ES2968078T3 - Medios de cultivo para células madre - Google Patents

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Johannes Carolus Clevers
Toshiro Sato
Ortega Meritxell Huch
Wouter Richard Karthaus
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Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
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Description

DESCRIPCIÓN
Medios de cultivo para células madre
CAMPO TÉCNICO
La invención está en el campo de los medios y métodos de cultivo de células madre, en particular medios y métodos de cultivo para expandir poblaciones de células madre, por ejemplo, células madre epiteliales humanas.
ANTECEDENTES
Existe un gran interés en los medios de cultivo y los métodos para ampliar las poblaciones de células madre. Las poblaciones de células madre tienen muchos usos. Por ejemplo, las células madre y su progenie diferenciada se pueden utilizar en ensayos celulares, detección de fármacos y ensayos de toxicidad. Las células madre también muestran utilidad en terapias basadas en células, como en la medicina regenerativa para el tratamiento de tejidos dañados. También pueden actuar como fuente de células diferenciadas para fines de trasplante, por ejemplo. trasplante de células beta pancreáticas para el tratamiento de la diabetes, etc. Además, los medios de cultivo celular eficientes son importantes para proporcionar y mantener poblaciones de células con fines de investigación.
También existe interés en medios de cultivo y métodos para cultivar células madre para la formación, mantenimiento y expansión de organoides, como criptas de vellosidades intestinales, organoides gástricos o pancreáticos. Un organoide comprende células madre, como las células madre epiteliales, que conservan su fenotipo indiferenciado y sus propiedades de autorrenovación, pero también tienen una progenie diferenciadora que crece hasta formar estructuras similares a tejidos. De manera similar a las poblaciones de células relacionadas o idénticas, las criptas de vellosidades y los organoides gástricos o pancreáticos, que se aproximan más estrechamente a la fisiología básica de su tejido de origen, pueden usarse en ensayos de toxicidad o ensayos para fármacos o complementos alimenticios. También pueden ser útiles para cultivar patógenos que actualmente carecen de cultivos de tejidos o modelos animales adecuados. Además, tales organoides pueden ser útiles en medicina regenerativa, por ejemplo, en la reparación del epitelio intestinal después de la radiación y/o después de la cirugía, o en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que padecen enfermedad inflamatoria intestinal.
Está claro que existen muchas aplicaciones clínicas y de investigación para las células madre y su progenie diferenciada. Para todas estas aplicaciones, los métodos de cultivo de células madre reproducibles son de suma importancia para proporcionar una cantidad adecuada de células de calidad adecuada. Por ejemplo, para una detección eficaz de fármacos, se deben controlar cuidadosamente las condiciones, lo que requiere métodos de cultivo precisos para controlar la diferenciación y proliferación de las células, de modo que se puedan generar poblaciones puras de células fenotípica y cariotípicamente idénticas. De manera similar, para las terapias basadas en células, en las que las células cultivadas pueden proporcionarse directamente a los pacientes, las células deben ser genética y fenotípicamente sólidas para evitar respuestas inmunitarias o destinos celulares indeseables cuando se proporcionan al paciente.
Aunque se han descrito una variedad de sistemas de cultivo para cultivar células madre epiteliales primarias, incluidas las células madre epiteliales intestinales (Bjerknes y Cheng, 2006. Methods Enzymol. 419: 337-83), hasta la fecha, no se ha establecido ningún sistema de cultivo a largo plazo que mantenga el potencial de diferenciación y la integridad fenotípica y genómica de las células madre epiteliales humanas.
La solicitud de patente internacional WO2010/090513 divulga un método para cultivar células madre epiteliales o fragmentos de tejido aislados. El método está optimizado para el cultivo de colon humano y criptas intestinales mediante la adición de Wnt-3a al medio. Esta fue la primera vez que se cultivaron cultivos de células madre intestinales humanas durante un período prolongado (hasta 3 meses) y proporcionó el primer sistema de cultivo de células madre intestinales humanas reproducible. Sin embargo, todavía existe la necesidad de medios y métodos de cultivo de células madre mejorados, en particular medios y métodos de cultivo de células madre humanas, que mejoren las tasas de proliferación, el tiempo de supervivencia y la integridad fenotípica y genómica de las células madre cultivadas en cultivo.
El documento WO 2010/090513 describe un medio de cultivo para células madre epiteliales y organoides que comprenden dichas células madre. Sato et al. (2011) Gastroenterology 141(5):1762-1772 describe la expansión a largo plazo de organoides epiteliales del colon humano, adenoma, adenocarcinoma y epitelio de Barrett. El documento WO 2012/014076 describe organoides hepáticos, sus usos y métodos de cultivo para su obtención. Zhu et al. (2011) Annual Review of Biomedical Engineering 13(1):73-90 describe estrategias químicas para la biología de células madre y la medicina regenerativa.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un medio de cultivo para expandir una población de células madre epiteliales adultas, en el que dicho medio de cultivo comprende:
i. cualquiera de R-espondina 1-4; y
ii. uno o más inhibidores de TGF-beta, en donde el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta si puede inhibir la señalización de TGF-beta en un ensayo celular en el que las células se transfectan de manera estable con una construcción de receptor que comprende el promotor PAI-1 humano.
La invención también proporciona un medio de cultivo para expandir una población de células madre epiteliales adultas, en el que dicho medio de cultivo comprende:
i. un agonista de Lgr5; y
ii. uno o más inhibidores de TGF-beta, en donde el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta si puede inhibir la señalización de TGF-beta en un ensayo celular en el que las células se transfectan de manera estable con una construcción de receptor que comprende el promotor PAI-1 humano.
La invención también proporciona una composición que comprende un medio de cultivo de la invención y una matriz extracelular o una matriz 3d que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular como las integrinas, por ejemplo, una matriz extracelular que contiene laminina como MatrigelTM. (BD Biosciences).
La invención también proporciona un recipiente herméticamente cerrado que contiene un medio de cultivo o una composición de la invención.
La invención también proporciona el uso de un medio de cultivo de la invención para expandir una célula madre epitelial adulta, una población de células madre epiteliales adultas, un fragmento de tejido u un organoide.
La invención también proporciona un método para expandir una única célula madre epitelial adulta, una población de células madre epiteliales adultas o un fragmento de tejido, preferiblemente para obtener un organoide, en donde el método comprende cultivar la única célula madre epitelial adulta o una población de células madre epiteliales adultas en un medio de cultivo de la invención.
La invención también proporciona un método que comprende: cultivar la célula madre epitelial adulta, la población de células madre epiteliales adultas o fragmentos de tejido en un primer medio de expansión de la invención; y continuar cultivando la célula madre epitelial adulta, la población de células madre epiteliales adultas o fragmentos de tejido y reponer el medio con un medio de diferenciación, en donde el medio de diferenciación no comprende uno o más de, preferiblemente todos, los factores seleccionados de: un inhibidor TGF-beta, un inhibidor de p38, nicotinamida y Wnt. La invención también proporciona un organoide o población de células que se puede obtener mediante el método de la invención.
La invención también proporciona una composición que comprende:
i) uno o más organoides o población de células de la invención; y
ii) un medio de cultivo de la invención y/o una matriz extracelular.
La invención también proporciona el uso de un organoide, o una población de células, o una composición de la invención para la detección de fármacos, la validación de dianas, el descubrimiento de dianas, la toxicología, las pruebas de toxicología o modelos de células/órganosex vivo,por ejemplo, para su uso como un modelo de enfermedad
La invención también proporciona un organoide, o una población de células, o una composición de la invención para uso en medicina o diagnóstico, opcionalmente en donde la medicina es medicina personalizada o medicina regenerativa. La invención también proporciona un método para detectar un fármaco o cosmético terapéutico o profiláctico, en el que el método comprende:
cultivar un organoide o una población de células de la invención, por ejemplo con un medio de cultivo de la invención; exponer dicho organoide o población de células a una o una biblioteca de moléculas candidatas; evaluar dicho organoide o población de células para detectar cualquier efecto, por ejemplo cualquier cambio en una célula, tal como una reducción o pérdida de la proliferación, un cambio morfológico y/o muerte celular; y 3a identificar la molécula candidata que causa dichos efectos como fármaco o cosmético potencial.
RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN
La invención se refiere a medios y métodos de cultivo mejorados para células madre, en particular células madre epiteliales humanas, y organoides que comprenden dichas células madre, que proporcionan ventajas significativas sobre los medios y métodos de cultivo conocidos. La invención también se refiere a suplementos, composiciones y usos de medios de cultivo relacionados.
Por consiguiente, la divulgación describe un medio de cultivo para expandir una población de células madre, en el que el medio de cultivo comprende al menos uno o más inhibidores que se unen y reducen la actividad de una o más dianas de serina/treonina proteína quinasa. Esto tiene el efecto de permitir un crecimiento continuo durante al menos tres meses a una tasa de expansión de aproximadamente cinco veces por semana. La serina/treonina proteína quinasa se selecciona preferiblemente del grupo que comprende: receptor quinasa 1 de TGFbeta, ALK4, ALK5, ALK7, p38. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que la inclusión de inhibidores de ciertas quinasas serina/treonina en medios de cultivo mejoró significativamente el rendimiento de los medios de cultivo en la expansión de una población de células madre. La población de células madre puede ser células normales (sanas) o células enfermas (por ejemplo, células madre cancerosas). Específicamente, se demostró que los inhibidores de p38 y ALK proporcionaban la mayor mejora de todos los compuestos probados. Esto es inesperado porque no se conoce ningún mecanismo que prediga cómo podrían funcionar estos inhibidores en particular. De hecho, varios de los inhibidores de moléculas pequeñas que se eligieron para ser probados y que funcionan en vías similares no tuvieron ningún efecto sobre el método. Por lo tanto, el experto no podría haber predicho que los inhibidores de estas quinasas particulares tendrían una mejora tan marcada en el medio de cultivo. Aún se observó una mejora adicional cuando se añadieron juntos al medio de cultivo dos inhibidores, por ejemplo, un inhibidor de p38, tal como SB202190 y un inhibidor de ALK, tal como A83-01.
Para llegar a esta conclusión, los inventores investigaron vías de señalización que se sabe que están subvertidas en ciertos cánceres, por ejemplo, cáncer colonrectal. Plantearon la hipótesis de que estas vías, que afectan el destino celular en el cáncer, también pueden desempeñar un papel en la determinación del destino celular en condiciones de cultivo. Cabe destacar, sin embargo, que esta hipótesis era enteramente nueva; dado el estado de la técnica, no había forma de predecir el efecto de ninguno de estos compuestos adicionales en el medio de cultivo, y no había ninguna expectativa particular de que alguno de estos compuestos pudiera tener un efecto beneficioso.
En un primer experimento de detección, se probaron una serie de vitaminas, hormonas y factores de crecimiento en combinación con medios de cultivo de células madre estándar. Inicialmente se identificó que la gastrina y la nicotinamida daban como resultado condiciones de cultivo significativamente mejoradas. Al incorporar estos factores en las condiciones de cultivo estándar, se realizó un segundo experimento de detección, en el que se probaron inhibidores de moléculas pequeñas relacionados con vías de señalización relevantes, como ERK, p38, JNK, PTEN, ROCK y Hedgehog. Se eligieron estas vías porque se sabía que estaban subvertidas en ciertos cánceres.
Intentos anteriores de cultivar células madre intestinales humanas con el medio de cultivo de células madre descrito anteriormente (que comprende factor de crecimiento epidérmico (EGF o (“E”), noggin (“N”) y R-espondina (“R”), denominado en el presente documento “ENR”) optimizado con Wnt-3A (“W ”) (denominado en el presente documento medio “WENR”), han dado como resultado la desintegración de la mayoría de las células en 7 días, y muy pocas células sobreviven más de 1 mes. Estos intentos también han estado sujetos a tiempos de proliferación lentos, irregularidades cromosómicas y cambios morfológicos desde la gemación hasta las estructuras quísticas. Por “quístico” se entiende que el organoide es mayoritariamente esférico. Por “brotación” se entiende que el organoide tiene múltiples regiones que crecen a partir de la estructura básica. No siempre es necesariamente una ventaja tener estructuras en gemación, aunque las estructuras en gemación típicamente tienen un área de superficie mayor y típicamente se parecen más al tejidoin vivocorrespondiente.
Los inventores demostraron que el método mejorado permitía el crecimiento continuo de las células madre durante al menos siete meses.
El nuevo método también aumentó la velocidad de proliferación de las células en la población ampliada. Esto es claramente de gran utilidad cuando se cultivan células con fines comerciales y terapéuticos.
El nuevo método también aumentó la calidad de las células en la población ampliada. Esto es una gran ventaja porque las aplicaciones clínicas y de investigación de las células madre y su progenie diferenciada requieren métodos de cultivo de células madre reproducibles que proporcionen poblaciones de células de alta calidad. Generalmente, la expansiónin vitrode células madre tiene como objetivo proporcionar una población de células que se parezcan lo más posible a sus homólogasin vivo.Esta propiedad se denomina en el presente documento “integridad genómica y fenotípica” de las células.
Por primera vez, los inventores han descubierto que es posible expandir células madre epiteliales humanas en cultivo, sin pérdida de integridad genómica y fenotípica, durante al menos 7 meses (véase Ejemplo 1). En las condiciones de cultivo mejoradas de la invención, los organoides intestinales humanos mostraron estructuras organoides en ciernes, en lugar de las estructuras quísticas observadas en condiciones de cultivo anteriores. Las diseminaciones en metafase de organoides de más de 3 meses revelaron consistentemente 46 cromosomas en cada una de las 20 células extraídas de tres donantes diferentes. Además, el análisis de microarrays reveló que las células madre en cultivo poseían firmas moleculares similares a las de las células de las criptas intestinales, incluidos los genes de las células madre intestinales.
Los inventores también demostraron que los organoides intestinales humanos generados por los medios y métodos de la presente invención imitaban las decisiones del destino celularin vivoen respuesta a factores externos. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que la inhibición de Notch en las células madre intestinales detiene la proliferación epitelial intestinal e induce la hiperplasia de las células caliciformesin vivo.Los inventores pudieron demostrar que los organoides intestinales de la invención, cuando se trataron con un inhibidor Notch, dejaron de proliferar y la mayoría de las células se convirtieron en células caliciformes en 3 días. Se observaron ventajas similares al incluir un inhibidor de TGF-beta y/o un inhibidor de p38 en medios de cultivo para expandir células madre u organoides de otros tejidos epiteliales, como estómago, páncreas, hígado y próstata (véase los Ejemplos). Los tejidos pueden ser tejidos normales (sanos) o tejidos enfermos, por ejemplo, tejidos cancerosos o tejidos que muestran un fenotipo de fibrosis quística.
Estos resultados muestran la espectacular mejora en la integridad genómica y fenotípica de las células madre y organoides producidos por los métodos y medios de la presente invención en comparación con los métodos y medios anteriores.
Por lo tanto, la divulgación describe un medio de cultivo para expandir y/o diferenciar una población de células madre adultas, en donde dicho medio de cultivo comprende:
i. cualquiera de R-espondina 1-4 y/o un imitador de R-espondina; y
ii. uno o más inhibidores que directa o indirectamente regulan negativamente la señalización de TGF-beta.
La invención también proporciona una composición que comprende un medio de cultivo según la invención y una matriz extracelular o una matriz 3D que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular tales como integrinas, por ejemplo, una matriz extracelular que contiene laminina como Matrigel™ (BD Biosciences).
La invención también proporciona un recipiente herméticamente cerrado que contiene un medio o composición de cultivo según la invención.
La invención también se refiere al uso de un medio de cultivo según la invención para expandir y/o diferenciar una célula madre, una población de células madre, un fragmento de tejido o un organoide.
La invención también se refiere a métodos para expandir una única célula madre, una población de células madre o un fragmento de tejido, preferiblemente para generar un organoide, en donde el método comprende cultivar la única célula madre o población de células madre en un medio de cultivo según la invención.
La invención también se refiere a organoides o poblaciones de células que se pueden obtener mediante los métodos de la invención.
La divulgación también se refiere a un organoide, preferiblemente obtenible mediante los métodos de la invención, que es un organoide tridimensional que comprende células epiteliales que rodean un lumen central, en el que opcionalmente las células epiteliales existen en distintos dominios de división y dominios de diferenciación.
La divulgación también se refiere a un organoide, preferiblemente obtenible mediante los métodos de la invención, que es un organoide tridimensional que comprende células epiteliales dispuestas en regiones de monocapas, monocapas opcionalmente plegadas y regiones de células estratificadas, y preferiblemente que es un organoide tridimensional, que comprende células epiteliales que rodean un lumen central, en el que opcionalmente las células epiteliales existen en distintos dominios de división y dominios de diferenciación.
La invención también se refiere a una composición que comprende:
i) uno o más organoides o población de células de la invención; y
ii) un medio de cultivo de la invención y/o una matriz extracelular.
La invención también se refiere a un organoide, una población de células o una composición según la invención para uso en detección de fármacos, validación de dianas, descubrimiento de dianas, toxicología, pruebas de toxicología, medicina personalizada, medicina regenerativa o modelos de células/órganosex vivo,para ejemplo para su uso como modelo de enfermedad.
La invención también se refiere a un organoide, una población de células o una composición según la invención, para su uso en el trasplante de dicho organoide, población de células o composición a un mamífero, preferiblemente a un ser humano.
La invención también se refiere a una población de células madre, u organoides que comprenden dichas células madre, que se han obtenido o se pueden obtener utilizando el medio de cultivo de la invención. Las células madre u organoides que comprenden dichas células madre se pueden usar, por ejemplo, con fines de trasplante u otras aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, las células madre u organoides que comprenden dichas células madre se pueden usar para la detección de fármacos, la validación de objetivos, el descubrimiento de objetivos, la toxicología y los exámenes toxicológicos, la medicina personalizada, la medicina regenerativa y los modelos de células/órganosex vivo,por ejemplo, modelos de enfermedades.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden un medio de cultivo de la invención.
La invención también se refiere a suplementos de medio de cultivo que comprenden un inhibidor según la invención.
La invención también se refiere a un recipiente herméticamente cerrado que comprende un medio de cultivo y/o un suplemento de medio de cultivo según la invención.
Los ingredientes específicos de los medios de cultivo, suplementos y composiciones de la invención se pueden variar según las necesidades y aplicaciones particulares. Asimismo, los pasos precisos de los métodos de la invención pueden variar según las necesidades y aplicaciones particulares.
Los medios de cultivo, suplementos, métodos, composiciones y usos según esta invención también pueden optimizarse mediante experimentación rutinaria. Por ejemplo, si un medio de cultivo, suplemento o composición no logra proporcionar el nivel deseado de expansión de células madre, variables tales como la cantidad de cada ingrediente en el medio de cultivo o suplemento, densidades de siembra, condiciones de cultivo, períodos de cultivo, etc. puede modificarse en experimentos posteriores. La cantidad de cada uno de los ingredientes descritos en este documento se puede optimizar independientemente de los otros ingredientes mediante optimización de rutina o se pueden agregar o eliminar uno o más ingredientes. Se puede probar la capacidad de un medio de cultivo para soportar la expansión de células madre probándolo junto con o en lugar de un medio o método de cultivo conocido.
Los medios de cultivo, suplementos, métodos, composiciones y usos de la invención se describen con más detalle a continuación. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de cultivo celular, biología molecular y microbiología, que están dentro del conocimiento de quienes trabajan en la técnica.
Hay numerosos libros de texto disponibles que brindan orientación sobre medios y métodos de cultivo de células de mamíferos, incluidos libros de texto dedicados a medios de cultivo y métodos para cultivar células madre. Dichos libros de texto incluyen 'Basic Cell Culture Protocols' de J. Pollard y J. M. Walker (1997), 'Mammalian Cell Culture: Essential Techniques' de A. Doyle y J. B. Griffiths (1997), 'Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques' por R. l. Freshney (2005), 'Basic Cell Culture Protocols' de C. Helgason y C. L. Miller (2005), 'Stem Cells: From Bench to Bedside' de A. Bongso (2005), 'Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide' por J. F. Loring, R. L. Wesselschrnidt y P. H. Schwartz (2007).
Las células madre y los reactivos de cultivo celular y los aparatos para uso en la invención están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Cellartis AB (Gotemburgo, Suecia), VitroLife AB (Kungsbacka, Suecia), GIBCO® (Invitrogen), Millipore Corporation (Billerica, Massachusetts), Sigma® (St. Louis, Missouri) y Biomol International L.P. (Exeter, Reino Unido).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describe un medio de cultivo para expandir una población de células madre, en donde el medio de cultivo comprende al menos uno o más inhibidores que se unen y reducen la actividad de una o más dianas de serina/treonina proteína quinasa, en donde el medio de cultivo tiene el efecto de permitir el crecimiento continuo de la población de células madre durante al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses o más.
Inhibidores
Un medio de cultivo utilizado según un primer aspecto de la invención comprende cualquier inhibidor que, directa o indirectamente, regule negativamente la señalización de TGF-beta o p38, tal como se reivindica. En una forma de realización preferida el medio de cultivo de la invención comprende un inhibidor que directa o indirectamente regula negativamente la señalización del TGF-beta, tal y como se reivindica. En algunas formas de realización, el medio de cultivo de la invención comprende un inhibidor que directa o indirectamente regula negativamente el TGF-beta y un inhibidor que directa o indirectamente regula negativamente la señalización de p38, como se reivindica. En una forma de realización adicional, el medio de cultivo de la invención comprende R-espondina o un imitador de R-espondina.
El uno o más inhibidores se dirige preferentemente a una serina/treonina proteína quinasa seleccionada del grupo que comprende: receptor quinasa 1 de TGF-beta, ALK4, ALK5, ALK7, p38. Un inhibidor de cualquiera de estas quinasas es aquel que efectúa una reducción en la actividad enzimática de cualquiera (o más) de estas moléculas. Anteriormente se ha demostrado que la inhibición de ALK y p38 quinasa está relacionada con el linfoma de células B (Bakkeb0 M Huse K, Hilden VI, Smeland EB, Oksvold MP, “TGF-beta-induced growth inhibition in B-cell lymphoma correlates with Smad1/5 signalling and constitutively active p38 MAPK”, BMC Immunol. 11:57, 2010). En esta publicación, se encontró que las líneas celulares sensibles a TGF-beta expresaban niveles más altos de ALK-5 en la superficie celular y que la fosforilación constitutiva de p38 estaba restringida a las líneas celulares sensibles a TGF-beta. La inhibición de p38 MAPK condujo a una sensibilidad reducida al TGF-beta, lo que sugiere que la fosforilación de Smad1/5 es importante para los efectos antiproliferativos del TGF-beta en el linfoma de células B. Los resultados indican un papel de p38 MAPK en la regulación de los efectos antiproliferativos inducidos por TGF-beta.
Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, los presentes inventores proponen que ALK y p38 pertenecen a una vía que regula negativamente el mantenimiento a largo plazo de las células madre, en particular, las células madre epiteliales humanas. Los inventores plantean la hipótesis de que los inhibidores que actúan a cualquier nivel en esta vía, incluyendo, por ejemplo, inhibiendo la señalización de Smadl/5, también serían beneficiosos para el cultivo de células madre. Los Smads desempeñan un papel clave en la señalización de TGF-beta.
En algunas formas de realización, un inhibidor de la divulgación se une y reduce la actividad serina/treonina proteína quinasa seleccionada del grupo que comprende: receptor quinasa 1 de TGF-beta, ALK4, ALK5, ALK7, p38.
El medio de cultivo comprende un inhibidor de TGF-beta, es decir, cualquier inhibidor que, directa o indirectamente, regule negativamente la señalización de TGF-beta, tal como se reivindica. En algunas formas de realización, un medio de cultivo de la invención comprende uno o más inhibidores de TGF-beta que se unen y reducen la actividad de una o más serina/treonina proteína quinasas seleccionadas del grupo que consiste en ALK5, ALK4, receptor quinasa 1 de TGF-beta y ALK7.
ALK4, ALK5 y ALK7 son receptores estrechamente relacionados de la superfamilia TGF-beta. ALK4 tiene GI número 91; ALK5 (también conocido como receptor quinasa 1 de TGF-beta) tiene el número GI 7046; y ALK7 tiene GI número 658. En una forma de realización, un inhibidor según la invención se une y reduce la actividad de ALK4, ALK5 (receptor quinasa 1 de TGF-beta) y/o ALK7. En otra forma de realización, el receptor de TGF-beta se une y reduce la actividad de una proteína Smad, por ejemplo, R-SMAD o SMAD1-5 (es decir SmAd 1, SMAD 2, SMAD 3, SMAD 4 o SMAD 5), como se ha reivindicado. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende un inhibidor de ALK5.
Se conocen varios métodos para determinar si una sustancia es un inhibidor del TGF-beta. Por ejemplo, se puede usar un ensayo celular, en el que las células se transfectan de manera estable con una construcción indicadora que comprende el promotor PAI-1 humano o sitios de unión Smad, que impulsan un gen indicador de luciferasa. La inhibición de la actividad luciferasa en relación con los grupos de control se puede utilizar como medida de la actividad del compuesto (De Gouville et al., Br J Pharmacol. Mayo de 2005; 145(2): 166-177). Otro ejemplo es el ensayo de fosfosensor AlphaScreen® para medir la actividad quinasa (Drew A E et al., Comparison of 2 Cell-Based Phosphoprotein Assays to Support Screening and Development of an ALK Inhibitor J Biomol Screen. 16(2) 164-173, 2011).
Se conocen en la técnica diversos inhibidores de TGF-beta (por ejemplo, véase la Tabla 1). En algunas formas de realización, el inhibidor que directa o indirectamente regula negativamente la señalización de TGF-beta se selecciona del grupo que consiste en A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 y SJN-2511.
En algunas formas de realización de la invención, el medio de cultivo comprende un inhibidor de p38, es decir, cualquier inhibidor que, directa o indirectamente, regule negativamente la señalización de p38. En algunas formas de realización, un inhibidor se une y reduce la actividad de p38 (número GI 1432). Las proteínas quinasas p38 son parte de la familia de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Las MAPK son proteínas quinasas específicas de serina/treonina que responden a estímulos extracelulares, como el estrés ambiental y las citocinas inflamatorias, y regulan diversas actividades celulares, como la expresión genética, la mitosis, la diferenciación, la proliferación y la supervivencia/apoptosis celular. Las MAPK p38 existen como isoformas a, p, p2,<y>y 6. Un inhibidor de p38 es un agente que se une y reduce la actividad de al menos una isoforma de p38. Se conocen varios métodos para determinar si una sustancia es un inhibidor de p38 y podrían usarse junto con la invención. Los ejemplos incluyen: detección de fosforilación por anticuerpo fosfoespecífico en Thrl 80/Tyrl 82, que proporciona una medida bien establecida de la activación o inhibición de p38 celular; ensayos bioquímicos de quinasa recombinante; ensayos de secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa); y la plataforma de detección de alto rendimiento DiscoverRx para inhibidores de p38 (consulte http://www.discoverx.com/kinases/literature/biochemical/collaterals/DRx_poster_p38 %20KBA.pdf). También existen varios kits de ensayo de actividad de p38 (p. ej. Millipore, Sigma-Aldrich).
Los inventores plantean la hipótesis de que, en algunas formas de realización, altas concentraciones (p. ej. más de 100 nM, o más de 10 uM, más de 10 uM, o más de 100 uM) de un inhibidor de p38 pueden tener el efecto de inhibir el TGF-beta. Sin embargo, los inventores no desean verse limitados por esta hipótesis y en otras formas de realización, el inhibidor de p38 no inhibe la señalización de TGF-beta. Se conocen varios inhibidores de p38 en la técnica (por ejemplo, consulte la Tabla 1). En algunas formas de realización, el inhibidor que directa o indirectamente regula negativamente la señalización de p38 se selecciona del grupo que consiste en SB-202190, SB-203580, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257 y BIRB-796. En una forma de realización adicional de la invención, el medio de cultivo comprende: a) un inhibidor que se une y reduce la actividad de una cualquiera o más de las quinasas del grupo que consiste en: ALK4, ALK5 y ALK7; yb) un inhibidor que se une y reduce la actividad de p38. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo comprende un inhibidor que se une y reduce la actividad de ALK5 y un inhibidor que se une a p38 y reduce su actividad.
En una forma de realización, un inhibidor se une y reduce la actividad de su objetivo (por ejemplo, TGF-beta o p38) en más del 10 %; mas de 30 %; más del 60 %; más del 80 %; más del 90 %; más del 95 %; o más del 99 % en comparación con un control, según lo evaluado mediante un ensayo celular. Son bien conocidos en la técnica ejemplos de ensayos celulares para medir la inhibición diana como se describió anteriormente.
Un inhibidor puede tener un valor de CI50 igual o inferior a 2000 nM; menos de 1000 nM; menos de 1100 nM; menos de 50 nM; menos de 30 nM; menos de 20 nM o menos de 10uM. El valor CI50 se refiere a la eficacia de un inhibidor para inhibir la función biológica o bioquímica de su objetivo. La CI50 indica la cantidad de un inhibidor particular que se requiere para inhibir una quinasa en un 50 %. Los valores de CI50 se pueden calcular de acuerdo con los métodos de ensayo establecidos anteriormente.
Un inhibidor puede actuar de forma competitiva, no competitiva, anti-competitiva o mediante inhibición mixta. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, un inhibidor puede ser un inhibidor competitivo de la bolsa de unión de ATP de la quinasa diana.
Los inhibidores pueden existir en diversas formas, incluidos sustratos naturales o modificados, enzimas, receptores, pequeñas moléculas orgánicas, tales como pequeñas moléculas orgánicas naturales o sintéticas de hasta 2000 Da, preferiblemente 800 Da o menos, peptidomiméticos, moléculas inorgánicas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos antisentido. aptámeros y miméticos estructurales o funcionales de estos, incluidas moléculas pequeñas. El inhibidor también puede ser un aptámero. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aptámero” se refiere a hebras de oligonucleótidos (ADN o ARN) que pueden adoptar conformaciones tridimensionales altamente específicas. Los aptámeros están diseñados para tener altas afinidades y especificidades de unión hacia ciertas moléculas objetivo, incluidas las proteínas extracelulares e intracelulares.
Por ejemplo, el inhibidor puede ser una pequeña molécula sintética con un peso molecular comprendido entre 50 y 800 Da, entre 80 y 700 Da, entre 100 y 600 Da o entre 150 y 500 Da. En algunas formas de realización, el inhibidor de molécula pequeña comprende un piridinilimidazol o una pteridina disustituida en 2,4 o una quinazolina, por ejemplo, comprende:
Ejemplos particulares de inhibidores que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen, entre otros: SB-202190, SB-203580, SB-206718, SB-227931, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257, BIRB-796, A83-01 SB-431542, SB-505124, SB- 525334, LY 364947, SD-208, SIN 2511 (véase tabla 1). Un medio de cultivo de la invención puede comprender uno o más de cualquiera de los inhibidores enumerados en la tabla 1. Un medio de cultivo de la invención puede comprender cualquier combinación de un inhibidor con otro inhibidor enumerado. Por ejemplo, un medio de cultivo de la invención puede comprender SB-202190 o SB-203580 o A83-01; o un medio de cultivo de la invención puede comprender SB-202190 y A83-01; o un medio de cultivo de la invención puede comprender SB-203580 y A83-01. El experto apreciará que se pueden incluir otros inhibidores y combinaciones de inhibidores que se unen y reducen la actividad de las dianas según la invención en un medio de cultivo o un suplemento de medio de cultivo según la invención.
Se pueden añadir inhibidores al medio de cultivo hasta una concentración final que sea apropiada, teniendo en cuenta el valor de CI50 del inhibidor.
Por ejemplo, se puede añadir SB-202190 al medio de cultivo en una concentración de entre 50 nM y 100 uM, o entre 100 nM y 50 uM, o entre 1 uM y 50 uM. Por ejemplo, se puede añadir SB-202190 al medio de cultivo a aproximadamente 10 uM.
Se puede añadir SB-203580 al medio de cultivo en una concentración de entre 50 nM y 100 uM, o entre 100 nM y 50 uM, o entre 1 uM y 50 uM. Por ejemplo, se puede añadir SB-203580 al medio de cultivo a aproximadamente 10 uM.
Se puede añadir VX-702 al medio de cultivo a una concentración de entre 50 nM y 100 uM, o entre 100 nM y 50 uM, o entre 1 uM y 25 uM. Por ejemplo, se puede añadir VX-702 al medio de cultivo a aproximadamente 5 uM.
Se puede añadir 25 VX-745 al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 50 uM, o entre 50 nM y 50 uM, o entre 250 nM y 10 uM. Por ejemplo, se puede añadir VX-745 al medio de cultivo a aproximadamente 1 uM.
PD-169316 se puede añadir al medio de cultivo en una concentración de entre 100 nM y 200 uM, o entre 200 nM y 100 uM, o entre 1 uM y 50 uM. Por ejemplo, se puede añadir PD-16931630 al medio de cultivo a aproximadamente 20 uM.
Se puede añadir RO-4402257 al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 50 uM, o entre 50 nM y 50 uM, o entre 500 nM y 10 uM. Por ejemplo, se puede añadir RO-4402257 al medio de cultivo a aproximadamente 1 uM.
BIRB-796 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 50 uM, 5 o entre 50 nM y 50 uM, o entre 500 nM y 10 uM. Por ejemplo, se puede añadir BIRB-796 al medio de cultivo a aproximadamente 1 uM.
Se puede añadir A83-01 al medio de cultivo en una concentración de entre 10 nM y 10 uM, o entre 20 nM y 5 uM, o entre 50 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir A83-01 al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
Se puede añadir SB-431542 al medio de cultivo en una concentración de entre 80 nM y 80 uM, o entre 100 nM y 40 uM, o entre 500 nM y 10 uM. Por ejemplo, se puede añadir SB-431542 al medio de cultivo a aproximadamente 1 uM.
Se puede añadir SB-505124 al medio de cultivo a una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir SB-505124 al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
Se puede añadir SB-525334 al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 10 uM, o entre 20 nM y 5 uM, o entre 50 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir SB-525334 al medio de cultivo a aproximadamente 100 nM.
Se puede añadir LY 36494 al medio de cultivo a una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir LY 36494 al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
Tabla 1: Inhibidores ejemplares
(Continuación)
SD-208 se puede añadir al medio de cultivo en una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir SD-208 al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
Se puede añadir LY364947 al medio de cultivo en una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir LY364947 al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
Se puede añadir SJN 2511 al medio de cultivo a una concentración de entre 20 nM y 20 uM, o entre 40 nM y 10 uM, o entre 100 nM y 1 uM. Por ejemplo, se puede añadir SJN 2511 al medio de cultivo a aproximadamente 200 nM.
Así, en algunas formas de realización, el inhibidor que directa o indirectamente regula negativamente la señalización de TGF-beta o p38 se añade al medio de cultivo en una concentración de entre 10 nM y 100 pM, entre 10 nM y 100 pM, entre 100 nM y 10 pM, o aproximadamente 1 pM, por ejemplo, en donde la concentración total del uno o más inhibidores está entre 10 nM y 100 pM, entre 100 nM y 10 pM, o aproximadamente 1 pM.
Además del inhibidor, los medios de cultivo celular generalmente contienen una serie de componentes que son necesarios para apoyar el mantenimiento y/o la expansión de las células cultivadas. Por lo tanto, un medio de cultivo celular de la invención normalmente contendrá muchos otros componentes además de un inhibidor. El experto puede formular fácilmente combinaciones adecuadas de componentes, teniendo en cuenta la siguiente descripción. Un medio de cultivo según la invención será generalmente una solución nutritiva que comprende componentes de cultivo celular estándar, tales como aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, una fuente de energía de carbono y un tampón como se describe con más detalle a continuación. Otros componentes estándar del cultivo celular que pueden incluirse en el cultivo incluyen hormonas, tales como progesterona, proteínas, tales como albúmina, catalasa, insulina y transferrina. Estos otros componentes estándar del cultivo celular constituyen el medio de cultivo “basal”.
Se puede generar un medio de cultivo según la invención mediante modificación de un medio de cultivo celular existente. El experto comprenderá, a partir del conocimiento general común, los tipos de medios de cultivo que podrían usarse para el cultivo de células madre. Los medios de cultivo celular potencialmente adecuados están disponibles comercialmente e incluyen, entre otros, el medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), Knockout-DMEM (KO-DMEM), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio Basal Eagle (BME), DMEM/F12 de Ham, DMEM avanzado/F12 de Ham, Medio Dulbecco modificado por Iscove y Medio esencial mínimo (MEM), F10 de Ham, F12 de Ham, Medio 199 y Medio RPMI 1640. Así, en algunas formas de realización, uno de estos medios de cultivo celular preexistentes se utiliza como medio de cultivo basal al que se añade el inhibidor que, directa o indirectamente, regula negativamente la señalización de TGF-beta o p38 como se reivindica, y, opcionalmente, para al que se le añade uno o más componentes como se describe en el presente documento.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo de la invención comprende uno o más componentes adicionales seleccionados de: un inhibidor de BMP, un agonista de Wnt, un ligando del receptor tirosina quinasa, un inhibidor de Rock, nicotinamida y gastrina. En algunas formas de realización, el medio de cultivo de la invención comprende cualquiera de R-espondina 1-4 y/o un imitador de R-espondina, un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de BMP (por ejemplo, Noggin) y un agonista de Wnt (por ejemplo, Wnt(3a)).
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo de la invención comprende cualquiera de R-espondina 1-4 y/o un imitador de R-espondina, un inhibidor de BMP (por ejemplo, Noggin), un inhibidor de TGF-beta, un ligando del receptor tirosina quinasa (por ejemplo, EGF), nicotinamida, un agonista de Wnt (por ejemplo, Wnt(3a)), y opcionalmente uno o más componentes adicionales seleccionados entre: un inhibidor de p38, gastrina,<f>G<f>10, HGF y un inhibidor de Rock. Los componentes adicionales opcionales pueden agregarse para optimizar el medio de cultivo para cultivar células que se originan a partir de tejidos particulares, como se explica con más detalle más adelante.
Los medios de cultivo de la invención pueden comprender uno o más inhibidores de la proteína morfogenética ósea (BMP). Los ligandos de BMP emiten señales como dímeros mediante el ensamblaje de un complejo de receptor de serina/treonina quinasa transmembrana cuatripartito que consta de dos receptores de tipo I y dos de tipo II. El ensamblaje complejo inicia una cascada de fosforilación que activa el Smadsl/5/8 sensible a BMP y produce cambios en la actividad transcripcional.
Ventajosamente, los presentes inventores muestran que los inhibidores de BMP promueven la expresión de Lgr5 y, por tanto, la presencia de un inhibidor de BMP en un medio de cultivo de la invención probablemente dará como resultado más organoides proliferativos que si el inhibidor de BMP está ausente (por ejemplo, véase el Ejemplo 3). Por tanto, los inhibidores de BMP son un componente ventajoso de los medios de expansión de la invención. Por tanto, el uso de un inhibidor de BMP es ventajoso en el uso de un medio de expansión cuando es deseable cultivar las células durante al menos 3 meses (p. ej. al menos 4, 5, 6, 7, 8 o 9 meses) sin que las células se diferencien.
Se conocen varias clases de proteínas naturales de unión a BMP, incluidas Noggin (Peprotech), Chordin y proteínas similares a cordina (R&D systems) que comprenden dominios de cordina, folistatina y proteínas relacionadas con folistatina (R&D systems) que comprenden un dominio de folistatina, DAN y proteínas de tipo DAN (R&D systems) que comprenden un dominio de nudo de cisteína DAN, esclerostina/SOST (R&D systems) y macroglobulina alfa-2 (R&D systems). Un inhibidor de BMP es un agente que se une a una molécula de BMP para formar un complejo en el que se reduce la actividad de BMP, por ejemplo previniendo o inhibiendo la unión de la molécula de BMP a un receptor de BMP. Alternativamente, el inhibidor puede ser un agente que se une a un receptor de BMP y previene la unión de un ligando de BMP al receptor, por ejemplo, un anticuerpo que se une al receptor. Un inhibidor de BMP puede ser una proteína o una molécula pequeña y puede ser natural, modificado y/o parcial o totalmente sintético. Un inhibidor de BMP de un medio de cultivo de la invención puede ser proteínas Noggin, DAN o de tipo DAN, incluidas Cerberus y Gremlin (R&D systems). Estas proteínas difusibles pueden unirse a un ligando de BMP con diversos grados de afinidad e inhibir su acceso a los receptores de señalización. Un inhibidor de BMP preferido para uso en un medio de cultivo de la invención es Noggin. Noggin se puede utilizar en cualquier concentración adecuada. En algunas formas de realización, un medio basal del medio de cultivo de la invención puede comprender entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 100 ng/ml de Noggin. Por ejemplo, un medio de cultivo puede comprender al menos 10 ng/ml de Noggin, al menos 20 ng/ml de Noggin, al menos 50 ng/ml de Noggin, al menos 100 ng/ml de Noggin, aproximadamente 100 ng/ml de Noggin o 100 ng/ml de Noggin. En algunas formas de realización, un medio de cultivo puede comprender menos de 200 ng/ml de Noggin, menos de 150 ng/ml de Noggin, menos de 100 ng/ml de Noggin, menos de 75 ng/ml de Noggin, menos de 50 ng/ml de Noggin. ml de Noggin o menos de 30 ng/ml de Noggin. El inhibidor de BMP se puede añadir al medio de cultivo cada dos días durante el cultivo, o cada día durante el cultivo, o cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días o según sea necesario. Los inhibidores de BMP son componentes especialmente ventajosos de los medios de expansión, por ejemplo para la expansión de células madre de páncreas, intestino delgado, colon, hígado y próstata. Sin embargo, se ha demostrado que Noggin previene cierta diferenciación (por ejemplo, consulte el ejemplo 3). Por lo tanto, en algunas formas de realización, un inhibidor de BMP se excluye de un medio de diferenciación de la invención.
En algunas formas de realización, las células cultivadas con un inhibidor de BMP tienen una expresión regulada positivamente de Lgr5 en comparación con las células cultivadas sin un inhibidor de BMP. Por lo tanto, la adición de un inhibidor de BMP normalmente da como resultado organoides más proliferativos. Esto es sorprendente, porque en la literatura se describe que la actividad de BMP es útil para la diferenciación de las células pancreáticas en células ductales (véase expresión de queratina7 y 19) y endocrinas. Por tanto, el experto esperaría que la inclusión de un inhibidor de BMP, tal como Noggin, disminuyera la proliferación y aumentara la diferenciación. Sin embargo, los inventores descubrieron sorprendentemente que el uso de un inhibidor de BMP era ventajoso porque daba como resultado organoides más proliferativos y una mayor expresión de Lgr5. Los medios de cultivo de la invención pueden comprender uno o más agonistas de Wnt. La vía de señalización Wnt se define por una serie de eventos que ocurren cuando una proteína Wnt se une a un receptor de la superficie celular de un miembro de la familia de receptores Frizzled. Esto da como resultado la activación de 18 proteínas de la familia Disheveled que inhiben un complejo de proteínas que incluye axina, GSK-3 y la proteína APC para degradar la beta-catenina intracelular. La beta catenina nuclear enriquecida resultante mejora la transcripción mediante factores de transcripción de la familia TCF/LEF. Un agonista de Wnt se define como un agente que activa la transcripción mediada por TCF/LEF en una célula. Por lo tanto, los agonistas de Wnt se seleccionan entre agonistas de Wnt verdaderos que se unen y activan un miembro de la familia de receptores Frizzled que incluye todas y cada una de las proteínas de la familia Wnt, un inhibidor de la degradación de beta catenina intracelular y activadores de TCF/LEF. Dicho agonista de Wnt estimula una actividad Wnt en una célula en al menos un 10 %, más preferentemente al menos un 20 %, más preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente al menos un 50 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos 100 %, con respecto a un nivel de dicha actividad Wnt en ausencia de dicha molécula. Como sabe un experto, la actividad de Wnt se puede determinar midiendo la actividad transcripcional de Wnt, por ejemplo mediante constructos indicadores de luciferasa pTOPFLASH y pFOPFLASH Tcf (Korinek et al, 1997 Science 275 1784-1787).
En algunas formas de realización, un agonista de Wnt comprende una glicoproteína secretada que incluye Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp (proteína relacionada con lnM), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a (R&D systems), Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6 (Kirikoshi H et al 2001 Biochem Biophys Res Com 283 798-805), Wnt-7a (R&D systems), Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt 10b/12, WnM1 y Wnt-16. Se proporciona una descripción general de las proteínas Wnt humanas en “THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS”, R&D Systems Catalog, 2004. Otros agonistas de Wnt incluyen la familia R-espondina de proteínas secretadas, que está implicada en la activación y regulación de la vía de señalización Wnt y que consta de 4 miembros (R-espondina 1 (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA), R-espondina 1 (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA), espondina 2 ((R&D systems), R-espondina 3 y R-espondina-4) y Norrin (también llamada proteína de la enfermedad de Nome o NDP) (R&D systems), que es una proteína reguladora secretada que funciona como una proteína Wnt en que se une con alta afinidad al receptor 2Frizzled-4 e induce la activación de la vía de señalización Wnt (Kestutis Planutis et al (2007) BMC Cell Biol 8 12). En algunas formas de realización, uno o más agonistas de Wnt para uso en la invención es un imitador de R-espondina, por ejemplo un agonista de Lgr5 tal como un anticuerpo anti-Lgr5. Recientemente se identificó un agonista de molécula pequeña de la vía de señalización de Wnt, un derivado de aminopirimidina, que también se incluye expresamente como agonista de Wnt (Lm et al (2005) Angew Chem Int Ed Engl 44, 1987-90).
En algunas formas de realización, el agonista de Wnt es un inhibidor de GSK. Los inhibidores de GSK conocidos comprenden ARN de pequeña interferencia (ARNip, señalización celular), litio (Sigma), kenpaulona (Biomol International, Leost, Metal (2000) Eur J Biochem 267, 5983-5994), 6-bromoindirubina-30-acetoxima (Meyer, Letal (2003) Chem Biol 10, 1255-1266), SB 216763 y SB 415286 3 (Sigma-Aldrich), y miembros de la familia FRAT y péptidos derivados de FRAT que previenen la interacción de GSK-3 con axina. Pharmacological Sciences 25, 471-480 proporcionan una descripción general. Un experto conoce los métodos y ensayos para determinar un nivel de inhibición de GSK-3 y comprenden, por ejemplo, los métodos y ensayos descritos en Liao et al 2004, Endocrinology, 145(6) 2941-2949.
En algunas formas de realización, el agonista de Wnt es un inhibidor de RNF43 o ZNRF3. Los inventores han descubierto que RNF43 y ZNRF3 residen en la membrana celular y regulan negativamente los niveles del complejo receptor Wnt en la membrana, probablemente mediante ubiquitinación de Frizzled. Por lo tanto, los inventores plantean la hipótesis de que la inhibición de RNF43 o ZNRF3 con anticuerpos antagonistas, ARNi o inhibidores de moléculas pequeñas estimularía indirectamente la vía Wnt. RNF43 y ZNRF3 tienen un dominio de anillo catalítico (con actividad de ubiquitinación), que puede ser objetivo en el diseño de inhibidores de moléculas pequeñas. Se encuentran disponibles comercialmente varios anticuerpos anti-RNF43 y varios anticuerpos anti-ZNRF3. En algunas formas de realización, dichos anticuerpos son agonistas de Wnt adecuados en el contexto de la invención.
En algunas formas de realización, dicho agonista de Wnt se selecciona del grupo que consiste en Wnt-3a, un inhibidor de GSK (tal como CHIR99021), Wnt 5, Wnt-6a, Norrin y cualquier otra proteína de la familia Wnt. 1 En algunas formas de realización, dicho agonista de Wnt comprende o consiste en cualquiera de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4. En una forma de realización preferida, dicho agonista de Wnt se selecciona de uno o más miembros de la familia Wnt, R-espondina 1-4, Norrin y un inhibidor de GSK. En algunas formas de realización, dicho agonista de Wnt es un inhibidor de GSK-3, tal como CHIR99021 (Stemgent 04-0004). En algunas formas de realización, se añade CHIR99021 al medio de cultivo hasta una concentración final de entre 50 nM y 100 uM, por ejemplo entre 100 nM y 50 uM, entre 1 uM y 10 uM, entre 1 uM y 5 uM, o 3 uM. En algunas formas de realización en las que se usa un inhibidor de GSK-3, el inhibidor de GSK-3 no es BIO (6-bromoindirubin-3'-oxima, Stemgent 04-0003). Los inventores descubrieron que la adición de al menos un agonista de Wnt al medio de cultivo basal es esencial para la proliferación de las células madre epiteliales o de las criptas aisladas.
En una forma de realización preferida adicional, dicho agonista de Wnt comprende o consiste en R-espondina 1 o R-espondina 4. Preferentemente se añade R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 al medio de cultivo basal en una concentración de al menos 50 ng/ml, más preferentemente al menos 100 ng/ml, más preferentemente a al menos 200 ng/ml, más preferentemente al menos 300 ng/ml, más preferentemente al menos 500 ng/ml. Una concentración más preferida de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 es aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml. En algunas formas de realización, se añade R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 al medio de cultivo en una concentración de al menos 500 ng/ml, al menos 600 ng/ml, al menos 700 ng/ml. ml, al menos 800 ng/ml, al menos 900 ng/ml, al menos 1 ug/ml, al menos 1,5 ug/ml o al menos 2 ug/ml. En otra forma de realización preferida, se añade R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 al medio de cultivo en una concentración de aproximadamente 31 ug/ml o 1 ug/ml. En algunas formas de realización, se añade R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 204 al medio de cultivo basal en una concentración de menos de 1000 ng/ml, por ejemplo, menos de 800 ng/ml, menos de 600 ng/ml, menos de 550 ng/ml, menos de 500 ng/ml, menos de 400 ng/ml, menos de 300 ng/ml o menos de 200 ng/ml, o menos de 100 ng/ml. En algunas formas de realización, dos o más (p. ej. Se añaden al medio 2, 3 o 4) de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4 (“R-espondina 1-4”). Preferiblemente, cuando se añaden dos o más de R-espondina 1-4, la concentración total de R-espondina asciende a las concentraciones descritas anteriormente. Cuando se dice que los medios de cultivo descritos en el presente documento comprenden “R-espondina 1-4”, se significa que el medio comprende uno cualquiera o más de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4. Cuando se dice que los medios de cultivo descritos en el presente documento comprenden “R-espondina”, significa que el medio comprende uno cualquiera o más de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3, R-espondina 4 y un imitador de R-espondina.
Durante el cultivo de células madre, dicho miembro de la familia Wnt se añade preferentemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se actualiza preferentemente cada cuatro días.
En una forma de realización preferida, un agonista de Wnt se selecciona del grupo que consiste en R-espondina, Wnt-3a y Wnt-6. Más preferiblemente, se usan R-espondina y Wnt-3a como agonistas de Wnt. Esta combinación es particularmente preferida puesto que esta combinación sorprendentemente tiene un efecto sinérgico sobre la formación de organoides. Las concentraciones preferidas son aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml para R-espondina y aproximadamente 100 ng/ml o 100 ng/ml para Wnt3a.
Los medios de cultivo de la invención pueden comprender uno o más ligandos del receptor tirosina quinasa. Un ejemplo de un ligando del receptor tirosina quinasa para uso en la invención es EGF, que es el ligando para el receptor tirosina quinasa EGFR. Muchos ligandos del receptor tirosina quinasa también son factores de crecimiento mitogénicos.
Los medios de cultivo de la invención pueden comprender uno o más factores de crecimiento mitogénicos. El uno o más factores de crecimiento mitogénicos pueden seleccionarse de una familia de factores de crecimiento que comprende factor de crecimiento epidérmico (EGF, Peprotech), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa, Peprotech), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, Peprotech), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, Peprotech), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, R&D Systems) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, Peprotech). EGF es un potente factor mitogénico para una variedad de células ectodérmicas y mesodérmicas cultivadas y tiene un profundo efecto sobre la diferenciación de células específicasin vivoein vitroy de algunos fibroblastos en cultivo celular. El precursor de EGF existe como una molécula unida a una membrana que se escinde proteolíticamente para generar la hormona peptídica de 53 aminoácidos que estimula las células. Un factor de crecimiento mitogénico preferido es EGF. Preferiblemente, el EGF se añade al medio de cultivo basal en una concentración de entre 5 y 500 ng/ml o de al menos 5 y no superior a 500 ng/ml. Una concentración preferida es al menos 10, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 ng/ml y no superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 ng/ml. Una concentración más preferida es al menos 50 y no superior a 100 ng/ml. Una concentración aún más preferida es aproximadamente 50 ng/ml o 50 ng/ml. Se podrían usar las mismas concentraciones para un FGF, preferiblemente para FGF10 o FGF7. Si se usa más de un FGF, por ejemplo FGF7 y FGF10, la concentración de un FGF es como se define anteriormente y se refiere a la concentración total de FGF usada. Durante el cultivo de células madre, dicho factor de crecimiento mitogénico se añade preferiblemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se renueva preferiblemente cada cuatro días. Se puede utilizar cualquier miembro de la familia FGF. Preferiblemente, se usa FGF7 y/o FGF10. FGF7 también se conoce como KGF (factor de crecimiento de queratinocitos). En otra forma de realización preferida se añade al medio de cultivo basal una combinación de factores de crecimiento mitogénicos como, por ejemplo, EGF y KGF o EGF y BDNF. En otra forma de realización preferida se añade al medio de cultivo basal una combinación de factores de crecimiento mitogénicos como, por ejemplo, EGF y KGF o EGF y FGF10. El factor de crecimiento mitogénico se puede añadir a un medio de cultivo en una concentración de entre 5 y 500 nanogramos/ml o al menos 5 y no más de 500 nanogramos/ml, por ejemplo al menos 10, 20, 25, 30, 40, 45, o 50 ng/ml y no superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 ng/ml. El factor de crecimiento mitogénico se puede seleccionar del grupo que consiste en EGF, TGF alfa, KGF, FGF7 y FGF. Preferiblemente, un factor mitogénico se selecciona de los grupos que consisten en EGF, TGF-alfa y KGF o de EGF, TGF-alfa y FGF7 o de EGF, TGF alfa y FGF o de EGF y KGF o de EGF y FGF7 o de EGF y un FGF o de TGF-alfa y KGF o de TGF-alfa y FGF7 o de TGF-alfa y un FGF. El EGF puede ser reemplazado por TGF-alfa. En algunas formas de realización, el factor de crecimiento mitogénico es el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). En algunas formas de realización, se añade HGF al medio de cultivo.
En algunas formas de realización, el ligando del receptor tirosina quinasa es un factor de crecimiento mitogénico, por ejemplo seleccionado de una familia de factores de crecimiento que consisten en factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF).
Los inhibidores de ROCK, como Y-27632 (10 pM; Sigma), pueden incluirse en cualquiera de los medios descritos, en particular en los primeros días de cultivo antes de realizar experimentos de clasificación celular, porque se sabe que evitan el anoikis (una forma de muerte celular programada que es inducida por células dependientes del anclaje que se desprenden de la matriz extracelular circundante). Por lo tanto, cualquiera de los medios definidos en el presente documento, puede comprender adicionalmente un inhibidor de ROCK durante los primeros días. En algunas formas de realización, los medios de cultivo de la invención comprenden adicionalmente un inhibidor de ROCK, como Y-27632, por ejemplo durante los primeros días de cultivo antes de realizar experimentos de clasificación celular.
Una forma de realización adicional de un método según la invención comprende un medio de cultivo que comprende un inhibidor de Rock (Rho-quinasa). Se descubrió que la adición de un inhibidor de Rock previene la anoikis, especialmente cuando se cultivan células madre individuales. Dicho inhibidor de Rock se selecciona preferiblemente entre diclorhidrato de R-(+)-trans-4-(1-aminoetil)-N-(4-piridil)ciclohexanocarboxamida monohidrato (Y-27632, Sigma-Aldrich), 5-(1,4-diazepan-1 -ilsulfonil)isoquinolina (fasudil o HA1077, Cayman Chemical), y dihidrocloruro de (S)-(+)-2-metil-1-[(4-metil-5-isoquinolinil)sulfonil]-hexahidro-1H-1,4-diazepina (H-1 152, Tocris Bioscience). Dicho inhibidor de Rho-quinasa, por ejemplo Y-27632, se añade preferiblemente al medio de cultivo cada dos días durante los primeros siete días de cultivo de dichas células madre. Preferiblemente se incluye un inhibidor de Rock en el medio en los primeros días, por ejemplo. durante los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días de cultivo después de la siembra de células individuales o después de una división. Puede usarse cualquier concentración adecuada del inhibidor de Rock, por ejemplo, 1-200 uM, 1-100 uM, 5-50 uM o aproximadamente 100 uM. Una concentración preferida para Y27632 es 10uM. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona un método para cultivar células madre y/o un método para obtener un organoide en el que se añade un inhibidor de Rock al medio de cultivo durante los primeros 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, opcionalmente cada dos días. En algunas formas de realización, el inhibidor de Rock no se añade al medio de cultivo después de los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días.
La adición de un inhibidor de Rock es particularmente importante cuando se cultivan células madre individuales (como se mencionó anteriormente), es decir cuando el material de partida de un organoide es una única célula madre. Por lo tanto, en algunas formas de realización la invención proporciona un método para obtener un organoide, en donde el método comprende cultivar células madre, opcionalmente células madre individuales, en donde se agrega un inhibidor de Rock al medio de cultivo durante los primeros 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, opcionalmente cada dos días, y opcionalmente no añadir el inhibidor de Rock al medio de cultivo después de los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días.
El inhibidor de Rock es menos importante, y en ocasiones no necesario, cuando se cultivan varias células, por ejemplo cuando el material de partida de un organoide es un fragmento de tejido. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona un método para obtener un organoide, en donde el método comprende cultivar células madre, opcionalmente un fragmento de tejido, en donde el inhibidor de Rock no se agrega al medio de cultivo ni en absoluto ni después de los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días.
Después de dividir las células en múltiples cultivos, se puede agregar un inhibidor de Rock al medio de cultivo de la misma manera, es decir, durante los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, opcionalmente cada dos días, después de la división, particularmente cuando la división implica tomar células madre individuales de un primer cultivo y colocarlas en un segundo cultivo. Si la división implica tomar múltiples células madre del primer cultivo y colocarlas en un segundo cultivo, entonces la adición de un inhibidor de Rock es menos importante y, a veces, no es necesaria. Por lo tanto, en algunas formas de realización, en las que el método para obtener organoides o para cultivar células madre implica una división, opcionalmente cuando una sola célula está involucrada en la división, se agrega un inhibidor de Rock al nuevo medio de cultivo para los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, opcionalmente cada dos días, después del fraccionamiento. En algunas formas de realización, en las que el método para obtener organoides o para cultivar células madre implica una división, opcionalmente cuando están involucradas múltiples células en la división, no se agrega al medio de cultivo en absoluto o después de los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días.
Aún en otra forma de realización adicional, un método según la invención comprende un medio de cultivo que comprende además un agonista de Notch. Se ha demostrado que la señalización Notch desempeña un papel importante en la determinación del destino celular, así como en la supervivencia y proliferación celular. Las proteínas del receptor Notch pueden interactuar con varios ligandos unidos a la superficie o secretados, incluidos, entre otros, Delta 1, Jagged 1 y 2, y tipo Delta 1, tipo Delta 3, tipo Delta 4. Tras la unión del ligando, los receptores Notch se activan mediante eventos de escisión en serie que involucran a miembros de la familia de proteasas ADAM, así como una escisión intramembranosa regulada por la gamma secretasa presenilina. El resultado es una translocación del dominio intracelular de Notch al núcleo donde activa transcripcionalmente genes posteriores. Un agonista de Notch preferido se selecciona entre Jagged 1 y Delta 1, o un fragmento activo o derivado de los mismos. Un agonista de Notch más preferido es el péptido DSL (Dontu et al., 2004. Breast Cancer Res 6. R605-R615) con la secuencia CDDYYYGFGCNk Fc RPR. Dicho péptido DSL se usa preferiblemente a una concentración entre 10 pM y 100 nM o al menos 10 pM y no superior a 100 nM. La adición de un agonista de Notch, especialmente durante la primera semana de cultivo, aumenta la eficacia del cultivo en un factor de 2 3. Dicho agonista de Notch se añade preferentemente al medio de cultivo cada dos días durante los primeros siete días de cultivo de dichas células madre. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona un método para cultivar células madre y/o un método para obtener un organoide en el que se añade un agonista de Notch al medio de cultivo durante los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, opcionalmente cada dos días. En algunas formas de realización, el agonista de Notch no se añade al medio de cultivo después de los primeros 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días.
Un agonista de Notch se define como una molécula que estimula una actividad de Notch en una célula en al menos un 10 %, más preferentemente al menos un 20 %, más preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente al menos un 50 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 100 %, con respecto a un nivel de actividad Notch en ausencia de dicha molécula. Como sabe un experto, la actividad de Notch se puede determinar midiendo la actividad transcripcional de Notch, por ejemplo mediante una construcción indicadora de 4xwtCBF1-luciferasa como se describe (Hsieh et al, 1996 Mol Cell. Biol. 16, 952-959).
En una forma de realización adicional, el medio de cultivo celular se complementa con un inhibidor de la gamma-secretasa 3, tal como DAPT o DBZ. Los inhibidores de la gamma-secretasa pueden influir en las decisiones sobre el destino celular 24 durante la diferenciación. Por ejemplo, en algunas formas de realización, los inhibidores de la gamma-secretasa pueden influir en el destino celular hacia las células secretoras, tales como las células caliciformes. Puede usarse cualquier concentración adecuada del inhibidor de la gamma-secretasa, por ejemplo, entre 1 nM y 10 uM, 1 nM y 1 uM, entre 1 y 100 nM, o preferiblemente entre 1 y 20 nM. Por ejemplo, se puede añadir un inhibidor de la gamma-secretasa al medio de cultivo hasta una concentración final de aproximadamente 1 nM.
En una forma de realización adicional, el medio de cultivo celular se complementa con gastrina (o una alternativa adecuada tal como Leu15-gastrina). Se puede añadir gastrina (o una alternativa adecuada) al medio de cultivo hasta una concentración final de entre 1 nM y 10 uM, 1 nM y 1 uM, entre 5 y 100 nM, o preferiblemente entre 10 y 50 nM. Por ejemplo, se puede añadir Leu15-gastrina al medio de cultivo hasta una concentración final de aproximadamente 10 nM. La gastrina no es necesaria para algunos medios de cultivo de la invención. Por lo tanto, en algunas formas de realización el medio de cultivo de la invención no comprende gastrina. En particular, la gastrina no es necesaria para cultivar células madre intestinales ni para obtener organoides intestinales (criptas de vellosidades o cripta de colon). Sin embargo, incluso cuando no se requiere gastrina, aún se puede agregar al medio de cultivo sin efectos negativos.
En una forma de realización adicional, el medio de cultivo de la invención se complementa con nicotinamida. Se ha descubierto que la adición de nicotinamida mejora la eficiencia del cultivo y la vida útil de los organoides del colon humano. Se puede añadir nicotinamida al medio de cultivo hasta una concentración final de entre 1 y 100 mM, entre 5 y 50 mM, o preferiblemente entre 5 y 20 mM. Por ejemplo, se puede añadir nicotinamida al medio de cultivo hasta una concentración final de aproximadamente 10 mM.
En una forma de realización preferida de la invención, el medio de cultivo se complementa con nicotinamida y gastrina (o una alternativa adecuada, tal como Leu15-gastrina), en donde se añaden nicotinamida y gastrina al medio de cultivo en cualquiera de las concentraciones descritas anteriormente.
En algunas formas de realización, el medio de cultivo se complementa con un activador de la vía de señalización de prostaglandinas (véase Figura 24, Antagonismo de los receptores de prostaglandinas D2 DP1 y CRTH2 como enfoque para tratar enfermedades alérgicas). Roy Pettipher, Trevor T. Hansel & Richard Armer Nature Reviews Drug Discovery 6, 313-325 (abril de 2007)). Por ejemplo, el medio de cultivo se complementa con uno cualquiera o más de los compuestos seleccionados de la lista que comprende: fosfolípidos, ácido araquidónico (AA), prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina G2 (PGG2), prostaglandina F2 (PGF2), prostaglandina H2 (P<g>H2), prostaglandina D2 (PGD2). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de cultivo se complementa con PGE2 y/o AA. En algunas formas de realización, se añade PGE2 al medio hasta una concentración final de al menos 10 nM, por ejemplo al menos 20 nM, al menos 30 nM, al menos 40 nM, al menos 45 nM, entre 10 nM y 500 nM, entre 10 nM, y 400 nM, entre 10 nM y 300 nM, entre 10 nM y 200 nM, entre 10 nM y 100 nM, entre 20 nM y 50 nM. En una forma de realización preferida, se añade PGE2 al medio hasta una concentración final de 50 nM. En algunas formas de realización, se añade AA al medio hasta una concentración final de al menos 1 ug/ml, al menos 5 ug/ml, al menos 8 ug/ml, al menos 9 ug/ml, al menos 10 ug/ml, por ejemplo entre 1 ug/ml y 1000 ug/ml, entre 1 ug/ml y 500 ug/ml, entre 1 ug/ml y 100 ug/ml, entre 1 ug/ml y 50 ug/ml, o entre 5 ug/ml /ml y 20 ug/ml. En una forma de realización preferida, se añade AA al medio hasta una concentración final de 10 ug/ml. AA y PGE2 son intercambiables en el contexto de los medios de cultivo de la invención. Por lo tanto, cuando se dice que un medio de cultivo descrito en el presente documento incluye PGE2, puede incluir alternativamente AA (en una concentración apropiada) en lugar de PGE2. Por el contrario, cuando se dice que un medio de cultivo descrito en el presente documento incluye AA, puede incluir alternativamente PGE2 (en una concentración apropiada) en lugar de AA. Además, el experto entendería que cuando se incluyen PGE2 y/o AA en un medio de cultivo de la invención, el medio de cultivo podría comprender en su lugar uno cualquiera o más de los compuestos seleccionados de la siguiente lista en reemplazo o además de PGE2 y/o AA: Fosfolípidos, prostaglandina G2 (PGG2), prostaglandina F2 (PGF2), prostaglandina H2 (PGH2) y prostaglandina D2 (PGD2).
En una forma de realización adicional, el medio de cultivo de la invención se complementa con ligando RANK (también denominado en el presente documento RANKL). El ligando RANK puede ser útil para dirigir la diferenciación hacia destinos celulares particulares. Por ejemplo, cuando se incluye ligando RANK en el medio de cultivo para células del intestino delgado, preferiblemente en el medio para diferenciar células del intestino delgado, se produce una mayor proporción de células que se diferencian en células M. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona un medio de cultivo que comprende RANKL. En particular, la invención proporciona un medio de cultivo para cultivar, preferiblemente para diferenciar células del intestino delgado, en el que el medio de cultivo comprende RANKL. Puede usarse cualquier concentración adecuada de RANKL, por ejemplo, entre 100 ng/ml y 1000 ng/ml, o entre 50 y 100 ng/ml. Por ejemplo, se puede añadir RANKL al medio de cultivo hasta una concentración final de aproximadamente 100 ng/ml.
Un medio de cultivo que comprende EGF, Noggin y R-espondina se denomina en el presente documento “medio ENR”. Un medio de cultivo que comprende el medio ENR y un agonista de Wnt tal como Wnt-3a se denomina en el presente documento “medio WENR”. En una forma de realización preferida de la divulgación, el medio de cultivo comprende un medio WENR. En una forma de realización más preferida de la divulgación, el medio de cultivo comprende un medio WENR suplementado con gastrina y/o nicotinamida (es decir, WENRg o WENR+nicotinamida o WENRg+nicotinamida).
El pH del medio puede estar en el intervalo de aproximadamente 7,0 a 7,8, en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 o aproximadamente 7,4. El pH se puede mantener usando un tampón. El experto en la técnica puede seleccionar fácilmente un tampón adecuado. Los tampones que pueden usarse incluyen tampones de carbonato (p. ej. NaHCO3) y fosfatos (p. ej. NaH2PO4). Estos tampones se utilizan generalmente en una cantidad de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg/l. También se pueden utilizar otros tampones como el ácido N-[2-hidroxietil]-piperazina-N'-[2-etanosulfónico] (HEPES) y el ácido 3-[N-morfolino]-propanosulfónico (MOPS), normalmente a aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000 mg/l. Un medio de cultivo puede comprender un indicador de pH, tal como rojo de fenol, para permitir que se controle fácilmente el estado de pH del medio (p. ej. de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/litro).
Un medio de cultivo para uso en la invención puede comprender uno o más aminoácidos. El experto comprende los tipos y cantidades apropiados de aminoácidos para su uso en medios de cultivo de células madre. Los aminoácidos que pueden estar presentes incluyen L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-cistina, ácido L-glutámico, L-glutamina, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina y combinaciones de los mismos. Algunos medios de cultivo contendrán todos estos aminoácidos. Generalmente, cada aminoácido cuando está presente está presente en aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 g/l de medio (normalmente en aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,15 g/l), excepto la L-glutamina que está presente en aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 g/l (normalmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,75 g/l). Los aminoácidos pueden ser de origen sintético.
Un medio de cultivo para uso en la invención puede comprender una o más vitaminas. El experto comprende los tipos y cantidades apropiados de vitaminas para su uso en medios de cultivo de células madre. Las vitaminas que pueden estar presentes incluyen tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), niacina (vitamina B3), D-pantotenato de calcio (vitamina B5), piridoxal/piridoxamina/piridoxina (vitamina B6), ácido fólico (vitamina B9), cianocobalamina (vitamina B12), ácido ascórbico (vitamina C), calciferol (vitamina D2), DL-alfa tocoferol (vitamina E), biotina (vitamina H) y menadiona (vitamina K).
Un medio de cultivo para uso en la invención puede comprender una o más sales inorgánicas. El experto comprende los tipos y cantidades apropiados de sales inorgánicas para su uso en medios de cultivo de células madre. Las sales inorgánicas normalmente se incluyen en los medios de cultivo para ayudar a mantener el equilibrio osmótico de las células y ayudar a regular el potencial de membrana. Las sales inorgánicas que pueden estar presentes incluyen sales de calcio, cobre, hierro, magnesio, potasio, sodio y zinc. Las sales se utilizan normalmente en forma de cloruros, fosfatos, sulfatos, nitratos y bicarbonatos. Las sales específicas que pueden usarse incluyen CaCl<2>, CuSO4-5H2O, Fe(NO3)-9H2O, FeSO4-<7>H<2>O, MgCl, MgSO4, KCl, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4, Na2HPO4-H2O y ZnSO4-7H2O.
La osmolaridad del medio puede estar en el rango de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 mOsm/kg, en el rango de aproximadamente 290 a aproximadamente 350 mOsm/kg, o en el rango de aproximadamente 280 a aproximadamente 310 mOsm/kg. La osmolaridad del medio puede ser inferior a aproximadamente 300 mOsm/kg (p. ej. alrededor de 280 mOsm/kg).
Un medio de cultivo para uso en la invención puede comprender una fuente de energía de carbono, en forma de uno o más azúcares. El experto comprende los tipos y cantidades apropiados de azúcares para usar en medios de cultivo de células madre. Los azúcares que pueden estar presentes incluyen glucosa, galactosa, maltosa y fructosa. Preferiblemente, el azúcar es glucosa, en particular D-glucosa (dextrosa). Una fuente de energía de carbono normalmente estará presente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 g/l.
Un medio de cultivo de la invención puede contener suero. Puede usarse suero obtenido de cualquier fuente apropiada, incluido suero fetal bovino (SFB), suero de cabra o suero humano. Preferiblemente se utiliza suero humano. Se puede utilizar suero entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 30 % en volumen del medio, según técnicas convencionales.
En otras formas de realización, un medio de cultivo de la invención puede contener un reemplazo de suero. Varias formulaciones diferentes de reemplazo de suero están disponibles comercialmente y son conocidas por el experto. Cuando se usa un reemplazo de suero, se puede usar entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 30 % en volumen del medio, según técnicas convencionales.
En otras formas de realización, un medio de cultivo de la invención puede estar libre de suero y/o libre de reemplazo de suero. Un medio libre de suero es aquel que no contiene suero animal de ningún tipo. Pueden preferirse medios sin suero para evitar una posible xenocontaminación de las células madre. Un medio sin reemplazo de suero es aquel que no ha sido suplementado con ninguna formulación comercial de reemplazo de suero.
En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular se complementa con un factor de crecimiento purificado, natural, semisintético y/o sintético y no comprende un componente indefinido, tal como suero fetal bovino o suero fetal de ternera. Por ejemplo, suplementos como B27 (Invitrogen), N-Acetilcisteína (Sigma) y N2 (Invitrogen) estimulan la proliferación de algunas células. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular se complementa con uno o más de estos suplementos, por ejemplo uno, dos cualesquiera o los tres de estos suplementos.
En otras formas de realización, el medio de cultivo celular se complementa con exendina-4. La exendina-4, un péptido de 39 aminoácidos, activa los receptores GLP-1 (péptido 1 similar al glucagón) para aumentar el AMPc intracelular en las células acinares pancreáticas y no tiene ningún efecto sobre los receptores VIP (péptido intestinal vasoactivo). Un medio de cultivo para uso en la invención puede comprender uno o más oligoelementos, tales como iones de bario, bromio, cobalto, yodo, manganeso, cromo, cobre, níquel, selenio, vanadio, titanio, germanio, molibdeno, silicio, hierro, flúor, plata, rubidio, estaño, circonio, cadmio, zinc y/o aluminio.
El medio puede comprender un agente reductor, como beta-mercaptoetanol en una concentración de aproximadamente 0,1 mM.
Un medio de cultivo de la invención puede comprender uno o más agentes adicionales, tales como nutrientes o factores de crecimiento previamente reportados para mejorar el cultivo de células madre, tales como colesterol/transferrina/albúmina/insulina/progesterona, putrescina, selenito/otros factores.
Un medio de cultivo de la invención se puede difundir en una matriz extracelular (MEC). En un método preferido de la invención, se unen fragmentos de tejido aislados o células madre epiteliales aisladas a una MEC. La MEC está compuesta por una variedad de polisacáridos, agua, elastina y glicoproteínas, donde las glicoproteínas comprenden colágeno, entactina (nidógeno), fibronectina y laminina. La MEC es secretada por células del tejido conectivo. Se conocen diferentes tipos de MEC, que comprenden diferentes composiciones que incluyen diferentes tipos de glicoproteínas y/o diferentes combinaciones de glicoproteínas. Dicha MEC se puede proporcionar cultivando células productoras de MEC, tales como por ejemplo células de fibroblastos, en un receptáculo, antes de la eliminación de estas células y la adición de fragmentos de tejido aislados o células madre epiteliales aisladas. Ejemplos de células productoras de matriz extracelular 1 son los condrocitos, que producen principalmente colágeno y proteoglicanos, los fibroblastos, que producen principalmente colágeno tipo IV, laminina, procolágenos intersticiales y fibronectina, y miofibroblastos colónicos que producen principalmente colágenos (tipo I, III y V), condroitina. proteoglicano sulfato, ácido hialurónico, fibronectina y tenascina-C. Alternativamente, dicho MEC se proporciona comercialmente. Ejemplos de matrices extracelulares disponibles comercialmente son proteínas de la matriz extracelular (Invitrogen) y preparaciones de membrana basal de células de sarcoma de ratón Engelbreth Holm-Swarm (EHS) (p. ej. Matrigel™ (BD Biosciences)). Se puede utilizar un material de matriz extracelular sintético, como ProNectin (Sigma Z378666). Si se desea, se pueden usar mezclas de materiales de matriz extracelular. El uso de una MEC para cultivar células madre mejoró la supervivencia a largo plazo de las células madre y la presencia continua de células madre indiferenciadas. En ausencia de una MEC, los cultivos de células madre no pudieron cultivarse durante períodos más prolongados y no se observó una presencia continua de células madre indiferenciadas. Además, la presencia de una MEC permitió el cultivo de organoides tisulares tridimensionales, que no podrían cultivarse en ausencia de una MEC. El material de la matriz extracelular normalmente será una gota en el fondo del plato en el que están suspendidas las células. Normalmente, cuando la matriz se solidifica a 37°C, se añade el medio y se difunde en el MEC. Las células del medio se adhieren a la MEC mediante la interacción con su estructura superficial, por ejemplo, con las integrinas. Se puede usar una solución de fibronectina de aproximadamente 1 mg/ml (solución madre) usada a aproximadamente 1 pg/cm2 para recubrir un recipiente de cultivo celular, o entre aproximadamente 1 pg/cm2 y aproximadamente 250 pg/cm2, o a aproximadamente 1 pg/cm2 a aproximadamente 150 pg/cm2. En algunas formas de realización, un recipiente de cultivo celular se recubre con fibronectina a entre 8 pg/cm2 y 125 pg/cm2.
Un ejemplo de una MEC para uso en un método de la invención comprende al menos una glicoproteína, tal como laminina.
Una MEC preferida para usar en un método de la invención comprende al menos dos glicoproteínas distintas, tales como dos tipos diferentes de colágeno o un colágeno y laminina. El MEC puede ser una matriz extracelular de hidrogel sintético o un MEC de origen natural. Matrigel™ (BD Biosciences) proporciona otro MEC preferido, que comprende laminina, entactina y colágeno IV. En algunas formas de realización, la matriz extracelular es una matriz extracelular que contiene laminina como Matrigel™ (BD Biosciences).
En algunas formas de realización, la célula madre única, población de células o fragmento de tejido se incluye en matrigel, que opcionalmente tiene un factor de crecimiento reducido y/o está libre de rojo de fenol.
En algunas formas de realización, el medio de cultivo se coloca encima del MEC. el medio de cultivo se puede retirar y reponer cuando sea necesario. En algunas formas de realización, el medio de cultivo se repone cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. Si se “agregan” o “eliminan” componentes del medio, entonces esto puede significar en algunas formas de realización que el medio en sí se elimina del MEC y luego se elimina un nuevo medio que contiene el componente “agregado” o con el componente “eliminado” excluido se coloca en el MEC.
En algunas formas de realización, el medio de cultivo de la invención está en contacto con una matriz extracelular o una matriz 3D que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular, como las integrinas.
En algunas formas de realización, el medio de cultivo basal comprende o consiste en DMEM/F12 avanzado suplementado con penicilina/estreptomicina, HEPES 10 mM, Glutamax, 1x N2, 1x B27 (todos de Invitrogen) y W-acetilcisteína 1 mM (Sigma)).
Ejemplos de medios de cultivo de la invención
En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende un inhibidor de TGF-beta que se une y reduce la actividad de ALK5 y un inhibidor de p38 que se une a p38 y reduce la actividad, como se reivindica. Por ejemplo, en una forma de realización el medio de cultivo celular comprende A83-0l y/o SB202190, preferiblemente A83-01 SB202190. Sorprendentemente se ha descubierto que el uso de A83-01+SB202190 juntos en un medio de cultivo de la invención aumenta sinérgicamente el número de pases de organoides de colon humano. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende WENR+A83-01+SB202190. En una forma de realización, los medios de cultivo celular comprenden WENR+A83-01+SB202190+nicotinamida. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende WENRg+nicotinamida A83-01+SB202190 (donde “g” es gastrina). En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende WENR+A83-01+Nicotinamida+FGF10. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende WENRg+A83-01+Nicotinamida+ FGF10. En una forma de realización, el medio de cultivo de 30 células comprende WENRg+A83-01 Nicotinamida+FGF10+SB202190. En una forma de realización, el medio de cultivo celular se usa para obtener organoides de colon. También se proporciona un organoide de colon que se puede obtener cultivando células epiteliales usando un medio de cultivo celular como se describe en esta forma de realización.
Por ejemplo, en una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende WENRg+A83-01 FGF10, en el que el agonista de Wnt es R-espondina pero no está presente ningún otro agonista de Wnt y no está presente nicotinamida. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende EGF (p. ej. 50 ng/ml), R-espondina (p. ej. 10 % o 1 ug/ml), Noggin (p. ej. 100 ng/ml), FGF10 (p. ej. 100 ng/ml), A8301 (p. ej. 500 nM) y gastrina (p. ej. 10uM) y opcionalmente SB202190. Estos componentes se pueden agregar a un medio basal, como el medio DMEM/F12. En algunas formas de realización, el medio basal se complementa además con uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5) o todos los componentes seleccionados de la lista que comprende: P/S, Glutamax, 10nmM Hepes, B27, N2 y N-Acetilcisteína. Se ha descubierto que el uso de dicho medio de cultivo celular es útil para obtener organoides pancreáticos. También se proporciona un organoide pancreático obtenido cultivando células epiteliales usando un medio de cultivo celular como se describe en esta forma de realización. En algunas formas de realización, la gastrina o nicotinamida o la gastrina y nicotinamida se excluyen del medio de cultivo.
Medios de cultivo específicos de tejido de la invención
Los medios de cultivo particularmente preferidos se describen en los Ejemplos del presente documento. El medio de cultivo de la invención se puede adaptar para su uso con diferentes tejidos, por ejemplo como se describe a continuación.
Medios de cultivo intestinal
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para criptas del intestino delgado, tales como criptas del intestino delgado murino, comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describió anteriormente, que comprende adicionalmente: EGF, tal como EGF murino; un inhibidor de<b>M<p>, tal como Noggin murino; y R-espondina, tal como R-espondina-1 o 4 humana. En algunas formas de realización de la divulgación, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de TGF-beta (tal como A83-01) y/o un inhibidor de p38 (tal como SB202190). En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para criptas colónicas, tales como criptas colónicas murinas, comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describió anteriormente, que comprende adicionalmente: un agonista de Wnt, tal como Wnt-3A humano recombinante o medio condicionado de Wnt-3A; EGF, tal como EGF murino; un inhibidor de BMP, tal como Noggin murino; y R-espondina, tal como R-espondina-1 o 4 humana. En algunas formas de realización de la divulgación, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de TGF-beta (tal como A83-01) y/o un inhibidor de p38 (tal como SB202190).
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para células madre intestinales humanas, criptas del intestino delgado humano o criptas del colon humano (también conocido como medio de cultivo HISC), comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describió anteriormente, adicionalmente que comprende: un agonista de Wnt, tal como Wnt-3A humano recombinante o medio condicionado de Wnt-3A; FEAG; un inhibidor de BMP, como Noggin; R-espondina, tal como R-espondina-1 humana; un inhibidor de TGF-beta, tal como A83-01; un inhibidor de p38, tal como SB202190; gastrina; y nicotinamida. En algunas formas de realización, el inhibidor de p38 y/o gastrina se pueden excluir del medio de cultivo HISC.
En el presente documento se divulga un medio de cultivo para cultivar células intestinales, que comprende o consiste en un medio basal, Wnt-3a, EGF, Noggin, cualquiera de R-espondina 1-4, un inhibidor de TGF-beta, nicotinamida y preferiblemente un inhibidor de p38.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para expandir células madre de intestino delgado o colon, por ejemplo células de intestino delgado o colon humano, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), Wnt3A (medio condicionado opcionalmente), cualquiera de R-espondina 1-4 (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (preferiblemente 50-100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10 mM) , 1EGF (preferiblemente 10-50 ng/ml), gastrina (preferiblemente 10 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM). En una forma de realización adicional, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 100 nM). En una forma de realización adicional, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de Rock, por ejemplo LY2157299.
En algunas formas de realización, la divulgación describe un medio de cultivo para diferenciar células intestinales, que comprende o consiste en un medio basal, EGF, Noggin, un inhibidor de TGF-beta y un inhibidor de p38.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para diferenciar células madre del intestino delgado o del colon, por ejemplo células del intestino delgado o del colon humano, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1,2 mM) y glutamina/glutamax), Noggin (preferiblemente 50-100 ng/ml), EGF (preferiblemente 10-50 ng/ml), gastrina (preferiblemente 10 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM) y un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 100 nM). En algunas formas de realización de la divulgación, la gastrina se puede excluir de este medio de diferenciación. En algunas formas de realización de la divulgación, se puede agregar un inhibidor de la gamma-secretasa al medio de diferenciación (preferiblemente en una concentración de 1 uM). Los inhibidores de la gamma-secretasa pueden influir en las decisiones sobre el destino celular durante la diferenciación, por ejemplo hacia células secretoras, como las células caliciformes. En algunas formas de realización de la divulgación, se puede añadir un RANKL al medio de diferenciación (por ejemplo, en una concentración de 100 ng/ml). RANKL puede influir en las decisiones sobre el destino celular durante la diferenciación, por ejemplo hacia las células M.
Medios de cultivo para cáncer
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para células de cáncer de colon comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describió anteriormente, que comprende adicionalmente: un agonista de Wnt, tal como Wnt-3A humano recombinante o medio condicionado de Wnt-3A; FEAG; un inhibidor de BMP, como Noggin; R-espondina, tal como R-espondina-1 humana; un inhibidor de TGF-beta, tal como A83-01; un inhibidor de p38, tal como SB202190; gastrina; y nicotinamida.
En una forma de realización de la divulgación, el medio de cultivo para carcinoma de colon, por ejemplo carcinoma de colon humano, comprende un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM), primocina y/o PIS (antibióticos) (500x) y hepes), R-espondina (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (preferiblemente 100 ng/ml), Nicotinamida (preferiblemente 10 mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), gastrina (preferiblemente 50 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM), un inhibidor de p38, tal como SB202190 (preferiblemente 10 uM), opcionalmente PGE2 (preferiblemente 10 nM) y/o un inhibidor de Rock (preferiblemente 10 uM).
En algunas formas de realización, las células de cáncer de colon también se pueden cultivar en el medio de cultivo HISC. En algunas formas de realización, las células de cáncer de colon se pueden cultivar en el medio de cultivo HISC, en el que uno o más o todos los siguientes se excluyen del medio: EGF, Noggin, R-espondina, inhibidor de TGF-beta e inhibidor de p38. Las células cancerosas pueden tener mutaciones que activan o desactivan constitutivamente ciertas vías de crecimiento. Por ejemplo, muchos cánceres de colon provocan una activación constitutiva de la vía Wnt. En tales casos, un medio de cultivo no requeriría un agonista de Wnt. Otras mutaciones permitirían que otros factores quedaran fuera del medio como se describe anteriormente. También se pueden cultivar otros cánceres epiteliales (carcinomas) en los medios de cultivo de la invención. En una forma de realización preferida, un organoide canceroso obtenido a partir de células madre cancerosas se cultiva en un medio de cultivo que es adecuado para el crecimiento del correspondiente organoide de tejido normal obtenido a partir de células madre normales, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. Por ejemplo, un organoide de cáncer de estómago obtenido cultivando células madre de cáncer de estómago puede cultivarse en las mismas condiciones de cultivo que un organoide gástrico normal obtenido cultivando células madre gástricas, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En otro ejemplo, un organoide de cáncer de páncreas obtenido cultivando células madre de cáncer de páncreas puede cultivarse en las mismas condiciones de cultivo que un organoide pancreático normal obtenido cultivando células madre de páncreas, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En otro ejemplo, un organoide de cáncer de próstata obtenido cultivando células madre de cáncer de próstata se puede cultivar en las mismas condiciones de cultivo que un organoide de próstata normal obtenido cultivando células madre de cáncer de próstata, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En otro ejemplo, un organoide de cáncer de hígado obtenido cultivando células madre de cáncer de hígado se puede cultivar en las mismas condiciones de cultivo que un organoide de hígado normal obtenido cultivando células madre de hígado, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En muchas situaciones puede ser preferible (o al menos más conveniente) cultivar organoides cancerosos en el medio de tejido normal (sin excluir ningún factor). El medio de tejido normal debería permitir el crecimiento de cánceres con todos los orígenes genéticos, sin excluir ninguna mutación cancerosa particular.
Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona un medio de cultivo para cultivar células cancerosas, por ejemplo células madre cancerosas, tales como células de adenocarcinoma o carcinoma de un tipo de tejido de interés, en donde el medio de cultivo comprende o consiste en los componentes del medio de cultivo. usado para cultivar las células del correspondiente tipo de tejido no canceroso de interés, opcionalmente en donde uno o más de los siguientes se excluyen del medio que se usa para cultivar las células no cancerosas del tipo de tejido de interés: Wnt-3a, EGF, Noggin, R-espondina, inhibidor de TGF-beta, inhibidor de p38, nicotinamida, gastrina, FGF10 y HGF.
Medio de cultivo de adenomas
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para adenomas intestinales, tales como adenomas intestinales murinos, comprende un medio basal, por ejemplo como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente EGF, tal como EGF murino.
Medios de cultivo gástrico
Se describe en el presente documento un medio de cultivo para cultivar células gástricas, que comprende o consiste en un medio basal, Wnt-3a, EGF, Noggin, cualquiera de R-espondina 1-4, un inhibidor de TGF-beta, gastrina, nicotinamida, FGF- 10, y preferiblemente un inhibidor de p38. En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para células madre gástricas, por ejemplo células madre gástricas humanas, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1 mM), primocina y/o PIS (antibióticos) (500x) y glutaminlglutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente luglml), Noggin (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 100 ng/ml), Wnt3A (medio condicionado opcionalmente), nicotinamida (preferiblemente 5 mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), 2FGF10 (preferiblemente 200 ng/ml), gastrina (preferiblemente 1 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 2 uM). El medio de cultivo para células madre gástricas comprende además opcionalmente un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 10 nM). El medio de cultivo para células madre gástricas opcionalmente comprende además PGE2 (preferiblemente 500 nM). El medio de cultivo para células madre gástricas comprende además opcionalmente un inhibidor de Rock (preferiblemente 10 uM).
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para células madre gástricas, por ejemplo células gástricas murinas, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEMF12 avanzado, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM), primocina y/ o PIS (antibióticos) (500x) y glutaminlglutamax), cualquiera de R-espondina 1 4 (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 100 ng/ml), Wnt3A (medio condicionado opcionalmente 34), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 200 ng/ml), gastrina (preferiblemente 1 nM) y un inhibidor de Rock (preferiblemente 10 uM). En algunas formas de realización de la divulgación, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de TGF-beta (tal como A83-01) y/o un inhibidor de p38 (tal como SB202190).
Medios de cultivo de próstata
En algunas formas de realización, el medio de cultivo para expandir células madre de próstata comprende testosterona, opcionalmente dihidrotestosterona (también denominada en el presente documento DHT). La testosterona es una hormona esteroide del grupo de los andrógenos. En los seres humanos, un gran porcentaje de testosterona sufre una reducción 5a para formar el andrógeno más potente, la dihidrotestosterona. Se puede añadir testosterona, dihidrotestosterona o un imitador de testosterona (por ejemplo, una molécula que imita la actividad de la unión de testosterona a un receptor de andrógenos) a un medio de cultivo de la invención. Por lo tanto, cuando se utiliza el término testosterona, siempre se puede reemplazar por dihidrotestosterona o un imitador de testosterona. Los inventores han demostrado que la adición de testosterona a un medio de cultivo para células madre de próstata da como resultado una mayor diferenciación pero también una expansión continua de la población de células madre (por ejemplo, véanse las Figuras 41 - 45). Esto es muy sorprendente porque la literatura enseña que la testosterona juega un papel importante en la diferenciación de las células al actuar para suprimir la proliferación y mantener la diferenciación terminal (Mirochnik et al. PLoS One, 7(3), e31052, 2012; Niu et al. Oncogene 29, 3593-3604, 2010). El experto habría esperado que la adición de testosterona a un medio de cultivo para próstata daría como resultado organoides completamente diferenciados sin potencial de expansión adicional. Esto sería similar a lo que se observa cuando los organoides del colon, el páncreas y el hígado se diferencian en un medio de diferenciación. Sin embargo, por el contrario, los presentes inventores han descubierto que aunque la testosterona aumenta la diferenciación, también permite que continúe la expansión de las células madre. Por lo tanto, los organoides cultivados en un medio de cultivo que comprende testosterona comprenden sorprendentemente células madre y células diferenciadas, es decir células luminales y células basales.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para obtener un organoide de próstata comprende un medio basal y testosterona, opcionalmente dihidrotestosterona y cualquiera de R-espondina 1-4 o un imitador de R-espondina. En algunas formas de realización, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de BMP, por ejemplo Noggin. En algunas formas de realización, el medio de cultivo comprende además un ligando de receptor de tirosina quinasa, opcionalmente en el que el ligando de receptor de tirosina quinasa es un factor de crecimiento mitogénico, tal como EGF, FGF, KGF o HGF. En algunas formas de realización, el medio de cultivo para obtener un organoide prostático comprende EGF, Noggin, cualquiera o R-espondina 1-4 y testosterona.
En una forma de realización preferida de la divulgación, el medio de cultivo para células de próstata comprende un inhibidor de 3TGF-beta. En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células de próstata comprende EGF, 35 Noggin, cualquiera de R-espondina 1-4, un inhibidor de TGF-beta y testosterona. En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células de próstata comprende además un inhibidor de p38. En algunas formas de realización, un medio de cultivo para obtener un organoide prostático no comprende un inhibidor, por ejemplo un inhibidor de TGF-beta y/o un inhibidor de p38. En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células madre de próstata no comprende testosterona. En algunas formas de realización, el medio de cultivo comprende un medio basal, EGF, Noggin y cualquiera de las R-espondina 1-4 y opcionalmente un inhibidor de TGF-beta, y no comprende testosterona.
En algunas formas de realización de la divulgación, la invención proporciona un medio de cultivo para cultivar células de próstata, que comprende o consiste en un medio basal, EGF, cualquiera de R-espondina 1-4, Noggin, nicotinamida, un inhibidor de TGF-beta, y preferiblemente Wnt-3a y FGF-10. En algunas formas de realización, el medio de cultivo para cultivar células de próstata comprende además testosterona, por ejemplo (dihidro)testosterona. En algunas formas de realización, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de p38. En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células de próstata, por ejemplo de ratón, humana, normal o de carcinoma, comprende un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio opcionalmente condicionado) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (medio opcionalmente condicionado) (preferiblemente 100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml) , FGF10 (preferiblemente 100 ng/ml), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM), (Dihidro)testosterona (preferiblemente 1 nM) 10 nM y opcionalmente Wnt-3a. En algunas formas de realización, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de Rock (preferiblemente 10 uM). En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células de próstata comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190. En algunas formas de realización, en las que se cultivan células de próstata de ratón, el inhibidor de TGF-beta puede excluirse del medio de cultivo. En otras formas de realización, la nicotinamida, FGF10 y/o el inhibidor de Rock pueden excluirse del medio de cultivo.
Medios de cultivo pancreáticos
Se describe en el presente documento un medio de cultivo para expandir células de páncreas, que comprende o consiste en un medio basal, cualquiera de R-espondina 1-4, Noggin, EGF, FGF10, gastrina, un inhibidor de TGF-beta y preferiblemente exendina 4 y Wnt-3a.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para expandir células madre pancreáticas, por ejemplo células madre pancreáticas humanas, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 1 pg/ml), Noggin (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10 mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 100 ng/ml), gastrina 3 (preferiblemente 100 nM) y un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 2 uM). En una forma de realización adicional, este medio de cultivo comprende adicionalmente Wnt-3a. En una forma de realización adicional, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 100 nM). En una forma de realización adicional, este medio de cultivo comprende adicionalmente un inhibidor de Rock, por ejemplo LY2157299 (preferiblemente 10 uM). En otra forma de realización, este medio de cultivo contiene además exendina 4 (preferiblemente 50 ng/ml).
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para expandir células madre pancreáticas, por ejemplo células madre pancreáticas de ratón, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM), primocina y/o PIS (antibióticos), Hepes y glutamina/glutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente lug/ml), Noggin (medio condicionado opcionalmente) (preferiblemente 100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10 mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 100 ng/ml), gastrina (preferiblemente 100 nM) y un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 2 uM). En una forma de realización adicional, este medio de cultivo comprende adicionalmente un inhibidor de Rock, por ejemplo LY2157299 (preferiblemente 10 uM). En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células pancreáticas comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190.
En algunas formas de realización, la divulgación describe un medio de cultivo para diferenciar células de páncreas que comprende o consiste en un medio basal, noggin, EGF, FGF10, gastrina, un inhibidor de TGF-beta, inhibidor de gammasecretasa y preferiblemente exendina 4.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para diferenciar células madre pancreáticas, por ejemplo células madre pancreáticas humanas, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), Noggin (preferiblemente 100 ng/ml), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 10 nM), gastrina (preferiblemente 100 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 50 nM) e inhibidor de gamma-secretasa (DAPT/DBZ) (preferiblemente 10 uM). En otra forma de realización, este medio de cultivo contiene además exendina 4 (preferiblemente 50 ng/ml). En algunas formas de realización, el medio de cultivo para células pancreáticas comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para diferenciar células madre pancreáticas, por ejemplo células madre pancreáticas de ratón, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), EGF (preferiblemente 50 ng/ml) e inhibidor de gamma-secretasa (por ejemplo DAPT/DBZ) (preferiblemente 10 uM).
Medio de cultivo de esófago de Barrett
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de cultivo para esófago de Barrett comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describió anteriormente, que comprende adicionalmente: un agonista de Wnt, tal como Wnt-3A humano recombinante o medio condicionado de Wnt-3A; EGF; un inhibidor de BMP, tal como Noggin; R-espondina, tal como R-espondina-1 humana; un inhibidor de TGF-beta, tal como A83-01; un inhibidor de p38, tal como SB202190; gastrina; nicotinamida; y un FGF, tal como FGF10 humano (es decir HISC+FGF). En algunas formas de realización, la gastrina se excluye de este medio de cultivo.
En el presente documento se divulga un método para obtener un organoide de esófago de Barrett, en donde el método comprende cultivar epitelio aislado del esófago de Barrett durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días en medio de cultivo HISC, que opcionalmente comprende adicionalmente FGF10; y retirar la nicotinamida y SB202190 después de los primeros 1, 2, 3, 4 o más días. En algunas formas de realización, el medio de cultivo comprende adicionalmente un inhibidor de Notch, tal como DBZ. En algunas formas de realización, un organoide de esófago de Barrett cultivado en presencia de un inhibidor de Notch no comprende casi ninguna o ninguna célula proliferativa, y comprende más células caliciformes en relación con un organoide cultivado en ausencia de un inhibidor de Notch (véase figura 5).
Medios de cultivo de hígado
En algunas formas de realización, las células hepáticas se pueden cultivar en un primer medio de cultivo de “expansión” (también denominado en el presente documento EM), seguido preferiblemente por el cultivo de las células en un segundo medio de cultivo de “diferenciación” (también denominado en el presente documento MD). Sin embargo, en algunas formas de realización, la etapa de diferenciación en medio MD no se lleva a cabo, por ejemplo, en algunos métodos, las células se trasplantan y se dejan diferenciarin vivo.De manera similar, existen medios de cultivo de expansión y medios de cultivo de diferenciación para otros tejidos, como el páncreas, el intestino delgado y el colon (véase arriba).
En una forma de realización de la divulgación, el medio de expansión del hígado comprende EGF, un agonista de Wnt, 25 FGF y nicotinamida. Preferiblemente, el agonista de Wnt es R-espondina 1-4 (por ejemplo, una cualquiera o más de R-espondina 1,2, 3 y 4) y por tanto el medio de expansión se denomina “ERFNic”. Un medio de expansión particularmente preferido comprende además HGF y se denomina “ERFHNic”.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de expansión del hígado se complementa con un inhibidor de TGF 30 beta. En algunas formas de realización, TGF-beta está presente al menos 5 nM, por ejemplo, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 300 nM, al menos 450 nM, al menos 475 nM, por ejemplo 5 nM-500 mM, 10 nM-100 mM, 50 nM-700 uM, 50 nM-10 uM, 100 nM-1000 nM, 350-650 nM o más preferiblemente 500 nM. La presencia de un inhibidor de TGF-beta en los medios de expansión es particularmente preferida para formas de realización de células humanas.
En el presente documento se divulga un medio de cultivo para expandir células hepáticas, que comprende o consiste en un medio basal, cualquiera de R-espondina 1-4, Noggin, nicotinamida, EGF, FGF10, HGF, gastrina, un inhibidor de TGF-beta y PGE2, y preferiblemente Wnt-3a.
En algunas formas de realización, el medio de expansión del hígado comprende además un inhibidor de p38.
En algunas formas de realización, el medio de expansión del hígado se complementa con un activador de la vía de señalización de las prostaglandinas (también llamado activador de la vía de las prostaglandinas) (véase Figura 24). Por ejemplo, el medio de expansión del hígado puede complementarse con uno o más de los compuestos seleccionados de la lista que comprende: fosfolípidos, ácido araquidónico (AA), prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina G2 (PGG2), prostaglandina F2 (PGF2), prostaglandina H2 (PGH2), prostaglandina D2 (PGD2). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de expansión del hígado se complementa con PGE2 y/o AA. En algunas formas de realización, se añade PGE2 al medio de expansión del hígado hasta una concentración final de al menos 10 nM, al menos 30 nM, al menos 40 nM, al menos 45 nM, al menos 50 nM, por ejemplo entre 10 nM y 500 nM, entre 10 nM y 10 nM y 400 nM, entre 10 nM y 300 nM, entre 10 nM y 200 nM, entre 10 nM y 100 nM, entre 20 nM y 50 nM. En una forma de realización preferida, se añade PGE2 al medio de expansión del hígado hasta una concentración final de 50 nM. En algunas formas de realización, se añade AA al medio de expansión del hígado hasta una concentración final de al menos 1 ug/ml, por ejemplo al menos 3 ug/ml, al menos 5 ug/ml, al menos 8 ug/ml, al menos 9 ug/ml, al menos 10 ug/ml, entre 1 ug/ml y 1000 ug/ml, entre 1 ug/rn1 y 500 ug/ml, entre 1 ug/ml y 100 ug/ml, entre 1 ug/ml y 50 ug/ml, o entre 5 ug/ml 20 y 10 ug/ml. En una forma de realización preferida, se añade<a>A al medio hasta una concentración final de 10 ug/ml.
En una forma de realización preferida de la divulgación, el medio de expansión hepática se complementa con un inhibidor de TGF-beta y un activador de la vía de señalización de prostaglandinas (por ejemplo, PGE2 y/o AA) y opcionalmente un inhibidor de p38.
En formas de realización preferidas, el medio de expansión del hígado comprende adicionalmente gastrina.
En una forma de realización de la divulgación, el medio de diferenciación hepática comprende EGF, un inhibidor de TGF-beta, FGF (por ejemplo, FGF10, FGF2 o cualquier otro miembro de la familia de FGF adecuado) y un inhibidor de Notch. En una forma de realización de la divulgación, el inhibidor de TGF-beta es A83-01 y/o el inhibidor de Notch es DAPT. Este medio de diferenciación se denomina en el presente documento “EAFD” y es un medio de diferenciación preferido de la invención. Opcionalmente, el FGF puede sustituirse por HGF o, alternativamente, tanto el FGF como el HGF pueden estar presentes o ausentes en el medio de diferenciación. En algunas formas de realización de la divulgación, el EGF podría reemplazarse por HGF u otro ligando del receptor tirosina quinasa. También se puede añadir dexametasona, por ejemplo en una concentración entre 10uM y 10uM. El medio de diferenciación hepática puede incluir opcionalmente un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 o AA. Sin embargo, este componente también puede excluirse del medio de diferenciación.
En algunas formas de realización de la divulgación, también se puede agregar oncostatina M, por ejemplo, en un rango de concentración entre 1 ng/ml y 1 mg/ml, para ayudar en la proporción de diferenciación a hepatocitos.
En algunas formas de realización, la divulgación describe un medio de cultivo para diferenciar células hepáticas que comprende o consiste en un medio basal, Noggin, EGF, gastrina, un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de gammasecretasa tal como DAPT o DBZ, y preferiblemente Wnt-3a.
En algunas formas de realización de la divulgación, las células hepáticas pueden cultivarse inicialmente en un medio de expansión que contiene adicionalmente Wnt y Noggin, por ejemplo un medio “ENRW” que contiene EGF, Noggin, R-espondina y Wnt (por ejemplo, Wnt-3A), opcionalmente un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 o AA, opcionalmente un inhibidor de TGF-beta y opcionalmente FGF, HGF, Nicotinamida. En una forma de realización preferida, el medio de expansión hepática se complementa con uno de, o más preferiblemente, un inhibidor de TGF-beta y un activador de la vía de señalización de prostaglandinas (por ejemplo, PGE2 y/o AA).
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de expansión para el hígado comprende EGF, Noggin, Gastrina, FGF, Nicotinamida, un inhibidor de TGF-beta tal como A83-01, HGF, R-espondina 1-4 (p. ej. cualquiera 15 uno o más de R-espondina 1, 2, 3 y 4) y PGE2.
En una forma de realización preferida, las células hepáticas pueden cultivarse inicialmente en un medio de expansión que contiene EGF, noggin, gastrina, FGF10, nicotinamida, A8301, HGF y cualquiera de R-espondina 1-4 suplementado con PGE2 y/o AA. Las respuestas 1 a 4 pueden proporcionarse en forma de medios condicionados Rspo. Por ejemplo, los medios de expansión pueden contener EGF (100 ng/ml, Invitrogen); noggin (25 ng/ml, peprotech); gastrina (10nM, sigma); FGF10 (p. ej. 100 ng/ml, peprotech); nicotinamida (10 mM, sigma); A8301 (500 nM, Tocris); hGf (50 ng/ml, peprotech); medios condicionados Rspo (10 %, p. ej. 1ug/ml) suplementado con PGE2 (50 nM) y/o AA (10 ug/ml). El medio de expansión también puede contener un inhibidor de Rock.
Cuando se expanden células hepáticas de ratón, se pueden excluir uno o más de los siguientes componentes del medio de cultivo descrito anteriormente: inhibidor de TGF-beta (p. ej. A83-01) y PGE2.
Los inventores han descubierto que este medio es óptimo para estimular la expansión inicial de las células durante los primeros días. Por lo tanto, este primer medio de expansión a veces se denomina en el presente documento EM1. En algunas formas de realización, Wnt y Noggin se eliminan después de aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o más, por ejemplo 2 semanas, 1 mes, 5 semanas, 8 semanas, 2 semanas. meses 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, 14 meses o más. En algunas formas de realización, las células se pueden expandir luego en un medio de expansión de la invención, como se describió anteriormente, que no contiene Wnt o Noggin. Este segundo medio de expansión se denomina a veces en el presente documento EM2. En algunas formas de realización, las células se cultivan en EM2 durante aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o un período de tiempo más largo, tal como 3, 4, 5, 10, 20 o más semanas. A continuación, el medio de cultivo se puede cambiar a un medio de diferenciación optimizado, como se describió anteriormente, que contiene un inhibidor de TGF-beta y un inhibidor de Notch. Normalmente, el medio de diferenciación no contiene un agonista de Wnt, R-espondina o nicotinarnida. En algunas formas de realización, el medio de diferenciación no contiene un activador de la vía de las prostaglandinas, como PGE2 o AA. 5 Esto favorece la diferenciación de las células hacia hepatocitos y colangiocitos maduros. Estas células son adecuadas para trasplantar a humanos o animales.
Medio de expansión (EM2) para hígado:
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un medio de cultivo celular que comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se agrega: Factor de crecimiento epidérmico, un FGF capaz de unirse a FGFR2 o FGFR4, preferiblemente FGF10 como factor de crecimiento mitogénico, nicotinamida y preferiblemente un agonista de Wnt, preferiblemente R-espondina 1-4. Este medio se conoce como EM2. Este medio “EM2” se prefiere para expandir las células del hígado.
En algunas formas de realización de la divulgación, EM2 comprende un activador de la vía de las prostaglandinas tal como PGE2 y/o AA.
En algunas formas de realización de la divulgación, EM2 comprende un inhibidor de TGF-beta tal como A83-01. Preferiblemente, el agonista de Wnt es la R-espondina 1-4. Un medio que comprende EGF, R-espondina 1-4, FGF y nicotinamida se denomina en el presente documento ERFNic.
En algunas formas de realización, el medio EM2 no comprende noggin y, más preferiblemente, no comprende un inhibidor de BMP. En algunas formas de realización, el medio EM2 no comprende Wnt, por ejemplo Wnt-3a.
En algunas formas de realización, HGF está presente además de FGF. Un medio preferido que comprende HGF además de FGF es ERFHNic (EGF R-espondina (preferiblemente R-espondina 1-4) Fg F (preferiblemente FGF10) HGF Nicotinamida un inhibidor de la vía de las prostaglandinas tal como PGE2 y/o AA y un inhibidor TGF-beta. Los inventores han descubierto que el medio ERFHNic que contiene el inhibidor de TGF-beta y el activador de la vía de las prostaglandinas es el medio óptimo para la expansión celular a largo plazo. En ausencia de HGF, las células no permanecieron viables en cultivo durante más de tres meses. Además, en ausencia de HGF, después de 10 pases, las células mostraron una desventaja en el crecimiento en comparación con las células cultivadas en presencia de HGF, como lo demuestra una menor proporción de proliferación. En particular, después de 15 pases, las células no estaban creciendo como organoides en la misma proporción de velocidad en ausencia de HGF que en presencia de HGF. Por tanto, se descubrió que el HGF era esencial para mantener una buena tasa de proliferación durante el cultivo a largo plazo. Así, la divulgación describe el uso de un medio ERFHNic para cultivar células durante al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, más preferiblemente al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 24, al menos 25, al menos 30 o más meses, por ejemplo 3 o más años. En la práctica, algunas formas de realización de la divulgación comprenden el uso de EM2 para aproximadamente 20-50 pases de las células. Por ejemplo, las células se pueden dividir de 4 a 8 veces una vez por semana durante 7 a 10 semanas seguidas. Preferiblemente, las células se expandirán a una velocidad de aproximadamente 4-5 veces por semana o más de dos duplicaciones de población por semana. La divulgación describe además el uso de un medio ERFHNic de la invención para cultivar células durante al menos 8 pases, por ejemplo, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60 pases o entre 15 y 35 pases, por ejemplo aproximadamente 20 a 30 pases. En algunas formas de realización de la divulgación, un inhibidor de TGF-beta tal como A83-01 está presente adicionalmente en el medio EM2. Esto es particularmente útil cuando se cultivan células humanas o 10 organoides. En algunas formas de realización, el A83-01 está presente en una concentración de entre 400-600 nM, por ejemplo 450-550 nM, 470-530 nM o aproximadamente 500 nM. En formas de realización en las que un inhibidor de TGF-beta está presente en EM2, preferiblemente no está presente un inhibidor de Notch. En algunas formas de realización, EM2 comprende adicionalmente un inhibidor de p38.
Medio de expansión (EMI) para hígado:
En un aspecto, la divulgación describe un medio de cultivo celular que comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se añade EGF, un inhibidor de BMP, R-espondina Wnt. Preferiblemente, el inhibidor de BMP es Noggin y el medio e M1 se denomina “ENRW” (EGF, Noggin, R-espondina y Wnt (p. ej. Wnt3A)). Este medio se conoce como<e>M<i>. En algunas formas de realización, EM1 comprende adicionalmente un activador de la vía de las prostaglandinas tal como PGE2 y/o AA. En algunas formas de realización, EM1 comprende un inhibidor de TGF-beta tal como A83-01. Más preferiblemente, el EM1 comprende adicionalmente un activador de la vía de las prostaglandinas y un inhibidor del TGF-beta. Los inventores han descubierto que un medio que contiene Wnt y Noggin es ideal para estimular la expansión inicial de las células. Por lo tanto, en algunas formas de realización, el medio EM1 se usa durante solo 1 pase o 1 semana, pero también se prevé que el medio EM1 se pueda usar durante aproximadamente un año porque no es perjudicial para las células. Así, en algunas formas de realización, se usa un medio EM1 para cultivar células desde el día 0 hasta el día 10, por ejemplo desde los días 0-7, días 0-6, días 0-5, días 0-4, días 0-3, días 0-2, días 0-1, donde el día 0 es el día en que las células se aíslan de su tejido de origen y el día 1 es el día posterior o se usa durante 1 o más semanas, por ejemplo 2, 3, 4 o más semanas. o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses. En algunas formas de realización, el medio EM1 se usa solo durante el primer día o los dos primeros días de cultivo. En algunas formas de realización, el medio EM1 se usa para 1 o más pases, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o más pases, por ejemplo, 20-30 pases, 30-35 pases, 32-40 pases o más. En algunas formas de realización, el medio EM1 se usa después de una etapa de congelación o cualquier otra etapa de transporte que implique un cambio de medio o temperatura que no se combina con el crecimiento óptimo. Este medio “EM1 ” se prefiere para células hepáticas en expansión.
El medio EM1 se complementa con uno o más de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en FGF, HGF, Nicotinamida, gastrina, B27, N-acetilcisteína y N2. En el caso de comenzar los cultivos a partir de una solución madre congelada o de una sola célula, el medio EM1 se complementa preferiblemente con un inhibidor de ROCK. Y27632 es el inhibidor de ROCK preferido para su uso en la invención.
Por tanto, en el presente documento se describe un medio de cultivo celular que comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se añade: factor de crecimiento epidérmico, un FGF (por ejemplo, un FGF capaz de unirse a FGFR2 o FGFR4), preferiblemente FGF10 y HGF como factores de crecimiento mitogénicos,
un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 y/o AA;
un inhibidor de TGF-beta;
gastrina, Nicotinamida, B27, N2 y N-Acetilcisteína, y preferentemente;
un inhibidor de BMP, preferiblemente Noggin; y
un agonista de Wnt, preferiblemente R-espondina 1 y/o Wnt-3a.
También se añaden B27 (lnvitrogen), N-acetilcisteína (Sigma) y N2 (Invitrogen), gastrina (Sigma) y nicotinamida (Sigma) al medio definido anteriormente y se cree que controlan la proliferación de las células y ayudan con la estabilidad del ADN. En el contexto de la invención, la nicotinamida también se denomina en el presente documento “Nic”. El 'Suplemento de N2' está disponible en Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com; n° de catálogo 17502-048; y de PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; www.paa.com; n° de catálogo F005-004; Bottenstein & Sato, PNAS, 76(1 ):514-517, 1979. PAA Laboratories GmbH suministra el suplemento N2 como un concentrado líquido 100x, que contiene 500 pg/ml de transferrina humana, 500 pg/ml de insulina bovina, 0,63 pg/ml de progesterona, 1611 pg/ml de putrescina y 0,52 pg/ml de selenito de sodio. El suplemento de N2 puede agregarse a un medio de cultivo como concentrado o diluirse antes de agregarlo a un medio de cultivo. Puede usarse a una concentración final de 1x o a otras concentraciones finales. El uso del suplemento de N2 es una forma conveniente de incorporar transferrina, insulina, progesterona, putrescina y selenito de sodio en un medio de cultivo de la invención. En algunas formas de realización en las que el medio comprende B27, no comprende también N2. Por lo tanto, las formas de realización de la presente invención pueden adaptarse para excluir N2 cuando B27 está presente, si se desea.
'Suplemento B27' (disponible en Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com; actualmente número de catálogo. 17504 044; y de PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; www.paa.com; n° de catálogo F01-002; Brewer et al., J Neurosci Res., 35(5):567-76, 1993) pueden usarse para formular un medio de cultivo que comprende biotina, colesterol, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, retinol, acetato de retinilo, selenito de sodio, triyodotironina (T3), DL-alfa tocoferol (vitamina E), albúmina, insulina y transferrina. El suplemento B27 es suministrado por PAA Laboratories GmbH como un concentrado líquido 50x, que contiene, entre otros ingredientes, biotina, colesterol, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, retinol, acetato de retinilo, selenito de sodio, tri-yodotironina (T3), DL-alfa tocoferol (vitamina E), albúmina, insulina y transferrina. De estos ingredientes, al menos el ácido linolénico, el retinol, el acetato de retinilo y la triyodotironina (T3) son agonistas de los receptores de hormonas nucleares. El suplemento B27 puede agregarse a un medio de cultivo como concentrado o diluirse antes de agregarlo a un medio de cultivo. Puede usarse a una concentración final 1x o a otras concentraciones finales. El uso del suplemento B27 es una forma conveniente de incorporar biotina, colesterol, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, retinol, acetato de retinilo, selenito de sodio, triyodotironina (T3), DL-alfa tocoferol (vitamina E), albúmina, insulina y transferrina en un medio de cultivo de la invención.
Por ejemplo, un medio de cultivo celular puede comprender o consistir en un medio basal al que se añade: EGF y R-espondina 1 suplementados con FGF10, HGF y nicotinamida; por ejemplo, EGF (50 ng/ml) y R-espondina 1 (1 ug/ml) suplementados con FGF10 (100 ng/ml), HGF (25-50 ng/ml), nicotinamida (1 pM), un activador de la vía de las prostaglandinas, tales como PGE2 (50 nM) y/o AA (10 ug/ml) y un inhibidor de TGF-beta tal como A83-01 (500 nM). En algunas formas de realización, el medio comprende adicionalmente un inhibidor de p38. Los inventores han descubierto que este medio puede usarse para la expansión de células a largo plazo. Por lo tanto, se prefiere este medio de cultivo celular para su uso como EM2 de la invención. El medio basal se complementa preferentemente con B27, N2 y 200 ng/ml de N-acetilcisteína. En algunas formas de realización, el medio basal es DMEM/F12 avanzado. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro medio basal adecuado.
Otro ejemplo de un medio de cultivo celular, y método de uso de este medio, comprende o consiste en DMEM/F12 avanzado suplementado preferiblemente con B27, N2, 200 ng/ml de N-acetilcisteína, 50 ng/ml de EGF, 1 pg/ml de R-espondina 1, gastrina 10 nM, FGF10 100 ng/ml, nicotinamida 10 mM, HGF 50 ng/ml, medio condicionado Wnt al 50 %, un activador de la vía de las prostaglandinas, como PGE2 (50 nM) y/o AA (10 ug/ml) y inhibidor TGF-beta tal como A83-01 (500 nM) y, preferiblemente, 10-100 ng/ml de Noggin. Los medios acondicionados Wnt comprenden Advanced DMEM, P/S, B27, N2 y también FCS. Las células 293T transfectadas con el plásmido de expresión Wnt3A producen Wnt. Se toma todo el medio después de unos días (es decir, con Wnt secretado) y utilizado como fuente de Wnt.
Por lo tanto, en el presente documento se describe un medio de cultivo celular, que comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se añade:
Factor de crecimiento epidérmico, un FGF capaz de unirse a FGFR2 o FGFR4, preferiblemente FGF10 y HGF como factores de crecimiento mitogénicos,
activador de la vía de las prostaglandinas, como PGE2 y/o AA,
un inhibidor del TGF-beta,
gastrina, nicotinamida, B27, N2 y N-acetilcisteína, y preferentemente
un inhibidor de BMP, más preferentemente noggin y
un agonista de Wnt, más preferentemente R-espondina 1 y/o Wnt-3a.
Se divulga en el presente documento un primer medio de cultivo preferido que comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se añade:
factor de crecimiento epidérmico, FGF10 y HGF como factores de crecimiento mitogénicos,
un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 y/o AA,
un inhibidor de TGF-beta;
gastrina, nicotinamida, B27, N2 y N-acetilcisteína,
un inhibidor de BMP más preferiblemente Noggin y
un agonista de Wnt, más preferiblemente R-espondina 1 y Wnt-3a.
En algunas formas de realización, se añade un inhibidor de p38 al medio de expansión.
Este medio se puede utilizar como medio de cultivo de células EM1 para estimular la expansión inicial de las células. En algunas formas de realización, el medio usado como medio de cultivo de células EM1 comprende todos los componentes de un medio de cultivo EM2 de la invención y además comprende Wnt-3a y Noggin.
En formas de realización de la divulgación en las que el medio basal se complementa con N-Acetilcisteína, B27 y N2, preferiblemente se agregan los siguientes a los medios de cultivo: EGF, R-20 espondina 1, gastrina, FGF10, Nicotinamida y HGF y medios acondicionados con Wnt y un activador de la vía de las prostaglandinas, como PGE2 y/o AA. Preferiblemente, el medio basal se complementa con N-Acetilcisteína, EGF, R-espondina 1, gastrina, FGF10, nicotinamida y medios condicionados HGF y Wnt y un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 y/o AA de acuerdo con las cantidades descritas anteriormente. Preferiblemente, un inhibidor de TGF-beta también está presente en las cantidades descritas en el presente documento.
Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con 150 ng/ml a 250 ng/ml de N-Acetilcisteína; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 200 ng/ml de N-acetilcisteína. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con 40 ng/ml a 60 ng/ml de EGF; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 50 ng/ml de EGF. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con 0,5 pg/ml a 1,5 pg/ml de R-espondina 1; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 1 pg/ml de R-espondina 1. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con gastrina de 5 nM a 15 nM; Preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 10 nM de gastrina. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con 25-200 ng/ml de FGF10, por ejemplo de 70 ng/ml a 130 ng/ml de FGF10; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 100 ng/ml de FGF10. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con nicotinamida de 5 mM a 15 mM; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 1 mM de nicotinamida. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con 25 ng/ml a 100 ng/ml de HGF, por ejemplo 35 ng/ml a 65 ng/ml de HGF; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 50 ng/ml de HGF. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal se puede complementar con un 35 % a un 65 % de medio acondicionado Wnt; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 50 % de medio acondicionado Wnt.
Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de expansión del hígado se complementa con un activador de la vía de señalización de prostaglandinas (véase Figura 24). Por ejemplo, el medio de expansión del hígado puede complementarse con uno cualquiera o más de los compuestos seleccionados de la lista que comprende: 15 Fosfolípidos, ácido araquidónico (AA), prostaglandina E2 (Pg E2), prostaglandina G2 (PGG2), prostaglandina F2 (PGF2), prostaglandina H<2>(PGH2), prostaglandina D2 (PGD2). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de expansión del hígado se complementa con PGE2 y/o AA. En algunas formas de realización, se añade PGE2 al medio de expansión del hígado hasta una concentración final de al menos 10 nM, por ejemplo entre 10 nM y 500 nM, entre 10 nM y 400 nM, entre 10 nM y 300 nM, entre 10 nM y 300 nM. y 200 nM, entre 10 nM y 100 nM, entre 20 nM y 50 nM. En una forma de realización preferida, se añade PGE2 al medio de expansión del hígado hasta una concentración final de 50 nM. En algunas formas de realización, se añade AA al medio de expansión del hígado hasta una concentración final de al menos 1 ug/ml, por ejemplo entre 1 ug/ml y 1000 ug/ml, entre 1 ug/ml y 500 ug/ml, entre 1 ug/ml y 1 ug/ml y 100 ug/ml, entre 1 ug/ml y 50 ug/ml, o entre 5, 25 ug/ml y 10 ug/ml. En una forma de realización preferida, se añade AA al medio hasta una concentración final de 10 ug/ml.
En algunas formas de realización, una o ambas de gastrina y N2 no están presentes en el medio de cultivo celular.
Preferiblemente, el medio basal es DMEM/F12 avanzado.
Este primer medio de cultivo (por ejemplo, EM1, EM2 o tanto EM1 como EM2) se usa preferiblemente durante las dos primeras semanas del método de cultivo de la invención. Sin embargo, se puede utilizar durante un período de tiempo más corto, como 1, 2, 3, 5, 7 o 10 días, o un período de tiempo más largo, como 3, 4, 5, 10, 20 o más semanas. 5 meses o más, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más.
Medio de diferenciación (MD) para hígado:
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un segundo medio de cultivo celular que comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se añade: EGF, un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de Notch y un activador de la vía de las prostaglandinas, como PGE2 y/o AA. Los inventores han descubierto que este medio es útil para diferenciar células. El medio utilizado para diferenciar las células puede denominarse en el presente documento MD.
Preferiblemente, el segundo medio de cultivo celular también comprende FGF y/o HGF.
En una forma de realización de la divulgación, el segundo medio de cultivo comprende o consiste en un medio basal para células animales o humanas al que se añade:
factor de crecimiento epidérmico, FGF10 y HGF como factores de crecimiento mitogénicos;
un inhibidor de Notch;
un inhibidor de TGF-beta; y
un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 y/o AA.
En una forma de realización de la divulgación, el inhibidor de TGF-beta es A83-01 y/o el inhibidor de Notch 15 es DAPT.
En otra forma de realización de la divulgación, el medio de cultivo de células MD comprende adicionalmente dexametasona. En otra forma de realización de la divulgación, el medio de cultivo de células MD comprende adicionalmente Oncostatina M. En otra forma de realización de la divulgación, el medio de cultivo de células MD comprende adicionalmente gastrina.
Un segundo medio de cultivo celular preferido, y un método para usar este medio, se describen en los ejemplos, y comprende o consiste en un medio basal al que se añade: 50 ng/ml de EGF, 100 ng/ml de FGF10, 50 nM de A8301 y 10 uM DAPT. Puede usarse DMEM/F12 avanzado como medio basal al igual que cualquier otro medio basal adecuado.
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de diferenciación para células hepáticas, por ejemplo para células hepáticas humanas, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1 mM) glutamina/glutamax), Noggin (preferiblemente 100 ng/ml), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), gastrina (preferiblemente 10uM), inhibidor de TGF-beta, tal como A83-01 (preferiblemente 50 nM) y un inhibidor de gamma-secretasa (por ejemplo DAPT/DBZ) (preferiblemente 10 uM).
En algunas formas de realización de la divulgación, el medio de diferenciación para células hepáticas, por ejemplo para células hepáticas de ratón, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo, que comprende DMEM/F12 avanzado, B27 (50x), n-Acetilcisteína (preferiblemente 1 mM) glutamina/glutamax), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 100 ng/ml), gastrina (preferiblemente 10uM), inhibidor de TGF-beta, tal como A83-01 (preferiblemente 50 nM) y un inhibidor de gamma-secretasa (por ejemplo DAPT/DBZ) (preferiblemente 10 uM).
En algunas formas de realización de la divulgación, el segundo medio de cultivo celular no comprende R-espondina o Wnt. En algunas formas de realización de la divulgación, el segundo medio de cultivo celular no comprende un agonista de Wnt. En algunas formas de realización de la divulgación, el segundo medio de cultivo celular no comprende nicotinamida. En algunas formas de realización de la divulgación, el segundo medio de cultivo celular no comprende un inhibidor de BMP. En algunas formas de realización de la divulgación, el segundo medio de cultivo celular no comprende un activador de la vía de las prostaglandinas, tal como PGE2 y/o AA.
Los inventores han descubierto que R-espondina 1 y nicotinamida inhiben la expresión del marcador de hepatocitos maduros CYP3Al 1 y aún promueven la expresión de la albúmina marcadora de hepatoblastos. Por lo tanto, para aumentar la diferenciación de las células hacia destinos hepáticos más maduros, los inventores eliminaron la R-espondina y la nicotinamida del cultivo celular. Los inventores también han descubierto que la expresión de factores de transcripción biliares específicos está altamente regulada en cultivos de expansión que contienen R-espondina1, lo que indica que la expresión del gen del cultivo estaba desequilibrada hacia un destino de células más biliares. Las vías de señalización de Notch y TGF-beta se han implicado en el destino de las células biliaresin vivo.De hecho, la eliminación de Rbpj (esencial para lograr la señalización activa de Notch) da como resultado una tubulogénesis anormal (Zong Y. Development 2009) y la adición de TGF-beta a explantes de hígado facilita la diferenciación biliarin vitro(Clotman F. Genes and Development 2005). Dado que las vías de señalización de Notch y TGF-beta estaban altamente reguladas en los cultivos de hígado (Figura 22), los inventores razonaron que la inhibición del destino celular del conducto biliar podría desencadenar la diferenciación de las células hacia un fenotipo más hepatocítico. Se encontró que la adición de un inhibidor de TGF-beta (como A8301) y un inhibidor de Notch (como DAPT) a un medio de diferenciación que preferiblemente no contiene R-espondina o Wnt, mejora la expresión de marcadores de hepatocitos maduros y aumenta la número de células similares a hepatocitos (por ejemplo, ver ejemplo 5).
Medios de cultivo generales
Un medio de cultivo celular según la invención permite la supervivencia y/o proliferación y/o diferenciación de células madre epiteliales o criptas aisladas sobre una matriz extracelular. En algunas formas de realización, un medio de cultivo celular según la invención permite la supervivencia y/o proliferación y/o diferenciación de un organoide de la invención, tal como un organoide de criptas de vellosidades, un organoide de colon, un organoide pancreático, un organoide gástrico, un organoide de esófago de Barret, un organoide de adenocarcinoma o un organoide de carcinoma de colon en una matriz extracelular. En algunas formas de realización, un medio de cultivo celular según la invención permite la supervivencia y/o proliferación y/o diferenciación de un organoide de la invención, tal como un organoide del intestino delgado (criptas de vellosidades), un organoide de colon, un organoide pancreático, un organoide gástrico, un organoide de esófago de Barret, un organoide de adenocarcinoma, un organoide de carcinoma, un organoide de carcinoma de colon, un organoide de próstata o un organoide de carcinoma de próstata en una matriz extracelular. Preferiblemente, en formas de realización en las que está presente un inhibidor de TGF-beta y/o un inhibidor de p38, el medio de cultivo celular permite la supervivencia y/o proliferación, preferiblemente la supervivencia y proliferación de una población de células u organoide de la invención, como se reivindica. Preferiblemente, formas de realización en las que un inhibidor de TGF-beta y/o un inhibidor de p38 están inicialmente presentes en un medio de cultivo celular, como se reivindica, pero, a continuación, se eliminan del medio (p. ej. al no agregarlo cuando se refresca el medio), permiten la supervivencia y/o diferenciación, preferiblemente la supervivencia y diferenciación de una población de células u organoide de la invención.
En algunas formas de realización, se añade un inhibidor de p38 a cualquiera de los medios descritos en el presente documento.
El término medio de cultivo celular es sinónimo de medio, medio de cultivo o medio celular.
Usos de los medios de cultivo de la invención
La invención también se refiere al uso de un medio de cultivo de la invención para expandir y/o diferenciar una célula madre, población de células madre, fragmento de tejido u organoide.
En algunas formas de realización, la célula madre, población de células madre, fragmento de tejido u organoide se selecciona del grupo que consiste en una o más células madre intestinales, criptas del intestino delgado, criptas del colon, células madre gástricas, células madre del hígado, células madre del páncreas y células madre de próstata.
En algunas formas de realización, la célula madre, población de células madre, fragmento de tejido u organoide se puede obtener a partir de un tejido normal.
En algunas formas de realización, la célula madre, población de células madre, fragmento de tejido u organoide se puede obtener a partir de un tejido enfermo, por ejemplo de un adenoma, un carcinoma, un adenocarcinoma, un intestino de un paciente que tiene fibrosis quística o un intestino de un paciente que tiene enfermedad inflamatoria intestinal.
Células madre cultivadas según la invención
Las células madre se encuentran en muchos órganos de humanos y ratones adultos. Aunque puede haber una gran variación en las características exactas de las células madre adultas en tejidos individuales, las células madre adultas comparten al menos las siguientes características: conservan un fenotipo indiferenciado; su descendencia puede diferenciarse hacia todos los linajes presentes en el tejido pertinente; conservan capacidades de automantenimiento durante toda la vida; y son capaces de regenerar el tejido pertinente tras una lesión. Las células madre residen en una ubicación especializada, el nicho de células madre, que proporciona los contactos y señales célula-célula adecuados para el mantenimiento de dicha población de células madre. Las células madre expresan preferentemente Lgr5.
En una forma de realización, la invención proporciona una población de células o uno o más organoides que comprenden dichas células madre que se han generado u obtenido cultivando células madre o fragmentos de tejido según la invención, que se han cultivado durante al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses o más.
Una 'población' de células es cualquier número de células mayor que 1, pero es preferiblemente al menos 1 x103 células, al menos 1x104 células, al menos 1x105 células, al menos 1x106 células, al menos 1x107 células, al menos 1x108 células, o al menos menos 1x109 células.
Las células madre cultivadas según la invención pueden ser células madre humanas, tal como se reivindica. Las células madre cultivadas según la invención pueden ser células madre epiteliales, tal como se reivindica.
En algunas formas de realización, las células madre y/o cultivadas según la invención no son células madre embrionarias. En algunas formas de realización, las células madre y/o cultivadas según la invención no son células madre embrionarias humanas. Preferiblemente, las células madre son células madre adultas.
En una forma de realización preferida, las células madre pueden ser células madre epiteliales humanas. Las células madre epiteliales humanas incluyen células madre de origen de tejido epitelial humano. Estas incluyen, pero no se limitan a tejidos pancreáticos, de intestino delgado, de intestino grueso, corneales, olfatorios, respiratorios, gástricos, de hígado y piel, mamarios y/o prostáticos, por ejemplo, un tejido seleccionado del grupo que consiste en pancreático, Tejidos del intestino delgado, intestino grueso, córnea, olfativo y respiratorio. Las células madre epiteliales pueden formar los distintos tipos de células que componen el epitelio. Algunos epitelios, como la piel o el intestino, muestran una rápida renovación celular, lo que indica que las células madre residentes deben estar proliferando continuamente. Otros epitelios, como el hígado o el páncreas, muestran un recambio muy lento en condiciones normales.
Células madre intestinales
El epitelio autorrenovador del intestino delgado está ordenado en criptas y vellosidades (Gregoreff and Clevers, 2005 Genes Dev 19, 877-90). Cada célula a lo largo del eje criptas de vellosidades está polarizada, por lo que las células en la parte superior de las vellosidades intestinales, o en las posiciones superiores de las criptas del colon, son las más diferenciadas y se pierden continuamente en la luz por apoptosis. La proliferación continua de células madre que residen en la base de las criptas y la proliferación masiva de células progenitoras que residen en el medio de las criptas garantizan el reemplazo adecuado de las células desprendidas. El tiempo de renovación epitelial resultante es de 5 días en el ratón. Se sabe desde hace mucho tiempo que las células madre autorrenovables residen cerca del fondo de la cripta y producen células amplificadoras de tránsito (TA) de rápida proliferación capaces de diferenciarse hacia todos los linajes. El número estimado de células madre está entre 4 y 6 por cripta (Bjerknes y Cheng, 1999 Gastroenterology 116, 7-14). Tres tipos de células diferenciadas, enterocitos, células caliciformes y células enteroendocrinas, se forman a partir de células TA y continúan su migración en bandas coherentes a lo largo del eje criptas de vellosidades. Cada vellosidad recibe células de múltiples criptas diferentes. El cuarto tipo de célula diferenciada principal, la célula de Paneth, reside en el fondo de la cripta.
El colon se parece al intestino delgado pero con un epitelio de superficie plana en lugar de vellosidades. Las criptas del colon están organizadas como las criptas del intestino delgado. Las células de Paneth no están presentes en las criptas del colon; en su lugar existen las llamadas células de “Secreción de Cripta Profunda”. La superficie plana del epitelio contiene las células diferenciadas (colonocitos y células secretoras). En toda la cripta se encuentran células caliciformes diferenciadas, también intercaladas con células amplificadoras del tránsito.
Aislamiento de fragmentos de tejido y células madre
Las criptas se pueden aislar del intestino delgado y grueso, incluyendo el duodeno, el yeyuno, el íleon y el colon, y la región pilórica y del cuerpo del estómago mediante protocolos que son conocidos por el experto. Por ejemplo, las criptas se pueden aislar mediante la incubación de tejido aislado con agentes quelantes que liberan a las células de sus interacciones dependientes de calcio y magnesio con la membrana basal y los tipos de células del estroma. Después de lavar el tejido, se raspa la capa de células epiteliales de la submucosa con un portaobjetos de vidrio y se tritura. A esto le sigue la incubación en tripsina o, más preferentemente, EDTA y/o EGTA y la separación de fragmentos de tejido no digeridos y células individuales de las criptas usando, por ejemplo, etapas de filtración y/o centrifugación. Se pueden usar otras enzimas proteolíticas, tales como colagenasa y/o dispasa I, en lugar de tripsina. Se utilizan métodos similares para aislar fragmentos del páncreas y el estómago. Se pueden usar métodos similares para aislar fragmentos de otros tejidos descritos en el presente documento. Los medios de cultivo de la invención son adecuados para cultivar dichos fragmentos de tejido (véase Ejemplo 1).
Un medio de cultivo según la invención permite el establecimiento de condiciones de cultivo a largo plazo bajo las cuales criptas individuales sufren múltiples eventos de fisión de criptas, generando simultáneamente dominios epiteliales similares a vellosidades en los que están presentes todos los tipos de células diferenciadas. Las criptas cultivadas sufren cambios morfológicos dramáticos después de ser cultivadas. La abertura superior de las criptas recién aisladas se sella y esta región se hincha gradualmente y se llena de células apoptóticas, de forma muy similar a como las células apoptóticas se pellizcan en la punta de las vellosidades. La región de la cripta sufre continuos eventos de gemación que crean criptas adicionales, un proceso que recuerda a la fisión de las criptas. En una forma de realización preferida de la invención, los organoides comprenden extensiones similares a criptas que comprenden todos los tipos de células epiteliales diferenciadas, incluidas células proliferativas, células de Paneth, enterocitos y células caliciformes. No se identificaron miofibroblastos u otras células no epiteliales en los organoides en ninguna etapa.
La expansión de las estructuras de las criptas en ciernes crea organoides, que comprenden estructuras similares a criptas que rodean una luz central revestida por un epitelio similar a vellosidades y llena de cuerpos celulares apoptóticos. Los organoides de criptas de vellosidades comprenden una luz central revestida por un epitelio similar a una vellosidad. El lumen se abre en intervalos de tiempo consecutivos para liberar el contenido al medio.
Una estructura organoide de criptas de vellosidades similar se forma cuando se cultivan células madre epiteliales individuales. Después de aproximadamente una semana, se forman estructuras que se parecen mucho a las estructuras organoides de criptas y vellosidades que se obtienen con criptas intactas.
Los métodos para aislar células madre son conocidos y el experto puede seleccionar métodos adecuados para su uso con esta invención dependiendo del tipo de célula madre que se utilice. Por ejemplo, el aislamiento de células madre epiteliales se puede realizar usando compuestos que se unen a Lgr5 y/o Lgr6, que son marcadores de superficie celular únicos en las células madre epiteliales. Ejemplos de tales compuestos son anticuerpos anti-Lgr5 y anti-Lgr6.
En algunas formas de realización de la invención, se pueden usar células madre epiteliales Lgr5+ individuales, por ejemplo del colon, el intestino delgado o el páncreas, para formar organoides, tales como organoides de colon, criptas de vellosidades o pancreáticos, respectivamente.
En un ejemplo adicional, se pueden usar células madre epiteliales Lgr5+ individuales del hígado, la próstata o el estómago para obtener organoides, tales como organoides de hígado, próstata u estómago, respectivamente.
En una forma de realización alternativa, se pueden usar fragmentos de tejido, tales como criptas cultivadas del tracto intestinal, que comprenden células madre Lgr5+ para obtener organoides usando métodos y medios de cultivo descritos en el presente documento.
En algunas formas de realización, la única célula madre epitelial Lgr5+ o fragmento de tejido puede ser una célula madre cancerosa o un fragmento de tejido canceroso, por ejemplo de un carcinoma o adenocarcinoma. En algunas formas de realización, la única célula madre epitelial Lgr5+ puede ser una célula madre o un fragmento de tejido de una patología neoplásica o tejido enfermo, por ejemplo, esófago de Barrett, fibrosis quística o adenoma. Los organoides obtenidos a partir de material de partida canceroso, neoplásico o enfermo tienen características que se asemejan al material de partidain vivoy, por lo tanto, son útiles como herramienta de investigación para la detección de fármacos, la validación de objetivos, el descubrimiento de objetivos, la toxicología y las pruebas toxicológicas, la medicina personalizada, la medicina regenerativa y la investigación celularexvivo/modelos de órganos, por ejemplo modelos de enfermedades. En una forma de realización, la invención proporciona organoides generados u obtenidos cultivando células madre humanas o fragmentos de tejido según un método de la invención. En una forma de realización, la invención proporciona organoides de criptas de vellosidades u organoides gástricos u organoides pancreáticos u organoides de colon u organoides de esófago de Barrett u organoides de adenocarcinoma u organoides de carcinoma de colon generados u obtenidos mediante el cultivo de células madre humanas o fragmentos de tejido según un método de la invención. En una forma de realización, la invención proporciona organoides de próstata generados u obtenidos mediante el cultivo de células madre humanas o fragmentos de tejido según un método de la invención. Tal población de organoides, por ejemplo, cripvellos, organoides gástricos o pancreáticos, generados u obtenidos cultivando células madre humanas o fragmentos de tejido según un método de la invención, puede comprender cada uno más de 10, preferiblemente más de 20, más preferiblemente más de 40 organoides. Dicha colección de organoides comprende preferiblemente al menos un 10 % de células viables, más preferiblemente al menos un 20 % de células viables, más preferiblemente al menos un 50 % de células viables, más preferiblemente al menos un 60 % de células viables, más preferiblemente al menos un 70 % de células viables, más preferido preferentemente al menos un 80 % de células viables, más preferentemente al menos un 90 % de células viables. La viabilidad de las células se puede evaluar mediante tinción de Hoechst o tinción con yoduro de propidio en FACS.
Los inventores han demostrado que los medios de cultivo y los métodos de la invención se pueden usar para el cultivo de líneas celulares cancerosas, incluido el cáncer colorrectal y el adenocarcinoma (véase Ejemplo 1). Como se explica en el Ejemplo 1, la tecnología de cultivo es ampliamente aplicable como herramienta de investigación para patologías infecciosas, inflamatorias y neoplásicas. Por consiguiente, las células madre según la invención pueden ser células madre cancerosas. En algunas formas de realización de la invención, las células madre cancerosas pueden formar organoides de adenoma o de cáncer de colon. En algunas formas de realización, estos organoides comprenden células que son Ki67+ (Thermo Scientific* Cellomics, Millipore).
De manera similar, los inventores han demostrado que los medios de cultivo y los métodos de la invención pueden usarse para cultivar células madre con otros genotipos y/o fenotipos enfermos. Por ejemplo, las células madre intestinales tomadas de pacientes con fibrosis quística se pueden expandir usando los medios de cultivo y los métodos de la invención. Estas células madre mantienen el genotipo y el fenotipo de la fibrosis quística. Por lo tanto, en algunas formas de realización de la invención, las células madre se toman de un paciente con una enfermedad, por ejemplo fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal (tal como enfermedad de Crohn), carcinoma, adenoma, adenocarcinoma, cáncer de colon, diabetes (tal como tipo I o tipo II), esófago de Barrett, enfermedad de Gaucher, deficiencia de alfa-1-antitripsina, síndrome de Lesch-Nyhan, anemia, síndrome de Schwachman-Bodian-Diamond, policitemia vera, mielofibrosis primaria, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, hipercolestrolemia familiar, síndrome de Crigler-Najjar, tirosinanemia hereditaria, enfermedad de Pompe, colestasis familiar progresiva, síndrome de Hreler, SCID o SCID con fugas, síndrome de Omenn, hipoplasia cartílago-pelo, encefalitis por herpes simple, esclerodermia, osteogénesis imperfecta, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Duchenne, disqueratosis congénita, etc. En algunas formas de realización de la invención, los organoides patológicos se pueden obtener cultivando células madre extraídas de un ser humano o animal con una enfermedad. Los organoides patógenos todavía tienen características del tejido del que se obtuvieron. Por lo tanto, un organoide del intestino delgado con fibrosis quística cultivado a partir de una cripta del intestino delgado entra dentro de la definición de organoide del intestino delgado. De manera similar, un organoide de carcinoma de colon entra dentro de la definición de organoide de colon.
Existe cierta confusión en la literatura en cuanto a la definición de célula madre cancerosa. En este documento, seguimos el consenso alcanzado en un reciente taller de la AACR (Clarke et al., 2006. Cancer Res. 66:9339-44), que afirma que la célula madre cancerosa “es una célula dentro de un tumor que posee la capacidad de autorrenovarse y causar los linajes heterogéneos de células cancerosas que componen el tumor. Las células madre cancerosas sólo pueden definirse experimentalmente por su capacidad de recapitular la generación de un tumor en continuo crecimiento”. Términos alternativos en la literatura incluyen célula iniciadora de tumores y célula tumorigénica. Los ensayos para determinar la actividad de las células madre cancerosas deben abordar el potencial de autorrenovación y de propagación del tumor. Actualmente, el ensayo de referencia es el xenotrasplante en serie en ratones inmunodeficientes. Además, las células madre cancerosas en el contexto de esta invención normalmente expresan Lgr5. Sin embargo, en algunas formas de realización, las células madre/iniciadoras/propagadoras del cáncer que no expresan Lgr5 también pueden cultivarse mediante los medios de cultivo y los métodos de la invención.
Integridad genómica y fenotípica de células madre y organoides que comprenden dichas células madreLas aplicaciones clínicas y de investigación para células madre y su progenie diferenciada requieren métodos de cultivo de células madre reproducibles que proporcionen poblaciones de células de calidad adecuada. Generalmente, la expansiónin vitrode células madre tiene como objetivo proporcionar una población de células que se parezcan lo más posible a sus homólogasin vivo.Esta propiedad se denomina en el presente documento “integridad genómica y fenotípica” de las células. Los organoides obtenidos mediante el cultivo de células enfermas, como células cancerosas o células de fibrosis quística, también se parecen a sus homólogosin vivo,es decir mantienen el genotipo y/o fenotipo de su enfermedad y, por lo tanto, también mantienen su “integridad genómica y fenotípica” en ese sentido, es decir mantienen la inestabilidad genética o fenotípica característica de la enfermedad que recuerda la situaciónin vivo.Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona organoides “normales” obtenidos de tejido sano. En otras formas de realización, la invención proporciona organoides de “enfermedad”, tales como organoides de cáncer (por ejemplo, organoides de carcinoma de colon o organoides de adenocarcinoma) u organoides de fibrosis quística del intestino delgado obtenidos de tejido enfermo.
Por primera vez, los inventores han descubierto que es posible expandir células madre epiteliales humanas en cultivo, con una pérdida mínima de integridad genómica y fenotípica, durante al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses o más (véase Ejemplo 1). En las condiciones de cultivo mejoradas de la invención, los organoides intestinales humanos mostraron estructuras organoides en ciernes, en lugar de las estructuras quísticas observadas en condiciones de cultivo anteriores. Las diseminaciones en metafase de organoides de más de 3 meses revelaron consistentemente 46 cromosomas en cada una de las 20 células extraídas de tres donantes diferentes. Además, el análisis de microarrays reveló que las células madre en cultivo poseían firmas moleculares similares a las de las células de las criptas intestinales, incluidos los genes de las células madre intestinales.
Por lo tanto, en algunas formas de realización la invención proporciona organoides que se han cultivado durante al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses o más con una pérdida mínima de integridad genómica y fenotípica.
En algunas formas de realización, la invención proporciona organoides intestinales humanos que comprenden estructuras en gemación. En algunas formas de realización de la invención, los organoides intestinales humanos no comprenden estructuras quísticas. En algunas formas de realización de la invención, los organoides intestinales humanos comprenden más estructuras en gemación que estructuras quísticas. Los inventores también demostraron que los organoides intestinales humanos generados por los medios y métodos de la presente invención imitaban decisiones de destino celularin vivoen respuesta a factores externos. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que la inhibición de Notch en las células madre intestinales detiene la proliferación epitelial intestinal e induce la hiperplasia de las células caliciformesin vivo.Los inventores pudieron demostrar que los organoides intestinales de la invención, cuando se trataron con un inhibidor de Notch, cesaron la proliferación y la mayoría de las células se convirtieron en células caliciformes en 3 días.
Estos resultados muestran la espectacular mejora en la integridad genómica y fenotípica de las células madre y organoides producidos por los métodos y medios de la presente invención en comparación con los métodos y medios anteriores.
La integridad genómica de las células madre de la invención puede confirmarse mediante análisis de cariotipo. Las células madre y su progenie pueden cariotiparse usando métodos conocidos como se describe en Sato, T et al., Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structuresin vitrowithout a mesenchymal niche. Nature 459, 262-265, 2009.
Un “cariotipo normal” es aquel en el que todos los cromosomas están presentes (es decir, euploidía) sin alteraciones apreciables. Por consiguiente, en formas de realización preferidas de la invención más del 50 %; más del 70 %; más del 80 %; más del 90 %; más del 95 %; o más del 99 % de las células madre y células diferenciadas en una población ampliada exhiben cariotipos normales después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12 o más meses. El término “población ampliada” abarca los organoides.
Un “fenotipo normal” se refiere a células que muestran, en una primera aproximación, las mismas características visuales, expresión genética y comportamiento que la célula equivalentein vivopromedio. En formas de realización preferidas de la invención más del 50 %; más del 70 %; más del 80 %; más del 90 %; más del 95 %; o más del 99 % de las células madre en una población expandida cultivada según la invención exhiben fenotipos normales después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12 o más meses.
Por ejemplo, visualmente un fenotipo normal puede juzgarse por el número de células muertas fuera del organoide, la cantidad de “gemación” del organoide en comparación con el crecimiento quístico (se prefieren las estructuras en gemación) y la integridad general de la capa única de células epiteliales (por ejemplo fenotipo escamoso columnar). Además, los tipos de células presentes pueden ayudar a juzgar si un organoide es visualmente “normal”.
Las propiedades preferidas de las células madre y organoides de la invención se describen a continuación.
Marcadores de células madre
Cuando en el presente documento se hace referencia a genes de ratón, un organoide humano de la invención puede tener un perfil genético similar pero en el que los genes de ratón se sustituyen por homólogos de genes humanos. Por tanto, la invención también proporciona un organoide humano que tiene un perfil de expresión génica como se describe en el presente documento, pero con respecto a los genes humanos correspondientes. Las contrapartes humanas de los genes de ratón enumerados en el presente documento estarán fácilmente disponibles para el experto.
En una forma de realización, la invención se refiere a una población de células madre adultas caracterizadas por la expresión natural de Lgr5. En una forma de realización preferida, la invención se refiere a una población de células madre adultas caracterizadas por la expresión natural de al menos Lgr5 y uno o más (p. ej. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23) de marcadores de células madre del grupo formado por: LGR4, epcam, Cd24a, Cdca7, Axin, CK19, Nestin, Somatostatina, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, HNF1a, Hnf4a, Sox9, KRT7 y KRT19, Tnfrsf19. Los marcadores de células madre pueden ser específicos de tejido. Por ejemplo, las células madre pancreáticas u organoides pueden caracterizarse por la expresión natural de uno o más (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1314 o 15 para ejemplo, 1,2, 3 o 4) de: CK19, Nestin, Somatostatina, insulina, glucagón, CXCR4+, Ngn3, Pdx1, NeuroD, Nkx2.2, Nkx6.1, Fax6, Mafa, HNF1b, opcionalmente Tnfrsf19 en un nivel significativo; los organoides gástricos pueden caracterizarse por la expresión natural de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) de: CD133+, DCAMKL-1, CD44, opcionalmente Tnfrsfl9 en un nivel significativo; y los organoides de criptas de vellosidades pueden caracterizarse por la expresión de uno o más o todos (por ejemplo 1 o 2) de: Sord y/o Prss23, en un nivel significativo o todos los genes de la tabla/figura 14, por ejemplo, en un nivel significativo.
El término “nivel significativo”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de la expresión de marcadores, se usa como sinónimo del término “nivel detectable”, como se describe a continuación.
Las poblaciones de células organoides gástricas y del intestino delgado también expresan marcadores de poblaciones progenitoras comunes al intestino delgado y al estómago, como uno o ambos de Cd44 y Sox9 (Barker & Huch et al Cell stem cell 2010). Éstos se expresan altamente en las células madre según la invención. Las células según este aspecto de la invención también pueden regular positivamente genes diana Wnt, incluyendo, por ejemplo, uno, dos o todos MMP7, Sp5, Tnfrs19 y axin2. Esto proporciona una fuerte evidencia del requisito de una actividad de señalización Wnt canónica activa y robusta para mantener la capacidad de autorrenovación de estos cultivos.
Los inventores han observado que la expresión de los genes de “células madre” está presente en los primeros organoides a un nivel significativamente mayor que el de las células diferenciadas que se convierten en descendientes de estas células madre. Por ejemplo, los genes LGR5, LGR4, Epcam, CD44, Tnfrsf19, Sox9, Cd24a, Sp5, Prom1/CD133, Cdca7, se expresan preferiblemente en los organoides de la invención pero preferiblemente se regulan negativamente significativamente tras la diferenciación del páncreas, hígado e intestino delgado y organoides de colon. Además, los genes RNF43 y ZNRF3 se expresan preferentemente en los organoides de la invención.
Por “expresión natural” se entiende que las células no han sido manipuladas de manera recombinante de ninguna manera, es decir, las células no han sido inducidas artificialmente para expresar estos marcadores o para modular la expresión de estos marcadores mediante la introducción de material genético exógeno, tal como la introducción de promotores de material genético heterólogo (no naturales) o más fuertes u otras secuencias reguladoras operativamente unidas a los genes endógenos o a las formas de los genes introducidas exógenamente. La expresión natural proviene del ADN genómico dentro de las células, incluidos los intrones entre las secuencias codificantes de exones cuando existen. La expresión natural no proviene del ADNc. Si es necesario, la expresión natural puede probarse mediante cualquiera de varios métodos, tales como secuenciar desde dentro del marco de lectura del gen para comprobar que no está presente ninguna secuencia heterogénea extraña. “Adulto” significa post-embrionario. Con respecto a las células madre de la presente invención, el término “célula madre adulta” significa que la célula madre se aísla de un tejido u órgano de un animal en una etapa de crecimiento posterior a la etapa embrionaria.
Esta población de células madre también puede caracterizarse por una falta de expresión natural de ciertos marcadores en un nivel significativo, muchos de los cuales están asociados con la diferenciación celular. Específicamente, las células de la población de células madre adultas aisladas no expresan de forma natural uno o más de Cd11b, CD13, CD14, AFP, Pdx1, cualquier miembro del CYP (p. ej. CYP3A11, CYP 11A1) en un nivel significativo. Como se define en el presente documento, se dice que estos marcadores son marcadores negativos.
Detección de marcadores y aislamiento de células
El término “expresado” se utiliza para describir la presencia de un marcador dentro de una célula. Para que se considere expresado, debe haber un marcador presente en un nivel detectable. Por “nivel detectable” se entiende que el marcador puede detectarse usando una de las metodologías de laboratorio estándar tales como PCR, transferencia o análisis FACS. Se considera que un gen está expresado por una célula si la expresión puede detectarse razonablemente después de 30 ciclos de PCR, lo que corresponde a un nivel de expresión en la célula de al menos aproximadamente 100 copias por célula. Los términos “expresar” y “expresión” tienen significados correspondientes. Un nivel de expresión por debajo de este umbral, se considera que un marcador 3 no está expresado. La comparación entre el nivel de expresión de un marcador en una célula de la invención y el nivel de expresión del mismo marcador en otra célula, tal como por ejemplo una célula madre embrionaria, se puede realizar preferiblemente comparando los dos tipos de células que han sido aislados de la misma especie. Preferiblemente esta especie es un mamífero y más preferiblemente esta especie es humana. Dicha comparación puede realizarse convenientemente utilizando un experimento de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
En algunas formas de realización, se considera que una población de células o un organoide de la invención expresa un marcador si al menos aproximadamente el 5 %, (por ejemplo, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %) de las células en la celda población u organoide según la invención muestran expresión del marcador.
En algunas formas de realización, las células expresan un marcador celular a un nivel significativo si comprenden entre 1x102 y 1x105, por ejemplo, 5 x 102 a 1x104 o 1x103 a 1x104 veces más copias del ARNm que codifica el marcador celular en relación con el número de copias de ARNm del gen constitutivo GADPH.
En algunas formas de realización, la expresión de un gen en un organoide de la invención cuando se cultiva en medio de expansión es varias veces (p. ej. al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces) mayor que cuando el organoide o la célula se cultiva en medio de diferenciación o en el tejido adulto completamente diferenciado. En algunas formas de realización, el organoide de la invención cuando se cultiva en condiciones de diferenciación, muestra un aumento en la expresión de genes que se conocen como genes de diferenciación en comparación con una célula u organoide de la invención cuando se cultiva en condiciones de expansión y también puede mostrar una disminución en el nivel de expresión de al menos uno o más genes de células madre/progenitores en comparación con una célula u organoide de la invención cuando se cultiva en medio de expansión.
Puede usarse cualquiera de varios métodos físicos de separación conocidos en la técnica para seleccionar las células y distinguirlas de otros tipos de células. Dichos métodos físicos pueden implicar FACS 2 y varios métodos de inmunoafinidad basados en fabricantes expresados específicamente por las células de la invención. Como se describió anteriormente, Lgr5, CD44 y Sox9 son tres de los marcadores celulares expresados en niveles elevados en las células madre en el contexto de la invención. Por lo tanto, sólo a modo de ilustración, las células madre pueden aislarse mediante varios métodos físicos de separación, que dependen de la presencia de éstas.
En una forma de realización, las células pueden aislarse mediante FACS utilizando un anticuerpo, por ejemplo, contra uno de estos marcadores. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se puede utilizar para detectar marcadores característicos de un tipo o linaje de células en particular. Como resultará evidente para un experto en la técnica, esto se puede lograr mediante un anticuerpo marcado con fluorescencia o mediante un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia con especificidad de unión por el anticuerpo primario. Los ejemplos de etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, entre otros, FITC, Alexa Fluor® 488, GFP, CFSE, CFDA-SE, DyLight 488, p E, PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, PE-Cy5 (TRI-COLOR®), PE Cy5.5, PI, PE-Alexa Fluor® 750 y PE-Cy7. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ejemplo y no pretende ser limitante.
Será evidente para un experto en la técnica que el análisis FACS utilizando un anticuerpo anti-Lgr5 proporcionará una población de células madre purificadas. Sin embargo, en algunas formas de realización, puede ser preferible purificar aún más la población celular realizando una ronda adicional de análisis FACS usando uno o más de los otros marcadores identificables.
La inmunohistoquímica también se puede utilizar para comprender la distribución y localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de una población celular u organoide. La visualización de una interacción anticuerpo-antígeno se puede lograr de varias maneras que son bien conocidas en la técnica, tales como las que se describen en Barker et al, Identification of Stem Cells in Small Colony and Colon by Marker Gene Lgr5, 25 de octubre de 2007; 449 (7165): 1003-7.
En otra forma de realización, las células se pueden aislar mediante purificación por inmunoafinidad, que es un método de separación bien conocido en la técnica. Sólo a modo de ilustración, las células pueden aislarse mediante purificación por inmunoafinidad dirigida a c-kit. Como resultará evidente para un experto en la técnica, este método se basa en la inmovilización de anticuerpos en una columna de purificación. A continuación, la muestra de células se carga en la columna, lo que permite que los anticuerpos unan las células apropiadas y, por lo tanto, se unan a la columna. Después de una etapa de lavado, las células se eluyen de la columna utilizando un competidor que se une preferentemente al anticuerpo anti-c-kit inmovilizado y permite que las células se liberen de la columna. Será evidente para un experto en la técnica que la purificación por inmunoafinidad utilizando un anticuerpo inmovilizado proporcionará una población de células purificadas. Sin embargo, en algunas formas de realización, puede ser preferible purificar aún más la población celular realizando una ronda adicional de purificación por inmunoafinidad usando uno o dos más de los otros marcadores identificables, y usar una alícuota de los clones aislados para determinar la expresión de otros marcadores intracelulares relevantes.
Será evidente para una persona experta en la técnica que la purificación de LGR5 o células madre puede ir precedida por cualquier número de etapas de purificación, tales como la purificación del epitelio con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, purificación con EDTA o clasificación con Epcam FACS del epitelio.
Será evidente para un experto en la técnica que no es necesario que las etapas de purificación secuenciales impliquen el mismo método físico de separación. Por lo tanto, quedará claro que, por ejemplo, las células se pueden purificar mediante una etapa de FACS usando un anticuerpo anti-Lgr5, seguida de una etapa de purificación por inmunoafinidad usando una columna de afinidad SSEA-1. En determinadas formas de realización, las células se pueden cultivar después del aislamiento durante al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días o al menos aproximadamente 30 días. En ciertos aspectos, las células se expanden en cultivo por más tiempo para mejorar la homogeneidad del fenotipo celular en la población celular.
Se pueden utilizar análisis de microarrays, análisis de conglomerados y perfiles comparativos de expresión génica para comparar el fenotipo de la población con el fenotipo de las células madre originales o de las contrapartesin vivoapropiadas (Sato T et al., Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 469415-418).
El rastreo del linaje de células madre Lgr5+ muestra la preservación de las características de las criptas y las vellosidades en los organoides.
En otra forma de realización, se puede utilizar un análisis de alto contenido para evaluar la integridad fenotípica de las células madre. Por ejemplo, existen varios kits y plataformas de detección de alto contenido, como el escaneo puntual de 4 colores ImageXpress ULTRA (Molecular Devices, Union City, EE. UU.), el disco giratorio (disco nipkow) Pathway 855 y 435 de BD Biosciences (anteriormente Atto Biosciences, Rockville, Maryland), Opera (PerkinElmer Inc., Waltham, MA) y el escaneo de hendiduras IN Cell 3000 (GE/Amersham Biosciences, Cardiff, Reino Unido), Arrayscan VTI (Cellomics (Cellomics)), IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.), Acumen eX3 (TTP LabTech Ltd (Acumen eX3)), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec, Aachen Alemania) e ImageXpress MICRO (Molecular Devices, Union City, EE. UU.), IN Cell 1000 (GE/Amersham Biosciences Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.), Pathway HT (Becton Dickinson Biosciences) e ImageXpress MICRO (Molecular Devices, Union City, EE. u U.), ScanAR (Olympus Soft Imaging Solutions, Alemania).
Densidad de siembra
En algunas formas de realización de la invención, normalmente se sembrarán suspensiones unicelulares o pequeños grupos de células (2-50 células/grupo), en lugar de grandes grupos de células, como se conoce en la técnica. A medida que se dividen, dichas células se sembrarán en un soporte con una densidad que promueva la proliferación celular. Normalmente, cuando se aíslan células individuales, se utiliza una densidad de siembra de al menos 1-500 células/pocillo, siendo la superficie del pocillo de 0,32 cm2. Cuando se siembran racimos, la densidad de siembra es preferiblemente de 250-2500 células/cm2. Para replantar, se puede usar una densidad de entre aproximadamente 2500 células/cm2 y aproximadamente 5000 células/cm2. Durante el replante, normalmente se sembrarán suspensiones unicelulares o pequeños grupos de células, en lugar de grandes grupos de células, como se conoce en la técnica.
Diferenciación adicional
En algunas formas de realización de la invención, ciertos componentes del medio de expansión se pueden retirar para cambiar el destino celular de las células cultivadas hacia la diferenciación. Cualquier componente del medio de cultivo que sea responsable de mantener un estado indiferenciado y/o activar programas genéticos de células madre o progenitores puede retirarse del medio de cultivo, como se reivindica.
En algunas formas de realización de la invención, la retirada de los inhibidores puede permitir que las células del organoide se diferencien en células maduras, tales como células caliciformes maduras y células enteroendocrinas en organoides de criptas y vellosidades. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la divulgación describe un método para diferenciar aún más los organoides usando un segundo medio de cultivo que no comprende un inhibidor de la invención. Por ejemplo, consulte el Ejemplo 1.
Por ejemplo, en algunas formas de realización de la divulgación, el inhibidor de TGF-beta y/o el inhibidor de p38 se retiran del medio de cultivo celular para permitir que las células se diferencien. Por “retirada” o “retirada” de un componente del medio de cultivo celular se entiende que cuando las células se vuelven a sembrar y se cambia el medio, el componente no se añade al medio nuevo.
En algunas formas de realización, Wnt está presente en el medio de expansión pero no en el medio de diferenciación. Por ejemplo, algunas formas de realización comprenden la extracción de Wnt para la diferenciación de organoides de colon en enterocitos maduros. Wnt también se puede retirar para permitir la diferenciación de organoides de criptas y vellosidades.
En algunas formas de realización, R-espondina está presente en el medio de expansión pero no en el medio de diferenciación. Por ejemplo, algunas formas de realización comprenden la retirada de R-espondina para la diferenciación de organoides del colon en enterocitos maduros. R-espondina también se puede retirar para permitir la diferenciación de organoides de criptas y vellosidades. En algunas formas de realización, R-espondina y Wnt pueden retirarse para permitir la diferenciación de organoides de criptas y vellosidades.
En algunas formas de realización, la nicotinamida está presente en el medio de expansión pero no en el medio de diferenciación. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la nicotinamida y SB202190 (u otro inhibidor de p38) se retiran del medio de cultivo celular para permitir la diferenciación de las células, por ejemplo, en organoides de criptas de vellosidades u organoides de colon.
Por lo tanto, un método para obtener células u organoides diferenciados puede comprender cultivar células epiteliales en un método de cultivo de la invención que comprende un inhibidor de TGF-beta y/o p38 para permitir que las células sobrevivan y/o proliferen (es decir, medio de expansión) y luego continuar cultivando la célula y reponer los medios, en donde los medios reabastecidos no comprenden un inhibidor de TGF-beta y/o un inhibidor de p38 (es decir, medio de diferenciación), como se afirma.
En algunas formas de realización, el medio de diferenciación comprende componentes adicionales. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de diferenciación comprende un inhibidor de la gamma secretasa, por ejemplo DAPT o DBZ. En algunas formas de realización, el medio de diferenciación comprende ligando RANK (también denominado en el presente documento RANKL). Como se mencionó anteriormente, la adición de un inhibidor de la gamma secretasa puede dirigir la diferenciación de células organoides intestinales, tales como células organoides del intestino delgado, hacia células secretoras, tales como células caliciformes. La adición de RANKL al medio de cultivo puede dirigir la diferenciación de células organoides intestinales, como las células organoides del intestino delgado, hacia las células M.
En el presente documento se divulga un medio de cultivo para diferenciar células madre de un tejido de interés, en donde el medio de cultivo comprende o consiste en los componentes del medio de cultivo usado para expandir las células madre del tipo de tejido de interés pero en donde uno o más de los siguientes Del medio para diferenciar células madre se excluyen: Wnt, R-espondina, inhibidor de BMP, inhibidor de TGF-beta, ligando del receptor tirosina quinasa, inhibidor de p38 y nicotinamida.
Además, la invención se refiere a un método para expandir una única célula madre o una población de células madre, preferiblemente para generar un organoide, en donde el método comprende cultivar la única célula madre o población de células madre en un medio de cultivo según la invención, en donde el método comprende:
cultivar la célula madre, población de células madre o fragmentos de tejido en un primer medio de expansión; continuar cultivando la célula madre, población de células madre o fragmentos de tejido y reponer el medio con un medio de diferenciación, en donde el medio de diferenciación no comprende uno o más de, preferiblemente todos, los factores seleccionados de: un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de p38, nicotinamida y Wnt, según se reivindica.
En general, cuando un componente se describe como “eliminado” de un medio, significa que ese componente no se agrega cuando el medio se repone, es decir el componente se excluye del medio repuesto. Cuando el medio se “repone”, esto puede significar que el medio se retira físicamente de la matriz extracelular y luego se reemplaza con medio nuevo.
Para el colon, el hígado y el páncreas, en el medio de expansión hay muy pocas células diferenciadas. Sólo una vez que el medio de expansión se reemplaza por un medio de diferenciación, las células comienzan a diferenciarse. En esta etapa, los organoides también comienzan a perder sus células madre. Los organoides diferenciados pueden ser apropiados para ciertos usos, tales como (pero no limitados a) trasplantes, detección de fármacos de enfermedades metabólicas, toxicología (por ejemplo usando organoides hepáticos que comprenden hepatocitos) y para estudiar funciones antibacterianas del intestino delgado. Los organoides en expansión pueden ser generalmente más apropiados para otros usos, tales como (pero sin limitarse a) medicina regenerativa y detección de fármacos, por ejemplo para cáncer o fibrosis quística. Los organoides en expansión generalmente tienen más potencial de crecimiento (y por tanto mayor longevidad) que los organoides diferenciados. En algunas formas de realización, los organoides del colon, el hígado y el páncreas no se diferencian más.
Los organoides del intestino delgado y la próstata se diferencian de los organoides del colon, el hígado y el páncreas en que mantienen una población de células madre en expansión y al mismo tiempo se diferencian. No es necesario cultivarlos en un medio de diferenciación separado para que estén presentes tipos de células diferenciadas. Se puede considerar que tienen las propiedades de un organoide tanto en expansión como diferenciado. Sin embargo, para lograr la diferenciación completa de los organoides del intestino delgado, se pueden cultivar en un medio de diferenciación separado que preferiblemente no comprende Wnt3a y que comprende preferiblemente un inhibidor de la gamma secretasa y/o un ligando RANK (también denominado en el presente documento RANKL). Por diferenciación “completa” se entiende que están presentes todos los tipos de células diferenciadas, incluidas células caliciformes, células neuroendocrinas, células en penacho, células M, enterocitos y células de paneth. Algunos de estos tipos de células diferenciadas, por ejemplo las células de Paneth, también están presentes (a veces en cantidades más pequeñas) en los organoides en expansión.
Organoides
Las células descritas anteriormente crecen hasta convertirse en organoides. Por consiguiente, un organoide que se puede obtener mediante un método de la invención es un aspecto adicional de la invención. También se proporciona un organoide como se describe en el presente documento. El organoide es preferiblemente un organoide humano. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se obtienen organoides humanos que son funcionales y están vivos después de un período de tiempo tan prolongado (es decir, al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses o más de cultivo; ver ejemplos incluidos en este documento). La funcionalidad se caracteriza preferiblemente por la presencia de marcadores específicos de tejido y/o por la estructura de dicho organoide como se define en el presente documento. Dado que la cantidad final de organoides obtenida se correlaciona con la duración del cultivo, el experto entenderá que la invención es una invención pionera y potencialmente abre nuevas posibilidades en, por ejemplo, la medicina regenerativa. Por lo tanto, se proporciona un organoide como se describe en el presente documento que es funcional y está vivo después de al menos 3 meses (por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8 o más meses) de cultivo. Por ejemplo, se proporciona un organoide como se describe en el presente documento que retiene al menos uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de su estructura, expresión de marcadores y función después de al menos 3 meses (p. ej. al menos 4, 5, 6, 7, 8 o más meses) de cultivo.
Por ejemplo, un organoide según la presente invención puede comprender una población de células de al menos 1x103 células, al menos 1x104 células, al menos 1x105 células, al menos 1x106 células, al menos 1x107 células o más. Cada organoide comprende entre aproximadamente 1x103 células y 5x103 células. Los inventores han demostrado que es posible cultivar organoides a partir de células madre Lgr5+ individuales en organoides que comprenden una población de células como se describió anteriormente o que comprenden una población de células de aproximadamente 104 células. Por ejemplo, ahora se ha demostrado en ratones que es posible iniciar el crecimiento de un organoide a partir de células madre individuales. Por tanto, la invención proporciona un método para generar un organoide a partir de una única célula madre. En algunas formas de realización, el organoide comprende aproximadamente 104 células. En algunas formas de realización, se pueden cultivar juntos 10-20, 20-30, 30-40 o 40-50 organoides en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
En algunas formas de realización, el organoide o población de células, que es capaz de sobrevivir en cultivo durante al menos 3 meses, por ejemplo al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses, o al menos 12 meses o más, cuando se cultivan en un medio de cultivo de la invención.
En algunas formas de realización, el organoide o población de células, en donde el organoide o población de células se expande a una velocidad de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces. veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces por semana.
Preferiblemente, la población de células u organoides se expandirá a un ritmo de aproximadamente 4-5 veces por semana o más de dos duplicaciones de población por semana. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la población de células u organoides se expandirá a una velocidad de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces por semana.
Los organoides de la invención se pueden obtener usando células aisladas de cualquier fuente adecuada. Generalmente, las células utilizadas para generar un organoide se aislarán del mismo tipo de tejido que el organoide que se genera. Los organoides son preferentemente de mamíferos, por ejemplo murinos, bovinos, porcinos o humanos. Lo más preferiblemente, los organoides son humanos.
En algunas formas de realización, un organoide o población de células, en el que el organoide o población de células es un organoide o población de células normal (sano) o un organoide o población de células enferma, por ejemplo obtenido cultivando células madre tomadas de un ser humano o animal con una enfermedad.
En algunas formas de realización, un organoide o población de células que se congela y almacena por debajo de -5 °C, por debajo de -1 °C, por debajo de -20 °C, por debajo de -40 °C, por debajo de -60 °C o por debajo de -80 °C, por debajo de -100 °C, por debajo de -150 °C o a aproximadamente -180°C. El organoide o población de células puede almacenarse en nitrógeno líquido. Por lo tanto, en algunas formas de realización, el organoide o población de células se almacena en nitrógeno líquido.
En algunas formas de realización, el organoide es un organoide del intestino delgado, un organoide del colon, un organoide gástrico, un organoide pancreático, un organoide hepático o un organoide prostático.
Estructura y morfología de organoides
Los organoides de la invención, que se pueden obtener mediante expansión de células madre, proporcionan una población de células que se asemejan a sus contrapartesin vivo.
El análisis de imágenes se puede utilizar para evaluar características de las células en cultivo, como la morfología celular; estructuras celulares; evidencia de apoptosis o lisis celular; y composición y estructura de organoides. Muchos tipos de análisis de imágenes son bien conocidos en la técnica, tales como microscopía electrónica, microscopía confocal, estereomicroscopía y microscopía de fluorescencia. El análisis histológico puede revelar la arquitectura básica y los tipos de células.
En las figuras adjuntas se dan ejemplos ilustrativos de organoides generados según la invención. Se puede observar que los organoides según la invención pueden poseer una capa de células con al menos una yema y un lumen central. Los organoides en el exterior del matrigel tienden a ser más grandes que los organoides en el centro del matrigel, quizás porque tienen mejor acceso a los factores de crecimiento necesarios. Desde el punto de vista estructural, los organoides según la invención suelen tener una forma alargada. Pueden incluir una o más estructuras en ciernes: una capa epitelial unicelular con similitudes con conductos o islotes. Bajo microscopía confocal, las estructuras pueden teñirse positivamente para queratina. Pueden incluir células con núcleos polarizados y citoplasma pequeño. Los organoides pueden tener una sección formada por múltiples capas; estas células a menudo tienden a tener sus núcleos más centrales a las células, es decir no polarizado. Las células en la sección multicapa pueden organizarse para incluir un espacio o luz entre las células. En algunas formas de realización, los organoides de la invención comprenden o consisten en células epiteliales. En algunas formas de realización, los organoides comprenden o constan de una única capa de células epiteliales. En algunas formas de realización, las células no epiteliales están ausentes de los organoides. En algunas formas de realización, los organoides de la invención comprenden todos los tipos de células diferenciadas que existen en su correspondiente contraparte de tejidoin vivo.
En algunas formas de realización, los organoides intestinales humanos mostraron estructuras organoides en ciernes, en lugar de las estructuras quísticas observadas en condiciones de cultivo anteriores. Las diseminaciones en metafase de organoides de más de 3 meses revelaron consistentemente 46 cromosomas en cada una de las 20 células extraídas de tres donantes diferentes.
En algunas formas de realización, los organoides de la invención comprenden una única monocapa de células. En algunas formas de realización, los organoides de la invención tienen una sección que está formada por múltiples capas. También se hace referencia en el presente documento a múltiples capas de células como regiones de células “estratificadas”. Por “estratificado” se entiende que hay múltiples (más de una) capas de células. En algunas formas de realización, los organoides de la invención comprenden monocapas individuales que están plegadas (o invaginadas) para formar dos o más capas. A veces puede resultar difícil distinguir entre monocapas plegadas (o invaginadas) y regiones de células estratificadas. En algunas formas de realización, un organoide comprende tanto regiones de células estratificadas como regiones de monocapas plegadas. En algunas formas de realización, los organoides de la invención tienen una sección que está formada por múltiples capas y una sección que comprende una única monocapa de células. Morfológicamente, las células aparecen como su correspondiente homólogo tisularin vivo.
Por lo tanto, en algunas formas de realización, un organoide, que se puede obtener usando los medios de cultivo y los métodos de la invención, es un organoide tridimensional que comprende células epiteliales que rodean un lumen central, en el que opcionalmente las células epiteliales existen en distintos dominios de división y dominios de diferenciación. En algunas formas de realización, el organoide de la invención es un organoide tridimensional que comprende células epiteliales dispuestas en regiones de monocapas, monocapas opcionalmente plegadas y regiones de células estratificadas. En algunas formas de realización, las células no epiteliales están ausentes de dicho organoide. En algunas formas de realización, todos los tipos de células diferenciadas del tejido normalin vivoestán presentes en dicho organoide.
Organoides de criptas de vellosidades
En los organoides de criptas de vellosidades del intestino delgado, la disposición estructural de los organoides es muy similar a la estructura de las criptas de vellosidadesin vivo:la célula madre Lgr5+ y sus células de nicho (células de Paneth) están una al lado de la otra en la base. de la cripta, seguido por el tránsito de células amplificadoras, justo encima de la base de la cripta y conduciendo hacia los lados de las vellosidades y finalmente las células diferenciadas, como los enterocitos que forman el resto de las vellosidades y se diferencian cada vez más hacia la parte superior de las vellosidades. Se puede observar que los organoides según la invención pueden poseer una capa de células con al menos una yema y un lumen central. Los organoides en el exterior del matrigel tienden a ser más grandes que los organoides en el centro del matrigel, quizás porque tienen mejor acceso a los factores de crecimiento necesarios. Desde el punto de vista estructural, los organoides según la invención suelen tener una forma alargada. Bajo microscopía confocal, las estructuras pueden teñirse positivamente para queratina. Pueden incluir células con núcleos polarizados y citoplasma pequeño. Los organoides de criptas y vellosidades son generalmente de una sola capa.
En algunas formas de realización, por ejemplo, para un organoide de criptas de vellosidades de ratón, un organoide de criptas de vellosidades es un organoide tridimensional, que comprende dominios tipo cripta que rodean un lumen central revestido por dominios epiteliales tipo vellosidad, que son dominios epiteliales que comprenden tipos diferenciados de células. En algunas formas de realización, las células no epiteliales están ausentes de dicho organoide.
En algunas formas de realización, por ejemplo, para un organoide de criptas de vellosidades humano, un organoide de criptas de vellosidades es un organoide tridimensional, que comprende dominios similares a criptas que rodean un lumen central. En algunas formas de realización, las células en división se limitan a las estructuras en gemación. Hay pocas o ninguna célula diferenciada. En condiciones de diferenciación se forman las células diferenciadas del intestino. En algunas formas de realización, las células no epiteliales están ausentes de dicho organoide. En algunas formas de realización, cuando el organoide se está expandiendo, por ejemplo cuando está en un medio de cultivo de expansión según la invención, el organoide tiene pocas o ninguna célula diferenciada.
En algunas formas de realización, un organoide del intestino delgado de la invención cultivado en un medio de cultivo de la invención que comprende RANKL comprende células M. En algunas formas de realización de la invención, un organoide del intestino delgado de la invención cultivado en un medio de cultivo de la invención que comprende un inhibidor de la gamma-secretasa, comprende células caliciformes. En algunas formas de realización, un organoide del intestino delgado cultivado en un medio de diferenciación (por ejemplo, en el que el medio de diferenciación comprende un medio basal, Noggin, EGF, un inhibidor de TGF-beta y un inhibidor de p38, un inhibidor de gamma-secretasa y un RANKL) comprende todas las células diferenciadas. tipos que incluyen, por ejemplo, células caliciformes, células neuroendocrinas, células en penacho, células M, enterocitos y células de paneth. Algunos de estos tipos de células diferenciadas, por ejemplo las células de Paneth, también están presentes (a veces en cantidades más pequeñas) en los organoides en expansión.
Los organoides intestinales humanos muestran estructuras organoides en ciernes, en lugar de las estructuras quísticas vistas en condiciones de cultivo anteriores. La abertura superior de las criptas recién aisladas se sella y esta región se hincha gradualmente y se llena de células apoptóticas, de forma muy similar a como las células apoptóticas se pellizcan en la punta de las vellosidades. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los organoides de criptas de vellosidades tienen una estructura similar a una cripta que rodea un lumen central revestido por un epitelio similar a una vellosidad y lleno de cuerpos celulares apoptóticos. En algunas formas de realización, el lumen se abre en intervalos de tiempo consecutivos para liberar el contenido al medio.
En algunas formas de realización, la región de la cripta sufre continuos eventos de gemación que crean criptas adicionales, un proceso que recuerda a la fisión de la cripta.
Los inventores también demostraron que los organoides intestinales humanos generados por los medios y métodos de la presente invención imitaban las decisiones del destino celularin vivoen respuesta a factores externos. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que la inhibición de Notch en las células madre intestinales detiene la proliferación epitelial intestinal e induce la hiperplasia de las células caliciformesin vivo.Por lo tanto, en algunas formas de realización, cuando un organoide de criptas de vellosidades de la invención se trata con un inhibidor de Notch, la proliferación cesa y la mayoría de las células (por ejemplo, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 %, más del 95 %, más del 98 %) se convierten en células caliciformes en 3 días.
Las diseminaciones en metafase de organoides de más de 3 meses revelaron consistentemente 46 cromosomas en cada una de las 20 células extraídas de tres donantes diferentes. Además, el análisis de microarrays reveló que las células madre en cultivo poseían firmas moleculares similares a las de las células de las criptas intestinales, incluidos los genes de las células madre intestinales.
Organoides de colon
Los organoides de colon exhiben una composición celular similar a los organoides de criptas y vellosidades. Por lo tanto, los comentarios anteriores para los organoides de criptas y vellosidades se aplican a los organoides de colon mutatis mutandis. Por ejemplo, consulte las Figuras 1 y 2.
Normalmente, la diferencia entre el colon y los organoides del intestino delgado es que las criptas son menos profundas en el colon, lo que lo hace parecer un poco como una “pelota de fútbol” en lugar de una esfera con protuberancias. Tanto los organoides del intestino delgado como del colon tienen dominios que contienen células madre y células amplificadoras de tránsito (TA), y otros dominios que contienen células diferenciadoras y/o diferenciadas. Para los organoides del intestino delgado, los dominios diferenciados a veces se denominan “similares a vellosidades”. Los dominios diferenciados de los organoides del colon suelen ser similares en composición celular a los dominios “similares a vellosidades” del intestino delgado, pero el colon en sí no tiene vellosidades.
La cantidad de Wnt presente puede influir en el tamaño de las estructuras en gemación (es decir, la profundidad de las criptas) en los organoides. Más Wnt reduce la brotación. El colon produce más Wnt que el intestino delgado y, por lo tanto, requiere menos Wnt adicional en el medio de cultivo y normalmente tiene criptas menos profundas que el intestino delgado. La misma diferencia se ve en los organoides.
En algunos aspectos, los organoides son organoides de colon. Los inventores han descubierto que se pueden obtener organoides de colon de ratón cultivando criptas de colon en un medio de cultivo celular ENR Wnt3A (WENR). Por tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona un organoide de colon obtenido cultivando criptas de colon en medio WENR.
Los inventores también han descubierto sorprendentemente que los organoides del colon humano se pueden mantener usando un medio de cultivo que comprende WENR más gastrina más nicotinamida. En algunas formas de realización, un organoide de colon humano de la invención se puede obtener usando un medio que comprende WENR más gastrina más nicotinamida y que también comprende un inhibidor de TGF-beta, como se reivindica. Por ejemplo, en algunas formas de realización, se pueden usar los siguientes medios de cultivo celular para obtener un organoide de colon humano: WENR+gastrina+nicotinamida+A8301+SB202190. En otras formas de realización, se puede usar el siguiente medio de cultivo celular para obtener un organoide de colon humano: WENR+Nicotinamida+A83-01.
En algunas formas de realización, un organoide de colon de ratón tiene un diámetro máximo de aproximadamente 200 700 um, por ejemplo 250-600 um, 300-500 um, 320-450 um, 340-400 um, 300-380 um, por ejemplo aproximadamente 360 um. En algunas formas de realización, un organoide de colon tiene un diámetro mínimo de aproximadamente 100 400 um, por ejemplo 150-350 um, 170-300 um, 190-280 um, 195-250 um, por ejemplo, aproximadamente 235 um. En otra forma de realización, los organoides pueden tener un diámetro de hasta 1 mm. En algunas formas de realización, un organoide de colon humano tiene un diámetro máximo de aproximadamente 300-800 um, por ejemplo 350-700 um, 400 600 um, 450-550 um, 475-540 um, 500-530 um, por ejemplo aproximadamente 500 um. En algunas formas de realización, un organoide de colon tiene un diámetro mínimo de aproximadamente 200-500 um, por ejemplo 250-450 um, 300-415 um, 350-400 um, 325-380 um, por ejemplo, aproximadamente 375 um. En otra forma de realización, los organoides pueden tener un diámetro de hasta 1 mm. En algunas formas de realización, un organoide de colon de la invención comprende estructuras en gemación. Estos pueden ser visibles mediante el uso de tinción EdU para visualizar células en proliferación.
Los organoides del colon humano conservan su estructura de gemación característica bajo la condición de cultivo de células madre intestinales humanas (“HISC”) (WENRg+nicotinamida+inhibidor de TGF-beta (p. ej. A83-01 )+inhibidor de p38 (p. ej. SB202190)). En algunas formas de realización, un organoide de colon es un organoide tridimensional, que comprende estructuras en ciernes que proliferan y contienen células madre. Estos dominios de células madre rodean una luz central. Las células en división generalmente se limitan a las estructuras en gemación. En algunas formas de realización, hay pocas células diferenciadas o ninguna. En condiciones de diferenciación se forman las células diferenciadas del intestino, por ejemplo enterocitos maduros. En algunas formas de realización, las células no epiteliales están ausentes de dicho organoide.
Organoides pancreáticos
Los organoides pancreáticos de la invención presentan preferentemente gemación. En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos tienen un diámetro de 100 a 1000 micrómetros, por ejemplo, de 200 a 900 micrómetros, de 300 a 1000 micrómetros, de 400 a 700 micrómetros. Los organoides pancreáticos son preferiblemente de una sola capa. Sólo existen los comienzos de las estructuras de islotes o ductales. La estructura de gemación es indicativa de un estado de proliferación saludable y del mantenimiento de las células madre.
En algunas formas de realización, por ejemplo, cuando los organoides pancreáticos se cultivan en un medio de cultivo de la divulgación (y en ausencia de inhibidores de TGF-beta), los organoides pancreáticos son principalmente estructuras quísticas con pocas estructuras de gemación o dominios similares a conductos. Las estructuras quísticas comprenden principalmente monocapas, pero pueden estar presentes algunas regiones de células estratificadas. Las células expresan marcadores de células madre y progenitores (ductales). En los organoides no hay células diferenciadas, como las células beta. El quiste está formado principalmente por una monocapa, pero existen partes estratificadas. Los tipos de células se parecen a las células madre/progenitoras (expresión de genes de células de conducto). No hay células diferenciadas (pcélulas).
En otras formas de realización, cuando los organoides pancreáticos se cultivan en presencia de un inhibidor de TGF-beta, tal como A83-01, por ejemplo en un medio de cultivo de la invención, como se reivindica, los organoides pancreáticos comprenden más estructuras en gemación/dominios de tipo ductal. (esto significa que las células son más parecidas a conductos que la estructura a un conducto), como lo muestra la tinción con Krt19 (por ejemplo, consulte la Figura 31). Se pueden identificar monocapas de células polarizadas, pero también zonas con células estratificadas.
Organoides de adenocarcinoma y cáncer de colon
Los organoides de adenocarcinoma y cáncer de colon generalmente forman estructuras quísticas en lugar de estructuras en gemación. Esto recuerda la ausencia de un buen soporte de nicho celular. Las criptas de adenoma cultivadas con EFG+Noggin muestran una expansión de aproximadamente 16x en los primeros 10 días. Los organoides de adeno(carcino)ma y cáncer de colon pueden proporcionar herramientas de investigación útiles y modelos de detección de fármacos.
Los organoides de carcinoma, adenoma y adenocarcinoma son en gran medida quísticos (por ejemplo, ver Figuras 4 y 9). Sin embargo, en algunas formas de realización, también pueden comprender estructuras que se asemejan a sus homólogos organoides de tejido normal.
Organoides del esófago de Barrett (BE)
Un organoide BE de la invención comprende estructuras en gemación (por ejemplo, véase la Figura 5).
Morfológicamente, las células de los organoides de la invención aparecen como su correspondiente homólogo tisularin vivo.
El esófago de Barrett es una enfermedad caracterizada por la presencia de epitelio columnar en la parte inferior del esófago, que reemplaza el epitelio de células escamosas normal como resultado de la metaplasia. La característica histológica del esófago de Barrett es la presencia de células caliciformes intestinales en el esófago. Aprovechando la similitud entre el esófago de Barrett y el epitelio intestinal, los inventores demostraron que el medio de cultivo y los métodos de la invención podrían usarse para mantener el epitelio del esófago de Barrett durante hasta 1 mes. Los inventores también demostraron, por primera vez, que la adición de FGF10 al medio de cultivo de la invención permitió que los organoides del esófago de Barrett formaran estructuras en gemación y prolongaron significativamente la duración del cultivo a más de tres meses. Por tanto, un organoide de esófago de Barrett es un ejemplo de un organoide de la invención. En algunas formas de realización, un organoide de esófago de Barrett tiene una estructura quística. En algunas formas de realización, un organoide de esófago de Barrett de la invención comprende células Paneth. En algunas formas de realización, un organoide de esófago de Barrett de la invención expresa lisozima.
Por lo tanto, los inventores también describen un medio de cultivo según la invención, que comprende FGF10, para el cultivo del epitelio del esófago de Barrett.
En algunas formas de realización de la invención, los organoides del esófago de Barrett se pueden cultivar usando un medio de cultivo según la invención que también comprende FGF10. En algunas formas de realización, estos organoides de esófago de Barrett expresan Ki67 y tienen un número mínimo, preferiblemente menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de células PAS positivas y células mucina positivas. En algunas formas de realización, los organoides del esófago de Barrett comprenden células de Paneth positivas a lisozima.
Organoides estomacales (gástricos) (por ejemplo, ver Figura 46)
Los organoides gástricos de ratón cultivados en un medio de cultivo de la invención son organoides tridimensionales, que comprenden o consisten en un epitelio de una sola capa, que comprende una base de glándula gástrica como dominios (formados por células madre y progenitoras) que rodean un lumen central revestido por dominios epiteliales que comprenden tipos de células diferenciadas, y opcionalmente en el que las células no epiteliales están ausentes de dicho organoide.
Los organoides gástricos humanos cultivados en un medio de cultivo de la invención comprenden estructuras quísticas. La estructura quística es una monocapa de células polarizadas. Estos organoides gástricos humanos cultivados en presencia de un inhibidor de TGF-beta se parecen mucho más a los organoides gástricos de ratón que los organoides humanos cultivados en ausencia de un inhibidor de TGF-beta.
Organoides prostáticos (véase Figuras 41 a 43)
En condiciones de cultivo que comprenden EGF, Noggin y R-espondina, los organoides prostáticos murinos forman estructuras quísticas tridimensionales con una luz. Con el tiempo, las capas se pliegan hacia adentro formando 3-4 capas de células epiteliales (estratificadas). La capa externa está compuesta principalmente por células epiteliales basales CK5+, mientras que las capas internas están compuestas principalmente por células epiteliales luminares CK8+. No se ha identificado ningún compartimento de células madre; todos los dominios contienen células en división. Por lo tanto, en algunas formas de realización, un organoide prostático cultivado en ausencia de testosterona comprende capas estratificadas de células epiteliales en división. En una forma de realización adicional, el organoide prostático comprende una capa externa de células que comprenden células epiteliales basales CK5+ y capas internas que comprenden células epiteliales luminales CK8+. En algunas formas de realización, un organoide prostático cultivado en ausencia de testosterona no contiene células madre.
Adición de testosterona al medio de cultivo de próstata
Los inventores han demostrado que la adición de (DiHidro) testosterona a las condiciones de cultivo para los organoides prostáticos da como resultado que la mayoría de las células se diferencien en células terminales CK8+ que forman una única capa de epitelio que se pliega sobre mismo en dos capas. Los organoides de próstata cultivados en presencia de testosterona consisten principalmente en células luminales con o sin una segunda capa de células basales. La estructura se parece a la estructurain vivo.Están presentes células diferenciadas y en división, así como células madre y progenitores. Por lo tanto, en algunas formas de realización, por ejemplo cuando se cultiva en un medio que comprende testosterona, un organoide prostático es un organoide tridimensional que comprende estructuras quísticas y una luz. En algunas formas de realización, el organoide prostático comprende células terminales CK8+ que forman una monocapa de epitelio. En algunas formas de realización, la monocapa se pliega en dos o más capas. En otras formas de realización, el organoide puede comprender regiones de células estratificadas. En algunas formas de realización, el organoide prostático comprende células diferenciadas mientras se mantiene la población de células madre en división. En algunas formas de realización, la forma del organoide está determinada por el origen del material de partida celular o tisular (es decir, la posición en la próstata antes del aislamiento). La próstata consta de diferentes lóbulos o regiones que muestran las diferentes estructuras epiteliales descritas anteriormente (estratificadas y plegadas). Después del cultivoin vitro,los organoides parecen en cierta medida mantener la diferente estructura macroscópica (estratificada o plegada) de la parte de la próstata de que se originó.
Organoides hepáticos
Estructuralmente, los organoides hepáticos de ratón suelen tener una forma alargada. Pueden incluir una o más estructuras en ciernes: una capa epitelial unicelular que tiene una estructura similar a la de un conducto biliar. Bajo microscopía confocal, las estructuras pueden teñirse positivamente para queratina. Pueden incluir células con núcleos polarizados y citoplasma pequeño. Los organoides pueden tener una sección formada por múltiples capas; Estas células a menudo tienden a tener sus núcleos más centrales a las células, es decir no polarizadas. Las células en la sección multicapa pueden organizarse para incluir un espacio o luz entre las células. Los organoides hepáticos humanos de la invención, en algunas formas de realización, tienen una estructura generalmente quística.
En algunas formas de realización, un organoide hepático es un organoide tridimensional, con una estructura quística (por ejemplo, véase la Figura 30). En condiciones de expansión, el organoide puede consistir en células madre y células progenitoras donde se definen dos dominios: (1) un dominio similar a un conducto, formado por un epitelio cúbico de una sola capa (positivo para el marcador ductal Krt19) con células que recubren una luz central; y (2) un dominio epitelial pseudoestratificado donde se detectan células positivas para krt19 y células positivas para albúmina dispersas. Esta arquitectura (áreas con epitelios monocapa junto con áreas de epitelios pseudoestratificados) se asemeja a la yema hepática embrionaria. En condiciones de expansión no están presentes células completamente diferenciadas, aunque en algunas formas de realización se puede detectar la expresión de marcadores específicos de hepatocitos/hepatoblastos. Las condiciones de diferenciación dan como resultado la formación de un organoide quístico donde el dominio similar a un conducto (epitelio de una sola capa) se pierde y toda la estructura se convierte en un epitelio pseudoestratificado que contiene >50 % de hepatocitos polarizados.
Un organoide hepático comprende preferiblemente un hepatocito y una célula colangiocítica (aunque los hepatocitos se ven especialmente después de la diferenciación en MD y no son necesarios para la expansión), más preferiblemente en el que se podría detectar al menos uno de los siguientes marcadores: en al menos un marcador de hepatocito tales como albúmina, transtiretrina, integrina B-1 y glutamina sintetasa y/o al menos uno de CYP3A11, FAH, tbx3, TAT y Gck y/o al menos un formador de colangiocitos tal como queratina 7 y 19. El experto sabe cómo detectar cada uno de estos marcadores (es decir, RT PCR y/o inmunofluorescencia). Preferiblemente la expresión de cada uno de estos marcadores se evalúa tal como se lleva a cabo en la parte experimental. Cada uno de estos marcadores normalmente se expresa después de al menos dos semanas, tres semanas o un mes de cultivo usando un método de la invención. El análisis de microarrays de los organoides en ambas condiciones de cultivo mostró que los organoides hepáticos se parecen al tejido hepático adulto.
Preferiblemente, todas las células en un organoide hepático expresan marcadores de superficie de hepatocitos. Por ejemplo, en algunas formas de realización, al menos el 50 % (por ejemplo, el 50-60 %), al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 99 % o el 100 % de las células en un organoide hepático expresan marcadores de hepatocitos. En algunas formas de realización, aproximadamente el 35 % de las células en un organoide hepático expresan un marcador de superficie de hepatocitos, por ejemplo, 25-45 %, 30-40 %, 33-37 %, 35 % o menos, o 15-35 % de las células. En algunas formas de realización, la fase de expansión tendría menos hepatocitos, por ejemplo menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % de las células, menos del 2 %, menos del 1 %, preferiblemente 0 % de las células. Preferiblemente, las células y organoides generados según la invención también poseen funciones de hepatocitos, tales como expresión o tinción positiva para los marcadores hepáticos maduros alburnina, integrina B-1, CK-8, CK-18, transtiretina (TTR), glucosa 6P, Met, glutamina sintasa (Glul), transferrina, Fahd1, Fahd2a, K7, K19 y isoformas del citocromo P4503A13 (CYP3A13), 51 (CYP51), 2D10 (CYP2D10), 2j6 (CYP2j6), 39A1 (CYP39A1), 4A10 (CYP4A10), 4F13 (CYP4F13) 4F16 (CYP4F16), CYP4B1 y 20A1 (CYP20Al). Además, el gen AFP del hígado embrionario en algunas formas de realización no se detecta en ninguna de las dos condiciones de cultivo, como en el hígado adulto. En algunas formas de realización, la expresión de la proteína fetal alfa está justo por encima de la expresión del gen de fondo.
Además, los factores de transcripción hepáticos conocidos como HNF1a, HNF1b y HNF4a se expresan altamente en ambas condiciones.
Dado que el hígado y el páncreas son órganos estrechamente relacionados, investigamos si nuestros cultivos de hígado también expresaban genes específicos del páncreas. El páncreas se divide funcionalmente en páncreas endocrino y exocrino. El páncreas endocrino se caracteriza principalmente por expresar insulina, glucagón y somatostatina. La expresión de estas hormonas está estrechamente regulada por un conjunto de factores de transcripción endocrinos específicos del páncreas, siendo los más importantes Pdx1 y NeuroD. El páncreas exocrino está formado por compartimentos acinares y ductales encargados de producir las enzimas digestivas amilasa, lipasa pancreática y quimotripsina, entre otras. La expresión de estos genes también está regulada por genes pancreáticos exocrinos específicos como Ptf1.
Los genes específicos del páncreas Ptf1a, amilasa pancreática (Amy2a4), lipasa pancreática (Pnlip), insulina (ins1 e ins2), glucagón (Gcg), quimotripsina (cela1), Pdx1 y NeuroD estuvieron ausentes en los cultivos de hígado descritos en este documento.
En algunas formas de realización, uno o más o todos los siguientes genes se expresan en los organoides hepáticos a un nivel similar al gen correspondiente en hepatocitos hepáticos adultos: Aqp1, Bmp2, Apo3, Apol7a, Sord, C3, Ppara, Pparg, tbx3, lgf1, ll17rb, II1b, Tgfbi, Apoa1, Apoa4, Apob, Cyp26b1, Cyp27a1, Cyp2b13, Cyp2b9, Cyp2c37, Cyp2f2, Cyp2gl, Cyp2j13, Cyp3a11, Cyp4a10 y Cypf14. Por ejemplo, consulte la Figura 27A.
En algunas formas de realización, uno o más de los siguientes genes se expresan en los organoides hepáticos a un nivel similarmente cerrado en comparación con el gen correspondiente en hepatocitos hepáticos adultos: Cc12, Osmr, Icam1 y Cxc12.
En algunas formas de realización, uno o ambos de los siguientes genes se expresan diferencialmente tanto en un organoide de hígado como en un hígado de recién nacido: mKi67 y cdkn3, lo que significa que la expresión de estos genes es mayor en los organoides que en los organoides diferenciados o en el órgano completo.
En algunas formas de realización, uno, dos o todos los siguientes genes se expresan a un nivel similar en un organoide hepático y en un hígado recién nacido: cyp2j6, olfm4 y Lefty l. Por ejemplo, consulte la Figura 27B.
En algunas formas de realización, un organoide hepático de la invención tiene un fenotipo ductal cuando se cultiva en medio de expansión de la invención (p. ej. EM1 o e M2).
En algunas formas de realización, un organoide hepático de la invención expresa marcadores de hígado adulto cuando se cultiva en un medio de diferenciación de la invención.
En una forma de realización, un organoide hepático de la invención tiene un perfil de expresión génica como se muestra en la Figura 27C.
En una forma de realización particularmente preferida, una población u organoide de células hepáticas de ratón tiene el perfil de expresión génica como se muestra en la Figura 28. Por ejemplo, en una forma de realización preferida, una población u organoide de células hepáticas de ratón:
a) expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), preferiblemente todos los siguientes marcadores de células madre: lgr5, lgr4, epcam, Cd44, Tnfrsf19, Sox9, Sp5, Cd24a, Prom1, Cdca7 y Elf3; y/o
b) no expresa el siguiente marcador de células madre: lgr6; y/o
c) expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), preferiblemente todos los siguientes marcadores de hepatocitos o colangiocitos cuando se cultivan en medio de expansión de la invención: HNF1a, HNF1b, Hnf4a, Hhex, Onecut1, Onecut2, Proxl, Cdh1, Foxa2, Gata6, Foxm1, Cebpa, Cebpb, Cebpd, Cebpg, Glu1, Krt7, Krt19 y Met; y/o
d) no expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) de los siguientes genes cuando se cultivan en medio de expansión de la invención: afp, Ins1, Ins2, Gcg, Ptf1a, Cela1, Cela2a, Cela3b, Neurod1, Neurod2, Neurog1, Neurog2, Neurog3, Amy2a4, Igf1r, Igf2 y Cd34; y/o
e) expresa al menos uno (p. ej. 1, 2 o 3) de los siguientes genes reprogramadores: Klf4, Myc y Pou5f1 y/o f) no expresa el siguiente gen reprogramador: Sox2.
en donde la expresión de los genes se detecta preferiblemente midiendo la expresión a nivel de ARNm, por ejemplo, usando una microarray.
Más preferiblemente, una población de células de hígado de ratón u organoide tiene todas las características a) a f) anteriores.
En algunas formas de realización, el perfil de expresión génica descrito anteriormente para una población de células hepáticas de ratón u organoide hepático es para una población de células hepáticas u organoide de ratón cultivado en medio de expansión hepática de la invención.
En algunas formas de realización, se proporciona una población de células hepáticas humanas u organoide de la invención que tiene la firma de expresión genética que se muestra en la Figura 29. Por ejemplo, una población de células hepáticas humanas u organoide cultivado en EM1 de la invención expresa preferiblemente los genes indicados en la Figura 29 como expresados en medio de cultivo de células EM1. Por ejemplo, una población de células hepáticas humanas u organoide cultivado en EM2 de la invención expresa preferiblemente los genes indicados en la Figura 29 como expresados en medio de cultivo de células EM2. Por ejemplo, una población de células hepáticas humanas u organoide cultivado en MD expresa preferiblemente los genes indicados en la Figura 29 como expresados en medio de cultivo de células MD.
Por ejemplo, en una forma de realización preferida, una población de células hepáticas humanas u organoide de la invención:
a) expresa al menos uno (p. ej. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), preferiblemente todos los siguientes genes característicos de células madre: LGR4, TACSTDI/Epcam, CD44, SOX9, SP5, CD24, PROM1, CDCA7 y ELF3; y/o b) expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4), preferiblemente todos los siguientes genes de reprogramación: KLF4, MYC, POU5F1 y SOX2; y/o
c) expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), preferiblemente todos los siguientes genes específicos de hepatocitos/colangiocitos: HNF1A, HNF1B, HNF4A, HHEX, ONECUT1, ONECUT2, PROXl, CDH1, FOXA2, GATA6, FOXM1, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, GLUL, KRT7, KRT19 y MET; y/o
d) no expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6), preferiblemente todos los siguientes genes específicos de hepatocitos/colangiocitos: NEUROG2, IGF1R y CD34, AFP, GCG y Ptf1A, por ejemplo, no expresa NEUROG2, IGF1R y CD34; y/o
e) expresa al menos uno (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18), preferiblemente todos los siguientes genes específicos de hepatocitos: TTR, ALB, FAH, TAT, CYP3A7, APOA1, HMGCS1, PPARG, CYP2B6, CYP2C18, CYP2C9, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F8, CYP4V2 y SCARB1;
en donde la expresión de los genes se detecta preferiblemente midiendo la expresión a nivel de ARNm, por ejemplo, usando una microarray.
Más preferiblemente, una población de células hepáticas humanas u organoide de la invención tiene todas las características a) a e) anteriores.
En algunas formas de realización, los genes en una población de células hepáticas humanas u organoide de la invención están regulados hacia arriba o hacia abajo en relación con la expresión de un ARN de referencia como se muestra en la Figura 29. Preferiblemente, el ARN de referencia es ARN de referencia humano universal (Stratagene, n.° de catálogo 740000). En algunas formas de realización, un gen está regulado hacia arriba o hacia abajo con respecto al ARN de referencia si también se muestra en la Figura 29 como regulado hacia arriba o hacia abajo con respecto al ARN de referencia, pero el grado de regulación hacia arriba o hacia abajo no tiene por qué ser el mismo. En otras formas de realización, el grado de regulación positiva o negativa es /-35 %, /-30 %, /-25 %, /-20 %, /-20 %, /-15 %, /-10 %, /-5 %, /-3 %, o más preferiblemente /-1,5 veces, /-2 veces, /-3 veces, /-5 veces o aproximadamente lo mismo que se muestra en la Figura 29. En otras formas de realización, el nivel absoluto de expresión de los genes en un organoide humano de la invención es /-35 %, /-30 %, /-25 %, /-20 %, /-15 %, /-10 %, /-5 %, /-3 %, o /-1,5 veces, /-2 veces, /-3 veces, /- 5 veces o aproximadamente el igual que se muestra en la Figura 29.
La población de células hepáticas humanas u organoides de la invención también expresan preferiblemente Lgr5 y/o Tnfrsf19, preferiblemente ambos. En algunas formas de realización, la población de células hepáticas humanas u organoides, cuando se cultivan en el medio de expansión de la invención, expresan Lgr5 y/o Tnfrsf19, preferiblemente ambos. Preferiblemente, la expresión de Lgr5 y/o Tnfrsfr19 se detecta mediante RT PCR. En algunas formas de realización, Lgr5 y/o Tnfrsf19 están presentes en niveles de expresión mucho más bajos en organoides o células cuando se cultivan en el medio de diferenciación en comparación con su nivel de expresión en organoides o células cuando se cultivan en el medio de expansión (por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces más bajo).
Los organoides hepáticos según la presente invención pueden ser preferiblemente capaces de secretar albúmina, por ejemplo, a una velocidad de entre aproximadamente 1 pg por hora por 106 células y 10 pg por hora por 106 células, preferiblemente entre 2 pg y 6 pg por hora por 106 células.
Además, dichas células hepáticas y organoides pueden secretar urea. Por ejemplo, en una placa de células de 35 mm, la actividad de síntesis de urea puede estar entre 1 pg y 50 pg en 48 horas, preferiblemente entre 30,5 pg y 30 pg.
Los organoides hepáticos según la invención pueden mostrar reservas de glucógeno visibles, por ejemplo, cuando se tiñen. La capacidad de las células y organoides para sintetizar glucógeno activamente se puede probar cambiando los medios de cultivo de medios de diferenciación con bajo contenido de glucosa a DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con FBS al 10 % y dexametasona 0,2 pM durante dos días.
Los organoides hepáticos según la invención pueden poseer actividad inducible del citocromo P450 (p. ej. CYPlA). Dicha actividad se puede probar, por ejemplo, usando un ensayo de etoxiresorufin-O-desetilasa (EROD) (Cancer Res, 2001,61: 8164-8170). Por ejemplo, las células u organoides pueden exponerse a un sustrato P450 como 3-metilcolantreno y los niveles de actividad EROD en comparación con las células de control.
Morfológicamente, las células organoides del hígado tienen apariencia de hepatocitos.
Un organoide hepático preferido comprende o consiste en una estructura quística con en el exterior una capa de células con yemas y un lumen central como se representa en la Figura 30. Este organoide hepático puede tener uno o más (p. ej. 2, 3 o todas las 4) de las siguientes características: (a) tener una densidad celular de >5x105 células/cm3, preferiblemente >10x105 células/cm3 (b) tener un espesor equivalente a 2-30 capas de células, preferiblemente un espesor equivalente a 2-15 capas de células; (c) las células entran en contacto mutuamente en tres dimensiones, (d) demuestran una función inherente al tejido hepático sano, (e) tienen una forma alargada, con 2 dominios definidos, es decir un dominio epitelial de una sola capa donde se detectan células altamente polarizadas y se expresan marcadores de queratina (este dominio se asemeja al dominio del conducto biliar) y el otro dominio constituye el cuerpo principal del organoide y está formado por un epitelio multicapa con células no polarizadas en las que se puede detectar expresión de albúmina. Está claro para el experto que tal organoide hepático preferiblemente no es un fragmento de hígado y/o no comprende un vaso sanguíneo y/o no comprende un lóbulo hepático o un conducto biliar.
En el contexto de la invención, un fragmento de hígado es una parte de un hígado adulto, preferiblemente un hígado humano adulto. Preferiblemente, un organoide hepático tal como se identifica en el presente documento no es, por lo tanto, un fragmento de hígado. Un organoide hepático se obtiene preferiblemente usando una célula de un hígado adulto, preferiblemente una célula madre epitelial de un hígado adulto, más preferiblemente una célula madre epitelial de un hígado adulto que expresa Lgr5. También se puede obtener un organoide hepático a partir de cualquier célula que, tras sufrir daño o cultivo, exprese Lgr5 y, por lo tanto, sea una célula madre cíclica que expresa Lgr5.
En algunas formas de realización, un organoide hepático comprende células que expresan Lgr5. Por ejemplo, en algunas formas de realización, al menos el 2 %, más preferiblemente al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 2 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 % al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % de las células del organoide hepático expresan Lgr5. De manera similar, la divulgación describe una célula o una población de células que expresan Lgr5, en donde dichas células se obtienen a partir de un organoide hepático de la invención. La progenie de tales células también está abarcada por la invención.
En una forma de realización, un organoide hepático es un organoide hepático que todavía se está cultivando usando un método de la invención y, por lo tanto, está en contacto con una matriz extracelular. Preferiblemente, un organoide hepático está incrustado en una matriz extracelular mesenquimatosa o no mesenquimatosa. En el contexto de la invención, “en contacto” significa un contacto físico, mecánico o químico, lo que significa que para separar dicho organoide hepático de dicha matriz extracelular es necesario utilizar una fuerza.
En una forma de realización preferida, un organoide hepático podría cultivarse durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 meses o más. En algunas formas de realización, el organoide hepático se expande o se mantiene en cultivo durante al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses. o más. Preferiblemente, un organoide hepático cultivado usando medios de expansión de la invención que comprenden un inhibidor de TGF-beta se puede cultivar durante al menos 4 semanas, más preferiblemente al menos 5 semanas con una expansión de 5 veces por semana o dos o más duplicaciones de población por semana (p. ej. para al menos 10 duplicaciones, al menos 20 duplicaciones, más preferentemente al menos 25 duplicaciones, por ejemplo al menos 30 duplicaciones). Preferiblemente, un organoide hepático cultivado usando medios de expansión de la invención que comprenden un activador de la vía de las prostaglandinas además de un inhibidor de TGF-beta se puede cultivar durante al menos 7 semanas, más preferiblemente al menos 8 semanas a 2 o más duplicaciones (p. ej. 2-3 duplicaciones) por semana (es decir al menos 15 duplicaciones, al menos 25 duplicaciones, al menos 30 duplicaciones, al menos 32 duplicaciones, al menos 35 duplicaciones, por ejemplo 32-40 duplicaciones o al menos 40 duplicaciones, por ejemplo al menos 50 duplicaciones). Así, preferiblemente, un organoide hepático de la invención, por ejemplo un organoide hepático humano, se obtiene usando medios de expansión de la invención.
En otra forma de realización preferida, un organoide hepático se origina a partir de una única célula, preferiblemente que expresa Lgr5, más preferiblemente en donde la célula única comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de interés.
Composición de oraanoides y expresión genética
Las criptas de vellosidades, las criptas de colon y los organoides pancreáticos normalmente comprenden células madre y/o células progenitoras y, por lo tanto, estos organoides comparten ciertos patrones de expresión genética. En algunas formas de realización, se pueden detectar uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) o todos los siguientes marcadores: LGR5, LGR4, epcam, Cd44, Sox9, Cd24a y CD133/Prom1 y opcionalmente Tnfrsf19. En otra forma de realización, se puede detectar la expresión de uno o dos o todos los siguientes genes progenitores: Pdx1, Nkx2.2 y Nkx6.1. Después de la diferenciación, se espera que los patrones de expresión genética de las criptas de vellosidades, las criptas del colon y los organoides pancreáticos diverjan a medida que los organoides diferenciados expresen marcadores adultos específicos de tejido, como la insulina en el páncreas, por ejemplo.
Organoides de criptas de vellosidades
En algunas formas de realización de la invención, los organoides comprenden extensiones similares a criptas de vellosidades que comprenden todos los tipos de células epiteliales diferenciadas, incluidas células proliferativas, células de Paneth, enterocitos y células caliciformes. En algunas formas de realización, los organoides de criptas y vellosidades de la invención no contienen miofibroblastos u otras células no epiteliales. Un organoide de criptas de vellosidades de la invención comprende preferiblemente enterocitos, incluyendo enterocitos absorbentes, células caliciformes, células enteroendocrinas y células de Paneth en una estructura similar a criptas de vellosidades. Preferiblemente, podría detectarse al menos uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) de los siguientes marcadores: SMOC2, CDCA7, OLFM4, ASCL2, AXIN2 y/o Lgr5 Tnfrsf19, CD24a, Sox9, CD44, Prom1 (véase Figura 2e y Figura 14). En algunas formas de realización, se pueden detectar los marcadores RNF43 y ZNRF3. En algunas formas de realización, uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5) o todos SMOC2, CDCA7, OLFM4, ASCL2, AXIN2 y/o Lgr5 son al menos 2 veces, 3 veces o 4 veces reguladas hacia arriba en las criptas, mientras que los marcadores que están regulados hacia abajo al menos 2 veces, 3 veces o 4 veces en las criptas incluyen al menos uno o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) o todos ABCG1, ENPP3, CSTE, MUC17 y/o APOA1. En este contexto, la “regulación positiva” se refiere a las vellosidades del intestino o a la sección superior de la cripta del colon. El análisis de microarrays, que compara la expresión genética de células organoides diferenciadas con células madre, reveló que las criptas de vellosidades del intestino delgado y los organoides del colon poseen firmas moleculares comparables de las criptas intestinales, incluida la expresión de genes de células madre intestinales. Por tanto, la invención también proporciona un organoide colónico que tiene la firma molecular descrita anteriormente para los organoides de criptas y vellosidades. Los organoides cultivadosin vitroexhiben claramente un perfil de expresión similar al de las criptas del intestino delgado recién aisladas y expresan marcadores de células madre conocidos.
En algunas formas de realización, el ARNm que codifica uno o más genes (p. ej. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) enumerados en la Figura 14 (por ejemplo, todos los genes sombreados en la Figura 14) como regulados positivamente en organoides de criptas de vellosidades o organoides de colon, respectivamente, están regulados positivamente en un organoide de criptas de vellosidades u organoides de colon de la invención en comparación con vellosidades intestinales delgadas recién aisladas, según lo determinado por microarrays. En algunas formas de realización, el ARNm que codifica uno o más (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25) Los genes enumerados en la Figura 14 (por ejemplo, todos los genes sombreados en la Figura 14) que están regulados negativamente en organoides de criptas de vellosidades o organoides de colon, respectivamente, están regulados negativamente en un organoide de criptas de vellosidades o en un organoide de colon de la invención en comparación con una vellosidad del intestino delgado recién aislada, según lo determinado por microarrays. En algunas formas de realización, la regulación hacia arriba o hacia abajo del pliegue es como se indica en la Figura 14 /- 25 %, por ejemplo, /- 20 %, /- 15 %, /- 10 %, /-5 %, / -3 % o aproximadamente como se cita en la Figura 14. Por ejemplo, un organoide de criptas de vellosidades de la invención puede tener ADORA2B regulado positivamente 9,54 veces /- 25 % en comparación con pequeñas vellosidades investinales recién aisladas. Lo mismo se aplica, mutatis mutandis, a los demás genes enumerados en la Figura 14.
En algunas formas de realización, los organoides de las vellosidades de la cripta muestran una expresión natural de Lgr5. En algunas formas de realización, los organoides de las vellosidades de la cripta muestran una expresión natural de al menos Lgr5 y uno o más (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16) o todos los marcadores de células madre del grupo formado por: C<k>19, Nestin, Somatostatina, CXCR4+, CD133+, D<c>A<m>KL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, HNF1a, Hnf4a, Sox9, KRT7 y KRT19. Además o alternativamente, los organoides de criptas y vellosidades pueden caracterizarse por la expresión de uno o más o los 79 (por ejemplo 1 o 2) de: Sord y/o Prss23. Además o alternativamente, los organoides de criptas y vellosidades pueden caracterizarse por la expresión de CD44 y/o Sox9. En otra forma de realización, los organoides de las vellosidades de la cripta muestran la expresión de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) o todos los marcadores del grupo que consiste en: lgr5, lgr4, epcam (tacstd1), Cd44, Tnfrsf19, Sox9, Sp5, Cd24a, Prom1 y Cdca7.
En algunas formas de realización, un organoide de criptas de vellosidades comprende células de Paneth que expresan lisozima.
Organoides de colon
En algunas formas de realización, un organoide de colon contiene células enteroendocrinas (p. ej. como detectable usando tinción con cromagranina A), células caliciformes (como detectable usando tinción con mucina 2). En algunas formas de realización, menos del 10 % de las células en el organoide del colon son células enteroendocrinas (p. ej. 0,01-5 %, 0,1 3 %). En algunas formas de realización, menos del 30 % de las células en el organoide del colon son células caliciformes (p. ej. 1-25 %, 1-15 %, 5-10 %). En algunas formas de realización, la distribución de las células enteroendocrinas y/o las células caliciformes es como se muestra en la Figura 1d.
En algunas formas de realización, un organoide de colon contiene enterocitos maduros (p. ej. como se visualiza mediante tinción con fosfatasa alcalina). En algunas formas de realización, menos del 10 % de las células en el organoide del colon son enterocitos maduros (p. ej. menos del 5 %, menos del 3 %, 0,01-5 %, 0,1-3 %, 0,1-5 %).
En formas de realización preferidas, un organoide de colon no comprende células de Paneth porque no hay células de Paneth en un colonin vivode origen natural.
En algunas formas de realización, los organoides del colon muestran una expresión natural de Lgr5.
En algunas formas de realización, un organoide de colon expresa uno o más (p. ej. 1, 2, 3 o 4) de Villin 1, Alpi, ChgA y Muc2. En algunas formas de realización, la cantidad relativa de ARNm de Villin1 expresado por un organoide de colon de la invención en comparación con una cripta de colon recién aislada es al menos 3 % (p. ej. al menos el 5 %, al menos el 8 %, al menos el 10 %), por ejemplo entre el 5-15 %. En algunas formas de realización, la cantidad relativa de ARNm de Alpi expresado por un organoide de colon de la invención en comparación con una cripta de colon recién aislada es al menos 0,5 % (p. ej. al menos 1 %, al menos 2 %), por ejemplo, entre 0,5-5 %. En algunas formas de realización, la cantidad relativa de ARNm de ChgA expresado por un organoide de colon de la invención en comparación con una cripta de colon recién aislada es al menos el 15 % (p. ej. al menos un 20 %, al menos un 22 %), por ejemplo, entre un 15-30 %. En algunas formas de realización, la cantidad relativa de ARNm de Muc2 expresado por un organoide de colon de la invención en comparación con una cripta de colon recién aislada es al menos el 20 % (p. ej. al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %), por ejemplo, entre el 25-37 %. En algunas formas de realización, un organoide de colon humano de la invención expresa marcadores de células madre conocidos.
Organoides pancreáticos
El páncreas contiene tres clases de tipos de células: las células ductales, las células acinares y las células endocrinas. Las células endocrinas producen las hormonas glucagón, insulina somatostatina y polipéptido pancreático (PP), que se secretan en el torrente sanguíneo y ayudan al cuerpo a regular el metabolismo del azúcar. Las células acinares son parte del sistema exocrino, que fabrica enzimas digestivas, y las células ductales de los conductos pancreáticos, que conectan las células acinares con los órganos digestivos. Durante el desarrollo, se cree que los islotes de Langerhans descienden de células endocrinas progenitoras que emergen del conducto pancreático y, después de la diferenciación, se agregan para formar islotes de Langerhans. Los islotes de Langerhans comprenden células a, células p, células ó y células PP.
Las células organoides pancreáticas pueden tener un patrón de expresión que se asemeja a los marcadores de células ductales, como uno o más (p. ej. 1,2 o todos) de K7, K19 y HNF1b y/o uno o más marcadores generales de células madre tales como Sox9 y/o Onecut1. Es probable que esto sea parte de la firma de sus células madre. Generalmente, se ven menos marcadores de diferenciación. En algunas formas de realización en las que se aísla una célula de un conducto pancreático para generar un organoide pancreático de la invención, el tipo de célula que da lugar a un organoide pancreático de la invención no es una célula ductal (es decir, las células epiteliales positivas para queratina 7 y queratina 19 que forman el tubo ductal), pero es una célula adherida al conducto pancreático, es decir, una célula que se encuentra en la siguiente capa de células después del conducto en contacto con el tejido pancreático (es decir, (no frente a la luz del conducto). Por lo tanto, en formas de realización en las que el tipo de célula que da lugar a un organoide pancreático no es una célula ductal, el organoide pancreático no expresará K7 o K19. Sin embargo, dicho organoide pancreático seguirá expresando preferiblemente uno o más marcadores generales de progenitores de células madre tales como Sox9.
Un organoide pancreático de la invención comprende preferentemente células a, células p, células ó y células PP. En otra forma de realización preferida, un organoide pancreático comprende células beta. Por ejemplo, un organoide pancreático puede comprender más del 1 %, más del 5 %, más del 10 %, más del 15 % o más del 20 % de células beta. La expresión de insulina puede usarse como marcador de células beta. En una forma de realización alternativa, el organoide pancreático comprende tipos de células progenitoras, opcionalmente con un origen ductal, que pueden dar lugar a tipos de células diferenciadas tras el trasplante a un ser humano o animal. En una forma de realización preferida, los tipos de células progenitoras pueden dar lugar a células beta secretoras de insulina tras el trasplante a un ser humano o animal. Los inventores han demostrado que los organoides pancreáticos humanos, cultivados según los medios y métodos de la invención, pueden trasplantarse a ratones y estimular las células secretoras de insulina en el plazo de un mes (véase el ejemplo 4). Se puede entender fácilmente que esto podría conducir a tratamientos revolucionarios para pacientes con diabetes y deficiencias de insulina.
En algunas formas de realización, un organoide pancreático de la invención puede comprender células ductales, células acinares y células endocrinas. En algunas formas de realización, K19 se usa como marcador de células ductales.
En algunas formas de realización, existe una célula beta dentro de islas pancreáticas o islotes de Langerhans. Un islote comprende generalmente alrededor de 1500 célulasin vivo,por ejemplo, 1300-1700 células. En una forma de realización, un organoide pancreático comprende al menos 0,5 %, al menos 1 %, al menos 1,5 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 % o más Islotes de Langerhans en masa. En algunas formas de realización, los islotes de Langerhans del organoide pancreático están compuestos de aproximadamente 65 a 90 % de células beta, aproximadamente 15 a 20 % de células alfa, aproximadamente 3 a 10 % de células delta y aproximadamente 1 % de células PP. Sin embargo, esto no es en modo alguno excluyente. Por ejemplo, en algunas formas de realización, es deseable tener muchas células beta en un organoide de la invención. Alternativamente, un organoide puede comprender células progenitoras que pueden trasplantarse para que se diferencienin vivo.
En algunas formas de realización, un organoide pancreático expresa uno, dos o los tres de Pdx1, Nkx2.2 y Nkx6.1. Un organoide pancreático puede expresar uno, dos, tres o los cuatro de NeuroD, Pax6, Pax4 y Mafa. Pax4 sirve como marcador de la presencia de células productoras de insulina porque es un factor de transcripción esencial para la diferenciación de las células productoras de insulina de las células progenitoras endocrinas durante el desarrollo embrionario. Un organoide pancreático puede expresar Ngn3.
En algunas formas de realización, al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5) de los siguientes marcadores se puede detectar en un organoide pancreático de la invención: insulina (ins1 y/o ins2), glucagón (Gcg), somatostatina, Pdx1 y NeuroD. En algunas formas de realización, al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5) de los siguientes marcadores se puede detectar en un organoide pancreático de la invención: insulina (insl y/o ins2), glucagón (Gcg), somatostatina, Pdx1 y NeuroD y no se detectan los siguientes marcadores: Ptf1a, amy2a4, Pnlip y cela1. En algunas formas de realización, al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) de los siguientes marcadores se puede detectar en un organoide pancreático de la invención: Ptf1a, amilasa pancreática (Amy2a4), lipasa pancreática (Pnlip), insulina (ins1 y/o ins2), glucagón (Gcg), somatostatina, quimotripsina (cela1), Pdx1 y NeuroD.
En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran una expresión natural de Lgr5. En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran expresión natural de al menos Lgr5 y uno o más (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) marcadores de células madre seleccionados del grupo que consiste en: CK19, Nestin, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, HNF1a, Hnf4a, Sox9, KRT7 y KRT19, Prom1, Cd24a, Lgr4, epcam. Alternativa o adicionalmente, en algunas formas de realización, los organoides pancreáticos pueden caracterizarse por la expresión natural de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) de: CK19, Nestina (insulina, glucagón) y CXCR4+.
En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos de la invención expresan somatostatina. La somatostatina es una hormona expresada en células delta diferenciadas y, por lo tanto, puede servir como marcador 3 para las células delta.
Alternativa o adicionalmente, en algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran expresión natural de uno o más marcadores endocrinos tempranos, por ejemplo al menos uno o más (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) de los siguientes marcadores endocrinos tempranos: Sox9, HNF1b, Hnf6, HNF1a, Nkx2.2, Nkx6.1 y Pdx1.
Alternativa o adicionalmente, en algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran expresión natural de uno o más marcadores endocrinos tempranos, por ejemplo al menos uno o más (p. ej. 1, 2, 3 o 4) de los siguientes marcadores endocrinos: Foxa2, Hnf6, HNF1b y Sox9. En algunas formas de realización, aunque los organoides pancreáticos muestran expresión natural de uno o más (p. ej. 1,2, 3 o 4) de los siguientes marcadores endocrinos: Foxa2, Hnf6, HNF1b y Sox9, no muestran expresión de Ngn3.
Alternativa o adicionalmente, en algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran expresión natural de uno o más marcadores ductales, por ejemplo, uno o ambos de queratina 7 y queratina 19. En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran expresión natural de uno o más marcadores ductales a un nivel significativo o detectable. Por tanto, en algunas formas de realización, los organoides pancreáticos tienen un fenotipo ductal. En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos muestran la expresión de uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) o todos los siguientes marcadores, seleccionados del grupo: HNFlA, Hn F1B, Hnf4A, HHEX, ONECUTI, ONECUT2, CDHl, FOXA2, GATA6, CEBPB, CEBPD, CEBPG, Glul, Krt7, Krt19 y MET.
Sin embargo, los organoides pancreáticos pueden tener algunas características ductales en combinación con características de las células precursoras productoras de insulina. Por ejemplo, pueden expresar uno o más marcadores ductales como se muestra en la Figura 16B. En algunas formas de realización, un organoide pancreático exhibe un perfil de expresión génica en relación con el páncreas o los organoides hepáticos adultos aproximadamente como se muestra en la Figura 16B. Por ejemplo, en algunas formas de realización, estos genes están regulados positivamente o negativamente en organoides pancreáticos en comparación con organoides hepáticos de páncreas adultos hasta aproximadamente la misma proporción de veces que en la Figura 16B, por ejemplo, menos de /- 3 %, menos de /- 5 %, menos de /- 10 %, menos de /- 20 %.
En algunas formas de realización, las células positivas para insulina aparecen a partir del revestimiento ductal en los organoides pancreáticos.
En algunas formas de realización, uno o más (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7), preferiblemente todos los siguientes genes están regulados positivamente en los organoides del páncreas en comparación con los organoides del hígado: Aaas, Rps4y2, Atp2c2, Akap2, Uts2, Sox17, Agr2. Por ejemplo, en algunas formas de realización, estos genes están regulados positivamente en organoides pancreáticos en comparación con organoides hepáticos hasta aproximadamente la misma proporción de veces que en la Figura 19, por ejemplo, menos de /- 3 %, menos de /- 5 %, menos de /- 10 %, menos de /- 20 %.
En una forma de realización, un organoide pancreático comprende al menos 103, al menos 104, al menos 105 o más células en total. En una forma de realización, un organoide pancreático comprende más del 50 %, más del 60 %, más del 70 % o más del 80 % de células progenitoras endocrinas de tipo ductal. Sin embargo, también se prevén porcentajes más bajos de células progenitoras endocrinas de tipo ductal.
Organoides del esófago de Barrett (BE)
Un organoide BE de la invención es Ki67+.
Preferiblemente un organoide BE tiene un número mínimo (p. ej. menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 2 %, menos del 1 % de células) de células PAS+ y Mucina+ 4 días después de la retirada de nicotinamida y SB202190 del medio de expansión para encubrimiento al medio de diferenciación.
En algunas formas de realización, un organoide BE comprende células caliciformes. Estos pueden inducirse mediante el tratamiento del medio de diferenciación con un inhibidor de la gamma-secretasa como DBZ (p. ej. en 10uM), por ejemplo, durante 4 días.
En algunas formas de realización, un organoide de esófago de Barrett de la invención comprende células de Paneth.
En algunas formas de realización, un organoide de esófago de Barrett de la invención expresa lisozima.
Organoides gástricos
En algunas formas de realización, los organoides gástricos de la invención muestran una expresión natural de Lgr5. En algunas formas de realización, los organoides gástricos de la invención muestran expresión natural de al menos Lgr5 y uno o más (p. ej. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17) de marcadores de células madre del grupo formado por: CK19, Nestina, Somatostatina, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, HNF1a, Hnf4a, Sox9, KRT7 y KRT19. De forma alternativa o adicional, en algunas formas de realización, los organoides gástricos pueden caracterizarse por la expresión natural de uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de: CD133+, DCAMKL-1 y CD44. De forma alternativa o adicional, los organoides gástricos pueden caracterizarse por CD44 y Sox9.
Organoides de próstata
En algunas formas de realización, los organoides de próstata de la invención, tales como próstatas de ratón, muestran expresión natural de Lgr5. En algunas formas de realización, los organoides prostáticos muestran expresión natural de marcadores luminales de la próstata, tales como citoqueratina 18 (CK1 8) y citoqueratina 8 (CK8). En algunas formas de realización, los organoides prostáticos de la invención muestran una expresión natural del receptor de andrógenos (RA). En algunas formas de realización, los organoides de la próstata expresan marcadores basales, tales como p63 y/o citoqueratina 5 (CK5). En algunas formas de realización, cuando la testosterona (p. ej. DHT) se añade al medio, la expresión de los marcadores basales, Lgr5 y Tnfrsf19, se regulan negativamente en comparación con los organoides cultivados en ausencia de testosterona (p. ej. DHT). El factor de transcripción específico de la próstata NKX3.1 se expresa en todas las condiciones. Por lo tanto, en algunas formas de realización los organoides prostáticos de la invención muestran expresión natural del marcador específico de próstata Nkx3.1.
En algunas formas de realización, los organoides prostáticos de la invención, por ejemplo organoides prostáticos humanos normales o cancerosos, muestran expresión natural de marcadores luminales, tales como CK18, CK8 y/o B-MSP. En algunas formas de realización, los organoides prostáticos muestran una expresión natural de RA. En algunas formas de realización, se expresan marcadores epiteliales basales, tales como CK14, CK5 y/o p63. En algunas formas de realización, se expresa TNFRSF19. El factor de transcripción específico de próstata NKX3.1 se expresa en todas las condiciones. Por lo tanto, en algunas formas de realización los organoides prostáticos de la invención muestran una expresión natural del marcador específico de próstata Nkx3.1.
La adición de testosterona (p. ej. DHT) a un medio de cultivo según la invención permite que crezcan organoides prostáticos que mantienen una población de células madre que permite un crecimiento hasta 3 veces más rápido (que sin testosterona) y la mayoría (si no todos) los tipos de células diferenciadas de la próstata (tanto basales como no luminales) también están presentes. Estas condiciones permiten una expansión celular ilimitada 1 (hasta ahora 9 meses a 2,5 duplicaciones de población por semana). Por lo tanto, en algunas formas de realización, un organoide prostático comprende todos los tipos de células diferenciadas de la próstata, por ejemplo, tanto células basales como luminales. En una forma de realización preferida, un organoide prostático comprende todos los tipos de células diferenciadas, por ejemplo células basales y luminales, y células madre.
En tejido normal, la adición de testosterona (p. ej. DHT) aumenta la expresión de RA en todas las condiciones de cultivo. En algunas formas de realización, los organoides de la próstata tienen una expresión de RA regulada positivamente en comparación con las células de la próstata cultivadas en ausencia de testosterona. En el tejido tumoral, la expresión de RA no está influenciada por la testosterona (p. ej. DHT) adición. Por lo tanto, en algunas formas de realización, un organoide de cáncer de próstata no tiene una expresión de RA aumentada en relación con las células de cáncer de próstatain vivo.El marcador de células madre LGR5 se expresa en condiciones ENRF en organoides prostáticos de 25 tejidos normales. En los organoides de próstata obtenidos de tejido tumoral, la expresión de LGR5 se induce con la adición de testosterona (p. ej. DHT). En algunas formas de realización, los organoides prostáticos expresan LGR5.
Funciones de los organoides
En algunas formas de realización, los organoides generados por los medios y métodos de la presente invención imitan las decisiones del destino celularin vivoen respuesta a factores externos. Preferiblemente, las células y organoides generados según la invención también poseen funciones específicas de tejido.
Organoides pancreáticos
Un organoide pancreático posee preferentemente funciones pancreáticas endocrinas y exocrinas, tales como expresar uno o más (por ejemplo 1, 2 o los 3) de insulina, glucagón y somatostatina. La expresión de estas hormonas está estrechamente regulada por un conjunto de factores de transcripción endocrinos específicos del páncreas, siendo los más importantes Pdx1 y NeuroD. El páncreas exocrino está formado por compartimentos acinares y ductales encargados de producir las enzimas digestivas amilasa, lipasa pancreática y quimotripsina, entre otras. La expresión de estos genes también está regulada por genes pancreáticos exocrinos específicos como Ptf1a.
Las células pancreáticas y los organoides según la presente invención pueden ser preferiblemente capaces de secretar insulina, por ejemplo, a una velocidad de entre aproximadamente 1 pg por hora por 106 células y 10 pg por hora por 106 células, por ejemplo, entre 2 pg y 6 pg por hora por 106 células. El nivel de secreción de insulina se puede detectar mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la transferencia Western comparada con una referencia o mediante Elisa de péptido C. El método preferido para demostrar que los organoides pancreáticos pueden secretar insulina es mediante pruebas de producción de péptido C. El péptido proinsulina C sirve como un conector importante entre las cadenas A y B de la insulina y facilita el ensamblaje, plegamiento y procesamiento eficiente de la insulina en el retículo endoplásmico. A continuación, se almacenan cantidades equimolares de péptido C e insulina en los gránulos secretores de las células beta pancreáticas y, finalmente, ambos se liberan a la circulación portal. Por tanto, el péptido C es un marcador preferido de la secreción de insulina.
Por tanto, en una forma de realización se proporciona un organoide pancreático que secreta insulina después del trasplantein vivo.En algunas formas de realización, después del trasplantein vivo,el organoide pancreático secreta insulina a una velocidad de al menos 1 pg por hora por 106 células, por ejemplo, al menos 2 pg por hora por 106 células, al menos 4 pg por hora por 106 células, al menos 6 pg por hora por 106 células, al menos 8 pg por hora por 106 células o al menos 10 pg por hora por 106 células. En algunas formas de realización, las células en el organoide pancreático no son capaces de secretar insulina y/o no expresan insulina como marcador cuando se cultivain vitro.Sin embargo, las células de un organoide pancreático de la presente invención son preferiblemente capaces de secretar insulinain vivocuando se trasplantan a un paciente, por ejemplo, al páncreas del paciente. En algunas formas de realización, la capacidad de secretar insulina puede no estar presente inmediatamente después del trasplante, pero está presente aproximadamente un mes después del trasplante, por ejemplo, 6 semanas, 2 meses o 3 meses después del trasplante.
Si se obtiene una muestra de células endocrinas enriquecida de un organoide pancreático de la invención, en algunas formas de realización, el 75-85 % de las células en la muestra de células endocrinas enriquecida serían células secretoras de insulina.
En algunas formas de realización, la invención proporciona organoides pancreáticos para su uso en el tratamiento de la diabetes. En algunas formas de realización, los organoides pancreáticos son organoides en expansión, mientras que en otras formas de realización pueden ser organoides diferenciados. En algunas formas de realización uno o más (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, etc.) se trasplantan organoides completos a un animal o paciente, mientras que en otras 3 formas de realización se trasplanta una muestra de células a un paciente.
Organoides de criptas de vellosidades
Un organoide de criptas de vellosidades posee preferiblemente funciones secretoras y de autorrenovación. Por ejemplo, un organoide de criptas de vellosidades secreta preferentemente mucina, secreciones enzimáticas y hormonales, tales como lisozima, colecistoquinina, secretina y péptido inhibidor gástrico, y otras glicoproteínas.
Organoides gástricos
El estómago humano está dividido anatómica y funcionalmente en dos regiones principales. El antro pilórico cerca del intestino produce principalmente moco protector y secreta hormonas como la gastrina. El cuerpo gástrico secreta ácido clorhídrico y enzimas gástricas como el pepsinógeno. El epitelio gástrico de ambas regiones se organiza en invaginaciones llamadas glándulas. Estas glándulas albergan células madre gástricas, células progenitoras y células diferenciadas. La composición precisa de las células diferenciadas varía según la función de la región anatómica. En el antro pilórico, las glándulas están compuestas principalmente por células productoras de mucina 6 y células endocrinas productoras de hormonas. En el cuerpo, las células principales productoras de pepsinógeno y las células parietales secretoras de ácido están dispersas entre las células productoras de moco y las escasas células endocrinas. La región de la superficie entre las glándulas gástricas está ocupada por células productoras de moco que producen principalmente la mucina 5 de la superficie.
Los organoides gástricos se parecen al epitelio gástrico en estructura y función. Aunque en su mayoría son esféricos, pueden tener dominios con invaginaciones que probablemente se asemejen a estructuras glandulares. La tinción de mucinas y pepsinógeno muestra que los tipos de células más abundantes en los organoides gástricos son las células mucosas productoras de mucina 6 y las células principales productoras de pepsinógeno (y/o sus progenitores). En consecuencia, las RT-PCR indican la expresión de pepsinógeno y mucina 6. Además, la expresión de gastrina indica la presencia de células endocrinas y la expresión de Lgr5 indica la presencia de células madre.
En algunas formas de realización, los organoides gástricos tienen expresión natural de uno o más (p. ej. 1, 2, 3 o 4) de gastrina, pepsinógeno, mucina 6 y/o Lgr5. En algunas formas de realización, los organoides gástricos comprenden células mucosas productoras de mucina 6 y células principales productoras de pepsinógeno y opcionalmente células madre Lgr5+. En algunas formas de realización, los organoides gástricos comprenden células endocrinas. En algunas formas de realización, los organoides gástricos son en su mayoría esféricos pero tienen dominios con invaginaciones que se asemejan a estructuras glandulares.
Organoides prostáticos
En algunas formas de realización, los organoides prostáticos comprenden o constan de dos linajes epiteliales distintos, células basales y células luminales. En algunas formas de realización, las células basales y las células luminales secretan fluidos prostáticos.
In vivo,el epitelio prostático está fuertemente plegado, lo que garantiza una superficie máxima. Los dos linajes epiteliales forman un epitelio estratificado simple con las células epiteliales basales formando la capa basal/externa y las células epiteliales luminales fuertemente polarizadas situadas en la parte superior formando la capa interna/luminal. El compartimento luminal es esencial para la función secretora de la próstata. El líquido prostático es alcalino y está compuesto por varias proteínas, como el antígeno prostático específico (PSA), la calicreína humana 2 (KLK2) y la microseminoproteína p (p-MSP). Las funciones principales del líquido prostático son: 1) preparar el medio del útero para el semen, que se realiza mediante la alcalinidad del líquido y las funciones paracrinas de p-MSP, y 2) aumentar la fluidez del líquido seminal, permitiendo que los espermatozoides naden libremente, lo cual es realizado por las proteasas PSA y KLK2 que descomponen las seminogelinas.
La expresión de proteínas secretoras está estrechamente regulada por el receptor de andrógenos (RA), que se une a la testosterona y posteriormente se traslada al núcleo y activa la transcripción. Las alteraciones en la función RA muestran una fuerte regulación negativa de las proteínas secretoras a nivel transcripcional y proteico.
La Figura 43 muestra la estratificación de los organoides de próstata cultivados en condiciones de ENR+Dihidrotestosterona (DHT), mostrando claramente las células basales de citoqueratina 5+ formando una capa externa de células y las células luminales de citoqueratina 8+ formando una capa interna fuertemente polarizada. En algunas formas de realización, un organoide de próstata comprende células basales de citoqueratina 5+ y células luminales de citoqueratina 8+, opcionalmente en donde las células basales de citoqueratina 5+ forman una capa externa de células y las células luminales de citoqueratina 8+ forman una capa interna fuertemente polarizada. En algunas formas de realización, un organoide prostático comprende capas plegadas de células, que opcionalmente comprenden un fuerte plegamiento. Tal plegamiento maximiza el área de superficie de las células secretoras, lo que demuestra que a nivel morfológico los organoides prostáticos se parecen a la próstatain vivo.En algunas formas de realización, la morfología de un organoide prostático se asemeja a la morfologíain vivode la próstata.
Los organoides prostáticos cultivados en condiciones ENR no secretan líquido prostático hacia la luz. Por el contrario, la adición de testosterona (p. ej. DHT) al medio da como resultado la secreción de fluidos, por ejemplo líquido prostático, en la luz del organoide. Esto se debe a la activación del programa transcripcional dependiente de RA en los organoides prostáticos por la testosterona (p. ej. DHT), que resulta en la secreción de líquidos por las células luminales CK8+. Los datos muestran que los organoides prostáticos se parecen tanto morfológica como funcionalmente al epitelio prostáticoin vivo.
Por consiguiente, en algunas formas de realización, por ejemplo en las que los organoides prostáticos se cultivan en un medio de cultivo que comprende testosterona (p. ej. DHT), un organoide prostático secreta líquido, por ejemplo líquido prostático, en la luz del organoide. En algunas formas de realización, por ejemplo, en las que los organoides de la próstata se cultivan en un medio de cultivo que comprende testosterona (p. ej. 3DHT), la funcionalidad de un organoide prostático se asemeja a la funcionalidadin vivode la próstata.
Fragmentos de tejido
En el contexto de la invención, un fragmento de tejido es una parte de un tejido adulto, preferiblemente un tejido humano adulto, tal como parte de un intestino delgado, colon o páncreas humano adulto. Otros ejemplos de tejido humano adulto en el contexto de esta invención incluyen estómago, hígado y próstata. El tejido puede ser tejido normal (sano) o puede ser tejido enfermo o infectado. Preferiblemente, un organoide como se identifica en el presente documento no es, por lo tanto, un fragmento de tejido. Un organoide se obtiene preferiblemente usando una célula de un tejido adulto, preferiblemente una célula madre epitelial de un tejido adulto, opcionalmente de un fragmento de tejido adulto, más preferiblemente una célula madre epitelial de un tejido adulto o un fragmento de tejido adulto que expresa Lgr5. Por lo tanto, dentro del contexto de esta invención, un fragmento de tejido comprende preferiblemente células madre Lgr5+.
En una forma de realización, un organoide es un organoide que todavía se está cultivando usando un método de la invención (preferiblemente usando un medio de cultivo de la invención) y, por lo tanto, está en contacto con una matriz extracelular. Preferiblemente, un organoide está incrustado en una matriz extracelular no mesenquimatosa. En el contexto de la invención, “en contacto” significa un contacto físico, mecánico o químico, lo que significa que para separar dicho organoide de dicha matriz extracelular es necesario utilizar una fuerza. En algunas formas de realización, la matriz extracelular es una mezcla de proteínas gelatinosa secretada por células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), tales como Matrigel (BD Biosciences). En otras formas de realización de la invención, los organoides pueden retirarse del cultivo y usarse para trasplante o con fines regenerativos. Por tanto, la invención proporciona un organoide de la invención para uso en trasplantes a un mamífero, preferiblemente a un ser humano.
Tasa de supervivencia
Los inventores muestran aquí, por primera vez, que la adición de un inhibidor de la quinasa ALK4, ALK5, ALK7 o p38 al medio de cultivo de células madre descrito anteriormente mejoró la eficiencia del cultivo en placas en al menos un 50 % y en más de un 100 % en algunos casos (véase tabla 2). Los inventores también han demostrado que incluir ambos inhibidores (un inhibidor de ALK y un inhibidor de p38, por ejemplo A83-01 y SB-202190) en el medio de cultivo prolonga sinérgicamente el período de cultivo.
Por consiguiente, en una forma de realización de la invención, las células madre sobreviven durante al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses o al menos 12 meses o más.
Velocidad de proliferación
La velocidad de proliferación puede evaluarse en términos del nivel de duplicación de la población celular. El nivel de duplicación de la población se refiere al número total de veces que las células de la población se han duplicado desde su aislamiento primarioin vitro.El nivel de duplicación de la población se puede determinar mediante el recuento de células. Alternativamente, la velocidad de proliferación puede evaluarse mediante un ensayo de proliferación celular, por ejemplo en el que sondas fluorescentes específicas miden la actividad de síntesis de ADN mediante la incorporación de BrdU y el estado de proliferación celular mediante la expresión de Ki67 (Thermo Scientific* Cellomics, Millipore).
Se pueden encontrar más ejemplos de ensayos de proliferación celular para células madre en línea o en revistas como Current Protocols. Un ejemplo entre muchos es: http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=101&filterDispName=Cellular Proliferation Assays for Stem Cells&filterType=l&OP=filter&filter=fM101%2Ff_494303*&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAH2NsQrDMAxEv0ZTsEkdKFmzZC7 0C4IjakFsGVuOfz%2FK0I6F4x284c48YJxfhffm%0ApQ7gnsMby0ke6x8fRDJMC7hV03u3IE6Swh9M1nNUWUIQq1UFJk XgeIvvotnSbn6LbllyPshvQpyq%0ADRIPfQE33RlnKQ21Lvuql7CrAAAA.
Los inventores han observado que utilizando los medios de cultivo de la invención las células pueden expandirse hasta un promedio de 5 veces por semana. Por ejemplo, cultivar una sola célula durante dos semanas daría aproximadamente 25 células en promedio. El experto entenderá que el tiempo medio de duplicación de la población de las células madre de la invención puede variar según varios factores, tales como el número de pases, las condiciones de cultivo, la densidad de siembra, etc.
En una forma de realización, el tiempo promedio de duplicación de la población puede ser de 6 a 48 horas, de 12 a 36 horas, de 18 a 30 horas o aproximadamente 24 horas. Por ejemplo, se puede esperar que una población de células madre cultivada usando un medio de cultivo de la invención se duplique aproximadamente 4-7 veces, o aproximadamente 5 veces por semana.
En otra forma de realización, el tiempo promedio de duplicación de la población es de 12 a 96 horas, de 24 a 72 horas o aproximadamente 72 horas. En otra forma de realización, la población celular se duplica en promedio más de una vez, más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces o más de cinco veces por semana.
Otras propiedades de los organoides de la invención
En una forma de realización preferida, un organoide podría cultivarse durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas o 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses o más. En una forma de realización preferida, un organoide podría cultivarse durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más. En otra forma de realización preferida, un organoide se origina a partir de una única célula, preferiblemente que expresa Lgr5, más preferiblemente en donde la célula individual comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de interés.
El organoide de la invención comprende preferentemente al menos un 50 % de células viables, más preferentemente al menos un 60 % de células viables, más preferentemente al menos un 70 % de células viables, más preferentemente al menos un 80 % de células viables, más preferentemente al menos un 90 % de células viables. La viabilidad de las células se puede evaluar mediante tinción de Hoechst o tinción con yoduro de propidio en FACS.
Las células viables poseen preferiblemente funciones específicas de tejido, o características de funciones específicas de tejido, como se describió anteriormente.
Los inventores también han demostrado que los organoides generados por los medios y métodos de la presente invención se pueden congelar y almacenar a -80°C o menos, como en nitrógeno líquido. Los organoides congelados se pueden descongelar y poner en cultivo sin perder su estructura e integridad tridimensional y sin una muerte celular significativa. Por lo tanto, en una forma de realización, los organoides son organoides congelados almacenados a menos de -5 °C, por debajo de -1 °C, por debajo de -20 °C, por debajo de -40 °C, por debajo de -60 °C o por debajo de -80 °C.
Las células y organoides de la presente invención se diferencian de cualquier célula y organoide que se haya elaborado anteriormente (WO2009/022907 y WO2010/016766) en que tienen un mejor perfil fenotípico (mejor diferenciación que incluye la conversión de células caliciformes tras la adición de inhibidores de la gamma secretasa para la organoides de criptas y vellosidades) y la integridad cariotípica, determinada por los métodos descritos anteriormente, mejores tasas de supervivencia y velocidades más rápidas de proliferación celular. Por consiguiente, para formas de realización intestinales, de colon y páncreas, un organoide de la presente invención representa claramente el epitelio intestinal, de colon o de páncreas humano, con preservación total de la integridad fenotípica y cariotípica y mantenimiento de la proliferación y diferenciación.
Usos de células madre u organoides
La invención se relaciona con el uso de una población organoide o expandida de células de la invención para uso en detección de fármacos, validación de objetivos (de fármacos), descubrimiento de objetivos (de fármacos), toxicología y exámenes de toxicología, medicina personalizada, medicina regenerativa y/o como modelos de células/órganosex vivo,tales como modelos de enfermedades.
Se cree que las células y organoides cultivados según los medios y métodos de la invención representan fielmente la situaciónin vivo.Esto es cierto tanto para poblaciones ampliadas de células y organoides cultivados a partir de tejido normal como para poblaciones ampliadas de células y organoides cultivados a partir de tejido enfermo. Por lo tanto, además de proporcionar modelos de células/órganosex vivonormales, los organoides o la población expandida de células de la invención se pueden usar como modelos de enfermedadesex vivo.
Los organoides de la invención también se pueden usar para cultivar un patógeno y, por lo tanto, se pueden usar como modelos de infecciónex vivo.Ejemplos de patógenos que pueden cultivarse usando un organoide de la invención incluyen virus, bacterias, priones u hongos que causan enfermedades en su huésped animal. Por tanto, se puede utilizar un organoide de la invención como modelo de enfermedad que representa un estado infectado. En algunas formas de realización de la invención, los organoides se pueden usar en el desarrollo y/o producción de vacunas.
Las enfermedades que pueden estudiarse mediante los organoides de la invención incluyen enfermedades genéticas, enfermedades metabólicas, enfermedades patógenas, enfermedades inflamatorias, etc., que incluyen por ejemplo, entre otras: fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal (como la enfermedad de Crohn), carcinoma, adenoma, adenocarcinoma, cáncer de colon, diabetes (como tipo I o tipo II), esófago de Barrett, enfermedad de Gaucher, deficiencia de alfa-1-antitripsina, síndrome de Lesch-Nyhan, anemia, síndrome de Schwachman-Bodian-Diamond, policitemia vera, primaria mielofibrosis, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, hipercolestrolaernia familial, síndrome de Crigler-Najjar, tirosinanaernia hereditaria, enfermedad de Pompe, colestasis familial progresiva, síndrome de Hreler, SCID o SCID con fugas, síndrome de Omenn, hipoplasia cartílago-pelo, encefalitis por herpes simple, esclerodermia, osteogénesis imperfecta, Becker distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne, disqueratosis congénita, etc.
Tradicionalmente, se han utilizado líneas celulares y, más recientemente, células iPS como modelos de células/órganos y/o enfermedadesex vivo(por ejemplo, véase Robinton et al. Nature 481,295, 2012). Sin embargo, estos métodos sufren una serie de desafíos y desventajas. Por ejemplo, no se pueden obtener líneas celulares de todos los pacientes (solo determinadas biopsias dan como resultado líneas celulares exitosas) y, por lo tanto, las líneas celulares no se pueden utilizar en diagnósticos y medicinas personalizados. Las células iPS generalmente requieren cierto nivel de manipulación genética para reprogramar las células en destinos celulares específicos. Alternativamente, están sujetas a condiciones de cultivo que afectan la integridad carotípica y, por lo tanto, el tiempo de cultivo debe mantenerse al mínimo (este también es el caso de las células madre embrionarias humanas). Esto significa que las células iPS no pueden representar con precisión la situaciónin vivosino que son un intento de simular el comportamiento de las célulasin vivo.Las líneas celulares y las células iPS también sufren de inestabilidad genética.
Por el contrario, los organoides de la invención proporcionan una plataforma genéticamente estable que representa fielmente la situaciónin vivo.Los organoides de la invención también se pueden expandir continuamente, proporcionando una buena fuente de células genéticamente estables. En particular, una población en expansión se puede “dividir”, lo que significa que el organoide se divide y todas las células del organoide se dividen en nuevos platos o matraces de cultivo. Las células divididas se eliminan del organoide y luego se pueden cultivar y expandir para producir nuevos organoides que contengan poblaciones más expandidas que luego se pueden dividir nuevamente. Las divisiones también se denominan en el presente documento “pases”. Un organoide de la invención puede cultivarse durante 1 o más pases, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o más pases, por ejemplo, 20-30 pases, 30-35 pases, 32-40 pases o más. En algunas formas de realización, una población celular u organoide en expansión se divide una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana o diariamente. Por tanto, los organoides de la invención pueden proporcionar una fuente continua de material celular genéticamente estable. En algunas formas de realización, los organoides en expansión de la invención comprenden todos los tipos de células diferenciadas que están presentes en la situaciónin vivocorrespondiente. En otras formas de realización, los organoides de la invención pueden diferenciarse para proporcionar todos los tipos de células diferenciadas que están presentesin vivo.Por lo tanto, los organoides de la invención se pueden usar para obtener información mecanística sobre una variedad de enfermedades y terapias, para llevar a cabo exámenes de detección de fármacosin vitro,para evaluar terapias potenciales, para identificar posibles objetivos (por ejemplo, proteínas) para el desarrollo futuro de nuevas terapias (fármacos) y/o para explorar la reparación genética junto con la terapia de reemplazo celular.
Los organoides de la invención pueden congelarse, descongelarse y ponerse en cultivo sin perder su integridad genética o características fenotípicas y sin pérdida de capacidad proliferativa. De este modo, los organoides se pueden almacenar y transportar fácilmente.
Por esta razón, los organoides o poblaciones expandidas de células de la invención pueden ser una herramienta para la detección de fármacos, la validación de objetivos, el descubrimiento de objetivos, la toxicología y los exámenes toxicológicos y la medicina personalizada.
Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de la población expandida de células madre u organoides, tales como organoides de criptas de vellosidades intestinales u organoides pancreáticos de acuerdo con la invención en un ensayo de toxicidad y detección de fármacos. En un aspecto adicional, la invención proporciona la población expandida de células madre u organoides, tales como organoides de criptas de vellosidades intestinales u organoides pancreáticos según la invención para su uso en medicina, tal como medicina regenerativa. Por ejemplo, cualquiera de los organoides del intestino delgado, colon, páncreas, gástrico, hígado o próstata se puede utilizar en una exploración de descubrimiento de fármacos, un ensayo de toxicidad o en medicina, tal como medicina regenerativa.
Vacunas mucosas
Otro uso importante de los organoides es el desarrollo de vacunas mucosas. Las vacunas mucosas son vacunas que se administran a través de la mucosa. Puede ser cualquier superficie mucosa, como la nariz, la boca o el recto. Se pueden administrar mediante un inhalador, un aerosol u otras ayudas externas. Esto tiene varias ventajas claras respecto de las inyecciones, como que no se necesita personal médico para administrar la vacuna, lo que puede ser importante, por ejemplo, en los países en desarrollo.
En el intestino, las células M (o “células de micropliegues”) son células que se encuentran en el epitelio asociado al folículo de los nódulos linfoides agregados del íleon. Transportan organismos y partículas desde la luz intestinal hasta las células inmunitarias a través de la barrera epitelial y, por tanto, son importantes para estimular la inmunidad de las mucosas. Tienen la capacidad única de captar antígeno de la luz del intestino delgado mediante endocitosis o fagocitosis, y luego entregarlo mediante transcitosis a células dendríticas (una célula presentadora de antígeno) y linfocitos (es decir, células T) ubicadas en una estructura de bolsa única en forma de bolsillo en su lado basolateral.
La Figura 48 muestra que los organoides de ratón pueden convertirse en células M cuando se estimulan con el ligando RANK. La Figura 49 muestra que también es posible generar células M en organoides intestinales humanos. Por lo tanto, en algunas formas de realización de la divulgación, la población de células expandidas comprende células M. En algunas formas de realización de la invención, un organoide, por ejemplo un organoide del intestino delgado, comprende células M.
La eficacia de las vacunas mucosas puede aumentar sustancialmente cuando se dirigen a las células M. Por lo tanto, la población expandida de células madre u organoide se puede utilizar para probar la capacidad de las células M para captar patógenos o antígenos y presentarlos al sistema inmunológico. Por lo tanto, en algunas formas de realización la invención proporciona el uso de la población de células madre expandidas u organoide de la invención en la detección de fármacos, por ejemplo en el desarrollo y/o producción de vacunas. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la población expandida de células madre u organoide se puede usar para el desarrollo o producción de vacunas contra infecciones virales, bacterianas, fúngicas u otras infecciones parasitarias, por ejemplo (pero sin limitarse a) cólera, virus sincitial respiratorio (RSV), Rotavirus y VIH. En una forma de realización particular, la invención 1 proporciona organoides del intestino delgado que se han diferenciado en un medio de cultivo de la invención que comprende RANKL, para su uso en el desarrollo de vacunas mucosas.
Detección de fármacos
Para fines preferiblemente de alto rendimiento, dicha población de células madre expandida u organoide de la invención, tales como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos, se cultivan en placas multipocillos tales como, por ejemplo, placas de 96 pocillos o placas de 384 pocillos. Se utilizan bibliotecas de moléculas para identificar una molécula que afecta a dichos organoides. Las bibliotecas preferidas comprenden bibliotecas de fragmentos de anticuerpos, bibliotecas de presentación en fagos peptídicos, bibliotecas de péptidos (p. ej. LOPAP™, Sigma Aldrich), bibliotecas de lípidos (BioMol), bibliotecas de compuestos sintéticos (p. ej. LOP AC™, Sigma Aldrich) o bibliotecas de compuestos naturales (Specs, TimTec). Además, se pueden utilizar bibliotecas genéticas que induzcan o repriman la expresión de uno o más genes en la progenie de las células madre. Estas bibliotecas genéticas comprenden bibliotecas de ADNc, bibliotecas antisentido y bibliotecas de ARNip u otras bibliotecas de ARN no codificantes. Preferiblemente, las células se exponen a múltiples concentraciones de un agente de prueba durante un cierto período de tiempo. Al final del período de exposición, se evalúan los cultivos. El término “que afecta” se utiliza para cubrir cualquier cambio en una célula, incluyendo, entre otros, una reducción o pérdida de la proliferación, un cambio morfológico y la muerte celular. Dicha población de células madre expandidas u organoide de la invención tal como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos también se puede usar para identificar fármacos que se dirigen específicamente a células de carcinoma epitelial, pero no dicha población de células madre expandidas u organoides de la invención, tales como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos.
Los inventores han demostrado que es posible tomar una biopsia del intestino delgado y expandirla durante sólo 7 a 14 días y obtener un organoide que esté listo para realizar una prueba de detección de drogas. La capacidad de obtener un organoide útil de la invención en tan poco tiempo muestra que los organoides serían muy útiles para probar las respuestas de pacientes individuales a fármacos específicos y adaptar el tratamiento de acuerdo con la capacidad de respuesta. En algunas formas de realización, en las que el organoide se obtiene a partir de una biopsia de un paciente, el organoide se cultiva durante menos de 21 días, por ejemplo menos de 14 días, menos de 13 días, menos de 12 días, menos de 11 días, menos de 10 días, menos de 9 días, menos de 8 días, menos de 7 días (etc).
Los organoides también son útiles para fines más amplios de descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, las Figuras 32 a 40 muestran que los organoides del intestino delgado extraídos de pacientes sanos y de pacientes con fibrosis quística pueden usarse para probar fármacos contra la fibrosis quística. Específicamente, las Figuras 32 a 40 muestran que la hinchazón inducida por forskolina de los organoides normales del intestino delgado depende del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y, por lo tanto, es posible probar la corrección de la función CFTR utilizando la hinchazón inducida por forskolina como resultado positivo. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los organoides de la invención podrían usarse para detectar fármacos para la fibrosis quística. Sin embargo, el experto entenderá que los organoides de la invención serían ampliamente aplicables como herramientas de detección de fármacos para patologías infecciosas, inflamatorias y neoplásicas del tracto gastrointestinal humano y otras enfermedades del tracto gastrointestinal y patologías infecciosas, inflamatorias y neoplásicas y otras enfermedades de otros tejidos descritas en el presente documento, incluidos páncreas, hígado y próstata. En algunas formas de realización, los organoides de la invención podrían usarse para detectar fármacos contra el cáncer.
En algunas formas de realización, las poblaciones de células expandidas, por ejemplo los organoides de la invención u organoides obtenidos usando medios y métodos de la invención, se pueden usar para probar bibliotecas de químicos, anticuerpos, productos naturales (extractos de plantas), etc. para determinar su idoneidad para su uso como medicamentos, cosméticos y/o medicamentos preventivos. Por ejemplo, en algunas formas de realización, una biopsia celular de un paciente de interés, tal como células tumorales de un paciente con cáncer, puede cultivarse usando medios de cultivo y métodos de la invención y luego tratarse con un compuesto químico o una biblioteca química. Entonces es posible determinar qué compuestos modifican, matan y/o tratan eficazmente las células del paciente. Esto permite probar la capacidad de respuesta específica del paciente a un fármaco en particular, permitiendo así adaptar el tratamiento a un paciente específico. Por tanto, esto permite un enfoque de medicina personalizada.
La ventaja adicional de utilizar los organoides para identificar fármacos de esta manera es que también es posible examinar organoides normales (organoides derivados de tejido sano) para comprobar qué fármacos y compuestos tienen un efecto mínimo en el tejido sano. Esto permite detectar fármacos con actividad mínima fuera del objetivo o efectos secundarios no deseados.
De esta manera se pueden detectar medicamentos para cualquier número de enfermedades. Por ejemplo, los organoides de la invención se pueden usar para detectar fármacos para la fibrosis quística, el esófago de Barrett, los carcinomas, los adenocarcinomas, los adenomas, la enfermedad inflamatoria intestinal (tal como la enfermedad de Crohn), la enfermedad hepática, etc. Los parámetros de prueba dependen de la enfermedad de interés. Por ejemplo, cuando se realizan pruebas de detección de medicamentos contra el cáncer, la muerte de las células cancerosas suele ser el resultado final. Para la fibrosis quística, es interesante medir la expansión de los organoides en respuesta a los fármacos y estrículos de CFTR. En otras formas de realización, se pueden evaluar los metabólicos o la expresión génica para estudiar los efectos de los compuestos y fármacos del cribado sobre las células u organoides de interés.
Por lo tanto, la invención proporciona un método para detectar un fármaco terapéutico o profiláctico o un cosmético, en el que el método comprende:
cultivar una población celular expandida (por ejemplo, un organoide) de la invención, por ejemplo con un medio de cultivo de la invención, opcionalmente por menos de 21 días; exponer dicha población celular expandida (por ejemplo, un organoide) de la invención a una o una biblioteca de moléculas candidatas;
evaluar dichas poblaciones de células expandidas (por ejemplo, organoides) para detectar cualquier efecto, por ejemplo cualquier cambio en la célula, tal como una reducción o pérdida de la proliferación, un cambio morfológico y/o muerte celular;
identificar la molécula candidata que causa dichos efectos como fármaco o cosmético potencial.
En algunas formas de realización, se emplean métodos de recolección de datos y cultivo asistidos por computadora o robot para aumentar el rendimiento de la pantalla.
En algunas formas de realización, la población celular expandida (por ejemplo, un organoide) se obtiene a partir de una biopsia de un paciente. En algunas formas de realización, la molécula candidata que provoca un efecto deseado en la población de células expandidas cultivadas (por ejemplo, un organoide) se administra a dicho paciente.
Por consiguiente, se proporciona un método para tratar a un paciente que comprende:
(a) obtener una biopsia del tejido enfermo de interés en el paciente;
(b) detectar un fármaco adecuado usando un método de detección de la invención; y
(c) tratar a dicho paciente con el fármaco obtenido en la etapa (b).
En algunas formas de realización, el fármaco o cosmético se usa para tratar, prevenir o mejorar síntomas de enfermedades genéticas, enfermedades metabólicas, enfermedades patógenas, enfermedades inflamatorias, etc., por ejemplo, que incluyen, entre otras: fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal (como la enfermedad de Crohn). enfermedad), carcinoma, adenoma, adenocarcinoma, cáncer de colon, diabetes (como tipo I o tipo II), esófago de Barrett, clasas de Gaucher, deficiencia de alfa-1-antitripsina, síndrome de Lesch-Nyhan, anemia, síndrome de Schwachman-Bodian-Diamond, policitemia vera, mielofibrosis primaria, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, hipercolestrolemia familiar, síndrome de Crigler-Najjar, tirosinanemia hereditaria, enfermedad de Pompe, colestasis familiar progresiva, síndrome de Hreler, SCID o SCID con fugas, síndrome de Omenn, hipoplasia cartílago-cabello, encefalitis por herpes simple, esclerodermia, Osteogénesis imperfecta, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Duchenne, disqueratosis congénita, etc.
Descubrimiento de objetivos
En algunas formas de realización, los organoides de la invención o las células cultivadas usando los medios de cultivo y los métodos de la invención se pueden usar para el descubrimiento de objetivos. Para la identificación del objetivo se pueden utilizar células de los organoides que se originan a partir de tejido sano o enfermo. Los organoides de la invención se pueden usar para el descubrimiento de objetivos farmacológicos para la fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal (como la enfermedad de Crohn), carcinoma, adenoma, adenocarcinoma, cáncer de colon, diabetes (como el tipo I o el tipo II), esófago de Barrett, enfermedad de Gaucher, deficiencia de alfa-1-antitripsina, síndrome de Lesch-Nyhan, anemia, síndrome de Schwachman-Bodian-Diamond, policitemia vera, mielofibrosis primaria, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, hipercolestrolemia familiar, síndrome de Crigler Najjar, tirosinanemia hereditaria, enfermedad de Pompe, colestasis familiar progresiva, Síndrome de Hreler, SCID o SCID con fugas, síndrome de Omenn, hipoplasia de cartílago-pelo, encefalitis por herpes simple, esclerodermia, osteogénesis imperfecta, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Duchenne, disqueratosis congénita, etc. Se cree que las células y organoides cultivados según los medios y métodos de la invención representan fielmente la situaciónin vivo.Por este motivo, pueden ser una herramienta para encontrar dianas (moleculares) novedosas en enfermedades específicas.
Para buscar un nuevo objetivo farmacológico, se puede utilizar una biblioteca de compuestos (como ARNip) para transducir las células e inactivar genes específicos. En algunas formas de realización, las células se transducen con ARNip para inhibir la función de un (gran) grupo de genes. Se puede utilizar cualquier lectura funcional del grupo de genes o función celular específica para determinar si un objetivo es relevante para el estudio. Se puede determinar una lectura específica de la enfermedad usando ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se analiza la proliferación celular para detectar genes implicados en el cáncer. Por ejemplo, se puede usar un ensayo Topflash como se describe en el presente documento para detectar cambios en la actividad Wnt causados por la inhibición del ARNip. Cuando se produce una reducción del crecimiento o muerte celular, los genes relacionados con el ARNip correspondientes pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica. Estos genes son posibles objetivos para inhibir el crecimiento de estas células. Tras la identificación, será necesario determinar la especificidad de la diana identificada para el proceso celular que se estudió mediante métodos bien conocidos en la técnica. Utilizando estos métodos, se pueden identificar nuevas moléculas como posibles objetivos farmacológicos para la terapia.
Pantallas de validación de objetivos y fármacos
Los organoides específicos del paciente obtenidos de tejido enfermo y/o normal se pueden utilizar para la validación de objetivos de moléculas identificadas en pantallas de alto rendimiento. Lo mismo ocurre con la validación de compuestos que fueron identificados como posibles fármacos terapéuticos en análisis de alto rendimiento. El uso de material primario del paciente expandido en el sistema de cultivo de organoides puede ser útil para detectar falsos positivos, etc., en estudios de líneas celulares de descubrimiento de fármacos de alto rendimiento.
En algunas formas de realización, la población de células madre expandida (por ejemplo, organoide de la invención), tal como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos, se puede utilizar para la validación de compuestos que se han identificado como posibles fármacos o cosméticos en un cribado de alto rendimiento.
Ensayo de toxicidad
Dicha población de células madre expandidas (por ejemplo, organoide de la invención), tales como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos, pueden reemplazar adicionalmente el uso de líneas celulares tales como células Caco-2 en ensayos de toxicidad de potenciales fármacos novedosos o de complementos alimenticios conocidos o novedosos. Las pruebas de toxicología funcionan de manera similar a las pruebas de detección de drogas (como se describe anteriormente), pero prueban los efectos tóxicos de las drogas y no los efectos terapéuticos. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los efectos de los compuestos candidatos son tóxicos.
Cultivo de patógenos
Además, dicha población de células madre expandida (por ejemplo, organoide de la invención), tal como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos, se puede usar para cultivar un patógeno tal como un norovirus que actualmente carece de un cultivo de tejido o modelo animal adecuado.
Medicina regenerativa y trasplantes
Los cultivos que comprenden la población de células madre expandidas (por ejemplo, organoides de la invención), tales como organoides de criptas de vellosidades u organoides pancreáticos, son útiles en medicina regenerativa, por ejemplo en la reparación post-radiación y/o post-cirugía de el epitelio intestinal, en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que padecen enfermedad inflamatoria intestinal como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, y en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que padecen síndrome del intestino corto. Su uso adicional está presente en la reparación del epitelio intestinal en pacientes con enfermedades hereditarias del intestino delgado/colon. Los cultivos que comprenden organoides pancreáticos también son útiles en medicina regenerativa, por ejemplo como implantes después de la resección del páncreas o parte del mismo y para el tratamiento de diabetes tal como diabetes I y diabetes II.
En una forma de realización alternativa, las células madre epiteliales expandidas se reprograman en destinos tisulares relacionados tales como, por ejemplo, células pancreáticas que incluyen células beta pancreáticas. Hasta ahora no ha sido posible regenerar células pancreáticas a partir de células madre adultas. Los métodos de cultivo de la presente invención permitirán analizar factores que transdiferencian la célula madre epitelial estrechamente relacionada con una célula pancreática, incluida una célula beta pancreática.
Para un experto quedará claro que la terapia génica se puede utilizar adicionalmente en un método dirigido a reparar tejido dañado o enfermo. Se puede hacer uso, por ejemplo, de un vehículo de administración de genes adenoviral o retroviral para administrar información genética, como ADN y/o ARN a células madre. Un experto puede reemplazar o reparar genes concretos a los que se dirige la terapia génica. Por ejemplo, se puede insertar un gen normal en una ubicación no específica dentro del genoma para reemplazar un gen no funcional. En otro ejemplo, una secuencia genética anormal puede reemplazarse por una secuencia genética normal mediante recombinación homóloga. Alternativamente, la mutación inversa selectiva puede devolver un gen a su función normal. Otro ejemplo es alterar la regulación (el grado en que un gen se activa o desactiva) de un gen en particular. Preferiblemente, las células madre se tratanex vivomediante un enfoque de terapia génica y posteriormente se transfieren al mamífero, preferiblemente a un ser humano que necesita tratamiento.
Dado que pequeñas biopsias tomadas de donantes adultos pueden ampliarse sin ningún límite aparente o daño genético, la tecnología puede servir para generar epitelio trasplantable con fines regenerativos. El hecho de que los organoides puedan congelarse, descongelarse y ponerse en cultivo sin perder su estructura e integridad tridimensionales y sin una muerte celular significativa aumenta aún más la aplicabilidad de los organoides con fines de trasplante. Además, los organoides incrustados en una MEC o en contacto con ella se pueden trasplantar a un mamífero, preferiblemente a un ser humano. Los organoides y la MEC se pueden trasplantar simultáneamente a un mamífero, preferiblemente a un ser humano.
El experto entenderá que se puede utilizar una MEC como armazón 3D para obtener estructuras similares a tejidos que comprenden poblaciones expandidas de células u organoides según la invención. A continuación, tales estructuras pueden trasplantarse a un paciente mediante métodos bien conocidos en la técnica. Se puede fabricar un armazón de MEC sintéticamente utilizando proteínas de la MEC, tales como colágeno y/o laminina, o alternativamente se puede obtener un armazón de MEC “descelularizando” un órgano aislado o fragmento de tejido para dejar un armazón que consiste en la MEC (por ejemplo, véase Macchiarini et al. The Lancet, volumen 372, número 9655, páginas 2023 - 2030, 2008). En algunas formas de realización, se puede obtener un armazón de MEC descelularizando un fragmento de órgano o tejido, en donde opcionalmente dicho fragmento de órgano o tejido es del páncreas, hígado, intestino, estómago o próstata.
Como se mencionó anteriormente, la invención proporciona un organoide o población de células de la invención para su uso en trasplantes a un mamífero, preferiblemente a un ser humano. También se divulga un método para tratar a un paciente que necesita un trasplante que comprende trasplantar un organoide o una población de células de la invención a dicho paciente, en el que dicho paciente es un mamífero, preferiblemente un ser humano. Ventajosamente, la invención permite tomar una pequeña biopsia de un donante adulto y expandirla sin ningún límite aparente o daño genético, por lo que la tecnología aquí proporcionada puede servir para generar epitelio trasplantable con fines regenerativos.
Significativamente, los inventores han descubierto que cuando los organoides pancreáticos humanos de la invención se trasplantan bajo la cápsula perirrenal en ratones, estas células se diferencian para formar células beta maduras que secretan insulina. Esto es importante ya que significa que incluso si la población de células u organoides de la invención no secreta insulina a un nivel detectable mientras las células u organoides se cultivanin vitro,estas células pueden ser útiles para el trasplante a un paciente para el tratamiento de un trastorno por deficiencia de insulina como la diabetes.
Por lo tanto, la descripción describe un método para tratar un trastorno por deficiencia de insulina tal como diabetes, o un paciente que tiene un páncreas disfuncional, que comprende trasplantar un organoide pancreático de la invención o células de un organoide pancreático de la invención al paciente.
En algunas formas de realización, las células u organoides no expresan ni secretan insulina tras el trasplante al paciente, sino que se diferencian dentro del paciente de manera que secretan insulina. Por ejemplo, la capacidad de secretar insulina puede no ser detectable inmediatamente después del trasplante, pero puede estar presente aproximadamente un mes después del trasplante, por ejemplo, 6 semanas, 2 meses o 3 meses después del trasplante.
El paciente es preferiblemente un ser humano, pero alternativamente puede ser un mamífero no humano, tal como un gato, perro, caballo, vaca, cerdo, oveja, conejo o ratón.
Por tanto, dentro del alcance de la divulgación se incluyen métodos de tratamiento de un paciente humano o animal no humano mediante terapia celular. Dicha terapia celular abarca la aplicación de las células madre u organoides de la invención al paciente a través de cualquier medio apropiado. Específicamente, dichos métodos de tratamiento implican la regeneración del tejido dañado. De acuerdo con la divulgación, un paciente puede ser tratado con células madre u organoides alogénicos o autólogos. Las células “autólogas” son células que se originaron en el mismo organismo en el que se reintroducen para terapia celular, por ejemplo para permitir la regeneración de tejidos. Sin embargo, las células no necesariamente se han aislado del mismo tejido en el que se introducen. Una célula autóloga no requiere compatibilidad con el paciente para superar los problemas de rechazo. Las células “alogénicas” son células que se originaron a partir de un individuo diferente del individuo en el que se introducen las células para terapia celular, por ejemplo para permitir la regeneración de tejido, aunque sean de la misma especie. Es posible que aún sea necesario cierto grado de coincidencia de pacientes para prevenir los problemas de rechazo.
Generalmente las células u organoides de la invención se introducen en el cuerpo del paciente mediante inyección o implantación. Generalmente las células se inyectarán directamente en el tejido en el que pretenden actuar. Alternativamente, las células se inyectarán a través de la vena porta. Dentro del alcance de la invención se incluye una jeringa que contiene células y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dentro del alcance de la invención se incluye un catéter unido a una jeringa que contiene células y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El experto podrá seleccionar un método y una vía de administración apropiados dependiendo del material que se esté trasplantando (es decir, población de células, células individuales en suspensión celular, organoides o fragmentos de organoides), así como el órgano que se está tratando.
Como se analizó anteriormente, las células se pueden utilizar en la regeneración de tejido. Para lograr esta función, las células pueden inyectarse o implantarse directamente en el tejido dañado, donde pueden multiplicarse y eventualmente diferenciarse en el tipo de célula requerido, de acuerdo con su ubicación en el cuerpo. Alternativamente, el organoide puede inyectarse o implantarse directamente en el tejido dañado. Los tejidos que son susceptibles al tratamiento incluyen todos los tejidos dañados, incluidos particularmente aquellos que pueden haber sido dañados por una enfermedad, lesión, trauma, una reacción autoinmune o por una infección viral o bacteriana. En algunas formas de realización de la invención, las células u organoides de la invención se usan para regenerar el colon, el intestino delgado, el páncreas, el esófago o el sistema gástrico.
Por ejemplo, las células u organoides de la invención se inyectan en un paciente usando un sintetizador Hamilton.
El experto sabrá cuál será la dosis apropiada de células u organoides de la invención para una afección particular a tratar.
Las células u organoides de la invención, ya sea en solución, en microesferas o en micropartículas de una variedad de composiciones, se administrarán en la arteria que irriga el tejido o la parte del órgano dañado que necesita regeneración. Generalmente dicha administración se realizará mediante un catéter. El catéter puede ser uno de la gran variedad de catéteres con balón utilizados para angioplastia y/o administración de células o un catéter diseñado con el propósito específico de administrar las células a una zona particular del cuerpo. Para ciertos usos, las células u organoides pueden encapsularse en microesferas hechas de varios compuestos biodegradables diferentes y con un diámetro de aproximadamente 15 pm. Este método puede permitir que las células u organoides administrados por vía intravascular permanezcan en el lugar del daño y no atraviesen la red capilar ni entren en la circulación sistémica en el primer paso. La retención en el lado arterial de la red capilar también puede facilitar su translocación al espacio extravascular.
Las células u organoides pueden inyectarse retrógradamente en el árbol vascular, ya sea a través de una vena para administrarlas a todo el cuerpo o localmente en la vena particular que drena en el tejido o parte del cuerpo al que se dirigen las células u organoides. Se pueden utilizar muchas de las preparaciones descritas anteriormente.
Las células u organoides de la invención pueden implantarse en el tejido dañado adherido a un implante biocompatible. En esta forma de realización, las células se pueden adherir al implante biocompatiblein vitro,antes de su implantación en el paciente. Como quedará claro para un experto en la técnica, se puede utilizar cualquiera de varios adherentes para adherir las células al implante, antes de la implantación. Sólo a modo de ejemplo, dichos adherentes pueden incluir fibrina, uno o más miembros de la familia de las integrinas, uno o más miembros de la familia de las cadherinas, uno o más miembros de la familia de las selectinas, una o más moléculas de adhesión celular (CAM), una o más de la familia de las inmunoglobulinas y uno o más adherentes artificiales. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ilustración y no pretende ser limitante. Para un experto en la técnica quedará claro que se puede utilizar cualquier combinación de uno o más adherentes.
Las células u organoides de la invención pueden incrustarse en una matriz, antes de la implantación de la matriz en el paciente. Generalmente, la matriz se implantará en el tejido dañado del paciente. Ejemplos de matrices incluyen matrices basadas en colágeno, matrices basadas en fibrina, matrices basadas en laminina, matrices basadas en fibronectina y matrices artificiales. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ilustración y no pretende ser limitante.
Las células u organoides de la invención pueden implantarse o inyectarse en el paciente junto con un componente formador de matriz. Esto puede permitir que las células formen una matriz después de la inyección o implantación, asegurando que las células u organoides permanezcan en la ubicación adecuada dentro del paciente. Ejemplos de componentes formadores de matriz incluyen cola de fibrina de alquilo líquido, monómeros de cianoacrilato, plastificantes, polisacáridos tales como dextrano, oligómeros que contienen óxido de etileno, copolímeros de bloque tales como poloxámero y Pluronics, tensioactivos no iónicos tales como Tween y Triton'8', y componentes formadores de matrices artificiales. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ilustración y no pretende ser limitante. Será claro para una persona experta en la técnica que se puede usar cualquier combinación de uno o más componentes formadores de matriz.
En una forma de realización adicional, las células u organoides de la invención pueden estar contenidos dentro de una microesfera. En esta forma de realización, las células pueden encapsularse dentro del centro de la microesfera. También en esta forma de realización, las células pueden estar incrustadas en el material de matriz de la microesfera. El material de matriz puede incluir cualquier polímero biodegradable adecuado, incluidos, entre otros, alginatos, polietilenglicol (PLGA) y poliuretanos. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ejemplo y no pretende ser limitante.
En una forma de realización adicional, las células u organoides de la invención se pueden adherir a un dispositivo médico destinado a implantación. Ejemplos de dichos dispositivos médicos incluyen stents, clavos, puntos, divisiones, marcapasos, prótesis de articulaciones, piel artificial y varillas. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ilustración y no pretende ser limitante. Para un experto en la técnica quedará claro que las células se pueden adherir al dispositivo médico mediante diversos métodos. Por ejemplo, las células u organoides se pueden adherir al dispositivo médico usando fibrina, uno o más miembros de la familia de las integrinas, uno o más miembros de la familia de las cadherinas, uno o más miembros de la familia de las selectinas, una o más moléculas de adhesión celular (CAM), uno o más miembros de la familia de las inmunoglobulinas y uno o más adherentes artificiales. Esta lista se proporciona únicamente a modo de ilustración y no pretende ser limitante. Para un experto en la técnica quedará claro que se puede utilizar cualquier combinación de uno o más adherentes.
Métodos de la invención
La invención también se refiere a un método para expandir una población de células madre, en donde el método comprende:
a) proporcionar una población de células madre;
b) proporcionar un medio de cultivo según la invención;
c) poner en contacto las células madre con el medio de cultivo; y
d) cultivar las células en condiciones apropiadas.
Además, la invención se refiere a un método para expandir fragmentos de tejido aislados, en el que el método comprende:
a) proporcionar un fragmento de tejido aislado;
b) proporcionar un medio de cultivo según la invención;
c) poner en contacto el fragmento de tejido aislado con el medio de cultivo; y
d) cultivar las células en condiciones apropiadas.
Un método para “expandir” una población de células o fragmentos de tejido aislados es aquel que implica mantener o aumentar el número de células madre en una población inicial para generar una población ampliada de células madre que conservan su fenotipo indiferenciado y sus propiedades de autorrenovación. Sin embargo, también puede incluir la producción de progenie diferenciadora, que puede, por ejemplo, formar estructuras similares a tejidos que contribuyen a la formación de organoides. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan métodos para obtener un organoide, tal como un organoide del intestino delgado (vellosidades de la cripta), un organoide de colon, un organoide pancreático, un organoide gástrico, un organoide prostático, un organoide de hígado, un organoide de adenocarcinoma, un organoide de carcinoma. o un organoide de esófago de Barrett, que comprende cultivar células madre o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre en un medio de cultivo de la invención. La invención se refiere a un método para expandir una única célula madre o una población de células madre, preferiblemente para generar un organoide, en donde el método comprende cultivar la única célula madre, población de células madre o fragmento de tejido en un medio de cultivo según la invención. En algunas formas de realización, el método para obtener un organoide comprende cultivar las células madre o fragmentos de tejido con un primer medio de “expansión”, seguido del cultivo de las células madre o fragmentos de tejido con un segundo medio de “diferenciación”. En algunas formas de realización, el medio de diferenciación no comprende ciertos componentes del medio de expansión, por ejemplo, el medio de diferenciación no comprende Wnt, R-espondina, nicotinamida, un inhibidor de TGF-beta y/o un inhibidor de p38.
En algunas formas de realización, el método para expandir una única célula madre o una población de células madre, preferiblemente para generar un organoide, comprende expandir la única célula madre, población de células madre o fragmento de tejido en un primer medio de cultivo según la invención, y opcionalmente, diferenciar las células expandidas o fragmentos de tejido en un segundo medio de cultivo según la invención.
Por lo tanto, la invención se refiere a un método para expandir una única célula madre o una población de células madre, preferiblemente para generar un organoide, en donde el método comprende:
proporcionar una célula madre, una población de células madre o un fragmento de tejido aislado; proporcionar un medio de cultivo según la invención;
poner en contacto las células madre con el medio de cultivo;
cultivar las células en condiciones apropiadas.
En algunas formas de realización, el método comprende poner en contacto la célula madre, la población de células madre o el fragmento de tejido aislado y el medio de cultivo con una matriz extracelular o una matriz 3D que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular tales como como integrinas, por ejemplo una matriz extracelular que contiene laminina como Matrigel™ (BD Biosciences). En algunas formas de realización, el medio de cultivo se difunde en la matriz extracelular.
En algunas formas de realización, la invención se refiere a un método para expandir una única célula madre o una población de células madre o fragmento de tejido, preferiblemente para generar un organoide, en donde el método comprende:
cultivar la célula madre, población de células madre o fragmento de tejido en un primer medio de expansión; continuar cultivando la célula madre, población de células madre o fragmento de tejido y
reponer el medio con un medio de diferenciación, en donde el medio de diferenciación no comprende uno o más de, preferiblemente todos, los factores seleccionados de: un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de p38, nicotinamida y Wnt.
En algunas formas de realización, la invención se refiere a un método para expandir una única célula madre o una población de células madre, preferiblemente para generar un organoide de un tejido de interés, que comprende:
expandir células madre o fragmentos de tejido de dicho tejido de interés en un medio de cultivo de la invención que sea adecuado para dicho tejido de interés; y opcionalmente diferenciar las células madre expandidas o fragmentos de tejido en un medio de cultivo de la invención que sea adecuado para dicho tejido de interés.
Las células madre aisladas se cultivan preferentemente en un microambiente que imita al menos en parte un nicho celular en el que dichas células madre residen de forma natural. Dicho nicho celular se imita cultivando dichas células madre en presencia de biomateriales, como matrices, andamios y sustratos de cultivo que representan señales reguladoras clave que controlan el destino de las células madre. Dichos biomateriales comprenden biomateriales naturales, semisintéticos y sintéticos, y/o mezclas de los mismos. Un andamio proporciona una red bidimensional o tridimensional. Los materiales sintéticos adecuados para dicho armazón comprenden polímeros seleccionados entre sólidos porosos, nanofibras e hidrogeles tales como, por ejemplo, péptidos que incluyen péptidos autoensamblables, hidrogeles compuestos de fosfato de polietilenglicol, fumarato de polietilenglicol, poliacrilamida, metacrilato de polihidroxietilo, acetato de policelulosa y/o copolímeros de los mismos (ver, por ejemplo, Saha et al, 2007 Curr Opin Chem Biol 11(4) 381-387, Saha et al, 2008 Biophysical Journal 954426-4438, Little et al, 2008 Chem Rev 108, 1787-1796). Como sabe un experto, las propiedades mecánicas tales como, por ejemplo, la elasticidad del armazón influyen en la proliferación, diferenciación y migración de las células madre. Un armazón preferido comprende (co)polímeros biodegradables que se reemplazan por componentes naturales después del trasplante en un sujeto, por ejemplo para promover la regeneración de tejidos y/o la curación de heridas. Además, se prefiere que dicho armazón no induzca sustancialmente una respuesta inmunogénica después del trasplante en un sujeto. Dicho andamio se complementa con ligandos naturales, semisintéticos o sintéticos, que proporcionan las señales necesarias para la proliferación y/o diferenciación y/o migración de células madre. En una forma de realización preferida, dichos ligandos comprenden fragmentos de aminoácidos definidos. Ejemplos de dichos polímeros sintéticos comprenden el tensioactivo de copolímero en bloque Pluronic® F 127 (BASF) y Ethisorb® (Johnson and Johnson).
Un nicho celular está determinado en parte por las células madre y las células circundantes, y la matriz extracelular (MEC) que producen las células en dicho nicho. En un método de la invención, se unen criptas aisladas o células madre epiteliales a una MEC. La MEC se compone de una variedad de polisacáridos (principalmente proteoglicanos de sulfato de heparina), agua, elastina y glicoproteínas, donde las glicoproteínas comprenden colágeno, entactina (nidógeno), fibronectina y laminina. La m Ec es secretada por células del tejido conectivo. Se conocen diferentes tipos de MEC, que comprenden diferentes composiciones que incluyen diferentes tipos de glicoproteínas y/o diferentes combinaciones de glicoproteínas. Dicha MEC puede proporcionarse cultivando células productoras de MEC, tales como por ejemplo células de fibroblastos, en un receptáculo, antes de la eliminación de estas células y la adición de criptas aisladas o células madre epiteliales. Ejemplos de células productoras de matriz extracelular son los condrocitos, que producen principalmente colágeno y proteoglicanos, los fibroblastos, que producen principalmente colágeno tipo IV, laminina, procolágenos intersticiales y fibronectina, y miofibroblastos colónicos que producen principalmente colágenos (tipo I, III y V), proteoglicano de sulfato de condroitina, ácido hialurónico, fibronectina y tenascina-C. Alternativamente, dicho MEC se proporciona comercialmente. Las MEC proporcionadas comercialmente son típicamente MEC sintéticas. Ejemplos de matrices extracelulares disponibles comercialmente son las proteínas de la matriz extracelular (lnvitrogen) y Matrigel™ (BD Biosciences). El uso de una MEC para cultivar células madre mejoró la supervivencia a largo plazo de las células madre y la presencia continua de células madre indiferenciadas.
Un ejemplo de una MEC para uso en un método de la invención comprende al menos dos glicoproteínas distintas, tales como dos tipos diferentes de colágeno o un colágeno y laminina. Dicha MEC puede ser una matriz extracelular de hidrogel sintético o una MEC de origen natural. Matrigel™ (BD Biosciences) proporciona una ECM más preferida, que comprende laminina, entactina y colágeno IV. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la MEC para uso en un método de la invención es una matriz 3D que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular tales como las integrinas.
Así, en algunas formas de realización, un método de la invención comprende poner en contacto la célula madre, la población de células madre o el fragmento de tejido aislado y el medio de cultivo con una matriz extracelular, por ejemplo una matriz extracelular que contiene laminina tal como MatrigelTM (BD Biosciences). En algunas formas de realización, el medio de cultivo se difunde en la matriz extracelular.
Composiciones y otras formas
La invención proporciona una composición que comprende un medio de cultivo según la invención y células madre. La invención también proporciona una composición que comprende un medio de cultivo según la invención y organoides. Además, la invención proporciona una composición que comprende un medio de cultivo según la invención y una matriz extracelular.
La invención también proporciona una composición que comprende un medio de cultivo de la invención, una matriz extracelular y células madre de la invención. La invención también proporciona una composición que comprende un medio de cultivo de la invención, una matriz extracelular y uno o más organoides de la invención. La divulgación también describe un suplemento de medio de cultivo que se puede usar para producir un medio de cultivo como se divulga en el presente documento. Un 'suplemento de medio de cultivo' es una mezcla de ingredientes que por sí solos no pueden sustentar a las células madre, pero que permiten o mejoran el cultivo de células madre cuando se combinan con otros ingredientes de cultivos celulares. Por lo tanto, el suplemento se puede usar para producir un medio de cultivo celular funcional de la invención combinándolo con otros ingredientes de cultivo celular para producir una formulación de medio apropiada. El uso de suplementos de medio de cultivo es bien conocido en la técnica.
La divulgación describe un suplemento de medio de cultivo que comprende un inhibidor según la invención. El suplemento puede contener cualquier inhibidor (o combinación de inhibidores) descrito en el presente documento. El suplemento también puede contener uno o más ingredientes de cultivo celular adicionales como se describe en el presente documento, por ejemplo uno o más ingredientes de cultivo celular seleccionados del grupo que consiste en aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, fuentes de energía de carbono y tampones.
Un medio de cultivo o suplemento de medio de cultivo puede ser un medio o suplemento de cultivo líquido concentrado (p. ej. un medio de cultivo líquido o suplemento concentrado de 2x a 250x) o puede ser un medio de cultivo o suplemento seco. Los medios de cultivo o suplementos tanto líquidos como secos son bien conocidos en la técnica. Se puede liofilizar un medio de cultivo o un suplemento.
Un medio de cultivo de la invención o suplemento de la divulgación normalmente se esterilizará antes de su uso para evitar la contaminación, por ejemplo mediante luz ultravioleta, calentamiento, irradiación o filtración. Se puede congelar un medio de cultivo o un suplemento de medio de cultivo (p. ej. a -20°C o -80°C) para almacenamiento o transporte. En algunas formas de realización, el medio de cultivo se puede almacenar como un líquido (p. ej. a aproximadamente 4°C). En algunas formas de realización, el medio de cultivo se puede dividir y almacenar como dos componentes: un componente congelado (p. ej. entre aproximadamente -20°C y aproximadamente -80°C) y un componente líquido (p. ej. a aproximadamente 4°C). En particular, el material degradable sensible a la temperatura o al tiempo se incluye preferiblemente en el componente congelado, mientras que el material menos sensible (por ejemplo DMEM o FCS) puede almacenarse en forma líquida y así incluirse en el componente líquido para almacenamiento y envío.
La invención también proporciona un recipiente herméticamente cerrado que contiene un medio de cultivo de la invención. En el presente documento también se divulga un recipiente herméticamente sellado que contiene un medio de cultivo complementario de la divulgación. Pueden preferirse recipientes herméticamente sellados para el transporte o almacenamiento de los medios de cultivo o suplementos de medios de cultivo descritos en el presente documento, para evitar la contaminación. El recipiente puede ser cualquier recipiente adecuado, tal como un matraz, un plato, una botella, un frasco, un vial o una bolsa.
La divulgación también describe un kit que comprende un medio de cultivo, un suplemento de medio de cultivo y/o una composición de la invención. En algunas formas de realización, el kit comprende además al menos otro componente adicional, por ejemplo seleccionado de la lista que comprende: una MEC (por ejemplo, Matrigel™), una población de células y un organoide.
General
La numeración general “GI” se utiliza anteriormente. Un número GI, o “ Identificador Genlnfo”, es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por el NCBI cuando se agregan secuencias a sus bases de datos. El número GI no se parece en nada al número de acceso del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (p. ej. para corrección, o para agregar más anotaciones o información) luego recibe un nuevo número GI. Por lo tanto, la secuencia asociada con un número GI determinado nunca cambia.
El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste”, por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X+Y.
La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, podrá omitirse la palabra “sustancialmente” en la definición de la invención.
El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±10 %.
A menos que se indique específicamente, un proceso que comprende una etapa de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezcla. Por tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces se pueden combinar dos componentes entre sí y luego la combinación se puede combinar con el tercer componente, etc.
A continuación se describen con más detalle a modo de ejemplo diversos aspectos y formas de realización de la invención. Se apreciará que se pueden realizar modificaciones de detalles sin apartarse del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1 Cultivo de colon de ratón
a.izquierda: la expresión de Axin2 está bajo el control de la vía de señalización Wnt. Organoides de criptas de colon de ratones reporteros Axin2-LacZ cultivados con EGF, Noggin y R-espondina (ENR) durante 3 días. La ausencia de tinción LacZ indica que no hay señal Wnt activa presente en los organoides del colon en condiciones de crecimiento ENR. El recuadro muestra la señalización activa de Wnt visualizada mediante la expresión de LacZ (tinción oscura) en criptas de colon recién aisladas de ratones informadores Axin2-LacZ. derecha: criptas de colon derivadas de ratones Axin2-LacZ cultivadas con ENR Wnt3A (WENR) durante 10 días. La mancha oscura indica la expresión de LacZ en estos organoides.
b.izquierda: criptas de colon Lgr5-GFP-ires-CreER cultivadas con ENR durante 3 días. La ausencia de fluorescencia de GFP indica la pérdida de la expresión de Lgr5 en los organoides del colon en condiciones de crecimiento ENR. El recuadro muestra la expresión de Lgr5-GFP en criptas de colon recién aisladas de ratones Lgr5-GFP-108 ires-CreER. derecha: La cripta de colon Lgr5-GFP-ires-CreER cultivada con WENR durante 10 días demuestra la presencia de células madre Lgr5.c.La eficiencia del cultivo se determina en tres condiciones diferentes: ENR, criptas llenas de WENR y criptas de WENR después de una digestión enzimática suave (digerida por WENR). Las criptas de colon se aislaron del colon proximal (columnas negras) o del colon distal (columnas blancas). *:p<0,05.
d. e:4 días después de la eliminación de Wnt3A del medio de cultivo WENR se produce la diferenciación de organoides.d.Se observa cromogranina A (ChA) en células enteroendocrinas; MuciNa<2>(muc2) en células caliciformes y la contratinción con DAPI.e.Los enterocitos maduros se visualizan mediante tinción con fosfatasa alcalina.
f.Se muestra la expresión relativa del ARNm de marcadores de células epiteliales maduras (Vill (Villin1), Alpi (fosfatasa alcalina), Chga (cromogranina A), Muc2 (Mucin2)). Los organoides de cripta de colon cultivados con WENR se cultivan durante 4 días en condición WENR (patrón rayado) o ENR (negro). Para el control se utilizan criptas de colon recién aisladas (blancas). Barra de escala en a, b, d, e: 50 pm. Las barras de error indican s.e.m. n=3.
Figura 2 Cultivo de colon humano
a.El efecto de la nicotinamida en los organoides de las criptas del colon humano. La mayoría de los organoides de las criptas del colon humano mueren en unos pocos días en condiciones de WENR+gastrina (WENRg) (panel izquierdo). La adición de nicotinamida (panel central: WENRg+nic) mejora la eficiencia del cultivo y la vida útil de los organoides del colon humano. *p<0,001. nic: nicotinamida.
b.El efecto del inhibidor de molécula pequeña para Alk4/5/7 (A83-01) y para la MAP quinasa p38 (SB202190) en los organoides de las criptas del colon humano. Panel izquierdo: organoides de colon humano cultivados en WENRg nicotinamida que contienen medio que forman estructuras quísticas 3-4 semanas después del cultivo. Panel central: Los organoides del colon humano conservan su estructura de gemación característica bajo la condición de cultivo de células madre intestinales humanas (“HISC”) (WENRg+nicotinamida+A83-01+SB202190). Panel derecho: A83-01 y SB202190 aumentan sinérgicamente el número de pases de los organoides del colon humano. *p<0,001. NS=estadísticamente no significativo. Las barras de error indican s.e.m. n=5.
c.Las células en proliferación visualizadas mediante la incorporación de EdU están confinadas a las estructuras en ciernes. DAPI se utiliza como contratinción
d.Imagen representativa de un cariotipo de un organoide de cripta de colon humano de 3 meses. Escala: 100 pm.e.Mapa de calor del perfil de expresión de organoides intestinales humanos cultivados. El mapa de calor es una comparación de las criptas del intestino delgado humano y las vellosidades del intestino delgado humano. Los genes más expresados en la cripta son de color gris oscuro (mitad superior del mapa de calor), los genes más expresados en las vellosidades son de color gris claro (mitad inferior del mapa de calor). Los organoides cultivadosin vitroexhiben claramente un perfil de expresión similar al de las criptas del intestino delgado recién aisladas y expresan marcadores de células madre conocidos. (carril 1: organoides del intestino delgado humano #1, carril 2: organoides del intestino delgado humano #2, carril 3: organoides del colon humano, carril 4: criptas del intestino delgado humano recién aisladas. Las cuatro muestras se comparan con vellosidades del intestino delgado humano).
Figura 3 Composición del tipo de células organoides intestinales humanas
(a-c)Los organoides humanos se diferencian en los diferentes tipos de células del intestino después de la retirada de nicotinamida y SB202190. Se utilizaron marcadores de los diferentes tipos de células para demostrar la diferenciación.
(a)Panel superior: tinción con fosfatasa alcalina para enterocitos maduros, panel central: tinción con PAS para células caliciformes, panel inferior: tinción con sinaptofisina para células enteroendocrinas.(b)En cada caso, las áreas claras indican tinción. La tinción con muciNa<2>(Muc2) en el panel central representa células caliciformes y la cromogranina A (ChgA) en el panel de la izquierda representa células enteroendocrinas (véase flecha y recuadro). DAPI se utiliza como contratinción (panel derecho).(c)La lisozima (Lysz) se tiñe en el panel de la izquierda para mostrar las células de Paneth. DAPI se utiliza como contratinción (panel derecho).
(d-f)La diferenciación de células caliciformes (Muc2) se bloquea mediante el tratamiento de organoides con SB202190 (d), mientras que el inhibidor de Notch DBZ aumenta el número de células caliciformes en los organoides humanos (f). Las células en proliferación están representadas por la incorporación de EdU (panel central), aumentan en los organoides tratados con SB202190 (d) o disminuyen en los organoides tratados con DBZ (f).
Los organoides se cultivan en las siguientes condiciones durante 5 días: a) arriba: ENRg+A83-01+SB202190+Nicotinamida, a) medio e abajo, b), c) WENRg+A83-01, d) WENRg+A83-01+SB202190, e) WENRg+A83-01, f) WENRg+A83-01+DBZ.
Barra de escala: 20 pm (a), 50 pm (b-f). a, b, d-f: organoides de la cripta del colon humano, c: organoides del intestino delgado humano.
Figura 4 Cultivos de adeno(carcino)ma
a.Criptas Lgr5-GFP-ires-CreER/APCfl/fl cultivadas con EGF (E) (arriba) o EGF+Noggin (EN) (abajo) durante 10 días.b.
Expresión relativa de ARNm de Lgr5 y Axin2. Se cultivaron células de adenoma recién aisladas (blancas) con EGF (eclosionadas) o EGF+Noggin (negro).c.Eficiencia del cultivo de organoides de células Lgr5-GFPhi, Lgr5-GFPlo, Lgr5-GFP-ve clasificadas. *p<0,01. ANOVA unidireccional. Las barras de error indican s.e.m. n=3
d.Cultivo en el tiempo de células de adenocarcinoma de colon humano.
Figura 5 Cultivo de esófago de Barrett y tratamiento con inhibidor de Notch.
a.El epitelio aislado del esófago de Barrett (BE) cultivado con condición HISC durante 7 días forma estructuras quísticas.b.La adición de FGF10 aumenta significativamente el número de pases para los organoides BE. Las barras de error indican s.e.m. n=3c.Curso temporal representativo de un organoide BE.d.Secciones de parafina de organoides BE. La nicotinamida y SB202190 se retiran durante 4 días con (derecha) o sin (izquierda) el inhibidor de Notch DBZ añadido al medio. Las células en proliferación (tinción Ki67) desaparecen y las células PAS+ de gohlet aumentan con el tratamiento con DBZ.
Figura 6 La expresión del ARNm de Axin2 se recupera en organoides de colon de ratón en presencia de Wnt-3A.
Se analizan criptas colónicas aisladas para determinar la expresión del ARNm de Axin2 después de 3 días o 7 días de cultivo con ENR (eclosionado) o WENR (negro). Como control se utilizaron criptas de colon recién aisladas. Las barras de error indican s.e.m. n=3
Figura 7 Expresión relativa de ARNm de marcadores de células epiteliales maduras
Las criptas del intestino delgado (blancas) recién aisladas se cultivan en condiciones HISC durante 14 días, seguido de un cultivo con las condiciones de cultivo indicadas durante 4 días. Se analizó la expresión de ARNm de ALPI (fosfatasa alcalina), VILI (Villin 1), LYZ (lisozima), CHGB (cromogranina B) y MUC2 (Mucin2). Condición de cultivo: HI<s>C (negro), ENRg+A83-01+SB202190+Nicotinamida, WENRg+A83-01, ENRg+A83-01, ENRg. Se utilizaron criptas del intestino delgado recién aisladas como control (establecidas como 1,0 para ALPI, VILI y LYZ, como 5,0 para CHGB y MUC2. Las barras de error indican s.e.m. norte=3.
Figura 8 Células Lgr5-GFP- clasificadas forman organoides Lgr5-GFP+
Se cultivan células de adenoma Lgr5-GFP-APCfl/fl clasificadas individualmente con EGF+Noggin (EN) o EGF (E) durante 7 días. Los organoides de adenoma derivados de células Lgr5-GFP recuperaron la expresión de Lgr5-GFP en condiciones EN pero no en condiciones E (a, c: brillante, b, d: autofluorescencia de GFP).
Figura 9 Análisis histoquímico de organoides de adenoma/cáncer de colon
Se analizaron los organoides de adenoma de intestino delgado de ratón (panel izquierdo) y los organoides de cáncer de colon humano (panel derecho) con las tinciones indicadas histoquímica (HE, PAS y fosfatasa alcalina) o inmunohistoquímica (cromogaranina A, Ki67 y caspasa3).
Figura 10 Células de Paneth en organoides BE
Se observaron células lisozima+ de Paneth en organoides BE diferenciados.
Figura 11 Lista de reactivos utilizados para el cultivo de organoides
Figura 12 Lista de reactivos utilizados para la optimización del cultivo de organoides intestinales humanos
Figura 13 Lista de inhibidores de moléculas pequeñas utilizados para la optimización del cultivo de organoides intestinales humanos
Figura 14 Lista de los 25 genes con mayor y menor regulación
ARNm de organoides del intestino delgado humano o de organoides del colon se comparan con el de vellosidades del intestino delgado recién aisladas mediante microarrays. Se muestran los 25 genes más regulados hacia arriba y hacia abajo. Las líneas rayadas resaltan los genes que se encontraban entre los 70 genes más regulados hacia arriba y hacia abajo en criptas del intestino delgado humano recién aisladas vs. vellosidades.
Figura 15. Resumen del estado de proliferación, diferenciación y apoptosis de cada condición de cultivo de organoides
Figura 16: Comparación de microarrays de organoides pancreáticos de ratón
A - Análisis de agrupamiento de microarrays, comparando ARN de los organoides del páncreas (cultivados en las condiciones descritas en el Ejemplo 2) con páncreas adulto, hígado adulto y el hígado del recién nacido. De izquierda a derecha: i) organoide del páncreas; ii) páncreas adulto; iii) hígado de adulto (muestra 1 [S1] y muestra 2 [2]); iv) hígado adulto S2; y v) hígado de recién nacido.
B - Datos de señal sin procesar del análisis de microarrays, comparando los niveles de expresión de marcadores ductales seleccionados, factores de transcripción necesarios para la expresión de Ngn3 y marcadores endocrinos en hígado adulto, páncreas adulto, organoides de páncreas y organoides de hígado en medios de expansión.
Figura 17: El efecto de Noggin en la expansión de los organoides pancreáticos
A - Gráficos de barras que muestran el análisis de la expresión genética de los organoides pancreáticos cultivados en EGFRA, que nunca se han cultivado con Noggin (negro) con organoides cultivados en EGFRAN, por lo que siempre se han cultivado con Noggin (blanco). El efecto de cultivar los organoides pancreáticos en EGFRA durante 2 días y luego retirar Noggin y cultivar durante 2 o 4 días más (gris claro) y el efecto de cultivar los organoides pancreáticos en EGFRA durante 2 días y luego agregar Noggin y cultivar durante un También se muestran 2 o 4 días adicionales (gris oscuro) en la expresión genética. Los niveles de ARNm (unidades arbitrarias) se presentan en el eje Y. En la figura principal se analiza el ARNrn de los siguientes marcadores endocrinos tempranos: Sox9, HNF1b, Hnf6, HNF1a, Nkx2.2, Nkx6.1 y Pdx1. El ARNrn de los siguientes marcadores ductales se analiza en la parte insertada: queratina 7 (Krt7) y queratina 19 (Krt19).
B - Gráfico de barras que muestra el efecto de Noggin sobre la expresión de Lgr5 en organoides pancreáticos en el medio de cultivo de expansión. Se proporcionan datos para organoides pancreáticos cultivados en e Gf RA que nunca se han cultivado con Noggin (negro) con organoides cultivados en EGFRAN y, por lo tanto, siempre se han cultivado con Noggin (blanco). También se muestra el efecto de cultivar los organoides pancreáticos en EGFRAN y luego retirar Noggin y cultivar durante 6 días más (gris claro) y el efecto de cultivar los organoides pancreáticos en EGFRA y luego agregar Noggin y cultivar durante 6 días más (gris oscuro) en la expresión del gen Lgr5. Los niveles de ARNm (unidades arbitrarias) se presentan en el eje Y.
F ig u ra 18: Las c é lu la s p ro d u c to ra s d e in s u lin a h u m an a s e d e s a rro lla n a p artir d e c é lu la s p ro g e n ito ras tra s p la n ta d a s in vivo, e x p a n d id a s ex vivo.
A - Crecimiento de tejido de páncreas humano a partir de células progenitoras (células madre de páncreas) en P0: (Día 1); P0: (Día 5); P1: (Día 12) y P3: (Día 24), donde “P” se refiere al número de pases. Las Figuras 18B y C muestran el trasplante de organoides pancreáticos humanos bajo la cápsula perirrenal murina.
B - 3 horas después del trasplante de las células organoides pancreáticas en los ratones receptores: la tinción DAPI (marcador nuclear) en la imagen superior indica todas las células; la tinción K19 (marcador ductal) en la imagen inferior muestra todas las células trasplantadas y la insulina (marcador de células beta) en la imagen inferior indica células productoras de insulina.
C - 1 mes después del trasplante de las células organoides pancreáticas en los ratones receptores: la tinción DAPI (marcador nuclear) en la imagen superior (en azul) indica todas las células; la expresión de CK19 (marcador ductal) en la imagen del medio (en verde) indica todas las células trasplantadas y la insulina (marcador de células beta) en la imagen inferior (en rojo) indica las células productoras de insulina. Se rodea una selección de células productoras de insulina, pero se cree que todas las células claramente teñidas son positivas para insulina.
F ig u ra 19: E xp re s ió n del g en o rg a n o id e p a n c re á tic o
Esta tabla muestra la expresión del gen pancreático de los genes más regulados en comparación con los organoides hepáticos.
F ig u ra 20: El c u ltiv o d e o rg a n o id e s d e h íg ad o d e ra tón m u e s tra un c a rio tip o e s ta b le d e s p u é s d e un c u ltiv o a larg o plazo .
A - Imágenes DIC de organoides hepáticos mantenidos en EGF (E) y R-espondina 1 (R), 15 suplementados con FGF10, HGF y nicotinamida (Figura izquierda, ER) o mantenidos en la misma combinación suplementada con Noggin (N) y medio acondicionado Wnt3 (W) (Figura derecha, ENRW) por un período de 24 meses.
B - Análisis de cariotipo de organoides de hígado de ratón después de 8 meses en cultivo. Se encontraron recuentos cromosómicos normales (n=40, figura del panel izquierdo) y poliploidía, una característica típica de los hepatocitos (n=80, figura del panel derecho).
F ig u ra 21: F ac to re s s u p le m e n ta rio s F G F 10 , H G F y n ic o tin a m id a ; e fe c to s o b re el c re c im ie n to y d ife re n c ia c ió n de o rg a n o id e s h ep á tico s .
A - Diagrama que muestra los genes expresados diferencialmente durante las 3 etapas del desarrollo del hígado, desde el hepatoblasto hasta el hepatocito maduro.
B - Esquema que muestra el protocolo utilizado. Los cultivos se sembraron en medio expansión (ERFHNic: EGF (E) y R-espondina 1 (R), suplementado con FGF10, HGF y nicotinamida; ERFHNic se indica como 'ER' en la Figura 8B) 2 días antes del experimento. Dos días después, los medios de cultivo se cambiaron a EGF (E) solo o EGF suplementado con R-espondina 1 (ER) con o sin suplementos adicionales elegidos entre FGF10 (F) o HGF (H) o nicotinamida (Nic) o una combinación de éstos en las concentraciones indicadas en el texto. Cinco días después, los cultivos se dividieron y se volvieron a sembrar en una proporción de 1:4 para cada condición. En estas condiciones, los cultivos se dividieron y se volvieron a sembrar cada 7 días durante un período total de 10 semanas.
C - Primer día después de la primera división en cada una de las condiciones de cultivo analizadas. Los resultados muestran que EGF y R-espondina 1 combinados con FGF10 o HGF o Nicotinamida o una combinación de estos son esenciales para lograr al menos 1 pase.
D - Después de un cultivo a largo plazo, la combinación de ER suplementado con FNic o ER suplementado con FHNic da como resultado un alto número de pases. Después del paso 10, la tasa de crecimiento es mejor para las condiciones de cultivo, incluidos los 3 factores suplementarios; ERFHNic.
E - Análisis RT-PCR que muestra la expresión de diferentes marcadores de hepatocitos (CYP3A11, Alb, FAH) y marcador de colangiocitos (K19) 5 días después de la retirada de determinados factores (el punto de partida fue ERFHNic). Tenga en cuenta que sólo la condición EF mostró expresión de todos los marcadores de hepatocitos analizados. HPRT se utilizó como gen de mantenimiento para normalizar la expresión genética.
F ig u ra 22: T a b la q u e m u es tra la c u a n tific a c ió n d e d ife re n te s fa c to re s d e tra n s c rip c ió n e s p e c ífic o s d e h ep a to c ito s y c o la n g io c ito s en c é lu la s d e tre s c o n d ic io n e s d e c u ltiv o d e h íg ad o d ife re n te s y en te jid o d e h íg ad o ad u lto .
También se muestra la expresión de los componentes clave de las vías de señalización de Notch y TGF-beta. E=EFHNic, ER=ERFHNic, ENRW=ENRWFHNic.
Figura 23: Protocolo de diferenciación
A - Esquema que muestra el protocolo utilizado. Los cultivos se sembraron en medio expansión (ERFHNic: EGF (E) y R-espondina 1 (R), suplementado con FGF10, HGF y nicotinamida; ERFHNic se indica como 'ER' en la Figura 10A) 2 días antes del experimento. Dos días después, los medios de cultivo se cambiaron a EGF (E) suplementado con A8301 (A), DAPT (D), FGF10 (F) o HGF (H) o nicotinamida (Nic) o R-espondina 1 (R). o Wnt3A o Noggin (N) o una combinación de estos en las concentraciones mostradas. El ARN se aisló en varios momentos. Se tomó tejido de hígado de ratón como control positivo (+) mientras que se tomó agua como control negativo (-).
B - Análisis por RT-PCR que muestra la expresión de los marcadores de hepatocitos CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT y Gck 7 días después de las condiciones de diferenciación. Tenga en cuenta que sólo la condición EADF mostró una expresión de todos los marcadores de hepatocitos analizados. HPRT se utilizó como gen de mantenimiento para normalizar la expresión genética.
C - Análisis de expresión en el curso del tiempo después de condiciones de diferenciación. En los días 2, 5 y 8, días después de la diferenciación, se analizó mediante RTPCR la expresión de los marcadores de hepatocitos CYP3A11, Alb, FAH y el marcador de colangiocitos K19. Tenga en cuenta que la expresión de los marcadores hepáticos CYP3A11 y FAH comienza el día 5 y alcanza su punto máximo el día 8 después. HPRT se utilizó como gen de mantenimiento para normalizar la expresión genética. A; A8301, D; DAPT, F; FGF10, H; HGF, De; Dexametasona
D - experimento de titulación que muestra la expresión de los marcadores de hepatocitos CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT, G6P y Gck 7 días después de diferentes concentraciones de los compuestos de diferenciación A y D. HPRT se utilizó como gen de mantenimiento para normalizar la expresión genética.
E - Tinción inmunofluorescente para los marcadores hepáticos K19, Albúmina y marcador de superficie de hepatocitos F - Tinción Xgal en organoides derivados del hígado de ratones Albcreert2LacZ. Se detectaron células positivas para albúmina (flechas) después de la diferenciación con EADF en cultivos derivados de Albcreert2LacZ inducidos por tamoxifeno.
Figura 24: Vía de señalización de prostaglandinas(antagonismo de los receptores DP<1>de prostaglandinas D<2>y CRTH<2>como enfoque para tratar enfermedades alérgicas. Roy Pettipher, T revor T. Hansel & Richard Armer Nature Reviews Drug Discovery 6, 313-325 (abril de 2007)).
Figura 25: Organoides de hígadocultivados en (A) medio basal que comprende hEGF (100 ng/ml, Invitrogen); noggin humano (hnoggin) (25 ng/ml, peprotech); gastrina (10 nM, sigma); hFGF10 (peprotech); nicotinamida (10 mM, sigma); A8301 (500 nM, Tocris); hHGF (50 ng/ml, peprotech); medios condicionados Rspo (10 %); (B) medio basal PGE2 (50 nM); (C) medio basal CHIR99021 (3uM); (D) medio basal CHIR99021 (3uM) PGE2 (50 nM).
Figura 26: Organoides de hígadocultivados en medio basal (como se describe en la Figura 25) con y sin ácido araquidónico.
Figura 27: El perfil de expresión genética de los organoides hepáticos de ratón en condiciones de diferenciación 15 se asemeja al perfil hepático de adulto y recién nacido.
A - grupos de genes que muestran los genes expresados de manera similar (a) o desactivados de manera similar (b) entre la condición de diferenciación EADF y el hígado de adulto o recién nacido.
B - Grupos de genes que muestran los genes expresados diferencialmente entre los organoides hepáticos y el hígado de un adulto o de un recién nacido (a) y los genes expresados de manera similar entre el EADF y el hígado de un recién nacido (b).
C - Datos de señal sin procesar de un análisis de micromatrices, que comparan los niveles de expresión de marcadores ductales seleccionados, factores de transcripción necesarios para la expresión de Ngn3 y marcadores endocrinos en hígado adulto, páncreas adulto, organoides de páncreas y organoides de hígado en medios de expansión.
Figura 28: Genes característicos del hígado de ratón
Tabla que muestra a) marcadores expresados en células madre de hígado de ratón; b) marcadores no expresados en células madre hepáticas de ratón; c) marcadores de hepatocitos y colangiocitos expresados en la firma de células madre de hígado de ratón para organoides de hígado de ratón en medios de expansión; d) marcadores de hepatocitos y colangiocitos no expresados en la firma de células madre de hígado de ratón para organoides de hígado de ratón en medios de expansión; e) reprogramar genes expresados en organoides de hígado de ratón; f) reprogramar genes no expresados en organoides de hígado de ratón. Los resultados se obtuvieron utilizando una microarray de hígado utilizando el ARN de referencia de ratón Universal 30 (Strategene, n.° de catálogo 740100) como ARN de referencia. Si las cifras absolutas detectadas eran inferiores a 100, el gen se consideraba no detectado.
Figura 29: Genes característicos del hígado humano
Tabla que muestra los resultados de la microarray hepática de organoides humanos. De izquierda a derecha, se muestran los resultados para a) medio de expansión EMI, b) medio de expansión EM2, c) medio de diferenciación, d) hígado adulto.
Los números (log2) en las cuatro columnas de la izquierda son el resultado de una comparación entre la muestra y una muestra de ARN de referencia (comercial) que se utiliza para todas las matrices. Se muestra la expresión relativa del ARNm en cada muestra en comparación con el ARN presente en la muestra de referencia. El ARN de referencia utilizado fue ARN de referencia humana universal (Stratagene, n.° de catálogo 740000). Por lo tanto, números negativos en estas columnas no se relacionan con los niveles de expresión reales; solo significa que hay menos ARN que en la muestra de referencia. Las 4 columnas de la derecha son cifras absolutas. Si están por debajo de 100, se consideran no detectados.
Figura 30: Morfología de los organoides hepáticos.(A) Paneles superiores: sección en parafina de un hígado de ratón que muestra los diferentes dominios (PT = tríada portal, CV = vena central). Paneles inferiores: sección de parafina de un organoide hepático que muestra diferentes dominios b (epitelios de una sola capa) y h (epitelios estratificados) (B) Panel derecho: tinción con ecadherina en los organoides hepáticos. Se pueden identificar dos dominios diferentes. Dominio b, formado por un epitelio de una sola capa que se asemeja a las estructuras de los conductos biliares del hígado. Este dominio del conducto biliar está formado por células altamente polarizadas que muestran tinción positiva para pancitoqueratina (PCK) (panel inferior). Los paneles de la izquierda muestran la presencia de un segundo dominio dentro de organoides hepáticos. Este dominio h está formado por un epitelio estratificado con células no polarizadas. Las células están organizadas alrededor de una luz central y expresan el marcador de hepatocitos Alb. Ampliación 10 x.
Figura 31: Tinción H&E de organoides de páncreas
Se cultivaron organoides de páncreas de ratón en condiciones de expansión EGFNRA83-01
[(EGF (50 ng/ml), gastrina (50 nM), Noggin (10 %), R-espondina (5 %), FGF10 (100 ng/ml) y A8301 (50 nM)] durante 8 pases (-10 semanas). Los organoides se retiraron del matrigel usando BD Cell Recovery Solution siguiendo las instrucciones del fabricante y se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, los organoides se lavaron tres veces con PBS frío, se deshidrataron con una mayor concentración de alcohol y se incluyeron en parafina. Se tiñeron secciones de parafina de 3 um con hematoxilina-eosina para analizar la histología de los organoides del páncreas.
Se observó una fuerte variabilidad en la forma y estructura de los organoides. Algunos de los organoides son estructuras quísticas formadas por una monocapa de células epiteliales polarizadas. Otros organoides muestran la misma monocapa de células epiteliales y algunas áreas estratificadas donde las células son de menor tamaño y con forma redonda. En algunos organoides se observaron invaginaciones que ocupaban el espacio interno de la estructura quística.
Las tinciones muestran que algunos organoides comprenden principalmente monocapas de células epiteliales (abajo a la izquierda), mientras que otros organoides comprenden regiones estratificadas y/o regiones pseudoestratificadas y/o monocapas plegadas (abajo a la derecha). La mayoría de los organoides pancreáticos comprenden regiones de células estratificadas y monocapas (a veces plegadas).
Figura 32. Cuantificación de la inflamación de organoides del intestino delgado murino inducida por forskolina. (a)Análisis de microscopía óptica de organoides estimulados con forskolina o DMSO. Se muestran ejemplos representativos de los puntos de tiempo indicados después del inicio de la estimulación. La línea roja indica la luz organoide interna.(b)Imagen confocal de fluorescencia de un organoide marcado con calceína verde con reconocimiento de objetos (línea verde) mediante software de análisis de imágenes.(c)Ejemplo representativo de un organoide marcado con calceína verde estimulado por forskolina. Se obtuvieron imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y fluorescencia utilizando microscopía confocal de células vivas. El área de superficie relativa a t=0 se indica en la esquina superior izquierda.(d)El área de superficie relativa a t=0 (área normalizada) de 11 organoides individuales en un solo pocillo. El promedio se indica en negro (media ± s.e.m.).(e)Aumento del área de superficie dependiente de la dosis con forskolina (5 pM (n = 4 número de organoides analizados), 5x102 pM (n = 11), 5x104 pM (n = 10), DMSO n = 9)). Barras de escala (a-c) 30 pm. Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Figura 33. La inflamación de organoides murinos inducida por forskolina depende del CFTR. (a)Curvas de hinchamiento normalizadas de organoides marcados con calceína verde estimulados por forskolina preincubados con DMSO (n=8), CFTR-inh172 (n=7), GlyH-101 (n=9) o tanto CFTR-inhl72 como GlyH-101 (n=11) (media ± s.e.m.).(b)Imágenes representativas de microscopía confocal de organoides de tipo salvaje o deficientes en CFTR marcados con calceína verde en respuesta a la forskolina. Barras de escala de 50 pm.(c)Cuantificación de la hinchazón inducida por forskolina en organoides de tipo salvaje (n=6) o deficientes en CFTR (n=11) (media ± s.e.m.)(d,e)Similar a b,c pero para tipo salvaje (n=8) y organoides CFTR-F508del (n = 12). Barras de escala de 30 pm.(f)Tamaño absoluto de organoides de tipo salvaje o deficientes en CFTR cuantificados en (c) en t=0 (media ± s.e.m.).(g)Hinchazón estimulada por forskolina de organoides CFTR-F508del marcados con verde calceína cultivados a 37°C con (n=20) o sin (n=15) inhibición de CFTR o cultivados a 27°C durante 24 horas con (n=31) o sin (n=27) Inhibición de CFTR (media ± s.e.m.).(h)Hinchazón inducida por forskolina de organoides CFTR-F508del marcados con verde calceína preincubados durante 24 horas con DMSO con (n=15) o sin (n=18) inhibición de CFTR o preincubados con el compuesto corrector de CFTR VRT-325 con (n=14) o sin (n=26) inhibición de CFTR (media ± s.e.m.).(i)Hinchazón normalizada inducida por forskolina de organoides CFTR-F508del pretratados durante 24 horas con Dm So (n=16), VRT-325 (n=18), Corr-4a (n=20) o ambos correctores (n = 20) (media± s.e.m.). Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Figura 34. Inflamación inducida por forskolina en el control de la salud humana o en organoides de fibrosisquística. (a)Cuantificación de la hinchazón de organoides inducida por forskolina preincubada con DMSO, CFTR¡nh-172, GlyH-101 o CFTRinh-172 y GlyH-101 (n = 5, n = 7, n = 8, n = 10) (media ± s.e.m.).(b)Hinchazón de organoides estimulada por forskolina derivada de 4 controles sanos individuales (1-4: n=30, n=18, n=13, n=42) y 1 paciente homocigoto CF CFTR-F508del (n=30) (media ± s.e.m.).(c)Hinchazón normalizada de organoides CFTR-F508del marcados con verde calceína inducidos por forskolina cultivados durante 24 horas a 37 °C o a 27 °C con o sin inhibición de CFTR (n = 10 para todas las condiciones) (media ± s.e.m.).(d)Imágenes representativas de microscopía confocal de organoides derivados de HC o derivados de pacientes con FQ marcados con verde calceína en respuesta a la forskolina tras la manipulación farmacológica de CFTR. Barras de escala de 60 pm.(e)Hinchazón normalizada inducida por forskolina de organoides CFTR-F508del pretratados durante 24 horas con DMSO, VRT-325, Corr-4a o ambos correctores (n = 10 para todas las condiciones) (media ± s.e.m.).(f)Hinchazón organoide derivada del paciente con FQ en respuesta a la forskolina con o sin pretratamiento de 24 horas con el corrector VX-809, estimulación con VX-770 (simultánea con forskolina) o tratamiento combinado con VX-809 y VX-770 (n=10 para todas las condiciones) (media ± s.e.m.).(g)Hinchazón de organoides inducida por forskolina tras el tratamiento con DMSO (control) o el tratamiento con compuestos combinados de e y f, en comparación con los organoides HC (n = 10 para todas las condiciones) (media ± s.e.m.). Cada línea en (d) representa la hinchazón de organoides promediada de al menos tres experimentos independientes por individuo. Los resultados de todas las demás figuras son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Figura 35.Análisis de microscopía óptica de organoides murinos de tipo salvaje estimulados con forskolina o DMSO. Se muestran ejemplos representativos de los puntos de tiempo indicados después del inicio de la estimulación. La hinchazón de los organoides inducida por forskolina (FIS) se revirtió al eliminar la forskolina mediante lavado.
Figura 36.El ARNm de CFTR se expresa en organoides humanos y de ratón. Las barras muestran valores de umbral del ciclo de PCR (CT) en tiempo real que representan niveles de ARNm de CFTR, p2m o GAPDH aislados de organoides CFTR-F508del (gráfico izquierdo) o CFTR-/- (gráfico central) y sus correspondientes tipos silvestres, u organoides humanos.
Figura 37.La hinchazón gradual inducida por la forskolina previene el colapso de los organoides. Aumento del área de superficie normalizada de organoides individuales estimulados con forskolina(a)de tipo salvaje,(b)CFTR-F508del (temperatura rescatada) y(c)humanos (5 % de medio acondicionado con Wnt3a, WCM). Se analizó el promedio de 25 hinchazones inducidas por forskolina de diferentes tipos de organoides hasta 10 (Fig. 1d,c 2a,c,c), 20 (Fig. 2g) o 40 (Fig. 2h,i 2a-c) minutos (línea discontinua).
Figura 38.El aumento de FIS mediante el tratamiento de compuestos correctores depende de CFTR. Hinchazón inducida por forskolina de organoides CFTR-F508del humanos marcados con calceína verde preincubados durante 24 horas con DMSO, o con VRT-325 y Corr-4a con o sin inhibición de CFTR (n = 10 para todas las condiciones) (media ± s.e.m.). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos diferentes.
Figura 39.La inflamación de organoides inducida por la toxina del cólera en organoides humanos depende del CFTR. La forskolina y la toxina del cólera inducen la inflamación de los organoides derivados de HC, pero no de los organoides CFTR-F508del. La respuesta a la toxina del cólera se retrasa en comparación con la forskolina debido a su función extracelular apical. (n=10 para todas las condiciones) (media ± s.e.m.). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos diferentes.
Figura 40.Organoides humanos en condiciones de cultivo de Wnt3a normales o reducidas.(a)Imágenes de microscopía óptica de organoides humanos cultivados en concentraciones normales (50 %, panel izquierdo) o reducidas (5 %, panel derecho) de medio acondicionado Wnt3a (WCM). Barras de escala de 400 pm.(b)Ejemplos representativos de hinchazón inducida por forskolina en condiciones de Wnt3a normales o reducidas. Barras de escala de 50 pm. La línea discontinua representa la luz interna del organoide(c)Cuantificación de la inflamación del organoide inducida por forskolina en niveles normales de Wnt3a preincubados con DMSO, CFTRinh-172, GlyH-101 o ambos CFTRinh-172 y GlyH-101 (n=29, n =41, n=26, n=15) (media ± s.e.m.).(d)Cuantificación de la hinchazón inducida por forskolina de organoides en gemación de bajo paso cultivados a concentraciones de medio acondicionado Wnt3a (WCM) del 50 % (n = 9) o del 5 % (n = 12) promediadas a partir de dos experimentos independientes (media ± s.e.m.). Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Figura 41. Tinciones H&E de organoides de próstata
Se incluyeron fragmentos de tejido del epitelio de próstata de ratón en matrigel. Las células en expansión se dividieron semanalmente. El cultivo se puede mantener durante un período prolongado de tiempo sin perder estabilidad genética o capacidad de proliferación. La Figura 41 muestra una comparación del epitelio prostático de la propia próstata y los cultivos de organoides tras periodos de tres meses. Los organoides de próstata de ratón crecen en medios que contienen ENR (EGF, Noggin y R-espondina) en presencia o ausencia de testosterona. El cultivo humano requiere la adición de un inhibidor de TGF-beta. El H&E de fijación e inclusión en parafina demuestra los diferentes niveles de estratificación y plegamiento del epitelioin vivo.Los organoides de próstata cultivados muestran una diversidad similar en plegamiento y estratificación.
Figura 42. Tinciones CK8 (un marcador de diferenciación) de organoides prostáticos
Se incluyeron fragmentos de tejido del epitelio prostético de ratón en matrigel. Las células en expansión se dividieron semanalmente. El cultivo se puede mantener durante un período prolongado de tiempo sin perder estabilidad genética ni capacidad de proliferación. La Figura 42 muestra la prueba de células luminales que expresan CK8. Los cultivos se cultivan en medios que contienen ENR (EGF, Noggin y R-espondina) en presencia o ausencia de testosterona. El cultivo humano requiere la adición de un inhibidor de TGF-beta. La adición de testosterona permite la diferenciación en células luminales positivas para CK8 y al mismo tiempo estimula el mantenimiento y la expansión de las células madre. La testosterona también aumenta la estratificación y el plegamiento del epitelio.
Figura 43. Próstata de ratón después de 25 semanas en cultivo.
Organoides de próstata cultivados en EGF, Noggin, R-espondina, NAC, B27, Glutamin/max, pen/strep, Ad-DMEM/F12 testosterona. La forma del organoide esté determinada por el origen del tejido (posición en la próstata antes del aislamiento). La próstata consta de diferentes lóbulos o regiones. Las regiones diferentes muestran estructuras epiteliales específicas (estratificación y plegamiento). Después del cultivoin vitro,los organoides parecen mantener la estructura macroscópica diferente (estratificada o plegada) de la parte de la próstata de la que se originó.
Figura 44. PCR de cultivo de próstata humana de 3 semanas
Se aisló epitelio prostético normal y canceroso y se cultivó durante tres semanas en condiciones de cultivo ENR FGF10, ENRF+DHT, WENRF, WENRF DHT, ENR, ENR DHT. Todas las condiciones de cultivo contenían A83, P38i y nicotinamida.
Fig. 44(a): Se aisló ARN y se realizó RT-PCR para marcadores del epitelio prostético. Tanto en tejido normal como tumoral se expresan los marcadores luminales CK18, CK8 y B-MSP. Todas las condiciones de cultivo expresan el RA. En tejido normal, la adición de DHT aumenta la expresión de RA en todas las condiciones de cultivo. En el tejido tumoral, la expresión de RA no se ve influenciada por la adición de DHT. En todas las condiciones de cultivo se expresan los marcadores epiteliales basales CK14, CK5 y p63. El supuesto marcador de células madre LGR5 se expresa en condiciones ENRF en tejido normal. En el tejido tumoral, la expresión de LGR5 se induce con la adición de DHT en todas las condiciones de cultivo. TNFRSF19, también un supuesto marcador de células madre, se expresa en todas las condiciones en tejido normal y tumoral. El factor de transcripción específico de próstata NKX3.1 se expresa en todas las condiciones. La adición de testosterona aumenta el crecimiento/duplicación mientras mantiene marcadores para los diferentes tipos de células de la próstata (basal y luminal).
Fig. 44(b): Dos imágenes representativas de organoides humanos cultivados en condiciones ENRF+ lnM DHT Carril 1: Línea 1 ENRF Tejido normal
Carril 2: Línea 1 ENRF 1 nM DHT Tejido normal
Carril 3: Línea 2 WENRF Tejido normal
Carril 4: Línea 2 WENRF Dh T 1 nM Tejido normal
Carril 5: Línea 3 ENR Tejido normal
Carril 6: Línea 3 ENR D<h>T 1 nM Tejido normal
Carril 7: Próstata completa Tejido normal
Carril 8: H<2>O
Carril 9: Línea 1 ENRF Tejido tumoral
Carril 10: Línea 1 ENRF 1 nM DHT Tejido tumoral
Carril 11: Línea 2 WENRF Tejido tumoral
Carril 12: Línea 2 WENRF 1 nM DHT Tejido tumoral
Carril 13: Línea 3 ENR Tejido tumoral
Carril 14: Línea 3 ENR 1 nM DHT Tejido tumoral
Carril 15: Tejido tumoral de próstata completo
Carril 16: H<2>O
Figura 45. PCR de organoide de próstata de ratón
Se cultivaron tres líneas biológicamente independientes en condiciones ENR o ENR DHT 1 nM. Se aisló ARN y se realizó RT-PCR para marcadores del epitelio prostético. En ambas condiciones de cultivo, los marcadores luminales de próstata citoqueratina 18 (CK18) y citoqueratina 8 (CK8) se expresan ampliamente. El receptor de andrógenos (RA) se expresa en ambas condiciones. Los marcadores basales p63 y citoqueratina 5 (CK5) se expresan en ambas condiciones de cultivo, pero tras la adición de DHT los marcadores basales se regulan negativamente. Los marcadores putativos de células madre Lgr5 y Tnfrsf19 se regulan negativamente al agregar DHT. Sin embargo, en estas condiciones la potencia se mantiene mientras que también estén presentes células diferenciadas. Estas condiciones permiten una expansión celular ilimitada (por ahora 9 meses con una población que se duplica 2,5 por semana). Todos los cultivos son positivos para el marcador específico de próstata Nkx3.1. La adición de testosterona aumenta el crecimiento/duplica hasta 3 veces mientras mantiene marcadores para los diferentes tipos de células de la próstata (basal y luminal).
Carril 1: Línea 1 ENR
Carril 2: Línea 1 ENR 1 nM DHT
Carril 3: Línea 2 ENR
Carril 4: Línea 2 ENR 1 nM DHT
Carril 5: Línea 3 ENR
Carril 6: Línea 3 ENR 1 nM DHT
Carril 7: Próstata entera de ratón
Carril 8: H<2>O
Figura 46: Organoides del estómago (gástrico)
Organoides del estómago humano. Se aisló tejido del corpus. Las células se cultivaron en el medio organoide del estómago (EGF, Noggin, R-espondina, Wnt, Nicotinamida, FGF10, Gastrina, inhibidor de TGF-beta (A8301). Las células se dividen semanalmente.
Fig. 46(a): Esta fotografía fue tomada después de 2 meses de cultivo.
Fig. 46(b): Tinción con H&E y diferentes anticuerpos después de la fijación y corte en parafina de un cultivo después de 2 semanas de cultivo. Muestra la presencia de las siguientes células: PAS para células productoras de mucina; Muc5Ac para células de las fosas mucosas superficiales; Muc6 para células mucosas del cuello. La tinción H&E muestra una única capa de epitelio polarizado.
Figura 47: Aislamiento de tejido prostático
Ver ejemplo 8 (Fotos de UCSF)
Figura 48:A) Se cultivaron organoides de ratón en presencia de diferentes dosis de RANKL de ratón recombinante durante 72 h. Los niveles de expresión de ARNm para RANK, el factor de transcripción SpiB y los marcadores específicos de células M GP2 y AnexinaV se determinaron mediante qPCR. B) Análisis confocal de la expresión de GP2 (véase flecha) y AnexinaV (véase flecha) en organoides de ratón cultivados con 100ng/ml RANKL durante 72 h.
Figura 49: Se cultivaron organoides humanos en presencia de diferentes dosis de RANKL humano recombinante durante 7 días. Los niveles de expresión de ARNm para RANK, SipB y el marcador GP2 específico de células M se determinaron mediante qPCR. ME: Medio de expansión; MD: medio de diferenciación.
EJEMPLO 1:
Para abordar la necesidad de medios y métodos de cultivo mejorados para células madre epiteliales humanas, los inventores investigaron vías de señalización que se sabe que están subvertidas en ciertos cánceres, por ejemplo cáncer colonrectal. Se planteó la hipótesis de que estas vías, que afectan el destino celular en el cáncer, también pueden desempeñar un papel en la determinación del destino celular en condiciones de cultivo celularin vitro.
En un primer experimento de detección, se probaron una serie de vitaminas, hormonas y factores de crecimiento en combinación con medios de cultivo de células madre estándar. Se identificó que la gastrina y la nicotinamida daban como resultado condiciones de cultivo significativamente mejoradas. Al incorporar estos factores en las condiciones de cultivo estándar, se realizó un segundo experimento de detección, en el que se probaron ciertos inhibidores de moléculas pequeñas relacionados con vías de señalización relevantes, como ERK, p38, JNK, PTEN, ROCK y Hedgehog. En el estado actual de la técnica, no habría forma razonable de predecir cuál sería el resultado de cada uno de estos compuestos adicionales sobre las propiedades del medio de cultivo.
Tabla 2:Lista de reactivos utilizados para la optimización del cultivo de organoides intestinales humanos
En resumen, los inventores han establecido condiciones de cultivo a largo plazo bajo las cuales criptas individuales o células madre derivadas del intestino delgado (ID) murino se expanden durante largos períodos de tiempo. Las criptas en crecimiento sufren múltiples eventos de fisión de criptas, al mismo tiempo que generan dominios epiteliales similares a vellosidades en los que están presentes todos los tipos de células diferenciadas. Los inventores ahora han adaptado las condiciones de cultivo para cultivar organoides epiteliales similares a partir de colon de ratón y ID y colon humanos. Basándose en el sistema de cultivo de intestino delgado murino, los inventores optimizaron el sistema de cultivo de colon humano y murino. Descubrieron que la adición de Wnt3A al cóctel de factores de crecimiento permitía que las criptas del colon del ratón se expandieran indefinidamente. La adición adicional de nicotinamida, una molécula pequeña inhibidora de Alk y un inhibidor de p38 era preferible para el cultivo de colon y ID humano a largo plazo. El sistema de cultivo también permitió el crecimiento de adenomas de Apcmin murinos, cáncer colorrectal humano y epitelio de Barrett metaplásico esofágico humano. La tecnología de cultivo debería ser ampliamente aplicable como herramienta de investigación para patologías infecciosas, inflamatorias y neoplásicas del tracto gastrointestinal humano. Además, las aplicaciones regenerativas pueden resultar factibles con epitelios intestinales expandidosex vivo.La autorrenovación del epitelio del intestino delgado y del colon está impulsada por la proliferación de células madre y sus progenitores ubicados en las criptas. Aunque se han descrito múltiples sistemas de cultivo (Evans GS et al. J Cell Sci 1992;101 (Parte 1 ):219-31; Fukamachi H. J Cell Sci 1992;103 (Parte 2):511-9; Perreault N y Jean-Franpois B. Exp Cell Res 1996;224:354-64; Whitehead RH y cols. Gastroenterology 1999;117:858-65), sólo recientemente se han puesto a disposición sistemas de cultivo a largo plazo que mantienen la fisiología básica de las criptas. Se publicaron dos protocolos diferentes que permiten la expansión a largo plazo del epitelio del intestino delgado murino. Kuo y sus colegas demostraron el crecimiento a largo plazo de pequeños fragmentos que contienen elementos epiteliales y estromales de forma independiente del factor de crecimiento (Ootani A et al. Nat Med 2009;15:701-6). Los inventores diseñaron un sistema de cultivo para células madre individuales combinando conocimientos previamente definidos sobre los requisitos de crecimiento del epitelio intestinal. La señalización Wnt es un requisito fundamental para la proliferación de criptas (Korinek V et al. Nat Genet 1998;19:379-83; Pinto D et al. Genes Dev 2003;17:1709-13; Kuhnert Fetal. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2004;101:266-71) y el agonista de Wnt R-espondina 1 induce una dramática hiperplasia de las criptasin vivo(Kim KA et al. Science 2005;309:1256-9). En segundo lugar, la señalización del EGF está asociada con la proliferación intestinal (Dignass AU & Sturm A. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001;13:763-70). En tercer lugar, la expresión transgénica de Noggin induce la expansión del número de criptas (Haramis AP et al. Science 2004;303:1684-6). Cuarto, las células intestinales aisladas sufren anoikis fuera del contexto del tejido normal (Hofmann C et al. Gastroenterology 2007;132:587-600). Dado que la laminina (a l y a2) está enriquecida en la base de la cripta (Sasaki T et al. Exp Cell Res 2002;275:185-), los inventores exploraron Matrigel rico en laminina para apoyar el crecimiento epitelial intestinal. Los cultivos basados en Matrigel se han utilizado con éxito para el crecimiento del epitelio mamario (Stingl J et al. Breast Cancer Res Treat 2001;67:93-109). Bajo esta condición de cultivo (R-espondinal, e Gf y Noggin en Matrigel), los inventores obtuvieron organoides del intestino delgado en constante expansión, que mostraban todas las características del epitelio del intestino delgado en términos de arquitectura, composición del tipo celular y dinámica de autorrenovación.
A pesar de grandes esfuerzos, el cultivo de células epiteliales intestinales humanas adultas a largo plazo sigue siendo difícil. Ha habido algunos modelos de cultivo a largo plazo, pero estas técnicas y líneas celulares no han obtenido una amplia aceptación, posiblemente como resultado de dificultades técnicas inherentes a la extracción y mantenimiento de células viables (Rogler G et al. Scandinavian journal of gastroenterology 2001;36:389-98; Buset M et al. In vitro cellular & developmental biology: journal of the Tissue Culture Association 1987;23:403-12; Whitehead RH et al. In vitro cellular & developmental biology: journal of the Tissue Culture Association 1987;23:436-42; Deveney CW et al. The Journal of surgical research 1996;64:161-9; Pang G et al. Gastroenterology 1996;111:8-18; Latella G et al. International journal of colorectal disease 1996;11:76-83; Panja A. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 2000;80:1473-5; Grossmann J et al. European journal of cell biology 2003;82:262-70). Alentados por el establecimiento de un cultivo de intestino delgado murino, los inventores se propusieron adaptar las condiciones de cultivo al epitelio del colon humano y de ratón. Los inventores informan ahora del establecimiento de protocolos de cultivo a largo plazo para epitelio de colon humano y murino, que pueden adaptarse al adenoma/adenocarcinoma de colon primario y al esófago de Barrett.
Resultados
Establecimiento de un sistema de cultivo de colon de ratón
En un intento de establecer un sistema de cultivo de colon de ratón, los inventores exploraron nuestra condición de cultivo del intestino delgado (aquí denominada ENR: EGF+Noggin+R-espondina). En nuestra experiencia, el crecimiento inicial del epitelio del colon a menudo se observa en la condición de cultivo ENR, pero invariablemente es abortivo. La formación de organoides se estudió utilizando epitelio aislado de la parte distal del colon de ratón. En condiciones de ENR, la eficacia de la colocación de placas de criptas colónicas distales únicas fue mucho menor que la del intestino delgado (1 -3 % frente a >90 %) y estos organoides no pudieron pasar. Recientemente, los inventores han demostrado que las células de Paneth producen varios ligandos Wnt (Gregorieff A et al. Gastroenterology 2005;129:626-38), y que la producción de Wnt por estas células de Paneth es esencial para mantener las células madre intestinales (Sato T et al. Nature; 469:415-8). Para determinar el estado de señalización de Wnt en organoides de colon, los inventores cultivaron criptas de colon de ratones Axin2-lacZ (un fiel reportero de Wnt) (Lustig B et al. Mol Cell Biol 2002;22:1184-93) o ratones knock-in Lgr5-GFP (siendo Lgr5 un marcador de células madre dependiente de Wnt) (Barker N et al. Nature 2007;449:1003-7).
Las criptas de colon recién aisladas expresaron fácilmente Axin2-LacZ o Lgr5-GFP en su parte inferior, pero perdieron la expresión de los reporteros Wnt poco después del inicio del cultivo (Figura1a,byFig. 6). Por el contrario, los organoides del intestino delgado expresaron constitutivamente los reporteros Wnt en sus estructuras en ciernes (Sato T et al. Nature; 469:415-8; Sato T et al. Nature 2009;459:262-5). Estos resultados sugirieron que los organoides del colon producen cantidades insuficientes de ligandos Wnt para mantener las células madre del colon. Para superar esto, los inventores añadieron Wnt3a recombinante o medio condicionado Wnt3a al medio de cultivo ENR (medio WENR). Esto aumentó la eficiencia del revestimiento de las criptas en unas 10 veces. Las criptas de colon formaron estructuras organoides con numerosos brotes Axin2-LacZ (Figura1a) o Lgr5-GFP+ (Figura1b), lo que implica que se restableció la activación de Wnt. Las criptas de colon recién aisladas contienen células completamente maduras en sus partes superiores, y los inventores razonaron que estas células maduras pueden interferir con el crecimiento de los organoides. Cuando los inventores digirieron levemente las criptas de colon en pequeños grupos de células, separando así físicamente los fondos de las criptas proliferativas de las regiones diferenciadas de las criptas superiores, la mayoría de los fragmentos derivados de la parte superior de la cripta murieron, sin embargo, los grupos de células de la base de las criptas de colon formaron organoides de manera eficiente (Figura1c).
El epitelio del intestino delgado de ratón cultivado en condiciones ENR genera todos los tipos de células epiteliales diferenciadas concomitantes con la autorrenovación de las células madre. Los inventores han demostrado previamente que la adición de Wnt3A a estos cultivos interfiere con la diferenciación intestinal y produce organoides que consisten en gran medida en progenitores indiferenciados (Sato T et al. Nature; 469:415-8). Esto no es inesperado dado el papel central de la señalización Wnt en el mantenimiento del estado indiferenciado del progenitor de la cripta (van de Wetering Metal. Cell 2002;111:241-50). De acuerdo con esta observación, los organoides colónicos en condición WENR no lograron diferenciarse adecuadamente. Tras la retirada de Wnt-3A, los inventores observaron diferenciación a lo largo de todos los linajes epiteliales (Figura1d-f). Es de notar que las células madre epiteliales del colon Lgr5+ de clasificación única pueden formar organoides cuando se cultivan en presencia de Y-27632 durante los primeros dos días.
Establecimiento del sistema de cultivo de colon humano
Alentados por el éxito del cultivo mejorado de criptas de colon de ratón, los inventores aplicaron la condición de cultivo a las criptas de colon humano. Aunque estas criptas sobrevivieron inicialmente, la mayoría se desintegró posteriormente en 7 días. Para aumentar la eficacia del recubrimiento de las criptas del colon humano, los inventores seleccionaron factores de crecimiento, hormonas y vitaminas candidatos (lista en laFig. 12). Entre estos, los inventores encontraron que la gastrina y la nicotinamida (precursoras de NAD+, y que suprimen la actividad de la sirtuina (Denu JM. Trends Biochem Sci 2005;30:479-83)) mejoró la eficiencia del cultivo (Fig. 12). El efecto de la gastrina sobre la eficiencia del recubrimiento fue marginal. Sin embargo, la hormona no interfirió con la diferenciación intestinal y decidimos incluir gastrina (en adelante abreviada como 'g') en todas las condiciones de cultivo intestinal humano. Es importante destacar que la nicotinamida (10 mM) fue esencial para la prolongación del período de cultivo más allá de los 7 días iniciales (Figura2 a). En esta condición de cultivo, los organoides del colon humano podrían expandirse durante al menos 1 mes. A partir de 1 mes, los organoides colónicos cambiaron su morfología de estructura de organoides en gemación a estructuras quísticas (Figura2b izquierda). Coincidiendo con la conversión morfológica, la proliferación disminuyó progresivamente. Ocasionalmente, los organoides quísticos recuperaron su potencial proliferativo. Sin embargo, todos los organoides finalmente detuvieron el crecimiento en 3 meses. Se ha observado una detención del crecimiento en dos fases en otros sistemas de cultivo primario, como las células epiteliales mamarias o los queratinocitos, y se ha denominado etapa de mortalidad 1 (M1; senescencia) y etapa de mortalidad 2 (M2; crisis) (Shay et al., 2006). No se observó diferenciación de múltiples linajes en los organoides intestinales humanos cultivados en esta condición incluso después de la retirada de Wnt (datos no mostrados).
Los inventores supusieron que la detención del crecimiento se produjo debido a condiciones de cultivo inadecuadas más que a una propiedad intrínseca de la célula de senescencia/envejecimiento replicativo. Por lo tanto, los inventores ampliaron nuestros intentos para optimizar las condiciones de cultivo. Los inventores seleccionaron varias moléculas pequeñas moduladoras de mAp quinasas, de moléculas de señalización mutadas en cáncer de colon y de modificadores de histonas (Fig. 12) en la condición de cultivo WENR+gastrina+nicotinamida. Los inventores descubrieron que dos inhibidores de molécula pequeña, A83-01 (inhibidor de Alk4/5/7; nM) y SB202190 (inhibidor de p38; 10 uM) mejoraron significativamente la eficiencia del recubrimiento. Otros inhibidores del receptor 1 de TGF-beta (ALK 5) que también se probaron y mostraron los mismos resultados que A83-01 fueron LY364947, SB431542, SB505124. Se esperaría que otros inhibidores de ALK también funcionaran de la misma manera. Además, la combinación de los dos compuestos prolongó sinérgicamente el período de cultivo. Los inventores demostraron que las diez muestras probadas se expandieron durante al menos 6 meses con una división semanal de 1:5. Bajo esta condición de cultivo, los organoides del colon humano mostraron estructuras organoides en ciernes, en lugar de las estructuras quísticas observadas en la condición de cultivo anterior (Figura2 b). Las células en proliferación se limitaron a las yemas (Figura2 c). Las diseminaciones en metafase de organoides de más de 3 meses revelaron consistentemente 46 cromosomas en cada célula (20 células cada una de tres donantes diferentes;F ig u ra 2 d). Los inventores secuenciaron todo el exorne (todos los exones) de los organoides del colon después de dos meses en cultivo. El número de mutaciones en los organoides fue extremadamente bajo. De hecho, en cuatro cultivos organoides paralelos procedentes de un clon, sólo se encontró una mutación que estaba presente en todos los cultivos y, por lo tanto, probablemente se originó en el tejido parental.
Estos resultados implicaron que el receptor Alk y la señalización de p38 regulan negativamente el mantenimiento a largo plazo de las células epiteliales intestinales humanas. Los inventores se refieren a la condición de cultivo optimizada como condición HISC (cultivo de células madre intestinales humanas).
O rg a n o id e s in te s tin a le s h u m an o s im itan la d ife re n c ia c ió n in vivo
En la condición HISC, los inventores no pudieron observar células diferenciadas. Como se observó en los organoides de colon de 3 ratones, se requirió la retirada de Wnt para la diferenciación de enterocitos maduros en organoides humanos (Figura3a, panel s u p e rio r y F ig .7). Sin embargo, la diferenciación de células caliciformes y enteroendocrinas permaneció bloqueada. Descubrimos que la nicotinamida y SB202190 inhibieron fuertemente esta diferenciación, mientras que la retirada de los dos reactivos permitió a los organoides producir células caliciformes y enteroendocrinas maduras (Figura3 a (p an e l ce n tra l e in fe rio r), 3b y F ig . 7.Se observaron los mismos efectos inhibidores de la diferenciación de Wnt, Nicotinamida y SB202190 en organoides del intestino delgado humano. Se observaron células lisozima Paneth en organoides del intestino delgado, pero no en organoides del colon (Figura 3d). Se ha informado que el tratamiento con inhibidor de p38in vivoinhibe la diferenciación de las células caliciformes y aumenta la proliferación epitelial intestinal (Otsuka M. Gastroenterology 2010;138:1255-65, 1265 e1-9). De hecho, los inventores observaron el mismo fenotipo en los organoides intestinales tratados con inhibidor de p38 (Figura3d vs . e). Los inventores examinaron además la respuesta de los organoides intestinales humanos a la inhibición de Notch. Los inventores han demostrado previamente que la inhibición de Notch con inhibidores de la y-secretasa (dibenzazepina; DBZ) o mediante el direccionamiento condicional del factor de transcripción de la vía de Notch CSL agotó las células madre intestinales, terminó la proliferación epitelial intestinal e indujo hiperplasia de células caliciformesin vivo(van Es JH et al. Nature 2005;435:959-63). De hecho, tras el tratamiento con DBZ, los organoides intestinales cesaron su proliferación y la mayoría de las células se convirtieron en células caliciformes en 3 días (Figura3g vs f).
E s ta b le c im ie n to d e a d e n o m a d e fic ie n te en A P C y a d e n o c a rc in o m a d e co lon
Recientemente, los inventores informaron sobre la formación eficiente de adenoma intestinal de ratón a partir de células madre Lgr5 en ratonesLgr5-GFP-ires-CreERT2 x APCflox/flaxtras la activación de Cre inducida por tamoxifeno (Barker N et al. Genes Dev 2008;22:1856-64). Los inventores aislaron los adenomas intestinales 10 días después de la inducción y optimizaron las condiciones de cultivo. Los adenomas formaron eficientemente una estructura organoide quística sin gemación. Dado que la pérdida de APC activa constitutivamente la vía Wnt, los inventores esperaban que R-espondina 1 fuera prescindible para el crecimiento organoide del adenoma. De hecho, esto se observó. Además, Noggin, que es esencial para el cultivo a largo plazo del intestino delgado normal, era prescindible en los organoides de adenoma. Curiosamente, los inventores observaron una pérdida de Lgr5-GFP pero no de Axin2-LacZ en organoides adenomatosos 7 días después de la retirada de Noggin (Figura4 a ,by datos no mostrados). Se hicieron observaciones similares para organoides intestinales normales cuando se cultivaron en medio ER (Sato T et al. Nature 2009;459:262-5). Esto indicó que Noggin, probablemente a través de la inhibición de las señales de BMP, es necesario para mantener la expresión de Lgr5, pero no para la expansión de los organoides del adenoma. Las células Lgr5alto (pero no Lgr5bajo) recién aisladas de criptas intestinales pueden iniciar el crecimiento organoidein vitro(Sato T et al. Nature 2009;459:262-5). Para determinar la existencia de una jerarquía Lgr5 similar dentro de los adenomas, los inventores aislaron células Lgr5-GFPalto, GFPbajo y Qppve de organoides cultivados en EN y examinaron su capacidad de formación de organoides. Después de un cultivo de 7 días, Lgr5-GFPalto mostró la mayor eficiencia de formación de organoides. Sin embargo, Lgr5-GFPbajo o -ve también formó 128 organoides con una eficiencia considerable (Figura4 c). Es de destacar que las células de adenoma GFP've clasificadas podrían dar lugar a organoides Lgr5-GFPalto ((Fig. 8)).
En las últimas cuatro décadas se han aislado muchas líneas celulares de cáncer colorrectal. Normalmente, estas líneas celulares surgen como excrecencias clonales raras después de que los cultivos primarios de tumores de colon entran en crisis de cultivo de tejidos. Actualmente, no existe ningún sistema de cultivo sólido que permita el cultivo consistente de muestras primarias de cáncer de colon humano sin crisis de cultivo y el consiguiente crecimiento clonal de células adaptadas al cultivo. Como siguiente paso, los inventores aplicaron condiciones de cultivo de adenoma intestinal a muestras de cáncer colorrectal humano. Como era de esperar, las células de cáncer de colon no requirieron ni R-espondina ni Noggin. El EGF fue prescindible en la mayoría de los organoides del cáncer de colon, mientras que algunos organoides del cáncer de colon desaceleraron su proliferación después de la retirada del EGF. A diferencia del adenoma intestinal de ratón, los organoides de cáncer colorrectal en la condición de cultivo crecieron como estructuras compactas irregulares en lugar de estructuras quísticas simples (Figura4d).
Los inventores examinaron el estado de proliferación/diferenciación de organoides de adenoma y cáncer de colon. Como era de esperar, la mayoría de las células eran Ki67+. De acuerdo con el fuerte efecto inhibidor de Wnt sobre la diferenciación de enterocitos (Figura1f y Fig. 7), no se observó tinción con fosfatasa alcalina en ambos tipos de organoides (Fig. 9). Por el contrario, ocasionalmente observamos células caliciformes PAS+ y células endocrinas de cromogranina A+ en organoides de adenoma y en algunos organoides de cáncer de colon (Fig. 9).
Cultivo del epitelio metaplásico de Barrett humano
El esófago de Barrett se caracteriza por la presencia de epitelio columnar en la parte inferior del esófago, que reemplaza el epitelio de células escamosas normal como resultado de la metaplasia (Odze RD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2009;6:478-90). La característica histológica del esófago de Barrett es la presencia de células caliciformes intestinales en el esófago. Aprovechando la similitud entre Barrett y el epitelio intestinal, los inventores sometieron pequeñas biopsias del epitelio de Barrett (BE) a condiciones de cultivo de colon humano. En estas condiciones de cultivo, las células escamosas esofágicas normales proliferaron transitoriamente durante 1 semana, pero no se pudo pasar los organoides. El epitelio del esófago de Barrett podría mantenerse hasta por 1 mes en condiciones HISC (Figura5a). Los organoides BE formaron estructuras organoides quísticas indistinguibles de las de los organoides senescentes del colon humano y, por lo general, sufrieron una detención del crecimiento 1 mes después del cultivo. La adición de FGF10 a la condición HISC permitió a los organoides BE formar estructuras en gemación y prolongó significativamente la duración del cultivo (> 3 meses) (Figura5 b, c). A diferencia de los organoides intestinales humanos, los organoides BE permanecieron Ki67+ con un número mínimo de células PAS+ y Mucina+ 4 días después de la retirada de nicotinamida y SB202190. El tratamiento con el inhibidor de la secretasa y DBZ (10 uM) durante 4 días después de la retirada bloqueó la proliferación e indujo la diferenciación de las células caliciformes (Fig. 5 d-g). Esto apoyó nuestra sugerencia anterior de que la administración local de dichos inhibidores puede representar una estrategia terapéutica útil para la eliminación de las lesiones del esófago de Barrett mediante terapia de diferenciación (Menke V et al. Disease models & mechanisms 2010;3:104-10). Es de destacar que ocasionalmente observamos células de Lisozima+ Paneth (Fig. 10), lo que indica que los organoides BE preservan la diferenciación multilinaje.
Discusión
Los protocolos desarrollados aquí permiten un cultivo sólido y a largo plazo de células epiteliales humanas primarias aisladas del intestino delgado, colon, adeno(carcino)mas y esófago de Barrett (tabla 3).
Tabla 3:Lista de componentes de los sistemas de cultivo de organoides
(Continuación)
Todas las soluciones madre y Matrigel alicuotado se almacenan en -20 °C
A diferencia del intestino delgado murino, las células epiteliales del colon murino requieren ligando Wnt en el medio de cultivo. Los inventores han informado previamente que las células CD24alto Paneth producen Wnt-3/11, que son esenciales para el mantenimiento de las células madre en el intestino delgado (Sato T, et al. Nature 2011;469:415-8). Los ARNm de Wnt-6 y -9b se expresan en el fondo de las criptas del colon (Gregorieff A, et al. Gastroenterology 2005;129:626-38.). Aún no se ha determinado si esta producción local de Wnt por parte de las células base de la cripta del colon es suficiente para activar la señal Wnt canónicain vivoo si existe otra fuente de ligando Wnt en la mucosa del colon. La diferencia entre las condiciones de cultivo de organoides intestinales humanos y de ratón fue inesperadamente grande. A83-01 inhibe ALK4/5/7, receptores que se detectan en criptas tanto murinas como humanas mediante microarrays. Los inventores están investigando actualmente el mecanismo por el cual la señal ALK regula el crecimiento de organoides humanos. Los inventores no han observado transformación celular en cultivos a largo plazo y no se hacen evidentes cambios cromosómicos en las condiciones de cultivo optimizadas. Además, los organoides pueden sufrir un número considerablemente mayor de división celular que el reportado para otros sistemas de cultivo epitelial humano adulto (Dey D et al. PloS one 2009;4:e5329; Garraway IP et al. The Prostate 2010;70:491-501). Generalmente se cree que las células somáticas están inherentemente limitadas en su capacidad proliferativa, un fenómeno llamado envejecimiento replicativo (Walen KH. In vitro cellular & developmental biology. Animal 2004;40:150-8). Se cree que la mayoría de las células humanas normales cuentan el número de veces que se han dividido y eventualmente sufren una detención del crecimiento denominada senescencia celular. Este proceso puede desencadenarse por el acortamiento de los telómeros y la consiguiente activación de señales de daño del ADN (M1) o desgaste de los telómeros (M2). En ausencia de los dos inhibidores de la quinasa de molécula pequeña, los organoides intestinales humanos sufrieron una detención del crecimiento después de 10 a 20 duplicaciones de población. Por el contrario, la capacidad replicativa en la condición de cultivo optimizada se extendió al menos hasta 100 duplicaciones de la población tras la adición de los inhibidores, lo que superó el límite de Hayflick (Hayflick L. The Journal of investigative dermatology 1979;73:8-14). Este resultado indica claramente que el fenotipo senescente observado en el primer sistema de cultivo refleja condiciones de crecimiento inadecuadas, en lugar de un envejecimiento replicativo inherente.
Las técnicas de cultivo se pueden utilizar para estudiar aspectos básicos de la biología de las células madre y el control de la diferenciación, ejemplificado por el agotamiento de las células madre y la diferenciación de las células caliciformes tras el tratamiento con inhibidores de Notch. Además, la plataforma de cultivo de organoides se puede utilizar para estudios farmacológicos, toxicológicos o microbiológicos sobre patologías del tracto intestinal, ya que los organoides representan más estrechamente el epitelio intestinal que las líneas celulares de cáncer de colon de uso frecuente, como CaCo2 o DLD1. Por último, dado que pequeñas biopsias tomadas de donantes adultos pueden ampliarse sin ningún límite aparente ni daño genético, la tecnología puede servir para generar epitelio trasplantable con fines regenerativos.
EJEMPLO 2 - Cultivo de organoides pancreáticos de ratón
También se probó el uso de un inhibidor de TGF-beta en un medio de cultivo para organoides pancreáticos de ratón. El medio de expansión que se utilizó fue medio DMEM/F12 (complementado con P/S, Glutamax, 10mM Hepes, B27, N2 y N-Acetilcisteína), EGF (50 ng/ml), R-espondina (10 %), Noggin (100ng/ml), FGF10 (100ng/ml), A8301 (inhibidor de TGF-beta, 500 nM) y gastrina (100ng/ml). Esto difiere ligeramente del cultivo HISC descrito anteriormente usado en el Ejemplo 2 en que no hay ningún agonista de Wnt (aparte de R-espondina) o nicotinamida y se añade FGF10. Sin embargo, estos medios de cultivo comparten una serie de componentes clave (ENR gastrina inhibidor de TGF-beta), siendo ventajosa la adición del inhibidor de TGF-beta en ambos casos. Los organoides de páncreas cultivados en estas condiciones podrían expandirse durante > 3 meses y pasarse al menos 5 veces.
Se llevaron a cabo experimentos de micromatrices para los organoides de páncreas cultivados en el medio de expansión descrito anteriormente y los resultados se compararon con el páncreas adulto, el hígado adulto y el hígado recién nacido (véase Figura 16A). El organoide del páncreas se agrupa claramente con el páncreas adulto, en lugar de con las muestras de hígado, lo que demuestra una buena similitud fenotípica con el páncreas adulto.
La Figura 16B muestra la señal sin procesar del experimento de microarray que compara los niveles de expresión en organoides de páncreas, páncreas adulto, hígado adulto y organoides hepáticos para marcadores ductales, marcadores endocrinos y factores de transcripción necesarios para la expresión de Ngn3 (Ngn3 es un factor de transcripción que está asociado con la especificación de linajes endocrinos). Los altos niveles de expresión de Krt19, Krt7 y otros marcadores ductales en los organoides del páncreas muestran que los organoides del páncreas tienen claramente un fenotipo ductal. Estos organoides pancreáticos se cultivaron originalmente a partir de preparaciones ductales. Los factores de transcripción esenciales para la expresión de Ngn3 (Foxa2, Hnf6, HNF1 b, Sox9) también se expresaron en los organoides del páncreas, aunque la expresión de Ngn3 en sí no se detectó en condiciones de expansión.
Los niveles de expresión de genes importantes para la generación de células productoras de insulina son bajos. Sin embargo, está claro que en el medio de expansión, los patrones de proliferación y expresión de los organoides pancreáticos se parecen mucho a los observados en las células endocrinas progenitoras tempranas.
El páncreas está formado principalmente por tres tipos de células diferentes: células acinares, células ductales y células endocrinas. En una muestra de ARN total de páncreas adulto, el 90 % del ARN procede de células acinares, por lo que los niveles de expresión de marcadores endocrinos están muy diluidos en una muestra de páncreas total. Por lo tanto, se planean más experimentos para cada tipo de célula específico. Por ejemplo, los inventores planean llevar a cabo una comparación de micromatrices entre organoides de páncreas, preparación de células acinares enriquecida, preparación de células ductales enriquecida y preparación de células endocrinas enriquecida, para tener una mejor estimación de los niveles de ARNm de los genes importantes en nuestros organoides de páncreas en comparación con los niveles presentes en las células productoras de insulina. Por ejemplo, en una muestra de células endocrinas enriquecida, el 75-85 % de las células presentes serían células secretoras de insulina).
EJEMPLO 3: El efecto de Noggin en el medio de expansión
Para investigar el papel del inhibidor de BMP, Noggin, en el medio de expansión, los inventores compararon los niveles de ARNm de marcadores endocrinos tempranos y marcadores ductales en organoides pancreáticos que siempre se han cultivado en medio EGFRA. por lo que nunca se han cultivado en presencia de Noggin con el nivel de expresión de los mismos marcadores en organoides que siempre se han cultivado en medio EGFRAN (es decir siempre en presencia de Noggin). Los inventores también compararon los niveles de ARNm de estos marcadores en organoides pancreáticos a los que se añadió o eliminó Noggin de los cultivos, respectivamente. Específicamente, se cultivó una muestra de organoides pancreáticos en medio EGFRA y luego se añadió Noggin y los organoides se cultivaron durante 2 o 4 días más. Se cultivó otra muestra de organoides pancreáticos en medio EGFRAN y luego se eliminó Noggin y los organoides se cultivaron durante 2 o 4 días más. Se comparó la expresión génica y los resultados se muestran en la Figura 17A. Se encontró que Noggin reduce la expresión de queratina 7 y queratina 19 (marcadores ductales) mostrando que Noggin bloquea la diferenciación hacia el fenotipo ductal (los niveles de queratina en las muestras blancas y gris oscuro son más bajos que en las muestras negras). Niveles de expresión de algunos factores de transcripción esenciales para la generación de células productoras de insulina (es decir, Sox9, Hnf6, HNF1 a, Pdx1, Nkx2.2, Nkx6.1 y HNF1b) no se vieron afectados por Noggin. Aunque Noggin evita que los cultivos adquieran un fenotipo ductal completo, lo que probablemente impedirá la futura diferenciación en células productoras de insulina, los inventores incluyen Noggin en el medio de expansión porque permite que las células se expandan mientras mantienen algunas características ductales en combinación con características de células precursoras de producción de insulina.
El efecto de la presencia o ausencia de Noggin, o su adición o retirada al medio EGFRA sobre la expresión del gen Lgr5 se evaluó utilizando organoides pancreáticos obtenidos de conductos pancreáticos. Los resultados de la Figura 17B muestran que los organoides de páncreas cultivados con Noggin expresan 2 veces más Lgr5 que los organoides de páncreas cultivados sin Noggin (compárese la segunda barra blanca desde la izquierda con la barra negra a la izquierda). También se demostró que la adición (gris oscuro) o la retirada (gris claro) de Noggin afecta los niveles de Lgr5. No está claro si el aumento en la expresión del gen Lgr5 en presencia de Noggin se debe a un mayor número de células Lgr5+ o a un mayor nivel de expresión de Lgr5 por célula. Sin embargo, los presentes inventores muestran aquí que los inhibidores de BMP, como Noggin, promueven la expresión de Lgr5 y, por lo tanto, dan como resultado organoides más proliferativos. Por tanto, se ha demostrado que los inhibidores de BMP son un componente ventajoso de los medios de expansión.
Esto es sorprendente, porque en la literatura se describe que la actividad de BMP es útil para el cultivo de diferenciación de células pancreáticas. Esta conclusión se basa en las observaciones de que la señalización de BMP es necesaria para la diferenciación en células ductales (véase expresión de queratina 7 y 19) y endocrinas. Por tanto, el experto esperaría que la inclusión de un inhibidor de BMP, tal como Noggin, fuera desventajosa en un medio de expansión. Sin embargo, los inventores descubrieron sorprendentemente que el uso de un inhibidor de BMP era ventajoso porque daba como resultado organoides más proliferativos y una mayor expresión de Lgr5.
EJEMPLO 4 - Trasplante de organoides pancreáticos humanos debajo de la cápsula renal en ratones
Se trasplantaron organoides pancreáticos, que se habían expandido usando el protocolo descrito en el ejemplo 1 (véase Figura 18A), debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes.
Justo antes del trasplante, los organoides se trataron con una solución de recuperación celular (BD#354253, BD Biosciences) para eliminar los residuos de matrigel. Los organoides se lavaron varias veces con PBS y se sedimentaron.
El trasplante de estos organoides debajo de la cápsula renal de receptores inmunodeficientes se llevó a cabo utilizando un procedimiento recomendado por los NIH para el trasplante de islotes debajo de la cápsula renal (“Purified Human Pancreatic Islets, In vivo Islets Function”, Documento N° 3104, A04, fecha de vigencia 7 de julio de 2008, DAIT, NIAID, NIH). Una semana antes del trasplante, se indujo químicamente hiperglucemia en los ratones receptores (NOD/SCID/IL2RgammaKO también conocido como n Sg ) con una inyección de estreptozotocina en dosis alta de 130 mg/kg. Se controlaron los niveles de glucosa en sangre y los ratones que tenían un nivel de glucosa en sangre superior a 18 mmol/l se consideraron hiperglucémicos.
Para el trasplante, se anestesió al receptor hiperglucémico y se realizó una pequeña incisión en el flanco izquierdo para exponer el riñón izquierdo. Se recogieron aproximadamente 2,5 - 3,0 mm3 de organoides en un tubo de trasplante PESO siliconado y se trasplantaron debajo de la cápsula renal usando una jeringa Hamilton. Después de cauterizar la cápsula dañada, el riñón se volvió a colocar en la cavidad abdominal. A continuación, se cerraron el peritoneo y la piel con suturas de seda 5-0.
Se sacrificó un ratón tres horas después del trasplante y se analizó el injerto en busca de células beta maduras y marcadores progenitores. En este ratón, no se pudieron observar células productoras de insulina en la cápsula perirrenal murina (Figura 18B).
A otro ratón se le permitió recuperarse en la jaula con una almohadilla térmica, bajo estrecha supervisión. Se controlaron los pesos corporales y los niveles de glucosa en sangre del ratón trasplantado durante 1 mes. Después de un mes, se sacrificó el ratón y se analizó el injerto en busca de células beta maduras y marcadores progenitores.
Un mes después del trasplante, se pudieron identificar varias células productoras de insulina. Estas células productoras de insulina son todas las células teñidas en la Figura 18C, una selección de las cuales está rodeada por un círculo para mayor claridad. En particular, aparecieron células positivas para insulina en el revestimiento de los conductos, mientras que en las preparaciones iniciales no se observaron células positivas para insulina.
El resultado de que las células productoras de insulina están presentes 1 mes después del trasplante pero no están presentes 3 horas después del trasplante demuestra que las células productoras de insulina surgen en gran medida o sólo después del trasplante.
Estos resultados muestran que las células tomadas de organoides pancreáticos de la presente invención, cultivadas con los medios y métodos de la presente invención, pueden trasplantarse a ratones y pueden promover el crecimiento de células productoras de insulina en el páncreas. Curiosamente, se podrían trasplantar organoides pancreáticos humanos. Esto abre una serie de posibilidades interesantes para el uso de células organoides trasplantadas para promover la producción de insulina, por ejemplo. para el tratamiento de la diabetes.
EJEMPLO 5 - Cultivo de organoides hepáticos que comprende inhibidor de TGF-beta
En condiciones de ER o ENRW, los cultivos de organoides hepáticos se renuevan automáticamente y pueden mantenerse y ampliarse semanalmente, durante hasta 1 año (Figura 20A). El análisis cariotípico después de 1 año no muestra evidencia de aberraciones cromosómicas. Más del 66 % de las células analizadas presentaron recuentos cromosómicos normales y el 13 % de ellas también mostraron poliploidía, rasgo característico de los hepatocitos (Figura 20B).
La combinación de EGF (50 ng/ml) y R-espondina 1 (ug/ml) suplementada con FGF10 (100 ng/ml), HGF (25-50 ng/ml) y nicotinamida (1-10mM), fue preferible para el mantenimiento a largo plazo de los cultivos. En estas condiciones, obtuvimos cultivos de células de larga vida que expresan marcadores de vía biliar y algunos hepatoblastos o hepatocitos inmaduros (Glul, Albúmina). Sin embargo, el número de células positivas para estos marcadores de hepatocitos fue muy bajo. En estas condiciones de cultivo, no hay marcadores de hepatocitos maduros (p. ej. p450 Citocromos). Estos resultados sugieren que las condiciones de cultivo descritas en este documento facilitan la expansión de los progenitores del hígado capaces de generar células similares a los hepatocitos, aunque en números más bajos, pero no hepatocitos completamente maduros (Fig. 21A).
Para mejorar la naturaleza hepatocítica de los cultivos y obtener hepatocitos madurosin vitro,primero determinamos si los tres factores suplementarios (FGF10, HGF y nicotinamida) agregados a EGF y R-espondina 1 también ejercían un efecto positivo o negativo sobre la expresión de los hepatocitos. como en la autorrenovación del cultivo. Generamos cultivos de organoides hepáticos y los cultivamos con<e>G<f>o EGF y R-espondina 1 más FGF10 o HGF o nicotinamida o la combinación de estos, y dividimos los cultivos una vez por semana durante un período total de 10 semanas. En cada momento también analizamos la expresión de varios marcadores de hepatocitos maduros (FAH, CYP3A11) y marcadores de hepatoblastos (albúmina) (Figura 21B).
Se observó que R-espondina 1 y Nicotinamida combinados con FGF10 son esenciales para el crecimiento y autorrenovación de los cultivos de hígado (Figura 21C y D). R-espondina 1 y Nicotinamida inhiben la expresión del marcador maduro CYP3A11 y aún promueven la expresión del marcador de albúmina de hepatoblastos. La adición de FGF10 o HGF a medios que contienen sólo EGF (sin R-espondina 1 y sin nicotinamida) facilitó la expresión del marcador maduro CYP3A11, aunque a niveles muy bajos (Figura 21E). Para identificar compuestos adicionales que podrían facilitar la diferenciación de hepatocitos, utilizamos dos enfoques diferentes, ambos basados en condiciones básicas de: EGF HGF y/o FGF10.
El primer enfoque implicó probar una serie de compuestos además de la condición EGF FGF10 o HGF. Una lista completa de los compuestos analizados se muestra en la tabla 4.
Tabla 4
El segundo enfoque tuvo en cuenta el conocimiento del desarrollo publicado estudios sobre la expresión de los factores de transcripción esenciales para lograr la diferenciación biliar y de hepatocitosin vivo.En la figura 21 se muestra un análisis comparativo de la expresión de factores de transcripción en los organoides en condiciones E, ER o ENRW suplementadas con FGF10, h Gf y nicotinamida. Todos los factores de transcripción necesarios para la especificación de los hepatocitos estaban presentes, además de tbx3 y prox1. Sin embargo, también notamos que la expresión de factores de transcripción biliares específicos estaba altamente regulada en los cultivos que contenían R-espondina 1 (R), lo que indica que la expresión del gen del cultivo estaba desequilibrada hacia un destino de células más biliares.
Las vías de señalización de Notch y TGF-beta se han implicado en el destino de las células biliaresin vivo.De hecho, la eliminación de Rbpj (esencial para lograr la señalización activa de Notch) da como resultado una tubulogénesis anormal (Zong Y. Development 2009) y la adición de TGFb a explantes de hígado facilita la diferenciación biliarin vitro(Clotman F. Genes and Development 2005). Dado que las vías de señalización de Notch y TGFb estaban altamente reguladas en los cultivos de hígado (Figura 22), razonamos que la inhibición del destino celular del conducto biliar podría desencadenar la diferenciación de las células hacia un fenotipo más hepatocítico. Se seleccionó A8301 como inhibidor de los receptores de TGFb ALK5, 4 y 7 y DAPT como inhibidor de la gamma-secretasa, la proteasa activa esencial para activar la vía Notch. Primero cultivamos las células durante 2 días en las condiciones de expansión (medio ER) y el día 2 (Figura 23A) comenzamos las condiciones de diferenciación agregando la combinación de los diferentes compuestos. Los medios se cambiaron cada dos días y la expresión de marcadores diferenciados se analizó 8-9 días después. Las condiciones ER y ENRW se utilizaron como control negativo.
La combinación de EGF FGF10 con DAPT y A8301 dio como resultado una mejora sorprendentemente grande de la expresión de los marcadores de hepatocitos analizados (CYP3A11, TAT, Albúmina) 20 (Figura 23B). El efecto ya era detectable el día 5 y alcanzó su punto máximo en los días 8-9 (Figura 23C). La máxima eficiencia de concentración se logró a 10uM (DAPT) y 50 nM (A8301) (Figura 23D) respectivamente. La adición de dexametasona (una conocida molécula de diferenciación de hepatocitos) no produjo ninguna mejora en la expresión genética. La combinación de EGF, FGF10, A8301 y DAPT no sólo mejora la expresión sino que también aumenta el número de células similares a hepatocitos, como se evaluó mediante inmunofluorescencia contra los marcadores de hepatocitos albúmina y 2F8, y tinción con Xgal en organoides derivados de AlbCreLacZ (Figura 23E y F). Por tanto, podemos concluir que el protocolo de diferenciación antes mencionado facilita la generación de células similares a hepatocitosin vitroa partir de cultivos de células madre hepáticas.
MÉTODOS
Reactivos
Los reactivos utilizados en los experimentos de cultivo se muestran en la Tabla 4.
Ratones RatonesLgr5-EGFP-ires-creERT2(Barker N et al. Nature 2007;449:1003-7),APCm(Sansom OJ et al. Genes Dev 2004;18:1385-90), ratonesAxin2-lacZ(Lustig B et al. Mol Cell Biol 2002;22:1184-93), se genotiparon ratones C57B/6 de tipo salvaje (6-12 semanas de edad) como se describió anteriormente y se usaron para experimentos. Se cruzaron ratonesLgr5-EGFP-ires-creERT2con ratonesAPCfl/fl.La actividad de la enzima Cre se indujo mediante inyecciones intraperitoneales de tamoxifeno (2 mg/ratón). Los ratones fueron sacrificados 4 semanas después de la inducción con tamoxifeno. Los intestinos delgados y los colones murinos se abrieron longitudinalmente, se lavaron con PBS frío y se procesaron adicionalmente para el aislamiento de las criptas. Las regiones que contenían adenomas intestinales se identificaron mediante un estereomicroscopio, se cortaron con un bisturí y se lavaron con PBS frío.
Materiales de te jido humano
Se obtuvieron tejidos intestinales resecados quirúrgicamente de 30 pacientes de Diaconessen Hospital Utrecht o de UMCU Hospital.
El material de los pacientes se recopiló de 20 pacientes con cáncer de colon (9 colon ciego-ascendente, 7 colon sigmoide, 4 recto; 33-86 años), 5 pacientes con colonoscopia de detección (33-63 años) y 5 pacientes con esófago de Barrett (45 78 años). Para el tejido normal se mantuvo una distancia de más de 3 cm a los tumores. Los tejidos intestinales se lavaron y se despojaron de las capas musculares subyacentes. El tejido se cortó en trozos de aproximadamente 5 mm y se lavó adicionalmente con PBS frío. Las biopsias endoscópicas (intestinales o esofágicas) se obtuvieron del hospital UMCU. Para cada caso, se recogieron al menos 5 muestras de biopsia y se almacenaron en PBS frío. Este estudio fue aprobado por el comité de ética de DHU y UMCU, y todas las muestras se obtuvieron con consentimiento informado.
Aislamiento de cripta/adenoma y disociación celular
Los fragmentos intestinales (colon normal murino, intestino delgado normal humano y colon) se lavaron adicionalmente con PBS frío hasta que el sobrenadante quedó claro. A continuación, los fragmentos de tejido se incubaron en tampón de quelación frío ED<t>A 2 mM (agua destilada con Na2HPO4 5,6 mM, KH2PO4 8,0 mM, NaCL 96,2 mM, KCl 1,6 mM, sacarosa 43,4 mM, D-sorbitiol 54,9 mM, DL ditiotreitol 0,5 mM) durante 30 min en hielo (Gregorieff A Gastroenterology 2005(129)626-638). Después de retirar el tampón EDTA, los fragmentos de tejido se resuspendieron vigorosamente en tampón de quelación 2 frío usando una pipeta de 10 ml para aislar las criptas intestinales. Se dejó que los fragmentos de tejido se asentaran bajo gravedad normal durante 1 minuto y se eliminó el sobrenadante para su inspección mediante microscopía invertida. El procedimiento de resuspensión/sedimentación fue típicamente de 6 a 8 veces y se descartaron los sobrenadantes que no contenían criptas. Los sobrenadantes que contenían criptas se recogieron en tubos falcon de 50 ml recubiertos con albúmina sérica bovina. Las criptas aisladas se sedimentaron, se lavaron con tampón de quelación frío y se centrifugaron a 150-200 g durante 3 minutos para separar las criptas de las células individuales.
Las criptas de colon murino se sedimentaron y resuspendieron con TrypLE express (Invitrogen) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C. En esta condición de disociación, las criptas del colon se digirieron levemente, separando así físicamente la parte inferior de las criptas del colon de la parte superior de las criptas del colon. Se incubaron fragmentos intestinales que contenían adenomas de ratonesLgr5-EGFPires creERT2/APCfl/flinducidos por tamoxifeno en tampón de quelación EDTA 2 mM durante 60 minutos en hielo. Después del lavado con tampón de quelación frío, la mayoría de las células epiteliales intestinales normales se desprendieron, mientras que las células de adenoma permanecieron unidas al mesénquima. A continuación, los fragmentos de adenoma se incubaron en tampón de digestión (DMEM con 2,5 % de sern bovino fetal, penicilina/estropomicina (lnvitrogen), 75 U/ml de colagenasa tipo IX (Sigma), 125 pg/ml de dispasa tipo II (lnvitrogen)) durante 30 mín. a 37 °C. Se dejó que los fragmentos de adenoma se asentaran bajo gravedad normal durante 1 minuto y el sobrenadante se recogió en un tubo Falcon de 50 ml, se sedimentó y se lavó con PBS. Las células de adenoma aisladas se centrifugaron a 150-200 g durante 3 minutos para separar el adenoma de las células individuales.
Se lavaron varias veces con PBS muestras de biopsia del epitelio de Barrett y muestras de cáncer de colon humano, cortadas en trozos de 5 mm. Los fragmentos de tejido se incubaron en tampón de digestión durante 60 min a 37 °C. Después de la digestión, se recogieron manualmente fragmentos de tejido bajo el microscopio.
Para los experimentos de clasificación, las criptas aisladas se disociaron con TrypLE express (Invitrogen), incluida 2000 U/ml de ADNasa (Sigma), durante 60 minutos a 37 °C. Las células disociadas se pasaron a través de un filtro celular de 120 pm (CellTrics) y se lavaron con PBS. Las células epiteliales individuales viables se seleccionaron mediante dispersión directa, dispersión lateral y ancho de pulso, y tinción negativa para yoduro de propidio o 7-ADD (eBioscience).
Cultivo de criptas intestinales, adenomas, epitelio de Barrett y cáncer de colon
Se contaron criptas intestinales aisladas, epitelio de Barrett y células de cáncer de colon mediante un hemocitómetro. Se incluyeron criptas, fragmentos de epitelio o células individuales en matrigel sobre hielo (factor de crecimiento reducido, sin rojo fenol; BD bioscience) y se sembraron en placas de 48 pocillos (500 criptas/fragmentos o 1000 células individuales por 25 pl de matrigel por pocillo). El matrigel se polimerizó durante 10 minutos a 37 °C y se agregaron 250 pl/pocillo de medio de cultivo basal (DMEM/F12 avanzado suplementado con penicilina/estreptomicina, HEPES 1 mM, Glutamax, 1 x N2, 1 x B27 (todos de Invitrogcn) y W-acetilcisteína 1 mM (Sigma)) se colocó de modo que contenía las siguientes combinaciones optimizadas de factores de crecimiento: EGF murino para adenomas intestinales murinos, ENR (EGF murino, nogina murina, R-espondina-1 humana) para criptas del intestino delgado murino, WENR (Wnt-3A humano recombinante o medio condicionado Wnt-3A+ENR) para criptas de colon murino, HISC (células madre intestinales humanas: WENR+gastrina+nicotinamida+A83-01+SB202190) para criptas de intestino delgado/colónico humano, HISC+FGF10 humano para epitelio de Barrett. Las células de cáncer de colon muestran un comportamiento heterogéneo y no requieren la adición de factores de crecimiento, EGF murino y/o A83-01 y/o SB202190. Para los experimentos de clasificación de células, se incluyó Y-27632 (10 pM; Sigma) en el medio durante los primeros 2 días para evitar anoikis. Los reactivos y las concentraciones de cada factor de crecimiento se indican en laFig. 12. En laFig. 12se ofrece una descripción general de las 3 combinaciones optimizadas de factores de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas para cada órgano.
Análisis de imágenes
Las imágenes de los organoides se tomaron mediante microscopía confocal con un Leica SP5, un microscopio invertido (Nikon MD-IL) o un estereomicroscopio (Leica, MZ16-FA). Para la inmunohistoquímica, las muestras se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 1 h a temperatura ambiente y las secciones de parafina se procesaron con técnicas estándar. La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente. Para la inmunotinción de montaje completo, se aislaron organoides de criptas de Matrigel usando una solución de recuperación (BD bioscience) y se fijaron con PFA al 4 %, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,1 %. Los anticuerpos primarios fueron: anti-Ki67 de ratón (1:250, Monosan), anti-Muc2 de conejo (1:100, Santa Cruz), anti-lisozima de conejo (1:1000, Dako), antisinaptofisina de conejo (1:100, Dako) y anticromogranina A (1:100, Santa Cruz). Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpos conjugados con peroxidasa o anticuerpos conjugados con Alexa-568. La tinción con EdU siguió el protocolo del fabricante (Click-IT; Invitrogen). El ADN se tiñó con DAPI (Molecular Probes). Se adquirieron imágenes tridimensionales con microscopía confocal y se reconstruyeron con el software Volocity (lmprovision).
Análisis de microarrays y análisis de PCR en tiempo real
Los datos se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE28907.
EJEMPLO 6 - Cultivo de organoides hepáticos que comprende prostaglandina-2 o ácido araquidónico
La supervivencia, el crecimiento y la expansiónin vitrode los organoides hepáticos se mejoraron potentemente mediante la adición de prostaglandina E2 (PGE2) o ácido araquidónico (AA) al medio basal. Las Figuras 25 y 26 muestran que la adición de p GE2 a 50 nM (que también funciona en el rango de 10 a 500 nM) o la adición de AA a 10ug/ml (también funciona a 100ug/ml, aunque no tan bien), da como resultado un número mayor de organoides más grandes que usando el medio basal solo. Es importante destacar que la adición de PGE2 o AA permite un tiempo de expansión más prolongado. Esto significa que los organoides se pueden expandir para duplicar más la población antes de que el crecimiento disminuya o se desacelere. Sin PGE2 se observa una reducción del crecimiento después de 5 semanas de cultivo a una expansión de 5 veces por semana. Con PGE2 no hay reducción del crecimiento antes de al menos 8 semanas con una expansión de 5 veces por semana. Se observó que la PGE2 tenía un efecto ligeramente mayor que el AA. El medio basal utilizado fue: hEGF (100ng/ml, Invitrogen); noggin humano (hnoggin) (25 ng/ml, peprotech); gastrina (10uM, sigma); hFGF10 (peprotech); nicotinamida (10mM, sigma); A8301 (500 nM, Tocris); hHGF (50 ng/ml, peprotech); Medios condicionados Rspo (10 %).
PGE2 y AA están ambos en la misma vía de señalización de prostaglandinas (véase Figura 24), junto con los fosfolípidos, la prostaglandina G2 (PGG2), la prostaglandina F2 (PGF2), la prostaglandina H2 (PGH2) y la prostaglandina D2 (PGD2). Se esperaría que la adición de cualquier otro componente activador de esta vía tuviera el mismo efecto beneficioso en los medios de cultivo.
La adición de PGE2 o AA es particularmente beneficiosa para los medios de cultivo de expansión. Sin embargo, en algunas circunstancias también pueden incluirse en medios de diferenciación.
EJEMPLO 7 - Los inhibidores de GSK3 son agonistas de Wnt eficaces en los medios de cultivo
Se demostró que CHIR99021, un inhibidor de GSK3, es un agonista de Wnt eficaz para los medios de cultivo. En particular, demostró ser un sustituto adecuado de Wnt en los medios de cultivo para organoides de colon e hígado.
Además, como una extensión del Ejemplo 6, la Figura 25 muestra que las células hepáticas humanas cultivadas en presencia de CHIR99021 (agonista de Wnt) y PGE2 dan como resultado más organoides y más grandes que las células cultivadas con el agonista de Wnt o PGE2 solos y ciertamente organoides adicionales/más grandes que solo en el medio basal.
Por lo tanto, los inhibidores de GSK3 podrían usarse en los medios de cultivo en lugar de, o además de, otros agonistas de Wnt, como Wnt o R-espondina 1-4.
Es sorprendente que CHIR99021 fuera un reemplazo de Wnt tan eficaz porque GSK3 participa en varias vías diferentes, no solo en la vía Wnt. Este resultado abre la posibilidad de diseñar otros agonistas de Wnt dirigidos a GSK3, que podrían resultar útiles en medios de cultivo.
EJEMPLO 8 - Próstata
Aislamiento del epitelio prostático (protocolo murino).
Los pasos numerados corresponden a la Figura 47.
i) Sacrificar un ratón macho con un mínimo de 8 semanas de edad para aislar una próstata madura; aislar el seno urogenital del ratón.
ii) Retirar las vesículas seminales rompiendo/cortando los vasos sanguíneos y el tejido conectivo y haciendo una incisión en la base de la uretra
iii) Retirar la vejiga rompiéndola/cortándola cerca de la base de la uretra
iv) Retirar las vesículas restantes y el tejido adiposo tirando suavemente y cortando. Lo que deberías haber dejado son los lóbulos de la próstata (6 de ellos) y una estructura rosada en el medio, que es la uretra;
v) Retirar la uretra, fácilmente reconocible por el color rosado (teñido de oscuro en la imagen). Tirar con cuidado de los lóbulos de la próstata para que ya no estén adheridos a la uretra; aislar cada lóbulo individualmente, simplemente separándolos, o continuar con toda la próstata.
A continuación, picar la próstata (lóbulos) en trozos pequeños; digerir la próstata en 1 ml 10 mg/ml Colagenasa II (disuelta en ADMEM/F12) durante 1 A horas a 37 °C; después de la digestión con colagenasa sólo deben quedar estructuras de células epiteliales “parecidas a dedos”.
- Lavar en ADMEM/F12
- Dejar que los trozos se asienten y extraigan el sobrenadante (la centrifugación a baja velocidad elimina la mayor parte del mesénquima)
- Centrifugar 50xG 5 min 4'C
- Resuspender en 1 ml de tripsina (TLE) y digerir durante aproximadamente 30 min 37'C. Pipetear hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos para asegurar la digestión
- Lavar en ADMEM/F12
- Iniciar el cultivo en ENR o ENR+ Dihidrotestosterona 1nM (sembrar aproximadamente 5000 células por pocillo) (0,1nM10uM) no conocemos un límite superior
- O continuar con el aislamiento de Tipo de célula específico mediante FACS
Resultados
Las células epiteliales prostáticas cultivadas en ENR Testosterona DiHidro, de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, se pueden mantener durante 35 semanas hasta el momento. En presencia de testosterona, los cultivos se expanden igual que sin testosterona. Sin embargo, con la testosterona están presentes todos los tipos de células, incluidas las células madre, las células amplificadoras del tránsito y las células diferenciadas, es decir, hay una mayor diferenciación mientras se mantiene una población de células madre. Los organoides de próstata cultivados en presencia de testosterona también se parecen más al órganoin vivo(véase Figuras 41 y 42). Además, la IHC y la RT-PCR muestran que los organoides prostáticos cultivados en presencia de testosterona contienen células tanto basales como luminales.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo para expandir una población de células madre epiteliales adultas, en el que dicho medio de cultivo comprende:
i. cualquiera de R-espondina 1-4; y
ii. uno o más inhibidores de TGF-beta, en donde el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta si puede inhibir la señalización de TGF-beta en un ensayo celular en el que las células se transfectan de manera estable con una construcción indicadora que comprende el promotor pAI-1 humano.
2. Un medio de cultivo para expandir una población de células madre epiteliales adultas, en el que dicho medio de cultivo comprende:
i. un agonista de Lgr5; y
ii. uno o más inhibidores de TGF-beta, en donde el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta si puede inhibir la señalización de TGF-beta en un ensayo celular en el que las células se transfectan de manera estable con una construcción indicadora que comprende el promotor PAI-1 humano.
3. El medio de cultivo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que uno o más inhibidores de TGF-beta se une y reduce la actividad de ALK5, ALK4 y/o ALK7.
4. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno o más inhibidores de TGF-beta se seleccionan del grupo que consiste en A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 y SJN-2511.
5. El medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de cultivo comprende uno o más componentes adicionales seleccionados entre: un agonista de Wnt, un ligando del receptor tirosina quinasa, nicotinamida, un inhibidor de p38, un inhibidor de Rock, gastrina, RANKL, un inhibidor de GSK3, un activador de la vía de señalización de prostaglandinas y testosterona.
6. Una composición que comprende un medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una matriz extracelular o una matriz 3D que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular tales como integrinas, por ejemplo, una matriz extracelular que contiene laminina.
7. Recipiente herméticamente cerrado que contiene un medio o composición de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Uso de un medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para expandir una célula madre epitelial adulta, una población de células madre epiteliales adultas, un fragmento de tejido u un organoide.
9. Un método para expandir una única célula madre epitelial adulta, una población de células madre epiteliales adultas o un fragmento de tejido, preferiblemente para obtener un organoide, en donde el método comprende cultivar la única célula madre epitelial adulta o la población de células madre epiteliales adultas en un cultivo Medio según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. Un método según la reivindicación 9, en el que el método comprende poner en contacto la célula madre epitelial adulta, la población de células madre epiteliales adultas o el fragmento de tejido aislado y el medio de cultivo con una matriz extracelular o una matriz 3D que imita la matriz extracelular mediante su interacción con las proteínas de la membrana celular como las integrinas, por ejemplo una matriz extracelular que contiene laminina.
11. Un método según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que comprende:
cultivar la célula madre epitelial adulta, la población de células madre epiteliales adultas o fragmentos de tejido en un primer medio de expansión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
continuar cultivando la célula madre epitelial adulta, la población de células madre epiteliales adultas o fragmentos de tejido y reponer el medio con un medio de diferenciación, en el que el medio de diferenciación no comprende uno o más de, preferiblemente todos, los factores seleccionados de: Inhibidor de TGF-beta, inhibidor de p38, nicotinamida y Wnt.
12. Un organoide o población de células que se puede obtener mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Una composición que comprende:
i) uno o más organoides o población de células según la reivindicación 12; y
ii) un medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y/o una matriz extracelular.
14. Uso de un organoideex vivosegún la reivindicación 12 o una población de células según la reivindicación 12 o una composición según la reivindicación 6 o la reivindicación 13 para la detección de fármacos, la validación de objetivos, el descubrimiento de objetivos, la toxicología, los exámenes toxicológicos, el diagnóstico o los modelos de células/órganos, por ejemplo para su uso como modelo de enfermedad.
15. Un organoide según la reivindicación 12 o una población de células según la reivindicación 12 o una composición según la reivindicación 6 o la reivindicación 13 para uso en medicina, opcionalmente en el que la medicina es medicina personalizada o medicina regenerativa.
16. Un método para detectar un fármaco o cosmético terapéutico o profiláctico, en el que el método comprende:
cultivar un organoide o una población de células según la reivindicación 12, por ejemplo con un medio de cultivo según las reivindicaciones 1 a 5;
exponer dicho organoide o población de células a una o una biblioteca de moléculas candidatas;
evaluar dicho organoide o población de células para detectar cualquier efecto, por ejemplo cualquier cambio en una célula, tal como una reducción o pérdida de la proliferación, un cambio morfológico y/o muerte celular; e identificar la molécula candidata que causa dichos efectos como fármaco o cosmético potencial.
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