JP2009114210A - 莢膜性多糖類の可溶化および組合せワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】細菌性莢膜性多糖類を精製すること。
【解決手段】沈殿した細菌莢膜多糖は、溶媒としてアルコールを用いて効率的に再溶解され得る。本発明は、細菌莢膜多糖を精製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）この多糖を沈殿させる工程、次いで、（ｂ）エタノールを用いて沈殿した多糖を可溶化する工程を包含する。ＣＴＡＢは、工程（ａ）に用いられ得る。好ましくは、加水分解およびサイジングの後に、得られた物質は、キャリアタンパク質に結合体化され得、そしてワクチンとして処方され得る。また、セログループＡおよびセログループＣに由来の糖を含むワクチンにおいて、本発明は、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比率（ｗ／ｗ）が、＞１であるワクチンを提供する。
【選択図】図１

Description

本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、ワクチン、特に、髄膜炎菌性感染および髄膜炎菌性疾患に対するワクチンの分野にある。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、グラム陰性ヒト病原体である。これは、咽頭にコロニー形成をし、髄膜炎、および、時折、髄膜炎のない敗血症を引き起こす。これは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅと密接に関係しているが、髄膜炎菌を明らかに区別する１つの特徴は、全ての病原性髄膜炎菌に存在する多糖性莢膜の存在である。

生物の莢膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２のセログループ（ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）が同定されている（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）。Ａ群は、サハラ以南のアフリカでの伝染病において最も頻繁に関与している病原体である。セログループＢおよびセログループＣは、米国および大部分の先進国における症例の大部分の原因である。セログループＷ１３５およびセログループＹは、米国および先進国における残りの症例の原因である。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜性多糖類は、多糖類沈殿（例えば、カチオン性界面活性剤を使用する）、エタノール分別、冷フェノール抽出（タンパク質を除くため）および超遠心分離（ＬＰＳを除くため）の工程を包含するプロセスによって代表的に調製される［例えば、参考文献１］。

セログループＡ、セログループＣ、セログループＹおよびセログループＷ１３５由来の莢膜性多糖類の４価のワクチンは、長年公知であり［２、３］、ヒト使用について許可されている。青年および成人において効果的であるが、このワクチンは、乏しい免疫応答および保護の短い期間を誘導し、そして乳児において使用され得ない［例えば、４］。これは、多糖類が、ブーストされ得ない弱い免疫応答を誘導するＴ細胞非依存性抗原であるからである。このワクチンの多糖類は、結合体化されず、１：１：１：１の比で存在する［５］。ＭＥＮＣＥＶＡＸ ＡＣＷＹ^ＴＭは、一旦、その凍結乾燥された形態から再構成すると、５０μｇの各々の精製された多糖類を含む。

結合体化されたセログループＣオリゴ糖はまた、ヒト使用について許可されている［例えば、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ；参考文献６］。しかし、セログループＡ、セログループＷ１３５、およびセログループＹに対する結合体ワクチンおよびそれらの製造における改善に対する必要性が残る。

（発明の開示）
本発明は、細菌性莢膜性多糖類を精製するためのプロセスを提供し、この方法は、（ａ）この多糖類の沈殿の工程、引き続く（ｂ）エタノールを使用する沈殿した多糖類の可溶化の工程を包含する。この多糖類は、ワクチン、例えば、結合体ワクチン、特に、Ｎ．ＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＡ、セログループＷ１３５、およびセログループＹに対する結合体を調製するために使用され得る。

本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
細菌莢膜多糖を精製するためのプロセスであって、該プロセスは、（ａ）該多糖の沈殿工程、次いで、（ｂ）アルコールを用いて該沈殿した多糖の可溶化工程、を包含する、プロセス。
（項目２）
前記工程（ａ）が、臭化セチルトリメチルアンモニウムを使用する、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
工程（ｂ）に用いられるアルコールが、エタノールを含む、項目１または２に記載のプロセス。
（項目４）
前記エタノールが、５０％と９５％との間の最終濃度を有する、項目３に記載のプロセス。
（項目５）
前記細菌莢膜多糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来である、項目１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目６）
前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが、セログループＡ、セログループＷ１３５、またはセログループＹ由来である、項目５に記載のプロセス。
（項目７）
前記細菌莢膜多糖が、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である、項目１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目８）
（ｃ）工程（ｂ）において得られた多糖を処理して、夾雑物を取除く工程、をさらに包含する、項目１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目９）
前記工程（ｃ）が、濾過を包含する、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記工程（ｃ）が、深層濾過、活性炭を通す濾過、サイズ濾過、および／または限外濾過を包含する、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）
工程（ｂ）または工程（ｃ）において得られた多糖が、沈殿される、項目１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１２）
オリゴ糖を形成するための加水分解の工程をさらに包含する、項目１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１３）
短い長さのオリゴ糖を取除くための、サイジングの工程をさらに包含する、項目１２に記載のプロセス。
（項目１４）
キャリアタンパク質に対する結合体化の工程をさらに包含する、項目１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１５）
前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、項目１４に記載のプロセス。
（項目１６）
他の生物学的分子と混合する工程をさらに包含する、項目１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１７）
項目１６に記載のプロセスであって、ここで、前記さらなる生物学的分子が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣに由来の糖抗原、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＢに由来のタンパク質抗原からなる群より選択される、プロセス。
（項目１８）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＡ株、Ｃ株、Ｗ１３５株および／またはＹ株由来の糖抗原が混合される、項目１６に記載のプロセス。
（項目１９）
ワクチン処方の工程をさらに包含する、項目１〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２０）
前記ワクチン処方の工程が、前記糖抗原とアジュバントを混合する工程を包含する、項目１９に記載のプロセス。
（項目２１）
前記アジュバントが、リン酸アルミニウムおよび／または水酸化アルミニウムである、項目２０に記載のプロセス。
（項目２２）
項目１９、２０、または２１に記載のプロセスにより得られ得る、ワクチン。
（項目２３）
患者において免疫応答を惹起させる方法であって、項目２２に記載のワクチンを該患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
エタノールが溶媒として用いられる、沈殿した細菌莢膜多糖を可溶化するためのプロセス。
（項目２５）
前記エタノールが、９５：５のエタノール：水混合物の形態である、項目２４に記載のプロセス。
（項目２６）
前記細菌莢膜多糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来である、項目２４または２５に記載のプロセス。
（項目２７）
前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが、セログループＡ、セログループＷ１３５、またはセログループＹ由来である、項目２６に記載のプロセス。
（項目２８）
少なくともセログループＡおよびセログループＣのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜多糖を含むワクチンであって、ここで、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）が、１より高い、ワクチン。
（項目２９）
前記比が、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上である、項目２８に記載のワクチン。
（項目３０）
（ａ）セログループＷ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖と（ｂ）１つ以上のさらなるセログループのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖との混合物を含むワクチンであって、ここで、成分（ａ）の免疫原性は、成分（ｂ）の非存在下で投与される場合よりも、成分（ｂ）の存在下で投与される場合のほうがより高い、ワクチン。
（項目３１）
セログループＷ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖と１つ以上のさらなるセログループのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖との相乗作用性の組合わせを含む、ワクチン。
（項目３２）
前記１つ以上のさらなるセログループが、セログループＡ、セログループＣおよびセログループＹからなる群より選択される、項目３０または３１に記載のワクチン。
（項目３３）
２つ以上のセログループのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖抗原の混合物を含むワクチンであって、これらの内の１つは、セログループＷ１３５であり、ここで、セログループＷ１３５に由来の糖抗原の免疫原性は、個々の莢膜糖と比較した場合、該混合物において増大される、ワクチン。
（項目３４）
前記莢膜糖が、キャリアタンパク質と結合体化される、項目２８〜３３のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３５）
前記莢膜糖がオリゴ糖である、項目２８〜３４のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３６）
前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、項目３４または３５に記載のワクチン。
（項目３７）
セログループＷ１３５のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖の免疫原性を増大させる方法であって、ここで、該莢膜多糖は、１つ以上のさらなるセログループのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖と混合される、方法。
（項目３８）
前記さらなるセログループが、セログループＡ、セログループＣ、およびセログループＹからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記莢膜糖は、キャリアタンパク質に結合体化される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記莢膜糖がオリゴ糖である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
セログループＡ、セログループＣ、セログループＷ１３５およびセログループＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも２つに由来の莢膜糖を含むワクチンであって、ここで、該莢膜糖が、キャリアタンパク質に結合体化される、ワクチン。
（項目４３）
前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、項目４２に記載のワクチン。
（項目４４）
前記莢膜糖がオリゴ糖である、項目４２または４３に記載のワクチン。
（項目４５）
セログループＡ、セログループＣ、セログループＷ１３５およびセログループＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも２つに由来の莢膜糖を含むワクチンであって、ここで、該莢膜糖がオリゴ糖である、ワクチン。
（項目４６）
前記オリゴ糖が、キャリアタンパク質に結合体化される、項目４５に記載のワクチン。
（項目４７）
前記キャリアタンパク質が、ＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、項目４５に記載のワクチン。
（項目４８）
セログループＣおよびセログループＹに由来の糖を含む、項目４２から４７のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目４９）
セログループＣ、セログループＷ１３５、およびセログループＹに由来の糖を含む、項目４２〜４８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目５０）
前記１つ以上の糖が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、項目４２〜４９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目５１）
前記ワクチンが、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、項目４２〜５０のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目５２）
（ａ）凍結乾燥した形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の莢膜糖；および（ｂ）液体形態のセログループＣ、セログループＷ１３５、およびセログループＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１つ以上に由来の莢膜糖を含む、キット。
（項目５３）
前記１つ以上の糖が、キャリアタンパク質に結合体化される、項目５２に記載のキット。
（項目５４）
前記１つ以上の糖が、オリゴ糖である、項目５２または５３に記載のキット。
（項目５５）
前記１つ以上の糖が、水酸化アルミニウムに吸着される、項目５２、５３、または５４に記載のキット。
（項目５６）
前記成分（ｂ）が、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、項目５２〜５５のいずれか１項に記載のキット。
（項目５７）
凍結乾燥した形態のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の結合体化莢膜オリゴ糖、および（ｂ）液体形態の１つ以上のさらなる抗原を含む、キット。
（項目５８）
項目４２〜５０のいずれか１項に記載のワクチンを調製するための方法であって、該方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の凍結乾燥した莢膜糖と、セログループＣ、セログループＷ１３５、およびセログループＹの１つ以上に由来の莢膜糖とを混合する工程を包含し、ここで、該１以上の糖が、液体形態である、方法。
（項目５９）
前記１つ以上の糖が、キャリアタンパク質に結合体化される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記１つ以上の糖が、オリゴ糖である、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記１つ以上の糖が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、項目５８、５９、または６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ワクチンが、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、項目５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
セログループＡのオリゴ糖結合体およびセログループＣのオリゴ糖結合体を含み、かつ、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバントおよびリン酸緩衝液、または（ｉｉ）水酸化アルミニウムアジュバントおよびヒスチジン緩衝液をさらに含む、免疫原性組成物。

（沈殿およびエタノール可溶化）
可溶性多糖類を沈殿させるための多くの技術が当該分野において公知である。好ましい方法は、１種以上のカチオン性界面活性剤を使用する。界面活性剤は、好ましくは、以下の一般式を有する：

ここで：Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれは、アルキルまたはアリールを示し；あるいは、Ｒ_１およびＲ_２は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、５員または６員の飽和複素環式環を形成し、そしてＲ_３は、アルキルまたはアリールを示し；あるいは、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、この窒素原子において不飽和な５員または６員の複素環式環を形成し、
Ｒ_４は、アルキルまたはアリールを示し、そして
Ｘ⁻は、アニオンを示す。

この方法における使用のための特に好ましい界面活性剤は、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）である。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）は、特に好ましい［８］。ＣＴＡＢはまた、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、セトリモニウムブロミド、ＣｅｔａｖｌｏｎおよびＣｅｎｔｉｍｉｄｅとしても公知である。他の界面活性剤としては、ヘキサジメトリンブロミド塩およびミリスチリルトリメチルアンモニウム塩が挙げられる。

莢膜性多糖類は、培養の間、培地に放出される。従って、沈殿のための開始物質は、代表的に、遠心分離された細菌培養物由来の上清であるか、または濃縮された培養物である。

沈殿工程は、多糖類に対して選択的であり得るが、代表的には、他の成分（例えば、タンパク質、核酸など）もまた共沈する。

沈殿した多糖類は、可溶化の前に遠心分離によって収集され得る。

沈殿の後、多糖類（代表的には、カチオン性界面活性剤との複合体の形態）を、再可溶化する。混入物（例えば、タンパク質、核酸など）を最小化するために、多糖類に対して比較的選択的である溶媒を使用することが好ましい。エタノールは、これに関して有利であることが見出され、そしてＣＴＡＢ多糖類複合体に対して高度に選択的である。他のより低級のアルコールが、使用され得る（例えば、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなど）。

エタノールは、好ましくは、沈殿した多糖類に添加されて、５０％と９０％との間（例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または約９０％）、好ましくは、７５％と９５％の間の最終エタノール濃度（エタノールおよび水の合計含有量に基づく）を与える。最適な最終エタノール濃度は、多糖類が得られる細菌のセログループに依存し得る。

エタノールは、純粋な形態で沈殿した多糖類に添加され得るか、または混和性溶媒（例えば、水）で希釈された形態で添加され得る。好ましい溶媒混合物は、エタノール：水混合物であり、約７０：３０と約９５：５の間（例えば、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０）の好ましい比である。

莢膜性多糖類を調製するための従来のプロセスと比較して、沈殿、引き続くエタノール抽出の２工程プロセスは、より迅速であり、より単純である。

参考文献９に記載されるプロセスと対照的に、このプロセスは、アニオン性界面活性剤よりもむしろカチオン性界面活性剤を使用する。参考文献１０のプロセスとは異なり、多糖類は、カルシウム塩またはマグネシウム塩を使用するカチオン交換によるよりもむしろ、エタノールを使用して再可溶化される。参考文献１１のプロセスとは異なり、沈殿は、不活性な多孔性支持体を必要としない。さらに、先行技術のプロセスとは異なり、アルコールは、多糖類を沈殿させるよりもむしろ再可溶化するために使用される。

細菌莢膜性多糖類は、通常、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ由来である。好ましくは、これは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来（セログループＡ、セログループＢ、セログループＣ、セログループＷ１３５、およびセログループＹを含む）である。好ましいセログループは、セログループＡ、セログループＷ１３５およびセログループＹである。

このプロセスはまた、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（特に、Ｂ型、または「Ｈｉｂ」）由来の莢膜性多糖類およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）由来の莢膜性多糖類を調製するために適切である。

（可溶化多糖類のさらなる処理）
再可溶化の後に、多糖類は、混入物を除くためにさらに処理され得る。これは、微量な混入物でさえ受容可能でない場合（例えば、ヒトワクチン作製のため）に、特に重要である。これは、代表的に、１つ以上の濾過工程を含む。

深層濾過が使用され得る。これは、清澄化のために特に有用である。

活性炭を通す濾過が使用され得る。これは、色素および微量の有機化合物を除去するために有用である。これは、例えば、ＯＤ_{２７５ｎｍ}＜０．２まで、繰り返され得る。

サイズ濾過または限外濾過が使用され得る。

一旦、濾過されて混入物が除去されると、多糖類は、さらなる処理および／またはプロセシングのために沈殿させられ得る。これは、カチオンを交換することによって（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加によって）好都合に達成され得る。

多糖類は、化学的に改変され得る。例えば、この多糖類は、１つ以上のヒドロキシル基をブロッキング基で置換するために改変され得る。これは、ＭｅｎＡについて特に有用である［１２］。セログループＢ由来の多糖類は、Ｎ−プロピオニル化され得る［１３］。

（必要に応じて改変された）多糖は、代表的に加水分解されてオリゴ糖を形成する。好ましくは、これは、３０個よりも少ない（例えば、セログループＡについて１０個と２０個の間、好ましくは１０個前後；セログループＷ１３５およびセログループＹについて１５個と２５個の間、好ましくは１５〜２０個前後；など）オリゴ糖における重合化（ＤＰ）の最終の平均的な程度を得るために実行される。オリゴ糖は、ワクチンにおける使用のために多糖であることが好ましい。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによってか、または比色アッセイによって簡便に測定され得る（１４）。

加水分解が実行される場合、加水分解は、一般的に短い長さのオリゴ糖を取り除くためのサイズにされる。これは、種々の方法（例えば、限外濾過、引き続くイオン交換クロマトグラフィー）によって達成され得る。約６以下の重合化の程度である多糖は、好ましくはセログループＡから除去され、そして約４未満の重合化の程度である多糖は、好ましくはセログループＷ１３５およびセログループＹから除去される。

免疫原性を増強するために、本発明の多糖またはオリゴ糖は、好ましくは、キャリアに結合体化される（図１８）。キャリアタンパク質への結合体化は、小児用ワクチンにとって特に有用であり（例えば、参考文献１５）、そして周知の技術（例えば、参考文献１６〜２４などに総説される）である。

好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素または細菌トキソイド（例えば、ジフテリアまたは破傷風）である。ＣＲＭ_１９７ジフテリアトキソイド（２５、２６、２７）が、特に好ましい。他の好ましいキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（２８）、合成ペプチド（２９、３０）、熱ショックタンパク質（３１、３２）、百日咳タンパク質（３３、３４）、サイトカイン（３５）、リンフォカイン（３５）、ホルモン（３５）、増殖因子（３５）、種々の病原由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（３６）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｉｔｚａｅ由来のプロテインＤ（３７）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ（３８）などが挙げられる。キャリアタンパク質の混合物を使用することは可能である。

０．５：１（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰な糖）との間の、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましく、そして１：１．２５と１：２．５との間の、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体がより好ましい。

単一キャリアタンパク質は、複数の異なる糖を保有し得る（３９）。結合体は、遊離のキャリアタンパク質との結合において使用され得る（４０）。

必要な場合、任意の適切な結合反応は、任意の適切なリンカーとともに使用され得る。

糖は、代表的に、結合の前に活性化されるか、または官能基化される。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（４１、４２など））のようなシアニル化試薬を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性化エステル、ノルボロン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献２２についての序論もまた参照のこと）。

リンカー基を介する結合は、任意の公知の手段（例えば、参考文献４３および４４に記載される手順）を用いてなされ得る。結合の１つの型は、多糖の還元的なアミノ化、生じたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一方の末端との結合、およびタンパク質とアジピン酸リンカー基の他方の末端との結合を含む（２０、４５、４６）。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（４７）、ニトロフェニル−エチルアミン（４８）、ハロアシルハライド（４９）、グリコシド結合（５０）、６−アミノカプロン酸（５１）、ＡＤＨ（５２）、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分（５３）などが挙げられる。リンカーを用いることの代替としては、直接的な結合が使用され得る。タンパク質との直接的な結合は、例えば、参考文献５４および５５に記載されるように、多糖の酸化、その後のタンパク質との還元的アミノ化を含み得る。

アミノ基の糖への導入（例えば、末端の＝Ｏと−ＮＨ_２基とを置換することによる）、続くアジピンジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）を用いる誘導化、およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスが好ましい。

結合後、遊離および結合した糖は分離され得る。多くの適切な方法としては、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる（参考文献５６および５７などもまた参照のこと）。

（糖を含む混合物および組成物）
本発明のオリゴ糖、多糖および結合体は、他の生物学的分子と混合され得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１つより多くのセログループに由来する糖の混合物は、例えば、セログループＡ＋セログループＣ、セログループＡ＋セログループＷ１３５、セログループＡ＋セログループＹ、セログループＣ＋セログループＷ１３５、セログループＣ＋セログループＹ、セログループＷ１３５＋セログループＹ、セログループＡ＋セログループＣ＋セログループＷ１３５、セログループＡ＋セログループＣ＋セログループＹ、セログループＣ＋セログループＷ１３５＋セログループＹ、セログループＡ＋セログループＣ＋セログループＷ１３５＋セログループＹなど由来の糖を含む組成物が好ましい。個々の糖抗原の保護的効力は、それらの結合によって除去されるが、実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少され得ることが好ましい。

セログループＣ由来の糖が使用される場合、好ましくは、これは約１２〜約２２の繰り返し単位を有する。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なるセログループ由来の糖は、同一か、または異なるキャリアタンパク質に結合体化され得る。

混合物がセログループＡおよびセログループＣの両方由来の莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より高い（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより高い）ことが好ましい。驚くべきことに、ＭｅｎＡ成分がＭｅｎＣ成分に対して過剰（質量／用量）に存在する場合、ＭｅｎＡ成分の改善された免疫原性が観察された。

混合物がセログループＷ１３５ならびにセログループＡ、セログループＣおよびセログループＹの少なくとも１つ由来の莢膜糖（例えば、オリゴ糖）を含む場合、ＭｅｎＷ１３５糖の免疫原性は、驚いたことに、単独（同じ投薬量などで）で投与される場合よりも、他のセログループ由来の糖との併用で投与される場合において高くなることが発見された（参考文献５８を参照のこと）。従って、ＭｅｎＷ１３５抗原の免疫応答を誘発する能力は、他のセログループ由来の抗原と併せずに送達される場合の同一の抗原の等しい量によって誘導される免疫応答よりも高い。このような増強された免疫原性は、コントロール動物にＭｅｎＷ１３５抗原を、そして試験動物にこの混合物を投与し、そして標準的なアッセイ（例えば、細菌力価、放射イムノアッセイおよびＥＬＩＳＡなど）を用いて、この２つについての抗体力価を比較することによって決定され得る。セログループＷ１３５由来の糖と他のセログループ由来の糖との、相乗作用性の組合わせを含むワクチンは、免疫学的に有利である。これらは、抗Ｗ１３５応答を増進させ、そして／またはより低いＷ１３５用量を可能にする。

混合物が、セログループＹ、ならびにセログループＣおよびセログループＷ１３５のうちの１つまたは両方由来の莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は１よりも高く（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより高く）そして／あるいはＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は１よりも低い（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５またはそれよりも低い）。

セログループＡ：セログループＣ：セログループＷ１３５：セログループＹ由来の糖についての好ましい比（ｗ／ｗ）は、以下である：１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１。

混合物はまた、タンパク質を含み得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、参考文献５９〜６４）もしくはＯＭＶ調製物（例えば、参考文献６５〜６８など）のセログループＢ由来のタンパク質を含むことが好ましい。

非髄膜炎菌性抗原および非ナイセリア性抗原（好ましくは、髄膜炎菌性成分に対する免疫応答を減少しない抗原）がまた、含まれ得る。例えば、参考文献６９は、Ｈｉｂ糖とともに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＢおよびセログループＣ由来のオリゴ糖の組み合わせを開示する。肺炎球菌、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ジフテリア、破傷風、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ポリオおよび／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の抗原が好ましい。特に好ましい非ナイセリア抗原としては、以下が挙げられる：
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、ＣａｇＡ（７０〜７３）、ＶａｃＡ（７４、７５）、ＮＡＰ（７６、７７、７８）、ＨｏｐＸ（例えば、７９）、ＨｏｐＹ（例えば、７９）および／またはウレアーゼ由来の抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、８０、８１、８２）由来の糖抗原。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化ウイルス）（例えば、８３、８４）。−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）（例えば、８４、８５）、これは、好ましくはリン酸アルミニウム上に吸着されている表面抗原である（８６）。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖抗原（例えば、８７）、好ましくは、リン酸アルミニウムに吸着されていないか、または吸着されている（８８）。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、８９）。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原（例えば、５９〜６２）。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、参考文献９０〜９６）。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原（例えば、９７）。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原（例えば、９８）。
−ＩＰＶのようなポリオ抗原（例えば、９９、１００）。
−凍結乾燥した不活性化ウイルス（例えば、１０２、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ）のような狂犬病抗原（例えば、１０１）。
−麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原（例えば、参考文献１０３の９、１０および１１章）。
−血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原（例えば、参考文献１０３の１９章）。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原（例えば、１０４）。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（連鎖球菌Ｂ群）由来の抗原（例えば、１０５、１０６）。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（連鎖球菌Ａ群）由来の抗原（例えば、１０６、１０７、１０８）。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原（例えば、１０９）。
−ＲＳウイルス（ＲＳＶ（１１０、１１１））および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３（１１２））のようなパラミクソウイルス。
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原（例えば、１１３、１１４、１１５）。
−フラビウイルスファミリー（フラビウイルス属）のウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４つのセログループ、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）由来の抗原。
−ペストウイルス抗原（例えば、伝統的なブタエンテロウイルス、ウシのウイルス性下痢ウイルスおよび／またはボーダー病ウイルス）。
−パルボウイルス抗原（例えば、パルボウイルスＢ１９に由来）。
−破傷風トキソイド（例えば、参考文献１１６）。
−百日咳血液毒（ＰＴ）ならびにＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じて、パータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／または凝集原２および凝集原３との併用（例えば、参考文献１１７および１１８）。
−細胞内百日咳抗原。

混合物は、これらのさらなる１つ以上の抗原を含み得、これは、必要な場合、解毒され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒）。

ジフテリア抗原がこの混合物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原が含まれることもまた好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原が含まれることもまた好ましい。

混合物中の抗原は、代表的に、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。概して、任意の所定の抗原濃度は、抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分である。

混合物においてタンパク質抗原を使用することの代替として、抗原をコードする核酸が使用され得る。従って、混合物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ（例えば、プラスミドの形状である））によって置換され得る。

（多価糖ワクチン）
本発明はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうち、少なくとも２つ（すなわち、２つ、３つまたは４つ）由来の莢膜糖を含むワクチンおよび免疫原性組成物を提供し、ここで、この莢膜糖は、キャリアタンパク質に結合体化されているか、そして／またはオリゴ糖である。このワクチンが、セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のたった２つの結合体化オリゴ糖または多糖を有する場合、これらは、好ましくは、セログループＡおよびＣ由来ではない（参考文献６、１１９および１２０を参照のこと）。好ましい組成物は、セログループＣおよびＹ由来の糖を含む。他の好ましい組成物は、セログループＣ、Ｗ１３５およびＹ由来の糖を含む。

本発明は、セログループＡのオリゴ糖結合体およびセログループＣのオリゴ糖結合体を含み、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバントまたは水酸化アルミニウムアジュバント、および（ｉｉ）緩衝液をさらに含む、免疫原性組成物を提供する。この組成物が、リン酸アルミニウムアジュバントを含む場合、緩衝液は、好ましくはリン酸塩緩衝液であり；この組成物が水酸化アルミニウムアジュバントを含む場合、緩衝液は、好ましくはヒスチジン緩衝液である。

ワクチンが、セログループＡ由来の莢膜糖を含む場合、セログループＡの糖は、その加水分解を最小化するために、使用直前に他の糖と合わせられることが好ましい（Ｈｉｂ糖を参照のこと）。このことは、凍結乾燥形態のセログループＡ成分および液体形態の他のセログループ成分を、使用準備の際に凍結乾燥成分を再構成するために使用される液体成分と共に有することによって、簡便に達成され得る。この液体成分は、好ましくは、アルミニウム塩アジュバントを含むが、一方で、凍結乾燥されたセログループＡ成分は、アルミニウム塩アジュバントを含んでも含まなくてもよい。

従って、本発明は、以下を含むキットを提供する：（ａ）凍結乾燥形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＡ由来の莢膜糖；および（ｂ）液体形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＣ、Ｗ１３５およびＹのうち１つ以上（例えば、１、２、３）由来の莢膜糖。これらの糖は、好ましくは、キャリアタンパク質に結合体化されているか、そして／またはオリゴ糖である。このキットは、２つのバイアルの形態を取り得る。

本発明はまた、本発明のワクチン組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡ由来の凍結乾燥莢膜糖を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣ、Ｗ１３５およびＹのうち１以上（例えば、１、２、３）由来の莢膜糖と混合する工程を包含し、ここで、この１以上の糖は、液体形態である。

本発明はまた、以下を含むキットを提供する：（ａ）凍結乾燥形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡ由来の結合体化莢膜オリゴ糖；および（ｂ）液体形態の１以上のさらなる抗原。このさらなる抗原は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣ由来の莢膜オリゴ糖に結合体化されてもされなくてもよい。

（免疫原性組成物およびワクチン）
本発明の多糖、オリゴ糖および結合体は、免疫原性組成物およびワクチン中に含めることに特に適する。従って、本発明のプロセスは、免疫原性組成物またはワクチンとして、多糖、オリゴ糖または結合体を処方する工程を包含し得る。本発明は、この方法で入手可能な組成物またはワクチンを提供する。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、髄膜炎菌性糖に加えて、代表的に、薬学的に受容可能なキャリアを含み、このキャリアとしては、この組成物を受容する個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的には、大きい、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１２１］、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。ワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含み得る。さらに、補助的物質（例えば、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）が存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、参考文献１２２において利用可能である。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の糖抗原、ならびに必要に応じて、任意の他の上記成分を含む。「免疫学的に有効な量」によって、単一用量または一連の用量の一部としてかのいずれかの、処置または予防のために個体に対して有効な量の投与を意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体条件、年齢、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、合成抗体に対する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの処方、処置を行う医師の、医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的な手順によって決定され得る比較的広い範囲に入ることが予測される。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数の用量スケジュール（例えば、ブースター用量を含む）であり得る。このワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与され得る。

このワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与され得る。

このワクチンは、アジュバントを含み得る。組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム（オキシヒドロキシドを含む）、リン酸アルミニウム（ヒドロキシホスフェートを含む）、硫酸アルミニウムなど［参考文献１２３の第８章および第９章］；（２）水中油エマルジョン処方物（他の特異的な免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド［ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）など］または細菌細胞壁成分を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）ミクロフリューダイザを使用して、ミクロン未満の粒子へと処方されたＭＦ５９^ＴＭ［参考文献１２３の第１０章；１２４、１２５］（５％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％ Ｓｐａｎ ８５を含む（必要に応じて、ＭＴＰ−ＰＥを含む）、（ｂ）ミクロン未満のエマルジョンへと微小流動化されたか、またはより大きい粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされたかのいずれかである、ＳＡＦ（１０％ Ｓｑｕａｌａｎｅ、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％ プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む）、ならびに（ｃ）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（２％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）からなる群由来の１以上の細菌細胞壁成分を含む）；（３）単純な形態またはこれらから生成される粒子の形態のいずれかの、サポニンアジュバント［参考文献１２３の第２２章］（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；参考文献１２３の第２３章）、このＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性剤を欠き得る（例えば、参考文献１２６）；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１２７］など）、インターフェロン（例えば、γ−インターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（６）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、参考文献１２８および１２９）（肺炎球菌の糖（例えば、参考文献１３０）と共に使用する場合、必要に応じて、実質的にミョウバンの非存在下で）；（７）例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの３ｄＭＰＬの組み合わせ（例えば、参考文献１３１、１３２および１３３）；（８）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８６、１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６−１２２４、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７、７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７、１７５９−１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、５３９４−５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、４７５５−４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、５８９８−５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１）（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、必要に応じて、５−メチルシトシンがシトシンの代わりに使用されている）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、参考文献１３４）；（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１３５］または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［１３６］；（１０）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）［１３７］；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、参考文献１３８）；（１２）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、参考文献１３９）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）（例えば、参考文献１４０）；（１４）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはその解毒変異体（例えば、Ｋ６３変異体またはＲ７２変異体）［例えば、参考文献１４１の第５章］；（１５）コレラ毒素（「ＣＴ」）またはその解毒変異体［例えば、参考文献１４１の第５章］；（１６）リポソーム［参考文献１２３の第１３章および第１４章］；（１７）キトサン［例えば、参考文献１４２］；（１８）二重鎖ＲＮＡ；（１９）必要に応じて、負に荷電した界面を有するように（例えば、ＳＤＳで）、または正に荷電した表面を有するように（例えば、カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理された、生体適合性かつ非毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された、微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒子、そして最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）；あるいは（２０）組成物の効力を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質［例えば、参考文献１２３の第７章］。

アルミニウム塩（特に、リン酸アルミニウムおよび／または水酸化アルミニウム）およびＭＦ５９は、本発明の糖抗原との使用のために好ましい。リン酸アルミニウムが使用される場合、このアルミニウム塩に１以上の糖を吸着させることが可能であるが、これらの糖を塩に吸着しないことが好ましく、そしてこのことは、溶液中に遊離のリン酸イオンを含むことによって（例えば、リン酸塩緩衝液の使用によって）促進される。水酸化アルミニウムが使用される場合、糖を塩に吸着させることが好ましい。アジュバントとしての水酸化アルミニウムの使用は、特に、セログループＡ由来の糖について有利である。

本発明の組成物において、いくつかの抗原を水酸化アルミニウムに吸着させるが、他の抗原はリン酸アルミニウムと共に有することが可能である。４価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループの組み合わせについて、例えば、以下の順列が利用可能である：

３価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループの組み合わせについて、以下の順列が利用可能である：

一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得る。処置されるべき被験体は、動物であり得；特にヒト被験体が処置され得る。これらのワクチンは、子供および十代をワクチン接種するために特に有用である。これらは、全身的経路および／または粘膜経路によって送達され得る。

代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして注射可能物として調製され；注射の前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁物に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、アジュバント効果を増強するために、乳濁化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。組成物の直接送達は、一般に、非経口的である（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射もしくは筋内注射のいずれかによるか、または組織の間隙空間に送達される）。これらの組成物はまた、病変部に投与され得る。他の投与の様式としては、経口投与および肺投与、座剤、ならびに経皮適用（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、参考文献１４３を参照のこと）、針および皮下噴射器が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュール（例えば、ブースター用量を含む）であり得る。

本発明のワクチンは、好ましくは滅菌されている。これらは、好ましくは発熱物質を含まない。これらは、好ましくは、例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間、一般には約ｐＨ７で緩衝化されている。ワクチンが水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［１４４］。

本発明のワクチンは、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０））を低レベル（例えば、＜０．０１％）で含み得る。本発明のワクチンは、特にこれらのワクチンが凍結乾燥される場合に、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはトレハロース（例えば、約１５ｍｇ／ｍｌ）を含み得る。

個々の抗原の最適用量は、実験的に評価され得る。しかし、一般に、本発明の糖抗原は、１用量当たり０．１μｇとｌ００μｇとの間の各糖の用量で、０．５ｍｌの代表的な投薬容量で投与される。この用量は、代表的には、１用量の糖当たり５μｇと２０μｇとの間である。これらの値は、糖として測定される。

本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的には予防的である。

本発明は、患者において免疫応答を惹起するための方法を提供し、この方法は、本発明に従うワクチンを患者に投与する工程を包含する。免疫応答は、好ましくは、髄膜炎菌性の疾患に対して保護的であり、そして体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を含み得る。この患者は、好ましくは子供である。

この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対してすでにプライムされた患者において、ブースター応答を惹起し得る。

本発明はまた、動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、本発明の多糖、オリゴ糖または結合体の使用を提供する。この医薬は、好ましくは、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。この医薬は、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａなど）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ、ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ、ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓなど）または肺炎球菌（例えば、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、ｓｅｐｓｉｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａなど）によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のためのものである。従って、細菌性髄膜炎の予防および／または処置が好ましい。

ワクチンは、標準的な動物モデルにおいて試験され得る（例えば、参考文献１４５を参照のこと）。

本発明はまた、沈殿した細菌莢膜多糖を可溶化するためのプロセスを提供し、ここで、エタノールが溶媒として使用される。

（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸから構成され得るか、または何らかの付加物（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含み得る。

数的値ｘに関して、用語「約」とは、例えば、ｘ＋１０％を意味する。

図１は、多糖の可溶化に対する、種々のエタノール：水比の影響を示す。 図２は、オリゴ糖抗原に対する、マウスにおいて獲得されたＩｇＧ力価を示す。図２は、セログループＡのオリゴ糖を用いた結果を示す。 図３は、オリゴ糖抗原に対する、マウスにおいて獲得されたＩｇＧ力価を示す。図３は、セログループＹについての結果を示す。 図４は、オリゴ糖抗原に対する、マウスにおいて獲得されたＩｇＧ力価を示す。図４は、セログループＷ１３５についての結果を示す。 図５ａは、セログループＡおよびＣについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。図５ａは、抗セログループＡ応答を示す。 図５ｂは、セログループＡおよびＣについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。図５ｂは、抗セログループＣ応答を示す。 図６は、セログループＣ、Ｗ１３５およびＹについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたＩｇＧ力価を示す。図６は、抗セログループＷ１３５応答を示す。 図７は、セログループＣ、Ｗ１３５およびＹについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたＩｇＧ力価を示す。図７は、抗セログループＹ応答を示す。 図８は、セログループＣ、Ｗ１３５およびＹについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたＩｇＧ力価を示す。図８は、抗セログループＣ応答を示す。 図９は、セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。図９は、抗セログループＷ１３５応答を示す。 図１０は、セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。図１０は、抗セログループＹ応答を示す。 図１１は、セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹについてのオリゴ糖結合体の混合物を用いてマウスにおいて得られたｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。図１１は、抗セログループＡ応答を示す。 図１２は、異なる加水分解時間における、試験ＭｅｎＡ多糖サンプルを使用して得られた較正曲線である。この曲線は、重合の程度の逆数と旋光能との間の線形関係を示す。 図１３は、異なる加水分解時間における、試験ＭｅｎＹ多糖サンプルを使用して得られた較正曲線である。この曲線は、重合の程度のｌｏｇとＫＤ（分配係数）との間の線形関係を示す。 図１４は、ＩｇＧサブクラスによって分割された、セログループ（１４）Ａ；（１５）Ｃ；（１６）Ｗ１３５および（１７）Ｙについてのオリゴ糖結合体での免疫後にマウスにおいて得られた、ｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。 図１５は、ＩｇＧサブクラスによって分割された、セログループ（１４）Ａ；（１５）Ｃ；（１６）Ｗ１３５および（１７）Ｙについてのオリゴ糖結合体での免疫後にマウスにおいて得られた、ｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。 図１６は、ＩｇＧサブクラスによって分割された、セログループ（１４）Ａ；（１５）Ｃ；（１６）Ｗ１３５および（１７）Ｙについてのオリゴ糖結合体での免疫後にマウスにおいて得られた、ｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。 図１７は、ＩｇＧサブクラスによって分割された、オリゴ糖結合体の４価混合物での免疫後にマウスにおいて得られた、ｐｏｓｔ−ＩＩ ＩｇＧ力価を示す。 図１８は、オリゴ糖結合体の調製を例示する。 図１９は、モルモットモデルにおいて得られた、（Ａ）抗ＭｅｎＡ ＧＭＴおよび（Ｂ）抗ＭｅｎＣ ＧＭＴ（±９５％の信頼区画）を示す。棒上の値は、血清殺菌性アッセイ（ＳＢＡ）力価（すなわち、５０％の殺傷を生じる血清希釈の逆数）である。

（発明を実施するための様式）
（Ａ．髄膜炎菌性多糖の産生および精製）
セログループＡ、Ｗ１３５およびＹの髄膜炎菌を、１５０ｍｌのＦｒａｎｚ Ａを培地として含む５００ｍｌのフラスコ中で、１２時間にわたって３５±１℃で増殖させた。攪拌を、３５ｍｍのスロー（ｔｈｒｏｗ）Ｓｈａｋｅｒを使用して１５０ｒｐｍに設定した。次いで、８５ｍｌの培養物を、培地としてＷａｔｓｏｎを含む２０Ｌの発酵槽に接種した。

１８．５時間後（Ｗ１３５およびＹ）または１６．５時間後（Ａ）、ＯＤ＝１０が達成された場合、この発酵を、３００ｍｌのホルマリンを添加することによって妨害し、次いで、インキュベーションの２時間後、発酵槽を１０℃まで冷却した。上清を、遠心分離、その後の濾過（０．２２μｍ）および３０ｋＤａの膜を用いる限外濾過によって回収した。

次いで、粗製濃縮多糖を、１００ｍｇ／ｍｌの水溶液としてＣＴＡＢの添加によって沈殿させた。添加した容量を、以下の表に示す。室温で１２時間後、ＣＴＡＢ複合体を、遠心分離によって回収した。このＣＴＡＢ複合体を、激しく攪拌しながら、１６〜２０時間にわたって室温にて９５％エタノール溶液を添加することによって抽出した。添加したエタノールの容量を、以下の表に示す：

得られた懸濁物を、ＣＵＮＯ １０ ＳＰ深層フィルタを介して濾過した。濾液を、ＣＵＮＯ ｚｅｔａｃａｒｂｏｎ^ＴＭカートリッジを介して、ＯＤ_{２７５ｎｍ}＜０．２まで再循環させた。次いで、このＺ ｃａｒｂｏｎ濾液を、０．２２μｍフィルタを介して収集および濾過した。多糖を、最終的に、ＣａＣｌ_２ ２Ｍ水溶液（ＥｔＯＨ最終溶液の１０〜１２ｍｌ／ｌ）の添加によって、エタノール相から沈殿させた。次いで、精製した多糖を、遠心分離によって収集し、９５％エタノールで洗浄し、そして減圧下で乾燥させた。

他の実験において、抽出に使用したエタノールの最終濃度は、異なった（図１）。セログループＡの多糖について、８０％と９５％との間のエタノール範囲が最も有効であり、抽出効率は、より低い％では、減少した。セログループＷ１３５について、良好な抽出は、７５％と９０％との間のエタノールで達成され、９５％ではあまり有効でなかった。セログループＹについて、最良の結果は、７５％と８５％との間のエタノールで達成され、より高い％（例えば、９０％、９５％）は、あまり有効でなかった。一般に、本明細書中で報告されるエタノールの％を下回る％は、混入物（例えば、タンパク質）の同時抽出を増加させる傾向があったことに留意のこと。この段落において与えられたエタノールの％は、最終濃度（エタノール＋水の総容量の％としてのエタノール）として表示されており、そして約５０％（すなわち、５００ｇのＨ_２Ｏ／ｋｇ湿性ペースト）の、遠心分離によって回収されるＣＴＡＢ−多糖ペースト中の水含量に基づく。この値は、小さいスケールアップ実験において実験的に決定された。

（Ｂ．セログループＡ多糖の結合）
ａ）加水分解
セログループＡ髄膜炎菌多糖を、７３℃にて約３時間、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７中で加水分解した。加水分解を、平均重合度（ＤＰ）約１０（総有機リンとリン酸モノエステルとの間の（ｗ／ｗ）比により決定される場合）のオリゴ糖を得るよう制御した。

（総有機リン）対（リンモノエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ））のＤＰ比は、図１２に示されるように、旋光能（α）に逆比例する。この関係は、直接的なリン測定よりも好都合に加水分解の程度をモニターするのに使用され得る。

ｂ）サイズ分け（Ｓｉｚｉｎｇ）
この工程は、加水分解プロセスの間に生成される短鎖オリゴ糖を除去する。上記で得られた加水分解産物を、３０ｋＤａカットオフメンブレン（１２ダイアフィルトレーション量の５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．５）を通じて限外濾過した。高いＭｗ種を含む保持物（（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を廃棄し；透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を、５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．５中で平衡化したＱ―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに充填した。次いで、このカラムを、５カラム量（ＣＶ）の平衡緩衝液で洗浄し、次いで、１０ＣＶの５ｍＭ酢酸緩衝液／１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で洗浄して、ＤＰ≦６のオリゴ糖を除去した。次いで、サイズ分けされたオリゴ糖を、５ＣＶの５ｍＭ酢酸緩衝液／０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で溶出した。

溶出したオリゴ糖集団は、約１５の平均ＤＰを有する。

ｃ）還元末端での一級アミン基の導入
アンモニウム塩（酢酸塩または塩酸塩）を、終濃度４９〜３００ｇ／Ｌの範囲で、サイズ分けしたオリゴ糖溶液に添加し、次いで、ナトリウム−シアノ−臭化水素を、終濃度１２〜７３ｇ／Ｌの範囲で添加した。ｐＨを６〜７．３の間に調整した後、この混合物を、３７℃で５日間インキュベートした。

次いで、アミノ−オリゴ糖を、１３ダイアフィルトレーション量の０．５Ｍ ＮａＣｌ、次いで、７ダイアフィルトレーション量の２０ｍＭ ＮａＣｌを用い、１ｋＤａまたは３ｋＤａカットオフメンブレンを用いてタンジェンシャルフロー限外濾過により精製した。精製したアミノ−オリゴ糖溶液を、参考文献１４６の手順によりリン含有量（この抗原の１つの化学活性）について分析し、そして参考文献１４７の手順により導入したアミノ基の量について分析した。

次いで、精製したオリゴ糖を、ロータリーエバポレーターを用いて乾燥し、水を除去した。

ｄ）活性エステルへの誘導体化
乾燥したアミノ−オリゴ糖を、４０ｍＭアミノ基濃度で蒸留水に溶解し、次いで、９容量のＤＭＳＯを添加し、次いで、トリエチルアミンを終濃度２００ｍＭで添加した。得られた溶液に、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、終濃度４８０ｍＭで添加した。

この反応を、室温にて２時間、攪拌下で維持し、次いで、活性化オリゴ糖を、アセトン（８０％ｖ／ｖ終濃度）を用いて沈殿させた。この沈殿を遠心分離により収集し、そしてアセトンを用いて数回洗浄して未反応アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルおよび副産物を除去した。最後に、活性化オリゴ糖を減圧下で乾燥させた。

オリゴ糖構造に導入した活性エステル基の量を、参考文献１４８に記載されるように、比色法により決定した。

ｅ）ＣＲＭ_１９７への結合
乾燥した活性化オリゴ糖を、ＣＲＭ_１９７の４５ｍｇ／ｍｌ溶液を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２に、１２：１の活性エステル／タンパク質（ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ）比で添加した。この反応を、室温にて一晩、攪拌下で維持した。この期間の後、結合体を、疎水性クロマトグラフィーまたはタンジェンシャルフロー限外濾過により精製した。精製ＭｅｎＡ−ＣＲＭ_１９７結合体を滅菌濾過し、そしてワクチン処方まで−２０℃または−６０℃で保存した。

この結合体を、タンパク質含有量（ｍｉｃｒｏＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）、ＭｅｎＡ糖含有量（リンの比色分析）、遊離糖含有量、ＨＰＬＣプロフィール（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷ ７．５ｍｍ ＩＤｘ３０ｃｍにおいて）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥについて分析した。代表的な調製物の特徴を、以下の表に示す。

（Ｃ．セログループＷ１３５多糖の結合）
ａ）加水分解
群Ｗ髄膜炎菌多糖を、８０℃にて約３時間、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７中で加水分解した。これにより、約１５〜２０の平均ＤＰ（シアル酸（ＳＡ）と還元末端ＳＡとの間の比により決定される場合）を有するオリゴ糖が得られた。

（総ＳＡ）対（還元末端ＳＡ）のＤＰ比は、図１３に示されるように、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより決定される場合、ＫＤに関連する。この関係は、直接的なＳＡ測定よりも好都合に加水分解の程度をモニターするのに使用され得る。

ｂ）サイズ分け
この加水分解産物を、３０ｋＤａカットオフメンブレン（１２〜２０ダイアフィルトレーション量の５ｍＭ酢酸緩衝液／１５〜３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を通じて限外濾過した。高いＭＷ種を含む保持物を廃棄し、透過物を、５ｍＭ酢酸緩衝液／１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で平衡化したＱ―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに充填した。次いで、このカラムを、１０ＣＶの平衡緩衝液で洗浄して、ＤＰ≦３〜４のオリゴ糖を除去し、そして３ＣＶの５ｍＭ酢酸緩衝液／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で溶出した。

ｃ）還元末端での一級アミノ基の導入
塩化アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを、終濃度３００ｇ／Ｌで、サイズ分けしたオリゴ糖溶液に添加し、次いで、ナトリウム−シアノ−臭化水素を、４９または７３ｇ／Ｌの終濃度で添加した。この混合物を、５０℃で３日間インキュベートした。

次いで、アミノ−オリゴ糖を、セログループＡについて記載されるようにタンジェンシャルフロー限外濾過により精製した。精製した物質を、シアル酸（参考文献１４９に従う比色方法）および／またはガラクトース（ＨＰＬＣ）（ＭｅｎＷ１３５抗原の化学活性）の含有量について分析した。次いで、精製したオリゴ糖を、ロータリーエバポレーターを用いて乾燥し、水を除去した。

ｄ）活性エステルへの誘導体化
乾燥したアミノ−オリゴ糖を、セログループＡについて上記されるようにして誘導体化した。

ｅ）ＣＲＭ_１９７への結合
結合を、セログループＡについて上記されるように実施した（しかし、結合体を精製するために、３０ｋＤａメンブレンによるダイアフィルトレーションを使用した（５０ダイアフィルトレーション量の１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２））。精製した結合体を滅菌濾過し、そしてワクチン処方まで−２０℃または−６０℃で保存した。

この結合体を、セログループＡについて上記したのと同一のパラメータについて分析した。ＭｅｎＷ糖含有量を、比色シアル酸決定により分析した。

（Ｄ．セログループＹ多糖の結合）
ａ）加水分解
群Ｙ髄膜炎菌多糖を、セログループＷ１３５について上記されるように加水分解した。これにより、約１５〜２０の平均ＤＰ（ＳＡと還元末端ＳＡ（上記Ｃ（ａ）で記載されるように間接的に好都合に測定される）との間の比により決定される場合）を有するオリゴ糖を得た。

ｂ）サイズ分け、ｃ）アミノ基の導入、ｄ）活性エステルへの誘導体化、およびｅ）結合
これらの工程を、セログループＷ１３５について上記されるように実施した。精製した結合体を滅菌濾過し、そしてワクチン処方まで−２０℃または−６０℃で保存した。

この結合体を、セログループＷ１３５について上記されるのと同一様式で分析した。

（Ｅ．個々の結合体の免疫原性）
凍結したバルク結合体を解凍した。それぞれを、２０μｇ糖／ｍｌ、５ｍＭホスフェート、９ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、リン酸アルミニウム（０．６ｍｇ／ｍｌのＡｌ^３＋濃度を得るまで）、ｐＨ７．２の終濃度になるまで攪拌しながら希釈した。次いで、この混合物を、攪拌せずに、２〜８℃で一晩維持し、そして、マウス免疫のために４μｇ糖／ｍｌになるまで生理食塩水でさらに希釈した。

第２セットのワクチンを、同一様式で各セログループについて調製した（しかし、リン酸アルミニウムを添加する代わりに、同量の水を添加した）。

各免疫群につき１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、０．５ｍｌのワクチンを第０週および第４週で２度、ｓ．ｃ．注射した。免疫前、２度目の投薬の前日、および２度目の投薬の２週間後に、採血を行った。（ａ）ミョウバンを含む結合体ワクチンまたは含まない結合体ワクチン、（ｂ）生理食塩水コントロール、および（ｃ）非結合体多糖コントロールを用いて免疫を行った。

特異的な抗多糖ＩｇＧ抗体を、本質的に参考文献１５０に記載されるように、免疫動物の血清中で決定した。個々のマウス血清を、滴定曲線により二連で分析し、そしてＧＭＴを、各免疫群について算出した。力価を、「Ｔｉｔｅｒｕｎ」ソフトウェア（ＦＤＡ）を用いて、Ｍｏｕｓｅ Ｅｌｉｓａ Ｕｎｉｔｓ（ＭＥＵ）で算出した。抗多糖力価の特異性を、競合因子として関連する多糖を用いた競合ＥＬＩＳＡにより決定した。

図２に示されるように、ＭｅｎＡ結合体は、動物中で高い抗体力価を誘導した。予想通り、非結合体多糖は、免疫原性ではなかった。アジュバントとしてのリン酸アルミニウムとの結合体処方物は、結合体単独により得られた力価と比較して、より高いレベルの抗体を誘導した。同様の結果を、ＭｅｎＹ（図３）およびＭｅｎＷ１３５（図４）について観察した。

ｐｏｓｔ−ＩＩ免疫応答のＩｇＧサブクラスを、種々の群について測定した。特異的なサブクラスを、上記Ｅ節において総ＩｇＧ力価の決定に使用したのと同一のＥＬＩＳＡ法を用いて決定した（しかし、二次抗体として、アルカリホスファターゼ−抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ）を用いた）。力価を、１：３２００に希釈した血清を用いて、基質の発色の３０分後に得られたＯＤ_{４０５ｎｍ}として表し、これを図１４（ＭｅｎＡ）、１５（ＭｅｎＷ１３５）、および１６（ＭｅｎＹ）に示す。応答は、主に、サブクラスＩｇＧ１においてであり、これは、Ｔ依存性抗原によりマウス中で優先的に誘導されるサブクラスである。多糖は、本来、免疫学的メモリーを誘導し得ないＴ非依存性抗原であるので、これらのデータは、結合体が所望の効果を有していたことを示す。

ｐｏｓｔ−ＩＩ血清をまた、細菌の補体媒介溶解を測定するインビトロアッセイを用いて、殺菌活性について試験した。ｐｏｓｔ−ＩＩ血清を、アッセイで使用する前に、５６℃で３０分間不活性化し、そして２５％子ウサギ補体を、補体の供給源として使用した。殺菌力価を、以下の菌株に対して５０％の細菌死滅を生じる相互血清希釈物として表した：ＭｅｎＡ Ｇ８２３８、Ａ１、Ｆ６１２４；ＭｅｎＷ１３５ ５５５４（ＯＡｃ＋）および２４２３１７（ＯＡｃ−）；ＭｅｎＹ ２４２９７５（ＯＡｃ−）および２４０５３９（ＯＡｃ＋）。

ＭｅｎＡについての結果は、以下の通りである。

ＭｅｎＷ１３５についての結果は、以下の通りである。

ＭｅｎＹについての結果は、以下の通りである。

（Ｆ．ＭｅｎＣ結合体と組み合わせたＭｅｎＡ結合体の免疫原性）
ＣＲＭ−ＭｅｎＣ濃縮バルク（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｉｔａｌｙ製）を、ＣＲＭ−ＭｅｎＡ濃縮バルク（上記のようにして得た）と混合し、攪拌により希釈および混合した。３つの異なる調製物を作製した。各々は、２０μｇ糖／ｍｌのＭｅｎＡを含むが、異なる量のＭｅｎＣ結合体を含んだ：（ｉ）２０μｇ糖／ｍｌ（ｉｉ）１０μｇ糖／ｍｌ；（ｉｉｉ）５μｇ糖／ｍｌ。従って、ＭｅｎＡ：ＭｅｎＣの比（ｗ／ｗ）は、（ｉ）１：１；（ｉｉ）２：１；（ｉｉｉ）４：１であった。

各調製物はまた、５ｍＭリン酸ナトリウム、９ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、リン酸アルミニウム（０．６ｍｇ／ｍｌのＡｌ^３＋濃度を与えるまで）、ｐＨ７．２を含んだ。次いで、各混合物を、攪拌せずに、２８℃で一晩維持し、そしてさらにマウス免疫前に生理食塩水で１：５に希釈した。

第２セットのワクチンを、同一の様式で調製した（しかし、リン酸アルミニウムを添加する代わりに、同量の水を添加した）。

６つのワクチン各々について、１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、上記のように免疫した。コントロール群は、生理食塩水またはＭｅｎＡ結合体のみを受けた。

ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについての抗多糖抗体を、上記のように決定した。

ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ結合体の混合物を用いて得られた結果は、Ａ成分とＣ成分との間の比（ｗ／ｗ）が、ＭｅｎＡの免疫原性に対して重要な役割を果たすことを、はっきりと示している。

ＭｅｎＡ結合体コントロールを用いて得られた特異的な抗ＭｅｎＡｐＳ力価は、同一投薬量で、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣの組み合わせよりも高かった（ミョウバンアジュバントを含む場合も含まない場合も）（図５ａ）。より少量のＭｅｎＣ結合体を、この組み合わせにおいて使用した場合、より良好な抗ＭｅｎＡｐＳ力価が、ＭｅｎＡ結合体成分により誘導された。同時に、抗ＭｅｎＣ力価は、受容可能な程度を維持した（図５ｂ）。

モルモットモデルを用いた実験もまた行った。以前のように同一のリン酸アルミニウムアジュバント（非晶質ヒドロキシリン酸、０．８４と０．９２との間のＰＯ_４／Ａｌモル比、０．６ｍｇＡｌ^３＋／ｍｌ）を用いて、３つの異なる調製物を作成した。

＊糖として表す
これらの調製物を、生理食塩水で１：２に希釈し、そしてこれを用いてモルモットを免疫した。各免疫群につき５匹のモルモット（Ｈａｒｔｅｌｌｅｙ系統、雌、４５０〜５００グラム）に、０．５ｍｌのワクチンを、第０日および第２８日で２度、注射した。採血を、最初の免疫前、次いで第４２日に行った。血清を、ＥＬＩＳＡおよび血清殺菌アッセイ（ＭｅｎＡ株ＭＫ８３／９４またはＭｅｎＣ株Ｃ１１に対する）による分析まで−７０℃で保存した。結果を図１９に示す。

（Ｇ．セログループＣ、Ｗ１３５、およびＹの組み合わせワクチン）
セログループＣ、Ｗ１３５、およびＹ由来の多糖の結合体を、上記のように混合して、各結合体につき終濃度２０μｇ糖／ｍｌとした。このワクチンは、５ｍＭリン酸ナトリウムおよび９ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の終濃度を含んだ。一晩保存した後、この混合物を、免疫のために、各結合体につき４μｇ糖／ｍｌを含むよう希釈した。

免疫および分析を、以前のように実施した。

この結果は、ＭｅｎＷ１３５結合体の免疫原性が、ＭｅｎＷ１３５結合体単独で得られる免疫原性と比較した場合、ＭｅｎＣおよびＭｅｎＹ結合体と組み合わせて投与された場合に増強されることを示す（図６）。ＭｅｎＹの免疫原性は、この組み合わせにおいて、個々の結合体で得られた免疫原性に匹敵し（図７）、そしてＭｅｎＣ結合体の免疫原性にも匹敵した（図８）。

（Ｈ．セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの組み合わせワクチン）
セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ由来の多糖の結合体を、上記のように混合して、セログループＡ、Ｗ１３５、およびＹ結合体について２０μｇ糖／ｍｌ、そしてセログループＣ結合体について５μｇ糖／ｍｌの終濃度とした。このワクチンは、５ｍＭリン酸ナトリウムおよび９ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、リン酸アルミニウム（０．６ｍｇ／ｍｌのＡｌ^３＋濃度を与えるまで）、ｐＨ７．２の終濃度を含んだ。次いで、この混合物を、攪拌せずに、２〜８℃で一晩維持し、そしてさらに、Ａ、Ｗ１３５、およびＹ結合体については４μｇ糖／ｍｌ、ならびにＣ結合体については１μｇ糖／ｍｌとなるよう生理食塩水で希釈した。この希釈混合物を免疫のために使用した。

免疫および分析を以前のように実施した（コントロールは、セログループＣを除く個々の結合体を含んだ）。

図９は、以前のように、ＭｅｎＷ１３５結合体の免疫原性が、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、およびＭｅｎＹ結合体と組み合わせて投与される場合に増強されたことを示す。図１０は、ＭｅｎＹ結合体の免疫原性が、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、およびＭｅｎＷ１３５結合体と組み合わせて送達される場合、有意に異ならないことを示す。図１１は、ＭｅｎＡ結合体の免疫原性が、ＭｅｎＣ結合体を低用量（１／４）で投与した場合でさえも、組み合わせにおいて顕著に減少することを示す。この抗原性の競合は、非結合四価（ＡＣＷＹ）多糖ワクチンにおいて見られない［５］。

（Ｉ．凍結乾燥したセログループＡ抗原）
セログループＡ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は特に、加水分解に対して感受性である。従って、ＭｅｎＡ莢膜オリゴ糖の結合体を、投与時の再構成の容易な凍結乾燥状態で調製した。再構成後に以下の成分を単一用量で与える成分を有する凍結乾燥形態を、調製した。

この組成物は、アジュバントを含まない。２つのアジュバントを、その再構成のために調製した。

＊非晶質ヒドロキシホスフェート、０．８４と０．９２との間のＰＯ_４／Ａｌモル比
注入のために水で再構成した場合、糖成分の安定性は以下の通りであった。

同じ４週の期間にわたって、ｐＨは、２〜８℃と３６〜３８℃との両方においてｐＨ７．２で安定であり、タンパク質含有量は、約２４．５μｇ／ｍｌで安定であり、そして水分含有量は、２．５％より下であった。

２〜８℃でリン酸アルミニウムアジュバント溶液により再構成し、そしてその温度で保存した場合、安定性は以下の通りであった。

（Ｊ．セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ（凍結乾燥したセログループＡ結合体）の組み合わせワクチン）
水酸化アルミニウムアジュバント（２ｍｇ／ｍｌ）に吸着させたかまたはリン酸アルミニウムアジュバント（１０ｍＭリン酸緩衝液の存在下で、非晶質ヒドロキシホスフェート、０．８４と０．９２との間のＰＯ_４／Ａｌモル比、０．６ｍｇ／ｍｌのＡｌ^３＋）と混合されたかのいずれかのＭｅｎＣ、Ｗ１３５、およびＹ成分の三価混合物を調製した。２つの三価混合物の組成は以下の通りであった：

＊非晶質ヒドロキシホスフェート、０．８４と０．９２との間のＰＯ_４／Ａｌモル比
水酸化物混合物については、糖成分の安定性は以下の通りであった：

同じ４週の期間にわたり、ｐＨは、２〜８℃と３６〜３８℃との両方で、７．１５±０．０５で安定であった。

リン酸塩混合物については、糖成分の安定性は、以下の通りであった。

同じ４週の期間にわたり、ｐＨは、２〜８℃と３６〜３８℃との両方で、７．０５±０．０５で安定であった。

三価液体組成物を希釈し、そして０．５ｍｌを用いて凍結乾燥したＭｅｎＡ結合体を再構成した。得られた三価混合物を、１群あたり１０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（雌６〜８週齢）に、第０日と第２８日で皮下投与した。この混合物は、１用量あたり２μｇの各糖結合体を含んだ。これは、単一ヒト用量（ＳＨＤ）の１／５を表す。コントロールは、生理食塩水または非結合相同多糖であった。採血を、免疫前、次いで第４２日に実施し、血清を−７０℃で保存した。ＩｇＧを、上記のように決定した。

使用される全ての結合体は、動物中で安全でありかつ免疫原性であった。ＧＭＴｐｏｓｔ−ＩＩ ＥＬＩＳＡ力価（９５％信頼区間）は以下の通りであった。

図１７は、（１７Ａ）ＭｅｎＡ；（１７Ｂ）ＭｅｎＣ；（１７Ｃ）ＭｅｎＷ１３５；および（１７Ｄ）ＭｅｎＹについてのＩｇＧサブクラス分析の結果を示す。ＩｇＧ１は、明らかに、最も突出したサブクラスである。

血清殺菌力価は、以下の通りであった。

（Ｋ．セログループＡ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの組み合わせワクチン（異なる用量））
マウスを上記のように免疫した（しかし、ワクチン組成物は、異なる比の種々のオリゴ糖結合体を含んだ）。用量は、０．５、１、２、または４μｇ／用量と様々であった。凍結乾燥ＭｅｎＡ−オリゴ結合体を、全ての実験で使用した。

ＥＬＩＳＡ力価は、以下の通りであった。

血清殺菌力価は、以下の通りであった。

第２セットの実験を、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについては２μｇ／ｍｌの糖の用量、ＭｅｎＹについてはその半分の用量、そしてＭｅｎＷ１３５についてはその１／４の用量を用いて実施した。ＥＬＩＳＡ力価は、以下の通りであった。

血清殺菌力価は、以下の通りであった。

（Ｌ．ＭｅｎＡ、Ｗ１３５、およびＹオリゴ糖結合体）
以下の表は、本発明の組み合わせ組成物を作製するのに適したＭｅｎＡ、ＭｅｎＷ１３５、およびＭｅｎＹ結合体に関するデータを示す。

本発明は、例示のみの目的で記載されており、そして本発明の範囲および意図を維持しつつ改変がなされ得ることが理解される。

（参考文献：これらの内容は、本明細書中でその全体が援用される）

Claims (39)

1. （ａ）凍結乾燥した形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の結合体化莢膜糖；ならびに（ｂ）液体形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＷ１３５およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＹのうち１つ以上に由来する莢膜糖を含む、キット。
2. （ｂ）の糖のうち１つ以上がキャリアタンパク質に結合体化される、請求項１に記載のキット。
3. 前記キャリアタンパク質がＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、請求項２に記載のキット。
4. Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の前記莢膜糖が、細菌毒素または細菌トキソイドに結合体化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
5. 前記細菌毒素または細菌トキソイドは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたはＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドである、請求項４に記載のキット。
6. 前記結合体化が、前記糖へのアミノ基の導入、続くアジピンジエステルを用いる誘導化、およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスによって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキット。
7. Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の前記結合体化莢膜糖が、０．５：１と５：１との間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット。
8. 前記糖の１つ以上が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキット。
9. 前記成分（ｂ）が、アルミニウム塩アジュバントを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
10. 前記成分（ｂ）が、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、請求項９に記載のキット。
11. 前記糖の１つ以上が、オリゴ糖である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
12. 前記セログループＡの糖が、１０と２０との間の平均重合度を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキット。
13. 前記成分（ｂ）が、セログループＷ１３５に由来の糖を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキット。
14. 前記セログループＷ１３５の糖が、１５と２５との間の平均重合度を有する、請求項１３に記載のキット。
15. 前記成分（ｂ）が、セログループＹに由来の糖を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキット。
16. 前記セログループＹの糖が、１５と２５との間の平均重合度を有する、請求項１５に記載のキット。
17. 前記成分（ｂ）が、セログループＣに由来の糖を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキット。
18. 前記セログループＣの糖が、１２〜２２の繰り返し単位を有する、請求項１７に記載のキット。
19. セログループＡの糖の、セログループＣの糖に対する比（ｗ／ｗ）が、１より高い、請求項１７または１８に記載のキット。
20. セログループＡの糖の、セログループＣの糖に対する比（ｗ／ｗ）が、２：１である、請求項１９に記載のキット。
21. 前記（ｂ）の糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣ、セログループＷ１３５およびセログループＹに由来する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のキット。
22. セログループＡに由来する糖：セログループＣに由来する糖：セログループＷ１３５に由来する糖：セログループＹに由来する糖の比（ｗ／ｗ）が２：１：１：１である、請求項２１に記載のキット。
23. （ａ）凍結乾燥した形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の結合体化莢膜オリゴ糖；ならびに（ｂ）液体形態の１つ以上のさらなる抗原を含む、キット。
24. ２つのバイアルの形態である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
25. Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂに由来の糖抗原をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
26. 用量が、１用量当たり５μｇと２０μｇとの間の各糖の用量である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のキット。
27. Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡ、セログループＣ、セログループＷ１３５およびセログループＹのうち少なくとも２つに由来の結合体化莢膜糖を含むワクチンを調製するための方法であって、該方法は、（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＡに由来の莢膜糖の凍結乾燥した結合体と、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣ、セログループＷ１３５およびセログループＹのうち１つ以上に由来の莢膜糖の液体形態の結合体とを混合する工程を包含する、方法。
28. 前記（ｉｉ）の糖が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＣ、セログループＷ１３５およびセログループＹに由来する、請求項２７に記載の方法。
29. セログループＡに由来の糖：セログループＣに由来の糖：セログループＷ１３５に由来の糖：セログループＹに由来の糖の比（ｗ／ｗ）が、２：１：１：１である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記糖が、ＣＲＭ _１９７ ジフテリアトキソイドに結合体化される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記結合体化が、前記糖へのアミノ基の導入、続くアジピンジエステルを用いる誘導化、およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスによって行われる、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記糖の１つ以上がオリゴ糖である、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記糖の１つ以上が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記ワクチンが、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記ワクチンが、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂに由来の糖抗原、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＢに由来のタンパク質、または、ＯＭＶ調製物を含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 用量が、１用量当たり５μｇと２０μｇとの間の各糖の用量である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 髄膜炎菌セログループＡ結合体と髄膜炎菌セログループＣ結合体とを含み、さらに、（ｉ）リン酸アルミニウムアジュバントまたは水酸化アルミニウムアジュバントと、（ｉｉ）緩衝液とを含む、免疫原性組成物。
38. 前記組成物が、リン酸アルミニウムアジュバントおよびリン酸緩衝液を含む、請求項３７に記載の組成物。
39. 前記組成物が、水酸化アルミニウムアジュバントおよびヒスチジン緩衝液を含む、請求項３７に記載の組成物。