NL192683C

NL192683C - "4"-Demethyl-epipodophyllotoxineglucoside verbinding alsmede farmaceutisch preparaat met antitumor activiteit

Info

Publication number: NL192683C
Application number: NL8801934A
Authority: NL
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 1987-08-04
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1997-12-02
Also published as: ES2010775A6; SE502214C2; CN1027169C; YU10490A; GB8818462D0; MX9202851A; CZ541288A3; NL970042I1; NO172440B; DE3826562A1; SE8802815D0; CN1061225A; NL192683B; NO172440C; US5041424A; NO920277L; FI87790C; NO1998002I1; NZ225615A; YU143688A

Description

1 192683 4’-Demethyl-epipodophyllotoxineglucoside verbinding, alsmede farmaceutisch preparaat met antitumor activiteit

De uitvinding heeft betrekking op een 4'-dimethyl-epipodophyllotoxineglucoside-verbinding, met antitumor 5 activiteit.

Dergelijke verbindingen zijn bekend uit het Amerikaanse octrooischrift 3.524.844, In deze op 18 augustus 1970 verschenen publicatie worden onder meer etoposide (formule I op het formuleblad) en teniposide (formule II op het formuleblad) beschreven. Beide verbindingen zijn afgeleid van het in de natuur voorkomende podophyllotoxine (formule III op het formuleblad). De klasse waartoe etoposide en teniposide 10 behoren, wordt vaak aangeduid als 4'-demethyl-epipodophyllotoxineglucosiden.

Zowel etoposide als teniposide is klinisch bruikbaar als middel tegen verschillende vormen van kanker, waaronder testikelkanker, kleincellige longkanker, eierstokkanker, borstkanker, schildklierkanker, blaaskanker, hersenkanker, niet-lymfocytische leukemie en de ziekte van Hodgkin. Een nadeel van deze bekende stoffen is echter dat ze slecht oplosbaar zijn in water, zodat ze door intraveneuze infusie tezamen met een 15 grote hoeveelheid fysiologisch zout moeten worden toegediend, hetgeen enkele uren vergt, gewoonlijk in een ziekenhuis moet geschieden en zeer kostbaar is.

Het doel van de uitvinding is het verschaffen van een verbinding, die een hoge oplosbaarheid in water bezit en een tumor-onderdrukkende werkzaamheid heeft die vergelijkbaar is aan die van etoposide en teniposide. Gevonden werd, dat bepaalde, hierna te omschreven 4'-demethyl-epipodophyllotoxineglucoside 20 verbindingen de hiertoe gewenste eigenschappen bezit.

De uitvinding heeft derhalve betrekking op de in de aanhef genoemde verbinding, met het kenmerk, dat de verbinding een 4'-fosfaat- of 4'-thiofosfaat derivaat met de formule V op het formuleblad is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, waarbij de symbolen in de formule V de volgende betekenissen hebben: 25 R1 is een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen; R6, R7 en R8 zijn waterstofatomen; en X is een zuurstofatoom of een zwavel atoom.

Overigens is fosforylering van therapeutische middelen die een hydroxilgroep bevatten, gebruikt als middel om een latente geneesmiddelwerking te realiseren; de gefosforyleerde derivaten kunnen dan in vivo 30 door een fosfatase worden gesplitst waarbij het actieve moedermolecule vrijkomt. Een korte bespreking van fosfaten als mogelijke geneesmiddel-voorlopers (pro-drugs) wordt gegeven in het overzichtsartikel "Rationale for Design of Biologically Reversible Drug Derivatives: Prodrugs” (A.A. Sinkula en S.H. Yalkowsky, J. Pharm. Sci., 64, 181-210 (1975), op biz. 189-191). Volgens dit artikel vertoont prostaatkanker-weefsel een hoge fosfatase activiteit. Hiervan is gebruik gemaakt door het tegen tumoren werkzame diethylstilbestrol toe 35 te dienen in de vorm van het overeenkomstige difosfaat. Ook fosfaat-esters van N,N-bis(2-chloor-ethyl) 4-hydroxianiline blijken, ten gevolge van de in tumoren aanwezige fosfatasen, een goede antitumor activiteit te bezitten. Verdere voorbeelden van fosfaten van bekende middelen tegen tumoren zijn fosfaat-esters van daunol’ubicine (Amerikaans octrooi 4.185.111). Tevens is bekend dat fosforglering van hydroxilgroepen een mogelijkheid is om de oplosbaarheid van een verbinding in water te vergroten. Het door fosforyleren 40 vergroten van de wateroplosbaarheid van verbindingen met antitumor activiteit is bekend uit Chemical Abstracts 96, 218193U (1982) [5'-fosfaten van 9-8-D-arabinofuranosyl-2-fluoradenine] en Chemical Abstracts 104, 199672q (1986) [5'-fosfaat van TCN] en uit een publicatie van A. Rosowsky et al in J. Medicinal Chem. 25, 171-178 (1982), met name blz. 172 [5'-gefosforgleerde 3'-0-acyl[-2,2’-anhydro-analoga van 1-8-D-arabino-furanosylcytosinej.

45 Echter is ook bekend, dat in het geval van podophyllotoxine de overeenkomstige fosfaat-ester, in de vorm van het dinatriumzout met de formule IV op het formuleblad, niet door zuurfosfatase van de prostaat wordt gehydrolyseerd en ook niet minder toxisch is dan het podophyllotoxine. Zie een publicatie van Seligman et al. in Cancer Chemotherapy Reports Part I (1975), 59, 233-242. Niettegenstaande hetgeen, ook na de publicatie van Seligman et al., bekend is geworden omtrent de gunstige eigenschappen van 50 fosfaat-esters van verbindingen met antitumor activiteit, drong het zich daarom niet aan een deskundige op te onderzoeken of, in het geval van de reeds lang bekende 4'-demethyl-epipodophyllotoxineglucoside verbindingen, de aan die stoffen verbonden problemen met toxiciteit en oplosbaarheid zouden kunnen worden opgelost door het toepassen van een overeenkomstige fosfaat-ester. Verrassenderwijs is nu gevonden, dat de hierboven omschreven fosfaat-esters met de formule V een significante antitumor activiteit 55 vertonen (zie de hiernavolgende Tabel A), veel minder ongewenste toxische bijwerkingen geven, en een veel betere oplosbaarheid in water bezitten dan de niet-gefosforgleerde moederverbindingen. De bij voorkeur toe te passen verbinding volgens de uitvinding, het etoposide 4'-fosfaat dinatriumzout met de 192683 2 formule Vla op het formuleblad, vertoont een hogere antitumor activiteit dan etoposide en kan, dankzij de veel hogere oplosbaarheid in water, door injectie worden toegediend, binnen een paar minuten, terwijl etoposide door intraveneuze infusie moet worden toegediend, wat enkele uren vergt en veel duurder is.

De zouten van de verbinding met de formule V omvatten zowel de mono-anionische als de di-anionische 5 zouten. Het kation kan een metaal-ion zoals een ion van de alkalimetalen of aardalkalimetalen of een ander gebruikelijk metaal-ion zijn, of een ammoniumion of een organische stikstofbevattende groep zijn zoals mono-, di-, of trialkylammonium of pyridinium. Het kation wordt bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit natrium, kalium, lithium, cesium, magnesium, calcium, aluminium, ammonium, en mono-, di-, en trialkylammonium.

10 De hierboven gedefinieerde verbindingen met de formule V en de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan, kunnen op voor analoge verbindingen bekende wijze worden beleid.

Bijvoorbeeld kan de fenolische hydroxilgroep van een 4'-demethyl-epipodophyllotoxineglucoside met de formule IX op het formuleblad, waarin R1 en R6 de eerder genoemde betekenissen hebben, worden gefosforyleerd met fosforoxichloride en thiophosphorylchloride onder vorming van respectievelijk het 15 overeenkomstige dichloorfosfaat en het overeenkomstige dichloorthiofosfaat (formule VIII). De fosforylerings-reactie wordt uitgevoerd in een geschikt watervrij organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld acetonitrile, en bij voorkeur in tegenwoordigheid van een tertiaire amine base, bij voorbeeld N,N-diisopropyl-N-ethylamine. Het reactieverloop kan met dunne laag chromatografie (TLC) worden gevolgd, waardoor de optimale reactieduur kan worden beoordeeld op basis van het verschijnen van product of het verdwijnen van het uitgangs-20 materiaal of beide. De reactieperiode kan ongeveer 4 uur tot ongeveer 72 uur in beslag nemen. De vereiste reactieduur lijkt verband te houden met de kwaliteit van het gebruikte fosforhoudende reagens.

De 4'-dichloorfosfaten met de formule VIII kunnen worden gehydroliseerd om de fosfaten met de formule V te verkrijgen, en in tegenwoordigheid van een base worden de overeenkomstige fosfaatzouten verkregen. Wanneer bijvoorbeeld de verbinding met de formule VIII wordt behandeld met een overmaat waterige 25 natrium waterstofcarbonaat-oplossing, worden de 4'-fosfaat dinatrium- en 4'-thiofosfaat dinatriumzouten verkregen; waterstofcarbonaten van andere kationen, zoals kalium en ammonium, kunnen eveneens worden gebruikt om de respectieve zouten te verkrijgen.

Een andere methode voor het bereiden van de hierboven gedefinieerde verbindingen met de formule V en de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan, verloopt als volgt: 30 (a) een verbinding met de formule IX, waarin R1 en R6 de eerder genoemde betekenissen hebben, wordt omgezet in een verbinding met de formule VII, waarin R1 en R6 de eerder genoemde betekenissen hebben en G een fosfaat-beschermende groep voorstelt, bijvoorbeeld een 2,2,2-trihalogeenethylgroep, een 2-cyaanethylgroep, een alkylgroep met 1-5 koolstofatomen, of een fenyl- of fenylalkylgroep waarin de fenylirest desgewenst is gesubstitueerd met alkyl, halogeen of nitro; 35 (b) uit de verbinding met de formule VII worden de fosfaat-beschermende groepen G verwijderd; (c) het verkregen product met de formule V wordt desgewenst omgezet in een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

In stap (a) wordt een 4'-demethyl-epipodophyllotoxineglucoside behandeld met een halogeenfosfaat-diëster, [d.w.z. Hal-P(0)(0-G)2].

40 Gevonden is dat deze reactie het meest efficiënt wordt uitgevoerd in acetronitrile in tegenwoordigheid van een organische trialkylamine base; de geprefereerde base is diisopropylethylamine. Tenminste één equivalent van het halogeenfosfaat en de amine base worden gebruikt, maar beide reagentia worden bij voorkeur gebruikt in molaire equivalenten in een geringe overmaat ten opzichte van die van de epipodophyl-lotoxineglucoside reactant. De reactie kan bij elke temperatuur die tot de vorming van product leidt, worden 45 uitgevoerd; enigszins verhoogde temperaturen, bijvoorbeeld 30-40°C, lijken echter de reactie die tot verscheidene dagen in beslag kan nemen om volledig te zijn, te vergemakkelijken. De benodigde halogeensofaat-diësters kunnen op conventionele wijze worden bereid uit de betreffende alcohol of fenol en fosforoxichloride. Het is ook mogelijk om fosfaat-triesters met de formule VII langs andere wegen te bereiden, bijvoorbeeld door eerst de fenol met de formule IX om te zetten in een fosfiet-ester, bijvoorbeeld 50 door een reactie met een reagens zoals (PhCH20)2PN(i-pr)2, en een daaropvolgende oxidatie van het fosfiet tot de fosfaat-ester onder toepassing van bijvoorbeeld m-chloorperbenzoëzuur.

In stap (b) wordt het dihydroxifosfaat (V, R7=R®=h) bijvoorbeeld verkregen wanneer de difenyl-ester (VII, G=fenyl) aan een katalytische hydrogenering wordt onderworpen. Andere geschikte fosfaatbeschermende groepen zijn, zonder daartoe beperkt te zijn, 2,2,2-trichloorethyl, benzyl, 2-cyaanethyl, p-nitrofenyl, 55 p-nitrobenzyl, p-nitrofenethyl en p-broomfenyl. De dihydroxifosfaten (V. R7=R®=H) worden in de overeenkomstige zouten omgezet (stap (c)) door ze te laten reageren met de geschikte base, bijvoorbeeld natriumwaterstofcarbonaat, ammoniumwaterstofcarbonaat of organische aminen. De zouten kunnen ook 3 192683 worden verkregen door het dihydroxifosfaat te elueren door een kolom van uitwisselingshars die het gewenste kation bevat.

Opgemerkt wordt, dat in het kader van het bereiden van de hierboven gedefinieerde verbindingen met de formule V ook andere fosforhoudende reagentia die in staat zijn om fenolen met de formule IX te fosforyle-5 ren, gebruikt kunnen worden. Geschikte reactiecondities en reactiemedia kunnen in afhankelijkheid van het gekozen fosforyleringsmiddel worden ingesteld. Het overzichtsartikel, getiteld "Current Methods of Phosphorylation of Biological Molecules (L.A. Slotin, Synthesis 1977, 737-52) bevat verdere voorbeelden van fosforyleringsmiddelen en dient door verwijzing hierin opgenomen te worden geacht.

10 Biologische eigenschappen

Representatieve verbindingen volgens de onderhavige uitvinding werden op hun werkzaamheid tegen tumoren onderzocht bij een transplanteerbare P388 muizenleukemie. In alle experimenten werden CDF., vrouwtjesmuizen gebruikt waarin een tumor inoculum van 106 ascites cellen van P388 muizenleukemie was geïmplanteerd. In experimenten met etoposide 4'-fosfaat, het dinatriumzout daarvan, en etoposide 15 4'-thiofosfaat dinatriumzout, vonden zowel de tumor-implantering als de behandeling met geneesmiddel plaats via de intraveneuze route. In alle gevallen werd echter de positieve controle, etoposide, intra-peritoneaal toegediend. De experimenten duurden 28 tot 46 dagen, aan het eind van welke periode het aantal overlevende dieren werd opgetekend. De antitumor activiteit werd uitgedrukt als % T/C, hetwelk de verhouding van de middelbare overlevingsduur (MST) van de met geneesmiddel behandelde groep tot de 20 MST van de met zoutoplossing behandelde controlegroep is. Een verbinding met een % T/C waarde van 125 of groter wordt in het algemeen geacht een significante antitumor activiteit in de P388 test te bezitten. Tabel A geeft de resultaten van de bovenstaand beschreven evaluatie; de maximum % T/C waarden en doses die dat effect gaven, zijn vermeld.

25 TABEL A

Antitumor activiteit tegen p388 muizenleukemie

Verbinding van Dosis* Route MST(d) % T/C

(mg/kg/inj) 30 - INTRAVENEUS GEÏMPLANTEERDE TUMOR CELLEN Voorbeeld 1 140 IV 29,0 363

Etoposide, ter vergelijking 50 IP 20,5 256

Voorbeeld 2 200 IV 18,0 225 35 Etoposide, ter vergelijking 100 IP 21,5 269

Voorbeeld 3B 125 IV 24,5 306

Etoposide, ter vergelijking 100 IP 29,5 369 * De geneesmiddelen werden toegediend op de dagen 5 en 8, tenzij anders is aangegeven (dag 1 was de dag waarop de tumor werd 40 geïmplanteerd).

Aangetoond werd dat de antitumor verbindingen volgens de onderhavige uitvinding actief zijn tegen getransplanteerde tumoren in proefdieren. Vooral de verbinding met de formule Vla ("etopofos”) vertoonde een significant hogere antitumor activiteit dan etoposide in de P388 test. Dit selectieve middel vertegen-45 woordigt een goed in water oplosbare prodrug van etoposide die door alkalisch fosfatase snel gesplitst wordt, hetgeen leidt tot het vrijkomen van etoposide.

De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor het remmen van tumoren bij zoogdieren, omvattende het toedienen van een effectieve tumor-remmende dosis van een antitumor verbinding met de formule V aan een tumor-dragende gastheer. Hiertoe kan het geneesmiddel langs conventionele wegen 50 worden toegediend, waaronder, zonder daartoe beperkt te zijn, de intraveneuze, intramusculaire, intratumor-ale, intraarteriële, intralymfatische en orale route.

Een verder aspect van de onderhavige uitvinding verschaft een farmaceutisch preparaat dat een verbinding met de formule V alsmede een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat. Het antitumor preparaat kan elke voor de gewenste toedieningsroute geschikte farmaceutische vorm hebben. Voorbeelden 55 van dergelijke preparaten omvatten vaste preparaten voor orale toediening zoals tabletten, capsules, pillen, poeders en granules, vloeibare preparaten voor orale toediening zoals oplossingen, suspensies, siropen of elixers en preparaten voor parenterale toediening zoals steriele oplossingen, suspensies of emulsies. Ze 192683 4 kunnen ook worden gepresenteerd in de vorm van steriele vaste preparaten die in steriel water, fysiologische zoutoplossing of een willekeurig ander steriel injecteerbaar medium, onmiddellijk voorafgaande aan het gebruik, kunnen worden opgelost.

Optimale doseringen en toedieningsvoorschriften voor een bepaalde zoogdier gastheer kunnen 5 gemakkelijk door de deskundigen worden vastgesteld. Uiteraard zal duidelijk zijn dat de feitelijke dosis zal kunnen variëren afhankelijk van de gekozen samenstelling, de gebruikte verbinding, de toedieningswijze en de te behandelen plaats, gastheer en tumor. Veel factoren die de werking van het geneesmiddel beïnvloeden zullen in aanmerking worden genomen, waaronder leeftijd, gewicht, sekse, dieet, toedieningstijdstip, toedieningsroute, snelheid van uitscheiding, conditie van de patiënt, geneesmiddelcombinaties, reactie-10 gevoeligheden en ernst van de ziekte.

De volgende voorbeelden dienen ter toelichting van de uitvinding en dienen niet te worden uitgelegd op een wijze waardoor ze de omvang van de uitvinding beperken.

In de volgende voorbeelden werden proton en koolstof kernmagnetische resonantie (NMR) spectra (gebruikmakend van CDCI3 of DzO als interne referentie) en fosfor NMR spectra (gebruikmakend van 85% 15 waterig H3P04 als externe referentie) opgetekend op een Bruker WM360 spectrometer. Infrarood spectra (IR) werden bepaald op een Perkin-Elmer 1800 Fourier Transform Infrarood spectrofotometer. Wanneer sprake is van "Flash chromatography” wordt daarmee de methode bedoeld, die beschreven is door W.C. Still, M. Kahn en A. Mitra, J. Org. Chem. 43, 2923 (1978) en die werd uitgevoerd met behulp van E. Merck silica gel (met mazen van 0,062-0,037 mm). Omgekeerde fase chromatografie werd uitgevoerd onder een 20 positieve stikstofdruk onder toepassing van octadecylsilaan, gebonden aan silicagel (40 μιη diameter, J.T. Baker).

Voorbeeld 1

Etoposide 4'-fosfaat dinatriumzout (verbinding met de formule Via 25 Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (2,30 gram, 3,91 mmol) in 210 ml droge acetonitrile werd opgewarmd om een nagenoeg volledige oplossing te bereiken. De oplossing liet men tot kamertemperatuur afkoelen, waarna N,N-diisopropyl-N-ethylamine (2,36 ml, 13,5 mmol) werd toegevoegd. Het mengsel werd daarna tot 0°C afgekoeld en P0CI3 (666 mg, 4,34 mmol) werd in 30 seconden tijd via een naald toegevoegd. Men liet het mengsel langzaam in 2-3 uur tijd tot kamertemperatuur komen en roerde bij 30 kamertemperatuur nog eens 63 uur door. Aan het eind van deze periode werd 20 volume % van het reactiemengsel verwijderd om voor andere proeven te worden gebruikt. De rest werd behandeld met een oplossing van natriumwaterstofcarbonaat (6,0 g, 71,4 mmol) in 110 ml gedeïoniseerd water. Het mengsel werd gedurende 80 minuten bij kamertemperatuur geroerd, en vervolgens verdeeld met behulp van 20 ml verzadigde waterige natriumwaterstofcarbonaat-oplossing, 125 ml gedeïoniseerd water en 350 ml ethyl-35 acetaat. De organische laag werd verder geëxtraheerd met 1 x 50 ml gedeïoniseerd water en de gecombineerde waterlagen werden gewassen met 250 ml ethylacetaat en daarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan een verminderde druk van 66,7 Pa onderworpen om opgeloste oplosmiddelen te verwijderen. Het waterhoudende gedeelte werd daarna op een kolom met een diameter van 4 cm gebracht die 15 cm aan silicagel gebonden octadecylsilaan bevatte, dat gepakt was in methanol en met water was geëquilibreerd.

40 Nadat het totale waterhoudende gedeelte was aangebracht, werd de kolom met 175 ml water geëlueerd om anorganische zouten te verwijderen en daarna werd met 4:1 H20:CH30H het product geëlueerd. Concentratie van het oplosmiddel bij een druk van 66,7 Pa gaf 744 mg (36%) van de zuivere titelverbinding als kleurloze vaste stof. Anderzijds gaf lyofilisatie de zuivere titelverbinding als een zeer rulle stof met gering soortgelijk gewicht.

45 IR (KBr), maxima bij: 3426, 1775, 1593, 1505, 1486, 1337, 1239, 1191, 1122, 1078, 1034, 983, 927, 888, 876, 851,830, 697, 684, 664, 547 cm’1.

360 MHz 1H NMR (D20), maxima bij δ-waarden: 6,93 (s,1H), 6,59 (s, 1H), 6,27 (S,2H), 5,93 (d,2H), 5,09 (d,1H,J=2,8Hz), 4,83 (q,1H,J=5,0Hz), 4,68 (d,1H,J=7,9Hz), 4,62 (d,1H,J=5,7Hz), 4,47-4,35 (m,2H), 4,24 (dd,1H,J=4,4 en 10,4Hz), 3,64 (s,6H), 3,68-3,52 (m,3H), 3,44-3,30 (m,3H), 3,17-307 (m,1H), 1,31 50 (d,3H,j=5,0 Hz).

90 MHz 13C NMR (D20), maxima bij δ-waarden: 178,5, 151,8, 148,1, 146,1, 135,0, 132,6, 130,9, 127,4, 109,9, 109,5, 107,4, 101,3, 100,4, 99,6, 79,2, 73,7, 72,7, 72,2, 69,1, 65,4, 55,6, 42,8, 40,3, 37,5, 18,8.

146MHz 31P NMR (DzO), maximum bij δ-waarde 3.79.

Massaspectrum (FAB), m/e, 713 (M+ + H). C^Hg^O^P vereist M+, 712.

55 Anal, berekend voor C^H^Na-, - 16P: 0,48,89; H,4,39; Na,6,45%; gevonden*: C,48,72; H,4,56; Na, 6,56%.

* Bijgesteld voor 8,16% H20, bepaald door Karl-Fischer analyse.

5 192683

Voorbeeld 2

Etoposide 4'-thiofosfaat dinatriumzout (formule Vlb)

Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (2,04 g, 3,47 mmol) in 175 ml droge acetonitrile werd opgewarmd waarbij een nagenoeg volledige oplossing werd verkregen. Men liet de oplossing tot kamertem-5 peratuur afkoelen en voegde vervolgens aan de oplossing N,N-diisopropyl-N-ethylamine (2,00 ml, 11,5 mmol) toe. Het mengsel werd daarna tot 0°C afgekoeld en thiofosforylchloride (0,720 g, 4,17 mmol) werd in een periode van 30 seconden via een naald toegevoegd. Het mengsel liet men langzaam in 2-3 uur tot kamertemperatuur oproeren en gedurende 16 uur werd bij kamertemperatuur doorgeroerd. Het mengsel werd daarna tot 30-35°C opgewarmd en nog eens 4 uur op die temperatuur gehouden. Met dunne laag 10 chromatografie (5% CH30H in CH2CI2) werd een grote nieuwe vlek met een hoger Rf dan etoposide waargenomen. Het reactiemengsel werd met 7,4 g vast natriumwaterstofcarbonaat behandeld en daarna werd 100 ml gedeïoniseerd water toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 1,5 uur bij 28-25°C en gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het mengsel werd over 200 ml gedeïoniseerd water, 30 ml verzadigde waterige natriumwaterstofcarbonaatoplossing en 300 ml ethylacetaat verdeeld. Verdere 15 opwerking en omgekeerde fase chromatografie werden uitgevoerd volgens de in voorbeeld 1 beschreven procedure, waarbij 1,03 g (40,8%) van de zuivere titelverbinding als een kleurloze vaste stof werd verkregen.

360 MHz 1H NMR (D20), maxima bij δ-waarden: 6,93 (s,1H), 6,60 (s,1H), 6,27 (s,2H), 5,93 (d,2H), 5,09 (d,1H,J=2,8Hz), 4,83 (q,1H,J=5,0Hz), 4,68 (d,1H,J=7,8 Hz), 4,63 (d,1H,J=5,7Hz), 4,47-4,35 (m,2H), 4,24 20 (dd,1H,J=4,3 en 10,5Hz), 3,64 (s,6H), 3,67-3,52 (m,3H), 3,47-3,29 (m,3H), 3,17-,3,07 (m,1H), 1,31 (d,3H,J=5,0 Hz).

Massaspectrum (FAB), m/e 728 (M+), 706 (M+ + H - Na). C29H31Na2015PS vereist M+, 728.

Voorbeeld 3 25 A. Etoposide 4'-difenylfosfaat (formule VII; R1=CH3, P?=H, G=fenyl)

Een magnetisch geroerde suspensie van etoposide (10,50 g, 17,84 mmol, gedroogd boven P205 bij 80°C 66,7 Pa) in 450 ml droge acetonitrile werd behandeld met diisopropyl-ethylamine (4,20 ml, 24,1 mmol) en daarna werd als zodanig via een naald difenylchloorfosfaat (2,00 ml, 9,65 mmol) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2 uur bij 50°C onder N2 geroerd, na welke tijd alle etoposide was opgelost. Men voegde 30 nog eens difenylchloorfosfaat (1,80 ml, 8,86 mmol) toe en hield het reactiemengsel gedurende 72 uur op 45°C. Nadat meer van de amine base (0,75 ml, 4,3 mmol) en het difenylchloorfosfaat (0,80 ml, 3,86 mmol) waren toegevoegd, werd het mengsel gedurende 27 uur op 40-45°C geroerd, dan behandeld met meer difenylchloorfosfaat (0,40 ml, 1,93 mmol) en gedurende 22 uur op 40-45°C gehouden. Daarna werd 20 ml isopropanol toegevoegd en werd het oplosmiddel onder verminderde druk afgedampt. Het zo verkregen 35 vaste residu werd opgelost in 500 ml CH2CI2, en met 400 ml HzO verdeeld. De waterlaag werd verder geëxtraheerd met 100 ml CH2CI2 en de gecombineerde organische extracten werden gewassen met 250 ml zoutoplossing en gedroogd boven Na2SCyMgSC)4. Rotatieverdamping, gevolgd door flash chromatografie over silicagel met behulp van 2-3% CH3OH in CH2CI2, gaf 12,50 g (85%) van de zuivere titelverbinding als een kleurloze vaste stof.

40 FAB MS, m/e (relatieve intensiteit) 820 (M+H)\ IR (KBr), maxima bij: 3460, 2925, 1775, 1490 cm'1.

Ή NMR (CDCI3), maxima bij δ-waarden: 7,28 (m, 8H), 7,15 (m,2H), 6,78 (s, 1H), 6,47 (s,1H), 5,95 (m,2H), 4,85 (d,J=3,5Hz,1 H), 4,71 (m,1H), 4,60 (d,J=7,6Hz,1H), 4,56 (d,J=5,1Hz,1H), 4,38 * m,1H), 4,22-4,13 (m,2H), 3,72-3,60 (m,lH), 3,48 (s,6H), 3,54-3,28 (m,3H), 3,23 (dd,J=14,2 en 5,3Hz,1H), 2,78 45 (m,1H), 1,35 (d,J=5,1Hz,3H).

Anal, berekend voor C41H4n016P: C,60,00; H,5,04%. Gevonden: C,60,20; H,5,16%.

B. Etoposide 4'-fosfaat (formule V; R?=H, R7=tf=H)

Platinaoxide (0,198 g, 0,87 mmol) uit een vers geopende fles (Aldrich Chemical Co.) werd toegevoegd aan 50 een oplossing van etoposide 4’-difenylfosfaat (product van stap A, 0,79 g, 0,962 mmol) in 95 ml absolute ethanol. De oplossing werd op een Parr-apparaat gehydrogeneerd gedurende 4 uren bij kamertemperatuur onder een druk van 310-345 kPa. Het reactiemengsel werd gefiltreerd door een kussen van celite onder toepassen van ethanol als eluens. Concentreren onder verminderde druk en drogen boven P2Os gedurende 14 uur onder verminderde druk leverde het gewenste product op in de vorm van een witte vaste stof (0,627 55 g, 94%).

FAB MS, m/e (relatieve intensiteit) 669 (M+H)+ IR (KBr), maxima bij: 3440, 2930, 1778, 1604, 1498 cm'1.

Claims

192683 6 1H NMR (DMSO-dg), maxima bij δ-waarden: 6,93 (s,1H), 6,46 (s,1H), 6,12 (s,2H), 5,94 (m,2H), 5,17 (bs,1 H), 4,86 (d,J=3,93Hz,1H), 4,64 (q,J=7,5 en 5,8Hz,1H), 4,51-4,42 (m,2H), 4,20 (d,J=10,7Hz,1H), 4,01 (dd,J=12,1 en 5,3Hz,1H), 3,51 (S,6H), 3,51-2,75 (m,7H), 2,83 (m,1H), 1,16 (d,J=5,1Hz,3H). 13C NMR (DMSO-d6), maxima bij δ-waarden: 174,5, 151,1, 147,7, 146,2, 126,1, 132,3, 128,8, 109,7, 5 107,9, 101,5, 101,2, 98,5, 80,0, 74,3, 72,7, 71,7, 67,6, 67,2, 65,7, 55,8, 43,0, 37,1, 20,2, 18,5. Anal, berekend voor C^H^, 016P. 0,85%H2O: C, 50,95; H, 5,11%. Gevonden: C, 51,42; H, 4,97%. Voorbeeld 4

10 Etoposide 4'-fosfaat dinatriumzout uit etoposide 4'-fosfaat Methode A In de handel verkrijgbare Dowex 50 x 8-100 kationenuitwisselingshars in de waterstofvorm (20 g, Aldrich Chemical Co.) werd behandeld met overmaat van 1N NaOH. De verkregen hars in de Na+ vorm werd gepakt in een kolom van 2 cm en geëquilibreerd met water. Etoposide 4'-fosfaat (product van voorbeeld 3B, 15 1,25 g, 1,87 mmol) opgelost in 25 ml gedeïoniseerd water, werd bovenop de gepakte kolom aangebracht en de kolom werd geëlueerd met water. Fracties die de titelverbinding bevatten werden samengevoegd, gefiltreerd, en gelyofiliseerd. Met verkreeg 1,15 g van de titelverbinding als een wit en rul materiaal. Methode B

20 Aan 2,90 g (4,34 mmol) van ruw etoposide 4'-fosfaat (product van voorbeeld 3B werden 50 ml gedeïoniseerd water en 3,00 g, 35,7 mmol natrium waterstofcarbonaat toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd; in de loop van deze periode hield de C02-ontwikkeling op. Het mengsel werd daarna op de in voorbeeld 1 beschreven wijze chromatografisch behandeld. Elutie met gedeïoniseerd water (300 ml) en daarna met 4:1 H20/CH30H gaf 1,90 g (61%) van de zuivere titel-25 verbinding als een rulle witte vaste stof na lyofilisatie. 30 1. 4'-Demethyl-epipodophyllotoxineglucoside verbinding, met antitumor activiteit, met het kenmerk, dat de verbinding een 4'-fosfaat- of 4'-thiofosfaat derivaat met de formule V op het formuleblad is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, waarbij de symbolen in de formule V de volgende betekenissen hebben: R1 is een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen; R6, R7 en R8 zijn waterstofatomen; en 35 X is een zuurstofatoom of een zwavelatoom.

2. Verbinding volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de verbinding etoposide 4'-fosfaat dinatriumzout met de formule Vla is.

3. Farmaceutisch preparaat met antitumor activiteit, dat een 4'-demethyl-epipodophyllotoxineglucoside verbinding met antitumor activiteit alsmede een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat, met het 40 kenmerk, dat het preparaat een werkzame hoeveelheid van een verbinding volgens conclusie 1 of 2 bevat. Hierbij 2 bladen tekening