JPH10507062A - 改善された界面活性剤耐性を有するリパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、リパーゼ活性を保持しながらも改善された界面活性剤耐性を有し、それゆえに洗剤組成物中で非常に有用であるリパーゼ変異体を提供するものである。この型の好ましいリパーゼには、界面活性剤分子の疎水性部分と酵素の界面活性剤による変性の開始サイトとの相互作用に影響する表面又は表面付近の１以上のアミノ酸置換を有する、シュードモナス・アルカリジーン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来のリパーゼの改変機能型が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 改善された界面活性剤耐性を有するリパーゼ 本発明は、リパーゼの安定性を増加させるようにリパーゼを改変する方法に関 する。特に、界面活性剤に対する改善された耐性を有し、洗剤組成物において用 いられるリパーゼに関する。 リパーゼは脂質を加水分解可能な酵素である。それらは脂肪および油のプロセ シング、洗浄目的のための洗剤組成物および診断用試薬等、幅広い範囲の用途に 於いて用いらている。 細胞外リパーゼ（トリアシルグリセロール アシルヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３ ．１．１．３）は数多くの種の微生物によって製造されている。単離された微生 物リパーゼは、例えば米国特許番号第３９５０２７７号に開示されている。これ らのリパーゼは例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｎ ｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ ｌｉｐｏｌｙｔｉ ｃａおよびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ等の多様な微生物から得られている。 多様な微生物由来のリパーゼの洗剤組成物中での利用の例は、例えばＥＰ４６ ３１００（Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、Ｅ Ｐ０２１８２７２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓ）、ＥＰ０２１４７６１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、Ｅ Ｐ０２５８０６８（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）およびＥＰ２０６３９０（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉ ｏｌｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）に提供されている。 特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのリパーゼは、既知の所望のリパーゼの用途に とって好ましい特徴を有している。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種は、それ故、リ パーゼを得るために幅広く用いられてきた。いくつかのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ のリパーゼはクローン化されており、それによって同種又は異種の宿主中でのこ れらのリパーゼの発酵収量を増加することが可能となった。リパーゼ遺伝子のク ローン化が報告されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの例としては：Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ（ＥＰ３３１３７６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ（ＥＰ４６４９２２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇ ｅｎｅｓ（ＥＰ３３４４６２）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ｅ Ｐ３１８７７５）が挙げられる。洗剤組成物の１成分としての利用のためには、 リパーゼは他の全ての成分に対して耐性であることが望ましい。例えば、Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ由来のリパーゼを、メチオニンを他の１９の自 然界で生産されうる他のアミノ酸の１つで置換することにより、洗剤組成物中の 酸化成分に対して安定化することが可能であることが示されている（ＥＰ４０７ ２２５）。 他の文書では、同じリパーゼを、洗剤組成物のプロテアーゼ成分によるタンパ ク質分解に対して安定化することが記載されている（Ｆｒｅｎｋｅｎ、Ｌ．Ｇ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６ （１９９３ ）６３７−６４２）。 他の重要な安定化の問題は、アニオン性、カチオン性もしくは非イオン性界面 活性剤分子による変性に対する酵素の感受性である。アニオン性界面活性剤分子 （例えばラウリル硫酸、ドデシル硫酸等）は、疎水性脂肪族部分と、例えばスル ホン酸基等の負に荷電した親水性部分を有する両親和性分子である。カチオン性 界面活性剤分子は、負に荷電したスルホン酸基の代わりに第４アンモニウム基等 の正に荷電した原子団を有し、非イオン性のものにおいては分子の親水性部分は 極性ではあるが荷電していないアルコール基等の原子団である。 本発明は、界面活性剤の存在下でのリパーゼの安定性の欠如の問題を解決する 。特に、一つの態様においては、本発明は、界面活性剤耐性を増加させるため、 天然のリパーゼもしくはその一部と比較して、表面またはその近傍で１以上のア ミノ酸の置換を有する天然リパーゼの改変機能型あるいはその機能性部分である 。 界面活性剤が誘導するタンパク質の変性が一般に引き起こされるひとつの機構 は、界面活性剤分子の疎水性部分が酵素の疎水性核への進入である。この過程は タンパク質の三次構造をほどくことにつながり、それによって触媒活性の不可逆 的な喪失という結果となる。 我々はリパーゼにおけるこのような過程の開始部位を、例えば対応する天然Ｄ ＮＡコード配列の部位特異的変異により生成される１または少数のアミノ酸置換 により、防御または除去可能であることを発見した。我々は、斯くして、リパー ゼの界面活性剤に対する耐性を、他の有用な性質を実質的に変化させることなく 増加させることが可能であることを発見した。 本発明の改変リパーゼは、強力な洗剤において、そのような組成物中に存在す る界面活性剤の量と強烈な活性のため、特に有用である。それらはまた自動皿洗 い用洗剤中での利用にも非常に適している。 本発明は、組換えＤＮＡ技術によって生成された変異体リパーゼを参照するこ とによってより明確に説明されるが、当業者には、本発明のリパーゼを生成する ための必要な１以上のアミノ酸修飾が化学修飾によっても達成されることは明白 である。 リパーゼではないタンパク質、特に高アルカリプロテアーゼの耐性を同様に増 加させるための成功した一つの試みが開示されている（ＤＥ４１０６５２５およ びＥＰ−Ａ−０５２５６１０）。高アルカリプロテアーゼの場合には、疎水性側 鎖を有するアミノ酸残基を極性もしくは荷電側鎖を有するアミノ酸残基で置換す ることにより、または小さい側鎖を有するアミノ酸残基をより空間を充填する側 鎖を有するアミノ酸残基で置換することにより、アニオン性界面活性剤に対する 酵素の安定性の改良につながっている。 しかしながら、このような教示を、リパーゼ等の全く異なったクラスの酵素に 移植することは不可能である。アミノ酸配列の変化の導入はしばしば、同時に活 性の変化にもつながる。さらには、原子レベルでの界面活性剤のスブチリシンお よびリパーゼに対する反応機構は知られておらず完全に異なることもあり得る。 故に、アミノ酸置換によるスブチリシンの界面活性剤耐性の増加の成功が、同じ 戦略によるリパーゼの界面活性剤耐性の増加の同様な成功を予測するものではな かった。 スブチリシンはリパーゼとホモロジーを有してはいないので、以前のスブチリ シンについての刊行物から、活性を破壊することなく界面活性剤耐性を改良する ために、リパーゼにおいてどの残基を改変すべきかを予測することは不可能であ る。さらに、洗剤組成物の他の成分が、酵素活性を実質的に変化させることなく 、あるいはその安定性を減少させることなく、そのような組成物中で用いるため のリパーゼに対してどのような変化を成し得るかということに影響することもあ り得る。 本発明者らは、Ｘ線結晶学または分子モデル技術により得られた酵素の三次元 構造の表面を視覚的に調査することにより、リパーゼの界面活性剤変性の開始サ イトを同定することが可能であることを発見した。例えば、そのような開始サイ トとは、界面活性剤がその疎水性部分で最初に付着し、続いて酵素の疎水性核に 入り込むことが可能である酵素表面の疎水性部分であってもよい。そのような疎 水性部分は、荷電しているか又は極性の側鎖を有するアミノ酸残基を導入するこ とにより除去することが可能である。 リパーゼの他の界面活性剤変性の開始サイトは、酵素の表面の空洞である。そ のような空洞は、界面活性剤分子の疎水性部分が空洞を経由して酵素の疎水性核 に入り込むことを可能とするためには、少なくとも３０ｎｍの直径を有していな ければならない。この型の空洞の界面活性剤分子への接触性は、より多くの空間 要求性を有し、少なくとも空洞を満たすかまたは入口をカバーするアミノ酸側鎖 を導入することにより減少させることができる。この型の変異は、このように立 体障害を通して界面活性剤の疎水性部分による変性を防止する。もし、界面活性 剤変性の開始サイトを提供するリパーゼの表面空洞が、主に疎水性側鎖を有する アミノ酸によって取り囲まれている場合は、これらのアミノ酸を極性の又は荷電 した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えることにより、界面活性剤耐性を改善 させることができる。この型の変異は酵素の空洞と界面活性剤分子の疎水性部分 との間の疎水性接触を弱め、そして、空洞を経由して酵素の疎水性核へ入り込も うとする界面活性剤分子の能力を減少させる。 本発明の他の改変の戦略は、点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）によ るリパーゼ表面電荷の改変である。アニオン性界面活性剤分子のリパーゼ表面へ の最初の接近は、恐らくは、酵素表面の正に荷電したアルギニンおよびリジン側 鎖と界面活性剤分子の負の部分との吸引的静電気的相互作用によって駆動されて いる。もしも酵素表面において正に荷電したアミノ酸側鎖に近接して疎水性部分 が存在する場合は、界面活性剤分子は一旦正に荷電した側鎖に引き寄せられ、容 易に酵素へ入り込むことができる。本発明の改善手段は、このような正に荷電し た側鎖を点変異により、負に荷電した側鎖又は極性ではあるが荷電していない側 鎖を有するアミノ酸と置き換えるものである。 数多くの表面での可能な変異のうちのいくつかは、酵素の触媒効率に対して好 ましくない影響もまた有することもあり得る。１つの同定された空洞は、例えば 、酵素の外側表面から活性サイトへ水分子を輸送するために必要な溶媒チャネル であって、活性サイトにおいて水分子はトリグリセリド加水分解反応の基質の１ つとして必要とされている。このような空洞におけるアミノ酸置換は水輸送機能 を妨害しそれによりリパーゼ活性を破壊しうる。しかしながら、改変リパーゼを 加水分解活性に関して試験し、顕著な活性の減少を示していないものを選択する ことは容易に可能である。 一般にリパーゼの触媒機構は、通常はいわゆるリッド（ｌｉｄ）で覆われリパ ーゼの内部において発見されている活性サイト領域に近づいてゆく、両親和性基 質（トリグリセリド）に依存している。このことは恐らく表面から接触可能な疎 水性チャネルによっても起こりうるであろう。 リパーゼの表面の疎水性部分は、酵素とその基質との相互作用についてもまた 重要であり得る。例えば、リパーゼには、その最適な機能には、基質の疎水性部 分との接触や特定の配向が必要であるかもしれない。極性または荷電した側鎖を 有するアミノ酸の導入によるリパーゼの疎水性パターンの妨害は、このように改 変されたリパーゼの観察される活性に影響を与えうる。 それ故、本発明者等が、リパーゼ分子の加水分解活性を実質的に減少させるこ となく界面活性剤耐性を改善するために改変させることができる数多くのサイト を同定したことは驚くべきことである。さらに、本発明の変異体リパーゼは、改 善された洗浄能力を有することが観察された。洗浄用途での酵素の挙動は未だに 予測することができない。洗剤酵素における特定の変異が何故変異酵素のより優 れた洗浄能力につながるのかは確認することは現在まで不可能である。より優れ た洗浄能力は、酵素の比活性とも、酸化安定性等の他の酵素の性質の改善とも関 連していないことが観察された。それ故に、本発明の改変リパーゼが改善された 洗浄能力を有していることが判明したのは予想外であった。 さらには、酵素の熱安定性を改善することが知られている変異はまた、酵素の アニオン性界面活性剤に対する安定性も改善することが判明した。これらは、例 えば、タンパク質内部の疎水的相互作用を強化する改変である。このような相互 作用の酵素の安定性にとっての重要性はモデルシステムにおいて研究されている （Ｊ．Ｔ．Ｋｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３３，７８４−７８ ６（１９８８））。しかしながら、この型の変異は、他の酵素においてはアニオ ン性界面活性剤に対する安定性にインパクトを与えることは示されていなかった 。一般的な安定化の変異の他の型とは、アルファヘリックス中のモデルシステム において安定化するものである（Ｌ．Ｓｅｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ ｒｅ ３５６，４５３−４５５（１９９２），Ｓｅｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，５４４−５５９（１９９２））。ここでもまた 、これらの変異が、洗剤配合物中の界面活性剤に対する増加された耐性を有する 酵素につながることは決して証明されてはいなかった。 本発明者等は、配列番号２のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ ｓのリパーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｍ１（ＣＢ Ｓ ４７３．８５）のＭ２１Ｌに相当し、現在Ｌｉｐｏｍａｘ（登録商標）とし て市販されている）の表面上で、本発明による改変によって有用に改変される、 界面活性剤変性の開始サイトに関して適切な位置にある以下の残基を同定した： ＩＬＥ １５，ＧＬＹ ２９，ＶＡＬ ３０，ＡＲＧ ４１，ＳＥＲ ４６，Ｉ ＬＥ ４９，ＧＬＵ ５１，ＬＥＵ ５５，ＡＳＮ ５６，ＴＨＲ ５７，ＬＥ Ｕ ６０，ＬＥＵ ６６，ＶＡＬ ６９，ＡＬＡ ７３，ＶＡＬ ８１，ＰＲＯ ９１，ＴＨＲ ９２，ＡＲＧ ９４，ＴＹＲ ９５，ＶＡＬ ９６，ＡＬＡ９ ７，ＶＡＬ ９９，ＬＥＵ １０３，ＶＡＬ １０４，ＡＬＡ １１２，ＬＹＳ １１５，ＡＬＡ １２０，ＩＬＥ １２３，ＡＲＧ １２４，ＰＲＯ １２７ ，ＩＬＥ １３５，ＶＡＬ １３６，ＩＬＥ １３９，ＶＡＬ １４０，ＰＲＯ １５８，ＬＥＵ １６２，ＬＥＵ １６５，ＳＥＲ １６７，ＧＬＹ １７ ２，ＡＬＡ １７３，ＡＬＡ １７５，ＰＨＥ １７６，ＴＹＲ １８０，ＰＲ Ｏ １８１，ＧＬＮ １８２，ＧＬＹ １８３，ＩＬＥ １８４，ＡＬＡ １９ ３，ＶＡＬ １９６，ＡＳＮ １９７，ＶＡＬ １９９，ＳＥＲ ２０８，ＰＲ Ｏ ２０９，ＬＥＵ ２１９，ＬＥＵ ２２１，ＧＬＹ ２２２，ＳＥＲ ２２ ４，ＬＥＵ ２３５，ＬＥＵ ２４３，ＶＡＬ ２４６，ＩＬＥ ２４７，ＭＥ Ｔ ２５３，ＡＳＮ ２５４，ＶＡＬ ２７６，ＬＥＵ ２８６，ＬＥＵ ２８ ９，ＬＹＳ １０，ＬＥＵ １７，ＳＥＲ ３９，ＡＳＰ ４３，ＳＥＲ ４６ ，ＧＬＵ ５９，ＧＬＵ ６３，ＶＡＬ ６９，ＡＬＡ ７３，ＬＹＳ ７８， ＬＹＳ ８０，ＶＡＬ ８４，ＰＲＯ ９１，ＬＹＳ １９５，ＶＡＬ １９６ ，ＳＥＲ ２００，ＬＥＵ ２１４，ＬＥＵ ２４３，ＭＥＴ ２５３，ＬＥＵ ２６８，ＴＨＲ ２７１，ＴＨＲ ２７５，ＬＥＵ ２８６． アミノ酸はそれぞれ、それらの１又は３文字コードで省略してある。コードは 以下のとおりである： 変異に関して用いられた命名法は、以下のとおりであり、Ｋ１０Ｅとは、位置 １０においてリジン（ＬＹＳ）がグルタミン酸（ＧＬＵ）で置き換えられたこと を意味する。複数の変異は以下のように命名された。Ｋ１０Ｅ／Ｋ８０Ｒとは、 位置１０におけるリジン（ＬＹＳ）のグルタミン酸（ＧＬＵ）による置換に加え て位置８０におけるリジン（ＬＹＳ）のアルギニン（ＡＲＧ）による置換を意味 する。 配列番号２の上記のアミノ酸残基に関して考えられる置換とは、例えば、小さ い荷電していない脂肪族の側鎖を有するアラニン等のアミノ酸残基と、より大き く非極性側鎖を有するアミノ酸との置換、例えば、アラニンとバリン、ロイシン 、フェニルアラニンとの置換などである。リパーゼ中の適切に選択された位置に お いて非極性側鎖の大きさを増加することが望まれているところでは、これは側鎖 の大きさの増加に基づく非極性アミノ酸の以下の順序に関連してなされるであろ う：ａｌａ＜ｐｒｏ＜ｖａｌ＜ｌｅｕ＜ｉｌｅ＜ｍｅｔ＜ｐｈｅ＜ｔｒｐ。この ような順序は、Ｓ．Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９ ６（１９８７）６４１−６５６に出版されたようなアミノ酸側鎖の接触可能な領 域に基づいている。上記の配列番号２のアミノ酸残基のうちの脂肪族残基は、荷 電されていない極性の原子団を有するセリン、スレオニン、アスパラキン、グル タミン、システインもしくはチロシンのようなアミノ酸残基、または荷電した側 鎖を有するリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン 酸のようなアミノ酸残基と置換されてもよい。本発明によると、配列番号２の荷 電していない極性アミノ酸残基は、ｓｅｒ＜ｔｈｒ＜ｃｙｓ＜ａｓｎ＜ｇｌｎ＜ ｔｙｒで順序で増加する、より空間を充填する荷電していない極性残基、または 、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンのよう な荷電したアミノ酸残基と置換されてもよい。ここでもまた、前記の配列番号２ のアミノ酸残基に関して、正に荷電した側鎖を有するアルギニン、ヒスチジンお よびリジンのようなアミノ酸残基は、極性原子団を有するセリン、アスパラギン 、グルタミン、スレオニンおよびチロシンのようなアミノ酸残基、またはアスパ ラギン酸およびグルタミン酸のような負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基と 置換されていてもよい。 配列番号２におけるこのような置換の考慮は、以下のアミノ酸位置の小グルー プを特別に考慮するために選択することにつながった：ＬＹＳ １０，ＬＥＵ １７，ＳＥＲ ３９，ＡＳＰ ４３，ＳＥＲ ４６，ＧＬＵ ５９，ＧＬＵ ６ ３，ＶＡＬ ６９，ＡＬＡ ７３，ＬＹＳ ７８，ＬＹＳ ８０，ＶＡＬ ８４ ，ＰＲＯ ９１，ＬＹＳ １９５，ＶＡＬ １９６，ＳＥＲ ２００，ＬＥＵ ２１４，ＬＥＵ ２４３，ＭＥＴ ２５３，ＬＥＵ ２６８，ＴＨＲ ２７１， ＴＨＲ ２７５，ＬＥＵ ２８６。特に好ましい本発明の変異体リパーゼは、配 列番号２のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓのリパーゼであっ て、以下のアミノ酸置換を少なくとも１つ有する変異体である： ＬＹＳ １０ ＧＬＵ， ＬＥＵ １７ ＧＬＮ，ＳＥＲ ３９ ＡＬＡ，ＡＳ Ｐ ４３ ＧＬＹ，ＳＥＲ ４６ ＣＹＳ，ＧＬＵ ５９ ＧＬＹ，ＧＬＵ ６ ３ ＧＬＹ，ＶＡＬ ６９ ＡＬＡ，ＡＬＡ ７３ ＬＥＵ，ＬＹＳ ７８ Ｇ ＬＵ，ＬＹＳ ８０ ＡＲＧ，ＶＡＬ ８４ ＩＬＥ，ＰＲＯ ９１ ＬＥＵ， ＬＹＳ １９５ ＧＬＵ，ＶＡＬ １９６ ＧＬＵ，ＳＥＲ ２００ ＡＲＧ又 はＧＬＹ，ＬＥＵ ２１４ ＨＩＳ，ＬＥＵ ２４３ ＴＹＲ，ＭＥＴ ２５３ ＴＹＲ，ＬＥＵ ２６８ ＡＲＧ又はＧＬＮ又はＰＲＯ，ＴＨＲ ２７１ Ｉ ＬＥ，ＴＨＲ ２７５ ＡＳＮ，ＬＥＵ ２８６ ＡＲＧ。 当業者にとっては、これに相当する改変をホモロジー、すなわちＰｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓのリパーゼに対する７０％以上のホモロジ ーを有するリパーゼにおいてもまた、改善された界面活性剤耐性を有する機能的 リパーゼを得るためにこれに相当する改変を行うことが可能であることは明白で ある。このような改変は、例えば、Ｍｉｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７，５２３−５２９（１９９４）に記載されている ように、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼのアミノ酸配列を並列させること に基づいて、行うことができる。 上記のＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼの改変に関する教示は、このよう に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｇｌｕｍａｅ、Ｐ．ｐｌａｎｔａｒｉｉ、 Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよびＰ．ｃｅｐａｃｉａのリパーゼ 等の、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の仲間によって生産されたリパーゼに容易 に拡張することが可能である。本発明はまた、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ ｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌ ａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼの機能性変異体にも拡張が可能である。この本発 明の目的のために、上記の教示に従った改変のために選ばれるリパーゼは、完全 な天然由来のリパーゼ、酵素的に活性なリパーゼ断片およびその機能性派生体か ら選択されてもよい。 更なる面においては、本発明は付加的に、前述されたように組換えＤＮＡ技術 による改変リパーゼの製造手段を提供する。かくして、本発明は、本発明の改変 リパーゼをコードしている、改変リパーゼのコード配列が使用可能に発現制御配 列に連結された発現ベクターを含む組換えＤＮＡ、およびそのようなＤＮＡを含 む形質転換細胞にも拡張している。 以前に示されたように、部位特異的変異は、本発明の組換えＤＮＡのためのリ パーゼをコードしている配列を得るための１つの方法であるが、別の方法もまた 当業者には公知であろう。本発明の目的のための部位特異的変異は、多様な公知 技術を用いた従来の方法で行われてもよい。 組換え技術分野の当業者は、本発明の変異リパーゼを発現するためのベクター および宿主細胞を選択する方法を理解するであろう。このようなリパーゼを発現 するためのベクターは、幅広い宿主範囲ベクターであり、好ましくはＲＳＦ１０ １０の派生体、特にｐ２４ Ａ２ ａ （図４を参照）またはその機能的相同体 である。本発明のリパーゼを発現するための好適な細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ細胞であり、好ましくはＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ細胞、特に好適にはリパ ーゼ欠損Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの派生体である。Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓのリパーゼ遺伝子は従来の技術で不活性化されてもよい。以下の実施例では 、ＰＳ６００と命名された、１つの特定のＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓのリパー ゼ欠損株が記載されている。しかしながら、本発明のリパーゼの生産のために宿 主として適当な他のリパーゼ欠損Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株を用意するために同 様の戦略が用いられ得ることは理解されている。 このように、更なる面においては、本発明は以前に記述されたように、宿主細 胞、例えば細胞中で所望のリパーゼの発現を指揮可能な好ましくは発現ベクター である組換えＤＮＡを有するリパーゼ欠損Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ細胞を、 リパーゼが生産される条件下で培養することからなる変異リパーゼの調製方法を 提供する。 本発明の一部分は、勿論、以前に記述されたように変異リパーゼの洗剤組成物 の配合物中での利用およびその結果得られる洗剤組成物それ自体でもある。この ような洗剤組成物は、本発明のリパーゼに加えて、数多くの従来の洗剤組成物成 分を含むであろう。洗剤粉末は一般に、ビルダー（例えばゼオライト、リン酸） 、界面活性剤（例えばアニオン性、非イオン性）、ポリマー（例えばアクリル性 ）、漂白剤前駆体（例えばホウ酸）、漂白剤活性剤、構造体（ｓｔｒｕｃｔｕｒ ａｎｔｓ）（例えばケイ酸）およびｐＨ調整組成物（例えばアルカリ）を含有す る。 液体洗剤は一般に、界面活性剤（例えばアニオン性、非イオン性）、漂白剤前駆 体（例えばホウ酸）漂白剤活性剤およびｐＨ調整組成物（例えばアルカリ）を含 有する。リパーゼ以外の酵素（例えばプロテアーゼ、アルファアミラーゼ）、有 機酸、無機塩および軟化剤を含む他の成分が、このような組成物中に取り込まれ てもよい。図面の簡単な説明 図１はＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ由来のＭ２１ＬリパーゼのＤＮＡ配列を示 している。本発明に従った置換に好ましいアミノ酸位置は下線がされている。同 じ配列が配列番号１および配列番号２にも示されている。 図２はＥ．ｃｏｌｉにおいてＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼ遺伝子の部 位特異的変異を行うために構築されたツインベクターを示している。 図３ａはＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの染色体へのプラスミドｐＢＲ−ｆｌａ ｎｋの組込みを示している。 図３ｂはＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの染色体からのリパーゼ遺伝子を除去す る組換え事象を示している。 図４はリパーゼ欠損Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＰｓ６００株等のＰ．ａｌｃ ａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼから派生した本発明の変異リパーゼの発現に好適なベ クターを示す。 図５は本発明の改変リパーゼ活性のＨＰＬＣ試験を示す。観察されたトリオレ イン、遊離脂肪酸、１，３ジアシルグリセリドおよび１，２ジアシルグリセリド の保持時間はそれぞれ１．２２分、１．６２分、２．４６分および３．６分であ った。 図６は１回の洗浄工程の後の口紅の除去へのリパーゼ添加の効果を示す。実施例 部位特異的変異による変異の導入 ｐＭＡ／Ｃ変異システムを用いて、ＷＯ９１／００３５３に記載されているよ うに変異を導入した。このツインベクターシステム中に、リパーゼ遺伝子及びリ パーゼ補助遺伝子を含む２．４ｋｂの断片をクローン化した。上述のベクターに 、二次変異の可能性を最小化するために、適当な制限サイトを導入した。その結 果 生成されたベクターをｐＭＡｌｉｐｏ（図２ａ）およびｐＭＣｌｉｐｏ（図２ｂ ）と称した。 多量の変異酵素を生産するため、変異遺伝子はマルチコピープラスミド中にク ローン化し、以下に記述するようにＰｓ６００と命名されたＰ．ａｌｃａｌｉｇ ｅｎｅｓリパーゼ欠損株中に形質転換した。 リパーゼ欠損Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ株Ｐｓ６００の構築 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ中では複製されないが他の 微生物中では複製されることが可能な、自殺組込みプラスミドを、Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ染色体中のリパーゼ遺伝子を不活性化する ために用いた。 リパーゼ含有遺伝子断片を、プラスミドｐＴＭＰｖ１８から、Ｅ．ｃｏｌｉで は複製されるがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓでは複製され ないプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ２（ １９７７）９５−１１３）へサブクローン化した。続いて、プラスミドから内部 配列を除いた。その結果得られたプラスミドをｐＢＲｆｌａｎｋと称した。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｍ１（ＣＢＳ ４７３． ８５）を、ｐＢＲｆｌａｎｋで形質転換した。このプラスミドはＰｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓにおいては複製されないので、テトラクリン耐性コロニーは組込みによ ってのみ得られる。幾つかのテトラクリン耐性（５ｍｇ／ｌ）コロニーを選択し た。これらの株においては、プラスミドｐＢＲｆｌａｎｋは、細菌染色体中に５ ’または３’隣接領域での単一組換え事象により組み込まれている。これらの菌 株はまだ機能的リパーゼ遺伝子を含んでいるので、それらはリパーゼ生産性でテ トラクリン耐性表現型を示す。幾つかの菌株をさらなる実験のために選択した。 リパーゼ遺伝子およびプラスミドを染色体から除去するために、第２の組換え（ 切り出し）操作を生じさせなくてはならない。このことは抗生物質の不在条件下 でＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地中で菌株を数日間 増殖させることにより達成される。 続いてこれらの細胞をトリブチリンを含む寒天培地にプレートした。リパーゼ 欠損表現型を含む菌株は選択用寒天プレートで生育できないことを確認した。こ のようにして得られたリパーゼ非生産性株をＰｓ６００と命名した。 この、第２の組換えが後に続く組込み操作の模式図は図３ａおよび３ｂに示さ れている。 変異体リパーゼの製造および単離 菌株をＥＰ０３３４６２に記載されたように増殖させた。リパーゼタンパク質 を続いて培養液体培地からＥＰ０３３４６２に記載されたように白色粉末として 精製した。 洗浄条件下でのリパーゼ活性の同定のためのアッセイ 洗浄工程におけるアルカリリパーゼ活性を評価するためにＳＬＭ試験を用いた 。ＳＬＭ試験はＴ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｙｕｋａｇａｋｕ ３ ４（１９８５）６０６−６１２によって開発された方法と同じ原理を用いている が、分析時間は顕著に減少されている。 方法は、繊維上に固定化されたエマルジョン化されていない脂質またはオイル を試験用の染みとし、洗浄工程で処理した後で１区分を抽出し、そして分析用溶 媒で脂質およびリパーゼ活性の結果として生成された脂肪酸を、洗浄工程の後で 繊維に残存しているトリグリセリドと同様に抽出した。区分に残された試験生産 物の量は、洗浄工程の間のリパーゼの性能のよい尺度であるように思われた。 以下は、ＳＬＭ試験を好ましく行う方法の典型的な例である： ポリエステルの区分を繊維として用い、トリオレインまたは精製油（ともにシ グマ、ＵＳＡの製品）を基質として用いた。トリオレインの加水分解は、溶媒抽 出工程の後でクロマトグラフィー的手法により後を追うことができる。 ＳＬＭ試験のために用いられる洗浄工程は好ましくは以下のものである： １０ｍｇのオリーブオイルを含むｎ−ヘキサン（１２．５％）８０μｌを、ポ リエステル区分（３Ｘ３ｃｍ）にスポット打ちした。区分は室温で空気乾燥した 。１０ｍｌのＳＴＷ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｔａｐ ｗａｔｅｒ：蒸留水中の２ｍ ｍ塩化カルシウムおよび０．７ｍＭ塩化マグネシウム）またはＳＴＷに溶解させ た洗剤からなる洗浄溶液を、グランドストッパーを有する三角フラスコ（５０ｍ ｌ）に入れ、振とうウォーターバス中で４０℃で保存した。洗浄工程は、三角フ ラスコにリパーゼ（４０ＩＬＵ、以下を参照）、その後すぐに続いて染みのつい た区 分を添加することにより開始した。フラスコは４０分間ウォーターバス中で振と うさせた。対照実験ではリパーゼを添加しなかった。洗浄後、区分をＳＴＷです すぎ、続いて５５℃で乾燥させ、その後第２の洗浄工程を行った。乾燥させた区 分を、５ｍｌの、基質と生成物とのクロマトグラフィー分離に用いられた溶出剤 と同じ組成を有する溶媒を含むガラス管中で回転させて抽出処理した。 抽出溶液中の脂肪酸および１，２および１，３ジアシルグリセリドの量ととも にトリグリセリドの残存量をＨＰＬＣで測定した。 装置と条件： ポンプ： ＬＫＢ（モデル２１５０） 検出： 屈折率モニター（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ） 注入システム： パーキンエルマーＩｓｓ−１０１； １０μｌ インテグレーター： スペクトラ・フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉ ｃｓ）クロムジェット（Ｃｈｒｏｍｊｅｔ） カラム： ＣＰマイクロスフェアーＳｉ（ＣＰ−Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒ−Ｓｉ） 、（クロムパック；ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）、１００Ｘ４．６ｍｍ 溶媒： ｎ−ヘキサン／イソプロピルアルコール／ギ酸：９７５：２５：２．５ （Ｖ／Ｖ）、１ｍｌ／ｍｉｎ 温度： 室温（ａｍｂｉｅｎｔ） これらの条件の下で、トリオレイン、オレイン酸、１，３および１，２ジアシ ルグリセリドの保持時間（およそ）は、それぞれ１．２、１．６、２．４および ３．６分である。ピーク面積及びピークの高さを測定した。それらは、トリオレ イン、オレイン酸、１，３および１，２ジアシルグリセリドの区分からの抽出後 の収率の尺度である。洗浄されていない区分から抽出したトリグリセリドの回収 を１００％とした。上記の条件のもとでオリーブオイル、オレイン酸、１，２お よび１，３ジアシルグリセリドの間の屈折率反応の比率はピークの高さに基づい て、それぞれ１．００、０．９８、２．１０および１．３０であることが判明し た。 リパーゼ活性の決定のためのアッセイ 選択された元のリパーゼおよび本発明の変異体の活性は、ＩＬＵで示されてい るが、オリーブオイルの加水分解により決定された。加水分解は、２０ｍＭの塩 化ナトリウムおよび塩化カルシウムの存在下で０．４ｍＭのｐＨ９のトリスバッ ファー中に１０％オリーブオイルを含むｐＨスタットを用いて３０℃で測定した 。１ＩＬＵは試験条件下で１μｍｏｌｅの脂肪酸を１分間に遊離するために必要 な酵素量として定義した。 リパーゼ比活性の決定 野生型および変異リパーゼの比活性を以前に記述されたアッセイ、およびタン パク質含量の定量のための（牛血清アルブミンを標準タンパク質として用いた） Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ、ＵＳＡ）により商業化されている ようなＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）タンパク質アッセイを 用いて決定した。 安定性試験のための酵素溶液の調整 適量のリパーゼ粉末を、０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００／０．１Ｍ Ｎ ａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ₂に溶解し、約４ｍｇ／ｍｌの酵素の終濃度とした。 ４℃で２−３時間撹拌したのち、固形沈殿物を遠心分離によって取り除いた。 ２０ｍｌの遠心分離上清を１０１の０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００／ ０．１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ₂に対して、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ＭＷＣＯ ３５００膜を用いて１６−２０時間に亘って透析した。この酵素溶液 ２ｍｌを１８ｍｌのアセトンに溶解し、十分に撹拌し−２０℃で１時間に亘って 保存し、酵素を沈殿させた。 溶液を遠心分離し、沈殿を１回１５ｍｌの氷冷アセトンで洗浄した。沈殿を続 いて０．１％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００／０．１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ Ｃ ａＣｌ₂に溶解し、酵素の終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。 界面活性剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＬＡＳ）に対する安定性の決定 ０．５ｍｌの調製した酵素溶液を、０．２５ｍｌのトリス／塩酸バッファーｐ Ｈ８．０、０．１５ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌおよび０．６ｍｌのミリＱ水に添加し た。この溶液を４０℃で前保温した。５分後、０．５ｍｌの１０ｍＭ ＬＡＳを 添加し、溶液全体を４０℃で保温した。０．１ｍｌの試料を０．５、１０、２０ 、３０および４５分間の保温で採取し、０℃で１ｍｌの０．１５Ｍ トリス／塩 酸／２．７ｍＭ ＣａＣｌ₂ｐＨ７．８に添加した。 続いて、残存活性をパラニトロフェニルアセテート法により、Ｖ．Ｋ．Ａｎｔ ｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７０ （１９８８），１２３ ５−１２４４に記載されているように測定した。データを、第１次不可逆変性プ ロセス（即ちＡ＝Ａ０＊ｅｋｔ）と仮定し、プログラムＧｒａｆｉｔ（Ｌｅａｔ ｈｅｒｂａｒｒｏｗ，Ｒ．Ｊ．（１９９０）ＧｒａＦｉｔ バージョン２．０， Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ，ＳｔａｉｎｅｓＵ．Ｋ．）を 用いて暫定的にフィットさせ、このプロセスの比率定数を得た。比率定数から等 式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋを用いて半減期を計算した。 酵素の強力液体洗剤（Ｈｅａｖｙ Ｄｕｔｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎ ｔｓ；ＨＤＬ）に対する安定性の決定 典型的な酵素を含まないＵＳ型液体洗剤を約４倍に希釈した（１ｇ ＨＤＬ＋ ３ｇ ミリＱ水）。 １．２ｍｌの洗剤希釈液を４０℃で前保温した。５分後に０．３ｍｌの調製し た酵素溶液を希釈ＨＤＬに添加した。溶液全体を４０℃で保温した。０．１ｍｌ の試料を０、５、１０、２０、３０および４５分間の保温で採取し、０℃で１ｍ ｌの０．１５Ｍ トリス／塩酸／２．７ｍＭ ＣａＣｌ₂ｐＨ７．８に添加した 。 続いて、残存活性をパラニトロフェニルアセテート法により、Ｖ．Ｋ．Ａｎｔ ｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７０ （１９８８），１２３ ５−１２４４に記載されているように測定した。データを、第１次不可逆変性プ ロセス（即ちＡ＝Ａ０＊ｅｋｔ）と仮定し、プログラムＧｒａｆｉｔ（Ｌｅａｔ ｈｅｒｂａｒｒｏｗ，Ｒ．Ｊ．（１９９０）ＧｒａＦｉｔ バージョン２．０， Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ，ＳｔａｉｎｅｓＵ．Ｋ．）を 用いて暫定的にフィットさせ、このプロセスの比率定数を得た。比率定数から等 式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋを用いて半減期を計算した。実施例１ 異なった変異体の比活性の決定 異なった変異リパーゼの比活性を、ここに以前に記述したようにＢＣＡおよび ｐＨスタット活性測定法により決定した。 表１に見られるように、変異リパーゼの比活性はおよそＬｉｐｏｍａｘ（登録 商標）と同程度であった。驚くべきことには、Ｔ２７５ＮおよびＳ２００Ｒ／Ｌ ２８６Ｒはより高い比活性を示した。 実施例１、２および３の変異リパーゼとは、配列番号２のＰｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼの派生体である。実施例２ 異なった変異体の半減期の決定 変異リパーゼの半減期をここに以前に記載した方法を用いて決定した。 ほとんどすべての変異体が、これらの条件のもとでは、Ｌｉｐｏｍａｘと比較 して改善された、アニオン性界面活性剤に対する耐性を示した。実施例３ 異なった変異体の半減期の決定 変異リパーゼの半減期をここに以前に記載した方法を用いて決定した。 ほとんどすべての変異体が、これらの条件のもとでは、Ｌｉｐｏｍａｘと比較 して改善された、典型的な商業用液体洗剤に対する耐性を示した。実施例４ 応用のための条件下でのリパーゼＭ１（ＣＢＳ ４７３．８５）の変異体のリパ ーゼ活性（ＳＬＭ試験） リパーゼＭ１変異体Ｍ２１Ｌ、Ｍ２１Ｌ／Ｋ７８ＥおよびＭ２１Ｌ／Ｖ１９６ Ｅを用いたＳＬＭ試験をここに以前に記載したように行った。以下の条件をこの 単一工程洗浄試験において用いた： ― Ｓｔａｎｄａｒｄ ｔａｐ ｗａｔｅｒ（ＳＴＷ） ― 洗剤はＡｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）（２ｇ／ｌ） ― リパーゼ使用量は示された通り Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）はＰｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅの 製品であり、市販されている。この洗剤はプロテアーゼもリパーゼも含んでいな い。 この表から、用いられたリパーゼは洗剤の存在下でも繊維上で脂質分解活性を 示すように見える。これらの結果は、両方のＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）の変異 体はＭ２１Ｌリパーゼ（Ｌｉｐｏｍａｘ（登録商標））変異体と比較して、これ らの応用のための条件の下で、同じ重量ベースで添加された場合により活性が高 いことを明白に示している。実施例５ ヨーロッパの洗剤を用いたＬａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程に おけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの洗浄性能 以下の条件でのＬａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程における上 記の変異リパーゼの洗浄性能を決定した。 ―２．５ｍＭ塩化カルシウム水硬度（ｗａｔｅｒｈａｒｄｎｅｓｓ） ―洗剤はＡｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）（５ｇ／ｌ） ―０．７５ｍｇ／ｌ Ｍａｘａｃａｌ（登録商標） ―示された量でのリパーゼ ―洗浄温度は４０℃ ―洗浄工程は４０分 ―モニターは、ＷＦＫ−Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，ドイツからの ポリエステル／コットン上の口紅の染みＬＳ２ Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）は、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅより 市販されている粉末洗剤である。この用いられた洗剤ベースはプロテアーゼもリ パーゼも含んではいない。 図６は、付加的なＫ７８Ｅ変異は、このＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）の改善さ れた洗浄性能の原因として把握できることを明白に示している。実施例６ アメリカの洗剤を用いたＬａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工程にお けるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの洗浄性能 上述の変異リパーゼの、Ｔｉｄｅ（登録商標）（含有量１．３ｇ／ｌ）存在下 での、用いられた水硬化が０．７５ｍＭ塩化カルシウムおよび０．２５ｍＭ塩化 マグネシウムであるという唯一の変更を加えた実施例５で示されたシステムにお ける洗浄性能を決定した。 Ｔｉｄｅ（登録商標）は、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅより市販されている 粉末洗剤である。この用いられた洗剤ベースはプロテアーゼもリパーゼも含んで はいない。 この表からも、Ｔｉｄｅ（登録商標）の存在下での、Ｍ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異 リパーゼの、Ｌｉｐｏｍａｘ（登録商標）を越える改善された洗浄性能特性は明 白である。実施例７ モニターとしてバター脂肪を用いた、Ｌａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による 洗浄工程におけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リパーゼの洗浄性能 上記の変異リパーゼの洗浄性能を、Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）およ びＴｉｄｅ（登録商標）両方の存在下で決定した。用いられた条件は実施例５（ Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ；登録商標）および６（Ｔｉｄｅ；登録商標）に記載さ れている。ポリエステル上のＬＳ４バター脂肪試験モニターは、試験材料センタ ー（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、オランダ）より入手した。 この表は、モニターとしてバター脂肪を用いても、Ｍ２１Ｌ／Ｋ７８Ｅ変異リ パーゼは、Ｍ２１Ｌ変異リパーゼ（Ｌｉｐｏｍａｘ）と比較して、改善された洗 浄性能を示すことを表している。実施例８ モニターとして口紅を用いた、Ｌａｕｎｄｒ−ｏ−ｍｅｔｅｒ試験による洗浄工 程におけるＭ２１ＬおよびＭ２１Ｌ／Ｖ１９６Ｅ変異リパーゼの洗浄性能 上記の変異リパーゼの洗浄性能を、Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）およ びＴｉｄｅ（登録商標）両方の存在下で、実施例５（Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ； 登録商標）および６（Ｔｉｄｅ；登録商標）に記載された条件で決定した。 この表から、２重変異体は単一（Ｍ２１Ｌ）変異リパーゼと比較して、とくに Ａｒｉｅｌ Ｕｌｔｒａ（登録商標）の存在下の高い酵素量において、改善され た洗浄性能を有すると結論付けることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レンティング，ヘルマナス ベルナルダス マリア オランダ国 ペイナッヘル エヌエル− 2641 ヴェーテー フンツェ ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．界面活性剤耐性を増加させるため、天然のリパーゼもしくはその一部分と比 較して、表面またはその近傍で１以上のアミノ酸の置換を有する、天然リパーゼ の改変機能型またはその機能性部分であることを特徴とする変異リパーゼ。 ２．天然のリパーゼもしくはその一部分の空洞部位に相当する部位またはその近 傍において、界面活性剤分子の疎水性部分の前記空洞に対する接触性を減少させ るために１以上のアミノ酸の置換を有する天然リパーゼの改変機能型またはその 機能性部分であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の変異リパーゼ。 ３．前記１以上のアミノ酸の置換が少なくとも前記空洞を部分的に充填またはカ バーする結果となっていることを特徴とする請求の範囲第２項記載の変異リパー ゼ。 ４．天然のリパーゼもしくはその機能性部分と比較して、非荷電非極性側鎖を有 するアミノ酸を、非荷電極性側鎖もしくは荷電側鎖を有するアミノ酸で置き換え ることから選択される少なくとも１以上のアミノ酸の置換を有することを特徴と する請求の範囲第１項または第２項記載の変異リパーゼ。 ５．上澄み変性をおこす疎水性開始サイトとアニオン性界面活性剤分子の疎水性 部分との相互作用を減少させるために、天然のリパーゼもしくは天然リパーゼの 機能性部分の相当する正に荷電した側鎖を有するアミノ酸が、非荷電極性側鎖も しくは負に荷した電側鎖を有するアミノ酸で置き換えられていることを特徴とす る請求の範囲第１項または第２項記載の変異リパーゼ。 ６．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のリパーゼの改変機能型もしくはその機能性部分 であることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項何れか１項記載の変異リ パーゼ。 ７．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ ｐｌａｎｔａｒｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ、Ｈ ｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼから選択されるリパーゼの改 変機能型およびその機能性部分であることを特徴とする請求の範囲第１項ないし 第５項何れか１項記載の変異リパーゼ。 ８．配列番号２のアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉ ｇｅｎｅｓのリパーゼもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ ｓ（ＣＢＳ４７３．８５）、および対応するアミノ酸配列にホモロジーを有する リパーゼから選択されたリパーゼの改変機能型であって、前記改変機能型が配列 番号２のアミノ酸配列の下記の位置、または当該配列とホモロジーを有するリパ ーゼのアミノ酸配列の相当する位置の少なくとも１つにアミノ酸置換を有する改 変機能型リパーゼであることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第５項何れ か１項記載の変異リパーゼ： ＩＬＥ １５，ＧＬＹ ２９，ＶＡＬ ３０，ＡＲＧ ４１，ＳＥＲ ４６， ＩＬＥ ４９，ＧＬＵ ５１，ＬＥＵ ５５，ＡＳＮ ５６，ＴＨＲ ５７，Ｌ ＥＵ ６０，ＬＥＵ ６６，ＶＡＬ ６９，ＡＬＡ ７３，ＶＡＬ ８１，ＰＲ Ｏ ９１，ＴＨＲ ９２，ＡＲＧ ９４，ＴＹＲ ９５，ＶＡＬ ９６，ＡＬＡ ９７，ＶＡＬ ９９，ＬＥＵ １０３，ＶＡＬ １０４，ＡＬＡ １１２，Ｌ ＹＳ １１５，ＡＬＡ １２０，ＩＬＥ １２３，ＡＲＧ １２４，ＰＲＯ １ ２７，ＩＬＥ １３５，ＶＡＬ １３６，ＩＬＥ １３９，ＶＡＬ １４０，Ｐ ＲＯ １５８，ＬＥＵ １６２，ＬＥＵ １６５，ＳＥＲ １６７，ＧＬＹ １ ７２，ＡＬＡ １７３，ＡＬＡ １７５，ＰＨＥ １７６，ＴＹＲ １８０，Ｐ ＲＯ １８１，ＧＬＮ １８２，ＧＬＹ １８３，ＩＬＥ １８４，ＡＬＡ １ ９３，ＶＡＬ １９６，ＡＳＮ １９７，ＶＡＬ １９９，ＳＥＲ ２０８，Ｐ ＲＯ ２０９，ＬＥＵ ２１９，ＬＥＵ ２２１，ＧＬＹ ２２２，ＳＥＲ ２ ２４，ＬＥＵ ２３５，ＬＥＵ ２４３，ＶＡＬ ２４６，ＩＬＥ ２４７，Ｍ ＥＴ ２５３，ＡＳＮ ２５４，ＶＡＬ ２７６，ＬＥＵ ２８６，ＬＥＵ ２ ８９，ＬＹＳ １０，ＬＥＵ １７，ＳＥＲ ３９，ＡＳＰ ４３，ＳＥＲ ４ ６，ＧＬＵ ５９，ＧＬＵ ６３，ＶＡＬ ６９，ＡＬＡ ７３，ＬＹＳ ７８ ，ＬＹＳ ８０，ＶＡＬ ８４，ＰＲＯ ９１，ＬＹＳ １９５，ＶＡＬ １９ ６，ＳＥＲ ２００，ＬＥＵ ２１４，ＬＥＵ ２４３，ＭＥＴ ２５３，ＬＥＵ ２６８，ＴＨＲ ２７１，ＴＨＲ ２７５ ，ＬＥＵ ２８６． ９．配列番号２のアミノ酸配列の下記の位置、または当該配列とホモロジーを有 するリパーゼのアミノ酸配列の相当する位置の１つに少なくともアミノ酸置換を 有することを特徴とする、請求の範囲第８項記載の変異リパーゼ：ＬＹＳ １０ ，ＬＥＵ １７，ＳＥＲ ３９，ＡＳＰ ４３，ＳＥＲ ４６，ＧＬＵ ５９， ＧＬＵ ６３，ＶＡＬ ６９，ＡＬＡ ７３，ＬＹＳ ７８，ＬＹＳ ８０，Ｖ ＡＬ ８４，ＰＲＯ ９１，ＬＹＳ １９５，ＶＡＬ １９６，ＳＥＲ ２００ ，ＬＥＵ ２１４，ＬＥＵ ２４３，ＭＥＴ ２５３，ＬＥＵ ２６８，ＴＨＲ ２７１，ＴＨＲ ２７５，ＬＥＵ ２８６。 10．配列番号２のアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉ ｇｅｎｅｓのリパーゼもしくは対応するアミノ酸配列にホモロジーを有するリパ ーゼから選択されたリパーゼの改変機能型であって、前記改変機能型が配列番号 ２のアミノ酸配列の下記の位置、または当該配列とホモロジーを有するリパーゼ のアミノ酸配列の相当する位置の１つに少なくともアミノ酸置換を有することを 特徴とする、請求の範囲第９項記載の変異リパーゼ：ＬＹＳ １０ ＧＬＵ， ＬＥＵ １７ ＧＬＮ，ＳＥＲ ３９ ＡＬＡ，ＡＳＰ ４３ ＧＬＹ，ＳＥＲ ４６ ＣＹＳ，ＧＬＵ ５９ ＧＬＹ，ＧＬＵ ６３ ＧＬＹ，ＶＡＬ ６９ ＡＬＡ，ＡＬＡ ７３ ＬＥＵ，ＬＹＳ ７８ ＧＬＵ，ＬＹＳ ８０ ＡＲ Ｇ，ＶＡＬ ８４ ＩＬＥ，ＰＲＯ ９１ ＬＥＵ，ＬＹＳ １９５ ＧＬＵ， ＶＡＬ １９６ ＧＬＵ，ＳＥＲ ２００ ＡＲＧ又はＧＬＹ，ＬＥＵ ２１４ ＨＩＳ，ＬＥＵ ２４３ ＴＹＲ，ＭＥＴ ２５３ ＴＹＲ，ＬＥＵ ２６８ ＡＲＧ又はＧＬＮ又はＰＲＯ，ＴＨＲ ２７１ ＩＬＥ，ＴＨＲ ２７５ Ａ ＳＮ，ＬＥＵ ２８６ ＡＲＧ。 11．前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼの改変機能 型であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の変異リパーゼ。 12．請求の範囲第８項または第９項で定義されたアミノ酸位置の１つが改変され ている前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓリパーゼ改変機能 型であることを特徴とする請求の範囲第８項ないし第１１項何れか１項記載 の変異リパーゼ。 13．配列番号２のアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉ ｇｅｎｅｓのリパーゼもしくは対応するアミノ酸配列にホモロジーを有するリパ ーゼから選択されたリパーゼの改変機能型であって、前記改変機能型が配列番号 ２のアミノ酸配列のＭｅｔ２１位置に、または当該配列とホモロジーを有するリ パーゼのアミノ酸配列の相当する位置に、付加的に変異を有することを特徴とす る、請求の範囲第８項ないし第１２項何れか１項記載の変異リパーゼ。 14．前記請求の範囲の何れか１項記載の変異リパーゼを含むことを特徴とする洗 剤組成物。 15．請求の範囲第１項ないし第１３項何れか１項記載の変異リパーゼをコードし ている組換えＤＮＡ分子。 16．前記リパーゼ配列をコードしている配列が、操作可能に、発現制御配列と連 結されている発現ベクターの型にあることを特徴とする請求の範囲第１５項記載 の組換えＤＮＡ。 17．請求の範囲第１５項または第１６項記載の組換えＤＮＡを有することを特徴 とする宿主細胞。 18．リパーゼ欠損Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株であることを特徴とする請求の範囲 第１７項記載の宿主細胞。 19．リパーゼをコードしているＤＮＡ中に少なくとも１つの適当なコドン変化を 導入するために部位特異的変異が行われたことを特徴とする請求の範囲第１５項 記載のＤＮＡの調製方法。 20．宿主細胞中で請求の範囲第１項ないし第１３項何れか１項記載のリパーゼの 発現を指令可能な組換えＤＮＡを含む請求の範囲第１７項もしくは請求の範囲第 １８項記載の宿主細胞を、前記リパーゼが産生されうる条件下で培養することか ら成ることを特徴とする、請求の範囲第１項ないし第１３項何れか１項記載の変 異リパーゼを調製するための方法。 21．リパーゼ配列の適当な変化を達成するために化学修飾が用いられることを特 徴とする、請求の範囲第１項ないし第１３項何れか１項記載の変異リパーゼを調 製するための方法。