JP5307708B2

JP5307708B2 - ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体

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Publication number: JP5307708B2
Application number: JP2009513324A
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Inventors: ショーン・スティーヴンス; タミー・ティー・フワーン; ジョウエル・エイチ・マーティン; ジャネット・エル・フェアハースト; アシク・ラフィク; エリク・スミス; ケヴィン・ジェイ・ポバースキ; ニコラス・ジェイ・パパドプーロス; ジェイムズ・ピー・ファンドル; ガン・チェン; マーガレット・カロウ
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Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2027-06-01
Also published as: KR101464502B1; CA2652976C; US9884916B2; US20130157313A1; US20140255995A1; RS52643B; CN102585002A; NL300911I2; NO20085309L; KR20090024690A; JP2016026171A; PT2374818E; IL195393A0; PL2041177T3; NO340778B1; US8043617B2; CN101454345B; US20070280945A1; CA2652976A1; NO2017060I1

Description

関連技術の説明
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、免疫反応、急性期反応および造血の調節において重要な役割を果たす、免疫および非免疫細胞によって生産される多面発現性のサイトカインである。これらが可溶性で細胞膜結合型のＩＬ−６Ｒ（α鎖）に結合して二元複合体を形成し、この複合体は、細胞膜結合型のｇｐ１３０（β鎖）と相互作用して、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒおよびｇｐ１３０のそれぞれ２種を含むシグナル伝達複合体の形成を誘導することができる。

ｈＩＬ−６Ｒに対する抗体は、ＵＳ５，６７０，３７３、５，７９５，９６５、５，８１７，７９０、６，４１０，６９１、および、ＥＰ４０９６０７Ｂ１で説明されている。治療方法は、ＵＳ５，８８８，５１０、および、６，７２３，３１９で説明されている。

第一の形態において、本発明は、ヒトインターロイキン−６受容体（ｈＩＬ−６Ｒ）と特異的に結合するヒト抗体、好ましくは組換えヒト抗体を提供する。これらの抗体は、高親和性で、かつ遅い解離速度でｈＩＬ−６Ｒに結合すること、および、ＩＬ−６活性を中和する能力を特徴とする。本抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってもよいし、または、抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂またはｓｃＦｖフラグメント）だけを含んでいてもよいし、例えば、残留したエフェクター機能を除去するような官能性が付与されるように改変されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ等（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３）。好ましい実施態様において、本発明は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約５００ｐＭまたはそれ未満のＫ_DでヒトＩＬ−６受容体（配列番号１）と結合する、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを提供する。より具体的な実施態様において、本抗体または抗原結合フラグメントは、３００ｐＭ未満または２００ｐＭ未満のＫ_Dを有し、または、１００ｐＭ未満ものＫ_Dを有する。様々な実施態様において、本抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ルシフェラーゼによる生物学的試験によって測定したところ２５０ｐＭまたはそれ未満のＩＣ₅₀でｈＩＬ−６活性をブロックする。より具体的な実施態様において、本抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、１５０ｐＭまたはそれ未満のＩＣ₅₀を示す。

関連する形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、サルＩＬ−６Ｒへの結合よりも少なくとも２倍高い親和性でｈＩＬ−６Ｒと結合する。より好ましい実施態様において、本抗体または抗原結合フラグメントは、サルＩＬ−６Ｒへの結合よりも約３倍（またはそれ以下の倍率で）高い親和性で、Ｌ−６Ｒタンパク質（配列番号１）（配列番号２５１に示されている、カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の細胞外ドメイン）と結合する。

一実施態様において、本発明の抗体、または、本発明の抗体の抗原結合部分は、配列番号３、２２７、１９、２３１、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、２３９、２４１、１６３、１７９、２３５、１９５、および、２１１、または、それらの実質的に類似した配列からなる群より選択された重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。より具体的な実施態様において、本抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、配列番号１１、２２９、２７、２３３、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２３７、２０３、および、２１９、または、それらの実質的に類似した配列からなる群より選択された軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をさらに含む。具体的な実施態様において、本抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、配列番号３／１１；２２７／２２９；１９／２７；２３１／２３３；３５／４３；５１／５９；６７／７５；８３／９１；９９／１０７；１１５／１２３；１３１／１３９；１４７／１５５；２３９／１５５；２４１／１５５；１６３／１７１；１７９／１８７；２３５／２３７；１９５／２０３；および、２１１／２１９、または、それらの実質的に類似した配列からなる群より選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む。

第二の形態において、本発明は、本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。一実施態様において、本発明の核酸分子は、上述のようなＨＣＶＲを含む抗体またはそれらのフラグメントをコードする。具体的な実施態様において、ＨＣＶＲをコードする核酸分子は、配列番号２、２２６、１８、２３０、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、２３８、２４０、１６２、１７８、２３４、１９４、および、２１０、または、それらの実質的に同一な配列からなる群より選択される。関連する形態において、本発明は、上述のようなＬＣＶＲをコードする単離された核酸分子を提供する。具体的な実施態様において、ＬＣＶＲをコードする核酸分子は、配列番号１０、２２８、２６、２３２、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２３６、２０２、および、２１８、または、それらの実質的に同一な配列からなる群より選択されたヌクレオチド配列である。

第三の形態において、本発明は、重鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）ドメイン、および、軽鎖のＣＤＲ３ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントを特徴とし、ここにおいて：
重鎖のＣＤＲ３ドメインは、式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸−Ｘ⁹−Ｘ¹⁰−Ｘ¹¹−Ｘ¹²−Ｘ¹³−Ｘ¹⁴−Ｘ¹⁵−Ｘ¹⁶−Ｘ¹⁷−Ｘ¹⁸−Ｘ¹⁹（配列番号２４７）で示されるアミノ酸配列を含み（ここにおいてＸ¹＝Ａｌａ、Ｘ²＝Ｌｙｓ、Ｘ³＝Ｇｌｙ、Ｘ⁴＝Ａｒｇ、Ｘ⁵＝Ａｓｐ、Ｘ⁶＝Ｓｅｒ、または、Ａｌａ、Ｘ⁷＝Ｐｈｅ、Ｘ⁸＝Ａｓｐ；Ｘ⁹＝Ｉｌｅ、Ｘ¹⁰＝Ｐｒｏ、または、存在せず、Ｘ¹¹＝Ｐｈｅ、または、存在せず、Ｘ¹²＝Ｖａｌ、または、存在せず、Ｘ¹³＝Ｔｙｒ、または、存在せず、Ｘ¹⁴＝Ｔｙｒ、または、存在せず、Ｘ¹⁵＝Ｔｙｒ、または、存在せず、Ｘ¹⁶＝Ｇｌｙ、または、存在せず、Ｘ¹⁷＝Ｍｅｔ、または、存在せず、Ｘ¹⁸＝Ａｓｐ、または、存在せず、および、Ｘ¹⁹＝Ｖａｌ、または、存在せず）；および、
軽鎖のＣＤＲ３ドメインは、式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸−Ｘ⁹（配列番号２５０）で示されるアミノ酸配列を含む（ここにおいてＸ¹＝Ｇｌｎ、Ｘ²＝ＧｌｎまたはＨｉｓ、Ｘ³＝Ａｌａ、Ｘ⁴＝ＡｓｎまたはＴｙｒ、Ｘ⁵＝Ｓｅｒ、Ｘ⁶＝Ｐｈｅ、Ｘ⁷＝Ｐｒｏ、Ｘ⁸＝Ｐｒｏ、および、Ｘ⁹＝Ｔｈｒ）。

より具体的な実施態様において、本抗体または抗原結合フラグメントは、以下をさらに含む：
式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸（配列番号２４５）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ１ドメイン（ここにおいてＸ¹＝Ｇｌｙ、または、Ａｒｇ、Ｘ²＝Ｐｈｅ、Ｘ³＝Ｔｈｒ、Ｘ⁴＝Ｐｈｅ、Ｘ⁵＝Ａｓｐ、Ｘ⁶＝Ａｓｐ、Ｘ⁷＝Ｔｙｒ、および、Ｘ⁸＝Ａｌａ）；
式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸（配列番号２４６）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ２ドメイン（ここにおいてＸ¹＝Ｉｌｅ、または、Ｖａｌ、Ｘ²＝Ｓｅｒ、Ｘ³＝Ｔｒｐ、Ｘ⁴＝Ａｓｎ、Ｘ⁵＝Ｓｅｒ、Ｘ⁶＝Ｇｌｙ、Ｘ⁷＝Ｓｅｒ、および、Ｘ⁸＝Ｉｌｅ）；
式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸（配列番号２４８）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ１ドメイン（ここにおいてＸ¹＝Ｇｌｎ、Ｘ²＝Ｇｌｙ、Ｘ³＝Ｉｌｅ、Ｘ⁴＝Ｓｅｒ、Ｘ⁵＝Ｓｅｒ、および、Ｘ⁶＝Ｔｒｐ）；および、
式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³（配列番号２４９）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ２ドメイン（ここにおいてＸ¹＝Ｇｌｙ、または、Ａｌａ、Ｘ²＝Ａｌａ、および、Ｘ³＝Ｓｅｒ）。

第四の形態において、本発明は、以下を含む抗体または抗原結合フラグメントを特徴とする：
配列番号２５、１５３、９、１８５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１６９、２０１、および、２１７からなる群より選択された重鎖のＣＤＲ３ドメイン；および、
配列番号３３、１６１、１７、１９３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１７７、２０９、および、２２５からなる群より選択された軽鎖のＣＤＲ３ドメイン。

より具体的な実施態様において、本抗体または抗原結合フラグメントは、以下をさらに含む：
配列番号２１、１４９、５、１８１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１６５、１９７、および、２１３からなる群より選択された重鎖のＣＤＲ１ドメイン；
配列番号２３、１５１、７、１８３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１６７、１９９、および、２１５からなる群より選択された重鎖のＣＤＲ２ドメイン；
配列番号２９、１５７、１３、１８９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１７３、２０５、および、２２１からなる群より選択された軽鎖のＣＤＲ１ドメイン；および、
配列番号３１、１５９、１５、１９１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１７５、２０７、および、２２３からなる群より選択された軽鎖のＣＤＲ２ドメイン。

具体的な実施態様において、本抗原または抗原結合フラグメントは、重鎖のＣＤＲ配列である配列番号２１、２３、２５、および、軽鎖のＣＤＲ配列である配列番号２９、３１、３３；重鎖のＣＤＲ配列である配列番号１４９、１５１、１５３、および、軽鎖のＣＤＲ配列である配列番号１５７、１５９、１６１；重鎖のＣＤＲ配列である配列番号５、７、９、および、軽鎖である配列番号１３、１５、１７；および、重鎖のＣＤＲ配列である配列番号１８１、１８３、１８５、および、軽鎖のＣＤＲ配列である配列番号１８９、１９１、１９３を含む。

第五の形態において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子を特徴とし、ここにおいて本抗体またはそれらのフラグメントは、以下を含む：
配列番号２４、１５２、８、１８４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１６８、２００、および、２１６からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされた重鎖のＣＤＲ３ドメイン；および、
配列番号３２、１６０、１６、１９２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１７６、２０８、および、２２４からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖のＣＤＲ３ドメイン；加えて、それらの実質的に同一な核酸配列。

より具体的な実施態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子が提供され、ここにおいて、該抗体またはそれらのフラグメントは、以下を含む：
配列番号２０、１４８、４、１８０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１６４、１９６、および、２１２からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされた重鎖のＣＤＲ１；
配列番号２２、１５０、６、１８２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１６６、１９８、および、２１４からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされた重鎖のＣＤＲ２ドメイン；
配列番号２８、１５６、１２、１８８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１７２、２０４、および、２２０からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖のＣＤＲ１ドメイン；および、
配列番号３０、１５８、１４、１９０、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１７４、２０６、および、２２２からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖のＣＤＲ２ドメイン；加えて、それらの実質的に同一な核酸配列。

本発明は、改変された糖付加パターンを有する、抗ｈＩＬ−６Ｒ抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを包含する。いくつかの用途において、望ましくない糖付加部位を除去するための改変が有用である可能性があり、または、オリゴ糖鎖上のフコース部分が欠失した抗体も、例えば抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を高めるためには有用である可能性がある（Ｓｈｉｅｌｄ等（２００２）ＪＢＣ２７７：２６７３３を参照）。その他の用途において、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を施すこともあり得る。

さらなる形態において、本発明は、本発明の核酸分子を有する組換え発現ベクター、および、このようなベクターが導入された宿主細胞を提供し、同様に、本発明の宿主細胞を培養することにより得られた本発明の抗体または抗原結合フラグメントの製造方法も提供する。このような宿主細胞は、原核細胞でもよいし、または真核細胞でもよく、好ましくはこのような宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。

さらなる形態において、本発明は、ｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合するヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメント、および、製薬上許容できる担体を含む医薬組成物を特徴とする。

さらなる形態において、本発明は、本発明の抗体またはそれらの抗原結合部分を用いてヒトＩＬ−６活性を阻害する方法を特徴とする。一実施態様において、本発明は、ＩＬ−６活性の阻害によって治療または改善される障害に罹ったヒト被検体に、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを投与することを含む、治療方法を包含する。このような障害は、例えば、関節炎、例えば慢性リウマチ様関節炎；炎症性腸疾患、例えばクローン病、および、潰瘍性大腸炎；全身性エリテマトーデス；および、炎症性疾患であり得る。

さらなる形態において、本発明は、ヒトにおいてＩＬ−６−が介在する病気または障害を弱めたり、または、抑制したりするのに使用する医薬品の製造における、上記で定義されたような抗体または抗体の抗原結合フラグメントの使用を提供する。関連する形態において、本発明は、ヒトにおけるＩＬ−６−が介在する病気または障害の低減または抑制に使用するための、上記で定義されたような抗体または抗体の抗原結合フラグメントを提供する。

その他の目的および利点は、続く詳細な説明の総論から明らかになると予想される。

詳細な説明
本発明の方法を説明する前に、当然のことながら本発明は、説明されている具体的な方法および実験条件に限定されることはなく、従ってこれらの方法および条件は様々であってよい。また当然ながら、本明細書において用いられる用語は、単に具体的な実施態様を説明するためだけのものであり、限定することは目的ではなく、従って、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されると予想される。

特に他の指定がない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同様の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書において説明されているものと類似した、または、等価なあらゆる方法および材料を用いることができるが、以下で、好ましい方法および材料を説明する。

本明細書で用いられる用語「ヒトＩＬ６Ｒ」（ｈＩＬ−６Ｒ）は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）と特異的に結合するヒトサイトカイン受容体を意味することとする。配列番号１に、ｈＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインを示す。

本明細書で用いられる用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖、および、２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を意味することとする。重鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）、および、重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）、および、軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細かく分類することができ、この領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより高度に保存された領域内に散在している。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲ、および、４つのＦＲで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端への方向で以下の順番で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

本明細書で用いられる抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」または「抗体フラグメント」）という用語は、抗原（例えば、ｈＩＬ−６Ｒ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上のフラグメントを意味する。このような抗体の抗原に結合する機能は、全長抗体のフラグメントが発揮することができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１およびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ２４１：５４４〜５４６）；および、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対をなして１価の分子が形成されるように、それらを単一の連続した鎖にすることができる合成リンカーによって合体させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６；および、Ｈｕｓｔｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９〜５８８３を参照）。このような単鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることとする。また、単鎖抗体のその他の形態、例えば二重特異性抗体も包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４〜６４４８を参照）。

本明細書で用いられる抗体「を中和すること」または「をブロックすること」は、ｈＩＬ−６Ｒに結合して、ｈＩＬ−６の生物活性の阻害を引き起こす抗体を意味することとする。このようなｈＩＬ−６の生物活性の阻害は、ｈＩＬ−６によって誘導された細胞の活性化、および、ｈＩＬ−６のｈＩＬ−６Ｒへの結合（以下の実施例を参照）のような、当分野で知られているｈＩＬ−６の生物活性に関する１種またはそれ以上の指標を測定することによって評価することができる。

「ＣＤＲ」または相補性決定領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより高度に保存された領域内に散在している超可変性の領域である。本発明の抗ｈＩＬ−６Ｒ抗体またはフラグメントの様々な実施態様において、ＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいし、または、自然に、または、人工的に改変されていてもよい。ＣＤＲ群は、アミノ酸コンセンサス配列と定義することもできる；例えば、一実施態様において、本発明の抗ｈＩＬ−６Ｒ抗体または抗原結合フラグメントは、式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸−Ｘ⁹−Ｘ¹⁰−Ｘ¹¹−Ｘ¹²−Ｘ¹³−Ｘ¹⁴−Ｘ¹⁵−Ｘ¹⁶−Ｘ¹⁷−Ｘ¹⁸−Ｘ¹⁹（配列番号２４７）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖のＣＤＲ３ドメイン（ここにおいてＸ¹＝Ａｌａ、Ｘ²＝Ｌｙｓ、Ｘ³＝Ｇｌｙ、Ｘ⁴＝Ａｒｇ、Ｘ⁵＝Ａｓｐ、Ｘ⁶＝Ｓｅｒ、または、Ａｌａ、Ｘ⁷＝Ｐｈｅ、Ｘ⁸＝Ａｓｐ；Ｘ⁹＝Ｉｌｅ、Ｘ¹⁰＝Ｐｒｏ、または、存在せず、Ｘ¹¹＝Ｐｈｅ、または、存在せず、Ｘ¹²＝Ｖａｌ、または、存在せず、Ｘ¹³＝Ｔｙｒ、または、存在せず、Ｘ¹⁴＝Ｔｙｒ、または、存在せず、Ｘ¹⁵＝Ｔｙｒ、または、存在せず、Ｘ¹⁶＝Ｇｌｙ、または、存在せず、Ｘ¹⁷＝Ｍｅｔ、または、存在せず、Ｘ¹⁸＝Ａｓｐ、または、存在せず、および、Ｘ¹⁹＝Ｖａｌ、または、存在せず）；および、式Ｘ¹−Ｘ²−Ｘ³−Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶−Ｘ⁷−Ｘ⁸−Ｘ⁹（配列番号２５０）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖のＣＤＲ３ドメイン（ここにおいてＸ¹＝Ｇｌｎ、Ｘ²＝ＧｌｎまたはＨｉｓ、Ｘ³＝Ａｌａ、Ｘ⁴＝ＡｓｎまたはＴｙｒ、Ｘ⁵＝Ｓｅｒ、Ｘ⁶＝Ｐｈｅ、Ｘ⁷＝Ｐｒｏ、Ｘ⁸＝Ｐｒｏ、および、Ｘ⁹＝Ｔｈｒ）を含むものと説明することもできる。

本明細書で用いられる用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ^TM）システム（ファルマシア・バイオセンサー社（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ））を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化を検出することによってリアルタイムの相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。

用語「エピトープ」は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基である。単一の抗原が、１種より多くのエピトープを有していることもある。エピトープは、コンフォメーショナルエピトープ、または、リニアーエピトープのいずれでもよい。コンフォメーショナルエピトープは、空間的に並列させたアミノ酸によって、直鎖状のポリペプチド鎖の異なるセグメントから生産される。リニアーエピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって生産されたものである。所定の環境において、エピトープは、抗原上に糖部分、ホスホリル基またはスルホニル基を含んでいてもよい。

用語「実質的な同一性」または「実質的に同一な」は、核酸またはそれらのフラグメントに対して用いられる場合、その他の核酸（またはその相補鎖）と共に、適切なヌクレオチドを挿入または欠失させて最適に並べた場合、以下で考察されているように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐのような配列同一性に関する周知のアルゴリズムのいずれかによって測定したところ、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列の同一性があることを示す。

ポリペプチドに用いられているように、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似した」は、２つのペプチド配列が、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムで、デフォルトのギャップウェイトを用いて最適に並べた場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または、９９％の配列同一性を共有していることを意味する。同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換のために異なっていることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、側鎖（Ｒ基）と類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有するその他のアミノ酸残基で置換されていることである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないものと予想される。２種またはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換のために相違している場合は、配列同一性、または、類似性の程度のパーセントを上方調整して、保存的な性質の置換に関して修正してもよい。この調節を行う手段は、当業者周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１を参照。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、および、イソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン、および、スレオニン；３）アミドを含む側鎖：アスパラギン、および、グルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、および、トリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、および、ヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパルテート、および、グルタマート、および、７）硫黄を含む側鎖、システイン、および、メチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタマート−アスパルテート、および、アスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的な置換は、Ｇｏｎｎｅｔ等（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３４５で開示されたＰＡＭ２５０の対数尤度マトリックスにおいて陽性の値を示すあらゆる変化である。「中度に保存的」な置換は、ＰＡＭ２５０の対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を示すあらゆる変化である。

ポリペプチドに関する配列類似性（また、配列同一性とも称される）は、一般的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換などの様々な置換、欠失およびその他の改変に割り当てられた類似性の尺度を用いて、類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含み、このようなソフトウェアは、デフォルトパラメーターを用いて、異なる生物種由来の相同ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間の、または、野生型タンパク質とそれらの突然変異蛋白質との間の配列相同性、または、配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照。またポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡで、デフォルトパラメーター、または、推奨されたパラメーター、ＧＣＧバージョン６．１内のプログラムを用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２、および、ＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと検索配列との間の最大にオーバーラップしている領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合、その他の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（デフォルトパラメーターを使用）である。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３４１０、および、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９４０２を参照。

ヒト抗体の製造
ヒト抗体の生成法としては、例えば、ベロシミューン（Ｖｅｌｏｃｌｍｍｕｎｅ^TM）（リジェネロン・ファーマシューティカルズ（ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、キセノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）^TMテクノロジー（Ｇｒｅｅｎ等（１９９４）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ７：１３〜２１；アブジェニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ））、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチ、および、ファージディスプレイ（および、例えばＵＳ５，５４５，８０７、ＵＳ６，７８７，６３７を参照）が挙げられる。ベロシミューン^TMテクノロジー（ＵＳ６，５９６，５４１）は、選択された抗原に対する高い特異性の完全ヒト抗体の生成法を包含する。この技術は、マウスが、抗原性の刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を生産するように、内因性のマウス定常領域遺伝子座に機能するように連結したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成に関する。このような抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離して、ヒト重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに機能するように連結する。続いてそのＤＮＡを、完全ヒト抗体を発現することことができる細胞で発現させる。具体的な実施態様において、上記細胞は、ＣＨＯ細胞である。

抗体は、補体の固定（補体依存性細胞障害活性）（ＣＤＣ）、および、関与する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって細胞を死滅させるというのではなく、リガンド−受容体相互作用をブロックすること、または、受容体成分の相互作用を阻害することにおいて治療上有用であり得る。抗体の定常領域は、補体を固定したり、細胞依存性細胞傷害を媒介したりする抗体の能力に関して重要である。従って、抗体のアイソタイプは、抗体にとって細胞毒性を媒介することが望ましいかどうかに基づき選択されることもある。

ヒト免疫グロブリンは、ヒンジの異質性を伴う２つの形態で存在することができる。１つの形態において、免疫グロブリン分子は、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４つの鎖コンストラクトを含み、鎖間の重鎖ジスルフィド結合によって二量体が一緒に保持される。第二の形態において、この二量体は鎖間のジスルフィド結合で連結されておらず、共有結合によって連結された軽鎖および重鎖（半抗体）で構成されている約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、親和性によって精製した後でさえ分離が極めて困難であった。様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、これらに限定されないが、抗体のヒンジ領域のアイソタイプに関連する構造的な差によるものである。実際に、ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、第二の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて通常観察されるレベルに有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ等（１９９３）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１種またはそれ以上の突然変異を有する抗体を包含し、このような抗体は、例えば生産の際に、望ましい抗体の形態の収量を改善することが望ましい場合がある。

本発明の抗体は、好ましくは、ベロシミューン^TMテクノロジーを用いて製造される。内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域が、それに対応するヒト可変領域で置換されているトランスジェニックマウスを対象の抗原で刺激して、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞系と融合させて不死化したハイブリドーマ細胞系を製造してもよいし、このようなハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択し、対象の抗原に特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を同定してもよい。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離して、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプの定常領域に連結させてもよい。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞中で生産することもできる。あるいは、抗原特異的なキメラ抗体、または、軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離してもよい。

一実施態様において、このようなトランスジェニックマウスは、１８個以下の機能的なヒト可変重鎖遺伝子、および、１２個の機能的なヒト可変カッパ軽鎖遺伝子を含む。その他の実施態様において、このようなトランスジェニックマウスは、３９個以下のヒト可変重鎖遺伝子、および、３０個のヒト可変カッパ軽鎖遺伝子を含む。さらにその他の実施態様において、このようなトランスジェニックマウスは、８０個以下のヒト可変重鎖遺伝子、および、４０個のヒト可変カッパ軽鎖遺伝子を含む。

一般的に、本発明の抗体は、固相に固定した状態または液相中のいずれかで抗原への結合を測定した場合、典型的には約１０^-9〜約１０^-12ＭのＫ_Dを示す極めて高い親和性を有する。

まず、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下で説明するように、この抗体は、ｈＩＬ−６Ｒに対する結合親和性、ｈＩＬ−６をブロックする能力、および／または、ヒトタンパク質に対する選択性などの望ましい特徴に関して特徴付けられ、さらに選択される。マウス定常領域は望ましいヒト定常領域で置換され、本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型または改変型のＩｇＧ４またはＩｇＧ１（例えば、配列番号２４２、２４３、２４４）を生成する。選択された定常領域は具体的な用途に従って様々であってよいが、高親和性の抗原結合、および、標的特異性の特徴は可変領域に存在する。

エピトープマッピングおよび関連技術
特定のエピトープに結合する抗体に関してスクリーニングするために、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ［１９８８，コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編集］で説明されているような慣例的なクロスブロッキング分析（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇａｓｓａｙ）を行ってもよい。その他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ２４８：４４３〜６３）、または以下の実施例で説明されているようなペプチド切断による解析が挙げられる。それに加えて、エピトープの切り出し、エピトープの抽出、および、抗原の化学修飾のような方法を用いてもよい（Ｔｏｍｅｒ（２０００）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ：９：４８７〜４９６）。

改変援用プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ＡｓｓｉｓｔｅｄＰｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＭＡＰ）は、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡｎｔｉｇｅｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＡＳＡＰ）としても知られており、これは、同じ抗原に対して向けられた膨大な数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的または酵素的に改変された抗原表面への抗体それぞれの結合プロファイルの類似性に従って類別する方法である（米国特許出願公開番号２００４／０１０１９２０）。それぞれカテゴリは、その他のカテゴリによって提示されるエピトープと明確に異なる固有のエピトープを特徴とするものもあるし、または、それらと部分的にオーバーラップしている固有のエピトープを特徴とするものもある。この技術によって、遺伝学的に同一な抗体の迅速なフィルタリングが可能になり、従って、遺伝学的に別個の抗体に焦点を合わせて特徴付けできるようになる。ハイブリドーマのスクリーニングに適用した場合、ＭＡＰは、望ましい特徴を有する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にする可能性がある。ＭＡＰを用いて、結合するエピトープごとに分類した抗体のグループに本発明のｈＩＬ−６Ｒ抗体を分類してもよい。

固定化された抗原の構造を変更するのに有用な物質は、例えばタンパク質分解酵素のような酵素、および、化学物質である。抗原タンパク質は、バイオセンサーチップ表面、または、ポリスチレンビーズのいずれかに固定されていてもよい。後者は、例えば、多重式のルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）^TM検出分析（ルミネックス社（ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ．），テキサス州）のような分析で処理することができる。ルミネックス^TMは、１００種までの異なるタイプのビーズを用いて多重分析を実施できる能力があるため、ルミネックス^TMは、ほぼ無限の様々な改変を有する抗原表面を提供するため、抗体エピトーププロファイリングにおいてバイオセンサー分析を超える改善された解決法となっている。

治療のための投与および調合物
本発明に係る治療用物質の投与は、適切な担体、賦形剤、および、改善された移動、送達、耐性などを提供するために調合物に包含されるその他の物質と共に投与されると予想される。多数の適切な調合物が、あらゆる薬剤師に知られている処方集である：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（第１５版，マック・パブリッシング・カンパニー（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ），イーストン，ペンシルベニア州，１９７５）、具体的にはそのなかのＢｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒによる第８７章で確認することができる。このような調合物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）を含む小胞（例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TM））、ＤＮＡ複合体、無水の吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルション状のカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、および、カーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。調合物中の活性成分が調合によって不活性化されず、調合物が生理学的に適合するものであり、投与経路に耐性を有するものであれば、前述のあらゆる混合物が、本発明に係る治療および療法において適切であり得る。Ｐｏｗｅｌｌ等．ＰＤＡ（１９９８）ＪＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８〜３１１、および、そのなかの、薬剤師にとって周知の賦形剤および担体に関する追加の情報についての用例も参照。

本発明の方法および組成物をどのように製造し使用するかについての詳細な開示および説明が当業者に提供されるように、以下の実施例を記載するが、発明者等が彼等の発明とみなすものの範囲を限定することは目的としない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするための努力がなされてきたが、ある程度の実験誤差および偏差も含まれると予想される。特に他の指定がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は、大気圧かまたはほぼ大気圧である。

実施例１．ヒトＩＬ−６受容体に対するヒト抗体の生成
齧歯類の免疫化は、当業界既知のあらゆる方法によって行うことができる（例えば、上記のＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）；ＭａｌｉｋおよびＬｉｌｌｅｈｏｊ，Ａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：アカデミックプレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ），１９９４，カリフォルニア州）を参照。その他の好ましい実施態様において、ｈＩＬ−６Ｒ抗原を、ヒトＩｇ重鎖可変領域とカッパ軽鎖可変領域との両方をコードするＤＮＡ遺伝子座を含むマウス（ベロシミューン^TM、リジェネロン・ファーマシューティカルズ社；ＵＳ６，５９６，５４１）に、免疫反応を刺激するためのアジュバントと共に直接投与した。このようなアジュバントとしては、完全および不完全フロインドアジュバント、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント系（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、または、ＲＩＢＩ（ムラミールジペプチド）（ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ（２０００，ニュージャージー州）によるＯ'ＨａｇａｎのＶａｃｃｉｎｅＡｄｊｕｖａｎｔを参照）が挙げられる。このようなアジュバントは、局所的なデポー剤中に抗原を隔離することによってポリペプチドの迅速な分散を予防することができ、さらにこれらは、宿主の免疫反応を刺激することができる因子を含んでいてもよい。一実施態様において、ｈＩＬ−６Ｒは、ｈＩＬ−６Ｒ遺伝子を含み、宿主細胞のタンパク質発現機構を用いてｈＩＬ−６Ｒを発現してインビボで抗原ポリペプチドを生産することができるＤＮＡプラスミドとして間接的に投与される。両方のアプローチにおいて、免疫化のスケジュールは、２〜３週間の間隔で数回の投与を必要とする。抗体免疫反応は、標準的な抗原特異的なイムノアッセイによってモニターされる。動物がそれらの最大の免疫反応に達したら、抗体を発現するＢ細胞を回収し、それらの生存能力を保存するためにマウス骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成した。機能的に望ましいモノクローナル抗体を選択するために、ハイブリドーマ細胞、または、トランスフェクションされた細胞の調整培地を、特異性、抗原−結合親和性、および、ｈＩＬ−６Ｒに結合するｈＩＬ−６をブロックする効力に関してスクリーニングした（以下で説明する）。

実施例２．脾細胞からの直接的な単離によって生成した抗ｈＩＬ６Ｒ抗体
ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、単一の抗原陽性のＢ細胞から直接単離することができる。簡単に説明すると、ｈＩＬ−６Ｒαで免疫化されたトランスジェニックマウスを殺し、脾細胞を回収した。溶解させて赤血球を除去し、続いて回収した脾細胞をペレット化した。まず再懸濁した脾細胞をヒトＩｇＧ、ＦＩＴＣ−抗ｍＦｃ、および、ビオチン−ＩＬ６Ｒａのカクテルと１時間インキュベートした。染色した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次にヒトおよびラットＩｇＧ、ＡＰＣ−抗ｍＩｇＭ、および、ＳＡ−ＰＥのカクテルで１時間染色した。染色した細胞をＰＢＳで一回洗浄し、ＭｏＦｌｏ（サイトメーション（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ））でのフローサイトメトリーによって解析した。各ＩｇＧ陽性、ＩｇＭ陰性、および、抗原陽性のＢ細胞を選別し、９６ウェルプレートの別個のウェルで平板培養した。これらのＢ細胞に関する抗体遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを、Ｗａｎｇ等（２０００）（ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２４４：２１７〜２２５）によって説明されている方法に従って行った。簡単に説明すれば、それぞれ単一のＢ細胞に関するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって合成した。次に、それぞれ生じたＲＴ産物をより分け、２つの９６ウェルプレート上の２つの対応するウェルに移した。まず、得られたＲＴ産物の一方のセットを、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域のリーダー配列に特異的な５'ディジェネレートプライマーと、マウス重鎖の定常領域に特異的な３'プライマーとを用いたＰＣＲによって増幅し、アンプリコンを形成した。次にこのアンプリコンを、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域の配列のフレームワーク１に特異的な５'ディジェネレートプライマーセットと、マウス重鎖の定常領域に特異的なネステッド３'プライマーとを用いて再度ＰＣＲで増幅した。得られたＲＴ産物の他方のセットを、まず、ヒトカッパ軽鎖可変領域のリーダー配列に特異的な５’ディジェネレートプライマーと、マウスカッパ軽鎖の定常領域に特異的な３’プライマーとを用いてＰＣＲで増幅し、アンプリコンを形成した。次にこのアンプリコンを、ヒトカッパ軽鎖可変領域の配列のフレームワーク１に特異的な５’ディジェネレートプライマーセットと、マウスカッパ軽鎖の定常領域に特異的なネステッド３’プライマーとを用いて再度ＰＣＲで増幅した。重鎖および軽鎖のＰＣＲ産物を、それぞれＩｇＧ１重鎖の定常領域、および、カッパ軽鎖の定常領域を含むＳａｐＩ−直線状抗体ベクターにクローニングした。重鎖プラスミドは、重鎖発現カセットの両端にｌｏｘ２２７２部位、および、ｌｏｘ５１１部位を有する。加えて、重鎖プラスミド中のｌｏｘ２２７２のすぐ下流に、プロモーター、および、開始ＡＴＧが欠失したハイグロマイシン耐性遺伝子がある。またハイグロマイシン耐性遺伝子は、下流のｅＧＦＰ遺伝子にＩＲＥＳ配列を介して転写可能に連結している。軽鎖プラスミドは、軽鎖発現カセットの両端にｌｏｘＰ部位、および、ｌｏｘ２２７２部位を有する。加えて、軽鎖プラスミドは、ｌｏｘ２２７２部位におけるＡＴＧの直前にＳＶ４０プロモーターを有しており、これは、適切な宿主細胞に統合されたら、軽鎖プラスミドからのｌｏｘ２２７２の近位にあるＳＶ４０プロモーターおよび開始ＡＴＧが、適切なリーディングフレーム内の重鎖プラスミド中でハイグロマイシン耐性遺伝子と隣接し、ハイグロマイシン耐性およびｅＧＦＰ遺伝子の転写および翻訳が可能になるようにするためである。次に、重鎖可変領域の配列を有する精製した組換えプラスミド、および、同じＢ細胞由来の軽鎖可変領域の配列を有するプラスミドを連結し、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドと共に改変されたＣＨＯ宿主細胞系にトランスフェクションさせた。改変されたＣＨＯ宿主細胞系は、５’から３’にかけて、転写活性を有する遺伝子座にｌｏｘＰ部位、ｅＣＦＰ、ｌｏｘ２２７２部位、ＤｓＲｅｄ、および、ｌｏｘ５１１部位を含む。その結果、宿主であるＣＨＯ細胞は、フローサイトメトリーによって、青色が陽性細胞、赤色が陽性細胞、および、緑色が陰性細胞のように単離することができる。重鎖および軽鎖遺伝子を発現する組換えプラスミドが、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドと共にトランスフェクションされると、Ｃｒｅリコンビナーゼが介在する部位特異的な組換えにより、ｌｏｘ部位を含む染色体の遺伝子座における抗体プラスミドの統合、および、ｅＣＦＰおよびＤｓＲｅｄ遺伝子の置換が起こる。次に組換え体を、フローサイトメトリーによって、青色が陰性細胞、赤色が陰性細胞、および、緑色が陽性細胞のように単離することができる。従って、重鎖可変領域の配列を有する組換えプラスミド、および、同じＢ細胞由来の軽鎖可変領域の配列を有するプラスミドでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、フローサイトメトリーによってより分け、青色の陰性、赤色の陰性、および、緑色の陽性表現型を示す適切な組換え体を単離し、単離されたクローンから安定な組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞系を確立した。

実施例３．抗原結合親和性の決定
上述の選択された抗体に結合する抗原のＫ_Dを、リアルタイムのバイオセンサー表面プラズモン共鳴分析（ビアコア^TM）での表面動力学によって決定した。より具体的には、ビアコア^(R)２０００またはビアコア^(R)３０００を用いてヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の親和性を測定した。抗体を抗マウスＩｇＧの表面で捕捉し、様々な濃度の組換えｈＩＬ−６Ｒタンパク質に単量体または二量体の形態のいずれかで晒した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ^TMソフトウェアを用いた動態解析を行い、会合および解離速度定数を得た。

また、ハイブリドーマ調整培地または精製したタンパク質のいずれかに関するｈＩＬ−６Ｒに対する抗体の結合親和性もプレートベースの競合イムノアッセイで測定した。ウシＩｇＧを枯渇させたハイブリドーマ細胞の調整培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））から、タンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて抗体タンパク質を精製した。競合ＥＬＩＳＡに関して、簡単に説明すれば、異なるレベルの一定量の抗体を、抗原タンパク質であるｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃの連続希釈液と０〜１０μｇ／ｍｌの範囲で予備混合し、室温で２時間インキュベートし、抗体と抗原との間の偽性の結合平衡を達成した。次にこれらの溶液を、９６ウェルのｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃでプレコーティングしたプレートに移して、混合物中の遊離の抗体を、ｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃで被覆したプレートに結合させた。このプレートを典型的にＰＢＳ溶液中の１〜２μｇ／ｍｌのｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃタンパク質で４℃で一晩コーティングして、続いてＢＳＡで非特異的にブロックした。溶液中の過量の抗体を洗浄して取り除いた後、プレートに結合した抗体を、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡポリクローナル抗体試薬で検出し、比色基質または化学発光基質のいずれかを用いて発現させた。シグナルの溶液中の抗原濃度に対する依存性を、プリズム（Ｐｒｉｓｍ^TM）ソフトウェア（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ））を用いた４−パラメートルの適合解析で解析し、ＩＣ₅₀として報告した。さらに、定常状態の液相によるＫｉｎｅｘａ^TM機器（サピダイン社（ＳａｐｉｄｙｎｅＩｎｃ．））を用いて競合イムノアッセイも行った。

表１に、結果を示す（コントロール：ヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト化モノクローナル抗体（米国特許第５，８１７，７９０号の配列番号６９および７１）。抗体（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列）：ＶＱ８Ａ９−６（３、１１）；ＶＱ８Ｆ１１−２１（１９、２７）；ＶＶ７Ｇ４−１（３５、４３）；ＶＶ７Ｇ４−１０（５１、５９）ＶＶ６Ｃ１０−１（６７、７５）；ＶＶ６Ｃ１０−３（８３、９１）；ＶＶ６Ｃ１０−４（９９、１０７）；ＶＶ６Ｆ１２−１１（１１５、１２３）；ＶＶ９Ａ６−１１（１３１、１３９）；ＶＶ６Ａ９−５（１４７、１５５）、ＶＶ３Ｄ８−４（１６３、１７１）；ＶＶ１Ｇ４−７（１７９、１８７）；２４８９８２−１３−１−Ｅ５（１９５、２０３）；２４８９８２−１３−２−Ａ９（２１１、２１９）。単量体および二量体のＫ_Dは、ビアコア^TMによって決定し；溶液のＫ_DはＫｉｎｅｘａ^TMによって決定し；ＩＣ₅₀はＥＬＩＳＡ分析によって決定した（ｎ．ｄ．＝未測定）。

実施例４．ｈＩＬ−６活性の中和
本発明の抗ｈＩＬ−６Ｒ抗体のｈＩＬ−６をブロックする活性を、ｈＩＬ−６をブロックするイムノアッセイ、インビトロでのｈＩＬ−６依存性の細胞増殖に関する生物学的試験、および、表面プラズモン共鳴（ビアコア^TM）によってスクリーニングした。イムノアッセイを用いて、試験された抗体の、ｈＩＬ−６Ｒに結合するｈＩＬ−６をブロックする能力をスクリーニングし、さらに、インビトロでの生物学的試験を用いて、抗体の、ｈＩＬ−６Ｒが介在する細胞シグナル伝達を中和する効力を決定した。

イムノアッセイに関して、ｈＩＬ−６組換えタンパク質を、ＰＢＳ緩衝液中で９６ウェルプレート上に４℃で一晩コーティングした。このプレートを用いて、抗体サンプル溶液から遊離のｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃを捕捉し、捕捉されたｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃの量を標準曲線に従って定量した。このサンプル溶液は、一定量のｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃ組換えタンパク質（１００ｐＭ）、および、様々な量の抗体（未精製のハイブリドーマ調整培地中で、または、０〜約５０ｎＭの範囲の連続希釈液中の精製した抗体タンパク質としてのいずれかで）で構成される。この抗体−抗原混合物を室温で〜２時間インキュベートして、抗体−抗原結合を平衡状態にした。次に、遊離のｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃを測定するために、平衡化させたサンプル溶液をｈＩＬ−６でコーティングしたプレートに移した。結合させてから１時間後、プレートを洗浄し、結合したｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃを、ＨＲＰ結合ヤギ抗ｈＦｃポリクローナル抗体（ジャクソン・イムノ・リサーチ（ＪａｃｋｓｏｎｌｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を用いて検出し、ＴＭＢ基質（ＢＤファーミンゲン（ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ））を用いて展開させた。ＩＣ₅₀を、プレートに結合したｈＩＬ−６リガンドに対する検出可能なＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃを５０％減少させるのに必要な抗体の量として決定した。表２の第一行に結果を示す。

加えて、試験された抗体の、ｈＩＬ−６Ｒ受容体に結合するｈＩＬ−６をブロックする能力を表面プラズモン共鳴を用いて決定した。精製した抗原ｈＩＬ−６Ｒ−ｈＦｃ分子を、アミンカップリングを介してＣＭ−５表面に２５０ＲＵの密度で固定されたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体によって捕捉した。受容体表面上にｈＩＬ−６溶液（０．２５ｍｌ，５０ｎＭ）を注入し、結合したｈＩＬ−６を記録した（第一のＩＬ−６注入）。次に、３ＭのＭｇＣｌ₂のパルスを用いて結合したｈＩＬ−６を除去し、続いて緩衝液を調整した。ハイブリドーマ調整培地中の抗ｈＩＬ６Ｒ抗体を捕捉された受容体表面上に注入し、続いてｈＩＬ−６の第二の注入を行った。予め形成された抗体と受容体との複合体に起因するｈＬ−６結合の減少のパーセントを、ｈＩＬ−６ブロッカーを非ブロッカーと区別するためのスコアとして用いた（表２の第二行）。

ｈＩＬ−６Ｒ抗体の、インビトロでｈＩＬ−６活性をブロックする能力を、ｈＩＬ−６依存性の骨髄腫系ＸＧ−１で測定した。ｈＩＬ−６を含む培地中で維持したＸＧ−１細胞をｈＩＬ−６非含有の培地で２回洗浄し、ｈＩＬ−６非含有の培地中で〜２４時間培養し、残留したｈＩＬ−６を枯渇させた。次に、この飢餓細胞を沈降させ、培地中に４×１０⁵細胞／ｍｌで再懸濁し、９６ウェルの組織培養プレートで２０，０００細胞／ウェルで平板培養した。精製した抗体タンパク質を培地で連続希釈し、０〜５０ｎＭの範囲の濃度で平板培養した細胞に添加した。その後、このウェルに組換えｈＩＬ−６を８ｐＭの最終濃度になるまで添加した。加湿した５％ＣＯ₂インキュベーター中で細胞を３７℃で〜７２時間増殖させた。増殖期間の最後に、ＣＣＫ−８キット（同仁堂化学研究所（Ｄｏｊｉｎｄｏ），日本）を用いて生きた細胞を測定した。上述のようにしてＩＣ₅₀を決定し、表２の第三行に報告した。

また、ｈＩＬ−６Ｒ抗体の、ｈＩＬ−６活性をブロックする能力も、インビトロでｈＩＬ−６反応性のヒト肝癌細胞系のＨｅｐＧ２で測定した。ＨｅｐＧ２細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子に連結したＳＴＡＴ３（転写物３のシグナルトランスデューサー、および、アクチベーター）反応要素を含むレポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をトリプシン処理し、沈降させ、培地に約２．５×１０⁵細胞／ｍｌで再懸濁し、９６−ウェルの組織培養プレート中で２０，０００細胞／ウェルで平板培養した。精製した抗体タンパク質を培地で連続希釈し、平板培養した細胞に０〜１００ｎＭの範囲の濃度で添加した。その後、このウェルに組換えｈＩＬ−６を５０ｐＭの最終濃度になるまで添加した。加湿した５％ＣＯ₂インキュベーター中で細胞を３７℃で６時間インキュベートした後に応答を測定した。Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ^TMルシフェラーゼ分析システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。上述のようにしてＩＣ₅₀を決定し、表２の第四行に報告した。

実施例５．結合するエピトープの多様性
抗体結合の競合イムノアッセイを、コントロールとしてヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト化抗体を用いて行った。簡単に説明すれば、９６ウェルの免疫吸着プレートを、２０ｎｇ／ウェルのｈＩＬ−６Ｒ組換えタンパク質で４℃で一晩コーティングした。ＢＳＡで非特異的な結合をブロックした後、プレートの半分には、ウェルあたりコントロール５００ｎｇを添加することによってｈＩＬ−６Ｒ結合部位をコントロール抗体の結合で飽和させ、プレートのもう一方の半分には、結合緩衝液だけを添加した。室温で３時間結合させた後、精製した抗体を、ウェル中に（元から存在するコントロール抗体を含んで、および、それらを含まないで）最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで注入した。さらに１時間結合させた後、遊離の抗体を洗浄して除き、プレートに結合した抗体を、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ、ポリクローナル抗体で検出し、発色性のＨＲＰ基質を用いてプレートを発現させ、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。以下の表３に、抗ｈＩＬ−６Ｒ抗体の結合からコントロール抗体の存在を差し引いたパーセンテージを列挙した。類似の実験を、表面プラズモン共鳴技術を用いて行った（表３）。両方の方法から、矛盾のない結果が得られた。抗体ＶＱ８Ｆ１１、ＶＶ３Ｄ８、ＶＶ６Ａ９、ＶＶ６Ｃ１０−１は、コントロール抗体とオーバーラップするエピトープと結合した；一方で、抗体ＶＱ８Ａ９、ＶＶ１Ｇ４、ＶＶ６Ｆ１２、ＶＶ７Ｇ４、ＶＶ９Ａ６、および、ＶＶ６Ｃ１０−３は、抗原との結合が、コントロール抗体によってブロックされなかったため、別個のエピトープと結合しているようであった。部分的な競合は、エピトープがオーバーラップしていない可能性があるとしても、第一の抗体結合による立体障害の結果生じた可能性がある。

実施例６．異種間の結合特性
サルＩＬ−６Ｒ組換えタンパク質に対する交叉反応性に関して、４種の抗体をビアコア^TM技術を用いて試験した。簡単に説明すれば、抗ｈＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体を約７５ＲＵの密度で提示させるために、表面にヤギ抗マウスＦｃポリクローナル抗体が固定されたバイオセンサーチップを用いた。組換えヒトまたはサルの単量体ＩＬ−６Ｒタンパク質（カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｈｓ），細胞外ドメイン；配列番号２５１）を１．２５〜４０ｎＭの範囲の濃度で抗体表面上に注入した。これら抗体に対する受容体の結合、および、結合した複合体の解離をリアルタイムでモニターした。会合速度定数（ｋａ）、および、解離速度定数（ｋｄ）の両方を得て、Ｋ_Dを計算した（表４）。

４種の試験された抗体のなかでも、ＶＱ８Ｆ１１、ＶＶ６Ａ９およびＶＱ８Ａ９がサル受容体に強く反応しており、Ｋ_D値は、それぞれヒト受容体結合とは約１．５〜約３倍までの差があった。ＶＶ１Ｇ４は、コントロール抗体でブロックされなかったものであり（表３）、２４１ｐＭのＫ_Dでヒト受容体に強く結合するにもかかわらずサル受容体への結合を示さなかった。

実施例７．結合親和性における定常領域の作用
マウスＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４（野生型、および、改変型）を有する４種の抗体の単量体のｈＩＬ−６Ｒに対する結合親和性を上述のようなビアコア^TMを用いてを決定した（ただし、ｈＩｇＧ抗体を捕捉するためにヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体表面を用いた）。単量体のｈＩＬ−６Ｒを１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｎＭの濃度で注入した。さらに、抗体の、ｈＩＬ−６−依存性ＨｅｐＧ２／ＳＴＡＴ３シグナル伝達を中和する能力もルシフェラーゼ分析（ＩＣ₅₀）で決定した。異なるＩｇＧアイソタイプのＩＣ₅₀は類似しており、これは、抗原への抗体親和性にアイソタイプの影響がないことを示唆している。

Claims

配列番号１９／２７または１４７／１５５の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）／軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）対を含む、ヒトインターロイキン−６受容体（ｈＩＬ−６Ｒ）と特異的に結合する、抗体または抗原結合フラグメント。