KR101712638B1

KR101712638B1 - Pac-1을 이용한 단백질 발현 조절 시스템과 방법 및 pac-1을 유효성분 포함하는 독시사이클린 길항제

Info

Publication number: KR101712638B1
Application number: KR1020150116566A
Authority: KR
Inventors: 송치만; 최기현; 박미리
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2017-03-07
Also published as: KR20170022065A

Abstract

본 발명은 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물 1)을 이용한 단백질 발현 조절 시스템과 방법 및 PAC-1을 유효성분으로하는 독시사이클린 길항제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TetR(테트라사이클린 억제제)에 의해 조절되는 표적 단백질 발현 시스템에서, TetR과 PAC-1의 결합에 의해 상기 단백질 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 PAC-1을 이용한 단백질 발현 제어시스템과 방법 및 PAC-1을 유효성분으로하는 독시사이클린 길항제에 관한 것이다.

Description

PAC-1을 이용한 단백질 발현 조절 시스템과 방법 및 PAC-1을 유효성분 포함하는 독시사이클린 길항제 {System and method of controlling protein expression by using PAC-1 and doxycycline antagonist containing PCA-1 as an effective ingredient}

본 발명은 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물 1)을 이용한 단백질 발현 조절 시스템과 방법 및 PAC-1을 유효성분 포함하는 독시사이클린 길항제에 관한 것이다.

유전자 발현을 조절하는 기술 중 TetR(테트라사이클린 억제제) 조절 시스템은 유전자 기능 연구에 널리 사용되는 도구이다. 테트라사이클린(Tc) 및 독시사이클린(Dox)과 같은 다양한 이펙터(effector)는 유전자 발현을 신속하게 유도 또는 중단시킨다.

TetR 조절 시스템은 원핵생물 및 진핵생물에서 유전자 발현 조절에 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이다[Berens, C. et al.; "Gene regulation by tetracyclines. Constraints of resistance regulation in bacteria shape TetR for application in eukaryotes"; European Journal of Biochemistry, vol. 270, 2003, p. 3109-3121; Bertram, R. et al.; "The application of Tet repressor in prokaryotic gene regulation and expression"; Microbial biotechnology, vol.1, 2008, p. 2-16; Lewandoski, M.; "Conditional control of gene expression in the mouse"; Nat Rev Genet, vol.2, 2001, p. 743-755]. Tet-시스템 중에서도 흔히 사용되는 T-REx 시스템은 Tc에 의해서 조절되는 유도성 유전자 발현 시스템이다[Yao, F. et al.; "Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells"; Human gene therapy, vol.9, 1998, p. 1939-1950].

대장균의 Tc 내성 오페론에서 유래된 TetR과 Tc가 결합되는 경우, Tc는 tetO(테트라사이클린 조절자)(로부터 TetR을 해리시킴으로써 표적 유전자의 발현을 조절한다[Hillen, W. et al.; "Mechanisms underlying expression of Tn10 encoded tetracycline resistance"; Annual review of microbiology, vol.48, 1994, p. 345-369; Hillen, W. et al.; "Control of expression of the Tn10-encoded tetracycline resistance genes. Equilibrium and kinetic investigation of the regulatory reactions"; Journal of molecular biology, vol.169, 1983, p. 707-721]. 표적 유전자의 발현은 T-REx 시스템에서 tetO 복합체를 해리시키는 Tc의 존재 하에 유도되고, Tc의 부재 하에 억제된다. Tet-시스템을 개선하기 위하여, TetR 변형, tetO 특이성 조작, 및 이펙터 개발 등 다양한 노력이 이루어지고 있다.

Tet-시스템은 유전자의 생리학적 역할 연구에서 표적 유전자 발현을 유도/중단하는데 널리 사용된다. 이미 발현이 유도된 표적 유전자 발현을 신속하게 중단하는 방법은 발생학적 또는 병리학적 과정에서 Tet-시스템의 이용 범위를 확장할 수 있지만, 이는 Tc 및 Dox의 긴 반감기에 의해서 방해받는다.

이펙터(Tc 또는 Dox) 무함유 배지 또는 식품은 세포 또는 동물에서 활성화된 유전자 발현을 Tc 희석에 의해 중단시키는데 사용될 수 있다. 이러한 희석에 의해 표적 유전자 발현을 감소시킬 수 있지만 감소 속도가 매우 느리다는 단점이 있다. 이에, 표적 유전자 발현의 빠른 차단을 달성하기 위하여 Tc 길항제가 요구된다.

대한민국 등록특허 제0952659호 대한민국 공개특허 제2014-143166호 대한민국 공개특허 제2014-0143771호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 본 발명의 목적은 표적 유전자 발현의 빠른 차단을 비롯하여 단백질의 발현을 조절할 수 있는, PAC-1을 이용한 단백질 발현 조절 시스템, 방법 및 PAC-1을 유효성분으로하는 독시사이클린 길항제를 제공하고자 한다.

이에, 본 발명에서는 포유동물 세포에서 발현된 TetR-조절 유전자의 발현을 빠르게 멈출 수 있는, Tc 길항제로서 PAC-1을 제공한다.

본 발명은 일 측면은 테트라사이클린 억제제(TetR)와 테트라사이클린 조절자(tetO)의 복합체(complex); 및 상기 테트라사이클린 억제제와 결합하는 하기 화학식 1로 표시되는 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물)을 포함하는, PAC-1을 이용한 표적 단백질 발현 제어 시스템에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 측면은 TetR과 tetO의 복합체(complex)에 하기 화학식 1로 표시되는 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물)을 적용시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 단백질 발현 제어방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 PAC-1을 유효성분으로 포함하는 Dox 길항제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 PAC-1을 이용한 단백질 발현 조절 방법은 신속하게 단백질의 발현을 유도 또는 중단함으로서 보다 정확하게 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.

도 1a 및 1b는 TetR 조절 GFP(green fluorescent protein) 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과를 실험한 결과이다.
도 2a 내지 2e는 TetR 조절 TRPM7 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과를 실험한 결과이다.
도 3c 및 도 3d를 참조하면, 프로테아좀 저해제인 MG-132 및 리소좀 저해제인 클로로퀸(chloroquine)을 사용하여 PAC-1에 의한 TRPM7 발현 수준 감소에 대한 단백질 분해 경로의 기여에 대하여 실험한 결과이다.
도 4a 내지 4f는 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 이용하여 측정한 흡광 스펙트럼 및 흡광계수를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5d는 단백질과 이펙터 간의 상호작용을 분석한 SPR(Surface plasmon resonance) 분석 결과이다.
도 6은 TetR 조절 TPRM7의 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 테트라사이클린 억제제(TetR)와 테트라사이클린 조절자(tetO)의 복합체(complex); 및 상기 테트라사이클린 억제제와 결합하는 하기 화학식 1로 표시되는 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물)을 포함하는, PAC-1을 이용한 표적 단백질 발현 제어 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 TetR과 tetO의 복합체에 상기 화학식 1의 화합물을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 단백질 발현 제어방법에 관한 것이다.

Dox와 같은 이펙터는 TetR-tetO 복합체의 TetR과 결합하여 TetR과 tetO를 분리시키고, 위 화학식 1의 PAC-1 화합물은 상기 복합체의 TetR과 결합함으로써, 표적 단백질의 발현을 억제하게 된다.

위 TetR-tetO 복합체는 반드시 체내에 있을 필요는 없고, 체외에 있는 경우에도 PAC-1 화합물을 적용하여 표적 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 위 TetR-tetO 복합체는 인체 내에 존재하는 것뿐만 아니라 인간을 제외한 동물, 특히 인간을 제외한 포유동물 체내에 존재하는 것 등을 포함한다.

일 구현예에 따르면, 상기 표적 단백질은 GFP(green fluorescent protein) 또는 TRPM7(Transient receptor potential melastatin 7)일 수 있다.

다른 구현예에 따르면, Dox 존재하에 상기 TetR과 tetO의 복합체에 상기 화학식 1의 화합물을 적용할 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 Dox와 상기 화학식 1의 PAC-1 화합물의 농도비는 1:3 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 1:10 이상, 더욱 바람직하게는 1:100 이상일 수 있다. 상기 Dox와 상기 화학식 1의 PAC-1 화합물의 농도비가 적어도 1:3에서부터 PAC-1에 의한 표적 단백질 발현 억제능이 관찰되기 시작하며, 1:10 또는 1:100 이상에서 PAC-1에 의한 표적 단백질 발현 억제능이 더욱 잘 나타나게 된다. 후술하는 바와 같이, TetR에 대한 Dox 및 PAC-1 각각의 K _D 값의 비율이 1:2 정도로 측정되는데, 이것은 TetR에 대한 PAC-1의 결합력이 Dox에 비해 2배 정도 낮음을 의미하므로, PAC-1의 양이 Dox에 비해 2배 정도 이상이 되어야 TetR에 대한 경쟁관계에서 보다 우위에 있을 수 있을 것이다. 즉 Dox 및 PAC-1의 TetR에 대한 결합력 차이를 근거로, Dox에 대한 PAC-1의 비율을 조절함으로써 표적 단백질 억제능을 최적화할 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 PAC-1은 상기 표적 단백질을 발현하는 세포에 처리되어 4시간 이상, 바람직하게는 4시간 내지 8시간 동안 배양하는 것이 가장 효율적인 표적 단백질 억제능을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로하는 Dox 길항제에 관한 것이다.

위에서 설명한 바와 같이, PAC-1은 TetR-tetO 복합체의 TetR과 결합하여 tetO에 의해 조절되는 특정 유전자의 발현 및 표적 단백질 형성을 억제함으로써, 결국 TetR-tetO 복합체의 TetR와 결합하여 TetR과 tetO를 분리시켜 표적 단백질을 형성시키게 하는 Dox와 같은 이펙터를 길항하는 작용을 하게 된다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백하다.

실시예

재료

하기 실시예에서, 독시사이클린 하이클레이트(doxycycline hyclate), MG-132, 및 클로로퀴논(chloroquine)은 Sigma-Aldrich(MO, USA)에서 구입했다. PAC-1은 Tocris Bioscience(Bristol, UK)에서 공급받았다. 마우스 단일클론 anti-GFP(B-2) 항체, 마우스 단일클론 anti-β actin(8H10D10) 항체, anti-Fas(CH11) 항체, anti-TRPM7(N74/25) 항체는 Santa Cruz Biotechnology(USA), Cell signaling technology(USA), Millipore(Germany), NeuroMab(USA)에서 각각 구입하였다. 재조합 TetR 단백질은 Imgen BioSciences(USA)에서 구입했다.

세포 배양 및 제조

유도성 TetR-조절 시스템을 통해 TRPM7을 안정하게 발현하는 T-REx-293 세포는 국립부산대학교로부터 제공받았다. TRPM7을 발현하는 T-REx-293 세포를 37℃에서 가습된 5% CO₂ 배양기에 넣어 10%(v/v) 소태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL), 5 μg/mL 블라스티시딘 및 0.5 mg/mL 제오신으로 보충된 Dulbecco 변성 Eagle 배지(DMEM)에서 배양했다. T-REx-293 세포(Life technologies, USA)는 37℃에서 가습된 5% CO₂ 배양기에 넣어 10%(v/v) FBS, 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 15 μg/mL 블라스티시딘을 함유한 DMEM에서 유지시켰다. 모든 세포는 2일 또는 3일마다 계대 배양했다.

구성물( construction ) 또는 DNA 증폭

GFP cDNA를 pcDNA5/FRT/TO 플라스미드(Life technologies, USA)에 BamHI-BamHI 단편으로서 삽입하여, TetR-조절 GFP 플라스미드를 생성하였다. GFP cDNA를 정방향 프라이머(5'-TACCGAGCTCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3')와 역방향 프라이머(5'-CTGGACTAGTGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTC-3')를 사용하여 증폭하였다.

pTet-On Advanced(Clontech/Takara, CA, USA) 유래 rtTA2^S-M2 cDNA를 pET-21b(+)-rtTA2^S-M2 플라스미드의 구성을 위해 pET-21b(+) 벡터(Novagen/Merck, Germany)에 NdeI-XhoI 단편으로서 삽입하였다. rtTA2^S-M2 cDNA를 정방향 프라이머(5'-AAGGAGATATACATATGTCTAGACTGGACAAG-3')와 역방향 프라이머 (5'-GGTGGTGGTGCTCGAGCCCGGGGAGCATGTCAAGGTC-3')를 사용하여 증폭하였다. 모든 구성물들은 DNA 시퀀싱(Cosmo Genetech, Korea)에 의해서 검증되었다.

데이터 분석

모든 데이터는 프리즘 4 소프트웨어(GraphPad, USA)를 사용하여 분석하였고, 결과는 평균±표준오차(SEM)(n = 3)로 나타내었다. 관찰된 차이의 유의성은 Tukey's 다중 비교 테스트를 수반한 일원분산분석(one-way ANOVA)에 의해서 평가하였다. P < 0.05의 통계값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험예 1: TetR 조절 GFP 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과 실험

웨스턴 블롯 분석

T-REx-293 세포를 2.0x10⁶ cells/dish의 농도로 폴리-L-리신 코팅된 100 mm 세포 배양 접시에 접종하고, Lipofectamine 2000(Life technologies, USA)을 사용하여 pcDNA5/FRT/TO-GFP 플라스미드로 형질감염(transfection) 시켰다. 일시적으로 GFP를 발현하는 T-REx-293 세포를 8.0x10⁵cells/dish의 농도로 폴리-L-리신(poly-L-lysine) 코팅된 60 mm 접시에 접종하고, 이어서 가습된 5% CO₂ 배양기에 넣어 37℃에서 0, 2, 4, 및 8 h 동안 PAC-1의 유무 (0μM, 10μM, 100μM) 하에 1 μM Dox와 함께 또는 Dox 없이 배양하였다. 세포를 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, Welgene, Korea)로 2번 세척했고, 4℃에서 30분 동안 프로테아제 억제제(Protease Inhibitor) 칵테일 용액(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 함유한 RIPA 버퍼(CellNest, China)에서 세포 용해시켰다. 세포 용해물로부터 단백질을 BCA 분석 키트(Thermo/Pierce, USA)를 사용하여 정량하고, 등량의 총 단백질을 7.5% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔(Elpis-biotech, Korea)에 로딩했다. 폴리아크릴아미드 겔에서 분리된 단백질을 0.20 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인(Millipore, Germany)으로 이동시키고, 이 멤브레인을 2 h 동안 5% 탈지유(skim milk)가 들어있는 TBST buffer (Tris-buffered saline Tween-20; 137mM NaCl, 20mM Tris, 및 0.1% Tween-20; pH 7.4)로 차단(blocking)했다. 차단 후, 멤브레인을 4℃에서 하룻밤 1차 항체와 함께 반응시켰고, horseradish peroxidase (HRP)- conjugated anti-mouse IgG (Cell signaling technology, USA)를 2차 항체로서 사용했다. HRP-결합된 2차 항체와의 복합체를 ECL substrate Kit(Thermo/Pierce, USA)를 사용하여 검출하였다. Image J 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯의 정량분석을 수행하였다. β-액틴 밴드를 기준으로 하여 각 단백질 밴드 데이터를 정량화하였다. 오차 막대는 표준오차를 나타낸다(n=3). 통계적 유의성은 Tukey's 다중 비교 테스트를 수반한 일원분산분석(one-way ANOVA)에 의해 분석되었다. *P < 0.05, ***P<0.001, 및 **** P<0.0001. 웨스턴 블롯 분석 결과 및 단백질 밴드 정량 분석 결과는 각각 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같다.

도 1a 및 1b는 TetR 조절 GFP 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과를 실험한 결과이다.

도 1a는 PAC-1 농도에 따른 GFP 발현에 대한 웨스터 블롯 분석 결과를 나타낸 것으로서, 1 μM Dox로 처리된 모든 세포에서 TetR 조절 GFP 발현이 4 h 동안 배양 후 검출되었으며, TetR 조절 GFP 발현 수준은 시간이 흐름에 따라 증가하는 것을 알 수 있다.

도 1b는 PAC-1의 농도에 따른 TetR 조절 GFP 단백질 밴드의 정량 분석 결과를 나타낸 그래프로서, 8 h 동안 배양할 경우 TetR 조절 GFP 발현 수준은 PAC-1의 농도에 반비례 하는 것을 알 수 있다. 구체적으로, 상기 TetR 조절 GFP 발현 수준은 PAC-1의 부재(0 μM) 시에 비해 10μM 및 100μM PAC-1의 존재 시에 각각 59% 및 83% 감소한 것으로 나타났다.

이로부터, PAC-1의 농도가 증가할수록 TetR-조절 GFP의 발현은 감소된다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2: TetR 조절 TRPM7 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과 실험

2-1. 웨스턴 블롯 분석

TRPM7을 발현하는 T-REx-293 세포를 8.0x10⁵ cells/dish의 농도로 폴리-L-리신 코팅 60 mm 접시에 접종하고, 이어서 4 h 동안 1 μM Dox를 처리한 후에(induction time), Dox의 부재(0 μM) 하에 1, 2, 4 h 동안 PAC-1의 유무(0, 1, 3, 10, 30, 100 μM) 하에 배양하였다(incubation time). 여기서, 단백질 샘플 제조 및 웨스턴 블롯 분석은 실험예 1에서 설명된 과정에 따라서 수행하였다. 농도-반응 곡선은 프리즘 4 소프트웨어(GraphPad, USA)의 힐 방정식을 사용하여 구했고, 이를 통해 IC₅₀ (half maximal inhibitory concentration)값을 얻었다. 각 단백질 밴드는 β-액틴 밴드를 기준으로 정량화하였다. 오차 막대는 표준오차를 나타낸다(n=3). 통계적 유의성은 Tukey's 다중 비교 테스트를 수반한 일원분산분석(one-way ANOVA)에 의해 분석되었다. **P<0.001 및 **** P<0.0001.

웨스턴 블롯 결과 및 시간에 따른 단백질 발현 정량 분석 결과, PAC-1의 농도에 따른 단백질 발현 정량 분석 결과 및 PAC-1의 농도-반응 곡선은 각각 도 2a, 2b, 2c 및 2d에 나타난 바와 같다.

2-2. 현미경을 이용한 세포 형태 관찰

TRPM7을 발현하는 T-REx-293 세포를 8.0x10⁵ cells/dish의 농도로 폴리-L-리신으로 코팅된 60 mm 접시에 접종하고, 이어서 4 h 동안 1 μM Dox로 처리한 후에 4 h 동안 다양한 농도(0, 1, 3, 10, 30, 100 μM)의 PAC-1 존재 하, Dox(0, 1 μM) 유무 조건에서 배양하였다. Eclipse Ti 현미경(Nicon, Japan)을 사용하여 위상차 10x PlanFluor 대물렌즈로 세포의 이미지를 얻었으며, 현미경 이미지는 도 2e에 나타난 바와 같다.

도 2a 내지 2e는 TetR 조절 TRPM7 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과를 실험한 결과이다.

도 2a는 PAC-1 농도와 배양시간(incubation time)에 따른 TRPM7 발현에 대한 웨스터 블롯 분석 결과를 나타낸 것으로서, PAC-1의 농도가 증가할수록 T-REx-293 세포에 의해 발현되는 TRPM7의 발현이 억제되는 것으로 나타났다.

도 2b는 PAC-1의 농도와 배양시간에 따른 TRPM7의 발현정도를 정량적으로 나타낸 그래프로서, 10 μM 이상의 PAC-1를 처리한 경우 4 h 동안 배양 후에는 TRPM7의 발현이 기저 수준으로 유지되는 것을 알 수 있다.

도 2c는 PAC-1의 농도에 따른 TRPM7의 발현정도를 정량적으로 나타낸 그래프로서, 0 μM의 PAC-1을 처리한 경우에 비해 1, 3, 10, 30 및 100 μM 의 PAC-1를 처리한 경우의 TRPM7 발현은 각각, 35%, 57%, 84%, 84% 및 96% 감소된 것으로 나타났다.

도 2d는 PAC-1 농도에 따른 세포 생장률을 대조군(PAC-1 농도 0 μM)에 대한 저해능으로 나타낸 그래프로서, 4 h 동안 배양한 후의 웨스터 블롯 분석 결과의 단백질 발현 정량분석 데이터에 의해 생성된 농도-반응 곡선을 사용하여 계산된 IC₅₀값은 2.2 ± 0.7 μM으로 나타났다.

위의 결과들로부터 PAC-1은 Dox보다 2배 이상 높은 농도에서 4 h 이내에 TRPM7 발현을 억제시킨다는 것을 알 수 있다.

도 2e는 TRPM7을 발현하는 T-REx-293 세포의 형태 분석 결과이며, PAC-1 농도에 따른 T-REx-293 세포의 현미경 이미지로서, 1 μM Dox로 4 h 처리 후 T-REx-293 세포는 둥근형으로 관찰되었다. 또한, 1 μM Dox로 유도하고 4 h 후, Dox의 유무(0, 1μM) 하에 다양한 농도의 PAC-1(0, 1, 10, 100 μM) 조건에서 TRPM7을 안정적으로 발현하는 T-REx-293 세포의 형태적 변형을 관찰할 수 있었다. 즉, PAC-1의 농도가 증가할수록 T-REx-293 세포의 rounding phenotype은 감소되었으며, 단백질-유도 세포 표현형(phenotype)의 정도와 상관관계에 있는 단백질 발현양이 PAC-1에 의해 제어되는 것으로 나타났다. 이로부터, PAC-1이 단백질 발현을 조절함으로써 하위 세포 신호를 조절할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3: TetR 조절 TRPM7 발현에 대한 PAC -1의 길항 작용기작 분석 실험

PAC-1은 procaspase-3을 caspase-3으로 활성화하는 세포자살 유도제로서 알려져 있다 (Putt, K.S., Chen, G.W., Pearson, J.M., Sandhorst, J.S., Hoagland, M.S., Kwon, J.T., Hwang, S.K., Jin, H., Churchwell, M.I., Cho, M.H. et al. (2006) Small-molecule activation of procaspase-3 to caspase-3 as a personalized acticancer strategy. Nature chemical biology, 2, 543-550.28). 따라서 caspase-의존적 세포사멸 동안 TRPM7의 발현 수준이 변화되는지 여부를 조사했다.

웨스턴 블롯 분석

TRPM7을 발현하는 T-REx-293 세포는 8.0 x 10⁵ cells/dish의 농도로 폴리-L-리신 코팅된 60 mm 접시에 접종하고, PAC-1 길항 효과를 위한 100 μM PAC-1 유무 하에서, 세포사멸 자극을 위한 1 μg/mL anti-Fas antibody, 프로테아좀(proteasome) 억제를 위한 10 μM MG-132, 그리고 리소좀(lysosome) 억제를 위한 25 μM 클로로퀸(chloroquine)의 존재 하에 8 h 동안 Dox(0, 1 μM) 유무 조건에서 배양하여, 웨스턴 블롯 분석 결과를 각각 도 3a, 3b, 3c 및 3d에 나타내었다.

도 3a 내지 3d는 TetR 조절 TRPM7의 발현 정도에 대한 PAC-1의 길항 효과의 웨스턴 블롯 분석 결과로서, 도 3a는 PAC-1과 함께 배양한 경우, 도 3b는 세포사멸 유도제인 anti-Fas antibody와 함께 배양한 경우, 도 3a는 PAC-1 및 프로테아좀 억제제(proteasome inhibitor)인 MG-132와 함께 배양한 경우, 도 3d는 PAC-1 및 리소좀 억제제인 클로로퀸과 함께 배양한 경우이다.

도 3a를 참조하면, TetR-조절 TRPM7 발현은 8 h, 1 μM Dox의 존재 하에 100 μM PAC-1에 의해서 완전히 감소하는 것으로 나타났으며, 이로부터 PAC-1이 TetR-조절 단백질 발현의 스위치를 끈다는 것을 확인하였다.

도 3b를 참조하면, 세포사멸 자극제인 anti-Fas antibody처리 후 caspase-의존적 세포사멸 동안 TRPM7의 발현 수준은 anti-Fas antibody 처리 전과 유사한 수준인 것으로 관찰되었다. 여기서, PAC-1의 세포사멸 활성이 TetR-조절 TRPM7의 발현에 대한 길항효과와 관련되어 있지 않음을 암시한다.

도 3c 및 도 3d를 참조하면, MG-132(proteasome inhibitor) 및 클로로퀸(lysosome inhibitor)을 사용하여 PAC-1에 의한 TRPM7 발현 수준 감소에 대한 단백질 분해 경로의 기여에 대하여 실험한 결과, TRPM7의 발현은 10 μM MG-132 또는 25 μM 클로로퀸의 존재 하에 1 μM Dox와 100 μM PAC-1의 공동처리 후 희미하게 관찰되었다. 여기서, PAC-1의 길항 작용기작은 단백질 분해와 무관함을 알 수 있다.

실험예 4: PAC-1의 길항 작용 기작 분석

마그네슘 이온(Mg²⁺)은 TetR과 Dox의 강한 상호작용에 필요하고, PAC-1은 2가(divalence) 양이온을 착화(chelation)한다. 따라서, PAC-1의 길항 작용이 Mg²⁺ 착화와 관련성이 있는지 여부를 중심으로, UV-vis 흡수 스펙트럼을 이용하여 PAC-1의 길항 작용 기작을 분석하였다.

UV-vis 흡수 스펙트럼

자외선-가시광선 분광계(UV-Vis spectrophotometer)(DU-650, Beckman Coulter, USA)를 사용하여 분석 용액 (assay solution)(50 mM Hepes, 100 mM KNO₃, Ph 7.2) 중에서 다양한 농도(0, 10, 19, 27, 34, 42, 48, 55, 61, 66, 71, 76 μM)의 PAC-1 하에서 흡수 스펙트럼을 얻었으며(도 4a), 282 nm(A282) 및 323 nm(A323)에서 흡광도를 측정함으로써 PAC-1의 몰 흡광 계수(εPAC-1)를 결정했다 (도 4b). 1.5M Mg²⁺의 존재 하에 분석 용액 (assay solution)에 용해된 다양한 농도(0, 10, 19, 27, 34, 42, 48, 55, 61, 66, 71, 76 μM)의 PAC-1 하에서 흡수 스펙트럼을 얻었으며(도 4c), 282 nm(A282) 및 323 nm(A323)에서 흡광도를 측정함으로써 PAC-1/Mg²⁺ 복합체에 대한 몰 흡광 계수(εPAC-1/Mg²⁺)를 결정하였다(도 4d). free PAC-1의 농도([PAC-1]_free)를 εPAC-1을 사용하여 계산하였다 (도 4e). PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 농도([PAC-1-Mg²⁺]) 및 free Mg²⁺의 농도([Mg²⁺]_free)를 하기 식 1 및 식 2를 이용하여 계산하였다 (도 4f).

[식 1]

흡광도(Absorbance) = εPAC-1[PAC-1]_total + (εPAC-1/Mg² ⁺ - εPAC-1) [PAC-1/Mg² ⁺]

[식 2]

[Mg²⁺]_free = [Mg²⁺]_total - [PAC-1/Mg²⁺]

상기 식 1 및 식 2에서, [PAC-1]_total 및 [Mg²⁺]_total은 각각 PAC-1 및 Mg²⁺의 총 농도를 의미한다.

해리 곡선은 하기 식 3에 의해서 피팅되었다.

[식 3]

K_D,PAC-1/Mg2+= [PAC-1]_free [Mg²⁺]_free/ [PAC-1/Mg²⁺]

PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 평형 해리 상수(K _D )는 75 μM PAC-1의 존재 하에 분석 용액(assay solution)에 용해된 다양한 농도(0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 21, 50, 101, 202, 499 mM)의 Mg²⁺ 하에서 흡광도를 측정하여 구했다. K _D 값은 프리즘 4 소프트웨어 (GraphPad, USA)를 사용하여 계산했다.

도 4a 내지 4f는 UV-vis 흡수 스펙트럼을 이용하여 측정한 흡광 스펙트럼 및 흡광계수를 나타낸 것이다.

도 4a는 PAC-1의 농도에 따른 흡광 스펙트럼으로서, PAC-1의 흡수 스펙트럼은 2개의 뚜렷한 피크(282 nm 및 323 nm)를 가지는 것으로 나타났다.

도 4b는 파장 282 nm 및 323 nm에서 PAC-1의 농도에 따른 흡광계수를 나타낸 그래프로서, PAC-1의 몰 흡광 계수는 282 nm 및 323 nm에서 각각 0.0225 μM^-1cm^-1 및 0.00764 μM^-1cm^-1로 나타났다.

도 4c는 PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 흡수 스펙트럼으로서, PAC-1/Mg²⁺의 복합체의 흡수 스펙트럼은 282 nm 및 323 nm에서 피크를 가지는 것으로 나타났다.

도 4d는 파장 282 nm 및 323 nm에서 PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 농도에 따른 흡광계수를 나타낸 그래프로서, PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 몰 흡광 계수(εPAC-1/Mg²⁺)는 282 nm 및 323 nm에서 0.0021 μM^-1cm^-1및 0.0012 μM^-1cm^-1로 나타났다.

도 4e는 Mg²⁺의 흡수 스펙트럼으로서, PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 평형 해리 상수(K _D )는, 0 ~ 499 mM의 Mg²⁺와 0 ~ 75 μM의 PAC-1을 적정하여 계산하여, PAC-1/Mg²⁺ 복합체의 평형 해리 상수(K _D )는 0.4 mM인 것으로 계산되었다.

도 4f는 Mg² ⁺의 포화분율(fractional saturation)을 나타낸 그래프로서, 4.0 ± 0.8 mM의 K _D 의 Mg² ⁺ 적정 데이터로부터 포화 곡선(The fractional saturation curve)을 얻었고, Dox/Mg² ⁺ 복합체의 평형 해리 상수(K_D _, _Dox _/ _Mg2 ₊=0.4 mM )보다 10배 이상 높은 값이 측정되었다.

이로부터 PAC-1의 길항 작용기작은 Mg²⁺에 대한 결합과는 관련성이 없으며, 따라서 PAC-1에 의한 Mg²⁺ 착화가 TetR-조절 시스템에 대한 PAC-1의 길항 작용기작의 중요한 요인이 아님을 알 수 있다.

실험예 5: 단백질과 이펙터간의 상호작용 분석

실험예 2를 통해서, PAC-1이 4 h 이내의 배양 시간으로 비교적 빠르게 TetR-조절 단백질 발현을 억제함을 확인한 바, PAC-1이 TetR과의 직접 결합에 의해 TetR-조절 단백질 발현을 억제하는지에 대해서, 표면 플라즈몬 분석을 이용하여 실험을 실시하였다.

표면 플라즈몬 공명 (Surface plasmon resonance, SPR) 분석

Reichert SR7500DC 시스템(Reichert Technologies, Depew, NY, USA)을 이용하여, TetR과 이펙터(Dox 및 PAC-1)간의 상호작용에 대하여 SPR 분석하였다. 리간드 TetR을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDC)과 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 사용하여 카복시메틸덱스트란 하이드로겔 (carboxymethyl dextran hydrogel, CMDH) 표면 센서 칩에 고정하였다. HEPES 버퍼(100mM NaCl, 2mM MgCl₂, 10mM HEPES; pH 7.5) 중의 분석물질 Dox 및 PAC-1을 다양한 농도(0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 μM)의 Dox와 (0, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 μM)의 PAC-1으로 각각 30 μL/min으로 센서 칩 위에 주입하였다. TetR과 이펙터 간의 결합 친화도를 반응 단위(RU)로서 측정하였다. RU를 매 주입마다 6분 동안 기록했고, 각 샘플로부터 기준 유동 셀로부터 기록된 바탕(background) 반응을 차감하였다. Scrubber2 소프트웨어(Biologic Software, Campbell, ACT, 호주)를 사용하여 데이터를 분석하여, 이펙터(Dox, PAC-1)와 TetR 간의 상호작용에 대한 센소그램을 얻었고, 결합속도 상수(k _a ) 및 해리속도 상수(k _d )와 같은 동력학 변수를 추출하여, 이들의 비(k _d /k _a )로서 K _D 값을 결정하였다. 또한, 동일한 방법으로 다양한 농도(0, 10, 20, 40, 80, 160, 320 μM)의 Dox 및 PAC-1에서 rtTA2^S-M2와 이펙터(Dox, PAC-1) 간의 상호작용을 분석하였다.

rtTA2 ^S -M2 단백질의 발현 및 정제

E. coli Rosetta2(DE3) pLysS 세포를 pET-21b(+)-rtTA2^S-M2 플라스미드로 형질 전환했다. 세포를 250 rpm으로 현탁배양하면서 37℃에서 50 μg/mL ampicillun으로 보충된 LB broth에서 성장시켰고, 0.2 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)로 600 nm(OD600)에서 흡광도가 0.7일 때 단백질 발현을 유도하였다. 유도된 세포를 18℃에서 16 h 동안 인큐베이션 하고, 원심분리(3,000 rpm, 10분)를 통해 세포를 수집하고, PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄; pH 7.4)로 세척하고 난 후, PBS에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 얼음 중에서 초음파로 용해시켰다. 세포 잔해와 파괴되지 않은 세포를 원심분리(15,000 rpm, 30분)를 통해 제거하고, 상청액을 nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA) 친화성 칼럼에 로딩했다. PBS에서 imidazole의 선형 구배(linear gradient)(0.1-1 M)에 의해 단백질을 용출하였다. 분획을 수집해서 SDS-PAGE로 분석하였다. rtTA2^S-M2 함유 분획을 모아서 50% 글리세롤을 포함하는 PBS buffer로 투석하여 imidazole을 제거했고, 사용할 때까지 -80℃에서 나눠서 분주하여 보관했다. BCA 분석 키트(Thermo/Pierce, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.

도 5a 내지 5d는 단백질과 이펙터 간의 상호작용을 분석한 SPR(Surface plasmon resonance) 분석 결과로서, 도 5a는 TetR 단백질에 대한 PAC-1의 적정 센소그램이고, 도 5b는 TetR 단백질에 대한 Dox의 적정 센소그램이며, 도 5c는 rtTA2^S-M2 단백질에 대한 PAC-1의 적정 센소그램이고, 도 5d는 rtTA2^S-M2 단백질에 대한 Dox의 적정 센소그램이다.

표 1은 SPR 분석으로부터 도출된 단백질(protein)과 이펙터(effector) 간의 상호작용에 대한 동력학 변수(k _a , k _d ) 및 평형 해리상수(K _D )를 나타낸 것이다.

Protein	Effector	k _a (M^-1s^-1)	k _d (s^-1)	K _D (μM)^a
TetR	PAC-1	98 ± 2	0.0258 ± 0.0002	264 ± 5
TetR	Dox	60 ± 2	0.0092 ± 0.0001	153 ± 4
rtTA2^S-M2	PAC-1	138 ± 3	0.0381 ± 0.0006	276 ± 5
rtTA2^S-M2	Dox	114 ± 3	0.0214 ± 0.0004	187 ± 6

표 1을 참조하면, Tet-R/PAC-1 복합체의 평형 해리상수(K _D )는 TetR/Dox 복합체에 비해 2배 이상인 것으로 나타났으며, 이는 결합속도 상수(k _a )가 아닌 해리속도 상수(k _d )의 차이에 기인한 것을 알 수 있다.

또한, TetR의 변이체인 rtTA2^S-M2와 PAC-1 사이의 상호 작용 역시 PAC-1에 대한 결과와 유사한 것을 알 수 있다.

이와 같은 SPR 분석결과, PAC-1은 TetR 및 rtTA2^S-M2에 대하여 Dox보다는 다소 낮은 친화력으로 직접 상호작용한다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 6: PAC-1 농도에 따른 세포증식률 측정실험

TRPM7을 발현하는 T-REx-293 세포를 1x10⁴ cells/well의 농도로 폴리-L-리신 코팅된 96-웰 플레이트(Falcon, USA)에 접종하고, 이어서 가습된 5% CO₂ 배양기에 넣어 37℃에서 24 h 동안 배양하였다. 기존의 배양배지 제거 후, 1 μg/mL Dox를 포함하는 새로운 100 μL 배양배지를 각 웰에 첨가하여 TRPM7 발현을 유도하였다. 4 h 동안 Dox를 유도한 후, 세포를 1, 2, 4, 8 h 동안 다양한 농도(0, 1, 3, 10, 30, 100 μM)의 PAC-1 존재 하에 Dox 없이 배양하였다. PAC-1-무함유 배지에서 배양된 세포를 대조군으로 사용하였다.

CellTiter 96 Aqueous One Solution 세포 증식 분석 Kit(Promega, USA)를 사용하여 세포 증식 분석을 수행하였다. 20 μL MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨)을 각 웰에 첨가하고, 세포를 2 h 동안 37℃에서 배양했다. Flexstation-3 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6은 TetR 조절 TPRM7의 발현에 대한 PAC-1의 길항 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은, PAC-1 농도 및 배양시간에 따른 대조군 대비 세포의 생존율(% of control)을 나타낸 것으로서, 10μM, 30μM, 100 μM의 PAC-1 존재 하에 배양된 세포는 시간 및 PAC-1 농도가 증가함에 따라 세포의 생존율이 감소하여 세포 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 PAC-1을 이용한 단백질 발현 조절 방법은 PAC-1과 TetR과의 직접적인 상호작용에 의하여 표적 단백질의 발현을 보다 신속하고 정확하게 조절할 수 있다. 이에 따라, 다양한 TetR 조절 단백질에 광범위하게 적용할 수 있음을 확인할 수 있다.

위에서 기재한 구현예 외에도, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 출원 당시의 기술 상식 및 본 명세서의 기재 내용에 기초하여, 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 점은 자명하다.

본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술할 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

테트라사이클린 억제제(TetR)와 테트라사이클린 조절자(tetO)의 복합체(complex); 및 상기 테트라사이클린 억제제와 결합하는 하기 화학식 1로 표시되는 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물)을 포함하는, PAC-1을 이용한 표적 단백질 발현 제어 시스템.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 테트라사이클린 억제제(TetR)와 상기 PAC-1이 결합되어 상기 표적 단백질의 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는, PAC-1을 이용한 표적 단백질 발현 제어 시스템.
제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 GFP(green fluorescent protein) 또는 TRPM7(Transient receptor potential melastatin 7)인 것을 특징으로 하는 PAC-1을 이용한 표적 단백질 발현 제어 시스템.
테트라사이클린 억제제(TetR)와 테트라사이클린 조절자(tetO)의 복합체(complex)에 하기 화학식 1로 표시되는 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물)을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 단백질 발현 제어방법:
[화학식 1]
제4항에 있어서, 상기 표적 단백질은 GFP(green fluorescent protein) 또는 TRPM7(Transient receptor potential melastatin 7)인 것을 특징으로 하는 단백질 발현 제어방법.
제4항에 있어서, 독시사이클린(Dox, Doxycycline) 존재하에 상기 테트라사이클린 억제제(TetR)와 테트라사이클린 조절자(tetO)의 복합체(complex)에 상기 화학식 1의 화합물을 적용하는 것을 특징으로 하는 표적 단백질 발현 제어방법.
제6항에 있어서, 상기 독시사이클린과 PAC-1의 농도비는 1:3 이상인 것을 특징으로 하는 표적 단백질 발현 제어방법.
제4항에 있어서, 상기 PAC-1은 상기 표적 단백질을 발현하는 세포에 처리되어 4 시간 이상 배양하는 것을 특징으로 하는 단백질 발현 제어방법.
하기 화학식 1로 표시되는 PAC-1(프로카스파아제 활성화 화합물)을 유효성분으로 포함하는 Dox 길항제.
[화학식 1]