PT92034B - Processo para a preparacao de conjugados de sacaridos inibidores de tumores e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Processo para a preparacao de conjugados de sacaridos inibidores de tumores e de composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

Info

Publication number
PT92034B
PT92034B PT92034A PT9203489A PT92034B PT 92034 B PT92034 B PT 92034B PT 92034 A PT92034 A PT 92034A PT 9203489 A PT9203489 A PT 9203489A PT 92034 B PT92034 B PT 92034B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
sugar
phosphodiamide
chloroethyl
benzyl
mmol
Prior art date
Application number
PT92034A
Other languages
English (en)
Other versions
PT92034A (pt
Inventor
Manfred Wiessler
Michael Dickes
Original Assignee
Deutsches Krebsforsch
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforsch filed Critical Deutsches Krebsforsch
Publication of PT92034A publication Critical patent/PT92034A/pt
Publication of PT92034B publication Critical patent/PT92034B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 92034
REQUERENTE: DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM STIFTUNG DES OFFENTLICHEN RECHTS, alemã, industrial e comercial, com sede em Im Neuenheimer Feld 280, D-6900 Heidelberg, República Fe deral Alemã.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS
DE SACARIDOS INIBIDORES DE TUMORES E DE COMPOSIÇQES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM
INVENTORES:
Prof. Dr. Manfred Wiessler e Michael Dickes.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
República Federal Alemã, em 20 de Outubro de 1988, sob ο η® P 38 35 772.0-42.
INPI. MOD 113 RF 18732
de invenção de Deutsches Krebsfor· schungszentrum Stiftungdes offentlichen Rechts, alema, industrial e comercial com sede em Im Neuenheimer Feld 280, D-6900 Heidelberi Republica Federal Alema, (invento res: Prof.Dr.Manfred Wiessler e Michael Dickes, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE SACÀRIDOS INIBIDORES DE TUMORES E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM
DESCRIÇÃO
As doenças cancerosas situam-se na Republicaz Federal da Alemanha depois das doenças cardio-vasculares no se gundo lugar na estatística de mortalidade. Na terapia estabele cida das doenças cancerosas conta-se hoje, para além da cirurgia e das radiações, com a quimioterapia antineoplásica.
Apesar da qualidade da técnica cirúrgica, das melhorias da terapia radiologica e de numerosos novos desenvolvimentos na quimioterapia, nao tem sido possível afinal nos últimos anos melhorar a percentagem de curas de tumores malignos embora para alguns tipos de tumores, como por exemplo no caso da doença de Hodgkin, se tenham obtido resultados muito bons .
Por conseguinte subsiste ainda a necessidade de possibilitar melhoramentos na quimioterapia com base no co nhecimento permanentemente aumentado sobre a biologia das células tumorais.
objectivo principal dos novos desenvolvimentos dos produtos terapêuticos dotados de acção antineoplásica é o melhoramento da selectividade e em consequência uma redu çao dos efeitos secundários indesejáveis.
Se bem que seja possível em geral distinguir muitas diferenças bioquímicas entre células tumorais normais, estas diferenças nao muito significativas.
Muitas das substancias actualmente utilizadas dispõem já de uma considerável selectividade e deste modo de um índice terapêutico utilizável, mas está-se ainda muito longe de uma selectividade absoluta.
Uma possibilidade de atingir este objectivo consiste na utilização de precursores, as chamadas prodrugs isto é, de produtos dotados de actividade farmacêutica que são activados especialmente nas células visadas ou cuja acçao tóxica é fortemente eliminada nas células nao visadas. Segundo outra abordagem procura-se conduzir as substâncias medicamentosas para as células visadas ou pelo menos concentrá-las nessas células (Drug Targeting).
Muitos conceitos da Drug Targeting baseiam-se numa ligaçao específica de uma substância farmacêutica à célula visada ou num mecanismo diferente de assimilaçao entre as células não visadas e as células visadas. Para o fim em vista também é possível usar diferenças quantitativas.
Deste modo, por exemplo, conseguiu-se com o auxilio da técnica de hibridaçao (Kohler e Milstein, 1975, Nature 256, 495) preparar anticorpos monoclonais (ACM's) dirigi-2-
dos e com o auxilio destes anticorpos reconhecer antigenes associados a tumores (AAT's).
Os ésteres de glicosilo a preparar sao obteníveis de acordo com um método conhecido, especialmente por meio da reacçao de Koenigs-Knorr adicionalmente desenvolvida ou do método do imidato.
Uma revisão destes métodos, bem como da glicosilaçao estereo-selectiva, para a gual actualmente existem três métodos básicos, segundo a estereoquimica de acoplamento pretendida, pode ser encontrada especialmente em Paulsen, 1984, Chem. Soc. Rev. 13, 15.
Sabe-se, no entanto, que apesar dos numerosos métodos existentes de glicosilação nem sempre é possível efectuar os acoplamentos pretendidos de modo estereo-selectivo em rendimentos satisfatórios. Cada uma das transferências de glicosilo apresenta um problema independente e não existem em geral condiçoes de reacção universais (Schmidt 1986, Angew.Chem. 98, 213) .
Em conformidade a presente invenção refere-se a glicoconjugados de gentes antitumorais de actividade elevada para utilização como agentes antineoplásicos com conservação em grau considerável da respectiva actividade, mas com uma redução elevada da sua toxicidade.
Como exemplos tipicos, prepararam-se do modo Rescrito conjugados com as seguintes fórmulas gerais
NHRRi açucar -0 - P »/
NHRNH la
e açúcar - 0 - P R,
nas quais a ligação do açúcar com a função perdida da fosforamida é efectuada de preferência na posição 1. Como açucares mais importantes podem ser referidos:
galactose, manose, glucose, manano, galactano, glucano bem como também açucares ramificados, especialmente nas posiçoes 3 e 6, sendo no entanto basicamente utilizáveis todos os açucares, sejam monossacáridos, dissacárido ou polissacáridos em todas as formas isómeras ou enantiómeras existentes.
Rl e R2 podem ser iguais ou diferentes e podem ter os seguintes significados:
hidrogénio, alquilo-C-L -C4 inferior , halogenoalquilo-Cj-C^, de preferência halogenoalquilo-Cj-Cqe especialmente halogenoalquilo-C .
Para grupos protectores podem usar-se todos os grupos protectores habituais para funções OH, por exemplo grupos benzilo, acetilo e tritilo, e a cisão pode ser efectuada igualmente de forma conhecida, por via enzimática, por hidro genólise ou por hidrólise ácida ou alcalina.
Em geral a mustarda de fosfamida e a mustarda de ifosfamida acopladas a grupos glicosilo da presente invenção podem ser preparadas pelo processo em seguida apresentado:
As unidades a acoplar, os compostos de fósforo, podem ser preparados de acordo com o método descrito por Lorenz e WieBler, 1985, Arch. Pharm. 318,577.
Estes dois compostos podem ser obtidos com bromossacáridos de acordo com o procedimento apresentado no Exemplo do composto 28 fi, glucose-/) IPM ou o composto dissacárido 50 e 51 de acordo com as Figuras 1 e 2 juntas.
Um açúcar protegido A é feito reagir com um composto fosfórico B, deixando os dois compostos interactuar num solvente, de preferência num solvente polar, por exemplo acetonitrilo, CH2CI2 ou tolueno numa gama de temperaturas de 20QC a 120QC durante um período de 1 h a 48 h com adiçao de uma base auxiliar, por exemplo EtgN ou Et(i-Prop)2N. 0 procedimento geral pode ser representado através do esquema seguinte.
(Rs)n “ açúcar - OH
H5C5O - P ^-N.HRx \
N:HR2 (Rs)n _ açúcar - x
NHR-
NHR2 il ^NHRi P \
nhr2
Ψ 0 açúcar - 0 - P- NHRj_
NHR2
A reacçao com ifosfamida é efectuada de modo análogo R= um grupo protector, p.ex. benzilo, x= um grupo reactivo, p. ex. bromo
A partir dos 1-0-metilpiranosidos da glucose, galactose e manose é possível preparar os correspondentes brometos de 2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-glicopiranosilo de acordo com a Fig. 1.
Ri *2 *3 R4
H OH H OH Metil-ce-D·
H OH OH H Metil-oD·
OH H H OH Metil-Ot-D·
Ri R2 R3 r4
H OBn H OBn 12
H OBn OBn H 11
OBn H H OBn 12
Ri *2 r3 R4
H OBn H OBn Γ3
H OBn OBn H 14
OBn H H OBn 15
R1 R2 R3 r4 R5
H OBn H OBn CO-Ph-NO2 16
H OBn OBn H CO-NH-Ph 17
OBn H H OBn CO-Ph-NOn 18
HBr
V 'OBn R3 Λ-°κ
OBnR
Br
FIG. 1
Ri *2 *3 R4
H OBn H OBn 12
H OBn OBn H 20
OBn H H OBn 21
Sintese dos bromoglicosidos benzilados
A benzilação é levada a efeito de modo conhecido em si, por exemplo em dioxano com cloreto de benzilo na presença de KOH para se obter metil-alfa-D-gluco- ou galactopiranosido, enquanto que o metil-alfa-D-manopiranosido, por exemplo, é transformado com cloreto debenzilo/NaH. Os metilglicosidos benzilados 10, 11 e 12 são em seguida hidrolisados, por exemplo com H2SO4/HOAC, dando 13, ou com HCl/HOAc, dando 14 e 15, respectivamente. 0 composto 13 e os isómeros de manose 15 podem então ser derivatizados por exemplo com cloreto de p-nitrobenzoílo em diclorometano/piridina, dando os correspondentes 2,3,4,6-tetra-0-benzil-1-0-p-nitrobenzoílo-D-glicopiranosilos e 18, os quais podem ser facilmente purificados por recrista lizaçao. Uma vez que esta operaçao nao é possível tao facilmente para o p-nitrobenzoato da 2,3,4,6-tetra-0-benzilgalactose, neste caso a derivatização é provocada com isocianato de fenilo em piridina, obtendo-se a 2,3,4,6-tetra-O-benzil-1-0-(N-feni1-carbomoi1)-D-galactopiranose 17 (Krozer e Schuerch, 1974, Carboh. Res. 33, 273).
As alfa-bromo-halogenoses protegidas por benzilo 19, 20 e 21 sao formadas por exemplo por tratamento com HBr em CH2C12 θ sao de modo conveniente utilizadas directamente sem qualquer purificação na reacçao de glicosilaçao que se segue após isolamento por métodos habituais, nomeadamente separaçao por filtraçao do ácido p-nitrobenzóico e do brometo de anilínio e da eliminação do HBr em excesso.
Os dadores de glicosilo protegidos por benzilo nao possuem agora qualquer substituinte em C-2, o que pode exercer uma influência directora sobre a glicosilaçao. A reacçao dos açucares bromados protegidos com grupos benzilo com a fosforamida ou com a ifosfamida é levada a efeito em diclorometano/trietilamina. Os rendimentos da reacçao dos compostos 16, e 18 para darem 22, 23 e 24 sao apresentados no Quadro 1, bem como a proporção de anómeros e o eluente utilizado para a cromatografia em coluna. A separaçao é feita, por exemplo, por
cromatografia em coluna.
QUADRO 1
Rendimento (%) Qp EE:EP
2_2 68 56:44 60 : 40
23 65 50 : 50 60:40
24 47 55:45 80:20
Na análise por HPLC é de notar a dependência muito pronunciada do tempo de retenção em função da concentração, bem como a forte arrastamento final (tailing) dos conjugados. A confirmação da estrutura e da estereoquimica é feita por meio de espectroscopia de H-NMR e de C-NMR.
Na preparaçao de quantidades superiores utili zou-se um procedimento no qual resulta de preferência um anómero por meio de uma síntese estereosselectiva, sendo possível deste modo dispensar uma purificação por HPLC.
Segundo Schmidt 1986, Angew. Chem. 98, 213, é possivel usar O-glicosiltricloracetimidatos protegidos por benzilo como dadores de glicosilo para sinteses estereoselectivas. A síntese dos tricloracetimidatos ê levada a efeito de acordo com métodos acordo com métodos descritos na literatura partindo dos tetra-O-benzilglicosidos 13, 14 e 15.
-se numa reacçao o B-imidato 25B, do-se o composto
Usando carbonato de potássio como base obtemcom controlo cinético a partir do composto 13 com NaH resulta uma anomerização rápida obten25 alfa termodinamicamente mais estável. De modo análogo obtém-se a partir do composto 14 o galactosil-imidato 26alfa e a partir do composto 15 o manosil-imidato 27alfa. Estes imidatos apresentam ao contrário dos benzilglicosidos activados por bromo a vantagem de uma estabilidade superior; são facilmenta isoláveis e conservam-se bem.
Deste modo fizeram-se reagir os imidatos sob diferentes condiçoes de reacçao com IMP 4b. Como solvente utili lizaram-se por exemplo diclorometano ou acetonitrilo, como ca talisadores por exemplo BFgéter dietílico ou HC1 em diclorometano .
A reacçao é levada a efeito mais rapidamente em CH3CN do que em CH2CI2· θ manosil-imidato 27alfa foi feito reagir com 4b dando selectivamente o manosido 24alfa.
Os grupos protectores dos glicosidos protegidos ser eliminadas por exemplo por hidrogenaçao catalítica com Pd/carvão activado à temperatura ambiente. 0 decurso da hidroge· naçao pode ser seguido por meio de cromatografia em camada fina, A detecção pode ser levada a efeito com efeito com ácido sulf4 rico metanólico, sendo no entanto mais sensível a detecção com reagente de 4-(p-nitrobenzi1)-piridina (NBP).
Após terminada a reacçao separou-se o catalisadorpor filtraçao, concentrou-se o filtrado à secura num evaporador rotativo e secou-se sob alto vácuo. Utilizando os glicosidos anómeros puros 22, 23 e 24 foram obtidos os correspondentes glicosidos 28, 29 e 30 igualmente sob a forma de anómeros puros (Fig.2).
Os conjugaos de fosforamida correspondentes bem como os conjugados dos derivados da fórmula açúcar - Ο
Podem
0-Ρ
O/NHCH2CH2CI 'xnhch2ch2ci
28α
Glc-O-IPM
29a
0-P ||^/NHCH2CH2CI
28g
Glc-B-IPM nhch2ch2ci iJHCH2CH2CI
29£
Gal-B-IPM
Gal-O-IPM
30a nhch2ch2ci
Man-o-IPM
Man-B-IPM
FIG. 2 Conjugados de glicosil-IPM diastereómeros nao protegidos em 6
2ieesaeH®sp=ESES^?íi2-‘’K2 —~
Hl
Nao se torna necessária uma purificação dos produtos que cristalizam sob a forma de óleos límpidos, incolores e muito viscosos. No entanto se se obtiverem na hidrogenaçao produtos secundários é possível separá-los por cromatografia em colunarápida através de gel de sílica (mistura acetonitrilo/metanol).
A análise por HPLC permite porção de anómeros no caso do glucosido 28 e o cálculo da prodo manosido 30.
QUADRO 2
Reacções dos tricloracetimidatos com IPM
M.P. Solv. Conds.Reacção Produto Rendimento
25o CH2C12 TA, 1 d 22 -
RF, 6 h 56% 1:6
CH3CN TA, 1 d baixo
RF, 5 h 42% 1:20
2 5^ CH2C12 RF, 4 h 51% 2 + 3
CH3CN RF, 5 h 45% 1:1.1
26tf CH2C12 TA, 4 h 23 -
RF, 8 h 48% 2:5
CH3CN RF, 6 h 42% 1 : 3
27cr CH2C12 TA, 4 h 24
RF, 4 h 48%
CH3CN RF, 6 h 47% apenas of
TA = temperatura ambiente
Foi possivel confirmar a identidade dos compos tos por FAM-MS e por espectroscopia de A configuração dos resíduos de açúcar foi ainda confirmada por reacçoes enzimáticas. Apresenta-se como exemplo na Fig. 3 o espectro de FAB (negativo) do composto Glc-^-IPM 28J±.
FIG. 3
Quando se usa glicerina como matriz tanto o espectro FAB negativo como o positivo dao informações essencial mente idênticas. Em todos os 6 compostos observam-se sinais dos iões de picos moleculares negativos (M-H)- ou dos ioes de picos moleculares positivos (M+H)+. Trata-se sempre de três picos numa proporção característica, um fenómeno que resulta do facto de a molécula conter 2 átomos de cloro e de o cloro na natureza nao ser, no entanto, um isótopo puro, ocorrendo pelo contrário numa proporção de ^^Cl: de 3 : 1, o que significa uma rela çao dos picos dos isótopos de cerca de 9:6:1. Deste modo encontraram-se para os ioes (M+H)+ os valores esperados de m/e 383, 385 e 387 e para (M-H)- de modo análogo os valores de m/e = 381, 383 e 385. Foi detectada nitidamente uma fragmentaçao característica, nomeadamente a da IPM nao glicosilada a alquila com os sinais de m/e = 221, 223 e 225 para (IPM+H)+, bem como para m/e = 219, 221 e 223 para (IPM-H)-; também neste caso se encontra a distribuição típica dos picos dos isótopos. Na Fig.
reconhecem-se distintamente os dois tripletos dos iões (M-H)- e (IPM-H)- de Glc-B-IPM 28B. Os sinais m/e = 91 e 183 referem-se à matriz de glicerina usada.
A coordenação da configuração no centro anómero pode ser conseguida por meio de 1H-NMR como para os materiais de partida protegidos por meio do acpoplamento típico do protão H-l e do respectivo deslocamento químico; este parâmetro é apresentado na Fig. 3.
. 0 isómero PM 4a de IPM reage com o 2,3,4,6-tetra-O-benzilo-D-glucopiranosido 19 e com o dador de manosilo correspondente 21 em diclorometano/trietilamina formando-se a 2,3,4,6-tetra-0-benzi1-D-glucopiranosi1-N,N-bis-(2-cloroetil)fosfodiamida 31 ou o 2-epimero 32 (Fig.4).
QUADRO 4
DESLOCAMENTO QUÍMICO E ACOPLAMENTO DO PROTÃO ANÓMERO DO CONJUGADO MONOSSACÁRIDO-IPM NÃO PROTEGIDO
J1 ,2 J1 ,P
28# 5.605 3,4 7,8
28p 5.004 8.0 8.0
29# 5.642 3.1 7.8
29p 4.950 8.0 8.0
30# 5.564 2.0 8.0
30JJ 5.282 1.1 8.6
O
H/N
O-P XCH2CH2CI XCH2CH2CI nh2
ι—1 *2
21 H OBn
3_2 OBn H
FIG.4 Glicosilação de PM 4a
Para a preparaçao dos conjugados glicosil-PM 5 ou 31 sao possíveis ainda outras vias de sintese, conforme se mostra na FIG.5.
POCI3
HN(CH2CH2CI)2HCI
CH2CH2CI
ABG
CI-P
CH2CH2CI
CI
34: R = Ac
13: R = Bn : R - Ac : R = Bn
0-P nh3
II
0-P
II N
II ^ci /CH2CH2CI
II N xch2ch2ci
CI ch2ch2ci ch2ch2ci nh2
CI
FIG. 5 dos, a partir
De modo análogo (Exemplo 1 e 2) foram obtidas hepta-O-benzilglicoses 43 e 44
Rl R2
43 OBn H
44 H OBn
os conjugados de dissacárido-IPM 50 e 51.
Quadro 4 apresenta os dados de Th-NMR dos conjugados de dissacárido nao protegidos.
J 1,2 J 1,P J 1 ’ , 2 '
50<X 5.623 3.6 7.8 4.478 8.0
5op 5. o49 8.0 8.0 4.473 8.0
51<X 5.622 3.6 7.8 4.537 7.9
5_lg. 5.044 8.0 8.0 4.532 8.0
Também neste caso se confirmou a identidade de todos os quatro compostos diastereomeros por meio de 2D-NMR-COSY. As Figs. 6a e 6b mostram o espectro 2D dos conjugados de celobiose-IPM nao protegidos 5lalfa e 51B.
H-1*
-: 1 : — : : 1— : : 1 ; —
5 5, i 5, 2 5.0 '.3 1. á 4,-1 i, > 4.2 3.5 3. ô 3.1
FIG. 6a Espectro de 1H-1H-2D-NMR a 500 MHz do conjugado de celobiose 51<y
Η-1
Η-1
J.À
L 3.4
L 3.6
L 3.6
- 4.2
L 4.6
F[ s <»
L 4.6
5.0
L 5.2
L S. J
L 5.6
5.2 S.0 4.6 4.5
4.2 4.0 3.5 3.ο 3.4
FIG. 6b Espectro de ^-H--'H-2D-NMR a 500 MHz do conjugado de celobiose 51ft
-¾. q. ~
'.tóSWjpaw
Também neste caso a estrutura do resíuo de açúcar foi confirmada por reacçoesenzimáticas como lactose e celobiose respectivamente.
Na preparaçao dosconjugados de IPM contendo dissacáridos acoplados a utilização dedissacáridos de ocorrência natural como a lactose ou a celobiose como material de partida tem a vantagem sobre uma preparaçao de conjugados de monoaçucares de a ligaçao glicosidica entre os açucares ser pré-existente e deste modo ser possível evitar uma fase de síntese estereoselectiva. Em consequência, o processo de síntese anteriormente descrito foi também utilizado para a preparaçao dos conjugados de IPM com dissacáridos conjugados. Para este fim, em primeiro lugar utilizou-se um dissacárido protegido por benzilo cuja posição 1-0 pode ser activada quer por meio de brometo de hidroto de hidrogénio quer de tricloroacetonitrilo. Deste modo sintetizaram-se a partir de lactose e de celobiose com o auxilio do processo de S. Koto (Koto et al., 1982, Nihon-Kagakkai: Nihon-Kagaku-Kaishi (J. Chem. Soc. Jpn.) 10,1651) os dissacaridos componentes 2,3,6-21,3',4'6'-hepta-o-benzil-lactose e o isómero derivado da celobiose 44 (Fig. 7).
FIG.
OH
Alilo <Alilo
OBn
Ri R2
43 OBn H
44 H OBn
CH2OAc
Por incubaçao dos glicosidos em HEPES ou em água com as glicosidases correspondentes foi possível observar a cisão rápida da ligaçao glicosídica.
Verificou-se gue os conjugados Lac-IPM 50 e Cel-IPM 51 sao estáveis em solução metanólica à temperatura ambiente bemcomo os conjugados com monossacáridos 28 a 30 (análise por cromatografia em camada fina). Uma vez gue existem em cada um compostos 50 e 51 duas ligações glicosidicas, gue apresentam umaconfiguraçao igual ( 5lP ) ou diferente (por exemplo 50alfa), utilizaram-se para o ensaio da libertação enzimática de IPM para além de glicosidases também misturas de enzimas.
A cisão enzimática dos conjugados anómeros puros 50 e 51 foi seguida por cromatografia em camada fina; detectaram-se com NBP quer os conjugados intactos quer os produtos de cisão 28alfa,
28^ ou IPM.
Por meio das glicosidases correspondentes cindiram-se todos os conjugados rapidamente e foi possível libertar por exemplo os metabolitos da fórmula geral 1 ou la.
Nos conjugados de dissacáridos 50 e 5lalfa para a libertação de IPM era necessária a cisão de duas ligações glicosidicas diferentes. Apenas para 5lp, que apresenta duas ligações de configuração semelhante, foi possível efectuar a cisãointegral por meio de uma única enzima, nomeadamente a J3-glucosidade.
Este facto foi confirmado por meio da medida da actividade biológica, nomeadamente da actividade citotóxica in vitro por investigação com um sarcoma de Retothel do rato e comlinhas de células de tumores da mama do rato bem como com linhas de células Eb/ESb.
Foram levadas a efeito investigações in vivo com a leucemia P388 do rato e com o tumor 1C32 da ratazana. Os resultados dos ensaios in vitro e in vivo encontram-se reunidos nas Figs. 8 a 13.
Células / ml
FIG. 8 : Proliferação da cultura RES com uma incubação demorada com 28 CK (a) θ 28 Jí—(b)
Proliferação em % do controle Proliferação em % do controlo
Tempo ( d )
FIG. 9 : Proliferação das culturas de células de tumores da mama
1C26 (a), 1C(32) (b) e 1C39 (c) após 2 h de incubaçao com conjugados de monossacáridos com IPM 28 a 30 8.10_^ M.
Proliferação em % do contacto
j - 5
Tempo ( d )
FIG. 10: Proliferação das linhas de células de tumores da mama
1C32 após 2 h de incubação com os conjugados de dissacáridos com IPM (8.10-^ M) 50 e 51
Proliferação em % do controlo Proliferação em % do controlo
Tempo ( d )
FIG. 11 : Dependencia da proliferação de Eb ('a' e ’b’) e de Esb('c' e ’d') do tempo de incubação; a incubação foi efectuada com Gal-of-IPM ('a' e 'b') e com Gal-^β-ΙΡΜ em ambos os casos a 8.10-^ M
- 27 35-|
tn tu •P c
ω >
•rd >
(D
P
Λ o
tn
20 15 10 (o) 2
Controlo 240 mg/kg 120 mg/kg 60 mg/kg π I j 1-;--—
5 10 15 20 25 30
Tempo ( d ) ,'Ηλ tn tu
-P c
QJ >
•rd >
QJ
P n
o tn
1510 Controlo
240 mg/kg 120 mg/kg 60 mc/kg 30 mg/kg \ j i ; i ; i !
5 10 15 20 25 30 35
Tempo ( d )
FIG. 12: Tempo de sobrevivência dos ratos fêmeas (a) e machos (b) tratados com Glc-^-IPM, esquema de tratamento dose 5.1 o.a. nos dias 1 a 5, resultados de um estudo NCI.
•521'^. VWU3>w i^^agàBaaa ’20 -i
σ)
b)
Volume relativo do tumor
3/·' Z
13O
Li
-P
C
O υ
o
Ό ε
tu ; !-ô:':?„7fnol/Ug !□ 5.2<:0_-noi/<c contraio 1.6'10
3.2'10
40·
3 5 7 3 11 13 '5
Tempo ( d ) \ ' \
k I \
\
13 15
Tempo ( d )
FIG. 13 Crescimento dos tumores transplantados sob terapia com
Gal-IPM (dose 5.1); a) aumento do volume dos tumores,
b) volume dos tumores em % do grupo de comparação.
As medições de toxicidade mostraram que na administração i.p. de 100 mg/kg e de 1000 mg/kg de Glc-^-IPM em ratos CD2F^ machos nao se observou qualquer toxicidade agudc A seccao dos animais após 28 dias nao forneceu qualquer diagnóstico. Também em ratazanas BD6 com tumores 1C32 transplantados que foram tratados com Gal-IPM (5 a 122,5 e 5 a 245 mg/kg) nao foi possível observar qualquer sintoma de toxicidade. Os resultados de secções (entre outras do fígado, dos rins, do baço, do cérebro e da medula óssea) no 15Q dia após o início do tratamento nao forneceu qualquer resultado positivo.
Sumariamente verificou-se pois que em investigações in vitro com um sarcoma de Retothel se demonstra a citotoxidade de PM e de IPM nao glicosiladas como também dos conjugados de monossacáridos com IPM da fórmula geral 1 e la e ainde dos conjugados de dissacáridos da fórmula 1 e la. Nos ensaiosin vitro verificou-se uma diferenciação nítida com as linhas de células de tumor da mama 1C29, 1C32 e 1C39, enquanto que o conjugado Gel-J3-IPM é sempre a substância mais activa. Também nas investigações in vivo se determinou uma boa activida de no modelo P388 e no tumor sólido da mama 1C32, em qualquer caso semtoxicidade aquda. Para além disso também a toxicidade sobre a medula óssea, estudada por exemplo com Glc-B-IPM é muit reduzida, preenchendo assim uma exigência do desenvolvimento de novas substâncias quimioterapêuticas com acçao antineoplássica.
Os Exemplos que se seguem elucidam em pormenor a preparaçao de diferentes compostos a título exemplificat ivo.
EXEMPLO 1
Procedimento geral para a preparaçao das glicosil-fosfodiamidas protegidas por benzilo.
Procedimento A: Activaçao por brometo de hidrogénio
-Ί
Disselveram-se 4,35 mmol de p-nitrobenzilgli-cose protegida de modo conhecido (p. ex. 3,0 g de 16) ou do derivado de N-fenilcarbamoilo 17 após secagem sobre P2O5 em 10 ml de CH2CI2 absoluto (num balao de três tubuladuras). Adicionaram-se lentamente a -202C sob atmosfera de azoto 30 ml de uma solução saturada de HBr em CH2CI2· Após aquecimento até à TA (temperatura ambiente) (durante um período de 30 min) agitou-se ainda 1 h à TA e em seguida filtrou-se para um segundo balão de três tubuladuras através de um filtro em linha de placa porosa. Após eliminação do CH2CI2 por evaporaçao (agitação com uma barra magnética, vácuo de trompa de água, banho de água,
TA) adicionaram-se ainda por duas vezes 5 ml de éter dietílico e evaporou-se à secura após cada adiçao como anteriormente a fim de eliminar os resíduos de HBr. Em seguida dissolveu-se o óleo amarelo a alaranjado obtido em 20 ml de CH2CI2 e adicionoú-se 1,0 g de 4a ou 4b ou 54 (4,6 mmol) e 0,85 ml de trietilamina (6mmol). Após 3 dias de agitaçao à TA filtrou-se, lavou-se 2 x com pequena quantidade água, secou-se a fase orgânica sobre Na2SO4 e evaporou-se à secura num evaporador rotativo.
Em seguida fez-se passar o óleo amarelado altamente viscoso atreves de uma coluna de cromatografia e obtiveram-se separadamente os anómeros sob forma concentrada nas fracções da cabeça e da cauda. É possivel conseguir uma puriicaçao dos anómeros em todos os casos por meio de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e frequentemente por cristalização.
Todas as fases de trabalho foram levadas a efeitoem atmosfera de azoto com solventes secos e ao abrigo da luz.
Procedimento B: Reacçao das fosfodiamidas com glicosilimidatos
Dissolveu-se 1,0 mmol de um glicosilimidato (p. ex. 25) em 20 ml de acetonitrilo. Após adição de 1,0 mmol de fosfodiamida aqueceu-se durante 6 h sob refluxo (ao abrigo da luz). Após filtraçao e evaporaçao num evaporador rotativo purificou-se através de gel de sílica de modo conhecido.
Procedimento C: Cisão dos grupos protectores benzilo
Dissolveu-se 0,1 mmol de um dos derivados de monossacáridos protegidos por benzilo 22, 23, 24 ou 55 ou de um dos conjugados de dissacáridos 48 ou 49 em 15 ml de MeOH. Após adição de cerca de 5 mg de Pd/carvão activo (forma oxidada, conteúdo de Pd 10 % por cada 0,1 mval de grupos benzilo a cindir (isto é, p. ex. 20 mg de catalisador por cada 0,1 mmol de 22 e 23 mg por cada 0,1 mmol de 48), procedeu-se à hidrogenaçao à TA até se ter verificado por análise de cromatografia em camada fina a cisão de todos os grupos benzilo (após 1 a 4 h). Interrompendo imediatamente a hidrogenação, obteve-se o produto sem grupos protectores em solução sob forma ácida após filtraçao e evaporação em evaporaçao rotativo. Se se deixasse continuar a reacçao durante um período mais longo do que o necessário ocorreria a decomposição do glicosido não protegido com formação de IPM 4b. Neste caso foi possível isolar o produto pretendido após cromatografia em coluna (cal de silica, CH3CN:Me0H = 70:30).
CCF.
Gel de sílica, ch3cn :MeOH 30: 70, Rf
Rf ( 4b) --
Gel de sílica, CH.jCN :MeOH: h2o = 75:20
Valores de Rf 0.44 (28o), 0.48 (28B)
0.43 (29o), 0.45 (29B)
0.43 (30o), 0.41 (30B)
0.29 (50 e 51) , 0.13 (
0.18 = 0,58,
Para a detecção pulverizou-se com reagente de NBP (a 2,5 % em acetona, aqueceu-se duranta 10 min a 12O2C e após arrefecimento à TA pulverizou-se com NaOH 0,5 M. Os conjugados de IPM adquirem uma coloraçao azul escuro, enquanto que a IPM livre aparece com uma cor azul clara.
A mistura de fosforamida e a mustarda de ifos32 famoda foram preparadas de acordo com procedimentos conhecidos da literatura.
Conjugados monossacáridos-PM/IPM (de modo análogo a 6)
Matérias primas: 0,55 g de 4 a (2,5 mmol) (N,N-di-(2-cloroetil) -fosfodiamida)
1,03 g de ABG (2,5 mmol)
Rendimento: 30 mg de 5 sob a forma de um óleo amarelado límpido (2,2 % do teórico), mistura de diastereómeros (A+B, ver espectro de NMR)
Análise C18H29C12N2°11P (551,3)
C calo. 39,24 determ. 39,53
H
5,30
5,38
N
5,08
4,94 com D2°' -NH2), 3,35-3,70 (m, 8H, 2x -CH2CH2C1),3.g2 (m,lH,H-5) 4.148 (dd, H-6a(A), Js,6a=5·0 Hz' J6a,5b=12·5 Hz)< 4.208 (dd, H-6a(B), Js,6a=4.9 Hz, J6a,6b=12·5 Hz), 4.244 (dd, H-6b(A), J5f6b=2.1 Hz, J6a,6b=12·5 Hz)- 4.288 (dd, H-6b(B), J5,6b=2·! Hz, J6a,6b=12·5 Hz), 5.02-5.12 (m, 2H), 5.21 e 5.23 (2t junto com IH, (B+A), J = 9.5 Hz), 5.298 e 5.316 (2t, junto com IH, H-l(A) e H-l(B), J].,2Jl,p=7-8 Hz)· m/e = 331 (M-PM)
2,3,4,6-Tetra-0-acetil-B-D-glucopiranosil-N,N'-di-(2-cloroetil) fosfodiamida 6
A uma mistura de 1,1 g de 4b (5 mmol) e 2,05 g de acetobroglucose (5 mmol) em 50 ml de acetona seca adicionaram-se gota a gota 0,5 g de trietilamina (5 mmol).
Agitou-se durante 48 h ao abrigo da luz à TA. Após filtração e evaporaçao em evaporador rotativo retomou-se o resíduo em CH2 -CI2/ lavou-se com uma pequena quantidade de HC1 0,1 M, con solução saturada de NaHC03 e com água, secou-se sobre Na2S04 e cromatografou-se através de gel de sílica (acetona:n-hexano = 40:60). Obtiveram-se 80 mg de J5 (2,9 % do teórico) sob a forma de um óleo límpido e incolor que cristalizou após meses a +42C.
P.f.: 9lQC
CCF: Gel de sílica, acetona:n-hexano = 1:1, Rf=0,l3
Análise
C H N Cl
C flH Cl N 0 P 18 29 2 2 ll Calc . 39,24 5,30 5,08 12,87
(551,3) determ. 39,42 5,40 4,80 12,58
Penta-0-pivaloil-g-D-glucose 7 (de acordo com Kunz e Harreus, 1982) Liebigs Ann Chem 41
Matérias Primas:
g de D-glucose (0,16 mol) 121,2 g de cloreto de pivaloílo (1,0 mol)
200 ml de clorofórmio, 120 ml de Piridina
Rendimento: 66 g de 7 (69 % do teórico) P.f.: 154SC (lit.: 156-158^0)
Analise
C71H 0 31 52 n (600,8) calc.
determ.
C
61,98
62,16
H
8,72
8,79
Brometo de 2,3,4,6-tetra-O-pivaloi 1-of-D-glucopiranosilo 8 (de acordo com Kunz e Harreus, 1982) Liebigs Ann. Chem.41
Matérias Primas: 12 g de 7 (20 mmol) ml de HBr em ácido acético glacial (33 %) ml de diclorometano
Rendimento: 6,4 g de 8 (55,5 % do teórico)
P.f
1422C
Análise
C7fiH BrO 26 43 9 (579,5)
C H
calc. 53,89 7,48
determ. 54,24 7,94
J2,3=9-5 Hz), 5.21 e 5.64 H-3),6.62 (d, 1H, H-1,J1>2=4.2 (2t,
Hz) .
2H, J
9.5 Hz,H-4
2,3,4,6-Tetra-O-pivaloí -D-glucopiranosi1-N,N-di-(2-clor oe til )-fosfodi amida _9
A uma mistura de 0,38 g de 4b (1,725 mmol) 1,0 g de 8 (1,725 mmol) em 50 ml de acetona adicionaram-se 0,5g de Ag2CO3 à TA. Após 24 h de agitaçao (ao abrigo da luz) à TA, filtrou-se, concentrou-se e cromatografou-se através de gel de sílica (acetona:n-hexano = 25:75). Obtiveram-se 160 mg de (12,9 % do teórico) sob a forma de um óleo límpido e incoloor que cristalizou após meses a +42C.
P.f.: 942C —ή Γ-
CCF: Gel de sílica, acetona:n-hexano = 1:1, Rf=0,43
Análise
C H N Cl
c30H54cl2N2°2p •calc. 50,08 7,42 3,89 9,86
(719,54) deter.51,35 7,98 3,24 9,36
Metil-2,3,4,6-tetra-0-benzil-or-D-qlucopiranosido 10 (de acordo com Methods in Carbohydrate Chemistry,
1972 )
Matérias Primas: 50 g de metil-o-D-glucopiranosido (257 mmol)
250 g de KOH (em pó)
150 ml de dioxano
318 ml de cloreto de benzilo (2,76 mol)
Rendimento: 116 g de 10 (81,3 % do teórico) sob a forma de um óleo muito viscoso, amarelo e límpido
Análise C35H38°6 (554,68)
C calc. 75,79 determ. 76,19
H
6,91
6,93
Metil-2,3,4,6-tetra-0-benzil-o-D-qalactopiranosido 11 (de modo análogo a 10)
Matérias Primas: 40 g de metil-a-D-galactopiranosido (206 mmol)
200 g de KOH, em pó
200 ml de dioxano
280 ml de cloreto de benzilo
Rendimento: 102 g de 11 (89,3 % do teórico) sob a for ma de um óleo amarelo e límpido
Análise
CocH 0 calc. 75,79 6,91
38 6 (554,68) determ. 76,07 6,67
Metil-2,3,4,6-tetra-O-benzil-or-D-manopiranosido 12 (de acoido com Koto et al., 1976)
Matérias Primas: 18 g de metil-or^D-manopiranosido (92,7 mmol) g de NaH em suspensão (a 20 %) 450 ml de cloreto de benzilo
Rendimento bruto: Segundo o processo de Wasch formam-se duas fases. Após separaçao da fase superior incolor (óleo branco) obtêm-se 52 g de um óleo amarelo ligeiramente turvo, o qual é utilizado para a reacção de transformaçao em 15 sem qualquer purificação adicional.
Uma parte do óleo foi cromatografada (gel de sílica, éter etílico:éter de petróleo = 40:60): óleo amarelo límpido .
J-H-NMR: 90 MHz, CDCI3 = 3.31 (s, 3H, - OMe), 3.65-4.15 (m, 6H, Zuckerprotonen) ,
4.43-5.10 (m, 9H, H-l e 4x-CH2-Ph), 7.1-7.45 (m,20H, 4x-Ph).
2,3,4,6-Tetra-O-benzi 1-çy-D-glucopiranose 13 (Segundo Methods in Carbohydrate Chemistry, 1982)
Matéria Prima:
Rendimento: 54
Análise c34H36°6 Cale.
(540,66) determ.
115 g de 10 (207 mmol) g de 13 (48,3 % do teorico)
C H
75,53 6,71
75,69 6,91
2,3,4,6-Tetra-O-benzil-cr-D-galactopiranose 14 (de acordo com Kronzer e Schuerch, 1974) Carboh. Res. 33, 273
Matérias Primas: 30 g de 11 (54 mmol)
500 g de ácido acético (a 80 %) 150 ml de HC1 1 N
Rendimento: 28,6 g de 14 (98 % do teórico) sob a forma de um óleo amarelo e límpido
4-H-NMR: 90 MHz, CDCI3 ó = 3,47 (d,lH, permutável com D20, -OH), 3.5-4.3 (m,6H, protoes do açúcar), 4.35-5.05 (m, 8H, 4x-CH2-Ph), 5.28 (dd, 1H, Η-1,Jx,2 =3·2Hz), 7.1-7,5 (m,20H, 4x-Ph).
2,3,4,6-Tetra-O-benzil-D-manopiranose 15
Dissolveram-se 50 g da mistura 12 (cerca de 90 mmol, contendo ainda algum óleo branco) em 800 ml de ácido acético glacial e aqueceu-se a uma temperatura de 80 a 85-C. Num período de 60 min adicionaram-se gota a gota 120 ml de HC1 2 N: após outros 90 min adicionaram-se 200 ml de água, arrefeceu-se a mistura reaccional à TA e em seguida extraiu-se com 3200 ml de tolueno. Lavou-se a fase orgânica com solu çao saturada de NaHCOg e com água, secou-se sobre Na2SO4 e evaporou-se à secura num evaporador rotativo. Cromatografou38
-se o xarope castanho obtido (gel de sílica, éter etílico: éter de petróleo - 30:7o) e obtiveram-se 33,2 g de 15 (68,3 % do teórico) sob a forma de um óleo amarelo.
1H-NMR: 90 MHz, CDC13 £ = 3,5-4,3 (m,7H,lH, permutável com D2O, -OH e 6 protoes),4.35-5.05 (m. 8H, 4x-CH2_Pb), 5.22 (d, ÍH, H-l, Ji,2~2 Hz), 7.05-7,4 (m, 20H, 4x-Ph).
2,3,4,6-Tetra-0-benzil-l-0-p-nitrobenzoí1-D-glucopiranose 16 (de acordo com Methods in Carbonydrate Chemistry, 1972)
Matérias Primas: 15,5 g de 13 (28,7 mmol) g de cloreto de p-nitrobenzilo (32,3 mmo1)
3,75 ml de piridina
Rendimento: 15,6 g de 16 (78,8 % do teórico) sob a forma de um pó branco
P.f.: 93-98-C (a partir do etanol)
Por nova recristalização a partir do éter diisopropilico obteve-se I6q em seguida.
P.f. : 1222C
Análise c41H3gN0g calc.
(689,76) determ
C Η N
71,39 5,70 2,03
71,37 5,67 2,04
A partir das águas maes cristalizou 16^, p.f
98QC
2,3,4,6-Tetra-0-benzi1-1-0 -(N-fenilcarbamoil)-D-galactopiranose 17
(de acordo com Kronzer e Schuerch, 1974) Carboh. Res. 33, 273
Matérias Primas: 18,7 g de 14 (34,6 mmol)
5,4 ml de piridina
5,4 ml de isocianato de fenilo
Rendimento: 8,0 g de 17 (35 % do teórico) / (or-p =
=35:65)
P.f.: 12O-122QC (a partir do etanol)
Análise C H N
C41H41NO7 calc. 74,64 6,26 2,12
(689,76) determ. 74,21 5,97 2,36
A partir das águas maes cristalizou I7or,
143QC
2,3,4,6-Tetra-0-benzil-l-0-p-nitrobenzoil-ty-D-manopiranose 18 (de acordo com Koto et al-, 1976) Buli. Chem. Soc. Kpn. 49, 2639
Matérias Primas: 9,8 g de 15 (18,1 mmol)
4,9 g de cloreto de p-nitrobenzoílo ml de piridina
Rendimento: Após cromatografia relâmpago (gel de sílica 60, éter etílico+ éter de petróleo= =25:75) cristalizaram 7,7 g de 18 (61,7% do teórico), a partir de éter diisopropílico
P.f.: 1O59C
Análise C H N
C41H39NO9 calc. 71,39 5,70 2,03
(689,76) determ. 71,46 5,58 1,90
2,3,4,6-Tetra-O-benzil-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 22
1.) de acordo com o Procedimento A
Matérias Primas
3,0 g de 16 (4,35 mmol) 1,0 g de 4b (4,6 mmol)
Rendimento: Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter etílico: éter de petróleo = 60:40) 2,2 g de 22 (68 % do teórico) mistura de anómeros = 5:4 (1-H-NMR) .
Cromatografia em camada fina: gel de sílica, éter etílico: éter de petróleo = 60:40, Rf = 0,28, Rf (o) Rf(/3)
HPLC analítica: gel de sílica, éter etílico:hexano = 75:25, caudal 1,0 ml/min, Rt (cr) - 12,53', Rt(j3) = 14,04
HPLC preparativa: gel de sílica, éter etílico:hexano:MeOH ~
52:42:0,5, caudal 10,0 ml/min, Rt(cr) = 45', Rt(JB) = 55'
Análise C38H45C12N2°7 p (743,60)
C H N Cl
calc. 61,38 6,10 3,77 9,54
determ. 61,15 6,22 3,78 9,61 22»
determ. 60,82 6,29 3,61 9,37 22β
1.) de acordo com o Procedimento B
Matérias Primas: 4,5 g de 25« (6,57 mmol)
1,45 g de 4b (6,57 mmol)
Rendimento: Após cromatigrafia em coluna (ver aci ma): 2,06 g de 22 (42,2 % do teórico), proporção entre os anómeros a:fi ~ 1:20 (de acordo com PH-NMR e HPLC).
Mistura reaccional: 50 mg de 25^ (0,073 mmol)
16,1 mg de 4b (0,073 mmol)
Por cromatografia em camada fina detecta-se o produto com um Rf=0,28 e uma pequena quantidade de tetrabenzilglucose 13 bem como uma pequena quantidade do material de partida 25ft, propor ção entre os anómeros ar-Jl = 1:1,1 (HPLC)
2,3,4,6-Tetra-O-benzi1-D-qalactopiranosi1-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 23
1.) de acordo com o Procedimento A
Matérias Primas: 2,6 g de 17 (3,94 mmol)
0,9 g de 4b (4,07 mmol)
Rendimento: Após cromatogrfia em coluna (gel de sílica, éter etilico:éter de petróleo = 60,40) 1,9 g de 23 (65 % do teórico) mistura de anómeros Qc.p = 1:1 (J-H-NMR) Cromatografia em camada fina: gel de sílica, éter etílico:
éter de petróleo = 60:40, Rf - Ό,2.Ί, Rf (o) > Rf(^)
HPLC analítica: gel de silica, éter etilico:hexano = 75:25, caudal 1,0 ml/min, Rt(cr) = 14,26', Rt(^) 18,03'
HPLC preparativa: gel de silica, éter etílico:hexano: MeOH =
58:42:0 ,5, Rt(or) = 51 ' , Rt(J3) = 62 '
Análise C H N Cl
C38H45CI2N2O7 P calc. 61,38 6,10 3,77 9,54
(743,60) determ. 61,26 6,19 3,76 9,76 23o
determ. 61,16 6,26 3,76 9,66 23B
1.) de acordo com o Procedimento B
Matérias Primas:
685 mg de 26« (1,0 mmol)
2215mg de 4b (1,0 mmol)
Rendimento: Na mistura reaccional filtrada a proporção entre os anómeros = 55:
:45 (HPLC). Após cromatografia em coluna (ver acima) obtiveram-se 260 mg de 23 (38 % do teórico).
2,3,4,6-Tetra -O-benzil-D-manopiranosil-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 24
1.) de acordo com o Procedimento A
Matérias Primas: 2,3 g de 18 (3,33 mmol)
0,75 g de 4b (3,39 mmol)
Rendimento: Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter etílico: éter de petróleo = 80:20) 1,16 g de 24 (47 % do teórico) mistura de anómeros or.Ji = 55:45 (iH-NMR).
CCF (Cromatografia em camada fina): gel de sílica, éter etílico:éter de petróleo = 60:40, Rf(«) = 0,23, Rf (p) = 0,19
HPLC analítica: gel de sílica, éter etílico:hexano = 75:25, caudal 1,0 ml/min, Rt(«) = 13,05', Rt(J3) 21,61
HPLC preparativa: gel de sílica, éter etílico:hexano:MeOH =
64:36:0,5, caudal 10,0 ml/min, Rt(«) = 45', Rt(JJ) - 70'
Análise C H N
C38H45C12N2°7 P calc. 61,38 6,10 3,77
(743,60) determ. 60,98 6,32 3,52 24o
determ. 60,98 6,19 3,29 24g
/1 o
1.) de acordo com o Procedimento B
Matérias Primas: 3,2 g de 27o< (4,67 mmol)
1,04 g de 4b (4,70 mmol)
Rendimento: Por cromatografia em camada fina verifica-se uma transformação quase quantitativa em 24<y com um Rf = 0,23. Na mistura reaccional filtrada encontra-se apenas o anómero o (HPLC). Após cromatigrafia em coluna obtiveram-se 1,6 g de 14ty (45 % do teórico) .
0-(2,3,4,6-Tetra-O-benzil-of-D-qlucopiranosil )-tricloroacetimidato 2 5<χ ( de acordo com Schmidt e Stumpp, 1983) Liebigs Ann. Chem., 1249
Matérias Primas: 9,2 g de 13 (17 mmol)
7,7 ml de tricloroacetonitrilo 680 mg de NaH
Rendimento: 10,9 g de 25oç (93,6 % do teórico), óleo incolor límpido
CCF: Gel de sílica, éter de petróleo: éter = 1:1, Rf = o,44 1H-NMR: 90 MHz, CDCI3.
ύ = 3.6-5.1 (m, 14H), 6.51 (d, 1H,H-1, J1í2=3.5 Hz) 6.95-7.55 (m,20H, 4x -Ph), 8.55 (s, IH, -NH-).
0-(2,3,4,6-Tetra-0-benzil-J3-D-qlucopiranosil)-tricloroacetimidato 25^Ρ ( de acordo com Schmidt et al., 1984) Liebigs Ann. Chem., 680
Matérias Primast 1,3 g de 13 (2,4 mmol)
1,25 g de K2CO3 (seco)
1,25 ml de tricloroacetonitrilo
Rendimento : após filtração através de gel de silica: óleo ligeiramente amarelado (1,6 g, 97 % do teórico, o:B = 1:5); após cromatografia em coluna de gel de silica, éter:éter de petróleo =2:3) obteve-se 25B puro sob a forma de um óleo incolor (50 mg, 30 % do teórico)
CCF: Gel de silica, éter de petróleo : éter =1 : 1, Rf = 0,37 iH-NMR 90 MHz, CDC1 = 3.55-3.90 (m, 6H), 4.40-5.05 (m,8H), 5.82 (d,
1H, H-l), 7.1-7.5 (m,20H, 4x-ph), 8.70 (s,lH,-NH-).
0-(2,3,4,6-Tetra-0-benzil-D-galactopiranosil)-tricloroacetímida to 26 (de acordo com Schmidt et al., 1984) Liebigs Ann. Chem.,1343)
Matérias Primas : 1,5 g de 14 (2,77 mmol)
1,4 ml de tricloroacetonitrilo 80 mg de NaH
Rendimento : após filtraçao através de gel de sil_i ca determinou-se uma proporção entre os anómeros de c^:JB = 4:1 (^H-NMR:
MHz, CDCI3, Nr.H14208, ,§ =5,72 (d, 0,2H, Hl (ρ), Ίΐ,2=θθ Hz)< 6,52 (d, 0,8 H, H-l (a), Jl,2=3'7 Hz)8,51 (s, 0,8H, -NH- (<χ) , permutável com D20), 8,60 (s, 0,2H, -NH- (p) , permutável com D2O).
Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter:éter de petróleo = 1:1) · obtiveram-se duas fracçoes:
Fl: 1130 mg de 26cx (59,5 % do teórico) sob a forma de um óleo incolor ^H-NMR: 500 MHz, CDC13, Nr. H14112
F2: 320 mg de 26 (16,8 % do teórico) sob a forma de um óleo amarelado =
2:1) J-H-NMR: 500 MHz, CDCI3, Nr. H14113
CCF: Gel de sílica, éter de petróleo: éter - 1:1, Rf (or) = 0,43, Rf (p) = 0,34
0-(2,3,4,6-Tetra-O-benzi 1-Qf-P-manopiranosi 1 )-tricloroacetimidato 27« (de acord° com Schmidt et al., 1984) Liebigs Ann. Chem., 1343
Matérias Primas: 4,5 g de 15 (8,27 mmol) ml de tricloroacetonitrilo 45 mg de NaH
Rendimento: após cromatografia em coluna: 4,45 g de 27ot (65 % do teórico) sob a forma de um óleo incolor
CCF: Gel de sílica, eter:éter de petróleo = 3:2, Rf = 0,51 1H-NMR: 90 MHz, CDCI3 = 3.65-5.0 (m, 14H), 6.33 (d, 1H, H-l, Jj.,2-1'5 âHz), 7.0-7.5 (m,20H,4x-Ph), 8.52 (s, 1H, -NH-).
Ot-D-Blucopiranosil-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodi amida 28cy
Hidrogenaçao de 22« de acordo com o Procedimento C
1H-NMR:
500 MHz, D20, Nr. 13943
<§ = 3.25-3.32 (m, 4H, 2x -CH2-) , 3.488 (t, 1H, J = 9.5
Hz) , 3.61-3.67 (m, 5H com 2x-CH2) , 3.719 (t,lH, J~9.5
Hz) , 3.75-3.90 (m,3H ) , 5. 605 (dd, 1H,H-1,Jlz2=3 .4 Hz,
Jl,p =7,8 Hz).
FAB-MS:
Nr. MSN 13608 positivo:
m/e = 383, 385, 387 221, 223, 225 (M+H)+ (IPM+H)+
JB-D-Glucopiranosil-N,Nl-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 28fi Hidrogenaçao de 22^3 de acordo com o Procedimento C
Análise C1OH21C12N2° > p cale. 31,35 5,35 7,31 (383,10) determ. 31,03 5,04 6,82
C(-D-Galactopiranosil-N ,Nl-di-(2-cloroetil)-fosfodi amida 29tX
Hidrogenaçao de 23pc de acordo com o Procedimento C 1H-NMR: 500 MHz, D20, Nr. 13945 <5 = 3.26-3.32 (m, 4H, 2x -CH2-), 3.635-3.665 (m,4H, 2-CH2-),, 3.74-4.05 (m, 5H), 4.098 (m, 1H), 5.642 (dd, 1H, H-l, J1í2=3.1 Hz, JlfP=7.8 Hz).
FAB-MS: Nr. MSN 13612 positivo m/e = 383
221,223, 225 219,221, 223 (M+H)+ (IPM+H)+ (IPM-H)-D-Galactopiranosil-Ν,Ν ' -di- ( 2-cloroetil)-fosfodiamida 29/}
Hidrogenaçao de 23 3 de acordo com o Procedimento C 1H-NMR
500 MHz, D2O, = 3.26-3.32 3.63-3.67 (m, J=1O.O Hz), 3
Nr. 13946 (m, 4H, 2x -CH2-), 3.605 (d, 1H), 4H, 2x -CH2-), 3.692 (dd, 1H, J=3.5 .70-3.95 (m, 4H), 4.950 (t, 1H, H-l,
Ji,p= 8.0 Hz).
FAB-MS
Nr. MSN 13613 negativo m/e = 381,383, 385 219,221, 223 (M-H)- (IPM-H)cx-D-Manopiranosi 1-N ,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodi amida 30oc
Hidrogenação de 24<y de acordo com o Procedimento C !h-NMR
FAB-MS
500 MHz,D20, Nr.13947
<3 = 3.26-3.32 (m, 4H, 2x -CH2-),3. 5-4.0 (m, 9H mi t
4H bei 3.63-3.67, 2x -CH2-), 4.018 (dd, 1H), 5. . 564
(dd, 1H, H-l, Jlz 2=2.0 Hz,Jlzp=8.0 Hz) .
Nr. 13614
negativo m/e - 381, 383, 385 (M-H)-
219, 221, 223 (IPM-H)-
0-D-Manopiranosil-N,Ν'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 30/3
Hidrogenação de 24/3 de acordo com o Procedimento C !h-NMR: 500 MHz,D20, Nr. 13948 ê = 3.26-3.33 (m, 4H, 2x -CH2), 3.45 (m, 1H, H-5), 3.604 (t, lH,H-4, J3,4=J4,5=9.8 Hz), 3.63-3.67 (m, 4H, 2x -CH2-), 3,703 (dd,lH,H-3, J2z3=3.2 Hz, J3;4 =
9.8 Hz), 3.754 (dd, 1H, H-6a, J5,6a=5·2 Hz , 36a,6b
12.5 Hz), 3.931 (dd, lH,H-6b, J5,6b=2-1 Hz , J6a,6b
12.5 Hz), 4.052 (dd, 1H, H-2, Jl,2~l-1 Hz, J2,3=3-2
Hz), 5.282 (dd, 1H, Η-ι,σ^^ι .1 Hz,Jlzp = 8,6 Hz) .
FAB-MS: Nr. 13615 negativo m/e = 381, 383, 385 (M-H)-
219, 221, 223 (IPM-H)-
Dicloreto de di-(2-cloroetil)-fosfamida 33 (de acordo com Friedman e Seligman, 1954) J.Am.Chem. Soc. 76, 655
Matérias Primas: 130 ml de POCI3 (1,4 mol) g de cloridrato de bis-(2-clo roetil)-amina
Rendimento
P.f.: 542C g de 33 sob a forma de cristais brancos (a partir de acetona/éter de petróleo
Análise C H N Cl
C4H8CI4NOP calc. 18,56 3,11 5,41 54,77
(258,9) determ. 18,67 3,13 5,35 54,90
EXEMPLO 2
Conjugados dissacárido-IPM
Octa-O-acetil-lactose 35
Agitou-se durante 60 min a uma temperatura de 120 a 135SC uma mistura de 100 g de lactose (147 mmol),
400 ml de anidro acético e 25 g de acetato de sódio anidro. Após arrefecimento verteu-se sobre água gelada e extraiu-se com CH2CI2- Lavou-se a fase orgânica com solução saturada de NaHCO3 e com água neutra, secou-se sobre Na2S04 e evaporou-se à secura num evaporador rotativo. Por cristalização a partir de etanol obtiveram-se 153 g de 35 (80% do teórico)
P.f.: 79-92 2C
CCF: Gel de sílica, tolueno:2-butanona = 10:4, Rf = 0,43
Análise C H
c28H30°l9 calc. 49,56 5,64
(678,6) determ. 49,37 5,80
- 49 Al il-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-aceti1-ff-D-galactopiranosi1 )-2,3,6-tri-O-acetil-D-glucopiranosido 37
(de acordo com Koto et al., 1982) J. Chem. Soc. Jpn. 10, 1651
Dissolveram-se 34 g de 35 (50 mmol) em 60 ml de CHCI3. A 02C adicionaram-se 20,6 ml de brometo de acetilo (276 mmol) e 4,56 ml de H2O. Após 2,5 h de agitaçao à TA evaporou-se à secura a solução límpida amarela a 302C e obteve-se uma espuma amarela (brometo de hepta-O-acetil-a-D-lactosilo ) com iH-NMR: 90 MHz, CDCI3 é = 1.95-2.20 (m,2lH,7x -OAc),3.7-5.65(m, 13H, protoes do açúcar), 6.51 (d,lH,H-l, Ji,2=4 Hz).
Dissolveu-se a espuma em 400 ml de álcool alílico a 35QC. Após adiçao de 30 g de carbonato de prata agitou-se 1 dia TA (ao abrigo da luz) e em seguida filtrou-se e evaporou-se à secura em evaporador rotativo. Retomou-se o resíduo eméter e após nova filtraçao e evaporaçao à secura em evaporador rotativo cromatografou-se através de gel de sílica (tolueno: 2-butanona = 10:1 10:3). Obtiveram-se 18,2 g de 37 (53,8 % do teórico) sob a forma de um óleo limpido.
CCF: Gel de silica, tolueno:2-butanona = 10:4 (10:1), Rf -
0,47 (0,08)
Análise C H
C29H4O°18 calc. 51,48 5,96
(676,62) determ. 51,44 5,92
Alil-4-O-(2,3,4,6-tetra-0-acetil-^-D-glucopiranosil)-2,3,6-tri
-0-acetil-D-glucopiranosido 38 (de modo análogo a 37)
Matérias Primas:
g de octacetato de o-D-celobiose (42,6 mmol) (Ega-Chemie) 17,6 ml de brometo de acetilo 3,9 ml de H20
Produto secundário: brometo de hepta-O-acetil-a-D-celobiosilo
J-H-NMR: 90 MHz, CDCI3 ê= 6.51 (d, 1H, H-l, Jj., 2=4 Hz)
Rendimento: Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter etilico:éter de petróleo) e cristalização a partir de éter diisopropílico obtiveram-se 16,5 g de 38 (57 % do teórico)
P.f
179QC
CCF
Gel de sílica, tolueno:-butanona = lo:4, Rf = 0,49
Análi se
C29h40°18 (679,62)
C calc. 51,48 determ. 51,45
H
5,96
6,07
Alil-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-ft-D-galactopiranosi1)-2.3.6-tri-O-benzil-D-glucopiranosido 39 ( de acordo com Koto et al 1651
1982) J
Chem. Soc. Jpn. 10,
Matérias Primas: 19,5 g de 37 (28,8 mmol)
800 ml de cloreto de benzilo 105 g de KOH, em pó
Rendimento:
Após cromatografia em coluna (gel de sílica, tolueno:2-butanona = 100:1
CCF
Gel de sílica,
10:1) e cristalizaçao a partir de éter etíico/hexano obtiveram-se 21,3 g de 39 (73 % do teórico) sob a forma de agulhas tolueno:2-butanona
10,1, Rf = 0,50
P.f.: 73eC
Análise
C64h68°11 calc.
(1013,24) determ.
C
75,87
75,66
H
6,76
6,63
Alil-4-Q-(2,3,4,6-tetra-0-benzi1-p-D-glucopiranosi1)-2,3,6-tri-O-benzil-D-glucopiranosido 40 (de modo análogo a 39
Matérias Primas: 2,65 9 de 38 (3,92 : mmol)
100 : ml de cloreto de benzilo
14,3 g de KOH, em pó
Rendimento: Após cromatografia em coluna e cristalizaçao a partir de éter diisopropílico/ /hexano obtiveram-se 2,82 g de 40 (71 % do teórico)
CCF: Gel de sílica, tolueno:2-butanona = 10:1, Rf = 0,50
P.f.: 1O2QC
Análise C H ^64^68^11 calc. 75,87 6,76 (1013,24) determ. 76,17 6,57
4-0-(2,3,4,6-Tetra-O-benzil-p-D-qalactopiranosil)-2,3,4-tri-O-benzil-D-qlucopiranose 43
A) Isomerização com t-BuOK a éter 1-propenílico 41
Agitou-se uma mistura de 4,9 g de 39 (4,84 mmol) e 1,3 g de t-BuOK em 30 ml de DMSO sob atmosfera de azoto durante 2 h à temperatura de 11OSC. Evaporou-se o DMSO em evaporador rotativo e dissolveu-se o resíduo numa mistura de éter/água. Separou-se a fase etérea e extraíu-se a fase aquosa ainda duas vezes com éter. Seacaram-se as fases etéreas reunidas sob Na2SO4 e evaporou-se à secura em evaporador rotativo. Obtiveram-se 4,02 g de 41 (4,13 mmol) sob a forma de óleo castanho (rendimento bruto 85 %)
CCF: Gel de sílica, tolueno:2-butanona - 10,1, Rf =
0,62
B) Hidrólise do éter 1-propenílico 41 com HgCl2 para dar 43 (de acordo com Gigg e Warren, 1968) J. Chem. Soc. (C),
1903
A uma mistura de 4,02 g de 41 (4,13 mmol) e 1130 mg de HgO em 10 ml de acetona/água (10:1) adicionaram-se gota agota 1150 mg de HgCl2 em 10 ml de acetona/água (10:1) Após 1 h de agitaçao à TA filtrou-se através de Celite, evaporou-se à secura num evaporador rotativo e tratou-se com éter. Lavou-se a fase etérea com 10 ml de uma solução de saturaçao média de Kl e com água. Após secagem sobre Na2SO4 e evaporaçao à secura sob vácuo cromatografou-se através de gel de sílica (tolueno:-2-butanona = 100:1 —> 10:5). Obteve-se 43 sob a forma de um óleo amarelo que se cristalizou a partir de éter/ eter de petróleo: 2,6 g (55 % do teórico referido a 39, mistura de anómeros, oc.]3 z2:l de acordo com í^q-nmr).
P.f.: 103-C
CCF: Gel de sílica, tolueno: 2-butanona
Análise C H
c61h64°11 calc. 75,29 6,63
(973,17) determ. 74,79 6,65
- 53 4-0- ( 2.3.4.6-Tetra-0-benzi 1 -fi-D-gl nrnpi rannsi 1 )-2.3,4-tri -0-benzil-D-glucopiranose 44
1. ) de modo análogo a 43: Isomerizaçao com t-BuOK a éter 1-propenílico 42 seguida de hidrólise com HgCl2
Rendimento: 47,7 % do teórico (deacordo com cromatograf ia em coluna)
2. ) Isomerizaçao com cloreto de tris-(trifenilfosfina)-ródio (RhCl (PPh3)3) seguida de hidrólise com HC1 1 N (de acordo com Corey e Suggs, 1973) J. Org. Chem. 38,3224
Aqueceram-se 125 mg de 40 (0,123 mmol) em 30 ml de EtOH/água (10:1) com 3 mg de diazabiciclo /2.2.2/ octano(0,027 mmol) e 12 mg de RhCl (PPh3)3 ( (0,009 mmol) durante 3 h. Em seguida adicionaram-se 6 ml de HC1 1 N e aqueceu-se ainda durante 2 h. Após, arrefecimento tratou-se com
NaHC03 e extraiu-se com éter. Lavou-se a fase orgânica com água, secou-se sobre Na2SO4 e evaporou-se à secura num evaporador rotativo. Após cromatografia em coluna (gel de sílica, tolueno:2-butanona = 100:1 —> 100:5) obtiveram-se 109 mg de 44 (91 % do teórico em relaçao a 40,mistura de anómeros,
3:1 de acordo com 13C-NMR) sob a forma de um óleo incolor.
CCF: Gel de sílica, tolueno:2-butanona - 10:1, Rf - 0,22 1H-NMR:
l3C-NMR
MHz, CDC13 § = 3.05 e 3.25 (2d, 1H, - 0H, (o e B), permutável com D20), 3.3-5.2 (m,28H), 7.1-7.5 (m,35H,7x -Ph).
Nr. C14897, CDCI3 = 91.38 (s,C-l«), 97.42 (s,C-l)B), 102.68 (s,C-l').
FAB-MS:
Nr. 13689 m/e = 973 (pos., Glicerina DMF/HCl) (M+H)+
4-0-(2,3,4,6-Tetra-Q-benzil-yB-D-qalactopiranosil )-2,3,6-tri-0-benzil-l-O-p-nitrobenzoil-D-glucopiranose 45
-.54
A 480 mg de 43 (0,49 mmol) em 20 ml de CH2C12 adicionaram-se gota a gota à TA uma solução de 130 mg de cloreto de p-nitrobenzoilo e 0,3 ml de piridina em CHgCe^. Após 20 h de agitação à TA já quase não era possível detectar qualquer material de partida 43 (Rf = 0,22) e detectavam-se dois produtos com Rf = 0,42 e 0,49. Após lavagem com HC1 0,5 N, NaHCOg 1 N e água e secagem sobre Na2SC>4 obteve-se um óleo muito viscoso. A partir de etanol cristalizaram 435 mg de 45 (79 % do teórico, mistura de anómeros, on J8 = 3:7 de acordo com l-H-NMR).
P.f.: 112SC
Analise C68H67°14N (1122,28)
Calc.
determ.
C
72,77
73.05
H
6,02
6,25
N
1,25
1,11
4-0-(2,3,4,6-Tetra-O-benzil-p-D-glucopiranosil)-2,3,6-tri-0-benzi1-1-0-p-nitrobenzoí1-D-qlucopiranose 46 ( de modo análogo a 45)
Matérias Primas
520 mg de 150 mg de benzoílo 0,4 ml de (0,534 mmol) cloreto de p-nitropiridina
Rendimento: Após 20 h verificou-se por cromatografia em camada fina (gel de sílica, tolueno :2-butanona = 10:1) a ocorrência de dois produtos com Rf = 0,43 e 0,49 juntamente com uma pequena quantidade do material de partida com Rf = 0,22. Após cromatografia em coluna (gel de sílica, tolueno:2-butanona = 20:1) obtiveram-se 32o mg de 46 (53,4 % do teórico) sob a forma de um óleo. A partir de eter diisopropilico cristalizou 46or.
P.f
1692C
I
Análise
C68H67014N calc.
(1122,28) determ.
c H N
72,77 6,02 1,25
72,70 6,01 1,07
0-/4-0- (2,3,4,6-Tetra-0-benzil-^B-D-qlucopiranosil )-2,3,6-tri-0-benzil-q-D-qlucopiranosil7-tricloroacetimidato 47 (de modo análogo a 25q)
Matérias Primas: 130 mg de 44 (0,133 mmol) ^1 de tricloroacetonitrilo 5,3 mg de NaH
Rendimento: Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter:éter de petróleo = 2:3) obtiveram-se 120 mg de 47 (80 %) sob a forma de um óleo incolor límpido.
CCF: Gel de sílica, éter:éter de petróleo = 3:2, Rf =
0,49 1H-NMR: 90 MHZ CDCI3 § = 3.3-5.2(m,27H),6.44(d, 1H, H-l,Jlz2=4 Hz), 7.1-7.4 (m, 35H, 7x -Ph), 8.57 (s, 1H, -NH-, permutável com D20).
C63H64C13NO11 (1117.56)
4-0-(2,3,4,6-Tetra-0-benzil-B-D-galactopiranosil)-2,3,6-tri-0J
-benzil-D-glucopiranosil-N,N1-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 48
De acordo com o procedimento A
Matérias Primas: 100 mg de 45 (0,089 mmol) mg de 4b (0,095 mmol)
Rendimento: Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter etílico:éter de petróleo= =40:60) obtiveram-se 2 fracçoes:
Fl: 7 mg de 48 , p > > ot (6,7% do teó r í co)
F2: 40 mg de 48, (38,2 do teórico)
CCF: Gel de sílica, éter etílico:éter de petróleo =
80:20, Rf(or) = 0,37, Rf(p) = 0,42 C65H73C12N2°12P (1176.18)
ÍH-NMR: Nr. H15189, 90MHz, CDClg, o-? > p
Nr. H15326, 90MHz, CDClg, p? o
HPLC analítica: Gel de sílica, éter etílico:hexano:Me0H =
72:28:0,7, caudal 1,0 ml/min, Rt(oç) = 10,32' Rt(^) = 8,73'
HPLC preparativa: Gel de sílica, éter etílico:hexano:MeOH 64:36:0,5, caudal 10,0 ml/min, Rt(o) = 35' Rt(j3) = 27'
4-0-(2,3,4,6-Tetra-O-benzil-^-D-qlucopiranosil)-2,3,6-tri-0-benzil-D-glucopiranosil-N,N*-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 49
De acordo com o procedimento B
Matérias Primas: 40 mg de 47 (0,036 mmol) mg de 4b (0,041 mmol)
Rendimento: Após cromatografia em coluna (gel de sílica, éter etílico:éter de petróleo = 60:40) obtiveram-se 2 fracçoes (qualquer delas sob a forma de um óleo límpido incolor) :
Fl: 18 mg de 49β (42,5 % do teórico)
F2: 7 mg de 49cy (10,9 % do teórico)
CCF: Gel de sílica, éter etílico:éter de petróleo = 80:20,
Rf(or) = 0,35, Rf(p) = 0,42 C65^73^3.2N20g2p (1176,18)
HPLC analítica:
Gel de sílica, éter etílico:hexano:MeOH = 72:28:1, caudal 1,0 ml/min, Rt(Of) = 7,o3' Rt(JÔ) = 5,89'
HPLC preparativa: Gel de sílica, éter etílico:hexano:MeOH = 64:36:0,5, caudal 10,0 ml/min, Rt(or) = 35' Rt(jS) = 25'
4-0-(^-D-Galactopiranosil)-0HD-glucopiranosil-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 500/
Hidrogenação de 48» de acordo com o procedimento C C16H31C12N2°12P (541.31)
1h_NMR: 500 MHz, D20, Nr. H15701
§ = = 3.27-3.34 (m, 4H, 2x - ch2-) , 3. 563 (dd, 1H,
H-2 ' ' J1' ,2'=8·0 Hz, J2' ,3' = 9.8 Hz) , 3.65-4. 0 (m,
15H com 4H a 3.65-3.68, 2x -ch2- ), 4 .478 (d, 1H,
H-l ' , jy, t2 >=8.0 Hz), 5.623 (dd, 1H, H-l,Ji, 2 = 3-6
Hz , Jl,p=7.8 Hz).
FAB-MS: Nr . MSN 14=75
positivo m/e = 221, 223, 225 (IPM+H)+
545 547, 549 (M+H)+
4-0 - (^j-D-Galactopiranosil)-^-D-qlucopiranosil-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida 50g
Hidrogenaçao de 48^6 de acordo com o procedimento C
Cl6H31Cl2N2Ol2P (541.31) 1H-NMR: 500 MHz,D20, 1H-1H-2D-COSY, Nr. 15834 = 3.27-3.34(m, 4H,2x -CH2-), 3.43 (dd, 1H, H-2,
Jl,2=8-0 Hz)' 3.558 (dd, 1H, H-2', J1<f2.=8.O Hz,
J2',3-=10-0 Hz), 3.65-3.68 (m, 4H, 2x -CH2-)3,90,3,68 (m,8H), 3.938 (dd, 1H, J=3.4 e J~1.0 Hz), 3.989 (dd, 1H, J=1.9 e J=12.6 Hz), 4.473 (d, 1H, H-1',J1>>2.= 8.0 Hz), 5.049 (t, 1H, H-l, Ji,2=J1,p=8·0 Hz).
FAB-MS
Nr. MSN 14076 positivo m/e = 221, 223, 225
545, 547, 549 (IPM+H)+ (M+H)+
4-0-( Jà-D-Glucopiranos i1)-orD-glucopiranosi1-N,Nl-di-(2-cloroetil) -fosfodiamida 5lot
Hidrogenaçao de 49<x de acordo com o procedimento C
Cl6H3lCl2N2Ol2P (541.31) 1H-NMR: 500 MHZ, D20, 1H-1H-2D-C0SY, Nr. 15856 δ = 3.27-3.32 (m, 4H, 2x -CH1/2-), 3.333 (dd, IH, H-2', Ji;2'=7·9 Hz' J2',3'=9-4 Hz)> 3.40-3.45 (m,2H), 3.47-3.55 (m, 2H), 3.64-3.68 (m,4H, 2x -CH2-), 3.69 (dd, IH, H-2), 3.70-3.99 (m, 6H), 4.537 (d, IH, H-l', Jl',2,=7·9 Hz), 5.622 (dd, IH, H-l, Jlf2=3.6 Hz, Jl,p=7-8 Hz).
FAB-MS: Nr. MSN 14077 positivo m/e = 221, 223, 225 (IPM+H)+
545, 547 (M+H)+
4-0 - (^B-D-Glucopi ranos i 1) -fi-D-qlucopiranosi1-N ,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodi amida 51^3 idrogenaçao de 4^ de acordo com o procedimento C
Cl6H3lCl2 N20i2P (541.31 )
l-H-NMR: 500 MHz, D20, 1H-1H-2D-COSY, Nr. 15857
Ó 3.27-3.32 (m, 4H, 2x -CHlr2- ), 3.33 (dd, IH,
H-2 1 , Jl·,2-=8 .0 Hz, J2i,3-10 Hz) , 3.428 (dd, IH,
H-2 , Jl,2=8-° Hz, J2;3=10.0 Hz), 3.44-3. 54 (m,3H),
3.64- 3.68 (m, 4H, 2x -CH2-), 3.69 -3.72 (m ι, 3H),
3.745 (dd, IH, H-6'a, J5,6'a=5.8 Hz, Jg. a,6'b_
12.3 Hz), 3.855 (m, IH, H-6b), 3.928 (dd, IH, H-6'b, J5.>5.b=2.1 Hz, J6'a,6'b72·3 Hz), 3.990 (dd, lH,H-6a, J5,6a=2·0 Hz, J6a,6b=l2·2 Hz), 4.532 (d, IH, H-l', Jl',2-=8.0 Hz) 5.044 (t,lH, H-1,J1;2= Jl,p=8.0 Hz).
FAB-MS:
Nr. MSN 14078 positivo m/e = 221, 223, 225 (IPM+)+
545, 547, 549 (M+H)+
EXEMPLO 3
Peracetilou-se maltotriose (acetato de sódio/ /anidrido acético), (Rf 0.48, CHCl3/éter etilico 1:1, gel de silica), obtendo-se o 1-brometo (Rf = o,58, mesmas condiçoes que acima) com HBr/ácido acético glacial a 09C; a partir deste í obteve-se o 1-alquil-maltotriosido (Rf = 0,60, mesmas condições que acima) com álcool alílico/Ag2C03. Com cloreto de benzilo/ /KOH a 12OQC obteve-se a partir daquele último composto o alquil-2,3,6,21,3',6',2,3,4,6-deca-O-benzil-maltotr ios ido (Rf = 0,51, tolueno/acetato de etilo 10:1, gel de sílica).Após isomerizaçao para se obter o éter enólico, procedeu-se a hidrólise para se obter o composto 1-OH com HC1 1 N (Rf = 0,17, tolueno/acetato de etilo 10:1, gel de silica). A partir deste último composto obteve-se o tricloroacetimidato por transformaçao ’ com NaH e tricloroacetonitrilo (Rfcf = 0,48, mesmas condiçoes ! que acima). Em seguida transformou-se no glicoconjugado em ace tonitrilo com mustarda de ifosfamida sob refluxo (Rf = 0,24, : acetato de etilo/hexano 6:4, gel de sílica). Por hidrogenaçao com Pd/carvao activo a 10 % em CH3OH à temperatura ambiente efectuou-se a cisão dos grupos benzilo (Rf = 0,22, CHClg/Metanol 1+1, gel de silica).
Via de síntese por exemplo do composto 28B CH2OH
Dioxano
KOH
BzCI
CH2OBzl
Procedimento
B
CI3C-CN
CH2C12
NaH
|| .NHCH2CH2C1
0-P /
segundo A : & : 5:4 segundo B : Oí : 1:20
B = D54B D14575
BzlO
OBzl
CH2C12 v Pyr
P-NO2BzCl
CH2OBzl
OBzl
N02
HBr
CH2C1
II Cl c6H50 ^C1
H3NCH2CH2C1-HC1/E13N
NHCH2CH2C1 3b 0θΗ5-0-Ρ^ XNHCH2CH2C1 h3h i θ I-C3H7OH || nhch2ch2ci — HO-PX VNHCH2CH2C1
p-NO2BzCl
CH2OBn
Λ— ο
OBn
CC13 R1 r2
OBn
NH
OBn
H R1
H
OBn r2
OBn
H
H
OBn
CH2OBn
O NHCH2CH2C1
-p z x nhch2ch2ci
ch2oh
O CHCH2CH2C1 O-p/ \nhch2ch2ci
Sintese dos conjugados dissacarido-IPM 50 e 51, partindo dos hepta-O-benzilglicosidos 43 e 44

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo para a preparação de glicoconjugados de mustarda de fosforamida ou mmstarda de ifosfamida da fórmula geral açúcar
    NHRX
    NHR2 açúcar -0 -P / \ \
    NH»
    1 la na qual a ligaçao do açúcar com a função perdida da fosforamida ou com a função perdida de ifosfamida, respectivamente é efectuada de preferencia na posição 1 e Rj eR2 são iguais ou diferentes e podem significar hidrogénio, alquilo-C^-C4 inferior, halogenoalquilo-Cj-Cb, de preferencia halogenoalquiloCl-C4 θ especialmente halogenoalquilo-C2, e o açúcar pode ser um monossacárido, um dissacárido ou um polissacárido em qualquer das formas isómeras e enantiómeras existentes, caracterizado por se conjugar demodo conhecido em si um açúcar bromadc protegido, especialmente um açúcar bromado protegido por benzilo, com o composto de fosfóro correspondente e por se libertar o composto deste modo obtido dos grupos protectores.
    - 2â _
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o glicoconjugado de mustarda de fosforamida ou de mustarda de ifosfamida obtido ser:
    o(-D-Glucopiranosil-N, N 1 -di - ( 2-cloroetil) f osf odiamida, p-D-Glucopiranosil-N,N1-di-(2-cloroetil)-fosf odiamida, c(-D-Galactopiranosil-N,N ' -di - ( 2-cloroetil) -f osf odiamida , <X-D-Manopiranosil-N,N'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida, ^-D-Manopiranosil-N,Ν'-di-(2-cloroetil)-fosfodiamida.
    4-0-(^-D-Galactopiranosil)-alfa-D-glucopiranosi1-N,N'-di(2-cloroetil)-fosfodiamida,
    4-0- (J3-D-Galactopiranos il)-N,Ν'-di(2-cloroetil)-fosfodiamida 4-0- (ji-D-Galactopiranosil )-y©-D-glucopiranosil-N,N 1 - di - ( 2-cloroetil)-fosfodiamida,
    4-0-( ^-D-Glucopiranosil)-alfa-D-glucopiranos i1-N,N'-di-(2-cloro-etil)-fosfodiamida ou
    4-0-(^-D-Glucopiranosi1)-^-D-glucopiranosi1-N,N'-di-(2-cloro etil)-fosfodiamida.
    - 33 Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica útil para o tratamento anti-tumoral, nomeada mente para o tratamento do carcinoma da mama, da doença de Hodgkin ou de tumores no domínio do estômago e do intestino, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto glicoconjugado de uma mustarda de fosforamida ou de uma mustarda de ifosfamida quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido alemao apresentado em 20 de Outubro de 1988, sob o NS. P 38 35 772.0-42.
    Lisboa, 19 de Outubro de 1989 0 AGENTE OFICIAL DA PBOFKTEDADE CfDUSTBIAL
    RESUMO
    PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE SACÁRIDOS INIBIDORES DE TUMORES E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM
    A invenção refere-se a um processo para a preparaçao de glicoconjugados de mustarda de fosforamida ou de mus tarda de ifosfamida da fórmula geral
    0 NHR· açúcar -O -P açúcar nhr2 xRl
    0 N
    II z \
    O -P \
    nh2
    R2
    1 la na qual a ligação do açúcar com a função perdida da fosforamida ou com a função perdida de ifosfamida, respectivamente, é efectuada de preferncia na posição 1 e Rj e R2 sao iguais ou diferentes e podem significar hidrogénio, alquilo-C-C4 inferior, halogenoalquilo-Cj-Cg, de preferncia halogenoalquilo-C;[-C4 e especialmente halogenoalquilo-C2, e o açúcar pode ser monossacárido, um dissacárido ou um polissacárido em qualquer das formas isómeras e enantiómeras existentes, que compreende conjugar-se de um modo conhecido em si um açúcar bromado protegido, especialmente um açúcar bromado protegido por benzilo, com o composto de fósforo correspondente e libertar-se o composto deste modo obtido dos grupos protectores.
PT92034A 1988-10-20 1989-10-19 Processo para a preparacao de conjugados de sacaridos inibidores de tumores e de composicoes farmaceuticas que os contem PT92034B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3835772A DE3835772A1 (de) 1988-10-20 1988-10-20 Tumorhemmende saccharid-konjugate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT92034A PT92034A (pt) 1990-04-30
PT92034B true PT92034B (pt) 1995-05-31

Family

ID=6365559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT92034A PT92034B (pt) 1988-10-20 1989-10-19 Processo para a preparacao de conjugados de sacaridos inibidores de tumores e de composicoes farmaceuticas que os contem

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5622936A (pt)
EP (1) EP0369182B1 (pt)
JP (2) JP2518739B2 (pt)
AT (1) ATE120465T1 (pt)
CA (1) CA2001129C (pt)
DE (2) DE3835772A1 (pt)
DK (1) DK170422B1 (pt)
ES (1) ES2072881T3 (pt)
FI (1) FI95268C (pt)
GR (1) GR3015566T3 (pt)
HK (1) HK157495A (pt)
HU (1) HU206124B (pt)
IE (1) IE67529B1 (pt)
NO (1) NO173548C (pt)
PT (1) PT92034B (pt)
WO (1) WO1990004597A1 (pt)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19524515A1 (de) * 1995-07-05 1997-01-09 Deutsches Krebsforsch Saccharid-Konjugate
US20040072889A1 (en) * 1997-04-21 2004-04-15 Pharmacia Corporation Method of using a COX-2 inhibitor and an alkylating-type antineoplastic agent as a combination therapy in the treatment of neoplasia
US6506739B1 (en) 2001-05-01 2003-01-14 Telik, Inc. Bis-(N,N'-bis-(2-haloethyl)amino)phosphoramidates as antitumor agents
US20050107310A1 (en) * 2002-03-19 2005-05-19 Holick Michael F. Carboxylic acid glycuronides, glycosamides and glycosides of quinolones, penicillins, analogs, and uses thereof
AU2003230750A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-13 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating cancer
CN1771334A (zh) * 2003-03-07 2006-05-10 施瑞修德制药公司 用于确定肿瘤对抗肿瘤药剂的治疗的敏感性的方法
ZA200507752B (en) * 2003-03-28 2007-01-31 Threshold Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for treating cancer
US7943586B2 (en) * 2003-06-09 2011-05-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antineoplastic agents targeted via glut transporters
DK1711188T3 (da) 2004-02-06 2012-09-10 Threshold Pharmaceuticals Inc Anticancerterapier
JP2008540559A (ja) * 2005-05-11 2008-11-20 スレッシュオールド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド グルフォスファミド併用療法
NZ565378A (en) 2005-06-29 2011-03-31 Threshold Pharmaceuticals Inc Phosphoramidate alkylator prodrugs
CN100358910C (zh) * 2006-02-14 2008-01-02 海南天源康泽医药科技有限公司 葡膦酰胺结晶及其制备方法与应用
WO2008011588A2 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of phosphoramidate alkylators for treatment of cancer
EP2114157B1 (en) * 2006-12-26 2021-05-26 ImmunoGenesis, Inc. Phosphoramidate alkylator prodrug for the treatment of cancer
US8765690B2 (en) * 2007-04-05 2014-07-01 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer with glufosfamide in patients not receiving insulin therapy
US20090118031A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Qualizza Gregory K Shaft Structure with Configurable Bending Profile
CN101481394B (zh) * 2008-01-09 2013-01-30 苏州天人合生物技术有限公司 2,3,4,6-四-o-乙酰基-d-吡喃葡萄糖基-[n, n′-双(2-氯乙基)]-磷酸二酰胺的制备方法
WO2010019396A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Administration of glufosfamide for the treatment of cancer
CN102115483B (zh) 2009-12-30 2014-12-17 苏州天人合生物技术有限公司 卤代双去氧糖衍生物及其制备方法与应用
CN103142626B (zh) * 2010-07-21 2014-08-20 苏州天人合生物技术有限公司 三乙酰葡萄烯糖在制备抗肿瘤药物中的应用
CN105002235B (zh) * 2015-07-10 2019-02-22 江苏九旭药业有限公司 一种利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法
CN105153251B (zh) * 2015-09-29 2018-03-20 浙江合糖科技有限公司 一种单糖甲苷的苄基化方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122386C (pt) *
DD122386A1 (pt) * 1975-06-24 1976-10-05
DE3225227A1 (de) * 1982-07-06 1984-01-12 Max Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen Derivate des n.n-bis-(2-chlor-aethyl)-phosphorsaeureamids
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5015733A (en) * 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
ZA851062B (en) * 1984-03-01 1985-11-27 Asta Werke Ag Chem Fab Salts of oxazaphosphorine derivatives and process for their production
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5055459A (en) * 1986-06-30 1991-10-08 Board Of Regents, The University Of Texas Selective elimination of malignant cells from bone marrow by bis (acyloxy) propylphosphoramidates

Also Published As

Publication number Publication date
DK170422B1 (da) 1995-08-28
HK157495A (en) 1995-10-13
EP0369182A1 (de) 1990-05-23
JPH03502934A (ja) 1991-07-04
US5622936A (en) 1997-04-22
FI95268B (fi) 1995-09-29
JP3056408B2 (ja) 2000-06-26
HUT54702A (en) 1991-03-28
HU896841D0 (en) 1990-12-28
NO173548B (no) 1993-09-20
NO902717L (no) 1990-08-20
IE67529B1 (en) 1996-04-03
IE893360L (en) 1990-04-20
FI95268C (fi) 1996-01-10
GR3015566T3 (en) 1995-06-30
NO902717D0 (no) 1990-06-19
CA2001129C (en) 2000-06-27
EP0369182B1 (de) 1995-03-29
HU206124B (en) 1992-08-28
WO1990004597A1 (de) 1990-05-03
PT92034A (pt) 1990-04-30
ATE120465T1 (de) 1995-04-15
CA2001129A1 (en) 1990-04-20
DK149290A (da) 1990-08-07
DE3835772A1 (de) 1990-04-26
DE58909141D1 (de) 1995-05-04
DK149290D0 (da) 1990-06-19
JP2518739B2 (ja) 1996-07-31
FI903123A0 (fi) 1990-06-20
ES2072881T3 (es) 1995-08-01
NO173548C (no) 1993-12-29
JPH08208680A (ja) 1996-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT92034B (pt) Processo para a preparacao de conjugados de sacaridos inibidores de tumores e de composicoes farmaceuticas que os contem
NL192683C (nl) &#34;4&#34;-Demethyl-epipodophyllotoxineglucoside verbinding alsmede farmaceutisch preparaat met antitumor activiteit
Gouy et al. Special feature of mixed phosphotriester derivatives of cytarabine
US6153736A (en) Modified ether glyceroglycolipids
US5530110A (en) 4-ethoxy-5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine
NZ226888A (en) Sialocylglycerolipids and their method of preparation
US6716826B2 (en) Compounds and their uses
Israel et al. Adriamycin analogs. 2. Novel anomeric ribofuranoside analogs of daunorubicin
Valdor et al. Synthesis of a trisaccharide repeating unit related to arabinogalactan-protein (AGP) polysaccharides
US7235533B2 (en) Compounds and their uses
Khan et al. Synthesis of some d-mannosyl-oligosaccharides containing the methyl and 4-nitrophenyl β-d-mannopyranoside units
DK174539B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af glycokonjugater af mustardforbindelser
CA2433857C (en) Inositol phosphoglycan derivatives and their medical uses
HU207734B (en) Process for producing phosphates and sulfates of 4&#39;-demethyl-epipodophyl-lotoxin-glycozides and pharmaceutical compositions containing them
US8357785B2 (en) Method of aralkylation of 4′-hydroxyl group of anthracylins
US4801698A (en) Process for preparing diaminopyrimido(4,5-d)pyrimidine glycoside and glycotide
JP4118357B2 (ja) Ａｍｐアルキルエステル誘導体の製造方法
EP1409501B1 (en) Inositol phosphoglycan derivatives and their medical uses
CN115260256A (zh) 一种甘露糖磷酸化衍生物及其制备方法和应用
EP1406913A2 (en) Inositolglycans and their uses
JP2022530141A (ja) シチジン誘導体およびシチジン誘導体の製造方法
Sarkar et al. Revised synthesis of the pentasaccharide related to the repeating unit of the O-antigen from Shigella dysenteriae type-4 in the form of its methyl ester 2-(trimethylsilyl) ethyl glycoside
JPH04210993A (ja) 新規なリン脂質・ヌクレオシド誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19941123

MM4A Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent

Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED

Effective date: 20091123