WO2012144546A1 - 新規ペプチド - Google Patents

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WO2012144546A1
WO2012144546A1 PCT/JP2012/060538 JP2012060538W WO2012144546A1 WO 2012144546 A1 WO2012144546 A1 WO 2012144546A1 JP 2012060538 W JP2012060538 W JP 2012060538W WO 2012144546 A1 WO2012144546 A1 WO 2012144546A1
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peptide
asp
derivative
present
salt
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PCT/JP2012/060538
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正通 阿部
益徳 熊澤
康助 松本
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ロート製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide having a specific amino acid sequence, a derivative thereof, or a salt thereof.
  • the novel peptide of the present invention or a derivative thereof or a salt thereof can be beneficially used to inhibit the activity of angiotensin converting enzyme and promote adhesion between cells and collagen.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitors are widely used for the treatment of hypertension and chronic heart failure.
  • An angiotensin converting enzyme inhibitor is known to act on both the pressor renin-angiotensin system and the antihypertensive kallikrein-kinin system in vivo, and exerts an antihypertensive action through vasodilation and the like.
  • an angiotensin converting enzyme inhibitor has an action of reducing cardiac preload and afterload and improving cardiac hemodynamics.
  • Non-patent Document 1 vascular endothelial growth factor
  • the adhesion of fibroblasts to collagen in the extracellular matrix contributes to strengthening and stabilizing the lattice-like three-dimensional structure of collagen fiber bundles and maintaining the firmness and elasticity of the skin. ing. It has been found that when the fibroblast adherence ability to collagen is reduced due to aging or the like, skin elasticity and elasticity are reduced. Furthermore, it is known that fibroblasts themselves become dull in their function (for example, production of various factors) unless they adhere to collagen fibers and grasp the scaffold. For the above reasons, a component that promotes adhesion between fibroblasts and collagen has been searched.
  • Patent Document 3 peptides having a specific sequence (Patent Document 3) and the like are known as materials for promoting adhesion between fibroblasts and collagen.
  • the present invention has been made in view of the prior art, and is a further useful material having high angiotensin converting enzyme inhibitory activity and / or adhesion promoting activity between fibroblasts and collagen, especially angiotensin converting enzyme.
  • the object is to provide a new material that has both inhibitory activity and activity to promote the adhesion of fibroblasts to collagen at the same time and is very useful for beauty.
  • a short-chain peptide having a specific amino acid sequence can exhibit high angiotensin converting enzyme inhibitory activity, and in addition, the peptide can be used as a fibroblast. It has been found that adhesion promoting activity can be exhibited between collagen and collagen, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following.
  • the peptide is Asp-Leu-Asp-Val-Phe (SEQ ID NO: 2), Arg-Asp-Leu-Asp-Val (SEQ ID NO: 3), or Arg-Asp-Leu-Asp-Val-
  • a composition comprising at least one selected from the group consisting of the peptide according to [1] or [2] and a derivative thereof, and a salt thereof.
  • composition according to [3] or [4], which is a cosmetic composition is a cosmetic composition.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof has high angiotensin converting enzyme inhibitory activity.
  • the present invention provides a new material that can be used as an angiotensin converting enzyme inhibitor.
  • An angiotensin converting enzyme inhibitor is not only useful as a medicament for the treatment of hypertension and chronic heart failure, but can also be beneficially used in foods for preventing lifestyle-related diseases by lowering blood pressure.
  • angiotensin converting enzyme inhibitory activity has peripheral vasodilatory action and angiogenesis promoting action, so it causes blue bears under the eyes and blue violet color of the lips caused by congestion (poor circulation) under thin skin. It can be expected that blood color defects such as discoloration can be effectively improved.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof can effectively promote the adhesion of fibroblasts to collagen. Therefore, according to the present invention, it is possible to effectively prevent a decrease in the adhesion ability between fibroblasts and collagen due to aging, etc., strengthening the binding of fibroblasts and extracellular matrix, and increasing the tensile strength of both New materials that tighten the dermis, improve skin wrinkles and sagging, and restore skin elasticity and elasticity.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof has a skin wrinkle improving action by angiotensin converting enzyme inhibitory activity and a skin wrinkle by promoting adhesion between fibroblasts and collagen.
  • cosmetic problems can be solved comprehensively from the viewpoint of both the effect of improving tarmi and the effect of restoring skin elasticity and elasticity, it can be beneficially used particularly in a cosmetic composition.
  • the present invention provides the following formula (I): Provided is a peptide consisting of an amino acid sequence represented by Xaa 1 -Asp-Leu-Asp-Val-Xaa 2 (abbreviated as one letter: X 1 DLDVX 2 , SEQ ID NO: 1), a derivative thereof, or a salt thereof.
  • Xaa 1 and Xaa 2 (one letter abbreviation: X 1 and X 2 ) in SEQ ID NO: 1 may or may not be present, and when present, each independently represents an arbitrary amino acid.
  • the amino acid is preferably an ⁇ -amino acid, more preferably a genetically encoded ⁇ -amino acid.
  • Xaa 1 and Xaa 2 are naturally occurring Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Lys and Val.
  • An ⁇ -amino acid arbitrarily selected from the group consisting of Preferably, it is an ⁇ -amino acid that is Arg or Phe, more preferably Xaa 1 is Arg and Xaa 2 is Phe. Xaa 1 and Xaa 2 may or may not be present, but it is preferable that at least one of Xaa 1 and Xaa 2 is present.
  • the peptide of the present invention includes Asp-Leu-Asp-Val-Phe (one letter abbreviation: DLDVF, SEQ ID NO: 2), Arg -Asp-Leu-Asp-Val (one letter abbreviation: RDLDV, SEQ ID NO: 3) or Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe (one letter abbreviation: RDLDVF, SEQ ID NO: 4) is preferable.
  • the “peptide derivative” means, for example, acetylation, palmitoylation, myristylation, amidation, acrylation, dansylation, biotinylation, phosphorylation, succinylation, anilideation, benzyloxylation of peptides.
  • salt refers to any pharmacologically acceptable salt (including inorganic salts and organic salts) of a peptide or a derivative thereof, such as a sodium salt or potassium of a peptide or a derivative thereof.
  • Salt calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, organic acid salt (acetate, trifluoroacetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, Succinate, fumarate, propionate, formate, benzoate, picrate, benzenesulfonate, etc.), preferably ammonium salts, hydrochlorides, sulfates, acetates or tris Fluoroacetate, more preferably ammonium salt, acetate or trifluoroacetate.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof may be a hydrate or an anhydride.
  • the solvate or non-solvate may be sufficient as the peptide of this invention, its derivative (s), or those salts.
  • the peptide of the present invention can be prepared by methods known in the art.
  • the peptide of the present invention may be synthesized by a chemical synthesis method (eg, a solid phase method (eg, Fmoc method), a liquid phase method, etc.), or may be produced by a method such as gene recombinant expression.
  • the amino acid constituting the peptide of the present invention may be L-form or D-form, but is preferably L-form.
  • the peptide of the present invention may be prepared by cutting out a peptide comprising the target amino acid sequence from the amino acid sequence of the protein containing the target amino acid sequence by a known means such as protease treatment.
  • a person skilled in the art can appropriately select an appropriate protease in order to cut out a peptide comprising the target amino acid sequence from the amino acid sequence of the protein containing the target amino acid sequence in consideration of the sequence specificity of the protease.
  • the reaction conditions used when the protein is hydrolyzed with a protease are not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to common technical knowledge.
  • the target peptide can be purified by purification by means known in the art, if necessary.
  • a peptide obtained by hydrolyzing a natural protein with a protease is more advantageous in terms of cost than a case of producing it by a chemical synthesis method. Furthermore, it is considered that a peptide obtained by hydrolyzing a natural protein with a protease is safer for a living body. Therefore, the peptide thus obtained can be suitably used for internal preparations, foods, sensitive skin cosmetics, feeds, and the like that require higher safety for application to living bodies.
  • food includes all foods and drinks including beverages.
  • the derivative of the peptide of the present invention can be easily prepared by a person skilled in the art by any method known in the art.
  • the salt of the peptide of the present invention can also be easily prepared by a person skilled in the art by any method known in the art.
  • any of the peptides having the specific sequence described above or derivatives thereof, or salts thereof can be used.
  • a peptide or a salt thereof is preferably used.
  • Particularly preferred are peptides.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof obtained as described above can inhibit the activity of angiotensin converting enzyme. It is known that by inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme, it acts on both the pressor renin-angiotensin system and the antihypertensive kallikrein-kinin system in vivo, and exerts the antihypertensive action through vasodilation, etc. .
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is used for the prevention and / or treatment of hypertension or chronic heart failure, for preventing lifestyle-related diseases by the blood pressure lowering effect, or poor blood color (for example, It can be beneficially used to improve a blue bear under the eyes and a discoloration of the lips to blue-violet.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitory activity is determined, for example, by using 3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) as a substrate and measuring 3-Hydroxybutyric acid (3HB) excised from the substrate Can do.
  • a person skilled in the art will be able to prevent and / or treat hypertension and chronic heart failure, prevent lifestyle-related diseases due to blood pressure lowering effects, and poor blood color (e.g., It can be understood that it is effective in improving blue bears under eyes and discoloration of lips to blue-violet.
  • the above peptide or derivative thereof, or a salt thereof can promote adhesion between fibroblasts and collagen.
  • the fibroblasts adhere to the collagen in the extracellular matrix within the dermis of the living body, strengthening the bond between the fibroblasts and the extracellular matrix, increasing the tensile strength of both, tightening the dermis, and tightening the skin And elasticity is maintained. Therefore, the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof, is for improving skin wrinkles and talmi caused by a decrease in the adhesion ability between the cells and collagen, or for restoring skin elasticity and elasticity. Can also be used beneficially.
  • the promotion of adhesion between fibroblasts and collagen can be achieved, for example, by culturing skin fibroblasts in a culture plate coated with collagen using a medium containing the above peptide, and then washing and washing away the plates. It can be measured by measuring the cells remaining in the collagen coat on the plate.
  • a peptide capable of promoting adhesion between fibroblasts and collagen by such a method enhances the bond between the fibroblasts and the extracellular matrix, and increases the tensile strength of both. It can be understood that it has the effect of tightening, improving wrinkles and talmi of the skin, or restoring the elasticity and elasticity of the skin.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof may be used in combination of two or more.
  • the angiotensin converting enzyme inhibitory activity is synergistically increased. Therefore, when the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is used in combination of two or more, it acts on both the repressive system renin-angiotensin system and the antihypertensive kallikrein-kinin system in vivo.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a mixture of combinations of two or more thereof prevents lifestyle-related diseases by lowering blood pressure for the prevention and / or treatment of hypertension and chronic heart failure. Therefore, in order to improve poor blood color (for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-violet), the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is used more than when used alone. It can be used effectively.
  • a combination of the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof a peptide consisting of an amino acid sequence represented by X 1 DLDVX 2 (SEQ ID NO: 1), DLDVF (SEQ ID NO: 2), RDLDV (SEQ ID NO: 3), and any combination of two, three, four or more peptides represented by RDLDVF (SEQ ID NO: 4).
  • the combination includes a combination of peptides having an amino acid sequence represented by X 1 DLDVX 2 (SEQ ID NO: 1), wherein X 1 and / or X 2 are different from each other.
  • the mixture which combined DLDVF peptide and RDLDV peptide the mixture which combined DLDVF peptide and RDLDVF peptide are mentioned. Furthermore, it is represented by the peptide consisting of the amino acid sequence represented by X 1 DLDVX 2 (SEQ ID NO: 1), DLDVF (SEQ ID NO: 2), RDLDV (SEQ ID NO: 3), and RDLDVF (SEQ ID NO: 4). Even when a peptide and a peptide represented by Leu-Asp-Val (LDV) are combined and used as a mixture, a remarkable effect is exhibited. For example, the mixture which combined DLDVF peptide and LDV peptide is mentioned.
  • the mixing ratio of the mixture is not limited, but when used in combination of two types, the mixing weight ratio of one peptide to the other is 95: 5 to 5:95, preferably 90:10 to 10:90. More preferably, it is 80:20 to 20:80, and particularly preferably 75:25 to 25:75.
  • DLDVF peptide and RDLDV peptide may be mixed at a mixing ratio of 75:25 to 25:75
  • DLDVF peptide and RDLDVF peptide may be mixed at a mixing ratio of 75:25 to 25:75
  • DLDVF peptide And the LDV peptide may be mixed at a mixing ratio of 75:25 to 25:75.
  • the angiotensin converting enzyme inhibitory activity is higher than that when each of them is used alone.
  • Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) is used as a substrate and determined by measuring 3-hydroxybutyric acid (3HB) cut out from the substrate, the IC50 value is 20% or more, preferably 30 % Or more, more preferably 40% or more, particularly preferably 50% or more.
  • the present invention also provides a composition comprising the peptide or a derivative thereof, or a salt thereof.
  • a composition containing a peptide or a derivative thereof or a salt thereof includes a composition containing a mixture of two or more of a peptide or a derivative thereof or a salt thereof.
  • the composition is preferably a cosmetic composition. Since the composition contains the peptide having the above function or a derivative thereof, or a salt thereof, a cosmetic effect can be obtained. That is, the peptide or derivative thereof, or a salt thereof has both an action of inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme and an action of promoting adhesion between skin fibroblasts and collagen.
  • the former action has the effect of improving poor blood color (for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-violet) through the expansion of blood vessels, etc., and the latter action tightens the skin It is effective in improving the wrinkles and sagging of the skin, and restoring the firmness and elasticity of the skin. Both effects can be combined to produce a remarkable cosmetic effect.
  • a composition that can be used for the purpose of making the face and body beautiful for example, beauty such as beautiful skin
  • a beauty composition a composition that can be used for the purpose of making the face and body beautiful
  • composition of the present invention can be suitably used as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, a food composition or a feed composition.
  • a pharmaceutical composition a cosmetic composition, a food composition or a feed composition.
  • pharmaceutical compositions a cosmetic composition, a food compositions and feed compositions used for cosmetic purposes.
  • the composition of the present invention can be suitably used as a research reagent for elucidating physiological conditions related to angiotensin converting enzyme inhibitory activity and adhesion between fibroblasts and collagen.
  • the composition of the present invention can also be used as an angiotensin converting enzyme inhibitor or an adhesion promoter for fibroblasts and collagen.
  • the pharmaceutical composition examples include a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases caused by angiotensin converting enzyme activity in mammals such as humans.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof includes, for example, a prophylactic and / or therapeutic agent for hypertension and / or chronic heart failure, and poor blood color symptoms (for example, It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for blue bears under the eyes and discoloration of the lips to blue-violet.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is an agent for preventing and / or treating a disease caused by a decrease in the ability to adhere between fibroblasts and collagen in mammals such as humans. It can also be used as an agent.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention, or a derivative thereof, or a salt thereof is, for example, a skin wrinkle caused by a decrease in the adhesive ability between fibroblasts and collagen caused by aging or the like.
  • prophylactic and / or therapeutic agent for talmi it can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for skin elasticity or a decrease in elasticity caused by the decrease in adhesion ability, or as a skin tightening agent.
  • the cosmetic composition examples include cosmetics for preventing and / or improving a state caused by an angiotensin converting enzyme activity in mammals such as humans.
  • the cosmetic composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is, for example, prevention of poor blood color (for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-violet) and the like. It can be used as a cosmetic for improvement.
  • the cosmetic composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof can prevent and / or improve a condition caused by a decrease in the ability to adhere between fibroblasts and collagen in mammals such as humans. It can also be used as a cosmetic for.
  • the cosmetic composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof, for example is a skin wrinkle caused by a decrease in the adhesion ability between fibroblasts and collagen caused by aging or the like.
  • a cosmetic for preventing and / or improving talmi a cosmetic for preventing and / or improving skin elasticity or a decrease in elasticity caused by the decrease in adhesion ability, or a makeup for tightening skin It can be used as a fee.
  • the food composition examples include foods for preventing and / or improving a state caused by an angiotensin converting enzyme activity in mammals such as humans.
  • the food composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof for example, a food for preventing and / or improving hypertension and chronic heart failure, It can be beneficially used as a food for preventing and / or improving, or a food for preventing and / or improving poor blood color (for example, blue bear under eyes or discoloration of lips to blue-violet).
  • the food composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof can prevent and / or improve a condition caused by a decrease in the ability to adhere between fibroblasts and collagen in mammals such as humans. It can also be used as a food product.
  • the food composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is, for example, a skin wrinkle caused by a decrease in the adhesive ability between fibroblasts and collagen caused by aging or the like.
  • the food composition of the present invention includes health food, food for specified health use, nutritional functional food, health supplement food and the like. These compositions include cosmetic health foods.
  • the food for specified health is a food that is ingested for the purpose of specific health in the diet, and indicates that the purpose of the health can be expected by the intake.
  • These food products can be provided as food products with a label indicating that they are used for the above-mentioned purposes in a specific embodiment.
  • an indication that it is used for beauty an indication that it has a beautifying effect, an indication that it is used for improving the skin quality, and an indicator that is used for the prevention or improvement of poor blood color Used to improve facial color (for example, blue bear under eyes or discoloration of lips to blue-violet), used to restore skin elasticity and elasticity Indication that the product is used, prevention of or improvement of skin wrinkles and tarmi, indication that the product is used for tightening the skin, prevention of hypertension and chronic heart failure Or it can be provided as a food with a display such as a display indicating that it is used for improvement and a display indicating that it is used for preventing or improving lifestyle-related diseases by a blood pressure lowering action.
  • a display such as a display indicating that it is used for improvement and a display indicating that it is used for preventing or improving lifestyle-related diseases by a blood pressure lowering action.
  • Examples of the feed composition include a feed for preventing and / or improving a condition caused by an angiotensin converting enzyme activity in domestic animals such as cattle, pigs, chickens, sheep and horses, and pet animals such as dogs and cats, or Examples thereof include a feed for preventing and / or improving a state caused by a decrease in adhesion ability between fibroblasts and collagen.
  • the content of the peptide or derivative thereof, or a salt thereof in the composition of the present invention described above varies depending on the type of peptide or the like, the dosage form of the composition, etc., but generally, from the viewpoint of obtaining a high effect of the present application.
  • composition comprising the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof, in addition to the peptide or the derivative thereof, or a salt thereof, a carrier, base, and / or Additives and the like can be appropriately blended and prepared within a range that achieves the object of the present invention.
  • a cross-linked vinyl polymer, lipids and the like may be used alone or in combination of two or more.
  • water, fats and oils, mineral oils, waxes, fatty acids, silicone oils, sterols, esters, metal soaps, alcohols and the like may be used alone or in combination of two or more.
  • additives include solubilizing components, emulsifiers, oils, stabilizers, thickeners, preservatives, binders, lubricants, dispersants, pH adjusters, moisturizers, ultraviolet absorbers, chelating agents, A percutaneous absorption enhancer, a disintegrant, a plasticizer, a buffer, an amino acid, a colorant, a fragrance and the like may be used alone or in combination.
  • whitening ingredients anti-inflammatory ingredients, antibacterial ingredients, cell activation are added to the composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof, as necessary, in order to add further useful action.
  • Various components such as an aging component, an astringent component, an acne-improving component, a biological component synthesis promoting component, a blood circulation promoting component, a moisturizing component, an anti-aging component, and the like may be used alone or in combination.
  • composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is an optional agent such as an external preparation (including cosmetics for external use), an internal preparation (including food and feed to be taken orally) Although it may be a mold, it can be preferably used as an external preparation in order to exert a higher effect more directly on complexion (blood color failure), skin wrinkles, tarmi, elasticity, elasticity, tightening, and the like.
  • an external preparation including cosmetics for external use
  • an internal preparation including food and feed to be taken orally
  • it may be a mold, it can be preferably used as an external preparation in order to exert a higher effect more directly on complexion (blood color failure), skin wrinkles, tarmi, elasticity, elasticity, tightening, and the like.
  • the external preparation for example, it can be used in any form such as liquid, emulsion, cream, lotion, paste, mousse, gel, sheet (supported substrate), aerosol, and spray.
  • Cosmetics include, for example, basic cosmetics such as lotions, emulsions, creams, oils, packs, makeup cosmetics such as foundations, blushers and lipsticks, as well as cleansers such as facial cleansers, cleansings, body cleansers, and bath preparations. Etc. may be used in any form.
  • the food composition containing the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof is mixed with a food hygiene-acceptable formulation to produce a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, etc. Can be used after processing.
  • a food hygiene-acceptable formulation to produce a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, etc.
  • food hygiene-acceptable formulation to produce a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, etc.
  • processed meat foods for example, ham, sausage, etc.
  • processed fishery products, seasonings for example, dressing, etc.
  • dairy products for example, biscuits, candy, Jelly, ice cream, etc.
  • soups, juices and the like can be provided in any common food form.
  • the peptide of this invention, its derivative (s), or those salts can be mix
  • the feed is not particularly limited because it can be used in any form.
  • the present invention further provides a method for inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme and a method between fibroblast and collagen, characterized by using the peptide or derivative thereof, or a salt thereof, or the composition containing them.
  • a method of promoting adhesion is provided.
  • the peptide or derivative thereof, or a salt thereof, or the composition containing them is more than an effective amount capable of obtaining the desired effect by inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme, or fibroblasts. What is necessary is just to use more than the effective amount which promotes the adhesion
  • the amount of the peptide or derivative thereof, or salt thereof used in the method of the present invention is usually about 0.1 ⁇ g to 2 g / day per body weight of about 50 kg per adult in the case of an external preparation.
  • the amount used in the case of internal use is usually about 0.001 to 10,000 mg / day, more preferably about 1 to 1000 mg / day, more preferably about 1 to 100 mg / day per adult body weight of about 50 kg. .
  • the method of the present invention may further include a step of applying the peptide or a derivative thereof, or a salt thereof or the composition containing them to the skin.
  • the amount of the peptide or derivative thereof or salt thereof applied to the skin is preferably about 1 ng to 500 ⁇ g / cm 2 , more preferably about 0.01 to 50 ⁇ g / cm 2 , and still more preferably about 0.1 to 10 ⁇ g / cm 2 . cm 2 .
  • the peptide or derivative thereof, or a salt thereof or an external preparation containing them can be locally applied to the skin by application, spraying or the like.
  • the present invention further relates to the production of a composition for inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme and / or promoting adhesion between fibroblasts and collagen, preferably a composition that can be used as an external preparation. , Use of the peptides or derivatives thereof, or salts thereof.
  • the amount of the peptide or its derivative or salt thereof used may be used so as to be the content in the composition.
  • the present invention further provides the peptide or derivative thereof, or a salt thereof for inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme and / or promoting adhesion between fibroblasts and collagen.
  • the present invention includes a method for improving the poor blood color (for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-purple color) by administering the composition to a mammal such as a human and expanding the blood vessels. Furthermore, it includes a method of tightening the skin to improve skin wrinkles and sagging, or restoring the elasticity and elasticity of the skin.
  • the present invention also provides a drug for improving poor blood color (for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-purple) or the like by tightening the skin through the expansion of blood vessels of the above composition. It includes the use of the above composition for the manufacture of a medicament for improving wrinkles and tarmi or restoring skin firmness and elasticity.
  • the present invention improves skin wrinkles and talmi to improve poor blood color (for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-purple) through blood vessel dilation or the like.
  • poor blood color for example, blue bear under the eyes or discoloration of the lips to blue-purple
  • the said composition used in order to recover the elasticity and elasticity of skin is included.
  • Example 1 Preparation of peptide 1-1.
  • DLDVF (Asp-Leu-Asp-Val-Phe) peptide (1)
  • Peptide synthesis The title peptide was synthesized by a solid phase synthesis method by the Fmoc method using an automatic peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation: PSSM8). The specific procedure is as follows: First, the C-terminus of Fmoc-Phe (1-Trt) -OH is bound to the resin for solid phase synthesis, and then the protective group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then After neutralizing and washing this resin, Fmoc-Val-OH was introduced into the N-terminus of Phe.
  • Fmoc-Val-OH was introduced into the N-terminus of Phe.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Val.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Leu.
  • RDLDV Arg-Asp-Leu-Asp-Val peptide
  • Peptide synthesis The title peptide was synthesized by a solid phase synthesis method by the Fmoc method using an automatic peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation: PSSM8). The specific procedure is as follows: First, the C-terminus of Fmoc-Val (1-Trt) -OH is bound to the resin for solid phase synthesis, and then the protecting group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then After neutralizing and washing the resin, Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N terminus of Val.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Leu.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Arg (Pmc) -OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • RDLDVF Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe
  • Peptide synthesis The title peptide was synthesized by a solid phase synthesis method by the Fmoc method using an automatic peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation: PSSM8). The specific procedure is as follows: First, the C-terminus of Fmoc-Phe (1-Trt) -OH is bound to the resin for solid phase synthesis, and then the protective group (Fmoc) is removed by piperidine treatment, and then After neutralizing and washing this resin, Fmoc-Val-OH was introduced into the N-terminus of Phe.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Val.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, the resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Leu-OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Asp (OtBu) -OH was introduced into the N-terminus of Leu.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and this resin was neutralized and washed again, and then Fmoc-Arg (Pmc) -OH was introduced into the N-terminus of Asp.
  • the protecting group (Fmoc) was removed by piperidine treatment, and the peptide chain was excised from this resin.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • RDLDVF was obtained by purification by removing unreacted substances by preparative HPLC.
  • Example 2 Measurement of angiotensin converting enzyme inhibitory activity Using the various peptides prepared in Example 1 above, angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured.
  • a test solution was prepared so that each peptide concentration was 1 mg / mL, and angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured using 1-fold, 10-fold, 100-fold, and 1000-fold dilutions.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured using 3-Hydroxybutyric acid (3HB-GGG) cleaved from 3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) using the ACE Kit-WST kit (manufactured by Dojindo Laboratories). 3HB) was detected by an enzymatic method and evaluated by measuring the absorbance at 450 nm with a plate reader.
  • the ACE Kit-WST kit was used according to the attached protocol. The results are shown below.
  • Example 3 Evaluation of Fibroblast Adhesion to Collagen Coat Using the various peptides prepared in Example 1 above, the effect of promoting the adhesion of fibroblasts to the collagen coat was evaluated.
  • human normal skin-derived fibroblasts (Kurabo: KF-4009) were first seeded in a collagen-coated cell culture plate (96 well) at a concentration of 2 ⁇ 10 4 cells / well. Next, 200 ⁇ l of Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM; FCS 10% / AB1%) diluted to a concentration of 5 ⁇ g / ml of each peptide was added to each well, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5% carbon dioxide and 95% air. The culture was performed in the environment of On the other hand, a D-MEM medium supplemented with 200 ⁇ l of peptide-free D-MEM medium was prepared and used as a control.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Example 4 Measurement of angiotensin converting enzyme inhibitory activity Using the peptide prepared in Example 1 above, angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured.
  • DLDVF Asp-Leu-Asp-Val-Phe
  • RDLDV Arg-Asp-Leu-Asp-Val
  • the test solution was prepared by mixing at a ratio of 100 so that the final peptide concentration would be 1 mg / mL in total.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured using the 1-fold, 10-fold, 100-fold and 1000-fold dilutions.
  • Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity is determined by using 3-Hydroxybutyric acid (3HB-GGG) cut from 3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) using the ACE Kit-WST kit (manufactured by Dojindo Laboratories). 3HB) was detected by an enzymatic method and evaluated by measuring the absorbance at 450 nm with a plate reader. The ACE Kit-WST kit was used according to the attached protocol. The result is shown in FIG.
  • Example 5 Measurement of angiotensin converting enzyme inhibitory activity Using the peptide prepared in Example 1 above, angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured.
  • DLDVF Asp-Leu-Asp-Val-Phe
  • RDLDVF Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe
  • the test solution was prepared by mixing so that the final peptide concentration was 1 mg / mL in total.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured using the 1-fold, 10-fold, 100-fold and 1000-fold dilutions.
  • Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity is determined by using 3-Hydroxybutyric acid (3HB-GGG) cut from 3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) using the ACE Kit-WST kit (manufactured by Dojindo Laboratories). 3HB) was detected by an enzymatic method and evaluated by measuring the absorbance at 450 nm with a plate reader. The ACE Kit-WST kit was used according to the attached protocol. The result is shown in FIG.
  • Example 6 Measurement of angiotensin converting enzyme inhibitory activity Using the peptide prepared in Example 1 above, angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured.
  • DLDVF AdLDVF (Asp-Leu-Asp-Val-Phe) peptide and LDV (Leu-Asp-Val) peptide are mixed at a ratio of 100: 0, 50:50, 0: 100, and the final peptide
  • a test solution was prepared so that the total concentration was 1 mg / mL.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitory activity was measured using the 1-fold, 10-fold, 100-fold and 1000-fold dilutions.
  • Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity is determined by using 3-Hydroxybutyric acid (3HB-GGG) cut from 3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) using the ACE Kit-WST kit (manufactured by Dojindo Laboratories). 3HB) was detected by an enzymatic method and evaluated by measuring the absorbance at 450 nm with a plate reader. The ACE Kit-WST kit was used according to the attached protocol. The result is shown in FIG.
  • the peptide of the present invention or a derivative thereof, or a salt thereof can be used as a cosmetic composition.

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Abstract

　本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性及び／又は線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着促進活性を有する新規物質を提供することを目的とする、 下記の式（Ｉ）：　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１） ［ここで、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す］ のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩である。

Description

新規ペプチド
　本発明は、特定のアミノ酸配列を有する新規ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩に関する。本発明の新規ペプチド若しくはその誘導体又はそれらの塩は、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害するために、また細胞とコラーゲンとの間の接着を促進するために有益に利用され得る。
　アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、高血圧症や慢性心不全の治療のために広く一般に用いられている。アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、生体内で昇圧系のレニン－アンジオテンシン系と降圧系のカリクレイン－キニン系の両方に作用し、血管の拡張等を通じて降圧作用を発揮することが公知である。さらに、アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、心臓の前負荷と後負荷を共に軽減して、心血行動態を改善する作用を有することも知られている。また近年では、アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を介して、アポトーシスの抑制や内皮修復、血管新生を促す作用があることも報告されている（非特許文献１）。
　これまでに、アンジオテンシン変換酵素阻害剤としては、エナラプリルやカプトプリル等の合成化合物が知られている他、食品由来の蛋白酵素分解物等が多数知られている。例えば、ゴマ蛋白質分解物（特許文献１）やブナハリタケエキス（特許文献２）等を添加した食品が、血圧が高めの方に適した特定保健用食品等として実用化されている。
　一方、生体の真皮内では、線維芽細胞が細胞外マトリクス中のコラーゲンと接着することが、コラーゲン線維束の格子状の立体構造を強化・安定化し、肌のハリや弾性を保つ一因となっている。そして、老化等の原因によって、この線維芽細胞のコラーゲンへの接着能力が低下すると、肌のハリや弾力の低下を引き起こすことが分かっている。更に、線維芽細胞自体も、コラーゲン線維に接着して足場を掴んでいなければ、その働き（例えば、種々の因子の産生等）が鈍くなることが知られている。以上のような理由から、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進する成分が探索されている。
　これまでに、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進させる素材としては、特定配列を有するペプチド（特許文献３）等が知られている。
　しかし、更なる有用なアンジオテンシン変換酵素阻害活性及び／又は線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着促進活性を有する素材の開発が求められている。そしてこれまでに、アンジオテンシン変換酵素阻害活性及び線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着促進活性の両者を併せ持つ素材は一切知られていない。
特表２００６－５２０８０９号公報 特開２００２－２９９９５号公報 米国特許出願公開第２００４／０１４１９３９号明細書
荒川博、Japanese Circulation Journal Vol.64, Suppl. 1,p438, 2000
　本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性及び／又は線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着促進活性を有する更なる有用な素材、とりわけ、アンジオテンシン変換酵素阻害活性と線維芽細胞のコラーゲンへの接着促進活性の両者を同時に併せ持ち、美容に非常に有用な新素材を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有する短鎖ペプチドが、高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性を発揮することができ、加えて該ペプチドが線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着促進活性をも発揮し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
[１]　下記の式（Ｉ）：
　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１）
［ここで、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す］
　のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩。
[２]　前記ペプチドが、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：２）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（配列番号：３）、又はＡｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：４）で示されるアミノ酸配列からなる、[１]に記載のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩。
[３]　[１]又は[２]に記載のペプチド及びその誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む、組成物。
[４]　[１]又は[２]のペプチド及びその誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種と、Ｌｅｕ―Ａｓｐ―Ｖａｌで表されるペプチド及びその誘導体、並びにそれらの塩とを含む、組成物。
[５]　美容組成物である、[３]又は[４]に記載の組成物。
[６]　外用組成物である、［３］～[５]のいずれかに記載の組成物。
[７]　皮膚の血色不良を改善し、皮膚のシワやタルミを改善し、かつ肌のハリや弾性を回復させるための、［３］～[６]のいずれかに記載の組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-095945号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する。本発明により、アンジオテンシン変換酵素阻害剤として用いることができる新素材が提供される。アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、高血圧症や慢性心不全の治療用の医薬として有用であるのみならず、血圧降下作用により生活習慣病を予防するための食品等にも有益に用いられ得る。また、アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、末梢血管拡張作用や血管新生促進作用を有することから、薄い皮膚の下で鬱血（血行不良）が起こることにより生じる目の下の青クマや、口唇の青紫色への変色等の血色不良をも有効に改善し得ることが期待できる。
　更に、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、線維芽細胞がコラーゲンに接着するのを効果的に促進することができる。従って、本発明により、老化等に起因した線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下を効果的に防止でき、線維芽細胞と細胞外マトリクスの結合を強化して、両者の引っ張り強度を増加させ、真皮を引き締め、皮膚のシワやタルミを改善し、肌のハリや弾性を回復させる新規素材が提供される。
　以上のように、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性による皮膚の血色改善作用と、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進することによる皮膚のシワ・タルミの改善作用と肌のハリ・弾性回復作用の両面から美容トラブルを総合的に解決できることが期待されるため、特に美容のための組成物に有益に用いることができる。
DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド及びRDLDV（Arg―Asp―Leu―Asp―Val）ペプチドの混合物によるアンジオテンシン変換酵素阻害を示す図である。 DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド及びRDLDVF（Arg―Asp―Leu―Asp―Val－Phe）ペプチドの混合物によるアンジオテンシン変換酵素阻害を示す図である。 DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド及びLDV（Leu―Asp―Val）ペプチドの混合物によるアンジオテンシン変換酵素阻害を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたって、単数形の表現は、特に他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書中において使用される用語は、特に他に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられていることが理解されるべきである。
　本発明は、下記の式（Ｉ）：
　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（一文字略記：Ｘ１ＤＬＤＶＸ２、配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、若しくはその誘導体又はそれらの塩を提供する。
　上記配列番号１におけるＸａａ１及びＸａａ２（一文字略記：Ｘ１及びＸ２）は、存在してもしなくてもよく、存在する場合には、それぞれ独立して、任意のアミノ酸を示す。該アミノ酸は、好ましくはα－アミノ酸であり、より好ましくは遺伝的にコードされるα－アミノ酸である。Ｘａａ１及びＸａａ２は、天然に存在するＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ及びＶａｌからなる群から任意に選択されるα－アミノ酸である。好ましくは、Ａｒｇ又はＰｈｅであるα－アミノ酸であり、より好ましくはＸａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ２がＰｈｅである。Ｘａａ１及びＸａａ２は、存在してもしなくても良いが、Ｘａａ１及びＸａａ２のうちの少なくとも一つは存在する方が好ましい。
　上述のようなペプチドのうち、より確実に高い本発明の効果を得るためには、本発明のペプチドは、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（一文字略記：ＤＬＤＶＦ、配列番号：２）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（一文字略記：ＲＤＬＤＶ、配列番号：３）、又はＡｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（一文字略記：ＲＤＬＤＶＦ、配列番号：４）であることが好ましい。
　本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、又はアセトアセチル化した誘導体等をいう。
　本明細書中において、「塩」とは、ペプチド又はその誘導体の薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）をいい、例えば、ペプチド又はその誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、有機酸塩（酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられ、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩、酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩である。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、水和物又は無水和物であってもよい。また、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、溶媒和物又は無溶媒和物であってもよい。
　本発明のペプチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、本発明のペプチドは、化学合成方法（例えば、固相法（例えば、Ｆｍｏｃ法）、液相法等）により合成されてもよく、また遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。なお本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ－体であってもＤ－体であってもよいが、好ましくはＬ－体である。
　さらに本発明のペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによって調製してもよい。
　当業者は、プロテアーゼの配列特異性等を考慮して、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドを切り出すために適切なプロテアーゼを適宜選択し得る。またタンパク質をプロテアーゼで加水分解する場合に用いられる反応条件は、特に制限されず、技術常識に従って当業者により適宜選択され得る。プロテアーゼによる加水分解処理後には、必要に応じ、当該分野で公知の手段によって精製することにより、目的のペプチドを精製することができる。
　このように、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、化学合成方法で製造する場合よりもコスト面から有利となる。さらに、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、生体に対してより安全であると考えられる。従って、このようにして得られたペプチドは、生体への適用に対しより高い安全性が求められる内服剤、食品、敏感肌用化粧料、飼料などに好適に使用され得る。ここで、食品とは飲料品を含むすべての飲食物を含む。
　本発明のペプチドの誘導体は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
　本発明のペプチドの塩もまた、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
　本発明には、上記の特定配列を有するペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩のいずれもが用いられ得るが、より確実に高い本願効果を得るためには、好ましくはペプチド又はその塩が用いられ、特に好ましくはペプチドが用いられる。
　以上のようにして得られた本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害し得る。アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害することにより、生体内で昇圧系のレニン－アンジオテンシン系と降圧系のカリクレイン－キニン系の両方に作用し、血管の拡張等を通じて降圧作用を発揮することが公知である。従って、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、高血圧症や慢性心不全の予防及び／又は治療のために、血圧降下作用により生活習慣病を予防するために、或いは血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を改善するために、有益に使用することができる。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、例えば、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)を基質として用い、該基質から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を測定することにより決定することができる。当業者ならば、このような方法によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性が認められたペプチドが、高血圧症や慢性心不全の予防及び／又は治療、血圧降下作用による生活習慣病の予防、及び血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）の改善に効果があることを理解することができる。
　また上記のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進し得る。生体の真皮内で線維芽細胞が細胞外マトリクス中のコラーゲンと接着することにより、線維芽細胞と細胞外マトリクスの結合を強化して、両者の引っ張り強度を増加させて真皮を引き締め、肌のハリや弾性が保持される。従って、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、前記細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する皮膚のシワやタルミを改善するため、或いは肌のハリや弾性を回復させるためにもまた有益に使用され得る。線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着の促進作用は、例えば、コラーゲンでコートした培養用プレート中で上記ペプチド等を含む培地を用いて皮膚線維芽細胞を培養した後、プレートを洗浄し、洗い流されずにプレート上のコラーゲンコートに残存した細胞を計測することにより測定することができる。当業者ならば、このような方法により線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進し得るペプチドが、線維芽細胞と細胞外マトリクスの結合を強化して、両者の引っ張り強度を増加させて真皮を引き締め、皮膚のシワやタルミを改善し、或いは肌のハリや弾性を回復させる効果を有することを理解することができる。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、２種類以上を組合せて用いてもよい。２種類以上を用いた場合、上記のアンジオテンシン変換酵素阻害活性が相乗的に高まる。従って、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は２種類以上を組合せて用いた場合、生体内で昇圧系のレニン－アンジオテンシン系と降圧系のカリクレイン－キニン系の両方に作用し、血管の拡張等を通じて降圧作用を相乗的に発揮する。その結果、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の２種類以上を組合せた混合物を、高血圧症や慢性心不全の予防及び／又は治療のために、血圧降下作用により生活習慣病を予防するために、或いは血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を改善するために、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を単独で用いる場合に比べ、より効果的に使用することができる。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の組合せとしては、X1DLDVX2（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、DLDVF（配列番号：２）、RDLDV（配列番号：３）、及びRDLDVF（配列番号：４）で表されるペプチドの２種類、３種類、４種類あるいはそれ以上の任意の組み合せが挙げられる。組合せにはX1DLDVX2（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド同士の組合せであって、X1及び／又はX2が互いに異なる同士の組合せも含まれる。
　例えば、DLDVFペプチド及びRDLDVペプチドを組合せた混合物、DLDVFペプチド及びRDLDVFペプチドを組合せた混合物が挙げられる。さらに、X1DLDVX2（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、DLDVF（配列番号：２）、RDLDV（配列番号：３）、及びRDLDVF（配列番号：４）で表されるペプチドとLeu―Asp―Val（LDV)で表されるペプチドを組合せて混合物として用いても顕著な効果を発揮する。例えば、DLDVFペプチド及びLDVペプチドを組合せた混合物が挙げられる。
　混合物の混合比は、限定されないが、２種類の組合せで用いる場合、一方のペプチドと他方のペプチドの混合重量比は、95：5～5:95であり、好ましくは90:10～10:90であり、さらに好ましくは80:20～20:80であり、特に好ましくは75:25～25:75である。例えば、DLDVFペプチド及びRDLDVペプチドを75:25～25:75の混合比で混合すればよく、DLDVFペプチド及びRDLDVFペプチドを75:25～25:75の混合比で混合すればよく、また、DLDVFペプチド及びLDVペプチドを75:25～25:75の混合比で混合すればよい。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の２種類以上を組合せて用いた場合、例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、それぞれを単独で用いた場合に比べ、アンジオテンシン変換酵素活性を、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)を基質として用い、該基質から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を測定することにより決定した場合、IC50値が20％以上、好ましくは30％以上、さらに好ましくは40％以上、特に好ましくは50％以上低下し得る。
　本発明はまた、前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む組成物を提供する。本発明において、ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む組成物という場合、ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の２種類以上の混合物を含む組成物も包含される。該組成物は、好ましくは美容組成物である。該組成物は上記の機能を有するペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含むため、美容効果を奏することができる。すなわち、上記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害するという作用及び皮膚維維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進するという作用の両方の作用を有する。前者の作用により、血管の拡張等を通じて、血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を改善するという効果を発揮し、後者の作用により、皮膚を引き締めて、皮膚のシワやタルミを改善し、或いは肌のハリや弾性を回復させるという効果を発揮する。両方の効果が相まって、顕著な美容効果を奏することができる。本発明においては、顔や体つきを美しくすること（例えば、美肌等の美容）を目的として用い得る組成物を、美容組成物という。
　また、本発明の組成物は、医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物又は飼料組成物として好適に使用され得る。好ましくは、美容のために用いられる医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物及び飼料組成物である。さらに、本発明の組成物は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性や、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着性に関連する生理状態解明のための研究試薬として好適に使用され得る。また、本発明の組成物はアンジオテンシン変換酵素阻害剤や線維芽細胞とコラーゲンの接着促進剤として用いることもできる。
　医薬組成物としては、例えば、ヒト等の哺乳動物におけるアンジオテンシン変換酵素の活性に起因する疾患の予防剤及び／又は治療剤等が挙げられる。具体的には、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む医薬組成物は、例えば、高血圧症及び／又は慢性心不全の予防剤及び／又は治療剤、並びに、血色不良症状（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）の予防剤及び／又は治療剤として使用され得る。更に、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む医薬組成物は、ヒト等の哺乳動物における線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する疾患の予防剤及び／又は治療剤等としても用いられ得る。具体的には、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む医薬組成物は、例えば、加齢等により生じる線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する皮膚のシワ若しくはタルミの予防剤及び／又は治療剤として、前記接着能力低下に起因する皮膚のハリ若しくは弾力性の低下に対する予防剤及び／又は治療剤、或いは肌の引き締め剤等として使用され得る。
　化粧料組成物としては、例えば、ヒト等の哺乳動物におけるアンジオテンシン変換酵素の活性に起因する状態の予防及び／又は改善のための化粧料が挙げられる。具体的には、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む化粧料組成物は、例えば、血色不良状態（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）の予防及び／又は改善のための化粧料として使用され得る。更に、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む化粧料組成物は、ヒト等の哺乳動物における線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する状態の予防及び／又は改善のための化粧料としても用いられ得る。具体的には、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む化粧料組成物は、例えば、加齢等により生じる線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のための化粧料として、前記接着能力低下に起因する皮膚のハリ若しくは弾力性の低下に対する予防及び／又は改善のための化粧料、或いは肌の引き締めのための化粧料等として使用され得る。
　食品組成物としては、例えば、ヒト等の哺乳動物におけるアンジオテンシン変換酵素の活性に起因する状態の予防及び／又は改善のための食品が挙げられる。具体的には、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む食品組成物は、例えば、高血圧症や慢性心不全の予防及び／又は改善のための食品、血圧降下作用により生活習慣病を予防及び／又は改善するための食品、或いは血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を予防及び／又は改善するための食品として有益に使用することができる。更に、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む食品組成物は、ヒト等の哺乳動物における線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する状態の予防及び／又は改善のための食品としても用いられ得る。具体的には、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む食品組成物は、例えば、加齢等により生じる線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する皮膚のシワ若しくはタルミの予防及び／又は改善のための食品、前記接着能力低下に起因する皮膚のハリ若しくは弾力性の低下に対する予防及び／又は改善のための食品、或いは肌の引き締めのための食品等として使用され得る。本発明の食品組成物は、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、健康補助食品等を含む。これらの組成物は美容健康食品を含む。特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。これらの食品には、特定の実施形態において、上記のような用途に用いられるものである旨の表示を付した食品として提供され得る。すなわち、美容のために用いられるものである旨の表示、美肌作用を有する旨の表示、肌質改善のために用いられるものである旨の表示、血色不良の予防又は改善のために用いられるものである旨の表示、顔色（例えば、目の下の青クマや、口唇の青紫色への変色等）の改善のために用いられるものである旨の表示、皮膚のハリや弾性を回復させるために用いられるものである旨の表示、皮膚のシワやタルミの予防又は改善のために用いられるものである旨の表示、肌の引き締めのために用いられるものである旨の表示、高血圧や慢性心不全の予防又は改善のために用いられるものである旨の表示、血圧降下作用により生活習慣病を予防又は改善するために用いられるものである旨の表示等の表示を付した食品として提供され得る。
　飼料組成物としては、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ等の家畜や、イヌ、ネコ等のペット動物におけるアンジオテンシン変換酵素活性に起因する状態の予防用及び／又は改善用の飼料、或いは線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着能力低下に起因する状態の予防用及び／又は改善用の飼料等が挙げられる。
　上記の本発明の組成物中の前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の含有量は、ペプチド等の種類、組成物の剤型等によっても異なるが、一般には、高い本願効果を得る観点から、0.00001～80重量％、好ましくは0.0001～70重量％、より好ましくは0.001～50重量％、さらに好ましくは0.001～20重量％、さらにより好ましくは0.01～10重量％、さらにより好ましくは0.05～10重量％、さらにより好ましくは0.1～10重量％である。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む組成物は、前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の他に製剤分野や食品分野等において通常使用される担体、基剤、及び／又は添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合して調製することができる。
　担体としては、例えば、架橋ビニル重合体、脂質類等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
　基剤としては、例えば、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
　添加剤としては、例えば、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、アミノ酸類、着色剤、香料等が１種又は２種以上組み合わせて用いられ得る。
　さらに本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む組成物には、必要に応じて更なる有用な作用を付加するために、他の美白成分や、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、ニキビ改善成分、生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等の各種成分が１種又は２種以上組み合わせて配合されてもよい。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む組成物は、外用剤(外用に供される化粧料を含む)、内服剤（経口摂取される食品及び飼料を含む）等の任意の剤型であり得るが、顔色（血色不良）や皮膚のシワ、タルミ、ハリ、弾力性、引き締め等に対してより直接的に高い効果を発揮させるためには、好ましくは外用剤として使用され得る。
　外用剤としては、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状(基材担持)、エアゾール状、スプレー状等の任意の形態で使用され得る。
　化粧料としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、オイル、パック等の基礎化粧料、またファンデーション、頬紅、口紅等のメーキャップ化粧料、さらに洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の洗浄料、入浴剤等の任意の形態で使用され得る。
　内服剤（食品及び飼料を含む）としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤(ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む)、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、ゼリー剤等の任意の形態で使用され得る。
　また本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を含む食品組成物は、食品衛生上許容される配合物を混合して、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品等に加工して利用することができる。さらに食品とする場合には、パン、麺、惣菜、食肉加工食品（例えば、ハム、ソーセージなど）、水産加工食品、調味料（例えば、ドレッシングなど）、乳製品、菓子（例えば、ビスケット、キャンディー、ゼリー、アイスクリームなど）、スープ、ジュースなどの任意の一般の食品形態としても提供され得る。このような形態にする場合、本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、目的とする食品の性質等に依存して、当業者に公知の方法により適宜配合され得る。
　飼料としては、任意の形態で使用され得るため、特に限定は無い。
　本発明はさらに、前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩、あるいはそれらを含む前記組成物を用いることを特徴とする、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害する方法及び線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進する方法を提供する。
　該方法においては、前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩、あるいはそれらを含む前記組成物を、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害して所期の効果が得られる有効量以上、或いは、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進して所期の効果が得られる有効量以上で用いればよい。
　すなわち、本発明の方法における前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の使用量は通常、外用剤の場合には、成人１人体重約50kgあたり好ましくは約0.1μg～２g/日である。また、内服剤の場合における当該使用量は通常、成人1人体重約50kgあたり好ましくは約0.001～10000mg/日、より好ましくは約1～1000mg/日、さらに好ましくは約1～100mg/日である。
　本発明の方法は、さらに前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩あるいはそれらを含む前記組成物を皮膚に適用する工程を含んでいてもよい。この場合の前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の皮膚への適用量は、好ましくは約1ng～500μg/cm2、より好ましくは約0.01～50μg/cm2、さらに好ましくは約0.1～10μg/cm2である。
　前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩あるいはそれらを含む外用剤は、塗布、噴霧等により皮膚に局所的に適用することができる。
　本発明はさらに、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害するため及び／又は線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進するための組成物、好ましくは外用剤として使用され得る組成物の製造のための、前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の使用を提供する。
　前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩の使用量は、前記組成物中の含有量となるように使用すればよい。
　本発明はさらに、アンジオテンシン変換酵素の活性を阻害するため及び／又は線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着を促進するための前記ペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩を提供する。
　本発明は、上記組成物をヒト等の哺乳動物に投与して、血管の拡張等を通じて、血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を改善する方法を包含し、さらに、皮膚を引き締めて、皮膚のシワやタルミを改善し、或いは肌のハリや弾性を回復させる方法を包含する。また、本発明は、上記組成物の血管の拡張等を通じて、血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を改善するための薬剤、又は皮膚を引き締めて、皮膚のシワやタルミを改善し、或いは肌のハリや弾性を回復させるための薬剤の製造のための上記組成物の使用を包含する。さらに、本発明は、血管の拡張等を通じて、血色不良（例えば、目の下の青クマや口唇の青紫色への変色等）を改善するため、又は皮膚を引き締めて、皮膚のシワやタルミを改善し、或いは肌のハリや弾性を回復させるために用いられる上記組成物を包含する。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ペプチドの調製
１－１．DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド：
（１）　ペプチドの合成：
　表題のペプチドを、ペプチド自動合成装置(島津製作所社製：ＰＳＳＭ８)を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである：まず固相合成用樹脂にＦｍｏｃ－Ｐｈｅ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨのＣ末端を結合させてから、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨをＰｈｅのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)－ＯＨをＶａｌのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨをAspのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)－ＯＨをLeuのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、この樹脂からペプチド鎖の切り出しを行った。ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)により、PheのＴｒｔ基とAspのｔＢｕ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することによりDLDVFペプチドを得た。
（２）　ペプチドの純度検定：
　得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Inertsil ODS－3 (内径：2.1mm、長さ： 50mm)、GL Sciences社製、；移動相：溶媒Ａ（0.05％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.05％トリフルオロ酢酸、100％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝0％）～25分（溶媒Ｂ＝50％））；流速：0.2 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、14.8分に単一の鋭いピークが示され、純度は99.5％であった。
１－２．RDLDV（Arg―Asp―Leu―Asp―Val）ペプチド：
（１）　ペプチドの合成：
　表題のペプチドを、ペプチド自動合成装置(島津製作所社製：ＰＳＳＭ８)を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである：まず固相合成用樹脂にＦｍｏｃ－Ｖａｌ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨのＣ末端を結合させてから、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)－ＯＨをValのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨをＡｓｐのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)－ＯＨをＬｅｕのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ(Ｐｍｃ)－ＯＨをＡｓｐのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、この樹脂からペプチド鎖の切り出しを行った。ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)により、ＶａｌのＴｒｔ基とＡｓｐのｔＢｕ基、ＡｒｇのＰｍｃ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することによりRDLDVを得た。
（２）　ペプチドの純度検定
　得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Inertsil ODS－3 (内径：2.1mm、長さ： 50mm)、GL Sciences社製、；移動相：溶媒Ａ（0.05％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.05％トリフルオロ酢酸、100％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝0％）～30分（溶媒Ｂ＝70％））；流速：0.2 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、11.2分に単一の鋭いピークが示され、純度は99.2％であった。
１－３．RDLDVF（Arg―Asp―Leu―Asp―Val―Phe）ペプチド：
（１）　ペプチドの合成：
　表題のペプチドを、ペプチド自動合成装置(島津製作所社製：ＰＳＳＭ８)を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。具体的な手順は以下の通りである：まず固相合成用樹脂にＦｍｏｃ－Ｐｈｅ（１－Ｔｒｔ）－ＯＨのＣ末端を結合させてから、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、次いでこの樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨをＰｈｅのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)－ＯＨをＶａｌのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨをＡｓｐのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)－ＯＨをＬｅｕのＮ末端に導入した。次いで保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、再度この樹脂を中和・洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ(Ｐｍｃ)－ＯＨをＡｓｐのＮ末端に導入した。次いで、保護基(Ｆｍｏｃ)をピペリジン処理で除去し、この樹脂からペプチド鎖の切り出しを行った。ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)により、ＰｈｅのＴｒｔ基とＡｓｐのｔＢｕ基、ＡｒｇのＰｍｃ基を切断することにより脱保護した。最後に、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することによりRDLDVFを得た。
（２）　ペプチドの純度検定：
　得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：Inertsil ODS－3 (内径：2.1mm、長さ： 50mm) 、GL Sciences社製、；移動相：溶媒Ａ（0.05％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.05％トリフルオロ酢酸、100％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝0％）～30分（溶媒Ｂ＝70％））；流速：0.2 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、14.3分に単一の鋭いピークが示され、純度は99.9％であった。
実施例２：アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定
　上記実施例１で調製した各種ペプチドを用いて、アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を行った。
　具体的には、各ペプチド濃度が1mg／mLになるように被験液を調製し、1倍、10倍、100倍、及び1000倍希釈液を用いてアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、ACE Kit-WSTキット（（株）同仁化学研究所製）を用いて、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を酵素法により検出し、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定することにより評価した。ACE Kit-WSTキットは、付属のプロトコールに順じて使用した。この結果を、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の結果に示されるように、３種のいずれの被験ペプチドでも、高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性が奏されることが明らかとなった。
実施例３：コラーゲンコートへの線維芽細胞接着評価
　上記実施例１で調製した各種ペプチドを用いて、コラーゲンコートへの線維芽細胞の接着促進効果について評価を行った。
　具体的には、先ず、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（クラボウ：KF-4009）をコラーゲンコートされたセルカルチャープレート(96well)に2×104cell /well濃度で播種した。次いで、各ペプチドが５μｇ／ｍｌ濃度となるように希釈したDulbecco’s Modified Eagle Medium（D-MEM；FCS10％・AB1％)を各ウェルに200μｌずつ添加し、３７℃、５％炭酸ガス及び９５％空気の環境下で20時間培養を行った。一方、ペプチドを添加していないD-MEM培地を200μｌ添加したもの用意して、コントロールとした。培養開始から4時間後にPBSで各ウェルの上清を洗い流し、Cell Counting Kit-8キット（（株）同仁化学研究所製）を用いて、各ウェル中でコラーゲンコートに接着して洗い流されずに残存した生細胞数を計測した。測定結果をもとに、コトロールにおける生細胞数を100％として各被験薬ペプチド添加群の生細胞数（％）を算出した。この結果を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記の結果に示されるように、３種のいずれの被験ペプチドを添加した場合でも、コラーゲンコートへの線維芽細胞の接着が促進されることが明らかとなった。この結果から、DLDVF、RDLDV、RDLDVFペプチドを用いることにより、線維芽細胞とコラーゲンとの間の接着が促進され、線維芽細胞と細胞外マトリクスの結合を強化して、両者の引っ張り強度を増加させ、真皮を引き締め、老化等に伴う皮膚のシワやタルミが改善され、肌のハリや弾性を効果的に改善できる新規素材が提供されることが分かる。
実施例４　アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定
　上記実施例１で調製したペプチドを用いて、アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を行った。
　具体的には、DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド及びRDLDV（Arg―Asp―Leu―Asp―Val）ペプチドを100：0、75：25、50：50、25：75、0：100となる比率で混合して、最終ペプチド濃度が合計1mg／mLになるように被験液を調製した。この1倍、10倍、100倍、及び1000倍希釈液を用いてアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、ACE Kit-WSTキット（（株）同仁化学研究所製）を用いて、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を酵素法により検出し、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定することにより評価した。ACE Kit-WSTキットは、付属のプロトコールに順じて使用した。この結果を、図１に示す。
　図１に示されるように、DLDVFペプチドとRDLDVペプチドを組み合わせて添加することによって、相乗効果的に高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性が発揮されることが認められた。
実施例５　アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定
　上記実施例１で調製したペプチドを用いて、アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を行った。
　具体的には、DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド及びRDLDVF（Arg―Asp―Leu―Asp―Val－Phe）ペプチドを100：0、50：50、0：100となる比率で混合して、最終ペプチド濃度が合計1mg／mLになるように被験液を調製した。この1倍、10倍、100倍、及び1000倍希釈液を用いてアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、ACE Kit-WSTキット（（株）同仁化学研究所製）を用いて、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を酵素法により検出し、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定することにより評価した。ACE Kit-WSTキットは、付属のプロトコールに順じて使用した。この結果を、図２に示す。
　図２に示されるように、DLDVFペプチドとRDLDVFペプチドを組み合わせて添加することによっても、相乗効果的に高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性が発揮された。
実施例６　アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定
　上記実施例1で調製したペプチドを用いて、アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を行った。
　具体的には、DLDVF(Asp―Leu―Asp―Val―Phe)ペプチド及びLDV（Leu―Asp―Val）ペプチドを100：0、50：50、0：100となる比率で混合して、最終ペプチド濃度が合計1mg／mLになるように被験液を調製した。この1倍、10倍、100倍、及び1000倍希釈液を用いてアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、ACE Kit-WSTキット（（株）同仁化学研究所製）を用いて、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)から切り出されてくる3-Hydroxybutyric acid (3HB)を酵素法により検出し、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定することにより評価した。ACE Kit-WSTキットは、付属のプロトコールに順じて使用した。この結果を、図３に示す。
　図３に示されるように、DLDVFペプチドに対してLDVペプチドを組み合わせて添加することによっても、相乗効果的に高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性が発揮された。
　本発明のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、美容のための組成物として用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号１～４　合成

Claims (5)

  1. 　下記の式（Ｉ）：
    　Ｘａａ１－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｘａａ２（配列番号：１）
    ［ここで、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在してもしなくてもよく、存在する場合にはそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す］
    　のアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩。
  2. 　前記ペプチドが、Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：２）、Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ（配列番号：３）、又はＡｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ（配列番号：４）で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド若しくはその誘導体、又はそれらの塩。
  3. 　請求項１又は２に記載のペプチド及びその誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む、組成物。
  4. 　請求項１又は２に記載のペプチド及びその誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種と、Ｌｅｕ―Ａｓｐ―Ｖａｌで表されるペプチド及びその誘導体、並びにそれらの塩とを含む、組成物。
  5. 　美容組成物である、請求項３又は４に記載の組成物。
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