NL8801934A

NL8801934A - Epipodophyllotoxine glucoside 4'-fosfaat derivaten.

Info

Publication number: NL8801934A
Application number: NL8801934A
Authority: NL
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1987-08-04
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1989-03-01
Also published as: NZ225615A; IT1226825B; LU87290A1; IL87290A; CZ286893B6; MY104321A; NL192683C; HK6392A; ATA195588A; NL970042I2; CH676716A5; FI87790C; FI883596A0; IE882378L; FR2622193A1; DK169344B1; JPH01100188A; SE502214C2; DK11992A; US5041424A

Description

* ψ Η -1- V0 1196

Titel: Epipodophyllotoxine glucoside 4'-fosfaat derivaten

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op 4'-fosfaat derivaten van epipodophyllotoxine glucosiden, op hun gebruik tegen tumoren, en op pharmaceutische preparaten die deze nieuwe middelen bevatten.

5 Etoposide (VP-16,1^) en teniposide (VM-26, II) zijn klinisch bruikbare middelen tegen kanker, die afgeleid zijn van het in de natuur voorkomende lignaav podophyllotoxine (III); de klasse van verbindingen waartoe etoposide en teniposide behoren, wordt soms aangeduid als 4'-demethylepipodo-10 phyllotoxin glucosiden. Etoposide en teniposide zijn aktief in de behandeling van verschillende kankers waaronder testi-kelkanker, kleincellige longkanker, eierstokkanker, borstkanker, schildklierkanker, blaaskanker, hersenkanker, niet-lymphocytische leukemie, en de ziekte van Hodgkin.

15 De verbindingen I en II en een werkwijze voor het be reiden ervan worden beschreven in het Amerikaanse Octrooi-schrift 3.408.441 van Wartburg et al en in het Amerikaanse Octrooischrift 3.524.844 van Keller-Juslen et al. De daarin beschreven verbindingen, waarvan in het bijzonder etoposide 20 en teniposide dienen als uitgangsmateriaal voor de hierin beschreven bereiding van epipodophyllotoxine glucoside 4'-fosfaat derivaten volgens de onderhavige uitvinding.

Fosforylering van therapeutische middelen die een hydroxyl groep bevatten, is gebruikt als middel om een latente 25 geneesmiddelwerking te realiseren; de gefosforyleerde derivaten kunnen dan iji vivo door een fosfatase worden gesplitst waarbij het aktieve moedermolecuul vrijkomt. Een korte bespreking van fosfaten als mogelijke geneesmiddel voorlopers (prodrugs) wordt gegeven in het overzichtsartikel "Rational for 30 Design of Biologically Reversible Drug Derivatives: Prodrugs" (Sinkula en Yalkowsky, J. Pharm. Sci., 1975, 64:181-120 op biz. 189-191). Voorbeelden van fosfaten van bekende middelen tegen tumoren zijn camptothecine(Japanse Kokai 21-95393 en 21-95393 Derwent Abstr. Nos. 87-281016 resp. 87-281015) en 35 daurorubicine (Amerikaans octrooi 4,185,111).

.8801934 ·> -2-

Podophyllotoxine fosfaat dinatriumzout IV werd bereid door Seligman et al. Het fosfaat werd echter niet door zuurfosfa-tase van de prostaat gehydrolyseerd en vertoonde geen lagere toxiciteit ten opzichte van de moederverbinding podophyllo-5 toxine (Cancer Chemotherapy Reports Part I, 1975, 59:233-242). De onderhavige uitvinding verschaft fosfaatesters van 4’-deme-thylepipodophyllotoxine glucosiden die aktieve middelen tegen tumoren zijn. In het bijzonder zijn het diwaterstoffosfaat van 41-demethylepipodophyllotoxine glucosiden en zouten daar-10 van goed oplosbaar in water waardoor een belangrijk pharma-ceutisch voordeel ten opzichte van de bestaande therapeutische middelen van deze klasse, etoposide en teniposide, die een minimale oplosbaarheid in water hebben, wordt verschaft.

De onderhavige uitvinding verschaft 4'-fosfaatderiva-15 ten van 4'-demethylepipodophyllotoxine glucosiden met de algemene formule V en pharmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan 6 1 waarin R H is en R gekozen wordt uit de groep bestaande uit (ci_iq)alkyl; (C2_1Q)alkenyl; (C5_g) cycloalkyl; 2-furyl; 2-thienyl; (Cg_10)aryl; (C7_14) aralkyl; en (Cg_14)aralkenyl 20 waarin elk van de aromatische ringen ongesubsitueerd of gesub- situeerd kan zijn door één of meerdere groepen gekozen uit halogeen, (C. Q)alkyl, (C-, Q)alkoxy, hydroxy, nitro, en amino; 1 6 -L *” o 1"o χ 0 of R en R elk (C. Q) alkyl zijn; of Rx en R en het kool- l-o stofatoom waaraan ze gebonden zijn tesamen een (C_ ‘ ) cycloal- 7 8~° 25 kylgroep vormen; X zuurstof of zwavel is; R en R onafhankelijk van elkaar gekozen zijn uit de groep bestaande uit H, (C. _) alkyl, doorA gesubstitueerd (Cn ,.)alkyl, (C_ _)cyclo-l—o l—o o—o alkyl, doorA gesubstitueerd (C2_g)cycloalkyl;(Cg_1Q)aryl, door A gesubstitueerd aryl, door alkyl gesubstitueerd aryl, 30 aralkyl, door A gesubstitueerd aralkyl, en door alkyl gesubstitueerd aralkyl; waarin de substituenten A een of meerdere groepen zijn gekozen uit hydroxy, alkoxy, alkanoyloxy, cyano, amino, alkylamino, dialkylamino, carboxy, alkylthio, mercapto, mercaptothio, nitropyridyl disulfide, alkanoylamino, alkanoyl, 35 carbamoyl, nitro en halogeen.

De zouten van de verbinding met formule V omvatten zowel de mono-anionische als de di-anionisch zouten. Het kation kan een metaal ion zoals een van de alkalimetalen of aardalkalimetalen of andere gebruikelijke metaal ionen zijn, of een 880 1 934 I 4 -3- organische stikstofbevattende groep zijn zoals ammonium, mono-, di-, of trialkylammonium of pyridinium. Het kation wordt bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit natrium, kalium, lithium, cesium, magnesium, calcium, aluminium, ammonium, en 5 mono-, di-, en trialkylammonium. Een voorkeurs uitvoerings- 7 δ vorm verschaft verbindingen met formule V waarinR en R allebei waterstof voorstellen, alsmede pharmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan. Een meest geprefereerde uitvoeringsvorm verschaft etoposide 4'-diwaterstoffosfaat en thiofosfaat en hun 10 respectievelijke dinatriumzouten met de formules Vla en Vlb.

Een andere voorkeursuitvoeringsvorm verschaft verbindingen 7 8 met formule V, waarin R en R gelijk zijn en gekozen worden uit de groep bestaande uit 2,2,2-trihalogeenethyl, 2-cyano-ethyl, (C1-5)alkyl, phenyl en phenylalkyl, waarin de phenyl 15 ring desgewenst door alkyl, halogeen of nitro is gesubstitueerd.

Een verder aspekt van de uitvinding verschaft tegen

tumoren werkzame fosforoamidaat derivaten met formule VII

en pharmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan, waarin r\ 20 en X de eerder vermelde betekenis hebben; Y is Cl, OH of 4 5 2 3 4 5 NR R ; R , R , R , en R elk onafhankelijk van elkaar worden gekozen uit de groep bestaande uit H, (C^_t-) alkyl, (C2—5^ alkenyl, (C0 -} cycloalkyl, door A gesubstitueerd (C. _)alkyl,

1“D

door A gesubstitueerd (C„_R) alkenyl, door A gesubstitueerd 2ά "*3 25 (C-, c) cycloalkyl; of R , R , en het stikstofatoom waaraan 4 5 ze gebonden zijn, tezamen een 3- tot 6-nng vormen; of R , R , en het stikstofatoom waaraan ze gebonden zijn, tezamen een 3-tot6-ring vormen?waarbij de substituenten A de eerder vermelde betekenis hebben.

30 Een ander aspekt van de onderhavige uitvinding verschaft dichlorofosfaat . tussenprodukten met de formule VIII waarin r\ R^ en X de eerder vermelde betekenissen hebben? deze middelen zijn bruikbaar in de bereiding van verbindingen met formule V.

35 Weer een ander aspekt van de onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze voor het bereiden van een verbinding 7 8 met formule V, waarin R en R allebei H voorstellen, alsmede de pharmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan, waarbij (a) een verbinding met formule IX wordt omgezet in een ver- .8801934

A

-4- 1 6 binding met formule x, waarin R , R en X de eerder vermelde betekenissen hebben en G een fosfaat beschermende groep voorstelt; (b) de fosfaat beschermende groep wordt verwijderd; 5 (c) desgewenst het produkt van stap (b) wordt omgezet in een pharmaceutisch aanvaardbaar zout. Fosfaat beschermende groepen omvatten, zonder daartoe beperkt te zijn, die 7 binnen de bovenstaand gegeven definitie van R , met uitzondering van H.

10 Tenzij anders is aangeven betekent hier de term "alkyl" alkylgroepen met rechte of vertakte koolstofketens; "halogeen" broom, chloor, fluor en jood; "etopofos" de verbinding etoposide 4'-fosfaat dinatriumzout (d.w.z. de verbinding met formule Vla).

15 De fenolgroep van 41-demethylepipodophyllotoxine glu- cosiden kan worden gefosforyleerd met fosforigoxychloride en thiophosphorylchloride onder vorming van respectievelijk het overeenkomstige dichlorofosfaat en het overeenkomstige dichlorothiofosfaat (formule VIII). De fosforyleringsreaktie 20 wordt uitgevoerd in een geschikt watervrij organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld acetonitrile en bij voorkeur in tegenwoordigheid van een tertiaire amine base, bij voorbeeld N,N-diisopropylethylamine. Het reaktieverloop kan met dunne laag chromatografie (TLC) worden gevolgd, waardoor de optimale 25 reaktieduur kan worden beoordeeld op basis van het verschijnen van produkt of het verdwijnen van het uitgangsmateriaal of beide. Volgens onze ervaringen kan de reaktieperiode ongeveer 4 uur tot ongeveer 72 uur in beslag nemen. De vereiste reaktieduur lijkt verband te houden met de kwaliteit van het gebruik-30 te fosforhoudende reagens.

De 4'-dichlorofosfaten met formule VIII zijn veelzijdige tussenprodukten die daarna met nucleofielen kunnen reageren onder vorming van verschillende fosfaat en thiofosfaat derivaten. De tussenprodukten kunnen derhalve worden ge-35 hydroliseerd om de fosfaten te verkrijgen, en in tegenwoordigheid van een base worden de fosfaatzouten verkregen.

Wanneer bijvoorbeeld de verbinding met formule VIII wordt behandeld met een overmaat waterige natrium bicarbonaat .8801934 * • -5- oplossing, worden de overeenkomstige 4'-fosfaat dinatrium en 4'-thiofosfaat dinatrium zouten verkregen; bicarbonaten van andere kationen zoals kalium en ammonium kunnen eveneens worden gebruikt öm de respektievelijke zouten te verkrijgen.

5 Het dichlorofosfaat tussenprodukt met formule VIII kan reageren met aminen, waarbij het overeenkomstige fosforodi-amidaat of het overeenkomstige chlorofosforomonoamidaat wordt verkregen. Voorbeelden van geschikte aminen zijn, zonder daartoe beperkt te zijn, ammoniak, primaire aminen zoals 10 ethylamine, chloroethylamine, allylamine, dimethylaminopropyl-amine, hydroxyethylamine, cyclohexylamine, en aminocyclo-hexanol; en secundaire aminen zoals diethylamine, piperidine, ëthylmethylamine,methylaminoethanol, ethylbutylamine, en dergelijke. De hoeveelheid die van het amine wordt gebruikt 15 in verhouding tot de hoeveelheid van het epipodophyllotoxine dichlorofosfaat, kan worden aangepast om het ene dan wel het andere reaktieprodukt te bevorderen. Wanneer bijvoorbeeld een grote overmaat van het amine ten opzichte van het epipodophyllotoxine wordt gebruikt, wordt het symmetrische 20 fosforodiamidaat verkregen, d.w.z. verbindingen met de 2 3 formule VII waarin Y hetzelfde is als NR R ; het chlorofosforomonoamidaat, d.w.z.verbindingen met formule VII waarin Y Cl is, kan worden bereid wanneer een beheerstere hoeveelheid van het amine wordt gebruikt. Het chlorofosforomono-25 amidaat kan worden gehydrolyseerd om verbindingen met formule VII te verkrijgen, waarin Y OH voorstelt of zouten daarvan, of kan verder reageren met een tweede amine om het niet- symmetrische fosforodiamidaat te verkrijgen, d.w.z. verbin- 4 5 dingen met formule VII waarin Y NR R is en verschillend is 2 3 30 van NR R .

De bovenstaand beschreven procedure wordt in het op het formuleblad weergegeven reaktieschema toegelicht.

Fosfaat triesters zijn verbindingen met formule V 7 8 waarin R en R niet H voorstellen, en ze kunnen worden 35 bereid door 41-demethylepipodophyllotoxine glucoside te behandelen met een halogeenfosfaat diester, [d.w.z. Hal-P(X) (OR )(OR )]. Gevonden is dat deze reaktie het méést efficient .8801934

A

* -6- wordt uitgevoerd in acetonitrile in tegenwoordigheid van een organische trialkylamine base; de geprefereerde base is diisopropylethylamine. Tenminste één equivalent van het halo-geenfosfaat en de amine base wordt gebruikt, maar beide 5 reagentia worden bij voorkeur gebruikt in molaire equivalenten in een geringe overmaat ten opzichte van die van de epipodo-phyllotoxine glucoside reactant. De reaktie kan bij elke temperatuur die tot de vorming van produkt leidt, worden uitgevoerd; enigszins verhoogde temperaturen, bijvoorbeeld 10 30-40°C, lijken echter de reaktie die tot verscheidene dagen in beslag kan nemen om volledig te zijn, te vergemakkelijken. Symmetrische halogeenfosfaat diesters [R =R ] kunnen op conventionele wijze worden bereid uit de alcohol en bijvoorbeeld fosforylchloride, en asymmetrische halogeenfosfaat 15 diesters [r ^R ] kunnen worden bereid uit de alcohol en de dihalogeenfosfaat ester. Het is ook mogelijk om fosfaat tries ters langs andere wegen te bereiden, bijvoorbeeld door eerst de fenol om te zetten in een fosfiet ester, bijvoorbeeld door een reaktie met een reagens zoals (PhC^O^PNii-pr ) 20 en een daaropvolgende oxidatie van het fosfaat tot de fosfaat ester onder toepassing van bijvoorbeeld m-chloro perbenzoë-zuur.

Fosfaat triesters kunnen bovendien dienst doen als tussenprodukten in de bereiding van verbindingen met formule 7 8 25 V en zouten daarvan. Het dihydroxyfosfaat (V, R =R =H) wordt 7 8 bijvoorbeeld verkregen wanneer de diphenyl ester (V, R =R = phenyl) aan een katalytische hydrogenering wordt onderworpen.

Andere geschikte fosfaatbeschermende groepen zijn, zonder daartoe beperkt te zijn,2,2,2-trichloroethyl, benzyl, cyano- 30 ethyl,p-nitro gesubstitueerd phenyl, benzyl, phenethyl en 7 8 p-bromophenyl. De dihydroxy fosfaten (V, R =R =H) worden in base zouten omgezet door te reageren met de geschikte base, bijvoorbeeld natrium bicarbonaat, ammonium bicarbonaat of organische aminen. De zouten kunnen ook worden verkregen 35 door dihydroxy fosfaat te elueren door een kolom van uit-wisselingshars die het gewenste kation bevat.

Hoewel de onderhavige uitvinding gebruik .maakt van . 8801 934 -7- fosforigoxychloride halogeenfosfaat diesters, en hun respectievelijke zwavel analoga als het fosforylerings reagens, wordt opgemerkt dat ook andere fosforhoudende reagentia die in staat zijn om fenolen te fosforyleren, gebruikt kunnen 5 worden, en geschikte reaktiecondities en reaktiemedia kunnen in afhankelijkheid van het gekozen fosforyleringsmiddel worden ingesteld. Het overzichtsartikel, getiteld "Current Methods of Phosphorylation of Biological Molecules" (Synthesis 1977, 737-52) bevat verdere voorbeelden van fosforylerings-10 middelen en dient door verwijzing hierin opgenomen te worden geacht.

BIOLOGISCHE EIGENSCHAPPEN

Representatieve verbindingen volgens de onderhavige 15 uitvinding werden op hun werkzaamheid tegen tumoren onderzocht tegen transplanteerbare muize P388 leukemie. In alle experimenten werden CDF^ vrouwtjesmuizen gebruikt waarin een tumor inoculum van 10^ ascites cellen van P388 muize leukemie was geïmplanteerd. In experimenten met etoposide 4'-fosfaat, het 20 dinatriumzout daarvan, en etoposide 4'-thiofosfaat dinatrium zout, vonden zowel de tumorimplantering als de behandeling met geneesmiddel plaats via de intraveneuze route. In alle andere experimenten vonden de tumorimplantering en de behandeling met geneesmiddel plaats via de intraperitoneale route.

25 In alle gevallen werd echter de positieve controle, etoposide, intraperitoneaal toegediend. De experimenten duurden 28 tot 46 dagen, aan het eind van welke periode het aantal overlevende dieren werd opgetekend. De anti-tumor aktiviteit werd uitgedrukt als % T/C, hetwelk de verhouding van de middelbare 30 overlevingsduur (MST) van de met geneesmiddel behandelde groep tot de MST van de met zoutoplossing behandelde controlegroep is. Een verbinding met een %T/C waarde van 125 of groter wordt in het algemeen geacht een significante anti-tumor aktiviteit in de P388 test te bezitten. Tabel A geeft de 35 resultaten van de bovenstaand beschreven evaluatie; de maximum % T/C waarden en doses die dat effekt gaven, zijn . 8801934 -8- vermeld.

Tabel A. Antitumor Aktiviteit tegen muize P388 leukemie

Dosis1

Verbinding van (mg/kg/inj) Route MST(d) %T/C

INTRAVENEUS GEÏMPLANTEERDE TUMOR CELLEN

Voorbeeld 1 140 IV 29.0 363 (Etoposide) 50 IP 20.5 256

Voorbeeld 4 200 IP 18.0 225 (Etoposide 100 IP 21.5 269

Voorbeeld 8 125 IV 24.5 306 (Etoposide) 100 IP 29.5 369

INTRAPERITONEAAL GEÏMPLANTEERDE TUMOR CELLEN

Voorbeeld 2 240 IP 16.5 165 (Etoposide) 60 IP 25.0 250

Voorbeeld 3 200 IP 15.5 155 (Etoposide) 100 IP 27.0 270

Voorbeeld 7 240 IP 25.0 250 (Etoposide) 100 IP 26,0 260

Voorbeeld 9 150 IP 19.5 217 (Etoposide) 100 IP 24.0 267 .8801934

De geneesmiddelen werden toegediend op de dagen 5 sn 8, tenzij anders is aangegeven (dag 1 was de dag waarop de tumor werd geïmplanteerd).

-9-

Aangetoond werd dat de anti-tumor verbindingen volgens de onderhavige uitvinding aktief zijn tegen getransplanteerde tumoren in proefdieren. Vooral de verbinding met formule Vla ("etopofos") vertoonde een significant hogere anti-tumor 5aktiviteit dan etoposide in de P388 test. Dit selektieve middel vertegenwoordigt een goed in water oplosbare pro-drug van etoposide die in-vitro een verminderde anti-tumor aktiviteit bezit en door alkalisch fosfatase snel gesplitst wordt hetgeen leidt tot het vrijkomen van etoposide. Het etoposide 10 dat vrijkomt, vertoont dezelfde cytotoxiciteit als het moedergeneesmiddel.

De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor het remmen van tumoren bij zoogdieren, omvattende het toedienen van een effektieve tumor remmende dosis van 15 een anti-tumor verbinding met formule V of VII aan een tumor dragende gastheer. Hiertoe kan het geneesmiddel langs conventionele wegen worden toegediend, waaronder, zonder daartoe beperkt te zijn, de intraveneuze, intramusculaire, intra-tumorale, intraarteriële, intralymfatische en orale route.

20 Een verder aspekt van de onderhavige uitvinding ver schaft een pharmaceutisch preparaat dat een verbinding met formule V of VII alsmede een pharmaceutisch aanvaardbare drager omvat. Het anti-tumor preparaat kan elke voor de gewenste toedieningsroute geschikte pharmaceutische vorm 25 hebben. Voorbeelden van dergelijke preparaten omvatten vaste preparaten voor orale toediening zoals tabletten, capsules, pillen, poeders en granules, vloeibare preparaten voor orale toediening zoals oplossingen, suspensies, siropen of elixers en preparaten voor parenterale toediening zoals steriele 30 oplossingen, suspensies of emulsies. Ze kunnen ook worden gepresenteerd in de vorm van steriele vaste preparaten die in steriel water, fysiologische zoutoplossing of een willekeurig ander steriel injekteerbaar medium, onmiddellijk voorafgaande aan het gebruik, kunnen worden opgelost.

35 Optimale doseringen en toedieningsvoorschriften voor een bepaalde zoogdier gastheer kunnen gemakkelijk door de .8801934 -10- deskundigen worden vastgesteld. Uiteraard zal duidelijk zijn dat de feitelijke dosis zal kunnen variëren afhankelijk van de gekozen samenstelling, de gebruikte verbinding, de toe-dieningswijze en de plaats, gastheer en ziekte van de behan-5 deling. Veel faktoren die de werking van het geneesmiddel beïnvloeden zullen in aanmerking worden genomen, waaronder leeftijd, gewicht,sexe, dieet, toedieningstijdstip, toedie-nïngsroute, snelheid van uitscheiding, conditie van de patient, geneesmiddelcombinaties, reaktiegevoeligheden en 10 ernst van de ziekte.

De volgende voorbeelden dienen ter toelichting van de uitvinding en dienen niet te worden uitgelegd op een wijze waardoor ze de omvang van de uitvinding beperken.

In de volgende voorbeelden werden proton en koolstof 15 kernmagnetische resonantie (NMR) spectra (gebruikmakend van CDCl^ of D^O als interne referentie) en fosfor NMR spectra (gebruikmakend van 85% waterig H-^PO^ als externe referentie) opgetekend op een Bruker WM360 spectrometer. Infrarood spectra (IR) werden bepaald op een Perkin-Elmer 1800 Fourier Transform 20 Infrarood spectrofotometer. Wanneer sprake is van "Flash chromatography" wordt daarmee de methode bedoeld, die beschreven is door Still, W.C.; Kahn, M.; Mitra, A.; J. Org. Chem., 1978 43, 2923 en werd uitgevoerd met behulp van E.

Merck silica gel (230-400 mesh). Reverse fase chromatografie 25 werd uitgevoerd onder een positieve stikstofdruk onder toepassing van C18 (Octadecylsilaan) gebonden aan silica gel (40 - vim diameter, J.T. Baker).

Voorbeeld 1 30 Etoposide 4'-fosfaat dinatrium zout (verbinding Vla)

Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (2,30 gram, 3,91 mmol) in 210 ml droog acetonitrile werd opgewarmd om een nagenoeg volledige oplossing te bereiken. De oplossing liet men tot kamertemperatuur afkoelen, waarna N,N-diisopropylethylamine (2.36 ml, 13,5 mmol) werd toegevoegd.

.8801934 -11-

Het mengsel werd daarna tot o°C afgekoeld en POCl^ (666 mg, 4,34 mmol) werd in 30 seconden tijd via een naald toegevoegd. Men liet het mengsel langzaam in 2-3 uur tijd tot kamertemperatuur komen en roerde bij kamertemperatuur nog eens 5 63 uur door. Aan het eind van deze periode werd 20 volume % verwijderd en op de in voorbeeld 2 beschreven wijze met diethylamine behandeld. De rest werd behandeld met een oplossing van natrium bicarbonaat (6,0 g, 71.4 mmol) in 110 ml gedeioniseerd water, het mengsel werd gedurende 80 10 minuten bij kamertemperatuur geroerd, en vervolgens verdeeld met behulp van 20 ml verzadigde waterige natrium bicarbonaat, 125 ml gedeioniseerd water en 350 ml ethyl acetaat. De organische laag werd verder geëxtraheerd met 1 x 50 ml gedeioniseerd water en de gecombineerde waterlagen werden gewassen 15 met 250 ml ethyl acetaat en daarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan een vacuum van 0,5 mm onderworpen om opgeloste oplosmiddelen te verwijderen. Het waterhoudende gedeelte werd daarna op een 4 cm diameter kolom gebracht die 15 cm aan silica gel gebonden octadecylsilaan bevatte, dat gepakt was 20 in methanol en met water was geëquilibreerd. Nadat het totale waterhoudende gedeelte was aangebracht, werd de kolom met 175 ml water geëlueerd om anorganische zouten te verwijderen en daarna werd door 4:1 ^OsCH^OH het produkt geëlueerd. Concentratie van het oplosmiddel bij 0,5 torr gaf 744 mg 25 (36%) van de zuivere titelverbinding als kleurloze vaste stof. Anderzijds gaf lyofilizatie de zuivere titelverbinding als een zeer rulle vaste stof met gering soortelijk gewicht.

IR (KBr) 3426, 1775, 1593, 1505, 1486, 1337, 1239, 30 1191, 1122, 1078, 1034, 983, 927, 888, 876, 851, 840, 697, 684, 66, 547 cm-1.

360 MHz 1H NMR (D20) δ 6.93 (s,lH), 6.59 (s,lH), 6.27 (s,2H), 5.93 (d,2H), 5.09 (d,1H,J=2.8Hz), 4.83 35 (q,1H,J=5.0Hz), 4.68 (d,lH,J=7.9Hz), 4.62 (d,1H,J=5.7Hz), 4.47-4.35 (m,2H), 4.24 (dd,lH,J=4.4 en 10.4Hz), 3.64 (s,6H), 3.68-3.52 (m,3H), 3.44-3.30 (m,3H), 3.17-3.07 .8801934 -12- (m,lH), 1.31 (d,3H,j=5.0Hz).

90 MHz 13C NMR (D20) δ 178.5, 151.8, 148.1, 146.1, 135.0, 132.6, 130.9, 127.4, 109.9, 109.5, 107.4, 101.3, 100.4, 99.6, 79.2, 73.7, 72.7, 72.2, 69.1, 65.4, 55.6, 5 42.8, 40.3, 37.5, 18.8.

31 146MHz P NMR (D20) 6 3.79

Massa spectrum (FAB), m/e, 713 (M+ + H). C29H3iNa2°16P ^ vereist M+, 712.

Anal, berekend voor C29H3iNa2°i6P: C,48.89; H,4.39;

Na,6.45 * gevonden : C,48.72; H,4.56; 15 Na, 6.56 *

Bijgesteld voor 8.16% H20, bepaald door Karl Fischer analyse.

20 Voorbeeld 2

Etoposide 4'-(Bis-[N,N-diethylj fosfonamide) (formule VII, X=0, R1=methyl, R6=H, Y=N(Et)2> R2=R3=Et)

Zoals aangegeven in voorbeeld 1, werd 20 volume 25 % van het reaktie produkt mengsel van etoposide en POCl^ toegevoegd aan 4ml diethylamine en gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het oplosmiddel werd onder verminderde druk afgedampt en het licht oranje kleurige residu werd door flash chromatografie op silica gel gezuiverd. Elutie met 4% 30 methanol in methyleen chloride gaf 271,3 mg (46.9%) van de zuivere titelverbinding als een licht gele vaste stof.

IR (KBr) 3408, 2974, 2936, 2877, 1774, 1598, 1508, 1486, 1467, 1421, 1383, 1339, 1234, 1191, 1162, 1130, 1098, 1079, 1037, 902, 858, 795, 713, 700, 544 cm"1.

35 360 MHz 1H NMR (CDC13) 6 6.79, (s,lH), 6.50 (s,lH), 6.20 <s,2H), 5.96 (ABq,2H), 4.87 (d,lH,J=3.2Hz), 4.71 .8801934 -13- (q,lH,J-5.lHz), 4.61 (d,lH,J=7.6Hz) , 4.57 (d, 1H, J=5.2Hz), 4.39 (dd,lH,J=9.1 en 10.2Hz), 4.22-4.13 (m,2H), 3.74 (ill, 1H), 3.65 (s,6H), 3.55 (m,lH), 3.40 (m,lH), 3.32-3.10 (m,llH), 2.94-2.83 (m,lH), 1.37 (d,3H,J=5.1Hz), 1.10 5 (m,12H).

146 MHz 31P NMR (CDC13) δ 16.49.

Massa spectrum (FAB), m/e, 779 (M+ + H), 573 (M+ -suiker). C37H5iN2°i4P vereist M+, 778./

Voorbeeld 3

Etoposide 4'-(Ν,Ν-[2-οίι1θΓθβίίινΐ3£θ5:ίθΓν·1 chloride) (Formule VII, R1= methyl, R6=H, X=Q, Y=C1, R2=R3=CH2CH2&) 15 Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (2,00g, 3.40 mmol) in 220 ml droge acetonitrile werd opgewarmd om een nagenoeg volledige oplossing te bereiken. Het mengsel werd tot kamertemperatuur afgekoeld en behandeld met N,N-diisopropylethylamine (2,05 ml, 11,8 mmol). Het mengsel 20 werd daarna tot 0°C afgekoeld onder N2 en fosforig oxychloride (624 mg, 4,07 mmol) werd in 30 seconden via een naald toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2,5 uur bij 0°C magnetisch geroerd en daarna gedurende nog eens 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna werd snel bis-(2-chlorethyl-25 amine) hydrochloride (1,82 g, 10,2 mmol) toegevoegd, onmiddellijk gevolgd door nog een 2,10 ml, 12,0 mmol Ν,Ν-diisopropylethylamine. Het mengsel werd gedurende 85 minuten bij kamertemperatuur geroerd, onder verminderde druk tot een volume van ongeveer 5 ml geconcentreerd, en 30 opgelost in 400 ml ethyl acetaat en 5 ml methanol. De verkregen oplossing werd gewassen met 2 x 200 ml pH5 buffer, 150 ml water, en 150 ml zoutoplossing Na2SO^/MgSC>4 gedroogd. Afdampen van het oplosmiddel gaf een geel oranje kleurige vaste stof die door flashchromatografie over silica gel 35 met 3-4% methanol in methyleenchloride werd gezuiverd, waarbij 1,25 g (45.4%) van de zuivere titelverbinding als .8801934 .-14- een kleurloze vaste stof werd verkregen.

360MHz 1H NMR (CDC13) <5 6.82 (s,lH), 6.52 (s,lH), 6.27 (s,2H), 5.99 (d,2H), 4.90 (d,lH,J=3.4Hz), 4.73 (q,lH,J=5.0Hz), 4.65-4.60 (m,2H), 4.41 (m,lH), 4.25-4.15 5 (m,2H), 3.75-3.65 (m,5H), 3.72 (s,6H), 3.60-3.23 (m,9H), 2.91-2.80 (m,1H), 1.38 (d,3H,J=5.0Hz).

146 MHz 31P NMR (CDC13) δ 11.16 en 10.96 (twee pieken als gevolg van een chiraal fosforatoom).

10

Massa spectrum (FAB), m/e, 812, 810, 808. C33H3gCl3N014P vereist M+ (35C1) 809.

Voorbeeld 4 15 Etoposide 41-Thiofosfaat dinatriumzout (formule VIb)

Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (2,04 g, 3.47 mmol) in 175 ml droge acetonitrile werd opgewarmd waarbij een nagenoeg volledige oplossing werd 20 verkregen. Men liet de oplossing tot kamertemperatuur afkoelen en voegde vervolgens aan de oplossing N,N-diiso-propylethylamine (2,00 ml, 11,5 mmol) toe. Het mengsel werd daarna tot 0°C afgekoeld en thiofosforyl chloride (0,720 g, 4.17 mmol) werd in een periode van 30 seconden 25 via een naald toegevoegd. Het mengsel liet men langzaam in 2-3 uur tot kamertemperatuur oproeren en gedurende 16 uur werd bij kamertemperatuur doorgeroerd. Het mengsel werd daarna tot 30-35°C opgewarmd en nog eens 4 uur op die temperatuur gehouden. Met dunne laag chromatografie 30 (5% CH30H in C^C^) werd een grote nieuwe vlek met een hoger Rf dan etoposide waargenomen. Het reaktiemengsel werd met 7,4 g vast natriumbicarbonaat behandeld en daarna werd 100 ml gedeioniseerd water toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 1,5 uur bij 28-25°C en gedurende 1,5 uur bij 35 kamertemperatuur geroerd. Het mengsel werd over 200 ml gedeioniseerd water, 30 ml verzadigde waterige .natrium- .8801934 -15- bicarbonaat en 300 ml ethyl acetaat verdeeld. Verdere opwerking en reverse fase chromatografie werden uitgevoerd volgens de in voorbeeld 1 beschreven procedure, waarbij 1,03 g (40,8%) van de zuivere titelverbinding als een 5 kleurloze vaste stof werd verkregen.

360 MHz 1H NMR (D20) 5 6.93 (s,lH), 6.60 (s,lH), 6.27 (s,2H), 5.93 (d,2H), 5.09 (d,lH,J=2.8Hz), 4.83 (q,1H,J=5.0Hz), 4.68 (d,lH,J=7.8Hz), 4.63 (d,lH,J=5.7Hz), 10 4.47-4.35 (m,2H), 4.24 (dd,lH,J=4.3 en 10.5Hz), 3.64 (s,6H), 3.67-3.52 (m,3Hj, 3.47-3.29 (m,3H), 3.17-3.07 (m,lH), 1.31 (d,3H,J=5.OHz).

Massa spectrum (FAB), m/e 728 (M+), 706 (M+ + H - Na). 15 C29H3iNa2°i5PS vereist M+, 728.

Voorbeeld 5

Etoposide 4'-[[N,N-bis(2-chloroethyl)amino]-[N-(3-hydroxypropyl)amino]jfosfaat (formule VII, X=0, R^methyl,

β O

20 R -Hr R =R =2-chloroethyl, Y=-NH (CH„) _,OH

' Z D

Een magnetisch geroerde oplossing van de verbinding volgens voorbeeld 3 (280 mg, 0,346 mmol) in 3 ml CH2C12 werd behandeld met een oplossing van 3-amino-l-propanol 25 (33,5 mg, 0,446 mmol) in 1 ml CH0C1-. Na 5 minuten werd nog Δ L· eens 31,0 mg, 0,413 mmol 3-amino-l-propanol in 0,5 ml absolute methanol toegevoegd. Het reaktiemengsel werd gezuiverd door het direkt aan te brengen op 4 preparatieve TLC platen (1 mm, E. Merck silica gel) die met 5-8% CH^OH 30 in CH2C12 werden ontwikkeld. Elutie van de gewenste produkt band onder toepassing van 5% CH^OH in ethyl acetaat, gevolgd door indampen onder verminderde druk en daarna verder drogen bij 0,1 torr gaf 185 mg (63%) van de zuivere titel-verbinding als een kleurloze vaste stof (mengsel van dia-35 stereomeren op het fosforatoom).

.8801934 -16- 360 MHz 1H NMR (CDCLj) 6 7.20 (br s, 1H), 6.80 (s,lH), 6.50 en 6.48 (2s, 1H), 6.26 en 6.25 (2s, 2H), 5.97 (d, 2H), 4.88 (m, 1H), 4.73 (q, 1H), 4.64-4.57 (mf 2H), 4.40 .(m, 1H), 4.21-4.13 (m, 2H), 3.71, 3.70 (2s, 6H)f 3.71-3.06 (m, 18H), 5 2.90-2.80 (m, 1H), 1.37 (d, 3H).

Massa Spectrum (FAB), m/e, 849, 851 (M+ + H, 33C1, 37C1). ClcH. CLN O, P vereist M+ 848 (35C1) en 850 (37C1).

36 47 2 2 15 10 Voorbeeld 6 Etoposide 41-[[N/N-bis(2-chloroethyl) amino]—[N—[2-[(3-nitro-pyridyl-2--yl)disulfide]ethyl]3amino]fosfaat (formule VII X=0, R^= methyl, R6=H, R2=R3=2-chloroethyl, Y=NH(CH2)2~SS-15 (3-nitropyridyl-2-yl).

Een mengsel van de verbinding volgens voorbeeld 3 (248 mg, 0,306 mmol) and 2-(3-nitropyridyl)-l-(2-aminoethyl) disulfide hydrochloride(105 mg, 0,393 mmol) werd behandeld 20 met 7 ml C^C^, gevolgd door de toevoeging van diisopropylethylamine (100 μΐ, 0,570 mmol) en 0,5 ml droge methanol. De verkregen oplossing werd gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd en daarna gezuiverd door hem direkt aan te brengen of 4 preparatieve TLC platen (1 mm, 25 E. Merck silica gel) die ontwikkeld werden met behulp van 4-5% CH^OH in ethyl acetaat. Elutie van de gewenste produkt band met behulp van 5% CH30H in ethyl acetaat, gevolgd door onder verminderde druk afdampen en daarna verder drogen bij 0,1 torr, gaf 321,7 mg (75,3%) van de zuivere titel verbinding 30 als een geel bruine vaste stof (mengsel van diastereomeren op het fosforatoom).

IR(KBr), 1774, 1598, 1584, 1559, 1509, 1486, 1456, 1421, 1397, 1342, 1236, 1160, 1128, 1096, 1038, 1004, 926, 35 857, 747, 699 cm"1.

.8801934 -17- 360 MHz λΗ NMR (CDC13) δ 8.81 en 8.77 (2m, 1H), 8.48 (mf 1H), 7.33 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.51 en 6.50 (2s, 1H), 6.26 (br s, 2H), 5.97 (d, 2H), 4.89 (m, 1H) 4.73 (q, 1H), 4.65-4.52 (m, 3H), 4.41 (m, 1H), 4.24-4.14 (m, 2H), 3.71, 5 3.70 (2s, 6H), 3.71-2.85 (m, 19H), 2.68 (br s, 1H, OH), 2.37 (br s, 1H, OH), 1.37 (d, 3H).

Massa Spectrum (FAB), m/e, 1005, 1007 (M+ + H, 3^C1, 37C1). C.nH._ClnN.O., vereist M+, 1004 (35C1) en 1006 4U 4/ 2 4 10 2 ( 'cd.

10

Voorbeeld 7 Etoposide 4'-difenyl fosfaat (R^=CH^, R^=H, R7=R8=fenyl) ·*·** Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (10,50 g, 17,84 mmol, gedroogd boven Ρ20^ kij 80°C/0,5 torr) in 450 ml droge acetonitrile werd behandeld met diisopropyl-ethylamine (4,20 ml, 24,1 mmol) en daarna werd als zodanig via een naald difenyl chlorofosfaat (c,00 ml, 9,65 mmol)

20 toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2 uur bij 50°C

onder N2 geroerd, na welke tijd alle etoposide was .opgelost. Men voegde nog eens difenyl chlorofosfaat (1,80 ml, 8,86 mmol) toe en hield het reaktie mengsel gedurende 72 uur op 45°C. Nadat meer van de amine base (0,75 ml, 4,3 mmol) en 25 het difenyl chlorofosfaat (0,80 ml, 3,86 mmol) waren toegevoegd, werd het mengsel gedurende 27 uur op 40-45°C geroerd, behandeld met meer difeny chlorofosfaat (0,40 ml, 1.93 mmol) en gedurende 22 uur op 40-45°C gehouden. Daarna werd 20 ml isopropanol toegevoegd, werd het oplosmiddel 30 onder verminderde druk afgedampt, en werd het vaste residu opgelost in 500 ml C^C^, en wet 400 ml H2Ö verdeeld. De waterlaag werd verder geëxtraheerd met 100 ml CH2C12 en de gecombineerde organische extracten werden gewassen met 250 ml zoutoplossing en gedroogd boven Na^O^/MgSO^. Rotatie 35 verdamping, gevolgd door flash chromatografie over silica gel met behulp van 2-3% CH3OH in CH2C12, gaf 12,50 g (85%) > 8801 934 -18- van de zuivere titel verbinding als een kleurloze vaste stof.

FAB MS m/e (relatieve intensiteit 820 (M+H)+.

IR (KBr) 3460, 2925, 1775, 1601, 1490 cm"1.

5 1H NMR (CDC13) δ 7.28 (m,8H), 7.15 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.95 (m, 2H), 4.85 (d,J=35Hz,lH), 4.71 (m,lH), 4.60 (d,J=7.6Hz,1H), 4.56 (d,J=5.1Hz,lH), 4.38 (m, 1H), 4.22-4.13 (m, 2H), 3.72-3.60 (m, 1H), 3.48 (s, 6H), 3.54-3.28 (m, 3H), 3.23 (dd, J=14.2,5.3Hz,1H), 2.78 m,lH), 10 1.35 (d,J=5.1Hz,3H).

Anal, berekend voor C,60.000; H/5.04.

Gevonden: C,60.20; H,5.16.

Voorbeeld 8

Etoposide 4'-fosfaat (formule V; R1=CH3; R^=H, R^=R8=H) 15 Platina oxyde (0,198 g, 0,87 mmol) uit een vers geopende fles (Aldrich Chemical Co.) werd toegevoegd aan een oplossing van etoposide 4'-difenyl fosfaat (produkt van bijvoorbeeld 7; 0,79 g, 0,962 mmol) in 95 ml absolute ethanol. De oplossing werd op een Parr apparaat gehydrogeneerd 20 gedurende 4 uren bij kamertemperatuur onder een druk van 45-50 psi (310-345 kPa). Het reaktiemengsel werd gefiltreerd door een kussen van celite onder toepassing van ethanol als eluens. Concentreren onder verminderde druk en drogen boven P2^5 9e^uren<^e 14 uur onder verminderde druk leverde het 25 gewenste produkt op in de vorm van een witte vaste stof (0,627 g, 94%).

FAB MS m/e (relatieve intensiteit) 669 (M+H)+ 30 IR (KBr) 3440, 2930, 1778, 1604, 1498 cm"1.

1H NMR (DMSO-d,) δ 6.93 (s,lH), 6.46 (s,lH), 6.12 6 (s,2H), 5.94 (m,2H), 5.17 (bs,lH), 4.86 (d,J=3.93Hz,1H), .8801934 -19- 4.64 (q,J=7.5,5.8Hz,lH), 4.51-4.42 (m,2H), 4.20 (d,J=10.7Hz,lH), 4.01 (dd,J=12.1,5.3Hz,lH), 3.51 (s,6H), 3.51-2.75 (m,7H), 2.83 (m,lH), 1.16 (d,J=5.1Hz,3H).

5 13C NMR (DMSO-d,.) δ 174.5, 151.1, 147.7, 146.2, 6 126.1, 132.3, 128.8, 109.7, 107.9, 101.5, 101.2, 98.5,. 80.0, 74.3, 72.7, 71.7, 67.6, 67.2, 65.7, 55.8, 43.0, 37.1, 20.2, 18.5.

10 Anal, berekend voor C29H33°i6P* c'5^.95; H, 5.11. Gevonden: C,51.42; H,4.97.

Voorbeeld 9

Etoposide 4l-bis(2,2,2,-trichlorethyl)fosfaat (formule VIII? r6=ch3, r^h, r7=r8=ch2cci3) 15 De in voorbeeld 7 beschreven procedure werd herhaald onder toepassing van bis(2,2,2-trichlorethyl) chlorofosfaat, waarbij de titel verbinding in een opbrengst van 100% werd verkregen in de vorm van een kleurloze vaste stof na flash chromatografie over silica gel.

20 IR (KBr) 1780, 1610, 1490, 1415, 1345, 1240, 1040, 960, 725 cm"1.

300 MHZ 1H NMR (CDCl3) δ 6.81 (s,lH), 6,49 (s,lH), 6.27 25 (s, 2H), 5.98 (dd,2H), 4.88 (d,lH,J=3.4Hz), 4.82-4.70 (m,5H), 4.64 (d,1H,J=7.6Hz), 4.61 (d,1H,J=5.3Hz), 4.41 (dd,lH), 4.25-4.13 (m,2H), 3.75 (m,lH), 3.73 (s,6H), 3.56 (m,lH), 3.43 (dd,1H), 3.34-3.24 (m,3H), 2.91-2.82 (m,lH), 1.38 (d,3H, J=4.9Hz).

30 .

Massa spectrum (FAB), m/e = 928.9848 (Μ +H).

C^-H-.Cl^O^P vereist 928.9872.

33 36 6 16 .8801934 -20-

Voorbeeld 10

Etoposide 4'-fosfaat dinatrium zout uit etoposide 41-fosfaat

Methode A

5 In de handel verkrijgbare Dowex 50 x 8-100 cationen uitwisselingshars in de waterstofvorm (20 g, Aldrich Chemical Co.) werd behandeld met overmaat van IN NaOH. De verkregen hars m de Na vorm werd gepakt xn een kolom van 2 cm en geëguilibreerd met water. Etoposide 4'-fosfaat (produkt van 10 voorbeeld 8, 1,25 g, 1,87 mmol) opgelost in 25 ml gedeioniseerd water, werd bovenop de kolom de gepakte kolom aangebracht en de kolom werd geëlueerd met water. Frakties die de titelverbinding bevatten werden samengevoegd, gefiltreerd, en gelyofiliseerd. Met verkreeg 1,15 g van de 15 titelverbinding als een wit en rul materiaal.

Methode B

Aan 2,90 g, 4.34 mmol van ruw etoposide 4'-fosfaat (produkt van voorbeeld 8) werd 50 ml gedeioniseerd water en 3,00 g, 35,7 mmol natrium bicarbonaat toegevoegd. Het 20 mengsel werd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd gedurende welke tijd de CC^ ontwikkeling ophield.

Het mengsel werd daarna op de in voorbeeld 1 beschreven wijze chromatografisch behandeld. Elutie met gedeioniseerd water (300 ml) en daarna 4:1 H20/CH3OH gaf 1,90 g (61%) 25 van de zuivere titelverbinding als een rulle witte vaste stof na lyofilisatie.

Voorbeeld 11

De algemene procedure die in voorbeeld 2 is beschreven werd herhaald met deze uitzondering dat het daar gebruikte 30 diethylamine vervangen werd door de onderstaand vermelde aminen, waarbij de overeenkomstige etoposide 4,-fosforo-diamidaten werden verkregen.

.8801934 η -21-

Amine Formule VII (X=0, 1 6 2 3 R =methyl, R =H, Y=NR R ) 2 3 R_ R_ propylamine H Cï^CE^CI^

5 ethanolamine H C^C^OH

methoxyethylamine Η ei^d^OCH-j N-acetylethyleendiamine H CI^CHNCtOCH^ 2-methylallylamine H CH2CH(CH3)=CH2

allylamine H CH2CH=CH

10 dimethylaminopropylamine H (CH2)N(CH3)2 N-methylethyleendiamine H CI^CE^NCi^ trif luoroethylamine H d^CF.^

2-aminoethaanthiol H CI^Ci^SH

cyclohexylamine H cyclohexyl 15 2-amino-l-methoxypropaan H CHiCH^C^OCI^ 2- (ethylthio) -ethylamine H d^CI^SC^CH.^ chloroethylamine H CI^Cï^Cl

4-aminocyclohexanol H

ethylmethylamine CH3 CK^CH.^ 20 ethylbutylamine CH2CH3 (CH2)3CH3

methylaminoethanol CH3 Cï^CË^OH

bis (2-chloroethyl) amine CI^CI^Cl CI^CI^Cl

2- propylaminoethanol CH2CH2CH3 CH2CH2OH

3- methylaminopropionitrile CH_ CHoCH^CN

2Ó 3= z 25 piperidine R +R -(CH2)5“

Voorbeeld 12

De algemene procedure die in voorbeeld 3 is beschreven, werd herhaald met deze uitzondering dat het daar gebruikte 30 bis (2-chloroethyl) amine vervangen werd door de onderstaand vermelde aminen, waarbij de overeenkomstige etoposide chloroforoamidaten werden verkregen.

.8801934 -22-

Amine Formule VII (X=0, R^=methyl, R6=H, Y=C1) 2 3 R_ R_ propylamine H CE^CE^CE^

5 ethanolamine H c^CI^OH

methoxyethylamine H CH^CI^OCH^ N-acetylethyleendiamine H C^CHNCÏOJCH^ 2-methylallylamine H CH2CH(CH3)=CH2 allylamine H CE^CE=CE^ 10 dimethylaminopropylamine H (CI^NtCH.^^ N-methylethyleendiamine H C^CI^NCH^

Trif luoroethylamine H CI^CF^

2-aminoethaanthiol H CH2CH2SH

cyclohexylamine H cyclohexyl 15 2-amino-l-methoxypropaan H CH(CH3Jd^OCH^ 2-(ethylthio)-ethylamine H C^O^Sd^CH^ chloroethylamine H Cl^d^Cl 4-aminocyclohexanol Η 4-OH cyclohexyl ethylmethylamine CH^ CH^CH^ 2 0 ethylbutylamine C^CH^ (CH2) 3^3 -

methylaminoethanol CH^ d^CI^OH

diethylamine CE^CH^ CI^CH^

2- propylaminoethanol C^CI^CH^ d^CI^OH

3- methylaminoproionitrile CH^ CI^CE^CN

25 piperidine R^+R^= -(CHj)^-

Voorbeeld 13

De algemene procedure die in voorbeeld 5 is beschreven, werd herhaald met deze uitzondering dat het daar gebruikte 3-aminopropanol werd vervangen door de volgende aminen, 30 waarbij de overeenkomstige niet-symmetrische etoposiden fosforodiamidaten werden verkregen.

l .8801934 -23-

Amine Formule VII (X=0, R^methyl, r6=h, y=nr4r&, r2=r3=ch2ch2cd 4 5 R_ R_ propylamine H CH2CH2CH3

5 ethanolamine H CH^CH^OH

methoxyethylamine H CH2CH2OCH3 N-acetylethyleendiamine H CH2CHNC(0)CH3 2-methylallylamine H CH2CH(CH3)=CH2 allylamine H CH2CH=CH2 10 dimethylaminopropylamine H (CH2)N(CH3)2 N-methylethyleeendiamine H CH2CH2NCH3 trifluoroethyamine H CH2CF3

2-aminoethaanthiol H CH2CH2SH

eyelohexylamine H cyclohexyl 15 2-amino-l-methoxypropaan H (CH(CH3)CH2OCH3 2-(ethylthio)-ethylamine H CH^CH^CH^CH^

chloroethylamine H CH2CH2CL

4-aminocyclohexanol Η 4-OH cyclohexyl ethylmethylamine CH3 CH2CH3 20 ethylbutylamine CH2CH3 (CH2)3CH3

methylaminoethanol CH3 CH2CH2OH

bis(2-chloroethyl)amine CH2CH2C1 CH2CH2C1

2- propylamineoethanol CH2CH2OH

3- methylaminopropionitrile CH3 CH2CH2CN

25 piperidine R2+R3= -(CH2)5“

Voorbeeld 14

De algemene procedure die in voorbeeld 7 is beschreven, werd herhaald met deze uitzondering dat het daar gebruikte difenyl chlorofosfaat vervangen werd door de onderstaand 30 vermelde chlorofosfaten waarbij de overeenkomstige etoposide 4’-fosfaat diesters werden verkregen.

.8801934 -24- 16 7 8 (X=0, R =methyl, R =H, R =R =R onderstaand vermeld.

chlorofosfaten [(R0)^P(0)C1] R = methyl ethyl 5 benzyl p-nitrobenzyl p-nitrofenyl p-bromobenzyl p-nitrofenethyl 10 cyanoethyl o-(t-butyl)fenyl

Voorbeeld 15

De algemene procedures, beschreven in de voorbeelden 15 1 tot 16, werden herhaald met deze uitzondering dat de daarin gebruikte etoposide uitgangsmaterialen vervangen werden door de overeenkomstige teniposide verbindingen waarbij de overeenkomstige teniposide produkten werden verkregen.

.8801934

Claims

1. Verbinding met formule V waarin

2. Verbinding volgens conclusie 1 met formule V, waarin

3. Verbinding volgens conclusie 1, waarin R waterstof is en R·*" methyl of 2-thienyl. g

4. NR R . 2 3 4

4. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R waterstof is en R1 methyl of 2-thienyl. 6

5. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R waterstof is en R·*· methyl.

6. Verbinding volgens conclusie 5, waarin X zuurstof voorstelt.

6. R staat voor waterstof en R gekozen wordt uit de groep bestaande uit (C^_^q)alkyl; (C2_^q)alkenyl; 5 (C5_g)cycloalkyl; 2-furyl; 2-thienyl; (Cg_1Q)aryl; (C?_14)aralkyl; en {Cg_14)aralkenyl waarin elk van de aromatische ringen niet gesubstitueerd of gesubstitueerd kan zijn door een of meerdere groepen gekozen uit halogeen, (C, _)alkyl, (C, O)alkoxy, hydroxy, nitro, en g X o 16 10 amino; of R en R elk (C^_g)alkyl zijn; of R en R en het koolstofatoom waaraan ze gebonden zijn, tezamen een (C^_g) cycloalkyl groep vormen; X zuurstof of zwavel is; 7 8 R en R onafhankelijk van elkaar gekozen worden uit de 15 groep bestaande uit Η, (C^_5) alkyl, door A gesubstitu eerd (C, _)alkyl, (C^ -)cycloalkyl,door A gesubstitu-±~D d~0 eerd (C3_6)cycloalkyl, (C6_1Q)aryl, door A gesubstitueerd aryl, door alkyl gesubstitueerd aryl, (0?_14> aralkyl, door A gesubstitueerd aralkyl, en door alkyl 20 gesubstitueerd aralkyl; waarin de substituenten A één of meerdere groepen zijn, gekozen uit hydroxy, alkoxy, alkanoyloxy, cyano, amino, alkylamino, dialkylamino, carboxy, alkylthio, mercapto, mercaptothio, nitro-pyridyl disulfide, alkanoylamino, alkanoyl, carbamoyl, 25 nitro, en halogeen; of een pharmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

7. Verbinding volgens claim 5, waarin X zwavel voorstelt.

7. X 6 R en R beide waterstof voorstellen en Rx, R° en X de eerder vermelde betekenissen hebben; of een 30 pharmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan. .8801934 *) -26- g

8. Verbinding volgens conclusie 1, waarin het pharmaceutisch aanvaardbare zout het natrium zout is.

9. Verbinding etoposide 4'-fosfaat dinatrium zout met de formule Via.

10. Verbinding etoposide 41-thiofosfaat dinatrium zout met 15 formule VIb. 7

11. Verbinding volgens conclusie 1, waarin R gekozen wordt uit de groep bestaande uit (C^_5) alkyl; door A gesubstitueerd (C1_5)alkyl; (C3_6)cycloalkyl; door A gesubstitueerd (C3_g)cycloalkyl; (C6_^Q)aryl; door A ge- 20 substitueerd aryl; door alkyl gesubstitueerd aryl; (C^_^)aralkyl; door A gesubstitueerd aralkyl; en door alkyl gesubstitueerd aralkyl en R^ staat voor waterstof 7 of een groep binnen de definitie R ; waarin de substitu-enten A zoals eerder gedefinieerd; of een pharmaceutisch 25 aanvaardbaar zout daarvan. g

12. Verbinding volgens conclusie 11, waarin R waterstof is en R·*· methyl of 2-thienyl is. .8801934 -27- 7 8

13. Verbinding volgens conclusie 12 waarin R en R onafhankelijk van elkaar gekozen worden uit (C^_j.) alkyl; door halogeen gesubstitueerd (C^j.)alkyl; door cyano gesubstitueerd (C^_j.) alkyl; (Cg_^g)aryl; en (c7_14) aralkyl; waarin het ring gedeelte van de aryl- en 5 arylalkylgroepen desgewenst gesubstitueerd is door een groep gekozen uit alkyl, halogeen en nitro.

14. Verbinding volgens conclusie 13, waarin R1 methyl is.

15. Verbinding volgens conclusie 14, waarin X zuurstof is. 7 8

16. Verbinding volgens conclusie 15, waarin R en R elk fenyl voorstellen. 7 8

17. Verbinding volgens conclusie 15, waarin R en R elk 2,2,2-trichloroethyl voorstellen. 1 6

18. Verbinding met formule VII waarin R , R en X de eerder 15 vermelde betekenissen hebben; Y staat voor Cl, OH of 4 5 2 3 4 5 NR R ; R , R , R , en R elk onafhankelijk van elkaar gekozen worden uit de groep bestaande uit H, (C^_j.) alkyl, (C2_5)alkenyl, (C3_g) cycloalkyl, door A gesubstitueerd (C^_j_)alkyl, door A gesubstitueerd (C2_3) 20 alkenyl, door A gesubstitueerd (C-_,) cycloalkyl; of 2 3 ó ö R , R , en het stikstofatoom waaraan ze gebonden zijn, 4 5 tezamen een 3 tot 6 ring voorstellen; of R , R , en het stikstofatoom waaraan ze gebonden zijn, tezamen een 3- tot 6 ring vormen; waarbij de substituenten A zoals 25 eerder gedefinieerd zijn; of een pharmaceutisch aan vaardbaar zout daarvan.

19. Verbinding volgens conclusie 18, waarin R^ waterstof is; 1 4 5 R methyl of 2-thienyl is; Y staat voor Cl of NR R ; 2 3 4 5 X staat voor zuurstof of zwavel; en R , R , R en R 30 onafhankelijk gekozen worden uit de groep bestaande uit „8801934 7 · -28- H, (C. _)alkyl, door halogeen gesubstitueerd (Cn _) alkyl, door hydroxy gesubstitueerd (C^,.)alkyl, en door nitropyridyl disulfide gesubstitueerd )alkyl.

20. Verbinding volgens conclusie 19, waarin X zuurstof is.

21. Verbinding volgens conclusie 20, waarin methyl is. . . 2 3

22. Verbinding volgens conclusie 21, waarin R en R elk 2-chloroethyl voorstellen; en Y Cl is.

23. Verbinding volgens conclusie 21, waarin Y staat voor

24. Verbinding volgens conclusie 23, waarin R , R , R en 5 R elk ethyl voorstellen. 2 3

25. Verbinding volgens conclusie 23, waarin R en R elk 4 5 2-chloroethyl zijn; R waterstof is; en R 3-hydroxy-propyl is. 2 3

26. Verbinding volgens conclusie 23, waarin R en R elk 4 5 2-chloroethyl voorstellen; R waterstof is; en R staat voor de groep met formule XI.

27. Tussenprodukt met formule VIII, waarin r\ R^ en X de eerder vermelde betekenissen hebben. 6

28. Verbinding volgens conclusie 27, waarin R waterstof is; R^ methyl is; en X zuurstof is. 6

29. Verbinding volgens conclusie 27, waarin R waterstof is; R1 methyl is; en X zwavel is.

30. Een pharmaceutisch preparaat omvattende een antitumor .8801934 f -29- effektieve hoeveelheid van de verbinding volgens conclusie 1 of conclusie 18, en een pharmaceutisch aanvaardbare drager.

31. Een preparaat volgens conclusie 30, waarin de verbinding 5 etoposide 4'-fosfaat dinatrium zout is.

32. Werkwijze voor het remmen van een zoogdier tumor, omvattende de toediening aan een tumor dragende gastheer van effektieve antitumor hoeveelheid van een verbinding volgens conclusie 1 of conclusie 18.

33. Werkwijze volgens conclusie 32, waarin de verbinding etoposide 4'-fosfaat dinatrium zout is.

34. Werkwijze voor het bereiden van een verbinding met de 7 8 1 formule V, waarin R en R waterstof voorstellen en R , g R en X de eerder vermelde betekenissen hebben, of een 15 pharmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, waarbij (a) een verbinding met formule IX wordt omgezet in een 1 6 verbinding met formule X, waarin R , R en X de eerder vermelde betekenissen hebben, en G een fosfaat beschermende groep is; 20 (b) de fosfaat beschermende groep wordt verwijderd; en (c) desgewenst het produkt van stap (b) wordt omgezet in een pharmaceutisch aanvaardbaar zout.

35. Werkwijze volgens conclusie 34, waarbij de omzettings-stap een reaktie omvat van een verbinding met formule

25 IX met een verbinding met formule Hal-P(X)(0-G)2, waarin Hal een halogeen is, en X en G de eerder vermelde betekenissen hebben, in acetonitrile of (C2_^)CN, en in tegenwoordigheid van een trialkylamine. .8801934