CN103443118A

CN103443118A - 新型肽

Info

Publication number: CN103443118A
Application number: CN2012800153805A
Authority: CN
Inventors: 阿部正通; 熊泽益德; 松本康助
Original assignee: SAATSU PHARMECEUTICAL Manufacturing Co Ltd
Current assignee: SAATSU PHARMECEUTICAL Manufacturing Co Ltd; Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2032-04-19
Also published as: HK1187628A1; CN103443118B; WO2012144546A1; JPWO2012144546A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种具有血管紧张素转换酶抑制活性和/或成纤维细胞和胶原之间的粘接促进活性的新型物质，所述新型物质为一种由下述的式(I)：Xaa¹-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa²(SEQ ID NO：1)[其中，Xaa¹及Xaa²可以存在或不存在，在存在的情况下，分别独立地表示任意的氨基酸]的氨基酸序列构成的肽或者其衍生物、或它们的盐。

Description

新型肽

技术领域

本发明涉及一种具有特定的氨基酸序列的新型肽或者其衍生物或它们的盐。本发明的新型肽或者其衍生物或它们的盐由于抑制血管紧张素转换酶的活性，还促进细胞和胶原之间的粘接，因此可有益地利用。

背景技术

血管紧张素转换酶抑制剂通常由于治疗高血压病及慢性心力衰竭而广泛使用。血管紧张素转换酶抑制剂在生物体内作用于升压系的肾素-血管紧张素系统和降压系的激肽释放酶-激肽系统这两者，通过血管的扩张等发挥降压作用的方面是公知的。进而，还已知血管紧张素转换酶抑制剂具有同时降低心脏的前负荷和后负荷，改善心血管动力学的作用。另外，近几年，还报告有血管紧张素转换酶抑制剂经由血管内皮细胞生长因子(VEGF)的产生而具有抑制细胞凋亡及促进内皮修复、血管新生的作用(非专利文献1)。

迄今为止，作为血管紧张素转换酶抑制剂，已知依拉普利及卡托普利等合成化合物，此外，已知有多个源自食品的蛋白酶分解物等。例如，添加了芝麻蛋白质分解物(专利文献1)或长齿白齿耳菌提取物（ブナハリタケエキス）(专利文献2)等的食品作为适于血压高者的特定保健用食品等被实用化。

另一方面，在生物体的真皮内，成纤维细胞与细胞外基质中的胶原粘接成为增强·稳定胶原纤维束的格子状的立体结构且保持肌肤的张力及弹性的一个原因。而且，可知若该成纤维细胞对胶原的粘接能力由于老化等原因而降低，则引起肌肤的张力及弹力的降低。进而，已知若成纤维细胞自身也未与胶原纤维粘接来抓住立足点，则其作用(例如，各种因子的产生等)变得迟钝。根据如上所述的理由，探求促进成纤维细胞和胶原之间的粘接的成分。

迄今为止，作为促进成纤维细胞和胶原之间的粘接的材料，已知有具有特定序列的肽(专利文献3)等。

但是，希望开发一种更有用的具有血管紧张素转换酶抑制活性和/或成纤维细胞和胶原之间的粘接促进活性的材料。而且，迄今为止，完全未知兼备血管紧张素转换酶抑制活性及成纤维细胞和胶原之间的粘接促进活性这两者的材料。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表2006-520809号公报

专利文献2:日本特开2002-29995号公报

专利文献3:美国专利申请公开第2004/0141939号说明书

非专利文献

非专利文献1:荒川博、Japanese Circulation Journal第64卷,增刊1,第438页,2000年

发明内容

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述现有技术而完成的，其目的在于，提供一种具有高血管紧张素转换酶抑制活性和/或成纤维细胞和胶原之间的粘接促进活性的更有用的材料，尤其是提供一种同时兼备血管紧张素转换酶抑制活性和成纤维细胞对胶原的粘接促进活性这两者，且对美容非常有用的新的材料。

用于解决问题的手段

本发明人等为了解决所述课题进行了潜心研究，结果发现，具有特定的氨基酸序列的短链肽可以发挥高血管紧张素转换酶抑制活性，另外，还可以发挥成纤维细胞和胶原之间的粘接促进活性，以至完成了本发明。

即，本发明提供以下内容。

[1]一种由下述的式(I)的氨基酸序列构成的肽或者其衍生物、或它们的盐，

Xaa¹-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa²(SEQ ID NO：1)

[其中，Xaa¹及Xaa²可以存在或不存在，在存在的情况下，分别独立地表示任意的氨基酸]。

[2]如[1]所述的肽或者其衍生物、或它们的盐，其中，所述肽由Asp-Leu-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO：2)、Arg-Asp-Leu-Asp-Val(SEQ ID NO：3)、或Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO：4)所示的氨基酸序列构成。

[3]一种组合物，其含有选自由[1]或[2]所述的肽及其衍生物、以及它们的盐构成的组中的至少1种。

[4]一种组合物，其含有选自由[1]或[2]所述的肽及其衍生物、以及它们的盐构成的组中的至少1种、和Leu-Asp-Val所示的肽及其衍生物、以及它们的盐。

[5]如[3]或[4]所述的组合物，其为美容组合物。

[6]如[3]～[5]中任一项所述的组合物，其为外用组合物。

[7]如[3]～[6]中任一项所述的组合物，其用于改善皮肤的肤色差、改善皮肤的皱纹及松弛，且恢复肌肤的张力及弹性。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2011-095945号的说明书和/或附图中所记载的内容。

发明效果

本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐具有高血管紧张素转换酶抑制活性。通过本发明，可提供一种可用作血管紧张素转换酶抑制剂的新的材料。血管紧张素转换酶抑制剂不仅作为高血压病及慢性心力衰竭的治疗用的医药有用，而且用于通过血压降低作用来预防生活习惯病的食品等也可有益地使用。另外，血管紧张素转换酶抑制活性由于具有末梢血管扩张作用及血管新生促进作用，因此，可以期待能够有效地改善由于在薄皮肤下引起淤血(血液循环差)而产生的眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等的肤色差。

进而，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可有效地促进成纤维细胞与胶原粘接。因此，通过本发明，可提供一种能够有效地防止起因于老化等的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低、增强成纤维细胞和细胞外基质的结合、增加两者的拉伸强度、紧致真皮、改善皮肤的皱纹及松弛、恢复肌肤的张力及弹性的新型材料。

如上所述，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐从通过血管紧张素转换酶抑制活性来改善皮肤的肤色作用、和通过促进成纤维细胞和胶原之间的粘接来改善皮肤的皱纹·松弛的作用和恢复肌肤的张力·弹性作用这两面考虑，可以期待能够综合性地解决美容问题，因此，可在用于美容的组合物中有益地使用。

附图说明

图1是表示利用DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及RDLDV(Arg-Asp-Leu-Asp-Val)肽的混合物抑制血管紧张素转换酶的图；

图2是表示利用DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及RDLDVF(Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽的混合物抑制血管紧张素转换酶的图；

图3是表示利用DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及LDV(Leu-Asp-Val)肽的混合物抑制血管紧张素转换酶的图。

具体实施方式

以下，对本发明详细地说明。本说明书的全文中，只要没有特别提及，单数形式的表述则应理解为也包含其复数形式的概念。另外，只要没有特别提及，本说明书中所使用的术语则应理解为以本领域中通常使用的含义进行使用的。

本发明提供一种由下述的式(I)：

Xaa¹-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa²(单字符简写：X¹DLDVX²、SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列构成的肽、或者其衍生物或它们的盐。

上述SEQ ID NO1中的Xaa¹及Xaa²(单字符简写：X¹及X²)可以存在或不存在，在存在的情况下，分别独立地表示任意的氨基酸。该氨基酸优选为α-氨基酸，更优选为遗传编码的α-氨基酸。Xaa¹及Xaa²为从天然存在的Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Lys及Val构成的组中任意选择的α-氨基酸。优选为作为Arg或Phe的α-氨基酸，更优选Xaa¹为Arg，Xaa²为Phe。Xaa¹及Xaa²可以存在或不存在，但优选存在Xaa¹及Xaa²中的至少一个。

如上所述的肽中，为了更可靠地得到高的本发明的效果，本发明的肽优选为Asp-Leu-Asp-Val-Phe(单字符简写：DLDVF、SEQ ID NO：2)、Arg-Asp-Leu-Asp-Val(单字符简写：RDLDV、SEQ ID NO：3)、或Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe(单字符简写：RDLDVF、SEQ ID NO：4)。

在本说明书中中，“肽的衍生物”是指例如将肽乙酰化、棕榈酰化、十四烷基化、酰胺化、丙烯酸化、丹酰化、生物素化、磷酸化、琥珀酰化、酰苯胺化、苄氧羰基化、甲酰化、硝基化、磺化、醛化、环状化、糖基化、单甲基化、二甲基化、三甲基化、胍基化、脒化、马来酰化、三氟乙酰化、氨基甲酰化、三硝基苯基化、硝基环庚三烯酮化、或乙酰乙酰化而成的衍生物等。

在本说明书中，“盐”是指肽或其衍生物的药理学上可接受的任意的盐(含有无机盐及有机盐)，例如可以举出：肽或其衍生物的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、有机酸盐(乙酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、草酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、丙酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、苦味酸盐、苯磺酸盐等)等，优选为铵盐、盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐或三氟乙酸盐，更优选为铵盐、乙酸盐或三氟乙酸盐。

本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可以为水合物或非水合物。另外，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可以为溶剂化物或非溶剂化物。

本发明的肽可以通过该领域中公知的方法来制作。例如，本发明的肽可通过化学合成方法(例如，固相法(例如、Fmoc法)、液相法等)来合成，另外，也可以通过基因重组表达等方法来制作。另外，构成本发明的肽的氨基酸可以为L-型，也可以为D-型，但优选为L-型。

进而，本发明的肽可以通过如下操作来制备：通过蛋白酶处理等公知的方法从含有目标氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列中切出由目标氨基酸序列构成的肽。

本领域技术人员考虑蛋白酶的序列特异性等，为了从含有目标氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列中切出由目标氨基酸序列构成的肽，可适宜选择适当的蛋白酶。另外，在用蛋白酶将蛋白质水解时使用的反应条件没有特别限制，可由本领域技术人员根据技术常识适宜选择而得到。利用蛋白酶的水解处理后，根据需要通过本领域中公知的方法进行精制，由此，可以精制目标肽。

如上所述，将天然的蛋白质用蛋白酶水解而得到的肽与用化学合成方法制造的情况相比，从成本方面考虑是有利的。进而，认为将天然的蛋白质用蛋白酶水解而得到的肽对于生物体是更安全的。因此，如上得到的肽可优选用于针对向生物体的适用要求更高的安全性的内服剂、食品、敏感肌肤用化妆品、饲料等。其中，食品是指包含含有饮用品的全部的饮食物。

本发明的肽的衍生物可以通过本领域中公知的任意的方法由本领域技术人员容易地制作而得到。

本发明的肽的盐也可以通过本领域中公知的任意的方法由本领域技术人员容易地制作而得到。

本发明可使用具有上述的特定序列的肽或者其衍生物、或它们的盐中的任一种，但为了更可靠地得到高的本申请效果，可优选使用肽或其盐，特别优选使用肽。

如上得到的本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可抑制血管紧张素转换酶的活性。通过抑制血管紧张素转换酶的活性，在生物体内作用于升压系的肾素-血管紧张素系统和降压系的激肽释放酶-激肽系统这两者，并通过血管的扩张等来发挥降压作用是公知的。因此，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可以为了预防和/或治疗高血压病及慢性心力衰竭、为了通过血压降低作用来预防生活习惯病、或者为了改善肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈或嘴唇向青紫色的变色等)而有益地使用。血管紧张素转换酶抑制活性例如可以通过使用3-羟丁酰-Gly-Gly-Gly(3HB-GGG)作为底物并测定从该底物中切出的3-羟丁酸(3HB)来确定。若为本领域技术人员，则可以理解通过这样的方法确认到血管紧张素转换酶抑制活性的肽对高血压病及慢性心力衰竭的预防和/或治疗、通过血压降低作用带来的生活习惯病的预防、及肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈或嘴唇向青紫色的变色等)的改善有效。

另外，上述的肽或者其衍生物、或它们的盐可促进成纤维细胞和胶原之间的粘接。通过成纤维细胞在生物体的真皮内与细胞外基质中的胶原粘接，可增强成纤维细胞和细胞外基质的结合、增加两者的拉伸强度、紧致真皮、保持肌肤的张力及弹性。因此，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐也可为了改善起因于上述细胞和胶原之间的粘接能力降低的皮肤的皱纹及松弛或者为了使肌肤的张力及弹性恢复而有益地使用。成纤维细胞和胶原之间的粘接的促进作用例如可以通过如下操作测定：在用胶原涂布的培养用板中使用含有上述肽等的培养基培养皮肤成纤维细胞后，在未将板清洗、冲洗的情况下测量板上的胶原涂层上残留的细胞。若为本领域技术人员，则可以理解通过这样的方法可促进成纤维细胞和胶原之间的粘接的肽具有增强成纤维细胞和细胞外基质的结合、增加两者的拉伸强度、紧致真皮、改善皮肤的皱纹及松弛、或者使肌肤的张力及弹性恢复的效果。

本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可以组合2种以上进行使用。在使用2种以上的情况下，上述的血管紧张素转换酶抑制活性协同地提高。因此，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐在组合2种以上进行使用的情况下，在生物体内作用于升压系的肾素-血管紧张素系统和降压系的激肽释放酶-激肽系统这两者，并通过血管的扩张等协同地发挥降压作用。其结果，为了预防和/或治疗高血压病及慢性心力衰竭、为了通过血压降低作用来预防生活习惯病、或者为了改善肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)，与单独使用本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的情况相比，可以更有效地使用组合本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的2种以上而成的混合物。

作为本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的组合，可以举出：由X¹DLDVX²(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列构成的肽、DLDVF(SEQ ID NO：2)、RDLDV(SEQ ID NO：3)、及RDLDVF(SEQ ID NO：4)所示的肽的2种、3种、4种或者其以上的任意的组合。组合为由X¹DLDVX²(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列构成的肽彼此的组合，也包含X¹和/或X²互相不同的彼此的组合。

例如可以举出：组合DLDVF肽及RDLDV肽而成的混合物、组合DLDVF肽及RDLDVF肽而成的混合物。进而，即使组合由X¹DLDVX²(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列构成的肽、DLDVF(SEQ ID NO：2)、RDLDV(SEQ ID NO：3)、及RDLDVF(SEQ ID NO：4)所示的肽和Leu-Asp-Val(LDV)所示的肽作为混合物使用，也发挥显著的效果。例如可以举出：组合DLDVF肽及LDV肽而成的混合物。

混合物的混合比没有限定，在使用2种的组合的情况下，一方的肽和另一方的肽的混合重量比为95：5～5:95，更优选为90:10～10:90，进一步优选为80:20～20:80，特别优选为75:25～25:75。例如只要将DLDVF肽及RDLDV肽以75:25～25:75的混合比混合即可，只要将DLDVF肽及RDLDVF肽以75:25～25:75的混合比混合即可，另外，只要将DLDVF肽及LDV肽以75:25～25:75的混合比混合即可。

在组合本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的2种以上进行使用的情况下，例如血管紧张素转换酶抑制活性与分别单独使用的情况相比，在通过使用3-羟丁酰-Gly-Gly-Gly(3HB-GGG)作为底物并测定从该底物中切出的3-羟丁酸(3HB)来确定血管紧张素转换酶活性时，IC50值可降低20%以上、优选可降低30%以上，进一步优选可降低40%以上，特别优选可降低50%以上。

本发明还提供一种含有上述肽或者其衍生物、或它们的盐的组合物。在本发明中，在含有肽或者其衍生物、或它们的盐的组合物的情况下，也包含含有肽或者其衍生物、或它们的盐的2种以上的混合物的组合物。该组合物优选为美容组合物。该组合物由于含有具有上述的功能的肽或者其衍生物、或它们的盐，因此，可以发挥美容效果。即，上述肽或者其衍生物、或它们的盐具有抑制血管紧张素转换酶的活性的作用及促进皮肤成纤维细胞和胶原之间的粘接的作用这两方面作用。利用前者的作用，通过血管的扩张等发挥改善肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)的效果，通过后者的作用，发挥紧致皮肤、改善皮肤的皱纹及松弛、或者恢复肌肤的张力及弹性的效果。两者的效果互相结合，可以发挥显著的美容效果。在本发明中，将美化面孔及体形(例如，美化肌肤等美容)作为目的而使用的组合物称为美容组合物。

另外，本发明的组合物可优选用作医药组合物、化妆品组合物、食品组合物或饲料组合物。优选为用于美容的医药组合物、化妆料组合物、食品组合物及饲料组合物。进而，本发明的组合物可优选作为用于阐明与血管紧张素转换酶抑制活性、成纤维细胞和胶原之间的粘接性相关生理状态的研究试剂而使用。另外，本发明的组合物也可用作血管紧张素转换酶抑制剂及成纤维细胞和胶原的粘接促进剂。

作为医药组合物，例如可以举出：起因于人等哺乳动物中的血管紧张素转换酶的活性的疾病的预防剂和/或治疗剂等。具体而言，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的医药组合物例如可用作高血压病和/或慢性心力衰竭的预防剂和/或治疗剂、以及、肤色差症状(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)的预防剂和/或治疗剂。进而，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的医药组合物也可用作起因于人等哺乳动物中的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的疾病的预防剂和/或治疗剂等。具体而言，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的医药组合物例如可用作起因于由于年龄增长等而产生的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的皮肤的皱纹或者松弛的预防剂和/或治疗剂，可用作相对于起因于上述粘接能力降低的皮肤的张力或者弹力性降低的预防剂和/或治疗剂、或者可用作肌肤的紧致剂等。

作为化妆品组合物，例如可以举出：用于预防和/或改善起因于人等哺乳动物中的血管紧张素转换酶的活性的状态的化妆品。具体而言，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的化妆品组合物例如可作为用于预防和/或改善肤色差状态(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)的化妆品而使用。进而，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的化妆品组合物也可作为用于预防和/或改善起因于人等哺乳动物中的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的状态的化妆品而使用。具体而言，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的化妆品组合物例如可作为用于预防和/或改善起因于由于年龄增长等而产生的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的皮肤的皱纹或者松弛的化妆品，可作为用于预防和/或改善相对于起因于上述粘接能力降低的皮肤的张力或者弹力性的降低的化妆品、或者可作为用于肌肤的紧致的化妆品等而使用。

作为食品组合物，例如可以举出：用于预防和/或改善起因于人等哺乳动物中的血管紧张素转换酶的活性的状态的食品。具体而言，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的食品组合物例如可以作为用于预防和/或改善高血压病及慢性心力衰竭的食品、作为通过血压降低作用来预防和/或改善生活习惯病的食品、或者作为预防和/或改善肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)的食品有益地使用。进而，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的食品组合物也可作为用于预防和/或改善引起于人等哺乳动物中的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的状态的食品而使用。具体而言，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的食品组合物例如可作为用于预防和/或改善起因于由于年龄增长等而产生的成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的皮肤的皱纹或者松弛的食品、可作为用于预防和/或改善相对于起因于所述粘接能力降低的皮肤的张力或者弹力性的降低的食品、或者作为用于肌肤的紧致的食品等而使用。本发明的食品组合物包括健康食品、特定保健用食品、营养功能食品、健康辅助食品等。这些组合物包括美容健康食品。特定保健用食品是指在饮食生活中以特定的保健的目的进行摄取，通过该摄取可以期待该保健的目的的食品。这些食品在特定的实施方式中，可作为附加了用于如上所述的用途的标识的食品提供。即，可作为附加了用于美容的标识、具有美肌作用的标识、用于肌质改善的标识、用于肤色差的预防或改善的标识、用于颜色(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色变色等)的改善的标识、用于使皮肤的张力及弹性恢复的标识、用于皮肤的皱纹及松弛的预防或改善的标识、用于肌肤的紧致的标识、用于高血压及慢性心力衰竭的预防或改善的标识、用于通过血压降低作用来预防或改善生活习惯病的标识等表示的食品提供。

作为饲料组合物，例如可以举出：起因于牛、猪、鸡、羊、马等家畜及狗、猫等宠物中的血管紧张素转换酶活性的状态的预防用和/或改善用的饲料、或者起因于成纤维细胞和胶原之间的粘接能力降低的状态的预防用和/或改善用的饲料等。

上述的本发明的组合物中的上述肽或者其衍生物、或它们的盐的含量也根据肽等的种类、组合物的剂型等而不同，从得到高的本申请效果的角度考虑，通常为0.00001～80重量%，优选为0.0001～70重量%，更优选为0.001～50重量%，进一步优选为0.001～20重量%，进一步更优选为0.01～10重量%，进一步更优选为0.05～10重量%，进一步更优选为0.1～10重量%。

含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的组合物可以在实现本发明的目的范围内适宜配制除上述肽或者其衍生物、或它们的盐以外在制剂领域或食品领域等中通常使用的载体、基质、和/或添加剂等来制备。

作为载体，例如可组合使用1种或2种以上交联乙烯基聚合物、脂质类等。

作为基质，例如可组合使用1种或2种以上水、油脂类、矿物油类、蜡类、脂肪酸类、硅酮油类、甾醇类、酯类、金属皂类、醇等。

作为添加剂，例如可以组合使用1种或2种以上可溶化成分、乳化剂、油分、稳定化剂、增粘剂、防腐剂、结合剂、润滑剂、分散剂、pH调节剂、保湿剂、紫外线吸收剂、络合剂、经皮吸收促进剂、崩解剂、增塑剂、缓冲剂、氨基酸类、着色剂、香料等。

进而，为了根据需要附加进一步有用的作用，也可以在含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的组合物中组合配制1种或2种以上其它的美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、细胞活化成分、收敛成分、粉刺改善成分、生物体成分合成促进成分、血液循环促进成分、保湿成分、抗老化成分等各种成分。

含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的组合物可以为外用剂(包括供于外用的化妆品)、内服剂(包括经口摄取的食品及饲料)等任意的剂型，但为了相对于颜色(肤色差)及皮肤的皱纹、松弛、张力、弹力性、紧致等更直接地发挥高效果，可优选用作外用剂。

作为外用剂，例如能够以液状、乳液状、霜状、化妆水状、膏状、奶油状、凝胶状、片状(携带基质)、气雾状、喷雾状等任意的形态使用。

作为化妆品，例如能够以化妆水、乳液、霜、油、润肤膏等基础化妆品、还有粉底霜、腮红、口红等化妆的化妆品、进而洗面奶、清洁卸妆膏、沐浴露等清洁剂、入浴剂等任意的形态使用。

作为内服剂(包括食品及饲料)，例如能够以片剂、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆、液剂(包括饮品、悬浮剂、糖浆剂)、凝胶剂、脂质体剂、提取物、酊剂、柠檬水剂、果冻剂等任意的形态使用。

另外，含有本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐的食品组合物可以混合食品卫生上可接受的复合物加工成健康食品、功能性食品、特定保健用食品、营养辅助食品等进行利用。进而，在制成食品的情况下，也可以作为面包、面、家常菜、食肉加工食品(例如，火腿、香肠等)、水产加工食品、调味料(例如，调味汁等)、乳制品、点心(例如，饼干、糖果、果冻、冰激凌等)、汤、果汁等任意的通常的食品形态提供。在形成这样的形态的情况下，本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可依赖于目标食品的性质等，由本领域技术人员利用公知的方法适宜配制。

作为饲料，由于能够以任意的形态使用，因此，没有特别限定。

本发明还提供一种抑制血管紧张素转换酶的活性的方法及促进成纤维细胞和胶原之间的粘接的方法，其特征在于，使用上述肽或者其衍生物、或它们的盐、或者含有它们的上述组合物。

在该方法中，只要以抑制血管紧张素转换酶的活性而得到期望的效果的有效量以上、或者促进成纤维细胞和胶原之间的粘接而得到期望的效果的有效量以上使用上述肽或者其衍生物、或它们的盐、或者含有它们的上述组合物即可。

即，本发明的方法中的上述肽或者其衍生物、或它们的盐的使用量通常在外用剂的情况下，优选相对于成人每人体重约50kg为约0.1μg～2g/天。另外，内服剂的情况下的当该使用量通常优选相对于成人每人体重约50kg为约0.001～10000mg/天，更优选为约1～1000mg/天、进一步优选为约1～100mg/天。

本发明的方法还可以含有将上述肽或者其衍生物、或它们的盐或者含有它们的上述组合物应用于皮肤的工序。此时的上述肽或者其衍生物、或它们的盐对皮肤的应用量优选为约1ng～500μg/cm²、更优选为约0.01～50μg/cm²，进一步优选为约0.1～10μg/cm²。

上述肽或者其衍生物、或它们的盐或者含有它们的外用剂可以通过涂布、喷雾等局部应用于皮肤。

本发明还提供一种用于抑制血管紧张素转换酶的活性和/或用于促进成纤维细胞和胶原之间的粘接的组合物、优选用于制造可用作外用剂的组合物的上述肽或者其衍生物、或它们的盐的使用。

上述肽或者其衍生物、或它们的盐的使用量只要以成为上述组合物中的含量的方式使用即可。

本发明还提供一种用于抑制血管紧张素转换酶的活性和/或用于促进成纤维细胞和胶原之间的粘接的上述肽或者其衍生物、或它们的盐。

本发明包含对人等哺乳动物给药上述组合物，通过血管的扩张等改善肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)的方法，还包含紧致皮肤、改善皮肤的皱纹及松弛、或者使肌肤的张力及弹性恢复的方法。另外，本发明包含用于制造用于通过上述组合物的血管的扩张等来改善肤色差(例如，眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)的药剂、或用于紧致皮肤、改善皮肤的皱纹及松弛、或者使肌肤的张力及弹性恢复的药剂的上述组合物的使用。进而，本发明包含用于通过血管的扩张等改善肤色差(例如、眼下方的青黑眼圈及嘴唇向青紫色的变色等)或用于紧致皮肤、改善皮肤的皱纹及松弛、或者使肌肤的张力及弹性恢复的上述组合物。

实施例

以下，基于实施例对本发明详细地说明，本发明并不限定于这些实施例。

实施例1：肽的制备

1-1．DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽：

(1)肽的合成：

使用肽自动合成装置(岛津制作所公司制：PSSM8)通过利用Fmoc法的固相合成法合成标题的肽。具体的步骤如下所述：首先，使Fmoc-Phe(1-Trt)-OH的C末端与固相合成用树脂结合后，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，接着，将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Val-OH导入Phe的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH导入Val的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Leu-OH导入Asp的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH导入Leu的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，从该树脂中切出肽链。通过利用TFA(三氟乙酸)切断Phe的Trt基和Asp的tBu基来进行脱保护。最后，通过分离HPLC除去未反应物来进行精制，由此得到DLDVF肽。

(2)肽的纯度检测：

将得到的精制物附于分析用反相高效液相色谱[柱：Inertsil ODS-3(内径：2.1mm、长度：50mm)、GL Sciences公司制；流动相：溶剂A(0.05%三氟乙酸)及溶剂B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分钟(溶剂B＝ 0%)～25分钟(溶剂B＝50%))；流速：0.2ml/分钟；检测法：波长220nm下的吸光度]，结果，在14.8分钟显示单一的尖锐的峰，纯度为99.5%。

1-2．RDLDV(Arg-Asp-Leu-Asp-Val)肽：

(1)肽的合成：

使用肽自动合成装置(岛津制作所公司制：PSSM8)通过利用Fmoc法的固相合成法合成标题的肽。具体的步骤如下所述：首先，使Fmoc-Val(1-Trt)-OH的C末端与固相合成用树脂结合后，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)、接着，将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH导入Val的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)、再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Leu-OH导入Asp的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)、再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH导入Leu的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Arg(Pmc)-OH导入Asp的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，从该树脂中切出肽链。通过利用TFA(三氟乙酸)切断Val的Trt基和Asp的tBu基、Arg的Pmc基来进行脱保护。最后，用分离HPLC除去未反应物来进行精制，由此得到RDLDV。

(2)肽的纯度检测

将得到的精制物附于分析用反相高效液相色谱[柱：Inertsil ODS-3(内径：2.1mm、长度：50mm)、GL Sciences公司制；流动相：溶剂A(0.05%三氟乙酸)及溶剂B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分钟(溶剂B＝0%)～30分钟(溶剂B＝70%))；流速：0.2ml/分钟；检测法：波长220nm下的吸光度]，结果在11.2分钟显示单一的尖锐的峰，纯度为99.2%。

1-3．RDLDVF(Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽：

(1)肽的合成：

使用肽自动合成装置(岛津制作所公司制：PSSM8)通过利用Fmoc法的固相合成法合成标题的肽。具体的步骤如下所述：首先，使Fmoc-Phe(1-Trt)-OH的C末端与固相合成用树脂结合后，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)、接着，将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Val-OH导入Phe的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH导入Val的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Leu-OH导入Asp的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH导入Leu的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，再次将该树脂中和·清洗后，将Fmoc-Arg(Pmc)-OH导入Asp的Ｎ末端。接着，通过哌啶处理除去保护基(Fmoc)，从该树脂中切出肽链。通过利用TFA(三氟乙酸)切断Phe的Trt基和Asp的tBu基、Arg的Pmc基来进行脱保护。最后，用分离HPLC除去未反应物来进行精制，由此得到RDLDVF。

(2)肽的纯度检测：

将得到的精制物附于分析用反相高效液相色谱[柱：Inertsil ODS-3(内径：2.1mm、长度：50mm)、GL Sciences公司制；流动相：溶剂A(0.05%三氟乙酸)及溶剂B(0.05%三氟乙酸、100%乙腈)的梯度(0分钟(溶剂B＝0%)～30分钟(溶剂B＝70%))；流速：0.2ml/分钟；检测法：波长220nm下的吸光度]，结果，在14.3分钟显示单一的尖锐的峰，纯度为99.9%。

实施例2：血管紧张素转换酶抑制活性的测定

使用上述实施例1中制备的各种肽进行血管紧张素转换酶抑制活性的测定。

具体而言，以各肽浓度为1mg/mL的方式制备受试液，使用1倍、10倍、100倍、及1000倍稀释液测定血管紧张素转换酶抑制活性。血管紧张素转换酶抑制活性通过如下操作进行评价：使用ACE Kit-WST试剂盒((株)同仁化学研究所制)利用酶法检测从3-羟丁酰-Gly-Gly-Gly(3HB-GGG)中切出的3-羟丁酸(3HB)，用酶标仪测定450nm的吸光度。ACE Kit-WST试剂盒按照附属的方案使用。将其结果示于以下。

[表1]

肽

IC50(mg/mL)

IC50(μM)

[0108]

DLDVF	0.4472	725.2
			RDLDV	0.3275	428.7
RDLDVF	0.3018	395.1

如上述的结果所示，表明即使为3种的任一种的受试肽，也发挥高的血管紧张素转换酶抑制活性。

实施例3：成纤维细胞向胶原涂层的粘接评价

使用上述实施例1中制备的各种肽对成纤维细胞向胶原涂层的粘接促进效果进行评价。

具体而言，首先，在胶原涂层的细胞培养板(96孔)上以2×10⁴细胞/孔浓度接种来自人正常皮肤的成纤维细胞(仓敷（クラボウ）：KF-4009)。接着，将以各肽为5μg/ml浓度的方式稀释的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(D-MEM；FCS10%·AB1%)在各孔中各添加200μl，在37℃、5%二氧化碳及95%空气的环境下进行20小时培养。另一方面，准备添加了200μl未添加肽的D-MEM培养基的细胞作为对照。从培养开始4小时后用PBS冲洗各孔的上清液，使用Cell Counting Kit-8试剂盒((株)同仁化学研究所制)测量各孔中与胶原涂层粘接且未被冲洗而残留的活细胞数。以测定结果为基础，将对照中的活细胞数设为100%，算出各受试肽添加组的活细胞数(%)。将该结果示于以下的表。

[表2]

肽	活细胞数（%）
		DLDVF	111
RDLDV	109
		RDLDVF	118

如上述的结果所示，表明即使在添加了3种的任一种受试肽的情况下，也促进成纤维细胞向胶原涂层的粘接。由该结果可知，通过使用DLDVF、RDLDV、RDLDVF肽，可提供一种可促进成纤维细胞和胶原之间的粘接、增强成纤维细胞和细胞外基质的结合、增加两者的拉伸强度、紧致真皮、改善伴随老化等的皮肤的皱纹及松弛、可有效地改善肌肤的张力及弹性的新型材料。

实施例4血管紧张素转换酶抑制活性的测定

使用上述实施例1中制备的肽进行血管紧张素转换酶抑制活性的测定。

具体而言，将DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及RDLDV(Arg-Asp-Leu-Asp-Val)肽以100：0、75：25、50：50、25：75、0：100的比率进行混合，以最终肽浓度为合计1mg/mL的方式制备受试液。使用该1倍、10倍、100倍、及1000倍稀释液测定血管紧张素转换酶抑制活性。血管紧张素转换酶抑制活性通过如下操作进行评价：使用ACE Kit-WST试剂盒((株)同仁化学研究所制)利用酶法检测从3-羟丁酰-Gly-Gly-Gly(3HB-GGG)中切出的3-羟丁酸(3HB)，用酶标仪测定450nm的吸光度。ACE Kit-WST试剂盒按照附属的方案使用。将该结果示于图1。

如图1所示，确认到通过组合添加DLDVF肽和RDLDV肽，可协同有效地发挥高血管紧张素转换酶抑制活性。

实施例5血管紧张素转换酶抑制活性的測定

具体而言，将DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及RDLDVF(Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽以100：0、50：50、0：100的比率进行混合，以最终肽浓度为合计1mg/mL的方式制备受试液。使用该1倍、10倍、100倍、及1000倍稀释液测定血管紧张素转换酶抑制活性。血管紧张素转换酶抑制活性通过如下操作进行评价：使用ACE Kit-WST试剂盒((株)同仁化学研究所制)利用酶法检测从3-羟丁酰-Gly-Gly-Gly(3HB-GGG)中切出的3-羟丁酸(3HB)，用酶标仪测定450nm的吸光度。ACE Kit-WST试剂盒按照附属的方案使用。将该结果示于图2。

如图2所示，即使组合添加DLDVF肽和RDLDVF肽，也可以协同有效地发挥高血管紧张素转换酶抑制活性。

实施例6血管紧张素转换酶抑制活性的测定

具体而言，将DLDVF(Asp-Leu-Asp-Val-Phe)肽及LDV(Leu-Asp-Val)肽以100：0、50：50、0：100的比率进行混合，以最终肽浓度为合计1mg/mL的方式制备受试液。使用该1倍、10倍、100倍、及1000倍稀释液测定血管紧张素转换酶抑制活性。血管紧张素转换酶抑制活性通过如下操作评价：使用ACE Kit-WST试剂盒((株)同仁化学研究所制)利用酶法检测从3-羟丁酰-Gly-Gly-Gly(3HB-GGG)中切出的3-羟丁酸(3HB)，用酶标仪测定450nm的吸光度。ACE Kit-WST试剂盒按照附属的方案使用。将该结果示于图3。

如图3所示，即使相对于DLDVF肽组合添加LDV肽，也可以协同有效地发挥高血管紧张素转换酶抑制活性。

工业上的可利用性

本发明的肽或者其衍生物、或它们的盐可以作为用于美容的组合物进行使用。

将本说明书中引用的全部的出版物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

序列表全文

SEQ ID NO1～4合成的.

Claims

1.一种由下述式(I)的氨基酸序列构成的肽或者其衍生物、或它们的盐，

Xaa¹-Asp-Leu-Asp-Val-Xaa²(SEQ ID NO：1)

其中，Xaa¹及Xaa²可以存在或不存在，在存在的情况下，分别独立地表示任意的氨基酸。

2.如权利要求1所述的肽或者其衍生物、或它们的盐，其中，所述肽由Asp-Leu-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO：2)、Arg-Asp-Leu-Asp-Val(SEQ IDNO：3)、或Arg-Asp-Leu-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO：4)所示的氨基酸序列构成。

3.一种组合物，所述组合物含有选自由权利要求1或2所述的肽及其衍生物、以及它们的盐构成的组中的至少1种。

4.一种组合物，所述组合物含有选自由权利要求1或2所述的肽及其衍生物、以及它们的盐构成的组中的至少1种、和Leu-Asp-Val所示的肽及其衍生物、以及它们的盐。

5.如权利要求3或4所述的组合物，所述组合物为美容组合物。