CN117821380A - Fgf7在制备促进干细胞体外扩增和维持表型的试剂中的应用 - Google Patents
Fgf7在制备促进干细胞体外扩增和维持表型的试剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及FGF7在制备促进干细胞体外扩增和维持表型的试剂中的应用，属于细胞培养技术领域。具体而言，在干细胞培养过程中，添加FGF7可以促进干细胞增殖并维持其干细胞表型和腱系表型。所述干细胞表型主要通过维持干细胞表面标志物表达水平实现，所述腱系表型主要通过提高肌腱系特异基因和蛋白的表达水平实现。本发明中FGF7制备的试剂和/或其所培养的干细胞可用于组织损伤治疗。
Description
本申请是分案申请，原申请的申请号为：“2021107557232”、申请日为：“2021年07月05日”发明名称为：“FGF7在制备干细胞扩增与表型维持试剂中的应用”
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其是FGF7在制备干细胞体外扩增与表型维持试剂中的应用及其制备的试剂在细胞培养和组织损伤修复中的应用。
背景技术
肌腱损伤为常见的运动系统损伤。外力引起的肌肉突然，猛力的收缩，可造成肌腱起止点的完全或部分撕裂，称肌腱断裂。若肌腱长期反复经受轻微外伤，或肌腱本身有慢性磨损，日久引起肌腱断裂，称肌腱自发性断裂。肌腱损伤可造成疼痛、局部肿胀与功能障碍。
目前，肌腱损伤或断裂尚未有理想的治疗方法，临床治疗通常是对症处理，包括药物治疗、物理治疗、手术治疗，如直接缝合、自体或异体移植、人工合成材料修补等。但由于修复愈合能力较差，并发症发病率高且长期疗效不稳定，容易出现肌腱粘连、钙化、强度降低，甚至再次断裂等问题。
组织工程技术的发展为提高肌腱和韧带的修复质量带来了广阔前景。肌腱干细胞作为组织工程理想的种子细胞来源之一，不仅具有像骨髓间充质干细胞一样的干细胞表型，而且具有腱系表型，高表达肌腱特异性的基因和蛋白质，如胶原I，粘蛋白C和纤连蛋白等。因此，肌腱/韧带干细胞是一种非常有潜力应用于肌腱组织工程中的种子细胞。
肌腱干细胞来源有限，需在体外扩增后应用于组织工程治疗。然而，在现有常规细胞培养技术条件下，肌腱干细胞体外扩增培养速度慢，易丢失表型。现有培养技术扩增的肌腱干细胞形成的再生肌腱在力学性能上，特别是微观结构上与正常肌腱仍有显著区别，修复组织的超微结构显示其由大量的小直径的胶原纤维构成，这些小直径胶原纤维证实导致愈后肌腱力学性能低下的直接因素。不仅如此，现有技术培养的肌腱干细胞用在肌腱修复时易出现异位骨化等表型丢失现象，导致肌腱修复失败。因此，目前尚缺乏适合肌腱干细胞在体外扩增和表型维持的培养条件。
生长因子作为培养基的添加成分，具有可控、操作便捷等优点，已经被广泛用于干细胞扩增、分化调控和组织工程领域。生长因子在促进改变细胞命运方面具有良好潜力，有良好的运用前景。因此提供合适的生长因子促进肌腱干细胞体外扩增和表型维持对肌腱干细胞体外培养及临床转化应用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供合适的生长因子制备体外维持干细胞扩增和表型的试剂，本发明发现成纤维细胞生长因子7(FGF7)能够在体外维持干细胞增殖和表型，实现了成纤维细胞生长因子7(FGF7)在制备体外维持干细胞扩增和表型维持试剂的应用。
为了实现本发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了FGF7在制备促进干细胞体外扩增和维持表型的试剂中的应用，其中，
所述的表型为干细胞表型和腱系表型，
所述干细胞表型主要通过维持干细胞表面标志物表达水平实现，所述干细胞表面标志物包括CD105、CD90、CD44、CD34、CD18，所述腱系表型主要通过提高包括SCX、FOS基因的表达水平实现；
所述FGF7的浓度范围为1-100ng/ml；
所述的干细胞为韧带干细胞、间充质干细胞或脂肪干细胞。
本发明中，所述FGF7主要通过增强干细胞扩增速率、缩短细胞倍增时间、增加细胞扩增数目来进行干细胞的扩增。
本发明中，所述生长因子FGF7主要通过维持干细胞表面标志物表达水平、提高肌腱系特异基因和蛋白的表达水平来进行干细胞的表型维持。
进一步地，所述的试剂还包括FGF7合成肽，所述所述FGF7合成肽是指根据FGF7自身的有效片段或片段组合的氨基酸序列，和/或利用化学合成的方法所制得的具有相同氨基酸序列的多肽或寡肽，FGF7合成肽浓度范围为1-100ng/ml。其中，关于FGF7的有效片段，可以根据已有文献报道找到对应氨基酸序列，然后通过设计引物进行合成或委托生物公司合成。文献未报道的，可以通过蛋白质酶解，肽谱分析的方法，寻找到最优化肽段，然后通过设计引物进行合成或委托生物公司合成。
进一步，所述FGF7合成肽还可以包括FGF7的模拟肽，利用FGF7的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽或粘附因子模拟肽，这些模拟肽的氨基酸序列与FGF7氨基酸序列不同，但具有FGF7的活性，并且具有相对分子质量小等优点，同理,FGF7模拟肽可根据已知的FGF7模拟肽氨基酸序列委托生物公司合成。
进一步地，以试剂的总体积计，所述FGF7浓度范围为5-70ng/ml；所述FGF7合成肽浓度范围为5-70ng/ml。
进一步地，以试剂的总体积计，所述FGF7浓度范围为10-40ng/ml；所述FGF7合成肽浓度范围为10-40ng/ml。
进一步地，所述试剂还包括基础培养基；所述基本培养基为DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、F12培养基、F10培养基、MEM培养基、BEM培养基、RPMI 1640培养基、Media 199培养基、IMDM培养基、mTesR培养基、E8培养基。
进一步地，所述试剂还包括血清、生长因子、小分子、激素、蛋白质、合成肽、多胺类、脂类、矿物质、糖类、有机酸、氨基酸、还原剂、维生素、微量元素、抗生素、缓冲剂和pH值调节剂中任意一种或两种以上成分。
进一步地，所述试剂用于体外培养干细胞，所述体外培养的方式包含二维培养、三维培养、贴壁培养、悬浮培养、静态培养、动态培养中任意一种或多种。
本发明所具有的有益效果：
本发明公开了成纤维细胞生长因子7(FGF7)和/或FGF7合成肽在制备(体外)维持干细胞扩增和表型的试剂中的用途。
本发明FGF7制备的试剂能够支持干细胞培养，其培养获得细胞增殖优于现有培养技术，且其培养获得细胞干细胞表型和腱系表型维持也显著强于现有技术，能够确保细胞质量达到组织损伤修复标准。
附图说明
图1为本发明实施例培养的干细胞形态图。
图2为本发明实施例与现有技术常规培养对比例的腱系基因表达情况柱形图。
图3为本发明实施例与现有技术常规培养对比例的腱系蛋白SCX免疫荧光图。
图4为本发明实施例与现有技术常规培养对比例的腱系蛋白FOS免疫荧光图。
图5为本发明实施例3D培养干细胞死活细胞染色荧光图。
具体实施方式
本发明实施例提供了成纤维细胞生长因子7(FGF7)和/或FGF7合成肽在制备(体外)维持干细胞扩增和表型的试剂中的应用。
在一些实施例中，所述的表型包括干细胞表型和腱系表型(腱系基因SCX、FOS的表达)。所述干细胞表型主要通过维持干细胞表面标志物表达水平实现，所述腱系表型主要通过提高肌腱系特异基因和蛋白(SCX、FOS)的表达水平实现。
在一些实施例中，所述的干细胞为肌腱干细胞、韧带干细胞、半月板干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、骨骼干细胞或肌肉干细胞；更优选地，所述干细胞为肌腱干细胞。
所述FGF7合成肽是指根据FGF7自身的有效片段或片段组合的氨基酸序列，和/或利用化学合成的方法所制得的具有相同氨基酸序列的多肽或寡肽。其中，关于FGF7的有效片段，可以根据已有文献报道找到对应氨基酸序列，然后通过设计引物进行合成或委托生物公司合成。文献未报道的，可以通过蛋白质酶解，肽谱分析的方法，寻找到最优化肽段，然后通过设计引物进行合成或委托生物公司合成。
在一些实施例中，所述FGF7合成肽还可以包括FGF7的模拟肽，利用FGF7的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽或粘附因子模拟肽，这些模拟肽的氨基酸序列与FGF7氨基酸序列不同，但具有FGF7的活性，并且具有相对分子质量小等优点，同理,FGF7模拟肽可根据已知的FGF7模拟肽氨基酸序列委托生物公司合成。
在一些实施例中，以试剂的总体积计，所述FGF7和/或FGF7合成肽浓度范围为1-100ng/ml。优选地，所述FGF7和/或FGF7合成肽浓度范围为5-70ng/ml；更优选地，所述FGF7和/或FGF7合成肽浓度为10-40ng/ml。
在一些实施例中，所述FGF7主要通过增强干细胞扩增速率、缩短细胞倍增时间、增加细胞扩增数目来进行干细胞的扩增。
在一些实施例中，所述生长因子FGF7主要通过维持干细胞表面标志物表达水平、提高肌腱系特异基因和蛋白的表达水平来进行干细胞的表型维持。
在一些实施例中，上述应用中，所述试剂还包括基础培养基；所述基本培养基为DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、F12培养基、F10培养基、MEM培养基、BEM培养基、RPMI 1640培养基、Media 199培养基、IMDM培养基、mTesR培养基或E8培养基。
在一些实施例中，上述应用中，所述试剂还包括血清、生长因子、小分子、激素、蛋白质、合成肽、多胺类、脂类、矿物质、糖类、有机酸、氨基酸、还原剂、维生素、微量元素、抗生素、缓冲剂和pH值调节剂中任意一种或两种以上成分。
在一些实施例中，上述应用中，所述培养的方式包含二维培养、三维培养、贴壁培养、悬浮培养、静态培养、动态培养中任意一种或多种。
本发明实施例还提供了一种维持干细胞扩增和干细胞表型和腱系表型的干细胞的体外培养方法，该方法包括如下步骤：将成纤维生长因子7(FGF7)和/或FGF7合成肽制备的试剂与干细胞接触，用于干细胞的体外培养。优选地，上述方法中，所述的干细胞为肌腱干细胞、韧带干细胞、半月板干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、骨骼干细胞或肌肉干细胞。更优选地，所述干细胞为肌腱干细胞。
在一些实施例中，以试剂的总体积计，所述FGF7和/或FGF7合成肽浓度范围为1-100ng/ml。优选地，所述FGF7和/或FGF7合成肽浓度范围为5-70ng/ml；更优选地，所述FGF7和/或FGF7合成肽浓度为10-40ng/ml。
在一些方法的实施例中，所述试剂还包括基础培养基；所述基本培养基为DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、F12培养基、F10培养基、MEM培养基、BEM培养基、RPMI 1640培养基、Media 199培养基、IMDM培养基、mTesR培养基、E8培养基。
在一些方法的实施例中，所述试剂还包括血清、生长因子、小分子、激素、蛋白质、合成肽、多胺类、脂类、矿物质、糖类、有机酸、氨基酸、还原剂、维生素、微量元素、抗生素、缓冲剂和pH值调节剂中任意一种或两种以上成分。
在一些方法的实施例中，所述培养的方式包含二维培养、三维培养、贴壁培养、悬浮培养、静态培养、动态培养中任意一种或多种。
本发明以举例的方式来说明本发明是如何实现的，这些仅仅是在本发明精髓下的有限列举，并不对本发明构成任何限制。
实施例1
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从人正常肌腱组织中提取的肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加5000ng FGF7(终浓度为10ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例1
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
实施例1生物活性实验例
培养细胞处理
将人肌腱干细胞按照约1X10^4/cm2的密度接种于孔板、培养皿或培养瓶中，分别用FGF7培养基和现有技术常规培养基培养细胞，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每3天换一次液，至其基本长满，并进行细胞拍照、细胞计数、基因表达检测、死活细胞染色、免疫荧光等实验。
实验结果分析
细胞形态学观察
在上述培养细胞的处理过程中，用倒置相差显微镜观察FGF7培养基培养的肌腱干细胞的生长情况及形态变化，并通过显微镜拍摄记录。
如图1所示，4X显微镜下显示肌腱干细胞在添加FGF7的培养条件下能够保持良好的贴壁性，胞质丰富，呈现出梭形的细胞形态。
qPCR检测基因表达情况
将肌腱干细胞按照约1X10^4/cm2的密度种植在12孔板中，分别用FGF7培养基和现有技术常规培养基培养细胞，第5天时，弃培养基，1XPBS洗一次，加入RNA细胞裂解液，利用RNA提取试剂盒将细胞RNA提取出来，逆转录成cDNA，然后加样上机进行Qpcr检测细胞中腱系相关基因相对表达情况，分析结果，以组为横坐标，基因相对表达量为纵坐标，绘制该基因相对表达柱形图。
如图2所示，QRT-PCR结果显示，与对比例1(即Ctrl)比较，添加FGF7培养会显著提高肌腱干细胞腱系基因SCX、FOS、BGN、COL3和FMOD的表达，表明FGF7能够增强人肌腱干细胞腱系表型。
免疫荧光检测腱系基因表达情况
将肌腱干细胞按照约1X10^4/cm2的密度种植在12孔板中，分别用FGF7培养基和现有技术常规培养基培养细胞，第5天时，弃培养基，1XPBS洗一次，4％多聚甲醛固定，进行SCX、FOS腱系标志蛋白染色，荧光显微镜下拍摄细胞染色结果。
如图3和图4所示，免疫荧光结果显示，与对比例1(即Ctrl)比较，添加FGF7培养会显著提高肌腱干细胞腱系标志物SCX和FOS的表达，表明FGF7能够增强人肌腱干细胞腱系表型。
实施例2
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为人间充质干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加10000ng FGF7(终浓度为20ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例2
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的人间充质干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合人间充质干细胞体外扩增与表型维持。
实施例3
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为人韧带干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加20000ng FGF7(终浓度为40ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例3
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的人韧带干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合人韧带干细胞体外扩增与表型维持。
实施例4
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从人脂肪干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加25000ng FGF7(终浓度为50ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例4
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的人脂肪干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合人脂肪干细胞体外扩增与表型维持。
实施例5
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从人肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加35000ng FGF7(终浓度为70ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例5
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的人肌腱干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合人肌腱干细胞体外扩增与表型维持。
实施例6
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从人肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加50000ng FGF7(终浓度为100ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例6
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的人肌腱干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合人肌腱干细胞体外扩增与表型维持。
实施例7
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从大鼠肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加2500ng FGF7(终浓度为5ng/ml)，2500ng FGF7合成肽(终浓度为5ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例7
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的大鼠肌腱干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合大鼠肌腱干细胞体外扩增与表型维持。
实施例8
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从人肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加500ngFGF7(终浓度为1ng/ml)，5000ng FGF7合成肽(终浓度为10ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例8
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的人肌腱干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合人肌腱干细胞体外扩增与表型维持，也说明FGF合成肽能够促进干细胞增殖与表型维持。
实施例9
本实施例设置两组培养基，FGF7培养基(FGF7)和现有技术常规培养基(Ctrl)。所培养细胞为从小鼠肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加12500ng FGF7(终浓度为25ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
对比例9
现有技术常规培养基(Ctrl)
所述现有技术常规培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
本组实施例细胞培养方式与实施例一相同，实验发现本实施例培养的小鼠肌腱干细胞增殖较对比例1速度快，细胞活率更高，腱系标志物表达更强，说明添加FGF7的培养试剂比现有技术常规培养基更适合小鼠肌腱干细胞体外扩增与表型维持。
实施例10
本实施例设置一组培养基，FGF7培养基(FGF7)。所培养细胞为从人肌腱干细胞。以下为详细的实验及检测步骤：
试剂配制
FGF7培养基(FGF7)
所述FGF7培养基选自DMEM低糖培养基，且每500mL的DMEM低糖培养基中添加7500ng FGF7(终浓度为15ng/ml)，55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。
实施例10生物活性实验例
培养细胞处理
将人肌腱干细胞按照约2X10^5/cm2的密度接种20mg 3D微载体(北京华龛生物，3DFloTrix细胞扩增套装)上，至于低黏附6孔板中培养，用FGF7培养基培养细胞，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每3天换一次液，培养4天，进行细胞染色、拍照、基因表达检测、死活细胞染色等实验。
实验结果分析
死活细胞染色
取3D培养4天的细胞800rpm,离心5min,1XPBS洗一次，利用死活细胞试剂盒进行死活细胞染色，细胞染上绿色则为活细胞，染上红色则为死细胞，荧光显微镜下观察细胞染色情况。
如图5所示，荧光显微镜拍照显示人肌腱干细胞在添加FGF7的3D培养条件下能够保持良好的贴壁性，高细胞活力。说明添加FGF7的培养实际适合3D情况下干细胞的培养。
上述实施例添加FGF7的培养基(试剂)的培养效果检测：
细胞增殖及细胞活力分析
细胞计数使用台盼蓝计数法，将消化得到的细胞进行1200rpm，离心5min，弃上清，加入对应培养基，制备单细胞悬液，并作适当稀释，取1mL细胞悬液移入EP管中，加0.4％台盼蓝溶液，混匀，加入血细胞计数板，观察计数。如果细胞膜完整，细胞不被台盼蓝染色，则为正常细胞；如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死细胞。于显微镜下计算活细胞数及死细胞数，细胞计数方法为：(四大格细胞总数/4)×104×稀释倍数＝细胞悬液细胞数/mL，计算细胞活率：细胞活率＝活细胞数/总细胞数×100％。
如表一所示，其是本发明实施例和对比例细胞长满时的细胞数量及细胞活力，可以看出，添加FGF7的实验组相较于常规培养对照组显现出更快的细胞增殖能力和更高的细胞活力。
表一各实施例和对比例细胞增殖与细胞活率
流式分析检测干细胞表面标志表达情况
将P3或者P5代干细胞按照约1X10^4/cm2的密度种植在10cm培养皿中，分别用各实施例FGF7培养基和现有技术常规培养基培养细胞，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，每3天换一次液，至其基本长满，弃培养基，1XPBS洗一次，胰酶消化2分钟，5分钟离心，弃上清，封闭，分管进行干细胞表面CD标志染色，CD105、CD90、CD44、CD34、CD18等流式直标抗体染色，上机检测，分析CD标志表达情况。
如表二所示，其中，CD105、CD90、CD44为干细胞阳性表达标志，CD34、CD18为干细胞阴性表达标志，结果显示各实施例组阳性标志表达均大于95％，阴性标志表达均小于2％，符合国际干细胞定义，且比对比例组更符合干细胞特征。由此，说明添加FGF7的培养基(试剂)培养出的细胞能够维持其干细胞特性，更符合干细胞特征。
表二各实施例和对比例干细胞表面CD标志物表达情况
qPCR检测腱系基因表达情况
将干细胞按照约1X10^4/cm2的密度种植在12孔板中，分别用各实施例FGF7培养基和现有技术常规培养基培养细胞，第5天时，弃培养基，1XPBS洗一次，加入RNA细胞裂解液，利用RNA提取试剂盒将细胞RNA提取出来，逆转录成cDNA，然后加样上机进行Qpcr检测细胞中腱系相关基因相对表达情况，分析结果，以Ctrl组基因表达量为1，比较并统计各实施例组腱系相关基因的相对表达量。
如表三所示，QRT-PCR结果显示，与对比例1(即Ctrl)比较，添加FGF7培养会显著提高干细胞腱系基因SCX、FOS的表达，表明FGF7能够增强干细胞腱系表型。
表三各实施例和对比例腱系基因相对表达情况
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (7)
1.FGF7在制备促进干细胞体外扩增和维持表型的试剂中的应用，其特征在于，
所述的表型为干细胞表型和腱系表型，
所述干细胞表型主要通过维持干细胞表面标志物表达水平实现，所述干细胞表面标志物包括CD105、CD90、CD44、CD34、CD18，所述腱系表型主要通过提高包括SCX、FOS基因的表达水平实现；
所述FGF7的浓度范围为1-100ng/ml；
所述的干细胞为韧带干细胞、间充质干细胞或脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的试剂还包括FGF7合成肽，所述所述FGF7合成肽是指根据FGF7自身的有效片段或片段组合的氨基酸序列，和/或利用化学合成的方法所制得的具有相同氨基酸序列的多肽或寡肽，FGF7合成肽浓度范围为1-100ng/ml。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以试剂的总体积计，所述FGF7浓度范围为5-70ng/ml；所述FGF7合成肽浓度范围为5-70ng/ml。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：以试剂的总体积计，所述FGF7浓度范围为10-40ng/ml；所述FGF7合成肽浓度范围为10-40ng/ml。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂还包括基础培养基；所述基本培养基为DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、F12培养基、F10培养基、MEM培养基、BEM培养基、RPMI 1640培养基、Media 199培养基、IMDM培养基、mTesR培养基、E8培养基。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述试剂还包括血清、生长因子、小分子、激素、蛋白质、合成肽、多胺类、脂类、矿物质、糖类、有机酸、氨基酸、还原剂、维生素、微量元素、抗生素、缓冲剂和pH值调节剂中任意一种或两种以上成分。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂用于体外培养干细胞，所述体外培养的方式包含二维培养、三维培养、贴壁培养、悬浮培养、静态培养、动态培养中任意一种或多种。
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