CN116042516A - 一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其制备方法和应用 - Google Patents
一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种从悬浮培养条件下的人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，该制备方法能够在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球，且避免了使用2D培养和分化方式，所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于实现工艺稳定、进行生产工艺放大和工业化生产心肌细胞球和心肌细胞以满足药物研发、心脏相关疾病临床研究和治疗需求。本发明还提供了一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球及其制备方法和应用。
背景技术
心肌疾病是现代社会发病率和致死率最高的重大疾病之一。据了解，心肌细胞是分化程度极高的终末细胞，成年人的心肌细胞几乎不具备分裂增殖的能力。在发生诸如急性心肌梗死、代谢障碍、病毒性心肌炎等多种造成心脏损伤的疾病后，会导致数以万计的心肌细胞的不可逆的死亡，引起心脏结构重塑和心功能的下降，至今仍缺少有效的治疗方式。目前，用正常的心肌细胞移植替换已经坏死的细胞是从根本上治疗这类心脏病的方法之一，但是，心肌细胞来源的不足大大限制了心肌细胞临床应用的发展。
人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)是通过体细胞重编程得到类似胚胎干细胞特性的一种细胞。研究表明，hiPSC具有分化成各类功能细胞的能力，有望解决心肌细胞用于治疗疾病过程中的细胞资源短缺的问题。现已报道的利用干细胞分化心肌细胞的各种方法使用2D培养的hiPSC在2D培养条件下完成分化，存在心肌细胞分化工艺稳定性差、所需成本较高、不容易规模化和自动化生产等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种在悬浮培养条件下从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法，该制备方法能够在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球，且避免了使用2D培养和分化方式，所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于实现工艺稳定、进行生产工艺放大和工业化生产心肌细胞球和心肌细胞以满足药物研发、心脏相关疾病临床研究和治疗需求。
第一方面，本发明提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，接种于培养皿、培养瓶或者反应器中培养48小时，形成聚集体；
(2)替换并使用第一分化培养基培养20-24小时，以诱导细胞分化；其中，所述第一分化培养基为包含7-8μM CHIR99021的CDM3基础培养基；
(3)弃去所述第一分化培养基，添加第二分化培养基培养48-56小时，所述第二分化培养基为包含4-6μM Wnt-C59的CDM3基础培养基；
(4)弃去所述第二分化培养基，换成CDM3基础培养基培养至第8-10天，且每隔48小时换液；
(5)弃去步骤(4)所述CDM3基础培养基，添加纯化培养基培养至第14天，每隔48小时换液；
(6)弃去所述纯化培养基，换成CDM3基础培养基培养，且每隔48小时换液，培养到第18-20天时，收集得到成熟的心肌细胞球。
可选地，所述人诱导性多能干细胞(hiPSCs)可以是商品化的细胞系，也可以是由供体细胞诱导而来，所述供体细胞可以但不限于包括绒毛细胞、成纤维细胞、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺上皮细胞、脂肪干细胞、尿液细胞、皮肤细胞中的一种或多种。
本发明中，所述人诱导性多能干细胞单细胞悬液是通过使用温和细胞解离试剂(GCDR)将hiPSCs解离成单个细胞，重悬获得。
可选地，所述CDM3基础培养为含0.2-0.25g/L L-抗坏血酸、0.4-0.6g/L重组人白蛋白和4-5g/L D-葡萄糖的RPMI-1640培养基。
本发明中，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)和步骤(6)中的CDM3基础培养基都是相同的培养基；其中，第一分化培养基由CHIR99021和CDM3基础培养基组合配制而成，所述第二分化培养基由Wnt-C59和CDM3基础培养基组合配制而成。
可选地，所述纯化培养基为含0.2-0.25g/L L-抗坏血酸、0.4-0.6g/L重组人白蛋白和3.5-4.5mM L-乳酸的RPMI-1640培养基。本发明步骤(5)中，纯化培养基能够纯化制备得到的人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球(hiPSC-CMs)，进一步提高制备方法中hiPSC-CMs的纯度。
可选地，所述步骤(4)的所述换成CDM3基础培养基培养至第8-10天时，开始分化得到具有节律跳动的细胞球。
本发明中，在制备的第8-10天，诱导分化的细胞中能开始出现具有节律跳动的hiPSC-CMs，然后继续开展步骤(5)的过程。
本发明中，所述步骤(4)中的第8-10天、步骤(5)中的第14天和步骤(6)中的第18-20天，都是连续的时间线，均以步骤(1)为第0天起始。
可选地，在所述步骤(1)中，使用mTeSRTM3D培养基培养接种后的所述人诱导性多能干细胞，所述mTeSRTM3D培养基包含10μM Y-27632。
其中，所述mTeSRTM3D培养基可以但不限于商品化的培养基。所述Y-27632(或Y27632)是一种ROCK的选择性抑制剂，一种高效的、细胞可渗透的、可逆的、选择性的Rho相关蛋白激酶抑制剂。通过采用含有Y-27632的mTeSRTM3D培养基可提高分化步骤(1)中hiPSC的存活率。
可选地，所述步骤(1)-(6)的细胞培养方式为悬浮培养，均置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养，所述旋转摇床的旋转速度为30-90转/分钟。
进一步地，可选地，所述步骤(1)-(6)的细胞培养均置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养；其中，步骤(1)-(3)中，所述旋转摇床的旋转速度为60-70转/分钟，步骤(4)和(5)中，所述旋转摇床的旋转速度为80-85转/分钟，步骤(6)中，所述旋转摇床的旋转速度为70-80转/分钟。
本发明中，在制备过程中不同阶段使用不同旋转速度有利于细胞增长及分化，以获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球。随着培养时间增长，细胞球直径逐渐增大，制备过程中提高转速可以防止细胞球之间相互黏连，当细胞已高度分化且不再增殖时，通过适当降低转速有利于进行纯化培养。
可选地，所述接种于培养皿、培养瓶或者反应器中的所述人诱导性多能干细胞密度为1.0×105-3.0×105个/mL。
进一步地，所述人诱导性多能干细胞单细胞悬液的细胞接种密度为1.0×105个/mL，或为1.5×105个/mL，或为2.0×105个/mL，或为2.5×105个/mL，或为3.0×105个/mL。本发明中，适宜细胞接种密度更加有利于细胞在培养条件下的诱导分化。
本发明中，所述培养皿、培养瓶或者反应器泛指用于细胞培养的容器或器皿，可以但不限于是孔板、培养瓶、培养盘和反应器中的一种或多种。优选地，所述培养器皿可以为超低吸附的6孔板、96孔板、10cm细胞培养皿及环形细胞培养皿中的至少一种。
本发明第一方面所提供了一种从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法，该制备方法在悬浮培养条件下高效地利用人诱导性多能干细胞分化获得纯度好、活率高、功能完善的心肌细胞球，且避免了使用2D培养和分化方式，所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于实现工艺稳定、进行生产工艺放大和工业化生产心肌细胞球。所述从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球具有完善生物学活性及功能。
第二方面，本发明还提供了一种从本发明第一方面所述的方法制备得到的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球。
本发明制备得到的成熟的心肌细胞具有纯度好、活性高的特点，其特异结构基因高表达，能够高表达心肌肌钙蛋白(cTnT)。制备得到的心肌细胞球具有正常心肌细胞的生物学活性及功能，能够自主且节奏规律地跳动，在实验室条件下可以持续跳动超过120天。
本发明第二方面提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球，具有纯度好、活率高、功能完善的特点，能够表现出稳定的心肌细胞活性，可广泛应用于体外心肌细胞各种临床测试，并且能满足于药物研发、心脏相关疾病临床研究和治疗需求，具有深远的研究意义。
第三方面，本发明还提供了一种由本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球在制备预防、诊断和治疗心脏疾病的药物中的应用。
可选地，所述心脏疾病可以但不限于包括心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎和慢性心力衰竭中的一种或多种。
本发明中，所述应用可以但不限于为检测试剂盒、靶向药物载体或是在药物筛选模型中的应用。
本发明第三方面的所述应用中，通过采用本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球，由于所述制备方法的高效，以及制备得到的心肌细胞具有纯度好、活率高、功能完善的特点，可以极大地丰富基于本发明提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的应用范围，具有极大的研究和临床应用价值。
第四方面，本发明还提供了一种由本发明第一方面所述的制备方法制备的或由第二方面所提供的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球在具有心脏疾病小鼠模型中研究心脏疾病治疗方法的应用。
可选地，所述心脏疾病可以但不限于包括心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎和慢性心力衰竭中的一种或多种。
本发明第四方面的所述应用中，小鼠模型是一种常见实验模型，构建的心脏疾病小鼠模型可以用于模拟其他哺乳动物，尤其是人类的对应疾病模型，有利于研究心肌细胞的功能和作用，同样具备重要的研究价值。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明
图1为本发明一实施例提供的从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的制备方法流程图；
图2为本发明一实施例提供的从人诱导性多能干细胞分化得到的心肌细胞球的实际细胞培养装置图；
图3为本发明实施例提供制备方法中第0天至第18天的各阶段细胞状态图(100×)；
图4为本发明实施例提供的制备方法得到的心肌细胞自发节律跳动状态图；
图5为本发明实施例提供的hiPSC向心肌细胞分化得到的细胞球表达心肌肌钙蛋白cTnT的细胞免疫荧光图像(40×)；
图6为本发明实施例提供的从hiPSC分化得到的心肌细胞球表现出心房肌、心室肌和窦房节细胞特征的动作电位图；
图7为本发明实施例提供的从hiPSC分化得到的心肌细胞球在小鼠心梗模型的实验图；
图8为本发明实施例提供的从hiPSC分化得到的心肌细胞球在小鼠心梗模型的超声检查小鼠心脏射血分数数据柱状图；
图9为本发明实施例提供的从hiPSC分化得到的心肌细胞球在小鼠心梗模型的心室壁厚效果对比图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
如图1所述，本发明一实施方式中，提供了一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，包括以下步骤：
S01、提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，接种于培养皿、培养瓶或者反应器中培养48小时，形成聚集体；
S02、替换并使用第一分化培养基培养20-24小时，以诱导细胞分化；其中，所述第一分化培养基为包含7-8μM CHIR99021的CDM3基础培养基；
S03、弃去所述第一分化培养基，添加第二分化培养基培养48-56小时，所述第二分化培养基为包含4-6μM Wnt-C59的CDM3基础培养基；
S04、弃去所述第二分化培养基，换成CDM3基础培养基培养至第8-10天，且每隔48小时换液；
S05、弃去步骤(4)所述CDM3基础培养基，添加纯化培养基培养至第14天，每隔48小时换液；
S06、弃去所述纯化培养基，换成CDM3基础培养基培养，且每隔48小时换液，培养到第18-20天时，收集得到成熟的心肌细胞球。
可选地，所述S01中，在一些实施方案中，hiPSCs可以来源于得自具有独特遗传背景的个体的体细胞或者其它祖代细胞。例如，hiPSCs可以由来自具有疾病病状的个体、具有高风险的疾病病状的个体和/或具有低风险的疾病病状的个体的细胞生产。如本文所述由具有不同遗传背景的个体生产的细胞或由其活体外分化的细胞可以用于研究疾病病状(诸如心脏疾病)的机理以及用于识别治疗靶标。所述心脏疾病可以但不限于包括心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎和慢性心力衰竭。
可选地，人诱导性多能干细胞单细胞悬液的制备过程包括：将hiPSCs用温和细胞解离试剂(GCDR)将解离成单个细胞，收集细胞悬液300g离心5min后弃上清，取含10μM Y-27632的mTeSRTM3D培养基重悬细胞，计数后以1.0×105-3.0×105个/mL的密度将细胞接种于培养皿、培养瓶或反应器中培养。
本发明所述制备方法中，从诱导人诱导性多能干细胞开始分化时，整个制备过程中细胞均是悬浮状态下完成的，分化所用到的培养体系不含动物源成份，无需滋养层细胞，易于生产工艺放大和工业化生产心肌细胞用于临床研究和治疗需求。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法。
将hiPSCs用温和细胞解离试剂(GCDR)解离成单个细胞，收集细胞悬液300g离心5min后弃上清，取添加有10μM Y-27632的mTeSRTM3D培养基重悬细胞，计数后，以细胞1×105-3×105个/mL的密度将细胞放入超低吸附6孔板进行悬浮培养，培养体积为2mL/孔。将超低吸附6孔板放在速率为60-70rmp/min的旋转摇床上，并在37℃，5％CO2培养箱培养，隔天每孔添加0.2-0.3mL的mTeSRTM3D培养基，培养48～56h后移除旧培养基，添加含有7-8μMCHIR99021的CDM3基础培养基，放置于速率为60-70rmp/min的旋转摇床上培养24h。所述的CDM3培养基配制方法为：取1g L-抗坏血酸缓慢加入至47.348mL的注射用无菌水，偶尔搅拌，溶解后加入至2.4g重组人白蛋白中，混匀直至完全溶解，使用0.22μM过滤器无菌过滤后分装为CDM3补充物。取49.5mL RMPI 1640培养基(含葡萄糖)，加入500μL的CDM3补充物，混匀后即为CDM3基础培养基。使用CHIR99021诱导24h后移除旧培养基，添加含有4-6μM Wnt-C59的CDM3基础培养基，放置于速率为60～70rmp/min的旋转摇床上培养48h。移除旧培养基，添加不含小分子的CDM3基础培养基，放置于速率为80-85rmp/min的旋转摇床上培养，每隔48h进行更换CDM3基础培养基，培养至第9天则更换为CDM3-L培养基进行纯化培养，每隔48h进行更换CDM3-L培养基，所述的CDM3-L培养基配制方法为：取49.5mL的RMPI 1640培养基(不含葡萄糖)，加入500uL的CDM3补充物及3.5-4.5mM L-乳酸，混匀后即为CDM3-L培养基。培养至第13天后移除旧培养基，添加不含小分子的CDM3基础培养基，每隔48h换液，放置于速率为70-80rmp/min的旋转摇床上培养至第18-20天收获心肌细胞球，并进行免疫荧光检测心肌肌钙蛋白cTnT的表达情况。从hiPSC分化为心肌细胞球的制备过程的实际装置图如图2所示。
从hiPSC分化为心肌细胞球过程中各阶段的细胞状况如图3所示，诱导开始时细胞形成拟胚体的球状结构，诱导1天后，细胞球边缘不平滑，诱导至第5天，细胞球直径增大，并出现腔室结构。具有节律跳动的心肌细胞球一般会在第8-10天出现。纯化培养至第15天后，细胞球腔室缩小，细胞球变得致密，跳动的节奏更为规律。在实验室条件下，由实施例制备得到的心肌细胞球可以持续跳动超过120天。
为了评估本发明所描述的上述方法制备的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球效果，进行如下效果实施例，其中，若无特别说明，本发明各效果实施例中使用的试剂均为市面上常规商品化试剂，清洗、接种等实验操作步骤也为本领域常规实验操作步骤。
效果实施例1验证hiPSC诱导的心肌细胞球表达心肌肌钙蛋白cTnT的情况
取实施例1的心肌细胞球进行免疫荧光检测cTnT的表达。将细胞球使用PBS洗3次，室温下用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，室温下用细胞通透液孵育5min。随后，用血清密封液在室温下封闭1h。吸弃封闭液后加入一抗cTnT并在4℃孵育过夜。PBS洗3次，用种特异性荧光偶联抗体(Alexa Fluor-488偶联抗兔IgG(H+L)室温避光孵育1h，PBS洗3次，使用4',6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色，使用倒置荧光显微镜进行拍照，结果如图5所示。
图5的细胞免疫荧光图像包括对DAPI的染色图、对cTnT的染色图，以及cTnT和DAPI的融合染色图；从图中可以清晰说明本发明提供制备方法制得的心肌细胞中表达成熟自主搏动心肌标志物cTnT。
使用膜片钳技术进一步测定心肌细胞表现出心房肌、心室肌和窦房节细胞特征的动作电位。利用Sutter P-1000微电极拉制仪拉制玻璃记录电极。将细胞盖玻片放入细胞外液的培养皿中，用10倍物镜视野观察细胞。利用微操操纵仪让玻璃电极缓慢接近细胞，当玻璃电极尖端视野与细胞视野接近同一水平面时，将物镜调整成40倍物镜，缓慢接触细胞表面。当玻璃电极刚接触细胞表面时，入液电阻略有增加，小心地继续向下移动玻璃电极，直到入液电阻增加到初始入液电阻的1/3–2/3时停止移动，迅速从夹持器侧孔轻轻抽吸，形成千兆欧密封。缓慢给予负压破膜，形成全细胞记录模式。细胞钳制在-80mv，形成全细胞模式；转换成电流钳模式I＝0进行记录，记录自发动作电位，相同模式下记录自发动作电位。试验中的有效数据需要满足以下标准：1)初始封接电阻>1GΩ；2)漏电流<100pA；3)串联电阻(Ra)<15MΩ；4)膜电阻Rm>200MΩ。实验结果见图6所示，其中，图6中的(a)为心房肌细胞，其静息电位为－62.53mV；图6中的(b)为心室肌细胞，其静息电位为－62.9mV；图6中的(c)为窦房节细胞，其静息电位为－48.9mV。心肌肌钙蛋白是心肌肌肉收缩的调节蛋白，仅存在于心肌细胞中，是由肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白C(cTnC)三种亚单位组成的络合物，cTnT是心肌细胞特有的抗原，免疫荧光检测显示细胞球可表达肌钙蛋白cTnT，说明本发明可将iPSC成功分化为心肌细胞球。
效果实施例2从hiPSC诱导的心肌细胞体内功能评价
10只NOG小鼠(雄性，8周，20g)在适应性饲养7天后，把小鼠分为心肌梗死组和正常组，其中，心肌梗死组再分为hiPSC来源的心肌细胞(hiPSC-CM)治疗组和非治疗组。心肌梗死模型组的小鼠使用8-0尼龙线缝合左前降支(LAD)造模。hiPSC-CM选用诱导分化后第20天的为宜，此时移植活存活率最高，移植后心肌细胞能在注射位置成熟。取1×106纯化的hiPSC-CMs(20μL，溶质为培养基)，用100μL的注射器吸取。将注射器贴在8-0尼龙线结下方一点插入。将纯化的hiPSC-CMs注射到心脏缺血区。要能看到hiPSC-CMs注射过程心肌梗死区会随着肿胀。完成手术后缝合小鼠胸腔切口。手术后14天后第1次用超声检查小鼠心脏射血分数，之后每隔7天检查1次，共检查3次。手术后第30天牺牲小鼠并取小鼠心脏组织做HE染色。
结果见图7、图8和图9所示。其中，图8中分别展示第1周、第2周、第3周和第4周的超声检查小鼠心脏射血分数数据柱状图，可以看出，治疗后第3周和第4周，接受治疗的小鼠的心脏射血分数明显优于未接受治疗的小鼠心脏，非常接近80％的正常心脏水平。
图9中的(a)为未治疗的心肌梗死模型组的HE染色图，图9中的(b)为hiPSC-CMs治疗组的HE染色图，图9中的(c)为细胞治疗组和未经治疗组的心室壁厚度对比图，可以看出，治疗4周后，接受细胞治疗的小鼠的心室壁厚度明显厚于未接受治疗的小鼠的心室壁。这一结果和接受治疗的小鼠心脏射血分数高于未接受治疗的小鼠一致。
数据表明，本发明提供的制备方法能高效实现从hiPSC定向分化为成熟的心肌细胞球，且获得的心肌细胞品质高、活性好，在小鼠模型中发挥治疗功效出色，可以直接用于心脏发育科学研究，心脏疾病的细胞治疗，心脏损伤的移植以及药物筛选的应用，具有重要的生物医学研究意义。同时，本发明提供的制备方法简单可靠，稳定高效，制备成本低，易于生产工艺放大和工业化生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供人诱导性多能干细胞单细胞悬液，接种于培养皿、培养瓶或者反应器中培养48小时，形成聚集体；
(2)替换并使用第一分化培养基培养20-24小时，以诱导细胞分化；其中，所述第一分化培养基为包含7-8μM CHIR99021的CDM3基础培养基；
(3)弃去所述第一分化培养基，添加第二分化培养基培养48-56小时，所述第二分化培养基为包含4-6μM Wnt-C59的CDM3基础培养基；
(4)弃去所述第二分化培养基，换成CDM3基础培养基培养至第8-10天，且每隔48小时换液；
(5)弃去步骤(4)所述CDM3基础培养基，添加纯化培养基培养至第14天，每隔48小时换液；
(6)弃去所述纯化培养基，换成CDM3基础培养基培养，且每隔48小时换液，培养到第18-20天时，收集得到成熟的心肌细胞球。
2.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，所述CDM3基础培养为含0.2-0.25g/L L-抗坏血酸、0.4-0.6g/L重组人白蛋白和4-5g/L D-葡萄糖的RPMI-1640培养基。
3.如权利要求2所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，所述纯化培养基为含0.2-0.25g/L L-抗坏血酸、0.4-0.6g/L重组人白蛋白和3.5-4.5mM L-乳酸的RPMI-1640培养基。
4.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)-(6)的细胞培养方式为悬浮培养，均置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养，所述旋转摇床的旋转速度为30-90转/分钟。
5.如权利要求1或4所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)-(6)的细胞培养均置于37℃和5％CO2环境下的旋转摇床上培养；其中，所述步骤(1)-(3)中，所述旋转摇床的旋转速度为60-70转/分钟，所述步骤(4)和(5)中，所述旋转摇床的旋转速度为80-85转/分钟，所述步骤(6)中，所述旋转摇床的旋转速度为70-80转/分钟。
6.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的所述换成CDM3基础培养基培养至第8-10天时，开始分化得到具有节律跳动的细胞球。
7.如权利要求1所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，使用mTeSRTM3D培养基培养接种后的所述人诱导性多能干细胞，所述mTeSRTM3D培养基包含10μM Y-27632。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球。
9.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的或如权利要8任一项所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球在制备预防、诊断和治疗心脏疾病的药物中的应用。
10.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的或如权利要7任一项所述的从人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞球在具有心脏疾病小鼠模型中研究心脏疾病治疗方法的应用。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117866884A (zh) * | 2024-03-13 | 2024-04-12 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种糖原累积症IIIa型心肌细胞模型的构建方法 |
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| CN113337458A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-03 | 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 | 一种提高多能干细胞定向诱导心肌细胞产量及纯度的方法 |
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2023
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