BR122021004509B1

BR122021004509B1 - Sais de inibidor de pi3k e processos para seu preparo

Info

Publication number: BR122021004509B1
Application number: BR122021004509-7A
Authority: BR
Inventors: Lei Qiao; Lingkai Weng; Chongsheng Eric Shi; David Meloni; Qiyan Lin; Michael Xia; Vaqar Sharief; William Frietze; Zhongjiang Jia; Youngchun Pan; Pingli Liu; Tai-Yuen Yue; Jiacheng Zhou
Original assignee: Incyte Holdings Corporation
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2023-11-07
Also published as: MA55193A; EP3262046B1; BR112017018312A8; AU2020217339B2; KR20240132104A; NZ773226A; KR20170132185A; AU2016222556A1; IL254093B; DK3262046T3; HRP20221444T1; SG10201907576SA; CY1123729T1; HUE053025T2; CN117736209A; CR20210055A; JP2018510144A; DK3831833T3; JP2021006532A; TWI748941B

Abstract

sais de inibidor de pi3k e processos para seu preparo. o presente pedido fornece processos para preparar (r)-4-(3-((s)-1-(4-amino-3-metil-1h-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2-ona, que é útil como um inibidor de fosfoinositida 3-quinase-delta (pi3kd), bem como uma forma de sal e intermediários relacionados à mesma.

Description

Dividido do BR112017018312-9, depositado em 26.02.2016

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido n° de série US 62/121.697, depositado em 27 de fevereiro de 2015, que está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] O presente pedido fornece processo para preparar (R)-4-(3- ((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2- etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2-ona, que é útil como um inibidor de fosfo- inositida 3-quinase-delta (PI3Kδ), bem como uma forma de sal e intermediários relacionados à mesma.

ANTECEDENTES

[003] As fosfoinositida 3-quinases (PI3Ks) pertencem a uma grande família de quinases de sinalização de lipídio que fosforilam fos- foinositidas na posição D3 do anel de inositol (Cantley, Science, 2002, 296(5573):1655 a 1657). PI3Ks são divididas em três classes (classe I, II e III) de acordo com sua estrutura, regulação e especificidade de substrato. PI3Ks de classe I, que incluem PI3Kα, PI3Kβ, PI3KY e PI3Kδ, são uma família de quinases de lipídio e proteína de especificidade dupla que catalisam a fosforilação de fosfatidilinosito-4,5- bisfosfato (PIP2) dando origem a fosfatidilinosito-3,4,5-trisfosfato (PIP3). PIP3 funciona como um segundo mensageiro que controla inúmeros processos celulares, incluindo crescimento, sobrevivência, adesão e migração. Todas as quatro isoformas de PI3K classe I existem como heterodímeros compreendidos de uma subunidade catalítica (p110) e uma subunidade regulatória fortemente associada que controla sua expressão, ativação e localização subcelular. PI3Kα, PI3Kβ e PI3Kδ se associam a uma subunidade regulatória conhecida como p85 e são ativadas por fatores de crescimento e citoquinas através de um mecanismo dependente de tirosina quinase (Jimenez, et al., J Biol Chem., 2002, 277(44):41556 a 41562), enquanto que PI3KY se associa a duas subunidades regulatórias (p101 e p84) e sua ativação é acionada pela ativação de receptores acoplados à proteína G (Brock, et al., J Cell Biol., 2003, 160(1):89 a 99). PI3Kα e PI3Kβ são expressadas de forma ubíqua. Em contrapartida, PI3KY e PI3Kδ são predominantemente expressadas em leucócitos (Vanhaesebroeck, et al., Trends Biochem Sci., 2005, 30(4):194 a 204).

[004] A distribuição de tecido diferencial de fatores de isoformas de PI3K em suas funções biológicas distintas. A ablação genética ou de PI3Kα ou de PI3Kβ resulta em letalidade embrionária, indicando que PI3Kα e PI3Kβ têm funções essenciais e não redundantes, pelo menos durante o desenvolvimento (Vanhaesebroeck, et al., 2005). Em contrapartida, camundongos que carecem de PI3KY e PI3Kδ são viáveis, férteis e têm uma expectativa de vida normal embora os mesmos mostrem um sistema imunológico alterado. A deficiência em PI3KY leva ao recrutamento prejudicado de macrófagos e neutrófilos a sítios de inflamação bem como ativação de célula T prejudicada (Sasaki, et al., Science, 2000, 287(5.455):1040 a 1046). Camundongos PI3Kδ- mutantes têm defeitos específicos em sinalização de célula B que le-vam a desenvolvimento de célula B prejudicado e respostas de anti-corpo reduzidas após estimulação de antígeno (Clayton, et al., J Exp Med. 2002, 196(6):753 a 763; Jou, et al., Mol Cell Biol. 2002, 22(24):8580 a 8591; Okkenhaug, et al., Science, 2002, 297(5.583):1031 a 1034).

[005] Os fenótipos dos camundongos PI3KY e PI3Kδ-mutantes sugerem que estas enzimas podem exercer um papel na inflamação e em outras doenças imune-baseadas e isto é confirmado em modelos pré-clínicos. Camundongos PI3KY-mutantes são amplamente protegidos contra doença em modelos de camundongo de artrite reumatoide (RA) e asma (Camps, et al., Nat Med. 2005, 11(9):936 a 943; Thomas, et al., Eur. J. Immunol. 2005, 35(4):1283 a 1291). Ademais, foi mostrado que o tratamento de camundongos do tipo selvagem com um inibidor seletivo de PI3KY reduz glomerulonefrite e prolonga a sobrevivência no modelo de MRL-lpr de nefrite lúpica sistêmica (SLE) e suprime a inflamação de articulação e dano em modelos de RA (Barber, et al., Nat Med. 2005, 11(9):933 a 935; Camps, et al., 2005). Similarmente, foi demonstrado que tanto camundongos PI3Kδ-mutante quanto camundongos do tipo selvagem tratados com um inibidor seletivo de PI3Kδ têm inflamação das vias aéreas alérgica atenuada e hipercapa- cidade de resposta num modelo de camundongo de asma (Ali, et al., Nature. 2004, 431(7011):1007 a 1011; Lee, et al., FASEB J. 2006, 20(3):455 a 465) e têm doença atenuada num modelo de RA (Randis, et al., Eur. J. Immunol., 2008, 38(5):1.215 a 1.224).

[006] Foi demonstrado que a proliferação de célula B desempe nha um papel importante no desenvolvimento de doenças autoimunes inflamatórias (Puri, Frontiers in Immunology (2012), 3(256), 1 a 16; Walsh, Kidney International (2007) 72, 676 a 682). Por exemplo, células B suportam autorreatividade de célula T, um componente importante de doenças autoimunes inflamatórias. Uma vez ativadas e matura- das, células B podem trafegar para sítios de inflamação e recrutar células inflamatórias ou se diferenciar em plasmablastos. Desta forma, a atividade de células B pode ser afetada por direcionamento de citoqui- nas estimulantes de células B, receptores de superfície de célula B ou através de depleção de célula B. Foi demonstrado que rituximab — um anticorpo monoclonal quimérico de camundongo/humano IgG1 K direcionado contra o receptor de superfície de célula B CD20 — esgota células B CD20+. Foi demonstrado que o uso de rituximab tem eficácia no tratamento de púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolí- tica autoimune ou vasculite. Por exemplo, o tratamento com rituximab resultou na remissão da doença em pacientes sofrendo de vasculite sistêmica (AASV) associada a anticorpo de citoplasma antineutrófilo (ANCA) com depleção de célula B periférica demonstrada (Walsh, 2007; Lovric, Nephrol Dial Transplant (2009) 24: 179 a 185). Similar-mente, uma resposta completa foi relatada num terço a dois terços dos pacientes tendo vasculite crioglobulinêmica misturada após o tratamento com rituximab, incluindo pacientes que apresentaram uma forma grave de vasculite que era resistente ou intolerante a outros tratamentos (Cacoub, Ann Rheum Dis 2008;67:283 a 287). Similarmente, foi mostrado que rituximab têm eficácia no tratamento de pacientes com púrpura trombocitopênica idiopática (ou púrpura trombocitopênica imune) (Garvey, British Journal of Haematology, (2008) 141, 149 a 169; Godeau, Blood (2008), 112(4), 999 a 1004; Medeo, European Journal of Haematology, (2008) 81, 165 a 169) e anemia hemolítica autoimune (Garvey, British Journal of Haematology, (2008) 141, 149 a 169).

[007] A sinalização de PI3Kδ está presa à sobrevivência, migra ção e ativação de célula B (Puri, Frontiers in Immunology, 2012, 3(256), 1 a 16, nas páginas 1 a 5; e Clayton, J Exp Med, 2002, 196(6):753 a 63). Por exemplo, PI3Kδ é exigida para ativação de célula B dependente de antígeno acionada por receptor de célula B. Bloqueando a adesão, a sobrevivência, a ativação e a proliferação de célula B, a inibição de PI3Kδ pode prejudicar a capacidade de as células B ativarem células T, evitando sua ativação e reduzindo a secreção de autoanticorpos e citoquinas pró-inflamatórias. Daí, por sua capacidade de inibir ativação de célula B, seria esperado que inibidores de PI3Kδ tratassem doenças mediadas por célula B que eram tratáveis por métodos similares como depleção de célula B por rituximab. De fato, foi mostrado que inibidores de PI3Kδ eram modelos de camundongo úteis de várias doenças autoimunes que são também tratáveis por rituximab como artrite (Puri (2012)). Adicionalmente, células B do tipo inatas, que são ligadas à autoimunidade são sensíveis à atividade de PI3Kδ, como células MZ e B-1, estão quase ausentes em camundongos carecendo do gene p110δ (Puri (2012). Os inibidores de PI3Kδ podem reduzir o tráfego de e a ativação de células MZ e B-1, que estão implicados em doenças autoimunes.

[008] Além de seu papel potencial em doenças inflamatórias, to das as quatro isoformas de PI3K de classe I podem desempenhar um papel no câncer. O gene que codifica p110α é mutado frequentemente em cânceres comuns, incluindo de mama, de próstata, de cólon e en- dométrico (Samuels, et al., Science, 2004, 304(5670):554; Samuels, et al., Curr Opin Oncol. 2006, 18(1):77 a 82). Oitenta por cento destas mutações são representados por uma de três substituições de amino- ácido nos domínios helicoidal ou quinase da enzima e levam a uma regulação ascendente de atividade de quinase resultando em transformação oncogênica na cultura celular e em modelos de animal (Kang, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102(3):802 a 807; Bader, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(5):1475 a 1479). Nenhuma destas mutações foi identificada nas outras isoformas de PI3K, embora haja evidência de que as mesmas podem contribuir para o desenvolvimento e progressão de malignidades. A superexpressão consistente de PI3Kδ é observada em leucemia mieloblástica aguda (Su- jobert, et al., Blood, 2005, 106(3):1063 a 1066) e inibidores de PI3Kδ podem evitar o crescimento de células leucêmicas (Billottet, et al., On-cogene. 2006, 25(50):6648 a 6659). A expressão elevada de PI3KY é vista em leucemia mieloide crônica (Hickey, et al., J Biol. Chem. 2006, 281(5):2441 a 2450). Alterações na expressão de PI3Kβ, PI3KY e PI3Kδ também foram observadas em cânceres do cérebro, cólon e bexiga (Benistant, et al., Oncogene, 2000, 19(44):5083 a 5090; Mizoguchi, et al., Brain Pathol. 2004, 14(4):372 a 377; Knobbe, et al., Neu- ropathol Appl Neurobiol. 2005, 31(5):486 a 490). Adicionalmente, foi demonstrado que todas estas isoformas eram oncogênicas na cultura celular (Kang, et al., 2006).

[009] Por estas razões, existe uma necessidade de desenvolver novos inibidores de PI3K que podem ser usados em distúrbios inflamatórios, doenças autoimunes e câncer. Esta invenção está direcionada a esta necessidade e a outras.

SUMÁRIO

[0010] O presente pedido fornece processos de preparo de um composto de Fórmula I: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que é útil como um inibidor de PI3Kδ.

[0011] O presente pedido fornece, ainda, um sal de ácido clorídri co do composto de Fórmula I.

[0012] O presente pedido também fornece composições farmacêu ticas compreendendo um sal de ácido clorídrico descrito no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0013] O presente pedido fornece, ainda, métodos de inibição de uma atividade de uma quinase PI3K, compreendendo colocar a qui- nase em contato com o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I.

[0014] O presente pedido também fornece métodos de tratamento de uma doença num paciente, em que a referida doença está associa- da a expressão ou atividade anormal de uma quinase PI3K, compre-endendo administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuti- camente eficaz do sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I.

[0015] O presente pedido fornece adicionalmente o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I para uso em qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[0016] O presente pedido fornece, ainda, o uso do sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I para a fabricação de um medicamento para uso em qualquer um dos métodos descritos no presente documento.

[0017] O presente pedido também fornece um processo de prepa- ro do sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I compreenden- do reagir um composto de Fórmula I:

[0018] com ácido clorídrico para formar o referido sal.

[0019] O presente pedido adicionalmente fornece um processo de preparo de um composto de Fórmula I compreendendo reagir um composto de Fórmula XVI: XVI

[0020] com acetato de formamidina para formar o referido compos- to de Fórmula I:

[0021] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu- la XIV:

[0022] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0023] O presente pedido também fornece um composto de Fór mula XV:

[0024] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0025] O presente pedido adicionalmente fornece um composto de Fórmula XVI:

[0026] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0027] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu- la XIX:

[0028] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0029] O presente pedido também fornece um composto de Fór mula XX:

[0030] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0031] O presente pedido adicionalmente fornece um composto de Fórmula XXI:

[0032] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0033] A Figura 1 mostra um termograma de DSC representativo do sal do Exemplo 3.

[0034] A Figura 2 mostra dados de TGA representativos do sal do Exemplo 3.

[0035] A Figura 3 mostra um padrão de XRPD representativo do sal do Exemplo 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA COMPOSTOS E SAIS

[0036] O presente pedido fornece processos de preparo de um composto de Fórmula I:

[0037] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que é útil como um inibidor de PI3Kδ, em que Et é etila.

[0038] O presente pedido fornece, ainda, um sal do composto de Fórmula I.

[0039] Consequentemente, em algumas modalidades, o presente pedido fornece sal de ácido 4-(3-(1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2-ona clorídri-co. Em algumas modalidades, o presente pedido fornece sal de ácido (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5- cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2-ona clorídrico. Em algumas modalidades, o sal é uma razão estequiométrica de 1:1 entre (R)-4-(3- ((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2- etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2-ona e ácido clorídrico.

[0040] Diferentes formas da mesma substância têm diferentes propriedades de volume relacionadas, por exemplo, à higroscopicida- de, solubilidade, estabilidade e similares. Formas com pontos de fusão altos frequentemente têm boa estabilidade termodinâmica que é vantajosa no prolongamento da vida útil de formulações de fármaco contendo a forma sólida. Formas com pontos de fusão inferiores frequentemente são menos termodinamicamente estáveis, mas são vantajosas visto que as mesmas têm solubilidade em água aumentada, traduzindo para biodisponibilidade de fármaco aumentada. Formas que são fra-camente higroscópicas são desejáveis por sua estabilidade ao calor e umidade e são resistentes à degradação durante longo armazenamento.

[0041] Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do com posto de Fórmula I fornecido no presente documento é cristalino. Conforme usado no presente documento, "cristalino" ou "forma cristalina" é destinado a se referir a uma certa configuração de rede de uma substância cristalina. Diferentes formas cristalinas da mesma substância tipicamente têm diferentes retículas cristalinas (por exemplo, células unitárias) que são atribuídas a diferentes propriedades físicas que são características de cada uma das formas cristalinas. Em alguns casos, diferentes configurações de rede têm diferentes teor de água ou sol- vente.

[0042] As diferentes formas de sal podem ser identificadas por mé todos de caracterização de estado sólido como por difração de raios X por pó (XRPD). Outros métodos de caracterização como calorimetria de varredura diferencial (DSC), análise termogravimétrica (TGA), sor- ção de vapor dinâmica (DVS) e similares ajudam adicionalmente a identificar a forma bem como ajudam a determinar a estabilidade e o teor de solvente/água.

[0043] Um padrão de XRPD de reflexões (picos) é tipicamente considerado uma impressão digital de uma forma cristalina particular. É bem conhecido que as intensidades relativas dos picos de XRPD podem amplamente variar dependendo, entre outros, da técnica de preparação de amostra, da distribuição de tamanho de cristal, de vários filtros usados, do procedimento de montagem de amostra e do instrumento particular empregado. Em alguns casos, novos picos podem ser observados ou picos existentes podem desaparecer, dependendo do tipo do instrumento ou dos ajustes. Conforme usado no presente documento, o termo "pico" se refere a uma reflexão tendo uma altu- ra/intensidade relativa de pelo menos cerca de 4% da altu- ra/intensidade de pico máxima. Ademais, a variação de instrumento e outros fatores podem afetar os valores 2-teta. Desta forma, atribuições de pico, tais como aquelas relatadas no presente documento, podem variar em mais ou menos cerca de 0,2° (2-teta) e o termo "substancialmente" e "cerca de" conforme usado no contexto de XRPD no presente documento é destinado a abranger as variações mencionadas acima.

[0044] Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do com posto de Fórmula I tem pelo menos um pico de XRPD, em termos de 2-teta, selecionado de cerca de 11,3°, cerca de 16,4°, cerca de 21,0°, cerca de 23,0°, cerca de 28,1°, cerca de 31,2° e cerca de 32,8°. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fór-mula I tem pelo menos dois picos de XRPD, em termos de 2-teta, se-lecionados de cerca de 11,3°, cerca de 16,4°, cerca de 21,0°, cerca de 23,0°, cerca de 28,1°, cerca de 31,2° e cerca de 32,8°. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem pelo menos três picos de XRPD, em termos de 2-teta, selecionados de cerca de 11,3°, cerca de 16,4°, cerca de 21,0°, cerca de 23,0°, cerca de 28,1°, cerca de 31,2° e cerca de 32,8°. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem pelo menos quatro picos de XRPD, em termos de 2-teta, selecionados de cerca de 11,3°, cerca de 16,4°, cerca de 21,0°, cerca de 23,0°, cerca de 28,1°, cerca de 31,2° e cerca de 32,8°. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem pelo menos cinco picos de XRPD, em termos de 2-teta, selecionado de cerca de 11,3°, cerca de 16,4°, cerca de 21,0°, cerca de 23,0°, cerca de 28,1°, cerca de 31,2° e cerca de 32,8°. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem um perfil de XRPD substancialmente conforme mostrado na Figura 3.

[0045] Da mesma forma, as leituras de temperatura em conjunto com DSC, TGA ou outros experimentos térmicos pode variar cerca de ±3 °C dependendo do instrumento, ajustes particulares, preparação de amostra, etc. Consequentemente, uma forma cristalina relatada no presente documento tendo um termograma de DSC "substancialmente" conforme mostrado em qualquer uma das Figuras ou o termo "cerca de" é entendido como acomodando tal variação. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem um termograma de DSC tendo um pico endotérmico em cerca de 207°C. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem um termograma de DSC substancialmente conforme mostrado na Figura 1. Em algumas modalidades, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I tem um termograma de TGA substancialmente conforme mostrado na Figura 2.

[0046] Em algumas modalidades, os sais e compostos descritos no presente documento (por exemplo, o composto de Fórmula I ou o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I) são substancialmente isolados. Entende-se por "substancialmente isolado" que o sal ou composto é pelo menos parcial ou substancialmente separado do ambiente no qual o mesmo foi formado ou detectado. A separação parcial pode incluir, por exemplo, uma composição enriquecida nos sais descritos no presente documento. A separação substancial pode incluir composições contendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 99% em peso dos sais descritos no presente documento, ou sal dos mesmos. Métodos para isolar compostos e seus sais são rotina na técnica.

INTERMEDIÁRIOS

[0047] O presente pedido fornece, ainda, intermediários que são úteis na preparação do composto de Fórmula I.

[0048] Consequentemente, em algumas modalidades, o presente pedido fornece um composto de Fórmula XIV:

[0049] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0050] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu la XV:

[0051] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0052] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu la XVI:

[0053] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0054] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu la XIX:

[0055] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0056] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu la XX:

[0057] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[0058] O presente pedido fornece, ainda, um composto de Fórmu la XXI:

[0059] ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

PROCESSOS

[0060] O presente pedido fornece, ainda, um processo de preparo de um sal de Fórmula I:

[0061] Em algumas modalidades, o processo compreende reagir um composto de Fórmula I:

[0062] com ácido clorídrico para formar o referido sal.

[0063] Em algumas modalidades, o referido ácido clorídrico é áci do clorídrico aquoso a 1 M.

[0064] Em algumas modalidades, cerca de 3,3 a cerca de 3,7 equivalentes de ácido clorídrico são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula I.

[0065] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada a uma temperatura de cerca de 45°C a cerca de 55°C.

[0066] Em algumas modalidades, o processo compreende:

[0067] adicionar ácido clorídrico ao composto de Fórmula I à tem peratura ambiente para formar uma pasta aquosa;

[0068] aquecer a referida pasta aquosa a uma temperatura de cer ca de 45°C a cerca de 55°C para formar uma solução; e

[0069] resfriar a solução a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 5°C para cristalizar o referido sal.

[0070] Em algumas modalidades, o processo compreende reagir um composto de Fórmula XVI:

[0071] com acetato de formamidina para formar um composto de Fórmula I:

[0072] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XVI com acetato de formamidina é conduzida num componente solvente compreendendo 1,2-etanodiol.

[0073] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XVI com acetato de formamidina é realizada a uma temperatura de cerca de 100°C a cerca de 105°C.

[0074] Em algumas modalidades, cerca de 8 a cerca de 10 equiva lentes de acetato de formamidina são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XVI.

[0075] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XVI por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XV:

[0076] com (1-etoxietilideno)malononitrila na presença de uma amina terciária.

[0077] Em algumas modalidades, a referida amina terciária é N- metilpirrolidinona.

[0078] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XV com (1-etoxietilideno)malononitrila é realizada cerca da temperatura ambiente.

[0079] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XV por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XIV-a:

[0080] com hidrazina na presença de uma amina terciária, em que P1 é alquilsulfonila C1-6.

[0081] Em algumas modalidades, a referida amina terciária é N- metilpirrolidinona.

[0082] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XIV-a com hidrazina é realizada a uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 60°C.

[0083] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XIV-a com hidrazina é conduzida num componente solvente compreendendo diclorometano.

[0084] Em algumas modalidades, P1 é grupo metanossulfonila.

[0085] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XIV por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XIII:

[0086] com haleto de alquilsulfonila C1-6 na presença de uma ami na terciária.

[0087] Em algumas modalidades, o referido haleto de alquilsulfoni- la C1-6 é cloreto de metanossulfonila.

[0088] Em algumas modalidades, a referida amina terciária é N,N- di-isopropiletilamina.

[0089] Em algumas modalidades, cerca de 1,1 a cerca de 1,5 equivalente de haleto de alquilsulfonila é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XIII.

[0090] Em algumas modalidades, a referida reação do referido composto de Fórmula XIII com haleto de alquilsulfonila C1-6 é realizada a uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de 5°C.

[0091] Em algumas modalidades, a referida reação do referido composto de Fórmula XIII com C1-6 haleto de alquilsulfonila é realizada num componente solvente compreendendo diclorometano.

[0092] Em algumas modalidades, as etapas de: (i) reagir o referido composto de Fórmula XIII com haleto de alquilsulfonila C1-6; (ii) reagir o referido composto de Fórmula XIV-a com hidrazina na presença de uma amina terciária para formar um composto de Fórmula XV; e (iii) reagir o referido composto de Fórmula XV com acetato de formamidina para formar um composto de Fórmula XVI são conduzidas no mesmo pote sem isolamento do composto de Fórmula XIV-a ou do composto de Fórmula XV.

[0093] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XVI por um processo compreenden- do reagir um sal de Fórmula XV-a:

[0094] com (1-etoxietilideno)malononitrila na presença de uma amina terciária, em que TsOH é ácido p-toluenossulfônico.

[0095] Em algumas modalidades, a referida amina terciária é N,N- di-isopropiletilamina.

[0096] Em algumas modalidades, a referida reação de um sal de Fórmula XV-a com (1-etoxietilideno)malononitrila é realizada cerca da temperatura ambiente.

[0097] Em algumas modalidades, cerca de 1,3 a cerca de 1,6 equivalente de (1-etoxietilideno)malononitrila é usado com base em 1 equivalente do sal de Fórmula XV-a.

[0098] Em algumas modalidades, a referida reação do sal de Fór mula XV-a com (1-etoxietilideno)malononitrila é conduzida num com-ponente solvente compreendendo etanol.

[0099] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o sal de Fórmula XV-a por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XXI:

[00100] com ácido p-toluenossulfônico, em que Boc é terc- butoxicarbonila.

[00101] Em algumas modalidades, o referido ácido p- toluenossulfônico é ácido p-toluenossulfônico monoidratado.

[00102] Em algumas modalidades, cerca de 1,3 a cerca de 1,6 equivalente de ácido p-toluenossulfônico é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XXI.

[00103] Em algumas modalidades, a referida reação do referido composto de Fórmula XXI com ácido p-toluenossulfônico é realizada a uma temperatura de cerca de 45°C a cerca de 65°C.

[00104] Em algumas modalidades, a reação do referido composto de Fórmula XXI com ácido p-toluenossulfônico é conduzida num componente solvente compreendendo etanol.

[00105] Em algumas modalidades, as etapas de: (i) reagir o referido composto de Fórmula XXI com ácido p-toluenossulfônico para formar um sal de Fórmula XV-a; e (ii) reagir o referido sal de Fórmula XV-a com (1-etoxietilideno)malononitrila são conduzidas no mesmo pote sem isolamento do sal de Fórmula XV-a.

[00106] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XXI por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XX:

[00107] com gás hidrogênio na presença de um ou mais catalisado-res de hidrogenação independentemente selecionados, em que Boc é terc-butoxicarbonila.

[00108] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XX com gás hidrogênio é realizada na presença de dois catalisadores de hidrogenação independentemente selecionados.

[00109] Em algumas modalidades, um catalisador de hidrogenação é bis(1,5-ciclooctadieno)ródio(I)tetrafluoroborato e o outro é (R)-(-)-1- {(S)-2-[bis(4-trifluorometilfenil)fosfina]ferrocenil}etil-di-t-butilfosfina.

[00110] Em algumas modalidades, cerca de 13,5 a cerca de 14,5 equivalentes de bis(1,5-ciclooctadieno)ródio(I)tetrafluoroborato são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XX.

[00111] Em algumas modalidades, cerca de 12 a cerca de 13 equi valentes de (R)-(-)-1-{(S)-2-[bis(4- trifluorometilfenil)fosfina]ferrocenil}etil-di-t-butilfosfina são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XX.

[00112] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XX com gás hidrogênio é realizada cerca da temperatura ambiente.

[00113] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XX com gás hidrogênio é conduzida num componente solvente compreendendo metanol.

[00114] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XX por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XIX:

[00115] com carbazato de t-butila.

[00116] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XIX com carbazato de t-butila é realizada a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 70°C.

[00117] Em algumas modalidades, a referida reação do composto de Fórmula XIX com carbazato de t-butila é conduzida num compo- nente solvente compreendendo metanol.

[00118] Em algumas modalidades, o processo compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XIX por um processo compreendendo oxidar um composto de Fórmula XIII-a:

[00119] na presença de um agente oxidante.

[00120] Em algumas modalidades, o referido agente oxidante é pe- riodinano de Dess-Martin.

[00121] Em algumas modalidades, cerca de 1,2 a cerca de 1,7 equivalente de referido agente oxidante é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XIII-a.

[00122] Em algumas modalidades, a referida oxidação do composto de Fórmula XIII-a é realizada cerca da temperatura ambiente.

[00123] Em algumas modalidades, a referida oxidação do composto de Fórmula XIII-a é conduzida num componente solvente compreen-dendo diclorometano.

[00124] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula XIII é preparado por um processo compreendendo aquecer um com-posto de Fórmula XII:

[00125] na presença de um componente solvente.

[00126] Em algumas modalidades, o referido aquecimento é reali-zado a uma temperatura de cerca de 95°C a cerca de 105°C.

[00127] Em algumas modalidades, o referido componente solvente compreende 1,4-dioxano.

[00128] Em algumas modalidades, o referido componente solvente compreende tolueno.

[00129] Em algumas modalidades, o referido componente solvente compreende 1,4-dioxano e tolueno.

[00130] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula XII é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XI:

[00131] na presença de uma base forte.

[00132] Em algumas modalidades, a referida base forte é hidróxido de sódio.

[00133] Em algumas modalidades, a referida base forte é hidróxido de sódio aquoso a 1 M.

[00134] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada cerca da temperatura ambiente.

[00135] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula XI é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula X:

[00136] com gás hidrogênio na presença de níquel de Raney.

[00137] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada a uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de 70°C.

[00138] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula X é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula IX:

[00139] na presença de eterato de triflureto de boro, catalisador de (3aS)-1-metil-3,3-difeniltetra-hidro-3H-pirrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaborol ((S)-MeCBS) e um complexo de borano.

[00140] Em algumas modalidades, cerca de 0,03 a cerca de 0,07 equivalente de eterato de triflureto de boro é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula IX.

[00141] Em algumas modalidades, cerca de 0,05 a cerca de 0,15 equivalente de catalisador de (3aS)-1-metil-3,3-difeniltetra-hidro-3H- pirrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaborol ((S)-MeCBS) é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula IX.

[00142] Em algumas modalidades, o referido complexo de borano é complexo de borano-THF a 1,0 M em THF.

[00143] Em algumas modalidades, cerca de 0,9 a cerca de 1,1 equivalentes de complexo de borano é usado com base em 1 equiva- lente do composto de Fórmula IX.

[00144] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada cerca da temperatura ambiente.

[00145] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula IX é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula VIII:

[00146] com iodo na presença de um componente solvente.

[00147] Em algumas modalidades, o referido componente solvente compreende acetona.

[00148] Em algumas modalidades, cerca de 0,75 a cerca de 1,25 equivalente de iodo é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula VIII.

[00149] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula VIII é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula VII:

[00150] com malonato de dimetila na presença de um catalisador.

[00151] Em algumas modalidades, o referido catalisador é (1S,2S)- N,N'-dibenzilciclo-hexano-1,2-diamina-dibromoníquel (Catalisador de Evans).

[00152] Em algumas modalidades, cerca de 1,1 a cerca de 1,3 equivalente de malonato de dimetila é usado com base em 1 equiva-lente do composto de Fórmula VII.

[00153] Em algumas modalidades, cerca de 0,02 a cerca de 0,03 equivalente de catalisador de metal de transição é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula VII.

[00154] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula VII é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula VI:

[00155] com nitrometano na presença de um ácido orgânico para formar uma primeira mistura.

[00156] Em algumas modalidades, o referido ácido orgânico é ácido acético glacial.

[00157] Em algumas modalidades, cerca de 9,5 a cerca de 10,5 equivalentes de nitrometano são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula VI.

[00158] Em algumas modalidades, a referida reação compreende, ainda, adicionar uma base de amina à referida primeira mistura para formar uma segunda mistura.

[00159] Em algumas modalidades, a referida base de amina é ben- zilamina.

[00160] Em algumas modalidades, cerca de 0,2 a cerca de 0,3 equivalente de base de amina é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula VI.

[00161] Em algumas modalidades, a referida segunda mistura é aquecida a cerca de 55°C a cerca de 65°C.

[00162] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula VI é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula V:

[00163] com um complexo de haleto de (alquila C1-4)magnésio para formar uma primeira mistura.

[00164] Em algumas modalidades, o referido complexo de haleto de (alquila C1-4)magnésio é 1,3 M complexo de isopropilmagnésio e cloreto de lítio.

[00165] Em algumas modalidades, cerca de 1,1 a cerca de 1,3 equivalente do referido complexo de haleto de (alquila C1-4)magnésio é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula V.

[00166] Em algumas modalidades, a referida reação compreende, ainda, adicionar N-formilmorfolina à referida primeira mistura para formar uma segunda mistura.

[00167] Em algumas modalidades, cerca de 1,8 a cerca de 2,2 equivalentes de N-formilmorfolina são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula V.

[00168] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada a uma temperatura de cerca de -5°C a cerca de 10°C.

[00169] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula V é preparado de acordo com procedimentos descritos na Publicação n° U.S. 2013-0059835Al.

[00170] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula VI é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula V-a:

[00171] com N,N-dimetilformamida na presença de di- isopropilamida de lítio.

[00172] Em algumas modalidades, a referida di-isopropilamida de lítio é preparada reagindo N,N-di-isopropilamina na presença de n- butillítio.

[00173] Em algumas modalidades, a referida di-isopropilamida de lítio é preparada a uma temperatura de cerca de -75°C a cerca de 5°C.

[00174] Em algumas modalidades:

[00175] (ii) o referido composto de Fórmula V-a é reagido com di- isopropilamida de lítio para formar uma primeira mistura; e

[00176] (ii) N,N-dimetilformamida é adicionada à referida primeira mistura para formar uma segunda mistura.

[00177] Em algumas modalidades, cerca de 1,2 a cerca de 1,3 equivalente de base de amina é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula V-a.

[00178] Em algumas modalidades, cerca de 1,4 a cerca de 1,6 equivalente de N,N-dimetilformamida é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula V-a.

[00179] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula V-a é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula IV-a:

[00180] com 1,2-etanodiol na presença de ácido p- toluenossulfônico.

[00181] Em algumas modalidades, o referido ácido p- toluenossulfônico é ácido p-toluenossulfônico monoidratado.

[00182] Em algumas modalidades, cerca de 2,2 a cerca de 2,7 equivalentes de 1,2-etanodiol são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula IV-a.

[00183] Em algumas modalidades, cerca de 0,05 a cerca de 0,1 equivalente de ácido p-toluenossulfônico é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula IV-a.

[00184] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em cerca de refluxo.

[00185] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula IV-a é preparado por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula II:

[00186] com CH2CH2-X1 na presença de uma base de carbonato de metal alcalino, em que:

[00187] X1 é haleto.

[00188] Em algumas modalidades, X1 é iodeto.

[00189] Em algumas modalidades, a referida base de carbonato de metal alcalino é carbonato de potássio.

[00190] Em algumas modalidades, cerca de 1,1 a cerca de 1,3 equivalente de CH2CH2-X1 é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula II.

[00191] Em algumas modalidades, cerca de 1,8 a cerca de 2,2 equivalentes de base de carbonato de metal alcalino são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula II.

[00192] Em algumas modalidades, a referida reação é realizada em cerca de 55°C a cerca de 65°C.

[00193] Em algumas modalidades, o referido composto de Fórmula II é preparado de acordo com procedimentos descritos na Publicação n° U.S. 2013-0059835Al.

[00194] É entendido que certos recursos da invenção, que são, para clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidos em combinação numa única modalidade (embora sendo previsto que as modalidades sejam combinadas como se escritas de múltiplas formas dependentes). Em contrapartida, várias características da invenção que são, por brevidade, descridas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação.

[00195] Os sais e compostos descritos no presente documento po-dem ser assimétricos (por exemplo, tendo um ou mais estereocentros). Se não for indicada nenhuma estereoquímica, então todos os estere- oisômeros, tais como enantiômeros e diastereômeros, são previstos exceto se indicado de outro modo pela estrutura ou nome. Sais e compostos do presente pedido que contêm átomos de carbono assi- metricamente substituídos podem ser isolados em formas opticamente ativas ou racêmicas. Métodos sobre como preparar formas opticamen- te ativas de materiais de partida opticamente inativos são conhecidos na técnica, tais como por resolução de misturas racêmicas ou por síntese estereosseletiva. Muitos isômeros geométricos de olefinas, ligações duplas C=N e similares também podem estar presentes sais nos sais e compostos descritos no presente documento e todos os referi-dos isômeros estáveis são contemplados no presente pedido. Isôme- ros geométricos cis e trans dos sais e compostos do presente pedido são descritos e podem ser isolados como uma mistura de isômeros ou como formas isoméricas separadas.

[00196] A resolução de misturas racêmicas de sais e compostos pode ser executada por qualquer um de inúmeros métodos conhecidos na técnica. Um exemplo de método inclui a recristalização fracional usando um ácido de resolução quiral que é um ácido orgânico de formação de sal opticamente ativo. Agentes de resolução adequados para os métodos de recristalização fracional são, por exemplo, ácidos opticamente ativos, tal como as formas D e L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido máli- co, ácido lático ou os vários ácidos canforsulfônicos opticamente ativos, tais como ácido e-canforsulfônico. Outros agentes de resolução adequados para métodos de cristalização fracional incluem formas es- tereoisomericamente puras de uma α-metilbenzilamina (por exemplo, formas S e R, ou formas diaestereomericamente puras), 2-fenilglicinol, norefedrina, efedrina, N-metilefedrina, ciclo-hexiletilamina, 1,2- diaminociclo-hexano e similares.

[00197] A resolução de misturas racêmicas também pode ser exe-cutada pela eluição numa coluna empacotada com um agente de resolução opticamente ativo (por exemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). Uma composição de solvente de eluição adequada pode ser determinada por um versado na técnica.

[00198] Sais e compostos da invenção podem também incluir todos os isótopos de átomos que ocorrem nos intermediários ou sais ou compostos finais. Isótopos incluem aqueles átomos tendo o mesmo número atômico, mas diferentes números de massa. Por exemplo, isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério.

[00199] Em algumas modalidades, os compostos ou sais podem ser encontrados juntos com outras substâncias tais como água e solventes (por exemplo, hidratos e solvatos) ou podem ser isolados.

[00200] Em algumas modalidades, os compostos descritos no pre-sente documento, ou sais dos mesmos (por exemplo, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I), são substancialmente isolados. Entende-se por "substancialmente isolado" que o composto é pelo menos parcial ou substancialmente separados do ambiente no qual o mesmo foi formado ou detectado. A separação parcial pode incluir, por exemplo, uma composição enriquecida nos compostos da invenção. A separação substancial pode incluir composições contendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% em peso dos compostos da invenção, ou um sal dos mesmos. Métodos para isolar compostos e seus sais são rotina na técnica.

[00201] A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada no presente documento para referir-se àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que estão contidas no escopo do julgamento médico do parecer, adequados para o uso em contato com os tecidos de indivíduos humanos e indivíduos animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma razão benefício/risco razoável.

[00202] Conforme será entendido, os compostos fornecidos no pre-sente documento, incluindo sais dos mesmos, podem ser preparados usando técnicas de síntese orgânica conhecidas e podem ser sintetizados de acordo com qualquer uma de inúmeras possíveis rotas sintéticas. Os processos descritos no presente documento podem ser monitorados de acordo com qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a formação de produto pode ser monitorada por meios espectroscópicos, tais como espectroscopia por ressonância magnética nuclear (por exemplo, 1H ou 13C), espectroscopia por infravermelho ou espectrofotometria (por exemplo, visível por UV); ou por cromatografia tal como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia de camada fina (TLC) ou outras técnicas relacionadas.

[00203] Conforme usado no presente documento, o termo "reagir" é usado conforme conhecido na técnica e geralmente se refere à ligação por ponte de reagentes químicos de modo a permitir sua interação no nível molecular para alcançar uma transformação química ou física. Em algumas modalidades, a reação envolve dois reagentes, em que um ou mais equivalentes de segundo reagente são usados em relação ao primeiro reagente. As etapas de reação dos processos descritos no presente documento podem ser conduzidas por um período e sob condições adequadas para preparar o produto identificado.

[00204] As reações dos processos descritos no presente documento podem ser executadas em solventes adequados que podem ser prontamente selecionados por um versado na técnica de síntese orgânica. Solventes adequados podem ser substancialmente não reativos com os materiais de partida (reagentes), os intermediários, ou produtos a temperaturas nas quais as reações são executadas, por exemplo, temperaturas que podem se situar na faixa da temperatura de congelamento do solvente até a temperatura de ebulição do solvente. Uma dada reação pode ser executada num solvente ou uma mistura de mais de um solvente. Dependendo da etapa de reação particular, solventes adequados para uma etapa de reação particular podem ser selecionados.

[00205] Solventes adequados podem incluir solventes halogenados tais como tetracloreto de carbono, bromodiclorometano, dibromoclo- rometano, bromofórmio, clorofórmio, bromoclorometano, dibromome-tano, cloreto de butila, diclorometano, tetracloroetileno, tricloroetileno, 1,1,1-tricloroetano, 1,1,2-tricloroetano, 1,1-dicloroetano, 2- cloropropano, 1,2-dicloroetano, 1,2-dibromoetano, hexafluorobenzeno, 1,2,4-triclorobenzeno, 1,2-diclorobenzeno, clorobenzeno, fluorobenze- no, misturas dos mesmos e similares.

[00206] Solventes de éter adequados incluem: dimetoximetano, te tra-hidrofurano, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, furano, éter dietílico, dimetil éter de etilenoglicol, dietil éter de etilenoglicol, dimetil éter de dietileno- glicol, dietil éter de dietilenoglicol, dimetil éter de trietilenoglicol, anisol, metil éter de t-butila, misturas dos mesmos e similares.

[00207] Solventes próticos adequados podem incluir, a título de exemplo e sem limitação, água, metanol, etanol, 2-nitroetanol, 2- fluoroetanol, 2,2,2-trifluoroetanol, etileno glicol, 1-propanol, 2-propanol, 2-metoxietanol, 1-butanol, 2-butanol, álcool i-butílico, álcool t-butílico, 2-etoxietanol, dietilenoglicol, 1-, 2-, ou 3- pentanol, álcool neo-pentílico, álcool t-pentílico, monometil éter de dietilenoglicol, monoetil éter de dietilenoglicol, ciclo-hexanol, álcool benzílico, fenol ou glicerol.

[00208] Solventes apróticos adequados podem incluir, a título de exemplo e sem limitação, tetra-hidrofurano (THF), N,N- dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), 1,3-dimetil- 3,4,5,6-tetra-hidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU), 1,3-dimetil-2- imidazolidinona (DMI), N metilpirrolidinona (NMP), formamida, N- metilacetamida, N-metilformamida, acetonitrila, sulfóxido de dimetila, propionitrila, formato de etila, acetato de metila, hexacloroacetona, acetona, etil metil cetona, acetato de etila, sulfolano, N,N- dimetilpropionamida, tetrametilureia, nitrometano, nitrobenzeno ou he- xametilfosforamida.

[00209] Solventes à base de hidrocarboneto adequados incluem benzeno, ciclo-hexano, pentano, hexano, tolueno, ciclo-heptano, metil- ciclo-hexano, heptano, etilbenzeno, m-, o-, ou p-xileno, octano, indano, nonano ou naftaleno.

[00210] As reações dos processos descritos no presente documento podem ser executadas a temperaturas apropriadas que podem ser prontamente determinadas pelo versado na técnica. Temperaturas de reação irão depender, por exemplo, dos pontos de fusão e de ebulição dos reagentes e do solvente, se presente; a termodinâmica da reação (por exemplo, reações vigorosamente exotérmicas podem precisar ser executadas a temperaturas reduzidas); e a cinética da reação (por exemplo, uma alta barreira de energia de ativação pode precisar de temperaturas elevadas).

[00211] As expressões "temperatura do ambiente" e "temperatura ambiente" ou "ta", conforme usado no presente documento, são en-tendidas na técnica e se referem, em geral, a uma temperatura, por exemplo, uma temperatura de reação, que é cerca da temperatura do ambiente no qual a reação é executada, por exemplo, uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 30°C.

[00212] As reações dos processos descritos no presente documento podem ser executadas no ar ou sob uma atmosfera inerte. Tipica-mente, reações contendo reagentes ou produtos que são substancialmente reativos com ar podem ser executadas usando técnicas sintéticas sensíveis ao ar que são bem conhecidas pelo versado na técnica.

MÉTODOS DE USO

[00213] Os sais e compostos da invenção podem modular atividade de uma ou mais de várias quinases incluindo, por exemplo, fosfoinosi- tida 3-quinases (PI3Ks). O termo "modular" é destinado a se referir a uma capacidade de aumentar ou diminuir a atividade de um ou mais membros da família PI3K. Consequentemente, os sais e compostos da invenção podem ser usados em métodos de modulação de uma PI3K colocando a PI3K em contato com qualquer um ou mais dos sais, compostos ou composições descritas no presente documento. Em algumas modalidades, sais e compostos do presente pedido podem atuar como inibidores de uma ou mais PI3Ks. Em modalidades adicionais, os sais e compostos da invenção podem ser usados para modular atividade de uma PI3K num indivíduo que precisa de modulação do receptor administrando uma quantidade modulante de um composto da invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, modular é inibir.

[00214] Dado que o crescimento e sobrevivência de célula do cân-cer são impactados por múltiplas trajetórias de sinalização, o presente pedido é útil para tratar estados de doença caracterizados por mutan- tes de quinase resistentes a fármaco. Ademais, diferentes inibidores de quinase, exibindo diferentes preferências nas quinases que os mesmos modulam as atividades, podem ser usados em combinação. Esta abordagem poderia se provar altamente eficaz no tratamento de estados de doença direcionando múltiplas trajetórias de sinalização, reduzir a probabilidade de surgimento de resistência a fármaco numa célula e reduzir a toxicidade de tratamentos para doença.

[00215] Quinases as quais os presentes sais e compostos se ligam e/ou modulam (por exemplo, inibem) incluem qualquer membro da família PI3K. Em algumas modalidades, a PI3K é PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ ou PI3KY. Em algumas modalidades, a PI3K é PI3Kδ ou PI3KY. Em algumas modalidades, a PI3K é PI3Kδ. Em algumas modalidades, a PI3K é PI3KY. Em algumas modalidades, a PI3K inclui uma mutação. Uma mutação pode ser uma substituição de um aminoácido por outro, ou uma deleção de um ou mais aminoácidos. Em tais modalidades, a mutação pode estar presente no domínio de quinase da PI3K.

[00216] Em algumas modalidades, mais de um sal ou composto da invenção é usado para inibir a atividade de uma quinase (por exemplo, PI3Kδ ou PI3KY).

[00217] Em algumas modalidades, mais de um sal ou composto da invenção é usado para inibir mais de uma quinase, tal como pelo menos duas quinases (por exemplo, PI3Kδ e PI3Ky).

[00218] Em algumas modalidades, um ou mais dos sais ou compos-tos são usados em combinação com outro inibidor de quinase para inibir a atividade de uma quinase (por exemplo, PI3Kδ ou PI3Ky).

[00219] Em algumas modalidades, um ou mais dos sais ou com- postos são usados em combinação com outro inibidor de quinase para inibir as atividades de mais de uma quinase (por exemplo, PI3Kδ ou PI3KY), tal como pelo menos duas quinases.

[00220] Os sais e compostos da invenção podem ser seletivos. En-tende-se por "seletivo" que o composto se liga a ou inibe uma quinase com maior afinidade ou potência, respectivamente, em comparação com a pelo menos uma outra quinase. Em algumas modalidades, os sais e compostos da invenção são inibidores seletivos de PI3Kδ ou PI3KY em relação a PI3Kα e/ou PI3Kβ. Em algumas modalidades, os sais e compostos da invenção são inibidores seletivos de PI3Kδ (por exemplo, em relação a PI3Kα, PI3Kβ e PI3KY). Em algumas modalidades, os sais e compostos da invenção são inibidores seletivos de PI3Kδ (por exemplo, em relação a PI3Kα, PI3Kβ e PI3KY). Em algumas modalidades, a seletividade pode ser pelo menos cerca de 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes. A seletividade pode ser medida por métodos de rotina na técnica. Em algumas modalidades, a seletividade pode ser testada na concentração de Km ATP de cada enzima. Em algumas modalidades, a seletividade de sais e compostos da invenção pode ser determinada por ensaios celulares associados à atividade de quinase PI3K particular.

[00221] Outro aspecto do presente pedido pertence a métodos de tratamento de uma quinase doença ou distúrbio associada (como PI3K) num indivíduo (por exemplo, paciente) administrando ao indivi-dual que precisa de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose de um ou mais sais ou compostos do presente pedido ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Uma doença associada a PI3K pode incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que é diretamente ou indiretamente ligada à expressão ou atividade da PI3K, incluindo superexpressão e/ou níveis anormais de atividade. Em algumas modalidades, a doença pode ser ligada a Akt (quinase de proteína B), alvo mamífero de rapamicina (mTOR), ou quinase dependente de fosfoinositida 1 (PDK1). Em algumas modalidades, a doença relacionada a mTOR pode ser inflamação, aterosclerose, psoríase, reeste- nose, hipertrofia prostática benigna, distúrbios ósseos, pancreatite, angiogênese, retinopatia diabética, aterosclerose, artrite, distúrbios imunológicos, doença renal ou câncer. Uma doença associada a PI3K pode também incluir qualquer doença, distúrbio ou condição que pode ser evitada, melhorara ou curada modulando a atividade de PI3K. Em algumas modalidades, a doença é caracterizada pela atividade anormal de PI3K. Em algumas modalidades, a doença é caracterizada por PI3K mutante. Em tais modalidades, a mutação pode estar presente no domínio de quinase da PI3K.

[00222] Exemplos de doenças associadas a PI3K incluem doenças imune-baseadas envolvendo o sistema incluindo, por exemplo, artrite reumatoide, alergia, asma, glomerulonefrite, lúpus ou inflamação relacionada a qualquer uma das dispostas acima.

[00223] Exemplos adicionais de doenças associadas a PI3K incluem cânceres tais como câncer de mama, próstata, cólon, endométrico, cérebro, bexiga, pele, útero, ovário, pulmões, pancreático, renal, gás-trico ou hematológico.

[00224] Exemplos adicionais de doenças associadas a PI3K incluem doenças pulmonares tais como lesão pulmonar aguda (ALI) e sín- drome da angústia respiratória em adultos (ARDS).

[00225] Exemplos adicionais de doenças associadas a PI3K incluem osteoartrite, reestenose, aterosclerose, distúrbios ósseos, artrite, retinopatia diabética, psoríase, hipertrofia prostática benigna, inflamação, angiogênese, pancreatite, doença renal, doença inflamatória in- testinal, miastênia grave, esclerose múltipla ou síndrome de Sjogren e similares.

[00226] Exemplos adicionais de doenças associadas a PI3K incluem púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), anemia hemolítica au- toimune (AIHA), vasculite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, pênfigo, nefropatia membranosa, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL), leucemia de célula pilosa, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma folicular, linfoma linfoplasmático, linfoma da zona marginal extranodal, linfoma de célula B grande difuso do tipo ativado por célula B (ABC) ou linfoma de célula B grande difuso de célula B central germinal (GBC).

[00227] Em algumas modalidades, a doença é selecionada de púr-pura trombocitopênica idiopática (ITP), anemia hemolítica autoimune, vasculite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, pênfigo, anemia hemolítica autoimune (AIHA), nefropatia membranosa, leucemia linfo- cítica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL), leucemia de célula pilosa, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocíti- co pequeno, linfoma folicular, linfoma linfoplasmático, linfoma da zona marginal extranodal , linfoma de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia prolinfocítica, leucemia linfoblástica aguda, mielo- fibrose, linfoma de tecido linfático associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B, linfoma de célula B grande mediastinal (tímica), granulo- matose linfomatoide, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma de efusão primária, linfoma de célula B grande intravascular, leucemia de célula plasmática, plasmacitoma extramedular, mieloma smouldering (também conhecido como mieloma assintomático), gamopatia mono-clonal de significância indeterminada (MGUS) e linfoma de célula B.

[00228] Em algumas modalidades, o método é um método de tra-tamento de púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) selecionada de ITP recidiva e ITP refratária.

[00229] Em algumas modalidades, o método é um método de tra-tamento de vasculite selecionada de doença de Behçet, síndrome de Cogan, artrite da célula gigante, polimialgia reumática (PMR), arterite de Takayasu, doença de Buerger (tromboangite obliterante), vasculite do sistema nervoso central, doença de Kawasaki, poliarterite nodosa, síndrome de Churg-Strauss, vasculite crioglobulinêmica misturada (induzida por vírus da hepatite C (HPC) ou essencial), púrpura de He- noch-Schonlein (HSP), vasculite hipersensível, poliangiite microscópica, granulomatose de Wegener e vasculite sistêmica (AASV) associada a anticorpo de citoplasma antineutrófilo (ANCA).

[00230] Em algumas modalidades, o método é um método de tra-tamento de linfoma não Hodgkin (NHL) selecionado de NHL recidivo, NHL refratário e NHL folicular recorrente.

[00231] Em algumas modalidades, o método é um método de tra-tamento de linfoma de célula B, em que o referido linfoma de célula B é linfoma de célula B grande difuso (DLBCL).

[00232] Em algumas modalidades, o método é um método de tra-tamento de linfoma de célula B, em que referido linfoma de célula B é linfoma de célula B grande difuso do tipo ativado por célula B (ABC), ou linfoma de célula B grande difuso de célula B central germinal (GBC).

[00233] Em algumas modalidades, a referida doença é osteoartrite, reestenose, aterosclerose, distúrbios ósseos, artrite, retinopatia diabética, psoríase, hipertrofia prostática benigna, inflamação, angiogênese, pancreatite, doença renal, doença inflamatória intestinal, miastênia grave, esclerose múltipla ou síndrome de Sjogren.

[00234] Em algumas modalidades, a referida doença é artrite reu- matoide, alergia, asma, glomerulonefrite, lúpus ou inflamação relacionada a qualquer um dos mencionados acima.

[00235] Em algumas modalidades, o referido lúpus é lúpus eritema- toso sistêmico ou nefrite lúpica.

[00236] Em algumas modalidades, a referida doença é câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer endométrico, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer de pele, câncer do útero, câncer do ovário, câncer dos pulmões, câncer pancreático, câncer renal, câncer gástrico ou um câncer hematológico.

[00237] Em algumas modalidades, o referido câncer hematológico é leucemia mieloblástica aguda ou leucemia mieloide crônica.

[00238] Em algumas modalidades, o referido câncer hematológico é malignidades linfoides de origem de célula B incluindo, linfoma não Hodgkin de célula B indolente/agressivo (NHL) e linfoma de Hodgkin (HL).

[00239] Em algumas modalidades, a referida doença é lesão pul-monar aguda (ALI) ou síndrome da angústia respiratória em adultos (ARDS).

[00240] Conforme usado no presente documento, o termo "colocar em contato" se refere à ligação em ponte junto de partes indicadas num sistema in vitro ou um sistema in vivo. Por exemplo, "colocar" a PI3K em contato com um composto da invenção inclui a administração de um composto do presente pedido a um indivíduo ou paciente, tal como um ser humano, tendo PI3K, bem como, por exemplo, a introdução de um composto da invenção numa amostra contendo uma preparação celular ou purificada contendo a PI3K.

[00241] Conforme usado no presente documento, o termo "indiví-duo" ou "paciente", usado de forma intercambiável, se refere a qual-quer animal, incluindo mamíferos, de preferência, camundongos, ratos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, gado, ovelha, cavalos, ou primatas e, com mais preferência, seres humanos.

[00242] Conforme usado no presente documento, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere à quantidade de com- posto ativo ou agente farmacêutico que provoca a resposta biológica ou medicinal que é está sendo procurada num tecido, sistema, animal, indivíduo ou ser humano por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. Em algumas modalidades, a dosagem do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administrada a um paciente ou individual é cerca de 1 mg a cerca de 2 g, cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg, cerca de 1 mg a cerca de 500 mg, cerca de 1 mg a cerca de 100 mg, cerca de 1 mg a 50 mg ou cerca de 50 mg a cerca de 500 mg.

[00243] Conforme usado no presente documento, o termo "tratar" ou "tratamento" se refere a um ou mais de (1) evitar a doença; por exemplo, evitar uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que pode ser predisposto à doença, condição ou distúrbio, mas ainda não experienciou ou exibiu a patologia ou sintomatologia da doença; (2) inibir a doença; por exemplo, inibir uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que está experienciando a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, impedindo o desenvolvimento adicional da patologia e/ou sintomatologia); e (3) melhorar a doença; por exemplo, melhorar uma doença, condição ou distúrbio num indivíduo que está experienciando ou exibindo a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, revertendo a patologia e/ou sintomatologia), tal como diminuindo a severidade da doença.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO

[00244] Um ou mais agentes farmacêuticos adicionais como, por exemplo, quimioterápicos, agente anti-inflamatórios, esteroides, imu- nossupressores, bem como inibidores de quinase Bcr-Abl, Flt-3, EGFR, HER2, JAK (por exemplo, JAK1 ou JAK2), c-MET, VEGFR, PDGFR, cKit, IGF-1R, RAF, FAK, Akt mTOR, PIM e AKT (por exemplo, AKT1, AKT2, ou AKT3) como, por exemplo, aqueles descritos no documento WO 2006/056399, ou outros agentes como anticorpos tera- pêuticos podem ser usados em combinação com os sais ou compostos do presente pedido para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições associadas a PI3K. O um ou mais agentes farmacêuticos adicionais podem ser administrados a um paciente simultânea ou sequencialmente.

[00245] Em algumas modalidades, o agente farmacêutico adicional é um inibidor de JAK1 e/ou JAK2. Em algumas modalidades, o presente pedido fornece um método de tratamento de uma doença descrita no presente documento (por exemplo, uma malignidade de célula B, como linfoma de célula B difuso) num paciente compreendendo administrar ao paciente um composto descrito no presente documento, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um inibidor de JAK1 e/ou JAK2. As malignidades de célula B podem incluir aquelas descritas no presente documento e no Pedido n° de Série US 61/976.815, depositado em 8 de abril de 2014.

[00246] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK1 e/ou JAK2 é um composto da Tabela 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Os compostos na Tabela 1 são inibidores de JAK1 seletivos (seletivos em relação a JAK2, JAK3 e TYK2). Os IC50s obtidos pelo método do Ensaio A a ATP a 1 mM são mostrados na Tabela 1.TABELA 1 + significa < 10 nM ++ significa > 100 nM +++ significa > 300 nM aDados para enantiômero 1 bDados para enantiômero 2

[00247] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK1 e/ou JAK2 é {1-{1-[3-fluoro-2-(trifluorometil)isonicotinoil]piperidin-4-il}-3-[4-(7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitrila, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00248] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK1 e/ou JAK2 é sal de ácido {1-{1-[3-fluoro-2-(trifluorometil)isonicotinoil]piperidin-4-il}-3- [4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]azetidin-3-il}acetonitrila adípico.

[00249] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK1 e/ou JAK2 é 4-{3-(cianometil)-3-[4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1- il]azetidin-1-il}-2,5-difluoro-N-[(1S)-2,2,2-trifluoro-1-metiletil]benzamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00250] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK1 e/ou JAK2 é selecionado de (R)-3-[1-(6-cloropiridin-2-il)pirrolidin-3-il]-3-[4-(7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, (R)-3-(1- [1,3]oxazolo[5,4-b]piridin-2-ilpirrolidin-3-il)-3-[4-(7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, (R)-4-[(4-{3-ciano-2-[4- (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propil}piperazin-1- il)carbonil]-3-fluorobenzonitrila, (R)-4-[(4-{3-ciano-2-[3-(7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)-1H-pirrol-1-il]propil}piperazin-1-il)carbonil]-3- fluorobenzonitrila, ou (R)-4-(4-{3-[(dimetilamino)metil]-5- fluorofenoxi}piperidin-1-il)-3-[4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H- pirazol-1-il]butanonitrila, (S)-3-[1-(6-cloropiridin-2-il)pirrolidin-3-il]-3-[4- (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, (S)-3-(1- [1,3]oxazolo[5,4-b]piridin-2-ilpirrolidin-3-il)-3-[4-(7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propanonitrila, (S)-4-[(4-{3-ciano-2-[4- (7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H-pirazol-1-il]propil}piperazin-1- il)carbonil]-3-fluorobenzonitrila, (S)-4-[(4-{3-ciano-2-[3-(7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-il)-1H-pirrol-1-il]propil}piperazin-1-il)carbonil]-3- fluorobenzonitrila, (S)-4-(4-{3-[(dimetilamino)metil]-5- fluorofenoxi}piperidin-1-il)-3-[4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-1H- pirazol-1-il]butanonitrila; e sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos mencionados acima.

[00251] Em algumas modalidades, o inibidor de JAK1 e/ou JAK2 é selecionado dos compostos da Publicação de Patente n° U.S. 2010/0298334, depositada em 21 de maio de 2010, Publicação de Patente n° U.S. 2011/0059951, depositada em 31 de agosto de 2010, Publicação de Patente n° U.S. 2011/0224190, depositada em 9 de março de 2011, Publicação de Patente n° U.S. 2012/0149681, depositada em 18 de novembro de 2011, Publicação de Patente n° U.S. 2012/0149682, depositada em 18 de novembro de 2011, Publicação de Patente n° U.S. 2013/0018034, depositada em 19 de junho de 2012, Publicação de Patente n° U.S. 2013/0045963, depositada em 17 de agosto de 2012 e Publicação de Patente n° U.S. 2014/0005166, depositada em 17 de maio de 2013, cada uma das mesmas está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

[00252] Anticorpos exemplificadores para uso em terapia de combinação incluem, sem limitação, trastuzumab (por exemplo, anti- HER2), ranibizumab (por exemplo, anti-VEGF-A), bevacizumab (Avas- tin™, por exemplo, anti-VEGF), panitumumab (por exemplo, anti- EGFR), cetuximab (por exemplo, anti-EGFR), rituximab (Rituxan™, anti-CD20) e anticorpos direcionados para c-MET.

[00253] Um ou mais dos seguintes agentes podem ser usados em combinação com os sais ou compostos do presente pedido e são apresentados como uma lista não limitadora: um agente citostático, cisplatina, doxorrubicina, taxotere, taxol, etoposida, irinotecan, camp- tostar, topotecan, paclitaxel, docetaxel, epotilonas, tamoxifen, 5- fluorouracil, metoxtrexato, temozolomida, ciclofosfamida, SCH 66336, R115777, L778,123, BMS 214662, Iressa, Tarceva, anticorpos a EGFR, Gleevec™, íntron, ara-C, adriamicina, citoxan, gemcitabina, mostarda de uracila, clormetina, Ifosfamida, Melfalan, clorambucil, Pi- pobroman, Trietilenomelamina, Trietilenotiofosforamina, Busulfan, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina, Floxuridina, Ci- tarabina, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, fosfato de Fludarabina, oxa-liplatin, leucovirin, ELOXATIN™, Pentostatina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Bleomicina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Epirubicina, Idarubicina, Mitramicina, Deoxicoformicina, Mitomicina-C, L-Asparaginase, Teniposida 17.alfa.-Etinilestradiol, Dietilstilbestrol, Testosterona, Prednissona, Fluoximesterona, propionato de Dromos- tanolona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilprednisolona, Metiltes- tosterona, Prednisolona, Triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiproges- terona, Aminoglutetimida, Estramustina, Medroxiprogesteroneacetato, Leuprolida, Flutamida, Toremifeno, goserelina, Cisplatina, Carboplatina, hidroxiureia, Amsacrina, Procarbazina, Mitotano, Mitoxantrona, Le- vamisol, Navelbeno, Anastrazol, Letrazol, Capecitabina, Reloxafina, Droloxafina, Hexametilmelamina, Avastina, herceptina, Bexxar, Velca- de, Zevalin, Trisenox, Xeloda, Vinorelbine, Porfimer, Erbitux, Liposomal, Tiotepa, Altretamina, Melfalan, Trastuzumab, Lerozol, Fulvestrant, Exemestana, Fulvestrant, Ifosfomida, Rituximab, C225, Campat, Clofa- rabina, cladribina, afidicolon, rituxan, sunitinib, dasatinib, tezacitabina, Sml1, fludarabina, pentostatina, triapina, didox, trimidox, amidox, 3-AP, MDL-101,731, bendamustina (Treanda), ofatumumab e GS-1101 (também conhecido como CAL-101).

[00254] Quimioterápicos exemplificadores incluem inibidores de proteossoma (por exemplo, bortezomib), talidomida, revlimid e agentes danificadores de DNA como melfalan, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, etoposida, carmustina e similares.

[00255] Esteroides exemplificadores incluem coriticosteroides como dexametassona ou prednisona.

[00256] Inibidores de Bcr-Abl exemplificadores incluem os compos- tos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, dos gêneros e espécies divulgadas na Patente n° US 5.521.184, no documento WO 04/005281, e no Pedido n° de série U.S. 60/578.491.

[00257] Inibidores de Flt-3 adequados exemplificadores incluem compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, conforme divulgado nos documentos WO 03/037347, WO 03/099771 e WO 04/046120.

[00258] Inibidores de RAF adequados exemplificadores incluem compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, conforme divulgado nos documentos WO 00/09495 e WO 05/028444.

[00259] Inibidores de FAK adequados exemplificadores incluem compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, conforme divulgado nos documentos WO 04/080980, WO 04/056786, WO 03/024967, WO 01/064655, WO 00/053595 e WO 01/014402.

[00260] Inibidores de mTOR adequados exemplificadores incluem compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, conforme divulgado no documento WO 2011/025889.

[00261] Em algumas modalidades, os sais e compostos da invenção podem ser usados em combinação com um ou mais outros inibidores de quinase incluindo imatinib, particularmente para tratar pacientes resistentes a imatinib ou outros inibidores de quinase.

[00262] Em algumas modalidades, os sais e compostos da invenção podem ser usados em combinação com um quimioterápico no tratamento de câncer, tal como mieloma múltiplo e pode aprimorar a resposta de tratamento em combinação com a resposta ao agente qui- mioterápico sozinho, sem exacerbação de seus efeitos tóxicos. Exemplos de agentes farmacêuticos adicionais usados no tratamento de mi- eloma múltiplo, por exemplo, podem incluir, sem limitação, melfalan, melfalan mais prednisona [MP], doxorrubicina, dexametasona e Velca- de (bortezomib). Adicionalmente, agentes adicionais usados no trata- mento de mieloma múltiplo incluem inibidores de quinase Bcr-Abl, Flt- 3, RAF e FAK. Efeito aditivos ou sinérgicos são resultados desejáveis da combinação de um inibidor de PI3K do presente pedido com um agente adicional. Ademais, a resistência de células de mieloma múltiplo a agentes tais como dexametasona pode ser reversível mediante tratamento com o inibidor de PI3K do presente pedido. Os agentes podem ser combinados com o presente composto numa forma de dosa-gem única ou contínua, ou os agentes podem ser administrados simultânea ou sequencialmente como formas de dosagem separada.

[00263] Em algumas modalidades, um corticosteroide tal como de- xametasona é administrado a um paciente em combinação com os sais e compostos da invenção quando a dexametasona é administrada intermitentemente em vez de continuamente.

[00264] Em algumas modalidades adicionais, combinações dos sais e compostos da invenção com outros agentes terapêuticos podem ser administradas a um paciente antes, durante e/ou após um transplante de medula óssea ou transplante de células-tronco.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E FORMAS DE DOSAGEM

[00265] Quando empregados como farmacêuticos, os compostos e sais da invenção podem ser administrados sob a forma de composições farmacêuticas. Estas composições podem ser preparadas de maneira bem conhecida na técnica farmacêutica e podem ser administradas por uma variedade de rotas, dependendo se é desejado tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo transdérmica, epidérmica, oftálmica e a membranas mucosas incluindo aplicação intranasal, vaginal e retal), pulmonar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal ou intranasal), oral ou parenteral. A administração parenteral inclui administração injeção ou infusão intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intra-arterial ou intravenosa; ou intracraniana, por exemplo, intratecal ou intraventricular. A administração parenteral pode ser sob a forma de uma única dose de bolus ou pode ser, por exemplo, por uma bomba de perfusão contínua. As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, aspersões, líquidos e pós. Os carreadores farmacêuticos convencionais, bases de água, pó ou óleo, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis.

[00266] Esta invenção também inclui composições farmacêuticas que contêm, como o ingrediente ativo, o composto ou sal da invenção (por exemplo, o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I), em combinação com um ou mais carreadores (excipientes) farmaceutica- mente aceitáveis. Em algumas modalidades, a composição é adequa-da para administração tópica. Na produção das composições da invenção, o ingrediente ativo é tipicamente misturado com um excipien- te, diluído por um excipiente ou confinado no interior de tal veículo sob a forma de, por exemplo, uma cápsula, sachê, papel ou outro recipiente. Quando o excipiente serve como um diluente, o mesmo pode ser um material sólido, semissólido ou líquido, que atua como um veículo, veículo ou meio para o ingrediente ativo. Desta forma, as composições podem ser sob a forma de tabletes, pílulas, pós, losangos, sachês, tablete em formato de cápsula, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou num meio líquido), pomadas contendo, por exemplo, até 10% em peso do composto ativo, cápsulas de gelatina macias e duras, supositórios, soluções injetáveis estéreis e pós embalados estéreis.

[00267] Preparando uma formulação, o composto ativo ou sal pode ser triturado fornecer o tamanho de partícula apropriado antes da combinação com os outros ingredientes. Se o composto ativo ou sal é substancialmente insolúvel, o mesmo pode ser triturado num tamanho de partícula menor que 200 mesh. Se o composto ativo ou sal é substancialmente solúvel em água, o tamanho de partícula pode ser ajustado por trituração para fornecer uma distribuição substancialmente uniforme na formulação, por exemplo, cerca de 40 mesh.

[00268] Os compostos e sais da invenção podem ser triturados usando procedimentos de trituração conhecidos tais como trituração a úmido para obter um tamanho de partícula apropriado para formação de tablete e para outros tipos de formulação. Preparações finamente divididas (nanoparticulados) dos sais e compostos da invenção podem ser preparadas por processos conhecidos na técnica, por exemplo, consulte o Pedido Internacional n° WO 2002/000196.

[00269] Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope e metilce- lulose. As formulações podem incluir adicionalmente: agentes lubrificantes tais como talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes umectantes; agentes emulsificantes e de suspensão; agentes de preservação tal como metila e propilhidroxi-benzoatos; agentes adoçantes; e agentes flavorizantes. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a fornecer liberação rápida, prolongada ou retardada do ingrediente ativo após a administração ao paciente empregando procedimentos conhecidos na técnica.

[00270] As composições podem ser formuladas numa forma de dosagem unitária, cada dosagem contendo de cerca de 5 a cerca de 1000 mg (1 g) mais normalmente cerca de 100 a cerca de 500 mg, do ingrediente ativo. O termo "formas de dosagem unitária" se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e outros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para pro- duzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacêutico adequado.

[00271] Em algumas modalidades, as composições da invenção contêm de cerca de 5 a cerca de 50 mg do ingrediente ativo. Um versado na técnica irá entender que isto incorpora composições contendo cerca de 5 a cerca de 10, cerca de 10 a cerca de 15, cerca de 15 a cerca de 20, cerca de 20 a cerca de 25, cerca de 25 a cerca de 30, cerca de 30 a cerca de 35, cerca de 35 a cerca de 40, cerca de 40 a cerca de 45, ou cerca de 45 a cerca de 50 mg do ingrediente ativo.

[00272] Em algumas modalidades, as composições da invenção contêm cerca de 2,5, cerca de 5, cerca de 7,5, cerca de 10, cerca de 12,5, cerca de 15, cerca de 17,5, cerca de 20, cerca de 22,5 ou cerca de 25 mg do ingrediente ativo. Em algumas modalidades, as composições da invenção contêm cerca de 5 mg do ingrediente ativo. Em algumas modalidades, as composições da invenção contêm cerca de 10mg do ingrediente ativo.

[00273] Dosagens similares podem ser usadas dos compostos e sais descritos no presente documento nos métodos e usos da invenção.

[00274] O composto ativo ou sal pode ser eficaz numa ampla faixa de dosagem e é geralmente administrado numa quantidade farmaceu- ticamente eficaz. Será entendido, no entanto, que a quantidade do composto ou sal realmente administrado será normalmente determinada por um médico, de acordo com as circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a rota de administração escolhida, o composto ou sal real administrado, a idade, peso e a resposta do paciente individual, a severidade dos sintomas do paciente e similares.

[00275] Para preparar composições sólidas tais como tabletes, o ingrediente ativo principal é misturado com um excipiente farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto ou sal do presente pedido. Com referência a estas composições de pré-formulação como homogêneas, o ingrediente ativo é tipicamente disperso uniformemente na composição de modo que a composição possa ser prontamente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes como tabletes, pílulas e cápsulas. A pré-formulação sólida é, então, subdividida em formas de dosagem unitária do tipo descrito acima contendo de, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg do ingrediente ativo do presente pedido.

[00276] Os tabletes ou pílulas do presente pedido podem ser re-vestidos ou de outra forma formulados para fornecer uma forma de dosagem proporcionando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o tablete ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e de dosagem externa, sendo que o segundo está sob a forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto pelo duodeno, ou até seja liberado de maneira retardada. Uma variedade de materiais pode ser usada nestas camadas ou revestimentos entéricos, como os materiais incluindo inúmeros ácidos poli- méricos e misturas de ácidos poliméricos com estes materiais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.

[00277] As formas líquidas nas quais os compostos, sais e composições farmacêuticas do presente pedido podem ser incorporadas para a administração oral ou por injeção incluem, soluções aquosas, xaropes adequadamente flavorizados, suspensões aquosas ou oleosas e emulsões flavorizadas com óleos comestíveis como óleo de caroço de algodão, óleo de gergelim, óleo de coco ou óleo de amendoim, bem como elixires e veículos farmacêuticos similares.

[00278] Composições para inalação e insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, ou misturas dos mesmos e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados conforme descrito supra. Em algumas modalidades, as composições são administradas pela rota respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. Composições podem ser nebulizadas pelo uso de gases inertes. Soluções nebulizadas podem ser respiradas diretamente do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebuliza- ção pode ser fixado a uma câmara de máscara facial, ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. Composições em solução, suspensão ou pó podem ser administradas oral ou nasalmente de dispositivos que aplicam a formulação de maneira apropriada.

[00279] Formulações tópicas podem conter um ou mais carreado- res convencionais. Em algumas modalidades, pomadas podem conter água e um ou mais carreadores hidrofóbicos selecionados de, por exemplo, parafina líquida, alquil éter de polioxietileno, propilenoglicol, Vaselina branca e similares. Composições veículos de cremes podem ser à base de água em combinação com glicerol e um ou mais outros componentes, por exemplo, glicerinamonostearato, PEG- glicerinamonostearato e álcool cetilstearílico. Géis podem ser formulados usando álcool isopropílico e água, adequadamente em combinação com outros componentes como, por exemplo, glicerol, hidroxietil celulose e similares. Em algumas modalidades, formulações tópicas contêm pelo menos cerca de 0,1, pelo menos cerca de 0,25, pelo menos cerca de 0,5, pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, ou pelo menos cerca de 5% em peso do composto ou sal da invenção. As formulações tópicas podem ser adequadamente embaladas em tubos de, por exemplo, 100 g que são opcionalmente associados a instruções para o tratamento da indicação selecionada, por exemplo, psorí- ase ou outra condição de pele.

[00280] A quantidade de composto, sal ou composição administrada a um paciente irá variar dependendo do que está sendo administrado, do propósito da administração, tal como profilaxia ou terapia, do estado do paciente, da maneira de administração e similares. Em aplicações terapêuticas, as composições podem ser administradas a um paciente que já sofre de uma doença numa quantidade suficiente para curar ou acabar, pelo menos parcialmente, com os sintomas da doença e suas complicações. Doses eficazes irão depender da condição da doença sendo tratada bem como pelo julgamento do médico atendente dependendo de fatores tais como a severidade da doença, a idade, o peso e a condição geral do paciente e similares.

[00281] As composições administradas a um paciente podem estar sob a forma de composições farmacêuticas descritas acima. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais ou podem ser filtradas até a esterilização. Soluções aquosas podem ser embaladas para uso como são ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com um veículo aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações de composto tipicamente será entre 3 e 11, com mais preferência, de 5 a 9 e com máxima preferência, de 7 a 8. Será entendido que o uso de certos excipien- tes, carreadores ou estabilizadores anteriores irão resultar na formação de sais farmacêuticos.

[00282] A dosagem terapêutica de um composto ou sal do presente pedido pode variar de acordo com, por exemplo, o uso particular para o qual o tratamento é feito, a maneira de administração do composto ou sal, a saúde e a condição do paciente e o julgamento do médico que prescreve. A proporção ou a concentração de um composto ou sal da invenção numa composição farmacêutica pode variar dependendo de inúmeros fatores incluindo dosagem, características químicas (por exemplo, hidrofobicidade) e a rota de administração. Por exemplo, os compostos e sais da invenção podem ser fornecidos em solução tampão fisiológica aquosa contendo cerca de 0,1 a cerca de 10% em p/v do composto para administração parenteral. Algumas faixas de dose típicas são de cerca de 1 Qg/kg a cerca de 1 g/kg de peso corporal por dia. Em algumas modalidades, a faixa de dose é de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia. É pro-vável que a dosagem dependa de tais variáveis como tipo e a extensão de progressão da doença ou distúrbio, da situação geral de saúde do paciente particular, da eficácia relativa do composto do composto selecionado, da formulação do excipiente e sua rota de administração. As dosagens eficazes podem ser extrapoladas destas curvas de resposta à dosagem derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro.

[00283] As composições da invenção podem incluir, ainda, um ou mais agentes farmacêuticos adicionais tais como um quimioterápico, esteroide, composto anti-inflamatório, ou imunossupressor, exemplos dos quais são fornecidos no presente documento.

KITS

[00284] O presente pedido também inclui kits farmacêuticos úteis, por exemplo, no tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios associados a PI3K, tal como câncer, que incluem um ou mais recipientes contendo uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção. Tais kits pode incluir, ainda, se for desejado, um ou mais de vários componentes convencionais de kit farmacêutico, tais como, por exemplo, recipientes com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, recipientes adicionais, etc., conforme ficará prontamente evidente para os versados na técnica. Instruções, ou como insertos ou como etiquetas, indicando quantidades dos componentes a serem administrados, diretrizes para administração, e/ou diretrizes para mis- turar os componentes, também podem ser incluídas no kit.

[00285] A invenção será descrita com mais detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Os versados na técnica irão reconhecer prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser mudados ou modificados para render essencialmente os mesmos resultados. Foi constatado que o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I e o composto de Fórmula I são inibidores de PI3K de acordo com pelo menos um ensaio descrito no presente documento.

EXEMPLOS

[00286] A invenção será descrita com mais detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma. Os compostos exemplificadores, ou sais dos mesmos, contendo um ou mais centros quirais foram obtidos em forma de racemato ou como misturas isoméricas, exceto se especificado em contrário.

MÉTODOS GERAIS

[00287] Purificações de LC-MS preparatória de alguns dos com-postos preparados foram realizadas em sistemas de fracionamento direcionado de massa Waters. A configuração de equipamento básico, protocolos e software de controle para a operação destes sistemas foram descritos com mais detalhes na literatura. Consulte, por exemplo, "Two-Pump At Column Dilution Configuration for Preparative LC- MS", K. Blom, J. Combi. Chem., 4, 295 (2002); "Optimizing Preparative LC-MS Configurations and Methods for Parallel Synthesis Purification", K. Blom, R. Sparks, J. Doughty, G. Everlof, T. Haque, A. Combs, J. Combi. Chem., 5, 670 (2003); e "Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization", K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Combi. Chem., 6, 874 a 883 (2004). Os compostos separados foram tipicamente submetidos à cromatografia líquida / espectrometria de massa analítica (LCMS) para análise de pureza sob as seguintes condições: Instrumento; Agilent série 1100, LC/MSD, Coluna: Waters SunfireTM Cie 5 μm, 2,1 x 50 mm, Tampões: fase móvel: A: 0,025% de TFA em água e fase móvel B: acetonitrila; gradiente 2% a 80% de B em 3 minutos com taxa de fluxo 2,0 ml/minuto.

[00288] Alguns dos compostos preparados foram também separados numa escala preparatória por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) com detector de MS ou cromatografia flash (gel de sílica) conforme indicado nos Exemplos. As condições de coluna de cromatografia líquida de alta eficiência preparatória de fase reversa típica (RP-HPLC) são da seguinte forma:

[00289] pH = 2 purificações: Waters SunfireTM C18 5 μm , coluna de 19 x 100 mm, eluição com fase móvel A: 0,1% de TFA (ácido trifluoro- acético) em água e fase móvel B: acetonitrila; a taxa de fluxo era 30 ml/minuto, o gradiente de separação foi otimizado para cada composto usando o protocolo de Otimização de Método Específico de Composto conforme descrito na literatura [consulte "Preparative LCMS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization", K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Comb. Chem., 6, 874 a 883 (2004)]. Tipicamente, a taxa de fluxo usada com a coluna de 30 x 100 mm foi 60 ml/minuto.

[00290] pH = 10 purificações: Waters XBridge C18 5 μm, coluna de 19 x 100 mm, eluição com fase móvel A: 0,15% de NH4OH em água e fase móvel B: acetonitrila; a taxa de fluxo era 30 ml/minuto, o gradiente de separação foi otimizado para cada composto usando o protocolo de Otimização de Método Específico de Composto conforme descrito na literatura [Consulte "Preparative LCMS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization", K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Comb. Chem., 6, 874 a 883 (2004)]. Tipicamente, a taxa de fluxo usada com coluna de 30 x 100 mm foi 60 ml/minuto.

[00291] Alguns dos compostos preparado também foram analisados através de Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). As condições de instrumento de DSC típicas foram as seguintes:

[00292] Calorimetria de Varredura Diferencial da TA Instrument, Modelo Q200 com autoamostrador: 30 a 350°C a 10°C/min; pote e tampa de amostra de alumínio T-zero; fluxo de gás nitrogênio a 50 ml/min.

[00293] Instrumento 822 de Calorimetria de Varredura Diferencial da Mettler Toledo (DSC): 40 a 340°C a uma taxa de aquecimento de 10°C/min.

[00294] Alguns dos compostos preparados também foram analisados através de Análise Termogravimétrica (TGA). As condições de instrumento de TGA típicas foram as seguintes:

[00295] Analisador Termogravimétrico da TA Instrument, Modelo Pyris: Rampa de temperatura de 25°C para 300 °C a 10 °C/min; fluxo de purga de gás nitrogênio a 60 ml/min; retentor de amostra de cadinho de cerâmica de TGA.

[00296] Q500 da TA Instrument: Rampa de temperatura de 20 °C para 300°C a 10°C/min.

[00297] Alguns dos compostos preparados também foram analisados através de Difração de Pó de Raios X (XRPD). As condições de instrumento de XRPD típicas foram as seguintes:

[00298] instrumento Difratômero de Pós de Raios X da Bruker D2 PHASER: comprimento de onda de radiação por raios X: pós de raios X 1,05406 Â CuKAI;: 30 KV, 10 mA; pós de amostra: disperso num retentor de amostra de fundo zero; condições de medição geral: ângulo de partida - 5 graus, ângulo de parada - 60 graus, Amostragem - 0,015 grau, Velocidade de varredura - 2 graus/min.

[00299] Difratômetro de Pó Rigaku Miniflex: Cu a 1,054056 Â com filtro Kβ; condições de medição geral: ângulo de partida - 3 graus, ângulo de parada - 45 graus, Amostragem - 0,02 grau, Velocidade de varredura - 2 graus/min. EXEMPLO 1. SÍNTESE DE (R)-4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5- ((R)-1-HIDROXIETIL)FENIL)PIRROLIDIN-2-ONA ETAPA 1. 1-(5-CLORO-4-FLUORO-2-HIDROXIFENIL)ETANONA (II)

[00300] 4-Cloro-3-fluorofenol (i, 166 g, 1,11 mol) e cloreto de acetila (107 ml, 1,50 mol) foram carregados num frasco de 5 litros à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada e se transformou numa solução transparente enquanto foi registrado que a temperatura de lote diminuiu para 6°C. A mistura de reação foi, então, aquecida a 60°C por 2 horas. A mistura de reação foi carregada com nitrobenzeno (187,5 ml, 1,82 mol) e subsequentemente resfriada para a temperatura ambiente. Tricloreto de alumínio (160 g, 1,2 mmol) foi, então, adicionado à mistura em três porções (50 g, 50 g e 60 g em intervalos de 5 min). A temperatura de lote aumentou para 78°C com o término da adição. A mistura de reação foi, então, aquecida a 100 a 120°C por 3 horas, tempo no qual a análise por HPLC mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi, então, resfriada para 0°C e carregada com hexanos (0,45 l), acetato de etila (0,55 l) e, então, carregada lentamente com ácido clorídrico aquoso a 1,0 N (1,0 l) à temperatura ambiente. A adição de ácido clorídrico aquoso foi exotérmica e a temperatura de lote aumentou de 26°C para 60°C. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos. As camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada sequencialmente com ácido clorídrico aquoso a 1,0 N (2 x 600 ml) e água (400 ml). A camada orgânica foi, então, extraída com solução de hidróxido de sódio aquoso a 1,0 N (2 x 1,4 l). As soluções básicas combinadas foram acidificadas para pH 2 pela adição de ácido clorídrico aquoso a 12 até que nenhum precipitado adicional se separasse. O sólido resultante foi coletado por filtração, lavado com água e seco no funil de filtro sob sucção para render o composto ii como um sólido amarelo (187,4 g, 89,5%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 12,44 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 2,61 (s, 3H). ETAPA 2. 1-(5-CLORO-4-FLUORO-2-HIDRÓXI-3- IODOFENIL)ETANONA (III)

[00301] 1-(5-Cloro-4-fluoro-2-hidroxifenil)etanona (ii, 100,0 g, 530,3 mmols) foi dissolvido em ácido acético (302 ml) e N-iodosuccinimida (179,2 g, 796,5 mmols) foi adicionado à solução. A mistura de reação foi agitada de cerca de 61°C a cerca de 71°C por 2 horas, tempo no qual a análise por HPLC indicou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi, então, resfriada para a temperatura ambiente, água (613 ml) foi adicionada e a pasta aquosa resultante foi agitada à temperatu- ra ambiente por 30 minutos. O produto foi coletado por filtração e enxaguado com água para proporcionar sólidos marrons. O produto úmido foi dissolvido em ácido acético (400 ml) a 60°C. Água (800 ml) foi adicionada (durante 15 minutos) à solução para precipitar produto puro. O produto foi coletado por filtração e lavado com água (100 ml). O produto foi seco no funil de filtro sob sucção por 18 horas para render o composto iii como um sólido marrom (164,8 g, 95,0% de rendimento). 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ13,34 (s, 1H), 8,26 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 2,68 (s, 3H). ETAPA 3. 1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-IODOFENIL)ETANONA (IV)

[00302] Em um frasco de fundo redondo de três gargalos de 5 litros equipado com um condensador e um termômetro, 1-(5-cloro-4-fluoro- 2-hidróxi-3-iodofenil)etanona (iii, 280 g, 840 mmols) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (600 ml). Durante a dissolução, a temperatura interna caiu de 19,3°C para 17,0°C. Iodoetano (81,2 ml, 1020 mmols) foi adicionado à mistura resultante. Carbonato de potássio (234 g, 1690 mmols) foi, então, adicionados durante 2 minutos à mistura de reação e nenhuma mudança na temperatura de lote foi observada. A mistura de reação foi aquecida para 60°C por 3 horas, tempo no qual a análise por HPLC indicou que a reação foi concluída. Foi permitido que a mistura de reação fosse resfriada para a temperatura ambiente e o produto foi coletado por filtração. Os sólidos foram dissolvidos numa mistura de DCM (1,0 l), hexano (500 ml) e água (2,1 l). O sistema bifá- sico foi agitado a 20°C por 20 minutos. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com DCM (1,0 l). A camada orgânica combinada foi lavada com água (2 x 250 ml) e salmoura (60 ml). A fa- se orgânica foi separada, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo até a secura para render o composto iv como um sólido amarelo (292 g, 94% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ7,69 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,95 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 2,62 (s, 3H), 1,49 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS para C10H10ClFIO2 (M + H)+: m/z = 342,9. ETAPA 4. 2-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-IODOFENIL)-2- METIL-1,3-DIOXOLANO (V)

[00303] Uma solução de 1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3- iodofenil)etanona (iv, 250,0 g, 693,4 mmols) e 1,2-etanodiol (58,0 ml, 1040 mmols) em tolueno (1,5 l) foi tratada com ácido p- toluenossulfônico monoidratado (10,6 g, 55,5 mmols). O frasco de reação foi equipado com um trap Dean-Stark e a mistura foi aquecida a refluxo por 7 horas. A análise por LCMS indicou que a mistura de reação continha 8,3% de material de partida e 91,7% de produto. A mistura de reação foi resfriada para 106°C e uma quantidade adicional de 1,2-etanodiol (11,6 ml, 208 mmols) foi introduzida através de uma seringa. A mistura de reação foi, então, aquecida a refluxo por mais 8 horas. A análise por LCMS indicou que a mistura de reação continha 3,6% de material de partida e 96,4% de produto. A mistura de reação foi resfriada para 106°C e 1,2-etanodiol adicional (7,73 ml, 139 mmols) foi introduzido através de uma seringa. A mistura de reação foi aquecida sob refluxo por mais 15,5 horas. A análise por LCMS indicou que a mistura de reação continha 2,2% de material de partida e 97,8% de produto.

[00304] A mistura de reação foi, então, resfriada para 0°C e água (200 ml) e NaHCO3 saturado aquoso (300 ml) foram adicionados para ajustar a mistura para um pH de 9. DCM (200 ml) foi adicionado e o lote foi agitado for 10 minutos. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com tolueno (300 ml). A camada orgânica combinada foi lavada sequencialmente com uma mistura de água (200 ml) e NaHCO3 saturado aquoso (200 ml), água (300 ml), salmoura (300 ml), seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo até a secura para fornecer o composto cru v como um sólido marrom claro (268 g 100% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,59 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,26 e 3,96 (m, 4H), 3,92 e 3,72 (m, 2H), 1,74 (s, 3H), 1,50 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). LCMS para C12H14ClFIO3 (M + H)+: m/z = 387,0. ETAPA 5. 3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-(2-METIL-1,3- DIOXOLAN-2-IL)BENZALDEÍDO (VI)

[00305] A uma solução agitada de 2-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3- iodofenil)-2-metil-1,3-dioxolano (v, 135,0 g, 349,2 mmols) (86,8% de pureza por HPLC com 5,5% da cetona) em tetra-hidrofurano anidro (300 ml) a cerca de 0°C a cerca de 3°C foi lentamente adicionado complexo de isopropilmagnésio e cloreto de lítio a 1,3 M em THF (322,3 ml, 419,0 mmols) durante 1 hora. A mistura de reação foi agitada de cerca de 0°C a cerca de 5°C por 30 minutos, tempo no qual a análise por LCMS indicou que a reação de troca de iodo-magnésio foi concluída. N-formilmorfolina (71,1 ml, 700 mmols) foi, então, adicionada à mistura de reação durante 1 hora de cerca de 0oC a cerca de 8°C. A mistura de reação foi agitada de cerca de 0°C a cerca de 8°C por mais 1 hora, tempo no qual análises por LCMS e HPLC mostraram que o material de partida foi consumido e uma quantidade significativa de subproduto de deiodinação, 2-(5-cloro-2-etóxi-4-fluorofenil)-2-metil- 1,3-dioxolano foi observada. A reação foi bruscamente arrefecida com uma solução aquosa de ácido cítrico (120,8 g, 628,6 mmols) em água (1,20 l) a 0°C. A mistura de reação bruscamente arrefecida foi, então, extraída com EtOAc (2 x 600 ml). As fases foram prontamente separadas. A camada orgânica combinada foi lavada sequencialmente com água (300 ml) e salmoura (500 ml), seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash em gel de sílica com EtOAc/hexano a 0 a 10% para render o composto de produto cru vi como um sólido amarelo pálido, que foi uma mistura do produto desejado, 3-cloro-6-etóxi-2-fluoro-5-(2- metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldeído (vi, 80 g, 80%) contendo 36 % mo-lar do subproduto de deiodinação, 2-(5-cloro-2-etóxi-4-fluorofenil)-2- metil-1,3-dioxolano conforme indicado por análise de RMN. O composto de produto cru vi foi adicionalmente purificado pela formação do aduto de bissulfito de sódio correspondente.

[00306] Bissulfito de sódio (36,91 g, 354,7 mmols) foi dissolvido em água (74,3 ml, 4121 mmols). A uma solução agitada de 3-cloro-6-etóxi- 2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)benzaldeído cru (vi, 80,00 g, 177,3 mmols) em acetato de etila (256,0 ml), a solução de bissulfito de sódio recentemente preparada foi adicionada numa porção. A solução foi agitada por cerca de 10 minutos e precipitados foram observados. A pasta aquosa foi, então, agitada por mais 1 hora. O aduto de aldeído- bissulfito foi coletado por filtração, lavado com EtOAc e seco sob vácuo e atmosfera de nitrogênio por 20 hora para render um sólido bran-co (58,2 g, 83,6% de rendimento). Ao aduto de aldeído-bissulfito (58,2 g, 148 mmols) misturado em hidróxido de sódio aquoso a 1,0 M (296 ml, 296 mmols) foi adicionado éter metil t-butílico (600 ml) (MTBE). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 6 minutos para render uma mistura bifásica transparente e a agitação continuou por mais 5 minutos. A fase orgânica foi coletada e a camada aquosa foi extraída com MTBE (2 x 300 ml). As camadas orgânicas combina- das foram lavadas com salmoura (300 ml), secas em Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo para render o composto puro vi como um sólido cristalino branco (31,4 g, 73,4% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 10,27 (s, 1H), 7,78 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,10 e 3,96 (m, 4H), 3,87 e 3,76 (m, 2H), 1,72 (s, 3H), 1,44 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). LCMS para C13H15ClFO4 (M + H)+: m/z = 289,0. ETAPA 6. (E)-2-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-(2- NITROVINIL)FENIL)-2-METIL-1,3-DIOXOLANO (VII)

[00307] Em um frasco de fundo redondo de 4 gargalos de 5 litros equipado com agitador suspenso, septa, termopar, entrada de nitrogênio e condensador foi carregado 3-cloro-6-etóxi-2-fluoro-5-(2-metil-1,3- dioxolan-2-il)benzaldeído (vi, 566,2 g, 1961 mmols), nitrometano (1060 ml, 19600 mmols) e ácido acético glacial (1120 ml). Posteriormente, a mistura de reação foi carregada com benzilamina (53,6 ml, 490 mmols) e a mistura resultante foi aquecida para 60°C e a reação foi monitorada por LCMS por 5,5 horas. Uma análise de linha de base inicial foi tirada em t = 0. A reação foi verificada após 2 horas e 5 horas. Após 2 horas, havia cerca de 20% de aldeído de material de partida não reagido. Após 5 horas, o perfil de reação foi o seguinte: material de partida composto vi (< 2%), intermediário imina (< 4%), composto de produto vii (> 93%) e aduto de benzilamina Michael (não detectado). No instante de reação de 5,5 horas, a reação foi considerada completa. A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e diluída com acetato de etila (3,0 l). A mistura foi dividida na metade para tra-balho devido ao grande volume envolvido.

[00308] Cada metade foi tratada de acordo com o seguinte proce- dimento: A mistura de reação foi primeiro lavada com NaCl a 1,5 M em água (2 x 1500 ml; após cada lavagem, a saída de volume aquoso aumentou em comparação com a entrada, sugerindo que ácido acético e/ou nitrometano estavam sendo removidos). A mistura foi, então, resfriada a cerca de 15°C e lavada com solução de NaOH aquosa a 4 M (4 x 300 ml) até que o extrato aquoso alcançasse pH de 8 a 9. Durante as lavagens iniciais, a camada aquosa permaneceu ácida, porém, conforme a camada aquosa se tornava ligeiramente básica durante as lavagens subsequente, a mistura foi aquecida e o extrato era escuro. As camadas foram separadas. A camada orgânica após o ajuste de pH foi, então, lavada com cloreto de sódio a 1,5 M em água (1000 ml) e água (500 ml). Emulsão e partição lenta foram observadas durante estas lavagens finais. A fase orgânica foi seca em MgSO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O xarope âmbar resultante foi colocado sob alto vácuo de um dia para o outro. O xarope solidificou e 740 g de produto cru foram obtidas.

[00309] Heptano (1,3 l) foi adicionado ao produto cru, formando uma pasta aquosa, que foi aquecida num banho de água de 60°C até que todos os sólidos fossem dissolvidos. A solução resultante foi filtrada num frasco de fundo redondo de 4 gargalos de 3 litros transparente equipado com um agitador suspenso e entrada de nitrogênio. O filtro foi enxaguado com heptano (40 ml). A solução filtrada foi resfriada para a temperatura ambiente e agitada por 5 horas. Precipitados sólidos foram observados e a pasta aquosa foi resfriada para 0°C num banho de gelo por 1 hora. O produto foi coletado por filtração e o bolo úmido resultante foi lavado com 500 ml de heptano resfriado com gelo. O produto foi parcialmente seco no filtro sob sucção a vácuo e adicionalmente seco sob alto vácuo de um dia para o outro. O filtrado e a solução de lavagem foram concentrados sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi mantido para purificação de coluna.

[00310] Sólidos de cristalização de heptano foram dissolvidos num pequeno volume de DCM e EtOAc/hexano a 20% e carregados numa coluna contendo cerca de 1 kg de gel de sílica. A coluna foi eluída com EtOAc/hexano a 20%. As frações desejadas foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida para render um sólido amarelo. O sólido foi seco sob alto vácuo de um dia para o outro para render 497 g de composto de produto vii como um sólido cristalino amarelo pálido.

[00311] O filtrado concentrado e a lavagem da cristalização de heptano foram carregados na mesma coluna conforme acima usando EtOAc/hexano a 20%. A coluna foi eluída usando o mesmo sistema de solvente conforme acima para remover impurezas de linha de base e ácido acético residual. As frações desejadas foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida para render um óleo âmbar avermelhado. O óleo foi colocado sob alto vácuo e cerca de 220 g de produto cru foram obtidas. Este produto cru foi dissolvido em heptano (500 ml) e considerado com uma pequena quantidade do produto sólido de primeira safra. A pasta aquosa foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e, então, resfriada num banho de gelo por 3 horas. O produto de segunda safra foi coletado por filtração. O produto foi seco sob alto vácuo e 110 g de produto foram obtidas como sólido amarelo. A quantidade total de composto de produto vii obtida foi 607 g (93,3% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,94 (s, 2H), 7,68 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 4,07 e 3,95 (m, 4H), 3,82 e 3,73 (m, 2H), 1,65 (s, 3H), 1,39 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS para C14H16ClFNO5 (M + H)+: m/z = 332,0. ETAPA 7. (R)-DIMETIL-2-(1-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-(2- METIL-1,3-DIOXOLAN-2-IL)FENIL)-2-NITROETIL)MALONATO (VIII)

[00312] Em um frasco de fundo redondo de 2 litros com uma barra de agitação magnética e entrada de nitrogênio contendo (E)-2-(5-cloro- 2-etóxi-4-fluoro-3-(2-nitrovinil)fenil)-2-metil-1,3-dioxolano (vii, 352,8 g, 1064 mmols) foram adicionados tetra-hidrofurano anidro (1,06 l) e ma- lonato de dimetila (146 ml, 1280 mmols). (1S,2S)-N,N'-dibenzilciclo- hexano-1,2-diamina-dibromoníquel (Catalisador de Evans, 21,4 g, 26,6 mmols) foi carregado na mistura de reação. A mistura de reação foi marrom em cor e uma solução homogênea foi observada. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 18,5 horas. A reação foi analisada após 18,5 horas por HPLC. Material de partida não reagido, composto vii, estava presente a 2%. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover THF e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia flash (DCM/hexanos usado para carregamento, 1422 g de gel de sílica foram usadas para esta coluna e a coluna foi eluída com 10% para EtOAc/hexano a 20%; frações de coluna foram monitoradas por TLC usando EtOAc/hexano a 30% como eluente e foi visualizado por UV). As frações desejadas foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi seco a alto vácuo. Ao longo do tempo, o xarope se solidificou em sólidos amarelo claro (503,3 g) e uma amostra foi tirada para análise por HPLC quiral. A pureza quiral foi 95,7 % do (R)-enantiômero desejado e 4,3% do (S)- enantiômero indesejado. Etanol (1,0 l) foi adicionado aos sólidos e a mistura foi aquecida num banho de água a 60°C até que os sólidos se dissolvessem. A solução foi filtrada num frasco de fundo redondo de 4 gargalos de 3 litros transparente através de papel de filtro Whatman n° 1. A solução filtrada foi resfriada para a temperatura ambiente durante agitação. A cristalização foi observada após 30 minutos de agitação e a pasta aquosa foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. A pasta aquosa foi resfriada num banho de gelo por 1 hora. O produto foi coletado por filtração e o bolo de filtro resultante foi lavado com etanol resfriado com gelo (500 ml) e foi parcialmente seco no filtro. Os sólidos foram secos sob alto vácuo para render o produto desejado viii (377,5 g) como sólidos cristalinos branco. A pureza quiral foi determinada por HPLC quiral como 100% do (R)-enantiômero desejado e 0% do (S)- enantiômero indesejado.

[00313] O filtrado e a lavagem foram combinados e concentrados sob pressão reduzida num óleo (118,9 g). O óleo foi dissolvido em etanol (475,0 ml) (4 ml/g) e foi considerado com os cristais de primeira safra. A pasta aquosa resultante foi agitada por 16 horas à temperatura ambiente e, então, resfriada num banho de gelo por 5,5 horas. O produto de segunda safra foi isolado por filtração e foi parcialmente seco no filtro. O mesmo foi seco sob alto vácuo para render o produto de segunda safra (31,0 g). A pureza quiral foi determinada por HPLC quiral como 98,3% do (R)-enantiômero desejado e 1,7 % do (S)- enantiômero indesejado. O rendimento combinado da primeira e da segunda safras de produto foi 408,5 g em 82,8% de rendimento. 1H RMN (500 MHz, DMSO e d6) δ 7,51 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 5,20 e 4,81 (m, 2H), 4,62 (m, 1H), 4,14 e 4,03 (m, 2H), 4,03 e 3,97 (m, 2H), 3,95 e 3,88 (m, 1H), 3,84 e 3,72 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 1,61 (s, 3H), 1,39 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS para C19H24ClFO9 (M + H)+: m/z = 463,9. ETAPA 8. 2-(1-(3-ACETIL-5-CLORO-2-ETÓXI-6-FLUOROFENIL)-2- NITROETIL)MALONATO DE (R)-DIMETILA (IX)

[00314] A uma solução agitada de (R)-dimetil-2-(1-(3-cloro-6-etóxi- 2-fluoro-5-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)fenil)-2-nitroetil)malonato (viii, 244,0 g, 526,0 mmols) em acetona (1,2 l) num frasco de fundo redon do de 5 litros de três gargalos, equipado com um agitador mecânico, foi adicionado iodo (13,4 g, 52,6 mmols) à temperatura ambiente. A solução marrom resultante foi aquecida a 50°C num banho de água por 30 minutos, tempo no qual a análise por LCMS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e, então, bruscamente arrefecida com uma solução de tios- sulfato de sódio (17,0 g, 108 mmols) em água (160 ml) para render uma solução transparente amarelo pálido. Neste momento, uma quantidade adicional de água (1,2 l) foi carregada na solução bruscamente arrefecida e a pasta aquosa branca resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. O sólido foi, então, coletado por filtração e re- dissolvido em acetona (1,4 l) a 40°C. A solução foi resfriada para a temperatura ambiente e, então, água adicional (1,4 l) foi adicionada. A pasta aquosa branca resultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. O sólido foi coletado por filtração e lavado com água (3 x 100 ml). O produto sólido foi seco num funil de filtro sob sucção com um fluxo de nitrogênio por 46 horas para render o composto ix como um sólido branco (212 g, 96% de rendimento). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,54 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,09 e 4,67 (m, 3H), 4,10 e 3,83 (m, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 1,46 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS para C17H20ClFNO8 (M + H)+: m/z = 420,1. ETAPA 9. 2-((R)-1-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-((R)-1- HIDROXIETIL)FENIL)-2-NITROETIL)MALONATO DE DIMETILA (X)

[00315] A uma solução agitada de (3aS)-1-metil-3,3-difeniltetra- hidro-3H-pirrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaborol, ((S)-MeCBS, 16,39 g, 59,12 mmols, 0,1 eq.) em THF anidro (100 ml) num frasco de fundo redondo de 5 litros à temperatura ambiente foram adicionados uma solução de complexo de borano-THF a 1,0 M em THF (591 ml, 591 mmol, 1 eq.) seguido de eterato de triflureto de boro (3,75 ml, 29,6 mmols, 0,05 eq). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos. Uma solução de [(1R)-1-(3-acetil-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)-2- nitroetil]malonato de dimetila (ix, 253,0 g, 591,2 mmols) em THF anidro (1,7 l) foi, então, adicionada por gotejamento através de um funil de adição durante 60 minutos. O frasco que continha a cetona ix foi enxa-guado com THF anidro (135 ml) e a solução foi adicionada por goteja- mento através do funil de adição à mistura de reação. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por mais 10 minutos, tempo no qual a análise por LCMS mostrou conversão completa da cetona no álcool. A reação foi bruscamente arrefecida por adição por gotejamen- to de metanol (71,8 ml, 1770 mmols) a 0°C. A mistura de reação brus-camente arrefecida foi agitada à temperatura ambiente por 15 minutos antes de a mesma ser concentrada in vacuo para render o produto cru. Os produtos crus deste lote e um lote similar (usando 200 g de material de partida) foram combinados e foram purificados por cromatografia em coluna de gel de sílica usando 0 a 5 % de MeOH/DCM como elu- ente para render o composto x como um sólido branco (437 g, 97,9% de rendimento). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,50 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,13 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 5,01 e 4,65 (m, 3H), 4,14 e 3,89 (m, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 1,57 e 1,42 (m, 6H). LCMS para C17H21ClFNNaO8 (M + Na)+: m/z = 444,0. ETAPA 10. 4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-((R)-1- HIDROXIETIL)FENIL)-2-OXOPIRROLIDINA-3-CARBOXILATO DE (4R)-METILA (XI)

[00316] Um frasco de fundo redondo Morton com 3 gargalos contendo ((1R)-1-{3-cloro-6-etóxi-2-fluoro-5-[(1R)-1-hidroxietil]fenil}-2- nitroetil)malonato de dimetila (x, 100,0 g, 237,1 mmols) em tetra- hidrofurano (800,0 ml) e níquel de Raney (120 g após a remoção de água por uma pipeta) foi equipado com um condensador, um agitador mecânico (barra de agitação de vidro e suporte de Teflon) e dois balões de gás hidrogênio (após purga a vácuo). O frasco foi colocado num banho de óleo a 65°C. O lote foi agitado vigorosamente por for 16 horas e os balões foram periodicamente removidos e recarregados com hidrogênio. Uma amostra foi tirada e analisada por HPLC. O produto, composto xi, estava presente a 83%. Havia 7,8% de amina não ciclizada e 5,5% de subproduto de hidroxilamina na mistura de reação. O catalisador foi filtrado (cuidado deve ser tomado para não permitir que o níquel de Raney seque à exposição ao ar). O filtrado foi evaporado até a secura para render 91 g de produto cru como uma espuma branca. O produto cru (91 g, 82,6% de pureza de área) foi combinado com outro lote similar de produto cru (93 g, 72,8 % de pureza) para purificação. O produto cru combinado (184 g) foi purificado por croma- tografia em coluna em gel de sílica (EtOAc/hexano como eluente) para render o composto xi (101,1 g, 93% de pureza por HPLC, 59,3% de rendimento cru). O material bruto foi usado para a próxima reação sem purificação adicional. LCMS para C16H20ClFNO5 (M + H)+: m/z = 360,0. ETAPA 11. ÁCIDO (4R)-4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-((R)-1- HIDROXIETIL)FENIL)-2-OXOPIRROLIDINA-3-CARBOXÍLICO (XII)

[00317] Em um frasco de fundo redondo de 4 gargalos de 5 litros equipado com um agitador suspenso e uma entrada de nitrogênio foi carregada uma solução de 4-(3-cloro-6-etóxi-2-fluoro-5-((R)-1- hidroxietil)fenil)-2-oxopirrolidina-3-carboxilato de (4R)-metila (xi, 268 g, 581 mmols) em tetra-hidrofurano (2150 ml, 26500 mmols). À solução, hidróxido de sódio a 1,0 M em água (1420 ml, 1420 mmols) foi carregado. A solução turva resultante se tornou transparente em 1 minuto. A mistura de reação foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A reação foi analisada por LCMS após 15 horas e pareceu estar completa visto que o material de partida não foi observado. A mistura de reação foi resfriada num banho de gelo a uma temperatura interna de 9,5°C e a mistura foi acidificada para pH 1 a 2 pela adição de ácido clorídrico aquoso a 6,0 M (237,0 ml, 1422 mmols) através de um funil de gotejamento durante 30 minutos. A mistura de reação foi dividida na metade e cada metade foi extraída com acetato de etila (2 x 1 l). As camadas aquosas combinadas foram adicionalmente extraídas com acetato de etila (500 ml). As duas camadas orgânicas foram lavadas com salmoura (20% em peso de NaCl/água, 2 x 1000 ml), secas em MgSO4 anidro, filtradas e concentradas para render o ácido intermediário cru xii como uma espuma amarelada que foi usada diretamente na próxima reação. 1H RMN (400 MHz, DMSO e d6) δ12,68 (br s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,27 (br s, 1H), 4,90 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 4,28 (q, J = 8,8 Hz, 1H), 3,92 e 3,81 (m, 1H), 3,76 e 3,65 (m, 1H), 3,57 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,46 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,23 (q, J = 9,5 Hz, 1H), 1,33 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,28 (d, J = 6,4 Hz, 3H). LCMS para C15H17ClFNNaO5 (M + Na)+: m/z = 368,0. ETAPA 12. (R)-4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-((R)-1- HIDROXIETIL)FENIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XIII)

[00318] O composto cru xii foi dissolvido em 1,4-dioxano (976 ml) e tolueno (976 ml) e a solução amarela resultante foi aquecida a 100°C. A cor da solução se tornou marrom conforme a reação progredia. Amostras foram retiradas nos instantes no tempo 1 hora, 2 horas e 2,5 horas. Em 2,5 horas, a análise por HPLC mostrou que o ácido, composto 12, estava a 0,38% e o produto desejado, composto xiii, a 78,8%. A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e foi filtrada num frasco de fundo redondo de 3 litros transparente. A solução foi, então, concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi colocado sob alto vácuo para render uma espuma marrom (254 g).

[00319] Acetonitrila (350 ml) foi carregada no xarope marrom e aquecida num banho de água a 65°C até que dissolução fosse observada. A solução foi resfriada para a temperatura ambiente e foi agitada por 16 horas. Sólidos foram separados da solução. A pasta aquosa resultante foi resfriada num banho de gelo por 1 hora. O produto foi coletado por filtração e a torta de filtro foi enxaguada com 400 ml de acetonitrila resfriada com gelo. Os sólidos pareceram ser higroscópi- cos. O sólido foi dissolvido em DCM (2,0 l) e concentrado num xarope que foi colocado sob alto vácuo para render o composto xiii como uma espuma branca (106,4 g).

[00320] O filtrado foi concentrado num xarope escuro (cerca de 120 g) que foi purificado por cromatografia flash (4 x 330 de colunas de gel de sílica, carregadas com DCM, eluídas com EtOAc/hexano a 50% a 100% e monitoradas por TLC usando EtOAc a 100% como eluente). Frações da cromatografia foram concentradas sob pressão reduzida e colocadas sob alto vácuo para render uma espuma marrom claro (54,4 g). A espuma foi carregada com MTBE (400 ml) e MeOH (10 ml) e aquecida num banho de água a 56°C por 15 minutos e alguns sólidos permaneceram. A pasta aquosa foi resfriada para a temperatura ambi- ente com agitação. A pasta aquosa foi filtrada para remover substâncias insolúveis. O filtrado foi concentrado num xarope e colocado sob alto vácuo para render uma espuma. A espuma foi carregada com acetonitrila (72 ml, 1,5 ml/g) e aquecida num banho de água a 60°C até que a solução se tornasse homogênea. A solução foi resfriada para a temperatura ambiente com agitação e sólidos precipitaram da solução e se tornaram muito espessos. Acetonitrila adicional (24 ml) foi carregada para ajustar a diluição para 2 ml/g. A pasta aquosa foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas e, então, resfriada num banho de gelo por 1 hora. O produto foi coletado por filtração e enxaguado com acetonitrila. O composto xiii (25 g) foi obtido como segunda safra. Um total de 131,4 g de composto xiii foi obtido em 74,9% de rendimento do composto xi. 1H RMN (400 MHz, DMSO e d6) δ 7,83 (s, 1H), 7,47 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 4,96 e 4,85 (m, 1H), 4,08 e 3,92 (m, 1H), 3,80 (qt, J = 6,9, 3,5 Hz, 2H), 3,61 e 3,51 (m, 1H), 3,25 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 2,61 e 2,50 (m, 1H), 2,35 e 2,26 (m, 1H), 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,27 (d, J = 6,4 Hz, 3H). LCMS para C14H18ClFNO3 (M + H)+: m/z = 302,0. EXEMPLO 2. SÍNTESE ALTERNATIVA DE (R)-4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2- FLUORO-5-((R)-1-HIDROXIETIL)FENIL)PIRROLIDIN-2-ONAETAPA 1. 1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUOROFENIL)ETANONA (IV-A)

[00321] 1-(5-Cloro-4-fluoro-2-hidroxifenil)etanona (Composto ii do Exemplo 1, Etapa 1, 1.350 g, 7.160 mmols), N,N-dimetilformamida (3,32 l), iodoetano (1.340 g, 8.590 mmols) e carbonato de potássio (1.980 g, 14.300 mmols) foram misturados e agitados à temperatura ambiente por 45 minutos. A temperatura de lote foi até 55°C de 22°C. A mistura de reação foi aquecida para 60°C por 1 hora (a temperatura de lote alcançou 67°C em 30 minutos e, então, caiu para 60°C). A análise por HPLC indicou que todo o material de partida foi consumido. Água (10 l) foi adicionada numa porção (agitação irá parar se água for adicionada em porções). A pasta aquosa resultante foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos. O produto foi coletado por filtração e foi enxaguado com água (3 l). O produto seco no filtro sob vácuo por 5 dias para render o composto iv-a como um sólido castanho (1418 g). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,69 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,15 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 2,51 (s, 3H), 1,37 (t, J = 7,0 Hz, 3H). ETAPA 2. 2-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUOROFENIL)-2-METIL-1,3- DIOXOLANO (V-A)

[00322] Uma solução de 1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluorofenil)etanona (iva, 1481,0 g, 6836,3 mmols) foi dissolvida em tolueno (6 l). 1,2- Etanodiol (953 ml, 17100 mmols) e ácido p-toluenossulfônico monoi- dratado (104 g, 547 mmols) foram adicionados à solução. A mistura de reação foi aquecida até refluxo a 104 a 110°C com o uso de um trap Dean-Stark para remover a água por 17,4 horas. A análise por HPLC indicou que 37% do material de partida permaneceu não reagido. Cerca de 600 ml de destilado foram removidos e a mistura de reação foi aquecida sob refluxo por mais 5 horas (total de 22 horas). A análise por HPLC indicou nenhuma reação adicional.

[00323] Foi especulado que K2CO3 residual no composto de material de partida iv-a pode ter parado a reação. Portanto, a mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e lavada com ácido clorídrico aquoso a 1 N (3 x 6,66 l). Após a lavagem de ácido aquoso, a camada orgânica foi transferida de volta para o vaso de reação. 1,2- Etanodiol (381 ml, 6840 mmols) e ácido p-toluenossulfônico monoidra- tado (104 g, 547 mmols) foram adicionados e a mistura de reação foi aquecida sob refluxo por 16 horas. A análise por HPLC indicou que cerca de 20 % do material de partida permaneceu não reagido. Cerca de 100 ml do destilado foram removidos. 1,2-Etanodiol (380 ml, 6800 mmols) foi adicionado e refluxado por 6 horas (22 horas no total). HPLC indicou que 7% do material de partida permaneceu não reagido. Cerca de 125 ml do destilado foram removidos. A mistura de reação foi aquecida até refluxo por 6 horas (total de 28 horas). HPLC indicou que 5,4% do material de partida permaneceu não reagido. Cerca de 125 ml do destilado foram removidos. A mistura de reação foi aquecida até refluxo por mais 7 horas. A análise por HPLC indicou que 3,5% do ma-terial de partida permaneceu não reagido. Cerca de 80 ml do destilado foram removidos. A reação foi considerada completa neste ponto.

[00324] A mistura de reação foi lavada com uma solução de hidróxido de sódio aquoso a 1 N (2 x 5,5 l). A primeira lavagem básica foi extraída com tolueno (2,1 l). A solução de tolueno combinada foi lavada com água (7 l) e concentrada para render 2153 g de óleo escuro. A análise por HPLC indicou a pureza de produto a 93,8% com 1,90 % de material de partida e 0,79% de produto de-iodo. A análise de 1H RMN indicou que cerca de 0,5 equivalente de tolueno (cerca de 256 g) permaneceu no produto. O rendimento corrigido de composto v-a foi 88,0%. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,51 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,17 e 3,92 (m, 4H), 3,91 e 3,80 (m, 2H), 1,75 (s, 3H), 1,46 (t, J = 7,0 Hz, 3H). ETAPA 3. 3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-(2-METIL-1,3- DIOXOLAN-2-IL)BENZALDEÍDO (VI)

[00325] Em um frasco de fundo redondo de 4 gargalos de 3 litros seco em forno equipado com um agitador suspenso, um funil de adição de 500 ml, entrada de nitrogênio, septa e termopar foi carregado N,N-di-isopropilamina (87,8 ml, 626 mmols) e tetra-hidrofurano anidro (1090 ml, 13500 mmols). Esta solução foi resfriada para -72°C e carregada com n-butillítio a 2,5 M em hexanos (261 ml, 652 mmols). A solução de n-butillítio foi adicionada durante 18 minutos. A temperatura interna máxima durante a adição foi -65°. O banho de gelo seco-acetona foi substituído por um banho de gelo-água e a mistura de reação foi aquecida para cerca de - 5°C a cerca de 0°C e mantida por 15 minutos. A mistura de reação foi, então, resfriada para - 74,5°C.

[00326] A um frasco de fundo redondo de 1 litro separado contendo 2-(5-cloro-2-etóxi-4-fluorofenil)-2-metil-1,3-dioxolano (v-a, 136,1 g, 522,1 mmols) foi adicionado tetra-hidrofurano anidro (456 ml) para dissolver os sólidos. A solução resultante foi resfriada num banho de gelo a cerca de 0°C. A solução contendo composto v-a foi transferida para a solução de LDA durante 40 minutos através de uma cânula enquanto mantém a temperatura de reação entre -70°C e -72,5°C. A mistura de reação se torna uma pasta aquosa amarela e foi agitada por 37 minutos a -74°C. N,N-Dimetilformamida (60,6 ml, 783 mmols) foi carregada numa porção através de uma a seringa e esta adição produziu um exoterma de -74,5°C para -66,5°C. A reação foi monitorada por HPLC a 90 minutos após a adição. O material de partida estava presente a 2,9%. O banho frio foi removido e a mistura de reação foi aquecida na temperatura do ambiente. A mistura de reação foi amostrada e analisada após 3 horas e material de partida não reagido estava presente a 1,5%. A reação foi considerada completa e foi bruscamente arrefecida pela adição da solução de reação à água fria (1,4 l) e diluída com acetato de etila (1,5 l). A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (1,5 l) e as camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com salmoura (20% em peso de NaCl aquoso, 2 x 600 ml) e seca em MgSO4 anidro. O MgSO4 foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado num óleo com alguns sólidos presentes. Este resíduo foi dissolvido em cloreto de metileno e carregado num bloco de gel de sílica (586 g). O bloco de sílica foi eluído com EtOAc/DCM a 2% (monitorado por TLC usando DCM a 100% como eluente). As frações desejadas foram coletadas e concentradas sob pressão reduzida para render um óleo âmbar claro. O óleo foi colocado sob alto vácuo para render o composto vi como um sólido amarelo (146,5 g, 95,1% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 10,27 (s, 1H), 7,78 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,10 e 3,96 (m, 4H), 3,87 e 3,76 (m, 2H), 1,72 (s, 3H), 1,44 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). LCMS para C13H15ClFO4 (M + H)+: m/z = 289,1. ETAPAS 4-10. (R)-4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-((R)-1- HIDROXIETIL)FENIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XIII)

[00327] O composto do título foi preparado usando procedimentos análogos àqueles descritos no Exemplo 1, Etapas 6 a 12. EXEMPLO 3. CLORIDRATO DE (R)-4-(3-((S)-1-(4-AMINO-3-METIL- 1H-PIRAZOLO[3,4-D]PIRIMIDIN-1-IL)ETIL)-5-CLORO-2-ETÓXI-6- FLUOROFENIL)PIRROLIDIN-2-ONA ETAPA 1. METANOSSULFONATO DE (R)-1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4- FLUORO-3-((R)-5-OXOPIRROLIDIN-3-IL)FENIL)ETILA (XIV)

[00328] (R)-4-(3-Cloro-6-etóxi-2-fluoro-5-((R)-1- hidroxietil)fenil)pirrolidin-2-ona (xiii, 172,0 g, 570,0 mmols) (consistia em 147 g a 99,83%: 0,09% de pureza quiral, 99,33% de pureza química; e 25 g, 87,46%: 12,54% de pureza quiral, 86,74% de pureza química) foi dissolvido em cloreto de metileno (860 ml). N,N-di- isopropiletilamina (149 ml, 855 mmols) foi adicionado à solução de cerca de -7°C a cerca de 2°C. Cloreto de metanossulfonila (57,4 ml, 741 mmols) foi adicionado por gotejamento à mistura de reação durante 25 minutos. A suspensão se transformou numa solução transparente. No ponto no tempo de reação de 30 minutos, a HPLC indicou que a reação foi concluída. Esta mistura de reação contendo composto xiv foi usada diretamente na próxima reação. ETAPA 2. (R)-4-(3-CLORO-6-ETÓXI-2-FLUORO-5-((S)-1- HIDRAZINILETIL)FENIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XV)

[00329] A 0°C, hidrazina (178,9 ml, 5,7 mol) foi adicionada numa porção seguido de N-metilpirrolidinona (860 ml) à mistura de reação contendo composto xiv da Etapa 1. A mistura de reação se tornou turva e alguns precipitados se formaram. A mistura foi aquecida para 40 a 57°C sob nitrogênio por 90 minutos. HPLC indicou que todo o mesi- lato foi consumido.

[00330] A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e uma solução saturada de bicarbonato de sódio (28,3 g) em água (300 ml) foi adicionada. A mistura foi agitada por 20 minutos, tempo no qual diclorometano (300 ml) foi adicionado. A camada orgânica foi separada e agitada com uma solução de bicarbonato de sódio (14,2 g) em água (150 ml). A camada aquosa foi extraída com diclo- rometano (200 ml x 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (80 ml), secas em Na2SO4 anidro (311 g), con-centradas e azeotropadas com tolueno (250 ml) para render uma solução de N-metilpirrolidinona incolor contendo composto xv que foi usado diretamente na próxima reação. Uma amostra foi purificada para análise de RMN. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ 7,88 (s, 1H), 7,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,42 (q, J = 6,7 Hz, 1H), 4,06 e 3,88 (m, 2H), 3,79 e 3,66 (m, 1H), 3,65 e 3,51 (m, 1H), 3,24 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 2,60 e 2,46 (m, 1H), 2,36 e 2,25 (m, 1H), 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,26 (d, J = 6,8 Hz, 3H). LCMS para C14H19ClFN3O2 (M + H)+: m/z = 316,1. ETAPA 3. 5-AMINO-1-((S)-1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-((R)- 5-OXOPIRROLIDIN-3-IL)FENIL)ETIL)-3-METIL-1H-PIRAZOL-4- CARBONITRILA (XVI)

[00331] Com agitação, (1-etoxietilideno)malononitrila (101 g, 741 mmols) foi adicionado à solução de N-metilpirrolidinona de composto xv da Etapa 2, em porções e a mistura foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio. Após 15 minutos, a análise por HPLC indicou 11% de material de partida hidrazina, composto xv, em relação ao composto de produto xvi. N,N-Di-isopropiletilamina (15 ml, 86 mmols) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 15 horas. A análise por HPLC indicou que 5,6 % de material de partida permaneceu. N,N-Di-isopropiletilamina (5 ml, 30 mmols) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 horas. A HPLC indicou que 5,6 % de material de partida permaneceu. A mistura de reação foi agitada por 2,5 dias e combinada com dois lotes similares e trabalhados em conjunto.

[00332] As misturas de reação de três lotes do composto xvi foram combinadas. Uma solução de hidróxido de sódio a 0,5 M aquoso (3,8 l) foi adicionada a 10 a 20°C e agitada por 5 minutos. A HPLC indicou que todo o (1-etoxietilideno)malononitrila de material de partida foi consumido. Acetato de etila (4,0 l) foi adicionado e a mistura foi agitada por 15 minutos. As camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com hidróxido de sódio a 0,5 M em água (2,38 l). As camadas foram separadas. A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (2 x 2 l). As camadas orgânicas combinadas foram la- vadas com ácido clorídrico aquoso a 1,0 M (3,56 l) e o pH da camada aquosa resultante foi 2 a 3. A camada orgânica foi lavada com salmoura (5 l), seca em Na2SO4 anidro, concentrada e seca sob alto vácuo por 40 horas para render o composto xvi como um sólido espumoso marrom claro (702,7 g). 1H RMN (500 MHz, DMSO e d6) δ 7,78 (s, 1H), 7,44 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (s, 2H), 5,64 (q, J = 6,7 Hz, 1H), 3,96 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,59 e 2,50 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,57 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS para C19H22ClFN5O2 (M + H)+: m/z = 406,1.

[00333] O rendimento geral de três etapas de composto xvi (mesi- lação, hidrazinólise e formação de pirazol) foi calculado como 72,8 % da entrada total do composto xiii. A pureza foi determinada por HPLC como cerca de 80%. A análise por HPLC indicou que algum produto existindo na camada aquosa básica que foi subsequentemente extraída com EtOAc (2 l), lavada com ácido clorídrico aquoso a 1,0 M e salmoura, seca com sulfato de sódio anidro, concentrada e seca em bomba de alto vácuo por 40 horas para proporcionar o composto xvi como um óleo marrom (134 g, 13,9%). ETAPA 4. (R)-4-(3-((S)-1-(4-AMINO-3-METIL-1H-PIRAZOLO[3,4- D]PIRIMIDIN-1-IL)ETIL)-5-CLORO-2-ETÓXI-6- FLUOROFENIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XVII)

[00334] 5-Amino-1-((S)-1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-((R)-5- oxopirrolidin-3-il)fenil)etil)-3-metil-1H-pirazol-4-carbonitrila (xvi, 702,7 g, 1731 mmols) foi adicionado a um vaso de reação com acetato de for- mamidina (1802 g, 17,31 mol) e 1,2-etanodiol (3,51 l). A mistura de reação foi aquecida a 102 a 103°C com agitação por 18 horas. A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e acetato de etila (7 l) e água (6 l) foram adicionados e a mistura bifásica foi agitada por 15 minutos. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi diluída com mais água (4,5 l) e acetato de etila (3 l) e agitada por 10 minutos. A camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi adici-onalmente extraída com acetato de etila (2 l). As camadas orgânicas foram combinadas e agitadas com água (4,5 l). A camada aquosa foi separada e a camada orgânica foi filtrada através de um bloco de celi- te (cerca de 1 kg). A camada orgânica foi extraída com ácido clorídrico aquoso a 1,0 M (7 l) por agitação da mistura por 10 minutos. A camada aquosa foi separada. A camada orgânica marrom claro foi agitada com ácido clorídrico aquoso a 1,0 M adicional (3 l) por 10 minutos. A camada aquosa foi separada. As camadas ácidas aquosas foram combinadas e lavadas com tolueno (500 ml). A solução ácida aquosa foi resfriada com um banho de água gelada e cloreto de metileno (4 l) foi adicionado. A 5 a 15°C, uma solução de hidróxido de sódio (530 g) em água (530 ml) (solução de NaOH a 50%) foi adicionada lentamente até um pH de solução de 11 a 12. Precipitados sólidos foram observados. Cloreto de metileno (3,5 l) e metanol (300 ml) adicionais foram adicionados e a mistura foi agitada por 10 a 15 minutos. O produto sólido foi coletado por filtração e seco no filtro sob sucção por 16 horas para render o composto xvii (289,7 g) como um sólido marrom. 1H RMN (400 MHz, DMSO e d6) δ 8,11 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,30 (br s, 2H), 6,23 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 3,97 (p, J = 9,2 Hz, 1H), 3,90 e 3,73 (m, 2H), 3,57 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 9,2, 8,7 Hz, 1H), 2,48 (s, 3H), 2,60 e 2,50 (m, 1H), 2,36 e 2,20 (m, 1H), 1,69 (d, J = 7,1 Hz, 3 H), 1,39 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS para C20H23ClFN6O2 (M + H)+: m/z = 433,3.

[00335] O filtrado foi transferido para um funil separador e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi agitada com cloreto de metileno (5 l) e metanol (200 ml). A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro, concentrada, seca em bomba de alto vácuo por 16 horas para render uma quantidade adicional de 259,3 g como um sólido marrom. O rendimento total de xvii foi 548,3 g em 73,2% de rendimento. ETAPA 5. SAL DE CLORIDRATO DE (R)-4-(3-((S)-1-(4-AMINO-3- METIL-1H-PIRAZOLO[3,4-D]PIRIMIDIN-1-IL)ETIL)-5-CLORO-2- ETÓXI-6-FLUOROFENIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XVIII)

[00336] Uma solução de ácido clorídrico aquoso a 1,0 M (HCl, 5,0 l, 5,0 mol) foi adicionada a (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2- ona (xvii, 609,8 g, 1,409 mol) à temperatura ambiente. A pasta aquosa espessa resultante foi, então, aquecida para 50°C para proporcionar uma solução transparente. Uma quantidade adicional de 1,82 l de solução de ácido clorídrico aquoso a 1,0 M (HCl, 1,82 l, 1,82 mol; total 6,82 l, 6,82 mol, 4,84 equiv) foi adicionada à solução transparente a 50°C e a solução foi, então, filtrada através de um filtro a aproximadamente 50°C. A mistura de reação filtrada foi gradualmente resfriada para a temperatura ambiente durante 2 horas antes de ser adicionalmente resfriada para 0 a 5°C. A mistura de reação foi agitada a 0 a 5°C por pelo menos 20 minutos para iniciar a precipitação. Os sólidos resultantes foram coletados por filtração, enxaguados com uma porção de licor-mãe frio, seguido de ácido clorídrico aquoso a 1,0 M (HCl, 200 ml) e secos no funil de filtro à temperatura ambiente sob sucção para peso constante (cerca de 39 horas) para proporcionar o sal de ácido clorídrico do composto de Fórmula I: Cloridrato de (R)-4-(3-((S)-1-(4- amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6- fluorofenil)pirrolidin-2-ona (xviii, 348,7 g, 661,2 g teórico, 52,7%) como pó cristalino branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,39 (br s, 1H), 9,05 (br s, 1H), 8,50 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,59 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,28 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 3,95 (m, 1H), 3,79 (m, 2H), 3,55 (m, 1H), 3,22 (m, 1H), 2,59 (s, 3H), 2,55 (ddd, J = 16,8, 10,3, 2,3 Hz, 1H), 2,28 (ddd, J = 16,8, 8,6, 1,5 Hz, 1H), 1,73 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,38 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm. RMN a 13C (100 MHz, DMSO e d6) δ 175,3, 156,4 (JCF = 249,8 Hz), 153,8 (JCF = 7,0 Hz), 152,4, 150,8, 147,3, 144,3, 131,4 (JCF = 3,5 Hz), 127,3, 126,4 (JCF = 12,6 Hz), 116,1 (JCF = 18,4 Hz), 98,0, 72,1, 49,1, 46,6, 36,0, 29,4, 21,0, 15,4, 14,6 ppm. RMN a 19F (376 MHz, DMSO-d6) δ - 113,6 (d, JFH = 7,7 Hz) ppm. C20H23CI2FN6O2 (MW 469,34); LCMS (EI) m/e 433,2 (M+ + H; massa exata de xvii: 432,15). Teor de água por KF: 3,63% em peso; teor de cloreto (Cl-) por titulação: 7,56% em peso (7,56% por teoria).

[00337] A faixa de fusão/decomposição de forma cristalina de sal de cloridrato de (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2-ona foi determinada por DSC, de uma temperatura inicial de 30°C para uma temperatura final de 350°C usando uma taxa de aquecimento de 10°C/min. O termograma de DSC revelou um evento endotérmico com um início a 194,37°C e o pico a 206,55°C, conforme mostrado na Figura 1.

[00338] O termograma de TGA mostrou a perda de peso total de 4,3% até 210°C. Acima de 210°C, o sal começa a se decompor, conforme mostrado na Figura 2.

[00339] Um padrão de Difração de Pós de Raios X (XRPD) representativo é mostrado na Figura 3 e a Tabela 2 mostra os picos e intensidades correspondentes.TABELA 2 EXEMPLO 4. SÍNTESE ALTERNATIVA DE CLORIDRATO DE (R)-4- (3-((S)-1-(4-AMINO-3-METIL-1H-PIRAZOLO[3,4-D]PIRIMIDIN-1- IL)ETIL)-5-CLORO-2-ETÓXI-6-FLUOROFENIL)PIRROLIDIN-2-ONA ETAPA 1. (R)-4-(3-ACETIL-5-CLORO-2-ETÓXI-6- FLUOROFENIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XIX)

[00340] (4R)-4-[3-cloro-6-etóxi-2-fluoro-5-(1- hidroxietil)fenil]pirrolidin-2-ona (como uma mistura de dois diastereô- meros com R-configuração na pirrolidinona e R- ou S-configurações no álcool secundário) (xiii, 16,7 g, 55,3 mmols) foi dissolvido em dicloro- metano (167 ml). A solução foi resfriada num banho de água gelada e periodinano de Dess-Martin (35,2 g, 83,0 mmols) foi adicionada em pequenas porções. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, tempo no qual a análise por HPLC mostrou conclusão de reação. Uma solução de sulfito de sódio (28 g, 220 mmols) em água (70 ml) foi adicionada à mistura de reação e a mistura foi agitada por 20 minutos. Uma solução de hidróxido de sódio a 1,0 M foi adicionada à mistura e agitada por 10 minutos. Foi permitido que as camadas se assentassem e a camada orgânica foi separada e lavada sequencialmente com solução de hidróxido de sódio aquoso a 1 M (66 ml) e água (60 ml). A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro. O agente secante foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado para render (R)-4-[3-acetil-5-cloro-2-etóxi-6- fluorofenil]pirrolidin-2-ona como um óleo que foi usado na próxima reação sem purificação adicional. ETAPA 2. 2-(1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-(5- OXOPIRROLIDIN-3- IL)FENIL)ETILIDENO)HIDRAZINACARBOXILATO DE (R,E)-TERC- BUTILA (XX)

[00341] (R)-4-[3-acetil-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil]pirrolidin-2-ona cru (composto xix da Etapa 1) foi dissolvido em metanol (60 ml) e car- bazato de t-butila (8,04 g, 60,8 mmols) foi adicionado à solução. A mistura de reação foi agitada a 65°C por 3,5 dias, tempo no qual a análise por HPLC mostrou conclusão da reação. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica eluindo com uma mistura de 0 a 5% de metanol em acetato de etila para render 2-(1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-(5-oxopirrolidin-3- il)fenil)etilideno)hidrazinacarboxilato de (R,E)-terc-butila (xx, 19,5 g, 85%). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 9,83 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,36 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,07 (p, J = 9,1 Hz, 1H), 3,84 e 3,69 (m, 2H), 3,59 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 3,28 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,14 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,25 (t, J = 7,0 Hz, 3H). LCMS para C19H25ClFN3NaO4 (M + Na)+: m/z = 436,1. ETAPA 3. 2-((S)-1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-((R)-5- OXOPIRROLIDIN-3-IL)FENIL)ETIL)HIDRAZINACARBOXILATO DE TERC-BUTILA (XXI)

[00342] 2-(1-(5-Cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-(5-oxopirrolidin-3- il)fenil)etilideno)hidrazinacarboxilato de (R,E)-terc-butila (xx, 0,5 g, 1,2 mmol) foi dissolvido em metanol (25 ml) e a solução foi borbulhada com gás nitrogênio por 5 minutos. Bis(1,5- ciclooctadieno)ródio(I)tetrafluoroborato (35 mg, 0,086 mmol) e (R)-(-)- 1-{(S)-2-[bis(4-trifluorometilfenil)fosfina]ferrocenil}etil-di-t-butilfosfina (64 mg, 0,094 mmol) foram adicionados à solução e a mistura de reação resultante foi borbulhada com gás nitrogênio por 30 minutos. A mistura de reação foi, então, agitada sob pressão de gás hidrogênio (0,38 MPa (56 psi)) por 2,5 dias. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi purificado por croma- tografia em coluna de gel de sílica eluindo com uma mistura de meta- nol (0 a 10%) em acetato de etila. As frações desejadas foram concentradas para render 2-((S)-1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-((R)-5- oxopirrolidin-3-il)fenil)etil)hidrazinacarboxilato de terc-butila (xxi, 428 mg, 85% de rendimento). 1H RMN (500 MHz, DMSO e d6) δ 8,18 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,73 (s, 1H), 4,41 (br s, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,75 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,26 (m, 1H), 2,53 (m, 1H), 2,29 (dd, J = 17,6, 8,6 Hz, 1H), 1,32 (s, 12H), 1,10 (d, J = 6,5 Hz, 1H). LCMS para C19H27ClFN3NaO4 (M + Na)+: m/z = 437,9. A análise por HPLC quiral indicou que o produto continha o diastereômero desejado carboxilato de terc-butil-2-((S)-1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-((R)-5- oxopirrolidin-3-il)fenil)etil)hidrazina (xxi) a 85,6% e o diastereômero in- desejado terc-butil-2-((R)-1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-((R)-5- oxopirrolidin-3-il)fenil)etil)hidrazinacarboxilato a 14,3%. ETAPA 4. 5-AMINO-1-((S)-1-(5-CLORO-2-ETÓXI-4-FLUORO-3-((R)- 5-OXOPIRROLIDIN-3-IL)FENIL)ETIL)-3-METIL-1H-PIRAZOL-4- CARBONITRILA (XVI)

[00343] 2-((S)-1-(5-Cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirrolidin-3- il)fenil)etil)hidrazinacarboxilato de terc-butila (xxi, 130 mg, 0,31 mmol) e ácido p-toluenossulfônico monoidratado (86 mg, 0,45 mmol) foram adicionados a etanol (3 ml) e a mistura de reação foi aquecida a 50°C por 20 horas. A análise por HPLC mostrou que havia cerca de 88% de material de partida não reagido. Uma quantidade adicional de ácido p- tolueno sulfônico (86 mg, 0,45 mmol) foi carregada e a mistura de reação foi aquecida para 60°C por 24 horas. A análise por HPLC mostrou Boc-desproteção completa. Esta mistura de reação foi adicionada com (1-etoxietilideno)malononitrila (61 mg, 0,45 mmol) e N,N-di- isopropiletilamina (260 μl, 1,5 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A HPLC mostrou conclusão da formação de anel de pirazol. Uma solução de hidróxido de sódio aquoso a 1,0 M foi adicionada à mistura de reação e agitada por 20 minutos. Acetato de etila (20 ml) foi adicionado à mistura e agitado. Foi permitido que a mistura bifásica assentasse. A camada de acetato de etila foi coletada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (10 ml). A solução de acetato de etila combinada foi adicionada com ácido clorídrico aquoso a 1 M (5 ml) e agitada por 15 minutos. Foi permitido que a mistura bifásica assentasse e a camada orgânica foi coletada e seca em sulfato de sódio anidro. O sulfato de sódio foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado para render 5-amino-1- ((S)-1-(5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-((R)-5-oxopirrolidin-3-il)fenil)etil)-3- metil-1H-pirazol-4-carbonitrila (xvi, 126 mg, rendimento quantitativo de produto cru) e foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. ETAPA 5. (R)-4-(3-((S)-1-(4-AMINO-3-METIL-1H-PIRAZOLO[3,4- D]PIRIMIDIN-1-IL)ETIL)-5-CLORO-2-ETÓXI-6- FLUOROFE- NIL)PIRROLIDIN-2-ONA (XVII)

[00344] 5-Amino-1-{(1S)-1-[5-cloro-2-etóxi-4-fluoro-3-(5- oxopirrolidin-3-il)fenil]etil}-3-metil-1Hpirazol-4-carbonitrila (xvi, 126 mg, 0,31 mmol) foi adicionado com acetato de formamidina (323 mg, 3,1 mmols) e 1,2-etanodiol (2 ml). A mistura de reação foi aquecida a 104 a 105°C com agitação. Após 18 horas, a análise por HPLC mostrou cerca de 44% de composto de material de partida xvi restante. A mistura de reação foi aquecida para 115°C por 24 horas. A análise por HPLC mostrou a reação foi concluída. A mistura de reação foi resfriada para a temperatura ambiente e acetato de etila (10 ml) e água (5 ml) foram adicionados. A mistura bifásica foi agitada. Foi permitido que as camadas se separassem. A camada orgânica foi coletada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (5 ml). A solução de acetato de etila combinada foi lavada com água (5 ml), seca em sulfato de sódio anidro. Sulfato de sódio foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado num resíduo. O resíduo foi purificado cromatografia em gel de sílica. A coluna foi eluída com uma mistura de metanol (0 a 5%) em cloreto de metileno. As frações desejadas foram combinadas e evaporadas para render (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2- ona (xvii, 94 mg, 69,9% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO e d6) δ 8,11 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,30 (br s, 2H), 6,23 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 3,97 (p, J = 9,2 Hz, 1H), 3,90 e 3,73 (m, 2H), 3,57 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 9,2, 8,7 Hz, 1H), 2,48 (s, 3H), 2,60 e 2,50 (m, 1H), 2,36 e 2,20 (m, 1H), 1,69 (d, J = 7,1 Hz, 3 H), 1,39 (t, J = 6,9 Hz, 3H). LCMS para C20H23ClFN6O2 (M + H)+: m/z = 433,3.

[00345] A análise por HPLC quiral do produto indicou que continha o diastereômero desejado, (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2- ona (xvii), a 87% e o diastereômero indesejado (R)-4-(3-((R)-1-(4- amino-3-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6- fluorofenil)pirrolidin-2-ona a 13%.

ETAPA 6. CLORIDRATO DE (R)-4-(3-((S)-1-(4-AMINO-3-METIL-1H- PIRAZOLO[3,4-D]PIRIMIDIN-1-IL)ETIL)-5-CLORO-2-ETÓXI-6-FLUOROFENIL)PIRROLIDIN-2-ONA

[00346] O produto do título foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3, Etapa 5. O sal de cloridrato resultante é bem compatível com o material feito a partir do processo sintético descrito no Exemplo 3, em cada aspecto comparável incluindo pureza química, pureza quiral e características de estado sólido.

EXEMPLO A1: ENSAIO DE ENZIMA DE PI3K

[00347] O kit de ensaio luminescente de PI3-quinase incluindo substrato de quinase de lipídio, Proteína Protetora D-mio- fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2)D (+)-sn-1,2-di-O- octanoilgliceril, 3-O-fosfo ligado (PIP2), biotinilado I(1,3,4,5)P4, PI(3,4,5)P3 é adquirido junto à Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT, EUA). O Kit de Detecção AlphaScreenTM GST incluindo microesfe- ras de doador e recipiendário foi adquirido junto à PerkinElmer Life Sciences (Waltham, MA). PI3Kδ (p110δ /p85α) é adquirido junto à Millipore (Bedford, MA). ATP, MgCl2, DTT, EDTA, HEPES e CHAPS são adquiridos junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

ENSAIO ALPHASCREENTM PARA PI3Kδ

[00348] A reação de quinase é conduzida numa placa REMP de 384 cavidades da Thermo Fisher Scientific num volume final de 40 μl. Inibidores são primeiro diluído em série em DMSO e adicionados às cavidades de placa antes da adição de outros componentes de reação. A concentração final de DMSO no ensaio é 2%. Os ensaios de PI3K são executadas à temperatura ambiente em HEPES a 50 mM, pH 7,4, MgCl2 a 5 mM, NaCl a 50 mM, DTT a 5mM e CHAPS a 0,04%. As reações são iniciadas pela adição de ATP, a mistura de reação final consistia em PIP2 a 20 μM, ATP a 20 μM, PI3Kδ a 1,2 nM são incubados por 20 minutos. 10 μl de mistura de reação são, então, transferidos para 5 μl de I(1,3,4,5)P4 biotinilado a 50 nM em tampão bruscamente arrefecido: HEPES a 50 mM pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 10 mM, DTT a 5 mM, Tween-20 a 0,1%, seguido da adição de 10 μl de microesferas de doador e recipiendário AlphaScreenTM suspensas em tampão bruscamente arrefecido contendo proteína detectora PI(3,4,5)P3 a 25 nM. A concentração final das microesferas de doador e recipiendário é 20 mg/ml. Após a vedação de placa, a placa é incubada num local escuro à temperatura ambiente por 2 horas. A atividade do produto é determinada em leitor de microplaca Fusion-alpha (Perkin-Elmer). A determinação de IC50 é realizada adaptando a curva de atividade de controle percentual versus o registro da concentração de inibidor usando o software GraphPad Prism 3.0.

EXEMPLO A2: ENSAIO DE ENZIMA DE PI3K

[00349] Materiais: Substrato de quinase de lipídio, fosfoinositol-4,5- bisfosfato (PIP2), são adquiridos junto à Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT, EUA). Isoformas de PI3K α, β, δ e Y são adquiridas junto à Millipore (Bedford, MA, EUA). ATP, MgCl2, DTT, EDTA, MOPS e CHAPS são adquiridos junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

[00350] As reações de quinase são conduzidas em placa de 96 cavidades de fundo transparente da Thermo Fisher Scientific num volume final de 24 μl. Inibidores são primeiro diluído em série em DMSO e adicionados às cavidades de placa antes da adição de outros componentes de reação. A concentração final de DMSO no ensaio é 0,5%. Os ensaios de PI3K são executados à temperatura ambiente em MOPS a 20 mM, pH 6,7, MgCl2 a 10 mM, DTT a 5 mM e CHAPS a 0,03%. A mistura de reação é preparada contendo PIP2 a 50 μM, qui- nase e concentração variada de inibidores. As reações são iniciadas pela adição de ATP contendo 2,2 μCi [Y-33P]ATP a uma concentração final de 1000 μM. A concentração final de isoformas de PI3K α, β, δ e Y no ensaio foram 1,3, 9,4, 2,9 e 10,8 nM, respectivamente. As reações são incubadas por 180 minutos e concluídas pela adição de 100 μl de fosfato de potássio a 1 M pH 8,0, tampão de arrefecimento brusco de EDTA a 30 mM. Uma alíquota de 100 μl da solução de reação é, então, transferida para uma placa de filtro de PVDF de 0,45 μm da Millipore MultiScreen IP de 96 cavidades (a placa de filtro é preumedecida com 100% de etanol a 200 μl, água destilada e fosfato de potássio a 1 M pH 8,0, respectivamente). A placa de filtro é aspirada numa Tubulação Millipore sob vácuo e lavada com 18 x 200 μl de tampão de lavagem contendo fosfato de potássio a 1 M pH 8,0 e ATP a 1 mM. Após a secagem por aspiração e blotting, a placa e seca a ar numa incubadora a 37°C de um dia para o outro. Um adaptador Packard TopCount (Millipore) é, então, fixado à placa seguido a adição de 120 μl de coquetel de cintilação Microscint 20 (Perkin Elmer) em cada cavidade. Após a vedação de placa, a radioatividade do produto é determinada por contagem por cintilação em Topcount (Perkin-Elmer). A determinação de IC50 é realizada adaptando a curva de atividade de controle percentual versus o registro da concentração de inibidor usando o software GraphPad Prism 3.0.

[00351] O sal de ácido (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2- ona clorídrico foi testado no ensaio do Exemplo A2 e determinado como um inibidor seletivo para PI3Kδ.

[00352] O sal de ácido (R)-4-(3-((S)-1-(4-amino-3-metil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-5-cloro-2-etóxi-6-fluorofenil)pirrolidin-2- ona clorídrico foi testado no ensaio do Exemplo A2 e determinado como um inibidor seletivo >100 vezes para PI3Kδ em relação a cada um dentre PI3Kα, PI3Kβ e PI3KY.

EXEMPLO A3: ENSAIO DE PROXIMIDADE DE CINTILAÇÃO DE PI3Kδ MATERIAIS

[00353] [Y-33P]ATP (10mCi/ml) foi adquirido junto à Perkin-Elmer (Waltham, MA). Substrato de quinase de lipídio, D-mio-fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2)D (+)-sn-1,2-di-O-octanoilglicerila, 3-O- fosfo ligado (PIP2), CAS 204858-53-7, foi adquirido junto à Echelon Biosciences (Salt Lake City, UT, EUA). PI3Kδ (p110δ /p85α) foi adquirido junto à Millipore (Bedford, MA). ATP, MgCl2, DTT, EDTA, MOPS e CHAPS foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Microesferas de Cintilação YSi SPA de Aglutinina de Germe de Trigo (WGA) foram adquiridas junto à GE healthcare life sciences (Piscataway, NJ, EUA).

[00354] A reação de quinase foi conduzida em placa branca de matriz de 384 cavidades de poliestireno da Thermo Fisher Scientific num volume final de 25 μl. Inibidores foram primeiro diluído em série em DMSO e adicionados às cavidades de placa antes da adição de outros componentes de reação. A concentração final de DMSO no ensaio foi 0,5%. Os ensaios de PI3K foram executados à temperatura ambiente em MOPS a 20 mM, pH 6,7, MgCl2 a 10 mM, DTT a 5 mM e CHAPS a 0,03%. As reações foram iniciadas pela adição de ATP, a mistura de reação final consistia em PIP2 a 20 μM, ATP a 20 μM, 0,2 μCi de [Y- 33P] ATP, PI3Kδ a 4 nM. As reações foram incubadas por 210 minutos e concluídas pela adição de 40 μl de microesferas de SPA suspensas em tampão bruscamente arrefecido: Fosfato de potássio a 150 mM pH 8,0, glicerol a 20%. EDTA a 25 mM, ATP a 400 μM. A concentração final de microesferas de SPA foi 1,0 mg/ml. Após a vedação de placa, as placas foram agitadas de um dia para o outro à temperatura ambiente e centrifugadas a 1800 rpm por 10 minutos, a radioatividade do produto foi determinada por contagem por cintilação em Topcount (Perkin-Elmer). A determinação de IC50 foi realizada adaptando a curva de atividade de controle percentual versus o registro da concentração de inibidor usando o software GraphPad Prism 3.0. Foi constatado que o composto de Fórmula I foi tem um IC50 de > 10 nM no ensaio do Exemplo A3.

EXEMPLO B1: ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA B

[00355] Para adquirir células B, PBMC humano é isolado do sangue periférico de doadores livres de fármacos normais por centrifugação por gradiente de densidade padrão em Ficoll-Hypague (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) e incubado com microesferas anti-CD19 (Mil- tenyi Biotech, Auburn, CA, EUA). As células B são, então, purificadas por imunoclassificação positiva usando um autoMacs (Miltenyi Biotech) de acordo com as instruções do fabricante.

[00356] As células B purificadas (2x105/cavidade/200 μl) são cultivadas em placas de ligação ultrabaixa de 96 cavidades (Corning, Corning, NY, EUA) em RPMI1640, FBS a 10% e IgM anti-humano F(ab’)2 de cabra (10 μg/ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) na presença de quantidade diferente de compostos de teste por três dias. [3H]-timidina (1 μCi/cavidade) (PerkinElmer, Boston, MA) em PBS é, então, adicionado às culturas de células B por mais 12 horas antes de a radioativi-dade incorporada ser separada por filtração com água através de filtros GF/B (Packard Bioscience, Meriden, CT) e medido por contagem por cintilação líquida com um TopCount (Packard Bioscience).

EXEMPLO B2: ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA PFEIFFER

[00357] Linhagem de células Pfeiffer (linfoma de célula B grande difuso) é adquirida junto à ATCC (Manassas, VA, EUA) e mantida no meio de cultura recomendado (RPMI e FBS a 10%). Para medir a atividade anti-proliferação dos compostos, as células Pfeiffer são plaque- adas com o meio de cultura (2x103 células/cavidade/por 200 μl) em placas de ligação ultrabaixa de 96 cavidades (Corning, Corning, NY, EUA), na presença ou ausência de uma faixa de concentração de compostos de teste. Após 3 a 4 dias, [3H]-timidina (1 μCi/cavidade) (PerkinElmer, Boston, MA) em PBS é, então, adicionado à cultura de célula por mais 12 horas antes de a radioatividade incorporada ser se- parada por filtração com água através de filtros GF/B (Packard Bioscience, Meridenj, CT) e medido por contagem por cintilação líquida com um TopCount (Packard Bioscience).

EXEMPLO B3: ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA SUDHL-6

[00358] Linhagem de células SUDHL-6 (linfoma de célula B grande difuso) foi adquirida junto à ATCC (Manassas, VA, EUA) e mantida no meio de cultura recomendado (RPMI e FBS a 10%). Para medir a atividade anti-proliferação dos compostos através de quantificação de ATP, as células SUDHL-6 foram plaqueadas com o meio de cultura (5000 células/cavidade/por 200 μl) em placa de cultura de tecido preto transparente de poliestireno de 96 cavidades (Greiner-bio-ona através de VWR, NJ) na presença ou ausência de uma faixa de concentração de compostos de teste. Após 3 dias, um agente de cultura celular Cell Titer-GLO Luminescent (Promega, Madison, WI) foi adicionado a cada cavidade por 10 minutos à temperatura ambiente para estabilizar o sinal luminescente. Isto determina o número de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, que sinaliza a presença de células ativas metabólicas. A luminescência foi medida com o TopCount 384 (Packard Bioscience através de Perkin Elmer, Boston, MA).

EXEMPLO C: ENSAIO DE FOSFORILAÇÃO DE AKT

[00359] Células Ramos (linfócito B de linfoma de Burkitts) são obtidas junto à ATCC (Manassas, VA, EUA) e mantidas em RPMI1640 e FBS a 10%. As células (3x107 células/tubo/3 ml em RPMI) são incubadas com diferentes quantidades de compostos de teste por 2 horas a 37°C e, então, estimuladas com IgM anti-humano F(ab’)2 de cabra (5 μg/ml) (Invitrogen) por 17 minutos num banho de água de 37°C. As células são giradas a 4°C com centrifugação e extratos de células inteiras são preparados usando 300 μl de tampão de lise (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). Os lisados resultantes são sonicados e os sobrenadantes são coletados. O nível de fosforilação de Akt nos sobrenadantes é analisada pelo uso de kits ELISA PathScan phosho- Akt1 (Ser473) sandwich (Cell Signaling Technology) de acordo com as instruções do fabricante.

[00360] Várias modificações da invenção, além daquelas mostradas no presente documento, serão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição anteriormente mencionada. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. Cada referência, incluindo todas as patentes, pedidos de patente e publicações, citada no presente pedido está aqui incorporada, a título de referência em sua totalidade.

Claims

1. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende reagir um composto de Fórmula XVI: com acetato de formamidina para formar um composto de Fórmula I:

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida reação do composto de Fórmula XVI com acetato de formamidina é conduzida num componente solvente compreendendo 1,2-etanodiol.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida reação do composto de Fórmula XVI com acetato de formamidina é realizada a uma temperatura de 100°C a 105°C.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que 8 a 10 equivalentes de acetato de formamidina são usados com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XVI.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XVI por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XV: com (1-etoxietilideno)malononitrila na presença de uma amina terciária.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida amina terciária é N- metilpirrolidinona.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a referida reação do composto de Fórmula XV com (1-etoxietilideno)malononitrila é realizada a temperatura ambiente.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XV por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XIV-a: com hidrazina na presença de uma amina terciária, em que P1 é alquilsulfonila C1-6.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida amina terciária é N- metilpirrolidinona.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a referida reação do composto de Fórmula XIV-a com hidrazina é realizada a uma temperatura de 35°C a 60°C.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida reação do composto de Fórmula XIV-a com hidrazina é conduzida num componente solvente compreendendo diclorometano.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que P1 é grupo metanossulfonila.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XIV-a por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XIII: com haleto de alquilsulfonila C1-6 na presença de uma amina terciária.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido haleto de alquilsulfonila C1-6 é cloreto de metanossulfonila.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a referida amina terciária é N,N-di- isopropiletilamina.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que 1,1 a 1,5 equivalente de haleto de alquilsulfonila é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XIII.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a referida reação do referido composto de Fórmula XIII com haleto de alquilsulfonila C1-6 é realizada a uma temperatura de -10°C a 5°C.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende a referida reação do referido composto de Fórmula XIII com haleto de alquilsulfonila C1-6 é realizada num componente solvente compreendendo diclorometano.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que as etapas de: (i) reagir o referido composto de Fórmula XIII com haleto de alquilsulfonila C1-6; (ii) reagir o referido composto de Fórmula XIV-a com hidrazina na presença de uma amina terciária para formar um composto de Fórmula XV; e (iii) reagir o referido composto de Fórmula XV com acetato de formamidina para formar um composto de Fórmula XVI são conduzidas no mesmo pote sem isolamento do composto de Fórmula XIV-a ou do composto de Fórmula XV.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XVI por um processo compreendendo reagir um sal de Fórmula XV-a: com (1-etoxietilideno)malononitrila na presença de uma amina terciária, em que TsOH é ácido p-toluenossulfônico.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que: a referida amina terciária é N,N-di-isopropiletilamina; e/ou a referida reação do sal de Fórmula XV-a com (1- etoxietilideno)malononitrila é realizada a temperatura ambiente; e/ou de 1,3 a 1,6 equivalente de (1-etoxietilideno)malononitrila é usado com base em 1 equivalente do sal de Fórmula XV-a; e/ou a referida reação do sal de Fórmula XV-a com (1- etoxietilideno)malononitrila é conduzida num componente solvente compreendendo etanol.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o sal de Fórmula XV-a por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XXI: com ácido p-toluenossulfônico, em que Boc é terc- butoxicarbonila.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que: o referido ácido p-toluenossulfônico é ácido p- toluenossulfônico monoidratado; e/ou de 1,3 a 1,6 equivalente de ácido p-toluenossulfônico é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XXI; e/ou a referida reação do referido composto de Fórmula XXI com ácido p-toluenossulfônico é realizada a uma temperatura de 45°C a 65°C; e/ou a reação do referido composto de Fórmula XXI com ácido p-toluenossulfônico é conduzida num componente solvente compreendendo etanol.

24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 23, caracterizado pelo fato de que as etapas de: (i) reagir o referido composto de Fórmula XXI com ácido p- toluenossulfônico para formar um sal de Fórmula XV-a; e (ii) reagir o referido sal de Fórmula XV-a com (1-etoxietilideno)malononitrila são conduzidas no mesmo pote sem isolamento do sal de Fórmula XV-a.

25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XXI por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XX: com gás hidrogênio na presença de um ou mais catalisadores de hidrogenação independentemente selecionados, em que Boc é t-butoxicarbonila.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que: a referida reação do composto de Fórmula XX com gás hidrogênio é realizada na presença de dois catalisadores de hidrogenação independentemente selecionados; e/ou um catalisador de hidrogenação é bis(1,5- ciclooctadieno)ródio(I)tetrafluoroborato e o outro é (R)-(-)-1-{(S)-2- [bis(4-trifluorometilfenil)fosfina]ferrocenil}etil-di-t-butilfosfina; e/ou 13,5 a 14,5 equivalentes do composto de Fórmula XX são usados com base em 1 equivalente do bis(1,5- ciclooctadieno)ródio(I)tetrafluoroborato; e/ou 12 a 13 equivalentes do composto de Fórmula XX são usados com base em 1 equivalente do (R)-(-)-1-{(S)-2-[bis(4- trifluorometilfenil)fosfina]ferrocenil}etil-di-t-butilfosfina; e/ou a referida reação do composto de Fórmula XX com gás hidrogênio é realizada a temperatura ambiente; e/ou a referida reação do composto de Fórmula XX com gás hidrogênio é conduzida num componente solvente compreendendo metanol.

27. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XX por um processo compreendendo reagir um composto de Fórmula XIX: com carbazato de t-butila.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que: a referida reação do composto de Fórmula XIX com carbazato de t-butila é realizada a uma temperatura de 60°C a 70°C; e/ou a referida reação do composto de Fórmula XIX com carbazato de t-butila é conduzida num componente solvente compreendendo metanol.

29. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, preparar o composto de Fórmula XIX por um processo compreendendo oxidar um composto de Fórmula XIII-a: na presença de um agente oxidante.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que: o referido agente oxidante é periodinano de Dess-Martin; e/ou de 1,2 a 1,7 equivalente de referido agente oxidante é usado com base em 1 equivalente do composto de Fórmula XIII-a; e/ou a referida oxidação do composto de Fórmula XIII-a é realizada a temperatura ambiente; e/ou a referida oxidação do composto de Fórmula XIII-a é conduzida num componente solvente compreendendo diclorometano.

31. Composto, caracterizado pelo fato de que tem a Fórmula XIV: ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

32. Composto, caracterizado pelo fato de que tem Fórmula XV: ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

33. Composto, caracterizado pelo fato de que tem Fórmula XVI: ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

34. Composto, caracterizado pelo fato de que tem Fórmula XX: ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

35. Composto, caracterizado pelo fato de que tem a Fórmula XXI: ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.