KR20150110571A - 키메라 불변 도메인을 포함하는 항체 - Google Patents

Abstract

특정의 Fc 수용체에 결합하지만 감소된 효과기 기능을 갖는 키메라 중쇄 불변 영역 서열을 함유하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 항원-결합 단백질 및 Fc-융합 단백질이 제공된다. 세포 시스템 내에서 이러한 키메라 Fc-함유 항체, 항원-결합 단백질 및 Fc-융합 단백질의 발현을 위한 작제물의 제조 방법, 및 키메라 Fc-함유 단백질을 생산하고 분리하는 방법이 제공된다.

Description

키메라 불변 도메인을 포함하는 항체{ANTIBODIES COMPRISING CHIMERIC CONSTANT DOMAINS}

관련 출원의 교차-참조

본 출원은 2013년 2월 1일자로 출원된, 미국 가특허원 제61/759,578호의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 청구하며, 당해 출원은 본원에 참조로 포함되어 있다.

서열 목록

본 출원은 2014년 1월 29일자로 생성된 파일 8550PCT_ST25.txt(43,512 바이트)로서 컴퓨터 판독가능한 형태로 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.

발명의 분야

본 발명은 키메라 불변 영역을 포함하는, 보다 구체적으로 중쇄 불변 영역내 키메라성 힌지 영역(chimeric hinge region)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드로 가공된 항체 또는 항원-결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 효과기 기능을 감소시키고 치료요법에서 사용하기 위한 이점을 제공하는 이러한 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 항체 및 항원-결합 단백질에 관한 것이다.

발명의 배경

IgG 부류의 면역글로불린은 치료제로서 매력적이다. IgG는 사람에서 4개의 아부류, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로서 존재한다. IgG의 중쇄 불변(C_H) 영역은 3개의 도메인, C_H1, C_H2, C_H3를 포함하며, 여기서 C_H1 및 C_H2는 힌지에 의해 연결되어 있다. 각각의 소부류의 역할이 종들 사이에서 변하는 것으로 보이지만, 중쇄 불변 도메인은 다양한 생물학적 효과기 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 사람 IgG 소부류는 Fcγ 수용체(FcγR)와 이들의 상호작용을 통해, 세포 사멸, 상보체 활성화, 식균작용(phagocytosis) 및 옵소닌작용(opsonization)과 같은, 세포 면역 반응 과다를 중재한다. FcγR에 대한 IgG 소부류의 효과를 이해하고 조작하기 위한 시도에서, 연구자들은 IgG의 불변 도메인에 대한 다양한 돌연변이를 이루어서 생성되는 IgG/FcγR 상호작용을 연구하였다(참조: 예를 들면, Canfield and Morrison J Exp Med 73, 1483-1491 (1991); Chappel, M.S., 등. JBC 268(33), 25124-31 (1993); and Armour, K. L., 등. Eur J Immunol 29, 2613-24 (1999)).

사람 IgG 항체의 Fc 의존성 세포독성 활성은 천연 킬러 세포, 활성화된 대식세포 등과 같은 효과기 세포의 표면에서 FcγR에 대한 항체(적어도 기능성 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어짐)의 Fc 영역의 결합을 필요로 한다. 상보체-중재된 세포 용해는 또한 Fc 영역과 다양한 상보체 성분의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. FcγR 결합과 관련하여, 항체의 힌지 영역 및 C_H2 도메인내 수개의 아미노산 잔기가 중요함이 제안되어 왔다(참조: Sarmay, G, 등. Mol Immunol 29, 633-9 (1992); Greenwood, J 등, Eur . J. Immunol, 23(5), 1098 (1993), Morgan, A. 등, Immunology, 86, 319 (1995), Stevenson, GT, Chemical Immunology, 65, 57-72 (1997)). CH2 도메인내 부위(N297)의 글리코실화 및 탄수화물의 조성물 중 변화는 또한 IgG/FcγR 상호작용에 강력하게 영향을 미친다(참조: Stevenson, GT, Chemical Immunology, 65, 57-72 (1997);

등 Immunol Ltrs 106, 111-118 (2006)).

특정의 항체 치료요법의 경우, Fc 수용체 결합 특성을 가공하여 항체의 약력학적 특성에 영향을 미치지 않고, 이용가능한 효과기 메커니즘 모두, 일부를 활성화시키거나, 어느 것도 활성화시키지 않는 것이 유리할 수 있다. 치료학적 특성의 바람직한 조합은 천연의 항체 레퍼토리에서 이용가능하지 않을 수 있다. 효과기 기능이 감소된 항체의 설계는, 예를 들어 치료 목적이 표적 세포를 사멸시키는 것이 아니라, 세포독성을 개시하지 않으면서 이의 표면에서 세포 표면 분자를 차단하거나 활성화시키는 것이 유효하여야 한다. Fc 수용체에 대한 감소된 결합이 바람직할 수 있는 다른 설정은, 항체가 2특이적인 경우이며, 이의 바람직한 치료학적 특성은 상이한 결합 특이성으로부터 온다. 예를 들어, 2특이적 항체의 일반적인 사용은 종양 표적화 특이성과 T 세포 활성화 특이성을 조합시켜 종양-특이적인 T 세포 사멸을 개시한다. 이 경우에, Fc 부위가 Fc 수용체에 결합하는 경우, 잠재적으로 세포에 의해 Fc 수용체를 지닌 세포의 바람직하지 않은 사멸, 또는 천연 킬러 세포 또는 대식 세포와 같은 Fc 수용체를 지닌 세포에 의한 T 세포의 사멸을 개시할 수 있다.

따라서, 이러한 치료요법에서 사용하기 위한, 바람직한 특성을 가진 항체와 같은, 개선된 생물학적 치료요법에 대한 요구가 존재한다. 본 출원인은, 재조합 항체 및 재조합 수용체-Fc 융합 단백질을 포함하는, 치환되거나 달리 변형된 항체 중쇄가 변경된 Fc 수용체 결합 활성을 가지며, 이는 원하지 않는 부작용의 위험을 감소시킴으로써 개선된 치료학적 효과를 제공함을 발견하였다.

발명의 요약

본원에 개재된 항체, 항원-결합 단백질 및 Fc-융합 단백질은 Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 가지도록 가공된다.

본 발명의 하나의 국면은 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하는 것이며, 여기서 Fc 영역은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)을 포함하는 키메라 힌지를 포함한다. 본 발명은 또한, 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 당해 Fc 영역은 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함하는 키메라 힌지를 포함한다.

본 발명의 다른 국면은 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 당해 Fc 영역은 IgG4 CH2 영역에 연결된 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)을 포함한다. 본 발명의 여전히 다른 국면은 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 당해 Fc 영역은 IgG4 CH2 영역에 연결된 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함하느 키메라 힌지를 포함한다.

일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 키메라 Fc 영역, 또는 이의 변이체를 포함하며, 여기서 당해 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 CH3 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 키메라 Fc 영역을 포함하며, 여기서 당해 Fc 영역은 FcγRIIA에 결합한다. 다른 국면에서 재조합 폴리펩타이드는 키메라 Fc 영역을 포함하며, 여기서 당해 Fc 영역은 FcγRIIA 및 FcγRIIB에 결합한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 당해 Fc 영역은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)를 포함하는 키메라 힌지를 포함하며 상기 재조합 폴리펩타이드는 FcγRIIA에 결합한다.

여전히 다른 국면에서, 본 발명은 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 당해 Fc 영역은 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함하는 키메라 힌지를 포함하고 상기 재조합 폴리펩타이드는 FcγRIIA에 결합한다.

본 발명의 추가의 국면은 N-말단으로부터 C-말단까지, CH1 도메인, 키메라 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH1 도메인은 212번 내지 215번(EU 번호매김) 위치의 적어도 하나의 아미노산 서열 DKKV 또는 DKRV를 갖는 사람 IgG1 CH1 또는 사람 IgG4 CH1을 포함하고, 키메라 힌지는 216 내지 227번(EU 번호매김)의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열 및 228 내지 236번(EU 번호매김)의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)을 포함하며, CH2 도메인은 237 내지 340번(EU 번호매김)의 사람 IgG4 CH2 도메인 아미노산 서열을 포함하고, CH3 도메인은 341 내지 447번(EU 번호매김) 위치의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.

본 발명의 일부 구현예는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH1 도메인은 사람 IgG1 CH1 아미노산 서열(서열 번호 43)을 포함하고, 키메라 힌지는 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)를 포함한다. 본 발명의 여전히 다른 구현예는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH1 도메인은 사람 IgG4 CH1 아미노산 서열(서열 번호 44)을 포함하고, 키메라 힌지는 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH1 도메인은 아미노산 서열 DKKV(서열 번호 4)를 포함하고, 키메라 힌지는 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)를 포함한다. 본 발명의 여전히 다른 구현예는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH1 도메인은 아미노산 서열 DKRV(서열 번호 5)를 제공하고, 키메라 힌지는 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함한다. 다른 국면에서, CH1 도메인은 서열 번호 43 또는 44의 변이체를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH2 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 여전히 다른 구현예는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 CH3 도메인은 서열번호 11 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 국면에서, CH3 도메인은 서열 번호 41 또는 42를 포함한다.

본 발명의 다른 국면은 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 당해 폴리펩타이드는 N'-VD1-X1_n-Y1-Y2-X2-X3-C'를 포함하고, 여기서:

N'는 폴리펩타이드의 상기 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 상기 C-말단이며,

VD1은 항원-결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열이고,

X1은 IgG1 CH1 도메인 또는 이의 변이체, IgG4 CH1 도메인 또는 이의 변이체, 및 IgG1 또는 IgG4 CH1 도메인의 적어도 212 내지 215번(EU 번호매김) 위치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 도메인을 포함하는 아미노산 서열이며,

Y1은 IgG1 또는 IgG4 힌지 영역의 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치들로부터의 아미노산 서열을 포함하고,

Y2는 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치들로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 영역 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)를 포함하며,

X2는 IgG4 CH2 도메인, 또는 이의 변이체를 포함하는 아미노산 서열이고,

X3은 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG4 CH3 도메인, 또는 이의 변이체를 포함하는 아미노산 서열이며; 여기서 n은 0 또는 1이다.

본 발명의 일부 구현예에서, n은 1이다. 본 발명의 여전히 다른 구현예에서, X1은 아미노산 서열 DKKV(서열 번호 4)를 포함하고, Y1 내지 Y2는 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)로 이루어진 키메라 힌지를 포함한다. 본 발명의 여전히 다른 구현에에서, X1은 아미노산 서열 DKRV(서열 번호 5)를 포함하고, Y1 내지 Y2는 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)로 이루어진 키메라 힌지를 포함한다. 하나의 구현예에서, X1은 서열 번호 43 또는 서열 번호 44를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, X2는 서열 번호 10을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, X3은 서열 번호 11 또는 서열 번호 12를 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, X3은 서열 번호 41 또는 서열 번호 42를 포함한다.

본 발명의 다른 국면은 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 중쇄 불변(CH) 영역은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 37 또는 서열 번호 38 중의 어느 하나에 대해 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, n은 0이고 Y1 내지 Y2는 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)를 갖는 키메라 힌지를 포함한다. 다른 구현예에서, n은 0이고 Y1 및 Y2는 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 갖는 키메라 힌지를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 항원-결합 단백질이다. 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 수용체-Fc-융합 단백질과 같은, Fc-융합 단백질이다. 본 발명의 여전히 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 항체이다.

본 발명의 추가의 국면은 적어도 10nM의 농도에서 야생형 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체와 비교하여 감소된 효과기 기능을 나타내는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 감소된 결합, 세포독성 활성, 및 세포 증식을 갖는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체를 제공한다.

본 발명은 적어도 10nM 또는 적어도 100nM의 농도에서, 약 50% 미만의 세포독성 활성을 나타내는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한, 적어도 10nM 또는 적어도 100nM의 농도에서 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만 또는 검출가능하지 않은 정도조차의 세포독성 활성을 나타내는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체를 제공한다.

다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체는 약 50% 미만의 세포독성, 또는 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 심지어 0% 또는 검출가능하지 않은 세포독성의 CDC 활성을 나타내며, 이는 시험관내 또는 생체외 세포 사멸 검정에서 측정된다. 특정의 구현예에서, CDC 활성은 100nM의 농도에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만이거나, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출가능하지 않다. 추가의 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체는 시험관내 또는 생체외 세포 사멸 검정에서 측정된 것으로서, 약 50% 미만의 세포독성, 또는 40%, 30%, 20%, 10% 미만의 세포독성, 또는 5%, 4%, 3%, 2%의 세포독성, 또는 심지어 0% 또는 검출가능하지 않은 세포독성의 ADCC 활성을 나타낸다. 특정의 구현예에서, ADCC 활성은 100nM의 농도에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%이거나, 또는 심지어 0% 또는 검출가능하지 않은 ADCC 활성이다.

여전히 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, Fc-융합 단백질 또는 항체는 시험관내 또는 생체외 세포 식균작용 검정으로 측정한 것으로서. 약 50% 미만의 ADCP 활성, 또는 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%의 ADCP 활성을 나타내거나, 심지어 0% 또는 검출가능하지 않은 ADCP 활성을 나타낸다. 특정의 구현예에서, ADCP 활성은 100nM의 농도에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%이거나, 심지어 0% 또는 검출가능하지 않은 ADCP 활성이다.

본 발명은 재조합 폴리펩타이드를 추가로 제공하며, 여기서 세포독성 활성은 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 폴리펩타이드의 세포독성 활성보다 적어도 약 10배 미만이다. 본 발명은 또한 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 세포독성 활성은 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 폴리펩타이드의 세포독성 활성보다 적어도 약 10배 미만, 약 20배 미만, 약 50배 미만, 또는 약 100배 미만, 또는 약 1000배 미만이다.

본 발명의 한가지 국면은 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 국면은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드 중의 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 제공하며, 여기서 재조합 폴리펩타이드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38 및 서열 번호 37로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 또는 서열 번호 33에 대해 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 36 또는 서열 번호 35에 대해 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 36 및 서열 번호 35로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 한가지 국면은 본 발명의 핵산 분자 중의 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 벡터를 추가로 제공하며 여기서 본 발명의 핵산 분자는 숙주 세포 내에서 발현시키기에 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 제공하며, 여기서 발현 조절 서열은 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, UbC, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi 및 HIV LTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 추가로 제공하며, 여기서 프로모터는 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/Arc 하이브리드 프로모터이다. 본 발명은 또한 bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 국면은 본 발명의 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 추가로 제공한다.

본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 세포를 추가로 제공하며, 여기서 당해 핵산은 세포의 게놈내로 통합된다. 본 발명은 또한 단백질 발현 인핸서(enhancer)를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 XBP 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 여전히 추가로 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 동물 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명의 다른 구현에에서, 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 CHO-K1 세포이다.

본 발명의 하나의 국면은 키메라 힌지 영역을 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 당해 방법은:

(a) 숙주 세포를 선택된 항원-특이적인 항체의 V_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드서열 및 Ig의 불변 C_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서 선택된 항원-특이적인 항체의 V_L 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 C_L 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결되어 있다); (b) 단계 (a)의 숙주 세포를 선택된 항원-특이적인 항체의 V_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 사람 Ig의 불변 C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38 또는 서열 번호 37을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 선택된 항원-특이적인 항체의 V_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결되어 있다); 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산 분자를 상기 숙주 세포 내에서 동시-발현시킴으로써 상기 항체를 제조하는 단계를 포함한다.

키메라 힌지 영역을 포함하는 항체를 제조하는 방법으로서, 당해 방법이:

(a) 숙주 세포를 선택된 항원-특이적인 항체의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 불변 CL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, 선택된 항원-특이적인 항체의 VL 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 CL 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다); (b) 단계 (a)의 숙주 세포를 선택된 항원-특이적인 항체의 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 사람 Ig의 불변 CH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, CH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 8 또는 서열 번호 9를 암호화하는 키메라 한지 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 선택된 항원-특이적인 항체의 VH 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 CH 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다); 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산 분자를 상기 숙주 세포 내에서 동시-발현시킴으로써 상기 항체를 제조하는 단계.

본 발명의 다른 국면에서, 항체를 제조하는 방법은 본원의 상기 단계 (b)의 숙주 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 항체는 세포 배양 배지 내로 분비되고; 세포 배양 배지로부터 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 국면은 키메라 힌지 영역을 포함하는 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 당해 방법은:

(a) 숙주 세포를 사람 Ig의 불변 C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된, 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 수용체 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다); 및 (b) 단계 (a)의 핵산 분자를 상기 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 국면에서, 수용체-Fc 융합체를 제조하는 방법은 본원의 상기 단계 (b)의 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 상기 수용체-Fc 융합 단백질은 세포 배양 배지내로 분비된다); 및 세포 배양 배지로부터 수용체-Fc 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 국면은 키메라 힌지 영역을 포함하는 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 당해 방법은:

(a) 숙주 세포를, 사람 Ig의 불변 CH 영역을 암호화는 뉴클레오타이드 서열에 융합된, 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계(여기서, CH 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 8 또는 서열 번호 9를 암호화하는 키메라 힌지 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 수용체 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 CH 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다); 및 (b) 단계 (a)의 핵산 분자를 상기 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함한다.

다른 구현예에서, 항체를 제조하는 방법은:

(a) 목적한 제1의 중쇄 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 포함하는 제1의 세포 배양물을 생산하는단계;

(b) 목적한 제2의 중쇄 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 포함하는 제2의 세포 배양물을 생산하는단계;

(c) 제1 및 제2의 배양 배양물, 또는 이의 상층액을 합하는 단계; 및

(d) 제1 및 제2의 폴리펩타이드를 이종이량체 형태로 회수하는 단계를 포함하며;

여기서, 제1 및 제2의 중쇄 폴리펩타이드 각각의 중쇄는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38 및 서열 번호 37로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 포함한다. 상기 방법에서, 제1의 세포 배양물은 목적한 제1의 동족 경쇄(cognate light chain)를 추가로 포함하고 제2의 세포 배양물은 목적한 제2의 동족 경쇄를 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2의 동족 경쇄는 제1 및 제2의 중쇄 폴리펩타이드에 공유결합으로 결합함으로써 회수된다. 상기 방법의 다른 구현예에서, 제1 및 제2 중쇄 폴리펩타이드 각각의 중쇄는 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 키메라 힌지 아미노산 서열을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 제1 및 제2의 세포 배양물 또는 이의 상층액을 합하고, 제1 및 제2의 scFv-Fc를 이종이량체 형태로 회수하거나 분리함을 포함하여, 제1의 세포 배양물 속에서 생산된 제1의 경쇄 가변 단편-Fc(scFv-Fc), 및 제2의 세포 배양물 속에서 생산된 제2의 scFv-Fc를 포함하는 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기서 제1 및 제2의 scFv-Fc 각각의 Fc는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38 및 서열 번호 37로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2의 scFv-Fc는 세포 배양 배지(예를 들면, 상층액)내로 분비되며, 당해 방법은 제1 및 제2의 세포 배양 배지를 합하는 단계, 및 이종이량체 단백질을 회수하거나 분리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 제1 및 제2의 scFv-Fc 각각의 Fc는 서열 번호 8 및 서열 번호 9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 키메라 힌지 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO, COS, 망막 세포, 베로(Vero), CV1, 293, MDCK, HaK, BHK, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 저켓(Jurkat), 다우디(Daudi), A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 상기 언급한 세포 중의 어느 것으로부터 기원한 세포주, 및 PER.C6® 세포중 어느 것으로부터 기원한 세포주로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 국면은:

(a) (a) 제1의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1의 중쇄, (b) 제2의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제2의 중쇄, 및 (c) 제1 또는 제2의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 일반적인 경쇄 항원-결합 도메인을 포함하는 2특이적인 항체를 제공하며, 여기서 (a) 또는 (b)의 중쇄 또는 (a) 및 (b) 둘 다는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 또는 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 여기서 (a) 또는 (b)의 중쇄 또는 (a) 및 (b) 둘 다는 서열 번호 8 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 힌지 영역을 포함한다.

본 발명의 추가의 국면은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 또는 서열 번호 31을 포함하는 제1의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제1의 중쇄, 및 (b) 서열 번호 38 또는 서열 번호 37을 포함하는 제2의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제2의 중쇄를 포함하는 본 발명의 2특이적 항체를 제공한다.

본원에 개재된 본 발명의 장점 및 특징과 함께, 이들 및 다른 목적은 다음의 설명, 도면, 및 특허청구범위로부터 보다 더 명백해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 hIgG1, hIgG2 및 hIgG4의 힌지 영역에 대한 상응하는 아미노산 번호매김 협약을 나타낸다. 아미노산 번호매김은 가장 최근에 업데이트된 IMGT 과학 챠트(IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(생성: 2001년 5월 17일, 마지막 업데이트: 2013년 1월 10일) 및 Kabat, E.A. 등. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5^th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)에 보고된 바와 같은 EU 지표. (wt = 야생형; -는, 특수한 참조물질에 대해 보고된 상응하는 번호가 없음을 의미한다; --는, 특수한 참조물질에 대한 위치에서 보고된 상응하는 아미노산이 없음을 의미한다)에 따른다.

도 2는 키메라 힌지 영역의 작제 및 상응하는 아미노산 협약에서 사용된 힌지 아미노산을 나타낸다.

도 3. CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 사람 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열(참조: 문헌 UniProtKB/Swiss-Prot Accn. No. P01857(서열 번호 13)에 IGHG1로서 기술된 바와 같음).

도 4. CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 사람 IgG2 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열(참조: 문헌 UniProtKB/Swiss-Prot Accn. No. P01859(서열 번호 14)에 IGHG2로서 기술된 바와 같음).

도 5. CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 사람 IgG4 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열(참조: 문헌 UniProtKB/Swiss-Prot Accn. No. P01861(서열 번호 15)에서 IGHG4로서 기술된 바와 같음).

도 6. 형광성 결합 검정에서 저켓 세포 상의 항원에 대한 항체 결합(최대 %)을 나타내는 단일-매개변수 막대그래프. 도 6a: 배경 형광성은 대조군 검정, 즉 제2 항원만(초) 및 염색되지 않은 저켓 세포와 함께 배양된 저켓 세포에 대해 측정하였다. 도 6b: 키메라 힌지 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체에 대한 저켓 세포 결합(Ab 1 = sIgG4) 대 상응하는 항원-결합 도메인 및 야생형(wt) IgG4 불변 영역(대조군 Ab 2)을 함유하는 항체에 대한 결합의 비교. 도 6c: 키메라 힌지 중쇄 불변 영역(Ab 2 = sIgG1)을 함유하는 항체에 대한 저켓 세포 결합 대 상응하는 항원-결합 도메인 및 야생형(wt) IgG1 중쇄 불변 영역(대조군 Ab 1)을 함유하는 항체에 대한 결합의 비교.

도 7. U937 세포에 결합하는 키메라 힌지 항체 능력을 나타내는 투여량-반응 곡선. 결합(평균 형광성 강도)와 관련하여 최대 농도의 1/2(EC₅₀) 값이 제공된다. (대조군 항체 1 = wt IgG1 C_H; 항체 2 = sIgG1; 대조군 Ab 2 = wt IgG4 C_H; 및 항체 1 = sIgG4.)

도 8. 활성화된 PBMC (T 세포)의 존재하에서 U937 세포와 관련한 세포독성의 키메라 힌지 항체 결여를 나타내는 투여량-반응 곡선. 세포독성 %와 관련하여 최대 농도의 1/2(EC₅₀) 값이 반영되어 있다. (대조군 항체 1 = wt IgG1 C_H; 항체 1 = sIgG4; 대조군 Ab 2 = wt IgG4 C_H; 및 항체 2 = sIgG1; 대조군 Ab 3 = wt IgG1 C _H.)

도 9. PBMC 증식 검정에서 세포 생존능과 관련하여 최대 농도의 1/2(EC₅₀)을 나타내는 투여량-반응 곡선 (대조군 항체 1 = wt IgG1 C_H; 항체 1 = sIgG4; 대조군 Ab 2 = wt IgG4 C_H; 항체 2 = sIgG1; 대조군 Ab 3 = wt IgG1 C_H; 및 대조군 Ab 4 = wt IgG1 C_H)를 지닌 비-특이적인 Ab.

도 10. 야생형 또는 키메라 힌지 C_H 영역의 존재하에서 다우디(도 10a) 및 라지(Raji)(도 10b) 세포와 관련하여 CDC 활성의 결여를 나타내는 투여량-반응 곡선. (대조군 항체 5 = wt IgG1 C_H를 지닌 2특이적 Ab; 항체 3 = sIgG1^*; 항체 4 = sIgG1^*; IgG1 동형 대조군 = wt IgG1 C_H를 지닌 비특이적인 Ab.)

도 11. 야생형 또는 키메라 힌지 C_H 영역을 갖는 항체의 존재하에서 다우디(도 11a) 및 라지(도 11b) 세포와 관련하여 ADCC 활성의 결여를 나타내는 투여량-반응 곡선. (대조군 항체 5 = wt IgG1 C_H를 지닌 2특이적 Ab; 항체 3 = sIgG1^*; 항체 4 = sIgG1^*; IgG1 동형 대조군 = wt IgG1 C_H를 지닌 비특이적인 Ab.)

발명의 상세한 설명

본 발명이 특수한 발명, 및 기술된 실험 조건은 변할 수 있으므로, 이러한 방법 및 조건에 제한되지 않음은 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 특수한 구현예를 단지 설명하기 위한 것이며 본 발명의 영역은 특허청구 범위에 정의되어 있으므로, 한정하는 것으로 의도되지 않음은 또한 이해되어야 한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 것으로서, 단수형("a", "an", 및 "the")은, 내용에서 달리 나타내지 않는 한, 다수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 방법"에 대한 참조는 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에 기술되고/되거나 당해 기재재용의 판독시 당해 분야의 숙련가에게 명백하게 될 유형의 단계들을 포함한다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 발명이 속한 당해분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 물질들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다고 해도, 특수한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 공보는, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

용어 "면역글로불린"은 2개 쌍의 폴리펩타이드 쇄, 경(L) 쇄의 하나의 쌍 및 중(H) 쇄의 하나의쌍으로 이루어진 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 말하며, 이들 쇄는 이황화물 결합에 의해 내부-연결된 모두 4개일 수 있다. 면역글로불린의 구조는 잘 특징화되어 있다. 예를 들면, Fundamental Immunology Ch. 7 (참조: Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))을 참조한다. 요약하면, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역(본원에서 V_H 또는 VH로 약술) 및 중쇄 불변 영역(C_H 또는 CH)을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 "중쇄 불변 영역"은 3개의 도메인, C_H1, C_H2, 및 C_H3, 또는 이의 기능성 단편을 전형적으로 포함하는 반면, C_H1 및 C_H2 도메인은 힌지 또는 이의 기능적 단편에 의해 연결되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 V_L 또는 VL로 약술) 및 경쇄 불변 영역을 전형적으로 포함한다. 사람, 및 다른 포유동물에서는 2개 유형의 경쇄가 존재한다: 카파(κ) 쇄 및 람다(λ) 쇄. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 하나의 도메인(C_L)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 골격 영역(FR)으로 명명된, 보다 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)을 또한 명명된, 초가변성의 영역(또는 서열 내에서 초가변성일 수 있고/있거나 구조적으로 정의된 루프의 형태일 수 있는 초가변성 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단(N-말단)으로부터 카복시-말단(C-말단)까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 전형적으로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(참조: 또한 Chothia and Lesk J. MoI . Biol. 196, 901-917 (1987)). 전형적으로, 당해 영역내 아미노산 잔기의 번호매김은 IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)에 따르거나, 예를 들면, Kabat, E.A. 등. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5^th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)에서와 같은 카밧(Kabat)의 EU 번호매김 시스템(또한 "EU 번호매김" 또는 "EU 지표"로 알려짐)에 의한다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "항체"(Ab)는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 지닌, 면역글로불린 분자, 또는 이의 유도체를 말한다. 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 "면역글로불린" 하에 위에서 요약한 바와 같이 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체는 또한 2특이적 항체, 디아바디(diabody), 또는 유사한 분자(참조: 예를 들면, 디아바디를 설명하기 위한 PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993))일 수 있다. 또한, 항체의 항원-결합 기능은 완전한 길이의 항체의 단편, 예를 들면, "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 단백질"에 의해 수행될 수 있음이 입증되어 왔다. 완전한 항체 분자를 사용하여, 항원-결합 단백질은 일특이적 또는 다특이적(예를 들면, 2특이적)일 수 있다. 용어 "항체" 내에 포함된 결합 분자 또는 단편의 예는 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 국제 특허공보 제WO2007059782호에 기술된 바와 같은 1가 항체인, Fab' 또는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 필수적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 필수적으로 이루어지고 또한 도메인 항체(참조: Holt 등; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90)로 명명된 dAb 단편(참조: Ward 등, Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 카멜리드(camelid) 또는 나노바디(nanobody)(참조: Revets 등; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5 (1):111-24) 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 기원한 가변 및불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열(예를 들면, 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 시험관 내에서 또는 유전자 재배열 또는 체세포 돌연변이에 의해 생체 내에서 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

항체의 다특이적 항원-결합 단편(예를 들면, 2특이적 항체)는 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개재된 2특이적 항체 양식을 포함하는, 어떠한 다특이적 항체 양식도 당해 분야에서 이용가능한 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 내용에서 사용하기 위해 조절할 수 있다.

또한, Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H이 별개의 유전자에 의해 암호화되어 있지만, 이들은 재조합 방법에 의해, V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv(scFv)로 공지됨, 예를 들면, 문헌 Bird 등, Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston 등, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 내용에서 달리 나타내거나 명확하게 지적하지 않는 한 용어 "항체" 내에 포함된다. 이러한 폴리펩타이드는 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 총괄적으로, 및 각각 독립적으로, 상이한 생물학적 특징 및 유용성을 나타내는, 본 발명의 유일한 특징이다. 본 발명의 내용에서 유용한 이들 및 다른 항체 단편 및 재조합 폴리펩타이드는 본원에 추가로논의되어 있다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 항체는 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAb), 항체-유사 폴리펩타이드, 예를 들면, 키메라 항체 및 인간화된 항체, 및 효소 분해, 펩타이드 합성, 및 재조합 기술과 같이 어떠한 공지된 기술에 의해 제공된 항원(항원-결합 단편 또는 분자)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 어떠한 항체 단편도 포함한다. 생성된 항체는 어떠한 Ig 동형 또는 이의 조합도 지닐 수 있다. 어떠한 scFv도 공지된 기술에 의해 본 발명의 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있다.

본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 2특이적 양식은 예를 들면, scFv-계 2특이적 양식, IgG-scFv 융합체, 이중 가변성 도메인(DVD)-Ig, 콰드로마(Quadroma), 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 일반적인 경쇄(예를 들면, 놉-인투 홀을 지닌 일반적인 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)보디, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 2특이적 양식(참조: 예를 들면, 앞서의 양식의 고찰을 위해서는 Klein 등. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 및 이에 인용된 문헌)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 2특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 접합, 예를 들면, 여기서 직각의 화학 반응성을 지닌 비천연 아미노산을 사용하여 부위-특이적인 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 생성한 후 정의된 조성, 원자가 및 기하학을 지닌 다량체성 복합체로 자가-조립한다. (참조: 예를 들면, Kazane 등. 2013, J. Am. Chem. Soc. 9;135(1):340-6 [Epub: Dec. 21, 2012]).

본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 추가의 예시적인 다특이적 양식은 예를 들면 표적 분자에 특이적으로 결합하는 제1의 항원-결합 도메인, 및 내부화 효과기 단백질에 특이적으로 결합하는 제2의 항원-결합 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 이러한 제2의 항원-결합 도메인은 효과기 단백질, 예를 들면, 수용체를 활성화시키고 내부화시킬 수 있다 (참조: 미국 특허원 공보 제2013/0243775A1호, 2013년 9월 19일자로 발표됨, 이는 본원에 참조로 포함된다).

재조합 단백질은 숙련가에게 잘 공지된 표준 분자 생물학 기술에 의해 생산될 수 있다(참조: 예를 들면, Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel 등, Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY).

어구 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 유기체의 면역글로불린(Ig) 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 일반적으로(즉, 야생형 동물의 측면에서) 예를 들면, 항체 또는 T 세포수용체(TCR)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 내에 보다 보존된 골격 영역(FR) 내에 산재된 고가변성 영역이다. CDR은 예를 들면, 배선 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열에 의해, 및 예를 들면, 천연 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 상황(예를 들면, CDR3의 경우)에서, CDR은 연속적이지 않지만(예를 들면, 재배열되지 않은 핵산 서열), 예를 들면, 서열의 스플라이싱(splicing) 또는 연결(예를 들면, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 조합)의 결과로서, B 세포 핵산 서열 내에 연속적인, 2개 이상의 서열 (예를 들면, 배선 서열)에 의해 암호화될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "항원-결합 도메인"은 항원을 선택적으로 인식하여 적어도 마이크로몰 범위에서 K_D로 항원에 결합할 수 있는 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열이다. 본 발명의 항원-결합 도메인은 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

어구 "가변 도메인"은 N-말단으로부터 C-말단까지의 서열 내에 다음의 아미노산 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄(바람직하게 변형된)의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "가변 도메인"은 이중 베타 시이트(dual beta sheet)를 지닌 표준적 도메인(canonical domain)(VH 또는 VL)내로 폴딩될 수 있는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 베타 시이트는 제1의 베타 시이트와 제2의 베타 시이트의 잔기 사이에 이황화물 결합에 의해 연결된다.

본원에 사용된 것으로서, 어구 "중쇄" 또는 "면역글로불린(Ig) 중쇄"는 어떠한 유기체로부터의 Ig 중쇄 불변 영역을 포함하며, 달리 나타내지 않는 한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 규정하지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄 가변 도메인의 단편은 CDR, 또는 CDR 및 FR 둘 다를 포함한다. 대표적인 중쇄 불변 영역은 다음의 가변 도메인(N-말단으로부터 C-말단까지), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 항원-결합 단백질내 중쇄의 기능적 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있는(예를 들면, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 K_D로 항원을 인식하는), 즉, 세포 내에서 발현되어 세포로부터 분비될 수 있고 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 중쇄 불변 영역의 기능적 단편은 적어도 Fc 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.

어구 "Fc-함유 단백질"은 항체, 2특이적 항체, 항체-결합 단편, 트랩 분자(trap molecule) 및 다른 수용체-Fc 융합 단백질, 및 리간드-Fc 융합 단백질과 같은, 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 기능적 부위를 포함하는 다른 결합 단백질을 포함한다. "기능적 부위"는 Fc 수용체 예를 들면, FcγR(즉, FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32a), FcγRIIb(CD32b), FcγRIIIa(CD16a), 또는 FcγRIIIb(CD16b)) 또는 FcRn(항체에 이들의 연장된 반감기를 부여하는, 신생 Fc 수용체)에 결합할 수 있는 CH2 및 CH3 영역을 말한다. CH2 및 CH3 영역은 어떠한 Fc 수용체에도 결합할 수 없도록 하는 하는 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 다른 변형을 함유하며, 이후에 CH2 및 CH3 영역은 비-기능성이 되는 것으로 고려된다. 이와 같이, 특정의 효과기 기능을 약화하거나 제거하는 것이 바람직한 경우, 어떠한 Fc-함유 단백질도 가공하여 본원에 기술된 바와 같은 키메라 중쇄 불변 영역을 함유하도록 할 수 있다.

어구 Fc-융합 단백질", 및 구체적으로 수용체-Fc 융합 단백질"은 본원에 기술된 바와 같은 기능적 Fc 단편을 함유하도록 가공된 재조합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 수용체-Fc 융합 단백질"은 Ig의 Fc 도메인의 아미노산 서열에 융합된 수용체 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 융합 단백질에 사용된 수용체 단백질의 예는 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Klinkert, 등. J Neuroimmunol . 72(2):163-8 (1997); Milligan, G., 등. Curr Pharm Des. 10(17):1989-2001 (2004); and Schwache D, and Muller-Newen G, Eur J Cell Biol . 91(6-7):428-34 (2012), doi: 10.1016/j.ejcb.2011.07.008. Epub 2011 Sep 29).

본 발명의 내용에서, 수용체-Fc 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 키메라 중쇄 불변 영역의 뉴클레오타이드 서열에 융합된 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 수용체 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 수용체의 리간드-결합 도메인 또는 세포외 도메인을 암호화한다. 다른 구현예에서, 수용체 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 수용체의 세포외 도메인 및 수용체의 전이막 도메인(transmembrane domain)을 암호화한다. 수용체-Fc 융합 단백질은 또한 제US20090137416 A1호에 예시되어 있다.

hFcgRI를 이용하는 유동 세포분석-계 자기 분비 트랩(FASTR) 방법은 본 발명의 항체 또는수용체-Fc 융합 단백질을 발현하거나 분비하는 고 발현 클론의 신속한 분리를 가능하도록 한다 (참조: 예를 들면, 제US20090137416 A1호, 이는 본원에 참조로 포함된다). 이러한 고 발현 클론을 사용하여 본 발명의 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 단백질을 발현하는 세포를 분리할 수 있다. FASTR 방법을 이용하여 본 발명의 어떠한 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질, 항체, 또는 Fc 융합 단백질을 발현하는 세포를 직접 스크리닝하여 분리할 수 있다.

어구 "경쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열, 및 달리 나타내지 않는 한 사람 카파 및 람파 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변(VL) 도메인은 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로(즉, 야생형 동물의 측면에서), 완전한 길이의 경쇄는 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인, 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 면역글로불린 도메인으로부터 기원한 아미노산 서열을 포함한다. 지정된 단백질 "로부터 기원한" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 기원을 말한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "힌지"는 면역글로불린의 C_H1의 C-말단을 C_H2 도메인의 N-말단에 연결시키는 연속적인 아미노산 잔기의 영역을 포함하는 것으로 의도된다. CH2 엑손(exon)에 의해 암호화된, C_H2 도메인의 N-말단의 수개의 아미노산은 또한 "하부 힌지"의 부분으로 고려된다. 어떠한 하나의 이론에 의해 얽메이지 않고, IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 영역의 아미노산은 명백한 힌지 엑손, 및 C_H2 도메인의 수개의 N-말단 아미노산(C_H2 엑손에 의해 암호화됨)에 의해 암호화된 12 내지 15개의 연속된 아미노산을 포함하는 것으로서 특징화되어 왔다(참조: Brekke, O.H., 등. Immunology Today 16(2):85-90 (1995)). 다른 한편으로, IgG3은 4개의 분절로 이루어진 힌지 영역을 포함한다: IgG1의 힌지 영역과 유사한 하나의 상부 분절, 및 IgG3에 대해 독특한 동일한 아미노산 반복체인 3개의 분절.

본 발명의 실시자의 편의를 위한 본 기재내용에서, 사람 IgG1, IgG2 및 IgG4에 대한 힌지 영역의 아미노산은 IMGT® Scientific Chart, IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®에 따라 업데이트된 것으로서, 생성: 2001년 5월 17일, 마지막 업데이트: 2013년 1월 10일, 본원에서 또한 "EU 번호매김" 또는 "EU 지표"로 공지된, 카밧의 EU 번호매김 시스템(참조: Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological interest. 5^thhttp://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991))에 의해 확인되어 왔다.

사람 IgG1, IgG2 및 IgG4 힌지 아미노산에 대한 EU 번호매김과 IMGT 독특한 도메인 번호매김, IMGT 엑손 번호매김, 및 카밧 번호매김 협약(참조: 또한 Kabat, E.A. 등, 1991, supra) 사이의 상응성은 도 1에 기술되어 있고 다음과 같다:

표 1: IgG1 힌지 번호매김

표 2: IgG1 C-도메인 힌지 번호매김

표 3: IgG2 힌지 번호매김

표 4: IgG2 C-도메인 힌지 번호매김

표 5: IgG4 힌지 번호매김

표 6: IgG4 C-도메인 힌지 번호매김

엑손 스플라이싱으로부터 생성되는 아미노산은 괄호안에 나타낸다.

-는, 보고된 상응하는 번호가 없음을 의미한다.

--는, 당해 위치에서 상응하는 아미노산이 없음을 의미한다.

^a 마지막으로 업데이트된 IMGT 과학 챠트에 따른 번호매김

^b 문헌(참조: Kabat, EA, 등. 1991)에 보고된 바와 같은 EU 지표에 따른 번호매김

또한, 예를 들면, Lefranc, M.-P. 등, Devel Comp Immunol, 29, 185-203 (2005); 및 Edelman, G.M. 등. PNAS USA, 63:78-85 (1969) 참조.

본 기재내용의 목적을 위해, "상부 힌지" 영역은 EU 번호매김에 따른 216 내지 227번 위치로부터의 아미노산 잔기(카밧 번호매김에 따른 226 내지 240번 위치의 아미노산 잔기)를 포함하는 것으로 의도된다(또한 도 2 참조). "하부 힌지" 영역은 EU 번호매김에 따른 228 내지 236번 위치의 아미노산 잔기(카밧 번호매김에 따른 241 내지 249번 위치로부터의 아미노산 잔기)를 포함하는 것으로 의도된다(또한 도 2 참조).

본원에 사용된 것으로서, 용어 "키메라"는 상이한 오리진의 부분으로 구성됨을 의미한다. 어구 "키메라 단백질"은 천연에서 일반적으로 연결되지 않은 제2의 아미노산 단백질에 연결된 제1의 아미노산 단백질을 포함한다. 아미노산 서열은 일반적으로 별도의 단백질로서 또는 동일한 단백질 상의 상이한 배열로 존재할 수 있으며, 신규 배열로 융합 폴리펩타이드 속에 함께 존재한다. 키메라 단백질은 당해 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 화학적 합성에 의해 또는바람직한 배열의 키메라 단백질의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생성함으로써 생성할 수 있다. 예시적인 키메라 단백질은 IgG의 중쇄 도메인을 연결하는 키메라 힌지 서열, 및 본 발명의 사람 항체, 항원-결합 단백질 및 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하도록 가공된 융합 단백질을 포함한다.

본원에 개재된 키메라 단백질은 예를 들면, 야생형 IgG Fc 영역 또는 도메인과 비교하여 연결부에서 면역원성 에피토프의 생성을 최소화하도록 설계되었다. 따라서, 본 발명의 가공된 단백질은 감소된 면역원성을 가지며, Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 나타내고, 효과기 기능이 없을 때까지 감소된다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "키메라"는 하나의 Ig 분자의 힌지 영역으로부터 기원한 제1의 아미노산 서열 및 Ig 분자의 상이한 부류 또는 소부류의 힌지 영역으로부터 기원한 제2의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 예시적인 키메라 힌지는 제1의 아미노산 서열, 또는 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 힌지영역으로부터 기원한 "상부 힌지" 서열, 및 제2의 아미노산 서열, 또는 사람 IgG2 힌지 영역으로부터 기원한 "하부 힌지" 서열을 포함한다. 특정의 구현예에서, 제1 또는 "상부 힌지" 서열은 EU 번호매김에 따른 216 내지 227번 위치로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 또는 "하부 힌지" 서열은 EU 번호매김에 따른 228 내지 236번 위치로부터의 아미노산 잔기를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "인간화된 항체"는, CDR 서열이 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선으로부터 기원하고, 사람 골격 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간화된 모노클로날 항체는 사람 중쇄 삽입유전자 및 무한증식된 세포에 융합된, 경쇄 삽입유전자를 포함하는 게놈을 가진, 유전자이식 마우스(transgenic mouse)와 같은, 유전자삽입 또는 트랜스염색체(transchromosomal) 비사람 동물로부터 수득된 B 림프구 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 비-사람 항체는 특수한 항원과 관련하여 제조되며, 가변 영역은 변형될 사람 항체 속에 존재하는 FR 상의 비사람 항체로부터 기원한 CDR을 이식함으로써 "재성형" 또는 "사람화될" 수 있다. 본 시도의 적용은 Sato, K. 등. Cancer Research 53:851-856 (1993); Riechmann, L., 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M., 등, Science 239:1534-1536 (1988); Kettleborough, C. A., 등, Protein Engineering 4:773-3783 (1991); Maeda, H., 등, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134 (1991); Gorman, S. D., 등, Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185 (1991); Tempest, P. R., 등, Bio/Technology 9:266-271 (1991); Co, M. S., 등, Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873 (1991); Carter, P., 등, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289 (1992); 및 Co, M. S. 등, J Immunol 148:1149-1154 (1992)에 보고되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열(예를 들면, 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 구현예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체와 관련하여 변경되는 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)을 가지며, 이는 또한 원래의 항체로부터의 하나 이상의 CDR로부터 기원한 "하나 이상의 CDR"로 명명된다. 인간화된 항체는 재조합 기술을 사용하여 제조된 키메라 분자를 말할 수 있다.

다른 구현예에서, VELOCIMMUNE 마우스에 의해 생성된 세포주에 의해 생산된 것과 같은, 쥐 불변 영역에 연결된 사람 가변 영역을 포함하는 키메라 항체는 쥐 불변 영역을 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38 또는 서열 번호 37을 포함하는 사람 불변 영역으로 대체함으로써 인간화된다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일의 분자조성물의 항체 분자의 제조를 말한다. 모노클로날 항체 조성물은 단일의 결합 특이성 및 특수한 에피토프에 대한 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "마우스 또는 쥐 모노클로날 항체"는 쥐 또는 마우스 배선 면역글로불린 서열로부터 기원한 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다.

본원에 사용된 것으로서, 예를 들면, 소정의 항원 또는 FcR에 대해 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 결합과 관련하여 용어 "결합"은 전형적으로 최소 2개의 실체, 또는 분자 구조 사이의 상호작용 또는 연합, 예를 들면, 항체-항원 상호작용, 또는 FcγR에 대한 Fc-함유 단백질(여기서, Fc-함유 단백질은 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-융합 단백질, 예를 들면, 수용체-Fc 융합이다)을 말한다.

예를 들면, 결합 친화성은 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 BIAcore 3000 장치속에서 리간드로서 항원 또는 FcR 및, 분석물(또는 안티리간드)로서 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질을 사용하여 측정된 경우 약 10^-7 M 이하, 예를 들면, 약 10^-8 M 이하, 예를 들면, 약 10^-9 M 이하의 K_D 값에 전형적으로 상응한다. 따라서, 항체 또는 다른 결합 단백질은 비-특이적인 항원(예를 들면, BSA, 카제인)에 대한 결합에 대한 이의 친화성보다 적어도 10배 더 낮은, 예를 들면, 적어도 100배 더 낮은, 예를 들면, 적어도 1,000배 더 낮은, 예를 들면, 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들면, 적어도 100,000배 더 낮은 K_D 값에 상응하는 친화성을 갖는 소정의 항원 또는 수용체에 결합한다.

본원에 사용된 것으로서 용어 "K_D" (M)은, 특수한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수, 또는 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 해리 평형 상수를 말한다. K_D 과 결합 친화성 사이에는 역 관계가 존재하므로, K_D 값이 작을수록, 친화성은 더 높아진다. 따라서, 용어 "보다 낮은(저) 친화성"은 상호작용을 형성하는 능력이 보다 낮아서 K_D 값이 보다 큰 것에 관한 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "k_d" (sec^-1 또는 1/s)는 특수한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수, 또는 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 해리 속도 상수를 말한다. 상기 값은 또한 k_off 값으로 언급된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "k_a" (M^-1 x sec^-1 또는 1/M)는 특수한 항체-항원 상호작용의 연합 속도 상수, 또는 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 연합 속도 상수를 말한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "K_A"(M^-1 또는 1/M)는 특수한 항체-항원 상호작용의 연합 평형 상수, 또는 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유 단백질의 연합 속도 상수를 말한다. 연합 평형 상수는 k_a를 k_d로 나누어서 수득된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "EC₅₀" 또는 "EC50"는 최대 유효 농도의 1/2을 말하며, 이는 규정된 노출 시간 후에 기본선과 최대 사이의 반응의 1/2을 유도하는 항체의 농도를 포함한다. EC₅₀은, 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체의 농도를 나타낸다. 따라서, 감소된 결합은 증가된 EC₅₀, 또는 최대 유효 농도 값의 1/2과 함께 관찰된다.

하나의 구현예에서, 감소된 결합은 표적 세포의 최대량의 1/2에 대한 결합을 가능하도록 하는 증가된 EC₅₀ 항체 농도로서 정의될 수 있다.

일부 구현예에서, 감소된 세포독성 활성은 표적 세포의 최대량의 1/2의 분해가 가능하도록 하는증가된 EC₅₀ 항체 농도로서 정의될 수 있다.

다른 구현예에서, 감소된 증식은 표적 세포의 최대량의 1/2의 증식을 가능하도록 하는 증가된 EC₅₀ 항체 농도로서 정의될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서 어구 "2특이적 항체"는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 대해 특이적이거나 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있는 항체를 포함한다. 예를 들면, Tutt 등. (1991) J. Immunol. 147:60-69를 참조한다. 예를 들면, 사람 항체는 다른 기능성 분자, 예를 들면, 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결될 수 있거나 동시-발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 실체에 기능적으로 연결되어(예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합적 연합 또는 기타에 의해), 제2의 결합 특이성을 지닌 2특이적 또는 다특이적 항체를 생산할 수 있다. 이와 같이, 2특이적 항체는, 또한 특이성이 상이한 2개의 항체를 포함한다.

예를 들어, 일반적인 경쇄를 사용하는 다른 전략을 미국 특허원 공보 제20100331527A1호에 기술된 바와 같이 사용할 수 있으며, 여기서 상이한 특이성의 2개의 항체는 동일한 경쇄를 사용한다. 특정의 구현예에서, 2특이적 항체내 Ig 중쇄들 중 적어도 하나의 중쇄는 변형되어 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 중의 적어도 하나는 CH3 내에서 변형되어 용이한 분리를 위해, 단백질 A와 같은, 친화성 시약에대한 2특이적 항체에 대한 차등적인 친화성을 생성한다. 다른 구현예에서, 이러한 2특이적 항체에서 중쇄중 적어도 하나는 IMGT 번호매김 시스템에서 i) 95R 또는 ii) 95R 및 96F(95R 및 96F는 EU 번호매김 시스템에서 435R 및 436F에 상응한다)에서의 아미노산 변형, 예를 들면, 서열 번호 37 및 서열 번호 38을 포함한다. (참조: 이의 내용이 본원에 참조로 포함된 제US20100331527A1호) 항체의 다특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에 대해 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 어떠한 다특이적 항체 양식도 당해 분야에서 이용가능한 정규 기술을 사용하여 본 발명의 항원-결합 단백질 또는 항체와 관련하여 사용하기 위해 조절될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "동형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 면역글로불린 부류(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)을 말한다.

용어 "에피토프"는 항체에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결정인자를 의미한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 그룹화로 일반적으로 이루어지며 일반적으로 특이적인 3차원 구조적 특성, 및 특이적인 전하 특성을 갖는다. 구조적 및 비구조적 에피토프는, 후자에 대한 결합이 아닌, 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재하에서 상실되어 있다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 포함된 아미노산 잔기(또한 에피토프의 면역우세 성분으로 불림) 및 특이적인 항원 결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단된 아미노산 잔기(다시 말해서, 당해 아미노산 잔기는 특이적인 항원 결합 펩타이드의 풋프린트(footprint) 내에 있다)와 같은, 결합에 직접적으로 포함되지 않는, 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 인간화된 항체는, 항체가 예를 들면 사람 면역글로불린 유전자를 수반하는 유전자삽입 마우스를 면역화시키거나 사람 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써, 사람 면역글로불린 서열을 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우 특수한 배선 서열"로부터 기원하며", 여기서 선택된 사람 항체 V 도메인 서열은 배선 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열에 대해 아미노산 V 도메인 서열 내에서 적어도 90%, 예를 들면, 적어도 95%, 예를 들면, 적어도 96%, 예를 들면, 적어도 97%, 예를 들면, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.

전형적으로, 중쇄 CDR3 외부로, 특수한 사람 배선 서열로부터 기원한 사람 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 20개 이하의 아미노산 차이, 예를 들면, 10개 이하의 아미노산 차이, 예를 들면, 9, 8, 7, 6 또는 5 이하, 예를 들면, 4, 3, 2, 또는 1 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다.

용어 "삽입유전자성 비-사람 동물"은 하나 이상의 사람 중쇄 및/또는 경쇄 삽입유전자 또는 트랜스염색체(동물의 천연 게놈 DNA내로 통합되거나 통합되지 않은)를 포함하는 게놈을 갖는 비-사람 동물을 말하며 이는 완전한 사람 항체를 발현할 수 있다. 완전한 사람, 또는 부분적으로 사람 및 부분적으로 마우스인 항체를 발현하는 마우스는 이미 보고되어 있다. 예를 들어, 유전자삽입 마우스는 사람 경쇄 삽입유전자 및 사람 중쇄 삽입유전자 또는 사람 중쇄 트랜스염색체를 가짐으로써 마우스가 표적 항원 및/또는 표적 항원을 발현하는 세포로 면역화되는 경우 사람 항체를 생산할 수 있다. 사람 중쇄 삽입유전자는 삽입유전자 마우스, 예를 들면, HCo7 또는 HCol2 마우스와 같은 HuMAb 마우스의 경우에서와 같이, 마우스의 염색체 DNA내로 통합될 수 있거나, 사람 중쇄 삽입유전자는 제WO02/43478호에 기술된 바와 같은 트랜스염색체성 KM 마우스의 경우에서와 같이, 염색체외적으로 유지될 수 있다. 이러한 삽입유전자 및 트랜스염색체 마우스(총괄적으로 본원에서 "유전자삽입 마우스"로 언급됨)는 직면하는 V-D-J 재조합 및 동형 스위칭(isotype switching)에 의해 제공된 항원(예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgD 및/또는 IgE)에 대해 사람 모노클로날 항체의 다수의 동형을 생산할 수 있다.

VELOCIMMUNE® 유전적으로 가공된 마우스는 내인성 마우스 유전자자리(locus)에서 재배열되지 않은 V(D)J 유전자 분절의 사람 V(D)J 유전자 분절로의 교체를 포함한다. VELOCIMMUNE® 마우스는 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 가진 키메라 항체를 발현한다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,605,237호). 대부분의 다른 보고서들은 장애가 있는 내인성 면역글로불린 유전자자리를 갖는 마우스에서 완전한 사람 삽입유전자로부터의 완전한 항체를 발현하는 마우스에 관한 것이다.

VELOCIMMUNE® 마우스는 부분적으로 내인성 마우스 불변 영역 유전자자리에 작동적으로 연결된 사람 가변 영역을 포함하는 게놈을 가짐을 포함하여 당해 마우스는 항원성 자극에 대한 반응시 사람 중쇄 가변 영역 및 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생산한다. 항체의 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 분리하여 본 발명의 사람 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결시킬 수 있다. 이후에, DNA는 항체의 완전한 사람 중쇄를 발현할 수 있는 세포 내에서 발현시킬 수 있다.

유전자삽입성, 비사람 동물은 또한 특이적인 항체를 암호화하는 동물 유전자내로 도입함으로써, 예를 들면, 당해 유전자를 동물의 우유에서 발현되는 유전자에 작동적으로 연결시킴으로써 이러한 특이적인 항원에 대해 항체를 생산하는데 사용할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 어구 "효과기 기능"은 FcγR에 대한 결합 시 Fc-함유 단백질에 의해 부여된 기능적 능력을 포함하는 것으로 의도된다. 어떠한 하나의 이론에 얽메일 필요없이, Fc/FcγR 복합체의 형성은 결합된 항원의 부위에 다양한 효과기 세포를 보충하여, 전형적으로 세포 내에서 다양한 신호전달 현상 및 중요한 후속적인 면역 반응을 생성한다.

"효과기가 없는 폴리펩타이드"는 IgG1 또는 IgG4 동형의 야생형 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질 또는 항체와 비교하여 변경되거나 감소된 효과기 기능을 갖는 재조합 폴리펩타이드, 항원-결합 단백질 또는 항체를 말한다. 일부 구현예에서, 감소되거나 변경된 효과기 기능은 세포독성 효과기 기능, 예를 들면, 세포독성, 상보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포독성(ADCC), 또는 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP)이다. 하나의 구현에에서, 감소되거나 변경된 효과기 기능은 상보체-의존성 세포독성이다. 다른 구현예에서, 감소되거나 변경된 효과기 기능은 항체-의존성 세포독성이다. 다른 구현예에서, 감소되거나 변경된 효과기 기능은 세포 증식이다.

수개의 항체 효과기 기능은 적어도 부분적으로 Fc 수용체(FcR)에 의해 중재되며, 이는 전형적인 면역글로불린의 불변 도메인(구체적으로, C_H2 및 C_H3 도메인)내 항체의 Fc 영역에 결합한다. 면역글로불린의 상이한 부류에 대해 특이적인 다수의 Fc 수용체, 즉, IgG, IgE, IgA, IgM, 및 IgD가 존재한다. 사람 IgG Fc 수용체 계열은 3개의 그룹으로 분리된다: IgG와 고 친화성으로 결합할 수 있는 FcγRI (CD64), 둘 다 낮은 친화성 수용체인 FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16). 각각의 FcγR 소부류는 2개 또는 3개의 유전자에 의해 암호화되며, 대체의 RNA 스플라이싱은 다수의 전사체를 초래함으로써, FcγR 동형에 있어서 광범위한 다양성이 존재한다(예를 들면, FcγRIA (CD64; FCGR1A), FcγRIB (CD64; FCRG1B), FcγRIIA (; FCGR2A), FcγRIIB (CD32; FCGR2B), FcγRIIC (CD32; FCGR2C), FcγRIIIA (CD16a; FCGR3A), 및 FcγRIIIB (CD16b; FCGR3B)). 또한, FcRn, 또는 신생의 Fc 수용체(또한 Fc 수용체 트랜스포터(transporter), 알파, 또는 FCGRT로 공지됨)는 어미로부터 태아로 태반을 가로질러 IgG 항체를 전달할 수 있다. 또한, Fc 수용체는 예를 들면, B 세포, 단핵세포, 수지 세포, 호중구, 및 특정의 림프구를 포함하는 다양한 세포에서 발현된다. 예를 들면, 사람 단핵구 세포주인, U937 세포는 FcγRI 및 FcγRIIA 둘 다를 발현한다(참조: 예를 들면, Jones, 등. J Immunol 135(5):3348-53 (1985); 및 Brooks, 등. J Exp Med 170:1369-85 (October 1989)).

이의 수용체에 대한 Ig Fc의 결합은 이들 효과기 세포가 결합된 항원의 부위에 오도록 함으로써 궁극적으로 B 세포 활성화, 염증 반응, 세포독성 반응, 및 식세포 반응을 포함하는 다양한 신호전달 및 면역 반응을 생성한다. 이와 같이, 이의 수용체에 대한 Ig Fc의 감소되거나 변경된 결합은 감소된 효과기 기능을 생성할 수 있다.

달리는, 세포독성, 상보체-의존성 세포독성("CDC"), 항체-의존성 세포독성("ADCC") 및 비정상적인 항체 생산과 같은 증가된 "효과기 기능"은 특정의 치료학적 항체와 관련된 원치않는 부작용일 수 있다.

어구 "항체-의존성 세포 세포독성", "항체-의존성 세포-의존성 세포독성", 또는 "ADCC"는, 특이적인 항체가 표적 세포의 세포-표면 항원에 부착할 때, Fcγ 수용체-함유 세포(면역 세포 등)이 Fcγ 수용체를 통해 특이적인 항체의 Fc 부위에 결합하는 경우에 표적 세포를 손상시키는 활성을 의미한다. 따라서, ADCC는, Fc 수용체-양성 효과기 세포가, 부착성 항원-특이적인 분자를 갖는 표적 세포를 분해할 수 있는 메커니즘이다. ADCC 활성은 칼세인 AM과 같은 형광성 염료를 사용하여 형광성 강도를 측정함을 포함하는, 다수의 잘 공지된 방법으로 평가할 수 있다(참조: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 349-07201). 당해 시도를 사용하는 경우, 세포독성 활성(%)은 수득된 값을 사용하여, 방정식: (A-C)/(B-C)x100(여기서, A는 각각의 시료내 형광성 값이고, B는 분해되어 1%의 최종 농도를 갖는 노니데트(Nonidet) P-40가 들어있는 배지로 방출되는 세포의 평균 형광성 값이며, C는, 배지만을 가하는 경우 평균 형광성 값이다)에 따라 계산할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 어구 "항체-의존성 세포 식세포작용" 또는 "ADCP"는 세포분해를 유도하는 것보다는 표적 세포를 에워쌈으로써 표적 세포를 제거(또는 사멸)시키는 효과기 기능에 관한 것이다. ADCP는 종양 세포를 사멸시키기 위한 중요한 생체내 메커니즘일 수 있다. ADCP는 2-색상 형광성 유동 세포분석 방법, 예를 들면, 상이한 세포 표면 단백질에 대해 PKH2(녹색 형광성 염료) 및 피코에리트린-접합된(적색) 모노클로날 항체를 이용하여 시험 세포를 분화시킴으로써 식세포 활성 및 식세포작용 비율을 측정하는 방법에 의해 측정될 수 있다. FcγRIIb와 비교하여 FcγRIIa를 선택적으로 활성화시키는 치료학적 전략은 대식구 식세포작용 활성을 향상시킬 수 있다(참조: Richards, JO, 등. 2008 Mol Cancer Ther 7(8):2517-27).

본원에 사용된 것으로서 어구 "상보체-지시된 세포독성" 또는 "CDC"는 상보체 시스템에 의한 세포독성 활성을 포함한다. CDC 활성은 잘-공지된 방법에 의해 측정되는데, 예를 들어, 표적 세포, 항체 및 상보체 용액(예를 들면, 아기 토끼 상보체(Cedarlane Technologies))를 항온처리하고 표준 프로토콜(참조: (NIAID Manual of Tissue Typing Techniques 1979-1980, Edited by J.G. Ray, NIH Publication No. NIH-83-545.)에 따라 반응하도록 한다. 세포독성 활성은 ADCC 활성의 측정과 동일한 방식으로 계산할 수 있다. 세포독성 활성은 또한 형광성 염료(예를 들면, 칼세인) 또는 ADCC와 관련하여 상기와 유사한 방사활성 염료를 사용하여 측정할 수 있다.

어구 "세포독성" 또는 "직접적인 세포독성"은 NK 세포와는 독립적인 것을 포함하는 어떠한 세포독성 활성도 포함한다. 세포독성은 당해 분야에 잘 공지된 기술, 예를 들면, 세포 분해 또는 세포 사멸, 즉, 세포자멸사에 의해 측정할 수 있다. 직접적인 세포 분해, 또는 세포 사멸은 칼세인을 사용하여 형광성 강도를 측정하고 본원의 상기에서 ADCC와 관련하여 기술한 바와 유사한 방식으로 평균 형광성 값을 계산함으로써 평가할 수 있다. 달리는, 항체와 같은 세포독성 분자는 조절된 세포 사멸의 유전 프로그램을 활성화시킴으로써세포자멸사 검정에서 효과적이다. 세포자멸사는 세포의 굴절률, 세포질성 수축, 핵 농축 및 DNA의 규칙적인 크기의 단편으로의 절단을 포함하는 잘 정의된 세포질성 및 분자 현상으로 특성화된다. 세포자멸사를 겪는 세포는 물질대사를 중지하고, 막 통합성을 상실하며 막 수포를 형성한다. 세포자멸사 활성은 염색되고/되거나 죽은 세포를 측정하는 표준 방법을 사용하여 측정한다. 세포자멸사를 측정하기 위하여, 세포독성 검정을 사용할 수 있다. 염색되는 세포는 유출성(leaky)이 되므로, 이들 검정은 혈장 막 투과성에 있어서의 증가를 측정하는 방사활성 또는 비-방사활성 검정일 수 있으며, 죽은 세포 내에서 미토콘드리아가 염료를 대사할 수 없는 반면, 살아있는 세포에서 미토콘드리아는 염료를 대사할 수 있다는 지식을 바탕으로 미토콘드리아의 물질대사 활성에 있어서의 감소를 측정하는 비색계 검정을 사용할 수 있다. 생물발광성 세포독성 검정(예를 들면, CytoTox-Glo™, 제조원: Promega)을 개발하여 세포 배양 배지내로 안정한 프로테아제 마커의 방출을 측정하였다. 프로테아제 활성은 강력한 효소 세포 사멸 마커로 고려되며 생존 및 죽은 세포의 비율적 측정으로서 사용될 수 있다(참조: Niles, A.L., 등. Anal Biochem, 366(2): 197-206, 15 July 2007).

세포 표면의 외부에 포스파티딜세린의 발생을 생성하는 막 비대칭에서의 변경과 같은 세포자멸사에 대한 조기 지시인자를 또한 측정할 수 있다(안넥신 V계 검정). 달리는, 카스파제의 활성화와 같은, 말기 단계의 세포자멸사를 세포의 집단 또는 개개 세포에서 측정할 수 있다. 또한, 미토콘드리아에 의한 시토크롬 C 및 AIF의 세포질내로의 방출의 측정 또는 염색체 DNA의 단편화를 측정할 수 있다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지화(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling: TUNEL)는 세포자멸사성 신호전달 캐스케이드로부터 생성되는 DNA 단편화를 검출하기 위한 일반적인 방법이다. 당해 검정은 특이적인 표지된 항체를 사용하여 부수적으로 측정되는 브롬화된 dUTP의 첨가를 촉매할 효소인, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 의해 확인될 수 있는 DNA내 닉의 존재에 달려있다.

세포독성은 상보체-지시되거나, 항체-지시되거나, 세포독성 분자 또는 세포의 결합과 직접 관련될 수 있다.

특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 시험관내 또는 생체외 세포 사멸 검정에서 측정된 것으로서, 20% 미만의 세포분해(즉 세포독성 %), 또는 10% 미만의 세포분해, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0%의 세포분해 또는 검출불가능한 세포분해(세포독성)의 세포독성을 나타낸다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 10nM의 항체 농도에서 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 세포독성을 나타낸다.

다른 구현예에서, 시험관내 또는 생체외 세포 사멸 검정에서 측정된 것으로서, 20% 미만의 세포분해(즉, 세포독성 %), 또는 10% 미만의 세포분해, 또는 5%, 4%, 3%, 2%의 세포분해, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 세포분해(세포독성)의 세포자멸사 활성을 나타낸다. 여전히 다른 구현예에서, 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 10nM의 항체 농도에서 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 세포자멸사 활성을 나타낸다.

여전히 다른 구현예에서, 항체는 시험관내 또는 생체외 세포 사멸 검정에서 측정된 것으로서, 약 50% 미만의 세포 독성, 또는 40%, 30%, 20%, 10% 미만의 세포 독성, 또는 5%, 4%, 3%, 2%의 세포 독성, 또는 심지어 0%의 세포독성 또는 검출불가능한 세포독성의 CDC 활성을 나타낸다. 여전히 다른 구현에에서, 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 100nM의 항체 농도에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 CDC 활성을 나타낸다. 추가의 구현예에서, 항체는 시험관내 또는 생체외 세포 사멸 검정에서 측정된것으로서, 약 50% 미만의 세포독성, 또는 40%, 30%, 20%, 10% 미만의 세포 독성, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 세포독성의 ADCC 활성을 나타낸다. 여전히 다른 구현예에서, 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 100nM의 항체 농도에서 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 ADCC 활성을 나타낸다.

본 발명은 키메라 힌지를 포함하는 항체, 항원-결합 단백질 및 Fc-융합 단백질을 제공하여, 감소된 효과기 기능을 추가로 제공한다. 본 발명의 이러한 재조합 폴리펩타이드의 특성은 하나 이상의 참조 단백질의 특성과 비교될 수있다. 참조로 하기 실시예, 또는 본 발명의 키메라 항체와 비교하여 상응하는 가변 영역 및 불변 영역(예를 들면 야생형 IgG1 C_H 영역(서열 번호 13) 또는 야생형 IgG4 C_H 영역(서열 번호 15))을 갖는 대조군 항체 및 항원-결합 단백질을 참조하며, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단백질에 대한 기능적 또는 약력학적 특성의 비교를 위해 특정의 시험 방법에서 사용될 수 있다. 상응하는 야생형 IgG C_H 영역은, "야생형" IgG CH 영역이 (N-말단으로부터 C-말단까지) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 함유하는 천연의 IgG 아미노산 서열로부터 기원한다는 점에서 본 발명의 키메라 C_H 영역과는 상이하다. 야생형 IgG는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖지만 천연의 IgG와 동일한 기능적 특성을 필수적으로 보유하는 변이체를 포함할 수 있다. 상응하는 항체 또는 폴리펩타이드는 키메라 CH 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩타이드와 동일한 표적 결합 도메인(예를 들면, V_H 및/또는 V_L)을 갖도록, 또는 달리는 특정의 검정에서 비교 목적을 위해 필수적으로 동일한 기능성을 갖도록 조립될 수 있다.

본 발명의 분리된 항체는 FcγR를 발현하는 세포, 예를 들면, 효과기 세포에 약하게결합하지만 야생형 IgG1 또는 IgG4 C_H 영역을 포함하는 상응하는 항체의 효과기 기능과 비교하여, 세포독성 및 증식과 같은 효과기 기능을 결여함이 실시예에서 밝혀졌다.

본 발명의 추가의 국면

하나의 국면에서, 본 발명은 키메라 힌지 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 국면에서, 키메라 힌지 영역은 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)을 포함한다. 다른 국면에서, 키메라 힌지 영역은 N-말단으로부터 C-말단까지 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열 및 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)을 포함한다.

다른 국면에서, 키메라 힌지 영역은 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로부터 선택된 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치로부터의 상부 힌지 아미노산 서열, 및 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치로부터 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)을 포함한다.

본 발명은 N-말단으로부터 C-말단까지, CH1 도메인, 키메라 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서:

CH1 도메인은 212 내지 215번(EU 번호매김) 위치로부터의 적어도 아미노산 서열 DKKV 또는 DKRV를 포함하고, 키메라 힌지는 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열 및 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)를 포함하고, CH2 도메인은 237 내지 340번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG4 CH2 도메인 아미노산 서열을 포함하고, CH3 도메인은 341 내지 447번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 CH3 도메인 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30 또는 서열 번호 31을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 불변 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 38 또는 37을 포함하거나 이로 이루어진 불변 영역을 지닌 적어도 하나의 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

표 7. 대표적인 키메라 C_H 작제물

일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 항체, 항원-결합 단백질 및 수용체-Fc 융합 단백질로이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 분리된 항체, 항원-결합 단백질, 또는 수용체-Fc 융합 단백질은 CH 영역, N-말단으로부터 C-말단까지, CH1 도메인, 키메라 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 작제물을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 아미노산 서열 DKKV 또는 DKRV를 포함하고, 키메라 힌지는 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열을 포함하고, CH2 도메인은 237 내지 340번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG4 CH2 도메인 서열, 또는 이의 천연 변이체를 포함하며, CH3 도메인은 341 내지 447번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 CH3 도메인 서열, 또는 이의 천연 변이체를 포함하고, CH 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%의 동질성을 지닌 아미노산을 갖는다.

다른 구현예에서, 본 발명은 CH 영역, N-말단으로부터 C-말단까지, CH1 도메인, 키메라 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 분리된 항체, 항원-결합 단백질, 또는 수용체-Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 CH1 도메인은 아미노산 서열 DKKV 또는 DKRV를 포함하고, 키메라 힌지는 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열을 포함하고, CH2 도메인은 237 내지 340번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG4 CH2 도메인 서열, 또는 이의 천연 변이체를 포함하며, CH3 도메인은 341 내지 447번(EU 번호매김) 위치로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 CH3 도메인 서열, 또는 이의 천연 변이체를 포함하고, CH 영역은 서열 번호 30 또는 서열 번호 31에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%의 동질성을 지닌 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서, CH 영역은 서열 번호 38 또는 서열 번호 37에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 지닌 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 이러한 "변이체" 또는 "천연 변이체" C_H 도메인, 예를 들어 Fc 도메인 및 Fc 도메인 단편은, 본 발명의 이러한 C_H 도메인이 기원하지만, 필수적으로 바람직하게 기능하는 야생형 서열과 비교하여 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, C_H 도메인 또는 Fc 도메인은 특정의 FcγR 발현 세포, 예를 들면, 효과기 세포에 대해 약한 결합을 나타내거나 결합하지 않음으로써 세포독성 및 증식과 같은 변경된 효과기 기능을 생성한다. 하나의 실시예에서, 이러한 변이체는 2특이적 분자의 분리를 위해 가공된 CH3 도메인 내에서 아미노산의 첨가, 결실, 또는 치환과 같은 변형을 포함한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역, 또는 이러한 중쇄 불변 영역에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%를 지닌 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역, 또는 이러한 중쇄 불변 영역에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%를 지닌 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 33에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 기술된 서열에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 불변 영역(C_H)을 포함하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 32에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 30의 아미노산 서열 또는 서열 번호 28에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 기술된 서열에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 불변 영역(C_H)을 포함하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.

여전히 다른 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 38의 아미노산 서열 또는 서열 번호 36에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 37의 아미노산 서열 또는 서열 번호 35에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 기술된 서열에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 불변 영역(C_H)을 포함하는, 분리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 구현예에서, 분리된 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 구현예에서, 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된, 키메라, 일본쇄 항체 또는2특이적 항체이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 33에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 31의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 기술된 서열에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 갖는 서열을 포함하는 Fc-함유 단백질이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 서열 번호 32에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 30의 아미노산 서열 또는 서열 번호 28에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 기술된 서열에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 갖는 서열을 포함하는 Fc-함유 단백질이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 38의 아미노산 서열 또는 서열 번호 36에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 번호 37의 아미노산 서열 또는 서열 번호 35에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 기술된 서열에 대해 적어도 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 동질성을 갖는 서열을 포함하는 Fc-함유 단백질이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 기술된 항체, 항원-결합 단백질 또는 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 세포독성 또는 세포독성 효과기 기능을 결여한 항체 또는 항원-결합 단백질을 제공한다. 일부 국면에서, 항원 또는 항원-결합 단백질은 세포독성 또는 세포독성 효과기 기능을 결여하며 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함한다.

본 발명은 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 CH 영역을 포함하는 상응하는 항체의 세포독성 활성보다 적어도 10배 적거나, 적어도 50배 적거나, 적어도 100배 적거나, 적어도 1000배 적거나 적어도 10000배 적은 세포독성 활성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단백질을 제공한다.

본 발명은 FcγR에 결합할 수 있는 항체를 제공하며, 여기서 이러한 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 항체의 결합 친화성과 비교하여 보다 낮은 친화성을 가진 FcγR 에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 10nM, 또는 약 20 nM, 또는 약 30 nM, 또는 약 40 nM, 약 50 nM, 약 100 nM보다 큰 최대 1/2의 농도(EC₅₀)에서 FcγR을 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, FcγR은 사람 또는 시노몰구스(cynomolgus) FcγRII이다. 다른 구현예에서, FcγR은 FcγRIIA 또는 FcγRIIB이다. 일부 구현예에서, 항체는, 친화성(K_D 값)이 약 10 μM, 또는 약 20 μM, 또는 약 30 μM, 또는 약 40 μM, 약 50 μM, 약 100 μM인 FcγRIIA에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 또는 재조합 폴리펩타이드는 FcγRIIB에 대한 항체 또는 재조합 폴리펩타이드의 친화성보다 큰 친화성으로 FcγRIIA에 결합한다.

일부 구현예에서, 항체는, 약 10μM, 또는 약 20μM, 또는 약 30μM, 또는 약 40 μM, 약 50 μM, 약 100 μM의 친화성(KD 값)을 가지면서 FcγRIIB에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 재조합 폴리펩타이드는 FcγRIIB에 대한 항체 또는 재조합 폴리펩타이드의 친화성과 실질적으로 유사한 친화성(K_D으로 FcγRIIA에 결합한다.

특정의 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체가 FcγRIIA에 대해 야생형 친화성을 가질 수 있지만, FcγRIIA-중재된 활성에 관여시키고, 심지어 간접적으로 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 어떠한 한가지 이론에 억매이지 않고, 특정의 항체, 및 따라서 치료제는 억제성 수용체 FcγRIIB와의 약화된 상호작용(야생형 항체와 비교하여)으로부터 유리할 수 있으며, 이는 활성화를 위하여 활성화 FcγRIIA와 억제성 FcγRIIB 수용체 사이에 균형을 이동시킬 수 있다.

본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함하고 다양한 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 모노클로날 항체의 생산을 포함한다. 본 발명은 a) 본 발명의 항체, 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포유동물 숙주 세포내로 도입시키는 단계, b) 상기 항체를 발현시킬 수 있는 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 c) 상기 세포 배양 배지로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들면, 문헌(참조: Kohler 등, Nature 256, 495 (1975)에 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 생산될 수 있거나, 재조합 DNA 방법으로 생산할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 파아지 항체 라이브러리로부터, 예를 들면, 문헌(참조: Clackson 등, Nature 352, 624-628 (1991) 및 Marks 등, J. MoI. Biol. 222, 581-597 (1991)에 기술된 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 모노클로날 항체는 어떠한 적합한 공급원으로부터도 수득할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모노클로날 항체는 예를 들면, 표면상에 항원, 또는 목적한 항원을 암호화하는 핵산을 발현하는 세포 형태의, 목적한 항원으로 면역화시킨 마우스로부터 수득된 림프구세포로부터 제조된 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 랫트, 토끼, 개, 영장류 등과 같은 면역화된 사람 또는 비-사람 포유동물의 항체-발현 세포로부터 기원한 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 사람 항체이다. 사람 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 사람 면역 시스템의 일부를 수반하는 유전자삽입 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 유전자삽입 및 트랜스염색체 마우스는 VELOCIMMUNE 마우스, HuMAb 마우스 및 KM 마우스 각각으로 본원에 언급된 마우스를 포함하며, 총체적으로 본원에서 "유전자삽입 마우스"로 언급되고 본원의 상기에 기술되어 있다.

이들 유전자삽입 마우스로부터의 비장세포를 사용하여 잘 공지된 기술에 따른 사람 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성할 수 있다. 본 발명의 사람 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체, 또는 다른 종으로부터 기원한 본 발명의항체는 또한 목적한 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 유전자삽입성인 다른 비-사람 포유동물 또는 식물의 생성 및 이로부터 회복가능한 형태의 항체의 생산을 통해 유전자삽입적으로 생성될 수 있다. 포유동물에서 유전자삽입성 생산과 관련하여, 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유동물의 우유 속에서 생산되어 회수될 수 있다. 예를 들면, 제US 5,827,690호, 제US 5,756,687호, 제US 5,750,172호 및 제US 5,741,957호를 참조한다. 목적한 Ig 중쇄 및 경쇄 서열을 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 마우스 UP-II 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 유전자삽입 동물의 뇨에서 목적한 단백질의 발현 및 분비를 위해 가공할 수 있다(참조: 예를 들면, 제US 5,824,543호).

또한 본 발명의 사람 항체 또는 다른 종으로부터의 본 발명의 항체는 파아지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보소옴 디스플레이, 및 다른 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 디스플레이형 기술을 통해, 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있으며 수득되는 분자는 친화성 성숙과 같은, 추가의 성숙에 적용시킬 수 있고, 이러한 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Hoogenboom 등, J. MoI . Biol . 227, 381 (1991) (파아지 디스플레이), Vaughan 등, Nature Biotech 14, 309 (1996) (파아지 디스플레이), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (리보소옴 디스플레이), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (파아지 디스플레이), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla 등, PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel 등, Nucl . Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom 등, Immunol . Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), 및 제US 5,733,743호). 디스플레이 기술을 이용하여 사람이 아닌 항체를 생산하는 경우, 이러한 항체는 사람화될 수 있다.

본 발명의 가공된 중쇄 불변(C_H) 영역은 감소된 효과기 기능을 제공할 것이다. 사람 경쇄 불변(C_L) 영역, 카파 또는 람다 각각을 사용할 수 있다. 경우에 따라, 본 발명의 항체의 부류는 공지된 방법으로 스위칭(switching)시킬 수 있다.

본 발명은 숙주 세포에 의해 생산된 본 발명의 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 a) VELOCIMMUNE® 마우스를 항체 면역 반응을 유발하기에 충분한 항원으로 면역화시키는 단계, b) 이러한 마우스로부터 혈청을 수득하고 당해 항원에 대해 항체 역가(antibody titer)를 시험하는 단계, c) 상승된 항체 역가를 갖는 것으로 입증된 이러한 면역화된 마우스의 비장으로부터 B 세포를 수거하고 당해 B 세포를 마우스 비장 세포와 융합시켜 이러한 하이브리도마를 형성시키는 단계, d) 이러한 하이브리도마로부터의 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 가진 키메라 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계, e) 바람직한 특성을 가진 키메라 항체를 선택하는 단계, 및 f) 이러한 항체의 마우스 불변 영역을, 예를 들면, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함하는 본 발명의 사람 불변 영역으로 교체하는 단계를 포함하여, 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 완전한 길이의 IgG 항체이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 단편 또는 일본쇄 항체이다. 여전히 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 완전한 사람 IgG 항체이다.

본 발명의 일부 국면에서, 항체는 2특이적 항체이고, 여기서 이러한 분자 또는 항체의 각각의 항원-결합 도메인은 V_L 영역과 쌍을 이룬 V_H 영역을 포함한다. 특정의 구현예에서, 2특이적 항체는 상이하고, 명백한 V_H 영역과 일반적인 V_L 영역을 포함하는 제1의 항원-결합 도메인 및 제2의 항원 결합 도메인 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1의 항원에 특이적으로 결합하는 제1의 항원-결합 도메인을 포함하는 2특이적 항체가 작제되며, 여기서 제1의 항원-결합 도메인은 제1의 항원에 대해 지시된 제1의 항원으로부터 기원한 V_H 영역 / V_L 영역 쌍; 및 제2의 항원에 특이적으로 결합하는 제2의 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 제2의 항원-결합 도메인은 제1의 항원체로부터 기원한 V_L 영역(예를 들면,, 제1의 항체의 항원-결합 도메인 내에 포함된 동일한 V_L 영역)과 쌍을 이룬 제2의 항원에 대해 지시된 제2의 항체로부터 기원한 V_H 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체, 즉, 2특이적인 항체내 제1의 항체 또는 제2의 항체 또는 항체 둘 다의 적어도 하나의 중쇄는 변형되어 키메라 중쇄 불변 영역(C_H 영역)을 포함한다. 다른 구현예에서, 2특이적 항체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함한다.

본 발명의 일부 국면에서, 상이한 특이성의 2개의 항체는 동일한 경쇄를 사용한다. 특정의 구현예에서, 2특이적 항체내 Ig 중쇄들 중 적어도 하나의 중쇄는 변형되어 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 중의 적어도 하나는 CH3 내에서 변형되어 용이한 분리를 위해, 단백질 A와 같은, 친화성 시약에 대한 2특이적 항체에 대한 차등적인 친화성을 생성한다. 다른 구현예에서, 이러한 2특이적 항체내 중쇄 중의 적어도 하나는 IMGT 번호매김 시스템내 i) 95R 또는 ii) 95R 및 96F(95R 및 96F는 EU 번호매김 시스템에서 435R 및 436F에 상응한다)에서 아미노산 변형을 포함한다.

다른 국면에서, 항체는 2특이적 항체이고, 여기서 2특이적 항체는:

(a) 제1의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1의 중쇄,

(b) 제2의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제2의 중쇄,

(c) 제1 또는 제2의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 일반적인 경쇄 항원-결합 도메인

여기서 (a) 또는 (b) 또는 (a) 및 (b) 둘 다의 중쇄는 서열 번호 1 또는 서열 번호 31을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

여전히 다른 국면에서, 항체는 2특이적 항체이고, 여기서 당해 2특이적 항체는:

(a) 제1의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1의 중쇄,

(b) 제2의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제2의 중쇄,

(c) 제1 또는 제2의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 일반적인 경쇄 항원-결합 도메인

여기서 (a) 또는 (b) 또는 (a) 및 (b) 둘 다의 중쇄는 서열 번호 2 또는 서열 번호 30을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

다른 구현예에서, 이러한 2특이적 항체내 (a) 또는 (b)의 중쇄 중의 적어도 하나는 (i) 435R 또는 (ii) 435R 및 436F(EU 번호매김)(IMGT 번호매김 시스템내 (i) 95R 또는 (ii) 95R 및 96F)에서 아미노산 변형을 포함한다.

다른 국면에서, 항체는 2특이적 항체이고, 여기서 당해 2특이적 항체는 (a) 제1의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1의 중쇄(당해 제1의 중쇄 불변 영역은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 또는 서열 번호 31을 포함한다); (b) 제2의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제2의 중쇄(당해 제2의 중쇄 불변 영역은 서열 번호 38 또는 서열 번호 37을 포함한다); 및 (c) 제1 또는 제2의 표적 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 일반적인 경쇄 항원-결합 도메인을 포함한다.

하나의 구현예에서, 항체는 일가 항체이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 1가 항체이고, 여기서 당해 항체는: i) 당해 1가 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 분자(당해 작제물은 선택된 항원 특이적인 항체의 V_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드 서열은 Ig의 불변 C_L 영역을 암호화하며, 여기서 선택된 항원 특이적인 항체의 V_L 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 C_L 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결되고, 여기서 C_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 변형되어 C_L 영역은 폴리클로날 사람 IgG의 존재하에서 또는 동물 또는 사람에게 투여되는 경우 C_L 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 이황화물 결합 또는 공유 결합을 형성할 수 있는 어떠한 아미노산도 함유하지 않는다)를 제공하는 단계; ii) 상기 1가 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 작제물(당해 작제물은 선택된 항원 특이적인 항체의 V_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 뉴클레오타이드 서열은 사람 Ig의 불변 C_H 영역을 암호화하며, 여기서 C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 당해 뉴클레오타이드 서열은 변형되어 있고 폴리크로날 사람 IgG의 존재하에서 또는 사람과 같은 동물에게 투여되는 경우 사람 Ig의 C_H 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 이황화물 결합 또는 공유결합 또는 안정한 비-공유결합의 중쇄간 결합의 형성에 관여하는 어떠한 아미노산 잔기로 포함하지 않으며, 여기서 선택된 항원 특이적인 항체의 V_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결되어 있다)을 제공하는 단계; iii) 상기 1가 항체를 생산하기 위한 세포 발현 시스템을 제공하는 단계; iv) (iii)의 세포 발현 시스템의 세포 내에서 (i) 및 (ii)의 핵산 작제물을 동시-발현함으로써 상기 1가 항체를 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 작제된다.

유사하게, 하나의 구현예에서, 항체는 i) 가변 영역 또는 상기 영역의 항원-결합 도메인, 및 ii) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 38, 또는 서열 번호 37을 포함하는 면역글로불린의 C_H 영역 또는 이의 단편을 포함하는 1가 항체이며, 여기서 C_H 영역 또는 이의 단편은 변형되어 동일한 C_H 영역 또는 이황화물 결합을 또는 폴리클로날 사람 IgG의 존재 하에서 동일한 C_H 영역과 다른 공유결합성 또는 안정한 비-공유결합성 중쇄간 결합을 형성할 수 있는 어떠한 아미노산 잔기도 포함하지 않는다.

다른 추가의 구현예에서, 상기 1가 항체의 서열은 변형되어 이는 N-연결된 글리코실화를 위한 어떠한 수용체 부위도 함유하지 않는다.

일반적으로, 본원에 기술된 항체는 이러한 변형된 아미노산의 어떠한 적합한 수의 포함 및/또는 접합된 치환체와의 연합에 의해 변형될 수 있다. 당해 내용에서 적합성은 일반적으로 항체 또는 항원 결합 단편의 선택성 및/또는 관련된 특이성을 적어도 실질적으로 보유하는 능력에 의해 측정된다. 변형된 아미노산은, 예를 들면, 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 잔기에 접합된 아미노산, 또는 유기 유도체화제에 접합된 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 변형된 아미노산의 포함은, 예를 들면, 폴리펩타이드 혈청 반감기를 추가로 증가시키거나, 폴리펩타이드 항원성을 감소시키거나, 폴리펩타이드 저장 안정성을 증가시키는데 유리할 수 있다. 아미노산(들)은 예를 들면 재조합 생산(예를 들면, 포유동물 세포 내에서 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서 N-연결된 글리코실화) 동안에 동시-해독적으로 또는 후-해독적으로 변형되거나 합성 수단에 의해 변형된다. 변형된 아미노산의 비-제한적 예는 글리코실화된 아미노산, 황산화된 아미노산, 프레닐화된(예를들면, 파르네실화된, 게라닐게라닐화된) 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 아실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 카복실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 등을 포함한다. 아미노산의 변형시 숙련가를 안내하기에 적절한 참조문헌은 문헌 전체에서 충분하다. 예시적인 프로토콜은 문헌(참조: Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ)에서 찾을 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 중합체에 대한 공유결합성 접합에 의해 화학적으로 변형시켜, 예를들면 이들의 순환하는 반감기를 추가로 증가시킬 수 있다. 예시적인 중합체 및, 이들을 펩타이드에 부착시키는 방법은, 예를 들면 제US 4,766,106호, 제US 4,179,337호, 제US 4,495,285호 및 제US 4,609,546호에 나열되어 있다. 추가의 예시적인 중합체는 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들면, 분자량이 약 1,000 내지 약 40,000, 예를 들면, 약 2,000 내지 약 20,000, 예를 들면, 약 3,000-12,000 g/mol인 PEG)을 포함한다.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 방사선표지된 아미노산을 포함하는 항체가 제공된다. 방사선 표지된 항체는 진단 및 치료 목적 둘 다에 대해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 치료제 또는 검출가능한 마커인 분자에 접합될 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 세포독성제, 예를 들면, 방사선동위원소이다. 펩타이드용 방사선동위원소의 예는 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, 및 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, 및 ²²⁵Ac를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 방사선표지된 아미노산 및 관련된 펩타이드 유도체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Junghans 등, in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) 및 제US 4,681,581호, 제US 4,735,210호, 제US 5,101,827호, 제US 5,102,990호(제US RE35,500호), 제US 5,648,471호 및 제US 5,697,902호). 예를 들면, 방사선동위원소는 클로라민 T 방법에 의해 접합될 수 있다. 추가의 구현예에서, 검출가능한 마커는 방사선표지, 효소, 발색단, 또는 형광성 표지일 수 있다.

추가의 국면에서, 본 발명은 폴리펩타이드, 예를 들면, 본 발명의 항체, 항원-결합 단백질 또는 수용체-Fc 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 내용에서 발현 벡터는 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터(발현 조절 성분의 적합한세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는, 어떠한 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40, 세균 플라스미드, 파아지 DNA, 바쿨로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파아지 DNA의 조합으로부터 기원한 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터의 유도체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체를 암호화하는 핵산 분자는 예를 들면, 선형 발현 성분(예를 들면, Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)에 기술된 바와 같음), 압축된 핵산 벡터(예를 들면, 제US 6,077,835호 및/또는 제WO 00/70087호에 기술된 바와 같음), 또는 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119와 같은 플라스미드 벡터를 포함하는, 네이크키드 (naked) DNA 또는 RNA 벡터에 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 이의 용도는 당해 분야에 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, 제US 5,589,466호 및 제US 5,973,972호).

다른 구현예에서, 벡터는 기술된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다.

하나의 구현예에서, 벡터는 세균 세포 내에서 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예는 BlueScript(제조원: Stratagene), pIN 벡터(참조: Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET 벡터(제조원: 위스콘신주 매디슨 소재의 Novagen) 등을 포함한다.

발현 벡터는 또한 또는 달리는 효모 시스템 내에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템 내에서의 발현에 적합한 어떠한 벡터도 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들면, 효모 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH(참조: F. Ausubel 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), 및 Grant 등, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987))와 같은 구성적 또는 유도성 프로포터를 포함하는 벡터를 포함한다.

본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공되며, 여기서 당해 핵산 분자는 포유동물 숙주 세포 내에서의 발현에 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다.

발현 조절 서열은 가공되어 목적한 유전자의 전사, 및, 다양한 세포 시스템에서 단백질의 후속적인 발현을 조절하고 구동한다. 플라스미드는 목적한 발현가능한 유전자를 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 선택가능한 마커, 오퍼레이터 등과 같은 바람직한 성분을 포함하는 발현 조절 서열(즉, 발현 카세트)와 결합시킨다. 본 발명의 발현 벡터에서, 항체를 암호화하는 핵산 분자는 어떠한 적합한 프로모터, 인핸서, 선택가능한 마커, 오퍼레이터, 억제인자 단백질, 폴리A 말단 서열 및 다른 발현-촉진 성분을 포함하거나 이와 연합될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서 "프로모터"는 이것이 작동적으로 연결된, 즉 적절한 신호가 존재하는 경우 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사를 허용하도록 하는 방식으로 연결된 DNA 서열의 전사를 지시하기에 충분한 DNA를 나타낸다. 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 당해 분야에 공지된 어떠한 프로모터 또는 인핸서 성분의 조절 하에 위치할 수 있다. 이러한 성분의 예는 강력한 발현 프로모터(예를 들면, 사람 CMV IE 프로모터/인핸서 또는 CMV 주요 IE(CMV-MIE) 프로모터, 및 또한 RSV, SV40 레이트 프로모터(late promoter), SL3-3, MMTV, 우비퀴틴(Ubi), 우비퀴틴 C(UbC), 및 HIV LTR 프로모터)를 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터는 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC 및 HIV LTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터를 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 유효한 폴리(A) 말단 서열, 이. 콜라이(E. coli) 내에서 플라스미드 생산을 위한 복제 오리진, 선택가능한 마커로서 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위(예를 들면, 폴리링커)에 작동적으로 연결시킬 수 있다. 핵산은 또한 CMV IE와 같은 구성적 프로모터와 대치되는 것으로서 조절가능한 유도성 프로모터(유도성, 억제성, 발달적으로 조절된)를 또한 포함할 수 있다(숙련가는, 이러한 용어가 특정 조건 하에서 유전자 발현의 정도의 실질적인 기술인자임을 인지할 것이다).

선택가능한 마커는 당해 분야에 잘 공지된 성분이다. 선택가능한 조건 하에서, 적절한 선택가능한마커를 발현하는 세포만이 생존할 수 있다. 일반적으로, 선택가능한 마커 유전자는 단백질, 일반적으로 세포 배양물 속에서 다양한 항생제에 대해 내성을 부여하는 효소을 발현한다. 다른 선택성 조건에서, 형광성 단백질 마커를 발현하는 세포는 가시적으로 제조됨으로써, 선택가능하다. 구현예는 베타-락타마제(bla)(베타-락탐 항생제 내성 또는 암피실린 내성 유전자 또는 ampR), bls(블라스티시딘 내성 아세틸 트랜스퍼라제 유전자), bsd(블라스티시딘-S 데아미나제 내성 유전자), bsr(블라스티시딘-S 내성 유전자), Sh ble(Zeocin® 내성 유전자), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt)(하이그로마이신 내성 유전자), tetM(테트라사이클린 내성 유전자 또는 tetR), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(npt)(네오마이신 내성 유전자 또는 neoR), kanR(가나마이신 내성 유전자), 및 pac(푸로마이신 내성 유전자)를 포함한다.

특정의 구현예에서, 벡터는 bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 녹색 형광성 단백질(GFP), 향상된 녹색 형광성 단백질(eGFP), 시아노 형광성 단백질(CFP), 향상된 시아노 형광성 단백질(eCFP), 또는 황색 형광성 단백질(YFP)을 암호화하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, 진핵 세포 내에서 유전자 발현은 궁극적으로 조절성 융합 단백질(RFP)에 의해 조절되는 오퍼레이터에 의해 조절된 강력한 프로모터를 사용하여 강하게 조절할 수 있다. RFP는 전사 차단 도메인, 및 이의 활성을 조절하는 리간드-결합 도메인으로 필수적으로 이루어진다. 이러한 발현 시스템의 예는 제US20090162901A1호에 기술되어 있으며, 이는, 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 것으로서, "오퍼레이터"는, 유전자가 오퍼레이터에 대한 RFP의 결합에 의해 조절될 수 있고, 그 결과 목적한 유전자, 즉, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드의 전사를 방지하거나 허용하는 방식으로 유전자 속에 또는 근처에 도입되는 DNA 서열을 나타낸다. 원핵 세포 및 박테리오파이지내 다수의 오퍼레이터는 잘 특징화되어 있다(참조: Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). 이들은 LexA 펩타이드에 결합하는, 이. 콜라이의 LexA 유전자의 오퍼레이터 영역, 및 이. 콜라이의 LacI 및 trpR에 의해 암호화된 리프레서 단백질에 결합하는, 락토즈 및 트립토판 오퍼레이터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들은 또한 람다 cI 및 P22 arc에 이해 암호화된 리프레서 단백질에 결합하는 람다 P_R 및 파아지 P22 ant/ mnt 로부터의 박테리오파아지 오퍼레이터를 포함한다. 일부 구현예에서, RFP의 전사 차단 도메인이 NotI과 같은 제한 효소인 경우, 오퍼레이터는 이러한 효소에 대한 인식 서열이다. 당해 분야의 숙련가는, 오퍼레이터가 프로모터에 대해 인접하게 또는 3'에 위치하여 이것이 프로모터에 의한 전사를 조절할 수 있어야 함을 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,972,650호는, tetO 서열이 TATA 박스로부터 특정 거리 내에 있어야 함을 명시하고 있다. 구체적인 구현예에서, 오퍼레이터는 바람직하게는 프로모터의 바로 하부에 위치한다. 다른 구현예에서, 오퍼레이터는 프로모터의 10개 염기 쌍 내에 위치한다.

특정의 구현예에서, 오퍼레이터는 tet 오퍼레이터(tetO), NotI 인식 서열, LexA 오퍼레이터, 락토즈 오퍼레이터, 트립토판 오퍼레이터 및 Arc 오퍼레이터(AO)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 리프레서 단백질은 TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, LambdaC1 및 GAL4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 전사 차단 도메인은 진핵세포 리프레서 단백질, 예를 들면, GAL4로부터 기원한 리프레서 도메인으로부터 기원한다.

예시적인 세포 발현 시스템에서, 세포는 테트라사이클린 리프레서 단백질(TetR)을 발현하도록 가공되며 목적한 단백질은, 이의 활성이 TetR에 의해 조절되는 프로모터의 전사 조절 하에 위치한다. 2개의 탠덤(tandem) TetR 오퍼레이터(tetO)는 벡터내 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하부에 위치한다. 이러한 벡터 내에서 CMV-MIE 프로모터에 의해 지시된 목적한 단백질을 암호화하는 유전자의 전사는 테트라사이클린 또는 일부 다른 적합한 유도인자(예를 들면, 독시사이클린)의 부재 하에서 TetR에 의해 차단될 수 있다. 유도인자의 존재 하에서, TetR 단백질은 tetO에 결합할 수 없으므로, 목적한 단백질의 전사 이후에 해독(발현)이 일어난다. (참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,435,553호, 이는, 전문이 본원에 참조로 포함된다.)

다른 예시적인 세포 발현 시스템은 TetR-ER_LBDT2 융합 단백질과 같은 조절성 융합단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질의 전사 차단 도메인은 TetR이고 리간드-결합 도메인은 T2 돌연변이를 지닌 에스트로겐 수용체 리간드-결합 도메인(ER_LBD)(ER_LBDT2; 참조: Feil 등. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757)이다. tetO 서열이 강력한 CMV-MIE 프로모터의 하부에 및 근접하게 위치한 경우, CMV-MIE/tetO 프로모터로부터 목적한 뉴클레오타이드 서열의 전사는 타목시펜의 존재 하에서 차단되었고 타목시펜의 제거에 의해 차단되지 않았다. 다른 예에서, 15개의 아미노산 링커에 의해 연결된 2개의 Arc 단백질로 이루어진 단일 쇄 이량체로 이루어진 융합 단백질인, 융합 단백질 Arc2-ER_LBDT2 및 ER_LBDT2 (상기 참조)는 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하부의 Arc 오퍼레이터(AO), 보다 구체적으로 2개의 탠덤 arc 오퍼레이터를 포함한다. 세포주는 Arc2-ER_LBDT2에 의해 조절될 수 있으며, 여기서 목적한 단백질을 발현하는 세포는 CMV-MIE/ArcO2 프로모터에 의해 구동되며 타목시펜의 제거로 유도성이 된다. (참조: 예를 들면, 제US 20090162901A1호, 이는 본원에 참조로 포함된다)

일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/AO2 하이브리드 프로모터를 포함한다.

본 발명의 벡터는 또한 목적한 유전자의 복제를 촉진시키기 위하여 재조합 기술을 위한 Cre-lox 도구를 사용할 수 있다. Cre-lox 전략은 적어도 2개의 성분: 1) 2개의 loxP 부위 사이에 재조합을 촉매하는 효소인, Cre 리컴비나제; 및 2) loxP 부위(예를 들면, 재조합이 일어나는 8-bp 코어 서열, 및 2개의 플랭킹(flanking) 13-bp의 역전된 반복체로 이루어진 특이적인 34-염기쌍 bp 서열) 또는 돌연변이체 lox 부위를 필요로 한다. (참조; 예를 들면, Araki 등. PNAS 92:160-4 (1995); Nagy, A. 등. Genesis 26:99-109 (2000); Araki 등. Nuc Acids Res 30(19):e103 (2002); 및 제US20100291626A1호, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다). 다른 재조합 전략에서, 효모-기원한 FLP 리컴비나제는 공통 서열 FRT과 함께 이용될 수 있다(참조: 또한, 예를 들면, Dymecki, S. PNAS 93(12): 6191-6196).

다른 국면에서, 유전자(즉, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)은 발현 카세트의 발현-향상 서열 내에 삽입되어, 프로모터에 임의로 작동적으로 연결되며, 여기서 프로모터-연결된 유전자는 제1의 리컴비나제 인지 부위에 의해 5' 플랭킹되며 제2의 리컴비나제 인지 부위에 의해 3' 플랭킹된다. 이러한 리컴비나제 인지 부위는 발현 시스템의 숙주 세포 내에서 Cre-중재된 재조합을 허용한다. 일부 예에서, 제2의 프로모터-연결된 유전자는 제1 유전자의 하부(3')에 존재하며 제2의 리컴비나제 인지 부위에 의해 3' 플랭킹된다. 여전히 다른 예에서, 제2의 프로모터-연결된 유전자는 제2의 리컴비나제 부위에 의해 5' 플랭킹되며, 제3의 리컴비나제 인지 부위에 의해 3' 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 리컴비나제 인지 부위는 loxP 부위, lox511 부위, lox2272 부위, 및 FRT 부위로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 리컴비나제 인지 부위는 상이하다. 추가의 구현예에서, 숙주 세포는 Cre 리컴비나제를 발현할 수 있는 유전자를 포함한다.

하나의 구현예에서, 벡터는 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 제1의 유전자, 및 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 제2의 유전자를 포함한다.

일부 구현예에서, 벡터는 소포체(ER) 내에서 단백질 폴딩(folding)에 관여하는 유전자의 발현의 조절을 통해 단백질 생산/단백질 분비를 향상시킬 수 있는 X-박스-결합-단백질 1(mXBP1)을 추가로 포함한다. (참조: 예를 들면, Ron D, and Walter P. Nat Rev Mol Cell Biol.8:519-529 (2007)).

용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현시키기에 적합한 어떠한 세포도 포함한다. 세포는 원핵세포 및 진핵세포(단일-세포 또는 다중-세포), 세균 세포(예를 들면, 이. 콜라이 , 바실러스 아종, 스트렙토마이세스 ( Streptomyces ) 아종, 등), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들면, 에스 . 세레비지아에 (S. cerevisiae ), 에스 . 폼베 (S. pombe ), 피. 파르토리스 (P. partoris ), 피. 메타놀리카 (P. methanolica ) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들면, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 예를 들면, 하이브리도마 또는 콰드로마와 같은 세포 융합체를 포함한다. 특정의 구현예에서, 세포는 사람, 원숭이, 고릴라, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 진핵 세포이고 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들면, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들면, COS-7), 망막 세포, 베로(Vero), CV1, 신장(예를 들면, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 저켓, 다우디, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 위에서 언급한 세포로부터 기원한 세포주. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들면, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들면, PER.C6® 세포)를 포함한다.

심지어 추가의 국면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 2특이적 분자를 생산하는, 트랜스펙토마(transfectoma)와 같이, 재조합 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포의 예는 효모, 세균, 및 CHO 또는 HEK 세포와 같은 포유동물 세포를 포함한다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 항체의 발현을 암호화하는 서열을 포함하는 세포 게놈내로 안정하게 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 항체의 발현을 암호화하는 서열을 포함하는, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 성분과 같은 비-통합된(즉, 에피소옴) 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 플라스미드로 숙주 세포를 안정하게 형질감염시킴으로써 생산된 세포주를 제공한다.

추가의 국면에서, 본 발명은, 본 발명의 항체, 또는 항원-결합 단백질, 또는 수용체-Fc 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 a) 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 하이브리도마 또는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 항체, 또는 항원-결합 단백질, 또는 수용체-Fc 융합체 (상기 참조)를 정제하는 단계를 포함한다.

심지어 추가의 국면에서, 본 발명은 본원에서 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항원-결합 단백질 또는 수용체-Fc 융합 단백질, 또는 본원에 정의한 바와 같은 2특이적 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 및 또한 문헌(참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995)에 기술된 것과 같은 통상의 기술에 따라 어떠한 다른 공지된 보조제 및 부형제와 함께 제형화될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 및 또한 어떠한 다른 공지된 보조제 및 부형제는 본 발명의 선택된 항체 및 선택된 투여 방식에 적합하여야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물 속의 활성 성분의 실제 용량 수준을 변화시켜 약물 물질의 적절한 안전성, 특수 환자를 위한 바람직한 치료학적 반응, 조성물, 및 투여 방식을 달성하는데 효과적인 활성 성분을 양을 수득할 수 있다. 선택된 용량 수준은 다양한 약력학적 인자에 따라 변할 것이다.

약제학적 조성물은 어떠한 적합한 경로 및 방식으로도 투여될 수 있다. 생체 내에서 본 발명의 항체의 적합한 투여 경로는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다(참조: Daugherty, AL, and Msrny, RJ, Adv Drug Delivery Rev, 58(5-6): 686-706 (2006)).

본 발명의 표지된 항체는 질병 또는 질환을 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명은: (a) 표적 항원에 면역특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 사용하여 피검자의 세포또는 조직 시료 속에서 항원의 존재를 검정하는 단계; 및 (b) 항원의 수준을 대조군 수준, 예를 들어, 정상 조직 시료 속의 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항원의 대조군 수준과 비교된 항원의 검정된 수준에 있어서의 증가는 질병 또는 질환의 척도, 또는 질병 또는 질환의 중증도의 척도인, 질병 또는 질환의 검출 또는 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 당해 분야에 잘 공지된 면역조직화학적 방법을 사용하여 생물학적 시료속에서 항원 수준을 검정하는데 사용될 수 있다. 단백질을 검출하는데 유용한 다른 항체-계 방법은 효소 연결된 면역검정(ELISA) 및 방사선면역검정(RIA)과 같은 면역검정을 포함한다. 적합한 항체 표지를 이러한 키트 및 방법에 사용할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 표지는 알칼린포스파타제 및 글루코즈 옥시다제와 같은 효소 표지; 요오드(¹²⁵I, ¹³¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 삼중수소(³H), 인듐(¹²¹In), 및 테크네튬(^{99 m} Tc)과 같은 방사선동위원소 표지; 및 루미놀 및 루시퍼라제와 같은 발광성 표지; 및 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광성 표지를 포함한다.

표지된 항체의 존재는 진단 목적을 위해 생체 내에서 검출될 수 있다. 하나의 구현에에서, 진단은: a) 피검자에게 유효량의 표지된 항체를 투여하는 단계; b) 표지된 항체가, 항원이 검출되는 부위에 농축되어 결합되지 않은 표지된 항원이 배경 수준으로 청소되도록 허용하기 위해 투여 후 시간 간격 동안 기다리는 단계; c) 배경 수준을 측정하는 단계: 및 d) 피검자에서 표지된 항체를 검출함으로써, 배경 수준을 초과하는 표지된 항체의 검출이, 피검자가 질병 또는 질환을 가짐을 나타내거나 질병 또는 질환의 중증임을 나타내는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에 따라서, 항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특수한 영상 시스템을 사용하여검출에 적합한 영상화 잔기로 표지한다. 배경 수준은 검출된 표지된 항체의 양을 특수한 영상 시스템을 위해 미리 측정된 표준 값과 비교함을 포함하는, 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명의 진단 방법에 사용될 수 있는 방법 및 시스템은 컴퓨터 단층촬영(CT), 양전자 방사 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상(MRI), 및 초음파 검사법과 같은 전신 스캔을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

실시예

다음의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 당해 분야의 통상의 기술자에게 설명하기 위해 제공되며, 본 발명자가 이들의 발명으로서 고려하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들면, 양, 농도, 온도 등)과 관련하여 정밀도를 보증하기 위한 노력이 이루어져 왔으나 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다.

실시예 1: 재조합 폴리 펩타이드의 제조

재조합 폴리펩타이드, 예를 들어 키메라 C_H IgG4(서열 번호 31) 및 키메라 C_H IgG1(서열 번호 30)를 생성하는 것은 표준 클로닝 기술을 사용하여 수행하였다. 우선, 키메라 IgG4 C_H를 2-단계 PCR 증폭 공정을 통해 생성시켰다. 2개의 PCR 단편인, 단편 1 및 2를 출발 작제물 pR85501(야생형 hIgG4 C_H DNA 함유) 및 프라이머 oSP030-oSP031 및 oSP032-oSP033(참조: 표 8)를 각각 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 바람직한 IgG2 하부 힌지 서열(이는 서열 번호 3을 암호화한다) 및 플랭킹 제한 부위를 단편 내로 도입하였다. 이들 2개의 단편을 이후에 PCR 프라이머 oSP031 및 oSP033을 사용하여 결합시켰다. 수득되는 서열을 pR85501 내로 Xho1-Not1 제한 부위를 통해 삽입하여 IgG2 하부 힌지 서열을 갖는 키메라 IgG4 C_H를 함유하는 벡터 작제물 pR85502를 생성하였다. 서열을 프라이머 KO_oLRC120 및 oKO021를 사용하여 확인하였다.

또한, 키메라 IgG1 C_H를 다수 단계 PCR 증폭을 통해 생성시켰다. 단편 1a는 주형 pR85503(이는 야생형 사람 IgG1 C_H DNA를 함유한다)으로부터의 프라이머 oSP031 및 oSP035(참조; 하기 표 8)를 사용하여 생성시켰다. 단편 2a를 프라이머 oSP036 및 oSP038로 주형으로서 pR85502(키메라 IgG4 C_H DNA를 함유)를 사용하여 증폭시켰다. 단편 3은 프라이머 oSP037 및 oSP039를 사용하여 주형 pR85503(야생형 hIgG1 C_H DNA)을 사용하여 제조하였다. 단편 1a 및 2a를 프라이머 oSP031 및 oSP038를 사용하여 결합시켜, 단편 4를 생성하였다. 단편 2a 및 3을 프라이머 oSP036 및 oSP039를 사용하여 결합시켜 단편 5를 생성하였다. 이후에, 단편 4 및 5를 프라이머 oSP031 및 oSP039를 사용하여 융합시켰다. 수득되는 서열을 pR85501내로 Xho1-Not1 제한 부위를 통해 삽입시켜 IgG1 불변 영역과 IgG2 하부 힌지 및 IgG4 CH2 도메인을 지닌 작제물 pR85504를 생성시켰다. 서열을 프라이머 KO_oLRC120 및 oKO021을 사용하여 확인하였다.

표 8: 키메라 C _H 핵산 작제물의 PCR 생성을 위한 프라이머

실시예 2: 키메라 중쇄 항체의 생성

예시적인 항체를 표준 방법을 사용하여 수득하였다. 항-hCD3 항체(항-hCD3 항체 "L2K")를 사용하여 당해 실시예의 키메라 항체를 작제하였다. L2K를 제WO2004/106380호를 기본으로 한 잘 공지된 방법에 의해 수득하였다. 본원에서 대조군 항체 1로 지정된, 항-hCD3_L2K는 야생형 사람 IgG1 중쇄 불변 영역(서열번호 13)을 함유한다.

본 실시예에 따라 생성된 2특이적 항체는 2개의 별개의 항원-결합 도메인(즉, 결합 아암)을 포함한다. 본원에서 대조군 항체 2로 지정된, 항-hCD3 x 항 -hCD20(2특이적 항체)는 미국 특허원 공보제 US20100331527A1호에 기술된 바와 같이 수득하였다. 2특이적 항체는 표준 방법을 사용하여 작제하였으며, 여기서 제WO2004/106380호의 "L2K" 항-CD3 항체로부터의 중쇄 및 경쇄를 항-CD20 항체(참조: 예를 들면, 2013년 9월 19일자로 출원되고, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된, PCT 국제 특허원 제PCT/US13/60511호)와 조합하였다. 대조군 항체 2는 야생형 사람 IgG4 중쇄 불변 영역(서열 번호 15)를 함유하지만, 항-CD3 아암은 정제의 용이성을 위해 변형된 CH3 도메인(서열 번호 42)를 갖는다.

대조군 항체 3은 본원에 기술된 바와 동일한 방법을 사용하여 대조군 Ab 2(항-hCD3 x 항-hCD20 2특이적 Ab)를 항-CD3 중쇄 아암 내에 변형된 CH3 도메인(서열 번호 41)을 갖는 야생형 사람 IgG1 중쇄 불변 영역(서열 번호 13)과 조합하였다.

대조군 항체 4는 CA9 항원과 야생형 사람 IgG1 중쇄 불변 영역(서열 번호 13)을 결합시킬 수 있는 항원-결합 도메인을 함유한다.

대조군 항체 5는 2013년 9월 19일자로 출원되고, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된, PCT 국제 출원 제 PCT/US13/60511호의 방법에 따라 수득된, 항-hCD3 x 항-hCD20 2특이적 항체이다. 요약하면, 항-CD20 항체("CD20-VH")로부터의 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1의 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체("CD3-VL")로부터 기원한 경쇄 가변 영역과 쌍을 이룬다. CD20-VH/CD3-VL 쌍은 CD20을 특이적으로 인식하는 항원-결합 도메인을 생성한다. 항-CD3 항체("CD3-VH")로부터 기원한 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2의 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체("CD3-VL")로부터 기원한 경쇄 가변 영역과 쌍을 이룬다. CD3-VH/CD3-VL 쌍은 CD3를 특이적으로 인지하는 항원-결합 도메인을 생성한다. 대조군 항체 5는 야생형 사람 IgG1 중쇄 불변 영역(서열 번호 13)으로 가공되지만, 항-CD3 아암은 정제의 용이성을 위해 중쇄 불변 영역 내에 변형된 CH3 도메인(서열 번호 41)을 갖는다.

시험된 항체와 동일한 표적 항원에 결합하지 않는, 예를 들면, CD3 또는 CD20 항원에 결합하지 않는 동형 대조군을 제조하였다. 야생형 IgG1 동형 대조군은 서열 번호 13의 야생형 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 함유한다. 야생형 IgG4 "CPPC" 동형 대조군은 "CPPC" 힌지 돌연변이 S228P(EU 번호매김에 따름)을 가지는 것을 제외하고는, 서열 번호 15의 야생형 CH 아미노산 서열을 가진다.

대조군 항체 1의 불변 영역은 본 발명의 키메라 사람 불변 영역, 예를 들면, 서열 번호31 또는 서열 번호 30으로 교체되었다. 불변 영역의 교체는 프라이머 oKO014 및 oKO015을 사용하여 증폭시킨 L2K 가변 영역 핵산 서열(플라스미드 pR85505)를 수득함으로써 수행하였다(참조: 표 8). L2K 가변 영역(서열 번호 34)은 이후에 플라스미드 pR85502 내로 클로닝용 Sap1 제한 부위를사용하여 도입시켰다. 수득되는 플라스미드 pR85506의 서열은 프라미어 KO_oLRC120 및 oKO_Fc_4-3를 사용하여 확인하였다. 당해 작제물을 사용하여 본 발명의 항체 1, sIgG4-항-CD3_L2K(본원에서 sIgG4로서 또한 공지됨)(이는 서열 번호 31을 포함한다)을 항체를 분리하기 위한 표준 방법을 사용하여 생성하였다.

제2의 예에서, L2K 가변 영역을 프라이머 oKO014 및 oKO015(참조: 표 8)을 사용하여 주형으로서 플라스미드 pR85505를 사용하여 증폭시켰다. 이후에, 가변 영역을 클로닝용 Sap1 제한 부위를 사용하여 플라스미드 pR85504내로 도입하였다. 수득되는 플라스미드 pR85507의 서열을 프라이머 KO_oLRC120 및 oKO_Fc_4-3을 사용하여 확인하였다. 당해 작제물을 사용하여 본 발명의 항체 2, sIgG1-항-CD3_L2K(본원에 sIgG1로서 또한 공지됨)(이는 서열 번호 30을 포함한다)을, 표준 방법을 사용하여 생성하였다.

항체 3을 대조군 항체 (Ab) 5의 항-CD3 x 항 -CD20 2특이적 항체로부터 작제하였다. 대조군 Ab 5는 키메라 불변 중쇄 영역으로 교체된 이의 중쇄 불변 영역, 서열 번호 30의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 갖는 항-CD20 아암, 및 CH(서열 번호 37)의 CH3 도메인내 돌연변이를 갖는 항-CD3 아암을 가짐으로써 항체 3(본원에서 sIgG1^*로서 또한 공지됨)을 생성하였다.

유사하게, 항체 4는 2특이적 항체 대조군 Ab 5로부터 생성하였으나 중쇄 불변 영역은 키메라 CH, 서열 번호 31을 포함하는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 갖는 항-CD20 아암, 및 CH(서열 번호 38)의 CH3 도메인 내에 돌연변이를 갖는 항-CD3 아암으로 교체하여 항체 4(본원에 sIgG4^*로서 또한 공지됨)를 생성하였다.

서열 번호 30 또는 서열 번호 31의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체(또는 서열 번호 30/37 또는 서열 번호 31/38을 포함하는 2특이적 항체), 및 대조군 항체를 다음의 실시예에 설정된 특정의 실험에서 사용하였다.

실시예 3: 저켓 세포에 특이적으로 결합하는 키메라 항체

키메라 항체를 완전한 사람 IgG로 전환시킨 후, 특이적인 항원 결합 특성을 측정하였다. 실시예 2에 설정된 바와 같은, 실시예 항체 작제물 및 대조군 항체를 저켓 세포(표적 항원 CD3+, CD20을 발현하는 사람 T-세포 주)에 결합하는 이들의 능력에 대해 형광성-활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 시험하였다. FACS 데이터를 다음의 프로토콜을 사용하여 획득하였다: 웰(well) 당 2x10⁵에서 세포를 일련 희석된 항체 및 100μl의 보충물과 함께 1시간 동안 4 ℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 2회 세척하고 적절한 제2 항체(예를 들면, 형광성-태그된 FITC 항-사람 IgG)를 가하고 추가로 30분 동안 4 ℃에서 항온처리한 후, 2회 세척하였다. 세포를 1% BSA를 함유하는 냉 PBS 속에 재-현탁시키고 FACSCanto II™ 유동 세포분석기(제조원: BD Biosciences) 상에서 유동 세포분석으로 분석하였다. 저켓 세포를 측방 및 전방 산란 분류(side and forward scatter sorting)로 게이팅(gating)하였다. 세포 결합 적정을 위한 각각의 EC₅₀를 프리즘(제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 GraphPad Software)을 사용하여 4-매개변수 비-선형 회귀 분석을 사용하여 계산된 값으로 측정하였다.

키메라 항체는 저켓 세포에 야생형 C_H 영역을 갖는 대조군 항체와 비교하여 동일한 농도에서 결합하였으므로, 변경된 C_H 영역을 갖는 키메라 항체는 항원에 결합하는 이의 능력을 상실하지 않음이 측정되었다. 도 6을 참조한다.

실시예 4: U937 세포에 결합하는 항체의 특성화

FcγRI 및 FcγRIIA을 발현하는 단핵 세포 세포주인, U937 세포를 플레이팅(plating)하고 Ab의 일련 희석물(사용된 Ab의 최대 농도는 50nM이다)과 함께 항온처리하였다. 세포를 Ab와 함께 1시간 동안 4 ℃에서 항온처리한 후 2회 세척하였다. 이후에, U937 세포를 제2의 Ab(FITC 염소 항-사람 Fab)와 함께 30분 동안 4 ℃에서 항온처리한 후 2회 세척하였다. 세포를 유동 세포분석으로 표준 방법을 사용하여 분석하고 메디안 형광성 강도(MFI)를 기록하였다. 결과를 표 9 및 도 7에 요약하며, 여기서 키메라 Ab, 항체 1(sIgG4) 및 항체 2(sIgG1)는 U937 세포에 고 농도에서 결합함이 입증된다.

표 9: U937 세포에 대한 키메라 Ab 대 야생형 Ab의 결합

실시예 5: 항체의 특성화 - U937 세포독성 검정

U937 세포를 다음의 세포검정에서 양성의 킬러 효과기 대조군으로 사용하였다. 이와 같이, Fc/FcγR 상호작용을 통해 U937 세포를 사멸하기 위한 키메라 C_H 영역을 지닌 항체의 능력을 시험하였다. 칼세인 사멸 검정을 다음의 프로토콜을 사용하여 수행하였다: 사람 및 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜-파크(Ficoll-Paque)(제조원: GE Healthcare Life Sciences) 위에서 또는 림프구-포유동물 밀도 세포 분리 배지(제조원: Cedarlane Laboratories)를 통해 각각 분리하였다. 분리된 PBMC를 재조합 사람 IL-2(30U/ml) 및 T-세포 활성화 비드(사람 PBMC에 대해 항-CD3/CD28, 시노몰구스 PBMC에 대해 항-CD2/CD3/CD28)를 함유하는 배지를 사용하여 수일 동안에 걸쳐 활성화시켰다. 활성화된 T-세포를 PBMC로부터 원심분리에 의해 분리한 후, 1ml 배지 속에 현탁시켰다. 자기화된 비드를 T-세포로부터 제거하였다. 표적 세포(U937)를 칼세인으로 표지한 후, 세척하고 분리되고 활성화된 T-세포(10:1 효과기: 표적 비) 및 항체와 함께 항체의 3배의 일련의 희석물을 사용하여 3일에 걸쳐 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 원심분리하고 상층액을 형광성 분석을 위해 반투명한 흑색의 선명한 바닥 플레이트로 이전시켰다. 50% 세포독성을 유도하는 항체의 몰 농도로 정의된, 각각의 EC₅₀을 프리즘(제조원; 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 GraphPad Software)을 사용하여 측정하였다. 값을 4-매개변수 비-선형 회귀 분석을 사용하여 계산하였다. 결과는 도 8에 요약한다.

항체 1(sIgG4) 및 항체 2(sIgG1)의 세포독성 활성은 야생형 IgG4 및 IgG1 힌지 영역을 함유하는 상응하는 항체와 비교하여 유의적으로 약화된다. 도 8을 참조한다. 흥미롭게도, 키메라 Ab는 실시예 4에 나타낸 바와 같이 고 농도에서 약하게 결합하지만, 이들은 세포검정에서 U937 세포를 사멸시키지 않았다.

실시예 6- 항체의 특성화- hPBMC의 증식

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 자극하고 증식을 유도하는 키메라 항체 및 대조군 작제물의 능력을 ATP 촉매화된 정량화(CellTiter Glo®)를 사용하여 평가하였다. PBMC의 활성화는 사이토킨의 방출을 야기하며, 이는 세포 증식을 유도한다. 증식 데이터를 다음의 프로토콜을 사용하여 획득하였다: 사람 또는 시노몰구스 원숭이 기원한 PBMC(5x10⁵ / 웰)을 3배 계열 희석한 항-CD20xCD3 또는 대조군 항체(CA9 항원에 대해 특이적인 대조군 Ab 4를 포함함)와 함께 96웰 플레이트 속에서 72시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, CellTiter Glo®를 가하고 발광성을 VICTOR X5 다중-표지 플레이트 판독기(제조원: PerkinElmer)를 사용하여 측정하였다. 세포 생존능(ATP 촉매된 정량화)의 EC₅₀을 프리즘(제조원: 캘리포니아주 샌디에고 소재의 GraphPad Software)를 사용하여 측정하였다. 값을 4-매개변수 비-선형 회귀 분석을 사용하여 계산하고 도 9에 나타낸다.

항체 1(sIgG4) 및 항체 2(sIgG1)는 야생형 IgG4 및 IgG1 힌지 영역을 함유하는 상응하는 항체와 비교시 세포 증식을 활성화하지 않는다. 도 9를 참조한다.

실시예 7- 키메라 항체의 표면 플라스몬 공명 기원한 결합 친화성 및 역학 상수

키메라 불변 중쇄 영역 sIgG1^*(항체 3) 및 sIgG4^*(항체 4)를 갖는 항-CD3 x 항-CD20 2특이적인 항체를 표면 플라스몬 공명(SPR) (Biacore) 기술을 사용하여 분석함으로써 사람 및 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 이들의 역학적 결합 매개변수를 측정하였다. 동형 대조군, 즉 wt-IgG1 동형 대조군 및 wt-IgG4 CPPC 동형 대조군을 유사한 방식으로시험하였다.

요약하면, SPR 실험을 25℃에서 Biacore T200 장치 상에서 카복시메틸덱스트란-피복된 (CM-5) 칩을 사용하여 수행하였다. 마우스 모노클로날 항-펜타-히스티딘 항체(제조원: GE Healthcare)를 CM-5 센서 칩 상에 표준아민-커플링 화학을 사용하여 고정시켰다. His-태그된 사람 또는 원숭이 FcγR 단백질의 140RU-376RU를 항-펜타-히스티딘 아민-커플링된 CM-5 칩 상에서 포획하고 항체의 스톡 용액을 20μl/분에서 2.5분 동안 포획된 단백질 위에서 주사하였다. mAb 결합 반응을 모니터링하고, 저 친화성 수용체의 경우, 정체-상 결합 평형을 계산하였다. 역학적 연합(k_a) 및 해리(k_d) 속도 상수를 1:1 결합 모델에 대해 스크루버(Scrubber) 2.0 곡선 핏팅 소프트웨어를 사용하여 진행시키고 핏팅하여 측정하였다. 결합 해리 평형 상수(K_D) 및 해리 반감기(t_1/2)를 역학 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다: K_D (M) = k_d / k_a; 및 t_1/2 (min) = (ln2/(60^*k_d).

표 10: 야생형(wt) 및 키메라 중쇄 항체에 대한 역학적 결합 매개변수

NB: 결합 없음

표 10의 결과가 입증하는 바와 같이, sIgG1^* 및 sIgG4^* 2특이적 항체는 야생형(wt) hIgG1 또는 hIgG4-CPPC CH 영역을 가진 항체와 비교하여 사람 FcγRI에 대한 결합을 나타내지 않는다. 본 발명의 키메라 중쇄 항체는 또한 wt hIgG1 또는 hIgG4-CPPC Fc 서열을 갖는 항체와 비교하여 수개의 저-친화성 FcRγ 수용체 (예를 들면 FcRγIIa, FcRγIIb)에 대해 약한 결합 내지 결합을 나타내지 않는다(표 11).

표 11: 야생형(wt) 및 키메라 중쇄 항체에 대한 정체 -상 평형 결합

NB: 결합 없음

실시예 8- 키메라 CH 영역을 갖는 IgG1 및 IgG4 항체는 CDC 검정에서 감소된 효과기 기능을나타낸다 .

위에서 기술한 바와 같이, 키메라 CH 영역(sIgG1^* 및 sIgG4^*)을 지닌 항체를 생성하여 변경되거나 감소된 효과기 기능을 지닌 mAb를 발생시켰다. IgG1 동형의 야생형(wt) 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체와 비교하여, CH 영역내 아미노산 치환은 이의 수용체에 결합하기 위한 Ig Fc의 능력을 방해할 수 있다. 따라서, B 세포 활성화 또는 식균작용과 같은, 신호전달 및 면역 반응은 변경될 수 있다. 상보체 의존성 세포독성(CDC)에 대한 CH 영역에서 아미노산 변형의 효과(당해 실시예에서) 및 항체-의존성 세포독성(ADCC) 효과기 기능(실시예 9 참조)를 시험하였다.

CDC 효과기 기능에 대한 항체 3(sIgG1^*) 및 항체 4(sIgG4^*)의 효과를 시험하기 위해, CD20-발현 라지(Raji)(표적) 세포(5000/웰) 또는 다우디 세포를 5% 사람 혈청 상보체의 존재하에서 플레이팅하였다. 100nM에서 출발하여, sIgG1^*, sIgG4^* 및 대조군 항체의 일련의 희석물을 세포에 4시간 동안 37℃에서 가하였다. 표적 세포 분해를 CytoTox Glo™ 키트(제조원: Promega)를 사용하여 측정하고 세포독성 퍼센트를 계산하였다.

세포독성 퍼센트를 방정식을 사용하여 계산하였다:

세포독성 % = ((L_S - L_SR)/(L_MR-L_SR))^*100% 여기서 L_SR 는 기본선 표적 세포 발광성이고 L_MR는 디기토닌에 의해 분해된 세포로부터의 최대 칼세인 방출이다. 세포독성에 대한 EC₅₀를 프리즘 소프트웨어(제조원: GraphPad)를 사용하여 측정하였다. 값을 4-매개변수 비-선형 회귀 분석을 사용하여 게산하고 표 12, 도 10a 및 10b에 나타낸다.

다우디 및 라지 세포에 대한 항체 3(sIgG1^*) 및 항체 4(sIgG4^*)의 CDC 활성은 야생형 중쇄 불변 도메인을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 유의적으로 약화되었다. 표 12, 및 도 10a/b를 참조한다. 일부 CDC 활성은 라지 세포에 대한 sIgG4^*으로 관측되었으나, 전체 결과는, 키메라 항체가 wt IgG1 Fc 대조군 항체보다 더 약한 효과기 반응을 증가시킴을 나타낸다.

표 12: sIgG1^* 및 sIgG4^* 항체는 효과기 기능을 측정하는 CDC 검정에서 감소된 활성을 나타낸다.

NA: 활성 없음

실시예 9- ADCC 검정에서 감소된 효과기 기능을 나타내는, 키메라 CH를 갖는 IgG1 및 IgG4 항체

ADCC 효과기 기능에 있어서 항체 3(sIgG1^*) 및 항체 4(sIgG4^*) 대 야생형 CH 영역을 지닌 항체의 효과를 시험하기 위해, FcγRIIIa의 보다 높은 친화성 V 대립형질을 발현하도록 가공된 새로이 분리한 자극되지 않은 CD56-양성 NK 세포 또는 NK92 세포를 칼세인-표지된 CD20-양성 라지 또는 다우디 세포와 함께 키메라 CH-항체 및 wt-CH 대조군 항체의 존재하에서 플레이팅하였다. 표적 세포로부터의 칼세인 방출을 모니터링하고 세포독성 퍼센트를 측정하였다. 세포독성 퍼센트 및 EC₅₀를 상기 CDC 검정에 대해 기술한 바와 같이 계산하였다. 결과는 표 13 및 도 11a 및 11b에 나타낸다.

키메라 CH 항체, sIgG1^* 및 sIgG4^*는 라지 또는 다우디 세포에 대해 ADCC 활성(표 13)을 중재하지 않는다.

표 13: sIgG1^* 및 sIgG4^* 항체는 효과기 기능을 측정하는 ADCC 검정에서 감소된활성을 나타낸다.

NA: 활성 없음; #: 배경 세포독성 ~20%

실시예 10- 키메라 항체의 약력학적 프로파일

항체 3(본원에서 sIgG1^*로 또한 공지됨) 및 항체 4(본원에서 sIgG4^*로서 또한 공지됨)의 독성역학적 프로파일을 단일의 30분 IV 주입을 제공받은 수컷 시노몰구스 원숭이(3마리의 동물/처리 그룹)로부터의 혈액 시료를 수득한 후, 12주 관찰 기간에 의해 평가하였다. 혈청 중 총 약물 농도의 독성역학적 분석에 대한 혈액 시료를 투여 전 및 투여 후 5분, 및 5, 24, 48, 72 및 168 시간째에, 및 14, 21, 35, 49, 66 및 84일째에 수집하였다. 수득되는 혈청 시료를 직접적인 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 분석하여 sIgG1^* 또는 sIgG4^* 항체의 총 약물 농도를 측정하였다. 시험 제품의 독성역학을 비-구획 분석(Phoenix WinNonLin)을 사용하여 평가함으로써 약력학적 매개변수를 측정하였다. 결과는 표 14에 나타낸다(AUC = 농도 하 영역 대 시간 곡선; C_max = 혈청 중 관찰된 최대 농도).

표 14: 시노몰구스 원숭이에 대한 단일의 정맥내 주입 후 시노몰구스 원숭이의 혈청 속에서 키메라 항체의 약력학적 프로파일

시노몰구스 원숭이에서 1.0mg/kg의 sIgG1^* 및 sIgG4^*의 단일 정맥내 투여량 후, 33.4 및 26.0μg/mL 각각의 평균 피크 농도(C_max), 및 100 및 61.1 일^*ug/mL 각각의 평균 AUC_{0 -168h} 값을 관찰하였다. 명백한 말기 반감기는 이들 2개 분자의 8.14 내지 14.0 일 사이인 것으로 추정되었다. 당해 데이터는, sIgG1^* 및 sIgG4^*에 대한 연속적인 노출이 대부분의 12주의 관찰 기간 동안 모든 동물에서 유지되었으며 노출이 치료 그룹에 걸쳐 비교가능하였음을 나타낸다. 시험 제품을 사용하여 명백한 면역원성은 관측되지 않았다. sIgG1^* 및 sIgG4^*의 전체적인 약력학적 프로파일은 시노몰구스 원숭이에서 투여된 대표적인 모노클로날 항체이다.

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> ANTIBODIES COMPRISING CHIMERIC CONSTANT DOMAINS <130> 8550/PCT <150> US 61/759,578 <151> 2013-02-01 <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 100 105 110 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 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Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 130 135 140 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 180 185 190 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 195 200 205 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 210 215 220 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Lys Lys Val 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Lys Arg Val 1 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 8 <211> 20 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gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660 cacaaccact acacgcagaa gtccctctcc ctgtctccgg gtaaatga 708 <210> 33 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 gataagcgcg tcgaatccaa atacggtccc ccctgcccac cgtgcccagc accacctgtg 60 gcaggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 180 aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacacaga agtccctctc cctgtctctg ggtaaatga 699 <210> 34 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 35 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggacca 360 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 420 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 480 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 540 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 600 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 660 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 720 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 780 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 840 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 900 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacag attcacgcag 960 aagtccctct ccctgtctcc gggtaaatga 990 <210> 36 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 gccagcacaa aaggtcctag cgtttttcca cttgccccat gttcaaggtc aacctccgaa 60 agtaccgccg ctcttggctg tctcgtaaaa gattattttc ccgaacctgt aactgtctcc 120 tggaactccg gcgcactcac ttccggcgta cataccttcc ccgctgtcct ccaatcttcc 180 ggtctctact ccctgtcttc tgttgtcact gttccatcat cctcactcgg cacaaaaaca 240 tatacctgca acgttgatca caagccaagt aataccaaag ttgataagcg cgtcgaatcc 300 aaatacggtc ccccctgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc atcagtcttc 360 ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 660 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caggctcacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaaca gattcacaca gaagtccctc 960 tccctgtctc tgggtaaatg a 981 <210> 37 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 38 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 39 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 gtgagcgctc ttcggcagac gtccaactgg tgcagtcagg g 41 <210> 40 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 cagctagctc ttccggctga ggagacggtg accgtggtgc cttggcc 47 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 43 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 44 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val

Claims (62)

1. N-말단으로부터 C-말단까지, CH1 도메인, 키메라 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하며, 여기서:
   (a) 상기 CH1 도메인은 212 내지 215번(EU 번호매김) 위치로부터의 적어도 아미노산 서열 DKKV 또는 DKRV를 갖는 사람 IgG1 CH1 도메인 또는 사람 IgG4 CH1 도메인을 포함하고,
   (b) 상기 키메라 힌지는 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치들로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열 및 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치들로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)을 포함하며,
   (c) 상기 CH2 도메인은 237 내지 340번(EU 번호매김) 위치들로부터의 사람 IgG4 CH2 도메인 아미노산 서열을 포함하고,
   (d) 상기 CH3 도메인은 341 내지 447번(EU 번호매김) 위치들로부터의 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 CH 영역이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 37, 또는 서열 번호 38 중의 어느 하나와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 폴리펩타이드.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 CH1 도메인이 상기 아미노산 서열 DKKV(서열 번호 4)를 포함하고, 상기 키메라 힌지가 상기 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 CH1 도메인이 상기 아미노산 서열 DKRV(서열 번호 5)를 포함하고, 상기 키메라 힌지(hinge)가 상기 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 CH2 도메인이 서열 번호 10의 상기 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 CH3 도메인이 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 41, 및 서열 번호 42로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 항원-결합 단백질인 재조합 폴리펩타이드.
8. 청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 수용체-Fc 융합 단백질인 재조합 폴리펩타이드.
9. 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 항체인 재조합 폴리펩타이드.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 항체가 적어도 10nM의 항체 농도에서 20% 미만의 세포분해, 또는 10% 미만의 세포분해, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 세포분해를 나타내는 재조합 폴리펩타이드.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 세포독성 활성이 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 CH 영역을 포함하는 상응하는 항체의 상기 세포독성 활성보다 적어도 약 5배 미만, 또는 적어도 약 10배 미만인 재조합 폴리펩타이드.
12. 상기 폴리펩타이드가 N'-VD1-X1_n-Y1-Y2-X2-X3-C'를 포함하고, 여기서:
    (a) N'는 폴리펩타이드의 상기 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 상기 C-말단이며,
    (b) VD1은 항원-결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열이고,
    (c) X1은 IgG1 CH1 도메인, IgG4 CH1 도메인, 및 IgG1 또는 IgG4 CH1 도메인의 적어도 212 내지 215번(EU 번호매김) 위치들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 도메인을 포함하는 아미노산 서열이며,
    (d) Y1은 IgG1 또는 IgG4 힌지 영역의 216 내지 227번(EU 번호매김) 위치들로부터의 아미노산 서열을 포함하고,
    (e) Y2는 228 내지 236번(EU 번호매김) 위치들로부터의 사람 IgG2 하부 힌지 영역 아미노산 서열 PCPAPPVA(서열 번호 3)를 포함하며,
    (f) X2는 IgG4 CH2 도메인을 포함하는 아미노산 서열이고,
    (g) X3은 IgG1 CH3 도메인 또는 IgG4 CH3 도메인, 또는 이의 변이체를 포함하는 아미노산 서열이며;
    (h) 여기서 n은 0 또는 1인 재조합 폴리펩타이드.
13. 청구항 12에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 37, 또는 서열 번호 38로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
14. 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서, n이 1이고, X1이 상기 아미노산 서열 DKKV(서열 번호 4)를 포함하며, Y1 및 Y2가 상기 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)로 이루어진 키메라 힌지를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
15. 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서, n이 1이고, X1이 상기 아미노산 서열 DKRV(서열 번호 5)를 포함하며, Y1 및 Y2가 상기 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)로 이루어진 키메라 힌지를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
16. 청구항 12에 있어서, n이 0 또는 1이고, Y1 및 Y2가 상기 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)로 이루어진 키메라 힌지를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
17. 청구항 12에 있어서, n이 0 또는 1이고, Y1 및 Y2가 상기 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)로 이루어진 키메라 힌지를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
18. 청구항 12 내지 청구항 17 중의 어느 한 항에 있어서, X2가 서열 번호 10의 상기 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
19. 청구항 12 내지 청구항 18 중의 어느 한 항에 있어서, X3이 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열번호 41, 및 서열 번호 42로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
20. 청구항 12 내지 청구항 19 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 분리된 항원-결합 단백질인 재조합 폴리펩타이드.
21. 청구항 12 내지 청구항 19 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 Fc-융합 단백질 또는 수용체-Fc 융합 단백질인 재조합 폴리펩타이드.
22. 청구항 12 내지 청구항 20 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 분리된 항체인 재조합 폴리펩타이드.
23. 청구항 22에 있어서, 상기 항체가 적어도 10nM의 항체 농도에서, 20% 미만의 세포분해, 또는 10% 미만, 또는 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 심지어 0% 또는 검출불가능한 세포분해의 세포독성을 나타내는 재조합 폴리펩타이드.
24. 청구항 23에 있어서, 상기 세포독성 활성이 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 CH 영역을 포함하는 상응하는 항체의 상기 세포독성 활성보다 적어도 약 5배 미만, 또는 적어도 약 10배 미만인 재조합 폴리펩타이드.
25. 청구항 1 내지 청구항 24 중의 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
26. 청구항 1 내지 청구항 24 중의 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 핵산 분자.
28. 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 및 서열 번호 36에 대해 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
29. 청구항 26 내지 청구항 28 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 및 서열 번호 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
30. 청구항 26 내지 청구항 28 중의 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
31. 청구항 30에 있어서, 상기 핵산 분자가 숙주 세포 내에서 발현에 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되는 벡터.
32. 청구항 31에 있어서, 상기 발현 조절 서열이 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, UbC, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi 및 HIV LTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 벡터.
33. 청구항 31에 있어서, 상기 발현 조절 서열이 CMV-MIE 프로모터에 의해 구동된 TetR-ER_LBDT2 융합 유전자, SV40 프로모터에 의해 구동된 블라스티시딘 내성 유전자, 및 CMV-MIE 프로모터에 의해 구동된 Arc-ER_LBDT2 융합 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 발현 카세트를 포함하는 벡터.
34. 청구항 32에 있어서, 상기 프로모터가 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/Arc 하이브리드 프로모터인 벡터.
35. 청구항 30 내지 청구항 34 중의 어느 한 항에 있어서, bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자들을 포함하는 벡터.
36. 청구항 26 내지 청구항 29 중의 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 세포.
37. 청구항 36에 있어서, 청구항 28 내지 청구항 33 중의 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
38. 청구항 36 또는 청구항 37에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 상기 게놈내로 통합되는 세포.
39. 청구항 36 내지 청구항 38 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 발현 인핸서를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포.
40. 청구항 36 내지 청구항 39 중의 어느 한 항에 있어서, XBP 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포.
41. 청구항 36 내지 청구항 40 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 세포.
42. 청구항 36 내지 청구항 41 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 동물 세포인 세포.
43. 청구항 36 내지 청구항 42 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인 세포.
44. 청구항 36 내지 청구항 43 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 세포.
45. 청구항 36 내지 청구항 44 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO-K1 세포인 세포.
46. 키메라 힌지 영역을 포함하는 항체를 제조하는 방법으로서, 당해 방법이:
    a. 숙주 세포를 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산(상기 핵산 분자는 선택된 항원-특이적인 항체의 상기 V_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 상기 불변 C_L 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 선택된 항원-특이적인 항체의 상기 V_L 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 C_L 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다)으로 형질감염시키는 단계;
    b. 단계 (a)의 숙주 세포를 상기 항체의 상기 중쇄를 암호화하는 핵산 분자(상기 핵산 분자는 선택된 항원-특이적인 항체의 상기 V_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 사람 Ig의 불변 C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 상기 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 또는 서열 번호 31을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 선택된 항원-특이적인 항체의 상기 V_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 상기 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다)로 형질감염시키는 단계; 및
    c. (a) 및 (b)의 상기 핵산 분자들을 상기 숙주 세포 내에서 동시-발현시킴으로써 상기 항체를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
47. 청구항 46에 있어서, 단계 (b)의 상기 숙주 세포를 배양하는 상기 단계(여기서 상기 항체는 세포 배양 배지내로 분비된다); 및 상기 항체를 상기 세포 배양 배지로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
48. 키메라 힌지 영역을 포함하는 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 당해 방법은:
    a. 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자(상기 핵산 분자는 사람 Ig의 불변 C_H 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된, 수용체 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 또는 서열 번호 31을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 수용체 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 상기 C_H 영역을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동적으로 연결된다)로 형질감염시키는 단계; 및
    b. 상기 숙주 세포 내에서 (a)의 상기 핵산 분자를 발현시킴으로써 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
49. 청구항 48에 있어서, 단계 (b)의 상기 숙주 세포를 배양하는 상기 단계(여기서 상기 수용체-Fc 융합 단백질은 세포 배양 배지내로 분비된다); 및 상기 세포 배양 배지로부터 상기 수용체-Fc 융합 단백질을 분리하는 상기 단계를 추가로 포함하는 방법.
50. 청구항 46 내지 청구항 49 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO, COS, 망막 세포, 베로(Vero), CV1, 293, MDCK, HaK, BHK, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 저켓(Jurkat), 다우디(Daudi), A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 전술한 세포 중의 어느 것으로부터 기원한 세포주, 및 PER.C6® 세포로 이루어진 상기 그룹으로부터 선택된 방법.
51. 다음을 포함하는 2특이적 항체:
    (a) 제1의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1의 중쇄,
    (b) 제2의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제2의 중쇄, 및
    (c) 제1 또는 제2의 표적 항원을 인지하여 이에 결합할 수 있는 일반적인 경쇄 항원-결합 도메인
    (여기서 (a) 또는 (b) 또는 (a) 및 (b) 둘 다의 중쇄는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38로 이루어진 상기 그룹으로부터 선택된 상기 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 불변 영역을 포함한다).
52. 청구항 51에 있어서,
    (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 30, 또는 서열 번호 31을 포함하는 제1의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제1의 중쇄, 및
    (b) 서열 번호 37 또는 서열 번호 38을 포함하는 제2의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제2의 중쇄를 포함하는 2특이적 항체.
53. 상기 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(서열 번호 8)를 포함하는 키메라 힌지를 포함하는, 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
54. 상기 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA(서열 번호 9)를 포함하는 키메라 힌지를 포함하는, 키메라 Fc 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
55. 청구항 53 또는 청구항 54에 있어서, 상기 키메라 힌지가 IgG4 CH2 영역에 연결되는 재조합 폴리펩타이드.
56. 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 35 및 서열 번호 36으로 이루어진 상기 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 중쇄 불변 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
57. 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 35 및 서열 번호 36으로 이루어진 상기 그룹으로부터 선택된 상기 뉴클레오타이드 서열과 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 중쇄 불변 영역을 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
58. 청구항 1 내지 청구항 24 및 청구항 53 내지 청구항 57 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하는 상응하는 폴리펩타이드의 상기 결합 친화성과 비교하여 보다 낮은 친화성으로 FcγR에 결합할 수 있는 재조합 폴리펩타이드.
59. 청구항 58에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 FcγRIIA에 결합하는 재조합 폴리펩타이드.
60. 청구항 59에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 FcγRIIB에 결합하는 재조합 폴리펩타이드.
61. 청구항 60에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 FcγRIIB에 대한 이의 결합 친화성과 비교하여 유사한 친화성으로 FcγRIIA에 결합하는 재조합 폴리펩타이드.
62. 청구항 60에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 FcγRIIB에 대한 이의 결합 친화성과 비교하여 보다 높은 친화성으로 FcγRIIA에 결합하는 재조합 폴리펩타이드.
    

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