DE60210456T3

DE60210456T3 - Solubisierung von kapseln polysacchariden

Info

Publication number: DE60210456T3
Application number: DE60210456T
Authority: DE
Inventors: Paolo Costantino
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2001-06-20
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2013-09-05
Anticipated expiration: 2022-06-21
Also published as: ES2347458T3; PT2184071T; EP2277539A2; JP2009114210A; LU91732I9; ES2261705T5; PT2277537E; JP2004536859A; US8753651B2; CA2450203C; TR201808055T4; DK1741442T3; EP2277537B1; EP2229954B1; EP1741442B1; US8889152B2; BE2010C033I2; RU2381814C2; US20090182128A1; RU2528066C2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Impfstoffe, insbesondere gegen Meningokokken-Infektionen und Meningokokken-Erkrankungen.
STAND DER TECHNIK
Neisseria meningitidis ist ein Gram-negatives humanes Pathogen. Sie besiedelt den Kehlkopf und ruft Meningitis sowie gelegentlich auch eine Septikämie bei fehlender Meningitis hervor. Dieser Erreger steht in enger Beziehung zu N. gonorrhoeae, obgleich ein Merkmal, durch das er sich klar von Meningococcus unterscheidet, das Vorliegen einer Polysaccharidkapsel ist, die bei allen pathogenen Meningococci vorliegt.
Auf der Basis des capsulären Polysaccharids des Organismus wurden zwölf Serogruppen von N. meningitidis identifiziert (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y und Z). Das Pathogen der Gruppe A ist in den meisten Fällen am epidemischen Auftreten der Erkrankung in Afrika südlich der Sahara beteiligt. Die Serogruppen B und C sind für die überwiegende Zahl der Fälle in den USA und in den meisten entwickelten Ländern verantwortlich. Die Serogruppen W135 und Y sind für die übrigen Fälle in den USA und den entwickelten Ländern verantwortlich.
Die capsulären Polysaccharide von N. meningitidis werden üblicherweise nach einem Verfahren hergestellt, das die Schritte der Polysaccharidfällung (zum Beispiel mit einem kationischen Detergens), der Ethanolfraktionierung, der kalten Phenolextraktion (zur Proteinentfernung) und der Ultrazentrifugierung (zur Entfernung von LPS) umfasst (vgl. z. B. Lit. 1].
Ein tetravalentes Vakzin aus capsulären Polysacchariden der Serogruppen A, C, Y und W135 ist seit vielen Jahren bekannt [2, 3] und für die humanmedizinische Anwendung zugelassen. Obgleich es bei Heranwachsenden und Erwachsenen wirksam ist, induziert es nur eine geringe Immunantwort und führt nur zu einer kurzen Schutzdauer und kann bei Kindern nicht verwendet werden [vgl. z. B. 4]. Der Grund hierfür liegt darin, dass die Polysaccharide T-Zellen-unabhängige Antigene sind, die eine schwache Immunantwort hervorrufen, die nicht geboostet werden kann. Die Polysaccharide in diesem Impfstoff sind nicht konjugiert und liegen im Verhältnis 1:1:1:1 vor [5]. Das Produkt MENCEVAX ACWY^TM enthält 50 μg jedes dieser Polysaccharide in gereinigter Form nach Rekonstituierung aus der lyophilisierten Form.
Die konjugierten Oligosaccharide der Serogruppe C wurden ebenfalls zur humanmedizinischen Verwendung zugelassen [z. B. Menjugat^®; vgl. Lit. 6]. Es besteht allerdings nach wie vor ein Bedürfnis nach Verbesserungen bei konjugierten Vaccinen gegen die Serogruppen A, W135 und Y sowie ihrer Herstellung.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Konjugation eines bakteriellen capsulären Polysaccharids mit einem Trägerprotein gemäß Anspruch 1 an. Das Konjugat kann zur Herstellung von konjugierten Impfstoffen, insbesondere gegen N. meningitidis der Serogruppen A, W135 und Y, verwendet werden.
Fällung und Solubilisierung mit Ethanol
Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur Fällung von löslichen Polysacchariden bekannt. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung machen von einem oder mehreren kationischen Detergentien Gebrauch. Das Detergens ist das Cetyltrimethylammoniumbromid ('CTAB') [8]. CTAB ist auch als Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Cetrimoniumbromid, Cetavlon und Centimide bekannt.
Die capsulären Polysaccharide werden während der Kultivierung in die Medien hinein freigesetzt. Dementsprechend ist das Ausgangsmaterial für die Fällung typischerweise der Überstand einer zentrifugierten Bakterienkultur oder eine aufkonzentrierte Kultur.
Der Fällungsschritt kann für Polysaccharide selektiv sein, jedoch werden typischerweise auch andere Komponenten (z. B. Proteine, Nucleinsäure, etc.) copräzipitiert.
Das ausgefällte Polysaccharid kann vor der Solubilisierung durch Zentrifugieren gewonnen werden.
Nach der Fällung wird das Polysaccharid (typischerweise in Form eines Komplexes mit dem kationischen Detergens) unter Verwendung von Ethanol wieder solubilisiert. Es wird ein Lösungsmittel verwendet, das für das Polysaccharid relativ selektiv ist, um die Menge der Verunreinigungen (z. B. Proteine, Nucleinsäure, etc.) zu minimieren. Es wurde festgestellt, dass Ethanol diesbezüglich vorteilhaft ist und eine hohe Selektivität für den CTAB-Polysaccharid-Komplex besitzt.
Das Ethanol wird in einer Menge zu dem ausgefällten Polysaccharid zugegeben, dass eine Endkonzentration des Ethanols (bezogen auf den Gesamtgehalt von Ethanol und Wasser) zwischen 75 und 95% resultiert. Das Optimum der Endkonzentration des Ethanols hängt von der Serogruppe des Bakteriums ab, von dem das Polysaccharid gewonnen wird.
Das Ethanol kann in reiner Form oder in mit einem mischbaren Lösungsmittel (z. B. Wasser) verdünnter Form zu dem ausgefällten Polysaccharid zugegeben werden. Bevorzugte Lösungsmittelgemische sind Ethanol:Wasser-Gemische, wobei das bevorzugte Mischungsverhältnis etwa 70:30 bis etwa 95:5 (z. B. 75:25, 80:20, 85:15, 90:10) beträgt.
Im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von capsulären Polysacchariden ist das zweistufige Verfahren der Fällung mit anschließender Ethanolextraktion schneller und einfacher.
Im Gegensatz zu dem in Lit. 9 beschriebenen Verfahren verwendet das Verfahren statt eines anionischen Detergens ein kationisches Detergens. Im Unterschied zu dem Verfahren von Lit. 10 wird das Polysaccharid unter Verwendung von Ethanol und nicht durch Kationenaustausch unter Verwendung von Calcium- oder Magnesiumsalzen resolubilisiert. Im Unterschied zu dem Verfahren von Lit. 11 erfordert die Fällung keinen inerten porösen Träger. Ein weiterer Unterschied zu herkömmlichen Verfahren besteht darin, dass der Alkohol zur Resolubilisierung des Polysaccharids und nicht zu seiner Fällung verwendet wird.
Das bakterielle capsuläre Polysaccharid stammt von N. meningitidis Serogruppen A, W135 oder Y.
Weitere Verarbeitung des solubilisierten Polysaccharids
Nach der Wiederauflösung wird das Polysaccharid zur Entfernung von Verunreinigungen weiter behandelt. Dies ist besonders in Fällen von Bedeutung, in denen auch eine geringfügige Verunreinigung nicht akzeptabel ist (z. B. zur Herstellung von Impfstoffen für die Humanmedizin). Hierbei werden ein oder mehrere Filtrationsschritte angewandt.
Bei der Filtration handelt es sich um die Filtration nach Größe und/oder die Ultrafiltration.
Nach der Filtration zur Entfernung von Verunreinigungen kann das Polysaccharid zur weiteren Behandlung und/oder Verarbeitung gefällt werden. Dies kann geeigneterweise durch Kationenaustausch vorgenommen werden (z. B. durch Zusatz von Calcium- oder Natriumsalzen).
Das Polysaccharid kann chemisch modifiziert werden. Es kann zum Beispiel so modifiziert werden, dass eine oder mehrere Hydroxylgruppen durch blockierende Gruppen ersetzt werden. Dies eignet sich insbesondere für MenA [12].
Das (gegebenenfalls modifizierte) Polysaccharid wird typischerweise unter Bildung von Oligosacchariden hydrolysiert. Dies wird bevorzugt vorgenommen, um einen endgültigen mittleren Polymerisationsgrad (DP) des Oligosaccharids von weniger als 30 zu erzielen (z. B. von 10 bis 20 und bevorzugt von etwa 10 für Serogruppe A; von 15 bis 25 für die Serogruppen W135 und Y, bevorzugt von etwa 15 bis 20; etc.). Die Oligosaccharide sind gegenüber den Polysacchariden zur Verwendung in Impfstoffen bevorzugt. Der Polymerisationsgrad DP kann günstigerweise durch Ionenaustauschchromatographie oder durch kolorimetrische Tests gemessen werden [14].
Wenn Hydrolyse durchgeführt wird, wird das Hydrolysat allgemein nach Größe aufgetrennt, um kurze Oligosaccharide zu entfernen. Dies kann auf verschiedenen Wegen vorgenommen werden, zum Beispiel durch Ultrafiltration und anschließende Ionenaustauschchromatographie. Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von weniger als oder gleich etwa 6 werden bevorzugt für Serogruppe A abgetrennt, und Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von weniger als etwa 4 werden vorzugsweise für die Serogruppen W135 und Y entfernt.
Zur Verstärkung der Immunogenität werden die Polysaccharide oder Oligosaccharide der Erfindung mit einem Träger konjugiert (4). Die Konjugation an Trägerproteine ist ganz besonders für Vakzine für die Pädiatrie geeignet [z. B. Lit. 15] und stellt eine gut bekannte Technik dar [z. B. abgehandelt in Lit. 16 bis 24, etc.].
Das Trägerprotein ist ein Diphtherietoxoid CRM₁₉₇ [25, 26, 27].
Konjugate mit einem Saccharid:Protein-Verhältnis (W/W) von 0,5:1 (d. h. mit Proteinüberschuss) bis 5:1 (d. h. mit Saccharidüberschuss) sind bevorzugt, wobei Konjugate mit einem Verhältnis von 1:1,25 bis 1:2,5 noch bevorzugter sind.
Ein einziges Trägerprotein kann mehrere unterschiedliche Saccharide tragen [39]. Konjugate können in Verbindung mit dem freien Trägerprotein verwendet werden [40].
Es kann eine beliebige geeignete Konjugierungsreaktion herangezogen werden, erforderlichenfalls mit einem geeigneten Linker.
Das Saccharid wird vor der Konjugierung aktiviert oder funktionalisiert. Die Aktivierung kann zum Beispiel Cyanylierungsreagentien, wie CDAP (z. B. 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluorborat [41, 42]) umfassen. Bei anderen geeigneten Techniken werden Carbodiimide, Hydrazide, aktive Ester, Norboran, p-Nitrobenzoesäure, N-Hydroxysuccinimid, S-NHS, EDC, TSTU verwendet; vergleiche auch die Einführung von Lit. 22.
Die Verknüpfungen über eine Linkergruppe können unter Anwendung beliebiger bekannter Verfahren erzeugt werden, zum Beispiel unter Anwendung der Verfahren, die in den Literaturreferenzen 43 und 44 beschrieben sind. Ein Typ der Verknüpfung umfasst die reduktive Aminierung des Polysaccharids, die Kupplung der resultierenden Aminogruppe mit einem Ende einer Adipinsäure-Linkergruppe und die anschließende Kupplung eines Proteins an das andere Ende der Adipinsäure-Linkergruppe [20, 45, 46]. Beispiele für weitere Linker sind B-Propionamido-Linker [47], Nitrophenylethylamin [48], Halogenacylhalogenide [49], glycosidische Verknüpfungen [50], 6-Aminocapronsäure [51], ADH [52], C₄-C₁₂-Gruppen [53], etc. Als Alternative zur Verwendung eines Linkers kann eine direkte Verknüpfung angewandt werden. Direkte Verknüpfungen mit dem Protein können die Oxidation des Polysaccharids und die anschließende reduktive Aminierung mit dem Protein umfassen, wie dies zum Beispiel in den Literaturreferenzen 54 und 55 beschrieben ist.
Ein Verfahren ist bevorzugt, bei dem Aminogruppen in das Saccharid eingeführt werden (z. B. durch Ersetzen von endständigen =O-Gruppen durch -NH₂), anschließend eine Derivatbildung mit einem Adipinsäureester (z. B. Adipinsäure-N-hydroxysuccinimidodiester) vorgenommen wird und dann mit dem Trägerprotein umgesetzt wird.
Nach der Konjugierung können die freien und die konjugierten Saccharide voneinander getrennt werden. Hierzu gibt es zahlreiche geeignete Verfahren, zu denen die hydrophobe Chromatographie, die Tangentialultrafiltration, die Diafiltration, etc. gehören [vergleiche ferner Lit. 56 und 57].
Immunogene Zusammensetzungen und Vakzine
Die Konjugate der Erfindung eignen sich besonders zum Einbringen in immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe. Ein Verfahren der Erfindung kann daher den Schritt der Formulierung des Konjugats als immunogene Zusammensetzung oder Vakzin umfassen.
Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe der Erfindung enthalten typischerweise, zusätzlich zu den Meningokokken-Sacchariden, 'pharmazeutisch akzeptable Träger', was beliebige Träger einschließt, die nicht selbst die Erzeugung von Antikörpern induzieren, die für das Individuum schädlich sind, welches die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Trehalose [121], Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) sowie inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind den Fachleuten auf diesem Gebiet geläufig. Die Vakzine können ferner auch Verdünnungsmittel, wie Wasser, Salzlösung, Glycerin, etc. enthalten. Zusätzlich können auch Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und dergleichen, vorliegen. Eine detaillierte Abhandlung pharmazeutisch geeigneter Excipientien findet sich in Lit. 122.
Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoffe verwendet werden, enthalten eine immunologisch wirksame Menge des Saccharid-Antigens sowie beliebige andere Komponenten, wie oben beschrieben, falls erforderlich. Unter einer 'immunologisch wirksamen Menge' wird verstanden, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in einer einzigen Dosis oder als Teil einer Reihe von Verabreichungen für die Behandlung oder die Vorbeugung wirksam ist. Diese Menge hängt vom Gesundheitszustand und vom körperlichen Zustand des zu behandelnden Individuums, dem Alter, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nichtmenschliche Primaten, Primaten, etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem angestrebten Grad des Schutzes, der Formulierung des Vakzins, der Beurteilung der medizinischen Situation durch den Arzt und anderen relevanten Faktoren ab. Es ist zu erwarten, dass die Menge in einen relativ weiten Bereich fällt, der durch Routineversuche ermittelt werden kann. Die Dosierung bei der Behandlung kann nach einem Einzeldosenschema oder nach einem Mehrfachdosenschema (z. B. einschließlich Booster-Dosen) erfolgen.
Die Vakzine können in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Der Impfstoff kann ein Adjuvans enthalten. Bevorzugte Adjuvantien zur Förderung der Wirksamkeit der Zusammensetzung umfassen, ohne allerdings darauf beschränkt zu sein, folgende Stoffe: (1) Aluminiumsalze (Aluminiumsulfat), wie Aluminiumhydroxide (einschließlich Oxyhydroxiden), Aluminiumphosphate (einschließlich Hydroxyphosphaten), Aluminiumsulfat, etc. [Kapitel 8 und 9 in Lit. 123]; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen (mit oder ohne andere spezifische immunstimulierende Mittel, wie Muramylpeptiden [Muramylpeptide umfassen N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-d-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin-MTP-PE), etc.] oder Bakterienwandbestandteile), wie zum Beispiel (a) MF59^TM [Kapitel 10 in Lit. 123; 124, 125], das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85 (wahlweise mit Gehalt an MTP-PE) enthält und mit einem Microfluidizer zu Submikronpartikeln formuliert ist, (b) SAF, das 10% Squalen, 0,4% Tween 80, 5% mit Pluronic geblocktes Polymer L121 und thr-MDP enthält und entweder zu einer Submikronemulsion mikrofluidisiert oder mit einem Vortexer zur Erzeugung einer Emulsion mit größerer Partikelgröße gemischt ist, und (c) das Ribi^TM-Adjuvanssystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2% Squalen, 0,2% Tween 80 sowie einen oder mehrere Bakterienzellwandbestandteile aus der Gruppe enthält, die besteht aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und Zellwandskelett (CWS), bevorzugt MPL + CWS (Detox^®); (3) Saponin-Adjuvantien [Kapitel 22 von Lit. 123], wie QS21 oder Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), entweder in einfacher Form oder in Form von daraus erzeugten Teilchen, wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe; Kapitel 23 von Lit. 123); die ISCOMs können frei von zusätzlichen Detergentien sein, zum Beispiel Lit. 126; (4) vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA) und unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA); (5) Cytokine, wie Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [127], etc.), Interferone (z. B. Gamma-Interferon), Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), etc.; (6) Monophosphoryllipid A (MPL) oder 3-O-deacyliertes MPL (3dMPL), z. B. Lit. 128 und 129, wahlweise bei im Wesentlichen Fehlen von Aluminiumsulfat bei Verwendung mit Pneumokokken-Sacchariden, z. B. Lit. 13; (7) Kombinationen von 3dMPL mit beispielsweise QS21 und/oder Öl-in-Wasser-Emulsionen, z. B. Lit. 131, 132 und 133; (8) Oligonucleotide, die CpG-Einheiten enthalten (Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849–854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833–10837; Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870–876; Chu et al., J. Exp. Med., 1977, 186, 1623–1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340–2344; Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216–1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546–549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879–2883; Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840–1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570–4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72–78; Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866–873; Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116–2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759–1764; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918–4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394–5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755–4761; und Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898–5906; internationale Patentanmeldungen WO96/02555 , WO98/16247 , WO98/18810 , WO 98/40100 , WO98/55495 , WO98/37919 und WO 98/52581 ), d. h., die mindestens ein CG-Dinucleotid enthalten, wobei wahlweise 5-Methylcytosin anstelle von Cytosin verwendet ist; (8) ein Polyoxyethylenether oder ein Polyoxyethylenester, z. B. Lit. 134; (9) ein Polyoxyethylen-sorbitanester als grenzflächenaktives Mittel in Kombination mit einem Octoxynol [135] oder ein Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxyethylenalkylester als grenzflächenaktives Mittel in Kombination mit mindestens einem zusätzlichen nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel wie einem Octoxynol [136]; (10) ein Saponin und ein immunstimulierendes Oligonucleotid (z. B. ein CpG-Oligonucleotid) [137]; (11) ein immunstimulierendes Mittel und ein partikelförmiges Metallsalz, z. B. Lit. 138; (12) ein Saponin und eine Öl-in-Wasser-Emulsion, z. B. Lit. 139; (13) ein Saponin (z. B. QS21) + 3dMPL + IL-12 (wahlweise + ein Sterin), z. B. Lit. 140; (14) hitzelabiles E. coli-Enterotoxin (”LT”) oder nichttoxisch gemachte Mutanten davon, wie die Mutanten K63 oder R72 (z. B. Kapitel 5 von Lit. 141); (15) Choleratoxin (”CT”) oder nichttoxisch gemachte Mutanten davon [z. B. Kapitel 5 von Lit. 141]; (16) Liposomen [Kapitel 13 und 14 von Lit. 123]; (17) Chitosan [z. B. Lit. 1421; (18) doppelsträngige RNA; (19) Mikropartikel (d. h., Partikel mit einem Durchmesser von ~100 nm bis ~150 μm, bevorzugter mit einem Durchmesser von ~200 nm bis ~30 μm und am meisten bevorzugt mit einem Durchmesser von ~500 nm bis ~10 μm), die aus Materialien bestehen, die biologisch abbaubar und nichttoxisch sind (z. B. eine Poly(α-hydroxysäure), wie Poly(lactid-co-glycolid), eine Polyhydroxybuttersäure, ein Polyorthoester, ein Polyanhydrid, ein Polycaprolacton, etc.), die gegebenenfalls so behandelt sind, dass sie eine negative Oberflächenladung besitzen (z. B. mit SDS) oder eine positive Oberflächenladung aufweisen (z. B. mit einem kationischen grenzflächenaktiven Mittel, wie CTAB), oder (20) andere Substanzen, die als immunstimulierende Mittel zur Förderung der Wirksamkeit der Zusammensetzung wirken [z. B. Kapitel 7 von Lit. 123].
Aluminiumsalze (insbesondere Aluminiumphosphate und/oder Aluminiumhydroxide) und MF59 sind bevorzugt. Wenn ein Aluminiumphosphat verwendet wird, ist es möglich, ein oder mehrere Saccharide am Aluminiumsalz zu adsorbieren, jedoch ist es bevorzugt, die Saccharide nicht am Salz zu adsorbieren; dies wird durch Einbringen von freien Sulfationen in die Lösung (z. B. durch die Verwendung eines Phosphatpuffers) begünstigt. Wenn ein Aluminiumhydroxid verwendet wird, ist es bevorzugt, die Saccharide am Salz zu adsorbieren. Die Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans ist für Saccharide der Serogruppe A besonders vorteilhaft.

Es ist bei den Zusammensetzungen möglich, einige Antigene an einem Aluminiumhydroxid zu adsorbieren, wobei jedoch andere Antigene zusammen mit einem Aluminiumphosphat vorliegen. Für tetravalente Serogruppenkombinationen von N. meningitidis sind zum Beispiel folgende Permutationen verfügbar:

Serogruppe

Aluminiumsalz (H = Hydroxid; P = Phosphat)

A

P

H

P

H

P

H

P

H

C

P

H

P

H

P

H

P

H

P

H

P

W135

P

H

P

H

P

H

P

H

P

Y

P

H

P

H

P

H

P

H

P

Für trivalente Serogruppenkombinationen von N. meningitidis sind folgende Permutationen verfügbar:

Serogruppe Aluminiumsalz (H = Hydroxid; P = Phosphat)

C P H H H P P P H

W135 P H H P H P H P

Y P H P H H H P P
Nach der Formulierung können die Zusammensetzungen der Erfindung dem Individuum direkt verabreicht werden. Die zu behandelnden Individuen können Tiere sein; insbesondere können Menschen behandelt werden. Die Vakzine eignen sich besonders günstig zur Impfung von Kindern und Jugendlichen. Die Verabreichung kann auf dem systemischen Weg und/oder über den Schleimhautweg erfolgen.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise als injizierbare Zusammensetzungen, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die sich zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor der Injektion eignen, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann ferner auch emulgiert oder in die Liposomen eingeschlossen werden, um die Adjuvanswirkung zu verstärken. Die direkte Verabreichung der Zusammensetzungen erfolgt allgemein parenteral (z. B. durch Injektion, entweder subkutan oder intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär oder in den Interstitialraum eines Gewebes hinein). Die Zusammensetzungen können ferner auch in eine Läsion hinein verabreicht werden. Zu anderen Verabreichungsarten gehören die orale oder pulmonale Verabreichung, die Verabreichung über Suppositorien und die transdermale oder transkutane Verabreichung (vgl. z. B. Lit. 143) sowie die Verabreichung über Nadeln und Hyposprays. Das Dosierungsregime kann ein Regime mit einer einzigen Dosis oder ein Regime mit mehreren Dosen sein (z. B. einschließlich Booster-Dosen).
Die Vakzine der Erfindung sind bevorzugt steril. Sie sind vorzugsweise pyrogenfrei. Sie sind bevorzugt gepuffert, z. B. auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 und allgemein auf einen pH-Wert um pH 7. Wenn ein Vakzin ein Aluminiumhydroxidsalz enthält, ist es bevorzugt, einen Histidinpuffer zu verwenden [144].
Die Vakzine der Erfindung können ein grenzflächenaktives Mittel (z. B. ein Tween, wie Tween 80) in geringer Menge enthalten (z. B. < 0,01%). Die Vakzine der Erfindung können einen Zuckeralkohol (z. B. Mannit) oder Trehalose enthalten, z. B. in einer Menge von etwa 15 mg/ml, insbesondere, wenn sie lyophilisiert werden sollen.
Die optimalen Dosen der individuellen Antigene können empirisch ermittelt werden. Die Saccharid-Antigene der Erfindung werden allerdings allgemein in einer Dosis von 0,1 bis 100 μg jedes Saccharids pro Dosis verabreicht, wobei das typische Dosierungsvolumen 0,5 ml beträgt. Die Menge beträgt typischerweise 5 bis 20 μg pro Saccharid pro Dosis. Diese Werte sind als Saccharid gemessen.
Die Impfstoffe gemäß der Erfindung können entweder prophylaktisch (d. h., zur Vorbeugung einer Infektion) oder therapeutisch sein (d. h., zur Behandlung einer Erkrankung nach der Infektion), sind jedoch typischerweise prophylaktisch.
Die Vakzine können in Standard-Tiermodellen getestet werden (vgl. z. B. Lit. 145).
Die Erfindung gibt ferner ein Verfahren gemäß Anspruch 11 an.
Definitionen
Das Wort ”umfassen” bedeutet ”enthalten” sowie ”bestehen aus”; so kann z. B. eine Zusammensetzung, die X ”umfasst”, ausschließlich aus X bestehen oder noch etwas Zusätzliches enthalten, z. B. X + Y.
Das Wort ”etwa” in Verbindung mit einem Zahlenwert x bedeutet zum Beispiel x ± 10%.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wirkung der Veränderung des Verhältnisses Ethanol:Wasser auf die Polysaccharid-Solubilisierung.
2 ist eine Eichkurve, die unter Verwendung von MenA-Polysaccharid-Testproben bei unterschiedlichen Hydrolysezeiten erhalten wurde. Die Kurve zeigt die lineare Beziehung zwischen dem Reziprokwert des Polymerisationsgrades und dem optischen Drehvermögen.
3 ist eine Eichkurve, die unter Verwendung von MenY-Polysaccharid-Testproben bei unterschiedlichen Hydrolysezeiten erhalten wurde. Die Kurve zeigt die lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus des Polymerisationsgrades und KD (Verteilungskoeffizient).
4 erläutert die Herstellung eines Oligosaccharid-Konjugats.
ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
A. Herstellung und Reinigung von Meningococcus-Polysacchariden
Meningokokken der Serogruppen A, W135 und Y wurden in 500 ml-Flaschen, die 150 ml Franz A als Medium enthielten, 12 Stunden bei 35 ± 1°C kultiviert. Das Schütteln wurde mit einer 35 mm-Schüttelmaschine bei einer eingestellten Drehzahl von 150 U/min vorgenommen. 85 ml der Kultur wurden dann als Inoculum in einen 20 l-Fermenter gegeben, der Watson als Medium enthielt. Nach 18,5 Stunden (W135 und Y) oder 16,5 Stunden (A), wenn OD = 10 erreicht war, wurde die Fermentation durch Zusatz von 300 ml Formalin unterbrochen; dann wurde der Fermenter nach 2 Stunden Inkubation auf 10°C abgekühlt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren gewonnen und anschließend filtriert (0,22 μm) und mit einer 30 kDa-Membran ultrafiltriert.
Das rohe konzentrierte Polysaccharid wurde dann durch Zusatz von CTAB in wässeriger Lösung mit einem Gehalt von 100 mg/ml gefällt. Die zugesetzten Volumina sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Nach 12 Stunden bei Raumtemperatur wurden die CTAB-Komplexe durch Zentrifugieren gewonnen. Der CTAB-Komplex wurde durch Zusatz einer 95%-igen Ethanollösung bei Raumtemperatur und 16–20 Stunden kräftiges Rühren extrahiert. Das Volumen an zugesetztem Ethanol ist in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:

Serogruppe Volumen CTAB (ml) Volumen 95%-iges Ethanol (Liter pro kg feuchte Paste)

A 475 3,5 bis 6

W135 200 4 bis 6

Y 650 3,4
Die resultierenden Suspensionen wurden durch ein CUNO 10 SP-Tiefenfilter filtriert. Das Filtrat wurde durch eine CUNO Zetacarbon^®-Kartusche rückgeführt, bis OD_275nm < 0,2 war. Das Zetacarbon-Filtrat wurde dann gesammelt und durch ein 0,22 μm-Filter filtriert. Das Polysaccharid wurde dann aus der Ethanolphase durch Zusatz einer wässerigen 2 M CaCl₂-Lösung (10–12 ml/l EtOH der resultierenden Lösung) gefällt. Das gereinigte Polysaccharid wurde dann durch Zentrifugieren gesammelt, mit 95%-igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Bei anderen Versuchen wurde die Endkonzentration des zur Extraktion verwendeten Ethanols variiert (1). Für das Polysaccharid der Serogruppe A war ein Bereich von 80 bis 95% Ethanol am wirksamsten, wobei die Extraktionswirksamkeit bei niedrigeren Prozentanteilen abfiel. Für die Serogruppe W135 wurde eine gute Extraktion mit 75 bis 90% Ethanol erzielt, wobei 95% weniger wirksam war.
Für die Serogruppe Y wurden die besten Ergebnisse mit 75 bis 85% Ethanol erzielt, wobei höhere Prozentanteile (z. B. 90%, 95%) weniger wirksam waren. Allgemein wurde festgestellt, dass Ethanol-Prozentanteile unterhalb der hier angegebenen zu der Tendenz einer Erhöhung der Co-extraktion von Verunreinigungen wie etwa Proteinen führten. Die Ethanol-Prozentanteile, die in diesem Abschnitt angegeben sind, sind als Endkonzentration ausgedrückt (Ethanol als Prozentanteil am Gesamtvolumen Ethanol + Wasser) und auf einen Wassergehalt in den CTAB-Polysaccharid-Pasten, die durch Zentrifugieren gewonnen wurden, von etwa 50% bezogen (d. h. 500 g H₂O pro kg feuchte Paste). Dieser Wert wurde empirisch bei Versuchen in kleinem Maßstab ermittelt.
B. Konjugation von Polysacchariden der Serogruppe A
a) Hydrolyse
Polysaccharid der Meningokokken-Serogruppe A wurde etwa 3 h bei 73°C in 50 mM Natriumacetatpuffer von pH 4,7 hydrolysiert. Die Hydrolyse wurde so kontrolliert, dass Oligosaccharide mit einem mittleren Polymerisationsgrad (DP) von etwa 10 erhalten wurden, bestimmt durch das Verhältnis (W/W) zwischen dem gesamten organischen Phosphor und dem Monoesterphosphat.
Der Wert DP als Verhältnis von gesamtem organischem Phosphor zu Phosphormonoester ist umgekehrt proportional zum optischen Drehvermögen (α), wie aus 2 hervorgeht. Diese Beziehung kann dazu verwendet werden, das Ausmaß der Hydrolyse bequemer zu überwachen als durch direkte Phosphorbestimmungen.
b) Auftrennung nach der Größe
In diesem Schritt werden die während des Hydrolyseprozesses erzeugten kurzkettigen Oligosaccharide entfernt. Das oben erhaltene Hydrolysat wurde durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 30 kDa einer Ultrafiltration unterzogen (12 Diafiltrationsvolumina, 5 mM Acetatpuffer, pH 6,5). Das zurückgehaltene Material, das die Species mit hohem Molekulargewicht enthielt, wurde verworfen; das Permeat wurde auf eine Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule aufgegeben, die mit 5 mM Acetatpuffer, pH 6,5, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 5 Säulenvolumina (CV) des Äquilibrierungspuffers und dann mit 10 CV 5 mM Acetatpuffer/125 mM NaCl, pH 6,5, gewaschen, um Oligosaccharide mit DP ≤ 6 zu entfernen. Das Oligosaccharid mit der gewünschten Größe wurde dann mit 5 CV 5 mM Acetatpuffer/0,5 M NaCl, pH 6,5, eluiert.
Die eluierte Oligosaccharid-Population besaß einen mittleren Wert DP von etwa 15.
c) Einführung einer primären Aminogruppe am reduzierenden Ende
Die Lösung des größenrichtigen Oligosaccharids wurde mit einem Ammoniumsalz (Acetat oder Chlorid) versetzt bis zu einer Endkonzentration im Bereich von 49 bis 300 g/l; dann wurde Natriumcyanoborhydrid bis zu einer Endkonzentration im Bereich von 12 bis 73 g/l zugesetzt. Nach Einstellung des pH-Werts auf 6–7,3 wurde das Gemisch 5 Tage bei 37°C inkubiert.
Die Amino-Oligosaccharide wurden dann durch Ultrafiltration mit tangentialer Strömung mit einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 1 kDa oder 3 kDa unter Anwendung von 13 Diafiltrationsvolumina von 0,5 M NaCl-Lösung und anschließend von 7 Diafiltrationsvolumina von 20 mM NaCl-Lösung gereinigt. Die gereinigte Lösung des Amino-Oligosaccharids wurde nach dem Verfahren von Lit. 146 auf ihren Phosphorgehalt analysiert (eine chemische Aktivität des Antigens), und die Menge an eingeführten Aminogruppen wurde nach dem Verfahren von Lit. 147 bestimmt.
Die gereinigten Oligosaccharide wurden dann mit einem Rotationsverdampfer zur Entfernung des Wassers getrocknet.
d) Derivatisierung zum aktiven Ester
Die getrockneten Amino-Oligosaccharide wurden in destilliertem Wasser zu einer Aminogruppenkonzentration von 40 mM gelöst; dann wurden 9 Volumina DMSO und anschließend Triethylamin zu einer Endkonzentration von 200 mM zugegeben. Zu der resultierenden Lösung wurde Adipinsäure-N-hydroxysuccinimidodiester bis zu einer Endkonzentration von 480 mM zugegeben.
Die Reaktion wurde unter Rühren bei Raumtemperatur 2 Stunden aufrechterhalten; dann wurde das aktivierte Oligosaccharid mit Aceton (Endkonzentration 80% V/V) gefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt und einige Male mit Aceton gewaschen, um nicht umgesetzten Adipinsäure-N-hydroxysuccinimidodiester und Nebenprodukte zu entfernen. Schließlich wurde das aktivierte Oligosaccharid im Vakuum getrocknet.
Die Menge der in der Oligosaccharidstruktur eingeführten aktiven Estergruppen wurde nach einem kolorimetrischen Verfahren bestimmt, wie es in Lit. 148 beschrieben ist.
e) Konjugation an CRM₁₉₇
Das getrocknete aktivierte Oligosaccharid wurde zu einer Lösung von CRM₁₉₇ in 0,01 M Phosphatpuffer von pH 7,2 mit einem Gehalt an CRM₁₉₇ von 45 mg/ml so zugegeben, dass das Verhältnis aktiver Ester/Protein (mol/mol) 12:1 betrug. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur unter Rühren über Nacht aufrechterhalten. Nach dieser Zeit wurde das Konjugat durch hydrophobe Chromatographie oder Ultrafiltration mit tangentialer Strömung gereinigt. Das gereinigte MenA-CRM₁₉₇-Konjugat wurde sterilfiltriert und bis zur Formulierung des Impfstoffs bei –20°C oder –60°C aufbewahrt.

Die Konjugat wurde analysiert auf den Proteingehalt (microBCA Protein Assay), den Gehalt an MenA-Saccharid (kolorimetrische Analyse des Phosphors), den Gehalt an freiem Saccharid, das HPLC-Profil (an TSKGel G4000SW 7,5 mm ID × 30 cm), und SDS-PAGE. Eigenschaften von typischen Präparationen sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:

Lot-Code	Saccharid (mg/ml)	Protein (mg/ml)	Glycosylierung	KD
210201/A	0,257	0,864	0,3	0,489
210201/BS	0,308	1,354	0,23	0,503
210201/BL	0,28	1,482	0,19	0,501
35I230595	0,138	0,3	0,46
010900	0,092	0,337	0,27
DP29	0,105	0,245	0,43
A1 (nicht nach Größe getrennt)	0,08	0,291	0,27
A2 (nach Größe getrennt)	0,446	2,421	0,18

C. Konjugation von Polysacchariden der Serogruppe W135
a) Hydrolyse
Das Meningokokken-Polysaccharid der Gruppe W wurde etwa 3 Stunden bei 80°C in essigsaurem 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,7, hydrolysiert. Dies führte zu Oligosacchariden mit einem mittleren Polymerisationsgrad DP von etwa 15 bis 20, bestimmt durch das Verhältnis von Sialinsäure (SA) zu reduzierter endständiger SA.
Der Wert DP als Verhältnis der gesamten SA zur reduzierten endständigen SA wird mit dem KD-Wert, der durch HPLC-SEC bestimmt wurde, in Beziehung gesetzt, wie in 3 gezeigt ist. Diese Beziehung kann zu einer bequemeren Überwachung des Ausmaßes der Hydrolyse als durch direkte SA-Messungen herangezogen werden.
b) Trennung nach Größe
Das Hydrolysat wurde durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 30 kDa der Ultrafiltration unterzogen (12 bis 20 Diafiltrationsvolumina von 5 mM Acetatpuffer/15–30 mM NaCl, pH 6,5). Das Retentat, das die Species mit hohem Molekulargewicht enthielt, wurde verworfen, während das Permeat auf eine Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule aufgegeben wurde, die mit 5 mM Acetatpuffer/15 mM NaCl, pH 6,5, äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 10 CV Äquilibrierungspuffer gewaschen, um Oligosaccharide mit DP ≤ 3–4 zu entfernen, und mit 3 CV 5 mM Acetatpuffer/500 mM NaCl, pH 6,5, eluiert.
c) Einführung einer primären Aminogruppe am reduzierenden Ende
Zu der Lösung des größenrichtigen Oligosaccharids wurde Ammoniumchlorid oder Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 300 g/l zugegeben; dann wurde Natriumcyanoborhydrid auf eine Endkonzentration von 49 g/l oder 73 g/l zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Tage bei 50°C inkubiert.
Die Amino-Oligosaccharide wurden dann durch Ultrafiltration mit tangentialer Strömung gereinigt, wie dies für die Serogruppe A beschrieben wurde. Das gereinigte Material wurde auf seinen Gehalt an Sialinsäure (kolorimetrisches Verfahren nach Lit. 149 und/oder Galactose (HPLC) (chemische Aktivitäten des MenW135-Antigens) analysiert. Die gereinigten Oligosaccharide wurden dann zur Entfernung des Wassers mit einem Rotationsverdampfer getrocknet.
d) Derivatisierung zum aktiven Ester
Die getrockneten Amino-Oligosaccharide wurden derivatisiert, wie oben für die Serogruppe A beschrieben wurde.
e) Konjugation mit CRM₁₉₇
Die Konjugation wurde vorgenommen, wie dies oben für die Serogruppe A beschrieben wurde, jedoch wurde zur Reinigung des Konjugats eine Diafiltration mit einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 30 kDa verwendet (50 Diafiltrationsvolumina 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2). Das gereinigte Konjugat wurde sterilfiltriert und bis zur Formulierung des Impfstoffs bei –20°C oder –60°C aufbewahrt.

Das Konjugat wurde auf die gleichen Parameter analysiert, wie dies oben für die Serogruppe A beschrieben wurde. Der Gehalt an MenW-Saccharid wurde durch kolorimetrische Bestimmung der Sialinsäure ermittelt:

Lot-Code	Saccharid (mg/ml)	Protein (mg/ml)	Glycosylierung	KD
Lot 1	5,73	3,52	1,63	0,296
Lot 2/4,5	3,51	2,88	1,22	0,308
Lot 3S	2,49	2,25	1,11	0,380
Lot 3Sd	2,03	2,24	0,91	0,394
Lot 3L	2,32	2,3	1,01	0,391
Lot 3Ld	1,94	2,29	0,85	0,383
Lot 3S/pr. Glic6	0,363	0,82	0,44	0,498
Lot 3S/pr. Glic9	0,424	0,739	0,57	0,447
Lot 3S/pr. Glic12	0,479	0,714	0,671	0,414

D. Konjugation von Polysacchariden der Serogruppe Y
a) Hydrolyse
Das Meningokokken-Polysaccharid der Gruppe Y wurde hydrolysiert, wie dies oben für die Serogruppe W135 beschrieben wurde. Dies ergab Oligosaccharide mit einem mittleren Polymerisationsgrad DP von etwa 15 bis 20, bestimmt durch das Verhältnis von SA zu reduzierter endständiger SA (günstigerweise indirekt gemessen, wie oben unter C(a) beschrieben).
b) Trennung nach Größe, c) Einführung der Aminogruppe, d) Derivatisierung zum aktiven Ester und e) Konjugation
Diese Schritte wurden vorgenommen, wie dies oben für die Serogruppe W135 beschrieben wurde. Das gereinigte Konjugat wurde sterilfiltriert und bis zur Impfstoffformulierung bei –20°C oder –60°C aufbewahrt.
Das Konjugat wurde in der gleichen Weise analysiert, wie oben für die Serogruppe W135 beschrieben wurde:

Lot-Code Saccharid (mg/ml) Protein (mg/ml) Glycosylierung KD

Lot 1A 1,16 0,92 1,26 0,303

Lot 1B 4,57 3,55 1,29 0,339

Lot 2/4,5 2,32 6,1 0,38 0,467

Lot 2/6 1,75 5,73 0,3 0,498
E. Oligosaccharid-Konjugate von MenA, W135 und Y
Die nachstehende Tabelle zeigt Daten, die sich auf Konjugate von MenA, MenW 135 und MenY beziehen, die sich zur Herstellung von Kombinationszusammensetzungen der Erfindung eignen:

A W135 Y

DP nach Größentrennung 16,6 21,9 21,1

Verhältnis Saccharid/Protein 0,5 1,1 0,7

KD 0,44 0,36 0,41

freies Saccharid 5% 10% 5%

freies Protein < 2% < 2% < 2%
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Claims

Verfahren zur Konjugation eines bakteriellen capsulären Polysaccharids mit einem Trägerprotein, das umfasst: Reinigung des Polysaccharids, die folgende Schritte umfasst: (a) Fällung des Polysaccharids unter Verwendung eines oder mehrerer kationischer Detergentien und anschließend (b) Solubilisierung des gefällten Polysaccharids unter Verwendung von Ethanol in einer Endkonzentration zwischen 75 und 95% und anschließend (c) Behandeln des in Schritt (b) erhaltenen Polysaccharids zum Entfernen von Verunreinigungen, wobei die Filtration nach Größe und/oder die Ultrafiltration mit umfasst sind, Aktivierung oder Funktionalisierung des Polysaccharids, und Konjugation des Polysaccharids an ein Trägerprotein, wobei das Trägerprotein ein Diphtherietoxoid CRM₁₉₇ ist, und wobei das bakterielle capsuläre Polysaccharid von N. meningitidis Serogruppe A, W135 oder Y stammt und das kationische Detergens das Cetyltrimethylammoniumbromid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das in Schritt (b) oder Schritt (c) erhaltene Polysaccharid anschließend gefällt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner den Schritt der Hydrolyse zur Erzeugung von Oligosacchariden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, das ferner den Schritt des Sizings zur Entfernung kurzkettiger Oligosaccharide umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner den Schritt des Mischens mit anderen biologischen Molekülen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die weiteren biologischen Moleküle aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus: Saccharid-Antigenen aus der Serogruppe C von N. meningitidis und Protein-Antigenen aus der Serogruppe B von N. meningitidis.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Saccharid-Antigene der Stämme A, C, W135 und/oder Y von N. meningitidis gemischt sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner den Schritt/die Schritte der Vakzinformulierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Schritt/die Schritte der Vakzinformulierung das Mischen des Saccharid-Antigens/der Saccharid-Antigene mit einem Adjuvans umfasst/umfassen.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Adjuvans ein Aluminiumphosphat und/ein Aluminiumhydroxid umfasst.
Verfahren zur Konjugation eines Trägerproteins mit einem bakteriellen capsulären Polysaccharid, das unter Verwendung eines oder mehrerer Detergentien gefällt, dann unter Verwendung von Ethanol als Lösemittel in einer Endkonzentration zwischen 75 und 95% solubilisert, zum Entfernen von Verunreinigungen, wobei Filtration nach Größe und/oder Ultrafiltration mit umfasst sind, behandelt und aktiviert oder funktionalisiert wurde, wobei das bakterielle capsuläre Polysaccharid von N. meningitidis Serogruppe A, W135 oder Y stammt, wobei das Trägerprotein ein Diphtherietoxoid CRM₁₉₇ ist und es sich bei dem kationischen Detergens um das Cetyltrimethylammoniumbromid handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Ethanol in Form eines Ethanol-Wasser-Gemischs im Verhältnis 95:5 vorliegt.