CN117866884A - 一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，涉及细胞模型构建技术领域。本发明从糖原累积症IIIa型患者外周血分离得到单个核细胞，然后重编程所述单个核细胞，生成诱导性多能干细胞，再利用多能干细胞稳定株诱导分化为心肌细胞，从而构建得到糖原累积症IIIa型心肌细胞模型，该细胞模型能够准确反映糖原累积症IIIa型心肌细胞的特性，为糖原累积症IIIa型心肌病的发病机制研究和药物筛选提供稀有的细胞来源。
Description
技术领域
本发明涉及细胞模型构建技术领域，特别涉及一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法。
背景技术
糖原累积症是一种由于先天性代谢酶缺陷所造成的糖原代谢障碍疾病，发病率因种族而异。根据代谢途径中不同的酶的缺陷，糖原累积症可分为16种亚型。其中，糖原累积症IIIa型患儿多存在心肌受累情况，主要表现为左心房和左心室心肌增厚，而目前基于糖原累积症IIIa型的常规饮食治疗方案尚不能有效控制心肌病进展，患儿心脏受累危及生命。
然而，目前针对糖原累积症IIIa型患儿心肌肥厚的治疗还没有明确的有效药物。患者心肌受累严重影响预后，在药物治疗和饮食管理方案上仍无共识。因此，构建一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型，以便于后续糖原累积症IIIa型心肌受累机制研究和药物筛选，具有重要意义。但是目前关于糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，旨在提供一种能准确反映糖原累积症IIIa型心肌细胞特性的细胞模型。
为实现上述目的，本发明提出一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
S10、从糖原累积症IIIa 型患者外周血分离得到单个核细胞；
S20、将所述单个核细胞培养3~4天后，进行重编程操作，得到iPSC单克隆细胞；
S30、将所述iPSC单克隆细胞接种至基质胶预处理后的孔板内，用干细胞维持培养基每天换液培养，直至细胞汇合度达到75~85%，得到原代细胞；
S40、将所述原代细胞使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基传代培养20~40代，得到iPSC的单细胞层；
S50、将所述iPSC的单细胞层进行扩板培养，然后用StemFlex培养基继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株；
S60、将所述iPSC稳定细胞株进行诱导分化，观察分化得到的细胞，并进行免疫荧光检测、流式检测、动作电位检测和糖原检测，以判断心肌细胞模型是否构建成功。
可选地，步骤S20包括：
将所述单个核细胞培养3~4天后，将其与仙台重编程试剂盒提供的携带有重编程基因的仙台病毒混合培养48h，然后除去仙台病毒，继续培养20~30天，得到单克隆细胞。
可选地，步骤S30中，所述干细胞维持培养基的配方包括Essential 6培养基。
可选地，步骤S40包括：
将所述原代细胞使用Accutase细胞消化液进行消化，然后使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基传代培养20~40代，得到iPSC的单细胞层。
可选地，步骤S50包括：
将所述iPSC的单细胞层接种至基质胶处理后的孔板内进行培养，其中，接种培养时，所述iPSC的单细胞层的体积与StemFlex培养基的体积之比为1:6~8，然后用StemFlex培养基继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株。
可选地，步骤S60中，将所述iPSC稳定细胞株进行诱导分化的步骤包括：
将得到所述iPSC稳定细胞株时记为Day 0，Day 0开始，将培养所述iPSC稳定细胞株的培养基更换为心肌细胞分化液1，并加入糖原合成酶激酶-3抑制剂，得到细胞悬液A，Day 1重复Day 0的操作；
Day 2-3，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24 h换液一次；
Day 4，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，并加入Wnt信号通路抑制剂，得到细胞悬液B，Day 5重复Day 4的操作；
Day 6-7，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24h换液一次；
Day 8-10，将培养基更换为心肌细胞分化液2，24 h换液一次，直至观察到心肌细胞搏动，得到含有心肌细胞的悬液；
将所述含有心肌细胞的悬液进行纯化培养，得到心肌细胞；
其中，所述心肌细胞分化液1的配方包括：RPMI 1640培养基、无血清添加剂B27和L-抗坏血酸；所述心肌细胞分化液2的配方包括：RPMI 1640培养基、无血清添加剂B27和胎牛血清。
可选地，将所述含有心肌细胞的悬液进行纯化培养，得到心肌细胞的步骤包括：
用预热后的胰蛋白酶-EDTA消化所述含有心肌细胞的悬液，然后用心肌细胞分化液2继续培养；
Day 12，将培养基更换为心肌细胞纯化液，培养48h后，换回心肌细胞分化液2继续培养，直至显微镜下观察到所述心肌细胞状态良好，正常搏动；
其中，所述心肌细胞纯化液的配方包括：无糖DMEM培养基、HEPES缓冲液和L-乳酸钠。
可选地，所述细胞悬液A中，所述糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为6μM。
可选地，所述细胞悬液B中，所述Wnt信号通路抑制剂的浓度为5μM。
本发明提供的技术方案中，从糖原累积症IIIa型患者外周血分离得到单个核细胞（以下可简称PBMC），然后重编程所述PBMC，生成iPSC，再利用iPSC稳定株诱导分化为心肌细胞，从而构建得到糖原累积症IIIa型心肌细胞模型，该细胞模型能够准确反映糖原累积症IIIa型心肌细胞的特性，为糖原累积症IIIa型心肌病的发病机制研究和药物筛选提供稀有的细胞来源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中构建得到的心肌细胞的显微镜图；
图2为本发明实施例2中的iPSC的短串联重复序列(STR)验证结果图；
图3为本发明实施例2中iPSC的三胚层分化结果图；
图4为本发明实施例2中iPSC用Nanog抗体溶液处理后的流式检测结果；
图5为本发明实施例2中iPSC用OCT4抗体溶液处理后的流式检测结果；
图6为本发明实施例2中iPSC用SSEA4抗体溶液处理后的流式检测结果；
图7为本发明实施例2中iPSC的免疫组化结果；
图8为本发明实施例2中iPSC的支原体检测结果；
图9为本发明实施例2中iPSC的染色体G显带分析结果；
图10为本发明实施例3中心肌细胞的支原体检测结果；
图11为本发明实施例3中心肌细胞的免疫荧光检测结果；
图12为本发明实施例3中心肌细胞的流式检测结果；
图13为本发明实施例3中心肌细胞的动作电位检测结果；
图14为正常心肌细胞与本发明构建的心肌细胞的糖原检测对比图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
构建一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型，以便于后续糖原累积症IIIa型心肌受累机制研究和药物筛选，具有重要意义。但是目前关于糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的研究尚未见报道。鉴于此，本发明提出一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
步骤S10、从糖原累积症IIIa型患者外周血分离得到单个核细胞。
优选地，选择同时携带糖原脱支酶基因AGLc.2001+ 1G>T剪接突变和c.3444 C>A(p.Tyr1148Ter)无意突变的糖原累积症IIIa型患者。本发明依据患者AGL基因突变特点，选择心肌受累严重的患者作为志愿者提供外周血单个核细胞进行心肌细胞模型构建，更具有代表性和实用性。
步骤S20、将所述单个核细胞培养3~4天后，将其与仙台重编程试剂盒提供的携带有重编程基因的仙台病毒混合培养48h，然后除去仙台病毒，继续培养20~30天，得到单克隆细胞。
需要说明的是，本文中，单个核细胞（以下可简称PBMC），iPSC指的是诱导性多能干细胞。
具体地，iPSC单克隆细胞是诱导性多能干细胞的单克隆细胞，将PBMC用PBMC培养基培养3~4天后，将其与仙台重编程试剂盒提供的携带有重编程基因的仙台病毒混合培养48h，然后除去仙台病毒，继续培养20~30天，可形成细胞密集生长的iPSC单克隆细胞。在本实施例中，PBMC培养基的配方为：StemPro®-34+SCF+IL-3+IL-6+L-谷氨酰胺 （L-Glutamine）+FLT-3。
在一实施例中，所述仙台重编程试剂盒选用的是CytoTune2.0 SendaiReprogramming Kit（Thermo Fisher Scientific)，也即，CytoTune2.0仙台重编程试剂盒。
步骤S30、将所述iPSC单克隆细胞接种至基质胶预处理后的孔板内，用干细胞维持培养基每天换液培养，直至细胞汇合度达到75~85%，得到原代细胞。
从步骤S20中密集生长的iPSC单克隆细胞中挑选中状态较好的单克隆细胞接种至基质胶（Matrigel）预处理后的24孔或48孔板，用干细胞维持培养基每天换液培养，克隆增殖后往周围延伸，直至细胞密度覆盖培养容器表面达到75~85%，得到原代细胞。
其中，所述干细胞维持培养基的配方包括Essential 6培养基（Gibco，A1516401）。
步骤S40、将所述原代细胞使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基传代培养20~40代，得到iPSC的单细胞层。
在本实施例中，采用消化传代法。将所述原代细胞使用Accutase细胞消化液进行消化，然后使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基传代培养20~40代，得到iPSC的单细胞层。进一步地，所述原代细胞与所述Accutase细胞消化液的体积之比为1:4~10。
较优地，ROCK抑制剂为Y-27632 dihydrochloride（Tocris)，通过加入上述抑制剂，能够促进iPSC贴壁生产，形成覆盖培养容器表面的单细胞层。更优地，所述含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基中，ROCK抑制剂的终浓度为10μM。本文中，μM即μmol/L。
需要说明的是，在本步骤中，将原代细胞传代至20~40代之间时，在6孔板中进行iPSC的单细胞层培养，当传代后3-4天iPSC汇合度达到75%-80%时，随机抽取一孔进行细菌、真菌、支原体和多能性的检测。
步骤S50、将所述iPSC的单细胞层进行扩板培养，然后用StemFlex培养基（不含有ROCK抑制剂）继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株。
其中，扩板培养步骤包括：将所述iPSC的单细胞层接种至基质胶处理后的孔板内进行培养。
具体实施时，将6孔板利用基质胶（Matrigel）于37℃培养箱中包被1h，然后将iPSC的单细胞层用StemFlex培养基按照1:6~8的比例进行扩板至包被后的6孔板中，扩板完成后的第二天，用不含Rock抑制剂的StemFlex培养基继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株。
步骤S60、将所述iPSC稳定细胞株进行诱导分化，观察分化得到的细胞，并进行免疫荧光检测、流式检测、动作电位检测和糖原检测，以判断心肌细胞模型是否构建成功。
在本实施例中，将所述iPSC稳定细胞株进行诱导分化的步骤包括：
将得到所述iPSC稳定细胞株时记为Day 0，Day 0开始，将培养所述iPSC稳定细胞株的培养基更换为心肌细胞分化液1，并加入糖原合成酶激酶-3抑制剂，得到细胞悬液A，Day 1重复Day 0的操作；
Day 2-3，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24 h换液一次；
Day 4，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，并加入Wnt信号通路抑制剂，得到细胞悬液B，Day 5重复Day 4的操作；
Day 6-7，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24h换液一次；
Day 8-10，将培养基更换为心肌细胞分化液2，24 h换液一次，直至观察到心肌细胞搏动，得到含有心肌细胞的悬液；
将所述含有心肌细胞的悬液进行纯化培养，得到心肌细胞；
在本发明中，所述心肌细胞分化液1的配方包括：RPMI 1640培养基、无血清添加剂B27和L-抗坏血酸，其中L-抗坏血酸指的是L-Ascorbic acid，也即LAA，以下简称LAA。优选地，所述心肌细胞分化液1的配方为：RPMI1640+2%无血清添加剂B27+LAA（终浓度100uM）。具体实施时，先将RPMI1640和无血清添加剂B27按比例配制好，并根据需要添加适量体积于含有细胞株的培养孔中，然后根据培养孔中悬液的体积，对应添加LAA的量，以使培养孔中悬液中的LAA的终浓度100uM。
进一步地，所述细胞悬液A中，所述GSK-3抑制剂的浓度为6μM。优选地，GSK-3抑制剂为CHIR99021。
在一实施例中，所述细胞悬液B中，所述Wnt信号通路抑制剂的浓度为5μM。较优地，所述Wnt信号通路抑制剂为IWR-1（Sigma-Aldrich，I0161-25MG）。
在本发明中，所述心肌细胞分化液2的配方包括：RPMI 1640培养基、无血清添加剂B27和胎牛血清（以下简称FBS）。较优地，所述心肌细胞分化液2的配方为：RPMI1640+2%无血清添加剂B27+5%FBS。本文中，胎牛血清（以下可以简称FBS）。
需要说明的是，RPMI1640指的是Roswell Park Memorial Institute 1640，RPMI1640 培养基含有生物素、维生素B12以及PABA，这些成分是 Eagle’s MEM 和DMEM所不具备的，适用于多种哺乳动物细胞培养。
在一实施例中，将所述含有心肌细胞的悬液进行纯化培养的步骤包括：用预热后的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化所述心肌细胞3-5分钟，加入5倍消化液体积的含10%FBS的DMEMF12溶液终止消化，离心后用心肌细胞分化液2重悬后接种至培养皿继续培养；Day 12，将培养基更换为心肌细胞纯化液，培养48h后，换回心肌细胞分化液2继续培养，直至显微镜下观察到所述心肌细胞状态良好，正常搏动。
其中，所述心肌细胞纯化液的配方包括：无糖DMEM培养基、HEPES缓冲液和L-乳酸钠（Sodium L-lactate）。
需要说明的是，其中，心肌细胞状态良好，正常搏动包括：心肌细胞收缩有力，收缩频率约40次/分钟，动作电位正常如图13所示。
本发明提供的技术方案中，从糖原累积症IIIa型患者外周血分离得到PBMC，然后重编程所述PBMC，生成多能干细胞单克隆细胞（以下可简称iPSC），再利用iPSC稳定株诱导分化为心肌细胞，从而构建得到糖原累积症IIIa型心肌细胞模型。本发明通过对培养步骤、抑制剂、以及培养基（例如：传代培养基、心肌细胞分化液1、心肌细胞分化液2、心肌细胞纯化液等）的配方等条件的设计，使构建得到的细胞模型能够准确反映糖原累积症IIIa型心肌细胞的特性，为糖原累积症IIIa型心肌病的发病机制研究和药物筛选提供稀有的细胞来源。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中用到的用于免疫细胞化学/流式细胞术的抗体如下表1所示。
表1抗体详情
需要说明的是：图3的FOXA2是内胚层标志物，Brachyury是中胚层标志物PAX-6是外胚层标志物
图4的Nanog是干细胞标志物
图5的OCT4是干细胞标志物
图6的SSEA4是干细胞标志物
图7的OCT4是干细胞标志物，Hoechst是用以标记DNA，活细胞显示蓝色荧光，Hoechst和OCT4染色merge标记活的多能干细胞。
图11的cTnT是心肌细胞标志物，Hoechst是用以标记DNA，活细胞显示蓝色荧光），cTnT+Hoechst是用以标记活的心肌细胞。
图14的左边是正常心肌细胞，右边是携带AGL基因c.2001+ 1G>T剪接突变和c.3444 C>A(p.Tyr1148Ter)无意突变的心肌细胞。
其中，StemFlex培养基、Essential 6培养基、DMEM/F12培养基，Accutase细胞消化液、RPMI 1640培养基、无血清添加剂B-27、胰蛋白酶-EDTA、HEPES缓冲液均购自于赛默飞（Thermo Fisher Scientific）公司。
实施例1糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建
（1）选择同时携带AGL基因c.2001+ 1G>T剪接突变和c.3444 C>A(p.Tyr1148Ter)无意突变的糖原累积症IIIa型患者，利用CPT采血管（BD Biosciences）从该患者外周血分离得到PBMC；
（2）将PBMC用PBMC培养基（配方为：StemPro®-34+SCF+IL-3+IL-6+L-谷氨酰胺（L-Glutamine）+FLT-3）培养基培养3~4天后，将其与CytoTune2.0 Sendai ReprogrammingKit（Thermo Fisher Scientific)提供的携带有重编程基因的仙台病毒混合培养48h，然后除去仙台病毒，继续培养20~30天，可形成细胞密集生长的iPSC单克隆细胞；
（3）从步骤（2）中密集生长的iPSC单克隆细胞中挑选中状态较好的单克隆细胞接种至基质胶（Matrigel）预处理后的24孔或48孔板，用干细胞维持培养基每天换液培养，克隆增殖后往周围延伸，直至细胞密度覆盖培养容器表面达到75~85%，得到原代细胞；其中，干细胞维持培养基的配方为Essential 6培养基；
（4）将上述原代细胞使用Accutase细胞消化液按照1:4~10的密度正常消化传代，传代时使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基进行培养，能够促进iPSC贴壁生产，形成覆盖培养容器表面的单细胞层，其中，ROCK抑制剂为Y-27632 dihydrochloride（Tocris)；
（5）传代培养至20~40代之间后，在6孔板中进行iPSC的单细胞层培养，并且在传代后3~4天iPSC汇合度达到75%~80%时，随机抽取一孔进行细菌、真菌、支原体和多能性的检测；
（6）将新的6孔板利用Matrigel于37℃培养箱中包被1h，然后将iPSC的单细胞层用StemFlex培养基按照1:6~8的比例扩板至包被后的6孔板中，扩板完成后的第二天，用StemFlex培养基继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株；
（7）将得到所述iPSC稳定细胞株时记为Day 0，Day 0开始，将培养所述iPSC稳定细胞株的培养基更换为心肌细胞分化液1，并每孔加入终浓度为6uM的GSK-3抑制剂，得到细胞悬液A，Day 1重复Day 0的操作；Day 2-3，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24 h换液一次；Day 4，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，并每孔加入终浓度为5uM的Wnt信号通路抑制剂，得到细胞悬液B，Day 5重复Day 4的操作；Day 6-7，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24h换液一次；Day 8-10，将培养基更换为心肌细胞分化液2，24 h换液一次，直至观察到心肌细胞搏动，得到含有心肌细胞的悬液；胰蛋白酶-EDTA消化所述心肌细胞，加入5倍消化液体积的含10%FBS的DMEM F12溶液终止消化，离心后用心肌细胞分化液2重悬后接种至培养皿继续培养；Day 12，将培养基更换为心肌细胞纯化液，培养48h后，换回心肌细胞分化液2继续培养，直至显微镜下观察到所述心肌细胞状态良好，正常搏动，即得到心肌细胞，其显微镜图如图1所示；
其中，GSK-3抑制剂为CHIR99021，Wnt信号通路抑制剂为IWR-1（Sigma-Aldrich，I0161-25MG），所述心肌细胞分化液1的配方为：RPMI1640+2%无血清添加剂B27+LAA（终浓度100uM）；所述心肌细胞分化液2的配方为：RPMI1640+2%无血清添加剂B27+5% FBS，所述心肌细胞纯化液的配方包括：无糖DMEM培养基、HEPES缓冲液和L-乳酸钠。
实施例2iPSC细胞的验证
将实施例1中步骤（4）得到的iPSC进行质控验证，验证方法和验证结果如下：
（1）iPSC的STR验证
取适量DNA，采用PowerPlex21DSystem复合扩增试剂盒进行扩增，在ABI3100型遗传分析仪上对STR位点和Amelogenin基因座进行检测。测试位点包括AMEL，D3S1358，D1S1656，D6S1043，D13S317，PentaE，D16S539，D18S51，D2S1338，CSF1PO，PentaD，TH01，vWA，D21S11，D7S820，D5S818，TPOX,D8S1179,D12S391,D19S433,FGA共21个。测试结果如图2所示。
由图2的STR检验结果说明该样本PBMC和iPSC来源于同一样本，PBMC的重编程过程不存在任何样本的交叉污染。
（2）三胚层试分化验证
将iPSC接种至24孔板，培养24-48小时后开始三胚层分化。分化过程中，每天进行内、中、外三个胚层的分化试剂全换液（内胚层：STEMdiff Trilineage Ectoderm Medium,05231; 中胚层：STEMdiff Trilineage Mesoderm Medium, 05232；外胚层：STEMdiffTrilineage Endoderm Medium, 05233），内胚层和中胚层分化5天后，收集细胞进行内胚层标志物FOXA2 (Forkhead box a2)和中胚层标志物Brachyury的染色；外胚层分化7天后，收集细胞进行外胚层标志物PAX6 (Paired Box 6)的染色，染色结果如图3所示。
由图3可以看出，从三胚层分化结果来看，iPSC具有往内中外三个胚层分化的能力，说明iPSC具有干性。
（3）流式检测
iPSC消化后进行固定破膜处理，分别用OCT4（BD，560186）和Nanog（BD，560873）抗体溶液进行避光孵育处理；iPSC消化后无需固定直接加入SSEA4（BD，560128）抗体溶液避光孵育；以上三种抗体处理细胞，分别用磷酸盐缓冲盐溶液 (DPBS) 清洗后，用DPBS重悬制备包含1万iPSC细胞的悬液，准备上机。其结果如图4-6所示。
流式结果分别检测了iPSC三个干性标志物的表达，从图4-6的结果看iPSC三个干性标志物表达量均高于99%，说明iPSC细胞纯度非常高，具有非常高的干性。
（4）免疫组化
载玻片包被后进行iPSC接种，iPSC常温4%PFA固定15min，1 x DPBS漂洗后，1%Triton X-100 (Thermo Fisher Scientific) 通透30min。1% 牛血清蛋白(BSA) 1:200稀释的一抗溶液OCT4 (BD，561555) 4℃孵育iPSC过夜，1 x DPBS漂洗后，1%BSA 1:800稀释的二抗溶液AF546 donkey anti-mouse IgG（invitrogen，A10036）常温避光孵育iPSC 1h，同时用细胞核染料Hoechst（Invitrogen，H3570）进行细胞核染色，1 x DPBS漂洗后，镜检，免疫荧光结果如图7所示，图7OCT4为Hoechst染色，图7Hoechst为OCT4染色，图7Merge为两者均有。
图7的免疫荧光结果说明iPSC高表达OCT4，同时验证了流式OCT4高表达干性的结果。
（5）支原体检测
支原体检测是按照厂家试剂盒提供的方法操作(ExCell Bio, Catalog Number:MB000-1591. ScienCell Research Laboratories)。上样时阳性对照为来自于MycoplasmaPCR Detection Kit，同时有150 bp和280 bp条带为阳性；阴性对照为灭菌去离子水（Meilunbio，MA0028），阴性对照没有条带。其结果如图8所示：由图8可以看出，标为1的iPSC样本的支原体检测结果显示只有150 bp条带，结果为阴性。
（6）核型分析
A、培养皿中加入10ug/ml 秋水仙胺37℃处理iPSC细胞60分钟，使细胞分裂停止在中期相。B. Accutase消化后收集细胞沉淀，加入37℃预热的0.075M KCl低渗溶液，吹打均匀，37℃低渗孵育20min，使iPSC细胞解体。
C、加入卡诺固定液多次固定后制片，用Geimsa染色液染色10-15分钟，选取20个分裂良好的中期相进行染色体G显带分析，且结果如图9所示：
选取标准：
a)细胞完整，所有染色体分布在同一水平面。
b)染色体形态和分布良好。
c)最好无重叠，或者有个别可明确识别的重叠。
d)所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。
e)观察细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在。
图9的核型分析结果显示，该iPSC样本来源于女性，具有23对正常染色体，没有任何结构异常。
实施例3心肌细胞成功构建的验证
将实施例1步骤（7）中最终得到的心肌细胞进行验证，以判断心肌细胞模型是否成功构建，其验证方法和验证结果如下：
（1）支原体检测
按照依科赛支原体检测试剂盒说明书对心肌细胞样本裂解后PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，上样时阳性对照为来自于Mycoplasma PCR Detection Kit (货号：ab289834)，同时有150bp和280bp条带为阳性；阴性对照为灭菌去离子水（Meilunbio，MA0028），阴性对照没有条带。支原体检测结果如图10所示：图10的实验结果显示4号目标心肌细胞的支原体检测结果为阴性，为150 bp条带。
（2）免疫荧光
心肌细胞按照5万每孔接种至24孔板，培养48小时后，待心肌细胞恢复稳定跳动，准备进行心肌细胞的染色。固定心肌细胞，进行细胞特异性标志物 cTnT（Anti-CardiacTroponin T antibody，心肌细胞肌钙蛋白，abcam，ab8295）,对应二抗为（Goat Anti-Mouse647，abcam, ab150115）和细胞核染料Hoechst（Invitrogen，H3570）孵育。检测结果如图11所示：图11的免疫荧光染色结果显示，心肌细胞特异性表达心肌标志物 cTnT，说明分化得到的确定为心肌细胞。
（3）流式检测
心肌细胞流式抗体cTnT（PE Mouse Anti-Cardiac Troponin T，BD, 564767）和同型对照（PE Mouse IgG1，κ Isotype Control，BD，554680 ）分别用1% BSA稀释，然后按照1:1体积将抗体溶液和对应的同型对照溶液混合均匀，然后加入经固定处理的心肌细胞沉淀中，避光常温孵育30分钟，孵育结束清洗后进行流式分析。检测结果如图12所示：由图12的心肌细胞流式检测结果可以看出，心肌细胞高表达特异性标志物cTnT (96.76%)，说明心肌细胞纯度很高。
（5）动作电位检测
心肌细胞复苏至6孔板中，培养5-7天，细胞正常稳定搏动之后，心肌细胞消化按照5万个细胞每孔重铺至放置于24孔板中的圆形玻片上，细胞贴壁后24-48小时内完成心肌细胞动作电位检测。动作电位检测采用手动膜片钳系统（HEKA EPC-10 信号放大器及数字转换系统，购自德国HEKA
Electronics）。实验过程采用常规全细胞膜片钳(电流钳和电压钳)记录技术，电流钳下细胞钳制在-60 mV 的电压，注入电流为500-900PA,去极化 3-10ms 以记录动作电位发放。检测结果如图13所示：由图13的心肌细胞动作电位检测结果可以看出，心肌细胞具有电生理功能，能够检测到动作电位，非常接近人的原代心肌细胞功能。
（6）糖原检测
心肌细胞复苏后培养15-20天直至成熟，按照过碘酸雪夫 (PAS) 染色试剂盒（Solarbio，G1360）推荐方法进行染色分析。使用PAS固定液固定10-15分钟，水洗晾干后，氧化剂室温氧化15-20分钟。清水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次。入品红醛 (Schiff) 染色液并加盖，至于室温阴暗处浸染10-20分钟，流水冲洗5分钟，入Mayer’s苏木素染色液，复染1-2分钟，水洗，晾干，镜检。将正常心肌细胞进行同样的操作，检测结果如图14所示，PAS染色结果出现红色或者紫色，说明心肌细胞存在糖原：图14的染色结果说明：心肌细胞疾病模型的糖原含量明显高于正常对照心肌细胞。
综上所述，本发明提供的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，成功构建得到了糖原累积症IIIa型心肌细胞模型。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、从糖原累积症IIIa型患者外周血分离得到单个核细胞；
S20、将所述单个核细胞培养3~4天后，进行重编程操作，得到iPSC单克隆细胞；
S30、将所述iPSC单克隆细胞接种至基质胶预处理后的孔板内，用干细胞维持培养基每天换液培养，直至细胞汇合度达到75~85%，得到原代细胞；
S40、将所述原代细胞使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基传代培养20~40代，得到iPSC的单细胞层；
S50、将所述iPSC的单细胞层进行扩板培养，然后用StemFlex培养基继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株；
S60、将所述iPSC稳定细胞株进行诱导分化，观察分化得到的细胞，并进行免疫荧光检测、流式检测、动作电位检测和糖原检测，以判断心肌细胞模型是否构建成功。
2.如权利要求1所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S20包括：
将所述单个核细胞培养3~4天后，将其与仙台重编程试剂盒提供的携带有重编程基因的仙台病毒混合培养48h，然后除去仙台病毒，继续培养20~30天，得到单克隆细胞。
3.如权利要求1所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S30中，所述干细胞维持培养基包括Essential 6培养基。
4.如权利要求1所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S40包括：
将所述原代细胞使用Accutase细胞消化液进行消化，然后使用含有ROCK抑制剂的StemFlex培养基传代培养20~40代，得到iPSC的单细胞层。
5.如权利要求1所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S50包括：
将所述iPSC的单细胞层接种至基质胶处理后的孔板内进行培养，其中，接种培养时，所述iPSC的单细胞层的体积与StemFlex培养基的体积之比为1:6~8，然后用StemFlex培养基继续培养，每24 h换液一次，直至iPSC细胞汇合度达到95%以上，得到iPSC稳定细胞株。
6.如权利要求1所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S60中，将所述iPSC稳定细胞株进行诱导分化的步骤包括：
将得到所述iPSC稳定细胞株时记为Day 0，Day 0开始，将培养所述iPSC稳定细胞株的培养基更换为心肌细胞分化液1，并加入糖原合成酶激酶-3抑制剂，得到细胞悬液A，Day 1重复Day 0的操作；
Day 2-3，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24 h换液一次；
Day 4，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，并加入Wnt信号通路抑制剂，得到细胞悬液B，Day 5重复Day 4的操作；
Day 6-7，将培养基更换为新鲜的心肌细胞分化液1，24h换液一次；
Day 8-10，将培养基更换为心肌细胞分化液2，24 h换液一次，直至观察到心肌细胞搏动，得到含有心肌细胞的悬液；
将所述含有心肌细胞的悬液进行纯化培养，得到心肌细胞；
其中，所述心肌细胞分化液1的配方包括：RPMI 1640培养基、无血清添加剂B-27和L-抗坏血酸；所述心肌细胞分化液2的配方包括：RPMI 1640培养基、无血清添加剂B27和胎牛血清。
7.如权利要求6所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，将所述含有心肌细胞的悬液进行纯化培养，得到心肌细胞的步骤包括：
用预热后的胰蛋白酶-EDTA消化所述含有心肌细胞的悬液，然后用心肌细胞分化液2继续培养；
Day 12，将培养基更换为心肌细胞纯化液，培养48h后，换回心肌细胞分化液2继续培养，直至显微镜下观察到所述心肌细胞状态良好，正常搏动；
其中，所述心肌细胞纯化液的配方包括：无糖DMEM培养基、HEPES缓冲液和L-乳酸钠。
8.如权利要求6所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液A中，所述糖原合成酶激酶-3抑制剂的浓度为6μM。
9.如权利要求6所述的糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液B中，所述Wnt信号通路抑制剂的浓度为5μM。
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