CN117957310A - 类器官的制造方法、类器官制造用培养基、类器官、及被检物质的评价方法 - Google Patents
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Abstract
一种类器官的制造方法,包括在含有环肽或其药学上能够接受的盐的培养基中对人类干细胞进行培养,所述环肽具有下述式(1)[式(1)中,X1~X6分别表示特定的修饰氨基酸,X7表示任意的氨基酸残基,R不存在或表示C末端修饰基,n表示0或1的整数,PeG表示N‑(2‑苯基乙基)‑甘氨酸,Nal1表示β‑(1‑萘基)‑L‑丙氨酸]中记载的氨基酸序列。[化1]
Description
技术领域
本发明涉及一种类器官的制造方法、类器官制造用培养基、类器官及被检物质的评价方法。本申请基于2021年9月30日在日本提出申请的日本专利特愿2021-160758号而主张优先权,将其内容引用至本申请中。
背景技术
已知转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号与上皮细胞、内皮细胞、血细胞、淋巴细胞等多种细胞的增殖抑制能力、细胞外基质的积累能力有关。为了制造类器官,需要对TGF-β信号进行控制,特别是为了使细胞增殖,需要对TGF-β信号进行下调控制。
作为对TGF-β信号进行下调控制的方法,使用了与作为TGF-β信号相关的受体之一的TGF-β受体键结并进行抑制的TGF-β受体拮抗剂(参照专利文献1、非专利文献1)。然而,报告了在使用了A83-01等拮抗剂时其他靶标(off-target,TGF-β受体以外的受体)也被抑制的情况,其影响令人担忧(参照非专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利申请公开第2014/0243227号说明书
非专利文献
非专利文献1:佐藤T.等人,人结肠、腺瘤、腺癌及巴雷特上皮来源的上皮类器官的长期扩展,《肠胃病学》(Sato T.,et al.,Long-term expansion of epithelialorganoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett's epithelium,Gastroenterology),141(5),1762-1772,2011.
非专利文献2:沃格特J.等人,TGF-β与BMP途径的小分子抑制剂的特异性,《蜂窝信号(Cellular Signalling,Cell Signal)》(Vogt J.,et al.,The specificities ofsmall molecule inhibitors of the TGF-beta and BMP pathways,Cell Signal.),23(11),1831-1842,2011.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种优异的类器官的制造方法、用于所述制造的培养基、通过所述制造方法获得的类器官、及使用了类器官的被检物质的评价方法。
解决问题的技术手段
本发明包含以下的实施方式。
[1]一种类器官的制造方法,包括在含有环肽或其药学上能够接受的盐(以下,也称为“环肽群组”)的培养基中对人类干细胞进行培养,所述环肽具有下述式(1)中记载的氨基酸序列(序列编号1)。
[化1]
[式(1)中,X1表示Tyr、W6N、W7N或Nal1,X2表示Val、Lys、KCOp或KCOm,X3表示Tyr或4Py,X4表示Asp、Phe、KCOp、Glu或KCOm,X5表示Tyr或4Py,X6表示Val、Glu、KCOp或KCOm,X7表示任意的氨基酸残基,R不存在或表示C末端修饰基,n表示0或1的整数,PeG为N-(2-苯基乙基)-甘氨酸,Nal1为β-(1-萘基)-L-丙氨酸,W6N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)丙酸,W7N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙酸,KCOp为N6-(4-(羧甲基)哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸,KCOm为N6-(甲基((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-)五羟基己基)氨甲酰基)-L-赖氨酸,4Py为4-吡啶基-L-丙氨酸]
[2]根据[1]所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中的X1~X7、R、n的组合为下述表1中所示的组合。
[表1]
表1中,“PEG”表示聚乙二醇链。
[3]根据[1]或[2]所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中记载的氨基酸序列中的X1为Nal1,X2为Val,X4为Asp,X5为Tyr。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中所示的氨基酸序列中的Phe与Cys的键结是经由硫醚键的键结。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中所示的氨基酸序列的X7包含Gly。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基中包含的所述环肽及其药学上能够接受的盐的合计浓度为0.1nM~10μM。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有Wnt信号增强剂。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或肝细胞生长因子(HGF)、或者它们的组合。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有骨形成因子(骨形成蛋白质)抑制剂。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有Rho激酶(Rho相关卷曲螺旋激酶)信号转导抑制剂。
[11]根据[1]至[10]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基实质上不含有间变性淋巴瘤激酶5、间变性淋巴瘤激酶4或间变性淋巴瘤激酶7、或者它们的组合的拮抗剂。
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的类器官的制造方法,其中,在使所述人类干细胞与细胞外基质接触的同时对所述人类干细胞进行培养。
[13]一种类器官制造用培养基,含有环肽或其药学上能够接受的盐,所述环肽具有下述式(1)中记载的氨基酸序列(序列编号1)。
[化2]
[式(1)中,X1表示Tyr、W6N、W7N或Nal1,X2表示Val、Lys、KCOp或KCOm,X3表示Tyr或4Py,X4表示Asp、Phe、KCOp、Glu或KCOm,X5表示Tyr或4Py,X6表示Val、Glu、KCOp或KCOm,X7表示任意的氨基酸残基,R不存在或表示C末端修饰基,n表示0或1的整数,PeG为N-(2-苯基乙基)-甘氨酸,Nal1为β-(1-萘基)-L-丙氨酸,W6N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)丙酸,W7N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙酸,KCOp为N6-(4-(羧甲基)哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸,KCOm为N6-(甲基((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-)五羟基己基)氨甲酰基)-L-赖氨酸,4Py为4-吡啶基-L-丙氨酸]
[14]一种类器官,通过根据[1]至[12]中任一项所述的类器官的制造方法而获得。
[15]一种被检物质的评价方法,包括:使所述被检物质与根据[14]所述的类器官接触的步骤;以及对所述被检物质给所述类器官造成的影响进行评价的步骤。
发明的效果
通过本发明,可提供一种增殖性优异的类器官的制造方法、用于所述制造方法的培养基、通过所述制造方法获得的类器官、及使用了类器官的被检物质的评价方法。
附图说明
[图1]图1是表示实验例2的结果的显微镜图像。
[图2]图2是表示实验例3的结果的图表。
[图3]图3是表示实验例3的结果的图表。
[图4]图4是表示实验例4的结果的图表。
[图5]图5是表示实验例5的结果的显微镜图像。
[图6]图6是表示实验例5的结果的显微镜图像。
[图7]图7是表示实验例6的结果的显微镜图像。
具体实施方式
以下,示出实施方式对本发明进一步进行详细说明,但本发明并不受以下实施方式的任何限定。
只要未特别提及,则本说明书中例示的各成分、例如培养基中包含的成分可分别单独使用一种,或者可并用两种以上来使用。
A、B、a及b表示任意的数值,在为A>B>a>b的关系时,在本说明书中,“A~B”等表示数值范围的表述与“A以上且B以下”为相同含义。另外,在本说明书中,“A~B,优选为a~b”等表示数值范围的表述与“A以上且B以下”、“A以上且b以下”、“a以上且B以下”、及“a以上且b以下”为相同含义。
在本说明书中,所谓“含有物质X的培养基”、“在物质X的存在下”,是指添加有外源性(exogenous)的物质X的培养基、包含外源性的物质X的培养基或在外源性的物质X的存在下。即,在所述培养基中所存在的细胞或组织内源性(endogenous)地表达、分泌或产生所述物质X的情况下,内源性的物质X与外源性的物质X有所区别,不含外源性的物质X的培养基即使包含内源性的物质X,也不符合“包含物质X的培养基”的范畴。
[类器官的制备方法]
在一个实施方式中,本发明提供一种类器官的制造方法,包括在含有环肽或其药学上能够接受的盐的培养基中对人类干细胞进行培养,所述环肽具有下述式(1)中记载的氨基酸序列。
当在所述培养基中对人类干细胞进行培养时,所述人类干细胞增殖,并形成包含干细胞及分化的细胞这两者的类器官。
在本说明书中,氨基酸包含天然的氨基酸及非天然的氨基酸。以下,有时将“具有下述式(1)中记载的氨基酸序列(序列编号1)的环肽或其药学上能够接受的盐”称为“环肽群组”。
[化3]
式(1)中,X1表示Tyr、W6N、W7N或Nal1,X2表示Val、Lys、KCOp或KCOm,X3表示Tyr或4Py,X4表示Asp、Phe、KCOp、Glu或KCOm,X5表示Tyr或4Py,X6表示Val、Glu、KCOp或KCOm,X7表示任意的氨基酸残基,R不存在或表示C末端修饰基,n表示0或1的整数,PeG为N-(2-苯基乙基)-甘氨酸,Nal1为β-(1-萘基)-L-丙氨酸,W6N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)丙酸,W7N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙酸,KCOp为N6-(4-(羧甲基)哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸,KCOm为N6-(甲基((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-)五羟基己基)氨甲酰基)-L-赖氨酸,4Py为4-吡啶基-L-丙氨酸。
如在实施例中后述的那样,通过本实施方式的类器官的制造方法,可在不使用A83-01等TGF-β受体拮抗剂的情况下对人类干细胞进行培养。已知许多拮抗剂会作用于多个受体,例如,已知在A83-01的情况下,不仅强力作用于作为TGF-β受体的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)5,还会强力作用于血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIPK)2、畸形样激酶(misshapen-like kinase,MINK)1、p38α、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、蛋白激酶D1(protein kinase D1,PKD1)及成纤维细胞生长因子-受体1(fibroblast growthfactor-receptor 1,FGF-R1)。另一方面,由于环肽群组作用于TGF-β受体的配体,因此可消除TGF-β受体拮抗剂对其他靶标的影响。此处,所谓TGF-β受体的配体,表示具有激动剂(agonist)作用的配体。另外,由于可推断环肽群组对其他靶标实质上不发挥作用,因此培养基中的环肽群组也可以比TGF-β受体拮抗剂的必要浓度低的浓度对人类干细胞进行培养。
可推断环肽群组可与外源性或内源性的TGF-β受体的配体键结、优选为特异性地键结。
本实施方式的类器官的制造方法在以往的使用A83-01等TGF-β受体拮抗剂进行的细胞培养中,使用环肽群组来代替TGF-β受体拮抗剂,由此也可以比TGF-β受体拮抗剂的必要浓度低的浓度对人类干细胞进行培养。
在本实施方式的类器官的制造方法中,所谓人类干细胞,是指人类细胞或来源于人类的细胞,且是具有自我复制能力与分化能力的细胞。作为人类干细胞,例如可列举:人类上皮干细胞、人类间充质干细胞、人类血管细胞、人类癌细胞等人体性干细胞;人类人工多能干细胞(人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC))、人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)等人类多能干细胞;处于从人类干细胞向特定的体细胞或生殖细胞分化的中途阶段的、具有向特定的组织/脏器的分化能力的人类前体细胞。在本实施方式的培养方法中,作为人类干细胞,可使用包含人类干细胞的细胞群体。
在本实施方式的类器官的制造方法中,在人类干细胞形成了细胞凝聚块的情况下,通常进行分散处理。所谓分散,是指通过酶处理或物理处理等分散处理,使细胞分离成100个以下的细胞群体、优选为50个以下的细胞群体、更优选为单一细胞。作为分散处理,例如可列举:机械分散处理;使用了胰蛋白酶、胶原酶、木瓜蛋白酶、乙二胺四乙酸等细胞分散液的处理。在进行分散处理之前,为了防止细胞死亡,可利用肝素、Rho相关卷曲螺旋激酶(Rho-associated coiled-coil forming kinase,ROCK)抑制剂、胰岛素样生长因子等细胞保护剂进行处理。
环肽的特征在于:在下述式(1-1)(序列编号1)中的序列(sequence,seq.)5~seq.8中,包含Asn-Val-Tyr-Asp(序列编号2)、或Asn-Val-4Py-Asp;以及在seq.11~seq.14中包含Val-Nal1-Tyr-His或Val-Nal1-4Py-His。具有这些氨基酸序列的肽在TGF-β受体的配体中具有活性。
[化4]
seq.2、seq.4、seq.9及seq.15分别包含选自由亲水氨基酸、疏水氨基酸及芳香族氨基酸所组成的群组中的残基,通过适宜地调整这些残基的组合,可在维持环肽的高次结构的同时,对其在培养基中的溶解性进行控制。
所述式(1)或所述式(1-1)中,X7为处于肽的C末端的接头,且可为一个或多个任意的氨基酸残基。在翻译合成系统中,X7用于与嘌呤霉素(puromycin)、低分子化合物、其他肽及蛋白质等的键结。作为X7,可列举:Gly及包含Gly-Lys的基团。另外,n为0或1。
另外,R不存在或为C末端的羧基的修饰基,由C末端的羧基与修饰基形成-COOR的结构,优选为去除羧基的负电荷并附加正电荷的修饰基。作为此种修饰基,可列举:氨基、酰胺基、氨基乙基、吡唑烷基、哌啶基、咪唑啉基及哌嗪基。另外,R可包含聚乙二醇链。
作为环肽的最优氨基酸序列,优选为环肽的X1~X6的组合为所述表1中所示的组合中的任一者,更优选为X1为Nal1、X2为Val、X4为Asp、X5为Tyr、X6为Val或KCOp的组合。
在本说明书中,环肽可通过液相法、固相法、将液相法与固相法加以组合的混合法等化学合成法、基因重组法等已知的制造方法来制造。
在固相法中,例如通过以下方法来合成环肽。首先,使具有羟基的树脂的羟基与α-氨基受保护基保护的第一氨基酸(通常为目标肽的C末端氨基酸)的羧基进行酯化反应。作为酯化催化剂,可使用1-均三甲苯基磺酰基-3-硝基-1,2,4-三唑(1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole,MSNT)、二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)、二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,DIPCDI)等已知的脱水缩合剂。
接着,使第一氨基酸的α-氨基的保护基脱离,并且添加除主链的羧基以外的所有官能基经保护的第二氨基酸,使所述羧基活化,以键结第一氨基酸及第二氨基酸。进而,使第二氨基酸的α-氨基脱保护,并添加除主链的羧基以外的所有官能基经保护的第三氨基酸,使所述羧基活化,以键结第二氨基酸及第三氨基酸。重复进行此操作,在合成了目标长度的肽后,使所有的官能基脱保护。
作为固相法中使用的树脂,可列举:马瑞费德树脂(Merrifield resin)、4-甲苯氢胺(4-methylbenzhydrylamine,MBHA)树脂、氯三苯甲基氯(chlorotrityl chloride,Cl-Trt)树脂、沙林树脂(SASRIN resin),王树脂(Wang resin)、冰场酰胺树脂(Rink amideresin)、HMFS树脂、氨基-聚乙二醇聚丙烯酰胺共聚物(Amino-PEGA(polyethylene glycolpolyacrylamide copolymers))树脂(默克公司)、六甲基磷酰胺(hexamethylphosphoramide,HMPA)-PEGA树脂(默克公司)等。这些树脂可在利用溶剂(二甲基甲酰胺(dimethyl formamide,DMF)、2-丙醇、氯甲烷(methylene chloride)等)进行清洗后使用。
作为α-氨基的保护基,可列举:苄基氧基羰基(Cbz基或Z基)、叔丁氧基羰基(Boc(t-butyloxy carbonyl)基)、芴基甲氧基羰基(Fmoc(fluorenylmethyloxycarbonyl)基)、苄基、烯丙基、烯丙氧基羰基(Alloc(allyloxycarbonyl)基)等。Cbz基可通过氢氟酸、氢化等进行脱保护,Boc基可通过三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)进行脱保护,Fmoc基可通过利用哌啶的处理进行脱保护。
α-羧基的保护可使用甲基酯、乙基酯、苄基酯、叔丁基酯、环己基酯等。
作为氨基酸的其他官能基,丝氨酸、苏氨酸的羟基可利用苄基或叔丁基进行保护,酪氨酸的羟基可利用2-溴苄基氧基羰基或叔丁基进行保护。赖氨酸侧链的氨基、谷氨酸、天冬氨酸的羧基可与α-氨基、α-羧基同样地进行保护。
羧基的活化可使用缩合剂来进行。作为缩合剂,例如可列举:二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)或水溶性碳二亚胺(water-solublecarbodiimide,WSC))、(1H-苯并三唑-1-氧基)三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐((1H-benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate,BOP),1-[双(二甲基氨基)甲基]-1H-苯并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(1-[bis(dimethylamino)methyl]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate,HBTU)等。
可通过利用TFA、氟化氢(hydrogen fluoride,HF)等酸进行处理而从树脂切断肽链。
利用基因重组法(翻译合成系统)的环肽的制造可使用对目标环肽进行编码的核酸来进行。对环肽进行编码的核酸可为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)或核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)。
对环肽进行编码的核酸可通过已知的方法来制备。例如,可通过自动合成装置进行合成。也可为了将所获得的DNA插入载体中而添加限制性酶识别部位,或者编入对利用酶等将合成后的肽链切出这一用途的氨基酸序列进行编码的碱基序列。
为了抑制源自宿主的蛋白酶所引起的分解,也可使用嵌合蛋白表达法,所述嵌合蛋白表达法将目标肽表达成与其他肽的嵌合肽。此情况下,作为所述核酸,可使用对作为目标的肽以及与其键结的肽进行编码的核酸。
继而,制备包含对肽进行编码的核酸的表达载体。对肽进行编码的核酸可以原本的状态、或者在利用限制性酶进行了消化之后或在附加接头等之后插入表达载体的启动子的下游。作为载体,可列举:源自大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、p蓝本(pBluescript)II等)、源自枯草杆菌的质粒(pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等)、源自酵母的质粒(pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等)、噬菌体(e噬菌体,M13噬菌体等)、病毒(逆转录病毒(retrovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)、花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)、杆状病毒(baculovirus)等)、黏粒(cosmid)等。
可根据宿主的种类适宜地选择启动子。在宿主为动物细胞的情况下,例如可使用源自猿猴病毒(simian virus 40,SV40)的启动子、源自巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)的启动子。在宿主为大肠杆菌的情况下,可使用trp启动子、T7启动子、lac启动子等。
在表达载体中,也可编入DNA复制起始点(ori)、选择标记(抗生素抵抗性、营养要求性等)、增强子、剪接信号、多聚A附加信号、对标签(标记(FLAG)、抗血凝素(anti-hemagglutinin,HA)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、绿色萤光蛋白(green fluorescent protein,GFP)等)进行编码的核酸等。
接着,利用所述表达载体对适当的宿主细胞进行转化。宿主可根据与载体的关系适宜地选择,例如可使用大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌属菌、酵母、昆虫活体、昆虫细胞、动物细胞等。作为动物细胞,例如可使用人类胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293T细胞、中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞、SV40转化的非洲绿猴肾克隆细胞(CV-1in Origin with SV40 genes,COS)细胞、骨髓瘤(myeloma)细胞、海拉(HeLa)细胞、非洲绿猴肾(Vero)细胞。转化可根据宿主的种类,通过脂质体转染法、磷酸钙法、电穿孔法、显微注射法、粒子枪法等已知的方法来进行。通过依照常规方法对转化体进行培养而表达出作为目标的肽。
在从转化体的培养物中进行肽的纯化时,首先,回收培养细胞并将其悬浮于适当的缓冲液中,然后通过超声波处理、冻融等方法将细胞破坏,并通过离心分离或过滤而获得粗提取液。在培养液中分泌出肽时,回收上清液。
从粗提取液或培养上清液中进行的肽的纯化也可通过已知的方法或依据于已知方法的方法(例如,盐析、透析法、超滤法、凝胶过滤法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法、离子交换色谱法、亲和色谱法(affinity chromatography)、逆相高效液相色谱法等)来进行。
所获得的肽可通过已知的方法或依据于已知方法的方法而从游离体转换为盐,或者从盐转换为游离体。
翻译合成系统可列举无细胞翻译系统。无细胞翻译系统例如包含核糖体蛋白、氨基酰转移核糖核酸(transfer RNA,tRNA)合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,ARS),核糖体RNA、氨基酸、rRNA、三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)、三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)、翻译起始因子(initiation factor,IF)、延伸因子(elongation factors,EF)、终止因子(释放因子(release factor,RF))、核糖体循环因子(ribosome recycling factor,RRF)、及翻译所需的其他因子。为了提高表达效率,可加入大肠杆菌提取液或小麦胚芽提取液。除此之外,还可加入兔红细胞提取液或昆虫细胞提取液。在无细胞翻译系统中,例如,可实施信使RNA(messenger RNA,mRNA)显示法,此情况下,可经由接头来连接负责模板mRNA与翻译后的肽的键结的嘌呤霉素。
使用透析向包含它们的系统连续地供给能量,由此可生产数百微克/毫升到数毫克/毫升的肽。为了同时进行来自基因DNA的转录,可使用包含RNA聚合酶的系统。作为市售的无细胞翻译系统,源自大肠杆菌的系统可使用罗氏诊断产品(Roche Diagnostics)公司的RTS-100(注册商标)、PGI公司的纯系统(PURESYSTEM)(注册商标)等,使用了小麦胚芽提取液的系统可使用佐伊基因(ZOE GENE)公司或无细胞科学(CellFree Sciences)公司的系统等。通过无细胞翻译系统,可在不进行纯化的情况下以高纯度的形式获得表达产物。
在无细胞翻译系统中,可代替天然的氨基酰tRNA合成酶中所合成的氨基酰tRNA,而使用将非天然的氨基酸或羟基酸与tRNA连结(进行酰化)而成的人工的氨基酰tRNA。此种氨基酰tRNA可使用灵活酶(flexizyme)等人工的核酶来合成。
通过使用连结有非天然的氨基酸或羟基酸的tRNA,可与非天然的氨基酸或羟基酸相关联地对所需的密码子进行翻译。
将环肽中的非天然的氨基酸示于下述表2中。表2中,省略化学式的立体结构。
[表2]
肽的环状化是通过利用seq.16的Cys的硫醇基、与例如seq.1的氯乙酰化的Phe的氯乙酰基(Cl-CH2-CO-NH-C(Bzl)-COO-)或Cl-R-CO-NH-C(Bzl)-COO-(此处,R为烷二基)的环化反应而形成硫醚键来进行。此情况下,所述式(1)中所示的氨基酸序列中的Phe与Cys的键结是经由硫醚键的键结。为了进行环状化,可利用灵活酶生成氯乙酰化的Phe与tRNA的复合体并用于翻译合成系统。
形成于氯乙酰基与硫醇之间的硫醚键即使在还原条件下也不易分解,因此半衰期长。
环肽具有与TGF-β受体的配体键结的能力。所述TGF-β受体可为ALK5、ALK4或ALK7、或者它们的组合。人类ALK5的美国国家生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information,NCBI)登录编号为NP_001124388.1、NP_001293139.1、NP_004603.1等。另外,人类ALK4的NCBI登录编号为NP_004293.1、NP_064732.3、NP_064733.3等。另外,人类ALK7的NCBI登录编号为NP_001104501.1、NP_001104502.1、NP_001104503.1、NP_660302.2等。
作为所述环肽所键结的TGF-β受体的配体,可列举TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,优选为TGF-β1。人类TGF-β1的NCBI登录编号为NP_000651.3等。人类TGF-β2的NCBI登录编号为NP_001129071.1、NP_003229.1等。人类TGF-β3的NCBI登录编号为NP_001316867.1、NP_001316868.1、NP_003230.1等。
所述环肽也可为衍生物。作为环肽的衍生物,例如可列举:在构成环肽的任一氨基酸上附加有聚乙二醇链等的衍生物;将构成环肽的任一氨基酸转换为D型体而成的衍生物;经由接头而键结有低分子化合物、其他肽、或蛋白质等的复合体。
作为环肽的药学上能够接受的盐,例如可列举:钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、与三甲基胺的盐、与吡啶的盐、与乙醇胺的盐、与酒石酸的盐、与柠檬酸的盐、与琥珀酸的盐、及与苹果酸的盐。环肽的药学上能够接受的盐可通过对环肽进行盐交换来制造。所谓药学上能够接受的盐,包含生物学上能够接受的盐。
在本实施方式的类器官的制造方法中,培养基中包含的环肽的浓度(环肽及其衍生物、以及它们的药学上能够接受的盐的合计浓度)通常为0.1nM~10μM,例如为0.1nM~1,000μM,根据细胞种类适宜地调整。
在本实施方式的类器官的制造方法中,通常在基础培养基中添加特定环肽来制备培养基。另外,在培养基中,还可适宜地添加下述所示的各种成分。作为基础培养基,可列举:杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)、最低必需培养基(Minimum Essential Medium,MEM)、诺克阿特(KnockOut)-DMEM(KO-DMEM)、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow's-MEM,G-MEM)、伊格尔最低必需培养基(基础伊格尔培养基(BasalMedium Eagle,BME))、DMEM/F12、高级(Advanced)DMEM/F12、伊斯科夫改良杜氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、汉姆氏(Ham's)F-10、汉姆氏F-12、199培养基、及洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培养基等。在本说明书中,所谓基础培养基,表示包含氨基酸、抗氧化剂、矿物质、及葡萄糖等碳源,进而任意地包含血清、脂肪酸、及胰岛素或转铁蛋白(transferrin)等蛋白质等最低限度培养所必需的成分的培养基。
培养基可含有Wnt信号增强剂。作为Wnt信号增强剂,可列举:Wnt家族成员(familymember)、糖原合成酶激酶(Glycogen Synthase Kinase,GSK)抑制剂或富含亮氨酸重复序列的g蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing g-protein coupled receptor5,Lgr5)激动剂、或者它们的组合。
作为Wnt家族成员,可列举:Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等。作为Wnt家族成员,也可列举与作为其稳定化物质的α白蛋白(afamin)的复合体。
作为GSK抑制剂,可列举GSK-3β抑制剂,例如可列举:CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile))(化学文摘社(Chemical Abstracts Service,CAS)编号:252917-06-9)、肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS编号:142273-20-9)、及6-溴靛玉红-3'-肟(6-Bromoindirubin-3'-oxime,BIO,CAS编号:667463-62-9)。
作为Lgr5激动剂,例如可列举R-spondin家族。作为R-spondin家族,例如可列举R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3、R-spondin4等,其中,优选为R-spondin1。
在使用CHIR99021作为Wnt信号增强剂的情况下,培养基中包含的CHIR99021的浓度通常为0.1μM~30μM,优选为0.2μM~20μM。
在使用Wnt3a作为Wnt信号增强剂的情况下,培养基中包含的Wnt3a的浓度通常为0.1ng/mL~20ng/mL,优选为0.2ng/mL~10ng/mL。
培养基可含有上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor,IGF)或肝细胞生长因子(hepatocyte growth actor,HGF)、或者它们的组合。
培养基中包含的EGF的浓度通常为5ng/mL~500ng/mL,优选为25ng/mL~300ng/mL,进而优选为50ng/mL~100ng/mL。
作为FGF,可列举FGF2、FGF4、FGF7及FGF10,这些中,优选为FGF10。培养基中包含的FGF的浓度通常为20ng/mL~500ng/mL,优选为50ng/mL~500ng/mL,更优选为100ng/mL~500ng/mL。
作为IGF,优选为IGF1。培养基中包含的IGF的浓度通常为5ng/mL~1,000ng/mL,优选为10ng/mL~1,000ng/mL,更优选为50ng/mL~1,000ng/mL。
培养基中包含的HGF的浓度通常为1ng/mL~100ng/mL,优选为10ng/mL~100ng/mL,更优选为20ng/mL~100ng/mL,进而优选为40ng/mL~100ng/mL。
培养基可含有骨形成因子(骨形成蛋白质(bone morphogenetic protein,BMP))抑制剂。BMP抑制剂优选为头蛋白(Noggin)。培养基中包含的BMP抑制剂的浓度通常为10ng/mL~100ng/mL,优选为20ng/mL~100ng/mL,更优选为50ng/mL~100ng/mL。
培养基可包含ROCK信号转导抑制剂。作为ROCK信号转导抑制剂,可列举:Y-27632(CAS编号:146986-50-7),法舒地尔(Fasudil)(CAS编号:105628-07-7)、Y39983(CAS编号:203911-26-6)、Wf-536(CAS编号:539857-64-2)、SLx-2119(CAS编号:911417-87-3)、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱(Azabenzimidazole-aminofurazans)(CAS编号:850664-21-0)、DE-104、H-1152P(CAS编号:872543-07-6)、及布雷他汀(Blebbistatin)(CAS编号:856925-71-8)等。
培养基中包含的ROCK信号转导抑制剂的浓度通常为1μM~20μM,优选为5μM~15μM。
除了上述成分以外,培养基还可含有例如胃泌素(或亮氨酸15(leucine15,Leu15)-胃泌素I等适当的替代物);SB202190(CAS编号:152121-30-7)、及达马莫德(Doramapimod)(CAS编号:285983-48-4)等p38抑制剂;青霉素类抗生素、头孢烯(cephem)类抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素等抗菌剂;白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-11(IL-11)、抑瘤素M(oncostatin M,OSM)、白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor,LIF)、心肌营养因子-1(cardiotrophin-1,CT-1)、睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophic factor,CNTF)等IL-6家族细胞因子;视黄酸;烟酰胺;佛司可林(Forskolin)等肿瘤细胞生长因子-α(TGF-α);N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT)(γ-分泌素抑制剂(γ-secretase inhibitor));二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO);地塞米松(dexamethasone,Dex);月桂酸、肉豆蔻酸、亚油酸、亚麻酸、油酸等脂肪酸;它们的组合。
培养基可含有赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司等销售的B27补充剂、谷氨酰胺(GlutaMax)系列等含谷氨酸的补充剂、MEM非必需氨基酸溶液(non-essential amino acids solution)等氨基酸水溶液、N2补充剂等补充剂。
在本实施方式的类器官的制造方法中,培养基优选为实质上不含ALK5、ALK4或ALK7、或者它们的组合中的任一者TGF-β受体的拮抗剂。此处,所谓“实质上不含”,是指未有意作为有效成分来混入、或者容许可忽略影响的程度的无意的混入。具体而言,培养基中包含的TGF-β受体拮抗剂的浓度为1nM以下,优选为0.1nM以下,更优选为0.01nM以下。
作为TGF-β受体拮抗剂,可列举:A83-01(CAS编号:909910-43-6)、SB-431542(CAS编号:301836-41-9)、SB-505124(CAS编号:694433-59-5)、SB-525334(CAS编号:356559-20-1)、LY364947(CAS编号:396129-53-6)、SD208(CAS编号:627536-09-8)、SJN2511(CAS编号:446859-33-2)等。作为TGF-β受体配体,可列举:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等。
在本实施方式的类器官的制造方法中,优选为在使人类干细胞与细胞外基质接触的同时对所述人类干细胞进行培养。
作为在使人类干细胞与细胞外基质接触的同时对所述人类干细胞进行培养的方法,可列举:将人类干细胞包埋于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中进行培养的方法、在培养基中混合ECM进行培养的方法、在培养容器的培养面涂布ECM进行培养的方法等。作为ECM,例如可列举基膜中包含的成分、存在于细胞间隙中的糖蛋白。作为基膜中包含的成分,例如可列举:IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin)等。作为存在于细胞间隙中的糖蛋白,可列举:胶原、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白、肝素硫酸盐(heparin sulfate)等。作为ECM,可使用包含ECM的市售品。作为包含ECM的市售品,例如可列举基质胶(Matrigel)(注册商标,康宁公司)、人型层粘连蛋白(西格玛(Sigma)公司)等。
混合有ECM的培养基可以如下量进行混合来制备:相对于培养基中的ECM以外的成分的体积,ECM的体积通常为1体积%以上,优选为5体积%以上且100体积%以下,更优选为10体积%以上且90体积%以下。作为混合ECM的方法,可列举在冰浴上移液的方法。所谓混合,是指在目视下在培养基中未观察到ECM的状态。
培养基可每1天~5天更换一次左右。培养通常在30℃~50℃、优选为32℃~48℃、更优选为34℃~46℃的温度条件下进行。培养是在二氧化碳含有比例通常为1体积%~15体积%、优选为2体积%~14体积%、更优选为3体积%~13体积%以下的环境下进行。
[类器官制造用培养基]
在一个实施方式中,本发明提供一种类器官制造用培养基,其含有环肽或其药学上能够接受的盐,所述环肽具有上述式(1)中记载的氨基酸序列。
本实施方式的类器官制造用培养基也可称为类器官培养用培养基。通过本实施方式的培养基,可良好地对人类干细胞进行培养来制造类器官。
培养基是在基础培养基中添加各种成分来制备。关于基础培养基、各种成分,与上文所述相同。
[类器官]
在一个实施方式中,本发明提供一种通过所述类器官的制造方法而获得的类器官。在本说明书中,所谓类器官,是指在体外(in vitro)形成的、对干细胞进行培养而获得的自我组织化三维细胞培养物。细胞培养物也可具有接近脏器的结构。本实施方式的类器官可在不存在TGF-β受体拮抗剂的情况下进行培养。因此认为,与以往的使用TGF-β受体拮抗剂获得的类器官不同,未受到TGF-β受体拮抗剂对其他靶标的抑制的影响,更反映出生物体内的细胞的状态。
作为本实施方式的类器官,可列举:大肠类器官、小肠类器官、肝类器官、胆管类器官、脑类器官、卵巢癌类器官、视网膜类器官等。
本实施方式的类器官与通过本实施方式的类器官的制造方法以外的制造方法获得的类器官相比,认为在基因表达谱(gene expression profile)等方面存在差异。然而,确定此种差异并根据基因表达谱的差异等来确定是通过本实施方式的类器官的制造方法以外的制造方法获得的类器官、还是本实施方式的类器官的情况是非常困难的且是不实际的。因此,现实中是通过制造方法来确定。
[被检物质的评价方法]
在一个实施方式中,本发明提供一种被检物质的评价方法,包括:使所述被检物质与所述类器官接触的步骤(以下,也称为“步骤1”);以及对所述被检物质给所述类器官造成的影响进行评价的步骤(以下,也称为“步骤2”)。
作为被检物质,例如可列举:天然化合物库、合成化合物库、现有药物库、代谢物库。另外,作为被检物质,也可使用新药。
在步骤1中,可使用类器官来构筑反孔(Transwell)型分析系统等基于细胞的分析(cell based assay)系统、或者器官芯片(Organ-on-a-Chip)等仿生系统,并使被检物质与类器官接触。
在步骤2中,被检物质给类器官造成的影响可通过蛋白质印迹(Westernblotting)、酶联免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫染色等进行评价。
实施例
以下,示出实验例对本发明进行更详细说明,但本发明并不受以下实验例任何限定。在以下的实验例中,所有的实验均使用了灭菌处理完毕的器具。
[实验例1]
(大肠上皮干细胞培养用培养基的制备)
在基础培养基中,以成为下述表3中所示的浓度的方式加入各成分,来制备培养基。表3中,“CM”是指条件培养基(conditioned medium)。基础培养基使用了高级DMEM/F12(Advanced DMEM/F12)。作为肽,使用了肽名称#7401及#2392(以下,有时分别称为“#7401肽”、“#2392肽”)。关于#7401肽,在式(2-1)中示出化学式,在式(2-2)中示出氨基酸序列(序列编号3)。另外,关于#2392肽,在式(3-1)中示出化学式,在式(3-2)中示出氨基酸序列(序列编号4)。
[表3]
[化5]
/>
[化6]
[化7]
[化8]
[实验例2]
(人类大肠上皮细胞的培养)
使人类大肠上皮细胞(包含人类大肠干细胞)分散至基质胶(Matrigel)(注册商标,BD生物科学(BD Bioscience)公司制造)中。继而,将分散物接种至48孔组织培养板的各孔中,在37℃下孵化(incubate)10分钟,使基质胶(Matrigel)(注册商标)聚合。
继而,在各孔中将实验例1中所制备的培养基(300μL/孔)重叠多层,在37℃、5体积%CO2存在下培养7天。每隔2天或3天进行培养基的更换。继而,利用光学显微镜对培养7天后的孔内进行观察。将明视野图像示于图1中。在图1中,“ND”表示未获取数据。
其结果,明确了:通过使用添加有#2392肽、#7401肽的培养基对人类大肠干细胞进行培养,可以与添加有A83-01的情况同等以上的效率形成类器官。
[实验例3]
(人类肝脏细胞的培养)
利用37℃的水浴将人类原代冷冻浮游肝细胞(百普洛(BIOPRRIDIC)公司制造,HEP187-S)融化,并悬浮于加入了无血清培养基(在高级DMEM/F12中加入HEPES、GLUTAMAX、青霉素(PENICILIN)/链霉素(STEREPTOMYCIN)而成的培养基)的50mL管中进行离心。离心后,除去上清液,然后在无血清培养基中悬浮,从而制备人类肝脏细胞悬浮液。从所述悬浮液中采集20,000个人类肝脏细胞,并与50μL的基质胶(Matrigel)(注册商标,BD生物科学(BD Bioscience)公司制造)混合,接种至24孔组织培养板中,在37℃下孵化10分钟,直至基质胶(Matrigel)(注册商标)完全聚合。在聚合后,将在基础培养基中以成为下述表4中所示的浓度的方式加入各成分制备而成的培养基(500μL/孔)重叠多层,在37℃、5体积%CO2存在下进行培养。基础培养基使用了高级DMEM/F12。每隔2天或3天进行培养基的更换。
[表4]
成分 | 浓度 |
R-spondin1(R-spondin1 CM) | 10v/v%(相对于基础培养基) |
Wnt3a(Wnt3a CM) | 20v/v%(相对于基础培养基) |
头蛋白(头蛋白CM) | 2v/v%(相对于基础培养基) |
EGF | 50ng/mL |
FGF10 | 100ng/mL |
HGF | 25ng/mL |
Y-27632 | 10μM |
佛司可林 | 10nM |
IL-6 | 100ng/mL |
A83-01或#7401肽 | 50nM、500nM或5μM |
图2是表示对细胞增殖进行测定而得的结果的图表。在图2中,“PDi”表示在培养基中添加有5μM的#7401肽时的结果,“A+”表示在培养基中添加有5μM的A83-01时的结果,“A-”表示在培养基中既未添加#7401肽也未添加A83-01时的结果。
根据图2的结果可知,当在培养基中添加有5μM的A83-01时,在35天以后未发现细胞增殖。根据此结果,暗示出A83-01可能受到了肝细胞所进行的代谢的影响。
图3是表示对将#7401肽设为低浓度时的细胞增殖进行测定而得的结果的图表。图3中,“5μM PDi”表示在培养基中添加有5μM的#7401肽时的结果,“500nM PDi”表示在培养基中添加有500nM的#7401肽时的结果,“50nM PDi”表示在培养基中添加有50nM的#7401肽时的结果,“A+”表示在培养基中添加有5μM的A83-01时的结果,“A-”表示在培养基中既未添加#7401肽也未添加A83-01时的结果。
根据图3的结果而明确,即使培养基中的#7401肽的浓度为50nM,细胞也可充分增殖。
[实验例4]
(利用Sma和Mad相关蛋白(Sma-and Mad-related protein,SMAD)结合元件(SMADbinding element,SBE)报告分析进行的#7401肽的特异性评价)
利用0.5nM的各种TGF-β(TGF-β1~TGF-β3)与图4中所示的浓度的A83-01或#7401肽,对报告细胞(TGF/SMAD信号转导途径SBE报告、荧光素酶、HEK293重组细胞系(TGF/SMADSignaling Pathway SBE Reporter,Luciferase,HEK293 Recombint Cell Line),BPS生物科学有限(BPS Bioscience Inc.)公司制造)进行刺激,在20小时后使用万格罗TM荧光素酶分析系统(ONE-GloTMLuciferase Assay System)对信号进行检测。在本分析系统中,当TGF-β信号被转导到核时,作为报告基因的荧光素酶进行表达,从而检测出信号。将结果示于图4中。
[实验例5]
(EGFR信号及p38 MAPK信号的研究)
已知对EGFR信号的上调控制会诱导细胞增殖。因此,对无EGFR信号的状态下的细胞增殖性进行了研究。另外,报告了A83-01会抑制p38 MAPK信号转导(非专利文献2),进而,已知p38 MAPK信号的下调控制对肠的长期培养有效(非专利文献1)。因此,对有/无p38MAPK信号时的培养进行了研究。
在基础培养基(高级DMEM/F12)中,以成为下述表5中所示的浓度的方式加入各成分,来制备培养基。将人类小肠上皮细胞(包括人类小肠干细胞)分散至基质胶(Matrigel)(注册商标,BD生物科学(BD Bioscience)公司制造)中。继而,将分散物接种至48孔组织培养板的各孔中,在37℃下孵化10分钟,使基质胶(Matrigel)(注册商标)聚合。
[表5]
继而,将300μL/孔的培养基重叠多层,在37℃、5体积%CO2存在下培养10天。每隔2天或3天进行培养基的更换。在包含EGF的培养基中培养10天,在不含EGF的培养基中培养14天。然后,进行孔内的利用光学显微镜的明视野观察及Lgr5-红色荧光蛋白(tdTomato)报告分析。图5表示在包含EGF(50ng/mL)的培养基中的培养结果,图6表示在不含EGF的培养基中的培养结果。图5、图6中,“#3-a_A500S”表示为包含500nM的A83-01及10μM的SB202190的培养基中的培养结果,“#7_A500”表示为包含500nM的A83-01且不含SB202190的培养基中的培养结果,“#8_A5000”表示为包含5000nM的A83-01且不包含SB202190的培养基中的培养结果,“#9_P50”表示为包含50nM的#7401肽且不含SB202190的培养基中的培养结果,“#10_P500”表示为包含500nM的#7401肽且不含SB202190的培养基中的培养结果。
图5的“#3-a_A500S”是表示p38 MAPK信号的下调控制对细胞增殖性及菌落形成性的抑制的结果。另外,图5的“#7_A500”及“#8_A5000”的结果与“#3-a_A500S”的结果同样地示出:通过使用A83-01,细胞增殖性及菌落形成性与浓度相依存地受到抑制。因此,这些结果示出了A83-01对p38 MAPK信号转导的抑制的可能性。
图6的“#3-a_A500S”的结果支持示出p38 MAPK信号的下调控制对肠的长期培养有效的非专利文献1的结果。在图6的“#7_A500”及“#8_A5000”中,与“#9_P50”或“#10_P500”相比干细胞性高,进而“#8_A5000”与“#7_A500”相比干细胞性高,因此示出了A83-01对p38MAPK信号转导抑制的可能性。
[实验例6]
(大脑皮质类器官的形成)
对hiPSCs(PChiPS771株,Lot.A01QM28,利普劳塞鲁(ReproCELL)公司制造)进行无饲养层(feeder-free)培养。具体而言,利用磷酸盐缓冲盐水(Phosphate BufferedSaline,PBS)对hiPSCs进行清洗后,使用TrypLE Select(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司制造)分散成单一细胞。继而,将分散后的hiPSCs接种至经仅包含层粘连蛋白-511的活性部位的人类重组型层粘连蛋白片段(产品名“iMatrix-511”,日皮(Nippi)公司制造)涂布的塑料培养平皿中,在Y27632(ROCK抑制剂,10μM)的存在下,利用StemFitAK02N培养基(味之素公司制造)进行无饲养层培养。在作为所述塑料培养平皿而使用60mm平皿(易威奇(Iwaki)公司制造,细胞培养用途)的情况下,分散成单一细胞的hiPSCs的接种细胞数设为3×104个/平皿。
在接种细胞起的1天后,将培养基更换为不含Y27632的StemFit AK02N培养基。以后,每1天~2天利用不含Y27632的StemFit AK02N培养基进行一次培养基更换。然后,在接种细胞起的6天后汇合(confluent)了80%。
继而,使用TrypLESelect(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司产品名)对hiPSCs的扩大培养物进行细胞分散液处理,进而通过移液操作分散成单一细胞。在基础培养基(“DMEM/F-12,HEPES”,赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司产品名)中以成为下述表6中所示的浓度的方式加入各成分来制备培养基(100μL/孔),在所述培养基中,将经分散的hiPSCs的扩大培养物接种至96孔培养板(产品名“PrimeSurface 96V底板”,住友电木(BakeLite)公司制造),使得成为1×104个/孔的细胞密度,并在孵化器内(37℃,1个大气压,CO2浓度5v/v%)进行7天悬液培养,获得hiPSCs的凝聚块。
[表6]
继而,从孔中除去230μL/孔的培养基。继而,添加150μL/孔的、在基础培养基(“DMEM/F-12,HEPES”,赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司产品名)中以成为下述表7中所示的浓度的方式加入各成分而制备的培养基,并在孵化器内(37℃,1个大气压,CO2浓度5v/v%)一边搅拌一边悬液培养7天。
[表7]
继而,将孔的内容物移至放入有10mL的PBS的福尔肯(Falcon)(注册商标)锥形管50mL(康宁公司制造)。继而,倒转混合5次,去除上清液,并回收细胞凝聚块。将30个所回收的细胞凝聚块、及在基础培养基(“DMEM/F-12,HEPES”,赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司产品名)中以成为下述表8中所示的浓度的方式加入各成分而制备的培养基(30ml/孔)加入至一次性生物反应器(Single-Use Bioreactor)(ABLE公司)中,一边进行搅拌一边进行悬液培养。每隔4天进行培养基的更换。从悬液培养开始起的第12周,回收一次性生物反应器内的细胞凝聚块(大脑皮质类器官),并移至96孔培养板。图7是表示悬液培养12周后的96孔培养板内的细胞凝聚块的状态的光学显微镜图像。图7下段是对孔整体进行拍摄而得的图像,图7上段是放大图像。比例尺为500μm。
[表8]
工业上的可利用性
通过本发明,可提供一种增殖性优异的类器官的制造方法、用于制造所述类器官的培养基、通过所述培养获得的类器官、及使用了类器官的被检物质的评价方法。
Claims (15)
1.一种类器官的制造方法,包括在含有环肽或其药学上能够接受的盐的培养基中对人类干细胞进行培养,所述环肽具有下述式(1)中记载的氨基酸序列,
[化1]
[式(1)中,
X1表示Tyr、W6N、W7N或Nal1,
X2表示Val、Lys、KCOp或KCOm,
X3表示Tyr或4Py,
X4表示Asp、Phe、KCOp、Glu或KCOm,
X5表示Tyr或4Py,
X6表示Val、Glu、KCOp或KCOm,
X7表示任意的氨基酸残基,
R不存在或表示C末端修饰基,
n表示0或1的整数,
PeG为N-(2-苯基乙基)-甘氨酸,
Nal1为β-(1-萘基)-L-丙氨酸,
W6N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)丙酸,
W7N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙酸,
KCOp为N6-(4-(羧甲基)哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸,
KCOm为N6-(甲基((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-)五羟基己基)氨甲酰基)-L-赖氨酸,
4Py为4-吡啶基-L-丙氨酸]。
2.根据权利要求1所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中的X1~X7、R、n的组合为下述表1中所示的组合,
[表1]
表1中,“PEG”表示聚乙二醇链。
3.根据权利要求1或2所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中记载的氨基酸序列中的X1为Nal1,X2为Val,X4为Asp,X5为Tyr。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中所示的氨基酸序列中的Phe与Cys的键结是经由硫醚键的键结。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述式(1)中所示的氨基酸序列的X7包含Gly。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基中包含的所述环肽及其药学上能够接受的盐的合计浓度为0.1nM~10μM。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有Wnt信号增强剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或肝细胞生长因子(HGF)、或者它们的组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有骨形成因子(骨形成蛋白质)抑制剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基还含有Rho激酶(Rho相关卷曲螺旋激酶)信号转导抑制剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的类器官的制造方法,其中,所述培养基实质上不含有间变性淋巴瘤激酶5、间变性淋巴瘤激酶4或间变性淋巴瘤激酶7、或者它们的组合的拮抗剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的类器官的制造方法,其中,在使所述人类干细胞与细胞外基质接触的同时对所述人类干细胞进行培养。
13.一种类器官制造用培养基,含有环肽或其药学上能够接受的盐,所述环肽具有下述式(1)中记载的氨基酸序列,
[化2]
[式(1)中,
X1表示Tyr、W6N、W7N或Nal1,
X2表示Val、Lys、KCOp或KCOm,
X3表示Tyr或4Py,
X4表示Asp、Phe、KCOp、Glu或KCOm,
X5表示Tyr或4Py,
X6表示Val、Glu、KCOp或KCOm,
X7表示任意的氨基酸残基,
R不存在或表示C末端修饰基,
n表示0或1的整数,
PeG为N-(2-苯基乙基)-甘氨酸,
Nal1为β-(1-萘基)-L-丙氨酸,
W6N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)丙酸,
W7N为(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)丙酸,
KCOp为N6-(4-(羧甲基)哌嗪-1-羰基)-L-赖氨酸,
KCOm为N6-(甲基((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-)五羟基己基)氨甲酰基)-L-赖氨酸,
4Py为4-吡啶基-L-丙氨酸]。
14.一种类器官,通过如权利要求1至12中任一项所述的类器官的制造方法而获得。
15.一种被检物质的评价方法,包括:使所述被检物质与如权利要求14所述的类器官接触的步骤;以及对所述被检物质给所述类器官造成的影响进行评价的步骤。
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PB01 | Publication | ||
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