ES2650980T3 - Medios de cultivo de células madre - Google Patents

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Johannes Carolus Clevers
Toshiro Sato
Meritxell Huch Ortega
Wouter Richard Karthaus
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Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen
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Abstract

Un medio de cultivo para la expansión de una población de células madre epiteliales adultas, en el que dicho medio de cultivo comprende un medio basal al que se añade: i. un agonista de Lgr5; ii. un inhibidor de BMP; y iii. uno o más inhibidores de TGF-beta, que se une y reduce la actividad de ALK5, ALK4 y/o ALK7.

Description

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[0054] En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende un inhibidor de TGF-beta, lo que significa cualquier inhibidor que, directa o indirectamente, regula negativamente la señalización de TGF-beta. En algunas realizaciones, un medio de cultivo de la invención comprende uno o más inhibidores de TGF-beta que se unen a y reducen la actividad de una o más quinasas de proteína de serina/treonina seleccionadas del grupo que consiste en ALK5, ALK4, quinasa de receptor de TGF-beta 1 y ALK7.
[0055] ALK4, ALK5 y ALK7 son todos los receptores de la superfamilia de TGF-beta estrechamente relacionados. ALK4 tiene número GI 91; ALK5 (también conocido como quinasa de receptor de TGF-beta 1) tiene número GI 7046; y ALK7 tiene número GI 658. En una realización, un inhibidor de acuerdo con la invención se une y reduce la actividad de ALK4, ALK5 (quinasa de receptor TGF-beta 1) y/o ALK7. En otra realización, el receptor de TGF-beta se une a y reduce la actividad de una proteína Smad, por ejemplo R-SMAD o SMAD1-5 (es decir, SMAD 1, SMAD 2, SMAD 3, SMAD 4 o SMAD 5). En una realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende un inhibidor de ALK5.
[0056] Varios métodos para determinar si una sustancia es un inhibidor de TGF-beta son conocidos. Por ejemplo, se puede usar un ensayo celular, en el que las células se transfectan de manera estable con una construcción indicadora que comprende el promotor de PAI-1 humano o los sitios de unión de Smad, dirigiendo un gen informador de luciferasa. La inhibición de la actividad de la luciferasa en relación con los grupos de control se puede usar como una medida de la actividad del compuesto (De Gouville y col., Br J Pharmacol. 2005 May; 145 (2): 166-177). Otro ejemplo es el ensayo de fosfonensores AlphaScreen® para medir la actividad de quinasas (Drew A.E. et al., Comparison of 2 Cell-Based Phosphoprotein Assays to Support Screening and Development of an ALK Inhibitor J Biomol Screen. 16 (2) 164-173, 2011)
[0057] Varios inhibidores de TGF-beta se conocen en la técnica (por ejemplo, véase la Tabla 1). En algunas realizaciones, el inhibidor que regula directa o indirectamente negativamente la señalización de TGF-beta se selecciona del grupo que consiste en A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 y SJN-2511.
[0058] En algunas realizaciones de la invención, el medio de cultivo comprende un inhibidor de p38, lo que significa cualquier inhibidor que, directa o indirectamente, regula negativamente la señalización de p38. En algunas realizaciones, un inhibidor de acuerdo con la invención se une y reduce la actividad de p38 (número de GI 1432). Las quinasas de proteínas p38 son parte de la familia de las quinasas de proteína activadas por mitógenos (MAPK). MAPKs son quinasas de serina de proteína/treonina-específica que responden a estímulos extracelulares, tales como estrés ambiental y citoquinas inflamatorias, y regulan diferentes actividades celulares, tales como expresión de gen, mitosis, la diferenciación, la proliferación y la supervivencia celular/apoptosis. Las MAPKs p38 existen como isoformas α, β, β 2, γ y . Un inhibidor de p38 es un agente que se une a y reduce la actividad de al menos una isoforma p38. Diversos métodos para determinar si una sustancia es un inhibidor de la p38 son conocidos, y podrían utilizarse en conjunción con la invención. Los ejemplos incluyen: detección de anticuerpos fosfo-específicos de fosforilación en Thr180/Tyr182, que proporciona una medida bien establecida de activación o inhibición de p38 celular; ensayos de quinasas recombinantes bioquímicas; ensayos de secreción de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα); y la plataforma de detección de alto rendimiento DiscoverRx para inhibidores p38 (véase http://www.discoverx.com/kinases/literature/biochemical/colaterals/DRx_poster_p38%20KBA.pdf). Varios kits de ensayo de la actividad de p38 también existen (por ejemplo, Millipore, Sigm a-Aldrich).
[0059] Los inventores plantean la hipótesis de que en algunas realizaciones, las altas concentraciones (por ejemplo, más de 100 nM, o más de 1 uM, más de 10 uM, o más de 100 uM) de un inhibidor de p38 pueden tener el efecto de inhibir TGF-beta. Sin embargo, los inventores no desean verse limitados por esta hipotesis y, en otras realizaciones, el inhibidor de p38 no inhibe la señalización de TGF-beta.
[0060] Varios inhibidores de p38 son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase la Tabla 1). En algunas realizaciones, el inhibidor que regula directa o indirectamente negativamente la señalización de p38 se selecciona del grupo que consiste en SB-202190, SB-203580, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257 y BIRB-796. En una realización adicional de la invención, el medio de cultivo comprende tanto: a) un inhibidor que se une a y reduce la actividad de una cualquiera o más de las quinasas del grupo que consiste en: ALK4, ALK5 y ALK7; y b) un inhibidor que se une a y reduce la actividad de p38. En una realización preferida, el medio de cultivo comprende un inhibidor que se une a y reduce la actividad de ALK5 y un inhibidor que se une a y reduce la actividad de p38.
[0061] En una realización, un inhibidor se une a y reduce la actividad de su destino (por ejemplo, TGF-beta o p38) en más de 10%; más del 30%; más del 60%; más del 80%; más del 90%; más del 95%; o más del 99% en comparación con un control, según lo evaluado por un ensayo celular. Los ejemplos de ensayos celulares para medir la inhibición de la diana son bien conocidos en la técnica como se describió anteriormente.
[0062] Un inhibidor puede tener un valor de CI50 igual o menos de 2.000 nm; menos de 1000 nM; menos de 100 nM; menos de 50 nM; menos de 30 nM; menos de 20 nM o menos de 10 nM. El valor de CI50 se refiere a la efectividad de un inhibidor para inhibir la función biológica o bioquímica de su objetivo. La CI50 indica qué cantidad de un inhibidor particular se requiere para inhibir una quinasa en un 50%. Los valores de CI50 se pueden calcular de
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acuerdo con los métodos de ensayo expuestos anteriormente. [0063] Un inhibidor puede actuar competitivamente, no competitivamente, o por inhibición mixta. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un inhibidor puede ser un inhibidor competitivo del bolsillo de unión a ATP de la cinasa diana.
[0064] Pueden existir los inhibidores en diversas formas, incluyendo sustratos naturales o modificados, enzimas, receptores, moléculas orgánicas pequeñas, tales como pequeñas moléculas orgánicas naturales o sintéticas de hasta 2000Da, preferiblemente 800Da o menos, peptidomiméticos, moléculas inorgánicas, péptidos, polipéptidos, aptámeros de oligonucleótidos antisentido y miméticos estructurales o funcionales de estos que incluyen moléculas pequeñas. El inhibidor de acuerdo con la invención también puede ser un aptámero. Como se utiliza en este documento, el término "aptámero" se refiere a cadenas de oligonucleótidos (ADN o ARN) que pueden adoptar conformaciones tridimensionales altamente específicas. Los aptámeros están diseñados para tener altas afinidades de unión y especificidades hacia ciertas moléculas diana, incluyendo proteínas extracelulares e intracelulares.
[0065] Por ejemplo, el inhibidor puede ser una molécula sintética pequeña con un peso molecular de entre 50 y 800 Da, entre 80 y 700 Da, entre 100 y 600 Da o entre 150 y 500 Da.
[0066] En algunas realizaciones, el inhibidor de molécula pequeña comprende un piridiniloimidazol o una pteridina disustituida 2,4 o una quinazolina, por ejemplo comprende:
[0067] Los ejemplos particulares de inhibidores que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a: SB-202190, SB-203580, SB-206718, SB-227931, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257, BIRB-796, A83-01 SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511 (véase la tabla 1). Un medio de cultivo de la invención puede comprender uno o más de cualquiera de los inhibidores enumerados en la Tabla 1. Un medio de cultivo de la invención puede comprender cualquier combinación de un inhibidor con otro inhibidor enumerado. Por ejemplo, un medio de cultivo de la invención puede comprender SB-202190 o SB-203580 o A83-01; o un medio de cultivo de la invención puede comprender SB-202190 y A83-01; o un medio de cultivo de la invención puede comprender SB-203580 y A83-01. La persona experta apreciará que otros inhibidores y combinaciones de inhibidores que se unen y reducen la actividad de los objetivos de acuerdo con la invención, pueden incluirse en un medio de cultivo o un suplemento de medio de cultivo de acuerdo con la invención.
[0068] Los inhibidores se pueden añadir al medio de cultivo a una concentración final que es apropiado, teniendo en cuenta el valor de CI50 del inhibidor.
[0069] Por ejemplo, SB-202190 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 50 nM y 100 uM, o entre 100 nM y 50 uM, o entre 1 uM y 50 uM. Por ejemplo, SB-202190 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 10 uM.
[0070] SB-203580 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 50 nM y 100 uM, o entre 100 nM y 50 uM, o entre 1 uM y 50 uM. Por ejemplo, SB-203580 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 10 uM.
[0071] VX-702 tal vez añadió al medio de cultivo a una concentración de entre 50 nM y 100 uM, o entre 100 nM y 50 uM, o entre 1 uM y 25 uM. Por ejemplo, VX-702 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 5 uM.
[0072] VX-745 tal vez añadió al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 50 uM, o entre 50 nM y 50 uM, o entre 250 nM y 10 uM. Por ejemplo, VX-745 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 1 uM.
[0073] PD-169316 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 100 nM y 200 uM, o entre 200 nM y 100 uM, o entre 1 uM y 50 uM. Por ejemplo, PD-169316 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 20 uM.
[0074] RO-4402257 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 50 uM, o entre 50 nM y 50 uM, o entre 500 nM y 10 uM. Por ejemplo, RO-4402257 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 1 uM.
[0075] BIRB-796 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 50 uM, o entre 50 nM y 50 uM, o entre 500 nM y 10 uM. Por ejemplo, BIRB-796 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 1
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uM.
[0076] A83-01 puede añadirse al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 10 uM, o entre 20 nM y 5 uM, o entre 50 nM y 1 uM. Por ejemplo, A83-01 puede añadirse al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
5 [0077] SB-431542 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 80 nM y 80 uM, o entre 100 nM y 40 uM, o entre 500 nM y 10 uM. Por ejemplo, SB-431542 se puede añadir al medio de cultivo en aproximadamente 1 uM.
10 [0078] SB-505124 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, SB-505124 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
[0079] SB-525334 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 10 nM y 10 uM, o entre 20 nM y 15 5 uM, o entre 50 nM y 1 uM. Por ejemplo, SB-525334 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 100 nM.
[0080] LY 36494 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, LY 36494 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 500 20 nM.
Tabla 1: Inhibidores de ejemplo de acuerdo con la invención
25
30
35
40
45
50
55
60
Inhibidor
Dianas CI50 (nM) Peso mole cular Nombre Formula
A83-01
ALK5 (TGFβR1) 12 421, 52 3-(6-metilo-2-piridinilo)-N-fenilo-4-(4quinolinilo)-1H-pirazol-1-carbotioamida C25H19N5S
ALK4
45
ALK7
7.5
SB431542
ALK5 94 384, 39 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-ilo)-5-(2-piridinilo)-1Himidazol-2-y l] benzamida C22H16N4O3
ALK4
ALK7
SB505124
ALK5 47 335, 4 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-IL-2-terc-butilo3Himidazol-4-ilo)-6-metilpiridina clorhidrato hidrato C20H21N3O2
ALK4
129
SB525334
ALK5 14.3 343. 42 6-[2-(1,1-dimetiletilo)-5-(6-metilo-2-piridinilo)1H-imidazol-4-ilo] quinoxalina C21H21N5
SD -208
ALK5 49 352, 75 2-(5-cloro-2-fluorofenilo)-4-[(4-piridilo)amino] pteridina C17H10ClFN6
LY-36494
TGRβRI 59 272, 31 4-[3-(2-piridinilo)-1H-pirazol-4-ilo]quinolina C17H12N4
TGFβRII
400
MLK7K
1400
LY364947
ALK5 59 272, 30 4-[3-(2-piridinilo)-1H-pirazol-4-ilo]quinolina C17H12N4
SJN-2511
ALK5 23 287, 32 2-(3-(6-metilpiridina-2-ilo)-1H-pirazol-4-ilo)-1,5naftiridina C17H13N5
SB202190
p38 MAP quinasa 38 331, 35 4-[4-(4-fluorofenilo)-5-(4-piridinilo)-1H-imidazol2-ilo] fenol C20H14N3OF
p38 α
50
p38 β
100
9
(continuación)
5
15
25
Inhibidor
Dianas CI50 (nM) Peso mole cular Nombre Formula
SB -203580
p38 50 377,4 4 4-[5-(4-fluorofenilo)-2-[4(metilsulfonilo)fenilo]-1H-imidazol-4 ilo]piridina C21H16FN3OS
p38β2
500
VX -702
p38α 4-20; (Kd = 3,7) 404,3 2 6-[(aminocarbonilo)(2,6difluorofenilo)amino]-2-(2,4-difluorofenilo)3-piridincarboxamida C19H12F4N4O 2
p38β
Kd = 17
VX -745
p38α 10 436,2 6 5-(2,6-diclorofenilo)-2-[2,4-difluorofenilo)tio]-6H-pirimido[1,6b]piridazina-6-ona C19H9Cl2F2N3 OS
PD -169316
p38 89 360,3 4-[5-(4-fluorofenilo)-2-(4-nitrofenilo)-1Himidazol-4-ilo]-piridina C20H13FN4O
RO4402257
p38α 14 Pirido [2,3-d] pirimidina-7(8H)-ona, 6-(2,4difluorofenoxi)-2-[[3-hidroxi-1-(2hidroxietilo) propil] un mino]-8-metilo
p38β
480
BIRB -
p38 4 527,6 1-[2-(4-metilfenilo)-5-terc-butilo-pirazol-3 C31H37N5O3
796
7 ilo]-3-[4-(2-morfolina-4-iletoxi)naftaleno-1
ilo] urea :: 3-[2-(4-metilfenilo)-5-terc-butilo
pirazol-3-ilo]-1-[4-(2-morfolina-4
iletoxi)naftaleno-1-ilo]urea: 3-[3-terc-butilo
1-(4-metilfenilo)-1H-pirazol-5-ilo]-1-{4-[2
(morfolina-4-ilo) etoxi] naftalen 1-ilo} urea
35 [0081] SD-208 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, SD-208 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
[0082] LY364947 puede añadirse al medio de cultivo a una concentración de entre 40 nM y 40 uM, o entre 80 nM y 20 uM, o entre 200 nM y 1 uM. Por ejemplo, LY364947 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 500 nM.
[0083] SJN 2511 se puede añadir al medio de cultivo a una concentración de entre 20 nM y 20 uM, o entre 40 nM y 10 uM, o entre 100 nM y 1 uM. Por ejemplo, SJN 2511 se puede añadir al medio de cultivo a aproximadamente 200
45 nM.
[0084] Por lo tanto, en algunas realizaciones, el inhibidor que regula negativamente directa o indirectamente señalización TGF-beta o p38 se añade al medio de cultivo a una concentración de entre 1 nM y 100 µM, entre 10 nM y 100 µM, entre 100 nM y 10 µM, o aproximadamente 1 µM, por ejemplo, en el que la concentración total de uno o más inhibidores es de entre 10 nM y 100 µM, entre 100 nM y 10 µM, o aproximadamente 1 µM.
[0085] Adicionalmente al inhibidor, medios de cultivo celular generalmente contienen un número de componentes que son necesarios para apoyar el mantenimiento y/o expansión de las células cultivadas. Un medio de cultivo celular de la invención, por tanto, normalmente contiene muchos otros componentes además de un inhibidor de
55 acuerdo con la invención. Las combinaciones adecuadas de componentes fácilmente se pueden formular por la persona experta, teniendo en cuenta la siguiente descripción. Un medio de cultivo de acuerdo con la invención será generalmente una solución de nutrientes que comprende componentes de cultivo celular estándar, tales como aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, una fuente de energía de carbono, y un tampón como se describe en más detalle a continuación. Otros componentes estándar de cultivo celular que se pueden incluir en el cultivo incluyen hormonas, tales como la progesterona, proteínas, tales como albúmina, catalasa, insulina y transferrina. Estos otros componentes de cultivo celular estándar componen el medio de cultivo "basal".
[0086] Un medio de cultivo según la invención puede ser generado por modificación de un medio de cultivo celular existente. El experto entenderá a partir del conocimiento general común de los tipos de medios de cultivo que 65 podrían ser utilizados para cultivo de células madre. Potencialmente medios de cultivo celular adecuados están disponibles comercialmente, e incluyen, pero no se limitan a Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM),
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5
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cultivo basal a una concentración de al menos 50 ng/ml, más preferiblemente al menos 100 ng/ml, más preferiblemente al menos 200 ng/ml, más preferiblemente al menos 300 ng/ml, más preferiblemente al menos 500 ng/ml. Una concentración más preferida de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondin 4 es de aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml. En algunas realizaciones, R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 se añade al medio de cultivo a una concentración de al menos 500 ng/ml, al menos 600 ng/ml, al menos 700 ng/ml, al menos 800 ng/ml, al menos 900 ng/ml, al menos 1 ug/ml, al menos 1,5 ug/ml o al menos 2 ug/ml. En otra realización preferida, R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 se añade al medio de cultivo a una concentración de aproximadamente 1 ug/ml o 1 ug/ml. En algunas realizaciones, Respondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 o R-espondina 4 se añade al medio de cultivo basal a una concentración de menos de 1.000 ng/ml, por ejemplo, menos de 800 ng/ml, a menos de 600 ng/ml, menos de 550 ng/ml, menos de 500 ng/ml, menos de 400 ng/ml, menos de 300 ng/ml o menos de 200 ng/ml, o menos de 100 ng/ml. En algunas realizaciones, dos o más (por ejemplo 2, 3 o 4) de R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4 ("R-espondina 1-4") se añaden al medio. Preferiblemente, cuando se añaden dos o más de Respondina 1-4, la concentración total de R-espondina asciende a las concentraciones descritas anteriormente. Cuando se dice que los medios de cultivo descritos en el presente documento comprenden "R-espondina 1-4", se quiere decir que el medio comprende uno cualquiera o más de medios de cultivo R-espondina 1, R-espondina 2, Respondina 3 y R-espondina 4. Cuando se dice que los medios de cultivo descritos en este documento comprenden "R-espondina", se quiere decir que el medio comprende uno cualquiera o más de R-espondina 1, R-espondina 2, Respondina 3, R-espondina 4 y un imitador de R-espondina.
[0099] Durante el cultivo de células madre, dicho miembro de la familia Wnt se añade preferiblemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se actualiza preferiblemente cada cuarto día.
[0100] En una realización preferida, un agonista de Wnt se selecciona del grupo que consiste en R-espondina, Wnt3a y Wnt 6. Más preferiblemente, R-espondina y Wnt-3a se utilizan ambos como agonista Wnt. Esta combinación es particularmente preferida ya que esta combinación sorprendentemente tiene un efecto sinérgico sobre la formación de organoide. Las concentraciones preferidas son de aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml para R-espondina y aproximadamente 100 ng/ml o 100 ng/ml de Wnt3a.
[0101] Los medios de cultivo de la invención pueden comprender uno o más ligandos de quinasa de tirosina de receptor. Un ejemplo de un ligando de quinasa de tirosina de receptor para su uso en la invención es EGF, que es el ligando para el EGFR de quinasa de tirosina de receptor. Muchos ligandos de quinasa de tirosina de receptor son también factores de crecimiento mitogénicos.
[0102] El medio de cultivo de la invención puede comprender uno o más del factor de crecimiento mitogénico. El uno
o más del factor de crecimiento mitogénico se puede seleccionar de una familia de factores de crecimiento que comprende factor de crecimiento epidérmico (EGF, Peprotech), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa, Peprotech), factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF, Peprotech), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, R&D Systems), y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, Peprotech). EGF es un factor mitogénico potente para una variedad de células ectodérmicas y mesodérmicas cultivadas y tiene un profundo efecto sobre la diferenciación de células específicas in vivo y in vitro y de algunos fibroblastos en cultivo celular. El precursor de EGF existe como una molécula unida a la membrana que se escinde proteolíticamente para generar la hormona peptídica de aminoácido 53 que estimula células. Un factor de crecimiento mitogénico preferido es EGF. EGF se añade preferiblemente al medio de cultivo basal a una concentración de entre 5 y 500 ng/ml o de al menos 5 y no superior a 500 ng/ml. Una concentración preferida es de al menos 10, 20, 25, 30, 40, 45, o 50 ng/ml y no superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, o 100 ng/ml. Una concentración más preferida es de al menos 50 y no superior a 100 ng/ml. Una concentración aún más preferida es de aproximadamente 50 ng/ml o 50 ng/ml. Las mismas concentraciones podrían ser utilizadas para un FGF, preferiblemente para FGF10 o FGF7. Si se utiliza más de un FGF, por ejemplo FGF7 y FGF10, la concentración de un FGF es como se define anteriormente y se refiere a la concentración total de FGF utilizado. Durante el cultivo de células madre, dicho factor de crecimiento mitogénico se añade preferiblemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se actualiza preferiblemente cada cuarto día. Cualquier miembro de la familia FGF se puede utilizar. FGF7 Preferiblemente, FGF7 y/o FGF10 se utiliza también se conoce como KGF (factor de crecimiento de queratinocitos). En una realización preferida adicional, una combinación de factores de crecimiento mitogénicos, tales como, por ejemplo, EGF y KGF, o EGF y BDNF, se añade al medio de cultivo basal. En una realización preferida adicional, una combinación de factores de crecimiento mitogénicos, tales como, por ejemplo, EGF y KGF, o EGF y FGF10, se añade al medio de cultivo basal. El factor de crecimiento mitogénico se puede añadir a un medio de cultivo a una concentración de entre 5 y 500 nanogramos/ml o al menos 5 y no más de 500 nanogramos/ml, por ejemplo al menos 10, 20, 25, 30, 40, 45, o 50 ng/ml y no superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, o 100 ng/ml. El factor de crecimiento mitogénico puede seleccionarse de entre el grupo constituido por EGF, TGF-alfa, KGF, FGF7 y FGF. Preferiblemente, un factor mitogénico se selecciona de los grupos constituidos por EGF, TGF-alfa y KGF o de EGF, TGF-alfa y FGF7 o de EGF, TGF-alfa y FGF o de EGF y KGF o de EGF y FGF7 o de EGF y un FGF o de TGF-alfa y KGF o de TGF-alfa y FGF7 o de TGF-alfa y un FGF. EGF puede ser reemplazado por TGF-alfa. En algunas realizaciones, el factor de crecimiento mitogénico es el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). En algunas realizaciones, el HGF se añade al medio de cultivo.
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describe a continuación.
Medios de cultivo intestinal
[0143] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para las pequeñas criptas intestinales, tales como pequeñas criptas intestinales murinas, comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente: EGF, tales como EGF murino; un inhibidor de BMP, tales como Noggin murino; y Respondina, tales como R-espondina-1 o 4 humana. En algunas formas de realización, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de TGF-beta (como A83-01) y/o un inhibidor de p38 (tales como SB202190). En algunas realizaciones, el medio de cultivo para criptas colónicas, tales como criptas del colon murino, comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente: un agonista de Wnt, como Wnt-3A humana recombinante o medio condicionado Wnt-3A; EGF, tales como EGF murino; un inhibidor de BMP, tales como Noggin murino; y R-espondina, tales como R-espondina-1 o 4 humana. En algunas formas de realización, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de TGF-beta (como A83-01) y/o inhibidor de AP38 (tales como SB202190).
[0144] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para las células humanas intestinales madre, pequeñas criptas intestinales humanas o criptas colónicas humanas (también conocidas como el medio de cultivo HISC), comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente: un agonista de Wnt, como Wnt-3A humana recombinante o medio acondicionado Wnt-3A; EGF; un inhibidor de BMP, tales como Noggin; R-espondina, como R-espondina-1 humana; un inhibidor de TGF-beta, tales como A83-01; un inhibidor de p38, tales como SB202190; gastrina; y nicotinamida. En algunas realizaciones, el inhibidor de p38 y/o de la gastrina pueden excluirse del medio de cultivo HISC.
[0145] En algunas realizaciones, la invención proporciona un medio de cultivo para el cultivo de las células intestinales, que comprende o que consiste en un medio basal, Wnt-3a, EGF, Noggin, cualquiera de R-espondina 14, un inhibidor de TGF-beta, nicotinamida, y preferiblemente un inhibidor de p38.
[0146] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para la expansión de pequeñas células del intestino o madre colon, por ejemplo pequeñas células del intestino o colon humano, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo que comprende DMEM/F12 avanzada, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), Wnt3A (medio acondicionado opcionalmente), cualquiera de R-espondina 1-4 (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (preferiblemente 50-100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10 mM), EGF (preferiblemente 10-50 ng/ml), la gastrina (preferentemente 10 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM). En una realización adicional, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 100 nM). En una realización adicional, este medio de cultivo comprende además un inhibidor ROCK, por ejemplo LY2157299.
[0147] En algunas realizaciones, la descripción describe un medio de cultivo para la diferenciación de las células intestinales, que comprende o que consiste en un medio basal, EGF, Noggin, un inhibidor de TGF-beta y un inhibidor de p38.
[0148] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para la diferenciación de células pequeñas del intestino o madre colon, por ejemplo pequeñas células del intestino o colon humano, comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo que comprende DMEM/F12 avanzada, B27 (50x), n-acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), Noggin (preferiblemente 50-100 ng/ml), EGF (preferiblemente 10-50 ng/ml), la gastrina (preferentemente 10 nM), un inhibidor de TGF-beta, para ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM) y un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 100 nM). En algunas realizaciones, la gastrina puede ser excluida de este medio de diferenciación. En algunas realizaciones, un inhibidor de gamma-secretasa se puede añadir al medio de diferenciación (preferiblemente a una concentración de 1 uM). Inhibidores de la gamma-secretasa pueden influir en las decisiones del destino celular durante la diferenciación por ejemplo, hacia las células secretoras, tales como las células caliciformes. En algunas realizaciones, una RANKL puede añadirse al medio de diferenciación (por ejemplo a una concentración de 100 ng/ml). RANKL puede influir en las decisiones del destino celular durante la diferenciación por ejemplo, hacia células M.
Medios de cultivo del cáncer
[0149] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para células de cáncer de colon, comprende o consiste en un medio basal, por ejemplo como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente: un agonista de Wnt, como Wnt-3A humana recombinante o medio acondicionado Wnt 3A; EGF; un inhibidor de BMP, tales como Noggin; R-espondina, como R-espondina-1 humana; un inhibidor de TGF-beta, tales como A83-01; un inhibidor de p38, tales como SB202190; gastrina; y nicotinamida.
[0150] En una realización, el medio de cultivo para el carcinoma de colon, por ejemplo carcinoma de colon humano, comprende un medio basal (por ejemplo que comprende DMEM/F12 avanzada, B27 (50x), N-acetilcisteína (1 mM), primocina y/o P/S (antibióticos) (500x) y HEPES), R-espondina (medio opcionalmente acondicionado) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (preferiblemente 100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10 mM), EGF
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(preferiblemente 50 ng/ml), gastrina (preferentemente 50 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM), un inhibidor de p38, tales como SB202190 (preferentemente 10 uM), opcionalmente PGE2 (preferiblemente 10 nM) y/o un inhibidor de Rock (preferentemente 10 uM).
[0151] En algunas realizaciones, las células de cáncer de colon también se pueden cultivar en el medio de cultivo HISC. En algunas realizaciones, las células de cáncer de colon pueden ser cultivadas en el medio de cultivo HISC, en el que uno o más o todos de los siguientes quedan excluidos del medio: EGF, Noggin, R-espondina, inhibidor de TGF-beta y el inhibidor de p38. Las células cancerosas pueden tener mutaciones que activan constitutivamente o desactivan ciertas vías de crecimiento. Por ejemplo, muchos cánceres de colon dan como resultado la activación constitutiva de la ruta de Wnt. En tales casos, un medio de cultivo no requeriría un agonista Wnt. Otras mutaciones permitirían otros factores para quedar fuera del medio como se describe anteriormente. Otros cánceres epiteliales (carcinomas) también pueden ser cultivados en medios de cultivo de la invención. En una realización preferida, un organoide de cáncer obtiene a partir de células madre de cáncer se cultiva en un medio de cultivo que es adecuado para el crecimiento del correspondiente organoide de tejido normal obtenido a partir de células madre normales, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. Por ejemplo, un organoides de cáncer de estómago obtenerse mediante el cultivo de células madre de cáncer de estómago pueden ser cultivados en las mismas condiciones de cultivo como un organoide gástrico normal obtenido mediante el cultivo de células madre gástricas, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En otro ejemplo, un organoides de cáncer de páncreas se obtiene mediante el cultivo de células madre de cáncer de páncreas puede cultivarse en las mismas condiciones de cultivo como un organoide de páncreas normal, obtenido mediante el cultivo de células madre pancreáticas, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En otro ejemplo, un organoides de cáncer de próstata se obtiene mediante el cultivo de células madre de cáncer de próstata se pueden cultivar en las mismas condiciones de cultivo como un organoides de próstata normal se obtiene mediante el cultivo de células madre prostáticas, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En otro ejemplo, un organoides de cáncer de hígado se obtiene mediante el cultivo de células madre de cáncer de hígado se pueden cultivar en las mismas condiciones de cultivo como un organoides de hígado normal se obtiene mediante el cultivo de células madre de hígado, opcionalmente con ciertos factores excluidos del medio. En muchas situaciones puede ser preferible (o al menos más conveniente) cultivar organoides cancerosos en el medio de tejido normal (sin ningún factor de excluidos). El medio de tejido normal debe permitir que crezcan los cánceres con todos los orígenes genéticos, sin excluir ninguna mutación de cáncer particular.
[0152] Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un medio de cultivo para el cultivo de células de cáncer, por ejemplo células madre de cáncer, tales como adenocarcinoma o carcinoma de células de un tipo de tejido de interés, en el que el medio de cultivo comprende o consiste en los componentes del medio de cultivo utilizado para cultivar las células a partir del tejido canceroso no correspondiente de interés, opcionalmente en el que uno o más de los siguientes son excluidos del medio que se utiliza para cultivar las células no cancerosas del tipo de tejido de interés: Wnt 3a, EGF, Noggin, R-espondina, inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de p38, nicotinamida, gastrina, FGF10 y HGF.
Medio de cultivo de adenoma
[0153] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para los adenomas intestinales, tales como adenomas intestinales murinos comprende un medio basal, por ejemplo como se describe anteriormente, que comprende, además, EGF, tales como EGF murino.
Medios de cultivo gástrico
[0154] En algunas realizaciones, la invención proporciona un medio de cultivo para el cultivo de células gástricas, que comprende o consiste de un medio basal, Wnt-3a, EGF, Noggin, cualquiera de R-espondina 1-4, un inhibidor de TGF-beta, gastrina, nicotinamida, FGF-10, y preferentemente un inhibidor de p38.
[0155] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para las células madre gástricas, por ejemplo, células madre gástricas humanas comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo que comprende
[0156] DMEM/F12 avanzada, B27 (50x), N-acetilcisteína (1 mM), primocina y/o P/S (antibióticos) (500x) y glutamina/glutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio acondicionado opcionalmente) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (medio opcionalmente acondicionado) (preferiblemente 100 ng/ml), Wnt3A (medio opcionalmente acondicionado), nicotinamida (preferiblemente 5 mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 200 ng/ml), gastrina (preferiblemente 1 nM), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 2 uM). El medio de cultivo para las células madre gástricas opcionalmente comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190 (preferiblemente 10 nM). El medio de cultivo para las células madre gástricas comprende opcionalmente además PGE2 (preferiblemente 500 nM). El medio de cultivo para las células madre gástricas opcionalmente comprende además un inhibidor de Rock (preferentemente 10 uM).
[0157] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para las células madre gástricas, por ejemplo células gástricas murinas comprende o consiste en un medio basal (por ejemplo que comprende DMEM/F12 avanzada, B27 (50x), N
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acetilcisteína (1 mM), primocina y/o P/S (antibióticos) (500x) y glutamina/glutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio acondicionado opcionalmente) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (medio acondicionado opcionalmente) (preferiblemente 100 ng/ml), Wnt3A (medio opcionalmente acondicionado), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 200 ng/ml), la gastrina (preferiblemente 1 nM) y un inhibidor de Rock (preferentemente 10 uM). En algunas formas de realización, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de TGF-beta (como A83-01) y/o un inhibidor de p38 (tales como SB202190).
Medios de cultivo de próstata
[0158] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para la expansión de células madre de próstata comprende testosterona, opcionalmente dihidrotestosterona (también denominada en el presente documento como DHT). La testosterona es una hormona esteroide del grupo de andrógenos. En los seres humanos, un gran porcentaje de testosterona se somete a reducción 5α para formar el andrógeno más potente, dihidrotesterona. La testosterona, dihidrotestosterona o un imitador de testosterona (por ejemplo, una molécula que imita la actividad de unión a testosterona a un receptor de andrógenos) se pueden añadir a un medio de cultivo de la invención. Por lo tanto, cuando se utiliza el término testosterona, que puede siempre ser sustituida por la dihidrotestosterona o un imitador de testosterona. Los inventores han demostrado que la adición de testosterona a un medio de cultivo para las células madre de la próstata, los resultados en el aumento de la diferenciación, sino también en la continua expansión de la población de células madre (por ejemplo, véanse las Figuras 41 -45). Esto es muy sorprendente porque la bibliografía enseña que la testosterona juega un papel importante en la diferenciación de células actuando para suprimir la proliferación y mantener la diferenciación terminal (Mirochnik et al. PLoS One, 7 (3), e31052, 2012;. Niu et al. Oncogene. 29, 3593-3604, 2010). El experto habría esperado que la adición de testosterona en un medio de cultivo para la próstata se traduciría en organoides completamente diferenciados con ningún potencial de expansión adicional. Esto sería similar a lo que se observa cuando los organoides de colon, páncreas y el hígado se diferencian en un medio de diferenciación. Sin embargo, por el contrario, los presentes inventores han encontrado que aunque la testosterona aumenta la diferenciación, sino que también permite la expansión de células madre para continuar. Por lo tanto, organoides cultivados en testosterona que comprende medio de cultivo sorprendentemente comprenden células madre y células diferenciadas, es decir, células luminales y células basales.
[0159] En algunas realizaciones, el medio de cultivo para la obtención de un organoide próstata comprende un medio basal y la testosterona, dihidrotestosterona opcionalmente y cualquiera de R-espondina 1-4 o un imitador Respondina. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de BMP, por ejemplo Noggin. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende además un ligando de la quinasa del receptor de tirosina, opcionalmente en el que el ligando de quinasa de tirosina de receptor es un factor de crecimiento mitogénico, tales como EGF, FGF, KGF o HGF. En algunas realizaciones, el medio de cultivo para la obtención de un organoide próstata comprende EGF, Noggin, cualquier uno o R-espondina 1-4 y la testosterona.
[0160] En una realización preferida, el medio de cultivo para células de la próstata comprende un inhibidor de TGFbeta. En algunas realizaciones, el medio de cultivo para células de la próstata comprende EGF, Noggin, cualquiera de R-espondina 1-4, un inhibidor de TGF-beta y la testosterona. En algunas realizaciones, el medio de cultivo para células de la próstata comprende además un inhibidor de p38. En algunas realizaciones, un medio de cultivo para la obtención de un organoide próstata no comprende un inhibidor de la invención, por ejemplo un inhibidor de TGFbeta y/o un inhibidor de p38. En algunas realizaciones el medio de cultivo para las células madre de próstata no comprende testosterona. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende un medio basal, EGF, Noggin y cualquiera de R-espondina 1-4 y, opcionalmente, un inhibidor de TGF-beta, y no comprende testosterona.
[0161] En algunas realizaciones, la invención proporciona un medio de cultivo para el cultivo de células de la próstata, que comprende o que consiste en un medio basal, EGF, cualquiera de R-espondina 1-4, Noggin, nicotinamida un inhibidor de TGF-beta, y preferiblemente Wnt-3a y FGF-10. En algunas realizaciones, el medio de cultivo para el cultivo de células de la próstata comprende además la testosterona, por ejemplo (dihidro) testosterona. En algunas realizaciones el medio de cultivo comprende además un inhibidor p38. En algunas realizaciones, el medio de cultivo para células de la próstata, por ejemplo ratón, humana, normal o carcinoma, comprende un medio basal (por ejemplo que comprende DMEM/F12 avanzada, B27 (50x), N-acetilcisteína (1 mM) y glutamina/glutamax), cualquiera de R-espondina 1-4 (medio acondicionado opcionalmente) (preferiblemente 1 ug/ml), Noggin (medio acondicionado opcionalmente) (preferiblemente 100 ng/ml), nicotinamida (preferiblemente 10 mM), EGF (preferiblemente 50 ng/ml), FGF10 (preferiblemente 100 ng/ml), un inhibidor de TGF-beta, por ejemplo A83-01 (preferiblemente 500 nM), (dihidro) testosterona (preferiblemente 1 nM) 10 nM y, opcionalmente, Wnt-3A. En algunas formas de realización, este medio de cultivo comprende además un inhibidor de Rock (preferiblemente 10 uM). En algunas realizaciones, el medio de cultivo para células de la próstata comprende además un inhibidor de p38, por ejemplo SB202190. En algunas formas de realización, en que células de la próstata del ratón se cultivan, el inhibidor de TGF-beta puede estar excluido del medio de cultivo. En otras realizaciones, nicotinamida, FGF10 y/o el inhibidor ROCK puede estar excluido del medio de cultivo.
Medios de cultivo de páncreas
[0162] En algunas realizaciones, la invención proporciona un medio de cultivo para la expansión de las células del
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realizaciones, el paso de diferenciación en los medios DM no se lleva a cabo, por ejemplo, en algunos métodos, las células se trasplantan y se dejaron diferenciar in vivo. Del mismo modo, hay medios de cultivo de expansión y medios de cultivo de diferenciación para otros tejidos, tales como el páncreas, intestino delgado y colon (véase más arriba).
[0171] En una realización, el medio de expansión de hígado comprende EGF, un agonista de Wnt, FGF, y nicotinamida. Preferiblemente, el agonista de Wnt es R-espondina 1-4 (por ejemplo, uno cualquiera o más de Respondina 1, 2, 3, y 4) y por lo que el medio de expansión se conoce como "ERFNic". Un medio de expansión particularmente preferido comprende, además, HGF y se conoce como "ERFHNic".
[0172] En algunas realizaciones, el medio de expansión hígado es suplementado con un inhibidor de TGF beta. En algunas realizaciones, TGF beta está presente en al menos 5 nM, por ejemplo, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 300 nM, al menos 450 nM, al menos 475 nm, por Ejemplo 5 nM-500 mM, 10 nM-100 mM, 50 nM -700uM, 50 nM-10 uM, 100 nM-1000 nM, 350-650nM o más preferiblemente 500 nM. La presencia de un inhibidor de TGF beta en los medios de expansión es particularmente preferido para realizaciones de células humanas.
[0173] En algunas realizaciones, la invención proporciona un medio de cultivo para la expansión de las células del hígado, que comprende o que consiste en un medio basal, cualquiera de R-espondina 1-4, Noggin, nicotinamida, EGF, FGF10, HGF, gastrina, un inhibidor TGF-beta y PGE2, y preferiblemente Wnt-3a.
[0174] En algunas realizaciones, el medio de expansión hígado comprende, además, inhibidor AP38.
[0175] En algunas realizaciones, el medio de expansión hígado se complementa con un activador de la vía de señalización de prostaglandina (también llamado un activador de vía de prostaglandina) (véase Figura 24). Por ejemplo, el medio de expansión de hígado puede ser suplementado con uno cualquiera o más de los compuestos seleccionados de la lista que comprende: fosfolípidos, ácido araquidónico (AA), prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina G2 (PGG2), prostaglandina F2 (PGF2), prostaglandina H2 (PGH2), prostaglandina D2 (PGD2). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de expansión hígado se complementa con PGE2 y/o AA. En algunas realizaciones, PGE2 se añade al medio de expansión de hígado a una concentración final de al menos 10 nM, al menos 30 nM, al menos 40 nM, al menos 45 nM, al menos 50 nM, por ejemplo entre 10 nM y 500 nM, entre 10 nM y 400 nM, entre 10 nM y 300 nM, entre 10 nM y 200 nM, entre 10 nM y 100 nM, entre 20 nM y 50 nM. En una realización preferida, PGE2 se añade al medio de expansión de hígado a una concentración final de 50 nM. En algunas realizaciones, se añade AA al medio de expansión de hígado a una concentración final de al menos 1 ug/ml, por ejemplo al menos 3 ug/ml, al menos 5 ug/ml, al menos 8 ug/ml, al menos 9 ug/ml, al menos 10 ug/ml, entre 1 ug/ml y 1,000 ug/ml, entre 1 ug/ml y 500 ug/ml, entre 1 ug/ml y 100 ug/ml, entre 1 ug/ml y 50 ug/ml, o entre 5 ug/ml y 10 ug/ml. En una realización preferida, se añade AA al medio a una concentración final de 10 ug/ml.
[0176] En una realización preferida, el medio de expansión de hígado se complementa con tanto un inhibidor de TGF-beta como un activador de la vía de señalización de la prostaglandina (por ejemplo, PGE2 y/o AA) y, opcionalmente, un inhibidor de p38.
[0177] En realizaciones preferidas, el medio de expansión de hígado comprende adicionalmente gastrina.
[0178] En una realización, el medio de diferenciación de hígado comprende EGF, un inhibidor de TGF-beta, FGF (por ejemplo, FGF10, FGF2 o cualquier otro miembro de la familia FGF adecuada) y un inhibidor de Notch. En una realización, el inhibidor de TGF-beta es A83-01 y/o el inhibidor de Notch es DAPT. Este medio de diferenciación se denomina aquí como "EAFD" y es un medio de diferenciación preferida de la invención. FGF puede estar opcionalmente sustituido por HGF o, alternativamente, tanto FGF y HGF puede estar presente o ausente en el medio de diferenciación. En algunas realizaciones, EGF podría ser sustituido por HGF u otro ligando de quinasa de tirosina de receptor. La dexametasona se puede añadir también, por ejemplo a una concentración de entre 10 nM a 10 uM. El medio de diferenciación de hígado puede incluir opcionalmente un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 o AA. Sin embargo, este componente también puede ser excluido del medio de diferenciación. En algunas realizaciones, la oncostatina M puede añadirse también, por ejemplo en un intervalo de concentración entre 1 ng/ml a 1 mg/ml, para ayudar a la diferenciación al destino de hepatocitos.
[0179] En algunas realizaciones, la descripción describe un medio de cultivo para la diferenciación de las células del hígado que comprende o que consiste en un medio basal, Noggin, EGF, la gastrina, un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de gamma-secretasa como DAPT o DBZ, y preferiblemente Wnt-3a.
[0180] En algunas realizaciones, las células del hígado puede ser inicialmente cultivadas en un medio de expansión que contiene adicionalmente Wnt y Noggin, por ejemplo un medio "ENRW" que contiene EGF, Noggin, R-espondina y Wnt (por ejemplo, Wnt-3A), opcionalmente un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 o AA, opcionalmente un inhibidor de TGF-beta y, opcionalmente, FGF, HGF, nicotinamida. En una realización preferida, el medio de expansión de hígado se complementa con uno de o más preferiblemente ambos de un inhibidor de TGFbeta y un activador de la vía de señalización de la prostaglandina (por ejemplo, PGE2 y/o AA).
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[0181] En algunas realizaciones, los medios de expansión para el hígado comprende EGF, Noggin, gastrina, FGF, nicotinamida, un inhibidor de TGF-beta tales como A83-01, HGF, R-espondina 1-4 (por ejemplo, uno cualquiera o más de R-espondina 1, 2, 3 y 4) y PGE2.
[0182] En una realización preferida, las células del hígado inicialmente pueden cultivarse en un medio de expansión, que contiene EGF, noggin, gastrina, FGF10, nicotinamida, A8301, HGF y cualquiera de R-espondina 1-4 suplementado con PGE2 y/o AA. R-espondina 1-4 se puede proporcionar en forma de medios acondicionados con RSPO. Por ejemplo, los medios de expansión pueden contener EGF (100 ng/ml, Invitrogen); noggin (25 ng/ml, Peprotech); gastrina (10 nM, Sigma); FGF10 (por ejemplo, 100 ng/ml, Peprotech); nicotinamida (10 mM, Sigma); A8301 (500 nM, Tocris); HGF (50 ng/ml, Peprotech); Medios acondicionados por RSPO (10%, por ejemplo 1 ug/ml) suplementado con PGE2 (50 nM) y/o AA (10 ug/ml). El medio de expansión también puede contener un inhibidor de Rock.
[0183] Cuando la expansión de las células del hígado de ratón, uno o más de los siguientes componentes pueden ser excluidos del medio de cultivo descrito anteriormente: inhibidor de TGF-beta (por ejemplo, A83-01) y PGE2.
[0184] Los inventores han encontrado que este medio es óptimo para estimular la expansión inicial de las células durante los primeros días. Por lo tanto, este primer medio de expansión se refiere a veces aquí como EM1. En algunas realizaciones, la Wnt y Noggin se eliminan después de aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o más, por ejemplo, 2 semanas, 1 mes, 5 semanas, 8 semanas, 2 mes 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, 14 meses o más. En algunas realizaciones, las células a continuación se pueden expandir en un medio de expansión de la invención, como se describe anteriormente que no contiene Wnt o Noggin. Este segundo medio de expansión se refiere a veces aquí como EM2. En algunas realizaciones, las células se cultivan en EM2 durante aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o un período de tiempo más largo, tales como 3, 4, 5, 10, 20 o más semanas. El medio de cultivo puede entonces ser cambiado a un medio de diferenciación optimizada, como se describe anteriormente, que contiene un inhibidor de TGF-beta y un inhibidor de Notch. Típicamente, el medio de diferenciación no contiene un agonista de Wnt, R-espondina o nicotinamida. En algunas realizaciones, el medio de diferenciación no contiene un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 o AA. Esto anima a la diferenciación de las células hacia los hepatocitos maduros y colangiocitos. Estas células son adecuadas para el trasplante en seres humanos o animales.
Media de expansión (EM2) para el hígado:
[0185] En un aspecto, se proporciona un medio de cultivo celular que comprende o consiste en un medio basal para células de animales o humanas al que se añade: Factor de Crecimiento Epidérmico, un FGF capaz de unirse a FGFR2 o FGFR4, preferiblemente FGF10 como un factor de crecimiento mitógeno, nicotinamida, y preferiblemente, un agonista de Wnt, preferiblemente R-espondina 1-4. Este medio se denomina EM2. Este medio "EM2" se prefiere para la expansión de las células del hígado.
[0186] En algunas realizaciones, EM2 comprende una vía de activador de prostaglandina tales como PGE2 y/o AA.
[0187] En algunas realizaciones, EM2 comprende un inhibidor de TGF-beta tales como A83-01.
[0188] Preferiblemente, el agonista de Wnt es R-espondina 1-4. Un medio que comprende EGF, R-espondina 1-4, FGF y nicotinamida que se denomina aquí ERFNic.
[0189] En algunas realizaciones, el medio EM2 no comprende noggin, y más preferiblemente no comprende un inhibidor BMP. En algunas realizaciones, el medio EM2 no comprende Wnt, por ejemplo Wnt-3a.
[0190] En algunas realizaciones, el HGF está presente además de FGF. Un medio preferido que comprende HGF además de FGF es ERFHNic (EGF + R-espondina (preferiblemente R-espondina 1-4) + FGF (preferiblemente FGF10) + HGF + nicotinamida + un inhibidor de la vía de prostaglandina tales como PGE2 y/o AA y un inhibidor TGF-beta. Los inventores han encontrado que el medio ERFHNic contiene el inhibidor de TGF-beta y el activador vía de prostaglandina es el medio óptimo para la expansión a largo plazo de las células. En ausencia de HGF, las células no permanecen viables en cultivo durante más tiempo de tres meses. Además, en ausencia de HGF, después de 10 pasajes, las células mostraron una desventaja de crecimiento en comparación con células cultivadas en presencia de HGF como se evidencia por una relación de proliferación inferior. En particular, después de 15 pasajes, las células no eran organoides en crecimiento en la misma relación de velocidad en ausencia de HGF como en presencia de HGF. Por lo tanto, se encontró que el HGF era esencial para mantener una buena tasa de proliferación durante el cultivo a largo plazo. Por lo tanto la invención proporciona el uso de un medio ERFHNic de la invención para el cultivo de células durante al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, más preferiblemente al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 24, al menos 25, al menos 30 o más meses, por Ejemplo 3 o más años. En la práctica, algunas formas de realización de la invención comprenden el uso de EM2 por alrededor de 20-50 pasajes de las células. Por ejemplo, las células pueden ser divididas 4-8 veces una vez por semana durante 7-10 semanas seguidas. Preferiblemente, las células se expandirán a un ritmo de aproximadamente 4-5 veces por semana o más
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desea. [0196] El "Suplemento B27" (disponible en Invitrogen, Carlsbad, CA; www.invitrogen.com; actualmente nº de catálogo 17504-044; y desde PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; www.paa.com;. Nº de catálogo F01-002; Brewer et al, J Neurosci Res, 35 (5): 567-76, 1993) puede usarse para formular un medio de cultivo que comprende biotina, colesterol, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, retinol, acetato de retinilo, selenita de sodio, triyodotironina (T3), DL-alfa-tocoferol (vitamina E), albúmina, insulina y transferrina. Suplemento B27 es suministrado por PAA Laboratories GmbH como un concentrado líquido 50x, que contiene entre otros ingredientes biotina, colesterol, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, retinol, acetato de retinilo, selenita de sodio, triyodotironina (T3), DL-alfa tocoferol (vitamina E), albúmina, insulina y transferrina. De estos ingredientes, al menos, ácido linolénico, retinol, acetato de retinilo y triyodotironina (T3) son agonistas de los receptores nucleares de hormonas. Suplemento B27 se puede añadir a un medio de cultivo como un concentrado o diluido antes de la adición a un medio de cultivo. Se puede utilizar a una concentración final de 1x o en otras concentraciones finales. El uso del suplemento B27 es una manera conveniente de incorporar biotina, colesterol, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, retinol, acetato de retinilo, selenita de sodio, triyodotironina (T3), DL-alfatocoferol (vitamina E), albúmina, insulina y transferrina en un medio de cultivo de la invención.
[0197] Por ejemplo, un medio de cultivo celular puede comprender o consistir en un medio basal al que se añade: EGF y R-espondina 1 suplementada con FGF10, HGF y nicotinamida; por ejemplo, EGF (50 ng/ml) y R-espondina 1 (1 ug/ml) suplementada con FGF10 (100 ng/ml), HGF (25-50ng/ml), nicotinamida (110 mM), un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 (50 nM) y/o AA (10 ug/ml) y un inhibidor de TGF-beta tales como A83-01 (500 nM). En algunas realizaciones el medio comprende adicionalmente un inhibidor de p38. Los inventores han encontrado que este medio puede ser utilizado para la expansión a largo plazo de las células. Por lo tanto, se prefiere este medio de cultivo celular para su uso como un EM2 de la invención. El medio basal se complementa preferiblemente con B27, N2 y 200 ng/ml de N-acetilcisteína. En algunas realizaciones, el medio basal es DMEM/F12 avanzada. Sin embargo, cualquier otro medio basal adecuado puede ser utilizado.
[0198] Otro ejemplo de un medio de cultivo celular, y método de uso de este medio comprende o consiste en DMEM/F12 avanzada preferiblemente suplementada con B27, N2, 200 ng/ml de N-acetilcisteína, 50 ng/ml EGF, 1 µg/ml R-espondina 1, 10 nM gastrina, 100 ng/ml de FGF10, 10 mM de nicotinamida, 50 ng/ml de HGF, 50% Wnt medio acondicionado, un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 (50 nM) y/o AA (10 ug/ml) y un inhibidor de TGF-beta tales como A83-01 (500 nM) y, preferiblemente 10-100ng/ml de Noggin. Medio acondicionado Wnt comprende DMEM avanzada, P/S, B27, N2 y también FCS. Células 293T transfectadas con Wnt3A plásmido de expresión producen Wnt. Todo el medio se toma después de unos pocos días (es decir, con Wnt secretada) y se utiliza como la fuente de Wnt.
[0199] La invención proporciona por lo tanto un medio de cultivo celular, que comprende o que consiste en un medio basal para células de animales o humanas al que se añade:
Factor de crecimiento epidérmico, un FGF capaz de unirse a FGFR2 o FGFR4, preferiblemente FGF10 y HGF como factores de crecimiento mitogénicos,
un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 y/o AA,
un inhibidor de TGF-beta;
gastrina, nicotinamida, B27, N2 y N-Acetilcisteína, y preferentemente
un inhibidor de BMP más preferiblemente Noggin y
un agonista de Wnt, más preferiblemente R-espondina 1 y/o Wnt-3a.
[0200] La invención así abarca un primer medio de cultivo preferido comprende o consiste en un medio basal para células de animales o humanas al que se añade:
Factor de crecimiento epidérmico, FGF10 y HGF como factores de crecimiento mitogénicos,
un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 y/o AA,
un inhibidor de TGF-beta;
gastrina, nicotinamida, B27, N2 y N-acetilcisteína,
un inhibidor de BMP más preferiblemente Noggin y
un agonista de Wnt, más preferiblemente R-espondina 1 y Wnt-3a.
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[0201] En algunas realizaciones, se añade un inhibidor de p38 al medio de expansión. [0202] Este medio puede ser usado como un medio de cultivo celular EM1 de la invención para estimular la expansión inicial de las células. En algunas realizaciones, el medio usado como un medio de cultivo celular EM1 comprende todos los componentes de un medio de cultivo EM2 de la invención y comprende, además, Wnt-3a y Noggin.
[0203] En realizaciones en las que el medio basal se complementa con N-acetilcisteína, B27 y N2, se añade los siguientes preferiblemente al medio de cultivo: EGF, R-espondina 1, gastrina, FGF10, nicotinamida y HGF y medios condicionados Wnt y un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 y/o AA. Preferiblemente, el medio basal se complementa con N-acetilcisteína, EGF, R-espondina 1, gastrina, FGF10, nicotinamida y HGF y Wnt acondicionado de medios y un activador de vía de prostaglandina, tales como PGE2 y/o AA de acuerdo con las cantidades descritas anteriormente. Preferiblemente, un inhibidor de TGF-beta también está presente en las cantidades descritas en este documento.
[0204] Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 150 ng/ml a 250 ng/ml N-acetilcisteína; preferiblemente, el medio basal se complementa con, alrededor de o exactamente 200 ng/ml de N-acetilcisteína. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 40 ng/ml a 60 ng/ml de EGF; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 50 ng/ml de EGF. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 0,5 µg/ml a 1,5 µg/ml R-espondina 1; preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 1 µg/ml R-espondina 1. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 5 nM a 15 NM de gastrina; Preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 10 nM gastrina. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con FGF10 25200ng/ml, por ejemplo 70 ng/ml a 130 FGF10 ng/ml; Preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 100 ng/ml de FGF10. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 5mM a 15 mM de nicotinamida; Preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente 10 mM de nicotinamida. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 25 ng/ml a 100 ng HGF/ml, por ejemplo 35 ng/ml a 65ng/ml de HGF; Preferiblemente, el medio basal se complementa con aproximadamente o exactamente y 50 ng/ml HGF. Por ejemplo, en algunas formas de realización el medio basal puede ser suplementado con 35% a 65% de medio acondicionado de Wnt; Preferiblemente, el medio basal se suplementó con medio acondicionado-Wnt aproximada o exactamente 50%.
[0205] Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de expansión de hígado se complementa con un activador de la vía de señalización de prostaglandinas (véase Figura 24). Por ejemplo, el medio de expansión de hígado puede ser suplementado con cualquier uno o más de los compuestos seleccionados de la lista que comprende: fosfolípidos, ácido araquidónico (AA), prostaglandina E2 (PGE2), prostaglandina G2 (PGG2), prostaglandina F2 (PGF2), prostaglandina H2 (PGH2), prostaglandina D2 (PGD2). Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de expansión de hígado se complementa con PGE2 y/o AA. En algunas realizaciones, PGE2 se añade al medio de expansión de hígado a una concentración final de al menos 10 nM, por ejemplo, entre 10 nM y 500 nM, entre 10 nM y 400 nM, entre 10 nM y 300 nM, entre 10 nM y 200 nM, entre 10 nM y 100 nM, entre 20 nM y 50 nM. En una realización preferida, PGE2 se añade al medio de expansión de hígado a una concentración final de 50 nM. En algunas realizaciones, se añade AA al medio de expansión de hígado a una concentración final de al menos 1 ug/ml, por ejemplo entre 1 ug/ml y 1,000 ug/ml, entre 1 ug/ml y 500 ug/ml, entre 1 ug/ml y 100 ug/ml, entre 1 ml ug/ml y 50 ug/o entre 5 ug/ml y 10 ug/ml. En una realización preferida, se añade AA al medio a una concentración final de 10 ug/ml.
[0206] En algunas realizaciones uno o ambos de gastrina y N2 no están presentes en el medio de cultivo celular.
[0207] Preferiblemente, el medio basal es DMEM/F12 avanzada.
[0208] Este primer medio de cultivo (por ejemplo, EM1, EM2 o ambos EM1 y EM2) se utiliza preferentemente durante las primeras dos semanas del método de cultivo de la invención. Sin embargo, puede ser utilizado para un período de tiempo más corto, tal como, por 1, 2, 3, 5, 7, o 10 días, o un período de tiempo más largo, tal como 3, 4, 5, 10, 20 o más semanas, 5 meses o más, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más.
Medio de diferenciación (DM) para el hígado:
[0209] En otro aspecto, se describe un medio de cultivo de segunda célula que comprende o consiste en un medio basal para células de animales o humanas al que se añade: EGF, un inhibidor de TGF-beta, un inhibidor de Notch y un activador de la vía de prostaglandinas, tales como PGE2 y/o AA. Los inventores han encontrado que este medio es útil para diferenciar células. El medio utilizado para la diferenciación de las células puede ser referido aquí como DM.
[0210] Preferiblemente, el segundo medio de cultivo celular también comprende FGF y/o HGF.
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un organoide de carcinoma, un organoide de carcinoma de colon, un organoide de próstata o un organoide de carcinoma en una matriz extracelular. Preferiblemente, en realizaciones en las que está presente un inhibidor de TGF-beta y/o inhibidor de medio de cultivo celular p38 permite la supervivencia y/o proliferación, preferiblemente la supervivencia y la proliferación de una población de células o organoide de la invención. Preferiblemente, realizaciones en las que está presente inicialmente en un medio de cultivo celular un inhibidor de TGF-beta y/o inhibidor de p38 pero luego se retira del medio (por ejemplo, al no añadir cuando el medio se actualiza), permiten la supervivencia y/o diferenciación, preferiblemente la supervivencia y la diferenciación de una población de células o organoide de la invención.
[0219] En algunas realizaciones, se añade un inhibidor de p38 para cualquiera de los medios descritos en este documento.
[0220] El medio de cultivo celular término es sinónimo de medio, medio de cultivo o medio celular.
Usos de los medios de cultivo de la invención
[0221] La invención también se refiere al uso de un medio de cultivo de la invención para la ampliación y/o la diferenciación de una célula madre, la población de células madre, fragmento de tejido o organoide.
[0222] En algunas realizaciones, la célula madre, la población de células madre, fragmento de tejido o organoide se selecciona del grupo que consiste en una o más células madre intestinales, pequeñas criptas intestinales, criptas colónicas, células madre gástricas, células madre del hígado, células del páncreas y las células madre de la próstata madre.
[0223] En algunas realizaciones, la célula madre, la población de células madre, fragmento de tejido o organoide es obtenible a partir de un tejido normal.
[0224] En algunas realizaciones, la célula madre, la población de células madre, fragmento de tejido o organoide es obtenible a partir de un tejido enfermo, por ejemplo a partir de un adenoma, un carcinoma, un adenocarcinoma, un intestino de un paciente que tiene fibrosis quística o un intestino de un paciente que tiene la enfermedad inflamatoria intestinal.
Células madre cultivadas de acuerdo con la invención
[0225] Las células madre se encuentran en muchos órganos de seres humanos y ratones adultos. Aunque puede haber una gran variación en las características exactas de las células madre adultas en tejidos individuales, las células madre adultas comparten al menos las siguientes características: que retienen un fenotipo indiferenciado; su descendencia puede diferenciarse hacia todos los linajes presentes en el tejido pertinente; que conservan capacidades de auto-mantenimiento durante toda la vida; y que son capaces de regenerar el tejido pertinente después de la lesión. Las células madre residen en un lugar especializado, el nicho de células madre, que suministra los contactos y señales entre células adecuadas para el mantenimiento de dicha población de células madre. Las células madre según la invención expresan preferiblemente Lgr5.
[0226] En una realización, la invención proporciona una población de células o uno o más organoides que comprenden dichas células madre que han sido generadas u obtenidas mediante el cultivo de células madre o fragmentos de tejido de acuerdo con la invención, que han sido cultivados durante por lo menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 9 meses, o al menos 12 meses o más.
[0227] Una "población" de las células es cualquier número de células mayor que 1, pero es preferiblemente al menos 1x103 células, al menos 1x104 células, al menos 1x105 células, al menos 1x106 células, al menos 1x107 células, al menos 1x108 células, o al menos 1x109 células.
[0228] Las células madre de la invención cultivadas de acuerdo con la invención pueden ser células madre humanas. Las células madre de la invención cultivadas de acuerdo con la invención pueden ser células madre epiteliales.
[0229] En algunas realizaciones, las células madre de la invención y/o cultivos de acuerdo con la invención no son células madre embriónicas. En algunas formas de realización las células madre de la invención y/o cultivos de acuerdo con la invención no son células madre embrionarias humanas. Preferiblemente, las células madre de la invención son células madre adultas.
[0230] En una realización preferida, las células madre pueden ser células madre epiteliales humanas. Células madre epiteliales humanas incluyen células madre de origen de tejido epitelial humano. Estas incluyen, pero no se limitan a tejido pancreático, intestino delgado, gran intestinal, córnea, tejidos olfativos, respiratorios, gástricos, el hígado y la piel, de mama y/o tejidos prostáticos, por ejemplo, un tejido seleccionado del grupo que consiste de páncreas,
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de moléculas pequeñas relacionadas con las vías de señalización pertinentes, tales como ERK, p38, JNK, PTEN, ROCK, y Hedgehog, se ensayaron. En el estado actual de la técnica, no habría ninguna forma razonable de predecir el resultado de cada uno de estos compuestos adicionales en las propiedades del medio de cultivo.
Tabla 2: Lista de los reactivos utilizados para la optimización del cultivo de organoides del intestino humano
Primera proyección (WENR **)
Descripción
Fuente Concentración Actividad*
Hormonas, vitaminas, etc.
Hidrocortisona
Sigma 500 nM 0
*** Gastrina
Sigma 1 uM 1+
Exendina-4
Análogo de GLP1 Sigma 100 nM 0
Nicotinamida
Derivado de vitamina B Sigma 10 mM 3+
Ácido L-ascórbico
Vitamina C Sigma 10 uM 0
Mezcla de antioxidante
Sigma 1x 0
Mezcla de lípidos
Sigma 1x 0
PGE2
Sigma 10 uM 1+ (quística)
Toxina del cólera
Sigma 100 nM 1+ (quística)
Factores de crecimiento
BDNF
Peprotech 100 ng/ml 0
GDNF
Peprotech 100 ng/ml 0
FGF2
Peprotech 100 ng/ml 0
FGF10
Peprotech 100 ng/ml 0
Folistatina
Peprotech 100 ng/ml 0
Cry61
Peprotech 1 ug/ml 0
LIF
Millipore 1000 U/ml 0
Segunda proyección (WENR + gastrina + nicotinamida)
Inhibidores de molécula pequeña
PD98059
Inhibidor de ERK Sigma 10 uM 1-
SB203580
Inhibidor de p38 Sigma 1-10uM 2+
SB202190
Inhibidor de p38 Sigma 1 -10 uM 2+
SP600125
Inhibidor de JNK Sigma 10 uM 0
PS48
Activador de PDK1 Sigma 5 uM 0
Y27632
Inhibidor ROCA Sigma 10 uM 1+ quística
Ciclopamina
Inhibidor hedgehog Sigma 100 nM 1
5 Azacitidina
Inhibidor de la metilasa de ADN Stemolécula 1-
Dorsomorfina
Inhibidor de bmp Stemolécula 0
A83-01
Inhibidor ALK4,5,7 Tocris 50n-1 uM 3+
Trihidrato VO-OHpic
Inhibidor de PTEN Sigma 500 nM 3
Pifithrina-α
Inhibidor de p53 Sigma 0
BIX01294
Inhibidor G9a HMTasa Stemolecule 1-
Segunda proyección (WENR + gastrina + nicotinamida)
Inhibidores de molécula pequeña
* Escala de Actividad (eficiencia del chapado se comparó con el control después de 4 días de cultivo):
0 = sin cambio; 1+ =<50% de aumento; 2+ = aumento 50-100%; 3+ =>100% de aumento; 1-= 050%; 2-= 50-100% de disminución; 3-=>100% de disminución. ** WENR comprende EGF+Noggin + R-espondina + Wnt-3a *** Destacado en negrita son los compuestos que mostraron la mayor mejora al medio de cultivo.
[0518] En resumen, los inventores han establecido las condiciones de cultivo a largo plazo bajo las cuales criptas individuales o células derivadas de murino intestino delgado (SI) expandidas durante largos períodos de tiempo. Criptas en crecimiento se someten a múltiples eventos de fisión de cripta, mientras que se genera simultáneamente dominios epiteliales de tipo vellosidades en los que todos los tipos de células diferenciadas están presentes. Los inventores ahora han adaptado las condiciones de cultivo para cultivar organoides epiteliales similares de colon de ratón y humano SI y colon. En base al sistema de cultivo murino de intestino delgado, los inventores han optimizado el sistema de cultivo de colon murino y humano. Encontraron que la adición de Wnt3A al cóctel de factor de crecimiento permite criptas del colon de ratón para expandirse indefinidamente. La adición posterior de nicotinamida,
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sustitución del epitelio celular escamoso normal como resultado de metaplasia (Odze RD Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2009; 6: 478-90). El sello distintivo histológico del esófago de Barrett es la presencia de células caliciformes intestinales en el esófago. Al explotar la similitud entre Barrett y el epitelio intestinal, los inventores sometieron biopsias pequeñas de epitelio de Barrett (BE) a la condición de cultivo de colon humano. Bajo estas condiciones de cultivo, las células escamosas de esófago normales proliferaron de forma transitoria durante 1 semana, pero los organoides no podían ser pasados. Epitelio de esófago de Barrett podría mantenerse durante un máximo de 1 mes en condiciones HISC (Figura 5a). El organoide BE formó estructuras de organoides quísticos indistinguibles del de organoides de colon humanos senescentes, y típicamente se sometieron a la detención del crecimiento 1 mes después del cultivo. La adición de FGF10 a la condición HISC permitió a los organoides BE para formar estructuras en ciernes y prolonga significativamente la duración del cultivo (>3 meses) (Figura 5b, c). En contraste con organoides intestinales humanos, organoides BE permanecieron Ki67+ con un número mínimo de PAS+ y las células de mucina + 4 días después de la retirada de nicotinamida y SB202190. El tratamiento con el inhibidor DBZ de secretasa γ (10 uM) durante 4 días después de que la retirada bloqueó la proliferación y la diferenciación de células caliciformes inducida (Fig.5 d-g). Esto apoya nuestra sugerencia anterior de que la administración local de tales inhibidores puede representar una estrategia terapéutica útil para la eliminación de las lesiones del esófago de Barrett por la terapia de diferenciación (Menke V et al. Disease models & mechanisms 2010; 3: 104-10). De nota, observamos de vez en cuando células lisozima + Paneth (Fig. 10), lo que indica que organoide BE conservan diferenciación de multilinaje.
Discusión
[0532] Los protocolos desarrollados aquí permiten cultivo robusto y de larga duración de las células epiteliales humanas primarias aisladas a partir del intestino delgado, colon, adeno(carcino)mas y el esófago de Barrett (Tabla 3).
Tabla 3: Lista de los componentes de los sistemas de cultivo de organoides
Nombre del reactivo
Proveedor Nº de Cat Solvente Solución madre Conc. final
Matrigel, TFG, libre de fenol DMEM/F12 avanzada GlutaMAX-I HEPES 1M Penicilina/Estreptomicina Suplemento N2 Suplemento B27 N-acetilcisteína EDTA Noggin recombinante de ratón EGF recombinante de ratón R-espondina recombinante de humano
BD Bioscience 356231 Invitrogen 12634-028 Invitrogen 35050-079 200 mM 2 mM Invitrogen 15630-056 10 mM Invitrogen 15140-122 10000/10 000 U/ml 100/100 U/ml Invitrogen 17502-048 100x 1x Invitrogen 17504-044 50x 1x Sigma-Aldrich A9165-5G DW 500 mM=81,5 mg/ml 1 mM Sigma-Aldrich 43178825g DW 500 mM=14.6 g/100ml 2 mM Peprotech 250-38 100 ug PBS/BSA 100 mg/ml 100ng/ml Invitrogen PMG8043 PBS/BSA 500 mg/ml 50 ng/ml Nuvelo PBS/BSA 1 mg/ml 1 mg/ml
FGF10 recombinante de humano
Peprotech 100-26 PBS/BSA 100 mg/ml 100 ng/ml
Wnt-3A recombinante de ratón
Millipore GF-160 PBS 10 mg/ml 100 ng/ml
Y-27632
Sigma-Aldrich Y0503 PBS 10 mM=1g/3 38 ml 10 mM
A-83-01
Tocris 2939 DMSO 500 mM 500 nM
SB202190
Sigma-Aldrich S7067 DMSO 30 mM 10 mM
Nicotinamida
Sigma-Aldrich DW 1M 10 mM
[Leu15] Gastrina I
Sigma-Aldrich G9145 PBS/BSA 100 mM 10 nM
DNasa
Sigma-Aldrich DN25-1g PBS 200000 U/ml 2000 U/ml
TrypLE express
Invitrogen 12605-036
Colagenasa tipo XI
Sigma-Aldrich C9407
Dispasa
Invitrogen 17105-041
70um Tamiz de células
BD falcon 352350
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[0556] El primer enfoque implicó examinar una serie de compuestos además del EGF + FGF10 o condición HGF. Una lista completa de los compuestos analizados se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4
Compuestos
Señal Concentración Resultado
Alb
CYP 3 AII
Exendina-4
Analógo de péptido 2 de tipo glucagón Sigma E7144 0,1-1uM
Ácido retinoico
Ligando de receptor RAR-RXR Sigma 25 nM
Ácido retinoico + exendina 4
Erizo Sonic
Invitrogen C25II 500-100ng/ml
BMP4
Señalización de BMP Peprotech 120-05 20 ng/ml
DAPT
Inhibidor gammasecretasa Sigma D5942 10 nM
A8301
Inhibidor Alk5/4/7 Tocris Bioscience 2939 50 nM
DAPT + A8301
++ + +++
FGF4
Ligando FGFR1,2 Peprotech 50 ng/ml
FGF1
Ligando FGFR1,2,3,4 PeprotecH450-33A 100 ng/ml
Dexametasona
Sigma D4902 25MG 10 µM-1 mM
Oncostatina M (OSM)
R&D systems 495-MO025 10-1000 ng/ml
FGF4+ OSM + Dexa
IGF
Peprotech 100 ng/ml
Ácido valproico
Inhibidor de desacetilasa de histona y regulador de vías ERK, PKC wnt/catenina Stemgent 04-0.007 250 µM
Butirato sódico
Inhibidor de desacetilasa de histona Stemgent 04-0005 250 µM
BIX01294
Inhibidor G9a HMTasa Stemgent 04 a 0002 1 µM
RG 108
Inhibidor de metiltransferasa de ADN Stemgent 04-0001 1 µM
TSA
100 nM + -
Hidrocortisona
Glucocorticoides Sigma H6909 5 nM
Oncostatina M (OSM)
R&D systems 495-MO025 10-1000 ng/ml
ARA
Sigma A 0937 500 nM
R59022
Inhibidor de quinasa de diacilglicerol Sigma D 5919 500 nM-50 nM + +
Arterenol bitrartre:----
Agonista de andrenoreceptor Sigma A 0937 500nM-50nM5nM
LIF
103
PD 035901
Inhibidor de MEK1 Axon MedChem cat n 1386 500 nM
CHIR99021
Inhibidor de GSK3 Axon MedChem cat n 1408 3 uM
DMSO
1%
Ácido Lascóbico
Sigma 077K13021 1 mM
VEGF
Peprotech
Matrigel 50%
Matrigel 20%
VEGF + DEXA
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