WO2013129456A1 - 線維芽細胞増殖促進能を有する組成物 - Google Patents

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gum
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陽子 水垂
正通 阿部
益徳 熊澤
康助 松本
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ロート製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting the proliferation of fibroblasts, and an invention related thereto.
  • the fibroblasts which are the main cells of the dermis, contain collagen that keeps the skin firm, elastin that keeps the skin elastic, and mucopolysaccharides (such as hyaluronic acid, Chondroitin sulfate, etc.).
  • the active oxygen increases inside the skin due to the influence of certain external factors such as ultraviolet irradiation, drastic air drying, excessive skin washing, etc., and aging, etc., and the proliferation ability of fibroblasts itself decreases. It is known.
  • promoting the proliferation of fibroblasts can prevent and / or improve the skin moisturizing function, prevent and / or improve the skin elasticity or elasticity, prevent skin wrinkles or tarmi and / or Or it is thought that it contributes to improvement, From this viewpoint, various cosmetics and beauty foods and drinks containing a plant extract having a fibroblast proliferation promoting action have been proposed.
  • Patent Document 1 describes that a complex of fibroblast growth factor (FGF) and fucoidan is used as a fibroblast growth promoter.
  • Patent Document 2 discloses that a composition containing (A) one or more selected from the group consisting of hyaluronic acid, hyaluronic acid derivatives, and salts thereof, and (B) a thermolysin degradation product of soy protein is a fiber. It describes that it can be used to promote blast proliferation.
  • FGF fibroblast growth factor
  • fucoidan fucoidan
  • the present invention has been made in view of the above prior art, and an object of the present invention is to provide a useful novel composition capable of highly promoting the proliferation of fibroblasts.
  • the present inventors can promote the proliferation of fibroblasts to a high degree by using a short-chain peptide having a specific amino acid sequence in combination with a polysaccharide. The present inventors have found that this can be done and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • the peptide of component (A) is Asp-Leu-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO: 2), Arg-Asp-Leu-Asp-Val (SEQ ID NO: 3), Arg-Asp-Leu-Asp
  • the polysaccharide of component (B) is hyaluronic acid, fucoidan, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, alginic acid, keratan sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin, xanthan gum, sclerotium gum, guar gum, tara gum, locust bean gum , Tamarind seed gum, psyllium seed gum, gum arabic, karaya gum, gellan gum, curdlan, carrageenan, quince seed, saxinoglycan, agar, pectin, porphyran, chitin, chitosan, cellulose, dextran, dextrin, pullulan, starch, and these
  • the composition according to [1] or [2] comprising at least one selected from the group consisting of a derivative of the polysaccharide and a salt of the polysaccharide and
  • component polysaccharide consists of hyaluronic acid, fucoidan, pectin, carrageenan, porphyran, caraya gum, gellan gum, xanthan gum, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, alginic acid, keratan sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, and heparin
  • the composition according to any one of [1] to [3], comprising at least one selected from the group consisting of acidic polysaccharides selected from the group, derivatives of the acidic polysaccharides, and salts of the acidic polysaccharides and derivatives thereof .
  • the polysaccharide of component (B) is at least one selected from the group consisting of hyaluronic acid, fucoidan, xanthan gum, sclerotium gum, dextran, and derivatives thereof, and salts of the polysaccharide and derivatives thereof.
  • the present invention provides a useful novel composition capable of effectively promoting the proliferation of fibroblasts. Therefore, according to the present invention, it is possible to effectively promote the proliferation of fibroblasts, improve the wrinkles and tarmi of the skin caused by external factors such as ultraviolet irradiation and aging, restore the elasticity and elasticity of the skin, Novel compositions that can be beneficially used in practice to enhance the skin moisturizing function are provided.
  • composition of the present invention comprises (A) a peptide comprising the amino acid sequence of the following formula (I): Xaa 1 -Asp-Leu-Asp-Val-Xaa 2 (SEQ ID NO: 1), or a derivative thereof, or a salt thereof. And (B) a polysaccharide.
  • (A) component Peptides blended as the component (A) in the composition of the present invention have the following formula (I): Xaa 1 -Asp-Leu-Asp-Val-Xaa 2 (one letter abbreviation: X 1 DLDVX 2 , SEQ ID NO: 1) Or a derivative thereof, or a salt thereof.
  • Xaa 1 and Xaa 2 (one letter abbreviation: X 1 and X 2 ) in SEQ ID NO: 1 may or may not be present, and when present, each independently represents an arbitrary amino acid.
  • the amino acid is preferably an ⁇ -amino acid, more preferably a genetically encoded ⁇ -amino acid.
  • Xaa 1 and Xaa 2 are naturally occurring Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Is preferably an ⁇ -amino acid arbitrarily selected from the group consisting of Tyr, Lys and Val, more preferably an ⁇ -amino acid which is Arg or Phe, Xaa 1 is Arg, and Xaa 2 is Phe Is particularly preferred.
  • Xaa 1 and Xaa 2 may or may not be present, but it is preferable that at least one of Xaa 1 and Xaa 2 is present.
  • the peptide used in the present invention is Asp-Leu-Asp-Val-Phe (one letter abbreviation: DLDVF, SEQ ID NO: 2), Arg-Asp-Leu-Asp-Val (one letter abbreviation: RDLDV, SEQ ID NO: 3), Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe (one letter abbreviation: RDLDVF, SEQ ID NO: 4), or Asp-Leu-Asp -Val (one letter abbreviation: DLDV, SEQ ID NO: 5), preferably Asp-Leu-Asp-Val-Phe (one letter abbreviation: DLDVF, SEQ ID NO: 2), or Arg-Asp-Leu-Asp-Val (One letter abbreviation: RDLDV, SEQ ID NO: 3) is particularly preferable.
  • the “peptide derivative” means, for example, acetylation, palmitoylation, myristylation, amidation, acrylation, dansylation, biotinylation, phosphorylation, succinylation, anilideation, benzyloxylation of peptides.
  • salt refers to any pharmacologically acceptable salt (including inorganic salts and organic salts) of a peptide or a derivative thereof, such as a sodium salt or potassium of a peptide or a derivative thereof.
  • Salt calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, organic acid salt (acetate, trifluoroacetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, Succinate, fumarate, propionate, formate, benzoate, picrate, benzenesulfonate, etc.), preferably ammonium salts, hydrochlorides, sulfates, acetates or tris Fluoroacetate, more preferably ammonium salt, acetate or trifluoroacetate.
  • the peptide or its derivative used in the present invention or a salt thereof may be a hydrate or an anhydride.
  • the solvate or non-solvate may be sufficient as the peptide used in this invention, its derivative (s), or those salts.
  • the peptide used in the present invention can be prepared by a method known in the art.
  • the peptide used in the present invention may be synthesized by a chemical synthesis method (for example, a solid phase method (eg, Fmoc method), a liquid phase method, etc.), or may be produced by a method such as recombinant expression. Good.
  • the amino acid constituting the peptide used in the present invention may be L-form or D-form, but is preferably L-form.
  • the peptide used in the present invention may be prepared by cutting out a peptide comprising the target amino acid sequence from the amino acid sequence of the protein containing the target amino acid sequence by a known means such as protease treatment.
  • a person skilled in the art can appropriately select an appropriate protease in order to cut out a peptide comprising the target amino acid sequence from the amino acid sequence of the protein containing the target amino acid sequence in consideration of the sequence specificity of the protease.
  • the reaction conditions used when the protein is hydrolyzed with a protease are not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to common technical knowledge.
  • the target peptide can be purified by purification by means known in the art, if necessary.
  • a peptide obtained by hydrolyzing a natural protein with a protease is advantageous from the viewpoint of cost as compared with the case of producing by a chemical synthesis method. Furthermore, it is considered that a peptide obtained by hydrolyzing a natural protein with a protease is safer for a living body. Therefore, the peptide thus obtained can be suitably used for internal preparations, foods, cosmetics for sensitive skin, feeds, and the like that require higher safety for application to living bodies.
  • the food includes all foods and drinks including beverages.
  • the peptide derivative used in the present invention can be easily prepared by a person skilled in the art by any method known in the art.
  • the salt of the peptide used in the present invention can also be easily prepared by those skilled in the art by any method known in the art.
  • composition of the present invention a peptide selected from the peptides having the above specific sequence or a derivative thereof, or a salt thereof may be used alone or in any combination of two or more. May be used.
  • any of the peptide having the specific sequence described above or a derivative thereof, or a salt thereof can be used.
  • a salt is used, and a peptide is particularly preferably used.
  • the amount of component (A) to be blended in the composition of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but is usually about 0.000001 to 70% by weight (w / w)% with respect to the entire composition. It is good to do.
  • the blending amount may be small, for example, 0.000001 to 5 w / w%, more preferably 0.00001 to 1 w / w%, still more preferably 0.00001 to 0.1 w. A sufficient effect of the present application can be obtained even when / w%.
  • (B) component In the composition of the present invention, a polysaccharide is further blended as the component (B).
  • the polysaccharide is not particularly limited as long as it is pharmaceutically or physiologically acceptable, for example, hyaluronic acid, fucoidan, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, alginic acid, keratan sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin, xanthan gum, Sclerotium gum, guar gum, tara gum, locust bean gum, tamarind seed gum, psyllium seed gum, arabic gum, karaya gum, gellan gum, curdlan, carrageenan, quince seed, saxinoglycan, agar, pectin, porphyran, chitin, chitosan, Cellulose, dextran, dextrin, pullulan, starch, and derivatives of these polysaccharides, and salts of the aforementioned polysaccharides or derivatives thereof.
  • hyaluronic acid
  • fucoidan examples include U-fucoidan containing glucuronic acid, F-fucoidan consisting only of sulfated fucose, and G-fucoidan containing galactose. In the present invention, fucoidan includes these.
  • polysaccharide includes the above-mentioned polysaccharides, polysaccharide derivatives, polysaccharides and salts of polysaccharide derivatives.
  • Examples of the form of the derivative of component (B) in the present invention include acetylation, palmitoylation, myristylation, amidation, acrylation, dansylation, biotinylation, phosphorylation, succinylation, anilide, benzyloxycarbonylation.
  • examples of the derivative of the component (B) include acetylated hyaluronic acid, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, and methyl cellulose.
  • the form of the salt of the component (B) in the present invention is not particularly limited as long as it is pharmacologically acceptable, but a salt with an inorganic base [for example, alkali metal (sodium, potassium, etc.), alkaline earth Metal salts (calcium, magnesium, etc.), salts with metals such as aluminum; ammonium salts, etc .; salts with organic bases [eg, methylamine, triethylamine, triethanolamine, morpholine, piperazine, pyrrolidine, tripyridine, picoline, etc.
  • an inorganic base for example, alkali metal (sodium, potassium, etc.), alkaline earth Metal salts (calcium, magnesium, etc.), salts with metals such as aluminum; ammonium salts, etc .
  • salts with organic bases eg, methylamine, triethylamine, triethanolamine, morpholine, piperazine, pyrrolidine, tripyridine, picoline, etc.
  • inorganic acid salts eg, hydrochloride, sulfate, nitrate, hydrobromide, phosphate, etc.
  • organic acid salts eg, monocarboxylate (acetate, trifluoro, etc.) Acetate, butyrate, palm
  • the polysaccharide used in the present invention may be extracted from biological materials such as algae and bacteria containing a large amount of polysaccharide, or commercially available ones may be used.
  • the weight average molecular weight of the polysaccharide used as the component (B) in the present invention is not particularly limited, but is usually about 1000 to 10000000, preferably about 3000 to 7000000, more preferably about 5000 to 5000000, and still more preferably about 10,000 to 3000000. Particularly preferably, about 100000 to 2000000 can be used.
  • hyaluronic acid, chondroitin sulfate, derivatives thereof or salts thereof are generally expressed as viscosity average molecular weight, but the same level can be used when expressed in viscosity average molecular weight, and is not particularly limited. However, it is usually about 1000 to 10000000, preferably about 3000 to 7000000, more preferably about 5000 to 5000000, still more preferably about 10,000 to 3000000, and particularly preferably about 100,000 to 2000000.
  • one of these polysaccharides may be used alone, or two or more may be used in any combination.
  • an acidic polysaccharide for example, hyaluronic acid, Fucoidan, pectin, carrageenan, porphyran, karaya gum, gellan gum, xanthan gum, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, alginic acid, keratan sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin and their derivatives, and salts thereof are particularly preferable.
  • hyaluronic acid and fucoidan may be mixed and used, or hyaluronic acid and xanthan gum, fucoidan and xanthan gum, or hyaluronic acid, fucoidan and xanthan gum may be mixed and used.
  • the amount of component (B) to be blended in the composition of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but is usually about 0.000001 to 70% by weight (w / w)% with respect to the entire composition. It is good to do.
  • the amount may be small, for example, 0.000001 to 5 w / w%, more preferably 0.00001 to 1 w / w%, still more preferably 0.0001 to Even if it is 0.3 w / w%, sufficient effects of the present invention can be obtained.
  • the blending ratio of the component (B) to the component (A) is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be achieved, but usually the total amount of the component (A) is 1 part by weight,
  • the total amount of component (B) is preferably about 1 to 70000000 parts by weight. From the standpoint that higher effects of the present application can be achieved, preferably, the total amount of component (A) is 1 part by weight, and the total amount of component (B) is 1 to 5000000 parts by weight, more preferably 10 to 500000 parts by weight. More preferably, the content is 50 to 50000 parts by weight.
  • the composition of the present invention containing the above components (A) and (B) can promote the proliferation of fibroblasts. Accordingly, the composition of the present invention improves skin wrinkles and elasticity due to the improvement of skin wrinkles and talmi caused by external factors such as ultraviolet irradiation and fibroblast reduction and inactivation caused by aging and the like. It can also be beneficially used to restore skin or to enhance the skin's moisturizing function.
  • the growth promoting effect on fibroblasts can be measured, for example, by culturing fibroblasts together with a test substance in a culture plate and then measuring the number of viable cells on the plate.
  • (A) of the present invention It can be determined that the proliferation of fibroblasts is promoted when the number of viable cells is significantly increased compared to the case where the component and the component (B) are not added.
  • a composition capable of promoting fibroblast proliferation by such a method is a skin caused by a decrease or inactivation of fibroblasts caused by external factors such as ultraviolet irradiation or aging. It can be understood that it has the effect of improving the wrinkles and tarmi of the skin, restoring the elasticity and elasticity of the skin, or enhancing the moisture retention function of the skin.
  • the composition of the present invention is preferably a cosmetic composition. Since this composition contains the combination of (A) component and (B) component which have said function, it can have a cosmetic effect. That is, the composition of the present invention containing a combination of the component (A) and the component (B) has an effect of promoting the proliferation of fibroblasts. By this action, the effect of improving skin wrinkles and talmi, restoring the elasticity and elasticity of the skin, or enhancing the skin moisturizing function can be exhibited, and a remarkable cosmetic effect can be achieved.
  • a composition that can be used for the purpose of making the face and body beautiful for example, beauty such as beautiful skin
  • a beauty composition a composition that can be used for the purpose of making the face and body beautiful
  • composition of the present invention can be suitably used as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, a food composition or a feed composition.
  • a pharmaceutical composition a cosmetic composition, a food composition or a feed composition.
  • pharmaceutical compositions a cosmetic composition, a food compositions and feed compositions used for cosmetic purposes.
  • the composition of the present invention can be suitably used as a research reagent for elucidating physiological states related to the proliferative ability of fibroblasts.
  • the pharmaceutical composition examples include a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases caused by the decrease or inactivation of fibroblasts in mammals including humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, a prophylactic agent for skin wrinkles or talmi caused by external factors such as ultraviolet rays or the reduction or inactivation of fibroblasts caused by aging and / or the like.
  • the cosmetic composition of the present invention can prevent and / or prevent wrinkles or talmi of the skin caused by a decrease or inactivation of fibroblasts caused by external factors such as ultraviolet rays or aging.
  • cosmetics for improvement, reduction or inactivation of fibroblasts as cosmetics for prevention and / or improvement of skin elasticity or loss of elasticity due to reduction or inactivation of fibroblasts It can be used as a cosmetic or the like for prevention and / or improvement of the skin moisturizing function lowering caused by.
  • the food composition for example, it can be used as a food for preventing and / or improving a state caused by the decrease or inactivation of fibroblasts in mammals including humans.
  • the food composition of the present invention can prevent and / or improve skin wrinkles or talmi caused by a decrease and inactivation of fibroblasts caused by external factors such as ultraviolet rays or aging, for example.
  • a food for the prevention and / or improvement of skin elasticity or loss of elasticity due to the decrease and inactivation of fibroblasts, resulting from the decrease or inactivation of fibroblasts It can be used as a food for preventing and / or improving the skin moisturizing function.
  • the food composition of the present invention includes health food, food for specified health use, nutritional functional food, health supplement food, and the like. These compositions include cosmetic health foods.
  • the food for specified health is a food that is ingested for the purpose of specific health in the diet, and indicates that the purpose of the health can be expected by the intake.
  • These food products can be provided as food products with a label indicating that they are used for the above-mentioned purposes in a specific embodiment. In other words, it is used to display the indication that it is used for beauty, the indication that it has a beautifying effect, the indication that it is used for improving the skin quality, and to restore the elasticity and elasticity of the skin.
  • feed for example, for the prevention and / or improvement of conditions caused by the reduction or inactivation of fibroblasts in domestic animals such as cattle, pigs, chickens, sheep, horses, and pet animals such as dogs and cats Feed.
  • composition of the present invention includes carriers, bases, and / or additives that are usually used in fields such as the pharmaceutical field and food field. In the range which achieves, it can mix
  • a cross-linked vinyl polymer, lipids and the like may be used alone or in combination of two or more.
  • water, fats and oils, mineral oils, waxes, fatty acids, silicone oils, sterols, esters, metal soaps, alcohols and the like may be used alone or in combination of two or more.
  • additives include surfactants, solubilizing components, emulsifiers, oils, stabilizers, thickeners, preservatives, binders, lubricants, dispersants, pH adjusters, humectants, UV absorbers.
  • Chelating agents, percutaneous absorption enhancers, antioxidants, disintegrating agents, plasticizers, buffering agents, amino acids, coloring agents, fragrances and the like may be used alone or in combination.
  • the composition of the present invention includes a whitening component, an anti-inflammatory component, an antibacterial component, a cell activation component, an astringent component, an antioxidant component, an acne improving component, Various components such as a biocomponent synthesis promoting component such as collagen, a blood circulation promoting component, a moisturizing component, and an anti-aging component may be used alone or in combination.
  • composition of the present invention may be in any dosage form such as an internal preparation (including food and feed) or an external preparation (including cosmetics).
  • the hydrolyzate can be appropriately blended by a method known to those skilled in the art depending on the properties of the target food.
  • the external preparation for example, it can be used in any form such as liquid, emulsion, cream, lotion, paste, mousse, gel, sheet (supported substrate), aerosol, and spray.
  • Cosmetics include, for example, basic cosmetics such as lotions, emulsions, creams, oils, packs, makeup cosmetics such as foundations, blushers and lipsticks, as well as cleansers such as facial cleansers, cleansings, body cleansers, and bath preparations. Etc. may be used in any form.
  • the feed is not particularly limited because it can be used in any form.
  • the present invention further includes a method for promoting the proliferation of fibroblasts, a skin wrinkle, a tarmi, a reduction in elasticity, a decrease in elasticity, or a moisturizing, characterized in that the component (A) and the component (B) are used in combination.
  • a method for improving or preventing functional deterioration or a cosmetic method is provided. In such a method, it is better to apply to the subject in the form of a composition containing the component (A) and the component (B) more simply.
  • Application may be applied as an internal medicine or as an external preparation by application to the skin.
  • the component (A) and the component (B) may be used in an amount greater than or equal to an effective amount that provides a growth promoting effect on fibroblasts.
  • the amount of the composition used in the method of the present invention is usually about 0.001 to 10000 mg / day, more preferably about 1 to 1000 mg / day per adult body weight of about 50 kg in the case of internal use. Day, more preferably about 1-100 mg / day. In the case of an external preparation, the amount used is usually about 0.1 ⁇ g to 2 g / day per adult weight of about 50 kg.
  • the amount of the composition applied to the skin is preferably about 1 ng to 500 ⁇ g / cm 2 , more preferably about 0.01 to 50 ⁇ g / cm 2 , and still more preferably about 0.1 to 10 ⁇ g / cm 2 . is there.
  • the present invention further provides a composition for improving or preventing skin wrinkles, tarmi, reduced elasticity, reduced elasticity, or reduced moisturizing function for the production of a composition for promoting fibroblast proliferation.
  • a composition for improving or preventing skin wrinkles, tarmi, reduced elasticity, reduced elasticity, or reduced moisturizing function for the production of a composition for promoting fibroblast proliferation.
  • the usage amount of the component (A) and the component (B) may be used so as to be the content in the composition.
  • Example 1 Preparation of DLDVF (Asp-Leu-Asp-Val-Phe) peptide: Peptide synthesis: The title peptide was synthesized by a solid phase synthesis method by Fmoc method using an automatic peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation: PSSM8). The specific procedure is as follows: First, the C-terminus of Fmoc-Phe (1-Trt) -OH is bound to the resin for solid phase synthesis, and then the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then After neutralizing and washing this resin, Fmoc-Val-OH was introduced into the N-terminus of Phe.
  • PSSM8 automatic peptide synthesizer
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Val.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Leu.
  • Example 2 Preparation of RDLDV (Arg-Asp-Leu-Asp-Val) peptide: Peptide synthesis: The title peptide was synthesized by a solid phase synthesis method by Fmoc method using an automatic peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation: PSSM8). The specific procedure is as follows: First, the C-terminus of Fmoc-Val (1-Trt) -OH is bound to the resin for solid phase synthesis, and then the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then After neutralizing and washing the resin, Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N terminus of Val.
  • Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N terminus of Val.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Leu.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Arg (Pmc) -OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • Example 3 Evaluation of fibroblast proliferation promoting action (1) Using the DLDVF peptide prepared in Example 1 and various polysaccharides (hyaluronic acid, fucoidan), the growth promoting effect on fibroblasts was evaluated.
  • various polysaccharides hyaluronic acid, fucoidan
  • each of a serum-free DMEM medium diluted with a test peptide at a predetermined concentration or a serum-free DMEM medium not containing a test peptide was added at 37 ° C., 5 It was kept warm for 1 hour in an environment of% carbon dioxide and 95% air.
  • human normal skin fibroblasts were seeded at a rate of about 5,000 cells / well, adjusted to a liquid volume of 150 ⁇ L, and cultured under the same conditions for 6 hours (the final peptide of the test peptide-containing group) Concentration 5 ⁇ 10 -5 w / w%).
  • Example 4 Evaluation of fibroblast proliferation promoting action (2) Using the RDLDV peptide prepared in Example 2 and various polysaccharides (hyaluronic acid, fucoidan), the growth promoting effect on fibroblasts was evaluated.
  • the test method was substantially the same as Example 3 except that the peptides used in the test were different.
  • the cell proliferation rate was calculated from the ratio of the average number of viable cells in each comparative example group and example group when the average number of viable cells in the control was 100. The results are shown in Table 2 below.
  • Example 5 Evaluation of the fibroblast proliferation promoting action (3) Using the DLDVF peptide or RDLDV peptide prepared in Examples 1 and 2 above and xanthan gum which is a kind of polysaccharide, the growth promoting effect on fibroblasts was evaluated.
  • the test method was carried out in substantially the same manner as in Example 3 above, except that the types of peptides and polysaccharides used in the test and the addition concentrations were different.
  • the cell proliferation rate was calculated from the ratio of the average number of viable cells in each comparative example group and example group when the average number of viable cells in the control was 100. The results are shown in Table 3 below.
  • the fibroblast can be synergistically synergistically used in combination with the DLDVF peptide or RDLDV peptide in the same manner as when using a polysaccharide such as hyaluronic acid or fucoidan. It became clear that the cell growth promoting effect was exhibited.
  • Example 6 Evaluation of the fibroblast proliferation promoting action (4) Using the DLDVF peptide or RDLDV peptide prepared in Examples 1 and 2 above and sclerotium gum (INCI name) which is a kind of polysaccharide, the growth promoting effect on fibroblasts was evaluated. .
  • the test method was carried out in substantially the same manner as in Example 3 above, except that the types of peptides and polysaccharides used in the test and the addition concentrations were different.
  • the cell proliferation rate was calculated from the ratio of the average number of viable cells in each comparative example group and example group when the average number of viable cells in the control was 100. The results are shown in Table 4 below.
  • the fibroblast can be synergistically effective by using the DLDVF peptide or RDLDV peptide in combination. It became clear that the cell growth promoting effect was exhibited.
  • Example 7 Evaluation of fibroblast proliferation promoting action (5) Using the DLDVF peptide prepared in Example 1 above and dextran, which is a kind of polysaccharide, the growth promoting effect on fibroblasts was evaluated.
  • the test method was performed in substantially the same manner as in Example 3 except that the type of polysaccharide used in the test and the concentration of addition were different.
  • the cell proliferation rate was calculated from the ratio of the average number of viable cells in each comparative example group and example group when the average number of viable cells in the control was 100. The results are shown in Table 5 below.
  • composition comprising the specific peptides of the present invention and a polysaccharide can promote the proliferation of fibroblasts, it can activate the proliferation ability of fibroblasts reduced by external factors such as ultraviolet rays or aging. Can improve skin wrinkles and talmi, restore skin firmness and elasticity, and enhance skin moisturizing function, and can be beneficially used for beauty.

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Abstract

　線維芽細胞の増殖を促進することができ、紫外線等の外的因子或いは加齢等により低下した線維芽細胞の増殖能を活性化させて、皮膚のシワやタルミを改善したり、肌のハリや弾性を回復させたり、肌の保湿機能を高めるのに役立ち、美容のために有益に用いられ得る新規組成物を提供すること。　（Ａ）　下記の式（Ｉ）：　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１） ［ここで、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す］ のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩と、 （Ｂ）多糖類、 とを含有する組成物。

Description

線維芽細胞増殖促進能を有する組成物
　本発明は、線維芽細胞の増殖を促進するための組成物、並びにそれに関連する発明に関する。
　真皮の主細胞である線維芽細胞は、皮膚のハリを保っているコラーゲンや、皮膚の弾力性を維持しているエラスチン、皮膚の保湿力に大きな影響を与えるムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）等を産生する。ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等のある種の外的因子の影響や加齢等により肌の内部で活性酸素が増大し、線維芽細胞自体の増殖能力が低下することが知られている。そして、線維芽細胞の増殖能が低下して、真皮内の恒常性バランスが崩れることで、様々な皮膚のトラブル（例えば、皮膚の保湿機能低下）や皮膚の老化（例えば、皮膚の弾力性もしくはハリの低下、皮膚のシワもしくはタルミ等）が加速されることが知られている。
　従って、線維芽細胞の増殖を促進することは、皮膚の保湿機能低下に対する予防及び／又は改善や、皮膚の弾力性もしくはハリの低下に対する予防及び／又は改善、皮膚のシワもしくはタルミの予防及び／又は改善に寄与すると考えられ、この観点から、線維芽細胞増殖促進作用を有する植物抽出物等を含有する化粧料や美容用飲食物が種々提案されている。
　例えば、特許文献１は、線維芽細胞増殖因子（FGF）とフコイダンとの複合体を線維芽細胞増殖促進剤として用いることを記載している。また、特許文献２は、（Ａ）ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、及びこれらの塩からなる群より選択される一種以上と、（Ｂ）ダイズタンパク質のサーモリシン分解物とを含有する組成物が、線維芽細胞増殖を促進するために使用され得ることを記載している。
　しかし、線維芽細胞増殖促進効果を発揮することができる、更なる有用な新規組成物の開発が求められている。
特開平10-17498号公報 特開2009-79043号公報
　本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、線維芽細胞の増殖を高度に促進させることができる、有用な新規組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有する短鎖ペプチド類と多糖類とを併用することにより、線維芽細胞の増殖を高度に促進させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
[１]　（Ａ）　下記の式（Ｉ）：
　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１）
［ここで、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す］
のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩と、
　（Ｂ）多糖類、
とを含有する組成物。
[２]　（Ａ）成分のペプチドが、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：２）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（配列番号：３）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：４）、又はＡｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（配列番号：５）で示されるアミノ酸配列からなる、[１]の組成物。
[３]　（Ｂ）成分の多糖類が、ヒアルロン酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アルギン酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、キサンタンガム、スクレロチウムガム、グアガム、タラガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、サイリウムシードガム、アラビアガム、カラヤガム、ジェランガム、カードラン、カラギーナン、クインスシード、サクシノグリカン、寒天、ペクチン、ポルフィラン、キチン、キトサン、セルロース、デキストラン、デキストリン、プルラン、デンプン、及びこれらの多糖の誘導体、並びに前記の多糖及びその誘導体の塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む、[１]又は[２]に記載の組成物。
[４]　（Ｂ）成分の多糖類が、ヒアルロン酸、フコイダン、ペクチン、カラギーナン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アルギン酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、及びヘパリンからなる群から選択される酸性多糖、及び該酸性多糖の誘導体、並びに前記酸性多糖及びその誘導体の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、[１]～[３]のいずれかの組成物。
[５]　（Ｂ）成分の多糖類が、ヒアルロン酸、フコイダン、キサンタンガム、スクレロチウムガム、デキストラン、及びそれらの誘導体、並びに前記多糖及びその誘導体の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、[１]～[４]のいずれかの組成物。
[６]　美容のために用いられる、[１]～[５]のいずれかに記載の組成物。
[７]　皮膚のシワ、タルミ、ハリ低下、弾力性低下、又は保湿機能低下の改善又は予防のために用いられる、[１]～[６]のいずれかに記載の組成物。
[８]　線維芽細胞の増殖を促進するために用いられる、[１]～[７]のいずれかに記載の組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-043881号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、線維芽細胞の増殖を効果的に促進することができる、有用な新規組成物が提供される。従って、本発明により、線維芽細胞の増殖を効果的に促進でき、紫外線照射等の外的因子や加齢等に起因した皮膚のシワやタルミを改善し、肌のハリや弾性を回復させ、皮膚の保湿機能を高めるために実用上有益に用いられ得る新規組成物が提供される。
　以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたって、単数形の表現は、特に他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書中において使用される用語は、特に他に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられていることが理解されるべきである。
　本発明の組成物は、（Ａ）次式（Ｉ）：Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１）のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩と、（Ｂ）多糖類とを含有する。
　（Ａ）成分：
　本発明の組成物に（Ａ）成分として配合されるペプチド類は、次式（Ｉ）：Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（一文字略記：Ｘ１ＤＬＤＶＸ２、配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩である。
　上記配列番号１におけるＸａａ１及びＸａａ２（一文字略記：Ｘ１及びＸ２）は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す。該アミノ酸は、好ましくはα－アミノ酸であり、より好ましくは遺伝的にコードされるα－アミノ酸である。より具体的には、Ｘａａ１及びＸａａ２は、天然に存在するＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ及びＶａｌからなる群から任意に選択されるα－アミノ酸であることが好ましく、Ａｒｇ又はＰｈｅであるα－アミノ酸がより好ましく、Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ２がＰｈｅであることが特に好ましい。Ｘａａ１及びＸａａ２は、存在してもしなくても良いが、Ｘａａ１及びＸａａ２のうちの少なくとも一つは存在する方が好ましい。
　上述のようなペプチドのうち、より確実に高い本発明の効果を得るためには、本発明で用いるペプチドは、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（一文字略記：ＤＬＤＶＦ、配列番号：２）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（一文字略記：ＲＤＬＤＶ、配列番号：３）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（一文字略記：ＲＤＬＤＶＦ、配列番号：４）、又はＡｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（一文字略記：ＤＬＤＶ、配列番号：５）であることが好ましく、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（一文字略記：ＤＬＤＶＦ、配列番号：２）、又はＡｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（一文字略記：ＲＤＬＤＶ、配列番号：３）であることが特に好ましい。
　本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、又はアセトアセチル化した誘導体等をいう。
　本明細書中において、「塩」とは、ペプチド又はその誘導体の薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）をいい、例えば、ペプチド又はその誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、有機酸塩（酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられ、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩、酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩である。
　本発明で用いるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、水和物又は無水和物であってもよい。また、本発明で用いるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、溶媒和物又は無溶媒和物であってもよい。
　本発明で用いるペプチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、本発明で用いるペプチドは、化学合成方法（例えば、固相法（例えば、Fmoc法）、液相法等）により合成されてもよく、また遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。なお本発明で用いるペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ－体であってもＤ－体であってもよいが、好ましくはＬ－体である。
　さらに本発明で用いるペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによって調製してもよい。
　当業者は、プロテアーゼの配列特異性等を考慮して、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドを切り出すために適切なプロテアーゼを適宜選択し得る。またタンパク質をプロテアーゼで加水分解する場合に用いられる反応条件は、特に制限されず、技術常識に従って当業者により適宜選択され得る。プロテアーゼによる加水分解処理後には、必要に応じ、当該分野で公知の手段によって精製することにより、目的のペプチドを精製することもできる。
　このように、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、化学合成方法で製造する場合よりもコスト面から有利となる。さらに、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、生体に対してより安全であると考えられる。従って、このようにして得られたペプチドは、生体への適用に対しより高い安全性が求められる内服剤、食品、敏感肌用化粧料、飼料などに好適に使用され得る。ここで、食品とは飲料品を含むすべての飲食物を含む。
　本発明で用いるペプチドの誘導体は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
　本発明で用いるペプチドの塩もまた、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
　本発明の組成物には、上記の特定配列を有するペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩から選択されるペプチド類の中から、１種を単独で使用しても、２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
　また本発明の組成物には、上記の特定配列を有するペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩のいずれもが用いられ得るが、より確実に高い本願効果を得るためには、好ましくはペプチド又はその塩が用いられ、特に好ましくはペプチドが用いられる。
　本発明の組成物に配合する（Ａ）成分の配合量は、本発明の効果を奏し得る限り特に制限されないが、通常は組成物全体に対して0.000001～70重量(w/w)％程度とするのがよい。とりわけ、本願組成物が外用組成物である場合には、上記配合量は少なくてもよく、例えば、0.000001～５w/w％、より好ましくは0.00001～１w/w％、さらに好ましくは0.00001～0.1w/w％としても十分な本願効果が得られる。
　（Ｂ）成分：
　本発明の組成物には、更に（Ｂ）成分として、多糖類が配合される。
　多糖類としては、医薬上又は生理学的に許容できるものであれば特に制限されず、例えば、ヒアルロン酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アルギン酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、キサンタンガム、スクレロチウムガム、グアガム、タラガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、サイリウムシードガム、アラビアガム、カラヤガム、ジェランガム、カードラン、カラギーナン、クインスシード、サクシノグリカン、寒天、ペクチン、ポルフィラン、キチン、キトサン、セルロース、デキストラン、デキストリン、プルラン、デンプン、及びこれらの多糖の誘導体、並びに前記の多糖又はその誘導体の塩などを含む。フコイダンには、グルクロン酸を含むU-フコイダン、硫酸化フコースのみからなるF-フコイダン、ガラクトースを含むG-フコイダン等があるが、本発明においては、フコイダンはこれらも含む。本発明において、多糖類という場合、上記の多糖、多糖の誘導体、多糖や多糖の誘導体の塩を含む。
　本発明における（Ｂ）成分の誘導体の形態としては、例えば、アセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、メチル化（モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化等）、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、アセトアセチル化、カルボキシル化、カルボキシメチル化、ヒドロキシル化、プロピル化、ヒドロキシプロピル化、ヒドロキシエトキシル化、メトキシル化、ヒドロキシプロポキシル化した誘導体等をいう。具体的には、（Ｂ）成分の誘導体として、アセチル化ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等を挙げることができる。
　本発明における（Ｂ）成分の塩の形態としては、薬理学的に許容されることを限度として、特に制限されないが、無機塩基との塩［例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）、アルミニウム等の金属との塩；アンモニウム塩等］；有機塩基との塩［例えば、メチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、ピペラジン、ピロリジン、トリピリジン、ピコリン等の有機アミンとの塩等］；無機酸塩［例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等］；有機酸塩［例えば、モノカルボン酸塩（酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酪酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩等）、多価カルボン酸塩（フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩等）、オキシカルボン酸塩（乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩等）等］等が挙げられる。
　本発明で用いる多糖類は多糖類を多く含む藻類や細菌等の生物材料から抽出してもよいし、市販のものを用いてもよい。
　本発明で（Ｂ）成分として用いられる多糖類の重量平均分子量は特に制限されないが、通常1000～10000000程度、好ましくは3000～7000000程度、より好ましくは5000～5000000程度、更に好ましくは10000～3000000程度、特に好ましくは100000～2000000程度のものを用いることができる。
　また、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸、その誘導体又はそれらの塩等は一般に粘度平均分子量として表わされる場合が多いが、粘度平均分子量で表わす場合にも同程度のものを使用することができ、特に制限されないが、通常1000～10000000程度、好ましくは3000～7000000程度、より好ましくは5000～5000000程度、更に好ましくは10000～3000000程度、特に好ましくは100000～2000000程度である。
　本発明の組成物には、上記多糖類の中から、１種を単独で使用しても、２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。上記（Ｂ）成分のなかでも、（Ａ）成分と一緒になってより効果的に線維芽細胞の増殖を促進させる作用を発揮できるという観点から、好ましくは、酸性多糖類（例えば、ヒアルロン酸、フコイダン、ペクチン、カラギーナン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アルギン酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩等）が挙げられ、特に好ましくは、ヒアルロン酸、フコイダン、キサンタンガム、及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩が挙げられる。また、ヒアルロン酸とフコイダンを混合して用いてもよいし、ヒアルロン酸とキサンタンガム、フコイダンとキサンタンガム、或いはヒアルロン酸とフコイダンとキサンタンガムを混合して用いてもよい。
　本発明の組成物に配合する（Ｂ）成分の配合量は、本発明の効果を奏し得る限り特に制限されないが、通常は組成物全体に対して0.000001～70重量(w/w)％程度とするのがよい。とりわけ、本発明の組成物が外用組成物である場合には、上記配合量は少なくてもよく、例えば、0.000001～５w/w％、より好ましくは0.00001～１w/w％、さらに好ましくは0.0001～0.3w/w％としても十分な本発明の効果が得られる。
　本発明の組成物において、（Ａ）成分に対する（Ｂ）成分の配合比率は、本発明の効果を奏し得る限り特に制限されないが、通常は（Ａ）成分の総量が１重量部に対して、（Ｂ）成分の総量が1～70000000重量部程度とするのがよい。より高い本願効果を発揮できるという観点から、好ましくは、（Ａ）成分の総量が１重量部に対して、（Ｂ）成分の総量が1～5000000重量部、より好ましくは10～500000重量部、さらに好ましくは50～50000重量部とするのがよい。
　後述の実施例に示すように、上記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を含有する本発明の組成物は、線維芽細胞の増殖を促進し得る。従って、本発明の組成物は、紫外線照射等の外的因子や加齢等により引き起こされる線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚のシワやタルミを改善するため、肌のハリや弾性を回復させるため、或いは皮膚の保湿機能を高めるためにまた有益に使用され得る。線維芽細胞に対する増殖促進作用は、例えば、培養用プレート中で線維芽細胞を被験物と共に培養した後、プレート上の生存細胞数を計測することにより測定することができ、本発明の（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを添加しない場合に対して、生存細胞数が有意に多くなった場合に、線維芽細胞の増殖が促進されたと判断することができる。
　当業者ならば、このような方法により線維芽細胞の増殖を促進し得る組成物が、紫外線照射等の外的因子や加齢等により引き起こされる線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚のシワやタルミを改善させ、肌のハリや弾性を回復させ、或いは肌の保湿機能を高める効果を有することを理解することができる。
　本発明の組成物は、好ましくは美容組成物である。該組成物は上記の機能を有する（Ａ）成分と（Ｂ）成分の組み合わせを含むため、美容効果を奏することができる。すなわち、上記（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを組み合わせて含有する本発明の組成物は、線維芽細胞の増殖を促進するという作用を有する。この作用により、皮膚のシワやタルミを改善し、肌のハリや弾性を回復させ、或いは肌の保湿機能を高めるという効果を発揮することができ、顕著な美容効果を奏することができる。本発明においては、顔や体つきを美しくすること（例えば、美肌等の美容）を目的として用い得る組成物を、美容組成物という。
　また、本発明の組成物は、医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物又は飼料組成物として好適に使用され得る。好ましくは、美容のために用いられる医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物及び飼料組成物である。さらに、本発明の組成物は、線維芽細胞の増殖能に関連する生理状態解明のための研究試薬として好適に使用され得る。
　医薬組成物としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物における線維芽細胞の減少や不活性化に起因する疾患の予防剤及び／又は治療剤等が挙げられる。具体的には、本発明の医薬組成物は、例えば、紫外線等の外的因子や加齢等により生じる線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚のシワ若しくはタルミの予防剤及び／又は治療剤として、線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚のハリ若しくは弾力性の低下に対する予防剤及び／又は治療剤として、線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚の保湿機能低下に対する予防剤及び／又は治療剤等として使用され得る。
　化粧料組成物としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物における線維芽細胞の減少や不活性化に起因する状態の予防及び／又は改善のための化粧料としても用いられ得る。具体的には、本発明の化粧料組成物は、例えば、紫外線等の外的因子や加齢等により生じる線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のための化粧料として、線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚のハリ若しくは弾力性の低下に対する予防及び／又は改善のための化粧料として、線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚の保湿機能低下に対する予防及び／又は改善のための化粧料等として使用され得る。
　食品組成物としては、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物における線維芽細胞の減少や不活性化に起因する状態の予防及び／又は改善のための食品としても用いられ得る。具体的には、本発明の食品組成物は、例えば、紫外線等の外的因子や加齢等により生じる線維芽細胞の減少と不活性化に起因する皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のための食品として、線維芽細胞の減少と不活性化に起因する皮膚のハリ若しくは弾力性の低下に対する予防及び／又は改善のための食品として、線維芽細胞の減少や不活性化に起因する皮膚の保湿機能低下に対する予防及び／又は改善のための食品等として使用され得る。
　本発明の食品組成物は、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、健康補助食品等を含む。これらの組成物は美容健康食品を含む。特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。これらの食品には、特定の実施形態において、上記のような用途に用いられるものである旨の表示を付した食品として提供され得る。すなわち、美容のために用いられるものである旨の表示、美肌作用を有する旨の表示、肌質改善のために用いられるものである旨の表示、皮膚のハリや弾性を回復させるために用いられるものである旨の表示、皮膚のシワやタルミの予防又は改善のために用いられるものである旨の表示、皮膚の保湿機能を回復させるために用いられるものである旨の表示等の表示を付した食品として提供され得る。
　飼料としては、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等の家畜や、イヌ、ネコ等のペット動物における、線維芽細胞の減少や不活性化に起因する状態の予防用及び／又は改善用の飼料等が挙げられる。
　本発明の組成物は、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の他に、製剤分野や食品分野等の分野において通常使用される担体、基剤、及び／又は添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合して調製することができる。
　担体としては、例えば、架橋ビニル重合体、脂質類等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
　基剤としては、例えば、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
　添加剤としては、例えば、界面活性剤、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、アミノ酸類、着色剤、香料等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
　さらに本発明の組成物には、必要に応じて他の有用な作用を付加するために、美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、ニキビ改善成分、コラーゲン等の生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等の各種成分を１種又は２種以上組み合わせて配合されてもよい。
　本発明の組成物は、内服剤（食品及び飼料を含む）又は外用剤(化粧料を含む)等の任意の剤型であり得る。
　内服剤（食品及び飼料を含む）としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤(ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む)、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、ゼリー剤等の任意の形態で使用され得る。
　また食品とする場合には、パン、麺、惣菜、食肉加工食品（例えば、ハム、ソーセージなど）、水産加工食品、調味料（例えば、ドレッシングなど）、乳製品、菓子（例えば、ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリームなど）、スープ、ジュースなどの任意の一般の食品に含有させた食品形態としても提供され得る。このような形態にする場合、前記の加水分解物は、目的とする食品の性質等に依存して、当業者に公知の方法により適宜配合され得る。
　外用剤としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状(基材担持)、エアゾール状、スプレー状等の任意の形態で使用され得る。
　化粧料としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、オイル、パック等の基礎化粧料、またファンデーション、頬紅、口紅等のメーキャップ化粧料、さらに洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料、入浴剤等の任意の形態で使用され得る。
　飼料としては、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。
　本発明はさらに、前記（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを併用することを特徴とする、線維芽細胞の増殖を促進する方法、皮膚のシワ、タルミ、ハリ低下、弾力性低下、又は保湿機能低下を改善又は予防する方法、或いは美容方法を提供する。かかる方法では、より簡便には、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を含む組成物の形態で被験体に適用するのがよい。適用は内服薬として適用してもよいし、外用剤として皮膚への塗布等により適用してもよい。
　本発明の方法においては、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を、線維芽細胞に対する増殖促進効果が得られる有効量以上の量で用いればよい。
　具体的には、本発明の方法における前記組成物の使用量は通常、内服剤の場合には、成人1人体重約50kgあたり好ましくは約0.001～10000mg/日、より好ましくは約1～1000mg/日、さらに好ましくは約1～100mg/日である。外用剤の場合における当該使用量は通常、成人１人体重約50kgあたり好ましくは約0.1μg～２g/日である。
　さらに外用剤として用いる場合、前記組成物の皮膚への適用量は、好ましくは約1ng～500μg/cm2、より好ましくは約0.01～50μg/cm2、さらに好ましくは約0.1～10μg/cm2である。
　本発明はさらに、線維芽細胞の増殖を促進するための組成物の製造のための、皮膚のシワ、タルミ、ハリ低下、弾力性低下、又は保湿機能低下の改善又は予防のための組成物の製造のための、或いは美容のための組成物の製造のための、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の使用を提供する。
　前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の使用量は、前記組成物中の含有量となるように使用すればよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１： DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチドの調製：
　ペプチドの合成：
　表題のペプチドを、ペプチド自動合成装置(島津製作所社製：PSSM8)を用いて、Fmoc法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである：まず固相合成用樹脂にFmoc－Phe（１－Trt）－OHのＣ末端を結合させてから、保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Val－OHをPheのＮ末端に導入した。次いで保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Asp(OtBu)－OHをValのＮ末端に導入した。次いで保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Leu－OHをAspのＮ末端に導入した。次いで保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Asp(OtBu)－OHをLeuのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、この樹脂からペプチド鎖の切り出しを行った。TFA(トリフルオロ酢酸)により、PheのTrt基とAspのtBu基を切断することにより脱保護した。最後に、分取HPLCで未反応物を除去して精製することによりDLDVFペプチドを得た。
　ペプチドの純度検定：
　得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Inertsil ODS－3 (内径：2.1mm、長さ： 50mm)、GL Sciences社製、；移動相：溶媒Ｉ（0.05％トリフルオロ酢酸）および溶媒II（0.05％トリフルオロ酢酸、100％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒II＝0％）～25分（溶媒II＝50％））；流速：0.2 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、14.8分に単一の鋭いピークが示され、純度は99.5％であった。
実施例２：RDLDV（Arg―Asp―Leu―Asp―Val）ペプチドの調製：
　ペプチドの合成：
　表題のペプチドを、ペプチド自動合成装置(島津製作所社製：PSSM8)を用いて、Fmoc法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである：まず固相合成用樹脂にFmoc－Val（１－Trt）－OHのＣ末端を結合させてから、保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Asp(OtBu)－OHをValのＮ末端に導入した。次いで保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Leu－OHをAspのＮ末端に導入した。次いで保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Asp(OtBu)－OHをLeuのＮ末端に導入した。次いで保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Fmoc－Arg(Pmc)－OHをAspのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Fmoc)をピペリジン処理で除去し、この樹脂からペプチド鎖の切り出しを行った。TFA(トリフルオロ酢酸)により、ValのTrt基とAspのtBu基、ArgのPmc基を切断することにより脱保護した。最後に、分取HPLCで未反応物を除去して精製することによりRDLDVを得た。
　ペプチドの純度検定：
　得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Inertsil ODS－3 (内径：2.1mm、長さ： 50mm)、GL Sciences社製、；移動相：溶媒Ｉ（0.05％トリフルオロ酢酸）および溶媒II（0.05％トリフルオロ酢酸、100％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒II＝0％）～30分（溶媒II＝70％））；流速：0.2 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、11.2分に単一の鋭いピークが示され、純度は99.2％であった。
実施例３：線維芽細胞増殖促進作用の評価（１）
　上記実施例１で調製したDLDVFペプチドと、各種多糖類（ヒアルロン酸、フコイダン）とを用いて、線維芽細胞に対する増殖促進効果について評価を行った。
　具体的には、先ず、96ウェルプレートの各ウェルに、被験ペプチドを所定濃度となるように希釈した無血清DMEM培地又は被験ペプチドを含まない無血清DMEM培地を50μLずつ添加し、37℃、5％炭酸ガス及び95％空気の環境下で1時間保温した。次いで、ヒト正常皮膚線維芽細胞を細胞数が約5,000 cells/wellとなる割合で播種し、液量150μLとなるように調整し、同条件下で6時間培養した（被験ペプチド含有群の最終ペプチド濃度5×10-5w/w%）。その後、各種多糖類を所定濃度で溶解させた同培地又は多糖類を含まない同培地を添加し、さらに48時間培養した（最終液量200μL/well）。その後、各ウェルの上清を除去し、MTT（3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）試薬を用いて生存細胞数を測定した。測定結果より、無血清DMEM培地のみ（コントロール）の場合の平均生存細胞数を100としたときの、各比較例群及び実施例群の平均生存細胞数の割合から、細胞増殖率を算出した。この結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記結果に示されるように、DLDVFペプチド自体には線維芽細胞の増殖を促進する効果は認められなかった（比較例１）。一方、ヒアルロン酸やフコイダン等の多糖類は単独で線維芽細胞を増殖する効果が認められたが、さらにDLDVFペプチドを併用することによって、これらの多糖類の線維芽細胞増殖促進作用が相乗効果的に増強されることが明らかとなった。
実施例４：線維芽細胞増殖促進作用の評価（２）
　上記実施例２で調製したRDLDVペプチドと、各種多糖類（ヒアルロン酸、フコイダン）とを用いて、線維芽細胞に対する増殖促進効果について評価を行った。試験方法は、試験に用いたペプチドが異なる以外は、上記実施例３と実質的に同じ方法で行った。
　上記実施例３と同様に、コントロールの平均生存細胞数を100とした場合の、各比較例群及び実施例群の平均生存細胞数の割合から細胞増殖率を算出した。この結果を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記結果に示されるように、DLDVFペプチドに替えてRDLDVペプチドを用いた場合でも、ヒアルロン酸やフコイダンといった多糖類にRDLDVペプチドを併用することによって、相乗効果的に線維芽細胞増殖促進効果が発揮されることが明らかとなった。
　実施例５：線維芽細胞増殖促進作用の評価（３）
　上記実施例１及び２で調製したDLDVFペプチド又はRDLDVペプチドと、多糖類の一種であるキサンタンガムとを用いて、線維芽細胞に対する増殖促進効果について評価を行った。試験方法は、試験に用いたペプチド及び多糖類の種類、並びに添加濃度が異なる以外は、上記実施例３と実質的に同じ方法で行った。
　上記実施例３と同様に、コントロールの平均生存細胞数を100とした場合の、各比較例群及び実施例群の平均生存細胞数の割合から細胞増殖率を算出した。この結果を下記の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記結果に示されるように、多糖類としてキサンタンガムを用いた場合でも、ヒアルロン酸やフコイダンといった多糖類を用いた場合と同様に、DLDVFペプチド又はRDLDVペプチドを併用することによって、相乗効果的に線維芽細胞増殖促進効果が発揮されることが明らかとなった。
　実施例６：線維芽細胞増殖促進作用の評価（４）
　上記実施例１及び２で調製したDLDVFペプチド又はRDLDVペプチドと、多糖類の一種であるスクレロチウムガム（INCI名：Sclerotium gum）とを用いて、線維芽細胞に対する増殖促進効果について評価を行った。試験方法は、試験に用いたペプチド及び多糖類の種類、並びに添加濃度が異なる以外は、上記実施例３と実質的に同じ方法で行った。
　上記実施例３と同様に、コントロールの平均生存細胞数を100とした場合の、各比較例群及び実施例群の平均生存細胞数の割合から細胞増殖率を算出した。この結果を下記の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記結果に示されるように、多糖類としてスクレロチウムガムを用いた場合でも、他の多糖類を用いた場合と同様に、DLDVFペプチド又はRDLDVペプチドを併用することによって、相乗効果的に線維芽細胞増殖促進効果が発揮されることが明らかとなった。
　実施例７：線維芽細胞増殖促進作用の評価（５）
　上記実施例１で調製したDLDVFペプチドと、多糖類の一種であるデキストランとを用いて、線維芽細胞に対する増殖促進効果について評価を行った。試験方法は、試験に用いた多糖類の種類及び添加濃度が異なる以外は、上記実施例３と実質的に同じ方法で行った。
　上記実施例３と同様に、コントロールの平均生存細胞数を100とした場合の、各比較例群及び実施例群の平均生存細胞数の割合から細胞増殖率を算出した。この結果を下記の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記結果に示されるように、多糖類としてデキストランを用いた場合でも、他の多糖類を用いた場合と同様に、DLDVFペプチドを併用することによって、相乗効果的に線維芽細胞増殖促進効果が発揮されることが明らかとなった。
総合考察：
　実施例３～７に示されるように、DLDVFペプチドとRDLDVペプチドのいずれのペプチドを用いた場合でも、各種多糖類と組み合わせることにより相乗効果的に線維芽細胞増殖促進効果が発揮されることが認められた。両ペプチドは、DLDV配列をコア配列として共有し、そのＮ末端又はＣ末端に任意の１アミノ酸を付加したペプチドという点で共通する。よってこれらの結果から、DLDVというコア配列を有しN末端又はC末端に任意に１個のアミノ酸を付加してもよいペプチドを用いることにより、各種多糖類と併用することで線維芽細胞の増殖を効果的に促進し得ることが示された。また多糖類も、ヒアルロン酸やフコイダン、キサンタンガム、スクレロチウムガム、デキストラン等の種々の多糖類で効果が発揮されることが認められた。
　本発明の特定ペプチド類と多糖類とを含む組成物は、線維芽細胞の増殖を促進することができるので、紫外線等の外的因子或いは加齢等により低下した線維芽細胞の増殖能を活性化させ、皮膚のシワやタルミを改善し、肌のハリや弾性を回復させ、肌の保湿機能を高めることができるので、美容のために有益に利用できる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　配列番号１～５　合成

Claims (8)

  1. 　（Ａ）　下記の式（Ｉ）：
    　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１）
    ［ここで、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す］
    のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩と、
    　（Ｂ）多糖類、
    とを含有する組成物。
  2. 　（Ａ）成分のペプチドが、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：２）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（配列番号：３）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：４）、又はＡｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（配列番号：５）で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
  3. 　（Ｂ）成分の多糖類が、ヒアルロン酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アルギン酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、キサンタンガム、スクレロチウムガム、グアガム、タラガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、サイリウムシードガム、アラビアガム、カラヤガム、ジェランガム、カードラン、カラギーナン、クインスシード、サクシノグリカン、寒天、ペクチン、ポルフィラン、キチン、キトサン、セルロース、デキストラン、デキストリン、プルラン、デンプン、及びこれらの多糖の誘導体、並びに前記の多糖及びその誘導体の塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　（Ｂ）成分の多糖類が、ヒアルロン酸、フコイダン、ペクチン、カラギーナン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アルギン酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、及びヘパリンからなる群から選択される酸性多糖、及び該酸性多糖の誘導体、並びに前記酸性多糖及びその誘導体の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 　（Ｂ）成分の多糖類が、ヒアルロン酸、フコイダン、キサンタンガム、スクレロチウムガム、デキストラン、及びそれらの誘導体、並びに前記多糖及びその誘導体の塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　美容のために用いられる、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　皮膚のシワ、タルミ、ハリ低下、弾力性低下、又は保湿機能低下の改善又は予防のために用いられる、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  8. 　線維芽細胞の増殖を促進するために用いられる、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
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