KR102179423B1

KR102179423B1 - 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성 방법

Info

Publication number: KR102179423B1
Application number: KR1020197025607A
Authority: KR
Inventors: 팅팡 이; 게르하르트 와그너
Original assignee: 셀미그 바이오랩스 주식회사
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2020-11-16
Also published as: WO2019139606A1; US10316286B1; AU2018400697B2; JP6893999B2; RU2019127303A3; RU2758487C2; JP2021097708A; JP2023058583A; RU2019127303A; CA3055174C; EP3574103A1; AU2018400697A1; US11162069B2; EP3574103A4; CA3055174A1; KR20190105119A; US20190249135A1; JP2020519234A; CN110352246A

Abstract

본 발명은 3D 매트릭스 내에 사이토캡슐(cytocapsulae) 및 사이토캡슐 튜브(cytocapsular tubes)의 형성을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성 방법

본 발명은 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성 영역 및 방법 및 이의 조성물에 관한 것이다.

세포 경계(cell boundary)는 세포를 외부 환경과 분리하여 세포 내 활동 및 구성성분을 환경 요인의 바람직하지 않은 영향으로부터 보호하고 허용한다. 세포 경계는 세포 감지, 이동, 침입, 재배치, 증식, 성장, 분화, 환경과의 통신 및 반응, 영양소 및 산소 섭취, 대사 폐기물 배제 및 환경 스트레스에 대한 보호에 필수적이다.

다세포 유기체에서의 세포 운동은 배아 발달(Le Douarin NM (1984) Cell migrations in embryos. Cell 38(2):353-360; Reig G, Pulgar E, & Concha ML (2014) Cell migration: from tissue culture to embryos. Development 141(10):1999-2013; Richardson BE & Lehmann R (2010) Mechanisms guiding primordial germ cell migration: strategies from different organisms. Nat Rev Mol Cell Biol 11(1):37-49), 장기 항상성 (Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M, & Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. The Journal of clinical investigation 119(6):1438-1449), 조직 재생 (Bryant DM & Mostov KE (2008) From cells to organs: building polarized tissue. Nat Rev Mol Cell Biol 9(11):887-901), 면역학적 반응 (Woodland DL & Kohlmeier JE (2009) Migration, maintenance and recall of memory T cells in peripheral tissues. Nat Rev Immunol 9(3):153-161; Weninger W, Biro M, & Jain R (2014) Leukocyte migration in the interstitial space of non-lymphoid organs. Nat Rev Immunol 14(4):232-246), 창상 수복 (Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, & Longaker MT (2008) Wound repair and regeneration. Nature 453(7193):314-321), 및 종양 전파 (Friedl P & Alexander S (2011) Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell 147(5):992-1009; Friedl P & Wolf K (2003) Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer 3(5):362-374; Barbolina MV, et al. (2009) Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treat Res 149:319-334)에 필수적이다. 3차원(3D) 미세 환경에서의 세포 이동은 이종 세포 및 세포 외 기질 (ECM)을 경험하며, 이는 운동 방향에 대한 지지 스캐폴드(supporting scaffolds) 및 안내 단서(guiding clues)를 제공하고, 동시에 세포 운동성을 지연시키는 환경적 장애물을 형성한다(Thiery JP, Acloque H, Huang RY, & Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 139(5):871-890; Franz CM, Jones GE, & Ridley AJ (2002) Cell migration in development and disease. Dev Cell 2(2):153-158). 운동성을 용이하게 하기 위해, 세포는 라멜리포디아(lamellipodia, Murphy DA & Courtneidge SA (2011) The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat Rev Mol Cell Biol 12(7):413-426), 사상위족(filopodia, Mattila PK & Lappalainen P (2008) Filopodia: molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol 9(6):446-454), 포도좀(podosomes, Tarone G, Cirillo D, Giancotti FG, Comoglio PM, & Marchisio PC (1985) Rous sarcoma virus-transformed fibroblasts adhere primarily at discrete protrusions of the ventral membrane called podosomes. Exp Cell Res 159(1):141-157), 인바도포디아(invadopodia, Chen WT (1989) Proteolytic activity of specialized surface protrusions formed at rosette contact sites of transformed cells. J Exp Zool 251(2):167-185), 수포(blebs, Fackler OT & Grosse R (2008) Cell motility through plasma membrane blebbing. J Cell Biol 181(6):879-884; Ridley AJ (2011) Life at the leading edge. Cell 145(7):1012-1022), 국소접착(focal adhesion, Wehrle-Haller B (2012) Structure and function of focal adhesions. Current opinion in cell biology 24(1):116-124), 수지상 위족을 갖는 원생동물의 돌출부(dendritic pseudopodial protrusion), 및 제 2형 상피 브릿지 (type II epithelial bridge, Zani BG, Indolfi L, & Edelman ER (2010) Tubular bridges for bronchial epithelial cell migration and communication. PLoS One 5(1):e8930)를 포함하는 시공간적으로 표면-접촉된 소기관 및 구획(temporospatial surface-connected organelles and compartments)을 적응적으로 생성한다. 따라서, 다세포 유기체에서 세포 재배치(cell relocation)의 역학(mechanic)은 명확하지 않다.

3D 세포 이동에서의 세포 형태, 사용되는 세포 소기관, 및 역학 및 신호 제어는 종종 이의 2D 대응물과 상이하다 (Baker BM & Chen CS (2012) Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci 125(Pt 13):3015-3024; Wu PH, Giri A, Sun SX, & Wirtz D (2014) Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(11):3949-3954; Friedl P, Sahai E, Weiss S, & Yamada KM (2012) New dimensions in cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol 13(11):743-747). 콜라겐이 풍부한 3D 매트릭스에서 운동하고 있는 세포는 라멜리포디아(lamellipodia) 또는 필로포디아(filopodia)를 나타내지 않지만, 단단한 플레이트의 표면에서는 나타나지 않는 수지상 위족을 갖는 원생동물의 돌출부(dendritic pseudopodial protrusion)를 발현한다 (Jayatilaka H, et al. (2017) Synergistic IL-6 and IL-8 paracrine signalling pathway infers a strategy to inhibit tumour cell migration. Nature communications 8:15584; Giri A, et al. (2013) The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 27(10):4089-4099).

3D 세포 외 매트릭스 및 3D 미세환경에서 세포 운동을 이해하는데 유용한 방법 및 조성물이 당업계에서 계속 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 필요성을 해결하고, 3D 세포 외 매트릭스와 같은 제어된 3D 미세 환경에서의 세포가 적어도 2 가지 이상의 유형의 신규 막 소기관, 즉 사이토캡슐(cytocapsulae) 및 사이토캡슐 튜브(cytocapsular tubes)를 생성할 수 있다는 발견에 기초한다. 사이토캡슐 튜브는 지시된 세포 수송을 위한 튜브형 경로(tubular pathway)를 제공한다. 다수의 사이토캡슐 튜브는 다양한 방향으로의 지시된 세포 수송을 위해 상호 연결하여, 튜브형 웹(tubular webs)의 네트워크를 형성한다. ITGB-2를 포함한 단백질의 발현 증가뿐만 아니라 향상된 캡 의존적 번역(cap-dependent translation)의 개시는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브 형성 및 사이토캡슐 튜브의 연장(elongation)과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 제어된 3D 세포 외 매트릭스에서 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성을 위한 방법 및 조성물은 3D 미세환경에서 세포 이동의 근본적인 메커니즘을 이해하기 위한 강력한 도구를 제공하며, 이는 세포 이주(cell migration), 세포 감작(cell sensing), 세포 스트레스 보호(cell stress protection), 세포 증식(cell proliferation), 세포 분화(cell differentiation), 종양 성장(tumor growth), 종양 발달(tumor development), 종양 전이(tumor metastasis), 종양 재발(tumor relapse), 및 약물 저항성(drug resistance)과 관련된 넓은 범위의 질병에 대한 효과적인 치료제 개발의 전제조건이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 3D 세포 외 매트릭스(extracellular matrix) 및 사이토캡슐(cytocapsulae) 및 사이토캡슐 튜브(cytocapsular tube)를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 3D 매트릭스 내에 또는 상부 위에 이식된 세포에 의해서 형성이 된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성 방법이 제공된다. 상기 방법은 3D 매트릭스 내에 또는 상부 위에 세포를 이식하는 단계, 및 상기 세포가 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하는 조건 하에서 상기 세포가 이식된 3D 매트릭스를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 in vitro 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 3D 매트릭스의 상부층 위에 단일 세포 현탁액을 이식하는 단계; 및 상기 세포가 3D 매트릭스 내에서 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하는 조건 하에서, 상기 세포가 이식된 3D 매트릭스를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 적합한 3D 매트릭스의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 3D 매트릭스를 동결하는 단계; 및 상기 3D 매트릭스를 2 내지 6℃에서 녹이는 단계를 포함한다.

본 명세서 및 특히 청구범위 및/또는 단락에서, "포함한다(comprises)", "포함된다(comprised)", "포함한(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에 따른 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "incudes", "included”, "including" 등을 의미할 수 있고; 및 "필수적으로 이루어지는"및 "필수적으로 이루어진"과 같은 용어는 미국 특허법에서 그와 관련된 의미를 갖는다. 예를 들어, 명시적으로 언급되지 않은 요소는 허용하지만, 종래 기술에서 발견되거나 본 발명의 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배제한다.

이들 및 다른 실시예는 개시되거나, 다음의 상세한 설명으로부터 명백하고 이에 의해 포함된다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 수반된 이 특허 또는 이 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 비용을 지불하면 특허청에서 제공될 수 있다. 본 실시예의 전술한 특징 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면과 함께 고려되는 예시적인 실시예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다.
도 1a 내지 1f는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 대한 이미지를 도시한다. 도 1a는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 관한 이미지를 나타낸다. 지시된 조건 하에서 두꺼운 3D 마트리겔 위에 이식된 인간 유방 상피 세포(HMECs)는 막성(membranous), 세포질 외(extra-cytoplasmic) 사이토캡슐 및 연장된 사이토캡슐 튜브를 형성한다. 일시적으로 EGFP-PMCA2 및 mCherry-β-actin을 과발현하는 단일 HMECs의 사이토캡슐 튜브와 사이토캡슐의 형광 이미지를 나타낸다. HMECs(빨간색 화살표), 사이토캡슐(CC, 하얀색 화살표), 사이토캡슐 막(CCM, 주황색 화살표)를 나타낸다. 도 1b는 사이토캡슐 튜브의 길이를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸다. 도 1c는 사이토캡슐의 세포화(ecellularization)의 역위상차 브라이트 필드 현미경(inverted phase contrast bright field microscope) 이미지를 나타낸다. 파란색 화살표로 표시된 단일 HMEC는 세포를 감싸고 있는 큰 사이토캡슐(CC, 빨간색 화살표)을 형성한다. 1시간 후에, 상기 HMEC는 사이토캡슐을 떠나고 내부에 세포가 없는 세포성 사이토캡슐(ecellulated cytocapsula, eCC, 하얀색 화살표)을 남긴다. 사이토캡슐 막(CCM, 주황색 화살표)이 나타나 있다. 도 1d는 사이토캡슐 세포화(ecellularization)의 개략도를 나타낸다. 도 1E는 사이토캡슐 직경 크기의 정량적 분석을 나타낸다. 도 1f는 큰 막성 사이토캡슐(CC, 빨간색 화살표)의 DIC 이미지(왼쪽 패널) 및 형광 이미지(오른쪽 패널)를 나타낸다. Scale bar = 10㎛
도 2는 HMEC 사이토캡슐 튜브 네트워크를 나타낸다. 사이토캡슐 튜브 내 HMEC의 이주 및 네트워크 형성. 사이토캡슐 튜브(CT, 빨간색 화살표), 사이토캡슐 튜브 연결 노드(cytocapsular tube connection node, CNT), 단일 사이토캡슐 튜브 내에서 이주하는 다수의 세포(주황색 화살표) 및 사이토캡슐 튜브가 없는 세포 집단(검정색 화살표)을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 사이토캡슐 튜브 네트워크의 구조를 도시한다(도 3a). 다수의 BCSC 사이토캡슐 튜브가 교차한다. 다수의 BCSC 사이토캡슐 튜브는 사이토캡슐 튜브 노드(CTN)를 통해서 상호 연결되고 교차 형태(cross morphologies)를 형성한다. 세포가 사이토캡슐 튜브 네트워크 내에서 이주한다(도 3B). 급진적인 형태의 BCSC 사이토캡슐 튜브(CT, 빨간색 화살표) 네트워크. 5개까지의 사이토캡슐 튜브는 사이토캡슐 튜브 노드(CTN)을 통해 연결된다. 다수의 세포가 다양한 형태로 사이토캡슐 튜브 네트워크 내에서 이주한다. Scale bar = 10㎛
도 4는 BCSC 사이토캡슐 튜브 네트워크 시스템의 순간적인 이미지를 세포 용해 분석(cell lysis analysis)으로 확인한 결과이다. 세포 용해(cell lysis)의 순간적인 이미지에 의한 사이토캡슐 튜브 네트워크의 브라이트 필드 이미지. 사이토캡슐 튜브 네트워크 내에서 중첩된 사이토캡슐 튜브(CT, 빨간색 화살표) 및 사이토캡슐 튜브 노드(CTN)를 나타낸다. 이미지는 세포 용해 버퍼를 처리한 이후 1~2초에 수득하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하고 3초 후에, 모든 사이토캡슐 튜브 및 세포 원형질막(plasma membrane)이 용해되고 사라져 버렸다.
도 5a 내지 5g는 사이토캡슐 병합(mergence) 및 세포 입장(entry)을 도시한다(도 5a). 두 개의 세포에 의해 생성된 두 개의 사이토캡슐 튜브에 의해 결합된, 병합된 사이토캡슐 튜브의 브라이트 필드 이미지. Cell 2는 병합된 사이토캡슐 튜브 내에 위치한다. 병합된 사이토캡슐 튜브(MTP, 빨간색 화살표), 병합된 사이토캡슐 튜브 막(MTM, 주황색 화살표)를 나타낸다(도 5b). 크게 병합된 사이토캡슐과 상기 병합된 큰 사이토캡슐 내에 위치한 다수의 세포(세포 집단)의 DIC 및 형광 현미경 이미지. 병합된 사이토캡슐 튜브 막(MTM, 주황색 화살표)를 나타낸다(도 5c). 세포 입장(cell entry)의 정량(도 5d). HMECs 내 내재적 신시틴-1(endogenous Syncytin-1)의 면역형광 현미경 이미지(도 5e). 사이토캡슐 튜브 발달 과정 동안의 신시틴-1(Syncytin-1) 발현의 웨스턴 블롯 이미지(도 5f). 신시틴-1의 낙다운(knockdown)은 HMEC 사이토캡슐 튜브 병합을 감소시킨다(도 5g). 신시틴-1의 낙다운(knockdown)은 HMEC 사이토캡슐 튜브의 개시에는 영향을 미치지 않는다.
도 6a 및 6b는 사이토캡슐 튜브 연장(elongation)을 조절하는 ITGB-2를 나타낸다(도 6a). 사이토캡슐 튜브 발달 과정 동안 26개 인테그린 유전자의 전사적 변화(transcriptional changes)의 히트맵(도 6b). 사이토캡슐 형성 및 사이토캡슐 튜브의 연장에 대한 ITGB-2의 영향.

본 명세서에 개시된 양태는 세포가 제어된 3D 세포 외 매트릭스에 이식되고 배양될 때, 본 발명에서 사이토캡슐(cytocapsulae) 및 사이토캡슐 튜브(cytocapusle tube)라 불리는 2개의 신규한 세포 외 막 소기관(extracellular membranous organelles)을 생성할 수 있다는, 기존에는 발견되지 않은 관찰에 기초한다. 세포는 사이토캡슐 내에서 이동하고 사이토캡슐 튜브를 생성하며, 다방면성(pleiotropic)의 생물학적 기능을 나타내고, 매트릭스 내에서 지시된 세포 수송(cell transportation)을 위한 관형 경로(tubular routes)를 제공한다. 다수의 사이토캡슐 튜브는 매트릭스 내에서 다양한 방향으로의 지시된 세포 수송을 지원하는 네트워크를 생성하기 위해 형성되고 상호 연결된다. 본 발명은 3D 미세환경에서 사이토캡슐 튜브를 통한 지시된 세포 전위(directed cell translocation)의 메카니즘을 제안한다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성을 위해 본 발명에 개시된 방법 및 조성물은 다세포 유기체 배아 발달(multicellular organism embryo development), 기관 항상성(organ homeostasis), 조직 재생(tissue regeneration) 및 면역 반응(immune response)의 기전의 이해뿐만 아니라 세포 이주(cell migration), 세포 감작(cell sensing), 세포 스트레스 보호(cell stress protection), 세포 증식(cell proliferation), 세포 분화(cell differentiation), 종양 성장(tumor growth), 종양 발달(tumor development), 종양 전이(tumor metastasis), 종양 재발(tumor relapse), 및 약물 저항성(drug resistance)을 포함하는 광범위한 질병 및 생물학적 프로세스의 치료 및 관리를 위한 치료제 개발을 용이하게 할 것이다.

관찰된 바와 같이, 본원에 기술된 방법에 따라 3D 세포 외 매트릭스에서 생성된 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 수명주기(lifecycle)는 다음과 같이 요약될 수 있다. 초기 단계에서, 단일/개별 세포는 세포를 둘러싸는 작고, 둥근, 세포 외 및 막 사이토캡슐을 형성한다. 후속적으로, 사이토캡슐은 다수의 발달 단계를 겪는다. 먼저, 사이토캡슐은 세포화를 진행한다(ecellularization). 상기 세포화(ecellularization)의 결과로, 사이토캡슐는 방출된 세포(expersed cell)와 완전히 분리되어 무세포성(acellular) 사이토캡슐이 된다. 사이토캡슐 및 방출된 세포의 불완전한 분리가 또한 관찰되었다. 불완전한 분리의 경우, 방출된 세포는 무세포성 사이토캡슐에 연결된 상태로 유지되며, 연결된 무세포성 사이토캡슐에 자동 출입(autoentry)을 통해 다시 들어가서, 관(lumen) 내의 세포와 폐쇄된 사이토캡슐(closed cytocapsulae)을 다시 형성할 수 있다. 둘째로, 사이토캡슐은 자라서 둥글거나 타원형의 큰 사이토캡슐(약 100 내지 250μm의 직경/주축)로 성장한다. 상기 큰 사이토캡슐은 약간 수축하여 관내(intraluminal) 세포를 둘러싸는 수축성 사이토캡슐을 형할 수 있다. 반면에, 주위 환경으로부터의 다른 세포는 세포를 포함하고 있는 단일의 큰 사이토캡슐로 들어갈 수 있고, 이는 다수의 세포를 보유하는 단일 사이토캡슐을 야기한다. 이들 큰 사이토캡슐의 세포화(ecellularization)는 큰 무세포성 사이토캡슐을 생성하는데, 이는 수축하고, 오므라들어 크고, 오므라들고, 오목한 (또는 불규칙한 형태의) 디스크를 형성한다. 셋째로, 세포는 사이토캡슐 내로 이동하여 사이토캡슐 막을 변형시키고 연장된 사이토캡슐 튜브를 생성시킨다. 주변세포의 동종출입(alloentry)은 다수의 세포가 사이토캡슐 튜브 내로 들어가고 이동하는 것을 허용한다. 동종(homogeneous) 및 막으로 둘러싸인 사이토캡슐 튜브에서 세포 (단일 세포 또는 다중 세포의)의 이동은 이종(heterogeneous) 세포 외 매트릭스 (ECM) 및 다른 세포 및 구조체로 이루어진 이종 환경에서 발견되는 것보다 빠르다. 아마도 사이토캡슐 튜브 내에서 세포 이동은 ECM, 세포 및 구조체의 방해가 없다. 사이토캡슐 튜브는 상호연결하여, 분지형, 이음매 없는 멤브레인형 튜브형 네트워크를 형성하고, 다양한 방향으로 3D 세포 수송/운동을 유도할 수 있는 튜브형 웹 시스템(tubular web system)을 제공한다. 세포화(ecellularization) 과정은 무세포성 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성한다. 모든 무세포성 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 빠른 자기 분해(self-decomposition)를 진행한다.

일 양태에 따르면, 3D 세포 외 매트릭스 및 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 포함하는 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 3D 매트릭스의 상부 내 또는 상부에 이식된 단일 세포에 의해 형성된다. 일 구체 예에서, 상기 세포는 3D 매트릭스의 상부 표면에 이식된다. 이식 전에, 상기 세포는 약 1 x 10 내지 약 1 x 10⁵ 세포/ml 사이 밀도의 단일 세포 현탁액으로 처리된다.

일 양태에 따르면, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하는 세포를 둘러싼다. 다른 양태에 따르면, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 주변 환경으로부터 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브로 들어가는 다수의 세포를 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 세포화(ecellularization)가 수행되고 밀폐된 세포를 지지하여 세포가 없는 무세포성(acellular) 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성한다.

특정 양태에 따르면, 대략적으로 단일 세포 현탁액 내 복수의 세포가 3D 매트릭스의 상부층 내에 또는 그 상부에 첨가되는 3D 매트릭스가 제공된다. 상기 세포 이식된 3D 매트릭스의 제어된 조건하에서의 배양은 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하는 단일 세포를 야기한다.

일 양태에 따르면, 3D 매트릭스는 다공성(porous)이다. 다공성(porosity)은 매트릭스 물질을 제조하는데 사용된 분자의 중합(polymerization) 및/또는 가교(crosslinking)에 의해 발생할 수 있다. 상기 다공성은 당업자에게 공지된 방법에 따라 가교 밀도, 쇄 길이 및 공중합된 분지화 단량체의 백분율을 변화시킴으로써 제어된다. 일 양태에 따르면, 상기 3D 매트릭스는 추가적인 시약이 매트릭스를 통해 확산되거나 달리 이동할 수 있을 정도로 다공성이다. 다공성 매트릭스는 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 분자체(molecular sieve) 크기 및 밀도에 대한 추가적인 제어는 기능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 추가의 가교제를 첨가함으로써 달성된다.

다른 양태에 따르면, 3D 매트릭스는 점성이다(viscous). 3D 매트릭스의 점도는 업계에 공지된 임의의 수단에 따라 조정될 수 있다.

일 양태에 따르면, 상기 3D 매트릭스 재료는 다양한 온도를 허용하도록 화학적으로 불활성이고 열적으로 안정적이다. 일 양태에 따르면, 상기 3D 매트릭스 재료는 광학적으로 투명하다. 일 양태에 따르면, 상기 3D 매트릭스 물질은 광학적으로 투명하여 당업자에게 공지된 3D 이미징 기술을 허용한다. 일 양태에 따르면, 매트릭스는 광학적으로 충분히 투명하거나, 또는 높은 처리량 정보 판독을 위한 깊은 3D 이미징에 적합한 광학 특성을 갖는다.

일 양태에 따르면, 매트릭스를 형성하는데 사용되는 물질은 생분해성(biodegradable)이다. 다른 양태에 따르면, 매트릭스를 형성하기 위해 사용된 물질은 in situ에서 광범위한 생물학적 및 비-생물학적 표본과 양립할 수 있다.

일 양태에 따르면, 상기 매트릭스 물질은 폴리아크릴아미드, 셀룰로오스, 알기네이트, 폴리아미드, 가교된 아가로스, 가교된 덱스트란 또는 가교된 폴리에틸렌 글리콜로부터 제조될 수 있는 반고체(semi-solid) 매질일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 반고체 매질은 현미경 슬라이드, 배양 플레이트 또는 플로우 셀과 같은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상기 고체 지지체는 반고체 매체의 바닥면에 부착될 수 있다.

매트릭스 형성 물질은 폴리아크릴아미드, 셀룰로오스, 알기네이트, 폴리아미드, 가교된 아가로스, 가교된 덱스트란 또는 가교된 폴리에틸렌글리콜을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 매트릭스 형성 물질은 매트릭스 형성 물질에 특정한 방법 및 당업자에게 공지된 방법, 시약 및 조건을 사용하여 매트릭스 형성 물질의 중합 및/또는 가교에 의해 매트릭스를 형성할 수 있다.

매트릭스 형성 물질은 엘라스틴, 라미닌, 프로테오글리칸 (예 : 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 케라틴 설페이트) 및 비-프로테오글리칸 다당류 (히알루론산)를 추가로 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 매트릭스 형성 물질은 또한 섬유(fabrillary), Facit, 단쇄 및 기저막 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 매트릭스 형성 물질은 FAK(focal adhesion kinase), 탈린(talin), 빈쿨린(vinculin), 팍실린(paxillin), α-액티닌(α-actinin), 및 GTPase을 포함하는 신호 단백질(signal proteins)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리안하드라이드(polyanhydrides), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리오르소에스테르(polyorthoesters), 폴리락트산(polylactic acid) 및 폴리락틱-글리콜릭 공중합체(polylactic, polyglycolic copolymers (PLG))를 포함하는 생분해성, 생체적합성 중합체가 매트릭스 물질로서 사용될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

특정 양태에 따르면, 매트릭스는 고체 지지체와 함께 사용된다. 예를 들어, 상기 매트릭스의 한 표면이 고체 지지체 (예를 들어, 유리 표면)에 부착되는 반면, 매트릭스의 다른 표면은 2 개의 고체 지지체 사이에 노출되거나 샌드위치되는 방식으로 매트릭스가 중합될 수 있다. 일 양태에 따르면, 매트릭스는 용기 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 고체 지지체는 다양한 형상으로 형성될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 고체 지지체는 실질적으로 평면이다. 고체 지지체의 예는 슬라이드(slide), 마이크로타이터 플레이트(microtitre plates), 플로우 셀(flow cells), 커버 슬립(coverslips), 마이크로 칩(microchips) 등과 같은 플레이트, 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tubes), 테스트 튜브(test tubes) 등과 같은 용기, 튜브, 시트, 패드, 필름 등을 포함한다. 또한, 상기 고체 지지체는 예를 들어 생물학적, 비생물학적, 유기, 무기 또는 이들의 조합일 수 있다.

매트릭스의 특정 특성은 매트릭스에서 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는데 결정적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 매트릭스의 중합도, 단백질 농도 및 점탄성은 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 영향을 미친다. 본 발명은 약 10 %의 낮은 수준에서 완전한 100 %의 중합까지 광범위한 매트릭스 중합을 고려한다. 매트릭스 중합도는 매트릭스 밀도 및 점탄성과 관련된다. 또한, 매트릭스에 존재하거나 이후에 매트릭스에 첨가되는 단백질은 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 영향을 미친다. 본 발명은 매트릭스 내에서 약 2 내지 12mg/ml 범위의 최종 단백질 농도를 고려한다. 본 발명은 매트릭스에 대해 pH 4 내지 8의 범위를 추가로 고려한다. 매트릭스의 중합도, 구배, 밀도 및 점탄성은 매트릭스 내에서 세포 이동의 듀로탁시스(durotaxis)에 영향을 미친다. 일 구현 예에서, 3D 매트릭스는 마트리겔(matrigel)이다.

본 명세서에 따른 세포는 초파리, C.elegant 세포 등을 포함하는 진핵 세포, 동물 세포, 식물 세포, 과일 세포, 곤충 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 세포는 질병 세포 또는 건강한 세포를 포함하여 인간 또는 다른 세포를 포함한다. 특정 세포에는 인간 세포, 비인간 세포, 인간 줄기 세포, 분화된 세포, 유도 만능 줄기세포 (iPSC), 유전자 변형 세포, 인간 다능성 세포, 상피 세포, 내피 세포, 면역 세포, 근육 세포, 마우스 줄기 세포, 1 차 세포주, 무한증식 세포주, 1 차 및 무한증식 섬유아세포, HeLa 세포 및 뉴런, 및 종양 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 인간 유방 상피 세포(human mammary epithelial cell)이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 성인이든 배아(embryonic)이든 줄기 세포이다. 한 구체예에서, 상기 세포는 다능성 줄기 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포는 인간 유도 만능 줄기 세포이다. 특정 양태에 따르면, 상기 세포는 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에 있다.

다른 양태에 따르면, 본 명세서는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 세포를 3D 매트릭스 내에 또는 그 위에 이식하는 단계, 및 세포 이식된 3D 매트릭스를 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 생성에 적합한 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 적합한 배양 온도는 약 37℃이며, 특정 세포 유형에 따라 변한다. 일구현예에서, 상기 3D 매트릭스는 이식 전에 동결된다. 특정 실시양태에서, 이식(implanting)은 약 1-45 ℃, 1-37 ℃, 1-6 ℃ 및 2-4 ℃ 범위의 온도에서 이루어진다. 다른 구체예에서, 3D 매트릭스의 두께는 약 1-1000 μm, 2-100 μm, 5-50 μm, 및 5-10 μm의 범위에 있다.

특정 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는 세포를 둘러싼다. 다른 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는 둘러싸인 세포의 퇴장(exit)을 허용한다. 또 다른 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 주변 환경으로부터 다수의 세포의 입장(entry)을 허용한다.

일 양태에 따르면, 상기 세포는 이식 전에 약 1 x 10 내지 1 x 10⁵세포/ml의 밀도로 단일 세포 현탁액으로 존재한다.

사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 막은 특정한 특성을 갖는다. 일 양태에 따르면, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 막은 원형질 막 단백질 Ca2+ ATPase 2를 포함한다. 다른 양태에 따르면, 신시틴-1(syncytin-1)은 사이토캡슐 튜브의 병합(mergence) 및 세포 입장(entry)을 조절한다. 또 다른 양태에 따르면, 성장 인자는 사이토캡슐 형성 및 사이토캡슐 튜브 발달을 조절한다. 또 다른 양태에 따르면, ITGB-2는 사이토캡슐 튜브에서의 세포 이동을 매개하고 사이토캡슐 튜브 연장(elongation)을 조절한다. 또 다른 양태에 따르면, 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinases)는 사이토캡슐 튜브의 연장을 매개한다.

특정 실시양태에서, 상기 3D 매트릭스는 콜라겐, 마트리겔 매트릭스 물질, 엘라스틴, 라미닌, 프로테오글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 케라틴 설페이트), 비-프로테오글리칸 다당류 (예를 들어, 히알루론산), 단백질 (예를 들어, 섬유(fibrillary), Facit, 단쇄 및 기저막 단백질) 및 신호 단백질 (예를 들어, FAK, 탈린, 빈쿨린, 팍실린, β-액티닌 및 GTPase)을 포함하는 생리활성(bioactiv) 및/또는 생리비활성(bioinactive) 제제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양태에 따르면, in vitro에서 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 제조하는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 3D 매트릭스의 상부층 위에 단일 세포 현탁액을 이식하는 단계; 및 이식된 세포를 적합한 배지에서 및 적합한 온도에서 배양하는 단계로서, 각각의 단일 세포는 3D 매트릭스에서 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에 따르면, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 적합한 3D 매트릭스를 제조하는 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 방법은 3D 매트릭스를 동결하는 단계 및 3D 매트릭스를 적절한 온도에서 해동하는 단계를 포함한다. 매트릭스를 해동시키기에 적합한 온도는 약 1-45 ℃, 1-37 ℃, 1-6 ℃ 및 2-4 ℃ 사이이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 설명하기 위해 제공된 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 본원에 기재된 방법과 함께 본 실시예는 현재 바람직한 실시양태를 대표하고 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구 범위의 범주에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 내에 포함되는 변경 및 다른 용도는 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성

세포 경계 및 3D 세포 운동의 역학을 조사하기 위해, 본 발명의 특정 실시 양태에 따라 재구성된 세포 외 매트릭스(ECM) 대용 3D 마트리겔 매트릭스에 정상적인 1차 인간 유방 상피세포(HMEC)를 이식하였다. 2D 환경의 세포가 아닌, 3D 마트리겔 내 단일 구형(spherical)의 HMEC는 세포를 둘러싸고 있는 다양한 크기의 원형/불규칙한 모양의 세포 외 기포형 캡슐을 생성했다(도 1a). 단일 HMEC의 대략 96% (6-웰 플레이트에서 1 x 10³ 세포/웰, n = 3)는 12시간 때에 세포 외 캡슐을 생성 하였다. 세포 외 구형/타원 캡슐의 직경/주축은 유의하게 증가하였고, 최대 250μm에 도달하였다. 캡슐 표면이 막성(membranous)인지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 원형질 막 단백질 Ca2+ ATPase 2(EGFP-PMCA2)와 융합된 EGFP(enhanced green fluorescence protein)를 HMEC에서 일시적으로 과발현시켰다. 실제로, EGFP-PMCA2는 세포의 원형질 막과 세포 외 캡슐 막 모두에 분포되어 있으며, 이는 세포 외 캡슐이 막으로 둘러싸여 있음을 확인시켜 주었다(도 1a). 이러한 세포 외 사이토캡슐은 연장되어 다양한 길이의 긴 튜브를 형성할 수 있다(도 1b). 시간이 지남에 따라 단일 캡슐은 자동으로 세포화되고(ecellularized), 팽팽한 멤브레인이 있는 여러 형태(구형, 타원형 또는 불규칙)의 무세포성(acellular) 및 닫힌(closed) 캡슐을 남긴다(도 1c 내지 1d). 이 사이토캡슐은 다양한 크기이며 직경이 100μm까지 이를 수 있다(도 1e). 이 사이토캡슐은 막성(membranous)이다(도 1f). 이러한 관찰은 캡슐 막이 독립적으로 원형질 막의 외부에 위치하고, 무세포성 캡슐은 세포없이 존재할 수 있음을 입증하였다. 이전에 인식되지 않은, 단일 포유 동물 세포 생성(single mammalian cell generated), 세포 외(extracellular), 막성 캡슐(membranous capsula)을 사이토캡슐(cytocapsula)로 지칭하였다.

실시예 2: 사이토캡슐 세포화(cytocapsula ecellularization)

대부분의 경우에, 사이토캡슐의 세포화(ecellularization) 이후에, 세포는 그것의 무세포성 사이토캡슐로부터 완전히 분리된다. 상기 무세성 사이토캡슐은 붕괴되어 수축되고 오목한 디스크를 형성한다(도 1c). 때때로, 사이토캡슐의 세포화(ecellularization)는 무세포성 사이토캡슐로로부터 방출된 세포의 불완전한 분리를 초래한다.

세포화(ecellularization) 이후에 무세포성 사이토캡슐의 성장은 종료되는데, 이는 사이토캡슐의 형성 및 성장은 관내(intraluminal) 세포에 의존한다는 것을 의미한다. 한편, 원형질 막과 세포외 캡슐 막 사이의 큰 유격(gap)/거리(distance)는, 관내 세포로부터 유래된 캡슐 구성성분이 사이토캡슐 구축을 위해 원형질 막 밖으로 방출(released)/운송(delivered)된다는 것을 의미한다(도 1c). 그 다음으로, 상기 무세포성 사이토캡슐은 계속해서 수축하고 오므라들며, 사이토캡슐 막이 접혀서, 크고 오므라든 오목한 디스크 또는 짧고 평평한 튜브를 형성한다. 약 0.5 내지 1시간이 경과한 후, 무세포성 사이토캡슐의 막은 분해되고 사이토캡슐은 자가 분해(self-decomposed)된다. 이러한 발견은 사이토캡슐의 수명주기(lifecycle)는 몇몇의 연속적이고 구분된 상(phase)을 통해서 진행된다는 것을 제시한다: 개시(initiation)으로부터, 성장(growth), 세포화(ecellularization), 평평화(deflatation) 및 수축(shrinkage), 막 분해(membrane degradation), 및 자가-분해(auto-decomposition).

높은 세포 밀도에서의 세포 접촉은 사이토캡슐의 생성을 감소시키고 사이토캡슐 분해를 현저하게 증가시킨다. 높은 세포 밀도에서의 세포 접촉 억제는 사이토캡슐 생성을 완전히 억제하거나 사이토캡슐 분해를 완전하게 유도하지는 않는다. 높은 세포 밀도에서의 세포 접촉은 사이토캡슐의 직경 성장을 감소시킨다.

시간이 지남에 따라, 단일 세포는 사이토캡슐에서 양방향으로 이동하고 사이토캡슐 막을 변형시키며 연장된(elongated) 사이토캡슐을 형성하여 다양한 길이의 막성 관(membranous tubes)을 형성한다(도 2).그 후, 관내(intraluminal) 세포를 사이토캡슐 튜브로부터 방출시킨다. 사이토캡슐의 세포화(ecellularization)는 무세포성 사이토캡슐 튜브를 생성하였다. 그 후, 긴 무세포성 사이토캡슐 튜브가 자동으로 줄어들었고, 막이 심하게 접혀 수축, 코일, 비틀림 및 막 응축된 가닥(strand)을 형성했다. 후속 적으로, 긴 수축성 및 무세포성 사이토캡슐 튜브의 막이 분해된 후, 튜브 자동-분해(auto-decomposition)가 이어졌다. 이와 같은 단일 세포의 사이토캡슐 튜브의 순차적인 발달 단계들은, 사이토캡슐 튜브의 수명주기(lifecycle)가 계속해서 사이토캡슐 내 단일 세포의 이주(migration)로부터 시작해서, 사이토캡슐 막 분해(cytocapsular membrane deformation), 사이토캡슐 연장(cytocapsula elongation), 사이토캡슐 튜브 형성(cytocapsular tube formation), 세포화(ecellularization) 및 무세포성 사이토캡슐 튜브의 자가 분해(auto-decomposition)까지 진행된다는 것을 보여준다.

단일 HMEC가 형성한 사이토캡슐 튜브는 820μm 길이까지 도달할 수 있다. 증가된 세포 밀도는 사이토캡슐 튜브의 평균 길이를 감소시키나, 평균 너비(대략적으로 11μm 직경/너비)는 감소시키지 않는다. 또한, 높은 세포 밀도는 사이토캡슐 튜브의 평균 수명(lifetime)의 감소를 야기한다. 또한, 높은 세포 밀도는 사이토캡슐 튜브 평균 밀도(길이 및 숫자)를 감소시킨다. 일부 사이토캡슐 튜브는 밀집된 미세 환경을 견딜 수 있다.

다음으로, 본 발명자들은 HMLER (CD44^high/CD24^low)^FA 하위 집단(subpopulations) 유방암 줄기 세포의 사이토캡슐 형성을 평가하였다(Yi T, et al. (2014) Quantitative phosphoproteomic analysis reveals system-wide signaling pathways downstream of SDF-1/CXCR4 in breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(21):E2182-2190). 1 x 10² 및 1 x 10³ 세포/웰의 낮은 세포 밀도에서, 대략 99 % BCSC는 3D 마트리겔에서 15시간째에 사이토캡슐을 생성하였다. BCSC 사이토캡슐은 세포 접촉 억제를 견딜 수 있는 능력을 더 갖고있다. BCSC 사이토캡슐 튜브는 HMEC보다 통계적으로 더 길며 단일 BCSC 사이토캡슐 튜브는 길이가 최대 1000μm에 이를 수 있다.

실시예 3: 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 원형질 막외 소기관(extra-plasma membrane organelles)이다

본 발명자들은 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브가 원형질 막의 연장부 또는 연결된 세포 표면이 아님을 발견하였다. 이들은 단일 세포에 의해 생성되며, 원형질 막과는 구분되는 이들 자신만의 생성된 막으로 둘러싸여 있고, 이를 생성한 세포를 둘러싼다. 다방면의 생물학적 기능(pleiotropic biological functions) 이외에도, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 다음의 것들을 포함하는 독특한 특성을 갖는다: 세포를 둘러싸고 있는 세포 외 막성 캡슐(또는 튜브), 세포화(ecellularization) 및 세포의 입장(entry)의 허용. 반면에, 사이토캡슐은 그렇지 않지만, 사이토캡슐 튜브는 다수 세포의 지시된 수송을 위한 긴 관로(tubular avenues)를 제공한다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 원형질 막의 연장부가 아니며, 세포를 둘러싸고있는 세포 외막 소기관이다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 2D 세포 배양물에는 존재하지 않는다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 지지 스캐폴드 및 둘러싸인 세포를 위한 커버를 제공하고, 세포화(ecellularization) 및 세포 입장을 허용하는 것을 포함하는 다방면의 생물학적 기능을 갖는다. 세포는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브, 및 사이토캡슐 튜브 네트워크 내에서 이동할 수 있다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 자동 분해(auto-decomposition)는 세포 생존, 증식 및 성장에 영향을 미치지 않는다. 세포화된(ecellularized) 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 최대 98 시간까지 존재할 수 있다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 수십 개의 세포와 같은 다수를 수용할 수 있다. 사이토캡슐 튜브는 상호 연결되어 여러 방향으로 지시된 세포 전위(translocation)를 위해 개방형 튜브 네트워크를 형성한다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 이러한 특성은, 이들이 이전에 설명된 모든 소기관과 구별되는 2 개의 신규한 기능성 소기관임을 보여준다.

실시예 4: 사이토캡슐 튜브 네트워크의 형성

6 시간 째에, 단일 1차 정상 HMEC는 지시된 마트리겔 매트릭스에서 크고, 막성이며 짧은 사이토캡슐 튜브를 생성하였다(도 2). 10 시간 째에, HMEC는 짧은 사이토캡슐 튜브에서 이동하여 연장된 사이토캡슐 튜브를 생성하였다(도 2). 36 시간 째에, 다수의 HMEC 긴 사이토캡슐 튜브는 상호연결되어, 연결 노드(connection nodes)를 통해 네트워크를 형성했다(도 2). 68 시간 째에, HMEC는 응집되어 세포 집단을 형성하였고, 모든 HMEC 사이토캡슐 튜브는 분해되었고, 사이토캡슐 튜브는 남아 있지 않았다(도 2).

4 시간 째에, 유방암 줄기 세포(BCSC)는 이미 지시된 3D 마트리겔 매트릭스에서 크고 짧은 사이토캡슐 튜브를 생성하였다(도 3a). BCSC는 사이토캡슐에서 양방향으로 이동하고 사이토캡슐 막을 변형시켜 튜브 형태를 형성하며 길고 곡선인 사이토캡슐 튜브를 만들었다(도 3b). 다수의 BCSC 사이토캡슐 튜브는 연결되었고 닫힌 원(closed circles)을 포함한 다양한 형태를 형성했다. 많은 암 세포는 사이토캡슐 튜브 내에서 스트리밍 및 선형을 포함한 다양한 방식으로 이동했다(도 3). 이후에, BCSC는 뭉치고, 구형 또는 불규칙한 모양의 종양 구체(tumor spheres)를 형성했다. 다음으로, 본 발명자는 시간에 따른 BCSC 사이토캡슐 튜브 길이를 정량화했다. BCSC 사이토캡슐 튜브는 길이가 최대 1000μm에 이를 수 있다. 다수의 사이토캡슐 튜브가 연결되어 더 긴 튜브를 형성할 수 있다. 사이토캡슐 튜브의 수는 시간에 따라 감소하며, 이는 사이토캡슐 튜브의 길이가 다이나믹하고 엄격하게 제어됨을 나타낸다(도 4).

상기 언급된 데이터는 사이토캡슐 튜브가 일반적으로 연속적이지만 구분되는 단계들을 진행한다는 것을 보여준다: 사이토캡슐 개시(cytocapsula initiation), 사이토캡슐 내에서 세포의 이주(cell migration in cytocapsulae), 사이토캡슐의 연장 및 사이토캡슐 튜브의 형성(cytocapsula elongation and form cytocapsular tubes), 다수의 사이튜캡슐 튜브의 연결 및 네트워크의 형성(multiple cytocapsular tunes connect and form networks), 사이토캡슐 튜브 내에서 세포의 이주(cells migrate in cytocapsular tube networks), 세포의 응집 및 세포 집단/클러스터의 형성(cell aggregation and cell mass/cluster formation), 및 사이토캡슐 튜브의 분해(cytocapsular tube decomposition).

가변적인 길이의 둘 이상의 HMEC 사이토캡슐 튜브는 연결 노드를 통해 상호 연결되고 튜브 네트워크를 형성한다. 38 시간 째에, BCSC는 HMEC보다 더 많은 사이토캡슐 튜브 연결 노드를 발생시킨다. 또한, BCSC의 연결 노드 당 평균 사이토캡슐튜브의 수는 HMEC 보다 많다. BCSC의 사이토캡슐 튜브 밀도는 HMEC의 그것보다 약 3배 더 높다. 이러한 데이터는 BCSC가 상호 연결된 사이토캡슐 튜브 네트워크를 생성할 수 있는 보다 공격적인 능력을 가지고 있음을 보여준다. 단리되거나 연결된 세포를 갖는 BCSC 사이토캡슐 튜브의 수명은 무세포성 BCSC 사이토캡슐 튜브의 수명보다 훨씬 길며, 이는 관 내(intraluminal) 세포가 분해(decomposition)에 저항하여 튜브를 유지하는 것을 용이하게 한다는 것을 의미한다. 세포를 갖는 단리된(isolated) BCSC 사이토캡슐 튜브와 비교하여, 세포를 갖는 연결된(connected) BCSC 사이토캡슐 튜브는 통계적으로 더 오랜 기간 동안 온전하게 유지된다. 이 결과는 사이토캡슐 튜브의 유지가 관 내(inraluminal) 세포에 의해 철저하게 관리되고 중재된다는 것을 제시한다. 중요하게는, BCSC 사이토캡슐 튜브는 상호 연결되어 in vivo 종양에서 튜브형 네트워크(tubular networks)를 형성하며, 다수의 세포가 이들 튜브형 네트워크에서 이동한다. 이 데이터는 사이토캡슐 튜브 네트워크가 다양한 방향으로 지시된 세포 운동을 위한 막성 튜브형 웹(membranous tubular webs)을 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 세포 운송을 위한 사이토캡슐 튜브 하이웨이(highway)

세포는 막성 사이토캡슐 튜브 네트워크 내에서 이동하며, 상기 사이토캡슐 튜브는 세포 전위를 위한 하이웨이(highway)를 제공한다(도 2 및 3). 빠른 세포 용해 및 즉각적인 이미지 기술을 사용하여, 본 발명자는 사이토캡슐 튜브 네트워크 아키텍쳐(architecture)를 조사했다. BCSC 사이토캡슐 튜브는 광범위하고 공격적으로 상호 연결되어 있으며, 십자형, 열린 원, 닫힌 원 및 기타 여러 불규칙한 형태를 현저하게 형성하여, 원거리 목적지를 향한 암세포 지향 세포 재배치(cancer cell directed cell relocation)를 위해 다양한 방향으로의 초대형 튜브형 네트워크를 제공한다(도 4). 단일 및 다중 세포 모두 3D 환경에서와 비교하여 사이토캡슐 튜브 내에서 더 빨리 이동한다. 사이토캡슐 튜브는 지시된 3D 세포 수송을 위한 하이웨이를 형성한다.

실시예 6: 신시틴-1(syncytin-1)은 사이토캡슐 튜브의 병합(mergence) 및 세포 입장(cell entry)을 조절함

다른 세포들의 사이토캡슐은 병합될 수 있고, 더 큰 사이토캡슐을 형성할 수 있으며, 세포는 다른 세포의 사이토캡슐에 들어갈 수 있다(도 5a). 세포는 다른 세포의 사이토캡슐로 들어갈 수 있으며, 이는 다수의 세포 또는 세포 집단을 보유하는 단일의 큰 사이토캡슐을 형성한다(도 5b 및 5c). 다음으로, 본 발명자는 사이토캡슐 튜브 융합(fusion), 병합(mergence) 및 세포 입장(cell entry)과 관련된 분자적 메커니즘을 조사했다. 내인성 막 융합 단백질 Syncytin-1은 HMEC, 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브에서 발현되었다. HMEC에서 Syncytin-1의 일시적 낙다운(knockdown)은 사이토캡슐 튜브 연장(elongation), 연결(connection)을 유의하게 감소시켰지만, 사이토캡슐 개시(initiation)는 감소시키지 않았다(도 5d 내지 5f). 또한, 사이토캡슐 튜브가 연장되는 동안 Syncytin-1 단백질 수준이 증가하였다(도 5g). 이들 데이터는 Syncytin-1이 사이토캡슐 튜브 병합 및 세포 입장을 조절함을 나타낸다.

실시예 7: ITGB-2(integrin subunit beta-2)는 사이토캡슐 튜브의 발달(development)을 촉진함

인테그린은 세포 접착(adhesion), 부착(attachment), 이주(migration) 및 침입(invasion)에 필수적인 세포 표면 지지 분자이다. 본 발명자는 사이토캡슐 튜브의 발달 과정 동안, 26종의 인테그린 유전자 전사를 BM-MSC, HMECs 및 BCSCs에서 조사하였다. ITGB-2는 사이토캡슐 튜브 연장과정에 따라 크게 증가한다(도 6a). 또한, 유전자 특이적 shRNA를 이용한 ITGB-2의 일시적인 낙다운은, ITGA-8과 달리 사이토캡슐 튜브의 연장을 상당히 감소시킨다(도 6b). 이들 데이터는 ITGB-2가 세사이토캡슐 튜브 내에서 세포 이동을 매개하고 사이토캡슐 튜브의 연장을 조절한다는 것을 나타낸다.

요약하면, 본 발명은 단일 세포가 2개의 신규한 소기관인 세포 외 및 막성 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하고, 이러한 사이토캡슐 튜브가 3D 세포 수송을 위한 튜브형 프리웨이(freeway)를 제공한다는 것을 제시한다. 다세포 유기체에서의 세포 운동은 배아 발생, 조직 형성, 기관 항상성, 면역 반응, 상처 치유, 조직 재생 및 종양 전이에 중요하다.

사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성과 발달은 3D 환경과 세포 활동에 크게 의존하며, 본 연구에서는 3D 매트릭스의 생화학, 생물 물리학 및 생체역학 특성 (예를 들어, 중합, 밀도 및 점탄성)이 정확하게 통제되는 방식인 경우에만 이들이 명확하게 된다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 시공간적 외관(temporospatial appearance), 자가 저하(self-degradation) 및 자동 분해(auto-decomposition)는 모두 이전에 보고된 바 없는 이러한 소기관을 인지하고 인식하는 것을 어렵게 만든다.

사이토캡슐 막은 세포 접착, 부착, 분리, 형태학적 이행(morphological transition) 및 운동 가소성(motility plasticity)를 지지하는 실체적인 생체-막성 스캐폴드(bio-membranous scaffolds)를 제공한다. 반면에, 사이토캡슐은 세포를 둘러싸고, 엄격하게 구형인 세포가 이완된 불규칙한 형상으로 상호전환할 수 있도록하는 사이토캡슐 외 미세환경으로부터 이들 세포를 보호하며, 환경적인 스트레스들에 대한 보호성 덮개로서 작용할 수 있다. 사이토캡슐 튜브는 다수의 세포의 양방향성 운동 및 지시된 이주를 수용할 수 있는 막성 튜브를 공급한다. 더욱 중요하게는, 사이토캡슐 튜브는 상호연결되고, 세포 이주 방향을 증가시키고, 세포 확산 영역을 증폭시키며, 지시된 3D 세포 이주 효율을 늘리는 튜브형 네트워크를 형성한다. 비록, 높은 세포 밀도에서의 세포 접촉은 사이토캡슐 형성을 감소시키고, 사이토캡슐 분해를 증가시키며, 사이토캡슐 튜브 지속 기간을 감소시키기는 하지만, 여전히 사이토캡슐을 형성하고 다수의 세포의 지시된 이주를 위한 긴 캡슐형 튜브를 형성하는 약 1.2‰의 정상 세포(HMECs) 및 1.1%의 유방암 줄기세포가 있다. 따라서, 모든 세포가 in vivo에서, 밀집되고 이종성인 3D ECM 및 세포로부터 유래되는 이종성 장애물에 불가피하게 노출되고 이를 경험하는 형태와 비교하여, 적어도 대체적인 방식으로서 적은 비율의 세포가 다수의 세포의 지시된 운송을 위한 하이웨이(highway)로서 작용하는 동종 막성 사이토캡슐 튜브를 형성하는 형태가 효율적인 것이다. 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 다방면의 생물학적 기능 및 추가적인 연구가 필요한 다른 기능들에 대한 잠재력을 보여준다.

사이토캡슐의 확장은 관 내(intraluminal) 세포의 활동에 의존하며, 무세포성 사이토캡슐은 성장을 종료한다. 반면에, 무세포성 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 신속한 자동 분해 및 자가 저하를 진행한다. 세포 내 소기관뿐만 아니라, 진핵세포는 미세환경으로 방출되거나 또는 보관되는 엑소좀과 같은 세포 외 소기관을 포함한다(Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, & Altevogt P (2006) Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function. Immunology letters 107(2):102-108)). 흥미롭게도, 사이토캡슐 튜브 관 내에는 단층막으로 둘러싸인 다양한 종류의 소낭(vesicle)이 있다. 따라서, 이러한 막성 소낭들은 세포 유래의 사이토캡슐 구성성분을 배송/운송하는 운반체(carrier) 또는 화물(cargo)과 기능적으로 연결될 수 있고, 방출되었을 때 철저하게 조절되고 있는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 자동 분해를 야기하는 용해물을 포함하고 있는 저장물(container)과도 연결될 수 있다.

세포화(ecellularization) 이후에, 무세포성 사이토캡슐이 쪼그라들고, 수축하며, 오목하게 되고, 짧아지며, 뒤틀리고 접힌 가닥이 되는 현상은 사이토캡슐 튜브의 내에 관 내(intraluminal) 골격이 부재하는 것과 일치한다. 사이토캡슐 튜브 관 내에 미세섬유(microfilament) 네트워크의 부재는 단일 및 다수의 세포가 활발하게 사이토캡슐 튜브 내에서 이주하는 것에 대응된다. 반면에, 사이토캡슐 튜브 막 아래의 미세섬유 스캐폴드의 존재는 긴 사이토캡슐 튜브가 파손, 방해 또는 차단 없이 ECM 표면을 가로질러 세포에 의해 끌려갈 수 있다는 것과 대응된다.

사이토캡슐 내에서 세포의 이주는 사이토캡슐 막의 변형 및 연장, 그리고 사이토캡슐 튜브의 형성 및 연장을 야기한다. 막(membrane)과 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브 내 다른 구성성분들의 구축은 매우 다양한 종류의 단백질을 필요로 하며, 이는 mRNA 번역 및/또는 단백질 생합성이 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 발달에 필수적이라는 것을 제시한다.

요약하면, 본 발명에서 공개하는 2개의 새로운 소기관인 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 세포 운송, 재배치 및 이주를 위한 튜브형 경로 및 네트워크의 제공을 포함하는 다방면의 생리학적 활성을 제공하며, 이는 세포 보호 및 종양의 전이를 포함하는 질병의 발달과 병인에 포함된 과정인 전위(translocation)의 기전을 이해하는데 필요한 통찰력을 제공해 줄 것이다.

실시예 8: 실험물질 및 방법

세포 및 시약: 1차 정상 인간 유방 상피 세포(Primary normal human mammary epithelial cells, HMECs)는 ATCC(PCS-600-010^TM)에서 구매하였다. HMLER의 BCSCs (CD44^high/CD24^low)^FA 서브파퓰에이션 세포는 기존에 공지된 방법에 따라 준비하였다. FITC-컨쥬게이트 anti-CD44 (BD Biosciences; G44-26) 항체 및 phycoerythrin-컨쥬게이트-anti-CD24 (BD Biosciences, ML15) 항체는 유세포분석을 통한 세포 분석을 위해 사용되었다. MEGM^TM 유방 상피세포 성장 배지 BulletKit^TM (Clonetics^TM MEGM^TM 유방 상피세포 성장 배지 plus SingleQuots^TM Kit package) 은 Lonza (CC-3150)로부터 구매하였다. Matrigel^TM Membrane Matrix (CB-40234)는 Corning으로부터 구입하였다. BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced (GFR, catalog number 356230) 는 BD Bioscience로부터 구매하였다.

타입랩스(time-lapse) DIC 현미경, 트랜지언트 트랜스펙션(transient transfection), 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative real-time PCR) 및 트랜지언트 유전자 낙다운(transient gene knockdown): 사이토캡슐 연장 및 세포 이주의 타임랩스 DIC(differentiation iterference contrast) 현미경 분석은 니콘 Ti 구동 역상 현미경(Nikon Ti motorized inverted microscope) 및 20X 렌즈가 구비된 디지털 Hamamatsu　ORCA-ER 쿨드 CCD 카메라를 이용하여 수행되었다. 마트리겔 매트릭스 (>40μm 두께) 내에서 사이토캡슐과 함께 배양된 HMEC는 TEM으로 분석하였다. EGFP-hPMCA2z/b의 플라스미드 (Addgene, #47584) 및/또는 mCherry-beta-actin (#54967)는 lipofectatine® 2000을 이용하여 HEMCs에 공-트랜스펙션(co-transfected)하였다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응은 유전자 특이적 프라이머(IDT Company), iQ SYBR®　Green Supermix (Bio-Rad), 및 7900HT　Fast　Real-Time PCR을 이용하여 수행하였다.

시약 및 항체: EGFP-hPMCA2z/b (#47584) 및 mCherry-beta-actin (#54967) 플라스미드는 Addgene으로부터 구입하였다. Anti-GAPDH (catalog number 2118S, 1:1000 희석, 웨스턴 블롯) 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하여 사용하였다. DAPI (4, 6-diamidine-2-phenylindole, dihydrochloride, 1:1000 dilution in immunofluorescence assay) KPL에서 구입하여 사용하였다. Anti-γ-Actin (gamma Actin, monoclonal, ab123034, 1:1000 희석, 면역형광염색), Anti-pan-Cadherin (polyclonal, ab140338, 1:1000 dilution in immunofluorescence assay) 항체는 Abcam에서 구입하여 사용하였다.

트랜지언트 트랜스펙션(transient transfection): HMECs는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 MEGM에 배양하였다. EGFP-hPMCA2z/b의 플라스미드 (Addgene, #47584) 및/또는 mCherry-beta-actin (#54967)는 lipofectatine® 2000을 이용하여 매뉴얼에 따라 HEMCs에 공-트랜스펙션(co-transfected)하였다. 트랜스펙션 2일 후에, 세포를 분석에 사용하였다.

사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 발달: 트랜스펙션이 되거나 되지 않은 HMEC, BM-MSC, 및 HMLER(CD44^high/CD24^low)^FA 의 BCSCs 서브파퓰레이션(subpopulation을 지시된 세포 밀도(만약, 지시되어 있지 않다면, 6-웰 플레이트에 5 x 10² 세포/웰, 또는 10cm 디쉬에 1.2 x 10⁴ 세포의 밀도)로 MEGM 배지 내 마트리겔 매트릭스 위에 플레이팅 하였다. 상기 3D 마트리겔층(>40 μm 두께)은 차갑고 해동된 마트리겔 매트릭스(4^oC 냉장실에서 밤샘 해동함, 단백질 농도는 4 내지 12mg/ml)를 미리 차갑게 준비한 6-웰 플레이트(차가운 마이크로 커버글라스와 함께, 또는 없이)에 빠르게 주입함으로써 준비하였고, 이후에 차가운(4^oC) MEGM을 첨가하고 후드 내, 상온(25^oC)에서 2 내지 25분간 배양하였다. 그 다음에, 세포를 상기 3D 마트리겔 표면에 이식하였고, 37^oC, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 다양한 층의 마트리겔 내의(또는 내부로 침투한) 세포는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하였다. 상기 발달된 다양한 단계(stage)의 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 실험에 사용하였다.

타입랩스 DIC 현미경 및 영상: 사이토캡슐 연장 및 세포 이주의 타임랩스-DIC(differentiation interference contrast) 현미경 분석은 니콘 Ti 구동 역상 현미경(Nikon Ti motorized inverted microscope) 및 20X 렌즈가 구비된 디지털 Hamamatsu　ORCA-ER 쿨드 CCD 카메라를 이용하여 수행되었다. 타입랩스 현미경은 DIC, 위상차(phase contrast), 및 epi-fluorscence 광학, Prior Proscan III 구동 스테이지 및 셔터, perfect focus system 및 OkoLab 37^oC, 5% CO₂ 케이지 현미경 인큐베이터(OKO Lab)이 구비되어 있다. 이미지는 10 내지 36시간에 걸쳐 매 30초마다 획득하였다. 모든 이미지는 MetaMorph 소프트웨어를 이용하여 수득하였다. 2시간의 사이토캡슐 연장에 의해 만들어진 트랙은 MetaMorph 및 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 수득하였다. 사이토캡슐 연장 속도는 길이 및 시간 측정을 통해 계산하였다. 영상은 타임랩스 및 MetaMorph 소프트웨어를 통해 얻어진 이미지(15 프레임/초, fps)를 통해 준비하였다.

이미지 획득: 고정된 세포(사이토캡슐이 있는/또는 없는)의 DIC(differential interference contrast) 및 형광 이미지는 80i 정립현미경 및 20X 또는 40X 렌즈가 구비된 디지털 Hamamatsu　ORCA-ER 쿨드 CCD 카메라를 이용하여 획득하였다. 브라이트 필드 위상차 이미지(bright field phasse contrast image)는 니콘 디지털 카메라를 이용하여 획득하였다. 사이토캡슐 개시 비율(cytocapsula initiation ratio)/high performance field(HPF, 200X) 및 연장된 사이토캡슐의 숫자/HPF를 정량하였다. 모든 이미지는 MetaMorph 이미지 획득 소프트웨어를 이용하여 얻었으며, ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.

총 RNA 추출 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응: TRIzol(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 검출이 가능한 사이토캡슐이 있거나 없는 HMECs 및 BCSCs(1.2 Х 10⁴ 세포/10cm 디쉬)로부터 지시된 시간에 총 RNA를 추출하였다. 사용된 샘플은 마트리겔 매트릭스 층(약 10μm 두께)에 플레이팅된 것이다. 총 RNA는 매뉴얼에 설명된 방법에 따라 추출하였다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응은 유전자 특이적 프라이머(IDT company), iQ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad), 및 7900HT Fast Real-Time PCR 을 이용하여, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. GAPDH를 대조군으로 이용하였으며, 세 번의 독립적인 실험이 수행되었다. 데이터 분석 및 시트맵 도면은 종래 보고된 방법에 따라 계산되고 준비되었다.

웨스턴 블로팅: RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 버퍼(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) 및 프로테아제 저해제(Roche)를 이용하여, 지시된 시간에 총 단백질을 사이토캡슐이 있거나 없는 HMECs 및 BCSCs(1.2 Х 10⁴ 세포/10cm 디쉬)로부터 추출하였다. 사용된 샘플은 마트리겔 매트릭스 층(약 10μm 두께)에 플레이팅된 것이다. 상기 총 단백질은 10% 또는 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 통해 전기영동 하였으며, 폴리비닐리딘 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) immobilon^TM-P 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 폴리비닐리딘 디플루오라이드 멤브레인을 1차 항체(Anti-GAPDH (Cell signaling Technology, 2118, 1:1000))로 4℃에서 4시간 동안 처리하고, 0.1% Tween/TBS로 세척하였다. 멤브레인을 peroxidase-컨쥬게이션된 2차 항체로 25℃에서 1시간 동안 처리하고, 신호 검출 이전에 3차례 세척하였다. ECL^TM웨스턴 블로팅 검출 시약을 사용하여 디벨롭 했다.

정량 및 통계학적 분석: 모든 도면에서 ns: 통계학적 유의성 없음, P > 0.05; * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.

다른 실시예들이 당업자에게 명백할 것이다. 전술한 설명은 명확성을 위해 제공된 것이며 단지 예시적인 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 사상 및 범위는 상기 예에 한정되지 않고, 다음의 청구범위에 포함된다. 상기 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 참고로 포함된 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함된다.

Claims

3D 매트릭스 및 사이토캡슐(cytocapsulae) 및 사이토캡슐 튜브(cytocapsular tubes)를 포함하는 조성물로서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 1 내지 6℃ 사이에서 3D 매트릭스 상부 위에 단일 세포 현탁액을 이식하고, 상기 단일 세포 현탁액의 세포를 4 내지 37℃에서 배양함으로써 형성되며, 상기 단일 세포 현탁액의 세포는 인간 유방 상피세포(HMECs) 또는 유방암 줄기 세포(BCSCs)를 포함하고, 상기 3D 매트릭스는 마트리겔인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는 상기 세포를 둘러싸고 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 주변 환경(surrounding environment)으로부터 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브 내로 들어가는 다수의 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 세포가 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 생분해성(biodegradable)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycans), 또는 비-프로테오글리칸 다당류(non-proteoglycan polysaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 프로테오글리칸은 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 및 케라틴 설페이트(keratin sulfate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 비-프로테오글리칸 다당류는 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 섬유성 단백질(fibrillary protein), Facit 단백질(Facit protein), 단쇄 단백질(short chain protein) 및 기저막 단백질(basement membrane protein)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 FAK(focal adhesion kinase), 탈린(talin), 빈쿨린(vinculin), 팍실린(paxillin), α-액티닌(α-actinin), 및 GTPase을 포함하는 신호 단백질(signal proteins)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 3D 매트릭스의 중합(polymerization), 밀도(density), 단백질 농도(protein concentration), 및 점탄성(viscoelasiticity)은 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 1 내지 6℃ 사이에서 3D 매트릭스의 상부 위에 단일 세포 현탁액의 세포를 이식하는 단계로서, 상기 단일 세포 현탁액의 세포는 HMECs 또는 BCSCs를 포함하고, 상기 3D 매트릭스는 마트리겔인 단계; 및
(b) 상기 3D 매트릭스의 상부 위에 이식된 단일 세포 현탁액의 세포를 4 내지 37℃에서 배양함으로써 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 생성하도록 하는 단계를 포함하는 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 in vitro 형성 방법.
삭제
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 이식 전에 동결 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 이식은 2 내지 4℃ 사이의 온도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 생분해성인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycans), 또는 비-프로테오글리칸 다당류(non-proteoglycan polysaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 프로테오글리칸은 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 및 케라틴 설페이트(keratin sulfate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 비-프로테오글리칸 다당류는 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 섬유성 단백질(fibrillary protein), Facit 단백질(Facit protein), 단쇄 단백질(short chain protein) 및 기저막 단백질(basement membrane protein)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 FAK(focal adhesion kinase), 탈린(talin), 빈쿨린(vinculin), 팍실린(paxillin), α-액티닌(α-actinin), 및 GTPase을 포함하는 신호 단백질(signal proteins)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스의 중합(polymerization), 밀도(density), 단백질 농도(protein concentration), 및 점탄성(viscoelasiticity)은 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스의 두께는 3 내지 100㎛ 사이의 두께인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는 세포를 둘러싸고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브를 형성하는 둘러싸인 세포의 퇴장(exit)을 허용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브는 주변 환경(surrounding environment)으로부터 다수의 세포의 입장(entry)을 허용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 세포는 이식 전에 1 ⅹ 10 내지 1 ⅹ 10⁵ 세포/ml 사이의 밀도의 단일 세포 현탁액으로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 막은 원형질막 단백질(plasma membrane protein) Ca2+ ATPase2를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 신시틴-1(syncytin-1)이 사이토캡슐 튜브의 병합(mergence) 및 세포의 입장(cell entry)을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, ITGB-2가 사이토캡슐 튜브 내에서 세포의 이주(migration)를 매개하고 및 사이토캡슐의 연장(elongation)을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스의 중합, 단백질 농도, 듀로탁시스(durotaxis), 밀도 및 점탄성은 상기 사이토캡슐 및 사이토캡슐 튜브의 형성에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 3D 매트릭스는 생리활성(bioactive) 및/또는 생리비활성(bioinactive) 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제14항에 있어서, 상기 이식 전에 상기 3D 매트릭스를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 방법.