al., 2016) 및 청각 자극을 통해 적용될 수 있음을 보여준 다음 실험은 40Hz 청각 톤 자극과 40Hz 빛 깜박임(결합 GENUS)의 조합이 AC, CA1 및 mPFC 및 감각 양식 단독보다 더 강한 효과가 있다. 우리는 동물이 구 모양의 러닝 머신에서 달릴 때 또는 쉬고 있을때 32 채널 실리콘 프로브를 사용하여 AC, CA1 또는 mPFC에서 신경 활동을 기록하면서 40Hz에서 12.5ms 길이의 광 펄스 (청각 + 시각 또는 A + V, 자극)와 결합된 1ms 길이의 청각 톤을 가진 3-8 개월 된 남성 야생형(C57BL6J) 마우스를 제시했다. 단일 유닛 발사 속도는 각 톤 및 점등 기간에 따라 주기적으로 증가 및 감소하여 결합된 GENUS 동안 40Hz까지 동반된다 (도 25A-C, 왼쪽). AC, CA1 및 mPFC에서 벡터 강도 분포는 상당히 높았으며, 무작위 및 무 자극 기간과 비교하여 단일 뉴런이 40Hz A + V까지 동반 스파이킹을 보여준다 (도 25A-C, 오른쪽). AC, CA1 및 mPFC에서 40Hz에서 LFP의 상승 된 전력은 40Hz A + V 자극 동안 관찰되었다 (도 26A, H 및 O). LFP 파워의 증가는 mPFC에서 매우 작았지만 A + V 자극 동안 평균 발사 속도 차이의 중앙값 분포는 자극이없는 것과 비교하여 0과 크게 다르지만 (도 26O, R) 청각이 있는 mPFC에서는 효과가 나타나지 않았다. GENUS 단독 (도 24P, R). 따라서 40Hz에서 결합 된 톤과 빛 자극은 AC, CA1 및 mPFC에서 GENUS를 유도했다. 20Hz, 80Hz 및 임의 주파수 A + V 자극이 있는 세 영역 모두에서 상당한 동행이 관찰되었지만 후자는 주기적 발사 변조를 유도하지 않았다 (도 26B-G, I-N, P-U).
한 측면에서, 개체를 자극에 노출시키는 것을 포함하는, 개체에서 신경 질환, 손상, 상태 또는 감염(예를 들어, 정신 분열증, 간질, 전측두엽 치매, 혈관성 치매, 양극성 장애, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 자폐증, 근 위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 양극성 장애, 허혈 재관류 손상, 다발성 경화증, 및 / 또는 우울증)으로 인한 염증성 손상을 포함하는 신경 질환, 손상, 상태 또는 감염을 치료하는 방법으로서; 상기 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도하고 개체 내에서 세포 활동의 하나 이상의 가용성 매개체의 발현을 조절하며 자극은 한 시간 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 방법이 본원에 개시된다.
한 측면에서, 신경 질환, 손상, 상태 또는 감염을 치료하는 개시된 방법에서 치료에 사용되는 자극이 개시된 방법에서 1시간 미만 동안 전달될 수 있음이 이해되고 본원에서 고려된다. 한 측면에서, 1 시간 미만의 자극은 단일 노출로 또는 하루에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 , 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 150 회 또는 그 이상의 복용량 노출로 전달 될 수 있다. 추가로, 자극 치료는 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 시간에 한번 이상, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 일에 한번 이상, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월에 한 번 이상 투여될 수 있음이 이해되고 본원에서 고려된다. 한 측면에서, 치료는 신경학적 질환 또는 상태를 치료하기 위해 필요에 따라 또는 1 회 투여될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 치료는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60 일, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 개월, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 년 또는 그 이상 발생할 수 있다. 한 측면에서, 치료는 개체의 나머지 수명 동안 계속된다.
또한, 개체를 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극, 일정한 감각 자극 또는 이들의 조합에 노출시키는 것을 포함하는 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법이 본원에 개시된다. 한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 40Hz 감각 미광 자극에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 세포 활성의 가용성 매개체 활성은 IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-12p70, IL-12p40, IFN-γ, LIF, TNF-α, MIP-1β, 에오탁신, MIG, GRO-α, IL-13, MCP-1, IL-1α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 본원에 개시된다.
한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 무작위 감각 미광 자극에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 세포 활성의 가용성 매개체는 IL-10, MIG, GRO-α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 본원에 개시된다.
한 측면에서, 임의의 선행 측면의 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 일정한 감각 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 상기 세포 활성의 가용성 매개체는 VEGF, IL-2, IL-5, IL-9, IL-13, MCP-1, IL-1α 및 / 또는 MIP-1α를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 본원에 개시된다.
또한, 개체를 20Hz에서 일정하거나 깜박이는 빛에 노출시키는 것을 포함하는 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
검토.
느린 청각 클릭(click)-트레인(train) 자극은 AC 뉴런으로부터 동기화된 위상 고정 스파이킹 응답을 유도 할 수 있지만, 각 클릭은 주파수가 증가함에 따라 더 조절된다. 이러한 결과와 일치하여 AC 뉴런은 20Hz, 40Hz 및 80Hz에서 반복되는 톤에 동행하고 더 빠른 주파수의 경우 뉴런은 개별 톤에 비해 더 작은 부분과 더 넓은 범위의 위상에 반응하여 발화한다. CA1 및 mPFC 뉴런이 청각 자극을 포함한 감각 신호에 반응 할 수 있다는 광범위한 증거가 있지만, 40Hz 청각 또는 A + V 자극이 이 뇌 영역(도 23B, H 및 N 및도 25A-C)에서 40Hz에서 작지만 상당한 발사 속도 동반을 유도한다는 사실이 처음으로 나타났다. AC에서와 마찬가지로 CA1 및 mPFC의 단일 장치는 변조를 표시하고 모든 펄스에 응답하여 발생하지는 않지만 자극 위상의 함수로 발생한다. 감각 입력이 여러 간접 경로를 통해 이러한 영역에 도달하기 때문에 HPC 및 mPFC에서 약한 스파이킹 변조가 예상될 수 있다.
속도 코딩 연구는 뉴런이 자극에 동기화하지 않고 발사 속도를 사용하여 클릭(click)-트레인(train)을 인코딩 할 수 있음을 보여준다. 각 뇌 영역에서 일부 뉴런은 청각 열차의 주파수에 따라 다른 속도로 발화하는 것으로 나타났지만, 전체 인구는 다른 자극 주파수로 다소 발화하지 않았다 (도 23F, L 및 R 및도 26D, K 및 R). 따라서 40Hz 청각 자극에 대한 반응으로 미세 아교 세포, 성상 세포, 혈관 구조 및 아밀로이드 수준과 행동 성능에서 관찰 된 변화는 발화 속도의 전반적인 변화로 설명 할 수 없다고 결론지었다.
방법 및 재료.
수술 절차. 성인 (2-3 개월령) 마우스를 이소플루란(isoflurane)으로 마취시키고 정위 프레임에 고정시켰다. 안과 연고 (Puralube Vet Ointment, Dechra)를 눈에 바르고 두피를 면도하고 포비돈 요오드 (Dynarex)와 70 % 에탄올로 소독했다. 맞춤형 스테인레스 스틸헤드 플레이트를 치과용 시멘트 (C & B Metabond, Parkell)를 사용하여 고정하고 LFP 기록을 위한 개체 개두술 부위를 두개골에 표시했다 (mm, 브레그마(bregma)에서 : -2.0 앞 / 뒤, +/- 1.8 중간 / 옆) CA1, -2.0 ~ -3.0 전방 / 후방, +/- 1.8 내측 / 측면 청각 피질, +1.3 ~ +1.4 전방 / 후방, +/- 1.0 내측 / 측면 (전전두피질(prefrontal cortex) 표적화). 개두술은 나중에 3-8 개월 된 마우스에서 수행되었다. 첫 번째 기록 세션 전날 또는 당일, 치과용 드릴로 두개골을 얇게 만든 다음 27 게이지 바늘로 구멍을 뚫어 두개골 절제술 (직경 200-500μm)을 만들었다. 기록하지 않을 때는 개두술을 멸균 실리콘 엘라스토머 (Kwik-Sil WPI)로 밀봉했다.
전기 생리학 기록. 기록 중에 머리에 고정된 동물은 공중에 떠있는 8 인치 구형 트레드밀에서 달렸다. 모든 동물은 이전에 러닝머신에서 이동하는 법을 배웠으며 때때로 단연유 (1 : 2 물 희석)를 받으면서 편안해질 때까지 배웠다. 동물은 최대 5 시간 동안 공 위에 있었고 이 시간 동안 여러 번 뛰고 휴식을 취했다. 단일 생크 32 채널 프로브 (NeuroNexus)가 대상 위치로 전진했다. 기록 사이트는 250m에 달했다. 청각 피질 기록을 위해 프로브는 관상면에 수직 평행에서 3-4.15mm 깊이까지 45 ° 각도로 진행되었다. 평균 LFP에서 청각 반응을 감지하기 위해 5, 10, 15 및 20kHz의 일련의 50ms 톤이 제공되었다. CA1 기록의 경우 프로브는 해마 피라미드 층 전기 생리학 특성이 관찰될 때까지 개두술을 통해 1.14 - 2.05mm 깊이까지 수직으로 전진했다 (큰 세타파 및 날카로운 파동, 여러 채널에서 150+ μV 스파이크). 전두엽 피질 기록을 위해 프로브는 수직에서 20 ° 각도로, 관상면에서 1.48-2.15mm 깊이까지 49 ° 각도로 전진했다. 동일한 기록 세션 동안 여러 깊이에서 데이터가 수집 된 경우 기록 사이트의 위치가 대상 위치에 남아 있는지 확인하기 위해 새로운 깊이가 매핑되었다 (n = AC의 경우 5 마우스에서 9 세션에서 9 개의 기록 깊이, CA1의 경우 5 마우스에서 10 세션에서 12 개의 기록 깊이, n = 7 기록 mPFC의 경우 4 마우스에서 7 세션의 깊이). 기준으로 지상 펠릿을 사용하는 Intan RHD2000 평가 시스템을 사용하여 20kHz의 샘플링 속도로 데이터를 수집했다.
전기 생리학 기록을 위한 청각 및 시각 자극. 동물에게 10 초의 기준 기간으로 인터리브된 10 초의 자극 블록을 제시 하였다. 20Hz, 40Hz, 80Hz 또는 무작위 자극으로 청각 전용 또는 청각 및 시각적 자극 사이에서 회전 된 자극 블록 (평균 25ms 간격의 균일한 분포에서 결정된 무작위 펄스 간 간격으로 펄스가 전달되었다). 관찰된 결과가 신경 세포 반응의 시간 경과에 따른 변화가 아닌지 확인하기 위해 자극 블록을 삽입했다. 10 초의 긴 자극 블록을 사용하여 발병 효과의 영향을 줄이고 장기간의 리듬 자극에 대한 신경 반응을 조사했다. 모든 청각 펄스는 1ms 길이의 10kHz 톤이었다. 모든 시각적 펄스는 자극 주파수 (25ms, 12.5ms 또는 6.25ms 길이)의 50 % 듀티 사이클이었다. 결합된 자극의 경우 청각 및 시각 펄스가 각 펄스의 시작에 맞춰 정렬되었다.
전두엽 피질 조직학. 각 동물의 최종 mPFC 기록 중에 프로브를 DiI로 코팅하고 목표 깊이까지 삽입했다. 마우스를 마취하에 인산염 완충 식염수 (PBS)에 4 % 파라포름 알데히드 (이소플루란)로 경동맥 관류하고, 뇌를 1xPBS에 4 % 파라 포름 알데히드에 하룻밤 후 고정시켰다. 뇌는 Leica VT1000S vibratome (Leica)로 100 μm 두께로 분할되었다. 섹션을 1xPBS에서 0.2 % 1mMol DAPI로 염색하고 Vectashield 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 장착했다. Zen Blue 2 소프트웨어와 함께 Zeiss Axio Observer Z1 도립 에피 형광 현미경(epifluorescent microscope)으로 이미지를 획득했다.
스파이크 분류 및 단일 단위 안정성. 스파이크 감지 및 정렬은 MountainSort 자동 스파이크 정렬을 사용하여 수행 된 다음 파형 및 교차 상관도의 시각적 검사를 기반으로 수동 큐레이션을 수행했다. 수동 큐레이션 이전에 품질 임계값은 피크 SNR이 1보다 크거나 같고, 노이즈와 10 % 미만 겹치며, 잘 격리된 단일 유닛을 생성 한 다른 유닛과의 분리가 95 % 이상인 유닛만 포함하도록 적용되었다. 단일 유닛이 손실 된 기록의 불안정 기간을 설명하기 위해 안정된 기간 (단일 유닛의 발사 속도가 갑작스럽게 손실되지 않음) 만 분석에 고려되도록 안정성 기준을 적용했다. 각 유닛에 대한 발사 속도 (FR)는 기록 세션 동안 계산되었다. 발사 속도는 k- 평균 클러스터링을 사용하여 낮은 FR과 높은 FR의 두 가지 분포로 클러스터링되었다. FR이 높은 FR 평균의 10 % 미만으로 떨어진 장치의 경우 추가 분석을 통해 FR이 낮은 FR 평균보다 2 표준 편차 높은 가장 긴 시간 길이로 정의된 안정적인 기록 기간을 확인했다.
LFP. LFP는 원시 트레이스를 2kHz로 다운 샘플링하고 1-300Hz 사이의 대역 통과 필터링을 통해 얻었다.
파워 스펙트럼. Chronux 도구 상자에서 멀티 테이퍼 방법을 사용하여 전력 스펙트럼 밀도 분석을 수행했다 (시간 대역폭 곱 = 3, 테이퍼 수 = 5). LFP 추적은 각 자극 조건의 10 초 시험으로 나누어졌다. 평균 전력 스펙트럼 밀도는 두개골 위의 식염수에 있는 지상 펠렛을 참조하여 이러한 시험을 통해 각 동물 (동일한 기록 일 및 기록 깊이 내)에 대해 계산되었다. 전력 스펙트럼 밀도 분석은 처음에 AC, CA1 및 mPFC의 모든 기록 사이트에 대해 계산되었다. 각 기록 깊이에서 40Hz 미광 자극에 대한 응답으로 가장 큰 40Hz 피크를 가진 트레이스가 분석에 포함되었다. 제시된 데이터에 표시된 심도별 추적은 청각 미광 자극에 대한 응답으로 가장 큰 40Hz 피크를 가졌다.
미광 자극 중 발사. 각 자극 주파수에 대한 단일 단위 주변 자극 시간 히스토그램 (PSTH)은 2 개의 자극주기 (여기서 한주기 = 1 / (자극 주파수) 초)를 포함하며, 주기 당 10 개의 빈을 사용하여 자극 열에 걸쳐 스파이크를 표시한다. 진동에 의한 변조를 표시하는 경우 여러 사이클에 걸쳐 스파이킹 변조를 표시하는 것이 일반적이다. PSTH는 각 점등 또는 오디오 켜기 펄스의 시작 전후에 1 개의 자극주기 동안 스파이크를 비닝(binning)하여 모든 단일 단위에 대해 계산되었다. 무작위 자극 조건에서와 같이 무작위로 분포된 펄스 시간을 사용하여 자극 (기준선) 히스토그램을 계산하지 않았다. 발사 속도는 빈당 스파이크 수를 해당 빈의 총 시간 (총 펄스 수 x 빈 크기)으로 나누어 각 빈에서 계산되었다. 자극 주파수와 관련하여 발사 속도 주기성을 정량화하기 위해 모든 단일 단위 히스토그램에 대해 발사 속도 피크 사이의 시간 간격을 계산했다. 각 PSTH의 피크는 한 자극 간격 내에서 최대 발사 속도였다. 자극에 의한 발사 속도 변조를 정량화하고 순환 통계를 계산하기 위해 주변 자극 스파이크 시간을 라디안으로 변환했다: (자극 주변 스파이크 시간) * 2π * (자극 주파수) 및 벡터 강도 및 Rayleigh 통계를 계산했다. 벡터 강도는 CircStat 도구 상자의 방법을 사용하여 계산되었다. Rayleigh 통계는 방정식 RS = 2nVS²을 사용하여 계산되었다. 여기서 n은 총 스파이크 수이고 VS는 벡터 강도이다 (Berens, 2009), Ma et al. 2013). 벡터 강도와 Rayleigh 통계 값의 차이는 각 단위에 대한 자극 조건 간의 이러한 값 차이를 취하여 계산되었다. 기록된 모든 단일 유닛에 대한 깜박임에 대한 발사 속도 반응을 보여주는 히트 맵이 4 회 연속 자극주기에 걸쳐 계산되었다. 모든 뉴런의 반응을 보여주기 위해 각 자극 기간의 4 개의 연속적인 자극주기를 보여준다. 이를 위해 각 자극 조건의 10 초 프레젠테이션 기간을 정렬한 다음 각 프레젠테이션 기간의 처음 100ms를 제외하여 시작 효과가 혼입을 가리지 않도록 했다. 그런 다음 깜박임에 대한 발사 속도 응답을 얻기 위해 다음 4 개의 자극주기 (20Hz의 경우 200ms, 40Hz의 경우 100ms, 80Hz의 경우 50ms)에 대한 스파이킹 응답을 평균했다. 각 단일 유닛의 발사 속도는 1ms 빈으로 계산되었으며 각 자극 주파수 (N = 1 / (자극 주파수) 초, α = 3) 및 z 점수에 비례하는 가우스 창(gaussian windows)으로 평활화되었다. 뉴런은 분석된 4주기에서 평균 자극 단계 선호도에 따라 정렬되었다.
평균 발사 속도. 평균 발사 속도는 각 자극 조건에 대해 각 단일 단위에 대해 계산되었다. 각 단위의 안정적인 기간 만 평균 FR 계산에 기여했다 (위의 스파이크 정렬 및 단일 단위 안정성 참조). 자극 조건 간의 평균 발사 속도의 차이는 해당 단위에 대한 각 조건의 평균 FR 차이를 취하여 각 단위 내에서 계산되었다.
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주제가 구조적 특징 및 / 또는 방법론적 행위에 특정된 언어로 설명되었지만, 첨부된 청구 범위에 정의된 주제가 반드시 위에 설명 된 특정 특징 또는 행위로 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야한다. 오히려, 위에서 설명된 특정 특징 및 동작은 청구 범위를 구현하는 예시적인 형태로 개시된다.
Claims (51)
- 개체에게 자극을 전달하는 단계를 포함하는 개체의 뇌 활동을 제어하는 방법으로서,
상기 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도하고 개체 내에서 세포 활동의 하나 이상의 가용성 매개체의 발현을 조절하며 자극은 한 시간 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 개체의 뇌 활동을 제어하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 세포 활성의 하나 이상의 가용성 매개체가 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자극이 약 30 분 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 자극이 약 10 분 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 자극이 약 5 분 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 비 침습성 자극 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극은 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 자극은 시각 또는 청각 자극 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
조절하기 위해 세포 활성의 가용성 매개체를 선택하는 단계; 및
세포 활성의 선택된 가용성 매개체를 조절하는 자극 프로토콜 선택 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 자극 프로토콜은 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 랜덤 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극 중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극은 40Hz 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-12 p70(IL-12p70), 인터루킨-12 p40(IL-12p40), 인터페론-γ(IFN-γ), LIF, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 대식세포 염증 단백질 1β(MIP-1β), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노 카인(MIG), 성장 조절 종양 유전자-α(GRO-α), LIX (CXCL5), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-15(IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 인터루킨-13(IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질 1(MCP-1), 인터루킨-1α(IL-1α) 및 / 또는 에오탁신(Eotaxin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 무작위 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-10(IL-10), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노 카인(MIG), 성장 조절된 종양 유전자-α(GRO-α), LIX(CXCL5), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-15(IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES), 및 / 또는 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 일정한 감각 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨 -2 (IL-2), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨-13 (IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질 1 (MCP-1), 인터루킨 -1 (IL-1) 및 / 또는 대식세포 염증 단백질 1 (MIP-1)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 감마 인터페론 (MIG)에 의해 유도된 모노 카인, 성장 조절된 종양 유전자-α(GRO-α), LIX (CXCL5), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터루킨 -1β (IL-1β), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-15 (IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES), 및 / 또는 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 40Hz 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-13 (IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질 1 (MCP-1) 및 / 또는 인터루킨-1α (IL-1α)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 20Hz 감각 미광 자극을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-12 p70(IL-12p70), 인터루킨-12 p40(IL-12p40), 인터페론-γ(IFN-γ), LIF, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 대식세포 염증 단백질 1β(MIP-1β), 에오탁신(Eotaxin), 인터루킨-10(IL-10), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-9(IL-9), 대식세포 염증성 단백질 1α (MIP-1α), 감마 인터페론에 의해 유도된 모노 카인(MIG), 성장 조절 종양 유전자-α(GRO-α), LIX (CXCL5), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-15(IL-15), 활성화시 조절됨, 정상 T 세포 발현, 및 분비(RANTES), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 인터루킨-13(IL-13), 단핵구 화학 유인 단백질(MCP-1) 1 및 / 또는 인터루킨-1α(IL-1α)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 감각 미광 자극 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 감각 미광 자극은 시각적 미광 자극 또는 청각 미광 자극 중 적어도 하나 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 감각 미광 자극은 결합된 시각 및 청각 미광 자극 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 경두개(transcranial) 전기 자극 또는 경두개 자기 자극 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌 활동이 감각 피질 중 적어도 하나에서 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌 활성이 해마, 내측 측두엽, 전두엽, 피질 하부 구조, 시상, 시상 하부 또는 뇌간 중 적어도 하나에서 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 개체의 뇌에서 신경 활동이 약 20 내지 80 Hz 범위의 신경 활동 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체의 뇌에서 질환, 손상, 감염 또는 정상 노화 중 적어도 하나를 치료하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 전달된 자극을 사용하여 신경 퇴행성 질환을 치료하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 신경 퇴행성 질환이 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 치매, 전두측두엽 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 다발성 경화증 (MS) 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 개체 내에서 면역 조절 신호 전달 또는 세포 생존 신호 전달 중 적어도 하나를 조절함으로써 개체의 상태를 치료하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 상기 상태가 간질, 정신 분열증, 자폐증, 외상성 뇌 손상 (TBI), 양극성 장애, 뇌졸중 또는 우울증 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 전달된 자극을 사용하여 개체의 뇌의 신경 가소성을 유도하거나 억제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 활성의 하나 이상의 가용성 매개체의 조절이 일시적이도록 자극 전달을 제어하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로를 상향 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 하나 이상의 세포 내 신호 전달 경로가 정규 키나아제(kinase) 경로를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 경로가 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로, 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 (NFκB) 경로, 사이클로옥시게나제(Cyclooxygenase)-2 (COX-2) 경로, 핵 인자 (적혈구-유래 2) 유사 2 (Nrf2) 경로, 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스포스페이트(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) 3- 키나아제 (PI3K) / Akt 경로 또는 야누스 키나아제 (JAK)-신호 변환기 및 전사 활성화제 (STAT) 경로를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 신호 전달에 대한 자극 효과가 적어도 하나의 즉각적인 초기 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항에 있어서, 하나 이상의 즉각적인 초기 유전자가 활성 조절 세포 골격 관련 단백질 (ARC) 또는 Fos 원종양 유전자 (C-Fos) 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극이 분화를 조절하는 세포 내 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 개체를 자극에 노출시키는 단계를 포함하는 개체에서 신경학적 상태를 치료하는 방법으로서,
상기 자극은 개체의 뇌에서 신경 활동을 유도하고 개체 내에서 세포 활동의 하나 이상의 가용성 매개체의 발현을 조절하며, 상기 자극은 한 시간 미만 동안 개체에게 전달되는 것을 특징으로 하는 개체에서 신경학적 상태를 치료하는 방법
- 제 38 항에 있어서, 상기 자극은 20Hz 감각 미광 자극, 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극, 일정한 감각 자극, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
- 제 38 항에 있어서, 상기 신경학적 상태가 정신 분열증, 간질, 전두측두엽 치매, 혈관성 치매, 양극성 장애, 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 근위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 또는 우울증을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
- 제 40 항에 있어서, 상기 신경학적 상태가 우울증을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 자극이 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 38 항에 있어서, 신경학적 상태가 노화, 외상성 뇌 손상, 스트레스, 정신 분열증 및 / 또는 우울증으로 인한 염증성 손상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 자극이 20Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 개체를 40Hz 감각 미광 자극, 무작위 감각 미광 자극, 일정한 감각 자극, 또는 이들의 임의의 조합에 노출시키는 것을 포함하는 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 상향 조절하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 세포를 40Hz 감각 미광 자극에 노출시키는 단계를 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-12p70, IL-12p40, IFN-γ, LIF, TNF-α, MIP-1β, 에오탁신(Eotaxin), MIG, GRO-α, IL-13, MCP-1, IL-1α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 세포를 무작위 감각 미광 자극에 노출시키는 단계를 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 IL-10, MIG, GRO-α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 상기 방법은 세포를 일정한 감각 자극에 노출시키는 것을 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체는 VEGF, IL-2, IL-5, IL-9, IL-13, MCP-1, IL-1α 및 / 또는 MIP-1α를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 세포를 40Hz 감각 미광 자극 또는 무작위 감각 미광 자극에 노출시키는 단계를 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 MIG, GRO-α, LIX, G-CSF, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-15, RANTES 및 / 또는 M-CSF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 세포를 40Hz 감각 미광 자극 또는 일정한 감각 자극에 노출시키는 단계를 포함하고, 세포 활성의 가용성 매개체가 IL-13, MCP-1 및 / 또는 IL-1α을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 개체를 20Hz에서 일정하거나 깜박이는 빛에 노출시키는 것을 포함하는 개체의 뇌에서 세포 활성의 가용성 매개체의 발현을 억제하는 방법.
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