JP2023519100A - 抗ａｃｖｒ１抗体およびその使用 - Google Patents

抗ａｃｖｒ１抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、アクチビンＡ Ｉ型受容体（ＡＣＶＲ１）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、およびその使用の方法を提供する。本発明の様々な実施形態では、抗体は、ＡＣＶＲ１に結合する完全ヒト抗体である。一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＡＣＶＲ１媒介骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害するために有用であり、したがって、ＡＣＶＲ１と関連する疾患、障害または状態を処置または予防する手段を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２１年２月１０日に出願され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下、そのそれぞれの全内容を参照によって本明細書に組み入れる、２０２０年２月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／９７５０４７号、および２０２０年５月２６日に出願された米国特許仮出願第６３／０３０１３１号の利益を主張する。
本発明は、アクチビンＡ受容体１型（ＡＣＶＲ１）および／またはＡＣＶＲ１変異タンパク質に特異的に結合する抗体および抗体の抗原結合断片、ならびにこれらの抗体を使用する治療および診断方法に関する。
アクチビンＡ受容体１型（ＡＣＶＲ１；ＡｃｔＲ１としても公知；またはアクチビン受容体様キナーゼ２；ＡＬＫ２）は、一回膜貫通受容体であり、ＴＧＦ－β受容体スーパーファミリーの１型骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体のメンバーである。リガンドが結合すると、ＡＣＶＲ１はＩＩ型受容体と共に下流のシグナル伝達カスケードを開始し、受容体特異的Ｒ－ＳＭＡＤタンパク質（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、またはＳＭＡＤ８）の活性化をもたらし、次いでＳＭＡＤ４と会合し、遺伝子の転写制御をもたらす（非特許文献１、非特許文献２）。
ＡＣＶＲ１タンパク質としても公知のＢＭＰ Ｉ型受容体、ＡＬＫ２をコードするＡＣＶＲ１遺伝子の変異は、骨外性骨橋による身体の動きの重度障害を伴う、軟組織での進行性異所的骨形成をもたらす希な障害である、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を引き起こすことがある。ＦＯＰの要因であるＡＣＶＲ１変異は、ＳＭＡＤ依存性下流シグナル伝達の調節不全を引き起こし、変異受容体に非標準のリガンド、アクチビンＡに応答する能力を付与し、異所的骨形成を引き起こす。ＡＣＶＲ１をコードする遺伝子における機能性変異の獲得は、ＦＯＰのようなヒトの骨外性（異所性）骨化の消耗性障害をもたらす。例えば、典型的なＦＯＰ患者は、ＡＣＶＲ１タンパク質の２０６位においてアミノ酸ヒスチジンと置換されたアミノ鎖アルギニンを有し得る。これは、タンパク質のグリシン－セリン活性化ドメインに変化を引き起こし、Ａｃｖｒ１：アクチビンＡ：Ａｃｖｒ２非シグナル伝達複合体をシグナル伝達複合体へと変換する。アクチビンの新機能の結果は、骨格筋間葉系前駆細胞（ＦＡＰ）が軟骨内骨化を開始することである。他の残基を含む非典型的な変異は、同様に作用することができ、ＡＣＶＲ１タンパク質はＢＭＰが存在していないにもかかわらずその活性立体構造で固着される。ＡＣＶＲ１遺伝子の変異は、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）にも関連し得る。
重要な鉄制御因子ヘプシジンの肝臓発現は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）／ＳＭＡＤ経路によって調節される。ＢＭＰシグナル伝達は、ＳＭＡＤタンパク質をリン酸化するリガンド（例えば、ＢＭＰ７、ＢＭＰ６、またはＢＭＰ２）、Ｉ型受容体（例えばＡＣＶＲ１）、ＩＩ型受容体（例えばＡＣＶＲ２またはＢＭＰＲ２）、および共受容体ヘモジュベリン（ＨＪＶ）を必要とする。ＡＣＶＲ１のＢＭＰ６媒介活性化は、ヘプシジンをコードする遺伝子であるＨａｍｐの転写を直接活性化する。ヘプシジンは、鉄排出輸送体として唯一公知のフェロポーチン（ｓｌｃ４０ａｌ）の内部移行を引き起こすことによる、鉄レベルの負の制御因子である。ＢＭＰ６－ＡＣＶＲ１シグナル伝達カスケードの阻害は、Ｈａｍｐ転写の減少をもたらし、ヘプシジンの循環レベルの減少を生じる。循環するヘプシジンの減少は、フェロポーチンレベルの増加をもたらし、小腸からの鉄の取り込みの増加を可能にし、それにより循環する鉄レベルが増加する。
ＡＣＶＲ１に対するモノクローナル抗体は、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載される。
高親和性を有し、ＡＣＶＲ１媒介性骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害する、ＡＣＶＲ１タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体、その断片、またはその変異体は、異所性骨化、異所的骨化、骨異形成症、貧血、またはびまん性橋膠腫の予防および処置において重要であり得る。
Ｋａｔａｇｉｒｉら、米国特許第１０４２８１４８号 Ｋａｔａｇｉｒｉら、米国特許出願公開第２０１８０１１８８３５号 国際公開第２０１９１７２１６５号
Ｍａｓｓａｇｕｅ １９９８ Ｍａｓｓａｑｕｅら ２００５
本発明は、アクチビンＡ受容体１型（ＡＣＶＲ１）タンパク質に特異的に結合し、ＡＣＶＲ１媒介ＢＭＰシグナル伝達を阻害する、抗体およびその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗ＡＣＶＲ１抗体は、高親和性でＡＣＶＲ１に結合し、ＡＣＶＲ１をブロックするかまたは活性化された立体構造を不安定化する完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、特にＡＣＶＲ１タンパク質の活性を不活性化するかまたは減少させるために有用である。ある特定の実施形態では、抗体は、対象におけるＡＣＶＲ１関連疾患または障害の少なくとも１つの症状もしくは兆候の予防、処置または緩和に有用である。ある特定の実施形態では、抗体は、ＡＣＶＲ１関連疾患または障害を有するかまたは有するリスクのある対象に予防的または治療的に投与される。特定の実施形態では、抗体は、それを必要とする対象に投与される場合、異所性骨化、異所的骨化、骨異形成症、貧血、または脳腫瘍を含むある特定のがんの予防および処置に使用される。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＡＣＶＲ１タンパク質および／またはその変異体に結合する。さらに、本明細書に開示される抗体は、高親和性でＡＣＶＲ１タンパク質またはその変異体に結合する。本発明で使用されるＡＣＶＲ１タンパク質は、ヒトまたはマウスのような哺乳動物に由来し得るＡＣＶＲ１タンパク質を含む。例えば、ヒトＡＣＶＲ１の全長アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）を参照して入手できる。
ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）の、ＡＣＶＲ１タンパク質の１～２０位に生じるシグナルペプチドを含み得る。成熟ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）のアミノ酸２１～５０９を含み得る。ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）のアミノ酸２１～１２３に細胞外ドメインを含み得る。ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）のアミノ酸１２４～１４６に膜貫通ドメインを含み得る。ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）の２０８～５０２位内にタンパク質キナーゼドメインを含み得る。ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）の、Ｎ結合（ＧｌｃＮＡｃ．．．）アスパラギンを含むアミノ酸１０２位にグリコシル化を含み得る。ＡＣＶＲ１タンパク質は、例えば受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）の例えば５０１位のリン酸化セリンのような改変残基を含み得る。
ＡＣＶＲ１遺伝子の変異は、ＦＯＰを含む様々な疾患の要因であり得る。ＡＣＶＲ１タンパク質は、様々な家族性および孤発性ＦＯＰ症例で見出されるアミノ酸置換を有する変異ＡＣＶＲ１タンパク質であり得る。ヒトＡＣＶＲ１タンパク質は、限定はされないが、配列番号３４１のＬ１９６Ｐ（１９６位のロイシンをプロリンによって置換する変異）、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ（１９７位のプロリンおよび１９８位のフェニルアラニンを欠失し、ロイシンを挿入する変異）、Ｒ２０２Ｉ（２０２位のアルギニンをイソロイシンによって置換する変異）、Ｒ２０６Ｈ（２０６位のアルギニンをヒスチジンによって置換する変異）、Ｑ２０７Ｅ（２０７位のグルタミンをグルタミン酸によって置換する変異）、Ｒ２５８Ｓ（２５８位のアルギニンをセリンによって置換する変異）、Ｒ２５８Ｇ（２５８位のアルギニンをグリシンによって置換する変異）、Ｇ３２５Ａ（３２５位のグリシンをアラニンによって置換する変異）、Ｇ３２８Ｅ（３２８位のグリシンをグルタミン酸によって置換する変異）、Ｇ３２８Ｒ（３２８位のグリシンをアルギニンによって置換する変異）、Ｇ３２８Ｗ（３２８位のグリシンをトリプトファンによって置換する変異）、Ｇ３５６Ｄ（３５６位のグリシンをアスパラギン酸によって置換する変異）、およびＲ３７５Ｐ（３７５位のアルギニンをプロリンによって置換する変異）を含む、様々な変異を含み得る。
別の例として、マウスＡＣＶＲ１タンパク質の全長アミノ酸配列は、受託番号Ｐ３７１７２（配列番号３４２）を参照して入手できる。
本発明の抗体は、全長（例えばＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体）であり得るかまたは抗原結合部分（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、機能的に影響する、例えば宿主における持続性を増加させるかもしくは残存するエフェクター機能を除去するように改変される（Ｒｅｄｄｙら、２０００，J.Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５～１９３３頁）。ある特定の実施形態では、抗体は二重特異性であってもよい。
第１の態様では、本発明は、ＡＣＶＲ１タンパク質に特異的に結合する単離した組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
本発明の例示的な抗ＡＣＶＲ１抗体は、本明細書の表１および表２に列挙される。表１は、例示的な抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を記載する。表２は、例示的な抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を記載する。
本発明は、表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＨＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対合する表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある特定の実施形態により、本発明は、表１に列挙した例示的な抗ＡＣＶＲ１抗体のいずれかの内に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体は、配列番号：２／１０（例えばｍＡｂ２７３９６）、２２／３０（例えばｍＡｂ２７２４１）、２２／７２（例えばｍＡｂ２７２４５）、４２／４８（例えばｍＡｂ２７２４２）、５８／６２（例えばｍＡｂ２７２４３）、７６／８４（例えばｍＡｂ２７２４７）、９６／１０４（例えばｍＡｂ２７４０４）、１１６／１１９（例えばｍＡｂ２７４０５）、１２８／１３６（例えばｍＡｂ２７４００）、２０３／２１１（例えばｍＡｂ２９２２６）、２７３／２７７（例えばｍＡｂ２９２５７）、および３００／３０７（例えばｍＡｂ２９２６６）の１つから選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲが１２個以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙したアミノ酸配列を含み、および／または前記ＬＣＶＲが１０個以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙したアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片も提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲが表１に列挙したアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸置換を有する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の例では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＬＣＶＲが表１に列挙したアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を有する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＡＣＶＲ１抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲが表１に列挙したアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、および／または前記ＬＣＶＲが表１に列挙したアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、表１に列挙した重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＨＣＤＲ１を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙した重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＨＣＤＲ２を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙した重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＨＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙した軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＬＣＤＲ１を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙した軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＬＣＤＲ２を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙した軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む、ＬＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、表１に列挙したＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対合する表１に列挙したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある特定の実施形態により、本発明は、表１に列挙した例示的な抗ＡＣＶＲ１抗体のいずれかの内に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号：２８／３６（例えばｍＡｂ２７２４２）、６０／６６（例えばｍＡｂ２７２４３）、８２／９０（例えばｍＡｂ２７２４７）、８／１６（例えばｍＡｂ２７３９６）、１０２／１１０（例えばｍＡｂ２７４０５）、２８／６６（例えばｍＡｂ２７２４５）、１３４／１４２（例えばｍＡｂ２７４００）、２０９／２１７（例えばｍＡｂ２９２２６）、２６１／２８３（例えばｍＡｂ２９２５７）、および３０５／３１３（例えばｍＡｂ２９２６６）からなる群から選択される。
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲが、１アミノ酸により表１に列挙したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、１アミノ酸により表１に列挙したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および１アミノ酸により表１に列挙したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＬＣＶＲが、１アミノ酸により表１に列挙したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、１アミノ酸により表１に列挙したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および１アミノ酸により表１に列挙したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲが、配列番号２４もしくは４４のアミノ酸配列または１アミノ酸により配列番号２４もしくは４４とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列または１アミノ酸により配列番号４６とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２８もしくは６０のアミノ酸配列または１アミノ酸により配列番号２８もしくは６０とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＬＣＶＲが、配列番号５０のアミノ酸配列または１アミノ酸により配列番号５０とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５２もしくは６４のアミノ酸配列または１アミノ酸により配列番号５２もしくは６４とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３６もしくは６６のアミノ酸配列または１アミノ酸により配列番号３６もしくは６６とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、表１に列挙した例示的な抗体のいずれかの内に含有される６個のＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４４－４６－２８－５０－５２－３６（例えばｍＡｂ２７２４２）、２４－４６－６０－５０－６４－６６（例えばｍＡｂ２７２４３）、７８－８０－８２－８６－８８－９０（例えばｍＡｂ２７２４７）、４－６－８－１２－１４－１６（例えばｍＡｂ２７３９６）、９８－１００－１０２－１０６－１２２－１１０（例えばｍＡｂ２７４０５）、９８－１００－１０２－１０６－１０８－１１０（例えばｍＡｂ２７４０４）、２４－２６－２８－５０－６４－６６（例えばｍＡｂ２７２４５）、２４－２６－２８－３２－３４－３６（例えばｍＡｂ２７２４１）、１３０－１３２－１３４－１３８－１４０－１４２（例えばｍＡｂ２７４００）、２０５－２０７－２０９－２１３－２１５－２１７（例えばｍＡｂ２９２２６）、２５７－２７５－２６１－２７９－２８１－２８３（例えばｍＡｂ２９２５７）、および４－３０３－３０５－３０９－３１１－３１３（例えばｍＡｂ２９２６６）からなる群から選択される。
関連する実施形態では、本発明は、表１に列挙した例示的な抗体のいずれかによって規定されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される６個のＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１０（例えばｍＡｂ２７３９６）、２２／３０（例えばｍＡｂ２７２４１）、２２／７２（例えばｍＡｂ２７２４５）、４２／４８（例えばｍＡｂ２７２４２）、５８／６２（例えばｍＡｂ２７２４３）、７６／８４（例えばｍＡｂ２７２４７）、９６／１０４（例えばｍＡｂ２７４０４）、１１６／１１９（例えばｍＡｂ２７４０５）、１２８／１３６（例えばｍＡｂ２７４００）、２０３／２１１（例えばｍＡｂ２９２２６）、２７３／２７７（例えばｍＡｂ２９２５７）、および３００／３０７（例えばｍＡｂ２９２６６）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。
ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は当技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習は、例えばＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義を含む。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法の間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１年）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７～９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８～９２７２頁（１９８９年）を参照。公開テーダベースは、抗体内のＣＤＲ配列を同定するためにも利用可能である。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＣＶＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗体またはその抗原結合断片が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）ならびに軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＶＲが：（ｉ）配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｖ）１２個以下のアミノ酸置換を有する、配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＶＲが：（ａ）配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列；または（ｄ）１０個以下のアミノ酸置換を有する、配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の好ましい実施形態では、本発明は、アンタゴニスト方法でＡＣＶＲ１に特異的に結合する、すなわちＡＣＶＲ１結合および／または活性を減少またはブロックする抗体を含む。
本発明は、改変グリコシル化パターンを有する抗ＡＣＶＲ１抗体を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変は有用であることがあり、または抗体はオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠如し、例えば抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）機能を増加させる（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２年）ＪＢＣ ２７７：２６７３３頁、参照）。他の適用では、ガラクトシル化の改変は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を改変するために行われる。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＣＶＲ１へのｐＨ依存性結合を示す抗体およびその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで、高親和性でＡＣＶＲ１に結合する抗体およびその抗原結合断片を含む（すなわち、酸性ｐＨでは結合が減少する）。
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲとＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片とＡＣＶＲ１への特異的結合について競合する抗体およびその抗原結合断片も提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ表１に列挙したＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲとＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片とＡＣＶＲ１への結合について交差競合する抗体およびその抗原結合断片も提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ表１に列挙したＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明は、ＨＣＶＲの３つのＣＤＲとＬＣＶＲの３つのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合断片も提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ表１に列挙したＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明は、アクチビンＩＩ型受容体とシグナル伝達複合体を形成するＢＭＰ７、アクチビンＡまたは他のＴＧＦベータファミリーリガンドによるリガンド誘導性シグナル伝達を阻害する単離抗体およびその抗原結合断片も提供する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＣＶＲ１がアクチビンＩＩ型受容体とシグナル伝達複合体を形成することを防ぐ。本発明は、ＢＭＰ７もしくはアクチビンＡとＡＣＶＲ１の同じエピトープもしくはアクチビンＩＩ型受容体に結合することができるかまたはＢＭＰ７もしくはアクチビンＡとＡＣＶＲ１の異なるエピトープもしくはアクチビンＩＩ型受容体に結合することができる、単離抗体およびその抗原結合断片を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＡＣＶＲ１の第１のエピトープへの第１の結合特異性およびＡＣＶＲ１の第２のエピトープへの第２の結合特異性を含む二重特異性であり、第１および第２のエピトープは異なり、重複しない。
ある特定の実施形態では、本発明は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を有する単離抗体またはその抗原結合断片を提供する：
（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；
（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、６０ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、もしくは０．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、２５℃でＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３９）に結合する；
（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、１５０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、３７℃でｍＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（配列番号３３９）に結合する；
（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、３００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、もしくは２ｎＭ未満のＫＤで、２５℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する；
（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、５００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満のＫＤで、３７℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する；
（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、５００ｎＭより高いＫＤで、２５℃でマウスＡＣＶＲ１に結合しないかもしくはｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する；
（ｇ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、５００ｎＭより高いＫＤで、３７℃でマウスＡＣＶＲ１に結合しないかもしくはｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する；
（ｋ）ヒトＡＣＶＲ１タンパク質もしくはヒトＡＣＶＲ（Ｒ２０６Ｈ）タンパク質を発現する細胞に結合する；
（ｌ）細胞ベースのバイオアッセイで測定した場合、２５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトアクチビンＡによってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する；
（ｍ）細胞ベースのバイオアッセイで測定した場合、２０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＢＭＰ７によってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する；
（ｍ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清ヘプシジンを著しく減少させる；
（ｎ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清鉄レベルを著しく増加させる；ならびに／または
（ｏ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、野生型ＡＣＶＲ１シグナル伝達を阻害する；ならびに
（ｏ）表１に列挙したＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび表１に列挙したＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
第２の態様では、本発明は、抗ＡＣＶＲ１抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、表１に列挙したＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。
本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ＨＣＶＲは３つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙した例示的な抗体のいずれかによって規定される。
本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ＬＣＶＲは３つのＣＤＲのセット（すなわちＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙した例示的な抗体のいずれかによって規定される。
本発明は、ＨＣＶＲとＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供し、ＨＣＶＲは表１に列挙したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは表１に列挙したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は表２に列挙したＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列、および表１に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を含む。本発明のこの態様によるある特定の実施形態では、核酸分子はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは両方とも表１に列挙した同じ抗ＡＣＶＲ１抗体に由来する。
関連する態様では、本発明は、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のいずれか、すなわち表２に記載するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）ＡＣＶＲ１に結合する抗体のＨＣＶＲをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、ＨＣＶＲが表１に列挙した配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、核酸分子；および／または（ｂ）ＡＣＶＲ１に結合する抗体のＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、ＬＣＶＲが表１に列挙した配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、核酸分子を含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはその部分を産生する、ならびにそのように産生された抗体および抗体断片を回収する方法も本発明の範囲内に含まれる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞または原核細胞を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞である。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、プロモーターに作動可能に連結された本発明の抗体またはその抗原結合断片のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；核酸配列の発現に好ましい条件下で宿主細胞を培養する工程；ならびに培養培地および／または宿主細胞から抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む方法を提供する。単離抗体またはその抗原結合断片は、先行技術で公知の方法のいずれかを使用して精製することができる。
第３の態様では、本発明は、ＡＣＶＲ１および薬学的に許容される担体に特異的に結合する治療有効量の少なくとも１つの組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＡＣＶＲ１抗体および第２の治療剤の組合せである組成物に注目する。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＡＣＶＲ１抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。
抗ＡＣＶＲ１抗体と有利に組み合わされる例示的な薬剤としては、限定はされないが、ＡＣＶＲ１に結合するおよび／もしくはＡＣＶＲ１活性を活性化する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合断片等を含む）ならびに／またはＡＣＶＲ１に直接結合しないが、それにもかかわらずＡＣＶＲ１関連疾患もしくは障害（本明細書の他の場所に開示される）の少なくとも１つの症状もしくは兆候を処置もしくは緩和する薬剤が挙げられる。さらなる併用療法および本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体を含む合剤が本明細書の他の場所に開示される。
第４の態様では、本発明は、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体または抗体の抗原結合部分を使用して、対象においてＡＣＶＲ１と関連する疾患または障害を処置する治療方法を提供し、治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。処置される障害は、ＡＣＶＲ１活性の増強によって改善、緩和、阻害または予防される任意の疾患または状態である（例えば貧血、異所性骨化、異所的骨化、骨異形成症、またはびまん性橋膠腫）。ある特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、ＡＣＶＲ１関連疾患または障害を予防または処置する方法を提供する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＣＶＲ１関連疾患または障害を有するかまたは有するリスクのある対象に予防的にまたは治療的に投与される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、第２の治療剤と組み合わせてそれを必要とする対象に投与される。
第２の治療剤は、抗アクチビンＡ抗体またはその抗原結合断片、抗ＢＭＰ７抗体またはその抗原結合断片、抗ＡＣＶＲ２抗体またはその抗原結合断片、抗炎症薬、ステロイド、ビスホスホネート、筋弛緩剤、またはレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）ガンマアゴニスト、生活習慣改善、栄養補助食品、および当技術分野で公知の任意の他の薬剤または治療からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗体またはその抗原結合断片と関連する任意の起こり得る副作用（複数可）を、そのような副作用（複数可）が起こる場合、弱めるまたは低減させるのを助ける薬剤であり得る。抗体またはその断片は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または脳室内に投与される。抗体またはその断片は、対象の約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、１０ｍｇ～６００ｍｇの間を含む１またはそれ以上の用量で投与される。
本発明は、ＡＣＶＲ１結合および／または活性の活性化から利益を得るであろう疾患または障害の処置のための医薬の製造における、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体またはその抗原結合断片の使用も含む。
他の実施形態は、詳細な説明を確実にするレビューから明らかになるであろう。
図１Ａは、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後異所性骨化（ＨＯ）モデルにおける、外科手術後１３週間の期間にわたるｍｉｃｒｏＣＴによる総ＨＯ容積のグラフを示す図である。マウスは、損傷の誘導と同時に開始して、アイソタイプ対照抗体（円、ｎ＝１２）、ＡＬＫ３－Ｆｃ（四角、ｎ＝１２）またはＡｃｖｒ１抗体ｍＡｂ２７２４２（三角、ｎ＝１２）のいずれかを投与された。ＨＯ容積は、損傷の３、６、９および１３週間後のμＣＴによって測定した。Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体は、外科手術の９週間後にアイソタイプ対照と比較して総ＨＯを著しく減少させた（ｐ＜０．０５）。 図１Ｂは、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後異所性骨化（ＨＯ）モデルにおける、外科手術後１３週間の期間にわたるｍｉｃｒｏＣＴによる接着ＨＯ容積のグラフを示す図である。マウスは、損傷の誘導と同時に開始して、アイソタイプ対照抗体（円、ｎ＝１２）、ＡＬＫ３－Ｆｃ（四角、ｎ＝１２）またはＡｃｖｒ１抗体ｍＡｂ２７２４２（三角、ｎ＝１２）のいずれかを投与された。ＨＯ容積は、損傷の３、６、９および１３週間後のμＣＴによって測定した。Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体は、外科手術の９週間後にアイソタイプ対照と比較して接着ＨＯを著しく減少させた（ｐ＜０．０５）。 図１Ｃは、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後異所性骨化（ＨＯ）モデルにおける、外科手術後１３週間の期間にわたるｍｉｃｒｏＣＴによる非接着ＨＯ容積のグラフを示す図である。マウスは、損傷の誘導と同時に開始して、アイソタイプ対照抗体（円、ｎ＝１２）、ＡＬＫ３－Ｆｃ（四角、ｎ＝１２）またはＡｃｖｒ１抗体ｍＡｂ２７２４２（三角、ｎ＝１２）のいずれかを投与された。ＨＯ容積は、損傷の３、６、９および１３週間後のμＣＴによって測定した。Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体は、外科手術の１３週間後にアイソタイプ対照と比較して接着ＨＯを著しく減少させた（ｐ＜０．０１）。 図２Ａ～Ｃは、外科手術の１３週間後のｍｉｃｒｏＣＴによる総ＨＯ容積によって測定した、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおける損傷した後肢のＨＯ容積、接着ＨＯ（白い破線によって囲まれる）または非接着ＨＯ（白い１点鎖線によって囲まれる）の画像を示す。図２Ａは、アイソタイプ対照抗体を受けた後の、外科手術の１３週間後のｍｉｃｒｏＣＴによる総ＨＯ容積によって測定した、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおける損傷した後肢のＨＯ容積、接着ＨＯ（白い破線によって囲まれる）または非接着ＨＯ（白い１点鎖線によって囲まれる）の代表的な画像を示す。図２Ｂは、Ａｌｋ３－Ｆｃを受けた後の、外科手術の１３週間後のｍｉｃｒｏＣＴによる総ＨＯ容積によって測定した、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおける損傷した後肢のＨＯ容積、接着ＨＯ（白い破線によって囲まれる）または非接着ＨＯ（１点鎖線によって囲まれる）の代表的な画像を示す。ｍｉｃｒｏＣＴによるＨＯ容積は、アイソタイプ対照を受けたマウスと比較してＡＬＫ３－Ｆｃを受けたマウスにおいて１３週間後に著しく減少した。図２Ｃは、抗ＡＣＶＲ抗体ｍＡｂ２７２４２を受けた後の、外科手術の１３週間後のｍｉｃｒｏＣＴによる総容積によって測定した、ＷＴマウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおける損傷した後肢のＨＯ容積、接着ＨＯ（白い破線によって囲まれる）または非接着ＨＯ（白い１点鎖線によって囲まれる）の代表的な画像を示す。ｍｉｃｒｏＣＴによるＨＯ容積は、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスと比較して抗ＡＣＶＲ抗体を受けたマウスにおいて１３週間後に著しく減少した。
本発明の方法が記載される前に、本発明が特定の方法、および記載される実験条件に限定されず、そのような方法および条件が変わり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
他に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書で記載する全ての文献、特許、および特許出願は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
定義
「ＡＬＫ２」とも呼ばれる用語「ＡＣＶＲ１」は、アクチビンＡ受容体１型（アクチビン様キナーゼ２としても公知）を指す。ＡＣＶＲ１は、１回貫通Ｉ型膜タンパク質である。ヒトＡＣＶＲ１の全長アミノ酸配列は、５０９ａａ残基を有する、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）を参照して入手できる。タンパク質は、アミノ酸残基２１～１２３に細胞外ドメイン、アミノ酸１２４～１４６位に膜貫通ドメイン、および１４７～５０９位に細胞質ドメインを有する。リガンドが結合すると、ＡＣＶＲ１は２つのＩＩ型および２つのＩ型膜貫通セリン／スレオニンキナーゼからなる受容体複合体を形成する。ＩＩ型受容体は、Ｉ型受容体をリン酸化および活性化する。自己リン酸化すると、次いでＳＭＡＤ転写制御因子に結合し、活性化する。ＡＣＶＲ１は、アクチビンの受容体である。
全長ヒトＡＣＶＲ１タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）としてＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔに提供されるアミノ酸配列によって例示される。マウスＡＣＶＲ１タンパク質の全長アミノ酸配列は、受託番号Ｐ３７１７２（配列番号３４２）を参照して入手できる。
用語「ＡＣＶＲ１」は、組換えＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片を含む。用語は、例えばヒスチジンタグ、ＰＡＤＲＥタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、またはシグナル配列に結合したＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片（例えば配列番号３３８～３４０）も包含する。
用語「ＡＣＶＲ１」は、変異を含むＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片を含み得る。例えば、変異は、ヒトＡＣＶＲ１ ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ受託番号Ｑ０４７７１（配列番号３４１）の相当するアミノ酸配列またはその断片に基づき得る。例えば、ＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片は、限定はされないが、相当する配列番号３４１のＬ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３２６Ｄ、およびＲ３７５Ｐを含む変異を含み得る。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続する２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えばＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すことを意図する。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分けることができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が点在する。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明のある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または自然もしくは人工的に改変される。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲのｓｉｄｅ－ｂｙ－ｓｉｄｅ解析に基づいて規定される。
１つもしくはそれ以上のＣＤＲ残基の置換または１つもしくはそれ以上のＣＤＲの削除も可能である。抗体は、１つまたは２つのＣＤＲが結合のために分配される科学文献に記載された。Ｐａｄｌａｎら（１９９５年 ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３～１３９頁）は、公開された結晶構造に基づき、抗体とそれらの抗原の間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約５分の１から３分の１のみが実際に抗原と接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎは、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を持たない多くの抗体も見出した（Ｖａｊｄｏｓら ２００２年 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５～４２８頁も参照）。
抗原と接触しないＣＤＲ残基は、分子モデリングおよび／または経験により、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、先の研究に基づいて同定される（例えばＣＤＲＨ２の残基Ｈ６０－Ｈ６５は必要とされないことが多い）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が除去される場合、通常、別のヒト抗体配列またはそのような配列のコンセンサスの相当する位置を占めるアミノ酸によって置換される。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸はまた、経験的に選択される。経験的な置換は、保存的または非保存的置換であり得る。
本明細書に開示される完全ヒト抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体は、相当する生殖系列配列と比較した場合、重および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手できる生殖系列配列と比較することによって容易に確かめることができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体、およびその抗原結合断片を含み、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の相当する残基（複数可）、または別のヒト生殖系列配列の相当する残基（複数可）、または相当する生殖系列残基（複数可）の保存アミノ酸置換（そのような配列変化は本明細書では総称して「生殖系列変異」と呼ばれる）に変異される。当業者は、本明細書に開示される重および軽鎖可変領域配列から開始して、１つまたはそれ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組合せを含む多くの抗体および抗原結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内の全てのフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は、抗体が由来した元の生殖系列配列に見出される残基に変異され戻る。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えばＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見出される変異残基のみが元の生殖系列配列に変異し戻される。他の実施形態では、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）が、異なる生殖系列配列（すなわち抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の相当する残基（複数可）に変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つまたはそれ以上の生殖系列変異の任意の組合せを含有することができ、例えば、ある特定の個々の残基は特定の生殖系列配列の相当する残基に変異されるが、元々の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持されるかまたは異なる生殖系列配列の相当する残基に変異される。一度得られると、１つまたはそれ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニスト生物特性の改善または増強、免疫原性の減少等のような、１つまたはそれ以上の所望の特性を容易に試験することができる。この通常の方法で得られる抗体および抗原結合断片は、本発明内に包含される。
本発明は、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む完全ヒト抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば１０個またはそれ以下、８個またはそれ以下、６個またはそれ以下、４個またはそれ以下等の保存アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＡＣＶＲ１抗体を含む。
用語「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列に移植されたｍＡｂを含むことを意図しない。用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において、組換えにより産生される抗体を含む。用語は、ヒト対象から単離したかまたはヒト対象において生成された抗体を含むことを意図しない。
用語「組換え」は、本明細書で使用される場合、例えばＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む組換えＤＮＡ技術として当技術分野で公知の技術または方法によって作製される、発現される、単離されるまたは得られる本発明の抗体またはその抗原結合断片を指す。用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えばトランスジェニックマウスを含む）、もしくは細胞（例えばＣＨＯ細胞）発現システムにおいて発現されたか、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を指す。
用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、または「特異的に～に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔｏ）」等は、抗体またはその抗原結合断片が生理的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－８Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数（例えば、小さいＫＤは強い結合を示す）によって特徴付けられる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等を含む。本明細書に記載される場合、抗体は、ＡＣＶＲ１に特異的に結合する表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって同定された。さらに、ＡＣＶＲ１の１つのドメイン、および１つもしくはそれ以上のさらなる抗原に結合する多特異性抗体、またはＡＣＶＲ１の２つの異なる領域に結合する二重特異性は、それでもなお、本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」抗体と考えられる。
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定された場合、少なくとも１０－８Ｍ；好ましくは１０－９Ｍ；より好ましくは１０－１０Ｍ；さらにより好ましくは１０－１１ＭのＫＤとして表されるＡＣＶＲ１に結合親和性を有するｍＡｂを指す。
用語「遅い解離速度」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定した場合、速度定数１×１０－３ｓ－１またはそれ以下、好ましくは１×１０－４ｓ－１またはそれ以下でＡＣＶＲ１から解離する抗体を意味する。
用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の自然発生の、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子工学的に作製されるポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。用語、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」は、本明細書で使用される場合、ＡＣＶＲ１タンパク質に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上の断片を指す。
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、そのようなリガンドまたは治療部分、第２の抗ＡＣＶＲ１抗体、またはＡＣＶＲ１関連疾患もしくは障害を処置するために有用な任意の他の治療部分のような部分にコンジュゲートされる（「イムノコンジュゲート」）。
「単離抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＡＣＶＲ１、またはその断片に特異的に結合する単離抗体はＡＣＶＲ１以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
「不活性化抗体」または「アンタゴニスト抗体」、（または「ＡＣＶＲ１活性を減少もしくはブロックする抗体」もしくは「活性化された立体構造を不安定化する抗体」）は、本明細書で使用される場合、そのＡＣＶＲ１ヘの結合がＡＣＶＲ１の少なくとも１つの生物学的活性の不活性化をもたらす抗体を指すことを意図する。例えば、本発明の抗体は、それを必要とする対象への投与時に、貧血を減少させることができる。
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用される場合、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用する、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出により、リアルタイム生体分子相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。
用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域において特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つより多くのエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原の異なる領域に結合することができ、異なる生物学的効果を有することができる。用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原の部位も指す。それは、抗体によって結合される抗原の領域も指す。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域も指す。エピトープは、構造性または機能性として定義される。機能性エピトープは、通常、構造性エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、立体構造性であってもよく、すなわち、非線状アミノ酸から構成される。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面グループである決定因子を含んでもよく、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴、および／または特定の荷電特徴を有してもよい。
用語「交差競合」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、別の抗体またはその抗原結合断片の結合を阻害またはブロックする抗体またはその抗原結合断片を意味する。用語は、両方向の２つの抗体間の競合、すなわち、第２の抗体に結合する、および第２の抗体の結合をブロックする第１の抗体、ならびにその逆も含む。ある特定の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、同じエピトープに結合することができる。あるいは、第１および第２の抗体は、一方の結合が、例えば立体障害を介して第２の抗体の結合を阻害またはブロックするように異なるが重複するエピトープに結合することができる。抗体間の交差競合は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、リアルタイム、ラベルフリーバイオレイヤー干渉アッセイによって測定される。２つの抗体間の交差競合は、自己結合（第１および第２の抗体は同じ抗体である）によりバックグラウンドシグナルより低い第２の抗体の結合として表される。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースライン自己バックグラウンド結合（第１および第２の抗体は同じ抗体である）より低い第２の抗体の％結合として表される。
用語「実質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「実質的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、核酸またはその断片を参照する場合、別の核酸（またはその相補性鎖）による適切なヌクレオチド挿入または欠失と適切にアラインすると、任意の周知の配列同一性のアルゴリズム、例えば以下に検討するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰによって測定した場合、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、ある特定の例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」または「実質的に類似（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ）」は、デフォルトギャップ重み付けを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによる等、最適にアラインされた場合、２つのペプチド配列が少なくとも９０％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存アミノ酸置換によって異なる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば荷電または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しないであろう。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合では、類似性のパーセントまたは程度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整される。この調整を行う手段は当業者に周知である。例えば、参照によって本明細書に組み入れる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１頁を参照。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、参照によって本明細書に組み入れるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３～４５頁に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックス中で正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックス中で負ではない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失および他の変更に割り当てた類似性の測定を用いて類似配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物からの相同ポリペプチド等の関連性の高いポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのミューテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターと用いることができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴ等のプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を参照。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを用いて、デフォルトまたは推奨パラメーターで比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、照会配列と検索配列の間の最良のオーバーラップ領域のアライメントと配列同一性パーセントを提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ（２０００年））。本発明の配列を異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較する場合に別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁および（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２頁を参照。
語句「治療有効量」は、そのために投与される所望の効果を産生する量を意味する。正確な量は、処置の目的により、公知の技術を使用して当業者によって確認できるであろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９年）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ参照）。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、貧血または異所的骨化のようなＡＣＶＲ１関連疾患または障害の緩和、予防および／または処置を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。
本明細書で使用される場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本発明の抗体のような治療剤の、それを必要とする対象への投与による、ＡＣＶＲ１関連疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候の重症度の減少または緩和を指す。用語は、疾患の進行または症状／兆候の悪化の阻害を含む。用語は、すなわち対象が、本発明の抗体のような治療剤を投与すると、疾患を持たないかまたは疾患が減少した、疾患の正の予後も含む。治療剤は、対象に治療用量で投与される。
用語「予防する（ｐｒｅｃｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本発明の抗体の投与時のＡＣＶＲ１関連疾患もしくは障害の兆候またはそのような疾患もしくは障害の任意の症状もしくは兆候の阻害を指す。
抗体の抗原結合断片
他に特に指定しない限り、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合断片を含む抗体分子を包含すると理解される。用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の自然発生の、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子工学的に作製されるポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。用語、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」は、本明細書で使用される場合、ＡＣＶＲ１タンパク質、その断片、および／またはその変異体に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離したＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態では、用語「抗原結合断片」は、多特異性抗原結合分子のポリペプチド断片を指す。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質消化または抗体可変ドメインおよび（場合により）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術のような任意の好適な標準技術を使用して完全抗体分子に由来し得る。そのようなＤＮＡは公知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手でき、もしくは合成することができる。ＤＮＡは、シークエンスおよび化学的または分子生物学技術を使用することによって操作し、１つもしくはそれ以上の可変および／もしくは定常ドメインを好適な構造へと配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を改変、付加もしくは欠失する等できる。
抗原結合断片の非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離した相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。他の工学的に操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインも、本明細書で使用される場合、表現「抗原結合断片」内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってもよく、通常、１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するかまたはそれらにインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合断片では、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに関連して位置し得る。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有し得る。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合断片内で見出される、非限定的な、可変および定常ドメインの例示的な構造としては：（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ii）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；(ｖ)ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上記に列挙した任意の例示的な構造を含む、可変および定常ドメインの任意の構造では、可変および定常ドメインは、互いに直接連結されるかまたは完全もしくは部分ヒンジもしくはリンカー領域によって連結される。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上）のアミノ酸からなってもよく、単一ポリペプチド分子の隣接する可変および／または定常ドメイン間の可動性もしくは半可動性連結を生じる。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いにおよび／または１つもしくはそれ以上の単量体のＶＨもしくはＶＬドメインとの非共有結合的な会合で（例えばジスルフィド結合（複数可）により）、上記に列挙した任意の可変および定常ドメイン構造のホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は単一特異性または多特異性（例えば二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別の抗原または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な通常の技術を使用して本発明の抗体の抗原結合断片の文脈での使用のために適用される。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である。任意のそのような公知の方法は、本発明の文脈で使用され、ＡＣＶＲ１に特異的に結合するヒト抗体を作製する。
以下のいずれか１つを含む免疫源は、ＡＣＶＲ１タンパク質に対する抗体を生成するために使用される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、全長、天然ＡＣＶＲ１タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ０４７７１を参照）によって、またはタンパク質もしくはその断片をコードするＤＮＡによって免疫したマウスから得られる。あるいは、タンパク質またはその断片は、標準的な生化学技術を使用して産生され、改変され、免疫源として使用される。
一部の実施形態では、免疫源は、大腸菌またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような、任意の他の真核もしくは哺乳動物細胞で発現される、組換えＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片であり得る（例えば、配列番号３３８～３４０）。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）参照）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＡＣＶＲ１に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。次いで、ＤＮＡは、完全ヒト抗体を発現することができる細胞で発現される。
通常、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、目的の抗原によって負荷され、リンパ細胞（例えばＢ細胞）は、抗体を発現するマウスから回収される。リンパ細胞は、骨髄腫細胞系と融合され、不死化したハイブリドーマ細胞系を調製し、そのようなハイブリドーマ細胞系はスクリーニングおよび選択され、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは単離され、重鎖および軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域に結合される。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞で産生される。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離される。
初めに、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。以下の実験の節のように、抗体は特徴付けられ、親和性、選択性、エピトープ等を含む所望の特徴について選択される。マウス定常領域は、所望のヒト定常領域と置き換えられ、本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型または改変ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を生成する。選択される定常領域は、特定の使用によって変わり得るが、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は可変領域にある。
生物学的等価性
本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体および抗体断片は、記載した抗体のものとは異なるアミノ酸配列を有するが、ＡＣＶＲ１タンパク質に結合する能力を保持するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較した場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載した抗体のものと基本的に等価である生物活性を示す。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示した配列と比較した場合、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片に基本的に生物学的に等価である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えばそれらが、単回投与または複数回投与のいずれでも、類似の実験条件下で同じモル用量で投与される場合、吸収の速度および程度が著しい違いを示さない製剤学的同等製剤または製剤学的代替製剤である場合、生物学的に等価であると考えられる。一部の抗体は、それらの吸収の程度が等価であるがそれらの吸収の速度が等価ではない場合、同等製剤または製剤学的代替製剤であると考えられ、吸収の速度のそのような違いは故意でありラベルに反映され、例えば慢性使用において有効な体内の薬物濃度の到達に必須ではなく、特定の薬物製品研究のために医学的に重要ではないと考えられるため生物学的に等価であると考えられる。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、または有効性に臨床的に意味のある違いがない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、患者が、そのような交換をしない連続治療と比較して、免疫原性の臨床的に著しい変化、または有効性の減少を含む副作用のリスクの予測される増加なく、１回またはそれ以上参照産物と生物学的産物の間で交換される場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方とも、共通のメカニズムまたは使用の条件（複数可）のための作用のメカニズムによって、そのようなメカニズムが公知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって実証される。生物学的等価性測定は、例えば（ａ）抗体またはその代謝物の濃度が、時間の関数として血液、血漿、血清、または他の生体液で測定される、ヒトまたは他の哺乳動物でのｉｎ ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトｉｎ ｖｉｖｏ生物学的利用能データと相関する、およびそれらの適度に予測できるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物でのｉｎ ｖｉｖｏ試験；ならびに（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立するコントロール良好な臨床試験を含む。
本発明の抗体の生物学的に等価なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を作製するか、または生物学的活性に必要ではない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることによって構築される。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基は、他のアミノ酸によって欠失または置換され、復元時に、必要ではないかまたは不適当な分子間ジスルフィド結合の形成を防ぐ。他の文脈では、生物学的に等価な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を改変するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を除去または取り除く変異を含む抗体バリアントを含み得る。
Ｆｃバリアントを含む抗ＡＣＶＲ１抗体
本発明のある特定の実施形態により、例えば中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１つまたはそれ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＡＣＶＲ１抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＡＣＶＲ１抗体を含み、変異（複数可）は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０の範囲であるエンドソーム）でＦｃＲｎへのＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与された場合、抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、２５０（例えばＥもしくはＱ）；２５０および４２８（例えばＬもしくはＦ）；２５２（例えばＬ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４（例えばＳもしくはＴ）、および２５６（例えばＳ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）位での改変；または４２８および／もしくは４３３（例えばＨ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４（例えばＡ、Ｗ、Ｈ、ＦもしくはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦもしくはＮ４３４Ｙ］）位の改変；または２５０および／もしくは４２８位の改変；または３０７もしくは３０８（例えば３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位の改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えばＶ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えばＶ３０８Ｆ）改変；４３３Ｋ（例えばＨ４３３Ｋ）および４３４（例えば４３４Ｙ）改変；２５２、２５４、および２５６（例えば２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌ改変（例えばＴ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８改変（例えば３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、改変は、２５６Ａ（例えばＤ２５６Ａ）および／または２９７Ａ（例えばＮ２９７Ａ）改変を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８L（例えばＴ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えばＭ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えばＰ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えばＰ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えばＤ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えばＴ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えばＨ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される変異の１つまたはそれ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＡＣＶＲ１抗体を含む。本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の前述のＦｃドメイン変異および他の変異の全ての可能な組合せは、本発明の範囲内で考えられる。
本発明は、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＡＣＶＲ１抗体も含み、キメラＣＨ領域は１つより多くの免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域由来のセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子由来のＣＨ３ドメインの一部または全てと組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子由来のＣＨ２ドメインの一部または全てを含むキメラＣＨ領域を含み得る。ある特定の実施形態により、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付による２２８～２３６位のアミノ酸残基）と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付による２１６～２２７位のアミノ酸残基）を含み得る。ある特定の実施形態により、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジ由来のアミノ酸残基およびヒトＩｇＧ２下部ヒンジ由来のアミノ酸残基を含む。本明細書に記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態では、抗体の治療または薬物動態特性に悪い影響を及ぼさない改変されたＦｃエフェクター機能を示す（例えば、その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号を参照）。
抗体の生物学的特徴
一般に、本発明の抗体は、ＡＣＶＲ１タンパク質に結合し、その活性を減少させることによって機能する。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５００ｎＭ以下のＫＤでヒトＡＣＶＲ１タンパク質（例えば２５℃または３７℃で）に結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴によって、または実質的に類似のアッセイによって測定された場合、約５００ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満のＫＤでＡＣＶＲ１に結合する。ある特定の実施形態では、本発明は、完全ヒトモノクローナル抗体である単離抗ＡＣＶＲ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、６０ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、２５℃でＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３９）に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、１５０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、３７℃でｍＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（配列番号３３９）に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、３００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満または２ｎＭ未満のＫＤで、２５℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、５００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満のＫＤで、３７℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、マウスＡＣＶＲ１に結合しない。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、５００ｎＭより高いＫＤで、２５℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例３に規定するアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴アッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、５００ｎＭより高いＫＤで、３７℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する。本発明は、例えば本明細書の実施例５に規定するアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、ヒトＡＣＶＲ１タンパク質またはヒトＡＣＶＲ（Ｒ２０６Ｈ）タンパク質を発現する細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片も含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例６に規定するアッセイフォーマットを使用して、細胞ベースのバイオアッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、２５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトアクチビンＡによってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例６に規定するアッセイフォーマットを使用して、細胞ベースのバイオアッセイで、または実質的に類似のアッセイで測定された場合、２０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＢＭＰ７によってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する。
本発明は、例えば本明細書の実施例７に規定するアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清ヘプシジンを著しく減少させる抗体またはその抗原結合断片も含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合は、例えば本明細書の実施例７に規定するアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清鉄レベルを著しく増加させる。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例７に規定するアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、野生型ＡＣＶＲ１シグナル伝達を阻害する。
ある特定の実施形態では、本発明による抗ＡＣＶＲ抗体またはその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例８に記載されるように野生型マウスの外傷後ＨＯモデル、または実質的に類似のモデルにおいて、異所性骨化（ＨＯ）を著しく減少させる。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＡＣＶＲ１、その断片、またはその変異体に特異的に結合し、表１に列挙したＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび表１に列挙したＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
一実施形態では、本発明は、ＡＣＶＲ１タンパク質に特異的に結合し、ＡＣＶＲ１媒介骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害する単離組換え抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその断片は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を示す：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定された場合、６０ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、もしくは０．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、２５℃でＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３９）に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定された場合、１５０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、３７℃でｍＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（配列番号３３９）に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定された場合、３００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、もしくは２ｎＭ未満のＫＤで、２５℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定された場合、５００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満のＫＤで、３７℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定された場合、マウスＡＣＶＲ１に結合せず、５００ｎＭより高いＫＤで、２５℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する；（ｇ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定された場合、マウスＡＣＶＲ１に結合せず、５００ｎＭより高いＫＤで、３７℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する；（ｋ）ヒトＡＣＶＲ１タンパク質もしくはヒトＡＣＶＲ（Ｒ２０６Ｈ）タンパク質を発現する細胞に結合する；（ｌ）細胞ベースのバイオアッセイで測定された場合、２５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトアクチビンＡによってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する；（ｍ）細胞ベースのバイオアッセイで測定された場合、２０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＢＭＰ７によってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する；（ｍ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清ヘプシジンを著しく減少させる；（ｎ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清鉄レベルを著しく増加させる；ならびに／または（ｏ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、野生型ＡＣＶＲ１シグナル伝達を阻害する；ならびに（ｐ）表１に列挙したＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび表１に列挙したＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
本発明の抗体は、前述の生物学的特徴の１つもしくはそれ以上、またはそれらの任意の組合せを持ち得る。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示のレビューから当業者には明らかであろう。
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、ＡＣＶＲ１タンパク質分子の１つまたはそれ以上の領域内に見出される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＡＣＶＲ１抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＡＣＶＲ１タンパク質分子の任意の前述のドメイン内に位置する３個またはそれ以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上）のアミノ酸の単一連続配列からなり得る（例えばドメインの線状エピトープ）。あるいは、エピトープは、タンパク質分子の前述のドメインのいずれかまたは両方内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る（例えば立体構造性エピトープ）。
当業者に公知の様々な技術は、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうか決定するために使用される。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されるような通常のクロスブロッキングアッセイが挙げられる。他の方法は、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３～６３頁）、ペプチド切断解析結晶構造研究およびＮＭＲ解析を含む。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学的改変などの方法が用いられる（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７～４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用される別の方法は、マススペクトロメトリーによって検出される水素／重水素交換である。一般的な用語では、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質の重水素標識後に重水素標識したタンパク質への抗体の結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体は、水に移され、抗体複合体によって保護されるアミノ酸内の交換可能な陽子は、境界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能な陽子よりも遅く重水素から水素へと逆交換される。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し、したがって、界面に含まれないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質は、プロテアーゼ切断およびマススペクトロメトリー解析に供され、それにより抗体が相互作用する特定のアミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２～２５９頁；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａ頁参照。
用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の３次フォールディングによって並べられた非連続アミノ酸から形成される。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への暴露で保持されるが、３次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変成溶媒による処置で失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３個、より通常には、ユニークな空間的立体構造で少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。
抗原構造ベース抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の改変関連プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性により同じ抗原に対する多くのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴライズする方法である（その全体を参照によって本明細書に特に組み入れる米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号参照）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるかまたは部分的に重複するユニークなエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝的に同一の抗体の急速なフィルタリングを可能にし、特徴付けは遺伝的に異なる抗体に注目される。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を促進し得る。ＭＡＰは、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群へとソートするために使用される。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＣＶＲ１の細胞外ドメイン内に見出される１つまたはそれ以上のエピトープと相互作用する抗ＡＣＶＲ１抗体およびその抗原結合断片を含む。エピトープ（複数可）は、ＡＣＶＲ１の細胞外ドメイン内に位置する３個またはそれ以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上）のアミノ酸の１つまたはそれ以上の連続配列からなり得る。あるいは、エピトープは、ＡＣＶＲ１タンパク質内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る。
本発明は、表１に列挙した任意の特定の例示的な抗体として、同じエピトープ、またはエピトープの部分に結合する抗ＡＣＶＲ１抗体を含む。同様に、本発明は、表１に列挙した任意の特定の例示的な抗体と、ＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片への結合について競合する抗ＡＣＶＲ１抗体も含む。例えば、本発明は、表１に列挙した１つまたはそれ以上の抗体と、ＡＣＶＲ１タンパク質への結合について交差競合する抗ＡＣＶＲ１抗体を含む。
当技術分野で公知の通常の方法を使用することにより、抗体が、参照抗ＡＣＶＲ１抗体と同じエピトープに結合するか、またはそれと結合について競合するかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＡＣＶＲ１抗体と同じエピトープに結合するか決定するため、参照抗体は、飽和条件下でＡＣＶＲ１タンパク質またはペプチドに結合させることができる。次に、ＡＣＶＲ１タンパク質分子に結合する試験抗体の能力が評価される。試験抗体が、参照抗ＡＣＶＲ１抗体との飽和結合後にＡＣＶＲ１に結合できる場合、試験抗体は、参照抗ＡＣＶＲ１抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が、参照抗ＡＣＶＲ１抗体による飽和結合後にＡＣＶＲ１タンパク質に結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＡＣＶＲ１抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合することができる。
抗体が、参照抗ＡＣＶＲ１抗体との結合について競合するか決定するため、上記の結合方法は、２つの方向で実施される：第１の方向では、参照抗体は、飽和条件下でＡＣＶＲ１タンパク質に結合し、ＡＣＶＲ１分子への試験抗体の結合を評価する。第２の方向では、試験抗体は、飽和条件下でＡＣＶＲ１分子に結合し、ＡＣＶＲ１分子への参照抗体の結合を評価する。両方向において、第１の（飽和する）抗体のみがＡＣＶＲ１分子に結合することができる場合、試験抗体と参照抗体はＡＣＶＲ１ヘの結合について競合すると結論付けられる。当業者によって評価されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、参照抗体と同一のエピトープに必ずしも結合しなくてもよいが、重複または隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を厳密にブロックすることができる。
それぞれ抗原に対して他の結合を競合的に阻害（ブロック）する場合、２つの抗体は、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定した場合、１、５、１０、２０または１００倍過剰の１つの抗体が、少なくとも５０％だが、好ましくは７５％、９０％または９９％他の結合を阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０年 ５０：１４９５～１５０２頁参照）。あるいは、１つの抗体の結合を減少または排除する抗原の基本的に全てのアミノ酸変異が他の結合を減少または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。１つの抗体の結合を減少または排除する一部のアミノ酸変異が他の結合を減少または排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
さらなる通常の実験（例えばペプチド変異および結合解析）を実施し、観察された試験抗体の結合の欠如が実際、参照抗体と同じエピトープに結合するためであるか、または立体的ブロッキング（または別の現象）が観察される結合の欠如の原因であるか確かめることができる。このソートの実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは当技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
イムノコンジュゲート
本発明は、ＡＣＶＲ１関連疾患または障害（例えば貧血または異所的骨化）を処置する、治療部分にコンジュゲートしたヒトモノクローナル抗体（「イムノコンジュゲート」）を包含する。本明細書で使用される場合、用語「イムノコンジュゲート」は、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤に化学的または生物学的に結合される抗体を指す。抗体は、その標的に結合できる限り、分子の任意の位置で、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療剤に結合される。イムノコンジュゲートの例としては、抗体薬物コンジュゲートおよび抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、薬剤は、ＡＣＶＲ１タンパク質に対する第２の異なる抗体であり得る。抗ＡＣＶＲ１抗体にコンジュゲートされる治療部分の型は、処置される状態および達成される所望の治療効果を考慮するであろう。イムノコンジュゲートを形成するために好適な薬剤の例は、当技術分野で公知であり；例えば国際公開第０５／１０３０８１号参照。
多特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多特異性であり得る。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０～６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８～２４４頁参照。
本発明の任意の多特異性抗原結合分子、またはそのバリアントは、当業者に公知のように、標準的な分子生物学技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を使用して構築される。
一部の実施形態では、ＡＣＶＲ１特異的抗体は、二重特異性フォーマット（「二重特異性」）で生成され、ＡＣＶＲ１タンパク質の異なるドメインに結合する可変領域が共に結合し、単一の結合分子内に二重ドメイン特異性を付与する。適切に設計された二重特異性は、特異性と結合能の両方の増加を通して全体的なＡＣＶＲ１タンパク質阻害効果を増強することができる。個々のドメインに特異性を有する可変領域、（例えばＮ末端ドメインのセグメント）、または１つのドメイン内の異なる領域に結合することができるものは、それぞれの領域が別々のエピトープ、または１つのドメイン内の異なる領域に同時に結合する構造足場で対合される。二重特異性の一例では、１つのドメインに特異性を有する結合剤からの重鎖可変領域（ＶＨ）は、第２のドメインに特異性を有する一連の結合剤からの軽鎖可変領域（ＶＬ）と組み換えられ、ＶＨの元の特異性を壊さずに元のＶＨと対合される非同族ＶＬパートナーを同定する。このように、単一のＶＬセグメント（例えばＶＬ１）は、２つの異なるＶＨドメイン（例えばＶＨ１とＶＨ２）と組み合わされ、２つの結合「アーム」から構成される二重特異性を生成する（ＶＨ１－ＶＬ１およびＶＨ２－ＶＬ１）。単一のＶＬセグメントの使用は、システムの複雑性を減少させ、それにより、二重特異性を生成するために使用されるクローニング、発現、および精製方法を簡単にし、その有効性を増加させる（例えば米国特許出願公開第２０１１／０１９５４５４号および米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号参照）。
あるいは、１つより多くのドメインおよび第２の標的に結合する抗体は、限定はされないが、例えば、第２の異なる抗ＡＣＶＲ１抗体は、本明細書に記載される技術、または当業者に公知の他の技術を使用して二重特異性フォーマットに調製される。異なる領域に結合する抗体可変領域は、例えばＡＣＶＲ１の細胞外ドメインの関連部位に結合する可変領域と共に結合され、単一の結合分子内に二重抗原特異性を与える。この性質の適切に設計された二重特異性は、二重機能を与える。細胞外ドメインに特異性を有する可変領域は、細胞外ドメインの外側に特異性を有する可変領域と組み合わされ、各可変領域を別々の抗原に結合させる構造足場で対合される。
本発明の文脈で使用される例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を含み、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸差異は、アミノ酸差異のない二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けにより；ＥＵ番号付けによりＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を減少または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴにより；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に見出されるさらなる改変は、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴにより；ＥＵによりＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴにより；ＥＵによりＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴにより；ＥＵによりＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）を含む。上記の二重特異性抗体フォーマットのバリエーションは、本発明の範囲内であると考えられる。
本発明の文脈で使用される他の例示的な二重特異性フォーマットとしては、限定はされないが、例えばｓｃＦｖベースまたはディアボディー二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ、共通軽鎖（例えばｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ等を有する共通軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマット（例えばＫｌｅｉｎら ２０１２年，ｍＡｂｓ ４：６，１～１１、および前述のフォーマットの概要について本明細書に引用された参考文献を参照）が挙げられる。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用しても構築され、例えば、直交性の化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して部位特異的抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートが生成され、次いで規定した組成、結合価および幾何学を有する多量体複合体へと自己集合する（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［ＥＰＵＢ：２０１２年１２月４日］参照）。
治療投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体またはその抗原結合断片を含む治療組成物を提供する。本発明による治療組成物は、好適な担体、賦形剤、および製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与され、移行、送達、耐性等の改善を提供する。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に公知の処方集に見出される：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、粉剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー剤、ろう剤、油剤、脂質製剤、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型乳剤、カーボワックス乳剤（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル剤、およびカーボワックス含有半固体混合物製剤が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ （１９９８年） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８～３１１頁も参照。
抗体の用量は、投与される対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与の経路等によって変わり得る。本発明の抗体が、成人患者の疾患または障害を処置するため、またはそのような疾患を予防するために使用される場合、本発明の抗体を、通常、約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で投与することは有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および期間が調節される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約６００ｍｇ、約５～約５００ｍｇ、または約１０～約４００ｍｇの初期用量として投与される。ある特定の実施形態では、初期用量は、初期用量とおよそ同じまたはそれより少ない量の抗体またはその抗原結合断片の第２または複数の続く用量の投与に続き、続く用量は、少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；少なくとも８週間；少なくとも９週間；少なくとも１０週間；少なくとも１２週間；または少なくとも１４週間空けられる。
様々な送達システムが公知であり、例えばリポソーム中へのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが本発明の医薬組成物を投与するために使用される（例えばＷｕら（１９８７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９～４４３２頁参照）。導入の方法としては、限定はされないが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、脳室内、および経口経路が挙げられる。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内壁（例えば口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通る吸収により投与され、他の生物学的活性剤と共に投与される。投与は、全身または局所であり得る。医薬組成物は、ベシクル、特にリポソームでも送達される（例えばＬａｎｇｅｒ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７～１５３３頁参照）。
本発明の抗体を送達するナノ粒子の使用も本明細書で考えられる。抗体コンジュゲートナノ粒子は、治療適用と診断適用の両方のために使用される。抗体コンジュゲートナノ粒子ならびに調製および使用の方法は、参照によって本明細書に組み入れるＡｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．ら ２００９年（Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９年，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４３９３８９，２４頁，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”）によって詳細に記載される。ナノ粒子は開発され、標的細胞への医薬組成物中に含有される抗体にコンジュゲートされる。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、それぞれその全体を本明細書に組み入れる米国特許第８２５７７４０号、または米国特許第８２４６９９５号にも記載される。
ある特定の状況では、医薬組成物は、放出制御システムで送達される。一実施形態では、ポンプが使用される。別の実施形態では、高分子材料が使用される。さらに別の実施形態では、放出制御システムは組成物の標的の近くに置かれ、したがって全身用量の画分のみを必要とする。
注射剤は、静脈内、皮下、頭蓋内、腹腔内および筋肉内注射、点滴等のための剤形を含み得る。これらの注射剤は、公知の方法によって調製される。
本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジによって皮下または静脈内に送達される。さらに、皮下送達に関して、ペン型注入デバイスが本発明の医薬組成物の送達に容易に適用される。そのようなペン型注入デバイスは再利用可能であるかまたは使い捨てであり得る。再利用可能なペン型注入デバイスは、通常、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されると、カートリッジは空になり、空のカートリッジは容易に捨てられ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換される。ペン型注入デバイスは、次いで、再利用される。使い捨てのペン型注入デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てのペン型注入デバイスは、デバイス内のリザーバーに保持される医薬組成物で事前に満たされる。リザーバーの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
ＤＩＰＧの処置では、血液脳関門を克服する必要があり得る。ある特定の実施形態では、血液脳関門は、当技術分野、例えばＰａｒｏｄｉら ２０１９年，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １１：２４５で開示される１つまたはそれ以上の手法を使用することにより克服される。
有利には、上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を合わせるのに好適な単位用量で剤形へと調製される。単位用量のそのような剤形としては、例えば、錠剤、ピル剤、カプセル剤、注射（アンプル）、坐薬等が挙げられる。含有される抗体の量は、通常、単位用量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり；特に、注射の形態では、抗体が約５～約３００ｍｇで含有されるのが好ましく、他の剤形では約１０～約３００ｍｇで含有される。
抗体の治療使用
本発明の抗体は、ＡＣＶＲ１と関連する疾患または障害もしくは状態の処置、および／もしくは予防のため、ならびに／またはそのような疾患、障害もしくは状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和するために有用である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＡＣＶＲ１または変異ＡＣＶＲタンパク質と関連する疾患もしくは障害もしくは状態を有する患者に治療用量で投与される。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、異所性骨化、異所的骨化、骨異形成症、貧血、およびびまん性橋膠腫からなる群から選択される、ＡＣＶＲ１関連またはＡＣＶＲ１変異タンパク質関連疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状もしくは兆候を処置するかまたは予防するために有用である。
１つまたはそれ以上の本発明の抗体を、ＡＣＶＲ１関連疾患または障害を患うリスクのある対象に予防的に使用することも本明細書で考えられる。
本発明の一実施形態では、本抗体は、本明細書に開示される疾患、障害または状態を患う患者を処置するための医薬組成物または医薬の調製のために使用される。本発明の別の実施形態では、本抗体は、本明細書に開示される疾患、障害または状態を処置または緩和するために有用な当業者に公知の任意の他の薬剤または任意の他の治療による補助治療として使用される。
併用療法
併用療法は、本発明の抗体および本発明の抗体と、または本発明の抗体の生物学的に活性な断片と有利に組み合わされる任意のさらなる治療剤を含み得る。本発明の抗体は、ＡＣＶＲ１関連またはＡＣＶＲ１変異タンパク質関連疾患または障害を処置するために使用される１つまたはそれ以上の薬物または治療と相乗的に組み合わされる。一部の実施形態では、本発明の抗体は、第２の治療剤と組み合わされ、前記疾患または状態の１つまたはそれ以上の症状を緩和する。
疾患、障害または状態に応じて、本発明の抗体は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて使用される。
抗ＡＣＶＲ１抗体と組み合わせて投与される異所的骨化のさらなる治療薬の例としては、限定はされないが、抗アクチビンＡ阻害剤またはその抗原結合断片、および抗ＡＣＶＲ２抗体またはその抗原結合断片、抗炎症薬、ステロイド、ビスホスホネート、筋弛緩剤、およびレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）ガンマアゴニストが挙げられる。
アクチビンは、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属し、細胞増殖、分化、代謝、恒常性、およびアポトーシス、ならびに免疫応答および組織修復に広範な生物学的効果を及ぼす。アクチビンＡは、Ｉ型（Ａｃｔ ＲＩ－ＡおよびＡｃｔ ＲＩ－Ｂ）およびＩＩ型（Ａｃｔ ＲＩＩ－ＡおよびＡｃｔ ＲＩＩ－Ｂ）セリン－スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体に結合し、活性化するジスルフィド結合ホモ二量体（２つのベータＡ鎖）である。アクチビンＡは、ＡＣＶＲ１タンパク質またはＡＣＶＲ１変異タンパク質に対するリガンドとして作用し得る。
抗炎症薬の例としては、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、インフリキシマブ、およびエタネルセプトが挙げられる。ステロイドの例としては、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾンが挙げられる。ビスホスホネートの例としては、アレンドロン酸、シマドロン酸、クロドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、ミノドロン酸、ネリドロン酸、オルパドロン酸、パミドロン酸、ピリドロン酸、リセドロン酸、チルドロン酸、およびゾレドロン酸が挙げられる。筋弛緩剤の例としては、シクロベンザプリン、メタキサロンおよびバクロフェンが挙げられる。レチノイン酸受容体ガンマアゴニストの例としては、パロバロテンが挙げられる。貧血のさらなる治療薬の例としては、組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）および鉄サプリメントが挙げられる。びまん性橋膠腫のさらなる治療処置の例としては、放射線治療、または実験化学療法が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「と組み合わせて」は、さらなる治療活性成分（複数可）が、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体の投与の前に、同時に、または後に投与されることを意味する。用語「と組み合わせて」は、抗ＡＣＶＲ１抗体および第２の治療剤の逐次または同時投与も含む。
さらなる治療活性成分（複数可）が、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体の投与の前に対象に投与される。例えば、第１の成分は、第１の成分が第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、または３０分以下前に投与される場合、第２の成分の「前に」投与されると考えられる。他の実施形態では、さらなる治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体の投与後に対象に投与される。例えば、第１の成分は、第１の成分が第２の成分の投与の３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後またはそれ以上後に投与される場合、第２の成分の「後に」投与されると考えられる。さらに他の実施形態では、さらなる治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体の投与と同時に対象に投与される。本発明の目的のための「同時」投与は、互いに約３０分またはそれ以下以内に対象に投与される単回剤形、または別々の剤形で、例えば抗ＡＣＶＲ１抗体およびさらなる治療活性成分の対象への投与を含む。別々の剤形で投与される場合、各剤形は同じ経路を介して投与される（例えば、抗ＡＣＶＲ１抗体とさらなる治療活性成分の両方が静脈内に投与される等）；あるいは、各剤形は異なる経路を介して投与される（例えば、抗ＡＣＶＲ１抗体は静脈内に投与され、さらなる治療活性成分は経口投与される）。任意のイベントでは、同じ経路による、単一剤形、別々の剤形、または異なる経路による別々の剤形中で成分を投与することは全て、本開示の目的のための「同時投与」と考えられる。本開示の目的のため、さらなる治療活性成分の投与「前」、「と同時」、または「後」の抗ＡＣＶＲ１抗体の投与は、さらなる治療活性成分「と組み合わせた」抗ＡＣＶＲ１抗体の投与を考えられる。
本発明は、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体が、本明細書の他に記載されるように１つまたはそれ以上のさらなる治療活性成分（複数可）と共に配合される医薬組成物を含む。
抗体の診断使用
本発明の抗体は、例えば診断目的のため、サンプル中のＡＣＶＲ１タンパク質を検出および／または測定するために使用される。一部の実施形態は、ＡＣＶＲ１関連またはＡＣＶＲ１変異タンパク質関連疾患もしくは障害を検出する、アッセイでの本発明の１つまたはそれ以上の抗体の使用を考える。ＡＣＶＲ１の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体と接触させる工程を含み、抗ＡＣＶＲ１抗体は検出可能な標識もしくはレポーター分子によって標識されるか、または患者サンプルからＡＣＶＲ１を選択的に単離する捕捉リガンドとして使用される。あるいは、非標識抗ＡＣＶＲ１抗体は、それ自体検出可能に標識される第２の抗体と組み合わせて診断用途で使用される。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉのような放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンのような蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼのような酵素であり得る。サンプル中のＡＣＶＲ１を検出または測定するために使用される特定の例示的なアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む。
本発明によるＡＣＶＲ１診断アッセイで使用されるサンプルは、正常または病理学的状態下で、検出可能な量のＡＣＶＲ１タンパク質またはその断片のいずれかを含有する、患者から得られる任意の組織または液体サンプルを含む。通常、健康な患者（例えばＡＣＶＲ１と関連する疾患で苦しんでいない患者）から得られる特定のサンプル中のＡＣＶＲ１タンパク質のレベルは、ＡＣＶＲ１のベースラインレベルまたは標準レベルを最初に確立するために測定される。ＡＣＶＲ１のこのベースラインレベルは、ＡＣＶＲ１関連状態、またはそのような状態と関連する症状を有すると考えられる個体から得られたサンプル中で測定されたＡＣＶＲ１のレベルに対して比較される。
ＡＣＶＲ１タンパク質に特異的な抗体は、さらなる標識または部分を含有しなくてもよく、Ｎ末端またはＣ末端標識もしくは部分を含有してもよい。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（ある場合）の位置は、ペプチドが結合される表面に対してペプチドの方向を決定することができる。例えば、表面がアビジンによってコートされる場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面より遠位にあるように方向づけられるであろう。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように述べられ、本発明者らが彼らの発明とみなす範囲を限定することを意図しない。使用する数（例えば量、温度等）に関して正確性を確実にする努力がなされてきたが、一部の実験誤差および偏差は説明されるはずである。他に示さない限り、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
アクチビンＡ受容体１型（ＡＣＶＲ１）に対するヒト抗体の生成
ＡＣＶＲ１タンパク質に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスで生成した。マウスは、ヒトＡＣＶＲ１タンパク質の細胞外ドメイン（例えば配列番号３３９）を含む免疫源によって免疫した。
抗体免疫応答は、ＡＣＶＲ１特異的免疫測定法によってモニターした。所望の免疫応答に達した場合、脾臓細胞を回収し、マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存能を保存し、ハイブリドーマ細胞系を形成した。ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択し、ＡＣＶＲ１特異的抗体を産生する細胞系を同定した。細胞系を使用して、いくつかの抗ＡＣＶＲ１キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを持つ抗体）を得た。
抗ＡＣＶＲ１抗体は、その全体を参照によって本明細書に特に組み入れる米国特許第７５８２２９８号に記載されるように、骨髄腫細胞に融合せずに抗原陽性マウスＢ細胞からも直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＡＣＶＲ１抗体（すなわちヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを持つ抗体）を得た。
上記に開示されたように生成された例示的な抗体は、ｍＡｂ２７３９６、ｍＡｂ２７２４１、ｍＡｂ２７２４２、ｍＡｂ２７２４３、ｍＡｂ２７２４５、ｍＡｂ２７２４７、ｍＡｂ２７４０４、ｍＡｂ２７４０５、ｍＡｂ２７４００、ｍＡｂ２２１２４、ｍＡｂ２２１２５、ｍＡｂ２２１６８、ｍＡｂ２９２２６、ｍＡｂ２９２３７、ｍＡｂ２９２５６、ｍＡｂ２９２５７、ｍＡｂ２９２６１、ｍＡｂ２９２６６、ｍＡｂ２２１１５と命名した。
実施例の方法に従って生成した例示的な抗体の生物学的特性は、以下に記載した実施例に詳細に記載される。
重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸およびヌクレオチド配列
表１は、本発明の選択した抗ＡＣＶＲ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。
Figure 2023519100000001
相当する核酸配列識別子を表２に記載する。
Figure 2023519100000002
本明細書で参照する抗体は、典型的には完全ヒト可変領域を有するが、ヒトまたはマウス定常領域を有し得る。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換されるが（例えばマウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体がヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換される等）、いずれにしても、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）－表１または表２に示す数字で表した識別子によって示される－は同じままであり、抗原への結合特性はＦｃドメインの性質にかかわらず同一または実質的に類似であると予想される。ある特定の実施形態では、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する選択された抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗体へと変換される。一実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、米国特許出願公開第２０１００３３１５２７号に開示されるように、２つまたはそれ以上のアミノ酸変化を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃは、ヒンジ領域にセリンからプロリンへの変異（Ｓ１０８Ｐ）を含み、二量体安定化を促進する。他に示さない限り、以下の実施例で使用した全ての抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを含む。
表３は、本発明の選択した抗ＡＣＶＲ１抗体の重鎖および軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）の核酸（ＤＮＡ）およびアミノ酸（ＰＥＰ）配列識別子を記載する。
Figure 2023519100000003
表面プラズモン共鳴によって決定されたＡＣＶＲ１に結合する抗体
実験手順
精製した抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体に結合するＡＣＶＲ１の平衡解離定数（ＫＤ）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅ）、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００を使用して決定した。全ての結合研究は、２５℃および３７℃での、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）ランニング緩衝液中で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサー表面は、まずモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ，＃ＢＲ－１００８－３９またはＲＥＧＮ２５６７）とのアミンカップリングにより誘導体化し、抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体を捕捉した。異なる濃度のＡＣＶＲ１試薬、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを有して発現されたヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（ｈＡＣＶＲ１－ＭＭＨ；配列番号３３８）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを有して発現されたマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（ｍＡＣＶＲ１－ＭＭＨ；配列番号３４０）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグを有して発現されたヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（ｈＡＣＶＲ１－ｍＦｃ；配列番号３３９）は、まずＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で調製した（９００ｎＭ－３．７ｎＭ；３倍まで段階希釈した）。ＡＣＶＲ１試薬は、次いで、３０μＬ／分の流速で２．５～３分間、抗ヒトＦｃ捕捉抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体表面に注入したが、モノクローナル抗体結合ＡＣＶＲ１試薬の解離は、ＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中で１０～１５分間モニターした。動態結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを使用して１：１結合モデルにリアルタイムセンサーグラムをフィッティングすることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）は、
Figure 2023519100000004
 として動態速度定数から算出した。
結果
２５℃および３７℃での本発明の抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体への異なるＡＣＶＲ１試薬の結合動態パラメーターを表４から表９に示す。
Figure 2023519100000005
Figure 2023519100000006
Figure 2023519100000007
Figure 2023519100000008
Figure 2023519100000009
Figure 2023519100000010
２５℃では、ｈＡＣＶＲ１－ＭＭＨに結合する抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体は、表４に示したように１．５６ｎＭ～１．９７μＭの範囲のＫＤ値を有した。３７℃では、ｈＡＣＶＲ１－ＭＭＨに結合する抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体は、表５に示したように５．７７ｎＭ～４３８ｎＭの範囲のＫＤ値を有した。
２５℃では、ｈＡＣＶＲ１－ｍＦｃに結合する抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体は、表６に示したように０．２０ｎＭ～５５．４ｎＭの範囲のＫＤ値を有した。３７℃では、ｈＡＣＶＲ１－ｍＦｃに結合する抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体は、表７に示したように０．６７ｎＭ～１４５ｎＭの範囲のＫＤ値を有した。
２５℃では、ｍＡＣＶＲ１－ＭＭＨに結合する抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体は、表８に示したように１７１ｎＭ～２．１３μＭの範囲のＫＤ値を有した。３７℃では、１つのみの抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体が、表９に示したように５０４ｎＭのＫＤ値でｍＡＣＶＲ１－ＭＭＨに結合した。
異なる抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体間の交差競合
実験手順
抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体のパネル内の結合競合は、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）でリアルタイム、無標識バイオレイヤー干渉法を使用して決定した。実験全体は、１０００ｒｐｍの速さでプレートを震盪しながら、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）緩衝液中、２５℃で実施した。２つの抗体が、それらのそれぞれのエピトープに結合するために互いと競合できるかどうか評価するため、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを有して発現されたヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（ｈＡＣＶＲ１－ＭＭＨ；配列番号３３８）は、４０秒間、１０μｇ／ｍＬ ｈＡＣＶＲ１－ＭＭＨを含有するウェルにバイオセンサーチップを沈めることにより、抗Ｈｉｓ抗体コートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，＃１８－５０７９）を浸けることによりまず捕捉した。抗原捕捉バイオセンサーチップは、次いで、４分間、ｍＡｂ－１の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルに浸けることにより、第１の抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ－１と呼ばれる）によって飽和した。バイオセンサーチップは、次いで、３分間、第２の抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ－２と呼ばれる）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルに浸けた。バイオセンサーチップは、実験の全てのステップ間にＨＢＳ－ＥＢＴ緩衝液中で洗浄した。リアルタイム結合応答は、実験の全期間にわたりモニターし、全てのステップの終わりに結合応答を記録した。ｍＡｂ－１と複合体を形成したｈＡＣＶＲ１－ＭＭＨへのｍＡｂ－２結合の応答を比較し、異なる抗ＡＣＶＲ１モノクローナル抗体の競合／非競合挙動は表１０に示すように決定した。
結果
Figure 2023519100000011
Figure 2023519100000012
表１０は、選択した抗ＡＣＶＲ１抗体間の交差競合を示す。
ＨＥＫ２９３／ｈＡＣＶＲ１－ｗｔとＨＥＫ２９３／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ細胞でのフローサイトメトリーによる細胞結合
抗ｈＡＣＶＲ１抗体による細胞結合を評価するため、２つの細胞系を生成し、ホタルルシフェラーゼレポーターに融合したＢＭＰ－応答エレメント（ＢＲＥ－Ｌｕｃ）と共に、ＨＥＫ２９３細胞において全長ｈＡＣＶＲ１を安定に過剰発現させた。１つの細胞系はｈＡＣＶＲ１の野生型バージョン（受託番号Ｑ０４７７１のアミノ酸１～５０９）を含有し、ＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－野生型と名付けられた。以降、ＨＥＫ２９３／ｈＡＣＶＲ１－ｗｔと呼ばれる。他の系はｈＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を含有した。この細胞系の単一クローンが単離され、生じる細胞系はＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ－クローンＨ２と名付けられた。以降、ＨＥＫ２９３／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈと呼ばれる。
細胞表面で発現される受容体への本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体の結合を評価するため、６６．６ｎＭまたは７０ｎＭのいずれかの抗体を、２％ ＦＢＳを含有するＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）中で３０分間４℃にて０．５×１０６個の細胞／ウェルとインキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、細胞を３．２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，抗ヒト＃１０９－６０７－００３）によって４℃で２５または３０分間染色した。細胞は、ＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃５５４６５５）を使用して固定し、Ｈｙｐｅｒｃｙｔ（登録商標）またはＩＱｕｅ（登録商標）のいずれかのフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標））で解析した。未染色および二次抗体のみの対照も全ての細胞系について試験した。結果は、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して解析し、生存細胞の蛍光の幾何平均を決定し、結合比は、相当する未染色細胞の幾何平均値によって試験条件の幾何平均値を正規化することによって算出した。
Figure 2023519100000013
表１１に示すように、２０個の本発明の抗ｈＡＣＶＲ１抗体のうち４個が、４～１８３倍の範囲の結合比でのＨＥＫ２９３／ｈＡＣＶＲ１－ｗｔ細胞への結合を示した。本発明の２０個全ての抗ｈＡＣＶＲ１抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ細胞への結合を試験し、それらは、２～１９００倍の範囲の結合比での細胞への結合を示した。本発明の抗ｈＡＣＶＲ１抗体は、１～２６倍の結合比で、ＨＥＫ２９３親細胞への結合を実証した。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独サンプルは、１～３倍の範囲の結合比を実証した。
ｈＢＭＰ７またはｈアクチビンＡによって活性化された、ＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ－クローンＨ２細胞による細胞ベースのバイオアッセイでのＡＣＶＲ１の機能阻害
アクチビンＡ受容体Ｉ型、ＡＣＶＲ１（ＡｃｔＲＩ、ＡＣＶＲ１Ａ、またはＡｌｋ２としても公知）は、１回膜貫通受容体であり、ＴＧＦ－β受容体スーパーファミリーのＩ型ＢＭＰ受容体のメンバーである。リガンドが結合すると、ＡＣＶＲ１はＩＩ型受容体と共に下流のシグナル伝達カスケードを開始し、受容体特異的Ｒ－ＳＭＡＤタンパク質（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、またはＳＭＡＤ８）の活性化をもたらし、ＳＭＡＤ、ＳＭＡＤ４と共同して、遺伝子の転写制御をもたらす（Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ，ＴＧＦ－ｂｅｔａ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８年．６７：７５３～９１頁，ＰＭＩＤ：９７５９５０３；Ｍａｓｓａｇｕｅら Ｓｍａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００５年 １９：２７８３～２８１０頁，ＰＭＩＤ：１６３２２５５５）。ＦＯＰにおいて見出される変異である（Ｓｈｏｒｅら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００６年５月；３８（５）：５２５～７頁．Ｅｐｕｂ ２００６年４月２３日 ＰＭＩＤ： １６６４２０１７）、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）の抗ＡＣＶＲ１抗体阻害を評価するため、ＨＥＫ２９３細胞でのバイオアッセイを確立した（ヒト胚腎臓、ＡＴＣＣ）。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＣＶＲ１、必要なＩＩ型受容体、ＳＭＡＤタンパク質、および機能的ＢＭＰシグナル伝達経路を形成する他の成分を内在的に発現する。ＡＣＶＲ１を通したシグナル伝達を駆動するため、細胞系は、ホタルルシフェラーゼ受容体に融合したＢＭＰ－応答エレメント（ＢＲＥ－ｌｕｃ）と共に全長ヒトＡＣＶＲ１（受託番号Ｑ０４７７１のアミノ酸１～５０９、Ｒ２０６Ｈ）を安定に過剰発現するように生成された。細胞系の単一クローンを単離し、生じる細胞系はＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ－クローンＨ２と名付けた。以降、ＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈと呼ぶ。
バイオアッセイのため、ＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ細胞を、９６ウェルプレートにアッセイ緩衝液（ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）中１０，０００個の細胞／ウェルでプレートし、５％ＣＯ２下、３７℃で５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、アッセイ緩衝液中で３００ｎＭ～７３．２ｐＭまたは１７３．３ｎＭ～４２．３ｐＭのいずれかに段階希釈した抗ＡＣＶＲ１抗体またはアイソタイプ対照抗体（＋試験分子を含まず緩衝液のみを含有するサンプル）を細胞に添加し、３０分間２５℃でインキュベートした。３０分後、３ｎＭヒトアクチビンＡ（ｈアクチビンＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ３３８－ＡＣ）、２ｎＭヒト骨形成タンパク質７（ｈＢＭＰ７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ３５４－ＢＰ／Ｃ）または３ｎＭ ｈＢＭＰ７のいずれかを細胞に添加した。リガンドによる用量依存的活性化を得るため、ｈアクチビンＡまたはｈＢＭＰ７をアッセイ緩衝液中で２００ｎＭ～３．４ｐＭまたは１００ｎＭ～１．７ｐＭのいずれかに段階希釈し（＋試験分子を含まず緩衝液のみを含有するサンプル）、抗体によって処置していない細胞に添加した。５％ＣＯ２下、３７℃で終夜インキュベーション後、ルシフェラーゼ活性をＯｎｅＧｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６０３１）およびＶｉｃｔｏｒＸまたはＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって測定した。結果は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）による非線形回帰（４パラメーターロジスティックス）を使用して解析し、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を得た。阻害のパーセンテージは、以下の等式を使用することによりＲＬＵ値によって算出した：
Figure 2023519100000014
 この等式では、「ＲＬＵベースライン」は、抗体を含まない一定量のリガンド（ｈアクチビンＡまたはｈＢＭＰ７）で処置した細胞からの発光値であり、「ＲＬＵ阻害」は、特定の濃度のリガンドと特定の抗体の最大濃度による発光値であり、「ＲＬＵバックグラウンド」はいずれのリガンドまたは抗体も含まない細胞からの発光値である。
本発明の２０個の抗ヒトＡＣＶＲ１抗体は、ＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ細胞の活性化を阻害するそれらの能力について試験した。結果は表１２に示す。
Figure 2023519100000015
表１２に示すように、本発明の抗体のうち１０個は、５８０ｐＭ～２．０ｎＭの範囲の阻害抗体のＩＣ５０値で、２ｎＭ ｈＢＭＰ７の少なくとも９０％阻害を示した。本発明の抗体のうち５個は、１４０ｐＭ～＞１００ｎＭの範囲の阻害抗体のＩＣ５０値で、３ｎＭ ｈアクチビンＡ、２ｎＭまたは３ｎＭ ｈＢＭＰ７のいずれかの４６％と７８％の間の阻害を示した。本発明の５個の抗体は、試験したいずれのリガンドの阻害も示さなかった。アイソタイプ対照抗体は、ｈアクチビンＡまたはｈＢＭＰ７のいずれかによって活性化されるＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ細胞の任意の測定可能な阻害を実証しなかった。リガンドは、ｈＢＭＰ７では２９７ｐＭまたは１．２２ｎＭ、およびｈアクチビンＡでは３３３ｐＭのＥＣ５０値で、ＨＥＫ２９３／ＢＲＥ－ｌｕｃ／ｈＡＣＶＲ１－Ｒ２０６Ｈ細胞を活性化した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＡＣＶＲ１抗体試験；ヘプシジンおよび鉄レベルについてＡｃｖｒ１ｈｕ／ｈｕマウスの血清解析
ヘプシジンおよび鉄レベルは、抗ＡＣＶＲ１抗体、ｍＡｂ２７２４２；ｍＡｂ２７２４３；ｍＡｂ２７２４７；およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）による処置後にＡｃｖｒ１ｈｕ／ｈｕマウスで試験した。
ＡＣＶＲ１のＢＭＰ６媒介活性化は、ヘプシジンをコードする遺伝子であるＨａｍｐの転写を直接活性化する。ヘプシジンは、鉄排出輸送体として唯一公知のフェロポーチン（ｓｌｃ４０ａｌ）の内部移行を引き起こすことによる、鉄レベルの負の制御因子である。ＢＭＰ６－ＡＣＶＲ１シグナル伝達カスケードの阻害は、Ｈａｍｐ転写の減少をもたらし、ヘプシジンの循環レベルの減少を生じる。循環するヘプシジンの減少は、フェロポーチンレベルの増加をもたらし、小腸からの鉄の取り込みの増加を可能にし、それにより循環する鉄レベルが増加する。
したがって、血清ヘプシジンおよび鉄への本発明の抗ＡＣＶＲ1抗体の効果を決定するため、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施した。実験のため、マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウス（Ａｃｖｒ１ｈｕ／ｈｕマウスと呼ばれる）を利用した。４２匹の雌のＡｃｖｒ１ｈｕ／ｈｕマウス（１２～１５週齢）は、実験の１日目と５日目に、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照、ｍＡｂ２７２４２、ｍＡｂ２７２４３またはｍＡｂ２７２４７のいずれかを投与された。マウスは８日目の血清回収のために屠殺された。血清は、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ－Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃ＨＭＣ－００１）を使用してヘプシジンタンパク質レベルを、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ Ｉｒｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＤＩＦＥ－２５０）を使用して鉄レベルを解析した。結果は、表１３に示す。
Figure 2023519100000016
表１３に示すように、本発明のＡＣＶＲ１抗体、ｍＡｂ２７２４２およびｍＡｂ２７２４３は、Ａｃｖｒ１ｈｕ／ｈｕマウスの血清ヘプシジンレベルを減少させ、血清鉄レベルを増加させたが、ｍＡｂ２７２４７は、Ａｃｖｒ１ｈｕ／ｈｕマウスの血清ヘプシジンレベルまたは血清鉄レベルに効果を示さなかった。これは、ｍＡｂ２７２４２およびｍＡｂ２７２４３が、野生型ＡＣＶＲ１シグナル伝達を阻害できることを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＡＣＶＲ１抗体試験；外傷後異所性骨化モデル
本研究は、マウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおける、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体、ｍＡｂ２７２４２および抗アクチビンＡ抗体の効果を評価した。
異所性骨化（ＨＯ）、軟組織における異所性化骨の形成は、２つの主な形態で生じる：外傷後ＨＯ（ｔＨＯ）は、典型的には、筋骨格または神経原性損傷を経験した、およびＡＣＶＲ１受容体のＲ２０６Ｈとして公知の特定の点変異の下流で進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を遺伝的に駆動した患者で見出される。両疾患は、異所性化骨の形成において内軟骨性骨化のプロセスを受ける。
ＨＯの原則的な管理は、再発によって複雑化されることが多い外科的切除のままであり、ＦＯＰにおいてほぼ普遍的にそうである。外傷後ＨＯとＨＯのＦＯＰバラエティーの両方が、内軟骨性骨化を誘発する炎症の異常を反映することが実証されたが、この収束プログラミングの先行するシグナルは、既存の文献内とは異なるようである。両バラエティーでは、病理は、Ａｌｋ２／ＡＣＶＲ１、Ａｌｋ３／ＢＭＰＲ１Ａ、Ａｌｋ４／ＡＣＶＲ１Ｂ、Ａｌｋ５／ＴＧＦＢＲＩ、Ａｌｋ６／ＢＭＰＲ１ＢおよびＡｌｋ７／ＡＣＶＲ１Ｃを含む、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのリガンドに感受性の受容体の特定のサブセットからのシグナル伝達によるようである。
アクチビンＡはＦＯＰ線維芽細胞に見出される。ＦＯＰの検証したマウスモデルにおけるアクチビンＡの移行は、その後の病変のほぼ根絶を実証した。ＦＯＰのマウスモデル（Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］）の筋肉損傷は、アクチビンＡブロッキング抗体を使用して完全に抑制されるＨＯを生じる（Ｈａｔｓｅｌｌら Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５年９月２日；７（３０３）：３０３ｒａ１３７）。抗アクチビンＡ中和抗体であるＲＥＧＮ２４７７を介してアクチビンＡの薬理学的阻害によるＦＯＰ ＨＯの実効減衰量も実証された（Ｕｐａｄｈｙａｙら、２０１７年，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ３２（１２）：２４８９～２４９９頁）。
しかしながら、近年の文献はｔＨＯとＦＯＰの間の対比、主にＦＯＰ病変の背後にある主な駆動力としてアクチビンＡによるネット機能獲得および新規の活性化を与えるＡＣＶＲ1遺伝子を同定した。
本実験は、マウスのｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおける、本発明の抗ＡＣＶＲ１抗体および抗アクチビンＡ抗体の効果を評価した。特に、外傷後異所性骨化は、抗ＡＣＶＲ１抗体であるｍＡｂ２７２４２による処置後のマウスにおいて、ｍｉｃｒｏＣＴ解析によって測定した。
マウスの組換えタンパク質および抗体投与
ヒトＡｃｖｒ１抗体（本発明によるｍＡｂ２７２４２）およびヒトアクチビンＡに対して生成した中和抗体（米国特許出願公開第２０１５００３７３３９号）を用いた。ＡＬＫ３－Ｆｃも外傷後ＨＯ形成で用いられ、いくつかの骨原性ＢＭＰを阻害する阻害的影響の可能性を調べた。Ａｌｋ３－Ｆｃは研究室内で、ＣＨＯ細胞で生成され、精製された。Ａｌｋ３の細胞外ドメインからなるＡｌｋ３－Ｆｃ（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ＃Ｐ２７０３７ Ｑ２４～Ｒ１５２）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（Ｄ１０４～Ｋ３３０）に結合された。
処置研究のため、マウスを群にわたり同齢に分け、処置は損傷と同日に開始した。マウス（ｎ＝１５／群）は、２５ｍｇ／ｋｇのアクチビンＡブロッキング抗体、またはアイソタイプ対照抗体を毎週皮下に注射された（ｓ．ｃ．）。第２の実験では、マウス（ｎ＝１２／群）は、１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｖｒ１ブロッキング抗体、Ａｌｋ３－Ｆｃまたはアイソタイプ対照抗体をｓ．ｃ．注射された。ＨＯ形成は、少なくとも１３週間の期間にわたりｉｎ ｖｉｖｏ ｍｉｃｒｏＣＴ画像によってモニターした。
火傷／腱切除損傷モデル
異所性骨を評価したマウスは、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。簡潔に言うと、ＷＴマウスは、５日間４０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．でタモキシフェンを注射され、モデルを開始した。全てのマウスは、４８時間０．０６ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンからなる術前の鎮痛処置、続いて吸入式イソフルレンによる麻酔、および鎮痛剤投与による緊密な術後モニタリングを受けた。マウスは、毛を剃った背側に、総体表面積の３０％に部分的な厚みの火傷を負わせ、次いで左アキレス腱を切断した。背面の火傷は、水浴中で６０℃に加熱した金属ブロックを使用して、１８秒間連続して背側に当てて誘導した。ＨＯ原基は、９週間までｍｉｃｒｏＣＴによって見ることができる成熟骨形成により、３週間まで観察した。
結果
Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体またはＡｌｋ３－Ｆｃは、マウスの外傷後ＨＯモデルにおいてＨＯを減少させた；しかし、アクチビンＡの阻害は、ＨＯ形成を変えなかった。
マウスは、ｔＨＯモデルにおける損傷の誘導と同時に開始して、アイソタイプ対照（ｎ＝１２）または抗ＡＣＶＲ（ｎ＝１２）抗体またはＡｌｋ３－Ｆｃ（ｎ＝１２）のいずれかを投与された。図１Ａ～Ｃは、損傷の誘導と同時に開始して、アイソタイプ対照抗体（円、ｎ＝１２）、ＡＬＫ３－Ｆｃ（四角、ｎ＝１２）またはＡｃｖｔ１抗体（三角、ｎ＝１２）（ｍＡｂ２７２４２）のいずれかを投与されたマウスのｍｉｃｒｏＣＴ解析の結果を示す。総ＨＯ（図１Ａ）、接着ＨＯ（図１Ｂ）、および非接着ＨＯ（図１Ｃ）容積は、損傷の３、６、９および１３週間後のｍｉｃｒｏＣＴ解析によって測定した。
火傷／腱切除損傷を誘導した野生型マウスにおいて、ブロッキング抗体を使用するＡＣＶＲ１の阻害は、４０％までＨＯ形成を減少させ（１３週間で総ＨＯ ３．９２ｍｍ３対２．４ｍｍ３）、ＨＯ形成および増殖の要因である少なくとも一部のＢＭＰシグナルがＡＣＶＲ１を通して伝達されたことを実証した。（図１Ａ～Ｃ）。Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体は、外科手術の９週間後にアイソタイプ対照と比較して総ＨＯ（図１Ａ）および接着ＨＯ（図１Ｂ）を著しく減少させた（ｐ＜０．０５）。Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体は、外科手術の１３週間後にアイソタイプ対照と比較して非接着ＨＯ（図１Ｃ）を著しく減少させた（ｐ＜０．０１）。
火傷／腱切除損傷を誘導した野生型マウスにおいて、ＡＬＫ３－Ｆｃは６０％までＨＯを減少させたが、完全には阻害せず（１３週間で総ＨＯ ３．９２ｍｍ３対１．６３ｍｍ３）、先に公開されたデータと一致した（Ａｇａｒｗａｌら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７年８月２日；２５（８）：１９７４～８７頁）（図１Ａ）。Ａｌｋ３－Ｆｃは、外科手術の６週間後にアイソタイプ対照と比較して総ＨＯ（図１Ａ）および接着ＨＯ（図１Ｂ）を著しく減少させた（ｐ＜０．０５）。Ａｌｋ３－Ｆｃは、外科手術の１３週間後にアイソタイプ対照と比較して非接着ＨＯ（図１Ｃ）も著しく減少させた（ｐ＜０．０００１）。
総ＨＯ容積、接着ＨＯ（白い破線によって囲まれる）または非接着ＨＯ（白い１点鎖線によって囲まれる）によって測定したＷＴマウスの損傷した後肢のＨＯ容積の画像を、図２Ａ～Ｃに示す。ｍｉｃｒｏＣＴによるＨＯ容積は、アイソタイプ対照（図２Ａ）と比較してＡＬＫ３－Ｆｃ（図２Ｂ）とＡｃｖｒ１抗体（図２Ｃ）で処置したマウスの両方において１３週間後に著しく減少した。総ＨＯ容積および接着ＨＯ容積は、それぞれＡｌｋ３－ＦｃおよびＡｃｖｒ１抗体処置群で、損傷の６または９週間後に著しく減少した。
さらに、ＷＴマウスは、火傷／腱切除損傷モデルにおいて、損傷の誘導と同時に開始して、アクチビンＡ（ｎ＝１５）抗体またはアイソタイプ対照（ｎ＝１５）のいずれかを投与された。ＨＯ容積は、損傷の９週間後にｍｉｃｒｏＣＴ解析によって測定した。総容積、接着ＨＯ容積、または非接着ＨＯ容積によって測定した損傷した後肢におけるＨＯ容積は、処置群間で著しく異ならなかった。アクチビンＡ阻害は、ＨＯ形成または増殖を減少させなかった。浮遊および骨結合ＨＯのさらなる層別化も、アクチビンＡ処置動物とビヒクル対照処置動物間で差異を実証しなかった（データは示さない）。
この例は、Ａｃｖｒ１ブロッキング抗体が、ｉｎ ｖｉｖｏ外傷後ＨＯモデルにおいてＨＯを著しく減少させたが、しかし、抗アクチビンＡ抗体の顕著な効果は観察されなかったことを示す。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付の請求項の範囲内にあること意図する。

Claims (38)

  1. アクチビンＡ受容体１型（ＡＣＶＲ１）タンパク質および／またはその変異体に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、ＡＣＶＲ１の細胞外ドメイン（配列番号３４１のアミノ酸２１～１２３）内に含有される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用し、全長ＡＣＶＲ１タンパク質および／またはその変異体を発現する細胞に結合する、前記単離抗体またはその抗原結合断片。
  2. 全長ＡＣＶＲ１タンパク質またはその変異体は、全長ヒトＡＣＶＲタンパク質またはその変異体である、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
  3. 全長ヒトＡＣＶＲ１タンパク質は、配列番号３４１のアミノ酸２１～５０９を含む、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
  4. 変異ＡＣＶＲ１タンパク質は、配列番号３４１のＡＣＶＲ１ Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、およびＲ３７５Ｐからなる群から選択される変異を含む、請求項１または２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
  5. ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）タンパク質に結合し、ＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）媒介骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害する、請求項４に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
  6. ＡＣＶＲ１タンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ｉ）ヒトＡＣＶＲ１を発現する細胞に結合する；および／または
    （ｉｉ）ＡＣＶＲ１に結合し、ＡＣＶＲ１媒介骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害する、
    前記単離抗体またはその抗原結合断片。
  7. 抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 抗体は：
    （ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；
    （ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、６０ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、もしくは０．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、２５℃でＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３９）に結合する；
    （ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、１５０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、３７℃でｍＦｃに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（配列番号３３９）に結合する；
    （ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、３００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、もしくは２ｎＭ未満のＫＤで、２５℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する；
    （ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、５００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満のＫＤで、３７℃でｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したヒトＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３３８）に結合する；
    （ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、５００ｎＭより高いＫＤで、２５℃でマウスＡＣＶＲ１に結合しないかもしくはｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する；
    （ｇ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、５００ｎＭより高いＫＤで、３７℃でマウスＡＣＶＲ１に結合しないかもしくはｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスタグに融合したマウスＡＣＶＲ１細胞外ドメイン（例えば配列番号３４０）に結合する；
    （ｋ）ヒトＡＣＶＲ１タンパク質もしくはヒトＡＣＶＲ（Ｒ２０６Ｈ）タンパク質を発現する細胞に結合する；
    （ｌ）細胞ベースのバイオアッセイで測定した場合、２５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトアクチビンＡによってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する；
    （ｍ）細胞ベースのバイオアッセイで測定した場合、２０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＢＭＰ７によってヒトＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）を発現する細胞の活性化を阻害する；
    （ｍ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清ヘプシジンを著しく減少させる；
    （ｎ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、血清鉄レベルを著しく増加させる；ならびに／または
    （ｏ）マウス対立遺伝子の代わりにヒトＡＣＶＲ１を発現するマウスに投与される場合、野生型ＡＣＶＲ１シグナル伝達を阻害する；ならびに
    （ｐ）表１に列挙したＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび表１に列挙したＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む
    からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  9. 重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびに軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＶＲは、表１に列挙したＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
  10. 表１に列挙したＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  11. （ａ）配列番号４、２４、４４、７８、９８、１３０、１５０、１６８、１８８、２０５、２２５、２５７、および３２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
    （ｂ）配列番号６、２６、４６、８０、１００、１３２、１５２、１７０、２０７、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０３、および３２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
    （ｃ）配列番号８、２８、６０、８２、１０２、１３４、１５４、１７２、１９１、２０９、２２９、２６１、３０５、および３２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
    （ｄ）配列番号１２、３２、５０、８６、１０６、１３８、１５８、１７６、１９５、２１３、２３３、２６５、２７９、３０９、および３２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
    （ｅ）配列番号１４、３４、５２、６４、８８、１０８、１２２、１４０、１７８、２１５、２４７、２８１、３１１、および３３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
    （ｆ）配列番号１６、３６、６６、９０、１１０、１４２、１６０、１８０、１９７、２１７、２３５、２４９、２６７、２８３、３１３、および３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
    を含む、請求項９または１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  12. 配列番号２／１０、２２／３０、２２／７２、４２／４８、５８／６２、７６／８４、９６／１０４、１１６／１１９、１２８／１３６、１４８／１５６、１６６／１７４、１８６／１９３、２０３／２１１、２２３／２３１、２４１／２４５、２５５／２６３、２７３／２７７、２８９／２９３、３００／３０７、および３１９／３２７からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. （ａ）配列番号４４、４６、２８、５０、５２、および３６；ならびに
    （ｂ）配列番号２４、４６、６０、５０、６４、および６６
    からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  14. 配列番号４２／４８、および５８／６２からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. ＡＣＶＲ１に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびにＬＣＶＲ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＶＲは：
    （ｉ）配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    （ｉｉ）配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｉｖ）１２個以下のアミノ酸置換を有する、配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    ＬＣＶＲは：
    （ａ）配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｄ）１０個以下のアミノ酸置換を有する、配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  16. 配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  17. 配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  18. 配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるＨＣＶＲ内に含有される３つのＣＤＲ；ならびに配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるＬＣＶＲ内に含有される３つのＣＤＲを含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  19. 配列番号２／１０、２２／３０、２２／７２、４２／４８、５８／６２、７６／８４、９６／１０４、１１６／１１９、１２８／１３６、１４８／１５６、１６６／１７４、１８６／１９３、２０３／２１１、２２３／２３１、２４１／２４５、２５５／２６３、２７３／２７７、２８９／２９３、３００／３０７、および３１９／３２７からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
  20. （ａ）配列番号４、２４、４４、７８、９８、１３０、１５０、１６８、１８８、２０５、２２５、２５７、および３２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
    （ｂ）配列番号６、２６、４６、８０、１００、１３２、１５２、１７０、２０７、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０３、および３２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
    （ｃ）配列番号８、２８、６０、８２、１０２、１３４、１５４、１７２、１９１、２０９、２２９、２６１、３０５、および３２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
    （ｄ）配列番号１２、３２、５０、８６、１０６、１３８、１５８、１７６、１９５、２１３、２３３、２６５、２７９、３０９、および３２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
    （ｅ）配列番号１４、３４、５２、６４、８８、１０８、１２２、１４０、１７８、２１５、２４７、２８１、３１１、および３３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
    （ｆ）配列番号１６、３６、６６、９０、１１０、１４２、１６０、１８０、１９７、２１７、２３５、２４９、２６７、２８３、３１３、および３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
    を含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  21. （ａ）配列番号４４、４６、２８、５０、５２、および３６；ならびに
    （ｂ）配列番号２４、４６、６０、５０、６４、および６６
    からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項２０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  22. 配列番号４２／４８、および５８／６２からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  23. 配列番号２、２２、４２、５８、７６、９６、１１６、１２８、１４８、１６６、１８６、２０３、２２３、２４１、２５５、２７３、２８９、３００、および３１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲの３つのＣＤＲ；ならびに配列番号１０、３０、４８、６２、７２、８４、１０４、１１９、１３６、１５６、１７４、１９３、２１１、２３１、２４５、２６３、２７７、２９３、３０７、および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲの３つのＣＤＲを含む、ＡＣＶＲ媒介および／またはＡＣＶＲ１（Ｒ２０６Ｈ）媒介骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  24. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片とＡＣＶＲ１ヘの結合について競合する、抗体またはその抗原結合断片。
  25. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合断片。
  26. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のＡＣＶＲ１に結合する単離抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
  27. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子。
  28. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子。
  29. 請求項２７に記載のポリヌクレオチド配列および／または請求項２８に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  30. 請求項２９に記載のベクターを発現する宿主細胞。
  31. 抗ＡＣＶＲ１抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、該抗体または断片の産生を可能にする条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を増殖させる工程、およびそのように産生された該抗体または断片を回収する工程を含む、前記方法。
  32. 許容される担体を含む医薬組成物として、抗体またはその抗原結合断片を製剤化する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. ＡＣＶＲ１関連疾患または障害の少なくとも１つの症状または兆候を処置、予防または緩和する方法であって、請求項１～２５のいずれか１項に記載の治療有効量の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、前記方法。
  34. ＡＣＶＲ１関連疾患または障害は、異所性骨化、異所的骨化、骨異形成症、貧血、およびびまん性橋膠腫からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 医薬組成物は、それを必要とする対象に予防的または治療的に投与される、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 医薬組成物は、第２の治療剤と組み合わせて投与される。請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 第２の治療剤は、抗アクチビンＡ阻害剤、抗ＢＭＰ７抗体またはその抗原結合断片、抗ＡＣＶＲ２抗体またはその抗原結合断片、抗炎症薬、ステロイド、ビスホスホネート、筋弛緩剤、およびレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）ガンマアゴニスト、生活習慣改善、および栄養補助食品からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、または脳室内に投与される、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
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