DK171118B1 - Syntetisk peptid udvisende den for VP1-proteinet fra mund-og-klovsygevirussen karakteristiske antigenicitet, vaccine samt diagnostisk testsystem omfattende samme - Google Patents

Description

i DK 171118 B1

Opfindelsen angår syntetiske peptider, som udgør den immunogene determinant (de immunogene determinanter) på et immunologisk vigtigt kappeprotein, VP1, hos mund-og-klovsygevirus og anvendelsen af disse peptider til fremstilling af vacciner og diagnostiske reagenser.

5 I søgningen efter mere effektive midler til at beskytte mod infektive sygdomme hos mennesker og dyr er der gjort store fremskridt indenfor den sidste dekade. Det er nu klart, at immunisering er muligt under anvendelse af en isoleret bestanddel fra hele det tilgrundliggende middel, såsom for eksempel i influenzavirus sub-10 unit vacciner.

Nuværende bestræbelser er rettet imod at reducere størrelsen af den immuniserende bestanddel yderligere, først til det polypeptid (protein), der bærer det nødvendige triggersignal for immunsystemet og dernæst til selve triggersystemet. Rekombinant-DNA-teknologi har 15 ved translation fra de fastlagte nukleotidsekvenser tilvejebragt midler til at opnå pålidelige aminosyresekvenser for biologisk vigtige proteiner indbefattende sådanne proteiner, som ikke er let tilgængelige udfra naturlige kilder. Metoden til at identificere de loci på et protein, som udgør triggermekanismen eller den immunogene 20 determinant, er imidlertid sparsomme og meget tidskrævende og udgør flaskehalsen for yderligere hurtige fremskridt.

Bestemmelsen af den immunogene determinant (de immunogene determinanter) for biologisk vigtige proteiner, navnlig proteiner hidrørende fra de tilgrundliggende midler for den infektive sygdom 25 hos mennesker og dyr, betragtes som værende af speciel vigtighed eftersom når disse determinanter er blevet identificeret kan de enkelt og økonomisk syntetiseres til tilvejebringelse af de ønskede peptidsekvenser til brug i vacciner, som vil have en høj grad af specificitet, og som vil medføre, at man undgår uønskede virkninger 30 fra unødvendige aminosyrer- eller peptidsekvenser, som stadig kan være til stede i for eksempel vacciner af sub-unittypen.

Immunogeniciteten af et polypeptid kan defineres som det immunsvar, der er rettet mod et begrænset antal immunogene determinanter, som er begrænset til nogle få loci på polypeptidmolekylet 35 (se Crumpton, M.J, i The Antigens (ed. Sela, M. Academic Press, New York, 1974); Benjamini, E. et al., Curr. Topics Microbiol, Immunol.

58, 85-135 (1972) og Atassi, M.Z., Immunochemistry 12, 423-438 (1975)). Antisera frembragt mod kemisk syntetiserede peptider svarende til en kort liniær strækning af polypeptidsekvensen har 2 DK 171118 B1 vist sig at reagere med hele polypeptidet (se Green N. et al., Cell 2§, 477-487 (1982); Bittie, J.L. et al., Nature 298, 30-33 (1982); Dreesman et al., Nature 295, 158-160 (1982); Prince, A. Μ., I kram, Η., Hopp, T.P., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 79, 579-582 (1982); Lerner, 5 R.A. et al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 78, 3403-3407 (1981) og Neurath, A.R., Kent, S.B.H., Strick, N., Proc.Nat. Acad.Sci. USA Z2, 7871-7875 (1982).). Interaktioner har imidlertid vist sig at finde sted selv når i nterakti onsstedet ikke korrel erer med de immunogene determinanter på det native protein (se Green N., et al, se oven-10 for). Omvendt følger, at eftersom antistoffer frembragt mod det native protein per definition er rettet mod de immunogene determinanter følger der heraf, at et peptid, som interagerer med disse antistoffer, må indeholde mindst en del af en immnugen determinant.

På baggrund af et studie over få proteiner, for hvilke de 15 immunogene determinanter er blevet nøjagtige kortlagt, er det klart, at en determinant kan bestå af en enkel sekvens (kontinuerlig) eller adskil 1 lige sekvenser (diskontinuerlig) sammenbragt fra liniært fjerntliggende områder af polypeptidkæden ved foldning af denne kæde i den native tilstand (se Atassi, M.Z., Immunochemistry 15^. 909-936 20 (1978).). Som det er tilfældet med lysozym består adskillige af elementerne af kun en aminosyre, idet størrelsen af et bidragende element kan variere mellem 1 og det maximale antal aminosyrer, som er konstistent med dimensionerne af antistofkombineringsstedet og er sandsynligvis af størrelsesorden 5 til 6 (se Atassi, Μ. Z., se 25 ovenfor). Enhver systematisk kortlægning af alle påviselige antigenelementer i et polypeptid ved kemisk syntese og overlappende segmenter og måling af deres efterfølgende reaktivitet med antisera fremstillet mod det native protein har indtil nu været alvorlig begrænset af den syntese og afprøvningskapacitet, der er nødvendig 30 (se Atassi, M.Z., se ovenfor, og Kazim, A.L., Atassi, M.L., Biochem.

J. 191, 261-264 (1980)).

Den præcise lokalisering af immunogene determinanter i aminosy-resekvensen hos nogle få proteiner er blevet udført ved hjælp af en eller flere af følgende måder: (1) måling af antigenicitet af hele 35 polypeptidet eller peptidfragmentet isoleret herfra før og efter kemisk modifikation af specifikke aminosyrerester: (2) lokalisering af positionen inden i polypeptidaminosyresekvensen af substitutioner, udvalgt ved at dyrke den virus, der udtrykker proteinet i nærværelse af monoklonale antistoffer, og (3) syntese og afprøvning 3 DK 171118 B1 af peptider, der er homologe med aminosyresekvensen i områder, der formodes at have immunogen aktivitet. Den sidste metode giver formodentlig de bedste muligheder for en omfattende fremgangsmåde; syntesen og oprensningen af talrige peptider kræver imidlertid stor 5 ekspertise og megen tid. Smith, J.A. et al, Immunochemistry 14, 565-568 (1977) undgik afkoblingen og oprensningstrinene ved at kombinere fastfasepeptidsyntese og fastfaseradioimmunassay under anvendelse af den samme faste bærer (se også Hurrell, J.G.R. Smith, J.A., Leach, S.J., Immunochemistry 15, 297-302 (1978)). Med denne 10 fremgangsmåde var de i stand til at bekræfte lokaliseringen af de kontinuerlige immunogene determinanter hos de to proteiner. Selv med denne forenklede fremgangsmåde vil imidlertid enhver systematisk scanning for antistofbindingsaktivitet hos alle mulige hexapeptider udfra endog et forholdsvis lille protein, såsom virus protein 1 15 (VP1) fra mund-og-klovsygevirus (FMDV), som vides at have 213 aminosyrer, tage uacceptabel lang tid.

FMD-virusen, som tilhører apthovirusslægten af familien Picor-naviridae, består af en ordnet aggregation af strukturelt uafhængige sub-units omgivende et molekyle af infektiøs DNA. Under forholdsvis 20 milde betingelser disaggregerer hele partiklen let til frembringelse af nøgen RNA, 60 kopier af VP4-polypeptidet og 12 sub-units bestående af en ordnet opbygning af fem kopier af polypeptiderne VP1, VP2 og VP3. Hver af disse strukturelle sub-units kan yderligere nedbrydes til frembringelse af de isolerede komponentproteiner. VPl-prote-25 inet hos FMD-virusen har vist sig at være et immulogisk vigtigt kappeprotein hos virusen.

Ved at følge udviklingen af nye metoder for fastfasesynteser af peptider er det nu blevet muligt at udvikle en fremgangsmåde til samtidig syntese af hundrede af peptider på faste bærere. Interak-30 tion mellem syntetiserede peptider og antistoffer påvises herefter let uden at fjerne dem fra bæreren. En foretrukken fremgangsmåde til fastfasesyntese ifølge den foreliggende opfindelse omfatter anvendelsen af et polymert materiale, såsom polyethylen eller polypropylen som fastfasebæreren, på hvilken der podepolymiseres en vinylmo-35 norner indeholdende mindst en funktionel gruppe til frembringelse af polymere kæder på bæreren. De funktionelle grupper på disse polymere kæder omsættes derefter til frembringelse af primære eller sekundære aminogrupper på kæderne, og disse aminogrupper omsættes derefter sekventielt med aminosyrerester i en hensigtsmæssig rækkefølge til 4 DK 171118 B1 opbygning af et ønsket syntetisk peptid. Bæreren findes fortrinsvis i form af en fast polymerstav med en diameter på ca. 4 mm og en længde på ca. 50 mm. Et antal af sådanne stave kan anbringes i en egnet holder i et 12 X 8 gitter, hvis dimensioner svarer til dimen-5 sionerne for den standard mikrotiterplade, der anvendes til ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays).

Som følge af et arbejde, der nu er udført under anvendelse af ovennævnte teknik, er peptider, som udgør immunogene determinanter på VP1-kappeproteinerne hos en række vigtige serotyper af mund-og-10 klovsygevirusen, blev identificeret og syntetiseret kemisk.

Note: i den foreliggende beskrivelse vil aminosyrerester blive angivet med tre-bogstaver-forkortelsen eller enkelt koden på følgende måde: 15 Tre-bogstav- Et-bogstav-

Aminosyre forkortelse symbol

Alanin Ala A

Argi nin Arg R

20 Asparagin Asn N

Asparaginsyre Asp D

Cystein Cys C

Glutamin Gin Q

GIutaminsyre Glu E

25 Glycin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

30 Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonine Thr T

35 Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

5 DK 171118 B1

Den foreliggende opfindelse angår således et syntetisk peptid, som udviser den for VPl-proteinet fra mund-og-klovsygevirus karakte-riske antigenicitet, hvilket peptid er ejendommeligt ved, at mindst en del af peptidet udvælges blandt fem, seks eller syv aminosyre 5 lange, antigenaktive aminosyresekvenser fra VPl-proteinet og antigenaktive, modificerede sekvenser heraf, enten type Oj, hvor peptidet omfatter en aminosyresekvens udvalgt blandt: (i) G-D-L-Q-V-L-A; 10 (ii) G - D - L - Q - V - L; (ii) D-L-Q-V-L-A; (iv) D - L - Q - V - L; navnligt hvor mindst en del af peptidet udvælges blandt hexapeptid-15 sekvenser baseret på formlen: G - D - L - Q - V - L (1) (2) (3) (4) (5) (6) hvor: 20 G ved position (1) erstattes med A, Η, I, K, Μ, N, P, Q, S eller T, eller D ved position (2) erstattes med A, C, E, F, G, Η, I, K,

L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V eller Y, eller 25 Q ved position (4) erstattes med D, K, A, Μ, E, N, S

eller R, eller V ved position (5) erstattes med A, D, E, F, I, K, L, Μ, N, Q, R, S, T eller Y, eller 30 type Ajq (Agl), hvor peptidet omfatter en aminosyresekvens udvalgt blandt: (i) G - D - L - G - S - I - A; (ii) G - D - L - G - S - I; 35 (iii) D - L - G - S - I - A; (iv) D - L - G - S - I; navnligt hvor mindst en del af peptidet udvælges blandt hexapeptid-sekvenser baseret på formlen: 6 DK 171118 B1 G - D - L - G - S - I (1) (2) (3) (4) (5) (6) hvor: 5 G ved positionen (1) erstattes med A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y, eller D ved position (2) erstattes med l, eller G ved position (4) erstattes med A, eller S ved position (5) erstattes med T, G eller A eller

10 I ved position (6) erstattes med A, C, D, E, F

K, L, M, Q, R, S, T, V, W eller Y, eller type Cj, hvor pepti det omfatter en aminosyresekvens udvalgt blandt: 15 (i) D - L - A - H - L - T - A; (ii) D - L - A - H - L - T; (i i i) L-A-H-L-T-A; (iv) L - A - H - L - T; 20 navnligt hvor mindst en del af peptidet udvælges blandt hexapeptid-sekvenser baseret på formlen:

D - L - A - H - L - T

25 (1) (2) (3) (4) (5) (6) hvor: D ved position (1) erstattes med H eller V, eller, 30 H ved position (4) erstattes med A, C, D, E, F, K, L, Μ, N, Q, R, S, T, V eller Y, eller T ved position (6) erstattes med S.

Ved tilvejebringelse af den foreliggende opfindelse er den samtidige kemiske syntese af alle mulige hexapeptider repræsenterende de totale sekvenser af VPl-kappeproteinerne hos FMD-virus, type 0j, Aj0 (eller Agj) og Cj, med overlap af fem aminosyrer mellem peptider i sidestilling i sekvensen, blev udført under anvendelse af den ovenfor beskrevne fastfasesyntesemetode. De syntetiske peptider 7 DK 171118 B1 er, medens de stadig er fæstnede til den bærer, der er anvendt til syntesen, blevet afprøvet for antistofbindende aktivitet ved ELISA til frembringelse af en fuldstændig kortlægning af alle reaktive sekvenser i VP1-proteinerne med en opløsning på 6 aminosyrer. En 5 peptidlængde på 6 aminosyrer blev udvalgt udfra følgende faktorer: 1. Antistofinteraktioner med hexapeptider er blevet påvist, 2. jo længere et peptid er, jo større er muligheden for, at det folder med en sekundær struktur, hvilken foldning ikke nød- 10 vendigvis er den, som finder sted i det native protein, 3. under syntesen falder udbyttet af det ønskede peptid med et stigende antal koblingsreationer, 4. jo mindre den syntetiserede sekvens er, jo større er præcisionen til specificeringen af bindinger af en påvist aktiv 15 sekvens i hele sekvensen.

Som anført ovenfor er peptiderne ifølge den foreliggende opfindelse karakteriseret ved at mindst en del af peptidet indeholder en aminosyresekvens udvalgt blandt de ovenfor beskrevne grupper (i) til (iv). Afprøvninger, som er blevet udført, navnlig under 20 anvendelse af ELISA-teknikken har påvist aktiviteten af disse aminosyresekvenser ved reaktivitet med antisera. Det skal imidlertid bemærkes, at skønt de syntetiske peptider ifølge den foreliggende opfindelse kan omfatte sekvenser, som kun er 5, 6 eller 7 aminosyrer lange, dækker den foreliggende opfindelse også syntiske peptider, i 25 hvilke en eller flere aminosyrer er inkluderet på den ene eller anden side af den definerede sekvens, dvs. enten på carboxyl-enden (-COOH) eller på amino-enden (-NI^) eller begge steder. Skønt sådanne yderligere aminosyrer måske ikke spiller en direkte rolle i at forøge den definerede aminosyresekvens immunogene aktivitet kan 30 de for eksempel fungere som spaceraminosyrer til at adskille den antigenaktive aminosyresekvens fra den frie carboxyl syre-ende og/eller den frie amino-ende i sekvensen.

Efter identifikation af de antigenaktive aminosyresekvenser i VP1-proteinerne er de modifierede sekvenser ifølge den foreliggende 35 opfindelse blevet syntetiseret i lighed hermed og afprøvet under anvendelse af ELISA-teknikken. Som anført ovenfor blev hver af disse modificerede sekvenser afledt ved at erstatte en aminosyre i den oprindelige sekvens med en anden aminosyre.

Peptiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan syntetiseres 8 DK 171118 B1 kemisk udfra aminosyrebestanddelene. Denne syntese kan for eksempel udføres ved Merrifield-fastfasemetoden som beskrevet i J.A.C.S 85: 2149-2154 (1963). I Merrifield fastfasemetoden fæstnes den C-termi-nale aminosyre til chlormethylerede polystyrendi vinyl benzencopoly-5 merkugler. Hver efterfølgende aminosyre, om nødvendigt med en egnet beskyttende gruppe, tilsættes derefter sekventielt til den voksende kæde. Som beskrevet i Merrifield-artiklen kan beskyttelsesgruppen for eksempel være en t-butyloxycarbonylgruppe eller en carbobenzoxy-gruppe. Ved kobling, fjernelse af beskyttelsesgruppen og kobling af 10 den næste aminosyre kan den ønskede aminosyresekvens og kædelængde frembringes. Som et sluttrin fjernes beskyttelsesgruppen fra den N-terminale aminosyre, og den C-terminale aminosyre spaltes fra bærerkuglerne under anvendelse af et hensigtsmæssigt reagens såsom trifloureddikesyre og hydrogenbromid.

15 Syntesen kan alternativt udføres ved fastfasemetoden, hvor den syntetiske peptidstruktur opbygges på en fastfasebærer, som omfatter et polymert materiale, for eksempel en polyethylenstav, hvortil er podet en polymeriseret vinylmonomer, for eksempel ved q-bestråling af acrylsyre-, acrylonitril eller acrylamidmonomerer. En monobe-20 skyttet biamin, såsom lysin eller lysin-alanin omsættes derefter med den polymere kæde frembragt på førstfasebæreren, og et syntetisk peptid opbygges derefter ved sekventiel omsætning med aminosyrer på samme måde som i den ovenfor beskrevne Merrifieldmetode.

Det skal bemærkes, at skønt det sidste trin i begge de ovenfor 25 omtalte metoder er fjernelsen af det syntetiske peptid fra fastfase-bæren eller støttematerialet ved en spaltningsreaktion under anvendelse af et egnet reagens er det for nogle anvendelser af peptiderne ifølge den foreliggende opfindelse hensigtsmæssigt, hvis ikke essentielt for de kemisk synteciserede peptider at blive anvendt i 30 form af et produkt, i hviket peptidet er koblet eller bundet til en fastfasebærer eller et fastfasestøttemateriale. For sådanne anvendelser undlades naturligvis det sidste spaltningstrin. Sådanne antigenaktive, kemisk syntetiserede peptider, som er immobil i serede på en fastfasebærer eller et fastfasestøttemateriale, er specielt 35 anvendelige til udførelse af immunokemiske assays, såsom enzym-immonoassay (EIA).

De immunogene, syntetiske peptider ifølge den foreliggende opfindelse kan tilvejebringe den basis, hvorpå dannelsen af syntetiske vacciner mod mund-og-klovsygevirus kan udvikles. Sådanne 9 DK 171118 B1 syntetiske vacciner vil navnlig have værdi for så vidt som de kan fremstilles til at være uden aminosyresekvenser svarende til hele aminoyresekvenserne for viralproteinet og også fri for biologisk fremstillet materialer og for aktive eller inaktiverede virale 5 rester. Anvendelsen af syntetiske peptider som basis for vacciner omtales for eksempel af Beale, J. i Nature 298, 14-15 (1982) og af Sutcliff, J.G. et al i Science 219, 650-666 (1982).

Opfindelsen angår således også en vaccine til behandling af dyr mod infektion med mund-og-klovsygevirus, hvilken vaccine er ejendom- 10 melig ved, at den omfatter mindst et syntetisk peptid ifølge krav 1.

Ved frembringelsen af en syntetisk vaccine kan de syntetiske peptider ifølge den foreliggende opfindelse enten anvendes alene, i kombination og/eller i forbindelse med en fysiologisk acceptabel bærer og/eller adjuvant.

15 De syntetiske peptider ifølge den foreliggende opfindelse har også et potentiel for anvendelse i en række andre anvendelser indenfor det immunologiske område indbefattende anvendelse ved diagnostiske metoder og andre immunologiske testmetoder, navnlig i immunokemiske assays såsom enzym-immunoassays.

20 Opfindelsen angår derfor desuden et diagnostisk testsystem eller et andet immundogisk testsystem til påvisning in vitro af tilstedeværelsen af mund-og-klovsygevirus eller antistoffer mod mund-og-klovsygevirus, hvilket system er ejendommeligt ved, at det omfatter mindst et syntetisk peptid ifølge krav 1.

25 På tegningen viser:

Figur 1 opdeling af den 213 aminosyre lange sekvens for VP1 i hexapeptidenheder og syntese heraf på en polyethylenbærer,

Figur 2 (a-f) antigenprofiler for hexapeptider som lodrette linier proportionale med den opnåede ELISA-extinction over tallet, 30 der angiver lokaliseringen i VPl-sekvensen i den N-terminale peptid-aminosyre,

Figur 3 (a-b) antigenprofiler for hexapeptider, hvilke profiler er frembragt ved anvendelse af antiserum mod intakt viruspartikel type A10, 35 Figur 4 (a-b) antigenprofiler for hexapeptider, hvilke profiler er frembragt ved anvendelse af antiserum mod intakt viruspartikel type Cj,

Figur 5 strategien ved fremstilling af peptider indeholdende erstatningsaminosyrer, 10 DK 171118 B1

Figur 6 antigenprofiler for peptiderne indeholdende erstat-ningsaminosyrer.

Yderligere detaljer vedrørende peptidforbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse, fremgangsmåde til fremstilling og deres 5 antigenaktivitet illustreres ved de følgende eksempler: EKSEMPEL 1.

A. Fremstilling af hexapeptider.

10 Den 213 aminosyre lange sekvens for VP1 (FMDV, type 0j) som translateret af Kurz, C. et al, Nucleic Acid Research 9, 1919-1931 (1981) , blev opdelt i alle mulige hexapeptidenheder, og hver hexa-peptidenhed blev syntetiseret på en polyethylenbærer i samme orientering og med en 2 aminosyre lang spacer som illustreret på fig. 1.

15 Polyethylenstave neddykket i en 6% v/v vandig opløsning af acrylsyre blev bestrålet med q-stråling ved en dosis på 1 Mrad (se Muller-Schulte, D., Horster, F.A., Polymer Bulletin 7j_ 77-81 (1982) ). Under anvendelse af traditionelle metoder indenfor fastfa-sepeptidkemien (se Erickson, B.W., Merrifield, R.B. "The Proteins", 20 bind 2, 255-257, Academic Press, New York (1976); Meienhofer, J., in "Hormonal Proteins and Peptides", bind 2, 45-267, Academic Press,

New York (1973)), blev Na-t-butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester koblet til polyethylenpolyacrylsyren (PPA) via N-aminogruppen i sidekæden. Dette blev efterfulgt af koblingen af Boc-alanin til 25 færdiggørelse af en peptidlignende spacer. Aminosubstitution af bæreren blev bestemt ved at omsætte NHg-lysin (OMe)-PPA med C^-smørsyre og fandtes at være 8-10 nmol/stav.

Efterfølgende aminosyrer blev tilført ved traditionel fastfase-peptidsyntese som dikteret af den sekvens, der skal syntetiseres.

30 Efter afslutning af den sidste koblingsreaktion og efter fjernelse af t-butyloxycarbonyl (Boc) beskyttelsesgruppen blev den terminale aminogruppe acetyleret med eddikesyreanhydrid en blanding af dime-thylformamid (DMF) og tri ethylenamin. Alle dicyclohexylcarbodi-imid-mediierede koblingsreaktioner blev udført i DMF i nærværelse af 35 N-hydroxybenzotriazol. Følgende sidekædebeskyttende grupper anvendtes: 0-benzyl for treonin, serin, asparginsyre, glutaminsyre og tyrosin; carbonbenzoxy for lysin; tosyl for arginin; 4-methylbenzyl for cystein og l-benzyloxycarbonylamido-2,2,2,-trifluorethyl for histidin. Fjernelse af sidekædebeskyttelse blev udført med 11 DK 171118 B1 behandling med borontris (tri fluoracetat) i tri fluoreddikesyre i 90 minutter ved stuetemperatur (se Pless, J., Bauer, W., Angewante Chemie 85» 142 (1973)). Efter hydrolyse i HCl/propionsyre bekræftede analyse af sekvenser inkluderet i syntesen, at kobling ved hvert 5 trin havde fundet sted. Før afprøvning med ELISA blev de stavkoblede peptider vasket adskillige gange i i fosfatbuffret sal in (PBS).

B. Afprøvning af hexapeptider.

Antigenprofiler for hexapeptiderne fremstillet som beskrevet 10 under punkt A. ovenfor vises på fig. 2 som en lodret linie proportional med den opnåede ELISA-extinction over tallet, der angiver lokaliseringen i VPl-sekvensen i den N-terminale peptidaminosyre. De antisera der blev anvendt til at frembringe de forskellige viste profiler, var som følger: 15 (a) og (b) to forskellige antisera mod intakt viruspartikel, type °Γ (c) antisera mod intakt viruspartikel som anvendt i (b) efter absorption med oprenset komplet virus type Oj, 20 (d) antisera mod virus sub-unit, type Oj (e) anti-VPl, type 0j og (f) antisera mod intakte viruspartikler, type Cj.

Enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) blev anvendt til at afprøve hvert stavkoblet peptid (RCP) for reaktivitet med hver af de 25 ovenfor definerede antisera, hvilket er beskrevet nedenfor. De stavkoblede peptider blev præ-belagte med 10% hesteserum og 10% ovalbumin og 1% Tween-80 i PBS i 1 time ved 37°C for at blokere ikke-specifik absorption af antistoffer. Inkubering natten over ved 4°C i antiserumfortyndet 1/40 i præ-inkuberingsblandingen blev 30 efterfulgt af tre vask i 0,05% Tween-80/PBS. Reaktion i en time ved 37°C med det rette anti-kanin IgG immunoglobulin koblet til peber-rodperoxidase, fortyndet 1/50.000 i præinkuberingsblandingen, blev igen efterfulgt af grundig vask i PBS/Tween til fjernelse af overskydende konjungat. Tilstedeværelsen af antistof blev påvist ved 35 reaktion i 45 minutter med en farveudviklende opløsning (40 mg ortophenylendiamin, 20 μΐ hydrogenperoxid i 100 ml fosfatbuffer, pH

5,0), og den frembragte farve blev aflæst i et Titertekmultiscan ved 420 nm. Efter test blev peptiderne vasket tre gange ved 37°C i 8 M urinstof indeholdende 0,1% 2-mercaptoethanol og 0,1% 12 DK 171118 B1 natriumdodecylsul fat efterfulgt af adskillige vask i PBS til fjernelse af alle spor af bundet antistof. De stavkoblede peptider var derefter parat til yderligere afprøvning med forskellige antisera.

Antisera mod intakt vi ruspartikkel blev fremstillet ved at 5 immunisere kaniner med 50 øg inaktiveret, oprenset virus i komplet Freund's adjuvant. Der blev tappet blod fra dyrene 3 til 4 uger efter enkeltvaccination. Antiserum mod virus sub-unit (kanin) blev fremstillet ved at immunisere tre gange med 3 til 4 ugers mellemrum med 10 mg med syre åbnet, renset virus, først i komplet Freund's 10 adjuvant og derefter i inkomplet Freund's adjuvant. Polypeptidet VP1 blev separeret fra blandingen af proteiner og opnåedes fra med urinstof åbnede, rensede virus, med iso-elektrisk fokusering. (Se Barteling, S.J., Wagenaar, F., Gielkins, A.L.J., J. Gen.Virol. 62, 357-361 (1982)). Efter eluering fra gel med 8M urinstof og dialyse 15 mod PBS blev der rejst antistof som beskrevet ovenfor for 12 S. Antiserum for scanning (c) blev anvendt til scanning (b), men efter absorption med renset virus (1500 mg komplet virus blev inkuberet med 1 ml serum i 72 timer ved 4°C) og alle virusbundne antistoffer blev fjernet ved centrifugering.

20 C. Identifikation af det viruspartikel-associerede, antigene peptid.

Af de fire afprøvede antisera mod intakt viruspartikel viste scanninger (a) og (b) extremerne i det fundne reaktivitetsmønster. Store kvantitative forskelle i responset til et identisk antigenpræ-25 parat er blevet rapporteret tidligere, men disse scanninger kaster lys over den mulige variabilitet i antistofsammensætning mellem sera. Ved undersøgelse af scanninger (a), (b) og (c) er antistof reaktivt med peptiderne nr. 146 og 147 til stede i komplet antiserum mod intakte virus men fraværende efter absorption med oprenset 30 virus. De samme antistoffer observeres ikke i antiserum mod subunit, scanning (d), og er kun svagt tilstede i antiserum mod VP1, scanning (e). At der fandtes nogen aktivitet i antiserum mod VP1 gør muligvis rede for det isolerede proteins immuniserende kapacitet om end svag. (Se Kleid, D.G., et al., Science 214, 1125-1129 (1981)).

35 Det skal imidlertid bemærkes, at en anden antiserum mod VP1, der ligeledes blev afprøvet, bevarede en stærk aktivitet i position nr. 148 og viste ingen aktivitet ved positionerne 146 og 147. Overlægning af scanning (c) på scanning (b) (absorberet sammenlignet med ikke-absorberet) viste, at ud over tabet af aktivitet mod peptiderne 13 DK 171118 B1 nr. 146 og 147 skete der også en reduktion i aktivitet mod peptiderne nr. 5, 6 og 206. Af disse blev aktivitet mod numrene 5 og 6 ikke fundet i alle de afprøvede antisera mod intakt virus, medens aktivitet mod 206 ufrivilligt var tilstede.

5 Udfra disse resultater konkluderedes, at af de sekvenser, der fandtes at være reaktive, udgjorde parret med nr. 146 og 147, dvs. hexapeptiderne

Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu (G-D-L-Q-V-L)og Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala (D-L-Q-V-L-A), det principale loci 10 med et bidrag fra locus nr. 206. hvilket er i overenstemmelse med andres observationer. Med hensyn til loci ved nr. 146-7 skelner vi imidlertid ikke mellem de to muligheder; den ene, at det aktive element er 5 aminosyrer langt dvs. sekvensen der er fælles for begge Asp-Leu-Gln-Val-Leu (D - L - Q - V - L) eller den anden, at det 15 aktive element er 7 aminosyrer langt dvs. kombinationen af de 2 hexapeptider Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala (G - D - L - Q - V -L - A).

Eksempel 2.

20 A. Fremstilling af hexapeptider.

Den 212 aminosyre lange sekvens af VP1 (FMDV, type Ajq eller Agl) som opgivet af Bachrach, H.L., et al, Office International des, Epizootics, blev inddelt i 207 hexapeptider. Disse hexapeptider blev 25 syntetiseret som beskrevet i eksempel 1 ovenfor med den undtagelse, at sidekæden af arginin blev beskyttet med p-methoxybenzensulfonyl-gruppen.

B. Afprøvning af hexapeptider.

30 Antigenprofiler for hexapeptiderne vises på fig. 3. De antise- raer, der blev anvendt til frembringelse af profilerne var: (a) antiserum mod intakt viruspartikel type Ajq (b) antiserum mod intakt viruspartikel som i (a) efter adsorption med renset komplet FMDV type Ajq.

35 Afprøvningen af hexapeptidet og fremstillingen af sera blev foretaget som stort set beskrevet i eksempel 1.

DK 171118 Bl 14 C. Identifikation af viruspartikelassocieret, aktivt element

Ved at resonnere på samme måde som i eksempel 1 blev det konkluderet, at hexapeptiderne Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Ile (G-D-L-G - S - I) og Asp-Leu-Gly-Ser-Ile-Ala (D - L - G -5 S - I - A), er de principale loci for den antigene determinant for A-typen af FMDV.

Som det var tilfældet med FMD-virus, type Oj, beskrevet i eksempel 1 skelnede vi ikke mellem disse to sekvenser og følgelig konkluderes det, at det er muligt, at den aktive sekvens er 5 10 aminosyrer lang, dvs. Asp-Leu-Gly-Ser-Ile (D - L - G - S - I), eller at den er 7 aminosyrer lang, dvs. Gly-Asp-Leu-Gly-Ser-Ile-Ala (G - D - L - G - S - I - A).

EKSEMPEL 3 15 A. Fremstilling af hexapeptider.

Den 210 aminosyrer lange sekvens af VP1 (FMDV type Cj) som angivet af Robertson, H.L. et al, Journal of Virology, 46, 311-316 (1983) blev inddelt i 205 hexapeptider. Disse hexapeptider blev syntetiseret som beskrevet i eksempel 2 ovenfor.

20 B. Afprøvning af hexapeptider.

Antigenprofiler for hexapeptiderne vises på fig.4. De anvendte antisera til frembringelse af profilerne var: (a) antisera mod intakt viruspartikel type Cj.

25 (b) antisera mod intakt viruspartikel som i (a) efter absorp tion med renset, komplet FMDV type Cj.

Afprøvningen af hexapeptiderne og præparation af sera foretoges stort set som beskrevet i eksempel 1. 1 2 3 4 5 6 C. Identifikation af viruspartikel-associeret aktivt element.

2

Ved at resonnere på samme måde som i eksempel 1 konkluderedes 3 det, at hexapeptidet Asp-Leu-Ala-His-Leu-Thr (D - L - A - H - L - T) 4 er det principale locus for den antigene determinant for C-typen af 5 FMDV.

6

Disse resultater viser klart potentialet af en systematisk scanning af en polypeptidsekvens. Resultaterne giver den sandsynlige lokalisering af den aktive determinant indesluttet i det peptid, med hvilket Bittie, J.L. et al., Nature 298, 30-33 (1982) opnåede den succesfulde beskyttelse hos marsvin mod en efterfølgende provokering 15 DK 171118 B1 med FMDV.

EKSEMPEL 4 A. Fremstilling af peptider indeholdende erstatningsaminosvrer.

5 Den i eksempel 1 beskrevne syntesemetode blev anvendt til at syntetisere 120 hexapeptider, som hver bestod af 5 oprindelige aminosyrer i det antigene hexapeptid G-D-L-Q-V-L (type 0j), idet den sidste aminosyre systematisk blev erstattet med hver af de 20 mulige, naturligt forekommende, genetisk kodede aminosyrer.

10 Denne udskiftning blev igen udført ved hver af de 6 positioner af peptidet. De 120 peptider omfattede således 6 kopier af den oprindelige sekvens og 114 variationer af den oprindelige sekvens, hvor hver af de 114 variationer kun adskiller sig med 1 aminosyre fra den oprindelige sekvens. Denne strategi er illustreret i diagram på 15 fig.5.

B. Afprøvning af peptider indeholdende erstattende aminosyrer ELISA-testen fra eksempel 1 blev anvendt til at teste 120 peptider mod et antiserum, som man vidste reagerede med den oprin-20 delige sekvens. Resultaterne vises på fig.6 og i tabel 1. På fig.6 er antistofbindingsaktiviteten for hvert peptid vist ved en lodret linie proportional med den opnåede ELISA-extinction. Indenfor en gruppe på 20 linier svarer linien til venstre til substitutionen af den oprindelige aminosyrerest med alanin (A) og linien til højre med 25 substitutionen med tyrosin (Y). Linierne ind imellem er i alfabetisk rækkefølge ifølge enkeltbogstavkoden for hver aminosyre. Hver gruppe på 20 linier svarer til det fuldstændige erstatningssæt for en af de 6 N-terminale restpositioner i hexapeptidet G-D-L-Q-V-L. Det fremgår, at aminosyrerne i visse positioner i sekvensen let kan 30 udskiftet uden at miste antigenicitet, hvorimod der ikke kan accepteres erstatning i andre positioner uden delvist eller fuldstændigt tab af antigenicitet. De peptider, der indeholder udskiftninger, som resulterer i bevarelse af antigenicitet, er kandidater til brug i vaccinefremstilling.

35 C. Fremstilling og afprøvningsmetoder for A. og B. ovenfor blev gentaget med de antigene hexapeptider G-D-L-G-S-I (type Ajq) og D-L-A-H-L-T (type Cj) - se fig.5. Resultaterne vises i tabel 1.

16 DK 171118 B1 EKSEMPEL 5

De udvalgte antigene peptider for hver af de tre FMDV-typer blev syntetiseret med en flerhed af forbindende aminosyrer ved den N-terminale ende og med den forbindende aminosyre lysin i den 5 C-terminale ende. Aminosyrerne i disse forbindelsesled forekommer ikke i disse positioner i de native sekvenser. De syntetiserede peptider blev koblet til en proteinbærer og kombineret med et adjuvant med det formål at immunisere dyr. Bæreren var "keyhole limpet"-hæmocyanin (KLH), og adjuvantet var enten en olieadjuvant 10 eller aluminiumhydroxidgel.

I tabel 2 angives resultaterne fra serologiske test på immuniserede kaniner. De viser, at i hvert tilfælde frembragte kaninen en væsentlig mængde antistof, som var i stand til at reagere med FMDV og i stand til at neutralisere FMDV's infektivitet.

15 EKSEMPEL 6

Der blev udført en beskyttelsestest under anvendelse af marsvin som en model, eftersom marsvin er følsomme overfor infektion med FMDV. Det peptid, der blev anvendt til immunisering, var C - G - D -20 L-Q-V-L-A-K, som består af heptapeptidet G-D-L-Q- V - L - A fra FMDV type Oj (aminosyrerester 146-152), en cysteinkob-ling ved den N-terminale ende og en lysinkobling ved den C-terminale ende. Til fremstilling af vaccinen blev peptidet koblet til KLH under anvendelse af maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, som 25 binder peptidet til KLH via cysteinsidekæden.

KLH-peptidkonjugatet blev derefter absorberet på en aluminiumhydroxidgel og anvendt til at vaccinere marsvin med en dosis på 100 mg peptid pr. dyr. En ikke-vaccineret gruppe af marsvin tjente som kontroller. Dyrene blev provokeret 21 dage efter enkeltvaccina-30 tionen.

Resultaterne af provokationen var som følger:

Vaccineret Ikke-vaccineret

Helt beskyttede 3 0 35 Delvist beskyttede 2 0

Ubeskyttede 0 5

Total 5 5 17 DK 171118 B1 * 1 til 6 læsionsscorepoint på en skala på fra 0 til 12.

** Mere end 6 læsionsscorepoint på en skala fra 0 til 12.

Disse resultater viser, at den anvendte korte peptidsekvens kan 5 stimulere immunsystemet i et følsomt model dyr til frembringelse af et beskyttende svar mod provokering med virulent FMDV.

EKSEMPEL 7

Et eksempel på anvendelse af den foreliggede opfindelse til 10 diagnostisk brug kan udtrækkes af fig.2. Denne viser, at ELISA-af-prøvning under anvendelse af bærerkoblede peptider er et yderst stammespecifikt værktøj til påvisning af FMDV-antistoffer. Fuld antiserum mod FMDV-type Oj reagerede med hexapeptider 146, 147 og 206 hidrørende fra FMDV-type-Oj-sekvensen, hvorimod antiserum mod 15 type Cj ikke reagerede overhovedet. Kontrol afprøvning af antiserum mod FMDV-type 1 viste, at lignende specifikke reaktioner kun skete med peptider hidrørende fra Cj-sekvensen. Afprøvning af bærerkoblede peptider med andre ikke-FMDV-specifikke kontrol sera og hyperimmun-sera mod andre FMDV-typer har ligeledes vist, at der ikke finder 20 nogen reaktion sted.

Dyresera kan derfor afprøves på udvalgte FMDV-bærerkoblede peptider, og en positiv reaktion er en diagnose på, at dyret tidligere er blevet udsat for FMDV-antigen.

25 1 35 18 DK 171118 B1 TABEL 1 1 ΓΙ Γ fe ω fe « - R 2 SS "O^fe·0 « η 0) « W ofe * 2 S « t c > s « si s si s s g $ S v? « > > .- O f* N N Π %} ro m *. i «Ό i—" ·!. v l·· ® O' r~ vo ST -i o σ» S 2| > Ή +* .—

«S H .X +J

|_ ID «0 .X

® 2 SI S S 8 5 £3 5; 8 8 & ±! „ " 1 M O C O 4->

_ ·— </) 0) <U

„ Ji N θ' ΟΠ ^ "· c rn L

'S <m r* r> o c 5? z: ω C h f _ ‘C CO θ' θ' ΟΙ Ό Ό O cm| vo -CJ Ό C ci\ it <u O Ό O M vO CO I ·» CN CO ol O CN ei·®

Lj ** — I — CN zi CO

g! «* σ> α> jq go. 52 5 2 S? oh-c° .g ΰ * 3 « B_.<5 '»co co -» ο o' <j o' c ^ 0) § 2 'o coin - N co Ί co O' .= c n » t? <U U — C X o O _ ctt f" cn in o' no s co co <r <D o * > ·

>r<XO σ' co — u-i — co m co O

iJ - c CL M -S a 3 5 (/) jQ >, 4j . O co eol co m ο»! σ' O'! aol co ml nt o n! w 1/) +j

. H J Ό CN col ο Ό 1-1 CM - co «I So in ° SI C Ο) , I

JJ -I -I -/ > ® C h 5» ca nj .= ® λ ,Ο w C; CO CN CN CN IN co CM CO Q> — C Ω ^ 3 * ® O — — CO 00 Ό CO ιΛ Eij 5 W N C Ο ϋ . É *-* Ό C0| ON CM CM S CO « W C ® - -a l. σι

-X 3 0) O

_ it ·» Ό O CM !Λ| c"* 5s ΙΛ -2 - - « O'! ω «r C-* C 2 η *ί 1. 0) o T> Φ > +-5 *«k iOi ®| ^ ol co col es +j 3 s v d)

O o| σΊ rs σΊ cn co| m q_ X φ -C

5 i_ w

«Μ k m . m Q) if· L· C

u.2 «2 53 s <d ω a> - 2s1 2 ® _ η tj = .- oi o _ w2 3 S 2ΪΙ SJ33 5 ra q. E o m c a> p

L ^ ^ ^rj C

_ <£ «I ® col sr co Olr-o in c2 <ϋ0>4_> ° ·» H <M NJ O co co - 3 £ 3 ^ Ρω ~ « w t E =

o 2 £ £ 2 S S > ° £ 'S

> jz ^ η E

ti ω ω _, *g O' CM IN O' CN CM — |N Ο CN CDICN „ , 5_ ®ΛIL.

<o n - » cm cm o -co SS? ol in «- J- *r c ~ £ £ S CL n ----- = ° £ •t: t_ ω —

•rN > ω +i t. -Q

C W y ^ > Ό E

Ο β m a5 w 3 Τ! S —f m vo <-· cn m m o ^ rs m >j m ο ^-· cn m ^ mo ifli? t.

O) > δ p 2> M <U C <Λ ® ·- O <n ·— · c τι — P* 1 ^ C S u £ -t-—--- σ <u ^ m Π3 iqo fi ^ > a>

Lj fl] . Η m « __ . . If" C φ 4-> 0) > 8 < > o ^ > o ^ S u T3 P^ J to '^*»«0 O' = ti I- U 0) c o <uq o. oS.'» q o. ® 3S. .2 O) <U Ό ω s » ° i SS- SS- ^ S σ> -σ > Μ Η t- Η C π) ο — c

“ < J3 Ε Ρ ID

DK 171118 B1 0 19 -o > α jq « «

> α E

c I 2 .

S 8?

fe ™ M- O

+J ra c <u d) o F«i X» σ> ε fe o .E ^ « c έ Ξ ? g — si s > v j a) o ·*.·*» i w Wv -m i- -ΙΟ) ·— *1 a> O -*-

CC id r-s m C U- CO

L. |_ φ V

• 3ZO 000 Γ'.ιηοο co σ> E .EP . °n.

1 ^ " - w " - - I SS g “ ic ω fe α «- ·- ti ® 4J l. « α Σρ T3 ® 3 E .t; d C- <U Q -M "tr

0) I i- S O O

α _ -«t t_ c £ % α S di S ! ε £ <U (O o > iλ t- t- — co .ϋ .ΰ w o ^ •Μ Ϊ3 -J — <υ ·- ® 'cd £ o J5 > ^3 ^ *0 ·“ c E 0) n, •»-ΙΛ^τ-,^Ο CO ΓΟ Tf po^fr- O CO ® 9 O « ϊ Η P #N r-Mr- CVJCOCO OJCVJ c ^ 0) ·£ S Ό ^ ” tt I i w £ g Έ S . S " Ϊ «~ε 3 ~ g i. “ _J ™ O x fe s ω

LU ^ 2 Ό ® —I q X OT

(O C ® -O X 0 C O

<2 .M-55 C w «{- 3 o

Η n 5r. ro ® <u_roE

Φ1. .E — * * * * * * * ii ® c J C 2 :j e«.........s g 11; ro V jo t o F , fe 0 ufe fe I % % » 5 2 5 r I gå s fe α <_,T3 υ * ™ «5 +J<U^<U m 4_. fe I ® ro ο. Ό — S* <n -ri c w •m r- w · o Ϊ o : a — “ g) · 1 1 Q. c io .Sr 3 X Ew t Vi 1 V) 1 ι/l οι E 3 > ΰ

«« g tgj, CO I Wli CO X

2! ε ® -u υ uuu uuu uu^ oJ &

Ifl l_ T c = <U 0(13 E C

ΪΪΖ2 gogs'c g .2 o Si f i S c cj <0 I—αΓ Z ^ ω gs £ ro o ^-q>£ w£ j? c = Ξ ^ „ 0 υ >2o7 O 7 i V fe ** 3 §

^ ^ ij ti J ώ I ^ <y> -π Φ L. ZL

1 > S&O? qJ 3? 73 .E ® - I oj < do— oli o il '~ 2 ® 13 fe ® £ O. ii ^ * >0)ΙΛ jilPVSt.

<0$ _ i, « < Ϋ Ό S fe is c ° ^ £ n Vi y- 3 ·— v»X?0 < U ~ _ _| 2! -±

g c E 'c > > > H ? Hi ς .E

fe c ’*- > Q S QS ΩΪ > S α S >: Έ > Σ>; . ..

O O LL V» LL^j U, r" CMCO

5 20 DK 171118 B1

Det vil selvfølgeligt være muligt at foretage mange variationer og modifikationer af den her beskrevne fremgangsmåde uden at afvige fra den foreliggende opfindelse.

10 15 20 25 30 35

Claims (5)

1. Syntetisk peptid, som udviser den for VPl-proteinet fra mund-og-klovsygevirussen karakteristiske antigenicitet, kende-5 tegnet ved, at mindst en del af peptidet udvælges blandt fem, seks eller syv aminosyre lange, antigenaktive aminosyresekvenser fra VPl-proteinet og antigenaktive, modificerede sekvenser heraf, enten type Oj, hvor peptidet omfatter en aminosyresekvens udvalgt blandt: 10 (i) G - D - L - Q - V - L - A; (ii) G - D - L - Q - V - L; (ii) D - L - Q - V - L - A; (iv) D-L-Q-V-L; 15 navnligt hvor mindst en del af peptidet udvælges blandt hexapeptid-sekvenser baseret på formlen: G - D - L - Q - V - L (1) (2) (3) (4) (5) (6) 20 hvor: G ved position (1) erstattes med A, Η, I, K, Μ, N, P, Q, S eller T, eller 25. ved position (2) erstattes med A, C, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V eller Y, eller Q ved position (4) erstattes med D, K, A, Μ, E, N, S eller R, eller V ved position (5) erstattes med A, D, E, F, I, K, L, 30 Μ, N, Q, R, S, T eller Y, eller type A10 (Agj), hvor peptidet omfatter en aminosyresekvens 35 udvalgt blandt: (i) G - D - L - G - S - I - A; (ii) G - D - L - G - S - I; (iii) D-L-G-S- I-A; DK 171118 Bl (iv) D - L - G - S - I; navnligt hvor mindst en del af peptidet udvælges blandt hexapeptid-sekvenser baseret på formlen: 5 G - D - L - G - S - I (1) (2) (3) (4) (5) (6) hvor: 10. ved positionen (1) erstattes med A, C, 0, E, F, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W eller Y, eller D ved position (2) erstattes med L, eller G ved position (4) erstattes med A, eller S ved position (5) erstattes med T, G eller A eller 15. ved position (6) erstattes med A, C, D, E, F K, L, M, Q, R, S, T, V, U eller Y, eller 20 type C^, hvor peptidet omfatter en aminosyresekvens udvalgt bl andt: (i) D - L - A - H - L - T - A; (ii) D - L - A - H - L - T; 25 (iii) L-A-H-L-T-A; (iv) L - A - H - L - T; navnligt hvor mindst en del af peptidet udvælges blandt hexapeptid-sekvenser baseret på formlen: 30 D - L - A - H - L - T (1) (2) (3) (4) (5) (6) hvor: 35 D ved position (1) erstattes med H eller V, eller, H ved position (4) erstattes med A, C, D, E, F, K, L, Μ, N, Q, R, S, T, V eller Y, eller T ved position (6) erstattes med S. DK 171118 B1

2. Vaccine til behandling af dyr mod infektion med mund-og-klovsygevirus, kendetegnet ved, at den omfatter mindst et syntetisk peptid ifølge krav 1.

3. Vaccine ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter en fysiologisk acceptabel bærer og/eller adjuvant.

4. Vaccine ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, 10 at mindst et syntetisk peptid er bundet til den fysiologisk acceptable bærer.

5. Diagnostisk testsystem eller et andet immunologisk testsystem til påvisning in vitro af tilstedeværelsen af mund-og-klovsy- 15 gevirus eller af antistoffer mod mund-og-klovsygevirus, kendetegnet ved, at det omfatter mindst et syntetisk peptid ifølge krav 1 som en antigenaktiv komponent i systemet. 20 25 1 35