KR20230037058A - 줄기세포용 배양 배지 - Google Patents

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KR20230037058A
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조아네스 카롤루스 클레버즈
토시로 사토
메리트셀 후치 올테가
와우터 리차드 칼타우스
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코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜
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Abstract

줄기세포 집단의 확대 및 분화 및 오르가노이드의 수득을 위한 배양 배지 및 방법. 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 확대된 세포 집단 및 오르가노이드 및 약물 선별, 독성 분석 및 재생 의학에 있어서 그의 용도.

Description

줄기세포용 배양 배지{CULTURE MEDIA FOR STEM CELLS}
본 원에 인용된 모든 문헌들은 내용 전체가 참고로 인용된다.
기술 분야
본 발명은 줄기세포 배양 배지 및 방법, 특히 줄기세포, 예를 들어 인간 상피 줄기세포의 집단을 확대시키기 위한 배양 배지 및 방법의 분야이다.
줄기세포의 집단을 확대시키기 위한 배양 배지 및 방법에 큰 관심이 존재한다. 줄기세포의 집단은 다수의 용도를 갖는다. 예를 들어, 줄기세포 및 그의 분화된 자손을 세포 분석, 약물 선별, 및 독성 분석에 사용할 수 있다. 줄기세포는 또한 세포 기본 요법, 예를 들어 손상된 조직의 치료를 위한 재생 의학에 유망하다. 상기 세포는 또한 이식, 예를 들어 당뇨병 등의 치료를 위한 췌장 베타-세포의 이식을 위한 분화된 세포의 공급원으로서 작용할 수 있다. 더욱 또한, 연구를 목적으로 세포 집단을 제공하고 유지시키기 위해서 효율적인 세포 배양 배지가 중요하다.
오르가노이드, 예를 들어 장 소낭-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드의 형성, 유지 및 확대를 위한 줄기세포의 배양을 위한 배양 배지 및 방법에 또한 관심이 존재한다. 오르가노이드는 줄기세포, 예를 들어 상피 줄기세포를 포함하며, 상기 세포는 그의 미분화된 표현형 및 자기재생 성질을 유지하지만 또한 조직-유사 구조로 성장하는 분화하는 자손을 갖는다. 관련된 또는 동일한 세포 집단과 유사하게, 기원 조직의 기본 생리학을 보다 가깝게 모방하는 소낭-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드를 독성 분석, 또는 약물 또는 식품 보충제의 분석에 사용할 수 있다. 상기는 또한 현재 적합한 조직 배양 또는 동물 모델이 없는 병원체의 배양에 유용할 수 있다. 더욱 또한, 상기와 같은 오르가노이드는 재생 의학, 예를 들어 방사선 치료 후 및/또는 수술 후 장 상피의 보수, 또는 염증성 장 질병을 앓고 있는 환자의 장 상피의 보수에 유용할 수 있다.
줄기세포 및 그의 분화된 자손에 대한 다수의 임상 연구 용도들이 존재함은 분명하다. 모든 이러한 용도를 위해서, 재생가능한 줄기세포 배양 방법이, 적합한 품질을 갖는 적합한 수의 세포를 제공하는데 대단히 중요하다. 예를 들어, 유효한 약물 선별을 위해서, 조건들을 조심스럽게 조절해야 하며, 이는 표현형 및 핵형이 동일한 순수한 세포 집단을 생성시킬 수 있도록 세포의 분화 및 증식을 조절하기 위한 정확한 배양 방법을 필요로 한다. 유사하게, 배양된 세포를 환자에게 직접 제공할 수도 있는 세포 기본 요법의 경우, 상기 세포는 환자에게 제공 시 바람직하지 못한 면역 반응 또는 세포 운명을 피하도록 유전자 및 표현형이 정상적이어야 한다.
다양한 배양 시스템들이, 장 상피 줄기세포를 포함하여 원발성 상피 줄기세포의 배양을 위해서 개시되었지만(문헌[Bjerknes and Cheng, 2006. Methods Enzymol. 419: 337-83]), 지금까지, 인간 상피 줄기세포의 분화 가능성 및 표현형 및 유전체 안정성을 유지하는 장기적인 배양 시스템은 확립되지 않았다.
국제 특허 출원 WO2010/090513은 상피 줄기세포 또는 단리된 조직 단편의 배양 방법을 개시한다. 상기 방법은 Wnt-3a를 배지에 첨가함으로써 인간 결장 및 장 소낭의 배양에 최적화된다. 이는, 인간 장 줄기세포 배양물을 연장된 기간(3 개월까지) 동안 배양하고 최초의 재생 가능한 인간 장 줄기세포 배양 시스템을 제공한 최초였다. 그러나, 배양물 중에서 증식된 줄기세포의 증식률, 생존 시간 및 표현형 및 유전체 안정성을 개선시키는, 개선된 줄기세포 배양 배지 및 방법, 특히 인간 줄기세포 배양 배지 및 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 공지된 배양 배지 및 방법보다 현저한 이점을 제공하는, 줄기세포, 특히 인간 상피 줄기세포, 및 상기 줄기세포를 포함하는 오르가노이드에 대한 개선된 배양 배지 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 관련된 배양 배지 보충제, 조성물 및 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명은 줄기세포 집단의 확대를 위한 배양 배지를 제공하며, 여기에서 상기 배양 배지는 하나 이상의 세린/쓰레오닌 단백질 키나제 표적에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 하나 이상의 억제제를 포함한다. 이는 주당 대략 5배 확대의 확대율로 3 개월 이상 동안 연속적인 성장을 허용하는 효과를 갖는다. 상기 세린/쓰레오닌 단백질 키나제는 바람직하게는 TGF베타 수용체 키나제 1, ALK4, ALK5, ALK7, p38을 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 놀랍게도, 발명자들은 배양 배지 중에 몇몇 세린/쓰레오닌 키나제의 억제제를 포함시키면 줄기세포의 집단을 확대시킴에 있어서 상기 배양 배지의 성능을 현저하게 개선시킴을 발견하였다. 상기 줄기세포의 집단은 정상(건강한) 세포 또는 병든 세포(예를 들어 암 줄기세포)일 수 있다. 구체적으로, p38 및 ALK의 억제제는 시험된 모든 화합물들 중에서 가장 큰 개선을 제공하는 것으로 나타났다. 이는, 이들 특정한 억제제들이 어떻게 작용할 수 있는지를 예견하는 기전이 공지되어 있지 않기 때문에 뜻밖이다. 실제로, 시험하고자 선택되고 유사한 경로로 작용하는 소 분자 억제제 중 다수는 상기 방법에 효과가 없었다. 따라서, 숙련가는 이들 특정한 키나제의 억제제가 배양 배지에 대해 상기와 같은 현저한 개선을 가질 것이라고는 예견할 수 없었다. 더욱 추가의 개선이, 2 개의 억제제, 예를 들어 p38 억제제, 예를 들어 SB202190 및 ALK 억제제, 예를 들어 A83-01을 배양 배지에 함께 첨가할 때 관찰되었다.
이러한 실현에 도달하기 위해서, 발명자들은 몇몇 암, 예를 들어 결장직장암에서 전복되는 것으로 공지된 신호전달 경로를 조사하였다. 이들은 암에서 세포 운명에 영향을 미치는 이들 경로가 배양 조건에서 세포 운명을 결정하는데도 또한 한 역할을 할 수 있다고 가정하였다. 그러나, 이러한 가정은 전적으로 새로운 것임이 강조되어야 하며; 당 시점의 기술 수준에서, 배양 배지에 대한 이러한 추가적인 화합물들 중 어느 하나의 효과는 결코 예견되지 못했으며, 이들 화합물 중 어느 하나가 실제로 유리한 효과를 가질 수도 있다는 특별한 예상도 없었다.
첫 번째 선별 실험에서, 일련의 비타민, 호르몬 및 성장 인자를 표준 줄기세포 배양 배지와 함께 시험하였다. 가스트린 및 니코틴아미드는 처음에, 현저하게 개선된 배양 조건을 생성시키는 것으로서 확인되었다. 이들 인자를 상기 표준 배양 조건에 통합시켜, 두 번째 선별 실험을 수행하였으며, 여기에서 관련된 신호전달 경로와 관련된 소분자 억제제, 예를 들어 ERK, p38, JNK, PTEN, ROCK 및 헤지호그가 시험되었다. 이들 경로는 몇몇 암에서 전복되는 것으로 공지되었기 때문에 선택되었다.
인간 장 줄기세포를, Wnt-3A("W")에 의해 최적화된 앞서 개시된 줄기세포 배양 배지(상피 성장 인자(EGF) 또는 ("E"), 노긴(" N") 및 R-스폰딘("R")을 포함한다, 본 발명에서 "ENR" 배지라 칭한다)(본 발명에서 "WENR" 배지라 칭한다)와 함께 배양하고자 하는 선행의 시도는 7 일 이내에 대부분의 세포를 붕괴시켰으며, 매우 적은 세포가 1 개월 이상 생존하였다. 상기와 같은 시도는 또한 증식 배수, 염색체 불규칙성 및 발아에서부터 낭성 구조로의 형태 변화를 또한 지연시키는 경향이 있었다. "낭성"은 상기 오르가노이드가 대개 구형임을 의미한다. "발아"는 상기 오르가노이드가 기본 구조 밖으로 성장하는 다수의 영역들을 가짐을 의미한다. 발아 구조를 갖는 것이 반드시 항상 유리한 것은 아니지만, 발아 구조는 전형적으로 보다 큰 표면적을 가지며 전형적으로는 상응하는 생체 내 조직을 보다 근접하게 닮는다.
발명자들은 상기 개선된 방법이 7 개월 이상 동안 상기 줄기 세포의 연속적인 성장을 허용함을 입증하였다.
상기 신규의 방법은 또한 확대된 집단에서 상기 세포의 증식 속도를 증가시켰다. 이는 세포를 상업 및 치료 목적으로 증식시키는 경우 분명히 큰 유용성을 갖는다.
상기 신규의 방법은 또한 확대된 집단에서 세포의 질을 증가시켰다. 이는 줄기세포 및 그의 분화된 자손에 대한 임상 연구 용도가 양질의 세포 집단을 제공하는 재생 가능한 줄기세포 배양 방법을 요하기 때문에 대단이 유리하다. 일반적으로, 줄기세포의 시험관 내 확대는 상기 세포의 생체 내 대응물을 가능한한 가깝게 닮은 세포 집단을 제공하는 것이 목적이다. 이러한 성질을 본 발명에서는 세포의 "유전체 및 표현형 안정성"이라 칭한다.
최초로, 발명자들은 유전체 및 표현형 안정성의 상실 없이, 최소한 7 개월 동안, 배양물에서 인간 상피 줄기세포를 확대시키는 것이 가능함을 발견하였다(실시예 1 참조). 본 발명의 개선된 배양 조건 하에서, 인간 장 오르가노이드는 선행의 배양 조건 하에서 나타난 낭성 구조보다는, 발아 오르가노이드 구조를 나타내었다. 3 개월을 초과하는 오르가노이드의 중기 확장은 3 개의 상이한 공여체로부터 취한 20 개 세포 각각에서 46 개의 염색체를 일관되게 드러내었다. 더욱 또한, 미세배열 분석은 배양물 중 상기 줄기세포가 장 줄기세포 유전자를 포함하여 장 소낭 세포에 대한 유사한 분자 특징을 가짐을 밝혀냈다.
발명자들은 또한 본 발명의 배지 및 방법에 의해 생성된 인간 장 오르가노이드가 외부 인자들에 반응하여 생체 내 세포 운명 결정을 모방함을 입증하였다. 예를 들어, 장 줄기세포에서 노치 억제는 생체 내에서 장 상피 증식을 종결시키고 배상세포 과형성을 유도함이 앞서 입증되었었다. 발명자들은 본 발명의 장 오르가노이드가 노치 억제제로 처리 시 증식을 멈추며 대부분의 세포가 3일 이내에 배상세포로 전환됨을 보일 수 있었다.
유사한 이점들이, 다른 상피 조직, 예를 들어 위, 췌장, 간 및 전립선으로부터의 줄기세포 또는 오르가노이드를 확장시키기 위한 배양 배지에 TGF-베타 억제제 및/또는 p38 억제제를 포함시키는 경우 관찰되었다(실시예 참조). 상기 조직들은 정상(건강한) 조직 또는 병든 조직, 예를 들어 암성 조직 또는 낭성 섬유증 표현형을 나타내는 조직일 수 있다.
이러한 결과는 선행의 방법 및 배지에 비해 본 발명의 방법 및 배지에 의해 생성된 줄기세포 및 오르가노이드의 유전체 및 표현형 안정성에 있어서의 극적인 개선을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 성숙한 줄기세포의 집단을 확대 및/또는 분화시키기 위한 배양 배지를 제공하며, 여기에서 상기 배양 배지는
i. R스폰딘 1-4 및/또는 R스폰딘 모방물질 중 어느 하나; 및
ii. TGF-베타 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 하나 이상의 억제제
를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지 및 세포외 기질, 또는 상기 세포외 기질을 세포막 단백질, 예를 들어 인테그린과의 상호작용에 의해 모방하는 3D 기질, 예를 들어 라미닌-함유 세포외 기질, 예를 들어 매트리젤(Matrigel)(상표)(BD Biosciences)을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지 또는 조성물을 함유하는 밀봉된 용기를 제공한다.
본 발명은 또한 줄기세포, 줄기세포의 집단, 조직 단편 또는 오르가노이드를 확대 및/또는 분화시키기 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 오르가노이드를 생성시키기 위해서 단일 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 확대시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 단일 줄기세포 또는 줄기세포의 집단을 본 발명에 따른 배양 배지에서 배양함을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 오르가노이드 또는 세포 집단을 제공한다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는, 중심 관강을 둘러싸는 상피 세포를 포함하는 3차원 오르가노이드인 오르가노이드를 제공하며, 여기에서 임의로 상기 상피 세포는 별개의 분열 도메인 및 분화 도메인 중에 존재한다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는, 단층, 임의로 폴딩된 단층의 영역 및 층상화된 세포의 영역 중에 배열된 상피 세포들을 포함하는 3차원 오르가노이드이고, 바람직하게는 중심 관강을 둘러싸는 상피 세포를 포함하는 3차원 오르가노이드인 오르가노이드를 제공하며, 여기에서 임의로 상기 상피 세포는 별개의 분열 도메인 및 분화 도메인 중에 존재한다.
본 발명은 또한
i) 본 발명의 하나 이상의 오르가노이드 또는 세포 집단; 및
ii) 본 발명의 배양 배지 및/또는 세포외 기질
을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학, 독물학 선별, 개인 맞춤형 의료, 재생 의학 또는 생체 외 세포/기관 모델에 사용하기 위한, 예를 들어 질병 모델로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 오르가노이드, 세포 집단 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에게, 바람직하게는 인간에게 본 발명에 따른 오르가노이드, 세포집단 또는 조성물을 이식하는데 사용하기 위한, 상기 오르가노이드, 세포집단 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지를 사용하여 수득되었거나 또는 수득할 수 있는 줄기세포의 집단 또는 상기 줄기세포를 포함하는 오르가노이드를 제공한다. 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포를 포함하는 오르가노이드를 예를 들어 이식을 위해서 또는 다른 치료 용도에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포를 포함하는 오르가노이드를 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학, 독물학 선별, 개인 맞춤형 의료, 재생 의학 및 생체 외 세포/기관 모델에, 예를 들어 질병 모델에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 억제제를 포함하는 배양 배지 보충제를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지 및/또는 배양 배지 보충제를 포함하는 밀봉된 용기를 제공한다.
본 발명의 배양 배지, 보충제 및 조성물의 구체적인 성분들은 특정한 필요 및 용도에 따라 변화될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명 방법의 정확한 단계들을 특정한 필요 및 용도에 따라 변화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 배양 배지, 보충제, 방법, 조성물 및 용도를 또한 통상적인 실험들에 의해 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, 배양 배지, 보충제 또는 조성물이 목적하는 수준의 줄기세포 확대를 제공하지 못하는 경우, 상기 배양 배지 또는 보충제 중의 각 성분의 양, 시딩 밀도, 배양 조건, 배양 기간 등과 같은 변수를 추가의 실험에서 변경시킬 수 있다. 본 발명에 개시된 각 성분들의 양을 통상적인 최적화에 의해 다른 성분들과 독립적으로 최적화하거나 또는 하나 이상의 성분들을 첨가하거나 제거할 수 있다. 배양 배지를 공지된 배양 배지 또는 방법과 함께 또는 상기 방법 대신에 시험함으로써 줄기세포의 확대를 지지하는 능력에 대해 시험할 수 있다.
본 발명의 배양 배지, 보충제, 방법, 조성물 및 용도를 하기에 보다 상세히 개시한다. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 통상적인 세포 배양 기법, 분자 생물학 및 미생물학을 사용할 것이며 이들은 당해 분야의 숙련가들의 기술 내에 있다.
포유동물 세포 배양 배지 및 방법에 대한 지침을 제공하는 다양한 교과서들, 예를 들어 줄기세포의 배양을 위한 배양 배지 및 방법 전용의 교과서들을 입수할 수 있다. 상기와 같은 교과서는 하기를 포함한다: Basic Cell Culture Protocols' by J. Pollard and J. M. Walker (1997), Mammalian Cell Culture: Essential Techniques’ by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. I. Freshney (2005), Basic Cell Culture Protocols by C. Helgason and C. L. Miller (2005), Stem Cells: From Bench to Bedside by A. Bongso (2005), Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide by J. F. Loring, R. L. Wesselschmidt and P. H. Schwartz (2007).
본 발명에 사용하기 위한 줄기세포 및 세포 배양 시약 및 장치를, 예를 들어 셀라티스(Cellartis) AB(Goteborg, Sweden), 비트로라이프(VitroLife) AB (Kungsbacka, Sweden), GIBCO(등록상표)(Invitrogen), 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)(Billerica, Massachusetts), Sigma(등록상표)(St. Louis, Missouri) 및 바이오몰 인터내셔널(Biomol International) L.P.(Exeter, UK)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
본 발명은 공지된 배양 배지 및 방법보다 현저한 이점을 제공하는, 줄기세포, 특히 인간 상피 줄기세포, 및 상기 줄기세포를 포함하는 오르가노이드에 대한 개선된 배양 배지 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 관련된 배양 배지 보충제, 조성물 및 용도를 제공한다.
도 1 마우스 결장 배양물
a. 좌측: 액신2 발현이 Wnt 신호전달 경로의 조절 하에 있다. EGF, 노긴 및 R-스폰딘(ENR)과 함께 3일 동안 배양된 액신 2-LacZ 리포터 마우스의 결장 소낭 오르가노이드. LacZ 염색의 부재는 활성 Wnt 신호가 ENR 성장 조건 하에서 결장 오르가노이드 중에 존재하지 않음을 가리킨다. 삽입물은 액신2-LacZ 리포터 마우스로부터 새로 단리된 결장 소낭 중 LacZ 발현(어둡게 염색)에 의해 가시화된 활성 Wnt 신호전달을 나타낸다. 우측: 10일간 ENR + Wnt3A(WENR)과 함께 배양된 액신2-LacZ 마우스 유래된 결장 소낭. 어두운 염색은 상기 오르가노이드 중의 LacZ 발현을 가리킨다.
b. 좌측: 3일간 ENR과 함께 배양된 Lgr5-GFP-ires-CreER. GFP 형광의 부재는 ENR 성장 조건 하에서 결장 오르가노이드 중의 Lgr5 발현의 상실을 가리킨다. 삽입물은 Lgr5-GFP-ires-CreER 마우스로부터 새로 단리된 결장 소낭 중 Lgr5-GFP 발현을 나타낸다. 우측: 10일간 WENR과 함께 배양된 Lgr5-GFP-ires-CreER 결장 소낭이 Lgr5 줄기세포의 존재를 입증한다.
c. 배양 효율을 3 개의 상이한 조건 하에서 측정한다: ENR, WENR 완전 소낭, 및 순한 효소 절단 후의 WENR 소낭(WENR 절단된). 결장 소낭을 근위 결장(흑색 컬럼) 또는 원위 결장(백색 컬럼)으로부터 단리하였다. *p<0.05.
d,e: 상기 WENR 배양 배지로부터 Wnt3A 제거 후 4일째에 오르가노이드 분화가 생성된다. d. 장내분비 세포 중 크로모그라닌(ChA); 배상 세포 중 뮤신2(muc2) 및 DAPI에 의한 대비염색을 볼 수 있다. e. 성숙한 장세포가 알칼리성 포스파타제 염색에 의해 가시화된다.
f. 성숙한 상피 세포 마커(Vil1(Villin1), Alpi(알칼리성 포스파타제), Chga(크로모그라닌 A), Muc2(뮤신2))의 상대적인 mRNA 발현을 나타낸다. WENR 배양된 결장 소낭 오르가노이드를 WENR(빗금친 패턴) 또는 ENR(흑색) 조건에서 4일간 배양한다. 새로 단리된 결장 소낭(백색)을 대조용으로 사용한다. a,b,d,e에서 축척 막대: 50 ㎛. 오차 막대는 s.e.m. n=3을 가리킨다.
도 2 인간 결장 배양물
a. 인간 결장 소낭 오르가노이드에 대한 니코틴아미드의 영향. 인간 결장 소낭 오르가노이드의 대부분은 WENR+가스트린(WENRg) 조건(좌측 패널)에서 수일 내에 죽는다. 니코틴아미드의 첨가(중간 패널: WENRg+nic)는 인간 결장 오르가노이드의 배양 효율 및 수명을 개선시킨다. *p<0.001. nic: 니코틴아미드.
b. 인간 결장 소낭 오르가노이드에 대한 Alk4/5/7(A83-01) 및 MAP 키나제 p38(SB202190)의 소분자 억제제의 효과. 좌측 패널: WENRg+니코틴아미드 함유 배지에서 배양된 인간 결장 오르가노이드는 배양 후 3 내지 4 주째에 낭성 구조를 형성한다. 중간 패널: 인간 결장 오르가노이드는 인간 장 줄기세포 배양물("HISC") 조건(WENRg+니코틴아미드+A83-01+SB202190) 하에서 그의 특징적인 발아 구조를 유지한다. 우측 패널: A83-01 및 SB202190은 인간 결장 오르가노이드의 계대수를 상승적으로 증가시킨다. *p<0.001. N.S. = 통계학적으로 의미 없음. 오차 막대는 s.e.m. n=5를 가리킨다.
c. EdU의 결합에 의해 가시화된 증식 세포는 발아 구조로 한정된다. DAPI를 대비염색으로서 사용한다.
d. 3 개월된 인간 결장 소낭 오르가노이드로부터의 핵형에 대한 전형적인 사진. 축척: 100 ㎛.
e. 배양된 인간 장 오르가노이드의 발현 프로파일의 열-지도. 상기 열-지도는 인간 소장 소낭과 인간 소장 융모의 비교이다. 소낭에서 보다 고도로 발현된 유전자는 짙은 회색(열지도의 상부 절반)이고, 융모에서 보다 고도로 발현된 유전자는 밝은 회색(열지도의 하부 절반)이다. 시험관 내에서 배양된 오르가노이드는 새로 단리된 소장 소낭과 유사한 발현 프로파일을 나타내고 공지된 줄기세포 마커를 발현한다(레인 1: 인간 소장 오르가노이드 #1, 레인 2: 인간 소장 오르가노이드 #2, 레인 3: 인간 결장 오르가노이드, 레인 4: 새로 단리된 인간 소장 소낭. 상기 4 개의 샘플을 인간 소장 융모와 비교한다).
도 3 인간 장 오르가노이드 세포 유형 조성물
(a-c) 인간 오르가노이드는 니코틴아미드 및 SB202190의 회수 후에 상기 장의 상이한 세포 유형들로 분화한다. 상기 상이한 세포 유형의 마커를 분화의 입증에 사용하였다. (a) 상부 패널: 성숙한 장세포를 염색하는 알칼리성 포스파타제, 중간 패널: 배상세포를 염색하는 PAS, 기부 패널: 장내분비세포를 염색하는 시냅토피신. (b) 각각의 경우에, 밝은 영역은 염색을 가리킨다. 중간 패널 중 뮤신2(Muc2) 염색은 배상 세포를 나타내고 좌측 패널 중 크로모그라닌 A(ChgA)는 장내분비 세포를 나타낸다(화살표 및 삽입물 참조). DAPI를 대비염색으로서 사용한다(우측 패널). (c) 좌측 패널에서 라이소자임(Lysz)은 염색되어 파네쓰 세포를 나타낸다. DAPI는 대비염색으로서 사용된다(우측 패널).
(d-f) 배상 세포 분화(Muc2)는 오르가노이드의 SB202190 처리에 의해 차단되는 반면(d), 노치 억제제 DBZ는 인간 오르가노이드에서 배상세포 수를 증가시킨다(f). 증식하는 세포는 EdU 결합에 의해 나타나고(중간 패널) SB202190 처리된 오르가노이드에서 증가되거나(d) 또는 DBZ 처리된 오르가노이드에서 감소된다(f). 오르가노이드를 5일 동안 하기의 조건 하에서 배양한다: a) 상부: ENRg+A83-01+SB202190+니코틴아미드, a) 중간 및 기부, b), c) WENRg+A83-01, d)WENRg+A83-01+SB202190, e) WENRg+A83-01, f) WENRg+A83-01+DBZ. 축척 막대: 20 ㎛(a), 50 ㎛(b-f). a,b,d-f: 인간 결장 소낭 오르가노이드, c: 인간 소장 오르가노이드.
도 4 선(암)종 배양물
a. Lgr5-GFP-ires-CreER/APCfl/fl 소낭을 10일간 EGF(E)와 함께 배양하거나(상부) 또는 EGF+노긴(EN)과 함께 배양한다(기부). b. Lgr5 및 액신2의 상대적인 mRNA 발현. 새로 단리된 선종 세포(백색)를 EGF(빗금) 또는 EGF+노긴(흑색)과 함께 배양하였다. c. 분류된 Lgr5-GFPhi, Lgr5-GFPlo, Lgr5-GFP-ve 세포로부터 오르가노이드의 배양 효율. *p<0.01. 일방 ANOVA. 오차 막대는 s.e.m. n=3을 가리킨다.
d. 인간 결장 선암종 세포의 시간 과정 배양.
도 5 바렛 식도의 배양 및 노치 억제제에 의한 처리
a. 7일간 HISC 조건으로 배양된 바렛 식도(BE)로부터 단리된 상피는 낭성 구조를 형성한다. b. FGF10의 첨가는 BE 오르가노이드에 대한 계대수를 현저하게 증가시킨다. 오차 막대는 s.e.m. n=3을 가리킨다. c. BE 오르가노이드의 전형적인 시간 과정. d. BE 오르가노이드로부터의 파라핀 섹션. 니코틴아미드 및 SB202190을 4일간 상기 배지에 첨가된 노치 억제제 DBA의 존재(우측) 또는 부재(좌측) 하에서 회수한다. 증식하는 세포(Ki67 염색)가 사라지고 PAS+ 배상세포는 DBZ 처리와 함께 증가한다.
도 6 액신 2 mRNA 발현이 Wnt-3A의 존재 하에 마우스 결장 오르가노이드에서 회복된다
단리된 결장 소낭을 ENR(빗금) 또는 WENR(흑색)과 함께 3일 또는 7일 배양 후 액신 2 mRNA 발현에 대해 분석한다. 새로 단리된 결장 소낭을 대조군으로서 사용하였다. 오차 막대는 s.e.m. n=3을 가리킨다.
도 7 성숙한 상피 세포 마커의 상대적인 mRNA 발현
새로 단리된 소장 소낭(백색)을 HISC 조건에서 14일간 배양한 다음 4일간 지시된 배양 조건으로 배양한다. ALPI(알칼리성 포스파타제), VIL1(Villin 1), LYZ(라이소자임), CHGB (크로모그라닌 B) 및 MUC2(뮤신2)의 mRNA 발현을 분석하였다. 배양 조건: HISC(흑색), ENRg+A83-01+SB202190+니코틴아미드, WENRg+A83-01, ENRg+A83-01, ENRg. 새로 단리된 소장 소낭을 대조군으로서 사용하였다(ALPI, VIL1 및 LYZ의 경우 1.0으로, CHGB 및 MUC2의 경우 5.0으로 설정). 오차 막대는 s.e.m. n=3을 가리킨다.
도 8 분류된 Lgr5-GFP-세포는 Lgr5-GFP + 오르가노이드를 형성한다
단일의 분류된 Lgr5-GFP-APCf1/f1 선종 세포를 7일간 EGF+노긴(EN) 또는 EGF(E)와 함께 배양한다. Lgr5-GFP-세포로부터 유래된 선종 오르가노이드는 EN 조건 하에서 Lgr5-GFP 발현을 회복하였으나 E 조건 하에서는 아니다(a,c: 밝은, b,d: GFP 자가형광).
도 9 선종/결장암 오르가노이드의 조직화학 분석
마우스 소장 선종 오르가노이드(좌측 패널) 및 인간 결장암 오르가노이드(우측 패널)를 지시된 조직화학(HE, PAS 및 알칼리성 포스파타제) 또는 면역조직화학(크로모그라닌 A, Ki67 및 카스파제3) 염색으로 분석하였다.
도 10 BE 오르가노이드 중의 파네쓰 세포
라이소자임 + 파네쓰 세포를 분화된 BE 오르가노이드에서 관찰하였다.
도 11 오르가노이드 배양물에 사용되는 시약 목록
도 12 인간 장 오르가노이드 배양물에 사용되는 시약 목록
도 13 인간 장 오르가노이드 배양물의 최적화에 사용되는 소 분자 억제제의 목록
도 14 25 개의 가장 상향- 및 하향-조절된 유전자의 목록
인간 소장 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드로부터의 mRNA를 새로 단리된 소장 융모로부터의 것과 미세배열에 의해 비교한다. 25 개의 가장 상향조절된 및 하향조절된 유전자를 도시한다. 빗금은 새로 단리된 인간 소장 소낭 대 융모에서 상위 70 개의 가장 상향조절된 및 하향조절된 유전자로 존재하는 유전자들을 강조한다.
도 15. 각 오르가노이드 배양 조건의 증식, 분화 및 세포사멸 상태에 대한 요약
도 16: 마우스 췌장 오르가노이드의 미세배열 비교
A - 성숙한 췌장, 성숙한 간 및 신생 간과 췌장 오르가노이드(실시예 2에 개시된 조건에서 배양된)로부터의 RNA를 비교하는 미세배열 클러스터링 분석. 좌측에서부터 우측으로: i) 췌장 오르가노이드; ii) 성숙한 췌장; iii) 성숙한 간(샘플 1[S1] 및 샘플 2[2]); iv) 성숙한 간 S2; 및 v) 신생 간.
B - 선택된 도관 마커, Ngn3 발현에 필요한 전사 인자 및 확대 배지 중의 성숙한 간, 성숙한 췌장, 췌장 오르가노이드 및 간 오르가노이드 중의 내분비 마커를 비교하는, 상기 미세배열 분석으로부터의 원 신호 데이터.
도 17: 췌장 오르가노이드의 확대에 대한 노긴의 효과
A - EGFRAN에서 배양된 오르가노이드가 노긴과 결코 배양되지 않도록 EGFRA에서 배양된(흑색), 따라서 항상 노긴과 함께 배양된(백색) 췌장 오르가노이드의 유전자 발현 분석을 도시하는 막대 차트. 유전자 발현에 대한, EGFRA에서 2일간 췌장 오르가노이드를 배양하고 이어서 노긴을 회수하고 추가로 2 또는 4일간 배양하는 효과(밝은 회색) 및 EGFRA에서 2일간 췌장 오르가노이드를 배양하고 이어서 노긴을 첨가하고 추가로 2 내지 4일간 배양하는 효과(짙은 회색)를 또한 도시한다. mRNA 수준(임의의 단위)을 Y 축상에 나타낸다. 하기 초기 내분비 마커들의 mRNA를 주 도면에서 분석한다: Sox9, Hnf1b, Hnf6, Hnf1a, Nkx2.2, Nkx6.1 및 Pdx1. 삽입된 부분에서, 분석된 하기 도관 마커의 mRNA: 케라틴 7(Krt7) 및 케라틴 19(Krt19).
B - 확대 배양 배지 중 췌장 오르가노이드에서 Lgr5의 발현에 대한 노긴의 효과를 도시하는 막대 차트. EGFRAN에서 배양된 오르가노이드가 노긴과 결코 배양되지 않도록 EGFRA에서 배양된(흑색), 및 따라서 항상 노긴과 함께 배양된(백색) 췌장 오르가노이드에 대한 데이터를 제공한다. Lgr5 유전자 발현에 대한, EGFRAN에서 췌장 오르가노이드를 배양하고 이어서 노긴을 회수하고 추가로 6일간 배양하는 효과(밝은 회색) 및 EGFRA에서 췌장 오르가노이드를 배양하고 이어서 노긴을 첨가하고 추가로 6일간 배양하는 효과(짙은 회색)를 또한 도시한다. mRNA 수준(임의의 단위)을 Y 축상에 나타낸다.
도 18: 인간 인슐린 생산 세포가 생체 외 확대된, 생체 내 이식된 선조 세포로부터 발생한다
A - P0: (제1일); P0: (제5일); P1: (제12일); 및 P3: (제24일)에서 선조 세포(췌장 줄기세포)로부터 인간 췌장 조직의 성장, 이때 "P"는 계대의 수를 지칭한다. 도 18B 및 C는 쥐 신장주변 피막 아래에 인간 췌장 오르가노이드의 이식을 도시한다.
B - 상기 췌장 오르가노이드 세포를 상기 수용 마우스에 이식 후 3 시간째: 상부 사진에서 DAPI(핵 마커) 염색은 모든 세포를 가리키고; 하부 사진에서 K19(도관 마커) 염색은 모든 이식된 세포를 나타내며 하부 사진에서 인슐린(베타 세포 마커)은 인슐린 생산 세포를 가리킨다.
C - 상기 췌장 오르가노이드 세포를 상기 수용 마우스에 이식 후 1 개월째: 상부 사진(청색으로)에서 DAPI 염색은 모든 세포를 가리키고; 중간 사진(녹색으로)에서 K19(도관 마커) 발현은 모든 이식된 세포를 나타내며 하부 사진(적색으로)에서 인슐린(베타 세포 마커)은 인슐린 생산 세포를 가리킨다. 상기 인슐린-생산 세포의 선택에 동그라미를 치지만 모든 분명히 염색된 세포는 인슐린 양성인 것으로 생각된다.
도 19: 췌장 오르가노이드 유전자 발현
본 표는 간 오르가노이드와 비교 시 가장 상향조절된 유전자들의 췌장 유전자 발현을 나타낸다.
도 20: 마우스 간 오르가노이드 배양물은 장기간 배양 후 안정한 핵형을 나타낸다.
A - 24 개월의 기간 동안 FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된 EGF(E) 및 R-스폰딘 1(R) 중에서 유지되거나(좌측 도면, ER), 노긴(N) 및 Wnt3 처리된 배지(W)가 보충된 동일한 조합중에서 유지된(우측 도면, ENRW) 간 오르가노이드의 DIC 상.
B - 배양물 중 8 개월 후 마우스 간 오르가노이드의 핵형 분석. 정상 염색체 카운트(n=40, 좌측 패널 도면), 및 전형적인 간세포 특징인 배수체가 발견되었다(n=80, 우측 패널 도면).
도 21: 보충 인자 FGF10, HGF 및 니코틴아미드; 간 오르가노이드 성장 및 분화에 대한 효과.
A - 간모세포에서 성숙한 간세포로의 간 발생 3 단계 동안 차별적으로 발현된 유전자들을 나타내는 다이어그램.
B - 사용된 프로토콜을 나타내는 도해. 배양물을 실험 전 2일째에 확대 배지(ERFHNic: EGF(E) 및 R-스폰딘 1(R), FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충됨; ERFHNic는 도 8B에서 'ER'로서 나타냄)에 시딩하였다. 2일 후에, 배양 배지를 다음에 서술된 농도에서 FGF10(F) 및 HGF(H) 또는 니코틴아미드(Nic) 및 이들의 조합 중에서 선택된 추가적인 보충제와 함께 또는 상기 보충제 없이 EGF(E) 단독 또는 R-스폰딘 1(ER)이 보충된 EGF로 교환하였다. 5일 후에 배양물을 분할하고 각 조건에 대해 1:4 비로 재도말하였다. 이러한 조건 하에서, 배양물을 분할하고 총 10주의 기간 동안 매 7일마다 재도말하였다.
C - 시험된 각 배양 조건에서 처음 분할 후 5일째. 결과는 FGF10 또는 HGF 또는 니코틴아미드 또는 이들의 조합과 함께 EGF 및 R스폰딘1이 1 회 이상의 계대를 성취하는데 필수적임을 보인다.
D - 장기간 배양 후, FNic가 보충된 ER 또는 FHNic가 보충된 ER의 조합은 모두 높은 계대수를 생성시킨다. 10 회 계대 후에, 증식률은 상기 3 개 보충인자들을 포함하는 배양 조건; ERFHNic의 경우 더 양호하다.
E - 몇몇 인자의 회수 후 5일째에(출발점은 ERFHNic였다) 상이한 간세포 마커(CYP3A11, Alb, FAH) 및 담혈관세포 마커(K19)의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석. 오직 조건 EF만이 시험된 모든 간세포 마커의 발현을 보였음을 주목한다. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현에 대해 표준화하였다.
도 22: 3 개의 상이한 간 배양 조건으로부터의 세포 및 성숙한 간 조직에서 상이한 간세포 및 담혈관세포 특이성 전사 인자의 정량분석을 나타내는 표.
노치 및 TGF-베타 신호전달 경로의 핵심 성분들의 발현을 또한 나타낸다. E=EFHNic, ER=ERFHNic, ENRW=ENRWFHNic.
도 23: 분화 프로토콜
A - 사용된 프로토콜을 나타내는 도해. 배양물을 실험 전 2일째에 확대 배지(ERFHNic: EGF(E) 및 R-스폰딘 1(R), FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충됨; ERFHNic는 도 10B에서 'ER'로서 나타냄)에 시딩하였다. 2일 후에, 배양 배지를 나타낸 농도에서 A8301(A), 및 DAPT(D), 및 FGF10(F) 및 HGF(H) 및 니코틴아미드(Nic) 및 R-스폰딘1(R) 및 Wnt3A 및 노긴(N) 및 이들의 조합 중 어느 하나가 보충된 EGF(E)로 교환하였다. RNA를 다수의 시점에서 단리하였다. 마우스 간 조직을 양성 대조군(+)으로서 취한 반면 물을 음성 대조군(-)으로서 취하였다.
B - 분화 조건 후 7일째에 간세포 마커 CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT 및 Gck의 발현을 도시하는 RT-PCR 분석. 오직 조건 EADF만이 시험된 모든 간세포 마커의 발현을 나타내었다. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현에 대해 표준화하였다.
C - 분화 조건 후 시간 과정 발현 분석. 분화 후 2, 5 및 8일째에, 간세포 마커 CYP3A11, Alb, FAH, 및 담혈관세포 마커 K19의 발현을 RTPCR에 의해 분석하였다. 간 마커 CYP3A11 및 FAH의 발현은 5일째에 시작하여 8일 후에 피크임에 주목한다. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현에 대해 표준화하였다. A; A8301, D; DAPT, F; FGF10, H; HGF, De; 덱사메타손
D - 상이한 농도의 분화 화합물 A 및 D 후 7일째에 간세포 마커 CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT, G6P 및 Gck의 발현을 나타내는 적정 실험. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현에 대해 표준화하였다.
E - 간 마커 K19, 알부민 및 간세포 표면 마커에 대한 면역형광 염색
F - Albcreert2LacZ 마우스 간-유래된 오르가노이드에 대한 Xgal 염색. 알부민 양성 세포(화살표)가 타목시펜 유도된 Albcreert2LacZ 유래된 배양물 중에서 EADF 분화 후에 검출되었다.
도 24: 프로스타글란딘 신호전달 경로(알러지성 질병을 치료하기 위한 접근법으로서 프로스타글란딘 D2 수용체 DP1 및 CRTH2의 길항작용. 문헌[Roy Pettipher, Trevor T. Hansel & Richard Armer Nature Reviews Drug Discovery 6, 313-325 (April 2007)]).
도 25: 간 오르가노이드 (A) hEGF (100ng/㎖, Invitrogen); 인간 노긴(hnoggin)(25ng/㎖, peprotech); 가스트린(10nM, sigma); hFGF10(peprotech); 니코틴아미드(10mM, sigma); A8301(500nM, Tocris); hHGF(50ng/㎖, peprotech); Rspo 처리된 배지(10%)를 포함하는 기본 배지; (B) 기본 배지 + PGE2(50nM); (C) 기본 배지 + CHIR99021(3uM); (D) 기본 배지 + CHIR99021(3uM) + PGE2(50 nM)에서 배양됨.
도 26: 간 오르가노이드 아라키돈산의 존재 및 부재 하의 기본 배지(도 25에 개시된 바와 같은)에서 배양됨.
도 27: 분화 조건 하에서 마우스 간 오르가노이드의 유전자 발현 프로파일은 성숙한 및 신생 간 프로파일을 닮는다
A - 유사하게 발현된(a) 또는 분화 조건 EADF와 성숙한 또는 신생 간 사이에서 유사하게 정지된(b) 유전자를 도시하는 유전자 클러스터.
B - 간 오르가노이드와 성숙한 또는 신생 간 사이에서 차별적으로 발현된 유전자(a) 및 EADF와 신생 간 사이에서 유사하게 발현된 유전자(b)를 도시하는 유전자 클러스터.
C - 선택된 도관 마커, Ngn3 발현에 필요한 전사 인자 및 확대 배지 중의 성숙한 간, 성숙한 췌장, 췌장 오르가노이드 및 간 오르가노이드 중의 내분비 마커를 비교하는, 상기 미세배열 분석으로부터의 원 신호 데이터.
도 28: 마우스 간 특징 유전자
a) 마우스 간 줄기세포에서 발현된 마커; b) 마우스 간 줄기세포에서 발현되지 않은 마커; c) 확대 배지에서 마우스 간 오르가노이드에 대한 마우스 간 줄기세포 특징으로 발현된 간세포 및 담혈관세포 마커; d) 확대 배지에서 마우스 간 오르가노이드에 대한 마우스 간 줄기세포 특징으로 발현된 간세포 및 담혈관세포 마커; e) 마우스 간 오르가노이드에서 발현된 재프로그램화 유전자; f) 마우스 간 오르가노이드에서 발현되지 않은 재프로그램화 유전자. 상기 결과는 기준 RNA로서 범 마우스 기준 RNA(Strategene, Catalog #740100)를 사용하는 간 미세배열을 사용하여 획득되었다. 검출된 절대 숫자가 100 미만인 경우, 상기 유전자는 검출되지 않은 것으로 간주되었다.
도 29: 인간 간 특징 유전자
인간 오르가노이드의 간 미세배열의 결과를 나타내는 표. 좌측에서 우측으로, a) 확대 배지 EM1, b) 확대 배지 EM2, c) 분화 배지, d) 성숙한 간에 대한 결과를 나타낸다.
좌측 4 개 컬럼의 숫자(log2)는 샘플과 모든 배열에 사용되는 기준(상업적인) RNA 샘플 간의 비교 결과이다. 상기 기준 샘플 중에 존재하는 RNA에 대한 각 샘플 중의 mRNA의 상대적인 발현을 나타낸다. 사용된 기준 RNA는 범 인간 기준 RNA(Strategene, Catalog #740000)이었다. 따라서, 이들 컬럼에서 음의 숫자는 실제 발현 수준과 관련이 없으며 단지 상기 기준 샘플에서 상기 RNA가 적게 존재함을 의미한다. 우측 4 개 컬럼은 절대 숫자이다. 상기 숫자가 100 이하인 경우, 이는 검출되지 않은 것으로 간주된다.
도 30: 간 오르가노이드의 형태.
(A) 상부 패널: 상이한 도메인들을 나타내는 마우스 간의 파라핀 섹션(PT = 문맥 삼조, CV = 중심 정맥). 하부 패널: 상이한 도메인 b(단일층 상피) 및 h(층상화된 상피)를 나타내는 간 오르가노이드의 파라핀 섹션. (B) 우측 패널: 간 오르가노이드에서 에카데린 염색. 2 개의 상이한 도메인을 확인할 수 있다. 간의 담관 구조를 닮은 단일의 층상화된 상피에 의해 형성된 도메인 b. 상기 담관 도메인은 판사이토케라틴(PCK)에 대한 양성 염색을 나타내는 고도로 양극화된 세포에 의해 형성된다(하부 패널). 좌측 패널은 간 오르가노이드 내의 제 2 도메인의 존재를 나타낸다. 상기 h 도메인은 양극화되지 않은 세포를 갖는 층상화된 상피에 의해 형성된다. 상기 세포는 중심 관강 주변에서 조직화되고 간세포 마커 Alb를 발현한다. 배율 10x.
도 31: 췌장 오르가노이드의 H&E 염색
마우스 췌장 오르가노이드를 8 회 계대배양 동안(약 10 주) 확대 조건 EGFNRA83-01[(EGF(50ng/㎖), 가스트린(50nM), 노긴(10%), R스폰딘(5%), FGF10 (100ng/㎖) 및 A8301 (50nM)] 중에서 배양하였다. 상기 오르가노이드를 제조자의 설명에 따라 BD 세포 회수 용액을 사용하여 매트리젤로부터 제거하고 실온에서 1 시간 동안 4% 파라폼알데하이드로 고정시켰다. 이어서, 상기 오르가노이드를 저온 PBS로 3 회 세척하고, 증가된 농도의 알콜로 탈수시키고 파라핀에 매몰시켰다. 3 um 파라핀 섹션을 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 췌장 오르가노이드의 조직학을 분석하였다.
상기 오르가노이드의 모양 및 구조에 있어서 강한 변동성이 관찰되었다. 상기 오르가노이드 중 일부는 양극화된 상피 세포의 단층에 의해 형성된 낭성 구조이다. 다른 오르가노이드는 상피 세포의 동일한 단층 및 세포의 크기가 보다 작고 둥근 모양을 갖는 일부 층상화된 영역을 보인다. 일부의 오르가노이드에서 상기 낭성 구조의 내부 공간을 차지하는 함입부가 관찰되었다.
상기 염색은 일부의 오르가노이드가 대개 상피 세포의 단층을 포함하는 반면(좌측 기부), 다른 오르가노이드들은 층상화된 영역 및/또는 모의 층상화된 영역 및/또는 폴딩된 단층을 가짐(우측 기부)을 보인다. 대부분의 췌장 오르가노이드는 층상화된 세포 및 단층(때때로 폴딩됨)의 영역들을 포함한다.
도 32. 포스콜린-유도된 쥐 소장 오르가노이드 팽창의 정량분석.
(a) 포스콜린 또는 DMSO에 의해 자극된 오르가노이드의 광 현미경검사 분석. 자극 후 지시된 시점들에 대한 전형적인 예를 나타낸다. 적색 선은 내부 오르가노이드 관강을 가리킨다. (b) 상 분석 소프트웨어에 의한 물체인식(녹색 선)으로 칼세인-그린-표지된 오르가노이드의 형광 공초점 상. (c) 포스콜린-자극된 칼세인-그린-표지된 오르가노이드의 전형적인 예. 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 및 형광을 살아있는 세포 공초점 현미경검사를 사용하여 영상화하였다. t=0에 대한 표면적은 상부 좌측 구석에 나타낸다. (d) 단일 웰 중 11 개 개별 오르가노이드의 t=0(표준화된 면적)에 대한 상대적인 표면적. 평균을 흑색으로 나타낸다(평균±s.e.m.). (e) 포스콜린에 의한 표면적의 용량-의존적인 증가(5μM(n=4 분석된 오르가노이드의 수), 5x10-2 μM (n=11), 5x10-4 μM(n=10), DMSO n=9)). 축척 막대(a-c) 30 ㎛. 모든 결과를 3 개 이상의 독립적인 실험에 대해 나타낸다.
도 33. 쥐 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창은 CFTR 의존적이다.
(a) DMSO(n=8), CFTR-inh172(n=7), GlyH-101(n=9) 또는 CFTR-inh172 및 GlyH-101(n=11)과 함께 예비 배양된 포스콜린-자극된 칼세인-그린-표지된 오르가노이드의 표준화된 팽창 곡선(평균±s.e.m.). (b) 포스콜린에 반응하여 칼세인-그린 표지된 야생형 또는 CFTR-결핍 오르가노이드의 전형적인 공초점 현미경 상. 축척 막대 50 ㎛. (c) 야생형(n=6) 또는 CFTR-결핍(n=11) 오르가노이드에서 포스콜린-유도된 팽창의 정량분석(평균±s.e.m.). (d,e) 야생형(n=8) 및 CFTR-F508del(n=12) 오르가노이드를 제외하고, b,c와 유사하다. 축적 막대 30 ㎛. (f) t=0에서 (c)에서 정량화된 야생형 또는 CFTR-결핍 오르가노이드의 절대 크기(평균±s.e.m.). (g) 37 ℃에서 CFTR 억제(n=20) 또는 억제 없이(n=15) 배양되거나 또는 27 ℃에서 24 시간 동안 CFTR 억제(n=31) 또는 억제 없이(n=27) 배양된 칼세인-그린 표지된 CFTR-F508del 오르가노이드의 포스콜린-자극된 팽창(평균±s.e.m.). (h) DMSO와 함께 24 시간 동안 CFTR 억제(n=15) 또는 억제 없이(n=18) 예비 배양되거나 또는 CFTR 교정 화합물 VRT-325와 함께 CFTR 억제(n=14) 또는 억제 없이(n=26) 예비 배양된 칼세인-그린 표지된 CFTR-F508del 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창(평균±s.e.m.). (i) DMSO (n=16), VRT-325 (n=18), Corr-4a (n=20) 또는 2 개의 교정제(n=20) 모두에 의해 24 시간 동안 예비-처리된 CFTR-F508del 오르가노이드의 표준화된 포스콜린-유도된 팽창(평균±s.e.m.). 모든 결과는 3 개 이상의 독립적인 실험들에 대해 전형적이다.
도 34. 인간 건강한 대조군 또는 낭성 섬유증 오르가노이드에서 포스콜린-유도된 팽창
(a) DMSO, CFTRinh-172, GlyH-101 또는 CFTRinh-172 및 GlyH-101 (n=5, n=7, n=8, n=10)과 함께 예비 배양된 포스콜린-유도된 오르가노이드 팽창의 정량분석(평균±s.e.m.). (b) 4 개의 개별적인 건강한 대조군(1-4: n=30, n=18, n=13, n=42) 및 1 개의 CF CFTR-F508del 동종접합 환자(n=30)로부터 유래된 오르가노이드의 포스콜린-자극된 팽창(평균±s.e.m.). (c) 37 ℃에서 또는 27 ℃에서 CFTR 억제와 함께 또는 억제 없이(모든 조건에서 n=10) 배양된 포스콜린-유도된 칼세인-그린 표지된 CFTR-F508del 오르가노이드의 표준화된 팽창(평균±s.e.m.). (d) CFTR의 약물학적 조작 시 포스콜린에 반응한 칼세인-그린 표지된 HC-유래된 또는 CF 환자-유래된 오르가노이드의 전형적인 공초점 현미경 상. 축척 막대 60 ㎛. (e) 24 시간 동안 DMSO, VRT-325, Corr-4a, 또는 2 개의 교정제 모두(모든 조건에서 n=10)에 의해 예비 처리된 CFTR-F508del 오르가노이드의 표준화된 포스콜린-유도된 팽창(평균±s.e.m.). (f) 교정제 VX-809, VX-770 자극(포스콜린과 동시에)의 24 시간 예비-처리 또는 병행된 VX-809 및 VX-770 처리의 존재 또는 부재 하에 포스콜린에 반응한 CF 환자-유래된 오르가노이드 팽창(평균±s.e.m.). (g) HC 오르가노이드에 비해, DMSO 처리(대조군) 또는 e 및 f로부터 병행된 화합물 처리 시 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창(모든 조건에서 n=10)(평균±s.e.m.). (d)에서 각각의 라인은 개인당 3 개 이상의 독립적인 실험으로부터 평균된 오르가노이드 팽창을 나타낸다. 모든 다른 도면들로부터의 결과는 3 개 이상의 독립적인 실험들에 대해 전형적이다.
도 35.
포스콜린 또는 DMSO에 의해 자극된 야생형 쥐 오르가노이드의 광 현미경 분석. 자극 시작 후 지시된 시점들에 대해 전형적인 예들을 나타낸다. 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창(FIS)은 세척에 의해 포스콜린 제거 시 역전되었다.
도 36.
CFTR mRNA는 마우스 및 인간 오르가노이드에서 발현된다. 막대들은 CFTR-F508del(좌측 그래프) 또는 CFTR-/-(중간 그래프) 오르가노이드 및 그들의 상응하는 야생형 또는 인간 오르가노이드로부터 단리된 CFTR, β2m 또는 GAPDH의 mRNA 수준을 나타내는 실시간 PCR 주기 한계(CT) 값들을 나타낸다.
도 37.
점차적인 포스콜린-유도된 팽창은 오르가노이드 붕괴를 방지한다. 개별적인 포스콜린-자극된 (a) 야생형, (b) CFTR-F508del(온도-구제된) 및 (c) 인간(5% Wnt3a-처리된 배지, WCM) 오르가노이드의 표준화된 표면적 증가. 상이한 오르가노이드 유형의 평균 포스콜린-유도된 팽창을 10 분(도 1d,e + 2a,c,e), 20 분(도 2g) 또는 40 분(도 2h,i + 2a-c)(대시선)까지 분석하였다.
도 38.
교정제 화합물의 처리에 의한 증가된 FIS는 CFTR 의존적이다. DMSO와 함께 또는 VRT-325 및 Corr-4a 모두와 함께 CFTR 억제의 존재 또는 부재 하에서 24 시간 동안 예비 배양시킨 칼세인-그린 표지된 인간 CFTR-F508del 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창(모든 조건에서 n=10)(평균±s.e.m.). 결과는 3 개 이상의 상이한 실험들에 대해 전형적이다.
도 39.
인간 오르가노이드에서 콜레라 독소-유도된 오르가노이드 팽창은 CFTR 의존적이다. 포스콜린 및 콜레라 독소는 HC-유도된 오르가노이드의 팽창을 유도하지만, CFTR-F508del 오르가노이드의 팽창은 유도하지 않는다. 콜레라 독소 반응은 그의 정점 세포외 작용으로 인해 포스콜린에 비해 지연된다(모든 조건에서 n=10)(평균±s.e.m.). 결과는 3 개 이상의 상이한 실험들에 대해 전형적이다.
도 40.
정상 또는 감소된 Wnt3a 배양 조건에서 인간 오르가노이드. (a) 정상(50%, 좌측 패널) 또는 감소된(5%, 우측 패널) Wnt3a 처리된 배지(WCM) 농도에서 배양된 인간 오르가노이드의 광 현미경 상. 축척 막대 400 ㎛. (b) 정상 또는 감소된 Wnt3a 조건에서 포스콜린-유도된 팽창의 전형적인 예. 축척 막대 50 ㎛. 대시선은 내부 오르가노이드 관강을 나타낸다. (c) DMSO, CFTRinh-172, GlyH-101 또는 CFTRinh-172 및 GlyH-101 (n=29, n=41, n=26, n=15)과 함께 예비 배양된 정상 Wnt3a 수준에서 포스콜린-유도된 오르가노이드 팽창의 정량분석(평균±s.e.m.). (d) 2 개의 독립적인 실험으로부터 평균된 50%(n=9) 또는 5%(n=12) Wnt3a에서 배양된 낮은-계대 발아 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창의 정량분석(평균±s.e.m.). 결과는 3 개 이상의 상이한 실험들에 대해 전형적이다.
도 41. 전립선 오르가노이드의 H&E 염색
마우스 전립선 상피의 조직 단편을 매트리젤 중에 매몰하였다. 상기 확대 세포는 매주 분할되었다. 상기 배양물을 유전자 안정성 또는 증식 능력의 상실 없이 연장된 기간 동안 유지시킬 수 있다. 도 41은 3 개월의 기간 후에 상기 전립선 자체 및 상기 오르가노이드의 전립선 상피의 비교를 나타낸다. 상기 마우스 전립선 오르가노이드는 테스토스테론의 존재 또는 부재 하에서 ENR(HGF, 노긴 및 R스폰딘)을 함유하는 배지에서 증식한다. 인간 배양물은 TGF-베타 억제제의 첨가를 요한다. 상기 H&E의 고정 및 파라핀에의 매몰은 생체 내 상기 상피의 상이한 수준의 층상화 및 폴딩을 입증한다. 상기 배양된 전립선 오르가노이드는 폴딩 및 층상화에서 유사한 다양성을 보인다.
도 42. 전립선 오르가노이드의 CK8(분화 마커) 염색
마우스 전립선 상피의 조직 단편들을 매트리젤 중에 매몰시켰다. 확대 세포는 매주 분할되었다. 상기 배양물을 유전자 안정성 또는 증식 능력의 상실 없이 연장된 기간 동안 유지시킬 수 있다. 도 42는 관강 세포를 발현하는 CK8의 존재를 나타낸다. 상기 배양물은 테스토스테론의 존재 또는 부재 하에서 ENR(HGF, 노긴 및 R스폰딘)을 함유하는 배지에서 증식한다. 인간 배양물은 TGF-베타 억제제의 첨가를 요한다. 상기 테스토스테론의 첨가는 CK8 양성 관강 세포로의 분화를 허용하는 동시에 줄기세포 유지 및 확대를 자극한다. 테스토스테론은 상기 상피의 층상화 및 폴딩을 또한 증가시킨다.
도 43. 배양물 중에서 25 주 후의 마우스 전립선.
EGF, 노긴, R스폰딘, NAC, B27, 글루타민/맥스, 펜/스트렙, Ad-DMEM/F12 + 테스토스테론 중에서 증식된 전립선 오르가노이드. 상기 오르가노이드의 모양은 조직 기원(단리 전 상기 전립선의 위치)에 의해 결정된다. 상기 전립선은 상이한 소엽 또는 영역들로 이루어진다. 상기 상이한 영역들은 특정한 상피 구조(층상화 및 폴딩)를 나타낸다. 시험관 내 배양 후에 상기 오르가노이드는 기원하는 전립선 부분의 상이한 거시적인 구조(층상화되거나 또는 폴딩된)를 유지하는 것으로 보인다.
도 44. 3 주 인간 전립선 배양물의 PCR
정상 및 암성 전립선 상피를 단리하고 ENR FGF10, ENRF+DHT, WENRF, WENRF + DHT, ENR, ENR + DHT 배양 배지에서 3 주 동안 증식시켰다. 모든 배양 조건은 A83, P38i 및 니코틴아미드를 함유하였다.
도 44(a): RNA를 단리하고 RT-PCR을 전립선 상피의 마커들에 대해서 수행하였다. 정상 및 종양 조직 모두에서, 관강 마커 CK18, CK8 및 B-MSP가 발현된다. 모든 배양 조간은 AR을 발현시킨다. 정상 조직에서 DHT의 첨가는 모든 배양 조건에서 AR 발현을 증가시킨다. 종양 조직에서 AR 발현은 DHT 첨가에 의해 영향을 받지 않는다. 모든 배양 조건에서 기본 상피 마커 CK14, CK5 및 p63이 발현된다. 추정적인 줄기세포 마커 LGR5가 정상 조직 중에서 ENRF 조건 하에서 발현된다. 종양 조직에서 LGR5 발현이 모든 배양 조건에서 DHT의 첨가에 의해 유도된다. TNFRSF19(또한 추정적인 줄기세포 마커)는 정상 및 종양 조직에서 모든 조건 하에 발현된다. 전립선 특이성 전사 인자 NKX3.1은 모든 조건에서 발현된다. 테스토스테론의 첨가는 상기 전립선의 상이한 세포 유형의 마커들(기저 및 관강)을 유지하면서 성장/배가를 증가시킨다.
도 44(b): ENRF + 1 nM DHT 조건 하에서 증식된 인간 오르가노이드의 2 개의 전형적인 사진
레인 1: 라인 1 ENRF 정상 조직
레인 2: 라인 1 ENRF + 1 nM DHT 정상 조직
레인 3: 라인 2 WENRF 정상 조직
레인 4: 라인 2 WENRF + 1 nM DHT 정상 조직
레인 5: 라인 3 ENR 정상 조직
레인 6: 라인 3 ENR + 1 nM DHT 정상 조직
레인 7: 전체 전립선 정상 조직
레인 8: H2O
레인 9: 라인 1 ENRF 종양 조직
레인 10: 라인 1 ENRF + 1 nM DHT 종양 조직
레인 11: 라인 2 WENRF 종양 조직
레인 12: 라인 2 WENRF + 1 nM DHT 종양 조직
레인 13: 라인 3 ENR 종양 조직
레인 14: 라인 3 ENR + 1 nM DHT 종양 조직
레인 15: 전체 전립선 종양 조직
레인 16: H2O
도 45. 마우스 전립선 오르가노이드의 PCR
3 개의 생물학적으로 독립적인 라인들을 ENR 또는 ENR + 1 nM DHT 조건 하에서 배양시켰다. RNA를 단리하고 RT-PCR을 전립선 상피의 마커들에 대해 수행하였다. 상기 두 배양 조건 하에서 관강내 전립선 마커 사이토케라틴 18(CK18) 및 사이토케라틴 8(CK8)이 광범위하게 발현된다. 안드로젠 수용체(AR)가 상기 두 조건에서 발현된다. 기본 마커 p63 및 사이토케라틴 5(CK5)가 상기 배양 조건에서 발현되나, DHT의 첨가 시 기본 마커들은 하향조절된다. 추정적인 줄기세포 마커 Lgr5 및 Tnfrsf19는 DHT 첨가 시 하향조절된다. 이러한 조건 하에서 줄기세포능이 유지되는 동시에 분화된 세포가 또한 존재한다. 이러한 조건은 무제한 세포 확대를 허용한다(현재로는 9 개월 동안 1주일에 2,5 집단 배가). 모든 배양물들이 상기 전립선 특이성 마커 Nkx3.1에 대해 양성이다. 테스토스테론의 첨가는 상기 전립선의 상이한 세포 유형에 대한 마커들((기저 및 관강)을 유지하면서 성장/배가를 3 배까지 증가시킨다.
레인 1: 라인 1 ENR
레인 2: 라인 1 ENR + 1 nM DHT
레인 3: 라인 2 ENR
레인 4: 라인 2 ENR + 1 nM DHT
레인 5: 라인 3 ENR
레인 6: 라인 3 ENR + 1 nM DHT
레인 7: 전체 마우스 전립선
레인 8: H2O
도 46: 복부(위) 오르가노이드
인간 위 오르가노이드. 조직을 위 조직으로부터 단리하였다. 상기 세포를 위 오르가노이드 배지(EGF, 노긴, R스폰딘, Wnt, 니코틴아미드, FGF10, 가스트린, TGF-베타 억제제(A8301))에서 배양하였다. 세포는 매주 분할된다.
도 46(a): 본 사진은 2 개월 배양 후에 촬영되었다.
도 46(b): 2 주 배양 후 배양물의 고정 및 파라핀 섹셔닝 후 H&E 및 상이한 항체 염색. 상기는 하기 세포들의 존재를 보인다: 뮤신 생산 세포의 경우 PAS; 표면 점액 오목 세포의 경우 Muc5Ac; 목 점액 세포의 경우 Muc6. 상기 H&E 염색은 양극화된 상피의 단일층을 나타낸다.
도 47: 전립선 조직의 단리
실시예 8을 참조하시오(UCSF로부터의 사진들)
도 48: A) 72 시간 동안 상이한 용량의 재조합 마우스 RANKL의 존재 하에서 마우스 오르가노이드를 배양하였다. RANK에 대한 mRNA 발현 수준, 전사 인자 SpiB 및 M 세포-특이성 마커 GP2 및 아넥신V를 qPCR에 의해 측정하였다. B) 72 시간 동안 100 ng/㎖ RANKL과 함께 배양된 마우스 오르가노이드에서 GP2(화살표 참조) 및 아넥신V(화살표 참조) 발현의 공초점 분석
도 49: 7일 동안 상이한 용량의 재조합 인간 RANKL의 존재 하에서 인간 오르가노이드를 배양하였다. RANK에 대한 mRNA 발현 수준, SpiB 및 M 세포-특이성 마커 GP2를 qPCR에 의해 측정하였다. EM: 확대 배지; DM: 분화 배지.
본 발명에 따라, 줄기세포 집단을 확대시키기 위한 배양 배지를 제공하며, 여기에서 상기 배양 배지는 하나 이상의 세린/쓰레오닌 단백질 키나제 표적에 결합하고 상기 표적의 활성을 감소시키는 하나 이상의 억제제를 포함하고, 상기 배양 배지는 3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 동안 상기 줄기세포 집단의 연속적인 성장을 허용하는 효과를 갖는다.
억제제
본 발명의 첫 번째 태양에 따라 사용되는 배양 배지는 TGF-베타 또는 p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로, 음으로 조절하는 임의의 억제제를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 본 발명의 배양 배지는 TGF-베타 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로, 음으로 조절하는 억제제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 TGF-베타를 직접적으로 또는 간접적으로, 음으로 조절하는 억제제 및 p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로, 음으로 조절하는 억제제를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 R스폰딘 또는 R스폰딘 모방물질을 추가로 포함한다.
상기 하나 이상의 억제제는 바람직하게는 TGF-베타 수용체 키나제 1, ALK4, ALK5, ALK7, p38을 포함하는 그룹 중에서 선택된 세린/쓰레오닌 단백질 키나제를 표적화한다. 이들 키나제 중 어느 하나의 억제제는 이들 분자 중 어느 하나(또는 그 이상)의 효소 활성의 감소를 초래하는 것이다. ALK 및 p38 키나제의 억제는 앞서 B-세포 림프종에 연계되는 것으로 입증되었다(문헌[Bakkebø M Huse K, Hilden VI, Smeland EB, Oksvold MP, “TGF-beta-induced growth inhibition in B-cell lymphoma correlates with Smad1/5 signalling and constitutively active p38 MAPK”, BMC Immunol. 11:57, 2010]). 상기 간행물에서, TGF-베타 민감성 세포주는 ALK-5의 더 높은 세포 표면 수준을 발현하고 p38의 구성적인 인산화는 상기 TGF-베타 민감성 세포주로 제한됨이 밝혀졌다. p38 MAPK의 억제는 TGF-베타에 대한 감소된 민감성을 도출하였으며 이는 Smad1/5의 인산화가 B-세포 림프종에서 TGF-베타의 증식억제 효과에 중요함을 암시한다. 상기 결과는 TGF-베타-유도된 증식억제 효과의 조절에 있어서 p38 MAPK의 역할을 가리킨다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 ALK 및 p38이 줄기 세포, 특히 인간 상피 줄기세포의 장기간 유지를 음으로 조절하는 경로에 속함을 제안하고 있다. 발명자들은, 예를 들어 Smad1/5 신호전달을 억제함으로써 상기 경로에 임의의 수준으로 작용하는 억제제가 줄기세포 배양에도 또한 이로울 것이라고 가정한다. Smad는 TGF-베타 신호전달에 핵심 역할을 한다.
일부 실시태양에서 본 발명의 억제제는 TGF-베타 수용체 키나제 1, ALK4, ALK5, ALK7, p38을 포함하는 그룹 중에서 선택된 세린/쓰레오닌 단백질 키나제에 결합하며 이의 활성을 감소시킨다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 배양 배지는 TGF-베타 억제제를 포함하며, 상기 억제제는 TGF-베타 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 임의의 억제제를 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 ALK5, ALK4, TGF-베타 수용체 키나제 1 및 ALK7으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세린/쓰레오닌 단백질 키나제에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 하나 이상의 TGF-베타 억제제를 포함한다. ALK4, ALK5 및 ALK7은 모두 상기 TGF-베타 상과의 가깝게 관련된 수용체들이다. ALK4는 GI 번호 91을 갖고; ALK5(또한 TGF-베타 수용체 키나제 1로서 공지됨)는 GI 번호 7046을 가지며; ALK7은 GI 번호 658을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 억제제는 ALK4, ALK5(TGF-베타 수용체 키나제 1) 및/또는 ALK7에 결합하고 이의 활성을 감소시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 TGF-베타 수용체는 Smad 단백질, 예를 들어 R-SMAD 또는 SMAD1-5(즉 SMAD 1, SMAD 2, SMAD 3, SMAD 4 또는 SMAD 5)에 결합하고 이의 활성을 감소시킨다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 ALK5의 억제제를 포함한다. 물질이 TGF-베타 억제제인지의 여부를 결정하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있다. 예를 들어, 세포를, 루시페라제 리포터 유전자를 구동하는, 인간 PAI-1 프로모터 또는 Smad 결합 부위를 포함하는 리포터 구조물로 안정하게 형질감염시키는 세포 분석을 사용할 수 있다. 대조군에 대한 루시페라제 활성의 억제를 화합물 활성의 척도로서 사용할 수 있다(문헌[De Gouville et al., Br J Pharmacol. 2005 May; 145(2): 166-177]). 또 다른 예는 키나제 활성의 측정을 위한 알파스크린(AlphaScreen)(등록상표) 포스포센서 분석이다(문헌[Drew A E et al., Comparison of 2 Cell-Based Phosphoprotein Assays to Support Screening and Development of an ALK Inhibitor J Biomol Screen. 16(2) 164-173, 2011]).
다양한 TGF-베타 억제제들이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 표 1 참조). 일부 실시태양에서 TGF-베타 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 억제제를 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 및 SJN-2511로 이루어진 그룹 중에서 선택한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 배양 배지는 p38 억제제를 포함하며, 상기 억제제는 p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 임의의 억제제를 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 억제제는 p38(GI 번호 1432)에 결합하고 이의 활성을 감소시킨다. p38 단백질 키나제는 미토젠-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 과의 부분이다. MAPK는 세포외 자극, 예를 들어 환경적 스트레스 및 염증성 사이토킨에 반응하고 다양한 세포 활동, 예를 들어 유전자 발현, 유사분열, 분화, 증식, 및 세포 생존/세포사멸을 조절하는 세린/쓰레오닌-특이성 단백질 키나제이다. 상기 p38 MAPK는 α, β, β2, γ 및 δ 동형으로서 존재한다. p38 억제제는 하나 이상의 p38 동형에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 작용제이다. 물질이 p38 억제제인지의 여부를 결정하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있으며, 이를 본 발명과 함께 사용할 수도 있다. 예로서 Thr180/Tyr182에서 인산화에 대한 인-특이 항체 검출(이는 세포 p38 활성화 또는 억제의 잘-확립된 측정을 제공한다); 생화학적 재조합 키나제 분석; 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 분비 분석; 및 p38 억제제에 대한 디스커버Rx(DiscoverRx) 대량처리 선별 플랫폼을 포함한다(http://www.discoverx.com/kinases/literature/biochemical/collaterals/DRx_poster_p38%20KBA.pdf를 참조하시오). 다수의 p38 활성 분석 키트가 또한 존재한다(예를 들어 밀리포어, 시그마-알드리치).
발명자들은 일부의 실시태양에서, 고 농도(예를 들어 100 nM 초과, 또는 1 uM 초과, 10 uM 초과, 또는 100 uM 초과)의 p38 억제제가 TGF-베타를 억제하는 효과를 가질 수 있음을 가정하였다. 그러나, 발명자들은 상기 가설에 의해 얽매이고자 하지 않으며 다른 실시태양에서 상기 p38 억제제는 TGF-베타 신호전달을 억제하지 않는다.
다양한 p38 억제제들이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 표 1을 참조하시오). 일부 실시태양에서, p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 억제제를 SB-202190, SB-203580, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257 및 BIRB-796으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 a) ALK4, ALK5 및 ALK7로 이루어진 그룹으로부터의 키나제들 중 임의의 하나 이상에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제; 및 b) p38에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제 모두를 포함한다. 바람직한 실신태양에서, 상기 배양 배지는 AKL5에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제 및 p38에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 억제제는 그의 표적(예를 들어 TGF-베타 또는 p38)에 결합하고 세포 분석에 의해 평가 시, 대조군에 비해 상기 표적의 활성을 10% 초과; 30% 초과; 60% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과 까지 감소시킨다. 표적 억제를 측정하기 위한 세포 분석의 예는 상술한 바와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 억제제는 2000 nM 이하; 1000 nM 미만; 100 nM 미만; 50 nM 미만; 30 nM 미만; 20 nM 미만 또는 10 nM 미만의 IC50을 가질 수 있다. 상기 IC50 값은 억제제가 그의 표적의 생물학적 또는 생화학적 작용을 억제하는 유효성을 지칭한다. 상기 IC50은 특정 억제제가 키나제를 50%까지 억제하는데 얼마나 많이 필요한 가를 가리킨다. IC50 값을 상기에 나타낸 분석 방법들에 따라 계산할 수 있다.
본 발명에 따른 억제제는 경쟁적으로, 비-경쟁적으로, 경쟁없이, 또는 혼합된 억제에 의해 작용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 억제제는 표적 키나제의 ATP 결합 포켓의 경쟁적인 억제제일 수 있다.
본 발명에 따른 억제제는 다양한 형태로, 예를 들어 천연 또는 변형된 기질, 효소, 수용체, 작은 유기 분자, 예를 들어 2000 Da 이하, 바람직하게는 800 Da 이하의 작은 천연 또는 합성 유기 분자, 펩타이드모방물질, 무기 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 앱타머, 및 소 분자를 포함하여 이들의 구조적 또는 작용적 모방물질로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 억제제는 또한 앱타머일 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "앱타머"란 용어는 고도로 특이적인 3차원 형태를 채택할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 가닥들을 지칭한다. 앱타머는 세포외 및 세포내 단백질을 포함한 몇몇 표적 단백질들에 대해 높은 결합 친화성 및 특이성을 갖도록 설계된다.
예를 들어, 상기 억제제는 50 내지 800 Da, 80 내지 700 Da, 100 내지 600 Da, 또는 150 내지 500 Da의 분자량을 갖는 작은 합성 분자일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 소-분자 억제제는 피리디닐이미다졸 또는 2,4-이치환된 프테리딘 또는 퀴나졸린, 예를 들어 하기를 포함한다:
Figure pat00001
본 발명에 따라 사용될 수 있는 억제제의 특정한 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: SB-202190, SB-203580, SB-206718, SB-227931, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257, BIRB-796, A83-01 SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511 (표 1 참조). 본 발명의 배양 배지는 표 1에 나열된 억제제들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 하나의 억제제와 나열된 또 다른 억제제와의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 배양 배지는 SB-202190 또는 SB-203580 또는 A83-01을 포함하거나; 또는 본 발명의 배양 배지는 SB-202190 및 A83-01을 포함하거나; 또는 본 발명의 배양 배지는 SB-203580 및 A83-01을 포함한다. 숙련가는 다른 억제제, 및 본 발명에 따른 표적에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제들의 조합이 본 발명에 따른 배양 배지 또는 배양 배지 보충제에 포함될 수 있음을 알 것이다.
본 발명에 따른 억제제를 상기 배양 배지에, 상기 억제제의 IC50 값을 고려하여, 적합한 최종 농도로 첨가할 수 있다.
예를 들어, SB-202190을 50 nM 내지 100 uM, 또는 100 nM 내지 50 uM, 또는 1 uM 내지 50 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB-202190을 상기 배양 배지에 대략 10 uM으로 첨가할 수 있다.
SB-203580을 50 nM 내지 100 uM, 또는 100 nM 내지 50 uM, 또는 1 uM 내지 50 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB-203580을 상기 배양 배지에 대략 10 uM으로 첨가할 수 있다.
*
*VX-702를 50 nM 내지 100 uM, 또는 100 nM 내지 50 uM, 또는 1 uM 내지 25 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 VX-702를 상기 배양 배지에 대략 5 uM으로 첨가할 수 있다.
VX-745를 10 nM 내지 50 uM, 또는 50 nM 내지 50 uM, 또는 250 nM 내지 10 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 VX-745를 상기 배양 배지에 대략 1 uM으로 첨가할 수 있다.
PD-169316을 100 nM 내지 200 uM, 또는 200 nM 내지 100 uM, 또는 1 uM 내지 50 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 PD-169316을 상기 배양 배지에 대략 20 uM으로 첨가할 수 있다.
RO-4402257을 10 nM 내지 50 uM, 또는 50 nM 내지 50 uM, 또는 500 nM 내지 10 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 RO-4402257을 상기 배양 배지에 대략 1 uM으로 첨가할 수 있다.
BIRB-796을 10 nM 내지 5 uM, 또는 50 nM 내지 50 uM, 또는 500 nM 내지 10 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 BIRB-796을 상기 배양 배지에 대략 1 uM으로 첨가할 수 있다.
A83-01을 10 nM 내지 10 uM, 또는 20 nM 내지 5 uM, 또는 50 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 A83-01을 상기 배양 배지에 대략 500 nM으로 첨가할 수 있다.
SB-431542를 80 nM 내지 80 uM, 또는 100 nM 내지 40 uM, 또는 500 nM 내지 10 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB-431542를 상기 배양 배지에 대략 1 uM으로 첨가할 수 있다.
SB-505124를 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB-505124를 상기 배양 배지에 대략 500 nM으로 첨가할 수 있다.
*SB-525334를 10 nM 내지 10 uM, 또는 20 nM 내지 5 uM, 또는 50 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB-525334를 상기 배양 배지에 대략 100 nM으로 첨가할 수 있다.
LY 36494를 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 LY 36494를 상기 배양 배지에 대략 500 nM으로 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 예시적인 억제제들
억제제
(Inhibitor) 		표적
(Targets) 		IC50 (nM) 분자량
(Mol Wt) 		명칭
(Name) 		화학식
(Formula)
A83-01 ALK5 (TGF-βR1) 12 421.52 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드/
3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide		 C25H19N5S
ALK4 45
ALK7 7.5
SB-431542 ALK5 94 384.39 4-[4-(1,3-벤조다이옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드/
4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide		 C22H16N4O3
ALK4
ALK7
SB-505124 ALK5 47 335.4 2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-3급-부틸-3H이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 하이드레이트/
2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-yl-2-tert-butyl-3Himidazol-4-yl)-6-methylpyridinehydrochloridehydrate		 C20H21N3O2
ALK4 129
SB-525334 ALK5 14.3 343.42 6-[2-(1,1-다이메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린/
6-[2-(1,1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline		 C21H21N5
SD-208 ALK5 49 352.75 2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프테리딘/
2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)-4-[(4-pyridyl)amino]pteridine		 C17H10ClFN6
LY-36494 TGR-βRI 59 272.31 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린/
4-[3-(2-Pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline		 C17H12N4
TGF-βRII 400
MLK-7K 1400
LY364947 ALK5 59 272.30 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린/
4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline		 C17H12N4
SJN-2511 ALK5 23 287.32 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘/
2-(3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine		 C17H13N5
SB-202190 p38 MAP kinase 38 331.35 4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(4-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]페놀/
4-[4-(4-Fluorophenyl)-5-(4-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]phenol		 C20H14N3OF
p38α 50
p38β 100
SB-203580 p38 50 377.44 4-[5-(4-플루오로페닐)-2-[4-(메틸설포닐)페닐]-1H-이미다졸-4-일]피리딘/
4-[5-(4-Fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-1H-imidazol-4-yl]pyridine		 C21H16FN3OS
p38β2 500
VX-702 p38α 4-20; (Kd = 3.7) 404.32 6-[(아미노카보닐)(2,6-다이플루오로페닐)아미노]-2-(2,4-다이플루오로페닐)-3-피리딘카복스아미드/
6-[(Aminocarbonyl)(2,6-difluorophenyl)amino]-2-(2,4-difluorophenyl)-3-pyridinecarboxamide		 C19H12F4N4O2
p38β Kd = 17
VX-745 p38α 10 436.26 5-(2,6-다이클로로페닐)-2-[2,4-다이플루오로페닐)티오]-6H-피리미도[1,6-b]피리다진-6-온/
5-(2,6-Dichlorophenyl)-2-[2,4-difluorophenyl)thio]-6H-pyrimido[1,6-b]pyridazin-6-one		 C19H9Cl2F2N3OS
PD-169316 p38 89 360.3 4-[5-(4-플루오로페닐)-2-(4-나이트로페닐)-1H-이미다졸-4-일]-피리딘/
4-[5-(4-fluorophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-1H-imidazol-4-yl]-pyridine		 C20H13FN4O
RO-4402257 p38α 14 피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온,6-(2,4-다이플루오로페녹시)-2-[[3-하이드록시-1-(2-하이드록시에틸)프로필]아미노]-8-메틸-/
Pyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one,6-(2,4-difluorophenoxy)-2-[[3-hydroxy-1-(2-hydroxyethyl)propyl]amino]-8-methyl-
p38β 480
BIRB-796 p38 4 527.67 1-[2-(4-메틸페닐)-5-3급-부틸-피라졸-3-일]-3-[4-(2-모폴린-4-일에톡시)나프탈렌-1-일]유레아::3-[2-(4-메틸페닐)-5-3급-부틸-피라졸-3-일]-1-[4-(2-모폴린-4-일에톡시)나프탈렌-1-일]유레아::3-[3-3급-부틸-1-(4-메틸페닐)-1H-피라졸-5-일]-1-{4-[2-(모폴린-4-일)에톡시]나프탈렌-1-일}유레아/
1-[2-(4-methylphenyl)-5-tert-butyl-pyrazol-3-yl]-3-[4-(2-morpholin-4-ylethoxy)naphthalen-1-yl]urea::3-[2-(4-methylphenyl)-5-tert-butyl-pyrazol-3-yl]-1-[4-(2-morpholin-4-ylethoxy)naphthalen-1-yl]urea ::3-[3-tert-butyl-1-(4-methylphenyl)-1H-pyrazol-5-yl]-1-{4-[2-(morpholin-4-yl)ethoxy]naphthalen-1-yl}urea 		C31H37N5O3
SD-208을 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SD-208을 상기 배양 배지에 대략 500 nM으로 첨가할 수 있다.LY364947을 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 LY364947을 상기 배양 배지에 대략 500 nM으로 첨가할 수 있다.SJN 2511을 20 nM 내지 20 uM, 또는 40 nM 내지 10 uM, 또는 100 nM 내지 1 uM의 농도로 상기 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SJN 2511을 상기 배양 배지에 대략 200 nM으로 첨가할 수 있다.
따라서, 일부 실시태양에서 TGF-베타 또는 p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 억제제를 상기 배양 배지에, 예를 들어 1 nM 내지 100 μM, 10 nM 내지 100 μM, 100 nM 내지 10 μM, 또는 대략 1 μM의 농도로 첨가하며, 여기에서 상기 하나 이상의 억제제의 전체 농도는 10 nM 내지 100 μM, 100 nM 내지 10 μM, 또는 대략 1 μM이다.
상기 억제제에 더하여, 세포 배양 배지는 상기 배양된 세포의 유지 및/또는 확대를 지지하기에 필요한 다수의 성분들을 일반적으로 함유한다. 따라서 본 발명의 세포 배양 배지는 통상적으로 본 발명에 따른 억제제 외에 다수의 다른 성분들을 함유할 것이다. 적합한 성분들의 조합은 하기의 명세를 고려하여, 숙련가에 의해 쉽게 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 배양 배지는 일반적으로 표준 세포 배양 성분, 예를 들어 하기에 보다 상세히 개시되는 바와 같은 아미노산, 비타민, 무기염, 탄소 에너지원, 및 완충제를 포함하는 배양액일 것이다. 상기 배양물에 포함시킬 수 있는 다른 표준 세포 배양 성분은 호르몬, 예를 들어 프로제스테론, 단백질, 예를 들어 알부민, 카탈라제, 인슐린 및 트랜스페린을 포함한다. 이들 다른 표준 세포 배양 성분들은 "기본" 배양 배지를 구성한다.
본 발명에 따른 배양 배지를 기존의 세포 배양 배지의 변형에 의해 생성시킬 수도 있다. 숙련가는 줄기세포 배양에 사용될 수도 있는 배양 배지의 유형을 통상적인 일반적인 지식으로부터 알 것이다. 잠재적으로 적합한 세포 배양 배지를 상업적으로 입수할 수 있으며, 상기 배지는 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 녹아웃-DMEM(KO-DMEM), 글래스고우 최소 필수 배지(G-MEM), 기본 배지 이글(BME), DMEM/햄의 F12, 어드밴스드(Advanced) DMEM/햄의 F-12, 아이스코베의 변형된 둘베코의 배지 및 최소 필수 배지(MEM), 햄의 F-10, 햄의 F-12, 배지 199 및 RPMI 1640 배지를 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 이들 기존의 세포 배양 배지 중 하나를, TGF-베타 또는 p38 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 음으로 조절하는 억제제가 첨가되고 임의로 본 발명에 개시된 바와 같은 하나 이상의 다른 성분들이 첨가된 기본 배양 배지로서 사용한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 BMP 억제제, Wnt 작용물질, 수용체 타이로신 키나제 리간드, Rock 억제제, 니코틴아미드 및 가스트린 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 R스폰딘 1-4 및/또는 R스폰딘 모방물질, TGF-베타 억제제, BMP 억제제(예를 들어 노긴) 및 Wnt 작용물질(예를 들어 Wnt(3a)) 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 R스폰딘 1-4 및/또는 R스폰딘 모방물질, BMP 억제제(예를 들어 노긴), TGF-베타 억제제, 수용체 타이로신 키나제 리간드(예를 들어 EGF), 니코틴아미드, Wnt 작용물질(예를 들어 Wnt(3a)) 중 어느 하나, 및 임의로 p38 억제제, 가스트린, FGF10, HGF 및 록 억제제 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분들을 포함한다. 상기 임의의 추가적인 성분들을 나중에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 특정 조직으로부터 기원하는 세포를 배양하기 위한 배양 배지의 최적화를 위해서 첨가할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 하나 이상의 골형성 단백질(BMP) 억제제를 포함할 수 있다. BMP 리간드는 2 개의 타입 I 및 2 개의 타입 II 수용체로 이루어지는 4 분 막관통 세린/쓰레오닌 키나제 수용체 복합체를 조립함으로써 이량체로서 신호를 전달한다. 복합체 조립은, 상기 BMP 반응성 Smad1/5/8을 활성화하고 전사 활성의 변화를 생성시키는 인산화 캐스케이드를 개시한다. 유리하게, 본 발명자들은 BMP 억제제가 Lgr5의 발현을 촉진하고, 따라서 본 발명의 배양 배지 중의 BMP 억제제의 존재가 마찬가지로, 상기 BMP 억제제가 존재하지 않는 경우보다 더 증식성인 오르가노이드를 생성시킬 것임을 입증한다(예를 들어 실시예 3 참조). 따라서, BMP 억제제는 본 발명의 확대 배지의 유리한 성분이다. 따라서, BMP 억제제의 사용은 세포 분화 없이 3 개월 이상(예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개월 이상) 동안 상기 세포를 배양하는 것이 바람직한 경우 확대 배지의 사용에 유리하다.
천연 BMP-결합 단백질의 여러 부류, 예를 들어 노긴(Peprotech), 코딘 및 코딘 도메인을 포함하는 코딘-유사 단백질(R&D systems), 폴리스타틴 및 폴리스타틴 도메인을 포함하는 폴리스타틴-관련된 단백질(R&D systems), DAN 및 DAN 시스테인-매듭 도메인을 포함하는 DAN-유사 단백질(R&D systems), 스클레로스틴/SOST(R&D systems) 및 알파-2 거대글로불린(R&D systems)이 공지되어 있다. BMP 억제제는 BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 작용제이며, 여기에서 상기 BMP 활성은, 예를 들어 상기 BMP 분자의 BMP 수용체에 대한 결합을 방지하거나 억제함으로써 감소된다. 한편으로, 상기 억제제는 BMP 수용체에 결합하고 BMP 리간드의 수용체에의 결합을 방지하는 작용제, 예를 들어 상기 수용체에 결합하는 항체일 수 있다. BMP 억제제는 단백질 또는 소분자일 수 있으며 천연, 변형 및/또는 부분적으로 또는 전적으로 합성일 수 있다. 본 발명의 배양 배지의 BMP 억제제는 노긴, DAN, 또는 써베루스 및 그렘린(R&D systems)을 포함하는 DAN-유사 단백질일 수 있다. 이들 확산성 단백질은 다양한 정도의 친화성으로 BMP 리간드에 결합하고 상기의 신호전달 수용체에의 접근을 억제할 수 있다. 본 발명의 배양 배지에 사용하기에 바람직한 BMP 억제제는 노긴이다. 노긴을 임의의 적합한 농도로 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지의 기본 배지는 약 10 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖의 노긴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 약 10 ng/㎖ 이상의 노긴, 20 ng/㎖ 이상의 노긴, 50 ng/㎖ 이상의 노긴, 100 ng/㎖ 이상의 노긴, 대략 100 ng/㎖의 노긴 또는 100 ng/㎖의 노긴을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 배양 배지는 200 ng/㎖ 미만의 노긴, 150 ng/㎖ 미만의 노긴, 100 ng/㎖ 미만의 노긴, 75 ng/㎖ 미만의 노긴, 50 ng/㎖ 미만의 노긴, 또는 30 ng/㎖ 미만의 노긴을 포함할 수 있다. 상기 BMP 억제제를 상기 배양 배지에 배양 중 이틀마다, 또는 배양중 매일, 또는 3일마다, 4일마다, 5일마다 또는 필요에 따라 첨가할 수 있다. BMP 억제제는 예를 들어 췌장, 소장, 결장, 간, 전립선 줄기세포의 확대를 위한 확대 배지의 특히 유리한 성분이다. 그러나, 노긴은 일부 분화를 방지하는 것으로 나타났다(예를 들어 실시예 3 참조). 따라서, 일부의 실시태양에서, BMP 억제제를 본 발명의 분화 배지로부터 제외한다.
일부의 실시태양에서, BMP 억제제와 함께 배양된 세포는 BMP 억제제 없이 배양된 세포에 비해 Lgr5의 발현이 상향 조절되었다. 따라서, BMP 억제제의 첨가는 전형적으로 보다 증식성인 오르가노이드를 생성시킨다. 이는, 문헌에 BMP 활성이 췌장 세포의 도관(케라틴 7 및 19 발현 참조) 및 내분비 세포 모두로의 분화에 유용한 것으로 개시되어 있기 때문에 놀라운 것이다. 따라서, 숙련가는 증식을 감소시키고 분화를 증가시키기 위해서 BMP 억제제, 예를 들어 노긴을 포함시킬 것을 예상할 것이다. 그러나, 발명자들은 놀랍게도 BMP 억제제의 사용이 보다 증식성인 오르가노이드 및 보다 높은 Lgr5의 발현을 생성시키므로 유리함을 발견하였다. 본 발명의 배양 배지는 하나 이상의 Wnt 작용물질을 포함할 수 있다. 상기 Wnt 신호전달 경로는, Wnt 단백질이 프리즐드 수용체 과 구성원의 세포-표면 수용체에 결합할 때 발생하는 일련의 사건들에 의해 한정된다. 이는 액신, GSK-3 및 단백질 APC를 포함하는 단백질의 복합체를 억제하여 세포 내 베타-카테닌을 분해하는 흩어진 단백질 과의 활성화를 생성시킨다. 상기 생성되는 농축된 핵 베타-카테닌은 TCF/LEF 과 전사 인자에 의해 전사를 증대시킨다. Wnt 작용물질은 세포에서 TCF/LEF-매개된 전사를 활성화하는 작용제로서 정의된다. Wnt 작용물질은 따라서 상기 Wnt 과 단백질, 세포내 베타-카테닌 분해의 억제제 및 TCF/LEF의 활성제 모두를 포함하는 프리즐드 수용체 과 구성원과 결합하고 이를 활성화하는 진정한 Wnt 작용물질들 중에서 선택된다. 상기 Wnt 작용물질은 세포에서 Wnt 활성을 상기 분자 부재 하의 상기 Wnt 활성의 수준에 비해 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상까지 자극한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, Wnt 활성을, 예를 들어 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라제 리포터 구조물(문헌[Korinek et al, 1997 Science 275 1784-1787])에 의해 Wnt의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
일부 실시태양에서, Wnt 작용물질은 Wnt-l/Int-1, Wnt-2/Irp(InM-관련된 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a(R&D sytems), Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6(문헌[Kirikoshi H et al 2001 Biochem Biophys Res Com 283 798-805]), Wnt-7a(R&D systems), Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, WnM l, 및 Wnt-16을 포함하는 분비된 당단백질을 포함한다. 인간 Wnt 단백질에 대한 개요가 문헌["THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS", R&D Systems Catalog, 2004]에 제공되어 있다. 더욱이 Wnt 작용물질은 분비된 단백질들의 R-스폰딘 과를 포함하며, 상기 과는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 및 조절에 관련되고 4 개의 구성원(R-스폰딘 1(NU206, Nuvelo, San Carlos, CA), R-스폰딘 2(R&D systems), R-스폰딘 3, 및 R-스폰딘 4), 및 노린(또한 놈(Nome) 질병 단백질 또는 NDP)(R&D systems)(상기 프리즐드-4 수용체에 높은 친화성으로 결합하고 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 유도한다는 점에서 Wnt 단백질과 유사한 작용을 하는 분비된 조절 단백질이다(문헌[(Kestutis Planutis et al (2007) BMC Cell Biol 8 12]))으로 구성된다. 일부의 실시태양에서, 본 발명에 사용하기 위한 하나 이상의 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 모방물질, 예를 들어 Lgr5의 작용물질, 예를 들어 항-Lgr5 항체이다. 상기 Wtn 신호전달 경로의 소분자 작용물질인 아미노피리미딘 유도체가 최근에 동정되었으며 이는 또한 Wnt 작용물질로서 분명히 포함된다(문헌[Lm et al (2005) Angew Chem Int Ed Engl 44, 1987-90]).
일부의 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 GSK-억제제이다. 공지된 GSK-억제제는 작은-간섭 RNA(siRNA, Cell Signaling), 리튬(Sigma), 켄파울론(kenpaullone)(문헌[Biomol International, Leost, M et al (2000) Eur J Biochem 267, 5983-5994]), 6-브로모인디루빈-30-아세톡심(문헌[Meyer, L et al (2003) Chem Biol 10, 1255-1266]), SB 216763 및 SB 415286(Sigma-Aldrich), 및 GSK-3과 액신과의 상호작용을 방지하는 FRAT-과 구성원 및 FRAT-유도된 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Meijer et al , (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25, 471-480]에 개요가 제공되어 있다. GSK-3 억제의 수준을 측정하기 위한 방법 및 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Liao et al 2004, Endocrinology, 145(6) 2941-2949]에 개시된 바와 같은 방법 및 분석을 포함한다.
일부의 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 RNF43 또는 ZNRF3의 억제제이다. 발명자들은 RNF43 및 ZNRF3이 세포막 중에 존재하며, 이들이 추정상 프리즐드의 유비퀴틴화에 의해, 상기 막 중의 상기 Wnt 수용체 복합체의 수준을 음으로 조절함을 발견하였다. 따라서, 발명자들은 길항작용성 항체, RNAi 또는 소분자 억제제에 의한 RNF43 또는 ZNRF3의 억제가 상기 Wnt 경로를 간접적으로 자극할 것으로 가정한다. RNF43 및 ZNRF3은 촉매 고리 도메인(유비퀴틴화 활성을 갖는다)을 가지며, 이는 소분자 억제제 설계에서 표적화될 수 있다. 다수의 항-RNF43 항체 및 다수의 항-ZNRF3 항체를 상업적으로 입수할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 상기와 같은 항체는 본 발명과 관련하여 적합한 Wnt 작용물질이다.
일부의 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 Wnt-3a, GSK-억제제(예를 들어 CHIR99021), Wnt 5, Wnt-6a, 노린, 및 임의의 다른 Wnt 과 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
일부의 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 R스폰딘 1, R스폰딘 2, R스폰딘 3 및 R스폰딘 4 중 어느 하나를 포함하거나 상기로 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 Wnt 과 구성원, R스폰딘 1 내지 4, 노린 및 GSK-억제제 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부의 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 GSK-3 억제제, 예를 들어 CHIR99021(Stemgent 04-0004)이다.
일부 실시태양에서, CHIR99021을 상기 배양 배지에 50 nM 내지 100 uM, 예를 들어 100 nM 내지 50 uM, 1 uM 내지 10 uM, 1 uM 내지 5 uM, 또는 3 uM의 최종 농도로 첨가한다. GSK-3 억제제를 사용하는 일부의 실시태양에서, 상기 GSK-3 억제제는 BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥심, Stemgent 04-0003)가 아니다. 기본 배양 배지에 하나 이상의 Wnt 작용물질을 첨가하는 것이 상피 줄기세포 또는 단리된 소낭의 증식에 필수적임이 발명자들에 의해 밝혀졌다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1 또는 R-스폰딘-4를 포함하거나 상기로 이루어진다. R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4를 바람직하게는 상기 기본 배양 배지에 50 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 100 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 200 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 300 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 500 ng/㎖ 이상의 농도로 가한다. R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4의 가장 바람직한 농도는 대략 500 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖이다. 일부의 실시태양에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4를 상기 배양 배지에 500 ng/㎖ 이상, 600 ng/㎖ 이상, 700 ng/㎖ 이상, 800 ng/㎖ 이상, 900 ng/㎖ 이상, 1 ug/㎖ 이상, 1.5 ug/㎖ 이상 또는 2 ug/㎖ 이상의 농도로 가한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4를 상기 배양 배지에 대략 1 ug/㎖ 또는 1 ug/㎖의 농도로 가한다. 일부의 실시태양에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4를 상기 기본 배양 배지에 1000 ng/㎖ 미만, 예를 들어 800 ng/㎖ 미만, 600 ng/㎖ 미만, 550 ng/㎖ 미만, 500 ng/㎖ 미만, 400 ng/㎖ 미만, 300 ng/㎖ 미만, 또는 200 ng/㎖ 미만, 또는 100 ng/㎖ 미만의 농도로 가한다. 일부의 실시태양에서, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4("R스폰딘 1-4") 중 2 개 이상(예를 들어, 2, 3 또는 4 개)을 상기 배지에 가한다. 바람직하게는, R스폰딘 1-4 중 2 개 이상을 가하는 경우, R스폰딘의 전체 농도는 상술한 농도들에 달한다. 본 발명에 개시된 배양 배지가 "R스폰딘 1-4"를 포함한다고 하면, 이는 상기 배지가 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중 임의의 하나 이상을 포함함을 의미한다. 본 발명에 개시된 배양 배지가 "R스폰딘"을 포함한다고 하면, 이는 상기 배지가 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4 및 R스폰딘 모방물질 중 임의의 하나 이상을 포함함을 의미한다.
줄기세포의 배양 중에, 상기 Wnt 과 구성원을 바람직하게는 상기 배양 배지에, 상기 배양 배지를 바람직하게는 4일마다 새로 공급하면서, 이틀마다 가한다.
바람직한 실시태양에서, Wnt 작용물질을 R-스폰딘, Wnt-3a 및 Wnt-6으로 이루어진 그룹 중에서 선택한다. 보다 바람직하게는, R-스폰딘 및 Wnt-3a를 모두 Wnt 작용물질로서 사용한다. 이러한 조합은 상기 조합이 놀랍게도 오르가노이드 형성에 상승작용적인 효과를 가지므로 특히 바람직하다. 바람직한 농도는 R-스폰딘의 경우 대략 500 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖이고 Wnt3a의 경우 대략 100 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖이다.
본 발명의 배양 배지는 하나 이상의 수용체 타이로신 키나제 리간드를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 수용체 타이로신 키나제 리간드의 일례는 EGF이며, 이는 상기 수용체 타이로신 키나제 EGFR에 대한 리간드이다. 다수의 수용체 타이로신 키나제 리간드는 또한 분열촉진성 성장 인자이다.
본 발명의 배양 배지는 하나 이상의 분열촉진성 성장 인자를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 분열촉진성 성장 인자를 상피 성장 인자(EGF, Peprotech), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파, Peprotech), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, Peprotech), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF, R&D Systems), 및 각질세포 성장 인자(KGF, Peprotech)를 포함하는 성장 인자 과 중에서 선택할 수 있다. EGF는 다양한 배양된 외배엽 및 중배엽 세포에 대한 효능 있는 분열촉진인자이며 생체 내 및 시험관 내에서 특정한 세포 및 세포 배양물 중의 일부 섬유아세포의 분화에 충분한 효과를 갖는다. 상기 EGF 전구체는, 단백질분해에 의해 절단되어 세포를 자극하는 53-아미노산 펩타이드 호르몬을 생성시키는 막-결합된 분자로서 존재한다. 바람직한 분열촉진성 성장 인자는 EGF이다. EGF를 바람직하게는 상기 기본 배양 배지에 5 내지 500 ng/㎖, 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하의 농도로 첨가한다. 바람직한 농도는 10, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50 ng/㎖ 이상 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 ng/㎖ 이하이다. 보다 바람직한 농도는 50 ng/㎖ 이상 100 ng/㎖ 이하이다. 훨씬 더 바람직한 농도는 약 50 ng/㎖ 또는 50 ng/㎖이다. 동일한 농도를 FGF, 바람직하게는 FGF10 또는 FGF7에 사용할 수 있다. 하나보다 많은 FGF, 예를 들어 FGF7과 FGF10을 사용하는 경우, FGF의 농도는 상기 정의된 바와 같으며 이는 사용되는 FGF의 전체 농도를 지칭한다. 줄기세포의 배양 중에, 상기 분열촉진성 성장 인자를 바람직하게는 상기 배양 배지에 이틀마다 가하는 동시에, 상기 배양 배지를 바람직하게는 4일마다 새로 공급한다. 상기 FGF 과의 임의의 구성원을 사용할 수도 있다. 바람직하게는 FGF7 및/또는 FGF10을 사용하며 FGF7은 또한 KGF(각질세포 성장 인자)로서 공지되어 있다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 분열촉진성 성장 인자들의 조합, 예를 들어 EGF와 KGF, 또는 EGF와 BDNF를 상기 기본 배양 배지에 첨가한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 분열촉진성 성장 인자들의 조합, 예를 들어 EGF와 KGF, 또는 EGF와 FGF10을 상기 기본 배양 배지에 가한다. 상기 분열촉진성 성장 인자를 배양 배지에 5 내지 500 나노그램/㎖ 또는 5 이상 500 나노그램/㎖ 이하, 예를 들어 10, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50 ng/㎖ 이상 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 ng/㎖ 이하의 농도로 가할 수 있다. 상기 분열촉진성 성장 인자를 EGF, TGF-알파, KGF, FGF7 및 FGF로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게는 분열촉진인자를 EGF, TGF-알파 및 KGF, 또는 EGF, TGF-알파 및 TGF7, 또는 EGF, TGF-알파 및 FGF, 또는 EGF 및 KGF, 또는 EGF 및 FGF7, 또는 EGF 및 FGF, 또는 TGF-알파 및 KGF, 또는 TGF-알파 및 FGF7 또는 TGF-알파 및 FGF로 이루어진 그룹 중에서 선택한다. EGF를 TGF-알파로 대체할 수도 있다. 일부의 실시태양에서, 상기 분열촉진성 성장 인자는 간세포 성장 인자(HGF)이다. 일부의 실시태양에서, HGF를 상기 배양 배지에 가한다.
일부의 실시태양에서, 상기 수용체 타이로신 키나제 리간드는, 예를 들어 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 이루어진 성장 인자 과 중에서 선택된 분열촉진성 성장 인자이다.
Rock 억제제, 예를 들어 Y-27632(10 μM; Sigma)를 개시된 배지 중 어느 하나에, 특히 세포 분류 실험을 수행하기 전 처음 수일의 배양 중에 포함시킬 수 있는데, 그 이유는 상기 억제제가 아노이키스(주변 세포외 기질로부터 탈착하는 정박-의존성 세포에 의해 유도되는 프로그램화된 세포사의 형태)를 피하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 정의된 배지 중 어느 하나는 처음 수일 동안 Rock 억제제를 추가로 포함할 수도 있다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는, 예를 들어 세포 분류 실험을 수행하기 전 처음 수일의 배양 기간 동안 Rock 억제제, 예를 들어 Y-27632를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 실시태양은 Rock(Rho-키나제) 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다. Rock 억제제의 첨가는, 특히 단일 줄기세포 배양 시 아노이키스를 방지하는 것으로 밝혀졌다. 상기 Rock 억제제는 바람직하게는 R-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Y-27632, Sigma-Aldrich), 5-(1,4-다이아제판-1-일설포닐)아이소퀴놀린(파수딜 또는 HA1077, Cayman Chemical), 및 (S)-(+)-2-메틸 1-[(4-메틸-5-아이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사하이드로-1H-1,4-다이아제핀 다이하이드로클로라이드(H-1 152, Tocris Bioschience) 중에서 선택된다. 상기 Rho-키나제 억제제, 예를 들어 Y-27632를 바람직하게는 상기 줄기세포 배양의 처음 7일 동안 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가한다. Rock 억제제를 바람직하게는 단일 세포 시딩 후 또는 분할 후 배양의 처음 수일간, 예를 들어 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일간 상기 배지에 포함시킨다. 상기 Rock 억제제의 임의의 적합한 농도, 예를 들어 1 내지 200 uM, 1 내지 100 uM, 5 내지 50 uM 또는 대략 10 uM을 사용할 수 있다. Y27632의 바람직한 농도는 10 uM이다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 줄기세포를 배양하는 방법 및/또는 오르가노이드를 수득하는 방법을 제공하며, 여기에서 Rock 억제제를 상기 배양 배지에 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일간, 임의로 이틀마다 가한다. 일부의 실시태양에서, 상기 Rock 억제제를 처음 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 후에 상기 배양 배지에 가하지 않는다.
Rock 억제제의 첨가는 단일 줄기세포의 배양시(상기 언급한 바와 같이), 즉 오르가노이드에 대한 출발 물질이 단일 줄기세포인 경우 특히 중요하다. 따라서, 일부의 실시태양에서 본 발명은 줄기세포, 임의로 단일 줄기세포를 배양함을 포함하고, Rock 억제제를 상기 배양 배지에 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일간, 임의로 이틀마다 가하고, 임의로 상기 Rock 억제제를 상기 배양 배지에 처음 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 후에 가하지 않는, 오르가노이드의 수득 방법을 제공한다.
다수의 세포를 배양하는 경우, 예를 들어 오르가노이드에 대한 출발 물질이 조직 단편인 경우 상기 Rock 억제제는 덜 중요하며, 때때로 필요하지 않다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 줄기세포, 임의로 조직 단편을 배양함을 포함하고, Rock 억제제를 상기 배양 배지에 전혀 가하지 않거나 또는 처음 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 후에 가하지 않는, 오르가노이드의 수득 방법을 제공한다.
상기 세포를 다수의 배양물로 분할한 후에, Rock 억제제를 동일한 방식으로(이는 상기 분할 후, 특히 상기 분할이 처음 배양물로부터 단일 줄기세포를 취하여 이를 두 번째 배양물에 넣음을 수반하는 경우 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안, 임의로 이틀마다를 의미한다) 가할 수 있다. 상기 분할이 상기 처음 배양물로부터 다수의 줄기세포를 취하고 이를 두 번째 배양물에 넣음을 수반하는 경우, Rock 억제제의 첨가는 덜 중요하며 때때로 필요하지 않다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 상기 오르가노이드의 수득 방법 또는 줄기세포의 배양 방법이 분할을 수반하는 경우, 임의로 단일 세포가 상기 분할에 포함되는 경우, Rock 억제제를 상기 분할 후, 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안, 임의로 이틀마다 새로운 배양 배지에 가한다. 일부의 실시태양에서, 상기 오르가노이드의 수득 방법 또는 줄기세포의 배양 방법이 분할을 수반하는 경우, 임의로 다수의 세포가 상기 분할에 포함되는 경우, 상기 배양 배지에 전혀 첨가하지 않거나 또는 처음 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 후에 첨가하지 않는다.
더욱 추가의 실시태양에서, 본 발명에 따른 방법은 노치 작용물질을 추가로 포함하는 배양 배지를 포함한다. 노치 신호전달은 세포운명 결정뿐만 아니라 세포 생존 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 노치 수용체 단백질은 다수의 표면-결합된 또는 분비된 리간드, 예를 들어 비제한적으로 델타 1, 지그재그 1 및 2, 및 델타-유사 1, 델타-유사 3, 델타-유사 4와 상호작용할 수 있다. 리간드 결합 시, 노치 수용체는 ADAM 프로테아제 과의 구성원을 포함하는 일련의 절단 사건 뿐만 아니라 감마 세크레타제 프레세닐린에 의해 조절되는 막내 절단에 의해 활성화된다. 상기 결과는 노치의 세포내 도메인의 핵(여기에서 하류 유전자를 전사에 의해 활성화한다)으로의 역위이다. 바람직한 노치 작용물질은 지그재그 1 및 델타 1, 및 그의 활성 단편 또는 유도체 중에서 선택된다. 가장 바람직한 노치 작용물질은 서열 CDDYYYGFGCNKFCRPR을 갖는 DSL 펩타이드(문헌[Dontu et al., 2004. Breast Cancer Res 6. R605-R615])이다. 상기 DSL 펩타이드를 바람직하게는 10 μM 내지 100 nM 또는 10 μM 이상 100 nM 이하의 농도로 사용한다. 노치 작용물질의 첨가는, 특히 배양 첫 주 동안, 2 내지 3의 인자까지 배양 효율을 증가시킨다.
상기 노치 작용물질을 바람직하게는 상기 배양 배지에 상기 줄기세포 배양의 처음 7일 동안 이틀마다 가한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 노치 작용물질을 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안, 임의로 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가하는 줄기세포 배양 방법 및/또는 오르가노이드 수득 방법을 제공한다. 일부의 실시태양에서, 상기 노치 작용물질을 상기 배양 배지에 처음 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 후에 첨가하지 않는다.
노치 작용물질은 세포에서 노치 활성을, 상기 물질 부재 하의 노치 활성 수준에 비해, 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상까지 자극하는 분자로서 정의된다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, 노치 활성을, 예를 들어 개시된 바와 같이(문헌[Hsieh et al, 1996 Mol Cell. Biol. 16, 952-959]) 4xwtCBF1-루시페라제 리포터 구조물에 의해 상기 노치의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에 감마-세크레타제 억제제, 예를 들어 DAPT 또는 DBZ를 보충한다. 감마-세크레타제 억제제는 분화 중에 세포 운명 결정에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 감마-세크레타제 억제제는 분비 세포, 예를 들어 배상세포를 향한 세포 운명에 영향을 미칠 수 있다. 상기 감마-세크레타제 억제제의 임의의 적합한 농도, 예를 들어 1 nM 내지 10 uM, 1 nM 내지 1 uM, 1 내지 100 nM, 또는 바람직하게는 1 내지 20 uM을 사용할 수 있다. 예를 들어, 감마-세크레타제 억제제를 상기 배양 배지에 대략 1 nM의 최종 농도로 가할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에 가스트린(또는 적합한 대안, 예를 들어 Leu15-가스트린)을 보충한다. 가스트린(또는 적합한 대안)을 상기 배양 배지에 1 nM 내지 10 uM, 1 nM 내지 1 uM, 5 내지 100 nM, 또는 바람직하게는 10 내지 50 nM의 최종 농도로 가할 수 있다. 예를 들어, Leu15-가스트린을 상기 배양 배지에 대략 10 nM의 최종 농도로 가할 수 있다. 가스트린은 본 발명의 일부 배양 배지에 필요하지 않다. 따라서, 일부의 실시태양에서 본 발명의 배양 배지는 가스트린을 포함하지 않는다. 특히, 가스트린은 장 줄기세포의 배양 또는 장(소낭-융모 또는 결장 소낭) 오르가노이드의 수득에 필요하지 않다. 그러나, 가스트린이 필요하지 않는 경우에조차도 부정적인 영향 없이 배양 배지에 여전히 첨가할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지에 니코틴아미드를 보충한다. 니코틴아미드의 첨가는 인간 결장 오르가노이드의 배양 효율 및 수명을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 니코틴아미드를 상기 배양 배지에 1 내지 100 mM, 5 내지 50 mM, 또는 바람직하게는 5 내지 20 mM의 최종 농도로 가할 수 있다. 예를 들어, 니코틴아미드를 상기 배양 배지에 대략 10 mM의 최종 농도로 가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 배양 배지에 니코틴아미드 및 가스트린(또는 적합한 대안, 예를 들어 Leu15-가스트린)을 보충하며, 여기에서 니코틴아미드 및 가스트린을 상기 배양 배지에 상술한 농도들 중 임의의 농도로 가한다.
일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지에 프로스타글란딘 신호전달 경로의 활성제를 보충한다(도 24 참조, 알러지성 질병을 치료하기 위한 접근법으로서 프로스타글란딘 D2 수용체 DP1 및 CRTH2의 길항작용. 문헌[Roy Pettipher, Trevor T. Hansel & Richard Armer Nature Reviews Drug Discovery 6, 313-325 (April 2007)]. 예를 들어, 상기 배양 배지에 인지질, 아라키돈산(AA), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2), 프로스타글란딘 D2(PGD2)를 포함하는 목록 중에서 선택된 화합물 중 임의의 하나 이상을 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지에 PGE2 및/또는 AA를 보충한다. 일부의 실시태양에서, PGE2를 상기 배지에 10 nM 이상, 예를 들어 20 nM 이상, 30 nM 이상, 40 nM 이상, 45 nM 이상, 10 nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 400 nM, 10 nM 내지 300 nM, 10 nM 내지 200 nM, 10 nM 내지 100 nM, 20 nM 내지 50 nM의 최종 농도로 가한다. 바람직한 실시태양에서, PGE2를 50 nM의 최종 농도로 상기 배지에 가한다. 일부의 실시태양에서, AA를 상기 배지에 1 ug/㎖ 이상, 5 ug/㎖ 이상, 8 ug/㎖ 이상, 9 ug/㎖ 이상, 10 ug/㎖ 이상, 예를 들어 1 ug/㎖ 내지 1000 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 500 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 100 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 50 ug/㎖, 또는 5 ug/㎖ 내지 20 ug/㎖의 최종 농도로 가한다. 바람직한 실시태양에서, AA를 상기 배지에 10 ug/㎖의 최종 농도로 가한다. AA 및 PGE2는 본 발명의 배양 배지와 관련하여 호환 가능하다. 따라서, 본 발명에 개시된 배양 배지가 PGE2를 포함한다고 하는 경우, 이는 PGE2 대신에 AA(적합한 농도에서)를 대신으로 포함할 수도 있다. 환원하면, 본 발명에 개시된 배양 배지가 AA를 포함한다고 하면, 이는 AA 대신에 PGE2(적합한 농도에서)를 대신으로 포함할 수 있다. 더욱 또한, 숙련가는 PGE2 및/또는 AA가 본 발명의 배양 배지에 포함되는 경우, 상기 배양 배지는 PGE2 및/또는 AA 대신에 또는 이에 더하여 인지질, 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2), 및 프로스타글란딘 D2(PGD2) 중에서 선택된 화합물들 중 임의의 하나 이상을 대신 포함할 수 있음을 알 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지에 RANK 리간드(또한 본 발명에서 RANKL이라 칭한다)를 보충한다. RANK 리간드는 특정 세포 운명을 향해 분화를 지시하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, RANK 리간드가 소장 세포용 배양 배지, 바람직하게는 소장 세포 분화용 배지에 포함되는 경우, 상기 리간드는 M 세포로 분화되는 세포의 비율을 더 크게 한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 RANKL을 포함하는 배양 배지를 제공한다. 특히, 본 발명은 소장 세포의 배양, 바람직하게는 분화용 배양 배지를 제공하며, 여기에서 상기 배양 배지는 RANKL을 포함한다. 상기 RANKL의 임의의 적합한 농도, 예를 들어 10 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖, 10 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 또는 50 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖을 사용할 수 있다. 예를 들어, RANKL을 상기 배양 배지에 대략 100 ng/㎖의 최종 농도로 가할 수 있다.
EGF, 노긴 및 R-스폰딘을 포함하는 배양 배지를 본 발명에서 "ENR 배지"라 칭한다. 상기 ENR 배지 및 Wnt 작용물질, 예를 들어 Wnt-3a를 포함하는 배양 배지를 본 발명에서 "WENR 배지"라 칭한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 배양 배지는 WENR 배지를 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 배양 배지는 가스트린 및/또는 니코틴아미드가 보충된 WENR 배지(즉 WENRg 또는 WENR+니코틴아미드 또는 WENRg+니코틴아미드)를 포함한다.
상기 배지의 pH는 약 7.0 내지 7.8의 범위, 약 7.2 내지 7.6의 범위, 또는 약 7.4일 수 있다. 상기 pH를 완충제를 사용하여 유지시킬 수 있다. 적합한 완충제를 숙련가에 의해 쉽게 선택할 수 있다. 사용될 수 있는 완충제는 카보네이트 완충제(예를 들어 NaHCO3), 및 포스페이트(예를 들어 NaH2PO4)를 포함한다. 이들 완충제를 일반적으로는 약 50 내지 약 500 ㎎/ℓ로 사용한다. 다른 완충제, 예를 들어 N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산](HEPES) 및 3-[N-모폴리노]-프로판설폰산(MOPS)을 또한, 통상적으로 대략 1000 내지 대략 10,000 ㎎/ℓ로 사용할 수 있다. 배양 배지는 pH 지시약, 예를 들어 페놀 레드를 포함하여, 상기 배지의 pH 상태를 쉽게 모니터할 수 있다(예를 들어 약 5 내지 약 50 ㎎/ℓ).
본 발명에 사용하기 위한 배양 배지는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 숙련가는 줄기세포 배양 배지에 사용하기에 적합한 아미노산의 유형 및 양을 안다. 존재할 수 있는 아미노산은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파트산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-쓰레오닌, L-트립토판, L-타이로신, L-발린 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 배양 배지는 이들 아미노산 중 전부를 함유할 것이다. 일반적으로, 각각의 아미노산(존재하는 경우)은 배지의 ℓ당 약 0.001 내지 약 1 g(대개는 약 0.01 내지 약 0.15 g/ℓ)으로 존재하나, 단 L-글루타민은 약 0.05 내지 약 1 g/ℓ(대개는 약 0.1 내지 약 0.75 g/ℓ)로 존재한다. 상기 아미노산들은 합성 기원일 수도 있다.
본 발명에 사용하기 위한 배양 배지는 하나 이상의 비타민을 포함할 수 있다. 숙련가는 줄기세포 배양 배지에 사용하기에 적합한 비타민의 유형 및 양을 안다. 존재할 수 있는 비타민은 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민 B2), 니아신(비타민 B3), D-칼슘 판토테네이트(비타민 B5), 피리독살/피리독사민/피리독신(비타민 B6), 폴산(비타민 B9), 시아노코발아민(비타민 B12), 아스코르브산(비타민 C), 칼시페롤(비타민 D2), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 비오틴(비타민 H), 및 메나디온(비타민 K)을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 배양 배지는 하나 이상의 무기염을 포함할 수 있다. 숙련가는 줄기세포 배양 배지에 사용하기에 적합한 무기염의 유형 및 양을 안다. 무기염은 전형적으로는 세포의 삼투압 균형의 유지를 돕고 막 전위의 조절을 돕기 위해서 배양 배지 중에 포함된다. 존재할 수 있는 무기염은 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연의 염을 포함한다. 상기 염은 통상적으로 클로라이드, 포스페이트, 설페이트, 나이트레이트 및 바이카보네이트의 형태로 사용된다. 사용될 수 있는 구체적인 염은 CaCl2, CuSO4-5H2O, Fe(NO3)-9H2O, FeSO4-7H2O, MgCl, MgSO4, KCl, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4, Na2HPO4-H2O 및 ZnSO4-7H2O을 포함한다.
상기 배지의 삼투압 농도는 약 200 내지 약 400 mOsm/㎏의 범위, 약 290 내지 약 350 mOsm/㎏의 범위, 또는 약 280 내지 약 310 mOsm/㎏의 범위일 수 있다. 상기 배지의 삼투압 농도는 약 300 mOsm/㎏ 미만(예를 들어 약 280 mOsm/㎏)일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 배양 배지는 탄소 에너지원을 하나 이상의 당의 형태로 포함할 수 있다. 숙련가는 줄기세포 배양 배지에 사용하기에 적합한 당의 유형 및 양을 안다. 존재할 수 있는 당은 글루코스, 갈락토스, 말토오스 및 프럭토스를 포함한다. 상기 당은 바람직하게는 글루코스, 특히 D-글루코스(덱스트로스)이다. 탄소 에너지원은 통상적으로 약 1 내지 약 10 g/ℓ로 존재할 것이다.
본 발명의 배양 배지는 혈청을 함유할 수 있다. 임의의 적합한 공급원으로부터 수득된 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청(FBS), 염소 혈청 또는 인간 혈청을 사용할 수 있다. 바람직하게는 인간 혈청이 사용된다. 혈청을 통상적인 기법에 따라 상기 배지의 약 1 내지 약 30 부피%로 사용할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 다양한 상이한 혈청 대체물 제형을 상업적으로 입수할 수 있으며 이는 숙련가에게 공지되어 있다. 혈청 대체물을 사용하는 경우, 상기를 통상적인 기법에 따라 배지 부피의 약 1% 내지 약 30%로 사용할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지는 혈청이 없고/없거나 혈청 대체물이 없을 수 있다. 무혈청 배지는 어떠한 유형의 동물 혈청도 함유하지 않는 것이다. 무혈청 배지는 줄기세포의 가능한 이종-오염을 피하기에 바람직할 수 있다. 혈청 대체물이 없는 배지는 임의의 상업적인 혈청 대체 제형이 보충되지 않은 것이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에 정제된, 천연, 반-합성 및/또는 합성 성장 인자를 보충하며 상기 배지는 확실하지 않은 성분, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청은 포함하지 않는다. 예를 들어, B27(Invitrogen), N-아세틸시스테인(Sigma) 및 N2(Invitrogen)와 같은 보충제는 일부 세포의 증식을 자극한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에 이들 보충제 중 하나 이상, 예를 들어 이들 보충제 중 임의의 2 개 또는 3 개 전부를 보충한다.
다른 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에 엑센딘(Exendin)-4를 보충한다. 엑센딘-4, 39 아미노산 펩타이드는 GLP-1(글루카곤-유사 펩타이드-1) 수용체를 활성화하여 췌장 샘꽈리 세포 중의 세포내 cAMP를 증가시키며, VIP(혈관활성 장 펩타이드)에는 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 사용하기 위한 배양 배지는 하나 이상의 미량 원소, 예를 들어 바륨, 브로뮴, 코발트, 요오드, 망간, 크로뮴, 구리, 니켈, 셀레늄, 바나듐, 티타늄, 게르마늄, 몰리브데늄, 규소, 철, 불소, 은, 루비듐, 주석, 지르코늄, 카드뮴, 아연 및/또는 알루미늄의 이온을 포함할 수 있다.
상기 배지는 환원제, 예를 들어 베타-머캅토에탄올을 약 0.1 mM의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 하나 이상의 추가적인 작용제, 예를 들어 줄기세포 배양을 개선시키는 것으로 앞서 보고된 영양소 또는 성장 인자, 예를 들어 콜레스테롤/트랜스페린/알부민/인슐린/프로제스테론, 푸트레신, 셀레나이트/다른 인자들을 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지를 세포외 기질(ECM) 내로 확산시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 단리된 조직 단편 또는 단리된 상피 줄기세포를 ECM에 부착시킨다. ECM은 다양한 폴리사카라이드, 물, 엘라스틴 및 당단백질로 구성되며, 여기에서 상기 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴 및 라미닌을 포함한다. ECM은 결합 조직 세포에 의해 분비된다. 상이한 유형의 당단백질 및/또는 상이한 당단백질들의 조합을 포함하는 상이한 조성을 포함하는 ECM의 상이한 유형들이 공지되어 있다. 상기 ECM은 ECM-생산 세포, 예를 들어 섬유아세포를 용기 중에서, 상기 세포의 제거 및 단리된 조직 단편 또는 단리된 상피 줄기세포의 첨가 전에 배양함으로써 제공될 수 있다. 세포외 기질-생산 세포의 예는 연골세포(주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생산한다), 섬유아세포(주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 생산한다) 및 결장 근섬유아세포(주로 콜라겐(I, III 및 V 유형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 테나신-C를 생산한다)이다. 한편으로, 상기 ECM은 상업적으로 제공된다. 상업적으로 입수할 수 있는 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(Invitrogen) 및 엥겔브레트-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 제제(예를 들어 매트리젤(Matrigel)(상표)(BD Biosciences))이다. 합성 세포외 기질 물질, 예를 들어 프로넥틴(ProNectin)(Sigma Z378666)을 사용할 수도 있다. 세포외 기질 물질들의 혼합물을 경우에 따라 사용할 수 있다. 줄기세포 배양용 ECM의 사용은 상기 줄기세포의 장기간 생존 및 미분화된 줄기세포의 계속된 존재를 증대시킨다. ECM의 부재 하에서, 줄기세포 배양물은 보다 오랜 기간 동안 배양될 수 없었으며 미분화된 줄기세포의 계속된 존재가 관찰되지 않았다. 또한, ECM의 존재는 3차원 조직 오르가노이드(이는 ECM의 부재 하에서는 배양될 수 없었다)의 배양을 허용하였다. 상기 세포외 기질 물질은 통상적으로 세포가 현탁되는 접시의 바닥 상에 한 방울일 것이다. 전형적으로, 상기 기질이 37 ℃에서 고형화되는 경우, 상기 배지를 첨가하고 상기 배지가 ECM에 확산된다. 상기 배지 중의 세포들은 ECM의 표면 구조와의 상호작용, 예를 들어 인테그린과의 상호작용에 의해 상기 ECM에 들러붙는다. 대략 1 ㎍/㎠, 또는 약 1 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/㎠, 또는 약 1 ㎍/㎠ 내지 약 150 ㎍/㎠로 사용된 약 1 ㎎/㎖의 피브로넥틴 용액(모액)을 사용하여 세포 배양 용기를 코팅할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 세포 배양 용기를 8 ㎍/㎠ 내지 125 ㎍/㎠의 피브로넥틴으로 코팅한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 ECM의 예는 하나 이상의 당단백질, 예를 들어 라미닌을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 ECM은 2 개 이상의 별개의 당단백질, 예를 들어 2 개의 상이한 유형의 콜라겐 또는 콜라겐과 라미닌을 포함한다. 상기 ECM은 합성 하이드로젤 세포외 기질 또는 천연 ECM일 수 있다. 추가의 바람직한 ECM은 매트리젤(상표)(BD Biosciences)에 의해 제공되며, 이는 라미닌, 엔탁틴 및 콜라겐 IV를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 세포외 기질은 라미닌-함유 세포외 기질, 예를 들어 매트리젤(상표)(BD Biosciences)이다.
일부의 실시태양에서, 단일 줄기세포, 세포들의 집단 또는 조직 단편을, 임의로 성장 인자 감소되고/되거나 페놀레드가 없는 매트리젤 중에 매몰시킨다.
일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지를 ECM의 상부에 놓는다. 이어서 상기 배양 배지를 제거하고 필요에 따라 보충한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지를 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 보충한다. 성분들을 "첨가"하거나 또는 상기 배지로부터 "제거"하는 경우, 이는 일부 실시태양에서 상기 배지 자체가 상기 ECM으로부터 제거되고 이어서 상기 "첨가된" 성분을 함유하거나 또는 "제거된" 성분이 제외된 새로운 배지를 상기 ECM 상에 놓음을 의미한다.
일부의 실시태양에서 본 발명의 배양 배지를 세포외 기질, 또는 세포막 단백질, 예를 들어 인테그린과의 상호작용에 의해 상기 세포외 기질을 모방하는 3D 기질과 접촉시킨다.
일부의 실시태양에서, 상기 기본 배양 배지는 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 글루타맥스, 1xN2, 1xB27(모두 Invitrogen으로부터) 및 1 mM N-아세틸시스테인(Sigma)이 보충된 어드밴스드(Advanced) DMEM/F12를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
본 발명의 배양 배지의 예
하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 ALK5에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 TGF-베타 억제제 및 p38에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 p38 억제제를 포함한다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서 상기 세포 배양 배지는 A83-01 및/또는 SB202190, 바람직하게는 A83-01+SB202190을 포함한다. 본 발명의 배양 배지에 A83-01+SB202190을 함께 사용하는 것은 놀랍게도 인간 결장 오르가노이드의 계대 수를 상승적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 WENR+A83-01+SB202190을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 WENR+A83-01+SB202190+니코틴아미드를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 WENRg+니코틴아미드+A83-01+SB202190(여기에서 "g"는 가스트린이다)을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 WENR+A83-01+니코틴아미드+FGF10을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 WENRg+A83-01+니코틴아미드+FGF10을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 WENRg+A83-01+니코틴아미드+FGF10+SB202190을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지를 결장 오르가노이드의 수득에 사용한다. 본 실시태양에 개시된 바와 같은 세포 배양 배지를 사용하여 상피 세포를 배양함으로써 수득할 수 있는 결장 오르가노이드를 또한 제공한다.
예를 들어, 하나의 실시태양에서 상기 세포 배양 배지는 WENRg+A83-01+FGF10을 포함하며, 여기에서 Wnt 작용물질은 R-스폰딘이나 다른 Wnt 작용물질은 존재하지 않고 니코틴아미드도 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 EGF(예를 들어 50 ng/㎖), R-스폰딘(예를 들어 10% 또는 1 ug/㎖), 노긴(예를 들어 100 ng/㎖), FGF10(예를 들어 100 ng/㎖), A8301(예를 들어 500 nM) 및 가스트린(예를 들어 10 uM) 및 임의로 SB202190을 포함한다. 이들 성분을 기본 배지, 예를 들어 DMEM/F12 배지에 첨가할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 기본 배지에 P/S, 글루타맥스, 10 mmM Hepes, B27, N2 및 N-아세틸시스테인을 포함하는 목록으로부터 선택된 성분들 중 임의의 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 개) 또는 전부를 추가로 보충한다. 상기와 같은 세포 배양 배지의 사용은 췌장 오르가노이드의 수득에 유용한 것으로 밝혀졌다. 상피 세포를 본 실시태양에 개시된 바와 같은 세포 배양 배지를 사용하여 배양함으로써 수득한 췌장 오르가노이드를 또한 제공한다. 일부 실시태양에서, 가스트린 또는 니코틴아미드 또는 가스트린 및 니코틴아미드는 상기 배양 배지로부터 제외된다.
본 발명의 조직-특이성 배양 배지
특히 바람직한 배양 배지를 본 발명의 실시예에 개시한다. 본 발명의 배양 배지는 상이한 조직들, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 조직들에 사용하기에 적합할 수 있다.
장 배양 배지
일부의 실시태양에서, 소장 소낭, 예를 들어 쥐 소장 소낭용 배양 배지는 EGF, 예를 들어 쥐 EGF; BMP 억제제, 예를 들어 쥐 노긴; 및 R스폰딘, 예를 들어 인간 R스폰딘-1 또는 4를 추가로 포함하는, 예를 들어 상술한 바와 같은 기본 배지를 포함하거나 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01) 및/또는 p38 억제제(예를 들어 SB202190)를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 결장 소낭, 예를 들어 쥐 결장 소낭용 배양 배지는 Wnt 작용물질, 예를 들어 재조합 인간 Wnt-3A 또는 Wnt-3A 처리된 배지; EGF, 예를 들어 쥐 EGF; BMP 억제제, 예를 들어 쥐 노긴; 및 R스폰딘, 예를 들어 인간 R스폰딘-1 또는 4를 추가로 포함하는, 예를 들어 상술한 바와 같은 기본 배지를 포함하거나 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01) 및/또는 p38 억제제(예를 들어 SB202190)를 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 인간 장 줄기세포, 인간 소장 소낭 또는 인간 결장 소낭용 배양 배지(또한 HISC 배양 배지로서 공지됨)는 Wnt 작용물질, 예를 들어 재조합 인간 Wnt-3A 또는 Wnt-3A 처리된 배지; EGF; BMP 억제제, 예를 들어 노긴; R스폰딘, 예를 들어 인간 R스폰딘-1; TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01; p38 억제제, 예를 들어 SB202190; 가스트린; 및 니코틴아미드를 추가로 포함하는, 예를 들어 상술한 바와 같은 기본 배지를 포함하거나 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 상기 p38 억제제 및/또는 가스트린은 상기 HISC 배양 배지로부터 제외될 수 있다.
일부의 실시태양에서 본 발명은 기본 배지, Wnt-3a, EGF, 노긴, R스폰딘 1-4 중 어느 하나, TGF-베타 억제제, 니코틴아미드, 및 바람직하게는 p38 억제제를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 장 세포 배양용 배양 배지를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 소장 또는 결장 줄기세포, 예를 들어 인간 소장 또는 결장 세포 확대용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM) 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), Wnt3A(임의로 처리된 배지), R스폰딘 1-4 중 어느 하나(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(바람직하게는 50 내지 100 ug/㎖), 니코틴아미드(바람직하게는 10 mM), EGF(바람직하게는 10 내지 50 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 10 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 500 nM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 p38 억제제, 예를 들어 SB202190(바람직하게는 100 nM)을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 Rock 억제제, 예를 들어 LY2157299를 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, EGF, 노긴, TGF-베타 억제제 및 p38 억제제를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 장세포 분화용 배양 배지를 제공한다.
일부 실시태양에서, 소장 또는 결장 줄기세포, 예를 들어 인간 소장 또는 결장 세포 분화용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM) 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), 노긴(바람직하게는 50 내지 100 ug/㎖), EGF(바람직하게는 10 내지 50 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 10 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 500 nM) 및 p38 억제제, 예를 들어 SB202190(바람직하게는 100 nM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 가스트린을 상기 분화 배지로부터 제외시킬 수 있다. 일부의 실시태양에서, 감마-세크레타제 억제제를 상기 분화 배지에 가할 수도 있다(바람직하게는 1 uM의 농도로). 감마-세크레타제 억제제는 분화 중에, 예를 들어 분비 세포, 예를 들어 배상세포를 향한 세포운명 결정에 영향을 미칠 수 있다. 일부의 실시태양에서, RANKL을 상기 분화 배지에 가할 수도 있다(예를 들어 100 ng/㎖의 농도로). RANKL은 분화 중에, 예를 들어 M-세포를 향한 세포운명 결정에 영향을 미칠 수 있다.
암 배양 배지
일부의 실시태양에서, 결장암 세포용 배양 배지는 Wnt 작용물질, 예를 들어 재조합 인간 Wnt-3A 또는 Wnt-3A 처리된 배지; EGF; BMP 억제제, 예를 들어 노긴; R스폰딘, 예를 들어 인간 R스폰딘-1; TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01; p38 억제제, 예를 들어 SB202190; 가스트린; 및 니코틴아미드를 추가로 포함하는, 예를 들어 상술한 바와 같은 기본 배지를 포함하거나 상기로 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 상기 결장 암종, 예를 들어 인간 결장 암종용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 프리모신 및/또는 P/S(항생제)(500x) 및 hepes를 포함한다), R스폰딘(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(바람직하게는 100 ng/㎖), 니코틴아미드(바람직하게는 10 mM), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 50 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 500 nM), p38 억제제, 예를 들어 SB202190(바람직하게는 10 uM), 임의로 PGE2(바람직하게는 10 nM) 및/또는 Rock 억제제(바람직하게는 10 uM)를 포함한다.
일부의 실시태양에서, 결장암 세포를 또한 상기 HISC 배양 배지에서 증식시킬 수 있다. 일부의 실시태양에서, 결장암 세포를, 하기 중 하나 이상 또는 전부가 상기 배지로부터 제외된 HISC 배양 배지에서 배양할 수 있다: EGF, 노긴, R스폰딘, TGF-베타 억제제 및 p38 억제제. 암세포는 몇몇 성장 경로를 구성적으로 활성화하거나 탈활성화하는 돌연변이를 가질 수도 있다. 예를 들어, 다수의 결장암은 상기 Wnt 경로의 구성적인 활성화를 생성시킨다. 상기와 같은 경우에, 배양 배지는 Wnt 작용물질을 필요로하지 않을 것이다. 다른 돌연변이들은 다른 인자들을 상술한 바와 같은 배지로부터 제외되도록 할 것이다. 다른 상피 암(암종)을 또한 본 발명의 배양 배지에서 증식시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 암 줄기세포로부터 수득된 암 오르가노이드를 정상적인 줄기세포로부터 수득한 상응하는 정상 조직 오르가노이드의 성장에 적합한 배양 배지에서, 상기 배지로부터 제외된 몇몇 인자들과 함께 증식시킨다. 예를 들어, 위암 줄기세포를 배양함으로써 수득한 위암 오르가노이드를, 위 줄기세포를 배양함으로써 수득한 정상적인 위 오르가노이드와 동일한 배양 조건에서 임의로 상기 배지로부터 제외된 몇몇 인자와 함께 증식시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 췌장암 줄기세포를 배양함으로써 수득한 췌장암 오르가노이드를, 췌장 줄기세포를 배양함으로써 수득한 정상적인 췌장 오르가노이드와 동일한 배양 조건에서 임의로 상기 배지로부터 제외된 몇몇 인자와 함께 증식시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 전립선암 줄기세포를 배양함으로써 수득한 전립선암 오르가노이드를, 전립선 줄기세포를 배양함으로써 수득한 정상적인 전립선 오르가노이드와 동일한 배양 조건에서 임의로 상기 배지로부터 제외된 몇몇 인자와 함께 증식시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 간암 줄기세포를 배양함으로써 수득한 간암 오르가노이드를, 간 줄기세포를 배양함으로써 수득한 정상적인 간 오르가노이드와 동일한 배양 조건에서 임의로 상기 배지로부터 제외된 몇몇 인자와 함께 증식시킬 수 있다. 다수의 상황들에서 정상적인 조직 배지(임의의 제외된 인자 없이)에서 암 오르가노이드를 증식시키는 것이 바람직할 수 있다(또는 적어도 보다 편리할 수 있다). 상기 정상 조직 배지는 모든 유전학적 배경과 함께 암을 임의의 특정한 암 돌연변이의 제외 없이 증식시킬 수 있어야 한다.
따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 관심 조직 유형으로부터 암세포, 예를 들어 암 줄기세포, 예를 들어 선암종 또는 암종 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 제공하며, 여기에서 상기 배양 배지는 관심의 상응하는 비-암성 조직 유형으로부터의 세포를 배양하기 위해 사용되는 배양 배지의 성분들을 포함하거나 또는 상기로 이루어지며, 임의로 하기 중 하나 이상이 상기 관심 조직 유형의 비-암성 세포를 배양하는데 사용되는 배지로부터 제외된다: Wnt-3a, EGF, 노긴, R스폰딘, TGF-베타 억제제, p38 억제제, 니코틴아미드, 가스트린, FGF10 및 HGF.
선종 배양 배지
일부의 실시태양에서, 장 선종, 예를 들어 쥐 장 선종용 배양 배지는 EGF, 예를 들어 쥐 EGF를 추가로 포함하는, 예를 들어 상술한 바와 같은 기본 배지를 포함한다.
위 배양 배지
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, Wnt-3a, EGF, 노긴, R스폰딘 1-4 중 어느 하나, TGF-베타 억제제, 가스트린, 니코틴아미드, FGF-10, 및 바람직하게는 p38 억제제를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 위 세포 배양용 배양 배지를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 상기 위 줄기세포, 예를 들어 인간 위 줄기세포용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 프리모신 및/또는 P/S(항생제)(500x) 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), R스폰딘 1-4 중 어느 하나(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 100 ng/㎖), Wnt3A(임의로 처리된 배지), 니코틴아미드(바람직하게는 5 mM), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 200 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 1 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 2 uM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 상기 위 줄기세포용 배양 배지는 p38 억제제, 예를 들어 SB202190(바람직하게는 10 nM)을 임의로 추가로 포함한다. 상기 위 줄기세포용 배양 배지는 PGE2(바람직하게는 500 nM)를 임의로 추가로 포함한다. 상기 위 줄기세포용 배양 배지는 Rock 억제제(바람직하게는 10 uM)을 임의로 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 상기 위 줄기세포, 예를 들어 쥐 위 세포용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 프리모신 및/또는 P/S(항생제)(500x) 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), R스폰딘 1-4 중 어느 하나(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 100 ng/㎖), Wnt3A(임의로 처리된 배지), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 200 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 1 nM) 및 Rock 억제제(바람직하게는 10 uM)를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01) 및/또는 p38 억제제(예를 들어 SB202190)를 추가로 포함한다.
전립선 배양 배지
일부의 실시태양에서, 전립선 줄기세포 확대용 배양 배지는 테스토스테론, 임의로 다이하이드로테스토스테론(또한 본 발명에서 DHT라 칭한다)을 포함한다. 테스토스테론은 안드로겐 그룹으로부터의 스테로이드 호르몬이다. 인간에서, 테스토스테론의 큰 비율은 5α-환원을 겪어 보다 효능있는 안드로겐, 다이하이드로테스토스테론을 형성한다. 테스토스테론, 다이하이드로테스토스테론 또는 테스토스테론 모방물질(예를 들어 안드로겐 수용체에 결합하는 테스토스테론의 활성을 모방하는 분자)을 본 발명의 배양 배지에 첨가할 수 있다. 따라서, 테스토스테론이란 용어가 사용되는 경우에, 이는 다이하이드로테스토스테론 또는 테스토스테론 모방물질에 의해 항상 대체될 수 있다. 발명자들은 테스토스테론을 전립선 줄기세포용 배양 배지에 첨가하면 분화가 증가하지만 상기 줄기세포 집단의 확대도 계속됨을 입증하였다(예를 들어 도 41 내지 45 참조). 이는 문헌이 테스토스테론이 증식을 억제하고 종결 분화를 유지하는 작용을 함으로써 세포의 분화에 중요한 역할을 한다고 교시하고 있기 때문에 매우 놀라운 것이다(문헌[Mirochnik et al. PLoS One, 7(3), e31052, 2012]; 문헌[Niu et al. Oncogene 29, 3593-3604, 2010]). 숙련가는 테스토스테론을 전립선용 배양 배지에 첨가하면 추가적인 확대 가능성 없이 완전히 분화된 오르가노이드가 생성됨을 예상할 수 있을 것이다. 이는 결장, 췌장 및 간 오르가노이드가 분화 배지에서 분화되는 경우에 관찰되는 것과 유사할 것이다. 그러나, 대조적으로, 본 발명자들은 테스토스테론이 분화를 증가시키지만, 이는 또한 줄기세포 확대가 계속될 것을 허용함을 발견하였다. 따라서, 테스토스테론을 포함하는 배양 배지에서 증식된 오르가노이드는 놀랍게도 줄기세포 및 분화된 세포, 즉 관강 세포 및 기저 세포를 포함한다.
일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드를 수득하기 위한 배양 배지는 기본 배지 및 테스토스테론, 임의로 다이하이드로테스토스테론 및 R스폰딘 1-4 또는 R스폰딘 모방물질을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 BMP 억제제, 예를 들어 노긴을 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 타이로신 수용체 키나제 리간드를 추가로 포함하며, 임의로 여기에서 상기 타이로신 수용체 키나제 리간드는 분열촉진성 성장 인자, 예를 들어 EGF, FGF, KGF 또는 HGF이다. 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드를 수득하기 위한 배양 배지는 EGF, 노긴, R스폰딘 1-4 중 어느 하나 및 테스토스테론을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 전립선 세포용 배양 배지는 TGF-베타 억제제를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 세포용 배양 배지는 EGF, 노긴, R스폰딘 1-4 중 어느 하나, TGF-베타 억제제 및 테스토스테론을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 세포용 배양 배지는 p38 억제제를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드를 수득하기 위한 배양 배지는 본 발명의 억제제, 예를 들어 TGF-베타 억제제 및/또는 p38 억제제를 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 전립선 줄기세포용 배양 배지는 테스토스테론을 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 기본 배지, EGF, 노긴 및 R스폰딘 1-4 중 어느 하나 및 임의로 TGF-베타 억제제를 포함하고, 테스토스테론은 포함하지 않는다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, EGF, R스폰딘 1-4 중 어느 하나, 노긴, 니코틴아미드, TGF-베타 억제제, 및 바람직하게는 Wnt-3a 및 FGF-10을 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 전립선 세포 배양용 배양 배지를 제공한다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 세포 배양용 배양 배지는 테스토스테론, 예를 들어 (다이하이드로)테스토스테론을 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 p38 억제제를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 세포, 예를 들어 마우스, 인간, 정상 또는 암종용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), R스폰딘 1-4 중 어느 하나(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 100 ng/㎖), 니코틴아미드(바람직하게는 10 mM), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 100 ng/㎖), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 500 nM), (다이하이드로)테스토스테론(바람직하게는 1 nM) 10 nM 및 임의로 Wnt-3a를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 Rock 억제제(바람직하게는 10 uM)를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 세포용 배양 배지는 p38 억제제, 예를 들어 SB202190을 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 마우스 전립선 세포를 배양하는 경우에, 상기 TGF-베타 억제제를 상기 배양 배지로부터 제외시킬 수 있다. 다른 실시태양에서 니코틴아미드, FGF10 및/또는 Rock 억제제를 상기 배양 배지로부터 제외시킬 수 있다.
췌장 배양 배지
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, R스폰딘 1-4 중 어느 하나, 노긴, EGF, FGF10, 가스트린, TGF-베타 억제제, 및 바람직하게는 엑센딘 4 및 Wnt-3a를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 췌장 세포 확대용 배양 배지를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 췌장 줄기세포, 예를 들어 인간 췌장 줄기세포 확대용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), R스폰딘 1-4 중 어느 하나(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 100 ng/㎖), 니코틴아미드(바람직하게는 10 mM), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 100 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 100 nM), 및 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 2 uM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 Wnt-3a를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 p38 억제제, 예를 들어 SB202190(바람직하게는 100 nM)을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 Rock 억제제, 예를 들어 LY2157299(바람직하게는 10 uM)를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 엑센딘 4(바람직하게는 50 ng/㎖)를 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 상기 췌장 줄기세포, 예를 들어 마우스 췌장 줄기세포 확대용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 프리모신 및/또는 P/S(항생제)(500x), Hepes 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), R스폰딘 1-4 중 어느 하나(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 1 ug/㎖), 노긴(임의로 처리된 배지)(바람직하게는 100 ng/㎖), 니코틴아미드(바람직하게는 10 mM), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 100 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 100 nM) 및 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 2 uM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 Rock 억제제, 예를 들어 LY2157299(바람직하게는 10 uM)를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 세포용 배양 배지는 p38 억제제, 예를 들어 SB202190을 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, 노긴, EGF, FGF10, 가스트린, TGF-베타 억제제, 감마-세트레타제 억제제 및 바람직하게는 엑센딘 4를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 췌장 세포 분화용 배양 배지를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 췌장 줄기세포, 예를 들어 인간 췌장 줄기세포 분화용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), 노긴(바람직하게는 100 ng/㎖), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 10 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 100 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 50 nM) 및 감마-세크레타제 억제제(DAPT/DBZ)(바람직하게는 10 uM)를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 엑센딘 4(바람직하게는 50 ng/㎖)를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 세포용 배양 배지는 p38 억제제, 예를 들어 SB202190을 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 췌장 줄기세포, 예를 들어 마우스 췌장 줄기세포 분화용 배양 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM), 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), 및 감마-세크레타제 억제제(예를 들어 DAPT/DBZ)(바람직하게는 10 uM)를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
바렛 식도 배양 배지
일부의 실시태양에서, 바렛 식도용 배양 배지는 Wnt 작용물질, 예를 들어 재조합 인간 Wnt-3A 또는 Wnt-3A 처리된 배지; EGF; BMP 억제제, 예를 들어 노긴; R스폰딘, 예를 들어 인간 R스폰딘-1; TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01; p38 억제제, 예를 들어 SB202190; 가스트린; 니코틴아미드; 및 EGF, 예를 들어 인간 FGF10(즉 HISC+FGF)를 추가로 포함하는, 예를 들어 상술한 바와 같은 기본 배지를 포함하거나 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 가스트린을 상기 배양 배지로부터 제외시킨다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 바렛 식도 오르가노이드의 수득 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 바렛 식도로부터 단리된 상피를, FGF10을 임의로 추가로 포함하는 HISC 배양 배지에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상 동안 배양하고; 상기 처음 1, 2, 3, 4일 이상 동안 니코틴아미드 및 SB202190을 회수함을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 노치 억제제, 예를 들어 DBZ를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, 노치 억제제의 존재 하에서 배양된 바렛 식도 오르가노이드는 증식하는 세포를 거의 또는 전혀 포함하지 않으며, 노치 억제제의 부재 하에서 배양된 오르가노이드에 비해 더 많은 배상세포를 포함한다(도 5 참조).
간 배양 배지
일부의 실시태양에서, 간 세포를 1차 "확대" 배양 배지(또한 본 발명에서 EM이라 칭한다)에서 증식시킨 다음, 상기 세포를 2차 "분화" 배양 배지(또한 본 발명에서 DM이라 칭한다)에서 증식시킬 수 있다. 그러나, 일부 실시태양에서, DM 배지에서의 분화 단계를 수행하지 않는다, 예를 들어 일부의 방법에서 세포를 이식하고 생체 내에서 분화되게 한다. 유사하게, 다른 조직, 예를 들어 췌장, 소장 및 결장용 확대 배양 배지 및 분화 배양 배지가 존재한다(상기 참조).
하나의 실시태양에서, 상기 간 확대 배지는 EGF, Wnt 작용물질, FGF 및 니코틴아미드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1-4(예를 들어 R스폰딘 1, 2, 3 및 4 중 임의의 하나 이상)이며 따라서 상기 확대 배지를 "ERFNic"라 칭한다. 특히 바람직한 확대 배지는 HGF를 추가로 포함하고 "ERFHNic"라 칭한다.
일부의 실시태양에서, 상기 간 확대 배지에 TGF 베타 억제제를 보충한다. 일부의 실시태양에서, TGF 베타는 5 nM 이상, 예를 들어 50 nM 이상, 100 nM 이상, 300 nM 이상, 450 nM 이상, 475 nM 이상, 예를 들어 5 nM 내지 500 mM, 10 nM 내지 100 mM, 50 nM 내지 700 uM, 50 nM 내지 10 uM, 100 nM 내지 1000 nM, 350 내지 650 nM 또는 보다 바람직하게는 500 nM로 존재한다. 상기 확대 배지 중의 TGF 베타 억제제의 존재는 인간 세포 실시태양에 특히 바람직하다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, R스폰딘 1-4 중 어느 하나, 노긴, 니코틴아미드, EGF, FGF10, HGF, 가스트린, TGF-베타 억제제 및 PGE2, 및 바람직하게는 Wnt-3a를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는, 간세포 확대용 배양 배지를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 상기 간 확대 배지는 p38 억제제를 추가로 포함한다.
일부의 실시태양에서, 상기 간 확대 배지에 프로스타글란딘 신호전달 경로의 활성제(또한 프로스타글란딘 경로 활성제라 칭한다)를 보충한다(도 24 참조). 예를 들어, 상기 간 확대 배지에 인지질, 아라키돈산(AA), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2), 프로스타글란딘 D2(PGD2)를 포함하는 목록 중에서 선택된 화합물들 중 임의의 하나 이상을 보충할 수도 있다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 상기 간 확대 배지에 PGE2 및/또는 AA를 보충한다. 일부의 실시태양에서, PGE2를 상기 간 확대 배지에 10 nM 이상, 30 nM 이상, 40 nM 이상, 45 nM 이상, 50 nM 이상, 예를 들어 10 nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 400 nM, 10 nM 내지 300 nM, 10 nM 내지 200 nM, 10 nM 내지 100 nM, 20 nM 내지 50 nM의 최종 농도로 가한다. 바람직한 실시태양에서, PGE2를 상기 간 확대 배지에 50 nM의 최종 농도로 가한다. 일부의 실시태양에서, AA를 상기 간 확대 배지에 1 ug/㎖ 이상, 예를 들어 3 ug/㎖ 이상, 5 ug/㎖ 이상, 8 ug/㎖ 이상, 9 ug/㎖ 이상, 10 ug/㎖ 이상, 1 ug/㎖ 내지 1000 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 500 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 100 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 50 ug/㎖, 또는 5 ug/㎖ 내지 10 ug/㎖의 최종 농도로 가한다. 바람직한 실시태양에서, AA를 상기 배지에 10 ug/㎖의 최종 농도로 가한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 간 확대 배지에 TGF-베타 억제제 및 프로스타글란딘 신호전달 경로의 활성제(예를 들어 PGE2 및/또는 AA) 모두 및 임의로 p38 억제제를 보충한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 간 확대 배지는 가스트린을 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 간 분화 배지는 EGF, TGF-베타 억제제, FGF(예를 들어, FGF10, FGF2 또는 임의의 다른 적합한 FGF 과 구성원) 및 노치 억제제를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제는 A83-01이고/이며 상기 노치 억제제는 DAPT이다. 상기 분화 배지를 본 발명에서 "EAFD"라 칭하며 이는 본 발명의 바람직한 분화 배지이다. FGF를 임의로 HGF에 의해서 대체하거나 또는 한편으로 FGF 및 HGF가 모두 상기 분화 배지 중에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일부의 실시태양에서, EGF를 HGF 또는 또 다른 수용체 타이로신 키나제 리간드에 의해 대체할 수도 있다. 덱사메타손을 또한, 예를 들어 10 nM 내지 10 uM의 농도로 가할 수도 있다. 상기 간 분화 배지는 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 또는 AA를 임의로 포함할 수도 있다. 그러나, 상기 성분을 또한 상기 분화 배지로부터 제외시킬 수도 있다. 일부의 실시태양에서, 온코스타틴 M을 또한, 예를 들어 1 ng/㎖ 내지 1 ㎎/㎖의 농도 범위로 가하여 간세포 운명으로의 분화를 도울 수도 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 기본 배지, 노긴, EGF, 가스트린, TGF-베타 억제제, 감마-세크레타제 억제제, 예를 들어 DAPT 또는 DBZ, 및 바람직하게는 Wnt-3a를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 간세포 분화용 배양 배지를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 상기 간 세포를 처음에 Wnt 및 노긴을 추가로 함유하는 확대 배지, 예를 들어 EGF, 노긴, R-스폰딘 및 Wnt(예를 들어 Wnt-3A)를 함유하는 "ENRW" 배지, 임의로 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 또는 AA, 임의로 TGF 베타 억제제 및 임의로 FGF, HGF, 니코틴아미드를 추가로 함유하는 확대 배지에서 배양시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 간 확대 배지에 TGF-베타 억제제 및 프로스타글란딘 신호전달 경로의 활성제(예를 들어 PGE2 및/또는 AA) 중 하나 또는 보다 바람직하게는 둘 모두를 보충한다.
일부의 실시태양에서, 상기 간용 확대 배지는 EGF, 노긴, 가스트린, FGF, 니코틴아미드, TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01, HGF, R스폰딘 1-4(예를 들어 R스폰딘 1, 2, 3 및 4 중 임의의 하나 이상) 및 PGE2를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 간 세포를 처음에, PGE2 및 AA가 보충된, EGF, 노긴, 가스트린, FGF10, 니코틴아미드, A8301, HGF, 및 R스폰딘 1-4 중 어느 하나를 함유하는 확대 배지 중에서 배양할 수 있다. R스폰딘 1-4를 Rspo 처리된 배지의 형태로 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 확대 배지는 EGF(100 ng/㎖, peprotech); 노긴(25 ng/㎖, peprotech); 가스트린(10 nM, sigma); FGF10(예를 들어 100 ng/㎖, peprotech); 니코틴아미드(10 mM, sigma); A8301(500 nM, Tocris); HGF(50 ng/㎖, peprotech); PGE2(50 nM) 및/또는 AA(10 ug/㎖)이 보충된 Rspo 처리된 배지(10%, 예를 들어 1 ug/㎖)를 함유할 수 있다. 상기 확대 배지는 Rock 억제제를 또한 함유할 수 있다.
마우스 간 세포를 확대시키는 경우, 하기의 성분들 중 하나 이상을 상술한 배양 배지로부터 제외시킬 수 있다: TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01) 및 PGE2.
발명자들은 상기 배지가 처음 수일 동안 세포의 초기 확대를 자극하기에 최적임을 발견하였다. 따라서, 상기 제 1 확대 배지를 때때로 본 발명에서 EM1이라 칭한다. 일부의 실시태양에서, 상기 Wnt 및 노긴을 대략 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상, 예를 들어 2주, 1 개월, 5주, 8주, 2 개월, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상, 14 개월 이상 후에 제거한다. 일부의 실시태양에서, 상기 세포를 Wnt 또는 노긴을 함유하지 않는 상술한 바와 같은 본 발명의 확대 배지 중에서 확대시킬 수 있다. 상기 제 2 확대 배지를 때때로 본 발명에서 EM2라 칭한다. 일부의 실시태양에서, 상기 세포를 EM2에서 대략 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상의 기간 동안, 예를 들어 3, 4, 5, 10, 20주 이상 동안 배양시킨다. 이어서 상기 배양 배지를 TGF-베타 억제제 및 노치 억제제를 함유하는, 상술한 바와 같은 최적화된 분화 배지로 교환할 수 있다. 전형적으로, 상기 분화 배지는 Wnt 작용물질, R-스폰딘 또는 니코틴아미드를 함유하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 분화 배지는 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 또는 AA를 함유하지 않는다. 이는 상기 세포의 분화를 성숙한 간세포 및 담관세포로 향하도록 촉진한다. 이들 세포는 인간 또는 동물에의 이식에 적합하다.
간용 확대 배지(EM2):
본 발명의 하나의 실시태양에서 상피 성장 인자, 분열촉진성 성장 인자로서 FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10, 니코틴아미드, 및 바람직하게는 Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1-4가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 세포 배양 배지를 제공한다. 상기 "EM2" 배지가 간세포 확대에 바람직하다.
일부의 실시태양에서, EM2는 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 및/또는 AA를 포함한다.
일부의 실시태양에서, EM2는 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01을 포함한다.
바람직하게는, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1-4이다. EGF, R-스폰딘 1-4, FGF 및 니코틴아미드를 포함하는 배지를 본 발명에서 ERFNic라 칭한다.
일부의 실시태양에서, 상기 EM2 배지는 노긴을 포함하지 않으며, 보다 바람직하게는 BMP-억제제를 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 EM2 배지는 Wnt, 예를 들어 Wnt-3a를 포함하지 않는다.
일부의 실시태양에서, HGF가 FGF 외에 존재한다. FGF 외에 HGF를 포함하는 바람직한 배지는 ERFHNic(EGF + R-스폰딘(바람직하게는 R-스폰딘 1-4) + FGF(바람직하게는 FGF10) + HGF + 니코틴아미드 + 프로스타글란딘 경로 억제제, 예를 들어 PGE2 및/또는 AA 및 TGF-베타 억제제이다. 발명자들은 상기 TGF-베타 억제제 및 상기 프로스타글란딘 경로 활성제를 함유하는 상기 ERFHNic 배지가 세포의 장기간 확대에 최적인 배지임을 발견하였다. HGF의 부재 하에서, 세포는 3 개월보다 오래 동안 배양물 중에서 살아남지 못하였다. 더욱이, HGF의 부재 하에서, 10 회의 계대 배양 후에, 세포는 보다 낮은 증식 비에 의해 입증된 바와 같이 HGF의 존재 하에서 배양된 세포에 비해 성장 불이익을 나타내었다. 특히, 15 회의 계대 배양 후에, 상기 세포는 HGF의 부재 하에서 HGF의 존재 하에서와 동일한 속도의 비로 오르가노이드를 증식시키지 않았다. 따라서, HGF는 장기 배양 동안 양호한 증식률을 유지하기 위해 필수적인 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명은 세포를 2주 이상, 1 개월 이상, 2 개월 이상, 보다 바람직하게는 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 8 개월 이상, 9 개월 이상, 10 개월 이상, 15 개월 이상, 20 개월 이상, 24 개월 이상, 25 개월 이상, 30 개월 이상, 예를 들어 3 년 이상 동안 배양하기 위한 본 발명의 ERFHNic 배지의 용도를 제공한다. 실제로, 본 발명의 일부 실시태양은 상기 세포의 대략 20 내지 50 회의 계대 배양을 위한 EM2의 용도를 포함한다. 예를 들어, 상기 세포는 7 내지 10 주간 계속해서 1주일에 한 번 4 내지 8 회 분할될 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 주당 약 4 내지 5배 이상의 비율로 또는 1주일에 2 회 초과의 집단 배가로 확대될 것이다. 본 발명은 8 회의 계대배양, 예를 들어 9 회 이상, 10 회 이상, 11 회 이상, 12 회 이상, 15 회 이상, 20 회 이상, 25 회 이상, 30 회 이상, 40 회 이상, 50 회 이상, 60 회 이상의 계대배양 동안, 또는 15 내지 35 회의 계대배양 동안, 예를 들어 대략 20 내지 30 회의 계대배양 동안 세포를 배양하기 위한 본 발명의 ERFHNic 배지의 용도를 추가로 제공한다. 일부의 실시태양에서, TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01은 상기 EM2 배지 중에 추가로 존재한다. 이는 인간 세포 또는 오르가노이드가 배양 중일 때, 특히 유용하다. 일부의 실시태양에서, 상기 A83-01은 400 내지 600 nM, 예를 들어 450 내지 550 nM, 470 내지 530 nM, 또는 대략 500 nM의 농도로 존재한다. TGF-베타 억제제가 EM2 중에 존재하는 실시태양에서, 노치 억제제는 바람직하게는 존재하지 않는다. 일부의 실시태양에서, EM2는 p38 억제제를 추가로 포함한다.
간용 확대 배지(EM1):
하나의 태양에서, 본 발명은 EGF, BMP 억제제, R-스폰딘 Wnt가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 세포 배양 배지를 제공한다. 바람직하게는, 상기 BMP 억제제는 노긴이고 상기 EM1 배지를 "ENRW"(EGF, 노긴, R-스폰딘 및 Wnt(예를 들어 Wnt3A))라 칭한다. 상기 배지를 EM1이라 칭한다. 일부의 실시태양에서, EM1은 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 및/또는 AA를 추가로 포함한다. 일부의 실시태양에서, EM1은 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 EM1은 프로스타글란딘 경로 활성제 및 TGF-베타 억제제를 추가로 포함한다. 발명자들은 Wnt 및 노긴을 함유하는 배지가 세포의 초기 확대를 자극하기에 이상적임을 발견하였다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 상기 EM1 배지를 단지 1회 계대배양 또는 1주간 사용하지만, EM1 배지는 상기 세포에 유해하지 않기 때문에 대략 1년간 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 따라서, 일부의 실시태양에서, EM1 배지를 0일 내지 10일, 예를 들어 0일 내지 7일, 0일 내지 6일, 0일 내지 5일, 0일 내지 4일, 0일 내지 3일, 0일 내지 2일, 0일 내지 1일 동안 세포를 배양하는데 사용하거나(여기에서 0일은 상기 세포를 그의 기원 조직으로부터 단리하는 날이고 1일은 후속일이다), 또는 1주 이상, 예를 들어 2, 3, 4주 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 동안 사용한다. 일부의 실시태양에서, 상기 EM1 배지는 오직 배양 첫날 또는 처음 2일 동안만 사용된다. 일부의 실시태양에서, EM1 배지는 1회 이상의 계대배양, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30회 이상의 계대배양, 예를 들어 20 내지 30 회 계대배양, 30 내지 35 회 계대배양, 32 내지 40 회 계대배양 또는 그 이상에 사용된다. 일부의 실시태양에서, 상기 EM1 배지를 동결 단계 또는 최적 성장과 결부되지 않는 배지 또는 온도 변화를 수반하는 임의의 다른 수송 단계에 이어서 사용한다. 상기 "EM1" 배지는 간 세포의 확대에 바람직하다.
상기 EM1 배지에 FGF, HGF, 니코틴아미드, 가스트린, B27, N-아세틸시스테인 및 N2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물들 중 하나 이상을 보충한다. 상기 배양물을 동결된 모액 또는 단일 세포로부터 출발하는 경우에, 상기 EM1 배지에 바람직하게는 Rock 억제제를 보충한다. Y27632가 본 발명에 사용하기에 바람직한 Rock 억제제이다.
따라서, 하나의 실시태양에서 분열촉진성 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGF(예를 들어 FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF), 바람직하게는 FGF10 및 HGF,
프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGF2 및/또는 AA;
TGF-베타 억제제;
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인, 및 바람직하게는;
BMP 억제제, 바람직하게는 노긴; 및
Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a
가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 세포 배양 배지를 제공한다.
B27(Invitrogen), N-아세틸시스테인(Sigma) 및 N2(Invitrogen), 가스트린(Sigma) 및 니코틴아미드(Sigma)를 또한 상기 정의된 배지에 첨가하며 이는 세포의 증식을 조절하고 DNA 안정성을 돕는 것으로 여겨진다. 본 발명과 관련하여, 니코틴아미드를 또한 본 발명에서 "Nic"라 칭한다.
'N2 보충제'를 하기의 공급처 및 문헌으로부터 입수할 수 있다: Invitrogen(Carlsbad, CA); www.invitrogen.com; 카탈로그 번호 17502-048; 및 PAA Laboratories GmbH(Pasching, Austria); www.paa.com; 카탈로그 번호 F005-004; 문헌[Bottenstein & Sato, PNAS, 76(1):514-517, 1979]. N2 보충제는 PAA 레보라토리즈 게엠베하(Laboratories GmbH)에 의해, 500 ㎍/㎖ 인간 트랜스페린, 500 ㎍/㎖ 소 인슐린, 0.63 ㎍/㎖ 프로제스테론, 1611 ㎍/㎖ 푸트레신, 및 0.52 ㎍/㎖ 나트륨 셀레나이트를 함유하는 100x 액체 농축물로서 공급된다. N2 보충제를 농축물로서 배양 배지에 가하거나 또는 배양 배지에 가하기 전에 희석할 수도 있다. 상기를 1x 최종 농도 또는 다른 최종 농도로 사용할 수 있다. N2 보충제의 사용은 트랜스페린, 인슐린, 프로제스테론, 푸트레신 및 나트륨 셀라나이트를 본 발명의 배양 배지에 혼입시키기 위한 편리한 방법이다. 상기 배지가 B27을 포함하는 일부의 실시태양에서, 상기 배지는 N2를 또한 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 실시태양은 B27이 존재하는 경우, 경우에 따라 N2를 제외시키기에 적합할 수 있다.
'B27 보충제'(Invitrogen(Carlsbad, CA); www.invitrogen.com; 현재 카탈로그 번호 17504-044; 및 PAA Laboratories GmbH(Pasching, Austria); www.paa.com; 카탈로그 번호 F01-002; 문헌[Brewer et al., J Neurosci Res., 35(5):567-76, 1993]으로부터 입수할 수 있다)를 사용하여 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트라이-요오도타이로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 포함하는 배양 배지를 제형화할 수 있다. B27 보충제는 PAA 레보라토리즈 게엠베하로부터, 다른 성분들 중에서도 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트라이-요오도타이로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 함유하는 액체 50x 농축물로서 공급된다. 상기 성분들 중에서 적어도 리놀렌산, 레티놀, 레티닐 아세테이트 및 트라이-요오도타이로닌(T3)은 핵 호르몬 수용체 작용물질들이다. B27 보충제를 농축물로서 배양 배지에 가하거나 또는 배양 배지에 가하기 전에 희석할 수도 있다. 상기를 1x 최종 농도 또는 다른 최종 농도로 사용할 수 있다. B27 보충제의 사용은 본 발명의 배양 배지에 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트라이-요오도타이로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 혼입시키는 편리한 방법이다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 EGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된 EGF 및 R-스폰딘 1; 예를 들어 EGF10(100 ng/㎖), HGF(25 내지 50 ng/㎖), 니코틴아미드(1 내지 10 mM), 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2(50 nM) 및/또는 AA(10 ug/㎖) 및 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(500 nM)이 보충된 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(1 ug/㎖)이 첨가된 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어질 수 있다. 일부의 실시태양에서, 상기 배지는 p38 억제제를 추가로 포함한다. 발명자들은 상기 배지가 세포의 장기간 확대에 사용될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 상기 세포 배양 배지는 본 발명의 EM2로서 사용하기에 바람직하다. 상기 기본 배지에 바람직하게는 B27, N2 및 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인을 보충한다. 일부의 실시태양에서, 상기 기본 배지는 어드밴스드-DMEM/F12이다. 그러나, 임의의 다른 적합한 기본 배지를 사용할 수도 있다.
세포 배양 배지의 또 다른 예, 및 상기 배지를 사용하는 방법은, 바람직하게는 B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 10 nM 가스트린, 100 ng/㎖ FGF10, 10 mM 니코틴아미드, 50 ng/㎖ HGF, 50% Wnt 처리된 배지, 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2(50 nM) 및/또는 AA(10 ug/㎖) 및 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(500 nM) 및 바람직하게는 10 내지 100 ng/㎖ 노긴이 보충된 어드밴스드-DMEM/F12를 포함하거나 상기로 이루어진다. Wnt 처리된 배지는 어드밴스드 DMEM, P/S, B27, N2 및 또한 FCS를 포함한다. Wnt3A 발현 플라스미드로 형질감염된 293T 세포는 Wnt를 생산한다. 전체 배지를 수일 후에(즉 분비된 Wnt와 함께) 취하고 Wnt 공급원으로서 사용한다.
따라서 본 발명은
분열촉진성 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF 및 HGF,
프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGF2 및/또는 AA;
TGF-베타 억제제;
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인, 및 바람직하게는;
BMP 억제제, 보다 바람직하게는 노긴; 및
Wnt 작용물질, 보다 바람직하게는 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a
가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 세포 배양 배지를 제공한다.
따라서 본 발명은
분열촉진성 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGF10 및 HGF,
프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGF2 및/또는 AA;
TGF-베타 억제제;
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인,
BMP 억제제, 보다 바람직하게는 노긴; 및
Wnt 작용물질, 보다 바람직하게는 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a
가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 바람직한 1차 배양 배지를 포함한다.
일부의 실시태양에서, p38 억제제를 상기 확대 배지에 첨가한다.
상기 배지를 본 발명의 EM1 세포 배양 배지로서 사용하여 세포의 초기 확대를 자극할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 상기 EM1 세포 배양 배지로서 사용된 배지는 본 발명의 EM2 배양 배지의 모든 성분들을 포함하고 Wnt-3a 및 노긴을 추가로 포함한다.
상기 기본 배지에 N-아세틸시스테인, B27 및 N2가 보충된 실시태양에서, 하기를 바람직하게는 상기 배양 배지에 첨가한다: EGF, R-스폰딘1, 가스트린, FGF10, 니코틴아미드 및 HGF 및 Wnt-처리된 배지 및 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 및/또는 AA. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 상기 개시된 양에 따라 N-아세틸시스테인, EGF, R-스폰딘1, 가스트린, FGF10, 니코틴아미드 및 HGF 및 Wnt-처리된 배지 및 프로스타글란딘 경로 활성제를 보충한다. 바람직하게는, TGF-베타 억제제가 또한 본 발명에 개시된 양으로 존재한다.
예를 들어 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 150 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖ N-아세틸시스테인을 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인을 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 40 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖ EGF를 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50 ng/㎖ EGF를 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 0.5 ㎍/㎖ 내지 1.5 ㎍/㎖ R-스폰딘1을 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1을 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 5 nM 내지 15 nM 가스트린을 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 10 nM 가스트린을 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 25 내지 200 ng/㎖ FGF10, 예를 들어 70 ng/㎖ 내지 130 ng/㎖ FGF10을 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 100 ng/㎖ FGF10을 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 5 mM 내지 15 mM 니코틴아미드를 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 10 mM 니코틴아미드를 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 25 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖ HGF, 예를 들어 35 ng/㎖ 내지 65 ng/㎖를 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50 ng/㎖ HGF를 보충한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 기본 배지에 35% 내지 65% Wnt-처리된 배지를 보충할 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50% Wnt-처리된 배지를 보충한다.
예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 간 확대 배지에 프로스타글란딘 신호전달 경로의 활성제를 보충한다(도 24 참조). 예를 들어, 상기 간 확대 배지에 인지질, 아라키돈산(AA), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2), 프로스타글란딘 D2(PGD2)를 포함하는 목록 중에서 선택된 화합물 중 임의의 하나 이상을 보충할 수 있다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 상기 간 확대 배지에 PGE2 및/또는 AA를 보충한다. 일부의 실시태양에서, PGE2를 상기 간 확대 배지에 10 nM 이상, 예를 들어 10 nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 400 nM, 10 nM 내지 300 nM, 10 nM 내지 200 nM, 10 nM 내지 100 nM, 20 nM 내지 500 nM의 최종 농도로 가한다. 바람직한 실시태양에서, PGE2를 상기 간 확대 배지에 50 nM의 최종 농도로 가한다. AA를 상기 간 확대 배지에 1 ug/㎖ 이상, 예를 들어 1 ug/㎖ 내지 1000 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 500 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 100 ug/㎖, 1 ug/㎖ 내지 50 ug/㎖, 또는 5 ug/㎖ 내지 10 ug/㎖의 최종 농도로 가한다. 바람직한 실시태양에서, AA를 상기 배지에 10 ug/㎖의 최종 농도로 가한다.
일부의 실시태양에서, 가스트린 및 N2 중 하나 또는 둘 다가 상기 세포 배양 배지 중에 존재하지 않는다.
바람직하게는 상기 기본 배지는 어드밴스드-DMEM/F12이다.
상기 1차 배양 배지(예를 들어 EM1, EM2 또는 EM1과 EM2 모두)를 바람직하게는 본 발명의 배양 방법의 처음 2 주 동안 사용한다. 그러나, 상기를 보다 짧은 기간 동안, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 7, 또는 10일, 또는 더 긴 기간 동안, 예를 들어 3, 4, 5, 10, 20 주 이상, 5 개월 이상, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 동안 사용할 수 있다.
간용 분화 배지(DM):
또 다른 태양에서, EGF, TGF-베타 억제제, 노치 억제제 및 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PEG2 및/또는 AA가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 2차 세포 배양 배지를 제공한다. 발명자들은 상기 배지가 세포 분화에 유용함을 발견하였다. 상기 세포 분화용 배지를 본 발명에서 DM으로서 지칭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 2차 세포 배양 배지는 FGF 및/또는 HGF를 또한 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 2차 배양 배지는
분열촉진성 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGF10 및 HGF;
노치 억제제;
TGF-베타 억제제; 및
프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGF2 및/또는 AA
가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제는 A83-01이고/이거나 상기 노치 억제제는 DAPT이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DM 세포 배양 배지는 덱사메타손을 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DM 세포 배양 배지는 온코스타틴 M을 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DM 세포 배양 배지는 가스트린을 추가로 포함한다.
바람직한 2차 세포 배양 배지, 및 상기 배지의 사용 방법은 실시예에 개시되어 있으며, 50 ng/㎖ EGF, 100 ng/㎖ FGF10, 50 nM A8301 및 10 uM DAPT가 첨가된 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어진다. 어드밴스드-DMEM/F12를 임의의 다른 적합한 기본 배지와 같이 기본 배지로서 사용할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 간 세포, 예를 들어 인간 간 세포용 분화 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM) 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), 노긴(바람직하게는 100 ng/㎖), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 10 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 50 nM) 및 감마-세크레타제 억제제(예를 들어 DAPT/DBZ)(바람직하게는 10 nM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
일부의 실시태양에서, 간 세포, 예를 들어 마우스 간 세포용 분화 배지는 기본 배지(예를 들어 어드밴스드 DMEM/F12, B27(50x), n-아세틸시스테인(1 mM) 및 글루타민/글루타맥스를 포함한다), EGF(바람직하게는 50 ng/㎖), FGF10(바람직하게는 100 ng/㎖), 가스트린(바람직하게는 10 nM), TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01(바람직하게는 50 nM) 및 감마-세크레타제 억제제(예를 들어 DAPT/DBZ)(바람직하게는 10 nM)을 포함하거나 또는 상기로 이루어진다.
일부의 실시태양에서, 상기 2차 세포 배양 배지는 R-스폰딘 또는 Wnt를 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 2차 세포 배양 배지는 Wnt 작용물질을 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 2차 세포 배양 배지는 니코틴아미드를 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 2차 세포 배양 배지는 BMP 억제제를 포함하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 상기 2차 세포 배양 배지는 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 및/또는 AA를 포함하지 않는다.
발명자들은 R-스폰딘1 및 니코틴아미드가 성숙한 간세포 마커 CYP3A11의 발현을 억제하고 간모세포 마커 알부민의 발현은 촉진함을 발견하였다. 따라서, 상기 세포의 보다 성숙한 간 운명으로의 분화를 증가시키기 위해서, 발명자들은 상기 세포 배양물로부터 R-스폰딘 및 니코틴아미드를 제거하였다. 발명자들은 또한 특이성 담즙 전사 인자의 발현이 R-스폰딘1을 함유하는 확대 배양물에서 매우 상향조절됨을 발견하였으며, 이는 상기 배양물 유전자 발현이 더 담즙세포 운명쪽으로 치우침을 가리킨다. 노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 생체 내에서 담즙 세포 운명에 연루되었다. 실제로, Rbpj(노치 신호전달을 성취하는데 필수적임)의 결실은 비정상적인 관형성을 생성시키며(문헌[Zong Y. Development 2009]) 간 외식체에 TGF-베타의 첨가는 시험관 내에서 담즙 분화를 촉진한다(문헌[Clotman F. Genes and Development 2005]). 노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 모두 상기 간 배양물에서 매우 상향조절되므로(도 22), 발명자들은 담관 세포-운명의 억제가 상기 세포의 분화를 보다 간세포 표현형쪽으로 촉발시킬 수도 있음을 추론하였다. TGF-베타 억제제(예를 들어 A8301) 및 노치 억제제(예를 들어 DAPT)의, 바람직하게는 R-스폰딘 또는 Wnt를 함유하지 않는 분화 배지에의 첨가가 성숙한 간세포 마커의 발현을 증대시키고 간세포-유사 세포의 수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 실시예 5 참조).
일반적인 배양 배지
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포외 기질 상에서 상피 줄기세포 또는 단리된 소낭의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 허용한다. 일부의 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포외 기질 상에서 본 발명의 오르가노이드, 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드, 결장 오르가노이드, 췌장 오르가노이드, 위 오르가노이드, 바렛 식도 오르가노이드, 선암종 오르가노이드 또는 결장 암종 오르가노이드의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 허용한다. 일부의 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포외 기질 상에서 본 발명의 오르가노이드, 예를 들어 소장(소낭-융모) 오르가노이드, 결장 오르가노이드, 췌장 오르가노이드, 위 오르가노이드, 바렛 식도 오르가노이드, 선암종 오르가노이드, 암종 오르가노이드, 결장 암종 오르가노이드, 전립선 오르가노이드 또는 전립선 암종 오르가노이드의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 허용한다. 바람직하게는, TGF-베타 억제제 및/또는 p38 억제제가 존재하는 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 본 발명의 세포 집단 또는 오르가노이드의 생존 및/또는 증식, 바람직하게는 생존 및 증식을 허용한다. 바람직하게는, TGF-베타 억제제 및/또는 p38 억제제가 초기에 세포 배양 배지 중에 존재하지만 이어서 상기 배지로부터 제거되는(예를 들어 상기 배지를 새로 공급할 때 첨가에 실패함으로써) 실시태양은 본 발명의 세포 집단 또는 오르가노이드의 생존 및/또는 증식, 바람직하게는 생존 및 증식을 허용한다.
일부의 실시태양에서, p38 억제제를 본 발명에 개시된 배지 중 어느 하나에 첨가한다.
세포 배양 배지란 용어는 배지, 배양 배지 또는 세포 배지와 동의어이다.
본 발명의 배양 배지의 용도
본 발명은 또한 줄기세포, 줄기세포의 집단, 조직 단편 또는 오르가노이드의 확대 및/또는 분화를 위한 본 발명의 배양 배지의 용도를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 상기 줄기세포, 줄기세포의 집단, 조직 단편 또는 오르가노이드는 하나 이상의 장 줄기세포, 소장 소낭, 결장 소낭, 위 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포 및 전립선 줄기 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부의 실시태양에서, 상기 줄기세포, 줄기세포의 집단, 조직 단편 또는 오르가노이드는 정상 조직으로부터 수득된다.
일부의 실시태양에서, 상기 줄기세포, 줄기세포의 집단, 조직 단편 또는 오르가노이드는 병든 조직, 예를 들어 선종, 암종, 선암종, 낭성 섬유증이 있는 환자의 장 또는 염증성 장 질환이 있는 환자의 장으로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라 배양된 줄기세포
줄기세포는 성숙한 인간 및 마우스의 다수의 기관 중에서 발견된다. 개별적인 조직 중의 성숙한 줄기세포의 정확한 특징들에는 큰 변화가 존재할 수 있지만, 성숙한 줄기 세포는 적어도 하기의 특징들을 공유한다: 상기 세포는 미분화된 표현형을 유지한다; 상기 세포의 자손은 적절한 조직 중에 존재하는 모든 계통을 향해 분화할 수 있다; 상기 세포는 생애에 걸쳐 자기-유지 능력을 유지한다; 상기 세포는 손상 후 적절한 조직을 재생시킬 수 있다. 줄기세포는, 적합한 세포-세포 접촉을 공급하고 상기 줄기세포 집단의 유지를 신호하는 한정된 위치인 줄기세포 니치에 존재한다. 본 발명에 따른 줄기세포는 바람직하게는 Lgr5를 발현한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 줄기세포 또는 조직 단편을 배양함으로써(3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 배양되었다) 생성되었거나 수득된 상기 줄기세포를 포함하는 세포의 집단 또는 하나 이상의 오르가노이드를 제공한다.
세포의 집단은 1 개 초과의 임의의 수의 세포이나, 바람직하게는 1 x 103 세포 이상, 1 x 104 세포 이상, 1 x 105 세포 이상, 1 x 106 세포 이상, 1 x 107 세포 이상, 1 x 108 세포 이상, 또는 1 x 109 세포 이상이다.
본 발명에 따라 배양된 본 발명의 줄기세포는 인간 줄기세포일 수 있다. 본 발명에 따라 배양된 본 발명의 줄기세포는 상피 줄기세포일 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 및/또는 본 발명에 따라 배양된 줄기세포는 배아 줄기세포가 아니다. 일부의 실시태양에서 본 발명의 및/또는 본 발명에 따라 배양된 줄기세포는 인간 배아 줄기세포가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 줄기세포는 성숙한 줄기세포이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 줄기세포는 인간 상피 줄기세포일 수 있다. 인간 상피 줄기세포는 인간 상피 조직 기원의 줄기세포를 포함한다. 상기 세포는 비제한적으로 췌장, 소장, 대장, 각막, 코, 호흡기 조직, 위 조직, 간 및 피부, 유방 및/또는 전립선 조직, 예를 들어 췌장, 소장, 대장, 각막, 코 및 호흡기 조직으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조직을 포함한다. 상피 줄기세포는 상피를 구성하는 별개의 세포 유형들을 형성할 수 있다. 일부의 상피, 예를 들어 피부 또는 장은 빠른 세포 턴오버를 나타내며, 이는 상기 생성되는 줄기세포가 연속적으로 증식함에 틀림없음을 가리킨다. 다른 상피, 예를 들어 간 또는 췌장은 정상적인 조건 하에서 매우 느린 턴오버를 나타낸다.
장 줄기세포
소장의 자기재생 상피는 소낭 및 융모로 정렬된다(문헌[Gregoreff and Clevers, 2005 Genes Dev 19, 877-90]). 상기 소낭-융모 축을 따라 있는 각각의 세포는 양극화되며, 이때 상기 장 융모 상부 위, 또는 결장 융모의 상부 위치의 세포가 가장 분화되고 세포사멸에 의해 관강 내로 연속적으로 상실된다. 상기 소낭의 기부에 존재하는 줄기세포의 연속적인 증식, 및 상기 소낭의 중간에 존재하는 선조 세포의 대량 증식은 상기 발산된 세포들의 적합한 대체를 보장한다. 마우스에서 5일의 상피 턴오버 시간이 생성된다. 자기재생 줄기세포는 오랫동안 상기 소낭 기부 부근에 존재하고 모든 계통을 향해 분화할 수 있는, 빠르게 증식하는 변화-증식(TA) 세포를 생성시키는 것으로 공지되어 왔다. 추정되는 줄기세포의 수는 소낭당 4 내지 6 개이다(문헌[Bjerknes and Cheng, 1999 Gastroenterology 1 16, 7- 14]). 3 개의 분화된 세포 유형, 장세포, 배상세포 및 장내분비 세포가 TA 세포로부터 형성되며, 상기 소낭-융모 축을 따라 일관되는 밴드로 계속해서 이동한다. 각각의 융모는 다수의 상이한 소낭들로부터의 세포를 수용한다. 4 번째 주요 분화 세포유형인 파네쓰 세포가 상기 소낭 기부에 존재한다.
결장은 소장과 유사하지만 융모라기보다는 편평한 표면 상피를 갖는다. 결장 소낭은 소장 소낭과 유사하게 구성된다. 파네쓰 세포는 결장 소낭 중에 존재하지 않으며; 대신에 소위 "깊은 소낭 분비" 세포가 존재한다. 상기 상피의 편평한 표면은 분화된 세포(결장세포 및 분비 세포)를 함유한다. 분화된 배상세포는 상기 소낭 전체를 통해 존재하며, 또한 변화-증식 세포와 섞여있다.
조직 단편 및 줄기세포의 단리
소낭을 숙련가에게 공지된 프로토콜에 의해, 십이지장, 공장, 회장 및 결장, 및 위의 유문 및 특수기관 영역을 포함한 소장 및 대장으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 소낭을, 기저막 및 간질 세포유형과의 칼슘- 및 마그네슘-의존성 상호작용으로부터 세포를 방출시키는 킬레이트제와 함께 단리된 조직을 배양함으로써 단리시킬 수 있다. 상기 조직의 세척 후에, 상피 세포층을 유리 슬라이드로 점막 아래로부터 긁어내어 다진다. 이어서 트립신 또는 보다 바람직하게는 EDTA 및/또는 EGTA 중에서 배양하고 절단되지 않은 조직 단편 및 단일 세포를, 예를 들어 여과 및/또는 원심분리 단계를 사용하여 소낭으로부터 분리시킨다. 다른 단백질 분해 효소들, 예를 들어 콜라게나제 및/또는 디스파제 I을 트립신 대신에 사용할 수 있다. 유사한 방법들을 사용하여 췌장 및 위의 단편들을 단리시킨다. 유사한 방법들을 사용하여 본 발명에 개시된 다른 조직의 단편들을 단리시킬 수 있다. 본 발명의 배양 배지가 상기와 같은 조직 단편의 배양에 적합하다(실시예 1 참조).
본 발명에 따른 배양 배지는, 단일 소낭이 다수의 소낭 분열 사건을 겪는 동시에 모든 분화된 세포 유형들이 존재하는 융모-유사 상피 도메인을 생성시키는 장기간 배양 조건의 확립을 허용한다. 배양된 소낭은 배양물 내로 취해진 후에 극적인 형태 변화를 겪는다. 새로 단리된 소낭의 상부 개구는 밀봉되며 상기 영역은 점진적으로 부풀어 오르고 세포사멸 세포로 충전되게 되며, 매우 그럴듯하게 세포사멸 세포는 상기 융모 끝에서 떨어져 나간다. 상기 소낭 영역은 연속적인 발아 사건을 겪어 추가적인 소낭들을 생성시킨다(소낭 분열을 연상케하는 과정). 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 오르가노이드는 증식성 세포, 파네쓰 세포, 장세포 및 배상세포를 포함하여, 모든 분화된 상피 세포 유형을 포함하는 소낭-유사 연장부를 포함한다. 근섬유아세포 또는 다른 비-상피 세포들은 어떠한 단계에서도 상기 오르가노이드 중에서 확인되지 않았다.
상기 발아 소낭 구조의 확대는, 융모-유사 상피가 늘어서고 세포사멸 세포체가 충전된 중심 관강을 둘러싸는 소낭-유사 구조를 포함하는 오르가노이드를 생성시킨다. 상기 소낭-융모 오르가노이드는 융모-유사 상피가 늘어선 중심 관강을 포함한다. 상기 관강은 연속적인 시간 간격으로 개방되어 내용물을 배지 내로 방출시킨다.
유사한 소낭-융모 오르가노이드 구조는 단일 상피 줄기 세포가 배양될 때 형성된다. 약 1 주일 후에, 완전한 소낭과 함께 수득되는 소낭-융모 오르가노이드 구조를 강하게 닮은 구조가 형성된다.
줄기세포를 단리하는 방법은 공지되어 있으며 본 발명에 사용하기에 적합한 방법을, 사용되는 줄기세포 유형에 따라 숙련가가 선택할 수 있다. 예를 들어, 상피 줄기세포의 단리를 Lgr5 및/또는 Lgr6(상피 줄기세포 상의 독특한 세포 표면 마커들이다)에 결합하는 화합물들을 사용하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 화합물의 예는 항-Lgr5 및 항-Lgr6 항체이다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 예를 들어 결장, 소장, 또는 췌장으로부터의 단일 Lgr5+ 상피 줄기세포를 사용하여 오르가노이드, 예를 들어 결장, 소낭-융모 또는 췌장 오르가노이드를 각각 형성시킬 수 있다.
추가의 예에서, 간, 전립선 또는 위로부터의 단일 Lgr5+ 상피 줄기세포를 사용하여 각각 간, 전립선 또는 위 오르가노이드와 같은 오르가노이드들을 수득할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, Lgr5+ 줄기세포를 포함하는 조직 단편, 예를 들어 장관으로부터의 배양된 소낭을 사용하여, 본 발명에 개시된 방법 및 배양 배지에 의해 오르가노이드를 수득할 수 있다.
일부의 실시태양에서 상기 단일 Lgr5+ 상피 줄기세포 또는 조직 단편은 예를 들어 암종 또는 선암종으로부터의 암 줄기세포 또는 암 조직 단편일 수 있다. 일부의 실시태양에서 상기 단일 Lgr5+ 상피 줄기세포는 종양 병리학 또는 병든 조직, 예를 들어 바렛 식도, 낭성 섬유증 또는 선종으로부터의 줄기세포 또는 조직 단편일 수 있다. 암성, 종양성 또는 병든 출발 물질로부터 수득된 오르가노이드는 생체 내 출발 물질을 닮은 특징들을 가지며 따라서 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학 및 독물학 선별, 개인맞춤형 의료, 재생 의학 또는 생체 외 세포/기관 모델을 위한, 예를 들어 질병 모델을 위한 연구 도구로서 유용하다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 인간 줄기세포 또는 조직 단편을 배양함으로서 생성되거나 수득되는 오르가노이드를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 인간 줄기세포 또는 조직 단편을 배양함으로써 생성되거나 수득되는 소낭-융모 오르가노이드 또는 위 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드 또는 바렛 식도 오르가노이드 또는 선암종 오르가노이드 또는 결장 암종 오르가노이드를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 인간 줄기세포 또는 조직 단편을 배양함으로써 생성되거나 수득되는 전립선 오르가노이드를 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 인간 줄기세포 또는 조직 단편을 배양함으로써 생성되거나 수득되는 상기와 같은 오르가노이드의 집단, 예를 들어 소낭-융모, 위 또는 췌장 오르가노이드는 각각 10 개 초과, 바람직하게는 20 개 초과, 보다 바람직하게는 40 개 초과의 오르가노이드를 포함할 수 있다. 상기 오르가노이드의 콜렉션은 바람직하게는 10% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 20% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 50% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 60% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 70% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 80% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 90% 이상의 생육 가능한 세포를 포함한다. 세포의 생육성은 FACS에서 훽스트 염색 또는 프로피디움 요오다이드 염색을 사용하여 평가할 수 있다.
발명자들은 본 발명의 배양 배지 및 방법을 결장직장암 및 선암종을 포함하여 암 세포주의 배양에 사용할 수 있다(실시예 1 참조). 실시예 1에 설명된 바와같이, 상기 배양 기술은 감염, 염증 및 종양 병리학에 대한 연구 도구로서 널리 적용 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 줄기세포는 암 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 암 줄기세포는 선종 또는 결장암 오르가노이드를 형성할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 이들 오르가노이드는 Ki67+(Thermo Scientific* Cellomics, Millipore)인 세포를 포함한다.
유사하게, 발명자들은 본 발명의 배양 배지 및 방법을 다른 병든 유전자형 및/또는 표현형을 갖는 줄기세포의 배양에 사용할 수 있다. 예를 들어, 낭성 섬유증이 있는 환자로부터 취한 장 줄기세포를 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 확대시킬 수 있다. 이들 줄기세포는 상기 낭성 섬유증 유전자형 및 표현형을 유지한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 줄기세포를 질병, 예를 들어 낭성 섬유증, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 암종, 선종, 선암종, 결장암, 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 바렛 식도 고셔병, 알파-1-안티트립신 결핍증, 레쉬니한 증후군, 빈혈, 스바크만-보디안-다이아몬드 증후군, 진성 적혈구 증가증, 원발성 골수섬유증, 글리코겐 저장 질병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 크리글러-나자르 증후군, 유전성 티로신혈증, 폼베병, 진행성 가족성 담즙정체증, 흐렐러(Hreler) 증후군, SCID 또는 누출성 SCID, 오멘 증후군, 연골-모 부전증, 헤르페스 단순 뇌염, 경피증, 골형성 부전증, 벡커 근이영양증, 듀켄씨근이영양증, 선천성이상각화증 등의 환자로부터 취한다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 질병 오르가노이드를 질병이 있는 인간 또는 동물로부터 취한 줄기세포를 배양함으로써 수득할 수 있다. 질병 오르가노이드는 상기가 수득된 조직의 특징을 여전히 갖는다. 따라서, 소장 소낭으로부터 증식된 낭성 섬유증 소장 오르가노이드는 소장 오르가노이드의 정의 내에 있다. 유사하게, 결장 암종 오르가노이드는 결장 오르가노이드의 정의 내에 있다.
암 줄기세포의 정의에 관하여 문헌에는 약간의 혼동이 있다. 여기에서, 우리는, 암 줄기세포"는 자기재생 및 종양을 포함하는 암 세포의 이종 계통을 야기하는 능력을 갖는 종양 내 세포이다. 따라서 암 줄기세포는 오직 계속해서 성장하는 종양의 발생을 반복하는 능력에 의해 실험적으로 정의될 수 있다"라고 진술하는 최근의 AACR 워크샵(문헌[Clarke et al., 2006. Cancer Res. 66:9339-44])에서 도달한 합의에 따른다. 상기 문헌에서 대체 용어는 종양-개시 세포 및 종양형성 세포를 포함한다. 암 줄기세포 활성에 대한 분석은 자기재생 및 종양 전파의 가능성을 다루기 위해 필요하다. 현행의 금-표준 분석은 면역결핍 마우스에의 일련의 이종-이식이다. 또한, 본 발명과 관련하여 암 줄기세포는 Lgr5를 통상적으로 발현한다. 그러나, 일부의 실시태양에서, Lgr5를 발현하지 않는 암 개시/전파/줄기세포를 또한 본 발명의 배양 배지 및 방법에 의해 배양할 수 있다.
줄기세포 및 상기 줄기세포를 포함하는 오르가노이드의 유전체 및 표현형 안정성
줄기세포 및 그의 분화된 자손에 대한 임상 연구 적용은 적합한 질의 세포 집단을 제공하는 재현 가능한 줄기세포 배양 방법을 요한다. 일반적으로, 줄기세포의 시험관 내 확대는 가능한한 가깝게 상기 세포의 생체내 대응물을 닮은 세포 집단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 성질을 본 발명에서 세포의 "유전체 및 표현형 안정성"이라 칭한다. 병든 세포, 예를 들어 암 세포 또는 낭성 섬유증 세포를 배양하여 수득한 오르가노이드가 또한 그의 생체 내 대응물을 닮는다, 즉 상기는 그의 질병 유전자형 및/또는 표현형을 유지하며 따라서, 즉 상기가 상기 생체내 상황을 연상시키는 상기 질병의 유전자 또는 표현형 불안정성 특징을 유지한다는 면에서, 그의 "유전체 및 표현형 안정성"을 또한 유지한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 건강한 조직으로부터 수득된 "정상" 오르가노이드를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 병든 조직으로부터 수득된 "질병" 오르가노이드, 예를 들어 암 오르가노이드(예를 들어 결장 암종 오르가노이드 또는 선암종 오르가노이드) 또는 낭성 섬유증 소장 오르가노이드를 제공한다.
최초로, 발명자들은 유전체 및 표현형 안정성의 상실을 최소로 하면서, 3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 또는 그 이상 동안 배양물에서 인간 상피 줄기세포를 확대시킬 수 있음을 발견하였다(실시예 1 참조). 본 발명의 개선된 배양 조건 하에서, 인간 장 오르가노이드는 선행의 배양 조건 하에서 나타난 낭성 구조보다는, 발아하는 오르가노이드 구조를 나타내었다. 3 개월보다 더 오래된 오르가노이드의 중기 확장은 3 개의 상이한 공여체로부터 취한 20 개 세포 각각에서 46 개 염색체를 일관되게 드러내었다. 더욱 또한, 미세배열 분석은 배양물 중 줄기세포가 장 줄기세포 유전자를 포함하여 장 소낭 세포와 유사한 분자 특징을 가짐을 밝혀내었다.
따라서, 일부의 실시태양에서 본 발명은 유전체 및 표현형 안정성의 상실을 최소로 하면서, 3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 또는 그 이상 동안 증식된 오르가노이드를 제공한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 발아 구조를 포함하는 인간 장 오르가노이드를 제공한다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 인간 장 오르가노이드는 낭성 구조를 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 인간 장 오르가노이드는 낭성 구조보다 더 많은 발아 구조를 포함한다. 발명자들은 또한 본 발명의 배지 및 방법에 의해 생성된 인간 장 오르가노이드가 외부 인자들에 반응하여 생체 내 세포 운명 결정을 모방함을 입증하였다. 예를 들어, 앞서 장 줄기세포에서의 노치 억제는 장 상피 증식을 종결시키고 생체 내에서 배상세포 과형성을 유도함이 입증되었다. 발명자들은 또한 본 발명의 장 오르가노이드가 노치 억제제로 처리 시 증식을 중단하고 대부분의 세포가 3일 이내에 배상세포로 전환됨을 보일 수 있었다.
이러한 결과는 선행의 방법 및 배지에 비교된 본 발명의 방법 및 배지에 의해 생산된 줄기세포 및 오르가노이드의 유전체 및 표현형 안정성의 극적인 개선을 나타낸다.
본 발명의 줄기세포의 유전체 안정성을 핵형 분석에 의해 확인할 수 있다. 줄기세포 및 그의 자손을 문헌[Sato, T et al., Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459, 262-265, 2009]에 개시된 바와 같은 공지된 방법을 사용하여 핵형분석할 수 있다.
"정상 핵형"은 모든 염색체가 주목할만한 변경 없이 존재하는(즉 정배수성) 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시태양에서 확대된 집단 중 줄기세포 및 분화된 세포의 50% 초과; 70% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12 개월 이상 후에 정상 핵형을 나타낸다. "확대된 집단"이란 용어는 오르가노이드를 포함한다.
"정상 표현형"은 첫 번째 근사치로, 평균적인 생체 내 대응 세포와 동일한 가시적인 특징, 유전자 발현 및 양상을 나타내는 세포를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시내양에서, 본 발명에 따라 배양된 확대된 집단 중의 상기 줄기세포의 50% 초과; 70% 초과; 80% 초과; 90% 초과; 95% 초과; 또는 99% 초과가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12 개월 이상 후에 정상 표현형을 나타낸다.
예를 들어, 가시적으로, 정상 표현형은 상기 오르가노이드 밖의 죽은 세포의 수, 낭성 성장에 비해 상기 오르가노이드의 '발아하는' 양(발아 구조가 바람직하다), 및 상피 세포의 단층의 전체적인 보전성(예를 들어 원주형 비늘모양 표현형)에 의해 판된될 수 있다. 또한 존재하는 세포 유형은 오르가노이드가 가시적으로 "정상"인지의 여부를 판단하는데 도움이 될 수 있다.
본 발명의 줄기세포 및 오르가노이드의 바람직한 성질을 하기에 개략한다.
줄기세포 마커
마우스 유전자를 본 발명에서 언급하는 경우, 본 발명의 인간 오르가노이드는 유사한 유전자 프로파일을 가질 수 있지만, 여기에서는 상기 인간 유전자 대응물이 상기 마우스 유전자를 대신한다. 따라서, 본 발명에 개시된 바와 같은, 그러나 상응하는 인간 유전자에 관한 유전자 발현 프로파일을 갖는 인간 오르가노이드가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명에 나열된 마우스 유전자의 인간 대응물은 숙련가에게 쉽게 입수될 수 있을 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 Lgr5의 천연 발현을 특징으로 하는 성숙한 줄기세포의 집단을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 Lgr5, 및 LGR4, epcam, Cd24a, Cdca7, 액신, CK19, 네스틴, 소마토스타틴, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, Hnf1α, Hnf4a, Sox9, KRT7 및 KRT19, Tnfrsf19로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23)의 줄기세포 마커의 천연 발현을 특징으로 하는 성숙한 줄기세포의 집단을 제공한다. 상기 줄기세포 마커는 조직 특이성일 수 있다. 예를 들어, 췌장 줄기세포 또는 오르가노이드는 현저한 수준의 CK19, 네스틴, 소마토스타틴, 인슐린, 글루카곤, CXCR4+, Ngn3, Pdx1, NeuroD, Nkx2.2, Nkx6.1, Pax6, Mafa, Hnf1b, 임의로 Tnfrsf19 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 천연 발현을 특징으로 할 수 있으며; 위 오르가노이드는 현저한 수준의 CD133+, DCAMKL-1, CD44, 임의로 Tnfrsf19 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 천연 발현을 특징으로 할 수 있고; 소낭-융모 오르가노이드는 현저한 수준의 Sord 및/또는 Prss23 중 하나 이상 또는 전부(예를 들어 1 또는 2), 또는 예를 들어 현저한 수준의 표/도 14의 모든 유전자의 발현을 특징으로 할 수 있다.
마커 발현과 관련하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "현저한 수준"이란 용어는 하기에 개시되는 바와 같이 "검출 가능한 수준"이란 용어와 동의어로 사용된다.
소장 및 위 오르가노이드 세포 집단은 소장 및 위에 공통인 선조 집단의 마커, 예를 들어 Cd44 및 Sox9 중 하나 또는 둘 다를 또한 발현한다(문헌[Barker & Huch et al Cell stem cell 2010]). 이들은 본 발명에 따른 줄기세포에서 고도로 발현된다. 본 발명의 상기 태양에 따른 세포는 또한, 예를 들어 MMP7, Sp5 Tnfrs19 및 액신2 중 하나, 둘 또는 전부를 포함하여, Wnt 표적 유전자를 상향 조절할 수 있다. 이는 상기 배양물의 자기재생 능력을 유지하기 위한, 활성이고 확고한 Wnt 신호전달 활성에 대한 요건의 강한 증거를 제공한다.
발명자들은 상기 '줄기세포' 유전자의 발현이, 상기 줄기세포의 자손이 되는 분화된 세포보다 현저하게 더 높은 수준으로 초기 오르가노이드 중에 존재함을 관찰하였다. 예를 들어, 유전자 LGR5, LGR4, Epcam, CD44, Tnfrsf19, Sox9, Cd24a, Sp5, Prom1/CD133, Cdca7은 바람직하게는 본 발명의 오르가노이드 중에서 발현되지만, 바람직하게는 췌장, 간, 소장 및 결장 오르가노이드의 분화 시 현저하게 하향조절된다. 또한, 유전자 RNF43 및 ZNRF3은 바람직하게는 본 발명의 오르가노이드에서 발현된다.
"천연 발현"은 세포가 임의의 방식으로 재조합에 의해 조작되지 않았음, 즉 상기 세포가 외래 유전 물질의 도입, 예를 들어 이종(비-천연) 또는 보다 강한 프로모터 또는 상기 유전자의 내생 유전자 또는 외부-도입된 형태에 작동적으로 결합된 다른 조절 서열의 도입에 의해 상기 마커를 발현하거나 상기 마커의 발현을 조절하도록 인위적으로 유도되지 않았음을 의미한다. 천연 발현은 존재하는 엑손 암호화 서열들 사이의 인트론을 포함하여, 상기 세포내 게놈 DNA로부터이다. 천연 발현은 cDNA로부터가 아니다. 천연 발현은 필요한 경우 다양한 방법들 중 어느 하나, 예를 들어 외부 이종 서열이 존재하지 않음을 검사하기 위한 상기 유전자의 판독 프레임 내부로부터의 서열화에 의해 입증될 수 있다. "성숙한"은 배아-후를 의미한다. 본 발명의 줄기세포에 관하여, "성숙한 줄기세포"란 용어는 상기 줄기세포가 배아 단계보다 나중 성장 단계의 동물의 조직 또는 기관으로부터 단리됨을 의미한다.
상기 줄기세포 집단은 또한 임의의 현저한 수준의 몇몇 마커의 천연 발현의 결여를 특징으로 할 수 있으며, 이들 마커 중 다수는 세포 분화와 관련된다. 구체적으로, 상기 단리된 성숙한 줄기세포 집단의 세포는 Cd11b, CD13, CD14, AFP, Pdx1, 임의의 CYP 구성원(예를 들어 CYP3A11, CYP 11A1) 중 하나 이상을 현저한 수준으로 천연으로 발현하지 않는다. 본 발명에 정의된 바와같이, 이들 마커를 음성 마커라 한다.
마커의 검출 및 세포의 단리
"발현된"이란 용어는 세포 내 마커의 존재를 개시하는데 사용된다. 발현되는 것으로 간주되기 위해서, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재해야 한다. "검출 가능한 수준"이란 상기 마커가 표준 실험 방법들 중 하나, 예를 들어 PCR, 블럿팅 또는 FACS 분석을 사용하여 검출될 수 있음을 의미한다. 유전자는 30 회의 PCR 주기 후에 타당하게 발현이 타당하게 검출될 수 있는 경우(이는 세포당 약 100 개 사본의 세포중 발현 수준에 상응한다) 본 발명의 집단의 세포에 의해 발현되는 것으로 간주된다. "발현하다" 및 "발현"이란 용어는 상응하는 의미를 갖는다. 상기 한계 이하의 발현 수준에서, 마커는 발현되지 않는 것으로 간주된다. 본 발명의 세포 중 마커의 발현 수준과 또 다른 세포, 예를 들어 배아 줄기세포 중 동일 마커의 발현 수준 간의 비교를 바람직하게는, 동일한 종으로부터 단리된 상기 두 세포 유형을 비교함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 종은 포유동물이며, 보다 바람직하게는 상기 종은 인간이다. 상기와 같은 비교를 편의상 역전사효소 폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR) 실험을 사용하여 수행할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 세포 집단 또는 오르가노이드는 본 발명에 따른 세포집단 또는 오르가노이드 중 세포의 약 5% 이상(예를 들어 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%)이 마커의 발현을 보이는 경우 상기 마커를 발현하는 것으로 간주된다.
일부의 실시태양에서, 상기 세포는 상기 세포가 하우스키핑 유전자 GADPH의 mRNA 사본의 수에 비해 세포 마커를 암호화하는 mRNA의 1 x 102 내지 1 x 105, 예를 들어 5 x 102 내지 1 x 104, 또는 1 x 103 내지 1 x 104 배 더 많은 사본을 포함하는 경우 현저한 수준으로 상기 세포 마커를 발현한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드 또는 세포 중의 유전자의 발현은 확대 배지에서 배양 시, 상기 오르가노이드 또는 세포를 분화 배지에서 또는 완전히 분화된 성숙한 조직에서 배양하는 경우보다 여러 배(예를 들어 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배 이상) 더 높다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드는 분화 조건 하에서 배양 시, 확대 조건 하에서 배양된 때의 본 발명의 세포 또는 오르가노이드에 비해 분화 유전자로서 공지된 유전자의 발현의 증가를 나타내며 또한 확대 배지에서 배양된 때의 본 발명의 세포 또는 오르가노이드에 비해 적어도 하나 이상의 줄기세포/선조 유전자의 발현 수준의 감소를 보일 수도 있다.
당해 분야에 공지된 다수의 물리적인 분리 방법들 중 어느 하나를 사용하여 본 발명의 상기 태양의 세포를 선택하고 상기를 다른 세포 유형들로부터 구분할 수 있다. 상기와 같은 물리적인 방법은 FACS 및 본 발명의 세포에 의해 특이적으로 발현되는 마커를 기본으로 하는 다양한 면역-친화성 방법을 수반할 수 있다. 상술한 바와 같이, Lgr5, CD44 및 Sox9가 본 발명의 줄기세포에서 높은 수준으로 발현되는 세포 마커 중 셋이다. 따라서, 단지 예시에 의해, 본 발명의 줄기세포를 상기 마커의 존재에 의존하는 다수의 물리적인 분리 방법에 의해 단리할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포를, 예를 들어 이들 마커 중 하나에 대한 항체를 사용하는 FACS에 의해 단리할 수 있다. 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 사용하여 특정 세포 유형 또는 계통의 특징 마커를 검출할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 상기를 형광 표지된 항체를 통해서 또는 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는 형광 표지된 2차 항체를 통해 성취할 수 있다. 적합한 형광 표지의 예는 비제한적으로 FITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 488, GFP, CFSE, CFDA-SE, 딜라이트(DyLight) 488, PE, PerCP, PE-알렉사 플루오르(등록상표) 700, PE-Cy5 (트라이 컬러(TRI-COLOR)(등록상표)), PE-Cy5.5, PI , PE-알렉사 플루오르(등록상표) 750, 및 PE-Cy7를 포함한다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며 제한하고자 하는 것은 아니다.
항-Lgr5 항체를 사용하는 FACS 분석이 정제된 줄기세포 집단을 제공함은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 그러나, 일부 실시태양에서, 다른 확인 가능한 마커들 중 하나 이상을 사용하는 추가 라운드의 FACS 분석을 수행함으로써 상기 세포 집단을 추가로 정제하는 것이 바람직할 수 있다.
면역조직화학을 또한 사용하여 바이오마커의 분포 및 위치 및 세포 집단 또는 오르가노이드의 상이한 부분들에서 상이하게 발현되는 단백질을 알 수 있다. 항체-항원 상호작용을 가시화하는 것은 당해 분야에 널리 공지된 다수의 방법들, 예를 들어 문헌[Barker et al, Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.Nature, 2007 Oct 25;449(7165):1003-7]에 개시된 것들로 수행될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포를 면역-친화성 정제에 의해 단리할 수 있으며, 상기 정제는 당해 분야에 널리 공지된 분리 방법이다. 단지 예로서, 본 발명의 세포를 c-키트에 대한 면역-친화성 정제에 의해 단리할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 상기 방법은 정제 컬럼 상의 항체의 고정화에 의존한다. 이어서 상기 세포 샘플을 상기 컬럼에 로딩하여, 적합한 세포가 상기 항체에 의해 결합되게 하고, 따라서 상기 컬럼에 결합되게 한다. 세척 단계에 이어서, 상기 세포를, 상기 고정화된 항-c-키트 항체에 우선적으로 결합하고 상기 세포를 상기 컬럼으로부터 방출되게 하는 경쟁자를 사용하여 상기 컬럼으로부터 용출시킨다. 고정화된 항체를 사용하는 면역-친화성 정제가 정제된 세포 집단을 제공함은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 그러나, 일부의 실시태양에서, 상기 세포 집단을, 다른 확인 가능한 마커 중 하나 이상을 사용하여 추가 라운드의 면역-친화성 정제를 수행함으로써 추가로 정제하고, 다른 관련된 세포내 마커의 발현을 확인하기 위해서 상기 단리된 클론들의 분액을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
LGR5 또는 줄기세포 정제에 임의의 수의 정제 단계, 예를 들어 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 상피의 EDTA 정제 또는 Epcam FACS 분류에 의한 상피의 정제가 선행될 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.
연속적인 정제 단계들이 동일한 물리적인 분리 방법을 수반하기 위해 반드시 필요한 것은 아님은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 따라서, 예를 들어 상기 세포를 항-Lgr5 항체를 사용하여 FACS 단계를 통해 정제한 다음 SSEA-1 친화성 컬럼을 사용하는 면역-친화성 정제 단계를 수행할 수 있음은 명백할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 단리 후에 약 15일 이상, 약 20일 이상, 약 25일 이상 또는 약 30일 이상 동안 배양할 수 있다. 몇몇 태양에서, 상기 세포를 더 오래 배양물에서 확대시켜 상기 세포 집단에서의 상기 세포 표현형의 동종성을 개선시킨다.
미세배열 분석, 클러스터 분석 및 비교에 의한 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 집단 표현형을 원래 모 세포 또는 적합한 생체 내 대응물의 표현형과 비교할 수 있다(문헌[Sato T et al., Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 469 415-418]).
Lgr5+ 줄기 세포의 계통 추적은 오르가노이드에서의 소낭-융모 특징의 보존을 입증한다.
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*또 다른 실시태양에서, 고 함량 분석을 사용하여 본 발명의 줄기세포의 표현형 보전을 평가할 수 있다. 예를 들어, 다수의 고 함량 선별 키트 및 플랫폼, 예를 들어 포인트 스캐닝 4 색 이미지익스프레스(ImageXpress) ULTRA(Molecular Devices, Union City, USA), 회전 디스크(닙코 디스크) 패쓰웨이(Pathway) 855 및 435(BD Biosciences)(이전에는 Atto Biosciences, Rockville, Maryland), 오페라(Opera)(PerkinElmer Inc., Waltham, MA) 및 슬릿 스캐닝 IN 쎌(Cell) 3000(GE/Amersham Biosciences, Cardiff, UK), 어래이스캔(Arrayscan) VTI(Cellomics (Cellomics)), IN 쎌 분석기 2000(GE Healthcare Piscataway, New Jersey, USA), 애큐멘(Acumen) eX3(TTP LabTech Ltd (Acumen eX3)), 스캐널라이저(Scanalyzer)(Scanalyzer LemnaTec, Aachen Germany) 및 이미지익스프레스 MICRO(Molecular Devices, Union City, USA), IN 쎌 1000(GE/Amersham Biosciences Piscataway, New Jersey, USA), 더 패쓰웨이(the Pathway) HT(Becton Dickinson Biosciences) 및 더 이미지익스프레스 MICRO(Molecular Devices, Union City, USA), 스캔(Scan)^R(Olympus Soft Imaging Solutions, Germany)이 존재한다.
도말 밀도
본 발명의 일부 실시태양에서, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 세포들의 큰 덩어리보다는 단일 세포 현탁액 또는 세포들의 작은 덩어리(2 내지 50 세포/덩어리)를 통상적으로 시딩할 것이다. 상기 세포가 분열됨에 따라, 상기를 세포 증식을 촉진하는 밀도로 지지체상에 시딩할 것이다. 전형적으로, 단일 세포가 단리되면, 1 내지 500 세포/웰의 도말 밀도를 사용하며, 상기 웰의 표면은 0.32 ㎠이다. 덩어리를 시딩하는 경우, 도말 밀도는 바람직하게는 250 내지 2500 세포/㎠이다. 재도말을 위해서, 약 2500 세포/㎠ 내지 약 5,000 세포/㎠의 밀도가 사용될 수 있다. 재도말 중에, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 세포들의 큰 덩어리보다는 단일 세포 현탁액 또는 세포들의 작은 덩어리를 통상적으로 시딩할 것이다.
추가의 분화
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 확대 배지의 몇몇 성분들을 회수하여 상기 배양된 세포의 세포운명을 분화를 향해 변화시킬 수 있다. 미분화된 상태를 유지하고/하거나 줄기세포 또는 선조세포 유전자 프로그램을 활성화하는데 책임이 있는 배양 배지의 임의의 성분들을 상기 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 일부의 실시태양에서, 본 발명의 억제제의 회수는 오르가노이드의 세포를 성숙한 세포로, 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드의 성숙한 배상세포 및 장내분비 세포로 분화되게 할 수 있다. 따라서 일부의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 억제제를 포함하지 않는 2차 배양 배지를 사용하여 상기 오르가노이드를 추가로 분화시키는 방법을 제공한다. 예를 들어 실시예 1을 참조하시오.
예를 들어, 일부의 실시태양에서, TGF-베타의 억제제 및/또는 p38의 억제제를 상기 세포 배양 배지로부터 회수하여 상기 세포를 분화되게 한다. 세포 배양 배지로부터 성분의 "회수된" 또는 "회수"란 상기 세포를 재도말하고 배지를 변화시킬 때, 상기 성분을 새로운 배지에 첨가하지 않음을 의미한다.
일부의 실시태양에서, Wnt가 확대 배지 중에는 존재하지만 분화 배지에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부의 실시태양은 결장 오르가노이드의 성숙한 장세포로의 분화를 위해 Wnt를 회수함을 포함한다. Wnt는 또한 회수되어 소낭-융모 오르가노이드의 분화를 가능하게 할 수 있다.
일부의 실시태양에서, R스폰딘은 확대 배지 중에는 존재하지만 분화 배지에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부의 실시태양은 결장 오르가노이드의 성숙한 장세포로의 분화를 위해 R스폰딘을 회수함을 포함한다. R스폰딘을 또한 회수하여 소낭-융모 오르가노이드의 분화를 가능하게 할 수 있다. 일부의 실시태양에서 R스폰딘 및 Wnt를 회수하여 소낭-융모 오르가노이드의 분화를 가능하게 할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 니코틴아미드는 확대 배지 중에는 존재하지만 분화 배지에는 존재하지 않는다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 니코틴아미드 및 SB202190(또는 또 다른 p38 억제제)은 세포 배양 배지로부터 회수되어, 상기 세포의, 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드로의 분화를 가능하게 할 수 있다.
따라서, 분화된 세포 또는 오르가노이드의 수득 방법은, 상피 세포를 생존 및/또는 증식될 수 있게 TGF-베타 및/또는 p38 억제제를 포함하는 본 발명의 배양 방법에서 상기 세포를 배양하고(즉 확대 배지) 및 이어서 상기 세포를 계속해서 배양하고 배지를 새로 공급함(여기에서 상기 새로 공급된 배지는 TGF-베타 억제제 및/또는 p38 억제제를 포함하지 않는다)(즉 분화 배지)을 포함할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 상기 분화 배지는 추가적인 성분들을 포함한다. 예를 들어 일부의 실시태양에서 상기 분화 배지는 감마 세크레타제 억제제, 예를 들어 DAPT 또는 DBZ를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 분화 배지는 RANK 리간드(또한 본 발명에서 RANKL이라 칭한다)를 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 감마 세크레타제 억제제의 첨가는 장 오르가노이드 세포, 예를 들어 소장 오르가노이드 세포의 분화를 분비 세포, 예를 들어 배상세포쪽으로 향하게 할 수 있다. RANKL의 상기 배양 배지에의 첨가는 분화 장 오르가노이드 세포, 예를 들어 소장 오르가노이드 세포를 M 세포쪽으로 향하게 할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 관심 조직으로부터 줄기세포를 분화시키기 위한 배양 배지를 제공하며, 여기에서 상기 배양 배지는 상기 관심 조직 유형으로부터의 줄기세포를 확대시키기 위해 사용되는 배양 배지의 성분들을 포함하거나 상기로 이루어지나, 여기에서 하기 중 하나 이상이 줄기세포 분화용 배지로부터 제외된다: Wnt, R스폰딘, BMP 억제제, TGF-베타 억제제, 수용체 타이로신 키나제 리간드, p38 억제제 및 니코틴아미드.
더욱 또한, 본 발명은 단일 줄기세포 또는 줄기세포의 집단을 확대시켜, 바람직하게는 오르가노이드를 생성시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 단일 줄기세포 또는 줄기세포의 집단을 본 발명에 따른 배양 배지에서 배양함을 포함하고, 여기에서 상기 방법은
상기 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 1차 확대 배지에서 배양하고;
상기 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 계속해서 배양하고 상기 배지에 분화 배지를 새로 공급하며, 여기에서 상기 분화 배지는 TGF-베타 억제제, p38 억제제, 니코틴아미드 및 Wnt 중에서 선택된 인자들 중 하나 이상, 바람직하게는 전부를 포함하지 않음
을 포함한다.
일반적으로, 성분이 배지로부터 "제거되는" 것으로 개시되는 경우에 이는 상기 배지를 새로 공급하는 경우 성분이 첨가되지 않음, 즉 상기 성분이 상기 새로 공급된 배지로부터 제외됨을 의미한다. 상기 배지가 "새로 공급될" 때, 이는 상기 배지가 세포외 기질로부터 물리적으로 제거되고 이어서 새로운 배지로 대체됨을 의미한다.
결장, 간 및 췌장의 경우, 확대 배지 중에는 매우 적은 분화된 세포가 존재한다. 오직 상기 확대 배지가 분화 배지로 대체된 경우에만, 상기 세포가 분화를 시작한다. 이 단계에서, 상기 오르가노이드는 또한 그의 줄기세포를 상실하기 시작한다. 분화된 오르가노이드는 몇몇 용도, 예를 들어(비제한적으로) 이식, 대사성 질병의 약물 선별, 독물학(예를 들어 간세포를 포함하는 간 오르가노이드를 사용하여) 및 소장의 항균 작용의 연구에 적합할 수 있다. 확대 오르가노이드는 일반적으로 다른 용도, 예를 들어(비제한적으로) 재생 의학 및 예를 들어 암 또는 낭성 섬유증에 대한 약물 선별에 보다 적합할 수 있다. 확대 오르가노이드는 일반적으로, 분화된 오르가노이드보다 더 큰 성장 잠재성(및 따라서 더 큰 수명)을 갖는다. 일부의 실시태양에서, 결장, 간 및 췌장 오르가노이드는 추가로 분화되지 않는다.
소장 및 전립선 오르가노이드는, 이들이 확대 줄기세포 집단을 유지하는 동시에 또한 분화한다는 점에서 결장, 간 및 췌장 오르가노이드와 다르다. 이들은 분화된 세포 유형을 존재하게 하기 위해서 별도의 분화 배지에서 배양될 것을 필요로 하지 않는다. 이들은 확대 및 분화된 오르가노이드 모두의 성질을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 소장 오르가노이드의 완전한 분화를 성취하기 위해서, 상기 오르가노이드를, 바람직하게는 Wnt3a를 포함하지 않고 바람직하게는 감마 세크레타제 억제제 및/또는 RANK 리간드(또한 본 발명에서 RANKL이라 칭함)를 포함하는 별도의 분화 배지에서 배양할 수 있다. "완전한" 분화란 배상세포, 신경내분비 세포, 술세포, M-세포, 장세포 및 파네쓰 세포를 포함하여 모든 분화된 세포 유형이 존재함을 의미한다. 이들 분화된 세포 유형 중 일부, 예를 들어 파네쓰 세포가 또한 확대 오르가노이드 중에 존재한다(때때로 보다 작은 양으로).
오르가노이드
상술한 세포는 오르가노이드로 성장한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 오르가노이드는 본 발명의 추가의 태양이다. 또한 본 발명에 개시된 바와 같은 오르가노이드를 제공한다. 상기 오르가노이드는 바람직하게는 인간 오르가노이드이다. 우리가 알고 있는 한, 이는 상기와 같은 연장된 기간(즉 3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상, 또는 그 이상의 배양; 본 발명에 포함된 실시예 참조) 후에 작용성이고 살아 있는 인간 오르가노이드가 수득된 최초이다. 작용성은 바람직하게는 조직-특이성 마커의 존재 및/또는 본 발명에 정의된 바와 같은 상기 오르가노이드의 구조를 특징으로 한다. 수득된 오르가노이드의 최종량은 배양의 지속 기간과 상관이 있기 때문에, 숙련가는 본 발명이 개척 발명이며 예를 들어 재생 의학에 새로운 가능성을 연 것을 알 것이다. 따라서, 3 개월 이상(예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 개월 이상)의 배양 후에 작용성이고 살아 있는 본 발명에 개시된 바와 같은 오르가노이드를 제공한다. 예를 들어, 3 개월 이상(예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 개월 이상)의 배양 후에 구조, 마커 발현 및 작용 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 또는 3 개)을 유지하는 본 발명에 개시된 바와 같은 오르가노이드를 제공한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 오르가노이드는 1 x 103 세포 이상, 1 x 104 세포 이상, 1 x 105 세포 이상, 1 x 106 세포 이상, 1 x 107 세포 이상의 세포 집단을 포함할 수 있다. 각각의 오르가노이드는 대략 1 x 103 세포 내지 5 x 103 세포를 포함한다. 발명자들은 오르가노이드가 단일 Lgr5+ 줄기세포로부터, 상술한 바와 같은 세포 집단을 포함하거나 또는 대략 104 세포의 세포 집단을 포함하는 오르가노이드로 성장이 가능함을 입증하였다. 예를 들어, 본 발명에 이르러 마우스가 단일 줄기세포로부터 오르가노이드의 성장을 시작할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 단일 줄기세포로부터 오르가노이드를 생성시키는 방법을 제공한다. 일부의 실시태양에서, 상기 오르가노이드는 대략 104 세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 10 내지 20, 또는 20 내지 30 또는 30 내지 40 또는 40 내지 50 개의 오르가노이드가 함께 24 웰 플레이트의 각 웰 중에서 증식할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 배양 배지에서 배양 시 3 개월 이상, 예를 들어 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 동안 배양물 중에서 생존할 수 있는 오르가노이드 또는 세포집단을 제공한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 주당 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 또는 10 배 이상의 비율로 확대되는 오르가노이드 또는 세포집단을 제공한다.
바람직하게는 상기 세포집단 또는 오르가노이드는 주당 약 4 내지 5 배 또는 주당 2 배 초과의 집단 배가의 비율로 확대될 것이다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 상기 세포집단 또는 오르가노이드는 주당 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 또는 10 배 이상의 비율로 확대될 것이다.
본 발명의 오르가노이드를 임의의 적합한 공급원으로부터 단리된 세포를 사용하여 수득할 수 있다. 일반적으로, 오르가노이드의 생성에 사용되는 세포를, 생성되는 오르가노이드와 동일한 조직 유형으로부터 단리할 것이다. 상기 오르가노이드는 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 쥐, 소, 돼지 또는 인간이다. 가장 바람직하게는, 상기 오르가노이드는 인간이다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은, 상기 오르가노이드 또는 세포집단이 정상(건강한) 오르가노이드 또는 세포 집단, 또는 병든 인간 또는 동물로부터 취한 줄기세포를 배양함으로써 수득된 병든 오르가노이드 또는 세포 집단인, 오르가노이드 또는 세포 집단을 제공한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 -5 ℃ 이하, -10℃ 이하, -20℃ 이하, -40℃ 이하, -60℃ 이하, 또는 -80℃ 이하, -100℃ 이하, -150℃ 이하, 또는 대략 -180℃에서 동결 및 보관되는 오르가노이드 또는 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 오르가노이드 또는 세포집단을 액체 질소 중에 보관할 수도 있다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 액체 질소 중에 보관되는 오르가노이드 또는 세포집단을 제공한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 소장 오르가노이드, 결장 오르가노이드, 위 오르가노이드, 췌장 오르가노이드, 간 오르가노이드, 또는 전립선 오르가노이드인 본 발명의 오르가노이드를 제공한다.
오르가노이드 구조 및 형태
줄기세포의 확대에 의해 수득 가능한 본 발명의 오르가노이드는 그의 생체 내 대응물을 닮은 세포집단을 제공한다.
상 분석을 사용하여 배양물 중의 세포의 특징, 예를 들어 세포 형태; 세포 구조; 세포사멸 또는 세포 용해에 대한 증거; 및 오르가노이드 조성 및 구조를 평가할 수도 있다. 다수의 유형의 상 분석, 예를 들어 전자 현미경 검사, 공초점 현미경 검사, 입체현미경 검사, 형광 현미경 검사가 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 조직학적 분석은 기본 구조 및 세포 유형을 밝혀낼 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 오르가노이드의 예시적인 예를 첨부되는 도면에 제공한다. 본 발명에 따른 오르가노이드는 하나 이상의 돌기 및 중심 관광을 갖는 세포층을 가질 수 있다. 매트리젤 외부의 오르가노이드는 상기 매트리젤 중심의 오르가노이드보다 더 큰 경향이 있는데, 그 이유는 추정상 상기가 필요한 성장 인자에 더 양호한 접근을 갖기 때문이다. 구조적으로, 본 발명에 따른 오르가노이드는 종종 모양이 신장된다. 상기는 하나 이상의 발아 구조, 즉 관 또는 섬과 유사한 단일 세포 상피층을 포함할 수 있다. 공초점 현미경 검사 하에서, 상기 구조는 케라틴에 대해 양성으로 염색될 수 있다. 상기는 양극화된 핵 및 작은 세포질을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 오르가노이드는 다수의 층으로 형성된 섹션을 가질 수도 있다; 상기와 같은 세포는 종종 상기 세포에 대해 보다 중심에 핵을 갖는 경향이 있다, 즉 양극화되지 않는다. 상기 다층 섹션에서 상기 세포는 스스로 조직화되어 상기 세포들 사이에 틈 또는 관강을 포함할 수 있다. 일부의 실시태양에서 본 발명의 오르가노이드는 상피 세포의 단일 층을 포함하거나 상기로 이루어진다. 일부의 실시태양에서, 비-상피 세포는 상기 오르가노이드로부터 존재하지 않는다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드는 그의 상응하는 생체 내 조직 대응물 중에 존재하는 모든 분화된 세포 유형들을 포함한다.
일부의 실시태양에서 인간 장 오르가노이드는 선행 배양 조건 하에서 나타난 낭성 구조보다는 발아하는 오르가노이드 구조를 나타내었다. 3 개월보다 더 오래된 오르가노이드의 중기 확장은 3 개의 상이한 공여체로부터 취한 20 개 세포 각각에서 46 개 염색체를 일관되게 드러내었다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드는 세포의 단일 단층을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드는 다수의 층으로 형성된 섹션을 갖는다. 세포의 다수의 층을 또한 본 발명에서는 "층상화된" 세포 영역이라 칭한다. "층상화된"은 세포의 다수(하나 초과)의 층이 존재함을 의미한다. 일부의 실시태양에서 본 발명의 오르가노이드는 폴딩된(또는 함입된) 단일 단층을 포함하여 2 개 이상의 층을 형성한다. 때때로 폴딩된(또는 함입된) 단층과 층상화된 세포의 영역을 구분하는 것이 어려울 수 있다. 일부의 실시태양에서 오르가노이드는 층상화된 세포의 영역과 폴딩된 단층의 영역 모두를 포함한다. 일부의 실시태양에서 본 발명의 오르가노이드는 다수의 층으로 형성된 섹션 및 세포의 단일 단층을 포함하는 섹션을 갖는다. 형태학적으로, 상기 세포는 그의 상응하는 생체 내 조직 대응물처럼 보인다.
따라서, 일부의 실시태양에서 본 발명은, 바람직하게는 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 수득할 수 있는, 중심 관강을 둘러싸는 상피 세포를 포함하는 3차원 오르가노이드인 오르가노이드를 제공하며, 여기에서 임의로 상기 상피 세포는 별개의 분할 도메인 및 분화 도메인 중에 존재한다. 일부의 실시태양에서 본 발명의 오르가노이드는 단층, 임의로 폴딩된 단층의 영역 및 층상화된 세포의 영역으로 배열된 상피 세포를 포함하는 3차원 오르가노이드이다. 일부의 실시태양에서, 비-상피 세포는 상기 오르가노이드에 없다. 일부의 실시태양에서, 상기 정상적인 생체 내 조직의 모든 분화된 세포 유형이 상기 오르가노이드 중에 존재한다.
소낭-융모 오르가노이드
소장 소낭-융모 오르가노이드에서 상기 오르가노이드의 구조적 배열은 생체 내 소낭-융모의 구조와 매우 유사하다, 즉 Lgr5+ 줄기세포 및 그의 니치 세포(파네쓰 세포)는 상기 소낭의 기부에서 서로 이웃하고, 이어서 상기 소낭의 기부 바로 위에 변화 증식 세포가 있고 융모의 측부 및 최종적으로 분화된 세포, 예를 들어 상기 융모의 나머지를 구성하는 장세포에 이르러 상기 융모의 상부를 향해 점점 더 분화된다. 본 발명에 따른 오르가노이드는 하나 이상의 돌기 및 중심 관강을 갖는 세포들의 층을 가질 수 있음을 알 수 있다. 상기 매트리젤 외부의 오르가노이드는 상기 매트리젤 중심의 오르가노이드보다 더 큰 경향이 있는데, 그 이유는 추정상 상기가 필요한 성장 인자에 더 양호한 접근을 갖기 때문이다. 구조적으로, 본 발명에 따른 오르가노이드는 종종 모양이 신장된다. 공초점 현미경 검사 하에서, 상기 구조는 케라틴에 대해 양성으로 염색될 수 있다. 상기는 양극화된 핵과 작은 세포질을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 소낭-융모 오르가노이드는 일반적으로 단일층이다.
일부의 실시태양에서, 예를 들어 마우스 소낭-융모 오르가노이드의 경우에, 소낭-융모 오르가노이드는, 분화된 세포 유형을 포함하는 상피 도메인인 융모-유사 상피가 늘어선 중심 관강을 둘러싸는 소낭-유사 도메인을 포함하는 3차원 오르가노이드이다. 일부의 실시태양에서, 비-상피 세포는 상기 오르가노이드가 없다.
일부의 실시태양에서, 예를 들어 인간 소낭-융모 오르가노이드의 경우에, 소낭-융모 오르가노이드는 중심 관강을 둘러싸는 소낭-유사 도메인을 포함하는 3차원 오르가노이드이다. 일부의 실시태양에서, 분열 세포는 발아 구조로 국한된다. 분화된 세포가 거의 또는 전혀 존재하지 않는다. 분화 조건 하에서 장의 분화된 세포가 형성된다. 일부의 실시태양에서, 비-상피 세포가 상기 오르가노이드에 없다. 일부의 실시태양에서, 상기 오르가노이드가 확대되는 경우, 예를 들어 상기가 본 발명에 따른 확대 배양 배지 중에 있는 경우, 상기 오르가노이드는 분화된 세포가 거의 또는 전혀 없다.
일부의 실시태양에서, RANKL을 포함하는 본 발명의 배양 배지에서 배양된 본 발명의 소장 오르가노이드는 M-세포를 포함한다. 본 발명의 일부의 실시태양에서, 감마-세크레타제 억제제를 포함하는 본 발명의 배양 배지 중에서 배양된 본 발명의 소장 오르가노이드는 배상세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 분화 배지에서 배양된 소장 오르가노이드(예를 들어 여기에서 상기 분화 배지는 기본 배지, 노긴, EGF, TGF-베타 억제제 및 p38 억제제, 감마-세크레타제 억제제 및 RANKL를 포함한다)는 예를 들어 배상세포, 신경내분비 세포, 술세포, M-세포, 장세포 및 파네쓰 세포를 포함하여 모든 분화된 세포 유형들을 포함한다. 이들 분화된 세포 유형들 중 일부, 예를 들어 파네스 세포가 또한 상기 확대 오르가노이드 중에 존재한다(때때로 보다 소량으로).
인간 장 오르가노이드는 선행의 배양 조건 하에서 나타난 낭성 구조보다는 발아하는 오르가노이드 구조를 나타낸다. 새로 단리된 소낭의 상부 개구는 밀봉되며 상기 영역은 점진적으로 부풀어 오르고 세포사멸 세포로 충전되게 되며, 매우 그럴듯하게 세포사멸 세포는 상기 융모 끝에서 떨어져 나간다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 상기 소낭-융모 오르가노이드는 융모-유사 상피가 늘어서고 세포사멸 세포체가 충전된 중심 관강을 둘러싸는 소낭-유사 구조를 갖는다. 일부의 실시태양에서, 상기 관강은 연속적인 시간 간격으로 개방되어 내용물을 배지 내로 방출시킨다.
일부의 실시태양에서, 상기 소낭 영역은 연속적인 발아 사건을 겪어 추가적인 소낭들을 생성시킨다(소낭 분열을 연상케하는 과정).
발명자들은 또한 본 발명의 배지 및 방법에 의해 생성된 인간 장 오르가노이드가 외부 인자들에 반응하여 생체 내 세포 운명 결정을 모방함을 입증하였다. 예를 들어, 장 줄기세포에서 노치 억제는 생체 내에서 장 상피 증식을 종결시키고 배상세포 과형성을 유도함이 앞서 입증되었다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명의 장 오르가노이드는 노치 억제제로 처리 시 증식을 멈추며 대부분의 세포(예를 들어 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과)는 3일 이내에 배상세포로 전환된다.
3 개월보다 더 오래된 오르가노이드의 중기 확장은 3 개의 상이한 공여체로부터 취한 20 개 세포 각각에서 46 개 염색체를 일관되게 드러내었다. 더욱 또한, 미세배열 분석은 배양물 중 줄기세포가 장 줄기세포 유전자를 포함하여 장 소낭 세포와 유사한 분자 특징을 가짐을 밝혀내었다.
결장 오르가노이드
결장 오르가노이드는 소낭-융모 오르가노이드와 유사한 세포 조성을 나타낸다. 따라서, 상기 소낭-융모 오르가노이드에 대한 설명을 결장 오르가노이드에 준용해서 적용한다. 예를 들어 도 1 및 2를 참조하시오.
전형적으로, 상기 결장과 소장 오르가노이드 간의 차이는 소낭이 결장에서 더 얕아, 돌기들을 갖는 구보다는 약간 "축구공"같이 보이게 한다는 것이다. 소장 및 결장 오르가노이드는 모두 줄기세포 및 변화 증식(TA) 세포를 함유하는 도메인, 및 분화하는 및/또는 분화된 세포를 함유하는 다른 도메인을 갖는다. 소장 오르가노이드의 경우, 상기 분화된 도메인을 때때로 "융모-유사"라 칭한다. 상기 결장 오르가노이드의 분화된 도메인은 전형적으로 세포 조성에 있어서 상기 소장의 "융모-유사" 도메인과 유사하지만 상기 결장 자체는 융모를 갖지 않는다.
존재하는 Wnt의 양이 상기 오르가노이드 중의 발아 구조의 크기(즉 소낭의 깊이)에 영향을 미칠 수 있다. 보다 많은 Wnt는 발아를 감소시킨다. 상기 결장은 소장보다 많은 Wnt를 생성시키며 따라서 배양 배지 중에 더 적은 추가 Wnt를 필요로 하고 전형적으로는 상기 소장보다 더 얕은 소낭을 갖는다. 같은 차이가 상기 오르가노이드에서 나타난다.
일부의 태양에서, 결장 오르가노이드가 본 발명에 의해 제공된다. 발명자들은 마우스 결장 오르가노이드를, ENR + Wnt3A(WENR) 세포 배양 배지에서 결장 소낭을 배양함으로써 수득할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 WENR 배지에서 결장 소낭을 배양함으로써 수득되는 결장 오르가노이드를 제공한다.
발명자들은 또한 놀랍게도 인간 결장 오르가노이드를 WENR + 가스트린 + 니코틴아미드를 포함하는 배양 배지를 사용하여 유지시킬 수 있음을 발견하였다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 인간 결장 오르가노이드를, WENR + 가스트린 + 니코틴아미드를 포함하고 TGF 베타의 억제제를 또한 포함하는 배지를 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 하기의 세포 배양 배지를 사용하여 인간 결장 오르가노이드를 수득할 수 있다: WENR + 가스트린 + 니코틴아미드 + A8301 + SB202190. 다른 실시태양에서, 하기의 세포 배양 배지를 사용하여 인간 결장 오르가노이드를 수득할 수 있다: WENR + 니코틴아미드 + A83-01.
일부의 실시태양에서, 마우스 결장 오르가노이드는 대략 200 내지 700 um, 예를 들어 250 내지 600 um, 300 내지 500 um, 320 내지 450 um, 340 내지 400 um, 300 내지 380 um, 예를 들어 대략 360 um의 최대 직경을 갖는다. 일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드는 대략 100 내지 400 um, 예를 들어 150 내지 350 um, 170 내지 300 um, 190 내지 280 um, 195 내지 250 um, 예를 들어 대략 235 um의 최소 직경을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 상기 오르가노이드는 1 ㎜ 이하의 직경을 가질 수 있다. 일부의 실시태양에서, 인간 결장 오르가노이드는 대략 300 내지 800um, 예를 들어 350 내지 700 um, 400 내지 600 um, 450 내지 550 um, 475 내지 540 um, 500 내지 530 um, 예를 들어 대략 500 um의 최대 직경을 갖는다. 일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드는 대략 200 내지 500um, 예를 들어 250 내지 450 um, 300 내지 415 um, 350 내지 400 um, 325 내지 380 um, 예를 들어 대략 375 um의 최소 직경을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 상기 오르가노이드는 1 ㎜ 이하의 직경을 가질 수 있다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 결장 오르가노이드는 발아 구조를 포함한다. 상기는 EdU 염색을 사용하여 증식하는 세포를 가시화함으로써 볼 수 있다.
인간 결장 오르가노이드는 인간 장 줄기세포 배양("HISC") 조건(WENRg + 니코틴아미드 + TGF-베타 억제제(예를 들어 A83-01) + p38 억제제(예를 들어 SB202190)) 하에서 그의 특징적인 발아 구조를 유지한다. 일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드는, 증식하고 줄기세포를 함유하는 발아 구조를 포함하는 3차원 오르가노이드이다. 상기 줄기세포 도메인은 중심 관강을 둘러싼다. 분열 세포는 일반적으로 상기 발아 구조로 국한된다. 일부의 실시태양에서, 분화된 세포가 거의 또는 전혀 존재하지 않는다. 분화 조건 하에서 상기 장의 분화된 세포, 예를 들어 성숙한 장세포가 형성된다. 일부의 실시태양에서, 비-상피 세포는 상기 오르가노이드가 없다.
췌장 오르가노이드
본 발명의 췌장 오르가노이드는 바람직하게는 발아를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 직경이 100 내지 1000 마이크로미터, 예를 들어 200 내지 900 마이크로미터, 300 내지 1000 마이크로미터, 400 내지 700 마이크로미터이다. 상기 췌장 오르가노이드는 바람직하게는 단일층이다. 섬 또는 도관 구조의 맨 처음만이 존재한다. 발아 구조는 건강한 증식 상태 및 줄기세포 유지를 가리킨다.
일부의 실시태양에서, 예를 들어 췌장 오르가노이드를 본 발명의 배양 배지 중에서 증식시킬 때(TGF-베타 억제제의 부재 하에서), 췌장 오르가노이드는 주로 낭성 구조이며 이때 발아 구조 또는 도관 유사 도메인은 거의 없다. 상기 낭성 구조는 주로 단층을 포함하지만 층상화된 세포의 일부 영역이 존재할 수도 있다. 상기 세포는 줄기세포 및 선조(도관) 마커를 발현한다. 분화된 세포, 예를 들어 베타-세포는 상기 오르가노이드 중에 존재하지 않는다. 상기 낭종은 주로 단층에 의해 형성되나, 층상화된 부분이 존재한다. 세포 유형은 줄기세포/선조세포(도관 세포 유전자 발현)를 닮는다. 분화된 세포(β-세포)는 존재하지 않는다.
다른 실시태양에서, 예를 들어 췌장 오르가노이드를 TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01의 존재 하에서, 예를 들어 본 발명의 배양 배지에서 증식시킬 때, 상기 췌장 오르가노이드는 Krt19 염색에 의해 나타난 바와 같이(도 31 참조), 보다 많은 발아 구조/도관-유사 도메인을 포함한다(이는 구조가 도관 같다기보다는 세포가 도관-유사 세포임을 의미한다). 양극화된 세포의 단층을 확인할 수 있으나 또한 층상화된 세포가 있는 영역을 확인할 수 있다.
선암종 및 결장암 오르가노이드
선암종 및 결장암 오르가노이드는 일반적으로 발아 구조 대신에 낭성 구조를 형성한다. 이는 양호한 세포 니치 지지체의 부재를 상기시킨다. EGF+노긴과 함께 배양된 선종 소낭은 처음 10일 동안 대략 16x 확대를 나타낸다. 선(암)종 및 결장암 오르가노이드는 유용한 연구 도구 및 약물 선별 모델을 제공할 수 있다.
암종, 선종 및 선암종 오르가노이드는 주로 낭성이다(예를 들어 도 4 및 9 참조). 그러나, 일부 실시태양에서, 이들은 또한 이들의 정상 조직 오르가노이드 대응물을 닮은 구조를 포함할 수 있다.
바렛 식도(BE) 오르가노이드
본 발명의 BE 오르가노이드는 발아 구조를 포함한다(예를 들어 도 5 참조).
형태학적으로, 본 발명의 오르가노이드 중의 세포는 그의 상응하는 생체 내 조직 대응물처럼 보인다.
바렛 식도는 하부 식도에 관상 상피의 존재를 특징으로 하는 질병으로, 화생의 결과로서 정상 편평상피 세포 상피를 대체한다. 바렛 식도의 조직학적 특징은 식도 중의 장 배상세포의 존재이다. 바렛 식도와 장 상피 간의 유사성을 활용하여, 발명자들은 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 바렛 식도 상피를 1 개월까지 유지시킬 수 있음을 보였다. 발명자들은 또한 FGF10을 본 발명의 배양 배지에 첨가하여 상기 바렛 식도 오르가노이드가 발아 구조를 형성할 수 있게 하고 상기 배양 기간을 3 개월보다 더 오래 현저하게 연장시킴을 처음으로 입증하였다. 따라서, 바렛 식도 오르가노이드는 본 발명의 오르가노이드의 일례이다. 일부의 실시태양에서, 바렛 식도 오르가노이드는 낭성 구조를 갖는다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 바렛 식도 오르가노이드는 파네쓰 세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 바렛 식도 오르가노이드는 라이소자임을 발현한다.
따라서, 발명자들은 또한 바렛 식도 상피의 배양을 위해서, FGF10을 포함하는 본 발명에 따른 배양 배지를 개시한다.
본 발명의 일부의 실시태양에서, 바렛 식도 오르가노이드를 FGF10을 또한 포함하는 본 발명에 따른 배양 배지를 사용하여 증식시킬 수 있다. 일부의 실시태양에서, 이들 바렛 식도 오르가노이드는 Ki67을 발현하고 최소 수, 바람직하게는 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 PAS-양성 세포 및 뮤신-양성 세포를 갖는다. 일부의 실시태양에서, 상기 바렛 식도 오르가노이드는 라이소자임-양성 파네쓰 세포를 포함한다.
복부(위) 오르가노이드(예를 들어 도 46 참조)
본 발명의 배양 배지에서 증식시킨 마우스 위 오르가노이드는, 분화된 세포 유형을 포함하는 상피 도메인이 늘어선 중심 관강을 둘러싸는 위샘 기부 유사 도메인(줄기 및 선조세포에 의해 형성됨)을 포함하는 단일 층 상피를 포함하거나 또는 상기로 이루어지고, 임의로 비-상피 세포가 상기 오르가노이드에 없는 3차원 오르가노이드이다.
본 발명의 배양 배지에서 증식시킨 인간 위 오르가노이드는 낭성 구조를 포함한다. 상기 낭성 구조는 양극화된 세포의 단층이다. TGF-베타 억제제의 존재 하에서 증식시킨 상기 인간 위 오르가노이드는 TGF-베타 억제제의 부재 하에서 증식시킨 인간 오르가노이드보다 훨씬 더 가깝게 마우스 위 오르가노이드를 닮는다.
전립선 오르가노이드(도 41 내지 43 참조)
EGF, 노긴, R스폰딘을 포함하는 배양 조건 하에서 쥐 전립선 오르가노이드는 관강을 갖는 3차원 낭성 구조를 형성한다. 이윽고, 상기 층들은 안쪽으로 폴딩하여 3 내지 4 층의 (층상화된) 상피 세포를 형성한다. 외부층은 대개 CK5+ 기저 상피 세포로 구성되는 반면 내부층은 주로 CK8+ 관강 상피 세포로 구성된다. 줄기세포 구획은 확인되지 않았으며; 모든 도메인은 분열하는 세포를 함유한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 테스토스테론의 부재 하에서 증식된 전립선 오르가노이드는 분열하는 상피 세포의 층상화된 층을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 전립선 오르가노이드는 CK5+ 기저 상피세포를 포함하는 외부 세포층 및 CK8+ 관강 상피세포를 포함하는 내부층을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 테스토스테론의 부재 하에서 증식된 전립선 오르가노이드는 어떠한 줄기 세포도 함유하지 않는다.
테스토스테론의 전립선 배양 배지에의 첨가
발명자들은 (다이하이드로)테스토스테론의 전립선 오르가노이드에 대한 배양 조건에의 첨가가 세포의 대다수를 CK8+ 관강 세포로 분화시키며, 이는 상피의 단일 층을 형성시키고 상기 층은 자신 위에서 2층으로 폴딩됨을 입증하였다. 테스토스테론의 존재 하에서 증식된 전립선 오르가노이드는 대개 기저 세포의 제 2 층과 함께 또는 상기 층 없이 관강 세포로 이루어진다. 상기 구조는 생체 내 구조를 닮는다. 분화된 및 분열하는 세포뿐만 아니라 줄기세포 및 선조세포가 존재한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 예를 들어 테스토스테론을 포함하는 배지에서 배양 시 전립선 오르가노이드는 낭성 구조 및 관강을 포함하는 3차원 오르가노이드이다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 오르가노이드는 상피의 단층을 형성하는 CK8+ 관강 세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 단층은 2 개 이상의 층으로 폴딩된다. 다른 실시태양에서, 상기 오르가노이드는 층상화된 세포의 영역을 포함할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 오르가노이드는 분열하는 줄기세포 집단을 유지하면서 분화된 세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 오르가노이드의 모양은 세포 또는 조직 출발 물질의 기원(즉 단리 전 전립선 중의 위치)에 의해 결정된다. 상기 전립선은 상술한 바와 같은 상이한 상피 구조(층상화된 및 폴딩된)를 나타내는 상이한 엽 또는 영역들로 이루어진다. 시험관 내에서 배양 후 상기 오르가노이드는 상기가 기원된 전립선 부분의 상이한 거시적인 구조(층상화되거나 폴딩된)를 어느 정도 유지하는 것으로 보인다.
간 오르가노이드
구조적으로, 본 발명에 따른 마우스 간 오르가노이드는 종종 모양이 신장된다. 상기는 하나 이상의 발아 구조, 즉 담관과 다르지 않은 구조를 갖는 단일 세포 상피층을 포함할 수 있다. 공초점 현미경 검사 하에서, 상기 구조는 케라틴에 대해 양성으로 염색될 수 있다. 상기는 양극화된 핵 및 작은 세포질을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 오르가노이드는 다수의 층들로 형성된 섹션을 가질 수 있으며; 상기와 같은 세포는 종종 상기 세포에 대해 보다 중심에 핵을 갖는 경향이 있다, 즉 양극화되지 않는다. 상기 다층 섹션에서 상기 세포는 스스로 조직화되어 상기 세포들 사이에 틈 또는 관강을 포함할 수 있다. 일부의 실시태양에서 본 발명의 인간 간 오르가노이드는 일반적으로 낭성 구조를 갖는다.
일부의 실시태양에서, 간 오르가노이드는 낭성 구조를 갖는 3차원 오르가노이드이다(예를 들어 도 30 참조). 확대 조건 하에서 상기 오르가노이드는 2 개의 도메인이 하기와 같이 정의되는 줄기세포 및 선조세포로 이루어질 수 있다: (1) 세포가 중심 관강에 늘어선 단일-층의 입방형 상피(도관 마커 Krt19에 대해 양성)에의해 형성된 도관-형 도메인; 및 (2) krt19 양성 세포 및 산란된 알부민 양성 세포가 검출되는 모의-층상화된 상피 도메인. 상기 구조(모의층상화된 상피 영역과 함께 단일층 상피를 갖는 영역)는 배아 간 돌기를 닮는다. 확대 조건 하에서 완전히 분화된 세포가 존재하지 않지만, 일부의 실시태양에서 간세포/간모세포-특이성 마커의 발현이 검출될 수 있다. 분화 조건은, 도관형 도메인(단일층 상피)이 상실되고 전체 구조가 >50% 양극화된 간세포를 함유하는 모의-층상화된 상피로 되는 낭성 오르가노이드를 형성시킨다.
간 오르가노이드는 바람직하게는 간세포 및 담혈관세포를 포함하며(간세포가 특히 DM에서 분화에 이어 보이고 확대에 요구되지 않지만), 보다 바람직하게는 하기의 마커 중 하나 이상이 검출될 수 있다: 하나 이상의 간세포 마커, 예를 들어 알부민, 트랜스티레트린, B-1 인테그린 및 글루타민 신시타제 및/또는 CYP3A11, FAH, tbx3, TAT 및 Gck 중 하나 이상 및/또는 하나 이상의 담혈관세포 마커, 예를 들어 케라틴 7 및 19. 숙련가는 각각의 이들 마커를 어떻게 검출하는 지를 안다(즉 RT-PCR 및/또는 면역형광). 바람직하게는 각각의 이들 마커의 발현을 실험 부분에서 수행된 바와 같이 평가한다. 각각의 이들 마커는 대개 본 발명의 방법을 사용하여 적어도 2 주, 3 주 또는 1 개월의 배양 후에 발현된다. 상기 두 배양 조건에서 상기 오르가노이드의 미세배열 분석은 간 오르가노이드가 성숙한 간 조직을 닮음을 입증하였다.
바람직하게는 간 오르가노이드 중의 모든 세포는 간세포 표면 마커를 발현한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 간 오르가노이드 중의 세포의 50% 이상(예를 들어 50 내지 60%), 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 또는 100%가 간세포 마커를 발현한다. 일부의 실시태양에서, 간 오르가노이드 중의 세포의 대략 35%, 예를 들어 25 내지 45%, 30 내지 40%, 33 내지 37%, 35% 이하, 또는 15 내지 35%가 간세포 표면 마커를 발현한다. 일부의 실시태양에서, 상기 확대 상은 적은 간세포, 예를 들어 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 바람직하게는 0%의 상기 세포를 가질 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 생성된 세포 및 오르가노이드는 또한 간세포 기능을 갖는다, 예를 들어 성숙한 간 마커 알부민, B-1 인테그린, CK-8, CK-18, 트랜스타이레틴(TTR), 글루코스 6P, Met, 글루타민 신타제(Glul), 트랜스페린, Fahd1, Fahd2a, K7, K19 및 시토크롬 P450 동형 3A13 (CYP3A13), 51 (CYP51) 2D10 (CYP2D10), 2j6 (CYP2j6), 39A1 (CYP39A1), 4A10 (CYP4A10), 4F13 (CYP4F13) 4F16 (CYP4F16), CYP4B1 및 20A1(CYP20A1)을 발현하거나 또는 이에 대해 양성 염색된다. 또한, 일부의 실시태양에서 배아 간 유전자 AFP는 성숙한 간에서와 같이, 상기 두 배양 조건 중 어느 것에서도 검출되지 않는다. 일부의 실시태양에서, 알파 태아 단백질의 발현은 배경 유전자 발현 바로 위에 있다.
또한, HNF1a, HNF1b 및 HNF4로서 널리 공지된 간 전사 인자가 상기 두 조건에서 고도로 발현된다.
간 및 췌장은 밀접하게 관련된 기관이므로, 우리는 우리의 간 배양물이 췌장-특이성 유전자를 또한 발현하는지의 여부를 조사하였다. 상기 췌장은 작용상 내분비 및 외분비 췌장으로 분류된다. 상기 내분비 췌장은 주로 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴의 발현을 특징으로 한다. 이들 호르몬의 발현은 일련의 내분비 췌장-특이성 전사 인자(가장 중요한 것은 Pdx1 및 NeuroD이다)에 의해 엄격하게 조절된다. 상기 외분비 췌장은 다른 것들 중에서도 소화 효소 아밀라제, 췌장 리파제 및 키모트립신의 생산을 맡고 있는 샘꽈리 및 도관 구획에 의해 형성된다. 이들 유전자의 발현은 또한 Ptf1으로서 특이적인 외분비 췌장 유전자에 의해 조절된다.
췌장 특이성 유전자 Ptfla, 췌장 아밀라제(Amy2a4), 췌장 리파제(Pnlip), 인슐린(ins1 및 ins2), 글루카곤(Gcg), 키모트립신(cela1), Pdx1 및 NeuroD는 여기에 개시된 간 배양물 중에 존재하지 않았다.
일부의 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나 이상 또는 전부는 간 오르가노이드에서 성숙한 간 간세포 중의 상응하는 유전자와 유사한 수준으로 발현된다: Aqp1, Bmp2, Apo3, Apol7a, Sord, C3, Ppara, Pparg, tbx3, lgf1, ll17rb, ll1b, Tgfbi, Apoa1, Apoa4, Apob, Cyp26b1, Cyp27a1, Cyp2b13, Cyp2b9, Cyp2c37, Cyp2f2, Cyp2g1, Cyp2j13, Cyp3a11, Cyp4a10 및 Cypf14. 예를 들어 도 27A를 참조하시오.
일부의 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나 이상은 간 오르가노이드에서 성숙한 간 간세포 중의 상응하는 유전자에 비해 유사한 정지 수준으로 발현된다: Ccl2, Osmr, Icam1 및 Cxcl2.
일부의 실시태양에서, 하기의 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 간 오르가노이드 및 신생 간 모두에서 차별적으로 발현되며: mKi67 및 cdkn3, 이는 이들 유전자의 발현이 분화된 오르가노이드 또는 전체 기관에서보다 상기 오르가노이드에서 더 높음을 의미한다.
일부의 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나, 둘 또는 모두는 간 오르가노이드 및 신생 간에서 유사한 수준으로 발현된다: cyp2j6, olfm4 및 Lefty. 예를 들어 도 27B를 참조하시오.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 간 오르가노이드는 본 발명의 확대 배지(예를 들어 EM1 또는 EM2)에서 배양 시 도관 표현형을 갖는다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 간 오르가노이드는 본 발명의 분화 배지에서 배양 시 성숙한 간 마커를 발현한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 간 오르가노이드는 도 27C에 나타낸 바와 같이 유전자 발현 프로파일을 갖는다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 도 28에 나타낸 바와 같은 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 예를 들어, 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 오르가노이드는
a) 하기의 줄기세포 마커 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: lgr5, lgr4, epcam, Cd44, Tnfrsf19, Sox9, Sp5, Cd24a, Prom1, Cdca7 및 Elf3;
b) 하기의 줄기세포 마커를 발현하지 않고/않거나: Igr6;
c) 본 발명의 확대 배지에서 증식 시 하기의 간세포 또는 담혈관세포 마커 중 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: Hnf1a, Hnf1b, Hnf4a, Hhex, Onecut1, Onecut2, Prox1, Cdh1, Foxa2, Gata6, Foxm1, Cebpa, Cebpb, Cebpd, Cebpg, Glul, Krt7, Krt19 및 Met;
d) 본 발명의 확대 배지에서 증식 시 하기의 유전자들 중 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17)을 발현하지 않고/않거나: afp, Ins1, Ins2, Gcg, Ptf1a, Cela1, Cela2a, Cela3b, Neurod1, Neurod2, Neurog1, Neurog2, Neurog3, Amy2a4, Igf1r, Igf2 및 Cd34;
e) 하기의 재프로그램화 유전자 중 하나 이상(예를 들어 1, 2 또는 3)을 발현하고/하거나: Klf4, Myc 및 Pou5f1;
f) 하기의 재프로그램화 유전자를 발현하지 않고: Sox2,
상기에서, 상기 유전자들의 발현을 바람직하게는, 예를 들어 미세배열을 사용하여 mRNA 수준에서 발현을 측정함으로써 검출한다.
보다 바람직하게는 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 상기 특징 a) 내지 f) 중 전부를 갖는다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 간 오르가노이드에 대한 상술한 유전자 발현 프로파일은 본 발명의 간 확대 배지에서 배양된 마우스 세포 집단 또는 오르가노이드에 대한 것이다.
일부의 실시태양에서, 도 29에 도시된 유전자 발현 특징을 갖는 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 EM1에서 배양된 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 바람직하게는 EM1 세포 배양 배지에서 발현되는 바와 같이 도 29에 나타낸 유전자들을 발현한다. 예를 들어, 본 발명의 EM2에서 배양된 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 바람직하게는 EM2 세포 배양 배지에서 발현되는 바와 같이 도 29에 나타낸 유전자들을 발현한다. 예를 들어, 본 발명의 DM에서 배양된 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 바람직하게는 DM 세포 배양 배지에서 발현되는 바와 같이 도 29에 나타낸 유전자들을 발현한다.
예를 들어, 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는
a) 하기의 줄기세포 특징 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: LGR4, TACSTD1/Epcam, CD44, SOX9, SP5, CD24, PROM1, CDCA7 및 ELF3;
b) 하기의 재프로그램화 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: KLF4, MYC, POU5F1 및 SOX2;
c) 하기의 간세포/담혈관세포 특이성 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: HNF1A, HNF1B, HNF4A, HHEX, ONECUT1, ONECUT2, PROX1, CDH1, FOXA2, GATA6, FOXM1, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, GLUL, KRT7, KRT19 및 MET;
d) 하기의 간세포/담혈관세포 특이성 유전자 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6), 바람직하게는 전부를 발현하지 않고/않거나: NEUROG2, IGF1R 및 CD34, AFP, GCG 및 PTF1A, 예를 들어 상기는 NEUROG2, IGF1R 및 CD34를 발현하지 않고/않거나;
e) 하기의 간세포 특이성 유전자 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18), 바람직하게는 전부를 발현하고: TTR, ALB, FAH, TAT, CYP3A7, APOA1, HMGCS1, PPARG, CYP2B6, CYP2C18, CYP2C9, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F8, CYP4V2 및 SCARB1;
상기에서, 상기 유전자들의 발현을 바람직하게는, 예를 들어 미세배열을 사용하여 mRNA 수준에서 발현을 측정함으로써 검출한다.
보다 바람직하게는 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 상기 특징 a) 내지 e) 중 전부를 갖는다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드 중의 유전자들은 도 29에 도시된 바와 같이 기준 RNA의 발현에 비해 상향 조절되거나 또는 하향 조절된다. 바람직하게는, 상기 기준 RNA는 범 인간 기준 RNA(Stratagene, Catalog #740000)이다. 일부의 실시태양에서, 유전자는 상기 기준 RNA에 비해 상향조절되거나 하향조절되는 바와 같이 도 29에 또한 도시되는 경우 기준 RNA에 비해 상향조절되거나 하향조절되지만, 상기 상향조절 또는 하향조절의 정도가 동일할 필요는 없다. 다른 실시태양에서, 상기 상향조절 또는 하향조절의 정도는 +/-35%, +/-30%, +/-25%, +/-20%, +/-20%, +/-15%, +/-10%, +/-5%, +/-3%, 또는 보다 바람직하게는 +/-1.5-배, +/-2-배, +/-3-배, +/- 5-배 또는 대략 도 29에 도시된 바와 동일하다. 다른 실시태양에서 본 발명의 인간 오르가노이드 중의 유전자들의 발현의 절대 수준은 +/-35%, +/-30%, +/-25%, +/-20%, +/-15%, +/-10%, +/-5%, +/-3%, 또는 +/-1.5-배, +/-2-배, +/-3-배, +/- 5-배 또는 대략 도 29에 도시된 바와 동일하다.
본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 또한 바람직하게는 Lgr5 및/또는 Tnfrsfl9, 바람직하게는 둘 다를 발현한다. 일부의 실시태양에서, 상기 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는, 본 발명의 확대 배지에서 배양 시, Lgr5 및/또는 Tnfrsfl9, 바람직하게는 둘 다를 발현한다. 바람직하게는, Lgr5 및/또는 Tnfrsfl9의 발현을 RT PCR에 의해 검출한다. 일부의 실시태양에서, Lgr5 및/또는 Tnfrsfl9는 확대 배지에서 배양 시의 발현 오르가노이드 또는 세포의 수준에 비해 분화 배지에서 배양 시 훨씬 더 낮은 오르가노이드 또는 세포의 발현 수준으로 존재한다(예를 들어 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 10 배 이상, 15 배 이상 더 낮은 수준).
본 발명에 따른 간 세포 및 오르가노이드는 바람직하게는 알부민을, 예를 들어 대략 1 ㎍/시간/106 세포 내지 10 ㎍/시간/106 세포, 바람직하게는 2 ㎍ 내지 6 ㎍/시간/106 세포의 비율로 분비할 수 있다.
더욱 또한, 상기와 같은 간 세포 및 오르가노이드는 유레아를 분비할 수 있다. 예를 들어, 35 ㎜ 디쉬의 세포에서, 유레아 합성의 활성은 48 시간 동안 1 ㎍ 내지 50 ㎍, 바람직하게는 5 ㎍ 내지 30 ㎍일 수 있다.
본 발명에 따른 간 세포 및 오르가노이드는 예를 들어 염색 시 가시적인 글리코겐 저장을 나타낼 수 잇다. 글리코겐을 능동적으로 합성하는 본 발명에 따른 세포 및 오르가노이드의 능력을, 배양 배지를 2일간 저-글루코스 분화 배지에서 10% FBS 및 0.2 μM 덱사메타손이 보충된 고-글루코스 DMEM으로 변화시킴으로써 시험할 수 있다.
본 발명에 따른 간 세포 및 오르가노이드는 유도성 시토크롬 P450 활성(예를 들어 CYP1A)을 가질 수 있다. 상기와 같은 활성을 예를 들어 에톡시레소루핀-O-데에틸라제(EROD) 분석을 사용하여 시험할 수 있다(문헌[Cancer Res, 2001, 61: 8164-8170]). 예를 들어, 세포 또는 오르가노이드를 P450 기질, 예를 들어 3-메틸콜안트렌에 노출시키고 EROD 활성의 수준을 대조용 세포와 비교할 수 있다.
형태학적으로, 상기 간 오르가노이드 세포는 간세포와 같이 보인다.
바람직한 간 오르가노이드는 도 30에 도시된 바와 같이 돌기 및 중심 관강을 갖는 세포의 층을 외부에 갖는 낭성 구조를 포함하거나 상기로 이루어진다. 상기 간 오르가노이드는 하기의 특징들 중 하나 이상(예를 들어 2, 3 또는 4 개)을 가질 수 있다: (a) >5x105 세포/㎤, 바람직하게는 >10x105 세포/㎤의 세포 밀도를 갖는다; (b) 2 내지 30 개의 세포층과 동등한 두께, 바람직하게는 2 내지 15 개의 세포층과 동등한 두께를 갖는다; (c) 세포가 3차원으로 상호 접촉한다; (d) 건강한 간 조직에 고유한 기능을 나타낸다, (e) 2 개의 한정된 도메인, 즉 고도로 양극화된 세포가 검출되고 케라틴 마커가 발현되는 단일층의 상피 도메인(상기 도메인은 담관 도메인을 닮는다) 및 상기 오르가노이드의 주 몸체를 구성하고 알부민 발현이 검출될 수도 있는 비-양극화된 세포를 갖는 다층화된 상피에 의해 형성되는 다른 도메인과 함께, 신장된 모양을 갖는다. 상기와 같은 간 오르가노이드가 바람직하게는 간 단편이 아니고/아니거나 혈관을 포함하지 않고/않거나 간 소엽 또는 담관을 포함하지 않음은 숙련가에게 명백하다.
본 발명의 개념 내에서, 간 단편은 성숙한 간, 바람직하게는 인간 성인 간의 일부이다. 따라서, 바람직하게는 본 발명에서 확인된 바와 같은 간 오르가노이드는 간 단편이 아니다. 간 오르가노이드는 바람직하게는 성숙한 간, 바람직하게는 성숙한 간으로부터의 상피 줄기세포, 보다 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 성숙한 간으로부터의 상피 줄기세포를 사용하여 수득된다. 간 오르가노이드를 또한, 손상 또는 배양 시 Lgr5를 발현하고 따라서 Lgr5-발현 순환 줄기세포인 임의의 세포로부터 수득할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 간 오르가노이드는 Lgr5를 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 간 오르가노이드 중 세포의 2% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이 Lgr5를 발현한다. 유사하게, 본 발명은 Lgr5를 발현하는 세포 또는 세포 집단을 제공하며, 여기에서 상기 세포는 본 발명의 간 오르가노이드로부터 수득된다. 상기와 같은 세포의 자손이 또한 본 발명에 포함된다.
하나의 실시태양에서, 간 오르가노이드는, 본 발명의 방법을 사용하여 여전히 배양되고 따라서 세포외 기질과 접촉하는 간 오르가노이드이다. 바람직하게는, 간 오르가노이드는 비-간엽성 또는 간엽성 세포외 기질 중에 매몰되어 있다. 본 발명의 개념 내에서, "접촉하는"은 물리적 또는 기계적 또는 화학적 접촉을 의미하며, 이는 상기 간 오르가노이드를 상기 세포외 기질로부터 분리시키기 위해서 힘을 사용할 필요가 있음을 의미한다.
바람직한 실시태양에서, 간 오르가노이드를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개월 이상 동안 배양할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 상기 간 오르가노이드를 배양물 중에서 3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 동안 확대시키거나 유지시킨다. 바람직하게는, TGF 베타 억제제를 포함하는 본 발명의 확대 배지를 사용하여 배양된 간 오르가노이드를 4주 이상, 보다 바람직하게는 5주 이상 동안 1주일에 5 배 확대 또는 주당 2 배 이상의 집단 배가(예를 들어 10 배 이상의 배가, 20 배 이상의 배가, 보다 바람직하게는 25 배 이상의 배가, 예를 들어 30 배 이상의 배가)로 배양할 수 있다. 바람직하게는, TGF 베타 억제제 외에 프로스타글란딘 경로 활성제를 포함하는 본 발명의 확대 배지를 사용하여 배양한 간 오르가노이드를 7주 이상, 보다 바람직하게는 8주 이상 동안 주당 2 배 이상의 배가(예를 들어 2 내지 3 배의 배가)(즉 15 배 이상의 배가, 25 배 이상의 배가, 30 배 이상의 배가, 32 배 이상의 배가, 35 배 이상의 배가, 30 내지 40 배 이상의 배가, 또는 40 배 이상의 배가, 예를 들어 50 배 이상의 배가)로 배양할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 간 오르가노이드, 예를 들어 인간 간 오르가노이드를 본 발명의 확대 배지를 사용하여 수득한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 간 오르가노이드는 단일 세포, 바람직하게는 Lgr5를 발현하는, 보다 바람직하게는 관심 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 단일 세포로부터 기원한다.
오르가노이드 조성 및 유전자 발현
상기 소낭-융모, 결장 소낭 및 췌장 오르가노이드는 전형적으로 줄기세포 및/또는 선조 세포를 포함하며, 따라서 이들 오르가노이드는 일정 패턴의 유전자 발현을 공유한다. 일부의 실시태양에서, 하기의 마커들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 또는 전부가 검출될 수 있다: LGR5, LGR4, epcam, Cd44, Sox9, Cd24a, 및 CD133/Prom1 및 임의로 Tnfrsf19. 또 다른 실시태양에서, 하기의 선조 유전자들 중 하나 또는 둘 또는 전부의 발현을 검출할 수 있다: Pdx1, Nkx2.2, 및 Nkx6.1. 분화 후에, 상기 소낭-융모, 결장 소낭 및 췌장 오르가노이드의 유전자 발현 패턴은, 상기 분화된 오르가노이드가 조직-특이성의 성숙한 마커, 예를 들어 췌장 중의 인슐린을 발현함에 따라 벗어날 것으로 예상된다.
소낭 융모 오르가노이드
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 오르가노이드는 증식성 세포, 파네쓰 세포, 장세포 및 배상세포를 포함하여, 모든 분화된 상피 세포 유형을 포함하는 소낭-융모 유사 연장부를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 소낭-융모 오르가노이드는 근섬유아세포 또는 다른 비-상피 세포를 함유하지 않는다. 본 발명의 소낭-융모 오르가노이드는 바람직하게는 소낭-융모-유사 구조로 흡수성 장세포, 배상세포, 장내분비 세포, 및 파네쓰 세포를 포함하여 장세포를 포함한다. 바람직하게는 하기의 마커들 중 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 또는 6)이 검출될 수 있다: SMOC2, CDCA7, OLFM4, ASCL2, AXIN2 및/또는 Lgr5 Tnfrsf19, CD24a, Sox9, CD44, Prom1(도 2e 및 도 14 참조). 일부의 실시태양에서, 마커 RNF43 및 ZNRF3이 검출될 수 있다. 일부의 실시태양에서, SMOC2, CDCA7, OLFM4, ASCL2, AXIN2 및/또는 Lgr5 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5) 또는 전부는 소낭에서 2 배, 3 배, 또는 4 배 이상 상향조절되는 반면, 소낭에서 2 배, 3 배, 또는 4 배 이상 하향조절되는 마커는 ABCG1, ENPP3, CSTE, MUC17 및/또는 APOA1 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 또는 4) 또는 전부를 포함한다. 이와 관련하여 "상향조절"은 관심 융모 또는 결장 소낭의 상부 섹션에 대한 것이다. 분화된 오르가노이드 세포의 유전자 발현을 줄기세포에 비교하는 미세배열 분석은 상기 소장 소낭-융모 및 결장 오르가노이드가, 관심 줄기세포 유전자의 발현을 포함하여 필적하는 장 소장의 분자 특징을 가짐을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명은 또한 소낭-융모 오르가노이드에 대해 상술한 분자 특징을 갖는 결장 오르가노이드를 제공한다. 시험관 내에서 배양된 오르가노이드는 새로 단리한 소장 소낭과 유사한 발현 프로파일을 명백히 나타내고 공지된 줄기세포 마커를 발현한다.
일부의 실시태양에서, 각각 소낭-융모 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드에서 상향조절되는 것으로서 도 14에 나열된 하나 이상의 유전자(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25)(예를 들어 도 14에서 빗금친 유전자들 전부)를 암호화하는 mRNA는 미세배열에 의해 측정된 바와 같이, 새로 단리된 소장 융모에 비해 본 발명의 소장-융모 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드에서 상향조절된다. 일부의 실시태양에서, 각각 소낭-융모 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드에서 하향조절되는 것으로서 도 14에 나열된 하나 이상의 유전자(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25)(예를 들어 도 14에 빗금친 유전자들 전부)를 암호화하는 mRNA는 미세배열에 의해 측정된 바와 같이, 새로 단리된 소장 융모에 비해 본 발명의 소장-융모 오르가노이드 또는 결장 오르가노이드에서 하향조절된다. 일부의 실시태양에서, 상향조절 또는 하향조절 배수는 도 14에 나타낸 바와 같이 +/-25%, 예를 들어 +/-20%, +/-15%, +/-10%, +/-5%, +/-3%, 또는 대략 도 14에 인용된 바와 같다. 에를 들어, 본 발명의 소낭-융모 오르가노이드는 새로 단리된 소장 융모에 비해 9.54 배 +/-25% 상향조절된 ADORA2B를 가질 수 있다. 이를 도 14에 나열된 다른 유전자들에도 준용하여 적용한다.
일부의 실시태양에서, 상기 소낭 융모 오르가노이드는 Lgr5의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 소낭 융모 오르가노이드는 적어도 Lgr5, 및 CK19, 네스틴, 소마토스타틴, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, Hnf1α, Hnf4a, Sox9, KRT7 및 KRT19로 이루어진 그룹으로부터의 줄기세포 마커 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16) 또는 전부의 천연 발현을 나타낸다. 또한 또는 한편으로, 소낭-융모 오르가노이드는 Sord 및/또는 Prss23 중 하나 이상 또는 전부(예를 들어 1 또는 2)의 발현을 특징으로 할 수 있다. 또한 또는 한편으로, 소낭-융모 오르가노이드는 CD44 및/또는 Sox9의 발현을 특징으로 할 수 있다. 또 다른 실시태양에서 상기 소낭-융모 오르가노이드는 lgr5, lgr4, epcam(tacstd1), Cd44, Tnfrsf19, Sox9, Sp5, Cd24a, Prom1, 및 Cdca7로 이루어진 그룹으로부터의 마커 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) 또는 전부의 발현을 나타낸다.
일부의 실시태양에서, 소낭 융모 오르가노이드는 라이소자임을 발현하는 파네쓰 세포를 포함한다.
결장 오르가노이드
일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드는 장내분비 세포(예를 들어 크로마그라닌 A 염색을 사용하여 검출할 수 있는 바와 같이), 배상세포(뮤신 2 염색을 사용하여 검출할 수 있는 바와 같이)를 함유한다. 일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드 중 상기 세포의 10% 미만은 장내분비 세포(예를 들어 0.01 내지 5%, 0.1 내지 3%)이다. 일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드 중 상기 세포의 30% 미만은 배상세포(예를 들어 1 내지 25%, 1 내지 15%, 5 내지 10%)이다. 일부의 실시태양에서, 상기 장내분비 세포 및/또는 배상 세포의 분포는 도 1d에 나타낸 바와 같다.
일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드는 성숙한 장세포를 함유한다(예를 들어 알칼리성 포스파타제 염색에 의해 가시화되는 바와 같이). 일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드 중 상기 세포의 10% 미만(예를 들어 5% 미만, 3% 미만, 0.01 내지 5%, 0.1 내지 3%, 0.1 내지 5%)은 성숙한 장세포이다.
바람직한 실시태양에서, 결장 오르가노이드는 파네쓰 세포를 포함하지 않는데, 그 이유는 천연 생체 내 결장 중에는 파네쓰 세포가 없기 때문이다.
일부의 실시태양에서, 상기 결장 오르가노이드는 Lgr5의 천연 발현을 나타낸다.
일부의 실시태양에서, 결장 오르가노이드는 Villin1, Alpi, ChgA 및 Muc2 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)을 발현한다. 일부의 실시태양에서, 새로 단리된 결장 소낭에 비해 본 발명의 결장 오르가노이드에 의해 발현된 Villin1 mRNA의 상대적인 양은 3% 이상(예를 들어 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상), 예를 들어 5 내지 15%이다. 일부의 실시태양에서, 새로 단리된 결장 소낭에 비해 본 발명의 결장 오르가노이드에 의해 발현된 Alpi mRNA의 상대적인 양은 0.5% 이상(예를 들어 1% 이상, 2% 이상), 예를 들어 5 내지 5%이다. 일부의 실시태양에서, 새로 단리된 결장 소낭에 비해 본 발명의 결장 오르가노이드에 의해 발현된 ChgA mRNA의 상대적인 양은 15% 이상(예를 들어 20% 이상, 22% 이상), 예를 들어 15 내지 30%이다. 일부의 실시태양에서, 새로 단리된 결장 소낭에 비해 본 발명의 결장 오르가노이드에 의해 발현된 Muc2 mRNA의 상대적인 양은 20% 이상(예를 들어 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상), 예를 들어 25 내지 37%이다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 인간 결장 오르가노이드는 공지된 줄기 세포 마커를 발현한다.
췌장 오르가노이드
췌장은 3 가지 부류의 세포 유형, 즉 도관 세포, 샘꽈리 세포 및 내분비 세포를 함유한다. 상기 내분비 세포는 호르몬 글루카곤, 인슐린 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩타이드(PP)를 생산하며, 이들은 혈류 내로 분비되어 신체가 당 대사를 조절하는 것을 돕는다. 샘꽈리 세포는 외분비 시스템의 부분이며, 이는 소화 효소, 및 췌장 도관으로부터 도관 세포를 제조하고, 상기 도관은 상기 샘꽈리 세포를 소화 기관에 연결시킨다. 발생 중, 랑게르한스섬이, 췌장 도관으로부터 발생하고 분화 후에 집합하여 랑게르한스섬을 형성하는 선조 내분비 세포로부터 내려오는 것으로 여겨진다. 랑게르한스섬은 α 세포, β 세포, δ 세포 및 PP 세포를 포함한다.
췌장 오르가노이드 세포는 도관 세포 마커, 예를 들어 K7, K19 및 Hnf1b 중 하나 이상(예를 들어 1, 2 또는 전부) 및/또는 Sox9 및/또는 Onecut1과 같은 하나 이상의 일반적인 줄기세포 마커를 닮은 발현 패턴을 가질 수 있다. 이는 그의 줄기세포 특징의 일부인 듯하다. 일반적으로 보다 적은 분화 마커들이 보인다. 세포가 본 발명의 췌장 오르가노이드를 생성시키기 위해서 췌장 도관으로부터 단리되는 일부의 실시태양에서, 본 발명의 췌장 오르가노이드를 생성시키는 세포 유형은 도관 세포(이는 상기 도관을 형성하는 케라틴 7 및 케라틴 19에 대해 양성인 상피 세포를 의미한다)가 아니고, 췌장 도관에 부착된 세포이며, 이는 췌장 조직과 접촉하여 도관 뒤의 다음 세포 층 중에 위치하는(즉 상기 도관의 관강과 면하지 않는) 세포를 의미한다. 따라서, 췌장 오르가노이드를 생성시키는 세포 유형이 도관 세포가 아닌 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 K7 또는 K19를 발현하지 않을 것이다. 그러나, 상기와 같은 췌장 오르가노이드는 여전히 바람직하게는 Sox9와 같은 하나 이상의 일반적인 줄기세포 선조 세포 마커를 발현할 것이다.
본 발명의 췌장 오르가노이드는 바람직하게는 α 세포, β 세포, δ 세포 및 PP 세포를 포함한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 베타 세포를 포함한다. 예를 들어, 췌장 오르가노이드는 1% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과의 베타 세포를 포함할 수 있다. 인슐린의 발현을 베타 세포에 대한 마커로서 사용할 수도 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 임의로 도관 기원을 갖는, 인간 또는 동물 내로 이식될 때 분화된 세포 유형을 생성시킬 수 있는 선조 세포 유형들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 선조 세포 유형은 인간 또는 동물 내로 이식될 때 인슐린-분비 베타-세포를 생성시킬 수 있다. 발명자들은 본 발명의 배지 및 방법에 따라 증식된 인간 췌장 오르가노이드를 마우스 내로 이식하여 한달 내에 인슐린-분비 세포를 자극할 수 있음을 입증하였다(실시예 4 참조). 상기가 당뇨병 및 인슐린-결핍증이 있는 환자에 대한 혁신적인 치료를 도출할 수 있음을 쉽게 알 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 췌장 오르가노이드는 도관 세포, 샘꽈리 세포 및 내분비 세포를 포함할 수 있다. 일부의 실시태양에서, K19를 도관 세포에 대한 마커로서 사용한다.
일부의 실시태양에서, 베타-세포는 췌장 섬 또는 랑게르한스섬 내에 존재한다. 섬은 일반적으로 생체 내에 대략 1500 개, 예를 들어 1300 내지 1700 개의 세포를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 질량 기준으로 0.5% 이상, 1% 이상, 1.5% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상의 랑게르한스섬을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드의 랑게르한스섬은 대략 65 내지 90%의 베타 세포, 대략 15 내지 20%의 알파-세포, 대략 3 내지 10%의 델타 세포, 및 대략 1%의 PP 세포로 구성된다. 그러나, 이는 결코 독점적인 것은 아니다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드 중에 다수의 베타 세포를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 한편으로, 오르가노이드는 생체 내에서 분화되도록 이식될 수도 있는 선조 세포를 포함할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 Pdx1, Nkx2.2 및 Nkx6.1 중 하나, 둘 또는 3 개 모두를 발현한다. 췌장 오르가노이드는 NeuroD, Pax6, Pax4 및 Mafa 중 하나, 둘, 셋 또는 네개 모두를 발현할 수 있다. Pax4는 배 발생 중에 내분비 선조 세포로부터 인슐린 생산 세포의 분화에 필수적인 전사 인자이므로 인슐린 생산 세포의 존재에 대한 마커로서 작용한다. 췌장 오르가노이드는 Ngn3을 발현할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 하기의 마커 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5)이 본 발명의 췌장 오르가노이드에서 검출될 수 있다: 인슐린(ins1 및/또는 ins2), 글루카곤(Gcg), 소마토스타틴, Pdx1 및 NeuroD. 일부의 실시태양에서, 하기의 마커 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5)을 본 발명의 췌장 오르가노이드 중에서 검출할 수 있고: 인슐린(ins1 및/또는 ins2), 글루카곤(Gcg), 소마토스타틴, Pdx1 및 NeuroD, 하기의 마커들은 검출되지 않는다: ptf1a, amy2a4, Pnlip 및 cela1. 일부의 실시태양에서, 하기의 마커들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9)을 본 발명의 췌장 오르가노이드 중에서 검출할 수 있다: Ptf1a, 췌장 아밀라제(Amy2a4), 췌장 리파제(Pnlip), 인슐린(ins1 및/또는 ins2), 글루카곤(Gcg), 소마토스타틴, 키모트립신(cela1), Pdx1 및 NeuroD.
일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 Lgr5의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 적어도 Lgr5, 및 CK19, 네스틴, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, Hnf1α, Hnf4a, Sox9, KRT7 및 KRT19, prom1, Cd24a, Lgr4, epcam으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)의 줄기세포 마커의 천연 발현을 나타낸다. 한편으로 또는 또한, 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 CK19, 네스틴, (인슐린, 글루카곤) 및 CXCR4+ 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 천연 발현을 특징으로 할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 췌장 오르가노이드 또는 세포는 소마토스타틴을 발현한다. 소마토스타틴은 분화된 델타 세포에서 발현되는 호르몬이며 따라서 델타 세포에 대한 마커로서 작용할 수 있다.
한편으로 또는 또한, 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 하나 이상의 초기 내분비 마커, 예를 들어 하기의 초기 내분비 마커: Sox9, Hnf1b, Hnf6, Hnf1a, Nkx2.2, Nkx6.1 및 Pdx1 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)의 천연 발현을 나타낸다.
한편으로 또는 또한, 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 하나 이상의 초기 내분비 마커, 예를 들어 하기의 내분비 마커: Foxa2, Hnf6, Hnf1b 및 Sox9 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 또는 4)의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 하기의 내분비 마커: Foxa2, Hnf6, Hnf1b 및 Sox9 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 천연 발현을 나타내지만, 이들은 Ngn3의 발현을 나타내지 않는다.
한편으로 또는 또한, 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 하나 이상의 도관 마커, 예를 들어 케라틴 7 및 케라틴 19 중 하나 또는 둘 모두의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 현저한 또는 검출 가능한 수준으로 하나 이상의 도관 마커의 천연 발현을 나타낸다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드는 도관 표현형을 갖는다. 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 그룹: Hnf1A, Hnf1B, Hnf4A, HHEX, ONECUT1, ONECUT2, CDH1, FOXA2, GATA6, CEBPB, CEBPD, CEBPG, Glul, Krt7, Krt19 및 MET 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) 또는 전부의 발현을 나타낸다.
그러나, 상기 췌장 오르가노이드는 인슐린 생산 전구 세포의 특징과 함께 일부의 도관 특징을 가질 수도 있다. 예를 들어, 상기는 도 16B에 나타낸 바와 같이 하나 이상의 도관 마커를 발현할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 성숙한 췌장 또는 간 오르가노이드에 비해 대략적으로 도 16B에 나타낸 바와 같은 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 이들 유전자는 췌장 오르가노이드에서 성숙한 췌장 간 오르가노이드에 비해 도 16B에서와 동일한 배수의 비로, 예를 들어 +/-3% 미만, +/-5% 미만, +/-10% 미만, +/-20% 미만으로 상향조절 또는 하향조절된다.
일부의 실시태양에서, 인슐린-양성 세포는 췌장 오르가노이드에서 도관 내층으로부터 나타난다.
일부의 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7), 바람직하게는 전부가 간 오르가노이드에 비해 췌장 오르가노이드에서 상향조절된다: Aaas, Rps4y2, Atp2c2, Akap2, Uts2, Sox17, Agr2. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 이들 유전자는 간 오르가노이드에 비해 췌장 오르가노이드에서 대략적으로 도 19에서와 동일한 배수 비, 예를 들어 +/-3% 미만, +/-5% 미만, +/-10% 미만, +/-20% 미만으로 상향조절된다.
하나의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 총 103 이상, 104 이상, 105 이상의 세포를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 췌장 오르가노이드는 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과 또는 80% 초과의 도관-유사 내분비 선조 세포를 포함한다. 그러나, 보다 낮은 백분율의 도관-유사 내분비 선조 세포가 또한 고려된다.
바렛 식도(BE) 오르가노이드
본 발명의 BE 오르가노이드는 Ki67+이다.
바람직하게는 BE 오르가노이드는 확대 배지로부터 니코틴아미드 및 SB202190의 회수 후 4일째에 최소 수(예를 들어 25% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 세포)의 PAS+ 및 뮤신+ 세포가 분화 배지로 전환된다.
일부의 실시태양에서, BE 오르가노이드는 배상세포를 포함한다. 상기는 예를 들어 4일 동안 DBZ(예를 들어 10 uM)와 같은 감마-세크레타제 억제제를 갖는 분화 배지의 처리에 의해 유도될 수 있다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 바렛 식도 오르가노이드는 파네쓰 세포를 포함한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 바렛 식도 오르가노이드는 라이소자임을 발현한다.
위 오르가노이드
일부의 실시태양에서, 본 발명의 위 오르가노이드는 Lgr5의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 위 오르가노이드는 적어도 Lgr5, 및 CK19, 네스틴, 소마토스타틴, CXCR4+, CD133+, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, Hnf1α, Hnf4a, Sox9, KRT7 및 KRT19로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17)의 줄기세포 마커의 천연 발현을 나타낸다. 한편으로 또는 또한, 일부의 실시태양에서, 위 오르가노이드는 CD133+, DCAMKL-1 및 CD44 중 하나 이상(예를 들어 1, 2 또는 3)의 천연 발현을 특징으로 할 수 있다. 한편으로 또는 추가로, 위 오르가노이드는 CD44 및 Sox9를 특징으로 할 수 있다.
전립선 오르가노이드
일부의 실시태양에서, 본 발명의 전립선 오르가노이드, 예를 들어 마우스 전립선은 Lgr5의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 오르가노이드는 관강내 전립선 마커, 예를 들어 사이토케라틴 18(CK18) 및 사이토케라틴 8(CK8)의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 전립선 오르가노이드는 안드로젠 수용체(AR)의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 오르가노이드는 기본 마커, 예를 들어 p63 및/또는 사이토케라틴 5(CK5)를 발현한다. 일부의 실시태양에서, 테스토스테론(예를 들어 DHT)을 배지에 첨가하는 경우, 기본 마커, Lgr5 및 Tnfrsfl9의 발현은 테스토스테론(예를 들어 DHT) 부재 하에서 증식된 오르가노이드에 비해 하향조절된다. 상기 전립선 특이성 전사 인자 NKX3.1은 모든 조건에서 발현된다. 따라서, 일부의 실시태양에서 본 발명의 전립선 오르가노이드는 전립선 특이성 마커 Nkx3.1의 천연 발현을 나타낸다.
일부의 실시태양에서, 본 발명의 전립선 오르가노이드, 예를 들어 정상 또는 암 인간 전립선 오르가노이드는 관강내 마커, 예를 들어 CK18, CK8 및/또는 B-MSP의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 전립선 오르가노이드는 AR의 천연 발현을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 기본 상피 마커, 예를 들어 CK14, CK5 및/또는 p63이 발현된다. 일부의 실시태양에서, TNFRSF19가 발현된다. 전립선 특이성 전사 인자 NKX3.1은 모든 조건 하에서 발현된다. 따라서 일부의 실시태양에서 본 발명의 전립선 오르가노이드는 전립선 특이성 마커 Nkx3.1의 천연 발현을 나타낸다.
본 발명에 따른 배양 배지에의 테스토스테론(예를 들어 DHT)의 첨가는 전립선 오르가노이드가 줄기세포 집단을 3배까지 더 빠른 증식(테스토스테론 부재 하의 경우보다)을 허용하도록 유지시키고 상기 전립선의 대부분(전부는 아니지만)의 분화된 세포 유형(기저 및 관강내 세포)이 또한 존재하도록 증식되게 한다. 이러한 조건은 제한되지 않은 세포 확대를 허용한다(9 개월 시점까지 1주일에 2.5 배 집단 배가). 따라서, 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 상기 전립선의 모든 분화된 세포 유형, 예를 들어 기저세포 및 관강 내 세포 모두를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 모든 분화된 세포 유형, 예를 들어 기저 및 관강내 세포, 및 줄기세포를 포함한다.
정상 조직에서, 테스토스테론(예를 들어 DHT)의 첨가는 모든 배양 조건에서 AR 발현을 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 테스토스테론의 부재 하에서 증식된 전립선 세포에 비해 상향조절된 AR 발현을 갖는다. 종양 조직에서 AR 발현은 테스토스테론(예를 들어 DHT) 첨가에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 전립선 암 오르가노이드는 생체 내 전립선 암 세포에 비해 증가된 AR 발현을 갖지 않는다. 줄기세포 마커 LGR5는 정상 조직으로부터의 전립선 오르가노이드에서 ENRF 조건 하에서 발현된다. 종양 조직으로부터 수득된 전립선 오르가노이드에서, LGR5 발현은 테스토스테론(예를 들어 DHT)의 첨가에 의해 유도된다. 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 LGR5를 발현한다.
오르가노이드 작용
일부의 실시태양에서, 본 발명의 배지 및 방법에 의해 생성된 오르가노이드는 외부 인자들에 반응하여 생체 내 세포 운명 결정을 모방한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 생성된 세포 및 오르가노이드는 조직-특이성 작용을 또한 갖는다.
췌장 오르가노이드
췌장 오르가노이드는 바람직하게는 내분비 및 외분비 췌장 작용, 예를 들어 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴 중 하나 이상(예를 들어 1, 2 또는 3 개 모두)을 발현함을 갖는다. 이들 호르몬의 발현은 일련의 내분비 췌장-특이성 전사 인자에 의해 엄격하게 조절되며, 가장 중요한 것은 Pdx1 및 NeuroD이다. 상기 외분비 췌장은 다른 것들 중에서도 소화 효소 아밀라제, 췌장 리파제 및 키모트립신의 생산을 맡고 있는 샘꽈리 및 도관 구획에 의해 형성된다. 이들 유전자의 발현은 또한 Ptf1으로서 특이적인 외분비 췌장 유전자에 의해 조절된다.
본 발명에 따른 췌장 세포 및 오르가노이드는 바람직하게는 인슐린을, 예를 들어 대략 1 ㎍/시간/106 세포 내지 10 ㎍/시간/106 세포, 바람직하게는 2 ㎍ 내지 6 ㎍/시간/106 세포의 비율로 분비할 수 있다. 상기 인슐린의 분비 수준을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 기준에 대한 웨스턴 블럿에 의해 또는 C-펩타이드 Elisa에 의해 검출할 수 있다. 췌장 오르가노이드가 인슐린을 분비할 수 있음을 입증하기에 바람직한 방법은 C-펩타이드의 생산을 시험함에 의한 것이다. 프로인슐린 C-펩타이드는 인슐린의 A- 및 B-쇄 간의 중요한 링커로서 작용하며 소포체에서 인슐린의 효율적인 조립, 폴딩 및 처리를 촉진한다. 이어서 동몰량의 C-펩타이드 및 인슐린이 췌장 베타 세포의 분비 과립 중에 저장되며 이들은 모두 결국 문맥 순환으로 방출된다. 따라서, C-펩타이드는 인슐린 분비의 바람직한 마커이다.
따라서, 하나의 실시태양에서 생체 내 이식에 이어서 인슐린을 분비하는 췌장 오르가노이드를 제공한다. 일부의 실시태양에서, 생체 내 이식에 이어서, 상기 췌장 오르가노이드는 인슐린을 1 ㎍/시간/106 세포 이상, 예를 들어 2 ㎍/시간/106 세포 이상, 4 ㎍/시간/106 세포 이상, 6 ㎍/시간/106 세포 이상, 8 ㎍/시간/106 세포 이상 또는 10 ㎍/시간/106 세포 이상의 비율로 분비한다. 일부의 실시태양에서, 상기 췌장 오르가노이드 중의 세포는 인슐린을 분비할 수 없고/없거나 시험관 내에서 배양 시 마커로서 인슐린을 발현하지 못한다. 그러나, 본 발명의 췌장 오르가노이드로부터의 세포는 바람직하게는 환자, 예를 들어 환자의 췌장에 이식 시 생체 내에서 인슐린을 분비할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 인슐린을 분비하는 능력은 이식 시 바로 존재하지 않을 수도 있지만, 이식 후 대략 1 개월까지, 예를 들어 이식 후 6 주, 2 개월 또는 3 개월까지 존재한다.
농축된 내분비 세포 샘플을 본 발명의 췌장 오르가노이드로부터 수득하는 경우, 일부의 실시태양에서, 상기 농축된 내분비 세포 샘플 중 75 내지 85%는 인슐린 분비 세포일 것이다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 췌장 오르가노이드를 제공한다. 일부의 실시태양에서 상기 췌장 오르가노이드는 확대 오르가노이드인 반면, 다른 실시태양에서 상기는 분화된 오르가노이드일 수 있다. 일부의 실시태양에서 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 등)의 전체 오르가노이드는 동물 또는 환자 내로 이식되는 반면, 다른 실시태양에서는 세포의 샘플을 환자에게 이식한다.
소낭-융모 오르가노이드
소낭-융모 오르가노이드는 바람직하게는 분비 및 자기재생 작용을 갖는다. 예를 들어, 소낭-융모 오르가노이드는 바람직하게는 뮤신, 효소 및 호르몬 분비, 예를 들어 라이소자임, 콜레시스토키닌, 세크레틴 및 위 억제성 펩타이드, 및 다른 당단백질을 분비한다.
위 오르가노이드
인간 위는 해부학적으로 및 작용적으로 2 개의 큰 영역으로 분류된다. 장에 가까운 유문동은 주로 보호 점액을 생산하고 가스트린과 같은 호르몬을 분비한다. 위 조직은 염산 및 위 효소, 예를 들어 펩시노겐을 분비한다. 상기 두 영역의 위 상피는 샘이라 칭하는 함입부로 구성된다. 상기 샘은 위 줄기세포, 선조 세포 및 분화된 세포를 갖는다. 상기 분화된 세포의 정확한 조성은 해부학적 영역의 작용에 따라 변한다. 상기 유문동에서, 샘은 주로 뮤신 6 생산 세포 및 호르몬 생산 내분비 세포로 구성된다. 상기 위 조직에서, 펩시노겐 생산 주세포 및 산 분비 벽세포가 상기 점액 생산 세포와 드문 내분비 세포 사이에 분산되어 있다. 위샘 간의 표면 영역은 표면 뮤신 5를 주로 생산하는 점액 생산 세포가 차지한다.
위 오르가노이드는 구조 및 작용이 위 상피를 닮는다. 상기는 대개 구형이지만, 샘 구조를 가장 닮은 듯한 함입부가 있는 도메인들을 가질 수 있다. 뮤신 및 펩시노겐의 염색은 상기 위 오르가노이드 중에 가장 풍부한 세포 유형이 뮤신 6 생산 점액 세포 및 펩시노겐 생산 주세포(및/또는 그들의 선조세포)임을 보인다. 따라서, RT-PCR은 펩티노겐 및 뮤신 6의 발현을 가리킨다. 추가로, 가스트린의 발현은 내분비 세포의 존재를 가리키고 Lgr5의 발현은 줄기세포의 존재를 가리킨다.
일부의 실시태양에서, 위 오르가노이드는 가스트린, 펩시노겐, 뮤신 6 및/또는 Lgr5 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 천연 발현을 갖는다. 일부의 실시태양에서, 위 오르가노이드는 뮤신 6 생산 점액 세포 및 펩시노겐 생산 주세포 및 임의로 Lgr5+ 줄기세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 위 오르가노이드는 내분비 세포를 포함한다. 일부의 실시태양에서, 위 오르가노이드는 대개 구형이나, 샘 구조를 닮은 함입부가 있는 도메인들을 갖는다.
전립선 오르가노이드
일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 2 개의 독특한 상피 계통, 기저 세포 및 관강내 세포를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부의 실시태양에서 기저 세포 및 관강내 세포는 전립선액을 분비한다.
생체 내에서 상기 전립선 상피는 강하게 폴딩하여, 최대의 표면적을 보장한다. 상기 두 상피 계통은 기저/외부층을 형성하는 기저 상피 세포를 갖는 단순한 층상화된 상피 및 상부에 위치하여 내부/관강내 층을 형성하는 강하게 양극화된 관강 상피 세포를 형성한다. 상기 관강내 대응물은 전립선의 분비 작용에 필수적이다. 상기 전립선액은 알칼리성이며 여러 단백질, 예를 들어 전립선 특이 항원(PSA), 인간 칼리크레인 2(KLK2) 및 β-마이크로세미노단백질(β-MSP)로 구성된다. 전립선액의 1차 작용은 1) 정액을 위한 자궁 환경의 준비(이는 상기 액의 알칼리성 및 β-MSP의 주변분비 작용에 의해 수행된다), 및 2) 상기 정액의 유동성을 증가시켜 정자가 자유롭게 유영하도록 하는 것(이는 세미노젤린을 파괴하는 프로테아제 PSA 및 KLK2에 의해 수행된다)이다.
분비 단백질의 발현은 안드로겐 수용체(AR)(이는 테스토스테론에 결합하고 후속으로 핵으로 전위되어 전사를 활성화한다)에 의해 엄격하게 조절된다. AR 작용의 붕괴는 전사 및 단백질 수준에 대한 분비 단백질의 강한 하향조절을 나타낸다.
도 43은 ENR+다이하이드로테스토스테론(DHT) 조건 하에서 증식된 전립선 오르가노이드의 층상화를 도시하며, 외부의 세포층을 형성하는 사이토케라틴5+ 기저세포 및 강하게 양극화된 내층을 형성하는 사이토케라틴8+ 관강 세포를 명백히 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 사이토케라틴5+ 기저 세포 및 사이토케라틴8+ 관강세포를 포함하며, 여기에서 상기 사이토케라틴5+ 기저 세포는 외부의 세포층을 형성하고 상기 사이토케라틴8+ 관강 세포는 강하게 양극화된 내층을 형성한다. 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 임의로 강한 폴딩을 포함하여, 폴딩된 세포층을 포함한다. 상기와 같은 폴딩은 분비 세포의 표면적을 최대화하며, 이는 형태학적 수준에서 전립선 오르가노이드가 생체 내 전립선을 닮음을 보인다. 일부의 실시태양에서, 전립선 오르가노이드의 형태는 상기 전립선의 생체 내 형태를 닮는다.
ENR 조건에서 배양된 전립선 오르가노이드는 관강 내로 어떠한 전립선액도 분비하지 않는다. 대조적으로, 상기 배지에의 테스토스테론(예를 들어 DHT)의 첨가는 상기 오르가노이드 관강 중의 유체, 예를 들어 전립선액의 분비를 생성시킨다. 이는 테스토스테론(예를 들어 DHT)에 의한 전립선 오르가노이드에서의 AR-의존적인 전사 프로그램의 활성화(이는 CK8+ 관강 세포에 의한 체액의 분비를 생성시킨다)에 기인한다. 상기 데이터는 전립선 오르가노이드가 형태학적으로 및 작용적으로 생체 내 전립선 상피를 닮음을 나타낸다.
따라서, 일부의 실시태양에서, 예를 들어 전립선 오르가노이드를 테스토스테론(예를 들어 DHT)을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 실시태양에서, 전립선 오르가노이드는 체액, 예를 들어 전립선액을 상기 오르가노이드의 관강 내로 분비한다. 일부의 실시태양에서, 예를 들어 상기 전립선 오르가노이드를 테스토스테론(예를 들어 DHT)을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 실시태양에서, 전립선 오르가노이드의 작용성은 상기 전립선의 생체 내 작용성을 닮는다.
조직 단편
본 발명의 개념 내에서, 조직 단편은 성숙한 조직, 바람직하게는 인간 성인 조직의 일부, 예를 들어 인간 성인 소장, 결장 또는 췌장의 일부이다. 본 발명과 관련하여 인간 성인 조직의 추가의 예는 위, 간 및 전립선을 포함한다. 상기 조직은 정상(건강한) 조직이거나 또는 병든 또는 감염된 조직일 수 있다. 따라서, 바람직하게는 본 발명에서 확인된 바와 같은 오르가노이드는 조직 단편이 아니다. 오르가노이드를 바람직하게는 성숙한 조직으로부터의 세포, 바람직하게는 성숙한 조직, 임의로 성숙한 조직 단편으로부터의 상피 줄기세포, 보다 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 성숙한 조직 또는 성숙한 조직 단편으로부터의 상피 줄기세포를 사용하여 수득한다. 따라서, 본 발명의 개념 내에서, 조직 단편은 바람직하게는 Lgr5+ 줄기세포를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 오르가노이드는, 본 발명의 방법을 사용하여(바람직하게는 본 발명의 배양 배지를 사용하여) 여전히 배양되고 따라서 세포외 기질과 접촉하는 오르가노이드이다. 바람직하게는 오르가노이드는 비-중간엽 세포외 기질 중에 매몰된다. 본 발명의 개념 내에서, "접촉하는"은 물리적 또는 기계적 또는 화학적 접촉을 의미하며, 이는 상기 오르가노이드를 상기 세포외 기질로부터 분리시키기 위해서 힘을 사용할 필요가 있음을 의미한다. 일부의 실시태양에서, 상기 세포외 기질은 엥겔브레트-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비된 젤라틴성 단백질 혼합물, 예를 들어 매트리젤(상표)(BD Biosciences)이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 오르가노이드를 배양물로부터 제거하고 이식 또는 재생 목적에 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에의 이식에 사용하기 위한 본 발명의 오르가노이드를 제공한다.
생존률
발명자들은 여기에서 앞서 개시된 줄기세포 배양 배지에 ALK4, ALK5, ALK7 또는 p38 키나제의 첨가가 배양물 도말 효율을 50% 이상까지 및 일부의 경우에 100% 넘게 개선시켰음을 처음으로 입증한다(표 2 참조). 발명자들은 또한 상기 배양 배지에 상기 두 억제제(ALK 억제제 및 p38 억제제, 예를 들어 A83-01 및 SB-202190) 모두를 포함시키는 것이 배양 기간을 상승작용적으로 연장시킴을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 줄기세포는 3 개월 이상, 바람직하게는 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 9 개월 이상, 또는 12 개월 이상 동안 생존한다.
증식 속도
증식 속도를 세포 집단 배가 수준에 의해 평가할 수 있다. 상기 집단 배가 수준은 집단 중 세포가 시험관 내에서 그의 1 차 단리 이래로 배가된 총 배수를 지칭한다. 상기 집단 배가 수준을 세포 카운팅에 의해 측정할 수 있다. 한편으로, 상기 증식 속도를 세포 증식 분석에 의해 평가할 수 있으며, 예를 들어 상기에서 특이적인 형광 탐침은 BrdU 결합에 의한 DNA 합성 활성 및 Ki67 발현에 의한 세포 증식 상태를 측정한다(Thermo Scientific* Cellomics, Millipore).
줄기세포에 대한 세포 증식 분석의 추가의 예를 쉽게 입수할 수 있으며 온라인이나 커런트 프로토콜(Current Protocols)과 같은 저널에서 찾을 수 있다. 다수 중 일례는 하기와 같다: http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=101&filterDispName=Cellular Proliferation Assays for Stem Cells&filterType=1&OP=filter&filter=ft_1101%2Ff_494303*&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAH2NsQrDMAxEv0ZTsEkdKFmzZC70C4IjakFsGVuOfz%2FK0I6F4x284c48YJxfhffm%0ApQ7gnsMby0ke6x8fRDJMC7hV03u3lE6Swh9M1nNUWUlQq1UFJkXgeIvvotnSbn6Lbl1yPshvQpyq%0ADRIPfQE33RlnKQ21Lvuql7CrAAAA.
발명자들은 본 발명의 배양 배지를 사용하여 세포가 1주일에 평균 5 배까지 확대될 수 있음을 관찰하였다. 예를 들어, 단일 세포가 2주 동안 증식하면 대략적으로 평균 25 개 세포를 제공할 것이다. 숙련가는 본 발명의 줄기세포의 평균 집단 배가 시간이 여러 인자들, 예를 들어 계대 배양 수, 배양 조건, 시딩 밀도 등에 따라 변할 수 있음을 알 것이다.
하나의 실시태양에서, 평균 집단 배가 시간은 6 내지 48 시간, 12 내지 36 시간, 18 내지 30 시간, 또는 대략적으로 24 시간일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 배양 배지를 사용하여 배양된 줄기세포 집단은 주당 대략 4 내지 7 배, 또는 대략 5 배 배가될 것으로 예상될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 평균 집단 배가 시간은 12 내지 96 시간, 24 내지 72 시간, 또는 대략적으로 72 시간이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 세포 집단은 1주일에 평균 1 배 초과, 2 배 초과, 3 배 초과, 4 배 초과, 또는 5 배 초과로 배가한다.
본 발명의 오르가노이드의 다른 성질들
바람직한 실시태양에서, 오르가노이드를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월 이상 동안 배양할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 오르가노이드를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 동안 배양할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 오르가노이드는 단일 세포, 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 단일 세포로부터 기원하며, 보다 바람직하게는 상기 단일 세포는 관심 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물을 포함한다.
본 발명은 또한 바람직하게는 50% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 60% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 70% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 80% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 90% 이상의 생육 가능한 세포를 포함하는 오르가노이드를 제공한다. 세포의 생육성은 FACS에서 훽스트 염색 또는 프로피디움 요오다이드 염색을 사용하여 평가할 수 있다.
상기 생육 가능한 세포는 바람직하게는 상술한 바와 같은 조직-특이성 작용, 또는 조직-특이성 작용의 특징을 갖는다.
발명자들은 또한 본 발명의 배지 및 방법에 의해 생성된 오르가노이드를 -80 ℃ 이하에서, 예를 들어 액체 질소 중에서 동결 및 보관할 수있다. 동결된 오르가노이드를 그의 3D 구조 및 완전성을 상실하지 않고 현저한 세포사 없이 해동시키고 배양물에 넣을 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 -5 ℃ 이하, -10 ℃ 이하, -20 ℃ 이하, -40 ℃ 이하, -60 ℃ 이하, 또는 -80 ℃ 이하에서 보관된 동결된 오르가노이드를 제공한다.
본 발명의 세포 및 오르가노이드는, 상기 개략된 방법에 의해 측정된 바와 같이, 보다 양호한 표현형(소낭-융모 오르가노이드의 경우 감마 세크레타제 억제제의 첨가 시 배상세포 전환을 포함한 보다 양호한 분화 프로파일) 및 핵형 안정성, 보다 양호한 생존률 및 보다 빠른 세포 증식 속도를 갖는다는 점에서, 앞서 제조된 임의의 세포 및 오르가노이드(WO2009/022907 및 WO2010/016766)와 상이하다. 따라서, 장, 결장 및 췌장 실시태양의 경우, 본 발명의 오르가노이드는 표현형 및 핵형 안정성의 완전한 보존 및 증식 및 분화의 유지를 갖는, 인간 장, 결장 또는 췌장 상피를 분명히 나타낸다.
본 발명의 줄기세포 또는 오르가노이드의 용도
*
*본 발명은 약물 선별, (약물) 표적 확인, (약물) 표적 발견, 독물학 및 독물학 선별, 개인 맞춤형 의료, 재생 의학 또는 생체 외 세포/기관 모델에 사용하기 위한, 예를 들어 질병 모델에 사용하기 위한 본 발명의 오르가노이드 또는 확대된 세포 집단의 용도를 제공한다.
본 발명의 배지 및 방법에 따라 배양된 세포 및 오르가노이드는 상기 생체 내 상황을 충실히 나타내는 것으로 생각된다. 이는 정상 조직으로부터 증식된 세포 및 오르가노이드의 확대된 집단 및 병든 조직으로부터 증식된 세포 및 오르가노이드의 확대된 집단 모두에 대해 사실이다. 따라서, 본 발명의 오르가노이드 또는 확대된 세포 집단은 정상적인 생체 외 세포/기관 모델을 제공할뿐만 아니라, 생체 외 질병 모델로서도 사용될 수 있다.
본 발명의 오르가노이드는 또한 병원체의 배양에 사용될 수 있으며 따라서 생체 외 감염 모델로서 사용될 수 있다. 본 발명의 오르가노이드를 사용하여 배양시킬 수 있는 병원체의 예는 동물 숙주에서 질병을 유발하는 바이러스, 세균, 프리온 또는 진균을 포함한다. 따라서 본 발명의 오르가노이드를 감염된 상태를 나타내는 질병 모델로서 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 오르가노이드를 백신 개발 및/또는 생산에 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 오르가노이드에 의해 연구될 수 있는 질병은 유전병, 대사 질환, 병원성 질병, 염증성 질병 등, 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 암종, 선종, 선암종, 결장암, 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 바렛 식도, 고셔병, 알파-1-항트립신 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 빈혈, 스바크만-보디안-다이아몬드 증후군, 진성 적혈구 증가증, 원발성 골수섬유증, 글리코겐 저장 질병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 크리글러-나자르 증후군, 유전성 티로신혈증, 폼베병, 진행성 가족성 담즙정체증, 흐렐러(Hreler) 증후군, SCID 또는 누출성 SCID, 오멘 증후군, 연골-모 부전증, 헤르페스 단순 뇌염, 경피증, 골형성 부전증, 벡커 근이영양증, 듀켄씨근이영양증, 선천성이상각화증 등을 포함한다.
전통적으로, 세포주 및 보다 최근의 iPS 세포가 생체 외 세포/기관 및/또는 질병 모델로서 사용되었다(예를 들어 문헌[Robinton et al. Nature 481, 295, 2012]을 참조하시오). 그러나, 상기 방법은 다수의 도전 및 단점들이 문제가 된다. 예를 들어, 세포주를 모든 환자들로부터 수득할 수 없으며(오직 몇몇 생검만이 성공적인 세포주를 생성시킨다), 따라서 세포주를 개인맞춤형 진단 및 의료에 사용할 수 없다. iPS 세포는 대개 세포를 특정한 세포 운명으로 재프로그램화하기 위해서 일부 수준의 유전자 조작을 요한다. 한편으로, 상기는 핵형 안정성에 영향을 미치는 배양 조건이 가해지고 따라서 배양 시간을 최소로 유지해야 한다(이는 또한 인간 배 줄기세포에 대한 경우이다). 이는 iPS 세포가 생체 내 상황을 정확하게 나타낼 수 없고 대신에 생체 내 세포의 양상을 모방하고자 하는 시도임을 의미한다. 세포주 및 iPS 세포는 또한 유전적 불안정성이 문제가 된다.
대조적으로, 본 발명의 오르가노이드는 상기 생체 내 상황을 충실히 나타내는 유전적으로 안정한 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 오르가노이드를 또한 연속적으로 확대시켜, 유전적으로 안정한 세포에 대한 양호한 공급원을 제공할 수 있다. 특히, 확대 집단을 "분할"할 수 있으며, 이는 상기 오르가노이드를 분할하여 상기 오르가노이드의 모든 세포를 새로운 배양 접시 또는 플라스크 내로 분류함을 의미한다. 상기 분류된 세포를 상기 오르가노이드로부터 제거하고 이어서 자체를 배양하고 확대시켜 추가의 확대된 집단을 함유하는 새로운 오르가노이드를 생산할 수 있으며, 이어서 이를 다시 분할할 수 있다. 분할을 또한 본 발명에서 "계대배양"이라 칭한다. 본 발명의 오르가노이드를 1 회 이상 계대배양, 예를 들어 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 회 이상 계대배양, 예를 들어 20 내지 30 회 계대 배양, 30 내지 35 회 계대배양, 32 내지 40 회 계대배양할 수 있다. 일부의 실시태양에서, 확대 세포 집단 또는 오르가노이드를 한 달에 1 회, 2주마다 1회, 1주일에 1 회, 1주일에 2 회, 1주일에 3 회, 1주일에 4 회, 1주일에 5 회, 1주일에 6 회 또는 매일 분할한다. 따라서, 본 발명의 오르가노이드는 유전적으로 안정한 세포 물질의 계속되는 공급원을 제공한다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 확대 오르가노이드는 상응하는 생체 내 상황 중에 존재하는 모든 분화된 세포 유형을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드는 분화되어 생체 내에 존재하는 모든 분화된 세포 유형을 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 오르가노이드를 사용하여 다양한 질병 및 치료제에 대한 기계론적 이해를 획득하고, 시험관 내 약물 선별을 수행하고, 잠재적인 치료제들을 평가하고, 장래 신규(약물) 요법 개발에 대한 가능한 표적(예를 들어 단백질)을 확인하고/하거나 세포-대체 요법과 결합된 유전자 수복을 조사할 수 있다.
본 발명의 오르가노이드를 그의 유전적 안정성 또는 표현형 특성의 상실 없이 증식 능력의 상실 없이 동결 및 해동시키고 배양물에 넣을 수 있다. 따라서, 상기 오르가노이드를 쉽게 보관하고 운반할 수 있다.
이러한 이유들로 인해 본 발명의 오르가노이드 또는 확대된 세포 집단은 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학 및 독물학 선별 및 개인맞춤형 의료를 위한 도구일 수 있다.
따라서, 추가의 태양에서, 본 발명은 약물 발견 선별, 독물학 분석 또는 의학, 예를 들어 재생 의학에 있어서 본 발명에 따른 확대된 줄기세포 집단 또는 오르가노이드, 예를 들어 장 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드의 용도를 제공한다. 예를 들어, 상기 소장, 결장, 췌장, 위, 간 또는 전립선 오르가노이드 중 어느 하나를 약물 발견 선별, 독물학 분석 또는 의학, 예를 들어 재생 의학에 사용할 수 있다.
점막 백신
상기 오르가노이드의 추가적인 중요한 용도는 점막 백신화의 개발에 있다. 점막 백신은 점막을 통해 투여되는 백신이다. 상기는 예를 들어 코, 입 또는 직장을 경유하는 임의의 점막 표면일 수 있다. 상기는 흡입기, 분무기 또는 다른 외부 보조장치를 통해 투여될 수 있다. 상기는 주사에 비해 다수의 명백한 이점들을 갖는다, 예를 들어 상기 백신의 투여를 위해 의료진이 필요하지 않으며, 이는 예를 들어 개발도상국에서는 중요할 수 있다.
장에서, M 세포(또는 "미세주름 세포")는 회장의 집합된 림프절의 소낭-결합된 상피에서 발견되는 세포이다. 상기는 유기체 및 입자를 장강에서부터 상피 차단층을 가로질러 면역 세포로 운반하며, 따라서 점막 면역성을 자극하는데 중요하다. 상기는 세포이물흡수 또는 식작용을 통해 소장의 관강으로부터 항원을 흡수하고 이어서 이를 세포통과를 통해 측저면상의 독특한 주머니형 구조 중에 위치한 수지상 세포(항원 제공 세포) 및 림프구(즉 T 세포)로 전달하는 독특한 능력을 갖는다.
도 48은 마우스 오르가노이드가 RANK 리간드에 의해 자극될 때 M 세포로 발생할 수 있음을 도시한다. 도 49는 인간 장 오르가노이드에서 M 세포를 생성시키는 것이 또한 가능함을 보인다. 따라서, 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 확대된 세포 집단은 M 세포를 포함한다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 오르가노이드, 예를 들어 소장 오르가노이드는 M 세포를 포함한다.
점막 백신의 효율은 상기 백신이 M 세포에 대해 표적화될 때 실질적으로 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 확대된 줄기 세포 집단 또는 오르가노이드를, 병원체 또는 항원을 흡수하고 이를 면역계에 제공하는 M 세포의 능력을 시험하는데 사용할 수 있다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명은 약물 선별, 예를 들어 백신 개발 및/또는 백신 생산에 있어서 본 발명의 확대된 줄기세포 집단 또는 오르가노이드의 용도를 제공한다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서 상기 확대된 줄기세포 집단 또는 오르가노이드를 바이러스, 세균, 진균 또는 다른 기생충 감염, 예를 들어 (비제한적으로) 콜레라, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 로타바이러스 및 HIV에 대한 백신의 개발 또는 생산에 사용할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 점막 백신 개발에 사용하기 위한, RANKL을 포함하는 본 발명의 배양 배지에서 분화된 소장 오르가노이드를 제공한다.
약물 선별
바람직하게는 대량 처리를 목적으로, 본 발명의 확대된 줄기세포 집단 또는 오르가노이드, 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드를 다중웰 플레이트, 예를 들어 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트에서 배양한다. 분자들의 라이브러리를 사용하여 상기 오르가노이드에 영향을 미치는 분자를 확인한다. 바람직한 라이브러리는 항체 단편 라이브러리, 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩타이드 라이브러리(예를 들어 LOPAP(상표), Sigma Aldrich), 지질 라이브러리(BioMol), 합성 화합물 라이브러리, (예를 들어 LOPAP(상표), Sigma Aldrich), 또는 천연 화합물 라이브러리(Specs, TimTec)를 포함한다. 더욱 또한, 상기 줄기세포의 자손에서 보다 많은 유전자들 중 하나의 발현을 유도하거나 억제하는 유전자 라이브러리를 사용할 수 있다. 이들 유전자 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-암호화 RNA 라이브러리를 포함한다. 상기 세포를 바람직하게는 일정한 기간 동안 다중 농도의 시험 작용제에 노출시킨다. 상기 노출 기간의 끝에서, 상기 배양물을 평가한다. "영향을 미치는"이란 용어는 세포에 있어서 임의의 변화, 예를 들어 비제한적으로 증식, 형태적 변화 및 세포사의 감소 또는 상실을 포함하는데 사용된다. 본 발명의 확대된 줄기세포 집단 또는 오르가노이드, 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드를 또한, 상피 암종 세포를 특이적으로 표적화하지만, 본 발명의 상기 확대된 줄기세포 집단 또는 오르가노이드, 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드는 표적화하지 않는 약물을 확인하는데 사용할 수 있다.
발명자들은 단지 7 내지 14일 동안 소장으로부터 생검을 취하고 이를 확대시키고 약물 선별을 수행할 준비가 된 오르가노이드를 수득하는 것이 가능함을 입증하였다. 상기와 같은 짧은 시간 내에 본 발명의 유용한 오르가노이드를 수득하는 능력은 상기 오르가노이드가 특정한 약물에 대한 개별적인 환자의 반응을 시험하고 상기 반응에 따라 치료를 맞춤하는데 매우 유용할 것임을 나타낸다. 일부의 실시태양에서, 상기 오르가노이드를 환자로부터의 생검으로부터 수득하는 경우에, 상기 오르가노이드를 21일 미만, 예를 들어 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만(등) 동안 배양한다.
상기 오르가노이드는 또한 보다 광범위한 약물 발견 목적에 유용하다. 예를 들어 도 32 내지 40은 건강한 환자 및 낭성 섬유증 환자로부터 취한 소장 오르가노이드를 사용하여 낭성 섬유증에 대한 약물을 시험할 수 있음을 도시한다. 구체적으로, 도 32 내지 40은 정상적인 소장 오르가노이드의 포스콜린-유도된 팽창이 상기 낭성 섬유증 유발 세포막 단백질(CFTR)에 따라 변하며 따라서 양성 판독으로서 포스콜린-유도된 팽창을 사용하여 CFTR 작용의 교정을 위해 시험하는 것이 가능함을 보인다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드를 낭성 섬유증 약물의 선별에 사용할 수 있다. 그러나, 숙련가는 본 발명의 오르가노이드를 인간 위장관의 감염성, 염증성 및 종양성 병리학 및 위장관의 다른 질병 및 췌장, 간 및 전립선을 포함하여 본 발명에 개시된 다른 조직의 감염성, 염증성 및 종양성 병리학 및 다른 질병에 대한 약물 선별 도구로서 광범위하게 적용할 수 있음을 알 것이다. 일부의 실시태양에서, 본 발명의 오르가노이드를 암 약물의 선별에 사용할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 확대된 세포 집단, 예를 들어 본 발명의 오르가노이드 또는 본 발명의 배지 및 방법을 사용하여 수득한 오르가노이드를 사용하여 약물, 화장품 및/또는 예방 의학으로서 사용하기 위한 적합성에 대해 화학물질, 항체, 천연 생성물(식물 추출물) 등의 라이브러리를 시험할 수 있다. 예를 들어, 일부의 실시태양에서, 관심 환자의 세포 생검, 예를 들어 암 환자로부터의 종양 세포를 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 배양하고 이어서 화학적 화합물 또는 화학적 라이브러리로 치료할 수 있다. 이어서 화합물이 상기 환자의 세포를 유효하게 변형시키고, 죽이고/죽이거나 치료함을 측정하는 것이 가능하다. 이는 시험되는 특정 약물에 대한 특이적인 환자 반응성을 허용하고, 따라서 치료를 특정한 환자에 맞추게 한다. 따라서, 이는 개인맞춤형 의학적 접근을 허용한다.
이러한 식으로 약물을 확인하기 위해 상기 오르가노이드를 사용하는 추가된 이점은 약물 및 화합물이 건강한 조직에 대해 최소의 영향을 가짐을 검사하기 위해 정상 오르가노이드(건강한 조직으로부터 유도된 오르가노이드)를 선별하는 것이 가능하다는 것이다. 이는 최소의 표적 이탈 활성 또는 불필요한 부작용을 갖는 약물을 선별할 수 있게 한다.
임의의 수의 질병에 대한 약물을 상기 방식으로 선별할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 오르가노이드를 낭성 섬유증, 바렛 식도, 암종, 선암종, 선종, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 간 질환 등에 대한 약물을 선별하기 위해 사용할 수 있다. 상기 시험 매개변수들은 관심 질병에 따라 다르다. 예를 들어, 암 약물을 선별하는 경우, 암 세포사가 대개는 궁극적인 목적이다. 낭성 섬유증의 경우에, 상기 약물 및 CFTR의 자극에 대한 반응으로 상기 오르가노이드의 확대를 측정하는 것이 중요하다. 다른 실시태양에서, 대사 또는 유전자 발현을, 관심 세포 또는 오르가노이드에 대한 상기 선별 화합물 및 약물의 효과를 연구하기 위해 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료학적 또는 예방학적 약물 또는 화장품을 선별하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
본 발명의 확대된 세포 집단(예를 들어 오르가노이드)을, 예를 들어 본 발명의 배양 배지로, 임의로 21일 미만 동안 배양하고;
본 발명의 확대된 세포 집단(예를 들어 오르가노이드)을 후보 분자들 중 하나 또는 라이브러리에 노출시키고;
상기 확대된 세포 집단(예를 들어 오르가노이드)을 임의의 효과에 대해, 예를 들어 세포의 임의의 변화, 예를 들어 증식의 감소 또는 손실, 형태 변화 및/또는 세포사에 대해 평가하고;
잠재적인 약물 또는 화장품으로서 상기 효과를 유발하는 후보 분자를 확인함
을 포함한다.
일부의 실시태양에서, 컴퓨터- 또는 로봇-지원된 배양 및 데이터 수집 방법을 사용하여 상기 선별의 자료처리량을 증가시킨다.
*
*일부의 실시태양에서, 확대된 세포 집단(예를 들어 오르가노이드)을 환자 생검으로부터 수득한다. 일부의 실시태양에서, 배양된 확대된 세포 집단(예를 들어 오르가노이드)에 대해 목적하는 효과를 야기하는 후보 분자를 상기 환자에게 투여한다.
따라서, 하나의 태양에서,
(a) 환자의 병든 관심 조직으로부터 생검을 수득하고;
(b) 본 발명의 선별 방법을 사용하여 적합한 약물을 선별하고;
(c) 단계 (b)에서 수득한 약물로 상기 환자를 치료함
을 포함하는, 환자의 치료방법을 제공한다.
일부의 실시태양에서, 상기 약물 또는 화장품을 유전병, 대사 질환, 병원성 질병, 염증성 질병 등, 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 암종, 선종, 선암종, 결장암, 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 바렛 식도, 고셔병, 알파-1-항트립신 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 빈혈, 스바크만-보디안-다이아몬드 증후군, 진성 적혈구 증가증, 원발성 골수섬유증, 글리코겐 저장 질병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 크리글러-나자르 증후군, 유전성 티로신혈증, 폼베병, 진행성 가족성 담즙정체증, 흐렐러(Hreler) 증후군, SCID 또는 누출성 SCID, 오멘 증후군, 연골-모 부전증, 헤르페스 단순 뇌염, 경피증, 골형성 부전증, 벡커 근이영양증, 듀켄씨근이영양증, 선천성이상각화증 등의 증상을 치료, 예방 또는 개선시키기 위해 사용한다.
표적 발견
일부의 실시태양에서, 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 증식시킨 본 발명의 오르가노이드 또는 세포를 표적 발견에 사용할 수 있다. 건강한 또는 병든 조직으로부터 기원하는 오르가노이드들의 세포를 표적 확인에 사용할 수 있다. 본 발명의 오르가노이드를 낭성 섬유증, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병), 암종, 선종, 선암종, 결장암, 당뇨병(예를 들어 I형 또는 II형), 바렛 식도, 고셔병, 알파-1-항트립신 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 빈혈, 스바크만-보디안-다이아몬드 증후군, 진성 적혈구 증가증, 원발성 골수섬유증, 글리코겐 저장 질병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 크리글러-나자르 증후군, 유전성 티로신혈증, 폼베병, 진행성 가족성 담즙정체증, 흐렐러(Hreler) 증후군, SCID 또는 누출성 SCID, 오멘 증후군, 연골-모 부전증, 헤르페스 단순 뇌염, 경피증, 골형성 부전증, 벡커 근이영양증, 듀켄씨근이영양증, 선천성이상각화증 등에 대한 약물 표적을 발견하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 배지 및 방법에 따라 배양된 세포 및 오르가노이드는 생체 내 상황을 충실히 나타내는 것으로 생각된다. 이러한 이유로 인해 상기는 특정 질병에서 신규의(분자) 표적을 찾기 위한 도구일 수 있다.
신규의 약물 표적을 찾기 위해서, 화합물(예를 들어 siRNA)의 라이브러리를 사용하여 상기 세포를 형질도입시키고 특정 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 일부의 실시태양에서, 세포를 siRNA로 형질도입시켜 (큰)그룹의 유전자의 작용을 억제시킨다. 상기 유전자 그룹 또는 특정한 세포 작용의 임의의 작용성 판독을 사용하여 표적이 상기 연구에 적합한지를 결정할 수 있다. 질병-특이적 판독은 당해 분야에 널리 공지된 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식을 분석하여 암에 관련된 유전자들을 검사할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 바와 같은 Topflash 분석을 사용하여 siRNA 억제에 의해 야기된 Wnt 활성의 변화를 검출할 수 있다. 성장 감소 또는 세포사가 발생하는 경우에, 상응하는 siRNA 관련된 유전자를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다. 이들 유전자는 상기 세포의 성장을 억제하기에 가능한 표적이다. 확인 시, 상기 연구된 세포 과정에 대해 확인된 표적의 특이성을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 측정하는 것이 필요할 것이다. 상기 방법을 사용하여, 신규의 분자들을 치료에 가능한 약물 표적으로서 동정할 수 있다.
표적 및 약물 확인 선별
병든 및/또는 정상 조직으로부터 수득된 환자-특이성 오르가노이드를 대량 자료처리 선별에서 확인된 분자의 표적 확인에 사용할 수 있다. 이는 대량 자료처리 선별에서 가능한 표적 약물로서 동정된 화합물의 확인에 해당한다. 상기 오르가노이드 배양 시스템에서 확대된 1차 환자 물질의 사용은 대량 자료처리 약물 발견 세포주 연구로부터 거짓 양성을 검사하는데 유용할 수 있다.
일부의 실시태양에서, 상기 확대된 줄기세포 집단(예를 들어, 본 발명의 오르가노이드), 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드를 대량 자료처리 선별에서 가능한 약물 또는 화장품으로서 동정된 화합물의 확인에 사용할 수 있다.
독성 분석
상기 확대된 줄기세포 집단(예를 들어, 본 발명의 오르가노이드), 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드를 잠재적인 신규 약물 또는 공지되거나 신규의 식품 보조제의 독성 분석에서 Caco-2 세포와 같은 세포주의 사용을 추가로 대체할 수 있다.
독물학 선별은 약물 선별(상술한 바와 같은)과 유사한 방식으로 수행되나 약물의 독성 효과 및 치료 효과 없음을 검사한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 상기 후보 화합물의 효과는 독성이다.
병원체 배양
더욱 또한, 상기 확대된 줄기세포 집단(예를 들어, 본 발명의 오르가노이드), 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드를 현재 적합한 조적 배양물 또는 동물 모델이 없는 병원체, 예를 들어 노로바이러스의 배양에 사용할 수 있다.
재생 의학 및 이식
상기 확대된 줄기세포 집단(예를 들어, 본 발명의 오르가노이드), 예를 들어 소낭-융모 오르가노이드 또는 췌장 오르가노이드를 포함하는 배양물은 재생 의학, 예를 들어 방사선 치료-후 및/또는 수술-후 장 상피의 보수, 염증성 장 질병, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염을 앓고 있는 환자의 장 상피의 보수, 및 짧은 장 증후군을 앓고 있는 환자의 장 상피의 보수에 유용하다. 소장/결장의 유전적 질병이 있는 환자의 장 상피의 보수에 추가의 용도가 존재한다. 췌장 오르가노이드를 포함하는 배양물은 재생 의학에, 예를 들어 췌장 또는 그의 일부의 절제 후 이식물로서, 및 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병과 같은 당뇨병의 치료에 또한 유용하다.
또 다른 실시태양에서, 상기 확대된 상피 줄기세포는 관련된 조직 운명, 예를 들어 췌장 베타-세포를 포함하는 췌장 세포로 재프로그램화된다. 지금까지, 성숙한 줄기세포로부터 췌장 세포를 재생시키는 것은 가능하지 않았다. 본 발명의 배양 방법은 밀접하게 관련된 상피 줄기세포를 췌장 베타-세포를 포함하는 췌장 세포로 트랜스-분화시키는 인자들을 분석할 수 있게 할 것이다.
유전자 요법을 손상되거나 병든 조직의 보수에 관한 방법에 추가로 사용할 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들어 DNA 및/또는 RNA와 같은 유전 정보를 줄기세포로 전달하는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클을 사용할 수 있다. 숙련가는 유전자 요법에서 표적화된 특정한 유전자를 대체하거나 보수할 수 있다. 예를 들어, 정상 유전자를 게놈 내 비특이적 위치에 삽입하여 비작용성 유전자를 대체할 수도 있다. 또 다른 예에서, 비정상 유전자 서열을 동종 재조합을 통해 정상 유전자 서열로 대체할 수 있다. 한편으로, 선택적인 역 돌연변이는 유전자를 그의 정상 기능으로 복귀시킬 수 있다. 추가의 예는 특정 유전자의 조절(유전자가 작동하거나 작동하지 않는 정도)을 변경시키는 것이다. 바람직하게는, 상기 줄기세포를 유전자 요법 접근법에 의해 생체 외에서 치료하며 후속으로 치료가 필요한 포유동물, 바람직하게는 인간으로 옮긴다.
성숙한 공여체로부터 취한 작은 생검을 임의의 명백한 제한 또는 유전적 손상 없이 확대시킬 수 있기 때문에, 상기 기술은 재생 목적을 위해 이식 가능한 상피를 생성시키는 작용을 할 수 있다. 오르가노이드를 그의 3D 구조 및 완전성의 상실 없이 및 현저한 세포사 없이 동결 및 해동시키고 배양물에 넣을 수 있다는 사실이 오르가노이드의 이식 목적에의 적용성에 추가로 더해진다. 더욱 또한, 일부의 실시태양에서, ECM에 매몰되거나 또는 이와 접촉하는 오르가노이드를 포유동물, 바람직하게는 인간에 이식할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 오르가노이드 또는 ECM을 동시에 포유동물, 바람직하게는 인간에게 이식할 수 있다.
숙련가는 ECM을 본 발명에 따라 세포의 확대된 집단 또는 오르가노이드를 포함하는 조직-유사 구조를 획득하기 위한 3D 스캐폴드로서 사용할 수 있음을 알 것이다. 이어서 상기와 같은 구조를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 환자에게 이식할 수 있다. ECM 스캐폴드를 ECM 단백질, 예를 들어 콜라겐 및/또는 라미닌을 사용하여 합성적으로 제조하거나, 또는 한편으로 ECM 스캐폴드를, 단리된 기관 또는 조직 단편을 "세포제거"하여 ECM으로 이루어지는 스캐폴드를 남김으로써 수득할 수 있다(예를 들어 문헌[Macchiarini et al. The Lancet, Volume 372, Issue 9655, Pages 2023 - 2030, 2008]을 참조하시오). 일부의 실시태양에서, ECM 스캐폴드를, 기관 또는 조직 단편을 "세포제거"함으로써 수득할 수 있으며, 여기에서 임의로 상기 기관 또는 조직 단편은 췌장, 간, 장, 위 또는 전립선으로부터의 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에의 이식에 사용하기 위한 본 발명의 오르가노이드 또는 세포 집단을 제공한다. 또한 본 발명의 오르가노이드 또는 세포집단을 환자에게 이식함을 포함하는, 이식이 필요한 환자의 치료 방법을 제공하며, 여기에서 상기 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
유리하게는, 본 발명은 작은 생검을 성숙한 공여체로부터 임의의 명백한 제한 또는 유전적 손상 없이 취할 수 있으며 따라서 본 발명에 제공된 기술은 재생 목적으로 이식가능한 상피를 생성시키는데 소용이 될 수 있다.
중대하게, 발명자들은 본 발명의 인간 췌장 오르가노이드를 마우스에서 신장주변 피막 아래에 이식하는 경우, 상기 세포가 분화하여 인슐린을 분비하는 성숙한 베타 세포를 형성함을 발견하였다. 이는 상기가, 본 발명의 세포 집단 또는 오르가노이드가 시험관 외에서 배양되는 동안 검출 가능한 수준으로 인슐린을 분비하지 않는다 하더라도, 이들 세포가 인슐린-결핍 질환, 예를 들어 당뇨병의 치료를 위해 환자에게 이식하기에 유용할 수 있음을 의미하므로 중요하다.
따라서 본 발명은 본 발명의 췌장 오르가노이드 또는 본 발명의 췌장 오르가노이드로부터의 세포를 환자에게 이식함을 포함하는, 당뇨병 같은 인슐린-결핍 질환, 또는 기능부전 췌장을 갖는 상기 환자의 치료 방법을 포함한다.
일부의 실시태양에서, 상기 세포 또는 오르가노이드는 환자에게 이식 시 인슐린을 발현하거나 또는 분비하지 않지만 인슐린을 분비하도록 상기 환자 내에서 분화된다. 예를 들어, 인슐린을 분비하는 능력은 이식 즉시 검출될 수 없지만, 이식 후 약 1 개월까지, 예를 들어 이식 후 6주, 2 개월, 또는 3 개월까지 나타날 수 있다.
상기 환자는 바람직하게는 인간이나, 한편으로 비-인간 포유동물, 예를 들어 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 양, 토끼 또는 마우스일 수도 있다.
따라서, 세포 요법을 통해 인간 또는 비-인간 동물 환자를 치료하는 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기와 같은 세포 요법은 본 발명의 줄기세포 또는 오르가노이드를 임의의 적합한 수단을 통해 상기 환자에게 적용함을 포함한다. 구체적으로, 상기와 같은 치료 방법은 손상된 조직의 재생을 포함한다. 본 발명에 따라, 환자를 동종이계 또는 자기조직 줄기세포 또는 오르가노이드로 치료할 수 있다. "자기조직" 세포는 동일한 유기체로부터 기원하여, 예를 들어 조직 재생을 허용하도록 세포 요법을 위해 상기 유기체 내로 재도입되는 세포이다. 그러나, 상기 세포는 상기 도입되는 조직과 반드시 동일한 조직으로부터 단리되지는 않는다. 자기조직 세포를, 거부의 문제를 극복하기 위해서 환자와 합치시킬 필요는 없다. "동종이계" 세포는, 예를 들어 조직 재생을 허용하도록 세포 요법을 위해 상기 세포를 도입하는 개인과, 종은 같지만 상이한 개인으로부터 기원하는 세포이다. 어느 정도의 환자 합치가 거부의 문제를 방지하기 위해 여전히 필요할 수 있다.
일반적으로 본 발명의 세포 또는 오르가노이드느를 주사 또는 이식에 의해 환자의 몸에 도입시킨다. 일반적으로 상기 세포는 상기 세포가 작용하고자 하는 조직에 직접 주사될 것이다. 한편으로, 상기 세포를 간문맥을 통해 주사할 것이다. 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 주사기는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 주사기에 부착된 카테터는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
숙련가는 이식하려는 물질(즉 세포 집단, 세포 현탁액 중의 단일 세포, 오르가노이드 또는 오르가노이드의 단편)뿐만 아니라 치료하려는 기관에 따라 적합한 방법 및 투여 경로를 선택할 수 있을 것이다.
상기에 논의되는 바와 같이, 본 발명의 세포를 조직의 재생에 사용할 수 있다. 상기 기능을 성취하기 위해서, 세포를 손상된 조직에 직접 주사하거나 이식할 수 있으며, 상기 조직에서 상기 세포는 번식되고 결국 신체 중 그의 위치에 따라, 필요한 세포 유형으로 분화될 수 있다. 한편으로, 상기 오르가노이드를 상기 손상된 조직에 직접 주사하거나 이식할 수 있다. 치료에 민감한 조직은 모든 손상된 조직, 특히 예를 들어 질병, 손상, 외상, 자가면역 반응에 의해 또는 바이러스 또는 세균 감염에 의해 손상될 수도 있는 조직들을 포함한다. 본 발명의 일부의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를 사용하여 결장, 소장, 췌장, 식도 또는 위 시스템을 재생시킨다.
예를 들어, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를 해밀톤 주사기를 사용하여 환자에게 주사한다.
숙련가는 본 발명의 세포 또는 오르가노이드의 적합한 투여량이, 치료되는 특정 상태에 대해 존재함을 알 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를 다양한 조성의 용액, 미소구 또는 미세입자 중에서 동맥 내로 투여하여 재생이 필요한 조직 또는 손상된 기관의 일부를 관주할 것이다. 일반적으로, 상기와 같은 투여는 카테터를 사용하여 수행될 것이다. 상기 카테터는 혈관형성 및/또는 세포 전달에 사용되는 카테터 및 세포를 신체의 특정한 장소로 전달하는 특수 목적용으로 설계된 카테터 중 하나일 수 있다. 몇몇 용도를 위해서, 상기 세포 또는 오르가노이드를, 다수의 상이한 생분해성 화합물로 제조되고 약 15 ㎛의 직경을 갖는 미소구로 캡슐화할 수 있다. 상기 방법은 혈관내 투여된 세포 또는 오르가노이드가 손상 부위에 남아있게 하고, 처음 통과에서 모세혈관망를 통해 전신 순환으로 가게 하지 않을 수 있다. 상기 모세혈관망의 동맥쪽에서의 체류는 또한 그의 혈관외 공간으로의 이동을 촉진할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 세포 또는 오르가노이드는, 정맥을 통해 상기를 몸 전체로 또는 상기 세포 또는 오르가노이드가 향하는 조직 또는 신체 부분 내로 유출하는 특정 정맥 내로 국소적으로, 혈관 수상구조로 역행 주사될 수 있다. 상기 실시태양을 위해서 상술한 제제들 중 다수를 사용할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를 생체적합성 임플란트에 부착된 손상된 조직에 이식할 수 있다. 상기 실시태양 내에서, 상기 세포는 환자에게 이식 전에 시험관 내에서 상기 생체적합성 임플란트에 부착될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 다수의 부착제들 중 어느 하나를 사용하여 세포를 이식 전에 상기 임플란트에 부착시킬 수 있다. 단지 예로서, 상기와 같은 부착제는 피브린, 인테그린 과 중 하나 이상의 구성원, 카데린 과 중 하나 이상의 구성원, 셀렉틴 과 중 하나 이상의 구성원, 하나 이상의 세포 부착 분자(CAM), 면역글로불린 과 중 하나 이상의 구성원, 및 하나 이상의 인공 부착제를 포함할 수 있다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 하나 이상의 부착제들의 임의의 조합을 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를, 환자에게 기질을 이식하기 전에 상기 기질 중에 매몰시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 기질을 상기 환자의 손상된 조직에 이식할 것이다. 기질의 예는 콜라겐 기재 기질, 피브린 기재 기질, 라미닌 기재 기질, 피브로넥틴 기재 기질, 및 인공 기질을 포함한다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를 기질 형성 성분과 함께 상기 환자에게 이식하거나 주사할 수 있다. 이는 상기 세포가 주사 또는 이식에 이어서 기질을 형성할 수 있게 하며, 이는 상기 세포 또는 오르가노이드가 상기 환자 내의 적합한 위치에 남아 있는 것을 보장한다. 기질 형성 성분의 예는 피브린 글루 액체 알킬, 시아노아크릴레이트 단량체, 가소제, 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트란, 에틸렌 옥사이드-함유 올리고머, 블록 공중합체, 예를 들어 폴록사머 및 플루로닉스, 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈 및 트리톤'8' 및 인공 기질 형성 성분을 포함한다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 하나 이상의 기질 형성 성분들의 임의의 조합을 사용할 수도 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드는 미소구 내에 포함될 수 있다. 상기 실시태양 내에서, 상기 세포를 상기 미소구의 중심 내에 캡슐화할 수 있다. 또한 상기 실시태양 내에서, 상기 세포를 상기 미소구의 기질 물질 내에 매몰시킬 수 있다. 상기 기질 물질은 임의의 적합한 생분해성 중합체, 예를 들어 비제한적으로 알기네이트, 폴리 에틸렌 글리콜(PLGA), 및 폴리유레탄을 포함할 수 있다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 세포 또는 오르가노이드를 이식용 의료 장치에 부착시킬 수도 있다. 상기와 같은 의료 장치의 예는 스텐트, 핀, 봉합사, 스플릿, 심박 조율기, 보철 관절, 인공 피부 및 막대를 포함한다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 상기 세포를 다양한 방법에 의해 상기 의료 장치에 부착시킬 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 세포 또는 오르가노이드를 피브린, 인테그린 과 중 하나 이상의 구성원, 카데린 과 중 하나 이상의 구성원, 셀렉틴 과 중 하나 이상의 구성원, 하나 이상의 세포 부착 분자(CAM), 면역글로불린 과 중 하나 이상의 구성원, 및 하나 이상의 인공 부착제를 사용하여 상기 의료 장치에 부착시킬 수 있다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 하나 이상의 부착제들의 임의의 조합을 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본 발명의 방법
본 발명은 또한 줄기세포 집단의 확대 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
a) 줄기세포의 집단을 제공하고;
b) 본 발명에 따른 배양 배지를 제공하고;
c) 상기 줄기세포를 상기 배양 배지와 접촉시키고;
d) 상기 세포를 적합한 조건 하에서 배양함
을 포함한다.
더욱 또한, 본 발명은 단리된 조직 단편의 확대 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
a) 단리된 조직 단편을 제공하고;
b) 본 발명에 따른 배양 배지를 제공하고;
c) 상기 단리된 조직 단편을 상기 배양 배지와 접촉시키고;
d) 상기 세포를 적합한 조건 하에서 배양함
을 포함한다.
세포의 집단 또는 단리된 조직 단편을 '확대'시키기 위한 방법은 초기 집단 중의 줄기세포의 수를 유지하거나 증가시켜, 분화된 표현형 및 자기재생 성질을 유지하는 줄기세포의 확대된 집단을 생성시킴을 수반하는 것이다. 그러나, 상기 방법은 예를 들어 오르가노이드 형성에 기여하는, 예를 들어 조직 유사 구조를 형성시킬 수 있는 분화 자손의 생산을 포함할 수도 있다. 따라서, 본 발명에서 줄기세포 또는 상기 줄기세포를 포함하는 조직 단편을 본 발명의 배양 배지에서 배양함을 포함하는, 오르가노이드, 예를 들어 소장(소낭-융모) 오르가노이드, 결장 오르가노이드, 췌장 오르가노이드, 위 오르가노이드, 전립선 오르가노이드, 간 오르가노이드, 선암종 오르가노이드, 암종 오르가노이드, 또는 바렛 식도 오르가노이드를 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 바람직하게는 오르가노이드를 생성시키기 위해서 단일 줄기세포 또는 줄기세포의 집단을 확대시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명에 따른 배양 배지에서 상기 단일 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 배양함을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 오르가노이드를 수득하기 위한 방법은 상기 줄기세포 또는 조직 단편을 1차 "확대" 배지와 함께 배양한 다음, 상기 줄기세포 또는 조직 단편을 2차 "분화" 배지와 함께 배양함을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 분화 배지는 상기 확대 배지의 몇몇 성분을 포함하지 않는다, 예를 들어 상기 분화 배지는 Wnt, R스폰딘, 니코틴아미드, TGF-베타 억제제 및/또는 p38 억제제를 포함하지 않는다.
일부의 실시태양에서, 바람직하게는 오르가노이드를 생성시키기 위한 단일 줄기세포 또는 줄기세포의 집단을 확대시키기 위한 방법은 상기 단일 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 본 발명에 따른 1차 배양 배지에서 확대시키고, 임의로 상기 확대된 세포 또는 조직 단편을 본 발명에 따른 2차 배양 배지에서 분화시킴을 포함한다.
따라서 본 발명은, 바람직하게는 오르가노이드를 생성시키기 위해서 단일 줄기세포 또는 줄기세포 집단의 확대 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편을 제공하고;
본 발명에 따른 배양 배지를 제공하고;
상기 줄기세포를 상기 배양 배지와 접촉시키고;
상기 세포를 적합한 조건 하에서 배양함
을 포함한다.
일부의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편 및 배양 배지를 세포외 기질, 또는 세포막 단백질, 예를 들어 인테그린과의 상호작용에 의해 상기 세포외 기질을 모방하는 3D 기질, 예를 들어 라미닌-함유 세포외 기질, 예를 들어 매트리젤(상표)(BD Biosciences)과 접촉시킴을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 세포외 기질 내로 확산된다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은, 바람직하게는 오르가노이드를 생성시키기 위해서 단일 줄기세포 또는 줄기세포 집단의 확대 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 1차 확대 배지에서 배양하고;
상기 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 계속해서 배양하고 상기 배지에 분화 배지를 새로 공급하며, 여기에서 상기 분화 배지가 TGF-베타 억제제, p38 억제제, 니코틴아미드 및 Wnt 중에서 선택된 인자들 중 하나 이상, 바람직하게는 전부를 포함하지 않음
을 포함한다.
일부의 실시태양에서, 본 발명은, 바람직하게는 관심 조직의 오르가노이드를 생성시키기 위해서 단일 줄기세포 또는 줄기세포의 집단을 확대시키는 방법을 제공하며, 상기 관심 조직으로부터의 줄기세포 또는 조직 단편을 상기 관심 조직에 적합한 본 발명의 배양 배지에서 확대시키고; 임의로 상기 확대된 줄기세포 또는 조직 단편을 상기 관심 조직에 적합한 본 발명의 배양 배지에서 분화시킴을 포함한다.
단리된 줄기세포를 바람직하게는 상기 줄기세포가 천연으로 존재하는 세포 니치를 적어도 부분적으로 모방하는 미세환경에서 배양한다. 상기 세포 니치는 상기 줄기세포를 생체적합물질, 예를 들어 줄기세포 운명을 조절하는 핵심 조절 신호를 나타내는 기질, 스캐폴드 및 배양 기질의 존재 하에서 배양함으로써 모방된다. 상기 생체적합물질은 천연, 반-합성 및 합성 생체적합물질, 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다. 스캐폴드는 2차원 또는 3차원 망상구조를 제공한다. 상기 스캐폴드에 적합한 합성 물질은 다공성 고체, 나노섬유, 및 하이드로젤, 예를 들어 자기-조립성 펩타이드를 포함하는 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 퓨마레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 폴리셀룰로스 아세테이트, 및/또는 이들의 공중합체로 구성된 하이드로젤 중에서 선택된 중합체를 포함한다(예를 들어 문헌[Saha et al , 2007 Curr Opin Chem Biol 1 1(4) 381-387], [Saha et al , 2008 Biophysical Journal 95 4426-4438], [Little et al , 2008 Chem Rev 108, 1787-1796]을 참조하시오). 숙련가에게 공지된 바와 같이, 상기 스캐폴드의 기계적 성질, 예를 들어 탄성은 줄기세포의 증식, 분화 및 이동에 영향을 미친다. 바람직한 스캐폴드는 환자에게 이식 후 천연 성분에 의해 대체되어, 예를 들어 조직 재생 및/또는 상처 치유를 촉진하는 생분해성 (공)중합체를 포함한다. 더욱 또한 상기 스캐폴드는 환자에게서 이식 후 면역원성 반응을 실질적으로 유도하지 않는 것이 바람직하다. 상기 스캐폴드에 천연, 반-합성 또는 합성 리간드를 보충하며, 이들은 줄기세포의 증식 및/또는 분화 및/또는 이동에 필요한 신호를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 리간드는 한정된 아미노산 단편을 포함한다. 상기 합성 중합체의 예는 플루로닉(등록상표) F 127 블록 공중합체 계면활성제(BASF), 및 에티솔브(등록상표)(Johnson and Johnson)를 포함한다.
세포 니치는 부분적으로 상기 줄기 세포 및 주변 세포, 및 상기 니치 중 세포에 의해 생산되는 세포외 기질(ECM)에 의해 결정된다. 본 발명의 하나의 방법에서, 단리된 소낭 또는 상피 줄기세포가 ECM에 부착된다. ECM은 다양한 폴리사카라이드(대개는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸), 물, 엘라스틴 및 당단백질로 구성되며, 여기에서 상기 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴 및 라미닌을 포함한다. ECM은 결합 조직 세포에 의해 분비된다. 상이한 유형의 ECM이 공지되어 있으며, 상이한 유형의 당단백질 및/또는 상이한 당단백질들의 조합을 포함하는 상이한 조성물들을 포함한다. 상기 ECM을, ECM-생산 세포, 예를 들어 섬유아세포를 상기 세포의 제거 전, 및 단리된 소낭 또는 상피 줄기세포의 첨가 전에 용기에서 배양함으로써 제공할 수 있다. 세포외 기질-생산 세포의 예는 주로 콜라겐과 프로테오글리칸을 생산하는 연골세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐, 및 피브로넥틴을 생산하는 섬유아세포, 및 주로 콜라겐(I, III 및 V 형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 네타신-C를 생산하는 결장 근섬유모세포이다. 한편으로, 상기 ECM은 상업적으로 제공된다. 상업적으로 제공되는 ECM은 전형적으로 합성 ECM이다. 상업적으로 입수할 수 있는 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(Invitrogen) 및 매트리젤(상표)(BD Biosciences)이다. 줄기세포의 배양을 위한 ECM의 사용은 상기 줄기세포의 장기간 생존 및 미분화된 줄기세포의 계속된 존재를 증대시켰다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 ECM의 일례는 2 개 이상의 별개의 당단백질, 예를 들어 2 개의 상이한 유형의 콜라겐 또는 콜라겐과 라미닌을 포함한다. 상기 ECM은 합성 하이드로젤 세포외 기질 또는 천연 ECM일 수 있다. 가장 바람직한 ECM은 매트리젤(상표)(BD Biosciences)에 의해 제공되며, 이는 라미닌, 엔탁틴 및 콜라겐 IV를 포함한다. 따라서, 일부의 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 ECM은 세포막 단백질, 예를 들어 인테그린과의 상호작용에 의해 상기 세포외 기질을 모방하는 3D 기질이다.
따라서 일부의 실시태양에서 본 발명의 방법은 상기 줄기세포, 줄기세포의 집단 또는 단리된 조직 단편 및 배양 배지를 세포외 기질, 예를 들어 라미닌-함유 세포외 기질, 예를 들어 매트리젤(상표)(BD Biosciences)과 접촉시킴을 포함한다. 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지는 세포외 기질 내로 확산된다.
본 발명의 조성물 및 다른 형태
본 발명은 본 발명에 따른 배양 배지 및 줄기 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지 및 오르가노이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 더욱 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 배양 배지 및 세포외 기질을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지, 세포외 기질 및 본 발명의 줄기세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지, 세포외 기질 및 본 발명의 하나 이상의 오르가노이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 개시된 바와 같은 배양 배지를 생산하는데 사용될 수 있는 배양 배지 보충제를 제공한다. '배양 배지 보충제'는 스스로 줄기세포를 지지할 수 없지만 다른 세포 배양 성분과 배합 시 줄기세포 배양을 가능하게 하거나 개선시키는 성분들의 혼합물이다. 따라서 상기 보충제를 사용하여 이를 다른 세포 배양 성분들과 배합하여 적합한 배지 제형을 생성시킴으로써 본 발명의 작용성 세포 배양 배지를 생성시킬 수 있다. 배양 배지 보충제의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 억제제를 포함하는 배양 배지 보충제를 제공한다. 상기 보충제는 본 발명에 개시된 임의의 억제제(또는 억제제들의 조합)를 함유할 수 있다. 상기 보충제는 본 발명에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 세포 배양 성분들, 예를 들어 아미노산, 비타민, 무기염, 탄소 에너지원 및 완충제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포 배양 성분을 또한 함유할 수 있다.
배양 배지 또는 배양 배지 보충제는 농축된 액체 배양 배지 또는 보충제(예를 들어 2x 내지 250x 농축된 액체 배양 배지 또는 보충제)이거나 또는 건조한 배양 배지 또는 보충제일 수도 있다. 액체 및 건조 배양 배지 또는 보충제는 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 배양 배지 또는 보충제를 동결건조시킬 수도 있다.
본 발명의 배양 배지 또는 보충제를 전형적으로는 사용 전에, 예를 들어 자외선 광, 가열, 조사 또는 여과에 의해 살균하여 오염을 방지할 것이다. 배양 배지 또는 배양 배지 보충제를 보관 또는 운반을 위해서 동결시킬 수도 있다(예를 들어 -20 ℃ 또는 -80 ℃). 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지를 액체로서 보관할 수도 있다(예를 들어 대략 4 ℃). 일부의 실시태양에서, 상기 배양 배지를 분할하여 2 개의 성분으로서 보관할 수도 있다: 동결된 성분(예를 들어 대략 -20 ℃ 내지 대략 -80 ℃) 및 액체 성분(예를 들어 대략 4 ℃). 특히, 온도-민감성 또는 온도-민감성 분해성 물질을 바람직하게는 상기 동결된 성분에 포함시키는 반면, 덜 민감한 물질(예를 들어 DMEM 또는 FCS)을 액체 형태로 보관할 수 있으며 따라서 보관 및 선적을 위해 액체 성분 중에 포함시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지 또는 배양 배지 보충제를 함유하는 밀봉된 용기를 제공한다. 밀봉된 용기는 오염을 방지하기 위해서, 본 발명에 개시된 배양 배지 또는 배양 배지 보충제의 운반 또는 보관에 바람직할 수 있다. 상기 용기는 임의의 적합한 용기, 예를 들어 플라스크, 플레이트, 병, 단지, 바이알 또는 주머니일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 배양 배지, 배양 배지 보충제 및/또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부의 실시태양에서, 상기 키트는 예를 들어 ECM(예를 들어 매트리젤(상표)), 세포의 집단 및 오르가노이드를 포함하는 목록 중에서 선택된 하나 이상의 다른 추가적인 성분을 추가로 포함한다.
일반적인 사항
"GI" 넘버링이 상기에 사용된다. GI 번호 또는 "GenInfo 식별자"는 서열이 그의 데이터베이스에 첨가될 때 NCBI에 의해 처리된 각 서열 기록에 연속해서 할당되는 일련의 숫자들이다. 상기 GI 번호는 상기 서열 기록의 수납 번호와 닮지 않았다. 서열이 갱신되면(예를 들어 교정을 위해서, 또는 보다 많은 주석 또는 정보를 가하기 위해서), 새로운 GI 번호를 받는다. 따라서, 주어진 GI 번호와 관련된 서열은 결코 변하지 않는다.
"포함하는"이란 용어는 "함유하는"뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함한다, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 오직 X로만 이루어지거나 또는 어떤 것을 추가로, 예를 들어 X+Y를 포함할 수도 있다. "실질적으로"란 단어는 "완전히"를 제외하지 않는다, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우, "실질적으로"란 단어를 본 발명의 정의로부터 생략할 수도 있다.
수치 x와 관련하여 "약"이란 용어는 임의적이며 예를 들어 x±10%를 의미한다.
달리 구체적으로 서술하지 않는 한, 2 개 이상의 성분을 혼합하는 단계는 임의의 특정한 혼합 순서를 요구하지 않는다. 따라서 성분들을 임의의 순서로 혼합할 수 있다. 3 개의 성분이 존재하는 경우, 2 개의 성분을 서로 배합하고 이어서 상기 조합을 세 번째 성분과 배합할 수 있는 등이다.
본 발명의 다양한 태양 및 실시태양들을 실시예에 의해 하기에 보다 상세히 개시한다. 세부사항의 변형을 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음을 알 것이다.
실시예 1:
인간 상피 줄기세포에 대한 개선된 배양 배지 및 방법에 대한 필요성을 다루기 위해서, 발명자들은 몇몇 암, 예를 들어 결장직장암에서 전복되는 것으로 공지된 신호전달 경로를 조사하였다. 암에서 세포 운명에 영향을 미치는 상기 경로는 시험관 내 세포 배양 조건 하에서 세포 운명의 결정에 또한 한 역할을 할 수도 있음이 가정되었다.
1차 선별 실험에서, 일련의 비타민, 호르몬 및 성장 인자들을 표준 줄기세포 배양 배지와 함께 시험하였다. 가스트린 및 니코틴아미드가 현저하게 개선된 배양 조건을 생성시키는 것으로서 확인되었다. 이들 인자를 표준 배양 조건에 통합시키면서, 2차 선별 실험을 수행하였으며, 여기에서 적절한 신호전달 경로, 예를 들어 ERK, p38, JNK, PTEN, ROCK, 및 헤지호그와 관련된 몇몇 소분자 억제제들을 시험하였다. 현 시점의 기술 수준에서, 이들 추가적인 화합물들 각각의 결과가 배양 배지 성질에 걸려 있음을 예견하기 위한 타당한 방법은 없을 것이다.
인간 장 오르가노이드 배양물의 최적화에 사용되는 시약들의 목록
1차 선별(First screening) (WENR**)
설명(Description) 공급처
(Source)		 농도
(Concentration)		 활성
(Activity*)

호르몬(Hormones), 비타민(vitamins) 등
하이드로코르티손
(Hydrocortison)		 Sigma 500nM 0
가스트린***(Gastrin***) Sigma 1uM 1+
엑센딘4(Exendin4) GLP1 동족체
(GLP1 analog)		 Sigma 100nM 0
니코틴아미드(Nicotinamide) 비타민 B 유도체
(Vitamin B derivative) 		Sigma 10mM 3+
L-아스코르브산
(L-Ascorbic acid)		 비타민 C
(Vitamin C)		 Sigma 10uM 0
산화방지제 혼합물
(anti-oxidant mixture)		 Sigma 1x 0
지질 혼합물
(Lipid mixture)		 Sigma 1x 0
PGE2 Sigma 10uM 1+
(Cystic)
콜레라 독소
(Cholera Toxin)		 Sigma 100nM 1+
(Cystic)

성장 인자(Growth factors)
BDNF Peprotech 100ng/ml 0
GDNF Peprotech 100ng/ml 0
FGF2 Peprotech 100ng/ml 0
FGF10 Peprotech 100ng/ml 0
폴리스타틴(Follistatin) Peprotech 100ng/ml 0
Cyr61 Peprotech 1ug/ml 0
LIF Millipore 1000U/ml 0
2차 선별(Second screening)(WENR+가스트린+니코틴아미드)

소분자 억제제(Small molecule inhibitors)
PD98059 ERK 억제제
(ERK inhibitor)		 Sigma 10uM 1-
SB203580 p38 억제제
(p38 inhibitor)		 Sigma 1-10uM 2+
SB202190 p38 억제제
(p38 inhibitor) 		Sigma 1-10uM 2+
SP600125 JNK 억제제
(JNK inhibitor)		 Sigma 10uM 0
PS48 PDK1 활성제
(PDK1 activator)		 Sigma 5uM 0
Y27632 ROCK 억제제
(ROCK inihibitor)		 Sigma 10uM 1+
(cystic)
사이클로파민
(Cyclopamine)		 헤지호그 억제제
(Hedgehog inhibitor)		 Sigma 100nM 1-
5 아자시티딘
(5 Azacytidin)		 DNA 메틸라제 억제제
(DNA methylase inhibitor)		 Stemolecule 1-
도소몰핀(Dorsomorphin) BMP 억제제
(BMP inhibitor)		 Stemolecule 0
A83-01 ALK4,5,7 억제제
(ALK4,5,7 inhibitor) 		Tocris 50n-1uM 3+
VO-OHpic 트라이하이드레이트
(VO-OHpic trihydrate)		 PTEN 억제제
(PTEN inhibitor)		 Sigma 500nM 3-
피피트린-α
(Pifithrin-α)		 p53 억제제
(p53 inhibitor)		 Sigma 0
BIX01294 G9a HMTase 억제제
(G9a HMTase inhibitor)		 Stemolecule 1-
*활성 등급(도말 효율을 4일 배양 후 대조군과 비교하였다):
0 = 변화 없음; 1+ = <50% 증가; 2+ = 50-100% 증가; 3+ = >100% 증가;
1- = 0-50%; 2- = 50-100% 감소; 3- = >100% 감소.
** WENR은 EGF+노긴+R-스폰딘+Wnt-3a를 포함한다
***굵게 강조된 것은 배양 배지에 가장 큰 개선을 나타낸 화합물들이다.
요약하면, 발명자들은 쥐 소장(SI)으로부터 유래된 단일 소낭 또는 줄기세포가 오랜 기간에 걸쳐 확대되는 장기간 배양 조건을 확립시켰다. 증식하는 소낭은 다수의 소낭 분열을 겪는 동시에, 모든 분화된 세포 유형들이 존재하는 융모-유사 상피 도메인을 생성시킨다. 발명자들은 본 발명에 이르러 마우스 결장 및 인간 SI 및 결장으로부터 유사한 상피 오르가노이드가 증식하도록 상기 배양 조건들을 조절하였다. 상기 쥐 소장 배양 시스템을 기본으로, 발명자들은 쥐 및 인간 결장 배양 시스템을 최적화하였다. 이들은 성장 인자 칵테일에의 Wnt3A의 첨가가 마우스 결장 소낭을 무한 확대시킴을 발견하였다. 니코틴아미드, 소분자 Alk 억제제 및 p38 억제제의 추가적인 첨가가 장기간 인간 SI 및 결장 배양물에 바람직할 수 있었다. 상기 배양 시스템은 또한 쥐 Apcmin 선종, 인간 결장직장 암 및 결장 식도 화생 바렛 상피의 증식을 허용하였다. 상기 배양 기술은 인간 위장관의 감염, 염증 및 종양 병리학에 대한 연구 도구로서 광범위하게 적용될 것이다. 더욱이, 재생적 적용이 생체 외 확대된 장 상피에 적합하게 될 수 있다. 상기 소장 및 결장 상피의 자기재생이 소장에 위치한 줄기세포 및 그의 선조 세포의 증식에 의해 구동된다. 다수의 배양 시스템들이 개시되었지만(문헌[Evans GS et al. J Cell Sci 1992;101 ( Pt 1):219-31]; [Fukamachi H. J Cell Sci 1992;103 ( Pt 2):511-9]; [Perreault N & Jean-Francois B. Exp Cell Res 1996;224:354-64]; [Whitehead RH et al. Gastroenterology 1999;117:858-65]), 최근에는 오직 기본적인 소낭 생리학을 유지하는 장기간 배양 시스템만이 이용가능해졌다. 쥐 소장 상피의 장기간 확대를 허용하는 2 개의 상이한 프로토콜이 공개되었다. 쿠오(Kuo)와 동료들은 성장 인자 독립적인 방식으로 상피 뿐만 아니라 기질 요소들을 함유하는 작은 단편의 장기간 성장을 입증하였다(문헌[Ootani A et al. Nat Med 2009;15:701-6]). 발명자들은 앞서 정의된 통찰력을 장 상피의 증식 요건에 결합시킴으로써 단일 줄기세포에 대한 배양 시스템을 설계하였다. Wnt 신호전달이 소낭 증식에 중요한 요건이며(문헌[Korinek V et al. Nat Genet 1998;19:379-83]; [Pinto D et al. Genes Dev 2003;17:1709-13]; [Kuhnert F et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:266-71]) 상기 Wnt 작용물질 R-스폰딘1은 생체 내에서 극적인 소낭 이상증식을 유도한다(문헌[Kim KA et al. Science 2005;309:1256-9]). 두 번째, EGF 신호전달은 장 증식과 관련된다(문헌[ (Dignass AU & Sturm A. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001;13:763-70]). 세 번째, 노긴의 트랜스제닉 발현은 소낭 숫자의 확대를 유도한다(문헌[Haramis AP et al. Science 2004;303:1684-6]). 네 번째, 단리된 장 세포는 정상 조직 개념 밖에서 아노이키스를 겪는다(문헌[Hofmann C et al. Gastroenterology 2007;132:587-600]). 라미닌(α1 및 α2)이 소낭 기부에 풍부하므로(문헌[(Sasaki T et al. Exp Cell Res 2002;275:185-]), 발명자들은 장 상피 성장을 지지하도록 라미닌-풍부 매트리젤을 탐구하였다. 매트리젤-기본 배양물이 유방 상피의 성장에 성공적으로 사용되었다(문헌[Stingl J et al. Breast Cancer Res Treat 2001;67:93-109]). 이러한 배양 조건(매트리젤 중의 R-스폰딘1, EGF, 및 노긴) 하에서, 발명자들은 계속 확대되는 소장 오르가노이드를 수득하였으며, 상기 오르가노이드는 구조, 세포 유형 조성 및 자기재생 동역학에 관하여 상기 소장 상피의 모든 특징을 나타내었다.광범위한 노력에도 불구하고, 장기간의 성숙한 인간 장 상피 세포 배양은 여전히 어려운 채로 남아 있다. 약간의 장기간 배양 모델이 있어 왔지만, 상기 기법 및 세포주들은, 어쩌면 생육 가능한 세포의 추출 및 유지에 있어서 내재하는 기술적 어려움의 결과로서, 폭넓은 허용성을 얻지 못하고 있다(문헌[Rogler G et al. Scandinavian journal of gastroenterology 2001;36:389-98]; [Buset M et al. In vitro cellular & developmental biology: journal of the Tissue Culture Association 1987;23:403-12]; [Whitehead RH et al. In vitro cellular & developmental biology: journal of the Tissue Culture Association 1987;23:436-42]; [Deveney CW et al. The Journal of surgical research 1996;64:161-9]; [Pang G et al. Gastroenterology 1996;111:8-18]; [Latella G et al. International journal of colorectal disease 1996;11:76-83]; [Panja A. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 2000;80:1473-5]; [Grossmann J et al. European journal of cell biology 2003;82:262-70]). 쥐 소장 배양물의 확립에 의해 고무되어, 발명자들은 상기 배양 조건을 마우스 및 인간 결장 상피에 적응시키고자 노력하였다. 발명자들은 본 발명에 이르러, 원발성 결장 선종/선암종 및 바렛 식도에 적응시킬 수 있는, 쥐 및 인간 결장 상피에 대한 장기간 배양 프로토콜의 확립을 보고한다.결과
마우스 결장 배양 시스템의 확립
마우스 결장 배양 시스템을 확립시키고자, 발명자들은 우리의 소장 배양 조건(여기에서 ENR: EGF + 노긴 + R스폰딘이라 칭함)을 탐구하였다. 우리의 경험상, 결장 상피의 초기 성장은 종종 상기 ENR 배양 조건 하에서 관찰되지만, 항상 결실이 없다. 오르가노이드 형성을 상기 마우스 결장의 원위 부분으로부터 단리된 상피를 사용하여 연구하였다. ENR 조건 하에서, 단일의 원위 결장 소낭의 도말 효율은 소장의 경우보다 훨씬 더 낮았으며(1-3% 대 >90%), 이들 오르가노이드를 계대배양할 수 없었다. 최근에, 발명자들은 파네쓰 세포가 다수의 Wnt 리간드를 생산하고(문헌[Gregorieff A et al. Gastroenterology 2005;129:626-38]), 이들 파네쓰 세포에 의한 Wnt의 생산이 장 줄기세포의 유지에 필수적임을 입증하였다(문헌[Sato T et al. Nature;469:415-8]). 결장 오르가노이드에서의 상기 Wnt 신호전달 상태를 측정하기 위해서, 발명자들은 액신2-lacZ 마우스(충실한 Wnt 리포터)(문헌[Lustig B et al. Mol Cell Biol 2002;22:1184-93]) 또는 Lgr5-GFP 녹-인 마우스(Lgr5는 Wnt-의존적인 줄기세포 마커이다)(문헌[Barker N et al. Nature 2007;449:1003-7])로부터의 결장 소낭을 배양하였다.
새로 단리된 결장 소낭은 그의 기부에서 액신2-LacZ 또는 Lgr5-GFP를 쉽게 발현하였지만, 배양 초기 직후에 상기 Wnt 리포터의 발현을 상실하였다(도 1a,b 및 도 6). 대조적으로, 소장 오르가노이드는 그의 발아 구조에서 Wnt 리포터를 구성적으로 발현하였다(문헌[Sato T et al. Nature;469:415-8]; [Sato T et al. Nature 2009;459:262-5]). 이러한 발견들은 결장 오르가노이드가 결장 줄기세포를 유지하기에 불충분한 양의 Wnt 리간드를 생산함을 암시하였다. 이를 극복하기 위해서, 발명자들은 재조합 Wnt3a 또는 Wnt3a-처리된 배지를 ENR 배양 배지(WENR 배지)에 가하였다. 이는 10배 정도로 소낭의 도말 효율을 증가시켰다. 결장 소낭은 다수의 액신2-LacZ(도 1a) 또는 Lgr5-GFP+(도 1b) 돌기를 갖는 오르가노이드 구조를 형성하였으며, 이는 Wnt 활성화가 복원되었음을 암시한다. 새로 단리된 결장 소낭은 그의 상부 부분에 충분히 성숙한 세포를 함유하며, 발명자들은 이들 성숙한 세포가 오르가노이드 성장을 방해할 수도 있음을 추론하였다. 발명자들이 결장 소낭을 세포의 작은 덩어리들로 온화하게 절단한 경우, 따라서 분화된 상부 소낭 영역으로부터 증식성 소낭 기부를 물리적으로 분리시킨 경우에, 소낭 상부로부터 유래된 단편들의 대부분은 죽었으나, 결장 소낭 기부로부터의 세포 덩어리들은 오르가노이드를 효율적으로 형성하였다(도 1c).
ENR 조건 하에서 증식된 마우스 장 상피는 줄기세포 자기재생을 동반하는 모든 분화된 상피 세포 유형들을 생성시킨다. 발명자들은 앞서 이들 배양물에 Wnt3A의 첨가가 장 분화를 방해하고 주로 미분화된 선조세포들로 이루어지는 오르가노이드를 제공함을 입증하였다(문헌[Sato T et al. Nature;469:415-8]). 이는 뜻밖에도 상기 미분화된 소낭 선조세포 상태의 유지에 있어서 Wnt 신호전달의 중심 역할을 제공하지 않는다(문헌[van de Wetering M et al. Cell 2002;111:241-50]). 이러한 관찰과 일관되게, WENR 조건에서의 결장 오르가노이드는 적절하게 분화하지 못했다. Wnt-3A의 회수 시, 발명자들은 모든 상피 계통을 따라 분화를 관찰하였다(도 1d-f). 중요하게, 단일의 분류된 Lgr5+ 결장 상피 줄기세포는 처음 이틀 동안 Y-27632의 존재 하에서 배양될 때 오르가노이드를 형성할 수 있다.
인간 결장 배양 시스템의 확립
상기 개선된 마우스 결장 소낭 배양의 성공에 의해 고무되어, 발명자들은 상기 배양 조건을 인간 결장 소낭에 적용하였다. 이들 소낭은 처음에는 생존하였지만, 7일 이내에 대부분 후속으로 붕괴되었다. 인간 결장 소낭의 도말 효율을 증가시키기 위해서, 발명자들은 후보 성장 인자, 호르몬 및 비타민을 선별하였다(도 12의 목록). 이들 중에서, 발명자들은 가스트린 및 니코틴아미드(NAD+의 전구체, 시르투인 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Denu JM. Trends Biochem Sci 2005;30:479-83]))가 배양 효율을 개선시킴을 발견하였다(도 12). 도말 효율에 대한 가스트린의 효과는 중요하지 않았다. 그러나, 상기 호르몬은 장 분화를 방해하지 않았으며 우리는 가스트린(이후에 'g'로 간략히 나타냄)을 모든 인간 장 배양 조건에 포함시킬 것을 결정하였다. 중요하게, 니코틴아미드(10 mM)는 초기 7일 이후의 배양 기간의 연장에 필수적이었다(도 2a). 이러한 배양 조건 하에서, 인간 결장 오르가노이드를 1 개월 이상 확대시킬 수 있었다. 1 개월 이후, 상기 결장 오르가노이드는 그의 형태가 발아 오르가노이드 구조에서 낭성 구조로 변화하였다(도 2b 좌측). 상기 형태적 전환과 일치하게, 증식이 점차적으로 감소하였다. 때때로, 낭성 오르가노이드는 그의 증식 잠재성을 회복하였다. 그러나, 모든 오르가노이드는 결국 3 개월 이내에 증식을 멈추었다. 2-단계 증식 정지가 다른 1차 배양물 시스템, 예를 들어 포유동물 상피 세포 또는 각질세포에서 관찰되었으며, 이를 사망 단계 1(M1; 노쇠) 및 사망 단계 2(M2: 위기)(문헌[Shay et al., 2006])라 칭하였다. 다-계통 분화는 Wnt의 회수 후에조차 상기 조건에서 배양된 인간 장 오르가노이드에서 관찰되지 않았다(데이터 도시 안됨).
발명자들은 노쇠/반복적인 노화의 세포-고유의 성질보다는 부적합한 배양 조건으로 인해 증식 정지가 발생하는 것으로 생각하였다. 따라서 발명자들은 우리의 시도를 상기 배양 조건의 최적화로 연장하였다. 발명자들은 WENR+가스트린+니코틴아미드 배양 조건 하에서 MAP 키나제, 결장암에서 돌연변이된 신호전달 분자, 및 히스톤 변형제(도 12)의 다양한 소분자 조절제들을 선별하였다. 발명자들은 2 개의 소분자 억제제, A83-01(Alk4/7 억제제; nM) 및 SB202190(p38 억제제; 10 uM)이 상기 도말 효율을 현저하게 개선시킴을 발견하였다. 또한 시험되고 A83-01과 동일한 결과를 보인 다른 TGF-베타 수용체 1(ALK5) 억제제는 LY364947, SB431542, SB505124이었다. 다른 ALK 억제제들이 또한 동일한 방식으로 작용할 것으로 예상할 수 있었다. 더욱 또한, 상기 두 화합물의 조합은 상기 배양 기간을 상승작용적으로 연장시켰다. 발명자들은 10 개의 시험 샘플이 모두 매주 1:5 분할로 6 개월 이상 확대됨을 입증하였다. 이러한 배양 조건 하에서, 상기 인간 결장 오르가노이드는 선행의 배양 조건 하에서 나타난 낭성 구조보다는 발아 오르가노이드 구조를 나타내었다(도 2b). 상기 증식하는 세포는 상기 돌기로 국한되었다(도 2c). 3 개월이 더 된 오르가노이드의 중기 확장은 각 세포(3 개의 상이한 공여체로부터 각각 20 개 세포; 도 2d) 중의 46 개 염색체를 일관되게 드러내었다. 발명자들은 2 개월 배양 후 상기 결장 오르가노이드의 전체 엑솜(모든 엑손)을 서열화하였다. 상기 오르가노이드에서 돌연변이의 수는 대단히 낮았다. 실제로 하나의 클론으로부터 기원하는 4 개의 나란한 오르가노이드 배양물에서, 오직 하나의 돌연변이만이 발견되었으며, 이는 모든 배양물 중에 존재하였고 따라서 이는 모 조직으로부터 기원하는 듯하였다.
상기 결과는 Alk 수용체 및 p38 신호전달이 인간 장 상피 세포의 장기간 유지를 음으로 조절함을 암시하였다. 발명자들은 최적화된 배양 조건을 HISC(인간 장 줄기세포 배양) 조건으로서 지칭한다.
인간 장 오르가노이드는 생체 내 분화를 모방한다
상기 HISC 조건 하에서, 발명자들은 분화된 세포를 관찰하지 못했다. 마우스 결장 오르가노이드에서 나타난 바와 같이, 인간 오르가노이드에서 성숙한 장세포 분화에 Wnt의 회수가 요구되었다(도 3a 상부 패널 및 도 7). 그러나, 배상세포 및 장내분비 세포 분화는 여전히 차단된 채로 남아있었다. 우리는 니코틴아미드 및 SB202190이 상기 분화를 강하게 억제하는 반면, 상기 두 시약의 회수는 상기 오르가노이드가 성숙한 배상세포 및 장내분비 세포를 생산할 수 있게 함을 발견하였다(도 3a(중간 및 기부 패널), 3b 및 도 7). Wnt, 니코틴아미드 및 SB202190의 동일한 분화 억제 효과가 인간 소장 오르가노이드에서 관찰되었다. 라이소자임+ 파네쓰 세포가 소장 오르가노이드에서 관찰되었지만, 결장 오르가노이드에서는 관찰되지 않았다(도 3d). p38 억제제 처리가 생체 내에서 배상세포 분화를 억제하고 장 상피 증식을 증가시킴이 보고되었다(문헌[Otsuka M. Gastroenterology 2010;138:1255-65, 1265 e1-9]). 실제로, 발명자들은 p38 억제제 처리된 장 오르가노이드에서 동일한 표현형을 관찰하였다(도 3d 대 e). 발명자들은 노치-억제에 대한 인간 장 오르가노이드의 반응을 추가로 조사하였다. 발명자들은 앞서 γ-세크레타제 억제제(다이벤즈아제핀; DBZ)에 의한 또는 노치 경로 전사 인자 CSL 고갈된 장 졸기세포의 조건부 표적화에 의한 노치 억제가 생체 내에서 장 상피 증식을 종결시키고 배상세포 과형성을 유도함을 입증하였다(문헌[van Es JH et al. Nature 2005;435:959-63]). 실제로, DBZ로 처리 시, 장 오르가노이드는 그의 증식을 멈추었고 대부분의 세포는 3일 이내에 배상 세포로 전환되었다(도 3g 대 f).
APC-결핍 선종 및 결장 선암종의 확립
최근에, 발명자들은 타목시펜-유도된 Cre 활성화 시 Lgr5-GFP-ires-CreERT2 x APCflox/flox 마우스에서 Lgr5 줄기세포로부터의 효율적인 마우스 장 선종 형성을 보고하였다(문헌[Barker N et al. Genes Dev 2008;22:1856-64]). 발명자들은 유도 후 10일째에 장 선종을 단리하고 배양 조건을 최적화하였다. 상기 선종은 발아 없이 낭성 오르가노이드 구조를 효율적으로 형성시켰다. APC 상실은 Wnt 경로를 구성적으로 활성화하기 때문에, 발명자들은 R-스폰딘1이 선종 오르가노이드 성장에 없어도 되게 될 것으로 예상하였다. 이는 실제로 관찰되었다. 더욱 또한, 정상 소장의 장기 배양에 필수적인 노긴은 선종 오르가노이드에 없어도 되었다. 흥미롭게도, 발명자들은 노긴의 회수 후 7일째에 선종 오르가노이드에서 Lgr5-GFP의 상실을 관찰하였으나 액신2-LacZ는 관찰하지 못했다(도 4a,b 및 데이터 도시 안 됨). 유사한 관찰이 ER-배지에서 증식 시 정상적인 장 오르가노이드에 대해 이루어졌다(문헌[Sato T et al. Nature 2009;459:262-5]). 이는 노긴은, 가장 있음직하게는 BMP 신호의 억제를 통해, Lgr5 발현을 유지하는데 요구되지만, 선종 오르가노이드의 확대에는 요구되지 않음을 가리킨다. 소장 소낭으로부터 단리된 새로 단리된 Lgr5hi(그러나 Lgr5low는 아님) 세포는 시험관 내에서 오르가노이드 증식을 개시시킬 수 있다(문헌[Sato T et al. Nature 2009;459:262-5]). 선종 내에서 유사한 Lgr5-체계의 존재를 측정하기 위해서, 발명자들은 EN-배양된 오르가노이드로부터 Lgr5-GFPhi, GFPlow 및 GFP-ve 세포를 단리하고 그들의 오르가노이드 형성 능력을 검사하였다. 7일 배양 후에, Lgr5-GFPhi는 최고의 오르가노이드-형성 효율을 나타내었다. 그러나, GFPlow 또는 GFP-ve 도 또한 상당한 효율로 오르가노이드를 형성하였다(도 4c). 중요하게, 분류된 GFP-ve 선종 세포는 Lgr5-GFPhi 오르가노이드를 생성시킬 수 있었다(도 8).
다수의 결장직장 암 세포주들이 과거 40년에 걸쳐 단리되었다. 전형적으로, 상기와 같은 세포주들은 드믈게 나타나며, 결장 종양의 1차 배양 후 클론 생성은 조직-배양 위기에 들어간다. 현재, 배양 위기 없이 1차 인간 결장암 샘플의 일관된 배양 및 배양-적응된 세포의 결과적인 클론 생성을 허용하는 확고한 배양 시스템은 존재하지 않는다. 다음 단계로서, 발명자들은 장 선종 배양 조건을 인간 결장직장암 샘플에 적용하였다. 예상된 바와 같이, 결장암 세포는 R-스폰딘도 노긴도 요구하지 않았다. EGF는 대부분의 결장암 오르가노이드에서 중요하지 않은 반면, 일부 결장암 오르가노이드는 EGF의 회수 후에 그의 증식을 감속하였다. 마우스 장 선종과 달리, 상기 배양 조건에서 결장직장 암 오르가노이드는 간단한 낭성 구조로서보다는 불규칙한 치밀한 구조로서 성장하였다(도 4d).
발명자들은 선종 및 결장암 오르가노이드의 증식/분화 상태를 검사하였다. 예상된 바와 같이, 세포의 대부분은 Ki67+였다. 장세포 분화에 대한 Wnt의 강한 억제 효과와 일관되게(도 1f 및 도 7), 알칼리성 포스파타제 염색은 상기 두 유형의 오르가노이드 모두에서 관찰되지 않았다(도 9). 대조적으로, 우리는 때때로 선종 오르가노이드 및 일부의 결정 암 오르가노이드에서 PAS+ 배상세포 및 크로모그라닌 A+ 내분비 세포를 관찰하였다(도 9).
인간 화생 바렛 상피의 배양
바렛 식도는 하부 식도의 원주 상피의 존재를 특징으로 하며, 화생의 결과로서 정상 편평상피세포를 대체한다(문헌[Odze RD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2009;6:478-90]). 상기 바렛 식도의 조직학적 특징은 식도 중 장 배상세포의 존재이다. 바렛과 장 상피간의 유사성을 활용하여, 발명자들은 작은 바렛 상피(BE) 생검에 인간 결장 배양 조건을 가하였다. 이러한 배양 조건 하에서, 정상적인 식도 편평상피 세포는 1주일 동안 일시적으로 증식하였으나, 상기 오르가노이드를 계대배양할 수 없었다. 바렛 식도 상피는 HISC 조건 하에서 1 개월까지 유지될 수 있었다(도 5a). 상기 BE 오르가노이드는 노쇠한 인간 결장 오르가노이드의 경우와 구분할 수 없는 낭성 오르가노이드 구조를 형성하였으며 전형적으로는 상기 배양 후 1 개월째에 증식을 멈추었다. 상기 HISC 조건에의 FGF10의 첨가는 상기 BE 오르가노이드가 발아 구조를 형성할 수 있게 하였고 배양 기간을 현저하게 연장시켰다(>3 개월)(도 5b,c). 인간 장 오르가노이드와 대조적으로, BE 오르가노이드는 니코틴아미드 및 SB202190의 회수 후 4일째에 최소 수의 PAS+ 및 뮤신+ 세포를 갖는 Ki67+를 남겼다. 상기 회수 후 4일 동안 γ-세크레타제 억제제 DBZ(10 uM)에 의한 처리는 증식을 차단하고 배상세포 분화를 유도하였다(도 5 d-g). 이는 상기와 같은 억제제의 국소 전달이 분화 요법에 의한 바렛 식도 병변의 제거에 유용한 치료 전략을 나타낼 수 있다는 우리의 선행 제안을 지지하였다(문헌[Menke V et al. Disease models & mechanisms 2010;3:104-10]). 중요하게, 우리는 때때로 라이소자임+ 파네쓰 세포(도 10)를 관찰하였으며, 이는 BE 오르가노이드가 다계통 분화를 보존함을 가리킨다.
논의
본 발명에서 개발된 프로토콜들은 소장, 결장, 선(암)종 및 바렛 식도로부터 단리된 1차 인간 상피 세포의 확고하고 장기적인 배양을 허용한다(표 3).
오르가노이드 배양 시스템의 성분들의 목록
시약명
(Reagent name) 		공급처
(Supplier) 		카탈로그 번호
(Cat No.) 		용매
(Solvent) 		모액
(Stock solution) 		최종 농도
(Final conc.)
매트리젤(Matrigel), GFR, 페놀 없음(phenol free) BD bioscience 356231
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-028
GlutaMAX-I Invitrogen 35050-079 200 mM 2 mM
HEPES 1M Invitrogen 15630-056 10 mM
페니실린(Penicillin)/스트렙토마이신(Streptomycin) Invitrogen 15140-122 10000/10000 U/ml 100/100 U/ml
N2 보충제
(N2 supplement)		 Invitrogen 17502-048 100x 1x
B27 보충제
(B27 supplement)		 Invitrogen 17504-044 50x 1x
N-아세틸시스테인
(N-Acetylcysteine)		 Sigma-Aldrich A9165-5G DW 500 mM=81.5 mg/ml 1 mM
EDTA Sigma-Aldrich 431788-25g DW 500 mM=14.6g/100ml 2 mM
Mouse recombinant noggin Peprotech 250-38 100ug PBS/BSA 100 mg/ml 100ng/ml
mouse recombinant EGF Invitrogen PMG8043 PBS/BSA 500 mg/ml 50 ng/ml
human recombinant R-spondin Nuvelo PBS/BSA 1 mg/ml 1 mg/ml
human recombinant FGF10 Peprotech 100-26 PBS/BSA 100 mg/ml 100 ng/ml
mouse recombinant Wnt-3A Millipore GF-160 PBS 10 mg/ml 100 ng/ml
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 PBS 10 mM=1g/338 ml 10 mM
A-83-01 Tocris 2939 DMSO 500 mM 500 nM
SB202190 Sigma-Aldrich S7067 DMSO 30 mM 10 mM
니코틴아미드
(Nicotinamide)		 Sigma-Aldrich DW 1M 10 mM
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145 PBS/BSA 100 mM 10 nM
DNase Sigma-Aldrich DN25-1g PBS 200000 U/ml 2000 U/ml
TrypLE 발현
(TrypLE express)		 Invitrogen 12605-036
콜라게나제 유형 XI
(Collagenase type XI)		 Sigma-Aldrich C9407
디스파제(Dispase) Invitrogen 17105-041
70 um 셀 스트레이너(70um Cell strainer BD falcon 352350
모든 모액 및 분액된 매트리젤을 -20 ℃에서 보관한다
쥐 소장과 대조적으로, 쥐 결장 상피 세포는 배양 배지에서 Wnt 리간드를 요한다. 발명자들은 앞서 CD24hi 파네쓰 세포가 Wnt-3/11을 생산하며, 이는 소장에서 줄기세포 유지에 필수적임을 보고하였다(문헌[Sato T, et al. Nature 2011;469:415-8]). Wnt-6 및 -9b mRNA는 결장 소낭의 기부에서 발현된다(문헌[Gregorieff A, et al. Gastroenterology 2005;129:626-38]). 결장 소낭 기저 세포에 의한 상기 국소 Wnt 생산이 생체 내에서 표준 Wnt 신호를 활성화하기에 충분한지 또는 결장 점막 중에 Wnt 리간드의 또 다른 공급원이 존재하는지는 결정되지 않은 채로 있다. 인간과 마우스 장 오르가노이드 배양 조간 간의 차이는 뜻밖에도 컸다. A83-01은, 미세배열에 의해 쥐 및 인간 소낭 모두에서 검출되는 수용체인 ALK4/5/7을 억제한다. 발명자들은 현재 ALK 신호가 인간 오르가노이드 성장을 조절하는 기전을 조사하고 있다. 발명자들은 장기간 배양물에서 세포 형질전환을 관찰하지 못했으며 최적화된 배양 조건 하에서 염색체 변화는 명백해지지 않았다. 더욱 또한, 상기 오르가노이드는 다른 성숙한 인간 상피 배양 시스템에 대해 보고된 경우보다 상당히 더 많안 수의 세포 분열을 겪을 수 있다(문헌[(Dey D et al. PloS one 2009;4:e5329]; [Garraway IP et al. The Prostate 2010;70:491-501]). 일반적으로 체세포는 반복적인 노화라 지칭되는 현상인 그의 증식 능력에 있어서 본질적으로 제한되는 것으로 여겨진다(문헌[Walen KH. In vitro cellular & developmental biology. Animal 2004;40:150-8]). 대부분의 정상적인 인간 세포는 상기가 분열하는 회수를 셈하여, 최종적으로 세포 노쇠라 칭하는 성장 정지를 겪는 것으로 여겨진다. 상기 과정은 텔로미어의 단축, 및 DNA 손상 신호(M1), 또는 말단소립 축소(M2)에 의해 촉발될 수 있다. 상기 두 소분자 키나제 억제제 모두의 부재 하에서, 인간 장 오르가노이드는 10 내지 20 집단 배가 후에 성장 정지를 겪었다. 대조적으로, 최적화된 배양 조건에서 반복 가능한 능력은 상기 억제제의 첨가 시 100 집단 배가 이상까지 연장되었으며, 이는 Hayflick 제한을 능가하였다(문헌[Hayflick L. The Journal of investigative dermatology 1979;73:8-14]). 상기 결과는 1차 배양 시스템에서 나타난 노쇠한 표현형이 고유의 반복적인 노화보다는 부적합한 성장 조건을 반영함을 명백히 가리킨다.상기 배양 기법을 사용하여 줄기세포 생물학의 기본적인 태양, 및 노치 억제제 처리 시 줄기세포 및 배상세포 분화의 고갈에 의해 예시되는 분화의 조절을 연구할 수 있다. 더욱이, 상기 오르가노이드 배양 플랫폼을, 상기 오르가노이드가 CaCo2 또는 DLD1과 같은 종종 사용되는 결장암 세포주보다 장 상피를 더 가깝게 나타내므로, 장관의 병리학에 대한 약물학, 독물학 또는 미생물학적 연구에 사용할 수 있다. 마지막으로, 성숙한 공여체로부터 취한 작은 생검을 어떠한 명백한 제한 또는 유전자 손상 없이 확대시킬 수 있으므로, 상기 기술은 재생 목적의 이식 가능한 상피를 생성시키는데 도움이 될 수 있다.실시예 2 - 마우스 췌장 오르가노이드의 배양
TGF-베타 억제제의 사용을 또한 마우스 췌장 오르가노이드에 대한 배양 배지에서 시험하였다. 상기 사용된 확대 배지는 DMEM/F12 배지(P/S, 글루타맥스, 10mM Hepes, B27, N2 및 N-아세틸시스테인), EGF(50ng/㎖), R-스폰딘(10%), 노긴(100 ng/㎖), FGF10(100ng/㎖), A8301(TGF-베타 억제제, 500nM) 및 가스트린(10 μM))이 보충됨)였다. 상기는 Wnt 작용물질(R스폰딘 이외의) 또는 니코틴아미드 및 FGF10이 첨가되지 않은 점에서, 실시예 2에 사용된 상술한 HISC 배양물의 경우와 약간 상이하다. 그러나, 상기 배양 배지는 다수의 핵심 성분(ENR + 가스트린 + TGF-베타 억제제)을 공유하며, 상기 TGF-베타 억제제의 첨가는 상기 두 경우에 모두 유리하다. 이러한 조건에서 증식된 췌장 오르가노이드를 >3개월 동안 확대시키고 5 회 이상 계대배양할 수 있었다.
미세배열 실험을 상술한 확대 배지에서 증식된 췌장 오르가노이드에 대해 수행하였으며 결과를 성숙한 췌장, 성숙한 간 및 신생 간과 비교하였다(도 16A 참조). 상기 췌장 오르가노이드는 상기 간 샘플보다는 성숙한 췌장과 명백히 덩어리를 형성하며, 이는 상기 성숙한 췌장과 양호한 표현형 유사성을 나타낸다.
도 16B는 도관 마커, 내분비 마커 및 Ngn3 발현(Ngn3은 내분비 계통의 명세와 관련된 전사 인자이다)에 필요한 전사 인자에 대한 췌장 오르가노이드, 성숙한 췌장, 성숙한 간 및 간 오르가노이드에서 발현 수준들을 비교하는 미세배열 실험으로부터의 원 신호를 도시한다. 췌장 오르가노이드에서 Krt19, Krt7 및 다른 도관 마커의 높은 발현 수준은 상기 췌장 오르가노이드가 도관 표현형을 명백히 가짐을 나타낸다. 상기 췌장 오르가노이드는 원래 도관 제제로부터 증식되었다. Ngn3 발현에 필수적인 전사 인자(Foxa2, Hnf6, Hnf1b, Sox9)가 또한 모두 췌장 오르가노이드에서 발현되었지만, Ngn3 자체의 발현은 확대 조건 하에서 검출되지 않았다.
인슐린-생산 세포의 생성에 중요한 유전자들의 발현 수준은 낮다. 그러나, 상기 확대 배지에서, 상기 췌장 오르가노이드의 증식 및 발현 패턴은 초기 선조 내분비 세포에서 나타난 것들을 밀접하게 닮음은 분명하다.
상기 췌장은 주로 3 개의 상이한 세포 유형, 즉 샘꽈리 세포, 도관 세포 및 내분비 세포에 의해 형성된다. 성숙한 췌장의 전체 RNA 샘플에서, 상기 RNA의 90%는 샘꽈리 세포로부터 나오며, 따라서 내분비 마커의 발현 수준은 전체 췌장 샘플에서 매우 희석된다. 따라서 각각의 특정한 세포 유형에 대해 추가의 실험들을 계획한다. 예를 들어, 발명자들은 췌장 오르가노이드, 농축된 샘꽈리 세포 제제, 농축된 도관 세포 제제 및 농축된 내분비 세포 제제 간의 미세배열 분석을 수행하여, 인슐린 생산 세포 중에 존재하는 수준에 비해 우리의 췌장 오르가노이드 중의 중요한 유전자들의 mRNA 수준의 보다 양호한 평가를 계획한다. 예를 들어, 농축된 내분비 세포 샘플에서, 상기 세포의 75 내지 85%는 인슐린-분비 세포일 것이다.
실시예 3 - 확대 배지에 대한 노긴의 효과
확대 배지에서 상기 BMP 억제제, 노긴의 역할을 조사하기 위해서, 발명자들은 항상 EGFRA 배지에서 배양되고, 따라서 결코 노긴의 존재 하에서 배양되지 않은 췌장 오르가노이드 중의 초기 내분비 마커 및 도관 마커의 mRNA 수준을 항상 EGFRAN 배지(즉 항상 노긴의 존재 하에서)에서 배양된 오르가노이드 중의 동일 마커의 발현 수준과 비교하였다. 발명자들은 또한 각각 노긴이 첨가되거나 배양물로부터 제거된 췌장 오르가노이드 중의 이들 마커의 mRNA 수준을 비교하였다. 구체적으로, 췌장 오르가노이드의 한 샘플을 EGFRA 배지에서 배양하고 이어서 노긴을 가하고 상기 오르가노이드를 추가로 2 또는 4일 동안 배양하였다. 또 다른 췌장 오르가노이드 샘플을 EGFRAN 배지에서 배양하고 이어서 노긴을 제거하고 상기 오르가노이드를 추가로 2 또는 4일 동안 배양하였다. 상기 유전자 발현을 비교하고 결과를 도 17A에 도시한다. 노긴은 케라틴 7 및 케라틴 19(도관 마커들)의 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 노긴이 도관 표현형에 대한 분화를 차단함을 보인다(백색 및 짙은 회색 샘플 중의 케라틴 수준은 흑색 샘플 중에서의 경우보다 낮다). 인슐린 생산 세포의 생성에 필수적인 일부 전사 인자들(즉 . Sox9, Hnf6, Hnf1a, Pdx1, Nkx2.2, Nkx6.1 및 Hnf1b)의 발현 수준은 노긴에 의해 영향을 받지 않았다. 노긴은 상기 배양물이 모든 도관 표현형을 획득하는 것을 방지하지만(이는 인슐린 생산 세포로의 차후의 분화를 방지하는 듯하다), 발명자들은 상기가 인슐린 생산 전구체 세포의 특징과 함께 일부 도관 특징을 유지하면서 상기 세포가 확대되게 하므로 상기 확대 배지에 노긴을 포함시킨다.
Lgr5 유전자 발현에 대한 노긴의 존재 또는 부재, 또는 EGFRA 배지에 대한 그의 첨가 또는 회수의 효과를 췌장 도관으로부터 수득한 췌장 오르가노이드를 사용하여 평가하였다. 도 17B의 결과는 노긴과 함께 배양된 췌장 오르가노이드가 노긴 없이 배양된 췌장 오르가노이드보다 Lgr5를 2 배 이상 발현함을 보인다(좌측으로부터 두 번째 백색 막대를 좌측의 흑색 막대와 비교한다). 노긴의 첨가(짙은 회색) 또는 회수(밝은 회색)가 또한 Lgr5 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 노긴의 존재 하에서 Lgr5 유전자 발현의 증가가 Lgr5+ 세포의 증가된 수에 기인하는지 또는 세포당 Lgr5 발현의 증가된 수준에 기인하는 지는 불명확하다. 그러나, 본 발명자들은 여기에서 BMP 억제제, 예를 들어 노긴이 Lgr5의 발현을 촉진하며 따라서 보다 증식성인 오르가노이드를 생성시킴을 보인다. 따라서, BMP 억제제는 상기 확대 배지의 유리한 성분임이 입증된다.
이는, 상기 문헌에서 BMP 억제제가 췌장 세포의 분화 배양에 유용한 것으로 개시되어 있기 때문에 놀라운 것이다. 상기 결론은 BMP 신호전달이 도관(케라틴 7 및 케라틴 19 발현 참조) 및 내분비 세포 모두의 분화에 요구된다는 관찰을 기본으로 한다. 따라서, 숙련가는 BMP 억제제, 예를 들어 노긴의 포함이 확대 배지에서 불리한 것으로 예상할 것이다. 그러나, 발명자들은 놀랍게도 BMP 억제제의 사용이 Lgr5의 보다 증식성인 오르가노이드 및 보다 높은 발현을 생성시키므로 유리함을 발견하였다.
실시예 4 - 마우스에서 신장 피막 아래에 인간 췌장 오르가노이드의 이식
실시예 1에 개시된 프로토콜을 사용하여 확대시킨 췌장 오르가노이드(도 18A 참조)를 면역결핍 마우스의 신장 피막 아래에 이식하였다.
이식 직전에, 오르가노이드를 세포 회수 용액(BD#354253, BD Biosciences)으로 처리하여 매트리젤 잔사를 제거하였다. 오르가노이드를 PBS로 수회 세척하고 펠릿화하였다.
면역결핍 수용자의 신장 피막 아래에 상기 오르가노이드의 이식을 신장 피막 아래에 섬 이식에 대해 NIH 권장된 과정을 사용하여 수행하였다(문헌[("Purified Human Pancreatic Islets, In Vivo Islets Function", Document No. 3104, A04, Effective Date 7th July 2008, DAIT, NIAID, NIH]). 상기 이식 일주일 전에, 상기 수용 마우스(NOD/SCID/IL2RgammaKO a.k.a. NSG)에서 고용량 130 ㎎/㎏ 스트렙토조토신 주사에 의해 고혈당증을 화학적으로 유발시켰다. 혈당 수준을 모니터하고 18 mmol/l 이상의 혈당을 갖는 마우스를 고혈당성으로 간주하였다.
이식을 위해서, 상기 고혈당성 수용자를 마취시키고 좌측 옆구리를 작게 절개하여 좌측 신장을 노출시켰다. 대략 2.5 내지 3.0 ㎣의 오르가노이드를 실리콘 처리된 PE50 이식 튜브에 수거하고 해밀톤 주사기를 사용하여 신장 피막 아래에 이식하였다. 상기 손상된 피막을 소작한 후에, 신장을 다시 복강 내에 넣었다. 이어서 복막과 피부를 5-0 견사로 봉합하였다.
한 마리의 마우스를 이식-후 3 시간째에 죽이고 이식편을 성숙한 베타 세포 및 선조 마커에 대해 분석하였다. 상기 마우스에서, 인슐린-생산 세포는 쥐 신장-주변 피막에서 볼 수 없었다(도 18B).
추가의 마우스를 밀착 관리 하에 열 패드가 있는 우리에서 회복되게 하였다. 상기 이식된 마우스의 체중 및 혈당 수준을 1 개월 동안 모니터하였다. 1 개월 후에 상기 마우스를 죽이고 이식편을 성숙한 베타 세포 및 선조 마커에 대해 분석하였다.
이식 후 1 개월째에, 다수의 인슐린 생산 세포를 동정할 수 있었다. 이들 인슐린 생산 세포는 모두 도 18C의 염색된 세포들이며, 명확성의 증대를 위해서 선택된 것을 동그라미하였다. 특히, 인슐린 양성 세포는 도관 내층으로부터 존재한 반면, 초기 조직표본에서는 보이지 않았다.
상기 인슐린 생산 세포가 이식 후 1 개월째에는 존재하지만 이식 후 3 시간째에는 존재하지 않는다는 발견은 상기 인슐린 생산 세포가 주로 또는 단지 이식 후에만 발생함을 입증한다.
이들 데이터는 본 발명의 배지 및 방법에 의해 배양된, 본 발명의 췌장 오르가노이드로부터 취한 세포를 마우스에 이식할 수 있고 상기 세포는 상기 췌장에서 인슐린 생산 세포의 성장을 촉진할 수 있음을 보인다. 놀랍게도, 인간 췌장 오르가노이드를 이식할 수 있었다. 이는 이식된 오르가노이드 세포의 사용이, 예를 들어 당뇨병의 치료를 위해 인슐린 생산을 촉진한다는 다수의 흥분되는 가능성을 연다.
실시예 5 - TGF-베타 억제제를 포함하는 간 오르가노이드 배양물
ER 또는 ENRW 조건 하에서 간 오르가노이드 배양물은 자기 재생하며 1년까지 매주 기준으로 유지되고 확대될 수 있다(도 20A). 1 년 후 핵형 분석은 염색체 이상의 증거를 보이지 않는다. 상기 분석된 세포의 66% 초과가 정상 염색체 수를 나타내었고 이들 중 13%는 또한, 간세포의 특징적인 특성인 배수성을 보였다(도 20B).
FGF10(100 ng/㎖), HGF(25-50 ng/㎖) 및 니코틴아미드(1-10 mM)이 보충된 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(1 ug/㎖)의 조합이 상기 배양물의 장기간 유지에 바람직하였다. 이러한 조건 하에서, 우리는 담관 및 일부 간모세포 또는 미성숙-간세포 마커(Glul, 알부민)를 발현하는 오래사는 세포 배양물을 수득하였다. 그러나, 이들 간세포 마커에 양성인 세포의 수는 매우 낮았다. 이러한 배양 조건 하에서, 성숙한 간세포 마커(예를 들어 p450 시토크롬)는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 여기에 개시된 배양 조건이 보다 낮은 수에도 불구하고 간세포 유사 세포를 생성시킬 수 있는 간 선조세포의 확대를 촉진하지만, 완전히 성숙한 간세포는 생성시킬 수 없음을 암시한다(도 21A).
시험관 내에서 상기 배양물의 간세포 성질을 증대시키고 성숙한 간세포를 수득하기 위해서, 우리는 먼저 EGF 및 R스폰딘1에 첨가된 상기 3 개의 보충 인자(FGF10, HGF 및 니코틴아미드)가 상기 간세포 발현뿐만 아니라 상기 배양물의 자기 재생에 대해 양으로 또는 음으로 영향을 발휘하고 있는지의 여부를 측정하였다. 우리는 간 오르가노이드 배양물을 생성시키고 이를 EGF 또는 EGF 및 R스폰딘1 + FGF10 또는 HGF 또는 니코틴아미드 또는 이들의 조합과 함께 배양하였으며, 우리는 상기 배양물을 총 10 주의 기간 동안 1주일에 한 번 분할하였다. 매 시점에서 우리는 또한 다수의 성숙한 간세포 마커(FAH, CYP3A11) 및 간모세포 마커(알부민)의 발현을 분석하였다(도 21B).
FGF10과 결합된 R스폰딘1 및 니코틴아미드가 상기 간 배양물의 증식 및 자기재생에 필수적임을 관찰하였다(도 21C&D). R스폰딘1 및 니코틴아미드는 모두 상기 성숙한 마커 CYP3A11의 발현을 억제하지만 상기 간모세포 마커 알부민의 발현은 촉진한다. 단지 EGF만 함유하는(R스폰딘1 부재 및 니코틴아미드 부재) 배지에 EGF10 또는 HGF의 첨가는, 매우 낮은 수준이기는 하지만, 상기 성숙한 마커 CYP3A11의 발현을 촉진하였다(도 21E). 간세포 분화를 촉진할 수도 있는 추가적인 화합물들을 확인하기 위해서, 우리는 2 개의 상이한 접근법을 사용하였으며, 상기 둘은 모두 EGF+HGF 및/또는 FGF10의 기본 조건을 기본으로 하였다.
상기 첫 번째 접근법은 상기 EGF+FGF10 또는 HGF 조건 외에 일련의 화합물들을 시험함을 수반하였다. 상기 화합물들의 완전한 목록을 표 4에 나타낸다.
화합물
(Compounds) 		신호
(Signal) 		농도
(Concentration) 		결과
(Result)




Alb CYP3
AII
엑센딘4
(Exendin4)		 글루카곤 유사 펩타이드 2 유사체(Glucagon like peptide 2 analog) Sigma E7144 0.1-1uM
레티노산
(Retinoic Acid)		 RAR-RXR 수용체 리간드(RAR-RXR receptor ligand) Sigma 25nM
레티노산+엑센딘4
(Retinoic Acid + Exendin 4)
소닉 헤지호그
(Sonic Hedgehog)		 Invitrogen C25II 500-100ng/ml
BMP4 BMP 신호전달
(BMP signaling)		 Peprotech 120-05 20ng/ml
DAPT 감마-세크레타제 억제제
(Gamma-secretase inhibitor)		 Sigma D5942 10 nM
A8301 Alk5/4/7 억제제(Alk5/4/7 inhibitor) Tocris Bioscience 2939 50 nM
DAPT + A8301 +++ +++
FGF4 FGFR1,2 리간드(FGFR1,2 ligand) Peprotech 50ng/ml
FGF1 FGFR1,2,3,4 리간드(FGFR1,2,3,4 ligand) Peprotech 450-33A 100ng/ml
덱사메타손
(Dexamethasone)		 Sigma D4902 25MG 10
온코스타틴 M
(Oncostatin M, OSM)		 R&D systems 495-MO-025 10-1000 ng/ml
FGF4+OSM+Dexa
IGF peprotech 100ng/ml
발프로산
(Valproic acid)		 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 ERK, PKC wnt/β-카테닌 경로의 조절제(histone deacetylase inhibitor and regulator of ERK, PKC wnt/β-catenin pathways) Stemgent 04-0007 250
나트륨 부티레이트
(Sodium Butyrate)		 히스톤 데아세틸라제 억제제(histone deacetylase inhibitor) Stemgent 04-0005 250
BIX01294 G9a HMTase 억제제
(G9a HMTase inhibitor)		 Stemgent 04-0002 1
RG 108 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제(DNA methyltransferase inhibitor) Stemgent 04-0001 1
TSA 100 nM + -
하이드로코르티손
(Hydrocortisone)		 글루코코르티코이드(glucocorticoid) Sigma H6909 5nM
온코스타틴 M
(Oncostatin M, OSM)		 R&D systems 495-MO-025 10-1000 ng/ml
ARA Sigma A 0937 500 nM
R 59022 다이아실글리세롤 키나제 억제제(Diacylglycerol kinase inhibitor) Sigma D 5919 500nM-50nM + +
아테레놀 바이트라터(Arterenol bitrartre): ---- 아드레날린 수용체 작용물질(andrenoreceptor agonist) sigma
A 0937 		500nM-50nM-5nM
LIF 103
PD 035901 MEK1 억제제
(MEK1 inhibitor)		 Axon Medchem cat n 1386 500nM
CHIR99021 GSK3 억제제
(GSK3 inhibitor)		 Axon Medchem cat n 1408 3uM
DMSO 1%
L-아스코르브산(L-Ascobic acid) Sigma 077K13021 1mM
VEGF Peprotech
매트리젤(Matrigel) 50%
매트리젤(Matrigel) 20%
VEGF+DEXA
두 번째 접근법은 생체 내 담즙 및 간세포 분화를 성취하는데 필수적인 전사 인자의 발현에 관한 공개된 개발 연구로부터의 지식을 고려하였다. FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된 E 또는 ER 또는 ENRW 조건 하에서 상기 오르가노이드에서 전사 인자의 발현의 비교 분석을 도 21에 나타낸다. tbx3 및 prox1을 제외하고 간세포 명세에 필요한 모든 전사 인자들이 제공되었다. 그러나, 우리는 또한 특정한 담즙 전사 인자의 발현이 R스폰딘1(R)을 함유하는 배양물에서 고도로 상향조절되며, 이는 상기 배양 유전자 발현이 보다 많은 담즙 세포 운명쪽으로 불균형하게 됨에 주목하였다.노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 생체 내에서 담즙 세포 운명에 연루되었다. 실제로, Rbpj(활성 노치 신호전달을 성취하는데 필수적임)의 결실은 비정상적인 관형성을 생성시키고(문헌[Zong Y. Development 2009]) 간 외식체에의 TGFb의 첨가는 시험관 내에서 담즙 분화를 촉진한다(문헌[Clotman F. Genes and Development 2005]). 노치 및 TGFb 신호전달 경로는 모두 간 배양물에서 고도로 상향조절되었기 때문에(도 22), 우리는 담관 세포 운명의 억제가 상기 세포의 분화를 보다 간세포 표현형쪽으로 촉발할 수도 있음을 추론하였다. A8301이 TGFb 수용체 ALK5, 4 및 7의 억제제로서, DAPT가, 상기 노치 경로의 활성화에 필수적인 활성 프로테아제인 감마 세크레타제의 억제제로서 선택되었다. 우리는 먼저 확대 배지(ER 배지)에서 2일 동안 상기 세포를 배양하였고 2일째(도 23A)에 우리는 상이한 화합물들의 조합을 가함으로써 상기 분화 조건을 시작하였다. 배지를 이틀마다 교환하였으며, 분화된 마커의 발현을 8-9일 후에 분석하였다. 상기 ER 및 ENRW 조건을 음성 대조군으로서 사용하였다.EGF+FGF10과 DAPT 및 A8301과의 조합은 놀랍게도 상기 분석된 간세포 마커(CYP3A11, TAT, 알부민)의 발현의 큰 증대를 생성시켰다(도 23B). 상기 효과는 5일째에 이미 검출될 수 있었고 8-9일째에 피크였다(도 23C). 최대 농도 효율은 각각 10 uM(DAPT) 및 50 nM(A8301)(도 23D)에서 성취되었다. 덱사메타손(공지된 간세포 분화 분자)의 첨가는 유전자 발현의 어떠한 개선도 생성시키지 못했다. EGF, FGF10, A8301 및 DAPT의 조합은, 간세포 마커 알부민 및 2F8에 대한 면역형광 및 AlbCreLacZ 유도된 오르가노이드상에서의 Xgal 염색에 의해 평가된 바와 같이, 상기 발현을 증대시킬 뿐만 아니라 간세포-유사 분자들의 수를 증가시킨다(도 23E & F). 따라서, 우리는 상기 언급된 분화 프로토콜이 간 줄기세포 배양물로부터 시험관 내에서 간세포 유사 세포의 발생을 촉진한다는 결론을 내릴 수 있다.
방법
시약
배양 실험에 사용된 시약들을 표 4에 나타낸다.
*
*마우스 MiceLgr5-EGFP-ires-creERT2 마우스(문헌[Barker N et al. Nature 2007;449:1003-7]), APCfl/fl(문헌[Sansom OJ et al. Genes Dev 2004;18:1385-90]), 액신2-lacZ 마우스(문헌[Lustig B et al. Mol Cell Biol 2002;22:1184-93]), C57B/6 야생형 마우스(6 내지 12주된 것)를 앞서 개시된 바와 같이 유전자 분류하고 실험들에 사용하였다. Lgr5-EGFP-ires-creERT2 마우스를 APCfl/fl 마우스와 교배하였다. Cre 효소 활성을 타목시펜(2 ㎎/마우스)의 복강 내 주사에 의해 유도하였다. 상기 마우스를 타목시펜 유도 후 4 주째에 안락사시켰다. 쥐 소장 및 결장을 종방향으로 열고, 저온 PBS로 세척하고 소낭 단리를 위해 추가로 처리하였다. 장 선종을 함유하는 영역들을 입체 현미경을 사용하여 확인하고, 외과용 메스로 잘라내어 저온 PBS로 세척하였다.
인간 조직 물질
외과적으로 절제된 장 조직을 위트레흐트 다이아코네센(Diaconessen) 병원 또는 UMCH 병원의 환자 30 명으로부터 수득하였다.
환자 물질을 20 명의 결장암 환자(9 맹장-상행 결장, 7 s자 결장, 4 직장; 33-86 세된), 5 명의 선별 대장내시경 환자(33-63 세된) 및 5 명의 바렛 식도 환자(45-78 세된)로부터 수집하였다. 정상 조직의 경우 상기 종양에 대해 3 ㎝ 초과의 거리를 유지하였다. 상기 소장 조직을 세척하고 하부 근육층을 스트리핑하였다. 상기 조직을 대략 5 ㎜ 조각으로 다지고, 저온 PBS로 추가 세척하였다. 상기 UMCM 병원으로부터 내시경 생검(장 또는 식도)을 수득하였다. 각각의 경우에 대해, 5 개 이상의 생검 샘플을 수집하고 저온 PBS에서 보관하였다. 상기 연구는 DHU 및 UMCU의 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 모든 샘플을 사전동의 하에 수득하였다.
소낭/선종 단리 및 세포 해리
장 단편(쥐 정상 결장, 인간 정상 소장 및 결장)을 상등액이 등명해질 때까지 저온 PBS로 추가 세척하였다. 이어서, 상기 조직 단편을 얼음 상에서 2 mM EDTA 저온 킬레이트화 완충제(5.6 mM Na2HPO4, 8.0 mM KH2PO4, 96.2 mM NaCL, 1.6 mM KCl, 43.4 mM 슈크로스, 54.9 mM D-솔비톨, 0.5 mM DL-다이티오트레이톨을 갖는 증류수) 중에서 30 분간 배양하였다(문헌[Gregorieff A Gastroenterology 2005(129)626-638]). 상기 EDTA 완충제의 제거 후에, 조직 단편을 10-㎖ 피펫을 사용하여 저온 킬레이트화 완충제 중에 격렬히 재현탁시켜 장 소낭을 단리하였다. 상기 조직 단편을 정상 중력 하에서 1 분간 침전되게 하고 상등액을 도립현미경에 의해 검사용으로 회수하였다. 상기 재현탁/침전 과정은 전형적으로는 6 내지 8 회였으며, 소낭을 함유하지 않는 상등액은 버렸다. 소낭을 함유하는 상등액은 소 혈청 알부민으로 코팅된 50 ㎖-팔콘 튜브에 수집하였다. 단리된 소낭을 펠릿화하고, 저온 킬레이트화 완충제로 세척하고 150 내지 200 g에서 3 분간 원심분리하여 단일 세포로부터 소낭을 분리시켰다.
쥐 결장 소낭을 펠릿화하고 TrypLE 익스프레스(Invitrogen)로 재현탁시키고 37 ℃에서 15 분간 배양하였다. 상기 해리 조건에서, 결장 소낭을 온화하게 절단하고, 이에 의해 상기 결장 소낭의 상부로부터 결장 소낭 기부를 물리적으로 분리시켰다. 타목시펜-유도된 Lgr5-EGFPires-creERT2/APCfl/fl 마우스로부터의 선종을 함유하는 장 단편을 얼음 상에서 2 mM EDTA 킬레이트화 완충제 중에서 60 분 동안 배양하였다. 저온 킬레이트화 완충제로 세척한 다음에, 상기 정상 장 상피 세포의 대부분이 탈착되는 반면, 선종 세포는 간엽에 부착된 채로 있었다. 이어서, 상기 선종 단편을 37 ℃에서 30 분간 절단 완충제(2.5% 소 태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen), 75 U/㎖ 콜라게나제 유형 IX(Sigma), 125 □g/㎖ 디스파제 유형 II (Invitrogen)) 중에서 배양하였다. 상기 선종 단편을 정상 중력 하에서 1 분간 침전되게 하고 상등액을 50 ㎖-팔콘 튜브에 수집하고, 펠릿화하고, PBS로 세척하였다. 단리된 선종 세포를 150 내지 200 g에서 3 분간 원심분리하여 단일 세포로부터 선종을 분리시켰다.
5 ㎜ 조각으로 다진, 바렛 식도 및 인간 결장암 샘플로부터의 생검 샘플을 PBS로 수회 세척하였다. 상기 조직 단편을 37 ℃에서 60 분간 절단 완충제 중에서 배양하였다. 상기 절단 후에, 조직 단편을 현미경 하에서 손으로 골라냈다.
분류 실험을 위해서, 단리된 소낭을 37 ℃에서 60 분간 2,000 U/㎖ DNase(Sigma)를 포함하는 TrypLE 익스프레스(Invitrogen)로 해리시켰다. 해리된 세포를 20-㎛ 셀 스트레이너(CellTrics)에 통과시키고 PBS로 세척하였다. 생육 가능한 상피 단일 세포를 전방 산란, 측방 산란 및 펄스-폭, 및 프로피디움 요오다이드 또는 7-ADD(eBioscience)에 대한 음성 염색에 의해 분류하였다.
장 소낭, 선종, 바렛 식도 및 결장암의 배양물
단리된 장 소낭, 바렛 식도 및 결장암 세포를 혈구 계산기를 사용하여 세었다. 소낭, 상피의 단편 또는 단일 세포를 얼음 상에서 매트리젤 중에 매몰하고(성장 인자 감소됨, 페놀 레드-부재; BD bioscience) 48-웰 플레이트에 시딩하였다(500 소낭/단편 또는 1000 단일 세포/25 ㎕의 매트리젤/웰). 상기 매트리젤을 37 ℃에서 10 분간 중합시키고, 하기의 최적화된 성장 인자 조합들을 함유하는 250 ㎕/웰 기본 배양 배지(페니실린/스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 글루타맥스, 1xN2, 1xB27(모두 Invitrogen으로부터) 및 1 mM N-아세틸시스테인(Sigma)이 보충된 어드밴스드 DMEM/F12)를 입혔다: 쥐 장 선종용 쥐 EGF, 쥐 소장 소낭용 ENR(쥐 EGF, 쥐 노긴, 인간 R-스폰딘-1), 쥐 결장 소낭용 WENR(재조합 인간 Wnt-3A 또는 Wnt-3A 처리된 배지+ENR), 인간 소장/결장 소낭용 HISC(인간 장 줄기세포: WENR+가스트린+니코틴아미드+A83-01+SB202190), 바렛 식도용 HISC+인간 FGF10. 결장암 세포는 이종 양상을 보이며 성장 인자, 쥐 EGF 및/또는 A83-01 및/또는 SB202190의 첨가를 필요로 하지 않는다. 세포 분류 실험을 위해서, Y-27632(10 μM; Sigma)를 처음 2일간 상기 배지에 포함시켜 아노이키스를 피하였다. 시약 및 각 성장 인자의 농도를 도 12에 나타낸다. 각 기관에 대한 성장 인자와 소분자 억제제의 최적화된 조합의 개요를 도 12에 제공한다.
상 분석
오르가노이드들의 상을 레이카(Leica) SP5, 도립현미경(Nikon DM-IL)에 의한 공초점 현미경 검사 또는 입체현미경(Leica, MZ16-FA)에 의해 촬영하였다. 면역조직화학을 위해서, 샘플을 실온에서 1 시간 동안 4% 폼알데하이드(PFA)로 고정시키고, 파라핀 섹션을 표준 기법으로 처리하였다. 면역조직화학을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다. 홀-마운트 면역염색을 위해서, 소낭 오르가노이드를 회수 용액(BD bioscience)을 사용하여 매트리젤로부터 단리하고, 4% PFA로 고정시킨 다음 0.1% 트리톤 X-100을 침투시켰다. 1차 항체는 마우스 항-Ki67(1:250, Monosan), 토끼 항-Muc2(1:100, Santa Cruz), 토끼 항-라이소자임(1:1,000, Dako), 토끼 항-시냅토피신(1:100, Dako) 및 항-크로모그라닌 A(1:100, Santa Cruz)이었다. 2차 항체는 퍼옥시다제-접합 하체 또는 알렉사(Alexa)-568-접합 항체였다. 제조자의 프로토콜(Click-IT; Invitrogen)에 따라 EdU 염색하였다. DNA를 DAPI(Molecular Probes)로 염색하였다. 3-차원 상을 공초점 현미경검사에 의해 획득하고 볼로시티 소프트웨어(Volocity Software)(Improvision)로 재구성하였다.
미세배열 분석 및 실시간 PCR 분석
데이터는 수납 번호 GSE28907 하에서 GEO 데이터베이스에 기탁되었다.
실시예 6 - 프로스타글란딘-2 또는 아라키돈산을 포함하는 간 오르가노이드 배양물
간 오르가노이드의 시험관 내 생존, 성장 및 확대는 기본 배지에 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또는 아라키돈산(AA)의 첨가에 의해 효능 있게 증대되었다. 도 25 및 26은 50 nM의 PGE2의 첨가(또한 10-500 nM의 범위에서 작용하는 것으로 나타남) 또는 10 ug/㎖의 AA의 첨가(또한 100 ug/㎖에서 작용함, 그다지 잘은 아니지만)가 상기 기본 배지만을 사용하는 경우보다 더 큰 수의 더 큰 오르가노이드를 생성시킴을 보인다. 중요하게, PGE2 또는 AA의 첨가는 보다 긴 확대 시간을 허용한다. 이는 오르가노이드를, 성장이 감소하거나 느려지기 전에 보다 많은 집단 배가를 위해 확대시킬 수 있음을 의미한다. PGE2 없이 성장 감소는 주당 5 배 확대 시 5 주의 배양 후에 나타난다. PGE2의 존재 하에서는 주당 5 배의 확대 시 8 주 이상 전에 성장 감소는 없다. PGE2는 AA보다 약간 더 큰 효과를 갖는 것으로 보였다. 사용된 기본 배지는 hEGF (100ng/㎖, Invitrogen); 인간 노긴 (hnoggin) (25ng/㎖, peprotech); 가스트린 (10nM, sigma); hFGF10 (peprotech); 니코틴아미드 (10mM, sigma); A8301 (500nM, Tocris); hHGF (50ng/㎖, peprotech); Rspo 처리된 배지(10%)였다.
PGE2 및 AA는 모두 인지질, 프로스타글란딘 G2(PGG2), 프로스타글란딘 F2(PGF2), 프로스타글란딘 H2(PGH2), 프로스타글란딘 D2(PGD2)와 함께 동일한 프로스타글란딘 신호전달 경로 중에 있다(도 24 참조). 상기 경로의 임의의 다른 활성화 성분의 첨가는 상기 배양 배지에 동일한 이로운 효과를 가질 것으로 예상될 수 있다. PGE2 또는 AA의 첨가가 확대 배양 배지에 특히 이롭다. 그러나, 상기를 일부의 상황에서 분화 배지에 또한 포함시킬 수도 있다.
실시예 7 - GSK3 억제제는 배양 배지 중의 유효한 Wnt 작용물질이다.
CHIR99021, GSK3 억제제는 상기 배양 배지에 유효한 Wnt 작용물질인 것으로 나타났다. 특히, 결장 및 간 오르가노이드용 배양 배지에서 Wnt에 적합한 대체물인 것으로 나타났다.
더욱 또한, 실시예 6에 대한 연장으로서, 도 25는 CHIR99021(Wnt 작용물질) 및 PGE2 모두의 존재 하에서 증식된 인간 간 세포가 상기 Wnt 작용물질 또는 PGE2 단독과 함께 증식된 세포보다 더 많고 더 큰 오르가노이드를 생성시키며 오직 기본 배지만의 경우보다는 확실히 더 많고/큰 오르가노이드를 생성시킴을 보인다.
따라서, GSK3 억제제를 다른 Wnt 작용물질, 예를 들어, Wnt 또는 R스폰딘1-4 대신에 또는 상기 외에 상기 배양 배지에 사용할 수 있었다.
GSK3이 Wnt 경로뿐만 아니라 다수의 상이한 경로에도 관여하므로 CHIR99021이 상기와 같은 유효한 Wnt 대체물임은 놀라운 것이다. 이러한 발견은 배양 배지에 유용할 수도 있는 GSK3을 표적화하는 다른 Wnt 작용물질을 설계할 가능성을 연다.
실시예 8 - 전립선
전립선 상피의 단리(쥐 프로토콜)
번호를 매긴 단계들은 도 47에 상응한다.
i) 최소 8 주된 수컷 마우스를 죽여 성숙한 전립선을 단리하고; 상기 마우스로부터 비뇨생식 동을 단리한다.
ii) 혈관 및 결합 조직을 파괴/절단하고 요도의 기부를 절개하여 정낭을 제거한다.
iii) 상기 요도의 기부 부근에서 방광을 파괴/절단하여 제거한다.
iv) 부드럽게 잡아당기고 절단하여 남아있는 소낭 & 지방 조직을 제거한다. 놔두어야 할 것은 전립선 엽(이중 6 개)과 가운데 분홍색 구조(상기는 요도이다)이다.
v) 상기 분홍색(사진에서는 어둡게 염색됨)에 의해 쉽게 인지되는 요도를 제거한다. 전립선 엽을 조심스럽게 잡아 당기며, 따라서 상기는 더 이상 상기 요도에 부착되어 있지 않고; 각 엽을 개별적으로, 단지 서로로부터 잡아당김으로써 단리하거나, 또는 전체 전립선를 존속시킨다.
이어서, 상기 전립선(엽)을 작은 조각들로 다지고; 상기 전립선을 37 ℃에서 1시간 반 동안 1 ㎖의 10 ㎎/㎖ 콜라게나제 II(ADMEM/F12에 용해됨) 중에서 절단시키고; 콜라게나제 절단 후 오직 상피 세포의 "손가락같은" 구조만이 남아 있을 것이다.
- ADMEM/F12에서 세척한다
- 큰 덩어리를 침전하게 두고 상등액을 제거한다(저속 원심분리는 중간엽을 제거한다)
- 50xG 5 분 4 ℃에서 원심분리시킨다
- 1 ㎖ 트립신(TLE)에 재현탁시키고 37 ℃에서 대략 30 분 동안 절단한다. 매 10 분마다 위아래로 피펫팅하여 확실히 절단시킨다
- ADMEM/F12에서 세척한다
- ENR 또는 ENR+1nM 다이하이드로 테스토스테론 중에서 배양을 시작한다(대략 5000 세포/웰로 시딩한다)(0.1 nM 내지 10 uM) 상한은 알지 못한다
- 또는 FACS를 통해 특정한 세포유형의 단리를 계속한다
결과
상술한 방법에 따라, ENR+다이하이드로 테스토스테론 중에서 배양시킨 전립선 상피 세포를 지금까지는 35 주 동안 유지시킬 수 있다. 테스토스테론의 존재 하에서, 상기 배양물은 테스토스테론 부재 하에서와 동일하게 확대된다. 그러나, 테스토스테론의 존재 하에서, 줄기세포, 변화 번식 세포 및 분화된 세포를 포함하여 모든 세포 유형이 존재한다, 즉 줄기세포 집단을 유지하면서 분화가 증가된다. 테스토스테론의 존재 하에서 증식된 전립선 오르가노이드는 보다 더 생체 내 기관처럼 보인다(도 41 및 42 참조). 더욱 또한, IHC 및 RT-PCR은 테스토스테론의 존재 하에서 증식된 전립선 오르가노이드가 기저 세포 및 관강 세포를 모두 함유함을 보인다.
본 발명은 또한 하기의 번호의 실시태양들을 제공한다:
1. 줄기세포 집단을 확대시키기 위한 배양 배지로, 상기 배양 배지는 TGFβ 수용체 키나제 1, ALK4, ALK5, ALK7, p38을 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세린/쓰레오닌 단백질 키나제 표적에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 하나 이상의 억제제를 포함하며, 상기 배양 배지는 3 개월 이상 동안 연속적인 성장을 허용한다.
2. 실시태양 1에 따른 배양 배지에 있어서, 상기 하나 이상의 억제제는
a) ALK5에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제; 및
b) p38에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 억제제를 포함한다.
3. 실시태양 1 또는 실시태양 2의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 세포 분석에 의해 평가 시, 그의 표적에 결합하고 상기 표적의 활성을 95%를 초과하여 감소시키는 작용제이다.
4. 실시태양 1 내지 실시태양 3 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 100 nM 미만의 IC50 값을 갖는다.
5. 실시태양 1 내지 실시태양 4 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 경쟁적으로; 비-경쟁적으로; 경쟁 없이; 또는 혼합된 억제에 의해 작용한다.
6. 실시태양 1 내지 실시태양 5 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 상기 세린-쓰레오닌 단백질 키나제 표적의 ATP-결합 포켓과 경쟁적으로 작용하고 이에 결합한다.
7. 실시태양 1 내지 실시태양 6 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 a) 소분자 억제제; b) 단백질 또는 펩타이드; c) 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 또는 d) 앱타머이다.
8. 실시태양 1 내지 실시태양 7 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 소분자 억제제는 50 내지 800 Da의 분자량을 갖는다.
9. 실시태양 1 내지 실시태양 8 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 피리디닐이미다졸 또는 2,4-이치환된 프테리딘 또는 퀴나졸린-유도된 억제제이다.
10. 실시태양 1 내지 실시태양 9 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제를 10 nM 내지 10 μM의 농도로 첨가한다.
11. 실시태양 1 내지 실시태양 10 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 억제제는 : SB-202190, SB-203580, SB-206718, SB-227931, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257, BIRB-796, A83-01, LY364947 SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-093, 및 SJN 2511를 포함하는 화합물들의 그룹 중에서 선택된다.
12. 실시태양 1 내지 실시태양 11 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, SB-202190 또는 SB-203580이 50 nM 내지 100 uM의 농도로 첨가된다.
13. 실시태양 1 내지 실시태양 12 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 줄기세포이다.
14. 실시태양 1 내지 실시태양 13 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기줄기세포는 상피 줄기세포이다.
15. 실시태양 14의 배양 배지에 있어서, 상기 인간 상피 줄기세포는 a) 췌장 줄기세포; b) 장 줄기세포; 또는 c) 결장 줄기세포이다.
16. 실시태양 1 내지 실시태양 15 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포는 오르가노이드 또는 단리된 조직 단편의 부분을 형성한다.
17. 실시태양 1 내지 실시태양 16 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포는 암 줄기세포이다.
18. 실시태양 1 내지 실시태양 17 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포 집단에서 1, 2 또는 3 개월 이상 후에 정상 핵형을 갖는 줄기세포의 백분율은 90% 초과이다.
19. 실시태양 1 내지 실시태양 18 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포 집단에서 1, 2 또는 3 개월 이상 후에 정상 표현형을 갖는 줄기세포의 백분율은 90% 초과이다.
20. 실시태양 1 내지 실시태양 19 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포는 3 개월 넘게; 예를 들어 6 개월 넘게 생존한다.
21. 실시태양 1 내지 실시태양 20 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 줄기세포는 12 내지 36 시간, 18 내지 30 시간 또는 대략 24 시간의 평균 집단 배가 시간을 갖는다.
22. 실시태양 1 내지 실시태양 21 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 배양 배지는 동물 또는 인간 세포용 기본 배지 및
a) 하나 이상의 골형성 단백질(BMP) 억제제;
b) 하나 이상의 분열촉진성 성장 인자; 및
c) 하나 이상의 Wnt 작용물질을 포함한다.
23. 실시태양 1 내지 실시태양 22 중 어느 한 실시태양의 배양 배지에 있어서, 상기 배양 배지는 가스트린 및/또는 니코틴아미드를 포함한다.
24. 줄기세포의 집단을 확대시키기 위한 방법으로, 상기 방법은
a) 줄기세포의 집단을 제공하고;
b) 실시태양 1 내지 실시태양 23 중 어느 한 실시태양에 따른 배양 배지를 제공하고;
c) 상기 줄기세포를 상기 배양 배지와 접촉시키고;
d) 적합한 조건 하에서 상기 세포를 배양시킴을 포함한다.
25. 실시태양 1 내지 실시태양 24 중 어느 한 실시태양에 따른 배양 배지 및 줄기세포를 포함하는 조성물.
26. 본 발명에 따른 배양 배지 및 세포외 기질을 포함하는 조성물.
27. 실시태양 1 내지 실시태양 26 중 어느 한 실시태양에 따른 하나 이상의 억제제를 포함하는 배양 배지 보충제.
28. 실시태양 1 내지 실시태양 27 중 어느 한 실시태양에 따른 배양 배지 또는 실시태양 27에 따른 배양 배지 보충제를 함유하는 밀봉된 용기.
29. 바렛 식도 상피의 배양을 위한 실시태양 1 내지 실시태양 23 중 어느 한 실시태양에 따른 배양 배지에서, 상기 배양 배지는 FGF10을 또한 포함한다.
30. 이식 목적 또는 다른 치료 용도에 사용하기 위한, 실시태양 1 내지 실시태양 29 중 어느 한 실시태양의 배양 배지를 사용하여 수득된 줄기세포 또는 오르가노이드.
31. 베타-세포를 포함하는 췌장 오르가노이드.
32. α 세포, δ 세포 및 PP 세포를 또한 포함하는, 실시태양 31의 췌장 오르가노이드.
33. α 세포, β 세포, δ 세포 및 PP 세포를 포함하는, 실시태양 31 또는 실시태양 32의 췌장 오르가노이드.
34. Pdx1, Nkx2.2 및 Nkx6.1 중 하나, 둘 또는 3 개 전부를 발현하는 실시태양 31 또는 실시태양 33의 췌장 오르가노이드.
35. NeuroD, Pax6 및 Mafa 중 하나, 둘 또는 3 개 전부를 발현하는 실시태양 31 내지 실시태양 34 중 어느 한 실시태양의 췌장 오르가노이드.
36. Ngn3을 추가로 발현하는 실시태양 35의 췌장 오르가노이드.
37. 환자에의 이식에 이어서 인슐린을 분비할 수 있는 췌장 오르가노이드, 예를 들어 실시태양 31 내지 실시태양 36 중 어느 한 실시태양에 따른 췌장 오르가노이드.
38. 당뇨병과 같은 인슐린-결핍성 질환을 갖는 환자의 치료에 사용하기 위한 실시태양 31 내지 실시태양 37 중 어느 한 실시태양의 췌장 오르가노이드.
39. 실시태양 31 내지 실시태양 37 중 어느 한 실시태양에 따른 췌장 오르가노이드를 환자에게 이식함을 포함하는, 당뇨병과 같은 인슐린-결핍성 질환을 갖는 환자의 치료 방법.
40. 소낭-융모 오르가노이드, 결장 오르가노이드, 췌장 오르가노이드, 위 오르가노이드, 바렛 식도 오르가노이드, 선암종 오르가노이드, 및 결장 암종 오르가노이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 인간 오르가노이다.
41. 손상된 상피의 치료에, 예를 들어 미세융모 봉입체병(MVID) 환자에 사용하기 위한, 실시태양 1 내지 실시태양 23 중 어느 한 실시태양의 배양 배지를 사용하여 수득된, 소장 또는 소낭-융모 오르가노이드.
42. 하나 이상의 수용체 타이로신 키나제 리간드, 예를 들어 분열촉진성 성장 인자(예를 들어 EGF), 니코틴아미드, 및 바람직하게는 Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1-4 및/또는 CHIR99021 및 a) 프로스타글란딘 경로 활성제, 예를 들어 PGE2 및/또는 AA 및 b) TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01 중 하나 또는 둘 다가 첨가된, 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기로 이루어지는 간 배양 배지.
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Claims (31)

  1. 성체 상피 줄기세포의 집단을 배양하기 위한 배양 배지로, 상기 배양배지는
    i. Lgr5의 작용물질;
    ii. p38 억제제; 및
    iii. EGF;
    를 포함하며,
    상기 p38 억제제는 p38 MAPK α, β 또는 β2 억제제인, 배양 배지.
  2. 제 1 항에 있어서,
    Lgr5의 작용물질이 R스폰딘 1-4 중 어느 하나인 배양 배지.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 p38 억제제는 SB-202190, SB-203580, VX-702, VX-745, PD-169316, RO-4402257 및 BIRB-769로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 배양 배지.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 TGF-베타 억제제를 추가로 포함하는, 배양 배지.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 TGF-베타 억제제가 AKL5, ALK4 또는 ALK7에 결합하고 이들의 활성을 감소시키는 배양 배지.
  6. 제 5 항에 있어서,
    AKL5, ALK4 또는 ALK7에 결합하고 이들의 활성을 감소시키는 상기 TGF-베타 억제제가 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 및 SJN-2511로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 배양 배지.
  7. 제 1 항에 있어서,
    BMP 억제제, Wnt 작용물질, 수용체 타이로신 키나제 리간드, 니코틴아미드, 록(Rock) 억제제, 가스트린, RANKL, GSK3 억제제, 프로스타글란딘 신호전달 경로의 활성제 및 테스토스테론 중에서 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함하는 배양 배지.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지 및 세포외 기질, 또 세포막 단백질과의 접촉에 의해 상기 세포외 기질을 모방하는 3D 기질을 포함하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 세포막 단백질은 인테그린인, 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 세포외기질은 라미닌-함유 세포외기질인, 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지를 함유하는 밀봉된 용기.
  12. 제 8 항에 따른 조성물을 함유하는 밀봉된 용기.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지를 줄기세포, 줄기세포의 집단, 조직 단편 또는 오르가노이드의 확대 또는 분화를 위하여 사용하는 방법.
  14. 단일 상피 줄기세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 확대시키는 방법으로, 상기 방법은 상기 단일 상피 줄기세포 또는 상피 줄기세포의 집단을 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지에서 배양함을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 방법은 오르가노이드를 수득하기 위한 방법인, 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 배양 배지;와 상기 단일 상피 줄기세포, 상기 상피 줄기세포의 집단 또는 상기 조직 단편;을
    세포외 기질, 또는 세포막 단백질과의 접촉에 의해 상기 세포외 기질을 모방하는 3D 기질을 접촉시키기 위해 운반하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 세포막 단백질은 인테그린인, 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 세포외 기질은 라미닌-함유 세포외기질인, 방법.
  19. 제 14항에 있어서,
    상기 방법은 상기 배양 배지에서 상기 단일 상피 줄기 세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 배양하는 단계;
    상기 단일 상피 줄기 세포, 상피 줄기세포의 집단 또는 조직 단편을 계속 배양하고, 상기 배지를 분화 배지로 보충하는 단계;를 포함하며,
    상기 분화 배지는 TGF-베타 억제제, p38 억제제, 니코틴아마이드 및 Wnt 중에서 선택된 인자 중 어느 하나 이상을 포함하지 않는, 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 분화 배지는 TGF-베타 억제제, p38 억제제, 니코틴아마이드 및 Wnt 을 포함하지 않는, 방법.
  21. 제 15 항에 따른 방법에 의해 수득된 오르가노이드 또는 세포 집단.
  22. i) 제 21 항에 따른 하나 이상의 오르가노이드 또는 세포 집단; 및
    ii) 배양 배지 또는 세포외 기질;
    을 포함하며,
    상기 배양 배지는 성체 상피 줄기세포의 집단을 배양하기 위한 배양 배지이며, 상기 배양 배지는 Lgr5의 작용물질 및 p38 억제제를 포함하는, 조성물.
  23. 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학, 독물학 선별, 생체 외 세포 모델 또는 생체 외 기관 모델에 사용하기 위한, 제 21항에 따른 오르가노이드 또는 세포 집단의 사용 방법.
  24. 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학, 독물학 선별, 생체 외 세포 모델 또는 생체 외 기관 모델에 사용하기 위한, 제 8 항에 따른 조성물의 사용 방법.
  25. 약물 선별, 표적 확인, 표적 발견, 독물학, 독물학 선별, 생체 외 세포 모델 또는 생체 외 기관 모델에 사용하기 위한, 제 22 항에 따른 조성물의 사용 방법.
  26. 제 23항에 있어서,
    상기 방법은 질병 모델로서 사용하기 위한, 방법,
  27. 제 24항에 있어서,
    상기 방법은 질병 모델로서 사용하기 위한, 방법,
  28. 제 25항에 있어서,
    상기 방법은 질병 모델로서 사용하기 위한, 방법,
  29. 치료학적 또는 예방학적 약물 또는 화장품을 선별하는 방법으로서, 상기 방법은
    제 21 항에 따른 오르가노이드 또는 세포 집단을 배양하는 단계;
    상기 오르가노이드 또는 세포 집단을 후보 분자들 중 하나 또는 라이브러리에 노출시키는 단계;
    상기 오르가노이드 또는 세포 집단을 임의의 효과에 대해 평가하는 단계; 및
    잠재적인 약물 또는 화장품으로서 상기 효과를 유발하는 후보 분자를 확인하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 효과는 증식의 저감 또는 소실, 형태학적 변화 또는 세포 사멸인, 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30항에 있어서,
    상기 배양은 제 1항에 따른 배양 배지로 배양하는, 방법.
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