CN106290917B - 用于检测蛋白质的变构调节剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明尤其公开了使用SHG活性探针标记靶蛋白，以用于通过二次谐波产生或和频产生进行检测，以便鉴别与靶蛋白上的变构位点结合从而改变其结构构象的试剂的方法。

Description

用于检测蛋白质的变构调节剂的方法

本申请是2013年04月25日提交的发明名称为“用于检测蛋白质的变构调节剂的方法”的第201380033299.4号(国际申请号PCT/US2013/000117)中国专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请是2013年3月11日提交的美国申请No.13/794,277的部分继续申请，并根据35U.S.C.§119(e)要求2012年4月25日提交的美国申请No.61/638,131的权益。本申请还要求2012年11月2日提交的PCT专利申请No.PCT/US2012/063286的优先权，该PCT专利申请又根据35U.S.C.§119(e)要求2012年4月25日提交的美国临时专利申请No.61/638,026的权益。上述申请为了所有目的通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及分子检测领域并且特别涉及蛋白质检测领域。具体地，本文提供了使用二次谐波产生(second harmonic generation)技术鉴别和检测靶蛋白的变构调节剂的方法。

背景技术

随着对癌症基因组学的认识的进步，在癌症生物学中潜在的治疗靶标的数目在过去二十年呈指数式增长。然而，与此同时，获准的针对最丰富地活化的癌症相关基因的疗法的数目仅略有增长。从化学的角度来看，许多从生物学角度来看具有吸引力的癌症靶标被认为是难治性的(“不可成药的(undruggable)”)。人们越来越认识到，这些蛋白质靶标并不适于传统的药物发现方法，通常这是因为它们在与其他蛋白质相互作用(即，蛋白质-蛋白质相互作用或“PPI”)时具有相对较大的接触面积，或者是由于它们具有极其紧密地与蛋白质的活性位点结合的配体。后一种情况的实例在例如Ras的蛋白质中发现，Ras以皮摩尔的亲和力结合其配体GTP，使得与潜在药物的竞争变得困难。据估计，全部现有靶标中的75-80％是传统的小分子或生物(蛋白质)类治疗剂所无法企及的，这些治疗剂通常通过竞争性结合蛋白质的活性位点来抑制蛋白质功能，在这些靶标中有许多针对癌症充分验证的靶标。

此类“不可成药的”靶标的变构调节剂提供了一种具有吸引力的治疗方案。根据定义，变构分子与除蛋白质的活性位点以外的位点结合，从而改变蛋白质的构象并伴随有功能效应(例如，受体的抑制、活化等)。此外，在其他优势中(1)，靶蛋白的变构调节还具有以下额外的优势：不必依赖于对天然配体与蛋白质结合的抑制或竞争，其可能导致不期望的临床副作用。然而，难以通过当前可用的常规技术来鉴别变构调节剂。例如，由X射线晶体学或NMR法获得的结构信息由于低通量、低灵敏度、非生理性条件、适于该技术的蛋白质的大小以及许多其他因素而在用于药物发现的目的时受到限制。因此，所需要的是能够快速且以高通量的方式鉴别对靶蛋白的结构进行变构调节的试剂(agent)的技术。

本文通过公开用于鉴别能够与靶蛋白进行变构结合从而改变其构象结构的试剂的方法而提供了这样的技术。

在整个说明书中，引用了多个专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章)。本文所引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文。

发明内容

本文提供的发明尤其公开了通过使用二次谐波产生技术来鉴别和检测靶蛋白构象状态的变构调节剂的方法。

因此，在一些方面，本文提供了一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：(a)使靶蛋白与结合靶蛋白的活性位点的试剂A接触；(b)使靶蛋白与试剂B接触，其中靶蛋白采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及(c)测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)选自PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)通过靶蛋白表面上的一个或多个巯基基团与靶蛋白结合。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)通过靶蛋白表面上的一个或多个胺基团与靶蛋白结合。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述一个或多个胺基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述靶蛋白在与表面结合时被原位标记。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)是非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白的区域内。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是Aladan。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述配体为蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物或辅因子中的一种或多种。在一些实施方案中，所述配体是激酶信号级联的蛋白质成员。在一些实施方案中，所述靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些实施方案中，使用寡聚PEG(oligo-PEG)分子或脂质对表面进行衍生化。在一些实施方案中，所述寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。在一些实施方案中，所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述靶蛋白包含亲和标签。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，实时检测靶蛋白结构的构象变化。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，试剂A和/或试剂B是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

在一些方面，本文提供了一种用于鉴别在与试剂结合时经历构象变化的靶蛋白结构中的特异性位点的方法，该方法包括：(a)使靶蛋白与试剂接触，其中靶蛋白在第一氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中，采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产生第一可检测信号，并且其中第一可检测信号指示在试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；(b)使靶蛋白与试剂接触，其中靶蛋白在第二氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中第二氨基酸残基位于与第一氨基酸残基的位置不同的靶蛋白区域内，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产生第二可检测信号，并且其中第二可检测信号指示在试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及(c)将第一可检测信号与第二可检测信号进行比较，其中单独的在第一氨基酸残基位点处的构象变化指示所述试剂与靶蛋白结合并诱导蛋白质结构在第一氨基酸残基的位点处的构象变化，并且其中单独的在第二氨基酸残基位点处的构象变化指示所述试剂在第二氨基酸残基的位点处与靶蛋白结合并诱导蛋白质结构在第二氨基酸残基的位点处的构象变化。在另一方面，本文提供了一种用于鉴别在试剂与蛋白质结合时该蛋白质结构的位点特异性构象变化的方法，该方法包括：(a)使靶蛋白与试剂接触，其中靶蛋白在第一氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中，采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生第一可检测信号，并且其中第一可检测信号指示在试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；(b)使靶蛋白与试剂接触，其中靶蛋白在第二氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中第二氨基酸残基位于与第一氨基酸残基的位置不同的靶蛋白区域内，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生第二可检测信号，并且其中第二可检测信号指示在试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及(c)将第一可检测信号与第二可检测信号进行比较，其中单独的在第一氨基酸残基位点处的构象变化指示所述试剂诱导蛋白质结构在第一氨基酸残基的位点处的构象变化，并且其中单独的在第二氨基酸残基位点处的构象变化指示所述试剂诱导蛋白质结构在第二氨基酸残基的位点处的构象变化。在一些实施方案中，该方法包括使靶蛋白与能够结合靶蛋白的活性位点的试剂接触的初始步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括重复步骤(b)和(c)，其中位于靶蛋白中的一个或多个不同位点处的一个或多个另外的氨基酸残基采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如标记物)产生一个或多个另外的可检测信号，并且其中所述一个或多个另外的可检测信号指示在试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法进一步包括确定所述试剂与靶蛋白上的变构位点是特异性地结合还是非特异性地结合，其中如果所述试剂诱导靶蛋白结构在一个经二次谐波活性部分标记的氨基酸的位点处的构象变化，但并不诱导靶蛋白结构在一个或多个其他经二次谐波部分标记的氨基酸的位点处的构象变化，则所述试剂与靶蛋白上的变构位点特异性地结合，并且其中如果所述试剂在全部二次谐波活性部分标记的氨基酸的位点处诱导靶蛋白结构的相同的构象变化，则所述试剂与靶蛋白上的变构位点非特异性地结合。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)选自PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)通过靶蛋白表面上的一个或多个巯基基团与靶蛋白结合。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)通过靶蛋白表面上的一个或多个胺基团与靶蛋白结合。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述一个或多个胺基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。在一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，靶蛋白在与表面结合时被原位标记。在一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)是非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白区域内。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述非天然氨基酸是Aladan。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述配体为蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物或辅因子中的一种或多种。在一些实施方案中，所述配体是激酶信号级联的蛋白质成员。在一些实施方案中，靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些实施方案中，采用寡聚PEG分子或脂质对表面进行衍生化。在一些实施方案中，该寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。在一些实施方案中，所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，靶蛋白包含亲和标签。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，实时检测靶蛋白结构的构象变化。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述试剂是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

在一些方面，本文提供了一种用于鉴别与G蛋白偶联受体(GPCR)上的变构位点结合的试剂的方法，该方法包括：(a)使GPCR与天然配体接触，其中该天然配体采用二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中该标记物在与GPCR结合后在界面处具有净取向；(b)使GPCR与试剂接触，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示当试剂与GPCR上的变构位点结合时所产生的GPCR结构的构象变化；以及(c)测定靶蛋白与试剂接触后所述可检测信号的存在或不存在。在一些实施方案中，GPCR位于生物细胞、脂质体或合成生物膜的表面上。在其他方面，本文提供了用于鉴别与G蛋白偶联受体(GPCR)上的变构位点结合的试剂的方法，该方法包括：(a)使GPCR与已知配体接触，其中已知该已知配体与GPCR结合，其中该已知配体采用二次谐波活性部分进行标记，并且其中标记的配体在与GPCR结合后在界面处具有净取向；(b)使GPCR与试剂接触，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性标记物产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂与GPCR上的位点结合时所产生的GPCR结构的构象变化；以及(c)测定靶蛋白与试剂接触后所述可检测信号的存在或不存在。在一些实施方案中，所述生物细胞天然地表达GPCR。在一些实施方案中，所述生物细胞包含编码GPCR的异源核酸。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，GPCR选自：α-1肾上腺素能受体(αl-AR)，硬骨鱼紧张肽(UT)受体，5-HT2和5-HT6血清素受体，下丘泌素(hypocretic)(食欲素)受体，组胺HI受体，缓激肽B1和B2受体，铃蟾肽BB2受体，P2Y嘌呤能受体，乙酰胆碱受体，mGluR5谷氨酸受体，加压素V2和VI受体，血管紧张素AGTR1受体，胆囊收缩素CCKAR和CCKBR受体，内皮素ENDRA受体，生长素释放肽GHSRla受体，褪黑激素MTNRl A受体，神经降压肽NTSR1受体，血小板活化因子PTAFR受体，催乳素释放肽受体PRLHR受体，G-偶联5-HT₂、5-HT_2A、5-H_T6和5-H_T7血清素受体，G_i-偶联GABA-B，组胺H3以及mGluR2/4谷氨酸受体。

在其他方面，本文提供了一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：(a)使靶蛋白与能够结合靶蛋白的活性位点的试剂A接触，其中试剂A采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；(b)使靶蛋白与试剂B接触；以及(c)测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。在一些方面，二次谐波活性部分(例如，标记物)选自PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在一些实施方案，二次谐波活性部分(例如，标记物)通过试剂A表面上的一个或多个巯基基团与试剂A结合。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。在一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。在一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)通过试剂A表面上的一个或多个胺基团与试剂A结合。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。在本文提供的任何实施方案中的一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。在一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)是非天然氨基酸。在本文提供的任何实施方案中的一些实施方案中，该非天然氨基酸是Aladan。在一些实施方案中，靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。在本文提供的任何实施方案中的一些实施方案中，所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些实施方案中，采用寡聚PEG分子或脂质对表面进行衍生化。在一些实施方案中，其中寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。在一些实施方案中，所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。在本文提供的任何实施方案中的一些实施方案中，靶蛋白包含亲和标签。在本文提供的任何实施方案中的一些实施方案中，试剂A或试剂B是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

本发明还提供了确定靶生物分子与候选结合配偶体之间的结合相互作用的特异性的方法，该方法包括：(a)使用第一二次谐波活性部分在第一位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与候选结合配偶体接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第一可检测信号；(b)使用第二二次谐波活性部分在第二位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与候选结合配偶体接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第二可检测信号。第一可检测信号与第二可检测信号之间的差异(例如，在噪声水平以上1％、2％、3％、4％、5％)指示靶生物分子与候选结合配偶体之间的特异性结合相互作用。任选地，使用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号。任选地，该表面选择性技术是二次谐波产生或和频产生。

本发明还提供了筛查靶向靶生物分子的药物候选物的文库的方法，该方法包括：(a)使用第一二次谐波活性部分在第一位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第一药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第一可检测信号；(b)使用第二二次谐波活性部分在第二位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第一药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第二可检测信号；(c)在第一可检测信号与第二可检测信号之间产生第一差异；(d)使用第一二次谐波活性部分在第一位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第二药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第三可检测信号；(e)使用第二二次谐波活性部分在第二位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第二药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第四可检测信号；(f)在第三可检测信号与第四可检测信号之间产生第二差异；(g)基于第一差异和第二差异选择药物。任选地，使用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号。任选地，该表面选择技术是二次谐波产生或和频产生。任选地，所述方法进一步包括在动物中筛选所选择的药物。

所述可检测信号可以是归一化的二次谐波产生强度的变化。所述靶生物分子可以是蛋白质、DNA、RNA或寡糖。任选地，所述候选结合配偶体是变构调节剂。

本发明还提供了测量靶蛋白在功能上相关的位点处的构象变化的方法，该方法包括：(a)将靶蛋白与已知与该蛋白质的活性位点结合的天然或合成配体进行预孵育；(b)使靶蛋白与候选变构结合配偶体接触；以及(c)采用表面选择性技术测量靶蛋白在功能上相关的位点处的构象变化。任选地，所述功能上相关的位点是与结合配偶体进行直接结构接触的位点。任选地，所述功能上相关的位点是与结合配偶体进行间接结构接触的位点。任选地，所述功能上相关的位点是非结构性地影响结合分子的结合和/或调节结合分子的位点。任选地，所述功能上相关的位点用二次谐波活性部分进行标记。

具体而言，本发明涉及：

1.一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：

a.使靶蛋白与试剂A接触，试剂A与靶蛋白的活性位点结合，或者其中试剂A在被分离时与靶蛋白的活性位点天然结合；以及

b.使靶蛋白与试剂B接触，其中用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分标记靶蛋白，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及

c.测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。

2.如段1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分选自PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。

3.如段1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过靶蛋白表面上的一个或多个巯基基团与靶蛋白结合。

4.如段3所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。

5.如段3所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。

6.如段5所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。

7.如段2所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。

8.如段2所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过靶蛋白表面上的一个或多个胺基团与靶蛋白结合。

9.如段8所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。

10.如段8所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。

11.如段10所述的方法，其中所述一个或多个胺基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。

12.如段11所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。

13.如段12所述的方法，其中所述靶蛋白在与表面结合时被原位标记。

14.如段1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是非天然氨基酸。

15.如段14所述的方法，其中所述非天然氨基酸位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白的区域内。

16.如段5所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。

17.如段6所述的方法，其中所述配体为蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物或辅因子中的一种或多种。

18.如段17所述的方法，其中所述配体是激酶信号级联的蛋白质成员。

19.如段18所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。

20.如段19所述的方法，其中所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。

21.如段20所述的方法，其中使用寡聚PEG分子或脂质对所述表面进行衍生化。

22.如段21所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。

23.如段20所述的方法，其中所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。

24.如段23所述的方法，其中所述靶蛋白包含亲和标签。

25.如段24所述的方法，其中实时检测靶蛋白结构的构象变化。

26.如段25所述的方法，其中所述试剂A是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

27.如段26所述的方法，其中所述试剂B是与靶蛋白活性位点特异性结合的小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

28.一种用于鉴别在试剂与蛋白质结合时该蛋白质结构的位点特异性构象变化的方法，该方法包括：

a.使靶蛋白与所述试剂接触，其中靶蛋白在第一氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中，采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生第一可检测信号，并且其中所述第一可检测信号指示在所述试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；

b.使靶蛋白与所述试剂接触，其中靶蛋白在第二氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中第二氨基酸残基位于与第一氨基酸残基的位置不同的靶蛋白的区域内，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生第二可检测信号，并且其中所述第二可检测信号指示在所述试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及

c.将第一可检测信号与第二可检测信号进行比较，其中单独的在第一氨基酸残基位点处的构象变化指示所述试剂诱导蛋白质结构在第一氨基酸残基的位点处的构象变化，并且其中单独的在第二氨基酸残基位点处的构象变化指示所述试剂诱导蛋白质结构在第二氨基酸残基的位点处的构象变化。

29.如段28所述的方法，其中所述方法包括使靶蛋白与能够结合靶蛋白的活性位点的试剂接触的初始步骤。

30.如段28所述的方法，其进一步包括重复步骤(b)和(c)，其中位于靶蛋白中的一个或多个不同位点处的一个或多个另外的氨基酸残基采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生一个或多个另外的可检测信号，并且其中所述一个或多个另外的可检测信号指示在试剂与靶蛋白上的位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化。

31.如段30所述的方法，其进一步包括确定所述试剂与靶蛋白上的变构位点是特异性地结合还是非特异性地结合，其中如果所述试剂诱导靶蛋白结构在一个二次谐波活性部分标记的氨基酸的位点处的构象变化，但并不诱导靶蛋白结构在一个或多个其他二次谐波活性部分标记的氨基酸的位点处的构象变化，则所述试剂与靶蛋白上的变构位点特异性地结合，并且其中如果所述试剂在全部二次谐波活性部分标记的氨基酸的位点处诱导靶蛋白结构的相同的构象变化，则所述试剂与靶蛋白上的变构位点非特异性地结合。

32.如段31所述的方法，其中所述二次谐波活性部分选自PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。

33.如段28所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过靶蛋白表面上的一个或多个巯基基团与靶蛋白结合。

34.如段33所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。

35.如段33所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。

36.如段33所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。

37.如段33所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。

38.如段28所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过靶蛋白表面上的一个或多个胺基团与靶蛋白结合。

39.如段38所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。

40.如段38所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。

41.如段38所述的方法，其中，所述一个或多个胺基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。

42.如段38所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。

43.如段28所述的方法，其中所述靶蛋白在与表面结合时被原位标记。

44.如段28所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是非天然氨基酸。

45.如段44所述的方法，其中所述非天然氨基酸位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白的区域内。

46.如段44所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。

47.如段36所述的方法，其中所述配体为蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物或辅因子中的一种或多种。

48.如段47所述的方法，其中所述配体是激酶信号级联的蛋白质成员。

49.如段48所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。

50.如段49所述的方法，其中所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。

51.如段50所述的方法，其中采用寡聚PEG分子或脂质对所述表面进行衍生化。

52.如段51所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。

53.如段50所述的方法，其中所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。

54.如段53所述的方法，其中所述靶蛋白包含亲和标签。

55.如段54所述的方法，其中实时检测靶蛋白结构的构象变化。

56.如段55所述的方法，其中试剂A是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

57.一种用于鉴别与G蛋白偶联受体(GPCR)上的变构位点结合的试剂的方法，该方法包括：

a.使GPCR与已知配体接触，其中已知该已知配体与GPCR结合，其中该已知配体采用二次谐波活性部分进行标记，并且其中标记的配体在与GPCR结合后在界面处具有净取向；

b.使GPCR与试剂接触，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性标记物产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在该试剂与GPCR上的位点结合时所产生的GPCR结构的构象变化；以及

c.在靶蛋白已与所述试剂接触后测定所述可检测信号的存在或不存在。

58.如段57所述的方法，其中所述GPCR位于生物细胞、脂质体或合成生物膜的表面上。

59.如段57所述的方法，其中所述生物细胞自然地表达GPCR。

60.如段57所述的方法，其中所述生物细胞包含编码GPCR的异源核酸。

61.如段57所述的方法，其中所述GPCR选自：α-1肾上腺素能受体(αl-AR)，硬骨鱼紧张肽(UT)受体，5-HT2和5-HT6血清素受体，下丘泌素(食欲素)受体，组胺HI受体，缓激肽B1和B2受体，铃蟾肽BB2受体，P2Y嘌呤能受体，乙酰胆碱受体，mGluR5谷氨酸受体，加压素V2和VI受体，血管紧张素AGTR1受体，胆囊收缩素CCKAR和CCKBR受体，内皮素ENDRA受体，生长素释放肽GHSRla受体，褪黑激素MTNRl A受体，神经降压肽NTSR1受体，血小板活化因子PTAFR受体，催乳素释放肽受体PRLHR受体，G-偶联5-HT₂、5-HT_2A、5-H_T6和5-H_T7血清素受体，G_i-偶联GABA-B，组胺H3，和mGluR2/4谷氨酸受体。

62.一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：

a.使靶蛋白与结合靶蛋白的活性位点的试剂A接触，其中所述试剂A采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及

b.使靶蛋白与试剂B接触；以及

c.测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。

63.如段62所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过试剂A表面上的一个或多个巯基基团与试剂A结合。

64.如段63所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。

65.如段63所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。

66.如段62所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。

67.如段62所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过试剂A表面上的一个或多个胺基团与试剂A结合。

68.如段67所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。

69.如段67所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。

70.如段67所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。

71.如段62所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是非天然氨基酸。

72.如段71所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。

73.如段62所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。

74.如段73所述的方法，其中所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。

75.如段74所述的方法，其中使用寡聚PEG分子或脂质对所述表面进行衍生化。

76.如段75所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。

77.如段62所述的方法，其中所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。

78.如段77所述的方法，其中所述靶蛋白包含亲和标签。

79.如段78所述的方法，其中所述试剂A或试剂B是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

80.一种试剂盒，其包含以下中的一种或多种：

a.用于缀合至靶蛋白上的一种或多种SHG或SFG活性标记物；

b.用于使用SHG或SFG活性标记物标记蛋白质的一种或多种试剂；

c.一个或多个用于结合靶蛋白的表面；

d.一个或多个与用于检测靶蛋白-变构调节剂相互作用的设备一起使用的信号外围设备；

e.一种或多种对于靶蛋白功能性而言所必需的辅因子；

f.已知与一种或多种靶蛋白结合的一种或多种肽和/或蛋白质；

g.已知与一种或多种靶蛋白结合的一种或多种抗体；以及

h.用于将SHG或SFG活性非天然氨基酸(UAA)标记物引入蛋白质中的一种或多种组分。

81.如段80所述的试剂盒，其中所述一种或多种SHG或SFG活性标记物选自马来酰亚胺标记物、PyMPO-NHS、噁唑标记物、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)、ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)以及基于香豆素的染料。

82.如段80所述的试剂盒，其中所述用于结合靶蛋白的表面选自玻璃、塑料、金属、胶乳、橡胶、陶瓷和聚合物。

83.如段81所述的试剂盒，其中所述聚合物是聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯或聚乙烯。

84.如段80所述的试剂盒，其中所述用于结合靶蛋白的表面包含至少一个预先形成的表面特征。

85.如段84所述的试剂盒，其中所述至少一个预先形成的表面特征是沟槽、V形槽、台面结构和/或孔。

86.如段80所述的试剂盒，其中所述用于结合靶蛋白的表面预先涂覆有一种或多种分子，所述分子提供适于连接至靶蛋白的表面化学反应。

87.如段86所述的试剂盒，其中所述一种或多种分子是醛硅烷、BSA-NHS或寡聚聚乙二醇。

88.如段87所述的试剂盒，其中所述寡聚聚乙二醇是镍-寡聚聚乙二醇。

89.如段80所述的试剂盒，其中所述用于结合靶蛋白的表面预先涂覆有支持的脂双层或支持的脂质类似物双层。

90.如段80所述的试剂盒，其中所述与用于检测靶蛋白-变构调节剂相互作用的设备一起使用的信号外围设备是通滤波器、滤色器、干涉滤波器、偏振光学器件或一个或多个用于引导和聚焦光束的镜子或透镜。

91.如段80所述的试剂盒，其中所述对于靶蛋白功能性而言所必需的辅因子是焦磷酸硫胺素、NAD⁺、NADP⁺、磷酸吡哆醛、硫辛酰胺、甲基钴胺素、钴胺素、生物素、辅酶A、四氢叶酸、甲萘醌、抗坏血酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、辅酶F420、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、S-腺苷甲硫氨酸、辅酶B、辅酶M、辅酶Q、三磷酸胞苷、谷胱甘肽、血红素、核苷酸糖、吡咯并喹啉、醌或四氢生物蝶呤。

92.一种用于使用二次谐波产生(SHG)和/或和频产生(SFG)来筛选和鉴别结合和/或调节靶蛋白上的变构位点的试剂的系统，该系统包括：

a.采用SFG或SHG活性部分标记的靶蛋白；

b.用于检测靶蛋白-试剂相互作用的设备，该设备包括：i)基本光的光源；ii)包含用SFG或SHG活性部分标记的靶蛋白的基底；和iii)用于测量二次谐波或其他非线性光束的强度的检测器，

其中通过所述设备来检测试剂与蛋白质上的变构位点的结合，并且将所述检测器所记录的数据记录在固定的或数据存储介质上，该存储介质是通过用于读取存储介质的系统可访问的。

93.一种确定靶生物分子与候选结合配偶体之间的结合相互作用的特异性的方法，该方法包括：

a.使用第一二次谐波活性部分在第一位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与候选结合配偶体接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第一可检测信号；以及

b.使用第二二次谐波活性部分在第二位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与候选结合配偶体接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第二可检测信号；

其中使用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生所述可检测信号；

其中，所述第一可检测信号与第二可检测信号之间的差异指示靶生物分子与候选结合配偶体之间的特异性结合相互作用。

94.如段93所述的方法，其中所述差异在噪声水平以上2％。

95.如段93所述的方法，其中所述差异在噪声水平以上5％。

96.一种筛查靶向靶生物分子的药物候选物的文库的方法，该方法包括：

a.使用第一二次谐波活性部分在第一位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第一药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第一可检测信号；

b.使用第二二次谐波活性部分在第二位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第一药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第二可检测信号；

c.在第一可检测信号与第二可检测信号之间产生第一差异；

d.使用第一二次谐波活性部分在第一位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第二药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第三可检测信号；

e.使用第二二次谐波活性部分在第二位点处标记靶生物分子；使靶生物分子与第二药物候选物接触；并在靶生物分子与候选结合配偶体结合时检测第四可检测信号；

f.在第三可检测信号与第四可检测信号之间产生第二差异；以及

g.基于所述第一差异和所述第二差异选择药物，

其中使用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生所述可检测信号。

97.如段94所述的方法，其进一步包括在动物中筛选所选择的药物。

98.如段93或94所述的方法，其中所述可检测信号是归一化的二次谐波产生强度的变化。

99.如段93或94所述的方法，其中所述表面选择性技术是二次谐波产生或和频产生。

100.如段93或94所述的方法，其中所述靶生物分子是蛋白质。

101.如段93或94所述的方法，其中所述靶生物分子是DNA。

102.如段93或94所述的方法，其中所述候选结合配偶体是变构调节剂。

103.一种测量靶蛋白在功能上相关的位点处的构象变化的方法，该方法包括：

a.将靶蛋白与已知与该蛋白质的活性位点结合的天然或合成配体进行预孵育；

b.使靶蛋白与候选变构结合配偶体接触；以及

c.采用表面选择性技术测量靶蛋白在功能上相关的位点处的构象变化。

104.如段101所述的方法，其中所述功能上相关的位点是与结合配偶体进行直接的结构接触的位点。

105.如段101所述的方法，其中所述功能上相关的位点是与结合配偶体进行间接的结构接触的位点。

106.如段101所述的方法，其中所述功能上相关的位点是非结构性地影响结合分子的结合和/或调节结合分子的位点。

107.如段101所述的方法，其中所述功能上相关的位点用二次谐波活性部分进行标记。

附图说明

图1示出了用于检测蛋白质的构象变化的检测方法的示意图。入射的红光照射到表面上，并通过全内反射产生倏逝波，该倏逝波垂直于该表面的平面而偏振并且从该表面仅行进短距离(左)。标记的蛋白质与表面结合，基线信号依赖于染料相对于该法线的位置(中)。使标记物朝向倏逝波的法线的构象变化导致信号增加(左)。

图2示出了采用SHG技术测量在野生型和K419C突变体Abl激酶与GNF2(一种已知的变构结合物)相互作用时所诱导的构象变化的实验结果。

图3示出了SHG数据，其表明标记的Ras蛋白在支持的脂双层(SLB)上通过SHG可检测到。

图4示出了三种化合物与胺标记(溶液标记)的Ras靶蛋白结合的SHG数据，其中A)示出了归一化的SHG强度，B)示出了变化百分比(percent shift)。在以20μM的2X浓度手动注入每种化合物之前，采集基线SHG测量结果约5秒的时间。注入后实时监测构象变化约60秒的一段时间。

图5示出了三种化合物与半胱氨酸标记的Ras靶蛋白结合的SHG数据，其中A)示出了归一化的SHG强度，B)示出了变化百分比。在以20μM的2X浓度手动注入每种化合物之前，采集基线SHG测量结果约5秒的时间。注入后实时监测构象变化约60秒的一段时间。

发明详述

本发明尤其公开了使用SHG活性部分、标记物或探针标记靶蛋白，以用于通过二次谐波产生或和频产生进行检测，以便鉴别与靶蛋白上的变构位点结合从而改变其结构构象的试剂的方法。

基于结构的药物筛选以及生物分子机制的基础研究的目标需要能够在生物分子与配体、药物或其他结合配偶体结合时测量该生物分子的结构和结构变化的工具。现有的用于确定结构变化的技术主要局限于NMR(核磁共振)和X-射线晶体学。这些技术均不适于实时测量结构变化。此外，这些技术耗时耗力，并且不适于在药物筛选中大规模使用。此外，存在许多难以结晶的蛋白质(例如，膜蛋白)，使得许多这样的蛋白质的结构尚未确定。

二次谐波产生(SHG)对连接至蛋白质上的SHG活性染料探针的结构变化高度敏感。目的蛋白在胺或巯基位点(例如，赖氨酸或半胱氨酸残基)处用SHG活性染料探针共价地标记。SHG活性染料探针通常是荧光探针；关键之处是需要大差异偶极矩和非中心对称结构。通过将标记的蛋白质与表面结合并使其暴露于来自超快激光器的脉冲红光来进行SHG测量。在光照下，染料探针将一小部分入射红光转变为蓝光，即“二次谐波”信号。这一现象并不涉及光的吸收，而是依赖于类似于反射的机制，仅当存在标记物的净平均取向时发生；在溶液中随机取向的标记的分子并不产生二次谐波光(图1)。理论上，蛋白质群体(其中一半标记物指向表面而另一半标记物背向表面，它们是沿着同一轴)将不产生二次谐波光。实际上，总是存在净平均取向。当标记物的平均取向由于配体结合和伴随的构象变化而发生改变时，二次谐波光的强度会发生变化，这即是SHG能够检测构象变化的依据。

本发明使用二次谐波产生技术来筛选和鉴别靶蛋白的变构调节剂。尤其是，本发明人已发现，在候选变构调节剂的SHG筛选之前将靶蛋白与已知与靶蛋白的活性位点结合的试剂或配体进行预孵育或者使用与蛋白质的活性位点结合的天然配体来分离该蛋白质增加了以下可能性，即通过SHG检测到的靶蛋白构象变化是由于候选调节剂在靶蛋白上的变构位点处的相互作用，而不是在活性位点处的相互作用。因此，相对于先前已在本领域中实施的方法，本申请的方法代表了一种改进，因为使用本文所述的方法对蛋白质构象和行为的变构调节剂的鉴别可作为高通量测定法实时地进行，这与传统方法形成对比，传统方法通常需要很长时间来获得结果，并且最多仅提供蛋白质在与配体结合时的构象动力学的快照。

I.一般技术

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、非线性光学检测和测量以及免疫学的常规技术，这些技术均在本领域的技术范围内。这些技术在下列文献中有充分阐述：“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”，第二版(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编著，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编著，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编著，1987，以及定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”(Mullis等编著，1994)。Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)；March,“Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure”,第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)；“Bioconjugate Techniques”,Elsevier(G.T.Hermanson 2008)；“Second-ordernonlinear optical effects at surfaces and interfaces”,于Nonlinear SurfaceElectromagnetic Phenomena,Elsevier(H.Ponath和G.I.Stegeman编著，1991)；以及“Neuronal Calcium Sensor Proteins”,NOVA Publishers(Philippov和Koch编著，2006)为本领域技术人员提供了针对在本申请中使用的许多术语的一般指导。

II.定义

如本文使用的“二次谐波”是指两倍于基本光束的频率的光频率。

如本文所使用的，如果空间中存在一个点(“中心”或“反转中心”)，通过该点对所有原子进行反转(x，y，z)—>>(-x，-y，-z)使得分子或物质不发生改变，则该分子或物质相是“中心对称的”。非中心对称的分子或物质缺少这种反转中心。例如，如果分子具有均匀的组成且形状为球形或立方体，则它是中心对称的。中心对称的分子或物质没有非线性磁化性(susceptibility)或超极化性，这两者对于二次谐波、和频以及差频的产生是必要的。

如本文所使用的，“表面选择性技术”指非线性光学技术，例如二次谐波产生或者和频/差频产生，或者本领域已知的其他表面特异性技术。

如本文所使用的，“和频产生”(SFG)是一种非线性光学技术，通过该技术，一个频率(Ω₁)的光与另一频率(Ω₂)的光混合，以产生在和频(Ω₁+Ω₂)处的响应(Shen,1984,1989)。例如，SFG尤其可用于通过分子的特征性振动跃迁来检测表面处的分子，在这种情况下，SFG本质上是一种在可见光和红外线频率具有Ω₁和Ω₂的表面选择性红外光谱法。当术语“SHG”或“二次谐波产生”在本文中使用时，可以理解，“SFG”与“和频产生”可采用本领域技术人员公知的方法替换SHG，以及代替SHG使用。

如本文所使用的“非线性活性部分”是具有超极化性的物质。

如本文所使用的“二次谐波活性部分”或“二次谐波活性部分”是指非线性活性部分、粒子或分子，其可(共价或非共价地)连接至分子(例如，蛋白质，如酶)、粒子或相(例如，脂双层)，从而使其具有更高的非线性光学活性。

如本文所使用的“变构”、“变构调节剂”或“变构候选物”是指这样的分子、部分或物质：其主要与活性位点以外的位点结合并引起如通过SHG或SFG确定的构象变化，从而通过变构作用机制发挥其作用。

如本文所使用的“活性位点”或“活性结合位点”是指这样的靶蛋白区域，由于其形状和电荷电势，该区域有利地通过各种共价和/或非共价结合力与另一试剂(包括但不限于配体、蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、分子、化合物、抗生素或药物、分子、部分、底物、产物、类似物或抑制剂)相互作用或相关联，并且在其中行使该蛋白质的功能，例如但不限于催化、信号传导和/或效应子活化。

如本文所使用的“超极化性”或“非线性磁化性”是指允许产生非线性光的分子、粒子、界面或相的特性。术语“超极化性”、“二阶非线性极化性”和“非线性磁化性”有时可互换使用。

如本文所提到的，本文定义的参与结合配偶体事件的“功能上相关的”位点包括与结合配偶体(例如，效应子分子)进行直接或间接的结构接触的任何位点，如通过例如X-射线晶体法、NMR或SHG的结构技术所确定的。直接的结构接触被定义为其某部分在结合配偶体分子的某部分的2nm之内的任何残基。间接的结构接触被定义为其某部分在与结合配偶体(例如，效应子分子)或结合配偶体模拟物或类似物结合时，相对于其在不存在结合配偶体、模拟物或类似物时的取向、构象或相对坐标而改变其取向、构象或相对坐标的任何残基，如通过例如X射线、NMR或SHG的结构技术所见的。术语“功能上相关的”也包括通过非结构手段(例如，表明特定残基对于结合配偶体的结合或调节而言重要的诱变或生化数据)已知在结合分子的结合或调节(例如，活化、抑制、调节等)中重要的残基。

如本文所定义的，术语“配体”包括与另一分子结合的任何分子，例如但不限于，与另一蛋白质结合的一种蛋白质、与蛋白质结合的碳水化合物或者与蛋白质结合的小分子。

如本文所使用的，“非线性”是指能够转变入射光束(也称为基本光束)的频率的光学技术。非线性光束是由这样的转变所产生的更高阶频率的光束，例如二次谐波。在二次谐波、和频或差频产生中，非线性光束相干地(coherently)产生。在二次谐波产生(SHG)中，基本光束(fundamental beam)的两个光子几乎被界面散射，从而产生二次谐波的一个光子。在本文中也称为“非线性光学的”或“表面选择性非线性的”。

如本文所使用的术语“非线性活性的”或“非线性地活性的”也指分子、粒子、界面或相在受到一个或多个入射辐射束驱动时产生非线性光辐射的能力的一般性质。

当本文中提及非线性光学方法时，“检测”是指这样的技术，通过该技术，表面选择性非线性光辐射的性质可用于检测、测量探针-靶标相互作用(例如蛋白质与候选调节剂化合物之间的相互作用)的性质或该相互作用的效应，或将该性质或效应与非线性光学光的性质(例如，强度、波长、偏振或其他与电磁辐射所共有的性质)相关联。

如本文所使用的，术语“构象变化”指生物物质(例如，蛋白质，如酶)的结构构象的改变。

如本文所使用的，术语“蛋白质”包括多肽、肽、多肽的片段和融合多肽。

如本文所使用的，术语“调节剂”是指改变蛋白质的构象(如通过SHG所检测到的)的任何物质(例如，小分子化合物、肽、蛋白质等)。

如本文所使用的，“界面”是产生非线性光信号的区域，或者其中存在具有净取向的经二次谐波活性部分标记的靶标的表面附近的区域。界面也可由两个表面、与不同介质接触的表面(例如，与水溶液接触的玻璃表面、与缓冲液接触的细胞表面)或者两个具有不同物理或化学性质的介质之间的接触区附近的区域所组成。

除非本文中另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

除非上下文另有明确说明，如本文所使用的单数术语“一种”、“一个”和“所述(该)”包括复数指代。

在整个说明书中给出的每一最大数值限值意在包括每个低于其的数值限值，如同所述低于其的数值限值在此明确地写出。在整个说明书中给出的每一最小数值限值包括每个高于其的数值限值，如同所述高于其的数值限值在此明确地写出。整个说明书中给出的每一数值范围将包括每一个落在该较宽数值范围内的更窄的数值范围，如同所述更窄的数值范围均在此明确地写出。

III.组成

A.用于所公开的方法的靶蛋白

用于本文所述的任何方法的靶蛋白可以是来自任何天然来源的天然存在的物质，或其亚单位或结构域，包括病毒、微生物(包括细菌、真菌、藻类和原生动物)、无脊椎动物(包括昆虫和蠕虫)、动物的正常或病理性细胞、脊椎动物(例如，哺乳动物、禽类或鱼类，以及在哺乳动物中，例如人、猿、猴、牛、猪、山羊、羊驼、绵羊、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、猫和狗)或者正常的或病理性的植物细胞。或者，靶蛋白可以是已经在体外产生或者经修饰(例如通过突变、嵌合蛋白或人工蛋白质)的非天然存在的蛋白质。靶蛋白可以是糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或金属蛋白。靶蛋白可以是核蛋白质、细胞质蛋白质、膜相关蛋白质或者分泌的蛋白质。靶蛋白并不需要是单个大分子。例如，靶蛋白可以是大分子的同质或异质多聚体(例如但不限于二聚体、三聚体或四聚体)。此外，靶蛋白可能需要一个或多个配体来行使生理功能，例如其他蛋白质、寡肽或多肽、核酸、碳水化合物、脂质或有机或无机小分子或离子。其他的实例包括辅因子、核糖体、多核糖体和染色质。

可用于本文公开的任何方法的靶蛋白的生物学活性并不限于特定的活性，例如受体或酶活性。靶蛋白的非限制性实例包括核受体、孤儿核受体、酪氨酸激酶受体、内皮素、促红细胞生成素受体、FAS配体受体、蛋白激酶(例如，蛋白激酶C、酪氨酸激酶、丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、核苷酸激酶或多核苷酸激酶)、蛋白磷酸酶(丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶、核苷酸磷酸酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶或焦磷酸酶)、细胞周期调节剂(细胞周期蛋白cdk2、CDC2、CDC25、P53、RB)、GTP酶、Rac、Rho、Rab、Ras、内切蛋白酶、外切蛋白酶(exoprotease)、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、核酸酶、聚合酶、逆转录酶、整合酶、离子通道、伴侣蛋白(即，热休克蛋白)、脱氨酶、核酸酶(例如脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、内切核酸酶、外切核酸酶)、端粒酶、引发酶、解旋酶、脱氢酶、转移酶(肽基转移酶、转氨酶、糖基转移酶、核糖基转移酶(ribosyltransferases)、乙酰基转移酶、鸟苷酸转移酶或甲基转移酶)、水解酶、羧化酶、异构酶、糖苷酶、脱氨酶、脂肪酶、酯酶、硫酸酯酶、纤维素酶、裂合酶、还原酶、连接酶或细胞泛素化途径的加工酶(如E1、E2或E3酶或去泛素化酶)。在一些实施方案中，可用于本文公开的任何方法的靶蛋白可以是选自病毒蛋白质、细菌蛋白质、植物蛋白质、动物蛋白质和人蛋白质的结构和非结构蛋白质。在一些实施方案中，靶蛋白可以是病毒蛋白质，例如但不限于流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、禽流感病毒、埃博拉(Ebola)病毒、SARS病毒、汉坦病毒或东方马脑炎病毒的蛋白质。

在本文提供的任何方法的一些方面，靶蛋白是受体。术语“受体”包括表面和细胞内受体。在一些实施方案中，靶蛋白是核受体。核受体是一类配体激活的转录激活物。这些受体被组织成为用于配体结合、二聚化、反式激活和DNA结合的独特结构域。类固醇受体家族是由糖皮质激素、盐皮质激素、雄激素、孕激素和雌激素的受体组成的大家族。当配体结合时发生受体激活，其诱导构象变化，从而允许受体二聚化和辅激活蛋白的结合。这些辅激活物转而又促进受体与DNA的结合以及后续的靶基因的转录激活。除了辅激活蛋白的募集，配体的结合也被认为将受体置于替换或阻止作为受体功能的协阻抑物的蛋白质的结合的构象中。如果配体是药理学激动剂，则新的构象是与生物信号转导途径的其他组分例如转录因子相互作用从而在靶组织中引起生物响应的构象。如果配体是药理学拮抗剂，则新的构象是其中受体不能被一种或多种激动剂激活(在其他情况下，该激动剂能够激活该受体)的构象。NR的非详尽清单描述于国际专利申请公开号2006/046134中，该申请的公开内容通过引用并入本文(参见第14和15页以及图1)。在一些实施方案中，可用于本文公开的任何方法的NR可选自雌激素受体、雄激素受体、糖皮质激素受体、视黄酸受体α(RARG)、视黄酸X受体(RXR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、肝X受体α(LXRG)或孕酮受体。

在一些方面，可用于本文所述的任何方法的靶蛋白是G蛋白偶联受体(也称为七跨膜域受体)。“G蛋白偶联受体(GPCR)”是指通过与G蛋白偶联而介导信号转导的受体的超家族的任何成员。GPCR包括跨膜受体蛋白的大家族(占人类总基因组的约5％)，这些蛋白质与在细胞外环境中存在的分子相结合并且能够在细胞内触发信号转导级联并最终引发细胞应答。GPCR仅发现于真核生物中，包括酵母、领鞭虫类和动物。结合并激活这些受体的分子包括但不限于光敏化合物、气味、信息素、激素以及神经递质，并且其大小从小分子到肽直至大的蛋白质不等。影响胞质钙水平的一类GPCR的一个实例通过Gq类型的G蛋白发挥作用，该Gq类型的G蛋白激活磷脂酶C(PLC)途径，导致磷酸肌醇的水解以产生两类不同的第二信使，即，二酰基甘油和肌醇磷酸。二酰基甘油转而激活某些蛋白酶C(PKC)，而肌醇磷酸(例如但不限于IP3)刺激钙从细胞内储库(store)如内质网、肌浆网(对于肌细胞)和/或线粒体的运动。GPCR仅发现于真核生物中，这包括酵母、领鞭虫类和动物。结合并激活这些受体的分子包括但不限于光敏化合物、气味、信息素、激素以及神经传递质，并且其大小从小分子到肽直至大的蛋白质不等。

可用于本文公开的方法的GPCR包括但不限于：G_q蛋白或G_q/11、α-1肾上腺素能受体(α1-AR)、硬骨鱼紧张肽(UT)受体、5-HT2和5-HT6血清素受体、下丘泌素(食欲素)受体、组胺HI受体、缓激肽B1和B2受体、铃蟾肽BB2受体、P2Y嘌呤能受体、乙酰胆碱受体(例如，M1、M3和M5)、mGluR5谷氨酸受体、加压素V2和VI受体、血管紧张素AGTR1受体、胆囊收缩素CCKAR和CCKBR受体、内皮素ENDRA受体、生长素释放肽GHSRla受体、褪黑激素MTNR1A受体、神经降压肽NTSR1受体、血小板活化因子PTAFR受体、促黄体激素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、促性腺激素释放激素受体(GnRHR)和催乳素释放肽受体PRLHR受体。在一些实施方案中，GPCR在表达钙传感蛋白的细胞中内源性表达。在其他实施方案中，GPCR在表达钙传感蛋白的细胞中异源性表达。

在其他方面中，可用于本发明的方法的靶蛋白可以是激酶。激酶是将磷酸基团从高能供体分子如ATP转移到特定底物的一类酶，这一过程被称为磷酸化。最大的激酶群体之一是蛋白激酶，其作用于并改变特定蛋白质的活性。激酶广泛地用于传送信号并控制细胞中的复杂过程。在人类中已经鉴别了超过500种不同的激酶。它们的庞大的多样性及其在信号传导中的作用使得它们成为尤其针对以异常激酶表达或调节为特征的疾病状态的研究的对象。

蛋白激酶含有大的柔性环，称为激活环或A-环，其构象被认为是调节激酶活性。在许多激酶中，A-环的构象由该区域内的特定残基的磷酸化来控制(Johnson 1996)。激活环通常开始于保守的AspPheGly序列并终止于保守的AlaProGlu。在失活激酶的结构中，该环通常阻断底物或ATP结合位点(Hubbard 1994；Mohammadi 1996；和McTigue 1999)。酪氨酸激酶通常在环内具有一个或两个酪氨酸，MAPK激酶具有在T和Y上都被磷酸化的T[DE]Y基序，而大多数其他激酶在环内具有苏氨酸。

可用于本发明的方法的靶蛋白广泛地适用于任何蛋白激酶。其可以包括蛋白质酪氨酸激酶和蛋白质丝氨酸激酶。蛋白质酪氨酸激酶的非限制性实例是pp60c-src、p56lck、ZAP激酶、血小板衍生生长因子受体酪氨酸激酶、Bcr-Abl、VEGF(血管内皮生长因子)受体酪氨酸激酶和表皮生长因子受体酪氨酸激酶和表皮生长因子受体样酪氨酸激酶。适用于本发明的丝氨酸蛋白激酶的非限制性实例包括MAP(促分裂原活化蛋白)激酶、蛋白激酶C、蛋白激酶A、Akt和CDK(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)。在哺乳动物生物学中，属于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的蛋白激酶在多种与ras基因的突变和生长因子受体的失调相关的增殖性细胞疾病(例如，癌症)中被不当地激活(Magnuson等,Seminars in CancerBiology,5:247-252(1994))。MAP激酶在本领域中是已知的，并且此类激酶的部分非限制性清单包括abl、Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C、ATK、bcr-abl、Blk、Brk、Btk、c-Kit、c-Met、c-Src、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、cRafl、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、ERK、Fak、fes、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Fgr、FLK-4、Flt-1、Fms、Fps、Frk、Fyn、Hck、IGF-1R、INS-R、Jak、KDR、Lck、Lyn、MEK、p38、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tiel、Tie2、Trk、Yes和Zap70。在本文所述方法的一些实施方案中，所述激酶是abl激酶。

对于激酶，已知几种类型的化合物调节激酶的功能。例如，I型激酶抑制剂识别激酶的活性构象。它们通过呈现模拟由ATP通常形成的氢键的一至三个氢键而与ATP结合位点结合。不受限于理论，据认为，与I型激酶抑制剂相反，II型激酶抑制剂识别激酶的非活性构象，并且能够通过占据直接与ATP结合位点相邻的疏水口袋而间接地与ATP竞争。该疏水口袋是由激活环的独特DFG-外(DFG-out)构象创建的。某些II型抑制剂能够直接与ATP结合位点形成氢键，但这不是功能性所必需的(Gotink和Verheul,Angiogenesis,2010,13(1):1–14)。在另一方面，III型激酶抑制剂是非ATP竞争性激酶抑制剂，其通过与激活环以外的位点结合(即通过与激酶上的变构位点结合)来调节激酶活性。由于III型化合物与激酶上的保守性较低的位点结合，它们是高度选择性的并且在研究和药物发现团体中受到越来越多的关注。

也预计在本发明的方法的范围内使用的是靶蛋白的突变形式。如本文中所用的“突变”包括在定义的一级氨基酸序列如靶蛋白的一级氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基的氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和/或氨基酸残基置换。氨基酸“置换”意指定义的一级氨基酸序列的至少一个氨基酸组分被另一个氨基酸(例如，半胱氨酸残基或赖氨酸残基)替换。通过标准技术将突变或置换工程化至靶蛋白的一级氨基酸序列内的方法在本领域中是公知的。可用于本文描述的方法的靶蛋白可包括保守置换。保守置换在下面的“氨基酸置换表”中的“优选置换”标题下示出。如果置换导致生物学活性的改变，则可以引入更多的实质性改变，在下表中命名为“示例性置换”，或者如下文针对氨基酸类别进一步描述的。

潜在的氨基酸置换

原残基	示例性置换	优选置换
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp,Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

靶蛋白的生物学性质的实质性改变通过选择置换来完成，该置换在其对维持以下方面的作用上显著不同：(a)在置换区域中的多肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积(bulk)。非保守置换将需要将这些类别之一的成员更换成另一类别的成员。

在其他实施方案中，可用于本文公开的任何方法的突变体靶蛋白可包含一个或多个非天然存在的或修饰的氨基酸。“非天然存在的氨基酸残基”是指除上文列出的那些天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、高丝氨酸、氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸(naphthalanine)、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、戊基甘氨酸、六氢吡啶羧酸和硫代脯氨酸。修饰的氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，其被可逆地或不可逆地化学阻断，或在其N-末端氨基或其侧链基团上被修饰，例如，N-甲基化的D和L氨基酸，侧链官能团被化学修饰成另一个官能团。例如，修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲酯)(其为天冬氨酸的修饰的氨基酸)、N-乙基甘氨酸(其为甘氨酸的修饰的氨基酸)，或丙氨酸羧酰胺，和丙氨酸的修饰的氨基酸。另外的非天然和修饰的氨基酸以及将其掺入至蛋白质和肽中的方法在本领域中是已知的(参见，例如Sandberg等,(1998)J.Med.Chem.41:2481-91；Xie和Schultz(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9:548-554；Hodgson和Sanderson(2004)Chem.Soc.Rev.33:422-430)。

在一些实施方案中，可用于本文描述的方法的突变靶蛋白可以通过适当的纯化方案使用标准蛋白质纯化技术从细胞(如癌细胞)中分离。在另一实施方案中，可用于本文描述的方法的突变靶蛋白通过重组DNA技术产生。作为重组表达的替代，供本文所述方法使用的突变靶蛋白可以使用标准肽合成技术进行化学合成。

B.供鉴别靶蛋白的变构调节剂的方法使用的试剂

在一些方面，可用于本文所述的方法的试剂可以是靶蛋白的未知候选变构调节剂。可用于本文所述的方法的试剂可以是任何小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。在一些实施方案中，该试剂是抗体(如人源化抗体)或其片段。或者，该试剂可以是小分子化合物。在其他实施方案中，该试剂可以是非抗体多肽(如分离的非抗体多肽)。在一些实施方案中，该试剂是肽(例如，分离的肽)。

1.非抗体结合性多肽

在一些方面，可用于本文所述的方法的试剂是非抗体结合性多肽。结合性多肽是与靶蛋白(如本文所述的任何靶蛋白)结合(优选特异性结合)的多肽。结合性多肽可以使用已知的多肽合成方法进行化学合成，或者可以使用重组技术进行制备及纯化。结合性多肽通常是至少约5个氨基酸的长度，或者至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸的长度或更长，其中这样的结合性多肽能够与野生型或突变型靶蛋白结合(优选特异性地结合)。使用公知的技术无需进行过度实验即可鉴别结合性多肽。在这方面，应当指出，针对能够与多肽靶标结合的结合性多肽筛查多肽文库的技术是本领域公知的(参见，例如，美国专利第5,556,762号、第5,750,373号、第4,708,871号、第4,833,092号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,689号、第5,663,143号；PCT公开号WO84/03506和WO 84/03564；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等,于SyntheticPeptides as Antigens,130-149(1986)；Geysen等,J.Immunol.Meth.,102:259-274(1987)；Schoofs等,J.Immunol.,140:611-616(1988)；Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等,(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363；和Smith,G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。

噬菌体(phage)展示是一种公知技术，其允许筛查大的多肽文库以鉴别这些文库中能够与靶多肽(如可用于本文公开的方法的野生型或突变型靶蛋白)结合的成员。噬菌体展示是这样一种技术：通过该技术使变体多肽在噬菌体颗粒表面上展示为与外壳蛋白的融合蛋白(Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science,249:386)。噬菌体展示的应用性在于以下事实：能够针对那些与靶分子高亲和力结合的序列，快速而高效地分选选择性随机化的蛋白质变体(或随机克隆的cDNA)的大型文库。肽(Cwirla,S.E.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378)或蛋白质(Lowman,H.B.等(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363)文库在噬菌体上的展示已经用于在数百万种多肽或寡肽中筛选那些具有特定结合性质的多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668)。对随机突变体的噬菌体文库的分选需要用于构建和繁殖大量变体的策略、使用靶受体进行亲和纯化的程序和评价结合富集结果的手段。参见美国专利第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,689号和第5,663,143号。

尽管大多数噬菌体展示方法使用了丝状噬菌体，但是λ形噬菌体展示系统(WO 95/34683；U.S.5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren等,Gene,215:439(1998)；Zhu等,CancerResearch,58(15):3209-3214(1998)；Jiang等,Infection&Immunity,65(11):4770-4777(1997)；Ren等,Gene,195(2):303-311(1997)；Ren,Protein Sci.,5:1833(1996)；Efimov等,Virus Genes,10:173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott,Methods inEnzymology,217:228-257(1993)；U.S.5,766,905)也是已知的。

额外的改进提高了展示系统针对与选定的靶分子的结合来筛查肽文库和展示功能性蛋白质的能力，其具有针对所需性质筛选这些蛋白质的潜力。已开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO 98/14277)，并且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169；WO 98/20159)和受约束的螺旋肽的性质(WO 98/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中噬菌体展示文库与一种溶液(其中的配体将与靶分子结合)和第二溶液(其中的亲和配体将不会与靶分子结合)接触，以选择性地分离结合配体。WO 97/46251描述了这样一种方法：用亲和纯化的抗体对随机噬菌体展示文库进行生物淘选，然后分离结合噬菌体，随后是使用微孔板孔来分离高亲和力结合噬菌体的微淘选过程。金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和标签的应用也已经被报道(Li等(1998)Mol Biotech.,9:187)。WO 97/47314描述了使用底物消减文库来区别酶特异性，其中使用组合文库，该组合文库可以是噬菌体展示文库。WO 97/09446中描述了一种利用噬菌体展示来选择适用于去污剂中的酶的方法。美国专利第5,498,538号、第5,432,018号和WO 98/15833中描述了其他选择特异性结合蛋白质的方法。

美国专利第5,723,286号、第5,432,018号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,498,530号、第5,770,434号、第5,734,018号、第5,698,426号、第5,763,192号和第5,723,323号中也公开了产生肽文库和筛查这些文库的方法。

可以修饰结合性多肽以增强其抑制效果(包括，例如，增强的亲和力，改善的药代动力学性质，例如半衰期、稳定性和清除率，降低的毒性等)。这样的修饰包括，例如，糖基化、聚乙二醇化、用非天然存在的但是在功能上等同的氨基酸置换、连接基团等。

2.小分子

在一些方面，可用于本文所述的方法的试剂是小分子化学化合物。该小分子优选为除本文定义的结合性多肽或抗体以外的有机分子，其与野生型或突变型靶蛋白结合(优选特异性地结合)。有机小分子可以使用已知的方法进行鉴别和化学合成(参见，例如，PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。有机小分子通常是小于约2000道尔顿的大小，或者小于约1500、750、500、250或200道尔顿的大小，其中能够与野生型或突变型靶蛋白结合(优选特异性结合)的此类有机小分子可以使用公知的技术进行鉴别而无需过度实验。在这方面，应当指出，针对能够与多肽靶标结合的分子筛查有机小分子文库的技术是本领域公知的(参见，例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。有机小分子可以是，例如，醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的酰肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯等。

在一些方面，小分子化学化合物是组合化学文库的组分。组合化学文库是多个种类的由较小亚单位或单体组成的化学化合物的集合。组合文库有多种大小，从数百到成百上千种不同的化学化合物种类不等。也存在多种文库类型，包括由化合物(例如碳水化合物、寡核苷酸和有机小分子等)组成的低聚和多聚文库。此类文库具有多种用途，例如化学化合物的固定和色谱分离，以及用于识别和表征能够结合受体分子(如c-met蛋白质)或能够介导目的生物活性(例如但不限于细胞增殖的抑制)的配体的用途。

用于在固相载体上合成化合物文库的各种技术在本领域中是已知的。固相载体通常是具有表面的聚合物体，该表面被官能化以与亚单位或单体结合从而形成文库的化合物。一个文库的合成通常涉及大量的固相载体。为制备组合文库，固相载体与化合物的一个或多个亚单位反应并以仔细控制的、预定的化学反应顺序与一个或多个数目的试剂反应。换句话说，文库亚单位在固相载体上“生长”。文库越大，所需的反应数目越大，从而使追踪组成文库的多个种类的化合物的化学组成的任务变得复杂。在一些实施方案中，小分子是小于约2000道尔顿的大小，或者小于约1500、750、500、250或200道尔顿的大小。

在本文任何方面所述的小分子试剂可源自能够在固相载体上进行的任何类型的化学反应。此类化学反应包括但不限于，包括丁二烯的捕获的2+2环加成；包括异噁唑啉、呋喃和修饰肽的合成的[2+3]环加成；包括二醇、醛和酮的固定化的乙缩醛形成；包括醛衍生化、丙二醇合成的醛醇缩合；包括醛衍生化的安息香缩合；包括苯二氮

和乙内酰脲、噻唑烷、转角(turn)模拟物、卟啉、酞菁的环缩合；包括二酯环化的Dieckmann环化；包括丙烯酸衍生化的Diels-Alder反应；包括醇加成到烯烃上的亲电加成；包括醛衍生化的格氏反应(Grignard reaction)；包括二取代烯烃合成的Heck反应；包括原位合成氧化腈(见2+3环加成)的Henry反应；包括信息素和肽合成的催化氢化(烯烃的氢化)；包括硫酮、双环[2.2.2]辛烷合成的迈克尔反应(Michael reaction)；包括芳基醚、肽基膦酸酯和硫醚合成的光延反应(Mitsunobu reaction)；包括喹诺酮合成的亲核芳香族取代；包括醛和酮合成的氧化；包括用戊炔醇环化降冰片二烯的Pausen-Khand环加成；包括螺烯合成的光化学环化；包括醛和酰氯的衍生化的与有机金属化合物的反应；以复合氢化物和锡化合物的还原，包括羰基、羧酸、酯和硝基的还原；包括羧基还原的Soai反应；包括联苯基衍生物合成的Stille反应；包括取代环己酮合成的Stork反应；包括喹诺酮合成的还原胺化；包括苯乙酸衍生物合成的Suzuki反应；和包括醛、信息素和硫酮的反应的Wittig-Horner反应。

公开了化学文库的合成以及这些文库的单个化合物向单个固相载体上讯号简化(deconvolution)的参考文献可见于美国专利申请第2009/0032592号；Needels等(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10700-10704；以及WO 97/15390。

3.抗体

在一些方面，可用于本文所述的方法的试剂是抗体。抗体是与靶蛋白结合(优选特异性地结合)的蛋白质。抗体的变体可根据本领域中已知的信息而制备，而基本不影响抗体的活性。例如，抗体变体可以在抗体分子中有至少一个氨基酸残基被不同的残基所替代。对于抗体，对置换诱变来说最感兴趣的位点通常包括高变区，但也考虑框架区(FR)的改变。

对于抗体，一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)中的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步开发的变体相对于产生该变体的亲本抗体具有改进的生物学性质。用于生成此类置换变体的适宜的方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，对数个高变区位点(例如6-7个位点)进行突变，以在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。这样产生的抗体由丝状噬菌体颗粒展示为包装在每个颗粒内的与M13基因III产物的融合体。随后根据如本文所公开的生物学活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变，以鉴别明显有助于抗原结合的高变区残基。可备选地或额外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是按照本文详述的技术进行置换的候选残基。一旦产生这样的变体，就如本文所述对这组变体进行筛选，并且可以选择在一个或多个相关试验中具有优异性质的抗体用于进一步开发。

编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过多种本领域已知的方法制备。这些方法包括但不限于，从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过对先前制备的抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变而制备。

可能需要在本发明的免疫球蛋白多肽的Fc区内引入一个或多个氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，该Fc区序列在包括铰链半胱氨酸在内的一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)。

在一个实施方案中，Fc区变体可表现出改变的新生Fc受体(FcRn)结合亲和力。这样的变体Fc区可在Fc区的氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任意一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。与FcRn的结合降低的Fc区变体可在Fc区的氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447中的任意一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。或者，上述Fc区变体可以表现出增加的与FcRn的结合，并且在Fc区的氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的任意一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。

与FcR的结合降低的Fc区变体可以在Fc区的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439中的任意一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。

例如，Fc区变体可表现出降低的与FcRI的结合，并且在Fc区的氨基酸位置238、265、269、270、327或329中的任意一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。

Fc区变体可表现出降低的与FcRII的结合，并且在Fc区的氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439中的任意一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。

Fc区变体可表现出降低的与FcRIII的结合，并且在Fc区的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437中的一个或多个位置处包含氨基酸修饰，其中Fc区中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。

具有改变的(即改善或削弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc区变体在国际专利申请号WO99/51642中描述。这样的变体可以在Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、331、333或334中的一个或多个位置处包含氨基酸置换。关于Fc区变体，还可参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及国际专利申请号WO94/29351。

C.二次谐波活性部分(例如，标记物)

在本文所提供的任何方法的一些方面，用二次谐波活性部分或标记物(又称作SHG-部分或SHG-标记物)标记野生型或突变型靶蛋白。二次谐波活性部分(例如，标记物)可以共价地或非共价地与靶蛋白结合，以使获得的靶蛋白对二次谐波产生敏感并且适于使用表面选择性技术进行界面研究。然后可以通过例如二次谐波产生或和频产生的表面选择性技术研究标记的靶蛋白。外源性部分(例如，标记物)可以预先连接到靶蛋白上，并且在进行测量前从标记的实体上分离任何未结合的或未反应的标记物。在一个实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)在体外连接到靶蛋白上。用二次谐波活性部分(例如，标记物)标记靶蛋白允许直接的、光学手段，该手段在结合反应(例如，能够将靶蛋白稳定为活性或非活性构象的试剂的结合)导致标记物的取向或构象变化的情况下，使用表面选择性非线性光学技术检测靶蛋白的构象变化。与使用荧光标记物的检测不同，SHG-标记物具有重要的优点，即仅有处于界面和具有净取向的标记的靶蛋白产生二次谐波信号；不能连接到表面上的标记的靶蛋白不产生信号。因此，用于检测SHG标记的靶蛋白分子在试剂结合时的构象变化的信噪比总是不变地且一致性地高。在一些实施方案中，用SHG-活性部分(例如，标记物)原位(即，在连接到表面上之后)标记靶蛋白。在其他实施方案中，靶蛋白在连接到支持的脂双层表面或支持的脂质类似物双层表面之后，用SHG-活性部分(例如，标记物)进行标记。

在本发明的备选方面，可以使用至少两种可区别的二次谐波活性部分(例如，标记物)。然后选择连接的两种或更多种可区别的标记物的取向以便有助于发出的相干非线性光束的明确定义的方向。所述两种或更多种可区别的标记物能够在如下的试验中使用，在该试验中，使用相对于样品以一个或多个偏振方向入射的、处于一个或多个频率的多个基本光束，得到至少两个非线性光束的发射。在一个实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)包含多个单独的二次谐波活性部分(例如，标记物)，其中每一个都具有非线性磁化性并且相对于彼此以固定和确定的方向结合在一起，以增加二次谐波活性部分(例如，标记物)的总非线性磁化性。

1.二次谐波活性染料

在本文所述方法的一些方面，二次谐波活性部分(例如，标记物)是染料。靶蛋白可用染料通过特异性标记或非特异性标记进行标记。

二次谐波活性部分可通过特异性标记，例如通过共价键或氢键连接到靶蛋白上。例如，二次谐波活性部分(例如，标记物)可以共价地或非共价地连接到待检测的靶蛋白的一级氨基酸序列中的胺基团、赖氨酸基团或巯基基团上。在一些实施方案中，二次谐波活性部分(例如，标记物)具有胺反应性琥珀酰亚胺酯、硫醇反应性马来酰亚胺或醛和/或酮反应性酰肼和羟胺。在一些实施方案中，SFG或SHG-活性染料标记物可以通过用于偶合到叠氮化物的“点击化学法”进行缀合。用于缀合物形成的点击化学法的细节在下列文献中描述：“Synthesis and Functionalization of Biomolecules via Click Chemistry,C.Schilling等，第15章，第355-378页，于“Click Chemistry for Biotechnology andMaterials Science”J.Lahann(Ed),Wiley(2009)中。

适于在本文公开的方法中用作二次谐波或和频率活性部分(例如，标记物)的染料的实例包括但不限于：马来酰亚胺标记物(例如PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)，其在半胱氨酸残基上特异性标记蛋白质)、PyMPO-NHS(其特异性标记赖氨酸残基)、噁唑标记物(例如特异性标记胺的PyMPO-琥珀酰亚胺酯)、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在其他实施方案中，标记物可以是基于香豆素的染料，例如但不限于酮基香豆素和3,3’-羰基双(7-二乙氨基香豆素)。在其他实施方案中，标记物可以是PyMPO-SE^TM(1-(3-(琥珀酰亚胺氧羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)。

在本文公开的方法的一些方面，可以将靶蛋白的一级氨基酸序列中的天然氨基酸残基突变为或置换为另一种能够与二次谐波活性染料结合的氨基酸。如本文中所使用的，“突变”包括至少一个氨基酸残基在确定的一级氨基酸序列(例如靶蛋白的一级氨基酸序列)中的氨基酸残基缺失、氨基酸残基插入和/或氨基酸残基置换。氨基酸“置换”意指确定的一级氨基酸序列的至少一个氨基酸成分被另一个氨基酸(例如，半胱氨酸残基或赖氨酸残基)所替换。理想的是，在一级氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的突变或置换(例如，保守突变或置换)不会导致由该氨基酸序列编码的靶蛋白的敏感性的实质性改变，该敏感性是对于在与该靶蛋白的配体结合时或与能够变构地结合靶蛋白的未知候选试剂结合时经历构象变化的敏感性。

通过标准技术向蛋白质(例如靶蛋白)的一级氨基酸序列中工程构建突变或置换的方法是本领域中公知的。本文所述的靶蛋白可包括保守置换。保守置换在上文的“氨基酸置换表”中的“优选置换”标题下示出。

2.非天然氨基酸

在其他方面，二次谐波活性部分(例如，标记物)可以是非天然氨基酸(UAA)。与常规的标记物不同，UAA提供了在隐蔽的和暴露的位点处均标记蛋白质的手段。此外，作为蛋白质的固有组分，它们可以相比于连接到氨基酸官能团(如半胱氨酸和胺)上的标记物(例如染料)以更高灵敏度和保真度报告结构变化。UAA具有用于使用非线性技术(如二次谐波产生)来检测蛋白质的超极化性。因此，这些特定的非天然氨基酸也被称为SHAA(“二次谐波氨基酸”)。使用UAA作为探针来检测蛋白质结构构象变化的另一个优点是，该检测可以在体内进行——也就是说，在活细胞中进行。例如，本文所述的方法可以用来检测活细胞中的靶蛋白响应于候选试剂的结合所表现出的构象变化。通过使用相对于表面定向的靶蛋白的蛋白质群体，可以使用包含UAA作为其氨基酸序列的一部分的靶蛋白建立在真实空间中实时的结构或构象变化的高度精确图谱。理想的是，在一级氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被UAA置换不导致由该氨基酸序列编码的靶蛋白的敏感性的实质性改变，该敏感性是对于在与GDP或GTP结合时或者在GTP水解时或者在与能够结合靶蛋白并将其稳定为非活性或活性构象的未知候选试剂结合时经历构象变化的敏感性。

任何可超极化的UAA可以作为二次谐波活性部分(例如，标记物)用来通过本文所述的任意方法测量靶蛋白结构在与候选试剂结合时的构象变化。在一些实施方案中，所述UAA是Aladan(Cohen等,2002,Science,296:1700；Abbyad等,2007,J.Phys.Chem.,111:8269，其公开内容通过引用整体并入本文)。在其他实施方案中，所述UAA是丹酰丙氨酸(Summerer等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,2006,103(26):9785-9789)。在一个实施方案中，所述非天然氨基酸是和频产生活性的(SFG-活性的)。如本文所使用的，“和频产生活性的”是指具有超极化性并且可通过SFG检测的SH活性标记物。在其他实施方案中，所述UAA不是可超极化的，但具有合适的一个或多个化学官能团，从而使其能够结合二次谐波活性标记染料，例如上述任意染料。在其他实施方案中，所述UAA可包括具有定制的振动性质的探针，用于工程构建到蛋白质内的不连续位点，以通过SFG鉴别位点特异性构象变化。在一些实施方案中，理想的是，用于包含在UAA内的探针部分足够小，以使其不扰乱天然蛋白质结构，并且可以包括但不限于NO、CN、SCN或N₃。在一些实施方案中，探针部分提供在约1900至2300cm^-1的频谱范围内的独特振动特征(vibrational signature)，这与内在蛋白质的振动很好地分开。在另一实施方案中，UAA可用于将靶蛋白连接到表面上，使得二次谐波活性部分(例如，标记物)具有相对于表面的净取向。

相应地，在一些方面，通过测量工程构建到靶蛋白不同突变体的氨基酸序列内的非天然氨基酸标记物或一系列此类标记物的倾斜角或绝对倾斜角，能够实时地和在真实空间中确定靶蛋白构象的结构变化。探针可以在靶蛋白内的任何位点处或在其末端，或在其任何结构域中引入。在一些实施方案中，靶蛋白可包括在化学上配备成与UAA共价反应的二次谐波活性标记物。例如，如果引入蛋白质内的UAA是对乙酰基苯丙氨酸(pAcF)，则二次谐波活性染料将具有在其上适当的化学反应(chemistry)，以便与pAcF共价键合。在另一实施方案中，除了第二UAA以外还引入SHAA，该第二UAA(其通常不是二次谐波活性的)允许蛋白质以定向方式在化学上垂直共价偶联到表面上，该表面用适当的化学反应进行衍生化以便与所述第二UAA反应。对于高度定向的SH-活性的靶蛋白样品(使用这两种UAA)，相较于不采用UAA产生SHG信号的靶蛋白，基线SHG信号和对比度(在构象变化时的信号变化)均可以更大。

在其他方面，利用本文公开的任意方法在靶蛋白的氨基酸序列中使用一个或多个UAA使得能够通过确定靶蛋白内一个或多个位点处的一个或多个标记物随时间变化的倾斜角，来确定靶蛋白在与候选变构调节剂结合后经历的实际构象变化。靶蛋白的三维结构可以如下确定：制备蛋白质的一个或多个突变体，其各自含有放置在不同位置上的SHAA探针(即，对于每个突变体中的探针，可以确定每个突变体中探针相对于表面的取向，从而确定侧链的取向，并且可以使用该信息构建整体三维蛋白质结构的模型)。由本领域技术人员已知的空间位阻方法、统计方法、分子动力学、拉马钱德兰图(Ramachandran plot)或能量最低化方法获得的信息可被用于进一步帮助基于所测量的探针倾斜角来确定该结构。对探针倾斜角的时间分辨测量产生蛋白质的构象变化在实时发生时的运动图像。由于SHG的(以及SFG的)实际上瞬时的响应和灵敏度，特定探针的空间取向(例如，相对于表面的倾斜角或绝对倾斜角)可以在几乎任何感兴趣的时间尺度上被实时地测量。

关于在SHG技术中使用UAA的进一步的信息可以在美国专利申请公开第2010/0068144号中找到，其公开内容通过引用整体并入本文。

D.界面

在本文所公开的方法的一些方面，靶蛋白与固体表面结合或相对于界面定向，使得与靶蛋白结合的二次谐波活性标记物具有净取向。正是这种净取向在结合GTP或GDP时、在靶蛋白活性位点内的GTP水解时或在能够将突变型或野生型靶蛋白的结构稳定为非活性或活性构象的候选试剂(条件是该试剂诱导标记的靶蛋白的结构的构象变化)结合时能够改变。在一些实施方案中，界面可以由二氧化硅、玻璃、硅、聚苯乙烯、尼龙、塑料、金属、半导体或绝缘体表面，或任何可以吸附或附着生物成分的表面制成。在不同的实施方案中，界面可以是汽-液界面、液-液界面、液-固或固-固界面。在一个实施方案中，该汽-液界面是空气-水界面。在一个实施方案中，该液-液界面是油-水界面。在不同的实施方案中，该液-固界面是水-玻璃界面或苯-SiO₂界面。

在一些方面，界面还可以包括生物细胞和脂质体表面。附着或固定可通过多种本领域公知的技术进行。例如，对于蛋白质，表面可使用醛硅烷进行衍生化，以供与生物分子表面上的胺偶联(MacBeath和Schreiber，2000——其相关部分通过引用并入本文)。BSA-NHS(BSA-N-羟基琥珀酰亚胺)表面也可以如下使用：首先使BSA的分子层附着到表面上，然后用N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯将其活化。BSA上的活化的赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基与蛋白质上的表面胺反应。

也可使用支持的磷脂双层，同时使用或不使用膜蛋白或其他膜相关成分，例如，Salafsky等，Biochemistry，1996——其相关部分通过引用并入本文，“Biomembranes”,Gennis,Springer-Verlag，Kalb等，1992，以及Brian等，1984，它们的相关部分通过引用并入本文。支持的磷脂双层是本领域公知的，并且有许多技术可用于其制备，其中使用或不使用相关的膜蛋白。这些支持的双层通常必须浸没于水溶液中，以防止其在暴露于空气时被破坏。在一些实施方案中，表面是脂质类似物双层表面。

如果使用固体表面(例如，平面基底、珠子等)，其也可以通过多种化学反应进行衍生化，以降低或提高其净表面电荷密度，从而优化对靶蛋白-候选变构调节剂相互作用的检测。在其他实施方案中，固体表面可以是玻璃表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚苯乙烯表面或聚乙烯表面(如聚乙二醇表面)。靶蛋白固定于其上的载体可以由广泛的材料构成，例如但不限于生物的、非生物的、有机的、无机的或任何上述这些的组合，以颗粒、链、沉淀物、凝胶、板片、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、膜、板或载玻片形式存在。表面可以具有任何适宜的形状，例如但不限于圆盘、正方形、球形或圆形。表面可以优选是扁平的，但也可以采取多种备选的表面构型。例如，表面可包含凸起的或凹陷的区域，样品(例如蛋白质)位于其上。表面优选地形成刚性支撑，在其上可以形成样品。表面也选择为用于提供适当的吸光特性。例如，表面可以是但不限于聚合的Langmuir Blodgett膜、官能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、改性硅，或多种凝胶或聚合物中的任何一种，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏氟乙烯、聚乙二醇、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其组合。其他表面材料对于本领域技术人员将是显而易见的。在一个实施方案中，基底是平板玻璃或二氧化硅。

在一些方面，表面可以用公知的技术进行蚀刻，以提供所需的表面特征。例如，通过形成沟槽、V形槽、台面结构等，可以将靶蛋白(如，蛋白质的合成区域)更接近地置于照射光的焦点内。表面也可设置有反射性“镜子”结构以使从中收集的发射最大化。作为另一实例，可以对表面进行蚀刻以形成孔。

在本发明的另一方面，寡聚聚乙二醇(PEG)分子可用于将亲和标记的靶蛋白固定于表面上以供SHG或SFG检测。在一些实施方案中，PEG可以是SAT(PEG4)(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基(硫代四乙二醇)。适于检测SHG信号的PEG化的界面可以通过用寡聚PEG溶液涂覆合适的表面(如上述任何表面)而制备。在一个实施方案中，表面可以是玻璃。在另一实施方案中，表面可以是氨基封端的硅烷衍生化的玻璃。亲和标签是本领域中常见的，并且可以是，例如，组氨酸标签(如His₆标签)、麦芽糖结合蛋白标签、HA标签、生物素标签、硫醇标签或GST标签。在一些实施方案中，亲和标签是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个组氨酸残基中任意书目的组氨酸。在一个实施方案中，寡聚PEG分子使用将会与靶蛋白上表达的亲和标签结合的试剂进行修饰。该试剂在组氨酸标签的情况下可以是镍，或者可以是糖(如麦芽糖)、抗体或本领域已知的任何其他能够与亲和标签结合的分子。

IV.本发明的方法

A.二次谐波产生

二次谐波产生(SHG)是非线性光学过程，其中与非线性材料相互作用的光子有效地“组合”以形成新的光子，新的光子具有初始光子的两倍的能量，并且因此具有两倍的频率和一半的波长。这是和频产生(SFG)的一种特殊情况。表面选择性非线性光学(SSNLO)技术(例如SHG)允许在大体积物质的存在下检测界面分子或颗粒。强激光束(基本的)照射至一些样品的界面上；如果该界面是非中心对称的，则样品能够产生非线性光，即基本光的谐波。基本或二次谐波束可以被容易地彼此分离，不像荧光技术中的典型情况(其中激发光和发射光由于斯托克斯位移(Stokes shift)而以更窄的差别被分离)。如果单独的分子或颗粒1)是非线性活性的(具有超极化性)且2)临近表面，并通过表面的影响(通过化学力或电力)成为非随机取向的，则它们可以被检测到。物质的这种净取向和固有的SHG-活性促成界面处SHG容许的效应。

SHG已作为一种采用SH-活性探针来检测和研究生物分子的构象变化的灵敏的技术而出现(Salafsky,J.S.Journal of Chemical Physics 2006,125,074701；Salafsky,J.S.Physical Chemistry Chemical Physics 2007,9,5704)。被吸附或共价固定在表面上的标记的蛋白质产生SHG信号，这是由于相对于表面平面的SHG标记物的非线性极化性的平均净取向。具体地，SH强度作为I_SH＝G(χ_s ⁽²⁾)²I²给出，其中，I_SH是二次谐波强度，G是依赖于实验几何形状和波长的常数，I是基本光束的强度。非线性磁化率，χ_s ⁽²⁾，通过如下等式带有表面上SH-活性分子的详细信息：

χ_s ⁽²⁾＝N_s＜α⁽²⁾＞，

其中N_s是分子的表面密度，括号代表取向平均值，α⁽²⁾是其非线性极化率，即决定由基本光束的两个入射光子产生二次谐波光子的概率的量子力学特性。对χ_s ⁽²⁾的测量提供了关于表面上分子的取向的信息。例如，当α⁽²⁾由沿分子轴ζ的单一元素ζζζ⁽²⁾决定并且分子的方位角分布在表面平面中为随机分布时，仅有的不会消失的χ_s ⁽²⁾元素为：

χ_s⊥⊥⊥ ⁽²⁾＝N_s＜cos³θ＞α_ξξζ ⁽²⁾

χ_s⊥||| ⁽²⁾＝χ_s||⊥|| ⁽²⁾＝χ_s||||⊥ ⁽²⁾＝1/2N_s＜cosθsin²θ＞α_ζζζ ⁽²⁾

其中θ是ζ与表面法线之间的极角，而下标⊥和||分别代表与表面垂直和平行的方向(Heinz,T.F等.Physical Review A 1983,28,1983)。

SH光是相干且定向的，从而简化了SH束的收集和分离，并且由于基本和二次谐波在频谱上很好地分离，串扰(其可给荧光测量造成麻烦)并不存在于SHG中。探针的光降解通过双光子诱导的吸收相对缓慢地发生，从而允许在相对较长的时间尺度上进行测量。对SHG的折衷(trade-off)是信号强度，它比荧光弱数个数量级。然而，由于在表面附近随机扩散的分子并不产生信号，因此仅固定在表面上的SH-活性分子有助于产生二次谐波光；由等式1得到的其取向平均值为零。因此，SHG固有地被配备为区分表面结合的和游离的分子。SH信号报告探针的取向平均值，并因此会由于构象变化而变化。

用于检测靶蛋白-变构调节剂的相互作用及其对靶蛋白构象结构的影响的设备可采取多种配置。作为其最简单的形式，该设备将包括：i)基本光的光源；ii)具有表面连接的探针(如SHG标记的靶蛋白)的基底；以及iii)用于测量二次谐波或其他非线性光束的强度的检测器。该设备的更复杂形式将采用例如：单色器(用于波长选择)、通滤波器、滤色器、干涉滤波器或其他滤谱器(用于波长选择或从高次谐波中分离基本光)、一个或多个偏振光学器件、一个或多个用于引导和聚焦光束的镜子或透镜、计算机控制或软件。

传送或生成非线性光学光(例如，SHG)的模式可基于以下手段中的一种或多种：TIR(全内反射)、光纤(连接有或未连接有珠子)、透射(基本光穿过样品)、反射(基本光从样品反射)、扫描成像(允许扫描样品)、共聚焦成像或扫描、用于功率积聚的谐振腔、多通设置。

测得的信息可以采取矢量的形式，其可包括一个或多个以下参数：光的强度(一般由PMT或光电二极管转换为光电压)、光的波长(用单色器和/或滤波器来确定)、时间或位置。所述设备的两种一般配置为：图像扫描(基底的成像——强度、波长等，作为x、y坐标的函数)和光谱学(强度、波长等的测量，对于一些平面的表面或对于细胞、脂质体或其他颗粒的悬浮液)。

基本光束可以以多种方式传输到样品(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0094528，其公开内容通过引用整体并入本文)。应当理解，在和频或差频配置中，基本光束将由两个或更多个光束组成，并且将在界面上产生差频或者和频光束。

根据另一方面，当希望信息为基底位置(x，y)的函数时，可以使用电荷耦合检测器(CCD)阵列检测器。CCD包含像素(即，光电二极管)的阵列，其中每一个像素都可以独立地测量照射在其上的光。对于给定的设备几何形状，产生自特定的基底位置(x，y)的非线性光可通过测量照射在与基底有一定距离的CCD位置(Q，R)上的非线性光的强度来确定——这可以确定是由于与荧光发射的自发、随机且多方向性质相比其为相干的、平行的(且通常与基本光共同传播)非线性光束。采用CCD阵列，检测器中的一个或多个阵列元件(10)将映射(map)到基底表面的特定区域，从而允许容易地确定作为基底位置(x，y)的函数的信息。光电二极管检测器和光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管、光电晶体管、真空光电二极管或本领域中已知的用于将入射光转换为电信号(即，电流、电压等)的其他检测器也可用于检测光强度。对于CCD探测器，CCD与安装在设备计算机中的数据采集板进行通信并受其控制。数据采集板可以是本领域所熟知的类型，例如由Computer Boards Inc.生产的CIO-DAS16/Jr。例如，数据采集板和CCD子系统可以按照下述方式操作。数据采集板通过发送时钟信号到CCD子系统来控制CCD整合周期。在一个实施方案中，CCD子系统将CCD整合周期设置为4096个时钟周期。通过改变时钟频率，可操控CCD整合数据的实际时间。在整合周期中，每个光电二极管累积与到达它的光的量成比例的电荷。一旦该整合周期结束，电荷即转移至CCD的移位寄存器且新的整合周期开始。移位寄存器将电荷存储为电压，该电压代表了入射到CCD阵列上的光模式(pattern)。然后将电压以时钟频率传送到数据采集板，在那里将电压数字化，并存储在计算机的存储器中。以这种方式，使样品的条带在每个整合周期中成像。此后，将随后的行整合，直到样品得到完全扫描。

在一方面，SH光的检测器可以是以单光子计数模式操作的光电倍增管。可使用SR445型快速前置放大器和SR 400型鉴别器(由Stanford Research Systems,Inc.提供)对光电流脉冲进行电压转换、放大、进行区分，然后发送到计数器。可使用数字延迟/脉冲发生器将通过DAC输出的光子计数器门控(gating)和电流计控制进行同步。与PC计算机的通信可根据本领域技术人员已知的多种方法来实现，包括但不限于使用并行寄存器、CAMAC控制器卡和PC适配器卡。

在可备选的方面，将带通滤波器、陷波滤波器或滤色器置于任一或全部的光束通路(例如，基本的、二次谐波等)中，从而允许，例如，更宽的频谱带宽或更多的光通量。在一个实施方案中，可使用干涉滤波器、陷波-通滤波器、带通滤波器、反射式滤波器或吸收性滤波器代替图中的滤波器，以便通过或阻断基本光束或非线性光束。

在本文所提供的方法的一些方面，可将检测器所记录的数据记录在固定的或数据存储介质中，该存储介质是通过用于读取存储介质的系统可访问的。例如，用于读取数据存储介质的系统可包括：计算机，其包括中央处理器(“CPU”)；工作存储器，其可以是，例如，RAM(随机存取存储器)或“磁芯”存储器、大容量存储器(例如一个或多个磁盘驱动器或CD-ROM驱动器)；一个或多个显示设备(例如，阴极射线管(“CRT”)显示器、发光二极管(“LED”)显示器、液晶显示器(“LCD”)、电致发光显示器、真空荧光显示器、场发射显示器(“FED”)、等离子体显示器、投影面板等)；一个或多个用户输入设备(例如，键盘、麦克风、鼠标、触摸屏等)；一条或多条输入线以及一条或多条输出线，它们均通过常规的双向系统总线互连。该系统可以是独立的计算机，或者可以与其他系统(例如，计算机、主机、服务器等等)网络化连接(例如，通过局域网、广域网、内联网、外联网或因特网)。该系统还可包括其他的计算机控制的设备，例如消费者电子产品和装置。

输入硬件可通过输入线耦接到计算机，并且可以以多种方式来实现。本发明的机器可读数据可通过使用经电话线或专用数据线连接的一个或多个调制解调器进行输入。可备选地或另外地，输入硬件可包括CD-ROM驱动器或磁盘驱动器。在与显示终端结合时，键盘也可用作输入设备。

输出硬件可通过输出线耦接到计算机，并且可以类似地通过常规设备来实现。举例而言，输出硬件可包括用于使用(例如QUANTA)的程序来显示本发明的活性位点的图形化表示形式的显示设备。输出硬件还可包括打印机以便可以产生硬拷贝输出；或者磁盘驱动器，以便存储用于后续使用的系统输出。

在本发明中有用的机器可读存储设备包括但不限于磁性设备、电子设备、光学设备及其组合。这样的数据存储设备的实例包括但不限于硬盘设备、CD设备、数字视频磁盘设备、软盘设备、可移动硬盘设备、磁光盘设备、磁带设备、闪存设备、磁泡存储器设备、全息存储设备以及任何其他大容量存储外围设备。应当理解，这些存储设备包括必要的硬件(例如，驱动器、控制器、电源等)，以及任何必要的使得能够存储数据的介质(例如，磁盘、闪存卡等)。

本领域技术人员将会理解，还可设想任何其他进行数据通信或数据存储的方法或技术来以机器可读格式提供靶蛋白在与候选调节剂结合时的构象变化的实时数据。

B.SHG检测和标记

根据本领域技术人员已知的程序将来自Ti:S飞秒激光器的光束用作基本光。具体地，采用在80MHz、约150fs脉冲持续时间和0.5W平均功率下运行的氩泵Ti:蓝宝石系统(Coherent，Inc.)。光束优先聚焦到载玻片-缓冲液界面处的点上。收集由表面产生的二次谐波光，将其从基本光中过滤，并根据本领域技术人员已知的程序通过光电倍增管(PMT)进行检测。记录由于光漂白引起的强度下降的基线信号。改变基本光束的偏振以产生最大信号输出。通过确定信号对基本强度的二次方依赖性并测量其特征性谱线形状来验证该信号为二次谐波。通过使用光子计数(1秒的整合时间)来获得每个数据点。

在一些方面，靶蛋白可用二次谐波(SH)活性标记物(例如上述的任意标记物)进行标记。在一个实施方案中，采用二次谐波活性部分(例如，标记物)在一个或多个氨基酸残基上标记靶蛋白，并将其连接到表面上或在界面(例如本文所述的任何表面或界面)处定向，从而使SH活性标记物具有相对于界面的净取向。标记的氨基酸可包括但不限于半胱氨酸残基、赖氨酸残基或胺。在其他实施方案中，采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan)对靶蛋白进行标记。在一些实施方案中，靶蛋白中的天然氨基酸残基采用二次谐波活性标记物进行标记。在其他实施方案中，所标记的氨基酸残基可以是工程构建至靶蛋白的一级氨基酸序列中的突变的或置换的氨基酸残基(如保守突变的或保守置换的氨基酸残基)。在其他实施方案中，靶蛋白被连接到表面(例如本文所述的任何表面或界面)上并采用SH活性标记物进行原位标记。

C.用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂的方法

本文提供了用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂的方法。将与在界面处具有净取向的SH活性标记物结合的靶蛋白与已知结合靶蛋白的活性位点的天然或合成配体进行预孵育，并建立基线二次谐波信号。或者，将靶蛋白从具有已与活性位点结合的天然配体的细胞或组织中分离。在此之后，将靶蛋白与候选变构调节剂(例如本文所述的任何候选变构调节剂)进行孵育。候选变构调节剂与靶蛋白的结合产生指示靶蛋白结构的构象变化的可检测信号。于是，可检测SHG信号的存在或不存在将候选试剂鉴别为靶标的变构调节剂。在一些实施方案中，已知与靶蛋白的活性位点结合的合成配体是药物，例如抑制剂或靶蛋白的天然配体的合成类似物。

在一些方面，SH活性标记物与已知结合一种或多种胞内或胞外配体的靶蛋白上的特定氨基酸残基结合。这些配体可包括但不限于，另一种蛋白质、肽、核酸(例如，抑制性核酸，例如反义寡核苷酸或siRNA)、磷脂、碳水化合物或辅因子(例如但不限于金属离子或维生素)。在一个实施方案中，SH活性标记物与已知位于靶蛋白与另一蛋白质之间相互作用的界面区(即，位于蛋白质-蛋白质相互作用的位点处)的靶蛋白中的氨基酸结合。

在一些方面，靶蛋白上的标记的氨基酸残基可包括但不限于半胱氨酸残基、赖氨酸残基或胺。在其他实施方案中，靶蛋白采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan或丹酰丙氨酸)进行标记。在另一实施方案中，非天然氨基酸是和频产生活性的(SFG活性的)。在一些实施方案中，可将包含具有定制的振动性质的独特探针的UAA工程构建至靶蛋白的不连续位点处(例如在靶蛋白与另一蛋白质之间的相互作用的界面区)，以通过SFG鉴别位点特异性构象变化。探针部分可包括但不限于NO、CN、SCN或N₃。在一些实施方案中，探针部分提供在约1900到2300cm^-1的频谱范围内的独特的振动特征(vibrational signature)。在一些实施方案中，靶蛋白中的天然氨基酸残基采用二次谐波活性标记物进行标记。在其他实施方案中，标记的氨基酸残基可以是工程构建至靶蛋白的一级氨基酸序列中的突变的或置换的氨基酸残基(例如保守突变的或保守置换的氨基酸残基)。

在其他方面，靶蛋白可与表面结合或在界面处结合，例如上述的任何表面或界面。在一些实施方案中，靶蛋白包括用于将其固定至表面上的亲和标签(例如但不限于聚组氨酸标签，例如His₆)。在另一实施方案中，表面涂覆有镍-寡聚PEG分子以便将His₆标记的激酶固定至表面上，以用于SHG或SFG检测。在又一实施方案中，表面是支持的脂双层表面或脂质类似物双层表面。

在一些方面，候选变构调节剂与SH活性标记的靶蛋白的结合可诱导靶蛋白结构的构象变化。在一些实施方案中，这种构象变化可使SH活性标记物的净取向相对于界面发生变化。在一些实施方案中，在与候选变构调节剂结合后，SH活性标记物的净取向相对于界面改变约1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或更大值中的任意值。在一个实施方案中，实时检测并记录这种变化。

C.用于鉴别在与试剂进行变构结合后经历构象变化的靶蛋白的结构中的特定位 点的方法

本文提供了用于鉴别与试剂进行变构结合后经历构象变化的靶蛋白的结构中的特定位点的方法。在一些方面，在两个或更多个不同的位置采用SH活性标记物标记单个靶蛋白，使得每个靶蛋白与一个SH活性标记物结合，但至少两个或更多个靶蛋白之间的SH活性标记物的位置不同(即，靶蛋白的至少两个拷贝各自具有位于靶蛋白的不同区域内的单一SH活性标记物)。任选地，与在界面处具有净取向的SH活性标记物结合的至少两个靶蛋白可与已知结合靶蛋白的活性位点的天然或合成配体进行预孵育，并建立基线二次谐波信号。然后将所述至少两个或更多个标记的靶蛋白中的每一个与候选变构调节剂(例如本文所述的任何候选变构调节剂)进行孵育。候选变构调节剂与靶蛋白的结合产生指示靶蛋白结构的构象变化的可检测信号。如果用位于靶标上第一位点处的SH活性标记物标记的靶蛋白在与候选变构调节剂结合后产生了可检测信号，而在相同的候选变构调节剂与用位于靶标上第二位点处的SH活性标记物标记的靶蛋白孵育时没有产生可检测信号，则指示该候选变构调节剂与靶蛋白特异性地结合并诱导靶蛋白上第一位点处而非第二位点处的构象变化。另一方面，如果带有位于第一位点处的SH活性标记物的靶蛋白和带有位于第二位点处的SH活性标记物的靶蛋白在与候选变构调节剂一起孵育时各自产生可检测信号，则指示该候选变构调节剂与靶蛋白特异性地结合并诱导靶蛋白结构在两个位点处的构象变化，或者指示该候选变构调节剂与靶蛋白非特异性地结合。增加靶蛋白上SH活性标记物所在的位点的数目，可提高确定候选变构调节剂与靶蛋白是特异性地结合还是非特异性地结合的能力(即，特异性相互作用的可能性随着在靶蛋白上超过一个，如两个、三个、四个或五个位点上产生的可检测信号的数目而降低)。在一些实施方案中，可产生靶蛋白的数种形式，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种中的任一种，每种均具有位于靶蛋白的不同区域中的SH活性标记物。

术语“特异性结合”描述了靶生物分子(例如，靶蛋白)与结合配偶体之间的通常特异性的且可逆的相互作用，其需要生物分子与结合配偶体结构在结合位点处的空间互补性加上结合位点处一种或多种类型的静电力、氢键键合、疏水力和/或范德华力的组合效应。空间互补性越大且在结合位点处的其他力越强，则生物分子对其相应的结合配偶体的结合特异性将会越大。

术语“非特异性结合”是指靶生物分子与结合配偶体之间的相互作用，其为通过在相互作用位点处的非特异性相互作用，例如通过静电力、氢键键合、疏水力和/或范德华力，但缺少增强非结构力(例如在亲和性(特异性)结合中)的效应的结构互补性。

在一些实施方案中，当在第一位点(例如，第一氨基酸位点)处标记靶生物分子时，测量候选结合配偶体与靶生物分子结合后可检测信号(例如，归一化的SHG强度)的第一变化。在一些实施方案中，当在第二位点(例如，第二氨基酸位点)处标记靶蛋白时，测量相同的候选结合配偶体与靶生物分子结合后可检测信号(例如，归一化的SHG强度)的第二变化。归一化的SHG强度是在候选结合配偶体与靶生物分子结合后测量的SHG信号与对照值(例 如，在不存在候选结合配偶体时测量的SHG信号)的比值。

在一些实施方案中，在噪声水平以上的第一变化与第二变化之间的差异指示候选结合配偶体是特异性结合物。在一些实施方案中，噪声水平是0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％。在一些实施方案中，第一变化与第二变化之间的差异为噪声水平以上1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或500％。在一些实施方案中，特异性结合配偶体在游离溶液中对靶生物分子具有在10^-4-10^-8M、10^-4-10^-8M、10^-4-10^-5M、10^-5-10^-6M、10^-6-10^-7M、10^-7-10^-8M、10^-8-10^-12M、10^-8-10^{- 9}M、10^-9-10^-10M、10^-10-10^-11M、10^-11-10^-12M范围内或者大于10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11或10^-12的亲和力。

在一些实施方案中，在噪声水平以下的第一变化和第二变化之间的差异指示候选结合配偶体是非特异性结合物。在一些实施方案中，噪声水平是0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％。在一些实施方案中，第一变化和第二变化之间的差异为噪声水平以下95％、85％、75％、65％、55％、45％、35％、25％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％。在一些实施方案中，非特异性结合配偶体在游离溶液中对靶生物分子具有在10^-1-10^-2M、10^-2-10^-3M、10^-3-10^-4M范围内或者小于10^-4、10^-3、10^-2或10^-1的亲和力。

在一些方面，至少一个SH活性标记物不与靶蛋白上的天然氨基酸残基结合，而是与工程构建至靶蛋白的特定区域内的氨基酸(例如，工程化的半胱氨酸残基)结合。在一些实施方案中，靶蛋白在多于一个天然氨基酸残基(如半胱氨酸残基)上用SH活性标记物标记，其中，每个天然氨基酸位于靶蛋白的不同区域或结构域中。在另一实施方案中，靶蛋白上所有的SH活性标记物均与靶蛋白的两个或更多个区域中的工程化的(即突变的或置换的)氨基酸残基结合。

在一些方面，靶蛋白上的标记的氨基酸残基可包括但不限于半胱氨酸残基、赖氨酸残基或胺。在其他实施方案中，靶蛋白采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan或丹酰丙氨酸)进行标记。在另一实施方案中，非天然氨基酸是和频产生活性的(SFG活性的)。在一些实施方案中，可将包含具有定制的振动性质的独特探针的UAA工程构建至靶蛋白的不连续位点(例如，在靶蛋白与另一蛋白质之间的相互作用的界面区)处，以通过SFG鉴别位点特异性构象变化。探针部分可包括但不限于NO、CN、SCN或N₃。在一些实施方案中，探针部分提供在约1900到2300cm^-1的频谱范围内的独特的振动特征。在一些实施方案中，靶蛋白中的天然氨基酸残基采用二次谐波活性标记物进行标记。在其他实施方案中，标记的氨基酸残基可以是工程构建至靶蛋白的一级氨基酸序列中的突变的或置换的氨基酸残基(如保守突变的或保守置换的氨基酸残基)。

在其他方面，靶蛋白可与表面结合或在界面上结合，例如上述的任何表面或界面。在一些实施方案中，靶蛋白包括用于将其固定至表面上的亲和标签(例如但不限于聚组氨酸标签，例如His₆)。在另一实施方案中，表面涂覆有镍-寡聚PEG分子以便将His₆标记的蛋白质(例如激酶)固定至表面上，以用于SHG或SFG检测。在又一实施方案中，表面是支持的脂双层表面或脂质类似物双层表面。

在一些方面，候选变构调节剂与SH活性标记的靶蛋白的结合可诱导靶蛋白结构的构象变化。在一些实施方案中，这种构象变化可使SH活性标记物的净取向相对于界面发生变化。在一些实施方案中，在与候选变构调节剂结合后，SH活性标记物的净取向相对于界面改变约1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或更大值中的任一数值。在一个实施方案中，实时检测并记录这种变化。

本文提供了用于确定靶生物分子与候选结合配偶体之间的结合相互作用的特异性的方法。在一些实例中，采用非线性活性标记物，如二次谐波活性部分，在第一位点处标记靶生物分子。然后使标记的蛋白质与候选结合配偶体接触。使用表面选择性技术测量与靶生物分子和候选结合配偶体之间的结合相关联的信号(例如，归一化的二次谐波产生强度)。

随后针对一个或多个位点重复进行相同的程序。例如，靶生物分子可在与相同的候选结合配偶体接触之前在第二位点进行标记(未标记第一位点)。使用表面选择性技术测量与靶生物分子和相同的候选结合配偶体之间的结合相关联的信号(例如，归一化的二次谐波产生强度)。将使用在第一位点标记的靶标产生的信号与使用在第二位点标记的靶标产生的信号进行比较。噪声水平以上的差异(例如，噪声水平以上1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或500％)指示靶生物分子与候选结合配偶体之间的特异性结合。噪声水平以下的差异指示靶生物分子与候选结合配偶体之间的非特异性结合。

本文提供的方法可用于筛查靶向同一靶生物分子的药物候选物文库。例如，可针对文库中的每种药物执行上文概述的程序。对于每种药物，与靶生物分子和药物候选物之间的结合相关联的信号(例如，归一化的二次谐波产生强度)在靶生物分子在第一标记位点上进行标记时测量一次，以及在靶生物分子在第二标记位点上进行标记(未标记第一位点)时测量一次。这两个测量结果之间的差异为药物候选物的结合特异性、药物候选物诱导靶生物分子的构象的能力、药代动力学和药效的指示。基于这两个测量结果之间的差异，可选择药物候选物用于另外的下游筛选(例如，动物试验或临床试验)。

靶生物分子可以是任何生物分子，包括蛋白质、DNA、RNA或寡糖。

可以基于若干标准来选择标记位点。例如，可以基于与结合位点的距离来选择标记位点。在一些方法中，第一标记位点比第二标记的位点更靠近结合位点。第一标记位点和第二标记位点可以都在结合界面内。优选地，并非所有的标记位点都在结合界面内。在一些方法中，至少一个标记位点不在结合界面内。在其他方法中，至少一个标记位点在结合界面内。在一些方法中，第一标记位点在结合界面内而第二位点在结合界面之外。在一些方法中，两个标记位点均在结合界面之外。

D.用于鉴别与G蛋白偶联受体(GPCR)上的变构位点结合的试剂的方法

本文提供了用于鉴别与G蛋白偶联受体(GPCR；例如本文所述的任何GPCR)上的变构位点结合的试剂的方法。将GPCR与天然配体进行预孵育，其中采用与GPCR结合后在界面处具有净取向的二次谐波活性标记物标记天然配体，并建立基线二次谐波信号。在此之后，将GPCR与候选变构调节剂(例如本文所述的任何候选变构调节剂)进行孵育。候选变构调节剂与GPCR的结合产生指示GPCR结构的构象变化的可检测信号。于是，可检测的SHG信号的存在或不存将候选试剂鉴别为GPCR的变构调节剂。在一些实施方案中，已知与GPCR的活性位点结合的天然配体是激素，例如肽激素。

在一些方面，天然配体上的标记的氨基酸残基可包括但不限于半胱氨酸残基、赖氨酸残基或胺。在其他实施方案中，天然配体采用非天然氨基酸(例如但不限于Aladan或丹酰丙氨酸)进行标记。在另一实施方案中，非天然氨基酸是和频产生活性的(SFG活性的)。在一些实施方案中，可将包含具有定制的振动性质的独特探针的UAA工程构建至天然配体的不连续位点处。探针部分可包括但不限于NO、CN、SCN或N₃。在一些实施方案中，探针部分提供在约1900到2300cm^-1的频谱范围内的独特的振动特征。在一些实施方案中，天然配体中的天然氨基酸残基采用二次谐波活性标记物进行标记。在其他实施方案中，标记的氨基酸残基可以是工程构建至天然配体的一级氨基酸序列中的突变的或置换的氨基酸残基(如保守突变的或保守置换的氨基酸残基)。

在其他方面，GPCR可在生物细胞的质膜或合成生物膜上(如在脂质体的表面上)表达。在又一个实施方案中，GPCR嵌入表面，例如支持的脂双层表面或脂质类似物双层表面内。在一些实施方案中，所述生物细胞在其表面上天然地表达GPCR。在其他实施方案中，生物细胞异源表达编码GPCR的核酸，该核酸在生物细胞的表面上表达。用于在细胞表面上异源表达蛋白质(例如GPCR)的方法有许多，并且是本领域公知的技术。

在一些方面，候选变构调节剂与GPCR的结合可诱导GPCR结构的构象变化。在一些实施方案中，这种构象变化可使SH活性标记的天然配体的净取向相对于界面(例如，细胞的质膜或合成生物膜，如脂质体)发生变化。在一些实施方案中，在与候选变构调节剂结合后，SH活性标记物的净取向相对于界面改变约1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或更大值中的任一数值。在一个实施方案中，实时检测并记录这种变化。

V.标记

标记物可连接至蛋白质上不同类型的标记位点。例如，一个或多个标记物可连接至天然蛋白质残基或突变蛋白质位点(例如，引入了非天然氨基酸的位点)或其组合。标记位点可位于蛋白质的表面上或埋藏于蛋白质内。优选地，标记位点位于蛋白质的表面上。连接至非天然氨基酸的标记物允许对埋藏于蛋白质内的残基进行标记。

标记物可连接至任何类型的氨基酸残基。例如，标记物可连接至预先选定的位点，如半胱氨酸残基或赖氨酸残基。标记物也可随机地连接至整个蛋白质中的氨基酸上(例如，通过氨基基团)。标记物可以以不同的速率或不同的占有率与不同的残基(例如半胱氨酸或赖氨酸残基)结合。例如，溶液中的标记物与一个位点处的胺基团的结合可比与另一个位点处的胺基团的结合更快。结合速率还依赖于标记反应条件。例如，pH的变化可意味着一种类型的残基将优先与给定的标记物结合。此外，标记物(例如，染料分子)与待标记的蛋白质的比值可影响所标记的位点的数目。控制所标记的位点的数目和/或位置可以是重要的，例如，用于探查结合相互作用的特异性。对于非天然氨基酸，标记程序可以是为了标记选定的位点而特别制订的。可策略性地选择这种位点，例如，在功能上相关的位点的附近。

在一些实例中，可使一个或多个标记位点更可用于进行标记，例如通过将待标记的蛋白质固定于脂双层上，从而暴露该蛋白质的背朝脂双层的部分。因此，标记可随机地进行和/或针对蛋白质上预选的位置特异性地进行。例如，可在预选的位置(如功能上相关的位点)的附近或周围提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100个或更多个标记物。

可使用各种形式来测定标记的蛋白质。例如，可使用多孔板测定标记的蛋白质。孔中的蛋白质可以以不同的方式(即，在不同的标记位点)进行标记。测定区别标记的蛋白质可以提供蛋白质在与结合配偶体结合后的构象变化的图谱(map)。在一些方法中，可选择标记位点从而使所述位点在蛋白质之上或之内形成预定的模式或网格。在不同的标记位点处检测到的构象变化可指示结合配偶体的结合特异性。

V.试剂盒

在其他方面，包含用于实践本文所公开的方法的组合物的试剂盒构成本发明的另一特征。本文中使用二次谐波产生(SHG)的方法、试剂盒和/或系统(例如，包括任何本文所述的标记物和/或非天然氨基酸)的任何描述可以应用于使用和频产生(SFG)或差频产生(DFG)的方法、试剂盒和/或系统。

在一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含一个或多个用于缀合至靶蛋白的SHG、SFG或DFG-活性部分(如标记物)，例如任何本文中所描述的SHG、SFG或DFG-活性标记物(如染料标记物)。这些可以包括具有针对特定官能团的不同偶联化学反应的染料标记物，例如但不限于，马来酰亚胺标记物(如，PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐))、PyMPO-NHS、噁唑标记物、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)、PyMPO-SE^TM(1-(3-(琥珀酰亚胺氧羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)以及ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在其他实施方案中，染料可以是基于香豆素的染料，例如但不限于酮基香豆素和3,3'-羰基双(7-二乙基氨基香豆素)。

在试剂盒中预期还包含供本文公开的任意方法使用的、用SHG、SFG或DFG-活性标记物标记蛋白质的工具和试剂。这些可以包括但不限于，用于测试不同的标记条件的缓冲液组、用于进行标记反应的缓冲液、在其中进行标记反应的管、用于从未结合的标记物中纯化标记的蛋白质的旋转柱和/或凝胶过滤柱，以及用于洗涤标记的蛋白质的缓冲液。

在另一实施方案中，试剂盒可包含一个或多个用于结合靶蛋白的表面，如本文公开的任何表面。这些表面可以是可重复使用的或消耗性的(即，打算使用一次或有限的次数)。表面可以由玻璃(如载玻片)、塑料、金属、胶乳、橡胶、陶瓷、聚合物(例如但不限于聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯或聚乙烯(例如，聚乙二醇))或任何可以吸附或附着生物分子(如蛋白质)的表面制成。在一些实施方案中，表面是平滑的。然而，在其他实施方案中，表面可包括预先形成的表面特征，例如但不限于沟槽、V形槽、台面结构和/或孔。此外，表面可以根据任何本文所公开的方法进行预清洗。在另外的实施方案中，当表面不包括预先形成的表面特征时，试剂盒可以包含用于在表面上模板化形成孔的粘合垫圈。

在一个实施方案中，可以针对不同的激发几何形状对包含在试剂盒中的表面进行优化，其中传送或生成非线性光学光的模式基于但不限于TIR(全内反射)、透射或反射中的一种或多种。

在其他实施方案中，包含在本文所公开的试剂盒中的表面可以预先涂覆有一种或多种提供适合于连接到靶蛋白上的表面化学反应的分子。这些分子可以包括任何本文公开的分子，例如但不限于醛硅烷、BSA-NHS(BSA-N-羟基琥珀酰亚胺)或寡聚聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中，该分子可以包括亲和标签，如任何本文公开的那些标签。例如，表面可以涂覆有镍-寡聚PEG分子以用于将组氨酸-标记的蛋白质固定至表面上。

在另一实施方案中，包含在试剂盒中的表面可以预先涂覆有支持的脂质(例如但不限于磷脂)双层或支持的脂质类似物双层。该试剂盒的该实施方案还包含用于在任何本文所公开的表面上制备支持的脂双层或支持的脂质类似物双层的脂质或脂质混合物。在一些实施方案中，脂质混合物可以包含磷酸胆碱，例如但不限于DOPC。在一些实施方案中，脂质混合物可以包含但不限于，DDAB(N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵)、DMRIE(N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵)、DODAC(N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵)、DOGS(双十七烷基氨基甘氨酰基亚精胺)、DOPE(1,2-sn-二油酰基磷脂酰乙醇胺)、DOSPA(N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵)、DOTAP(N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵)、DOTMA(N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵)中的一种或多种。在其他实施方案中，任何脂质混合物的脂质或脂质组分可以包括用于与蛋白质结合的亲和标签(例如但不限于镍化脂质，例如，DOGS-Ni-NTA脂质)。

预期在本文所公开的一个或多个试剂盒中还包含与如下的设备一起使用的信号外围设备，该设备用于检测靶蛋白-变构调节剂相互作用和对靶蛋白构象结构的影响，用于确定靶生物分子与候选结合配偶体之间的结合相互作用的特异性，和/或任何使用SHG、SFG或DFG检测和/或测量构象变化的方法。这些可以包括但不限于通滤波器、滤色器、干涉滤波器或其他滤谱器(用于波长选择或从高次谐波中分离基本光)、一个或多个偏振光学器件和/或一个或更多个用于引导和聚焦光束的镜子或透镜。以定量测量为目的的机动化旋转台也可包括在本文所公开的试剂盒中。

在另一实施方案中，蛋白质或酶功能所必需的一种或多种辅因子可以包含在本文所公开的试剂盒中。这些可以包括无机辅因子(例如但不限于铜、铁、镁、锰、钼、镍、钴或锌离子)。这些也可包括有机辅因子，例如但不限于焦磷酸硫胺素、NAD⁺(NADH)、NADP⁺(NADPH)、磷酸吡哆醛、硫辛酰胺、甲基钴胺素、钴胺素、生物素、辅酶A、四氢叶酸、甲萘醌、抗坏血酸、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、辅酶F420、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸鸟苷(GTP)、二磷酸鸟苷(GDP)、S-腺苷基甲硫氨酸、辅酶B、辅酶M、辅酶Q、三磷酸胞苷、谷胱甘肽、血红素、核苷酸糖、吡咯并喹啉、醌和/或四氢生物蝶呤。预期在本文公开的任何试剂盒中还包含已知与一种或多种靶蛋白(例如，泛素或SUMO)结合的一种或多种标记的(如SFG或SHG标记的)肽和/或蛋白质，或一种或多种SFG或SHG标记的抗体或其片段。

在其他实施方案中，试剂盒可包含一种或多种用于向蛋白质中引入SHG-、SFG-或DFG-活性非天然氨基酸(UAA)标记物的组分。这些组分可以包括但不限于无细胞翻译提取物、用于引入特定非天然氨基酸标记物(如，Aladan)的tRNA/tRNA合成酶对和/或反应和洗涤缓冲剂。在一些实例中，这些组分可以允许在靶蛋白上的一个或多个位置选择性地进行标记，例如，用于按照本文所述的特异性方法放置标记物，用于在蛋白质结构之上或之内的功能上相关的位点(例如，位于蛋白质-蛋白质相互作用区域附近的位点，不直接位于任何结合位点附近但在构象上受结合事件影响的位点，等)、活性位点、结合位点或任何其他位点周围的策略性位置放置标记物。试剂盒可以包含用于在预定位置实现选择性标记的工具。

在另一实施方案中，试剂盒可包含一种或多种用于活细胞标记的组分。这些可以包括但不限于，用于细胞附着的表面、SHG和SFG-活性标记物、在细胞标记反应中使用的缓冲液、用于除去未反应的标记物的洗出缓冲液以及细胞生长培养基。

在又一个实施方案中，试剂盒可包含一种或多种用于根据本文所描述的标记技术标记天然残基的组分。这样的组分可包括任何所述的用于标记活细胞的组分、反应和洗涤缓冲液、用于相对于待标记的蛋白质定量标记物(例如，染料)的组分和其他组分。例如，该组分可允许标记条件(例如，标记物浓度、物理和/或化学环境)改变以获得所期望的标记结果。

在一些实施方案中，一个或多个试剂盒可以包含用于标记阵列和/或用于标记多个样品孔的组分。例如，基于对标记条件的精确控制，用于控制标记剂量的组分可以在不同的孔和/或阵列区域中实现不同的标记结果。例如，试剂盒可以包括用于随位置改变标记条件的组分。

进一步地，试剂盒可包括与相应的标记工具(例如，一种或多种用于将SHG、SFG或DFG活性非天然氨基酸(UAA)标记物引入蛋白质中的组分)一起提供的一种或多种标记物。此类试剂可按照试剂盒的应用领域以自定的浓度或量包括在内。

VI.系统

在其他方面，本文提供了下述系统：其用于使用二次谐波产生(SHG)、和频产生(SFG)和/或差频产生(DFG)技术来筛选和鉴别结合至和/或调节靶蛋白上的变构位点的试剂，以确定靶生物分子与候选结合配偶体之间的结合相互作用的特异性，和/或检测和/或测量构象变化。

在一些实施方案中，所述系统包含用SHG-、SFG-或DFG-活性部分(例如，在本文所提供的任何组合物、方法或试剂盒中公开的任何SFG-、SHG-或DFG-活性部分，例如，SFG-、SHG-或DFG-活性染料标记物或SFG-、SHG-或DFG-活性非天然氨基酸)标记的靶蛋白。所述系统还包含用于检测靶蛋白-试剂相互作用的设备，其包括：i)基本光的光源；ii)具有表面连接的探针(例如SHG标记的、SFG标记的或DFG标记的靶蛋白)的基底；和iii)用于测量二次谐波或其他非线性光束的强度的检测器。在该系统的一些实施方案中，通过该设备检测试剂与蛋白质上的变构位点的结合，并且可以将检测器所记录的数据记录在固定的或数据存储介质上，该介质是通过用于读取存储介质的系统可访问的。在其他实施方案中，通过该设备检测靶生物分子与候选结合配偶体之间的结合相互作用的特异性，并且可以将检测器所记录的数据记录在固定的或数据存储介质上，该介质是通过用于读取存储介质的系统可访问的。在另外其他的实施方案中，检测并监测(例如，实时地)在任何结合事件后的一个或多个实时构象变化，并且可以将检测器所记录的数据记录在固定的或数据存储介质上，该介质是通过用于读取存储介质的系统可访问的。

在其他实施方案中，该系统还包括单色器(用于波长选择)、通滤波器、滤色器、干涉滤波器或其他滤谱器(用于波长选择或从高次谐波中分离基本光)、一个或多个偏振光学器件、一个或多个用于引导和聚焦光束的镜子或透镜、计算机控制或软件。在其他实施方案中，传送或生成非线性光学光(例如，SHG)的模式可以基于以下一种或多种手段：TIR(全内反射)、光纤(连接有或未连接有珠子)、透射(基本光穿过样品)、反射(基本光从样品反射)、扫描成像、共聚焦成像或扫描、用于功率积聚的谐振腔、多通设置。

在所述系统的另一个实施方案中，测得的信息可以采取矢量的形式，其可以包括以下一个或多个参数：光的强度(通常由PMT或光电二极管转换为光电压)、光的波长(由单色器和/或滤波器确定)、时间或位置。所述设备的两种一般配置为：图像扫描(基底的成像——作为x，y坐标的函数的强度、波长等)和光谱学(强度、波长等的测量，对于一些平面表面或对于细胞、脂质体或其他颗粒的悬浮液)。

可以通过参考以下实施例进一步理解本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不意味着是限制性的。

实施例

实施例1：通过向激酶活性位点添加合成配体对激酶的变构调节剂的鉴别

激酶为一类主要的药物靶标，当前在临床试验中具有至少30种不同的激酶靶标。大多数激酶药物，被称为I型抑制剂，通过模拟ATP并与ATP直接竞争而与激酶的ATP结合位点结合并起作用，从而将激酶激活环稳定为活性构象。在另一方面，II型抑制剂通过部分地与激活环以及激酶上的其他位点结合而导致激酶的激活环转变成无活性构象。在另一方面，III型激酶抑制剂通过与激酶上除激酶激活环以外的位点结合来变构地调节激酶活性。III型抑制剂的鉴别是困难的，因为确定候选抑制剂与激酶结合的位点通常需要X射线晶体学来辨别。在本实施例中，使用二次谐波产生(SHG)检测对分子进行鉴别，该分子i)在一个或多个标记的位点处改变激酶构象，且ii)在存在与激酶活性位点结合的已知合成配体(伊马替尼)时发生上述改变，从而偏向对按照定义与活性位点以外的位置结合的变构分子的搜索。

材料与方法

激酶产生与标记

如文献(5-7)所述构建、表达和纯化带有N-末端6xHis标签的Abl激酶KD。然后通过标准程序在标记缓冲液(0.1M Tris缓冲液pH 8.0，20mM NaCl，5mM TCEP，5％甘油)中透析该蛋白质。为了进行标记，蛋白质浓度应为2-5mg/mL。更低的浓度是可以接受的，但是标记时间可能需要相应地调整。为了使蛋白质上升到此浓度水平，通过使用Centricon来浓缩蛋白质可能是必要的。

将浓缩的蛋白质(2-5mg/mL)与PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)(Invitrogen)以1:12的摩尔比混合。马来酰亚胺探针对半胱氨酸具有高度特异性。将标记反应中的DMSO浓度限制为约3％或更低。然后将标记反应转移到带有搅拌叶片的干净的锥形玻璃标记瓶中，并将反应置于搅拌盘上的箔包内部，在轻轻搅拌下于室温下放置1小时。采用制造商公布的方案，在测量/加样缓冲液(0.1M Tris，缓冲液pH 8.0，20mM NaCl)的一份浓缩(stacking)缓冲液中用Zeba旋转柱对标记的蛋白质进行柱纯化。在这种情况下，蛋白质：染料的化学计量经分光光度法确定为约1：2。质谱分析证实该探针标记了激酶中的两个半胱氨酸。

玻璃器皿和超声波仪的准备

在开始前(20分钟)用食人鱼洗液(Piranha wash)清洁所有玻璃器皿。小心使用。食人鱼洗液是高度放热的，并且容易爆炸，特别是当与有机物接触时。在通风橱中、在耐热玻璃器皿(例如Pyrex)中，通过先量出H₂O₂再加入醋酸来制备溶液。用氯仿(CHCl₃)漂洗真空瓶。确定DOPC脂质与DGS NTA(Ni)的所需摩尔比，同时注意尽可能地避免暴露于空气。将含有脂质混合物的真空瓶放到Rotovap蒸发器上。蒸发至干(约30秒)，然后用N₂气体吹过蒸发后的制品10分钟以除去残留的CHCl₃。在2mL的diH₂O中重悬浮脂质混合物。剧烈涡旋振荡直到浑浊悬浮液形成(大约5分钟)。将该悬浮液转移至4mL聚苯乙烯试管中。在冰上超声处理脂质混合物，直至溶液澄清。超声波仪被设定为25％功率时这应该需要约60至90秒。

将超声处理后的脂质溶液转移到微量离心管中，并在4℃下以17,000×G离心30分钟。将上清液转移到干净的微量离心管中，并将成品脂质制剂储存在4℃，其稳定大约1个月。

载玻片准备和蛋白质上样

在临施加DOPC/DGS NTA(Ni)脂质前，用食人鱼洗液清洗显微镜载玻片20分钟。在载玻片染色容器中用diH₂O漂洗三次。用压缩氮气干燥载玻片。通过将粘合垫圈附接至用食人鱼洗液清洗过的载玻片上来组装SHG孔(即，每个载玻片16个孔，包含10-20μl体积)。使用装配夹具来对齐垫圈，小心地将载玻片放入夹具中，并用力按压。用PBS或TBS缓冲液1：1稀释DOPC/DGS NTA(Ni)脂质制剂。需要100mM NaCl来减少载玻片的流体静电荷，并使SLB能够形成。将10μl稀释的DOPC/DGS NTA(Ni)脂质移取到载玻片的孔中，并在室温下孵育5分钟。通过将载玻片浸没在缓冲液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器搅动来清洗各孔，在任何时候都要注意不要向孔中引入空气。将液浴中的整个体积的缓冲液更换为新鲜缓冲液，并再重复洗涤步骤两次。向所有孔中加入1：1体积的100mM NiCl₂溶液，并在室温下孵育10分钟。通过将载玻片浸没在缓冲液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器搅动来清洗各孔。将液浴中的整个体积的缓冲液更换为新鲜缓冲液，并再重复洗涤步骤两次。如果有必要，将孔中的缓冲更换为适当的蛋白质上样缓冲液，并将目的靶蛋白加载至孔中。在室温下孵育30至90分钟，随后在开始实验前用测定缓冲液对孔进行彻底的漂洗。

将SUV施加到食人鱼洗液清洗过的Fisher载玻片上，以制作SLB表面。添加NiCl₂10分钟，并在标记缓冲液中洗涤各孔。

将标记的蛋白质以3μM加载到如上所述制备的SLB表面上45分钟，随后进行洗涤。图1显示该标记的蛋白质在SLB上能够通过SHG而检测到。如果添加咪唑，则信号下降到基线水平，表明经由蛋白质的His标签发生了与表面的附着。

将伊马替尼(通过晶体学得知其能够结合至Abl激酶的活性位点口袋(6，8，9))以5μM的浓度加入到孔中并孵育10分钟，以允许结合到ATP口袋(活性位点)。然后向孔中加入候选变构调节剂并监测SHG信号以检测候选剂在标记位点处改变构象的能力。阳性“命中(hit)”被鉴别为在其添加后改变基线信号的候选变构调节剂。

实施例2：标记位于参与配偶体结合事件的靶蛋白区域中的位点

进行多种突变以将半胱氨酸插入到已知参与PI3K效应子结合的H-Ras区域中。可以任选地将天然半胱氨酸残基C118突变为丙氨酸或丝氨酸。使用质谱法和本领域技术人员已知的方案检测突变体被SHG探针PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)标记的能力。例如，已知天然残基酪氨酸Y64参与PI3K结合。因此，根据标准方案(10)制备具有双突变(C118A，Y64C)的重组6×-His标记的(N-末端)H-Ras蛋白质。在室温下，在0.1M Tris pH 8.0、20mM NaCl、0.5mM TCEP、5％甘油中，采用12：1的染料：蛋白质比，使用半胱氨酸反应性SHG探针PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)标记H-Ras一小时。通过凝胶过滤纯化除去未反应的染料。通过质谱法确认第64位半胱氨酸的标记。使蛋白质暴露于候选结合剂分子以仅仅识别那些与本领域技术人员已知的对照(例如，DMSO缓冲液载体)相比以显著方式在C64位点处改变Ras构象的候选结合剂分子。如果工程化的半胱氨酸不能被标记，则对如本文所定义的在功能上与效应子结合事件相关的位点进行突变并测试其被标记的能力。对其他的位点可以进行类似的程序。

实施例3：以两种或更多种不同的方式标记靶标，其中该两种或更多种不同方式中 的至少一种不涉及标记天然残基

寡聚PEG衍生化的载玻片如下制备：将载玻片染色容器在75℃/20英寸汞柱下在真空炉中清洗并干燥，然后使其冷却至室温。向染色容器中加入足够的SAT(PEG4)(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基(硫代四乙二醇)；Pierce)的溶液，以覆盖整个载玻片(约50mL)。将Ultrastick载玻片(氨基封端的硅烷衍生化的载玻片；Thermo)放置在染色架中并浸没在染色容器中。载玻片在通风橱(hood)中在室温下孵育，搅拌2-3小时。然后从SAT(PEG4)溶液中取出载玻片，并将其转移至含有无水氯仿的载玻片洗涤皿中。通过将洗涤皿浸泡在自来水中至其高度的2/3来超声处理载玻片15分钟。将载玻片转移到第二洗涤皿中并用乙醇漂洗各个载玻片，然后用diH₂O漂洗。最后，将清洗后的SAT(PEG4)载玻片放在37℃/20英寸汞柱的真空炉中直至干燥(30至60分钟)。

每孔加入15μL含有1mg/mL马来酰亚胺基-C3-NTA的脱酰溶液。在玻璃罩下于室温孵育20分钟。用diH₂O彻底洗涤，接着每孔加入15μL 100mM NiCl₂/Tris pH7.2溶液。在室温下孵育10分钟。通过浸没在特定实验所需的上样缓冲液中来洗涤各孔。用200μL移液器搅动。(但是，如果实验需要使用PBS，则首先用水将NiCl₂/Tris pH7.2溶液从孔中洗出，然后用所需的缓冲液洗涤)。在任何时候都保持孔用适当的缓冲液湿润。

使用本领域中已知的方法(11-13)创建具有N-末端8xHis标签的二氢叶酸还原酶(DHFR)蛋白质的突变体。在第一种情况下，构建一种突变体，其中两个天然半胱氨酸被除去(C85A和C152A)，而一个不同的残基被突变为半胱氨酸。为了选择突变位点，将该蛋白质的表面上的各种残基突变成半胱氨酸，并测试其被SHG探针标记的能力。在第二种情况下，对野生型蛋白质进行标记，并通过质谱法确认探针与C152的连接。将野生型或重组蛋白质纯化至25mM Tris pH 7.2、150mM NaCl中。按照以下方案，使用PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)对任一蛋白质进行标记。将该蛋白质在25mM Tris pH 7.2、150mM NaCl、1mM TCEP和约50μM的10％甘油中用20：1的染料：蛋白质标记比(DMSO终浓度为5％)进行孵育。该蛋白质在4℃下搅拌过夜，然后凝胶纯化至25mM Tris-HCl pH 7.2、150mM NaCl、1mM TCEP中。该蛋白质经由其His标签被固定到PEG表面上。两种蛋白质都暴露于候选结合剂分子，以测定所述分子是否在不同(半胱氨酸)标记位点改变蛋白质的构象。比较两种不同标记的突变体的SHG响应可以用来确定，例如，给定的候选结合分子在靶蛋白上的位点特异性响应。例如，在来自不同的标记位点的SHG响应相同的情况下，候选结合分子可以是非特异性地与该蛋白质结合。

实施例4：通过SHG技术测试已知变构调节剂与Abl激酶的结合

在本实施例中，利用二次谐波产生(SHG)检测来研究基于X射线晶体学研究(NagarB等,Cell 2003；112(6):859-871)已知会变构结合Abl激酶的GNF-2是否在结合后诱导Abl激酶结构的构象变化。对GNF-2与Abl激酶的野生型和K419C突变体的结合都进行了研究。

材料与方法

载玻片清洁和组装

载玻片在100℃下在食人鱼洗液(70％硫酸/30％过氧化氢)中洗涤20分钟。使其离热并让其冷却10分钟。然后将载玻片从食人鱼洗液中移出，并让过量的溶液从载玻片上滴下。

将载玻片放置在新的容器中，并在dH₂O(超纯18MOhm)中洗涤三次以除去任何残留的食人鱼洗液。从dH₂O中取出载玻片，并通过将氮气吹过载玻片而使其干燥。

将含有16个孔的粘合硅隔离体放置在装配夹具上，并将干燥的载玻片放置在隔离体上，随后用Kimwipe向下按压以使其牢固地粘附。

脂双层和蛋白质上样

小单层囊泡(SUV)溶液通过用PBS按1：1稀释SUV原液(DOPC脂质/DGS-NTA/DHPE德克萨斯红)来制备。向载玻片的各孔中加入10μL此1：1的SUV/PBS溶液，并在表面玻璃下于室温孵育5分钟。然后通过将整个载玻片浸入含有50mL PBS的容器中洗涤载玻片3次。各孔用PBS洗涤，并更换两次200μL吸头。然后从PBS中取出载玻片，各孔用20μL dH₂O洗涤3次。该步骤对于防止在下一步使用的NiCl₂溶液从溶液中沉淀出来是必要的。

向各孔中加入10μL的0.1M NiCl₂储备溶液，从而在孔中产生0.05M NiCl₂的最终溶液。将其在表面玻璃下于室温孵育10分钟。

通过将整个载玻片浸没在含有50mL PBS的容器中洗涤载玻片一次。各孔用PBS洗涤，并更换两次200μL吸头。然后通过将整个载玻片浸没在含有50mL蛋白质特异性反应缓冲液(100mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM TCEP)的容器中洗涤载玻片三次。各孔用反应缓冲液洗涤，并更换两次200μL吸头。

将6×His标记的Abl-KD或KD-K419C(Seeliger等,Structure.2007；15:299-311)加到含有8μL反应缓冲液的各孔中至5μM的终浓度。然后使蛋白质在表面玻璃下在孔中于室温孵育45分钟。

SHG测定

将GNF2(Sigma Aldrich)在DMSO中制备成10mM储液。对于该实验，在反应缓冲液中制备20μM储备溶液，该反应缓冲液具有0.2％的DMSO终浓度。

45分钟后，使用BK-7匹配流体将载玻片放置在Artemis平台中以安装到道威(dove)棱镜上。小心从载玻片下除去所有气泡。使用Artemis平台，进行洗涤前的行扫描以评价每个孔中的SHG水平。

然后用20μL测定溶液(100mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM TCEP，0.2％DMSO)洗涤各孔5次。

然后使用Artemis平台，进行洗涤后的行扫描以获得每个孔中的SHG水平。使用定制编写的软件将平台移动至选定的孔。开始采集并记录数据5-7秒以确定缓冲液注入前的基线。

向孔中注入10μL测定溶液并混合。记录SHG水平的变化约30秒。在此之后，阻断激光输出约5秒，以标记GNF2注入前的阶段。随后去除激光阻断并使SHG信号返回至基线水平。随后记录数据约5秒，接着向孔中注入10μL 20μM GNF2储备溶液。孔中的GNF2终浓度为10μM。随后在注入后记录数据30秒，阻断激光输出约60秒，然后再记录数据30-60秒。

结果

针对缓冲液注入和GNF2注入均测定了SHG水平的变化。通过在注入后15秒获取SHG强度并除以注入前的基线SHG强度来确定所述变化。

来自这些实验的数据表明，用Abl激酶特异性抑制剂GNF2处理野生型Abl-KD或K419C突变体不会导致如通过SHG测到的构象变化。虽然这些ABL-KD片段包含对于GNF2结合而言必需的结构域，但这些片段缺乏在全长Abl激酶中所发现的SH3-SH2结构域，如以下列出的同行评审的出版物中所表明的，对于响应于GNF-2结合的构象变化而言，该SH3-SH2结构域是必需的。因此，SHG数据显示在结合GNF-2后不发生构象变化，如根据以前的X射线共晶体结构数据所预期的。因此，该实施例表明，SHG检测是用于评估分子与靶蛋白的变构结合的强大且相对快速的技术。

实施例5：在天然胺和巯基上均标记蛋白质并且偶联到支持的脂双层上

本实施例表明，蛋白质可以在天然胺和巯基上均被标记并通过组氨酸亲和标签偶联到支持的脂双层上，以供使用SHG技术进行检测。

材料与方法

玻璃器皿和超声波仪的准备：在开始前(20分钟)用食人鱼洗液清洁所有的玻璃器皿。用氯仿(CHCl₃)漂洗真空瓶。随后确定DOPC脂质与DGS NTA(Ni)的所需摩尔比。对于本文所公开的数据，使用掺杂有0.5％德克萨斯红DHPE的3％DGS NTA(Ni)、96.5％DOPC对支持的双层进行成像。将含有脂质混合物的真空瓶置于Rotovap蒸发器上，蒸发至干(大约30秒)。用N₂气体吹过蒸发后的制品上10分钟以除去任何残留的CHCl₃。然后在2mL diH₂O中重悬浮脂质混合物，并且剧烈涡旋振荡直到浑浊悬浮液形成(大约5分钟)。将悬浮液转移至4mL聚苯乙烯试管中。在冰上超声处理脂质混合物，直至溶液澄清。然后将超声处理后的脂质溶液转移到微量离心管中，并在4℃下以17,000×G离心30分钟。随后将上清液转移到干净的微量离心管中。将成品脂质制剂储存在4℃，其大约1个月是稳定的。

蛋白质标记-溶液中半胱氨酸的标记：根据标准方案(6)制备重组His-标记的(N-末端)H-Ras蛋白。根据该方案制备的Ras蛋白与GDP结合。随后在0.1M Tris pH 8.0、20mMNaCl、0.5mM TCEP、5％甘油中，以12：1的染料：蛋白质比，用半胱氨酸反应性染料PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)在室温下标记该蛋白质一小时。通过凝胶过滤纯化出未反应的染料。所得的染料：蛋白质比为0.7：1，并且是通过分光光度法所确定的。单一的半胱氨酸在Ras的X-射线晶体结构中是溶剂可及的(Cys 118)；这一发现符合所测的染料：蛋白质比小于或等于1.0。半胱氨酸标记的Ras随后直接偶联至膜上。

蛋白质标记-溶液中胺的随机标记：使用标准方案在pH 8.3的碳酸氢钠缓冲液(Invitrogen,Inc.)中标记Ras蛋白中的胺基团，并且通过凝胶过滤和透析进行纯化。然后胺标记的Ras直接偶联至膜上。

载玻片准备和蛋白质上样：在临施加DOPC/DGS NTA(Ni)脂质前，用食人鱼洗液清洁显微镜载玻片20分钟，随后在载玻片染色容器中用diH₂O漂洗三次。用压缩氮气干燥载玻片。通过将粘合垫圈附接至用食人鱼洗液清洁过的载玻片上来组装SHG孔。用PBS或TBS缓冲液1：1稀释dDOPC/DGS NTA(Ni)脂质制剂。需要100mM NaCl来减少载玻片的流体静电荷，并使SLB能够形成。将10μL稀释的DOPC/DGS NTA(Ni)脂质移取到载玻片的孔中，随后在室温下孵育5分钟。通过将载玻片浸没在缓冲液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器搅动来清洗各孔两次。要小心确保在任何时候都没有空气被引入孔中。向所有孔中加入1：1体积的100mMNiCl₂溶液并在室温下孵育10分钟。通过将载玻片浸没在缓冲液浴(PBS或TBS)中并用200μL移液器搅动来清洗各孔两次。随后将孔中的缓冲液更换为适当的蛋白质上样缓冲液。

通过采用德克萨斯红-DHPE对表面进行表面荧光成像来证实流体支持的脂双层。如本领域已知的，该双层的侧向移动性通过光漂白后的荧光恢复被证实。随后向孔中加入目的靶蛋白，并在室温下孵育30至90分钟。在开始实验之前用测定缓冲液对孔进行彻底漂洗。

结果

将标记的H-Ras蛋白(通过胺或半胱氨酸)以3μM加载到支持的脂双层(SLB)表面上45分钟，然后进行洗涤。图3显示该标记的蛋白质在SLB上能够通过SHG而检测到。如果加入咪唑，则信号下降至基线水平，表明经由蛋白质的His标签发生了与表面的附着。

本实施例表明，Ras蛋白可以在天然胺和巯基上均被标记并且经由N-末端组氨酸亲和标签偶联到支持的脂双层上，以供使用SHG技术进行检测。

实施例6：检测蛋白质中两个不同位点处的构象变化，以研究试剂结合的特异性及 蛋白质结合位点的功能性

本实施例证明了检测蛋白质中两个不同位点处的构象变化如何提供关于结合剂的特异性的信息。在本实施例中，一个位点是Ras中的溶剂可及的半胱氨酸(C118)，如在解析的Ras蛋白的X射线晶体结构(PDB编码3L8Z、5P21等)中所鉴别的。其他位点为带有自由胺(赖氨酸)的位点。对几种化合物在这两个位置(半胱氨酸位点vs.胺位点)改变构象的能力进行了检测。一种化合物只在胺位点而不在半胱氨酸位点产生构象变化，表明该化合物特异性地结合Ras。

本实施例也表明了如何能标记并研究蛋白质中的功能上相关的位点：半胱氨酸118接近Ras的催化区(半胱氨酸残基的硫原子SG与3L8Z结构中的核苷酸的磷酸原子PA之间的距离为1.6nm)，并因此提供了有关这些化合物是否能够在催化区中特异性地改变构象的信息。

针对通过N端6X组氨酸标签链接到SLB表面上的随机标记的(胺标记的)和半胱氨酸标记的野生型H-Ras蛋白，测试一组三个小分子。

材料与方法

采用两个方案中的一个，将PyMPO-SE^TM(1-(3-(琥珀酰亚胺氧羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)偶联到His标记的野生型H-Ras(Novus)上。

在第一方案中，蛋白质首先结合至支持的脂双层的表面(通过SUV和本领域技术人员已知的标准方案制备得到的含有3％Ni-NTA DOGS的DOPC)，随后于洗涤前暴露于10μMPyMPO-SE^TM(1-(3-(琥珀酰亚胺氧羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)30分钟。

或者，使用标准第二方案在pH8.3的碳酸氢钠缓冲液(Invitrogen,Inc.)中标记Ras并通过凝胶过滤和透析进行纯化。标记的Ras然后直接偶联到膜上。在第二方案中，用半胱氨酸反应性SHG探针PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)标记H-Ras。

根据标准方案(Hall等,2002,Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.,99(19):12138-42)制备重组的His-标记(N-末端)的H-Ras蛋白。根据该方案制备的Ras蛋白与GDP结合。随后在0.1M Tris pH 8.0、20mM NaCl、0.5mM TCEP、5％甘油中，以12：1的染料：蛋白质比，用半胱氨酸反应性染料PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)在室温下标记该蛋白质一小时。通过凝胶过滤纯化出未反应的染料。如通过分光光度法所确定的，所得的染料：蛋白质比为0.7：1。

使三种化合物暴露于标记的Ras：化合物1：117028，5-溴-7-[(4-苯基哌嗪-1-基)甲基]喹啉-8-醇；化合物2：643000，2-(1H-咪唑-2-基甲基)-4-(1H-咪唑-4-基甲基)-1H-咪唑；和化合物3：662796，1H-吡啶并[2,3-E][1,2,4][三氮杂

-1-酮，2,3-二氢-4-[(吗啉代乙酰基)氨基]。

通过以3X浓度(30μM)将5μL化合物1至3分开加到孔中的10μL测定缓冲液中然后轻柔混合，诱发经固定的Ras靶蛋白的构象变化。各化合物的终浓度为10μM。测定缓冲液为20mM Tris pH8.0，150mM NaCl，0.5mM DTT，0.15％DMSO。

结果

结果总结于表1中。化合物1对胺和半胱氨酸标记的蛋白质都表现出活性，而化合物2只对胺标记的蛋白质表现出有活性。化合物3不与Ras蛋白反应，这与标记物的位置无关。暴露于空白双层(无蛋白质)随后进行洗涤的PyMPO-SE^TM(1-(3-(琥珀酰亚胺氧羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物)不产生高于背景的信号。因此，在标记后的蛋白质的存在下检测到的信号是由于固定在膜上的该蛋白质本身的标记引起的。化合物2的位点依赖性活性提供了对其特异性结合蛋白质的额外支持。化合物1，因为它在功能上相关的半胱氨酸位点处有活性，因此很可能对附近(纳米距离)的催化区有影响。图4示出了胺标记的H-Ras靶蛋白的数据。图5示出了半胱氨酸标记的H-Ras靶蛋白的数据。在以20μM的2倍浓度手动注入每种化合物前，采集基线SHG测量结果约5秒钟。在注入后，实时监测构象变化约60秒的一段时间。根据探针在胺或半胱氨酸位点上的安置，观察所施加的化合物的差异活性。

表1：化合物对通过本文中描述的两种不同方法标记的H-Ras的活性的总结表。

该实验表明，SHG可用于鉴别这样的小分子化学化合物：该化合物能够诱导链接到支持脂双层上的Ras蛋白的结构的构象变化。

实施例(其纯粹是本发明的示例，因此不应被认为以任何方式限制本发明)还描述并详述了以上讨论的发明的方面和实施方案。上述实施例和详述是以举例说明的方式提供的，而不是以限制的方式提供的。本说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利均通过引用并入本文，如同具体地和单独地指出每个单独的出版物、专利申请或专利通过引用并入本文那样。特别地，本文引用的所有出版物均明确地通过引用并入本文，用于描述和公开可能与本发明结合使用的组合物和方法学的目的。尽管为了清楚理解的目的已通过举例说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导将会轻易地明白，可以对其进行某些变更和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。

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Claims (23)

1.一种在体外用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：

a.在体外使靶蛋白与结合靶蛋白的活性位点的试剂A接触，其中所述试剂A采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及

b.在体外使靶蛋白与试剂B接触；

c.测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分选自PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADAN^TM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODAN^TM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过试剂A表面上的一个或多个巯基基团与试剂A结合。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-MALEIMIDE^TM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分通过试剂A表面上的一个或多个胺基团与试剂A结合。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分是非天然氨基酸。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述非天然氨基酸是Aladan。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂A为蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物或辅因子中的一种或多种。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述试剂A是激酶信号级联的蛋白质成员。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面和聚乙烯表面。

17.如权利要求16所述的方法，其中使用寡聚PEG分子或脂质对所述表面进行衍生化。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是支持的脂双层。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述靶蛋白包含亲和标签。

21.如权利要求1所述的方法，其中实时检测靶蛋白结构的构象变化。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂A是与靶蛋白活性位点特异性结合的小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂B是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。

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