KR20200039651A - 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 카르복시 말단이 아미드화된 펩타이드와 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 카르복시 말단이 아미드화된 펩타이드와 이를 포함하는 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 구성되는펩타이드와 이를 유효성분으로 포함하는 색소침착질환 치료용 약학적 조성물, 화장료 조성물, 그리고 식품용 조성물에 대한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 세포 생존율은 손상시키지 않으면서 매우 효과적으로 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있기 때문에 색소침착치료용 의약품 조성물, 화장품, 그리고 기능성 식품으로 개발되는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 카르복시 말단이 아미드화된 펩타이드와 이를 포함하는 조성물{C-terminal amidated peptides with melanogenesis-inhibiting activity and compositions thereof}
본 발명은 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 카르복시 말단이 아미드화된 펩타이드와 이를 포함하는 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드와 이를 포함하는 색소침착질환 치료용 약학적 조성물 및 화장료 조성물, 그리고 식품용 조성물에 대한 것이다.
멜라닌은 피부, 머리카락, 눈 그리고 다른 색소가 침착되는 조직에 존재하는 갈색 또는 흑색의 색소로, 사람의 외모에서 큰 비중을 차지하며, 피부 항상성을 유지하는 데에도 중요하다. 피부의 멜라닌 생합성은 호르몬 변화와 영양 상태 등 다양한 요인의 영향을 받으며, 멜라닌이 정상적으로 생성되지 않고 생합성 과정이 교란되면 색소 침착 감소 또는 과잉 색소 침착으로 분류되는 색소 침착의 결함이 발생하게 된다. 색소 침착의 결함은 유전적이거나 후천적일 수 있고, 일시적이거나 영구적일 수 있으며, 또한 신체 일부 또는 전체적으로 발생할 수 있다. 멜라닌이 비정상적으로 축적되거나 분포하게 되면 외관상 비호감을 줄 수 있는 기미, 주근깨, 노인성 흑점 등이 유발되기 때문에, 원치 않는 멜라닌의 축적을 방지하는 것은 화장품 업계의 초미의 관심사이다.
멜라노사이트(멜라닌 형성 세포, melanocyte)는 체내 내분비계 뿐 아니라, 자외선과 약물 등과 같은 외부적인 요인과도 상호작용한다. 피부에서 하나의 멜라노사이트는 약 30~40여개의 케라티노사이트(keratinocyte)에 둘러싸여 있으며, 멜라닌 생성은 폐쇄 측분비계(closed paracrine system)의 조절을 받는다. 멜라닌은 멜라노사이트 내 세포소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 L-타이로신(L-tyrosine)으로부터 연쇄적인 효소 반응에 의하여 합성된다. 케라티노사이트는 멜라노사이트를 자극하여 멜라노좀을 성숙시키고 멜라닌 생합성을 촉진하는 신호전달 물질을 분비한다. 멜라닌을 축적한 성숙한 멜라노좀은 멜라노사이트의 수상돌기(dendrite)로부터 분비되어 인접한 케라티노사이트의 세포질로 전달된다.
α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)은 멜라닌 생성에 매우 중요하다. α-MSH는 Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 멜라노코틴 1 수용체(melanocortin 1 receptor, MC1-R)의 작용제이다. 작용제가 MC1-R에 결합하면, MC1-R은 아데닐 사이클라제(adenylate cyclase)를 활성화하고, cAMP가 증가하여 PKA가 활성화되며, PKA는 cAMP 반응성 단백질 전사인자(cAMP-responsive element binding protein transcription factor)를 인산화하여 최종적으로 소안구 관련 전사인자(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)를 활성화시킨다. MITF는 또한 Wnt, GSK3β, 그리고 MAPK 신호전달계에 의하여 활성화되며, 다양한 자극에 반응하여 타이로시나제(TYR), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1), 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase, DCT; tyrosinase-related protein 2, TYRP2라고도 불림) 등 멜라닌 생합성에 관련된 효소의 발현 수준을 조절한다. 아구티 신호전달 단백질(Agouti)는 α-MSH와 경쟁적인 MC1-R의 길항제로 알려져 있으며, 멜라닌 생성을 억제한다.
펩타이드는 피부 관리에 적합한 생활성(bioactivity)으로 인해 화장품 및 의료용 화장품(cosmoceutical)의 유효성분으로 주목받아 왔으며, 다양한 펩타이드가 이미 화장품 성분으로 포함되고 있다. 펩타이드의 아미노산 서열은 매우 다양하여 다양한 작용 방식이 가능하다. 나아가 펩타이드는 특히 독성이 없는 자연적인 아미노산으로 분해된다. 그러나 펩타이드의 결점은 펩타이드 생합성의 비용이 많이 들고, 이온성으로 인해 피부 투과가 비효율적이라는 결점도 있다. 팔미토일 펜타펩타이드-4(palmitoyl pentapeptide-4, KTTKS), 글리신-히스티딘-라이신-Cu(glycyl-histidyl-lysine, (GHK)-Cu) 그리고 아세틸 헥사펩타이드(acetyl hexapeptide, Argirelineⓡ) 등은 피부 노화의 특정 일면을 완화시킨다. 멜라닌 생성 억제 효과를 갖는 펩타이드는 디설파닐 펩타이드(disulfarnyl peptide)와 안지오-S(Angio-S, SFKLRY-NH2) 등이 보고된 바 있다.
본 발명자들은 세포 멜라닌 생성을 억제하는 펩타이드 억제자를 개발하기 위하여, 다양한 생활성 펩타이드를 스크리닝하는데 효과적으로 사용되어 온 합성 펩티드 조합 라이브러리의 위치 스캐닝(positional scanning of synthetic peptide combinatorial library, PS-SPCL) 방법을 적용하였다. PS-SPCL과 α-MSH로 자극한 설치류 멜라노마(murine melanoma) B16-F10 세포주를 이용하여 멜라닌 생성 억제 활성을 가질 것으로 예상되는 펩타이드를 판별하고 그 효과를 확인하였다.
이에 본 발명자들은 positional scanning of synthetic peptide combinatorial library(PS-SPCL)을 바탕으로 1 내지 4개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 스크리닝하고, 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성이 있는 신규한 펩타이드를 동정하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 포함하는 식품용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 카르복시 말단이 아미드화(-NH 2 )된 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 "단백질" 또는 "펩타이드, 펩티드(peptide)"와 호환성있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 1 내지 4개의 아미노산 서열로 이루어진 것으로서, 본 명세서에서는 디펩타이드(dipeptide), 트리펩타이드(tripeptide), 및 테트라펩타이드(tetrapeptide)로 지칭하기도 한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply):　피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
또한 본 명세서의 모든 펩타이드의 아미노산 서열은 생화학 분야의 표준 규정에 따라 아미노 말단(N-말단, amino terminal 또는 N-terminal)으로부터 카르복시 말단(C-말단, carboxy terminal 또는 C-terminal)의 방향으로 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 펩타이드의 카르복시 말단에 아미노 작용기(-NH2)가 표시되어 있는 경우, 이는 아미노산 서열의 아미노 말단을 의미하는 것이 아니라, 펩타이드의 화학적 합성 방법인 카르복시 말단 아미드화에 의하여 카르복시 말단에 아미노 작용기가 부가된 것을 나타내는 것이다.
상기 본 발명에 따른 펩타이드는 구체적으로는 카르복시 말단이 아미드화된 서열번호 1 (Arg-Phe-Cys-Gly-NH2; D1 펩타이드), 서열번호 2(Arg-Phe-Cys-Arg-NH2; D2 펩타이드), 서열번호 3(Arg-Phe-Trp-Gly-NH2; D3 peptide), 서열번호 4(Arg-Phe -Trp-Arg-NH2; D4 peptide), 서열번호 5(Arg-Leu-Trp-Gly-NH2; D5 peptide), 서열번호 6(Arg-Leu-Trp-Arg-NH2, D6 peptide), 서열번호 7(Arg-Leu-Cys-Gly-NH2; D7 peptide), 서열번호 8(Arg-Leu-Cys-Arg-NH2; D8 peptide), 서열번호 9(Phe-Arg-Trp -Gly; D9 peptide) 서열번호 10 (Arg-Phe-Trp-NH2; E1 펩타이드), 서열번호 11(Arg-Phe-Gly-NH2; E2 펩타이드), 서열번호 12(Arg-Leu-Gly-NH2; E3 peptide), 서열번호 13(Arg-Leu-Trp-NH2; E4 peptide), 서열번호 14(Phe-Trp-Gly-NH2; E5 peptide), 서열번호 15(Leu-Trp-Gly-NH2, E6 peptide), 서열번호 16(Arg-Trp-Gly-NH2; E7 peptide), 서열번호 17(Trp-Gly-NH2; F1 peptide), 서열번호 18(Gly-NH2; G1 peptide)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9 내지 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 더 바람직하게는 서열번호 14 내지 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명자들이 실시예에서 확인한 바에 따르면, 상기 펩타이드는 모두 멜라닌 생성 억제 효과가 있으며 구체적으로 세포 멜라닌 함량을 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한 본 발명자가 확인한 바에 따르면 상기 펩타이드는 B16-F10 세포를 α-MSH로 자극한 경우에 국한하여 멜라닌 생성을 억제하는 것이 아니라, 멜라닌 세포의 종류나 멜라닌 생성 유발 물질에 상관없이 멜라닌 생성 억제 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 즉 인간 표피 멜라노사이트에서도 foskolin, theophylline, cAMP, stem cell factor, 자외선 등 다양한 자극에 의해 유발되는 멜라닌 생성을 억제한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 천연에서 유래한 것일 수 있으며, 공지의 폴리펩타이드 합성 방법(유전공학적 방법, 화학적 합성)을 이용하여 합성될 수 있다. 유전공학적 방법에 의한 펩타이드의 제작은, 예를 들어, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산을 제작함으로써 실시할 수 있다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 준비할 수 있다. 또는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence; 예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시켜 재조합 발현 벡터로 제작하고 숙주세포에 형질전환시킨 후, 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산으로부터 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 회수하게 된다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 본 발명자들은 C-말단 아미드화(amidation) 반응을 이용하여 화학적으로 합성된 펩타이드를 이용하였다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 멜라닌 생성 억제의 효과를 갖는 이의 아미노산 서열 변이체 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩타이드로서, 멜라닌 생성 억제의 효과를 유지하고 있는 것을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
또한 필요에 따라 본 발명의 펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아미드화 (amidation) 등으로 적절한 작용기가 부가될 수도 있다.
본 발명은 상기 본 발명에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 독성이 매우 낮고, 멜라닌 생성 억제 효과가 뛰어나므로, 이를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 과도한 멜라닌 색소 침착의 병리 상태, 예를 들어 노화/광노화, 임신 등 급격한 호르몬의 변화, 상처, 염증, 화상 등으로 인한 피부 손상과 재생 등을 원인으로 한 색소 침착, 기미, 주근깨, 잡티, 점, 반점, 오타모반, 검버섯, 노인성 흑자, 멜라닌피부증 등을 개선하고 완화하기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 바람직하게는 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물일 수 있으며, 피부에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하는데 도움을 주는 기능을 가질 수 있으며, 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착하는 것을 방지하여 피부 색소 침착 질환의 발생을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
상기 피부 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 다크서클, 흑색점, 검버섯, 멜라닌세포모반, 밀크커피반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반, 유두 색소 침착, 소음순 색소 침착 및 잡티 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에는 본 발명에 따른 펩타이드를 한 종류를 선택하여 단독으로 포함할 수도 있고, 두 가지 이상을 선택하여 혼합하여 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 그 자체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고, 인간에게 투여될 때 활성성분의 작용을 저해하지 않으며, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함하며, 바람직하게는 염산일 수 있다.
본 발명에 따른 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 멜라닌 생합성 억제 또는 미백의 효과를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 멜라닌 생성 억제 또는 미백 효과를 나타내는 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 10000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 멜라닌 생성이 주로 일어나는 부분은 피부이므로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경피로 투여되는 것이 주된 투여 경로가 될 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피투여제의 경우, 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나, 멜라닌 생성 억제 또는 미백 효과가 있는 공지의 물질(예 : 화합물)과 병용하여 투여할 수 있다
본 발명은 상기 본 발명에 따른 펩타이드를 하나 이상 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 뛰어나고 세포 독성이 매우 늦으므로, 본 발명에 따른 펩타이드를 하나이상 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에는 본 발명에 따른 펩타이드를 선택하여 단독으로 포함할 수도 있고, 두 가지 이상을 선택하여 혼합하여 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로,
피부 미백을 원하는 부위에 제한없이 사용될 수 있으나, 그 예시로 얼굴, 유두, 유륜, 외음부, 복벽정중선, 배꼽, 겨드랑이, 팔꿈치, 무릎 등 색소침착이 일어난 부위에 사용될 수 있다.
특히, 여성에 따라 유두 또는 외음부의 멜라닌 색소 분포가 상이하고, 멜라닌 색소 분포량에 따라 분홍에서 검정 등으로 변하게 되는 바, 본 발명의 멜라닌 생성 억제 활성을 가진 펩타이드를 사용하여 상기 부위 색에 의해 스트레스를 받는 여성에게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드 이외에도 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명에 따른 펩타이드 외에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
적합한 화장료 조성물의 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는 이에 한정되는 것은 아니나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 바디크림, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 트리트먼트, 미용액, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
상기 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 본 발명의 펩타이드의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량% 범위로 함유될 수 있으며, 이는 목적하는 미백의 효과, 도포 정도, 제형의 종류, 화장료 조성물 내 펩타이드의 안정성 등의 요인을 고려하여 통상의 기술자가 적절하게 결정할 수 있다.
본 발명은 상기 본 발명에 따른 펩타이드를 하나 이상 포함하는 식품용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 펩타이드를 하나 이상 포함하는 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강기능식품 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 식품용 조성물에는 본 발명에 따른 펩타이드를 선택하여 단독으로 포함할 수도 있고, 두 가지 이상을 선택하여 혼합하여 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 식품 조성물이다.
또한, 본 발명에 따른 식품용 조성물은 미백용 식품 조성물일 수 있다.
상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품용 조성물은 멜라닌 생성 억제나 미백의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로 서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 펩타이드를 포함하는 식품첨가제를 식품에 보존료, 살균제, 산화 방지제, 향신료, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 여러 가지 영양제, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색료, 발색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 소포제, 용제, 이형제, 방부제, 품질 개량제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등 또는 기타 식품제조용 첨가제 또는 식품소재(부원료)의 필수원료로 사용하는 것을 특징으로 하는 식품첨가제를 제공한다. 이때 식품첨가제는 식품에 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 식품에 첨가할 수 있다.
또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드의 식품용 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.00001 내지 100중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량% 이다.
따라서, 본 발명은 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 신규한 펩타이드와 이를 유효성분으로 포함하는 약학적, 화장료 또는 식품용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 생존율은 손상시키지 않으면서 매우 효과적으로 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있다.
도 1a는 세포 내 멜라닌 생성에 대한 합성 펩티드 조합 라이브러리의 위치 스캐닝(PS-SPCL) 결과이다. 설치류 멜라노마 세포주인 B16-F10 세포를 vehicle 대조군 또는 해당 펩타이드 풀로 자극하고 멜라닌 함량을 측정하였다. 각각의 패널은 아미노산 서열이 확인된 테트라펩타이드의 풀(tetrapeptide pool)로부터 얻어진 결과를 나타내며, 패널 상단의 X와 O의 서열은 테트라펩타이드 풀의 아미노산의 위치적 특성을 나타낸다. O 위치는 각각 20가지의 L-아미노산 중 한 가지로 결정되며, 나머지 다섯 개의 X는 20가지의 L-아미노산의 혼합으로 구성된다. 도 1b는 펩타이드 조합별 MTT assay 시혐결과로, B16-F10 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. [도 1a *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05, 도 1b * : 대조군 대비 p<0.05]
도 2a는 각각의 테트라펩타이드가 세포 멜라닌 생합성에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다. 도 2a의 세포 기반 어세이는 B16-F10 세포를 vehicle 또는 특정 농도의 펩타이드로 처리한 후 100nM의 α-MSH로 자극하고 72시간 후 475nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 측정한 것이다. 도 2a에 기재되어 있는 아미노산 서열은 모두 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 기재된 것이다. 펩타이드 말단에 표시된 아미노 작용기(-NH2)는 펩타이드 합성에 이용된 카르복시 말단 아미드화에 의하여 부가된 것을 나타낸다. 도 2b는 각각의 테트라펩타이드의 MTT assay 시험 결과로, 각각의 테트라펩타이드가 B16-F10 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. [도 2a *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05, 도 2b * : 대조군 대비 p<0.05]
도 3a는 D3, D5, D9 테트라펩타이드가 B16-F10 세포의 멜라닌 함량에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다. 도 3a은 10 - 30μM 농도의 펩타이드로 처리하고 100nM의 α-MSH로 72시간 동안 자극한 세포의 멜라닌 함량을 나타낸다. 멜라닌 함량은 총 단백질 함량에 대하여 표준화하였다. 도 3b는 D3, D5, D9 테트라펩타이드의 MTT assay 시험 결과로, 각각의 테트라펩타이드가 B16-F10 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. 도 3은 양성대조군으로 쿠마릭산과 알부틴을 이용하였다. [도 3a *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05, 도 3b * : 대조군 대비 p<0.05]
도 4a는 아미노산 2 또는 3개의 서열이 정의된 펩타이드들의 효과를 나타낸다. 도 4a의 세포 기반 어세이는 B16-F10 세포를 vehicle 또는 특정 농도의 펩타이드로 처리한 후 100nM의 α-MSH로 자극하고 72시간 후 475nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 측정한 것이다. 도 4b는 아미노산 2 또는 3개의 서열이 정의된 펩타이드들의 MTT assay 시험 결과로, 각각의 펩타이드가 B16-F10 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. [도 4a *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05, 도 4b * : 대조군 대비 p<0.05]
도 5a는 글라이신 유도체들이 B16-F10 세포의 멜라닌 함량에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다. 도 5a는 다양한 농도의 글라이신 유도체로 처리하고 100nM의 α-MSH로 72시간 동안 자극한 세포의 멜라닌 함량을 나타낸다. 멜라닌 함량은 총 단백질 함량에 대하여 표준화하였다. 도 5b는 글라이신 유도체들의 서열이 정의된 펩타이드들의 MTT assay 시험 결과로, 각각의 펩타이드가 B16-F10 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. 도 5는 양성대조군으로 쿠마릭산과 알부틴을 이용하였다. [도 5a *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05, 도 5b * : 대조군 대비 p<0.05]
도 6a는 α-MSH로 자극한 HEMs 세포주에 테트라펩타이드 D3, 트리펩타이드 E5, 디펩타이드 F1, 모노펩타이드 G1가 세포 외 및 내 멜라닌 함량에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다. 도 6b는 HEMs 세포주에 대한 MTT assay 시험 결과로, 각각의 펩타이드가 HEMs 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. [도 6a *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05, 도 6b * : 대조군 대비 p<0.05]
도 7a는 글라이신아마이드-염산염(Glycinamide-HCl)의 MTT assay 시험 결과로, B16-F10 세포 생존율에 미친 영향을 보여준다. 도 7b은 글라이신아마이드-염산염(Glycinamide-HCl)이 B16-F10 세포의 멜라닌 함량에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다. [도 7a * : 대조군 대비 p<0.05, 도 7b *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05]
도 8a은 글라이신아마이드-염산염(Glycinamide-HCl이 α-MSH로 자극한 B16-F10 세포주에 대하여, 타이로시나제 (TYR)의 활성을 보여준다. 도 8b는 TYR (tyrosinase), TYRP1 (tyrosinase-related protein 1), DCT(dopachrometautomerase) 및 β-actin의 단백질의 발현 수준을 보여준다. [*: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05]
도 9은 글라이신아마이드-염산염(Glycinamide-HCl이 α-MSH로 자극한 B16-F10 세포주에 대하여, cAMP 반응성 요소 결합 단백질(CREB, cAMP-responsive element binding protein) 및 세포 외 신호 조절 키나아제(ERK, extracellular signal-regulated kinase)의 인산화 수준, 및 소안구 관련 전사 인자(MITF, microphthalmia-associated transcription)의 단백질 수준에 미치는 영향을 보여준다. [도 9a * : 그룹들 대비 p<0.05, 도 9b *: α-MSH로만 자극한 세포 대비 p<0.05]
도 10은 본 발명에서 규명된 멜라닌 생성 억제활성을 갖는 펩타이드 서열을 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
펩타이드 합성
합성 테트라펩타이드 조합 라이브러리 패키지(synthetic tetrapeptide combinatorial library package)는 펩트론(대전, 대한민국)에서 구입하였다. 라이브러리는 4가지의 위치 서브라이브러리(positional sub-libraries) 즉, OXXX-NH2, XOXX-NH2, XXOX-NH2, 그리고 XXXO-NH2으로 구성되어 있다. 상기에서 O 위치는 각각 어느 20가지 L-amino acid 중 하나이고, X 위치는 20가지 L-amino acid의 등몰 혼합물(equimolar mixture)로 구성되어 있다. 라이브러리의 펩타이드는 C-말단 amidation 반응으로 합성하였다.
추가적으로 펩타이드 풀과 각각의 펩타이드는 Peptron Co.(Daejeon, Korea)의 펩타이드 주문 제작 서비스를 이용하여 제조하였다. 실시예에서는 카르복시 말단 아미드화 반응을 이용하여 화학적으로 합성된 펩타이드를 이용하였다. 펩타이드의 종류나 순도는 질량분석(mass spectrometry, MS)과 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 확인하였다.
세포 배양
세포는 37℃, 5% CO2 조건의 가습 배양기에서 배양하였다. Murine melanoma B16-F10 세포주는 the American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 항생제(100U/mL penicillin, 0.1mg/mL streptomycin, 0.25μg/mL amphotericinB)를 포함하는 Dulbecco' Modified Eagle Medium으로 배양하였다. 색소 침착된 인간 신생아의 포피에서 유래한 인간 상피 멜라노사이트(human epidermal melanocyte, HEM)은 Cascade Biologics(Portland, OR, USA)에서 구입하여 인간의 멜라노사이트 성장 보조인자(human melanocyte growth supplements, Cascade Biologics)와 항생제를 포함하는 medium 254로 배양하였다.
세포 생존율(cell viability)
세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하여 측정하였다. B16-F10 세포주는 다양한 농도의 시험 펩타이드로 72시간 동안 처리하였다. 세포들은 PBS로 세척하고, 1mg/mL MTT(Amresco, Solon, OH, USA)를 첨가한 100μl의 배양액으로 3시간 동안 배양하였다. 이후 배양액은 제거하고, 세포 내부에 축적된 formazan을 100 ㎕의 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 추출하였다. 추출된 용액의 흡광도는 SPECTROstar Nano microplate reader (BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, Germany)를 사용하여 595 nm에서 측정 하였다.
멜라닌 생성 억제 활성
분석 대상 펩타이드의 멜라닌 형성 억제 효과는 B16-F10 세포주 및 HEM을 이용하여 확인하였다. B16-F10 세포는 다양한 농도의 시험 펩타이드로 처리하고, 100nM α-MSH를 이용하여 72시간 동안 자극하였다. 대조군으로 헥사펩타이드 B6 (Phe-Ser-His-His-Leu-Gly-NH2), p-쿠마르산(p-Coumaric acid)과 알부틴(arbutin)을 이용하였다. 세포를 배양한 배지(conditioned medium)를 이용하여 세포 외 멜라닌(extracellular melanin) 수준을 측정하였다. 세포 내 멜라닌(intracellular melanin)은 60℃에서 60분 동안 1.0 M NaOH를 이용하여 추출하였다. 멜라닌 함량은 475nm에서 흡광도를 측정하여 분광학적으로 측정하였으며, 도출된 수치는 Bio-Rad DC assay를 이용하여 세포의 총 단백질 함량에 대하여 표준화하였다(normalization).
TYR 활성 평가(TYR activity assay)
B16-F10 세포는 글라이신아마이드 염산염으로 60분간 처리하고, 100nM α-MSH를 이용하여 24시간 동안 자극하였다. 120 mM 염화나트륨, 25 mM 칼륨 클로라이드, 2.0 mM 에틸렌글리콜 테트라아세트산, 1.0 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산, 0.5% 트리톤 X-100, Protease inhibitor cocktail(Roche, Mannheim, Germany)을 함유하는 차가운 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)에 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 13,000 x g에서 15분간 4 ℃에서 원심 분리하여 cell-free 추출물을 얻었다. TYR 활성은 L-티로신(L-tyrosine) 및 L-3,4-디히드록시 페닐알라닌(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)을 사용하여 측정하였다. 반응 혼합물 (200μL)은 100 mM 인산 나트륨 (pH 6.8), 1.0 mM L-티로신, 42μM L-3,4-디히드록시 페닐알라닌 및 37 ℃에서 배양한 무세포 추출물 (40μg 단백질)로 이루어져 있다. 흡광도의 변화는 Spectrostar Nano microplate reader를 사용하여 475 nm에서 측정되었다.
웨스턴 블롯(Western blotting)
웨스턴 블롯은 문헌 [Study on phenolic compounds and novel peptides inhibiting UVB- and PM10-induced MMP1 expression and melanogenesis in skin cells. PhD Thesis 2017. Kyungpook National University, Korea.]에 기재된 바와 같이 수행하였다. B16-F10 세포를 150 mM NaCl, 5mM EDTA, 0.1 % 소듐도데실설페이트(SDS), 1% 트리톤 X-100, 1% 데옥시콜레이트, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 및 Protease inhibitor cocktail (Roche)을 포함하는 차가운 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)에 용해하였다. 세포 용해물 (단백질 30μg)의 일부를 Laemmli sample buffer과 혼합하고 95 ℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음 10% SDS- 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 단백질을 겔로부터 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK)으로 옮겼다. TYR, TYRP1, DCT, MITF 및 β-actin에 대한 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. CREB, phospho-CREB(Ser133), 세포외 signal-regulated kinase(ERK), phospho-ERK(Thr202/Tyr204)에 대한 1차 항체는 Cell Signaling(미국 메사추세츠 주 Danvers 소재)에서 구입하였다. 막을 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양한 후, 실온에서 1시간 동안 홀스래디쉬 퍼옥시다아제와 결합된 2차 항체(Cell Signaling)와 함께 배양하였다. 단백질 밴드는 picoEPD Western Reagent kit(Elpis-Biotech, 대전, 한국)를 사용하여 가시화하였고, 이미지 밀도는 National Institutes of Health ImageJ 프로그램을 사용하여 분석하였다.
통계 분석
데이터는 3번 이상 독립 실험의 결과를 평균±표준오차(mean±n=3)로 표시하였다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 p<0.05를 기준으로 판단하였으며 대조군에 대해 통계적으로 유의한 차이가 있는 경우 *로 표시하였다.
실시예 1 : PS-SPCL을 이용한 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 펩타이드의 동정
PS-SPCL을 이용한 스크리닝을은 합성 테트라펩타이드 조합 라이브러리(synthetic tetrapeptide combinatorial library)의 모든 펩타이드 풀(pool)을 α-MSH으로 자극한 B16-F10 멜라노마 세포에 처리하여 멜라닌 생성에 미치는 효과를 관찰하여 실시하였다(도 1a).
α-MSH은 예상대로 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 증가시켰으며, 이는 1.0 mM 농도의 다양한 테트라펩타이드 풀에 의하여 다양한 정도로 약화되었는데, 그 중 특히 멜라닌 생성에 대하여 우수한 억제 효과를 갖는 테트라펩타이드 풀이 확인되었다. 상기 실험 결과와 확인된 펩타이드 풀의 아미노산 서열에 따라, 아미노산 잔기의 첫번째 위치에 아르기닌 잔기를 가진 펩타이드 풀은 α-MSH에 의해 자극된 세포에서 멜라닌 생성을 유의적으로 억제하였다. 유사하게,두번째 위치에서 페닐알라닌 또는 류신, 세번째 위치에서 시스테인 또는 트립토판, 네번째 위치에서 글리신, 아르기닌 또는 시스테인을 갖는 것들은 멜라닌 합성에 대해 유의적인 억제 효과를 나타내었다. 따라서, 위치 스캐닝 결과에 따라 다음과 같이 항 멜라닌 생성 효과를 갖는 테트라펩타이드의 서열을 예측 하였다 : (Arg)-(Phe/Leu)-(Cys/Trp)-(Gly/Arg/Cys)-NH2.
실시예 2 : 개별 테트라펩타이드의 멜라닌 생성 억제 효과
앞선 실시예의 PS-SPCL 결과에 따라, 아미노산 서열의 각각의 위치에 특정한 아미노산을 갖는 8가지의 개별 테트라펩타이드를 합성하였다(도 2a 및 도 3a). 이들 테트라펩타이드는 아미노 말단으로부터 첫 번째 위치에는 Arg; 두 번째 위치에는 Phe 또는 Leu; 세 번째 위치에는 Cys 또는 Trp, 네번째 위치에는 Gly 또는 Arg를 포함하며, D1 내지 D8으로 명명하였다(D1 peptide, RFCG-NH2, 서열번호 1; D2 peptide, RFCR-NH2, 서열번호 2; D3 peptide, RFWG-NH2, 서열번호 3; D4 peptide, RFWR-NH2, 서열번호 4; D5 peptide, RLWG-NH2, 서열번호 5; D6 peptide, RLWR-NH2, 서열번호 6; D7 peptide, RLCG-NH2, 서열번호 7; D8 peptide, RLCR-NH2, 서열번호 8). 이들 개별 펩타이드는 30 μM 및 100 μM 농도에서 멜라닌 억제 효과를 평가하였다. 헥사펩타이드 B6 (Phe-Ser-His-His-Leu-Gly-NH2) 를 대조군으로 참조하였다. (Seok JK, Lee SW, Choi J, Kim YM, Boo YC. Identification of novel antimelanogenic hexapeptides via positional scanning of a synthetic peptide combinatorial library. Experimental Dermatology. 2017 Aug;26(8):742-744).
도 2a에 도시 된 바와 같이, 테트라펩타이드 D3 (Arg-Phe-Trp-Gly-NH2) 및 D5 (Arg-Leu-Trp-Gly-NH2)는 α-MSH에 의해 자극된 세포 내 멜라닌 생성을 우수하게 억제하였다. Hexa-peptide B6는 100μM에서만 멜라닌 생성 억제 효과를 보였다.
본 발명자들은 테트라펩타이드 D3 (Arg-Phe-Trp-Gly-NH2) 및 D5 (Arg-Leu-Trp-Gly-NH2)의 서열이 α-MSH 의 서열, 즉 Ac-SYSMEHFRWGKPV-NH2 의 일부분, 즉 FRWG 와 유사함을 발견하였고 따라서 테트라펩타이드 D9 (FRWG-NH2, 서열번호 9)을 다음 실험에 포함시켰다. 본 발명자들은 D3, D5, 및 D9 펩타이드에 대하여 양성대조군 coumaric acid 및 arbutin을 이용하여 동일한 방법으로 항 멜라닌 생성 활성을 추가로 확인하였다. 몰 농도 기준으로 비교했을 때, 테트라펩타이드 D3, D5 뿐만 아니라 테트라펩타이드 D9도 p-쿠마르산(p-Coumaric acid) 및 알부틴(arbutin) 보다 낮은 농도에서 멜라닌 생성을 억제하는 활성이 있음을 확인하였다 (도 3a 참조)
실시예 3 : 짧은 펩타이드의 멜라닌 생성 억제 효과
앞선 실시예에서는 D3 및 D5, D9의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 멜라닌 생성 억제 효과가 가장 강력한 것으로 확인하였다. 추가적으로, 펩타이드 합성의 편의성과 경제성 등의 측면에서 보다 유리할 것으로 예상되는, 상기 테트라펩타이드보다 짧은 서열의 펩타이드의 멜라닌 생성 억제 효과와 활용 가능성을 알아보았다(도 4a).
이를 위하여 E1 내지 E8 펩타이드를 추가적으로 합성하였다: E1(RFW-NH2, 서열번호 10); E2(RFG-NH2, 서열번호 11); E3(RLG-NH2, 서열번호 12); E4(RLW-NH2, 서열번호 13); E5(FWG-NH2, 서열번호 14); E6(LWG-NH2, 서열번호 15); E7(RWG-NH2, 서열번호 16); F1(WG-NH2, 서열번호 17). 상기 E1 내지 F1 펩타이드는 화학적 합성법에 따라 카르복시 말단은 아미드화되어 있으며, 30μM내지 100μM 농도에서 멜라닌 생성에 미치는 효과를 평가하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 상기 추가 분석 대상 펩타이드는 모두 우수한 멜라닌 억제 효과를 나타내었다. 시험된 트리펩타이드 중 Trp-Gly-NH2를 포함하는 E5(Phe-Trp-Gly-NH2), E6(Leu-Trp-Gly-NH2) 및 E7(Arg-Trp-Gly-NH2)은 다른 트리펩타이드보다 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 보였다. 또한, 디펩타이드 F1(Trp-Gly-NH2, tryptophanyl glycinamide) 또한 멜라닌 생성 억제 활성을 효과를 갖고 있음을 확인하였다.
실시예 4 : 글리신유도체의 멜라닌 생성 억제 효과
본 발명자들은 글리신아마이드(Gly-NH2, glycinamide, 서열번호 18, G1 peptide)는 항 멜라닌 생성 활성을 유지하고 유리 글리신(Glycine) 및 아세틸 글리신 아미드(acetyl glycinamide)는 활성이 없음을 추가로 확인하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 몰 농도 기준으로 비교했을 때, 글리신아마이드의 멜라닌 생성 억제 효과는 p-쿠마르산(p-Coumaric acid)과 유사하고 알부틴(arbutin)보다 현저히 우수한 것으로 추정되었다.
실시예 5 : HEM 세포주에 대한 멜라닌 생성 억제 효과
B16-F10 세포 실험 결과를 보다 명확히 확인하기 위해 HEM 세포주(인간 상피 멜라노사이트 세포)를 사용하여 추가 분석을 수행하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, α-MSH 처리에 의해 HEMs의 세포 내 및 세포 외 멜라닌 함량이 증가하였고, 테트라펩타이드 D3, 트리펩타이드 E5, 디펩타이드 F1 및 모노펩타이드 G1에 의해 멜라닌 함량 증가가 약화되었다.
HEMs 세포 생존율은 펩타이드 처리에 의해 영향을 받지 않았다 (도 6b).
따라서, 본 발명의 펩타이드가 세포독성이 없이 안전하게 이용할 수 있는 멜라닌 생성 억제제인 것을 보다 명확히 확인하였다.
실시예 6 : 글라이신아마이드 염산염의 효능 시험
실시예 6-1 : 글라이신아마이드 염산염의 세포독성 및 멜라닌 생성 억제 활성
글라이신아마이드의 효과를 나타내면서, 섭취가능한 염 형태인 글라이신아마이드 염산염을 이용하여, 글라이신아마이드의 세포독성 및 멜라닌 생성 억제활성을 보다 구체적으로 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 글라이신아마이드 염산염은 B16-F10 세포에서 300 μM까지 세포 독성을 전혀 일으키지 않았다. 글라이신아마이드 염산염은 25 ~ 100 μM에서 α-MSH로 자극된 세포에서 세포 외부 및 세포 내 멜라닌 수치를 낮추는 것으로 확인되었다.
실시예 6-2 : 글라이신아마이드 염산염의 TYR 활성 및 관련 단백질 수준 측정
도 8a에 나타낸 바와 같이, α-MSH는 TYR 활성을 증가 시켰고, 그 변화는 글리신 아미드 염산염에 의해 유의하게 약화되었음을 확인하였다. 또한, α-MSH는 TYR (tyrosinase) 과 TYRP1 (tyrosinase-related protein 1)의 단백질 수준은 증가시켰으나 DCT(dopachrometautomerase)나 β-actin의 단백질의 발현 수준은 증가시키지 않았다. 그러나, 글라이신아마이드 염산염(Glycinamide·을 처리한 경우, α-MSH의 부재 및 존재하 모두에서 TYR, TYRP1 및 DCT의 단백질 수준을 유의하게 감소시켰다.
글라이신 아마이드 염산염이 타이로시나제(TYR), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1), 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase, DCT; tyrosinase-related protein 2, TYRP2라고도 불림) 등 멜라닌 생합성에 관련된 효소의 발현 수준을 조절하여, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 6-3 : 글라이신아마이드 염산염의 CREB, ERK 인산화 및 MITF 단백질 발현 수준에 미치는 영향
α-MSH-MC1R 경로가 CREB 및 MITF를 활성화시킴으로써 TYR 발현을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 글라이신아마이드 염산염이 이러한 신호 전달 경로에 영향을 주는지 여부를 조사 하였다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, CREB (Ser)의 인산화는 α-MSH 자극 후 20 분만에 유의하게 증가하였고, 웨스턴 블롯에 의해 측정된 바와 같이 60분 뒤 최대수준에 도달하였다. 그동안 총 CREB 수치는 변하지 않았다. α-MSH는 또한 ERK (Thr 및 Tyr)의 인산화를 증가시키지만, 총 ERK 수준에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 글라이신아마이드 염산염은 α-MSH에 의해 자극된 CREB의 인산화를 억제하였으나, ERK의 인산화에는 영향을 미치지 않았다.
또한, 도 9b에 나타난 바와 같이, α-MSH는 MITF 발현 수준을 증가시켰으나, 글라이신아마이드 염산염에 의해 약화되었다.
따라서, 글라이신아마이드 인산염이 CREB 및 ERK의 인산화를 억제하여 MITF 단백질 발현을 감소시킴에 따라 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7 : 세포생존율 측정
실시예 1 내지 4의 펩타이드들을 동일한 방법으로 B16-F10 세포 및 HEM에 처리한 후 세포 생존율을 측정하고 그 결과를 각각 도 1b, 도 2b, 도 3b, 도 4b, 도 5b, 도 6b, 및 도 7a에 정리하였다.
실시예 1의 펩타이드 풀을 1.0 mM 농도로 처리한 경우 펩타이드 풀에 따라 세포의 생존율을 다소 감소시키는 경우가 있었으나, 선별된 펩타이드 풀의 멜라닌 생성 억제 효과가 세포 생존율 감소 때문은 아닌 것으로 판단되었다.(도 1b)
실시예 2 내지 4의 개별 펩타이드 중에서 몇몇 개별 펩타이드가 세포의 생존율을 다소 감소시키는 경우가 있었으나, 이 또한 선별된 펩타이드의 멜라닌 생성 억제 효과가 세포 생존율 감소 때문은 아닌 것으로 판단되었다. (도 2b 내지 5b)
이에 더하여, 추가적으로 실험한 HEM 세포주에 대해서도 D3, D5, F1, G1 펩타이드의 세포 독성이 거의 없는 것으로 확인되었다.(도 6b)
따라서, 본 발명에 따른 펩타이드들은 세포독성이 낮아 안전하고 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 규명한 멜라닌 생성을 억제하는 활성을 갖는 펩타이드를 이용하여 보다 안전하고 효과적인 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 의약품, 화장료 또는 기능성 식품을 개발하는 데 유용하게 이용할 수 있다.
<110> ruby crown Co. Ltd. <120> C-terminal amidated peptides with melanogenesis-inhibiting activity and compositions thereof <130> NP18-0036PD <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1 peptide <400> 1 Arg Phe Cys Gly 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2 peptide <400> 2 Arg Phe Cys Arg 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3 peptide <400> 3 Arg Phe Trp Gly 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4 peptide <400> 4 Arg Phe Trp Arg 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D5 peptide <400> 5 Arg Leu Trp Gly 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D6 peptide <400> 6 Arg Leu Trp Arg 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D7 peptide <400> 7 Arg Leu Cys Gly 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D8 peptide <400> 8 Arg Leu Cys Arg 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D9 peptide <400> 9 Phe Arg Trp Gly 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 peptide <400> 10 Arg Phe Trp 1 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2 peptide <400> 11 Arg Phe Gly 1 <210> 12 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E3 peptide <400> 12 Arg Leu Gly 1 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 peptide <400> 13 Arg Leu Trp 1 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E5 peptide <400> 14 Phe Trp Gly 1 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E6 peptide <400> 15 Leu Trp Gly 1 <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E7 peptide <400> 16 Arg Trp Gly 1 <210> 17 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 peptide <400> 17 Trp Gly 167 <210> 18 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G1 peptide <400> 18 Gly 117

Claims (9)

  1. 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드:
    [일반식 1]
    Xaa1-Xaa2-Trp-Gly
    상기 일반식 1에서,
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Phe (서열번호 3);
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Leu (서열번호 5);
    Xaa1은 Phe 및 Xaa2는 Arg (서열번호 9);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Phe (서열번호 14);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Leu (서열번호 15);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Arg (서열번호 16); 또는
    Xaa1 및 Xaa2는 존재하지 않는다 (서열번호 17).
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [일반식 1]
    Xaa1-Xaa2-Trp-Gly
    상기 일반식 1에서,
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Phe (서열번호 3);
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Leu (서열번호 5);
    Xaa1은 Phe 및 Xaa2는 Arg (서열번호 9);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Phe (서열번호 14);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Leu (서열번호 15);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Arg (서열번호 16); 또는
    Xaa1 및 Xaa2는 존재하지 않는다 (서열번호 17).
  4. 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물:
    [일반식 1]
    Xaa1-Xaa2-Trp-Gly
    상기 일반식 1에서,
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Phe (서열번호 3);
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Leu (서열번호 5);
    Xaa1은 Phe 및 Xaa2는 Arg (서열번호 9);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Phe (서열번호 14);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Leu (서열번호 15);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Arg (서열번호 16); 또는
    Xaa1 및 Xaa2는 존재하지 않는다 (서열번호 17).
  5. 카르복시 말단이 아미드화(-NH2)된 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물:
    [일반식 1]
    Xaa1-Xaa2-Trp-Gly
    상기 일반식 1에서,
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Phe (서열번호 3);
    Xaa1은 Arg 및 Xaa2는 Leu (서열번호 5);
    Xaa1은 Phe 및 Xaa2는 Arg (서열번호 9);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Phe (서열번호 14);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Leu (서열번호 15);
    Xaa1은 존재하지 않고, Xaa2는 Arg (서열번호 16); 또는
    Xaa1 및 Xaa2는 존재하지 않는다 (서열번호 17).
  6. 제3항에 있어서, 상기 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 다크서클, 흑색점, 검버섯, 멜라닌세포모반, 밀크커피반점, 오타모반, 청색모반, 과다 색소침착 반, 유두 색소 침착, 소음순 색소 침착 및 잡티로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 미백용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 미백용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강기능식품 및 식품첨가제(food additives)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
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