TW201207397A - Anti-tim-3 antibody - Google Patents

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TW201207397A
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Shin-Ichiro Takayanagi
Hitomi Tomura
Tomonori Tawara
Yoshimasa Inagaki
Tsuguo Kubota
Koichi Akashi
Yoshikane Kikushige
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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Description

201207397 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於如下者：與τ細胞免疫球蛋白黏蛋白分子 (T-cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-3，以下記為TIM-3)之細胞外區域結合，且發揮 抗體依賴性細胞毒殺活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，以下記為ADCC活性）之單株抗體或其抗體片 段；產生該抗體之融合瘤；編碼該抗體之DNA ;含有該 • DNA之載體；導入該載體而獲得之轉形體；使用該融合瘤 或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法；以該抗體或 該抗體片段作為有效成分之治療藥及診斷藥。 【先前技術】 TIM基因家族於小鼠體内係由8種基因構成，於人類體 内係由3種基因構成，分別存在於第11號染色體與5q33區 域（非專利文獻1)。該等基因區域與自體免疫疾病及過敏性 疾病有關。TIM蛋白質係具有結構上獲得保存之免疫球蛋 • 白可變[immunoglobulin variable(IgV)]區域及黏蛋白區域 的I型跨膜蛋白質。 先前一直認為TIM蛋白質係於初始T細胞上特異性表現 而直接控制其等之活性，但近來亦報告有於抗原呈現細胞 上之表現及功能（非專利文獻2) ^藉由結晶結構分析得知 TIM蛋白質具有經保存之結構，於IgV區域内具有配體結 合部位。 TIM-3已鑑定為不表現於Th2細胞中而特異性地表現於 156912.doc 201207397 小鼠Thl細胞中之分子（非專利文獻3)。TIM-3之DNA序 歹·！、胺基酸序列及立體結構已公開於公共資料庫上，例如 可根據 NM_032782 ' NM_134250(GenBank)等登錄編號進 行參照。TIM-3之別名為HAVCR2。 人類之TIM-3與小鼠同樣地表現於τ細胞中，亦表現於 巨噬細胞或樹狀細胞等巨噬細胞中。TIM-3藉由與成為配 體之蛋白質（例如半乳糖凝集素蛋白結合，而利用誘導 Thl細胞凋亡等機制來抑制Thl應答，例如誘導周邊免疫耐 受性（peripheral tolerance)。 藉由利用siRNA減弱人類TIM-3之表現或利用阻斷性抗 體抑制人類TIM-3之表現，可見來自CD4陽性T細胞之干擾 素γ(ΝΝγ)之分泌亢進等，證明TIM-3係承擔人類τ細胞之 抑制作用。又，於巨噬細胞上，ΤΙΜ-3係作為識別调亡細 胞之受體而發揮功能。 於使用臨床檢體之分析中，於源自自體免疫疾病患者之 CD4陽性Τ細胞中未見ΤΙΜ-3之表現。尤其於源自多發性硬 化症患者之腦脊髓液的Τ細胞純系中，ΤΙΜ-3之表現低於源 自健康人之純系，IFNY之分泌較多（非專利文獻4)。又， 亦提示TIM-3與過敏或哮喘疾病有關（專利文獻1及2)。 進而’根據急性骨髓性白血病（以下記為AML)之造血幹 細胞與正常造血幹細胞之微陣列分析，得知AML幹細胞上 表現TIM-3，提示其與血液腫瘤有關（非專利文獻5及專利 文獻3)。 至今為止確立之抗TIM-3單株抗體已知有抗人類TIM-3 156912.doc 201207397 大鼠單株抗體（Clone 344823、R & D Systems公司製造）、 抗人類TIM-3小鼠單株抗體（Clone F38-2E2、eBioscience公 司製造）等。 先前技術文獻 專利文獻 專利文獻1:國際公開96/27603號 專利文獻2:國際公開2003/063792號 專利文獻3:國際公開2009/091547號 # 非專利文獻 非專利文獻 1 : Hafler DA等人、J Exp Med. 205 : 2699-701 (2008) 非專利文獻 2 : Anderson AC 等人、Science 3 18 : 1141 - 3 (2007) 非專利文獻 3 : Monney L 等人、Nature 415 : 536-41。 (2002) 非專利文獻4 : Koguchi K等人、J Exp Med. 203 : 1413-® 8 ° (2006) 非專利文獻 5 : Majeti R等人、Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Mar 3 ； 106 (9) : 3396-401 ° 【發明内容】 發明所欲解決之問題 然而，具有ADCC活性之針對人類TIM-3之單株抗體尚 屬未知。因此，本發明之課題在於提供一種與人類TIM-3 之細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構結合，且發揮 156912.doc 201207397 ADCC活性之單株抗體或其抗體片段。又，本發明之課題 在於藉由探索與該單株抗體或其抗體片段競爭之抗人類 ΤΙΜ-3抗體’提供具有高ADCC活性之抗人類ΤΙΜ-3抗體。 進而’本發明之課題在於提供：產生上述抗體之融合 瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA之載體、導入該載體 而獲得之轉形體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗 體片段之製造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分 之治療藥及診斷藥。 解決問題之技術手段 φ 本發明之主旨如下。 (1) 一種單株抗體或該抗體片段，其與選自以下〜(iii)中 之1種抗體競爭而與人類TIM-3之細胞外區域結合。 ⑴含有互補決定區域（complementarity determining region ’以下記為CDR)1~3分別含有序列編號1〜3所表示之 胺基酸序列的抗體之重鏈（以下，記為Η鏈），且含有 CDR1〜3分別含有序列編號4〜6所表示之胺基酸序列的抗體 之輕鏈（以下，記為L鏈）的抗體 鲁 (ii)含有CDR1〜3分別含有序列編號u〜13所表示之胺基 酸序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號 14〜16所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的抗體 (ill)含有CDR1〜3分別含有序列編號21 ~23所表示之胺基 酸序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號 24~26所表示之胺基酸序列的抗體之l鏈的抗體 (2) 如（1)之單株抗體或該抗體片段，其係與和選自上述 156912.doc 201207397 ⑴〜㈣中之m抗體相同之㈣、決定位結合的單株抗體。 (3) -種單株抗體或該抗體片段，其與以下⑷或⑻之抗體 競爭而與人類TIM-3之細胞外區域結合。 (a) 含有包含序列編號8所表示之胺基酸序列的抗體之 VH，且含有包含序列編號1〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的抗體 (b) 含有包含序列編號18所表示之胺基酸序列的抗體之 VH，且含有包含序列編號2〇所表示之胺基酸序列的抗體 # 之VL的抗體 (4) 如（3)之單株抗體或該抗體片段，其係與和上述（a)或（b) 之抗體相同之抗原決定位結合的單株抗體。 (5) 如（1)至（4)中任一項之單株抗體或該抗體片段，其係基 因重組抗體。 (6) 如（5)之單株抗體或該抗體片段，其係選自人類型嵌合 抗體、人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。 (7) —種單株抗體或該抗體片段，其係選自以下（i)〜(Hi)中 鲁之1種。 ⑴含有CDR1〜3分別含有序列編號1〜3所表示之胺基酸序 列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號4〜6所 表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的單株抗體及該抗體片 (ii)含有CDR1〜3分別含有序列編號11〜13所表示之胺基 酸序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1~3分別含有序列編號 14〜16所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的單株抗體及該抗 156912.doc 201207397 體片段。 (iii)含有CDR1〜3分別含有序列編號21〜23所表示之胺基 酸序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號 24〜26所表示之胺基酸序列的抗體之l键的單株抗體及該抗 體片段。 (8) —種單株抗體及該抗體片段，其係以下（a)或（b)。 (a) 含有包含序列編號8所表示之胺基酸序列的抗體之 VH ’且含有包含序列編號1〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的單株抗體及該抗體片段。 (b) 含有包含序列編號18所表示之胺基酸序列的抗體之 VH ’且含有包含序列編號20所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的單株抗體及該抗體片段。 (9) 一種單株抗體及該抗體片段，其與序列編號53所表示之 人類TIM-3之IgV區域之胺基酸序列中之第67號至第105號 之胺基酸序列、第67號至第96號之胺基酸序列或第67號至 第8 7號之胺基酸序列結合。 (10) 如（1)至（9)中任一項之抗體片段，其係選自Fab、 Fab'、F(ab')2、單鏈抗體（scFv)、二聚化 v 區域（diabody)、 二硫鍵穩定化V區域（dsFv)及含有CDR之肽中之抗體片 段。 (11) 一種DNA ’其編碼（1)至（10)中任一項之單株抗體或該 抗體片段。 (12) —種重組體載體，其含有（u)之dnA。 (13) —種轉形株，其係將（12)之重組體載體導入宿主細胞 156912.doc 201207397 而獲得。 (14) 一種（1)至（1〇)中任一項之單株抗體或該抗體片段之製 造方法，其係於培養基中培養（13)之轉形株，使（1)至（1〇) 中任一項之單株抗體或該抗體片段生成蓄積於培養物中， 再培養物採集該抗體或該抗體片段。 (15) —種人類TIM-3之免疫學之檢測或測定方法，其使用 (1)至（10)中任一項之單株抗體或該抗體片段。 (16) —種人類TIM-3之檢測或測定用試劑，其含有（丨）至 • (10)中任一項之單株抗體或該抗體片段。 (17) 種與人類TIM-3陽性細胞相關之疾病之診斷藥，其 含有（1)至（10)中任一項之單株抗體或該抗體片段。 (18) —種與人類TIM-3陽性細胞相關之疾病之診斷方法， 其包括使用（1)至（10)中任一項之單株抗體或該抗體片段而 檢測或測定人類TIM-3陽性細胞。 (19) 種與人類t〗M-3陽性細胞相關之疾病之診斷方法， 其包括使用（1)至（1〇)中任一項之單株抗體或該抗體片段而 _ 檢測或測定人類TIM-3。 (20) -種⑴至⑽中任一項之單株抗體或該抗體片段之用 途’其係用於製造與人類TIM_3陽性細胞相關之疾病之診 斷藥。 (21) —種與人類TIM-3陽性細胞相關之疾病之治療藥，其 含有（1)至（10)中任一項之單株抗體或該抗體片段。 (22) 一種與人類TIM-3陽性細胞相關之疾病之治療方法， 其包括使用（1)至（1G)中任-項之單株抗體或該抗體片段而 156912.doc 201207397 誘導人類TIM-3陽性細胞之細胞死亡。 (23)—種（1)至（10)中任一項之單株抗體或該抗體片段之用 途，其係用於製造與人類TIM-3陽性細胞相關之疾病之治 療藥。 發明之效果 本發明之單株抗體或其抗體片段會特異性地識別人類 TIM-3之細胞外區域之特定胺基酸序列或其立體結構，且 與該細胞外區域結合。認為本發明之單株抗體或其抗體片 段所識別之人類TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列或其立 體結構不同於先前之抗TIM-3單株抗體所識別之胺基酸序 列或其立體結構，藉此可發揮出高ADCC活性。與人類 TIM-3之細胞外區域特異性地結合，且具有高ADCC活性 之本發明之單株抗體或其抗體片段對於與人類TIM-3陽性 細胞相關之疾病之治療及診斷等非常有用。 又，本發明可提供如下者：產生上述抗體之融合瘤、編 碼該抗體之DNA、含有該DNA之載體、導入該載體而獲得 之轉形體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段 之製造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分之治療 藥及診斷藥。 【實施方式】 作為本發明之人類TIM-3，可列舉：含有序列編號53或 GenBank登錄編號NM_032782所示之胺基酸序列且具有人 類TIM-3之功能的多肽，以及具有與序列編號53或 GenBank登錄編號NM_032782所示之胺基酸序列具有60% 156912.doc 10 201207397 以上、較佳為80%以上、更佳為90%以上之同源性之胺基 酸序列的多肽，最佳為含有具有95%以上之同源性之胺基 酸序列且具有人類TIM-3之功能的多肽等。 作為獲得具有序列編號53或GenBank登錄編號 NM_03 27 82所示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸缺 失、置換、或附加之胺基酸序列之多肽的方法，可列舉： 使用部位特異性變異導入法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition, Cold Spring Harbor • Laboratory Press (1989) ' Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) ' Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409, (1982) ' Gene, 34, 315 (1985) ' Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)]等，對例如編碼具有序列編號53所示 之胺基酸序列之多肽的DNA導入部位特異性變異之方法。 缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳 為1個〜數十個、例如1〜20個，更佳為1個〜數個、例如1〜5 ® 個胺基酸。 作為編碼人類TIM-3之基因，可列舉：序列編號52或 GenBank登錄編號NM_032782所示之鹼基序列。本發明之 編碼人類TIM-3之基因包括如下者等：含有編碼如下多肽 之DNA的基因，該多肽係包含序列編號52或GenBank登錄 編號NM_032782所示之鹼基序列中有1個以上之鹼基缺 失、置換或附加之鹼基序列且具有人類TIM-3之功能者； 含有編碼如下多肽之DNA的基因，該多肽係包含與序列編 156912.doc 201207397 號52或GenBank登錄編號NM_032782所示之鹼基序列具有 至少60%以上之同源性之鹼基序列、較佳為具有80%以上 之同源性之鹼基序列、更佳為具有95%以上之同源性之鹼 基序列且具有人類TIM-3之功能者；以及含有編碼如下多 肽之DNA的基因，該多肽係包含於嚴格條件下與具有序列 編號52或GenBank登錄編號NM_032782所示之鹼基序列之 DNA進行雜交之DNA且具有人類TIM-3之功能者。 作為於嚴格條件下進行雜交之DNA，係指使用具有序列 編號52或GenBank登錄編號NM_032782所示之鹼基序列之 φ DNA作為探針且藉由菌落雜交法、嗜菌斑雜交法、南方墨 點雜交法、或DNA微陣列法等而獲得之可進行雜交之 DNA。 具體而言，可列舉：使用固定有源自經雜交之菌落或者 嗜菌斑之DNA、或具有該序列之PCR產物或寡聚DNA的過 濾片或載玻片，於0.7〜1.0 mol/L之氣化鈉之存在下，於 65°C 下進行雜交[Molecular Cloning，A Laboratory Manual， Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ' Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley
& Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1 : Coretechniques，A
Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]後，使用0，1〜2倍濃度之SSC溶液（1倍濃度之SSC溶 液之組成包含150 mmol/L氣化納、15 mmol/L擰檬酸納）， 於65°C條件下清洗過濾片或載玻片，藉此可進行鑑定之 DNA » 156912.doc 201207397 作為上述可進行雜交之DNA，可列舉：與序列編號52或 GenBank登錄編號NM_032782所示之鹼基序列具有至少 60%以上之同源性之DNA，較佳為具有80%以上之同源性 之DNA，更佳為具有95%以上之同源性之DNA。 編碼真核生物之蛋白質之基因之鹼基序列經常可見基因 之多型性。藉由此種多型性使本發明中所使用之基因之鹼 基序列產生小規模變異而成之基因亦包含在本發明之編碼 TIM-3之基因中。 本發明之同源性之數值除特別明示之情形以外，可為使 用從業者公知之同源性檢索程式所算出之數值，對於鹼基 序列，可列舉使用 BLAST[J. Mol. Biol·，215、403 (1990)] 中預設之參數所算出之數值等，對於胺基酸序列，可列舉 使用 BLAST2 [Nucleic Acids Res.，25，3389 (1997)、 Genome Res.，7，649 (1997)，http : "www.ncbi.nlm.nih.gov/ Education/ BLASTinfo/information3.html]中預設之參數所 算出之數值等。 作為預設參數，G (Cost to open gap，起始空隙罰分）於 鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11 ; -E (Cost to extend gap，延伸空隙罰分）於驗基序列之情形時 為2，於胺基酸序列之情形時為1 ; -q (Penalty for nucleotide mismatch，核酸錯配罰分）為-3 ; -r (reward for nucleotide match，核酸匹配得分）為 1 ; -e (expect value， 期望值）為10 ·，-W (wordsize，字長）於驗基序列之情形時 為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基；-y 156912.doc -13- 201207397 (DroP〇ff (X) f〇r blast extensions in bits，blastn延伸下降值 域（位元））於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式時為 7 I -X f v ’ dropoff value forgapped alignment in bits > 空隙 比對之下降值（位元））為15 ;及Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits，最終空隙比對之下降值（位元 於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式時為25(1^卩·· //www.ncbi.nim.nih.g〇v/blast/html/blastcgihelp.html) 〇 包含序列編號53或GenBank登錄編號NM_032782所示之 胺基酸序列之部分序列之多肽可藉由從業者公知之方法來 製作’例如可藉由使編碼序列編號52所示之胺基酸序列之 DNA之一部分缺失，並對導入有含有其之表現載體的轉形 體進行培養而製作。 又’基於藉由上述方法所製作之多肽或DNA，藉由與上 述相同之方法，可獲得具有序列編號53或GenBank登錄編 號NM_032782所示之胺基酸序列之部分序列十有1個以上 之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽。 進而，包含序列編號53或GenBank登錄編號NM_032782 所示之胺基酸序列之部分序列之多肽、或具有序列編號53 或GenBank登錄編號NM_032782所示之胺基酸序列之部分 序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序 列的多肽亦可藉由苐基甲氧基羰基（Fmoc)法、第三丁氧基 羰基（tBoc)法等化學合成法來製造。 作為本發明之人類TIM-3之細胞外區域，例如可列舉： 使用公知之跨膜區域預測程式SOSUI (http : //bp.nuap. 156912.doc • 14- 201207397 nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html) 、TMHMM ver.2 (http · //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) ' ExPASy Proteomics Server(http : //Ca.expasy.org/)或 SMART (http : //smart.embl-heidelberg.de/)等對序列編號53所示之該多肽 之胺基酸序列進行預測而獲得之區域等。 作為本發明之人類TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列， 可列舉SMART中預測之細胞外區域、即序列編號53所表示 之胺基酸序列之第1號至第201號。 作為本發明之人類TIM-3之細胞外區域之立體結構，只 要具有與含有序列編號53或GenBank登錄編號NM_032782 所示之胺基酸序列之人類TIM-3之細胞外區域可於天然狀 態下形成之結構同等之結構，則可為任意結構。所謂人類 TIM-3之細胞外區域可於天然狀態下形成之立體結構，係 指表現於細胞膜上之人類TIM-3之天然型之立體結構。 本發明中所謂人類TIM-3之功能，係指利用藉由與成為 配體之蛋白質（例如半乳糖凝集素蛋白-9)之結合而誘導Th 1 細胞之細胞凋亡等機制，抑制Thl應答，而誘導例如周邊 免疫耐受性。又，係指於巨噬細胞上識別凋亡細胞作為受 體。 本發明之單株抗體（以下，亦稱為本發明之抗體）或其抗 體片段與人類TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列或其立體 結構結合之情況可藉由如下方法確認：使用固相三明治法 等之放射免疫分析、或使用酶免疫測定法（ELIS A)等之針 對表現人類TIM-3之細胞之公知之免疫學檢測法，較佳為 156912.doc •15- 201207397 螢光細胞染色法等可調查表現特定抗原之細胞與針對特定 抗原之抗體之結合性的方法。 例如可列舉：使用FMAT8100HTS系統（Applied Biosystems公司製造）等之螢光抗體染色法[Cancer Immunol. Immunother.，36，373 (1993)]、使用流式細胞儀之螢光細 胞染色法、或使用Biacore系統（GE Healthcare公司製造）等 之表面離體子共振等方法》 又’亦可組合公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996) ' Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、單株抗體實驗指南講 談社科學（1987)]等而確認》 作為表現人類TIM-3之細胞，只要表現該TIM-3，則可 為任意細胞，例如可列舉：人類體内天然存在之細胞、由 人類體内天然存在之細胞所建立之細胞株、或藉由基因重 組技術獲得之細胞等》 作為人類體内天然存在之細胞，例如可列舉於癌、自體 免疫疾病或過敏性疾病之患者體内表現該TIM-3之細胞， 具體可列舉：Thl細胞、巨噬細胞及樹狀細胞等。 作為由人類體内天然存在之細胞所建立之細胞株，例如 可列舉：將上述自癌患者獲得之表現該TIM-3之細胞株化 而獲得之細胞株中的表現該TIM-3之細胞株。例如可列 舉：作為由人類細胞建立之細胞株的源自急性骨髓性白血 病之細胞株KG-1[美國典型菌種保藏中心（ATCC， 156912.doc -16· 201207397
American Type Culture Collection)編號：CCL-246]或源自 伯奇氏淋巴瘤之細胞株Daudi(ATCC編號：CCL-213)等。 作為藉由基因重組技術獲得之細胞，具體而言，例如可 列舉：藉由將含有編碼該TIM-3之cDNA之表現載體導入昆 蟲細胞或動物細胞等中而獲得之表現該TIM-3之細胞等。 又，本發明係關於一種與人類TIM-3之細胞外區域之胺 基酸序列或其立體結構結合而發揮ADCC活性之單株抗 體。 本發明所謂ADCC活性，係指與細胞表面之人類TIM-3 結合之抗體經由Fc部分而主要與自然殺手細胞（以下記為 NK細胞）表面之FcyRIIIa結合，結果由自NK細胞釋放之穿 孔素或顆粒溶解酶等細胞毒殺性分子所產生之細胞溶解反 應[Clark M，Chemical Immunology，65，88 (1997) ; Gorter A等人，Immunol. Today，20，576 (1999)]。 作為本發明之抗體，只要為識別人類TIM-3之細胞外區 域之胺基酸序列或其立體結構，且與該細胞外區域所結合 之抗體或其抗體片段、或者人類TIM-3之細胞外區域之胺 基酸序列或其立體結構結合而具有ADCC活性之單株抗體 或抗體片段，則包括任意抗體。 作為本發明之抗體，具體而言，可列舉與如下胺基酸序 列或其立體結構結合的抗體：於包含序列編號53所表示之 人類TIM-3之胺基酸序列中之第1號〜第201號之胺基酸序列 的細胞外區域中，選自較佳為第67號〜第105號之胺基酸序 列、更佳為第67號〜第96號之胺基酸序列、更佳為第67號〜 156912.doc -17- 201207397 第87號之胺基酸序列中之任一胺基酸序列或其立體結構。 作為上述抗體，具體而言，可列舉以下（i)〜(iii)之單株 抗體及其抗體片段》 (i) 互補決定區域（complementarity deterining region，以下 記為CDR)1〜3分別含有包含序列編號u所表示之胺基酸 序列的抗體之重鏈（以下，記為Η鏈），且含有CDR1〜3分別 含有序列編號4〜6所表示之胺基酸序列的抗體之輕鍵（以 下，記為L鏈）的單株抗體及其抗體片段 (ii) 含有CDR1〜3分別含有序列編號η〜13所表示之胺基酸 序列的抗體之Η鏈’且含有CDR1〜3分別含有序列編號 14〜16所表示之胺基酸序列的抗體之l鏈的單株抗體及其抗 體片段 (iii) 含有CDR1〜3分別含有序列編號21〜23所表示之胺基酸 序列的抗體之Η鏈’且含有CDR1〜3分別含有序列編號 24〜26所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的單株抗體及其抗 體片段 又’作為本發明之單株抗體，更具體而言，可列舉以下 (a)及（b)之單株抗體及其抗體片段。 (a) 含有包含序列編號8所表示之胺基酸序列的抗體之VH， ^•含有包含序列編號10所表示之胺基酸序列的抗體之VL 的單株抗體及其抗體片段 (b) 含有包含序列編號1 8所表示之胺基酸序列的抗體之 VH ’且含有包含序列編號2〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的單株抗體及其抗體片段 156912.doc 201207397 進而’作為本發明之單株抗體，可列舉：與上述單株抗 體競爭而與人類ΤΙΜ·3之細胞外區域之胺基酸序列或其立 體結構結合之單株抗體及其抗體片段、以及與和上述單株 抗體所結合之人類Τ购之細料區域上存在之抗原決定 位相同之抗原蚊位結合的單株抗體及其抗體片段。 於本發明中，所謂與單株抗體競爭之抗體，係指於與本 發明之單株抗體相同或部分相同之人類m3之細胞外區 域具有抗原決定位（亦稱為抗原決定基），且與該抗原決定 位結合之抗體。所謂與和本發明之單株抗體所結合之抗原 決定位相同之抗原決定位結合的抗體，係指識別並結合與 本發明之單株抗體所識別之人類ΤΙΜ_3之胺基酸序列相同 之序列的抗體。 作為本發明之單株抗體，可列舉：利用融合瘤生產之抗 體、或利用由含有抗體基因之表現載體轉形而成之轉形體 生產之基因重組抗體。 所謂單株抗體’係指單株之抗體產生細胞所分泌之抗 體’其僅識別一個抗原決定位（亦稱為抗原決定基），且構 成早株抗體之胺基酸序列（1次結構）均一。 作為抗原決定位，例如可列舉：單株抗體所識別、結合 之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有 糖鏈之胺基酸序列及包含結合有糖鏈之胺基酸序列的立體 結構等。 本發明之單株抗體較佳為與序列編號53所表示之人類 ΤΙΜ-3之細胞外區域之胺基酸序列中之第22號〜第131號之 156912.doc •19- 201207397 胺基酸序列所表示之人類TIM-3之IgV區域之胺基酸序列結 合。具體而言，本發明之單株抗體所結合之胺基酸序列較 佳為序列編號53之第67號〜第105號之胺基酸序列，更佳為 第67號〜第96號之胺基酸序列，更佳為第67號〜第87號之胺 基酸序列。 本發明之單株抗體所結合之抗原決定位較佳為包含於序 列編號53所表示之人類TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列 中之第22號〜第131號之胺基酸序列所表示之人類TIM-3之 IgV區域。具體而言，本發明之單株抗體所結合之抗原決 定位較佳為包含於第67號〜第105號之胺基酸序列中，更佳 為包含於第67號〜第96號之胺基酸序列中，更佳為包含於 第67號〜第87號之胺基酸序列中。 本發明之單株抗體所結合之抗原決定位之胺基酸序列較 佳為含有人類TIM-3之IgV區域之胺基酸序列中選自序列編 號53之第67號〜第87號之胺基酸中之至少1個胺基酸，更佳 為含有選自第67號、第74號、第76號、第78號、第79號、 第81號、第83號及第85號之胺基酸中之至少1個胺基酸。 又，本發明之單株抗體所結合之抗原決定位之胺基酸序 列較佳為含有人類TIM-3之IgV區域之胺基酸序列中之選自 序列編號53之第67號〜第87號之胺基酸序列中之至少連續2 個以上之胺基酸，更佳為含有選自第67號、第74號、第76 號、第78號、第79號、第81號、第83號及第85號之胺基酸 中之至少1個胺基酸，且含有選自序列編號53之第67號〜第 87號之胺基酸序列中之至少連續2個以上之胺基酸。 156912.doc • 20- 201207397 具體而言，作為本發明之單株抗體所結合之抗原決定位 之胺基酸序列’可列舉：含有序列編號53之第67號〜第74 號之胺基酸之胺基酸序列、含有第67號〜第76號之胺基酸 之胺基酸序列、含有第67號〜第78號之胺基酸之胺基酸序 列、含有第67號〜第79號之胺基酸之胺基酸序列、含有第 67號~第81號之胺基酸之胺基酸序列、含有第67號〜第83號 之胺基酸之胺基酸序列、含有第67號~第85號之胺基酸之 胺基酸序列、 含有第74號〜第76號之胺基酸之胺基酸序列、含有第74 號〜第78號之胺基酸之胺基酸序列、含有第74號〜第79號之 胺基酸之胺基酸序列、含有第74號〜第81號之胺基酸之胺 基酸序列、含有第74號〜第83號之胺基酸之胺基酸序列、 含有第74號~第85號之胺基酸之胺基酸序列、 含有第76號〜第78號之胺基酸之胺基酸序列、含有第76 號〜第79號之胺基酸之胺基酸序列、含有第76號〜第81號之 胺基酸之胺基酸序列、含有第76號〜第83號之胺基酸之胺 基酸序列、含有第76號〜第85號之胺基酸之胺基酸序列、 含有第78號〜第79號之胺基酸之胺基酸序列、含有第78 號〜第81號之胺基酸之胺基酸序列、含有第78號〜第83號之 胺基酸之胺基酸序列、含有第78號〜第85號之胺基酸之胺 基酸序列、 含有第79號〜第81號之胺基酸之胺基酸序列、含有第79 號〜第83號之胺基酸之胺基酸序列、含有第79號〜第85號之 胺基酸之胺基酸序列、 156912.doc -21 - 201207397 含有第81號〜第83號之胺基酸之胺基酸序列、含有第8l 號〜第85號之胺基酸之胺基酸序列、或 含有第83號〜85番之胺基酸之胺基酸序列等。 融合瘤例如可藉由如下方式製備：製備表現上述人類 TIM-3之細胞等作為抗原，自利用該抗原進行免疫之動物 誘導具有抗原特異性之抗體生產細胞’進而使該抗體生產 細胞與骨髓瘤細胞融合.藉由培養該融合瘤，或將該融合 瘤細胞投予動物而使該動物患上腹水癌，再對該培養液或 腹水進行分離、純化，可取得抗TIM_3單株抗體。 _ 作為利用抗原進行免疫之動物，只要可製作融合瘤則可 使用任何動物，較佳為使用小鼠、大鼠、倉鼠、雞或兔子 等。又，自此種動物取得具有抗體產生能之細胞，於活體 外對該細胞實施免疫後，使其與骨髓瘤細胞融合而製作之 融合瘤所生產的抗體等亦包含在本發明之抗體中。 於本發明中，作為基因重組抗體，包括人類型嵌合抗 體' 人類型CDR移植抗體、人類抗體或抗體片段等藉由基 因重組而製造之抗體。於基因重組抗體中，具有單株抗體鲁 之特徵，抗原性較低，血漿半衰期延長者作為治療藥較 佳。作為基因重組抗體，例如可列舉使用基因重組技術對 上述本發明之單株抗體進行修飾而成者。 人類型嵌合抗體係指包含人類以外之動物之抗體之VH 及VL與人類抗體之重鏈恆定區域（以下，記為ch)及輕鏈 恆疋區域（以下，記為CL)的抗體。本發明之人類型嵌合抗 體可藉由如下方式製造：自產生特異性識別人類τΐΜ_3且 I56912.doc •22- 201207397 與該細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構結合之單株抗 體的融合瘤，取得編碼VH及VL之cDNA，分別插入具有編 碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體中而 構建人類型嵌合抗體表現載體，再導入動物細胞中使其表 現。 作為人類型嵌合抗體之CH，只要屬於人類免疫球蛋白 (以下，記為hlg)則可為任意者，較佳為使用hlgG型者，進 而可使用屬於hlgG型之hlgGl、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞 型中之任一者。又，作為人類型嵌合抗體之CL，只要屬於 hlg則可為任意者，可使用κ型或λ型者。 作為本發明之人類型嵌合抗體，具體可列舉：含有包含 序列編號28所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且含有包 含序列編號30所表示之胺基酸序列之抗體之VL的嵌合抗 體。 進而，作為本發明之嵌合抗體，可列舉：與本發明之單 株抗體競爭而與人類ΤΙΜ-3之細胞外區域之胺基酸序列或 其立體結構結合之嵌合抗體、及與和上述嵌合抗體所結合 之人類ΤΙΜ-3之細胞外區域上存在之抗原決定位相同之抗 原決定位結合的嵌合抗體。 所謂人類型CDR移植抗體，亦有稱為人類化抗體之情 形，係指將人類以外之動物之抗體之VH及VL之CDR之胺 基酸序列移植至人類抗體之VH及VL之適當位置而成的抗 體。本發明之人類型CDR移植抗體可藉由如下方式製造： 將由產生特異性識別人類ΤΙΜ-3且與該細胞外區域之胺基 156912.doc -23- 201207397 酸序列或其立體結構結合的人類以外之動物之單株抗體的 融合瘤所產生之人類以外之動物之抗體之VH及VL之CDR 之胺基酸序列移植至任意之人類抗體之VH及VL之構架區 域（以下，記為FR)，構建編碼所獲得之V區域之cDNA，將 其分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物 細胞用表現載體中而構建人類型CDR移植抗體表現載體， 再導入動物細胞中使其表現。 作為人類型CDR移植抗體之CH，只要屬於hlg則可為任 意者，較佳為使用hlgG型者，進而可使用屬於hlgG型之 hlgGl、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞型中之任一者°又，作 為人類型CDR移植抗體之CL，只要屬於hlg則可為任意 者，可使用κ型或λ型者。 作為本發明之人類型CDR移植抗體，具體可列舉：含有 CDR1〜3包含序列編號21〜23所表示之胺基酸序列之抗體之 VH，且CDR1〜3包含序列編號24〜26所表示之胺基酸序列 之抗體之VL的人類化抗體。 作為本發明之人類化抗體，具體可列舉含有以下（a)VH 及（b)VL中至少一者之人類化抗體。
(a)含有序列編號67之胺基酸序列、或序列編號67之胺基酸 序列之選自第12號之Lys、第20號之Va卜第38號之Arg、 第40號之Ala、第48號之Met、第67號之Arg、第68號之 Val、第70號之lie、第72號之Ala、第74號之Thr、第98號 之Arg、及第113號之Val中之至少1個胺基酸殘基被置換為 其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VH 156912.doc -24- 201207397 (b)含有序列編號69之胺基酸序列、或序列編號69之胺基酸 序列中之選自第11號之Leu、第13號之Ala、第15號之 Val、第36號之Tyr、第43號之Ala、第44號之Pro、第46號 之Leu、第71號之Phe、及第85號之Thr中之至少1個胺基酸 殘基被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的抗體之VL 進而，作為本發明之人類化抗體所含之VH，較佳為以 下⑴〜(8)。
(1) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys、第20 號之Val、第38號之Arg、第40號之Ala、第48號之Met、第 67號之Arg、第68號之Val、第70號之lie、第72號之Ala、 第74號之Thr、第98號之Arg、及第113號之Val被置換為其 他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(2) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys、第38 號之Arg、第40號之Ala、第48號之Met、第67號之Arg、第 68號之Val、第70號之lie、第72號之Ala、第74號之Thr、 及第98號之Arg被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的 VH
(3) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val、第38 號之Arg、第48號之Met、第68號之Val、第70號之lie、第 72號之Ala、第98號之Arg、及第113號之Val被置換為其他 胺基酸殘基之胺基酸序列的VH (4) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg、第40 號之Ala、第48號之Met、第67號之Arg、第72號之Ala、第 74號之Thr、及第98號之Arg被置換為其他胺基酸殘基之胺 156912.doc •25- 201207397
基酸序列的VH
(5) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys、第67 號之Arg、第68號之Val、第72號之Ala、第74號之Thr、及 第98號之Arg被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(6) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg、第40 號之Ala、第48號之Met、第67號之Arg、及第98號之Arg被 置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(7) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg、第48 號之Met、第67號之Arg、及第74號之Thr被置換為其他胺 基酸殘基之胺基酸序列的VH
(8) 含有序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg、第48 號之Met、及第98號之Arg被置換為其他胺基酸殘基之胺基 酸序列的VH 作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉：導入有將序 列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為Va卜第20 號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、第40號之 Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換 為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、 第72號之Ala置換為Val、第74號之Thr置換為Lys、第98號 之Arg置換為Gly、或第113號之Val置換為Leu之修飾中之 至少1個修飾的胺基酸序列。 作為導入有12個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言， 例如可列舉：將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之 Lys置換為Va卜第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置 156912.doc -26- 201207397 換為Lys、第4〇號之Aia置換為Arg、第48號之Met置換為 He、第67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第 70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜第74號之 Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val 置換為Leu的胺基酸序列。 作為導入有11個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言， 例如可列舉以下（1)〜（I2)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第2〇號之Val置換為 鲁 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lle、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第丨2號之Lys置換為 Va卜第3 8號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 鲁 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Val、第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第丨2號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Aia置 換為Val、第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 156912.doc -27· 201207397
Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Val、第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第2〇號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Val、第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號 之Arg置換為Lys、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 156912.doc • 28 · 201207397
Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號 之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第72號之Ala 置換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 • Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號 之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置 換為Leu、第74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (10) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號 ® 之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置 換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜第98號之Arg置換為 Gly、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (11) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號 之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置 換為Leu、第72號之Ala置換為Val、第74號之Thr置換為 156912.doc • 29· 201207397
Lys、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (12)將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第67號 之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置 換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜第74號之Thr置換為 Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 作為導入有10個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言， 例如可列舉以下（1)〜（8)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為 Gly之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Val、第74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為 Gly之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號 156912.doc •30- 201207397 之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、第74號之Thr置 換為Lys、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val置換 為Leu之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第丨2號之Lys置換為 Va卜第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之 lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、第74號之Thr置換 為Lys、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val置換為 Leu之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第2〇號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為 Gly之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48鐃之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之 lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、第74號之Thr置換 為Lys、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val置換為 Leu之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第68號 156912.doc • 31 _ 201207397 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Val、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val置換為 Leu之胺基酸序列 (8)將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第3 8號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號 之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置 換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為 Gly之胺基酸序列 作為導入有8個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（13)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號 之Ala置換為Val、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之 Val置換為Leu之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第3 8號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第68號之Val置換為Ala、第 70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜第74號之 Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val 置換為Leu之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之 156912.doc •32· 201207397
Ala置換為Val、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val 置換為Leu之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 68號之Val置換為Ala、第70號之Ile置換為Leu、第72號之 Ala置換為Val、第74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg 置換為Gly之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 # Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之 Ala置換為Val、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之Val 置換為Leu之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第3 8號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 68號之Val置換為Ala、第70號之Ile置換為Leu、第72號之 Ala置換為Val、第74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg ® 置換為Gly之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第70號之 lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、及第98號之Arg置 換為Gly之胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為Ue、 156912.doc •33· 201207397 第68號之Val置換為Ala、第70號之Ile置換為Leu、第72號 之Ala置換為Val、第74號之Thr置換為Lys、及第98號之 Arg置換為Gly之胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第2〇號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第68號之Val置換為Ala、第70號 之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、及第98號之Arg 置換為Gly之胺基酸序列 (10) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號 之Ala置換為Val、第98號之Arg置換為Gly、及第113號之 Val置換為Leu之胺基酸序列 (11) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號 之Ala置換為Val、第74號之Thr置換為Lys、及第98號之 Arg置換為Gly之胺基酸序列 (12) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第68號之Val置換為Ala、第70號 之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、及第98號之Arg 置換為Gly之胺基酸序列 (13) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 156912.doc -34- 201207397
Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第48號之Met置換為He、第68號之Val置換為Ala、第70號 之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜及第98號之Arg 置換為Gly之胺基酸序列 作為導入有7個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（11)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第72號之Ala置換為Va卜第74號之 Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第68號之Val置換為Ala、第 70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜第74號之 Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、第74號之 Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 68號之Val置換為Ala、第72號之Ala置換為Va卜第74號之 Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 156912.doc -35- 201207397 68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之 Ala置換為Va卜及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Val、第74號之 Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 68號之Val置換為Ala、第72號之Ala置換為Val、第74號之 鲁
Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 68號之Val置換為Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之 Ala置換為Val、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第72號之Ala置換為Val、第74號之 籲 Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (10) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第70號之lie置換為Leu、第72號之 Ala置換為Val、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (11) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 156912.doc -36- 201207397 67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第72號之 Ala置換為Va卜及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 作為導入有6個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（16)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、第 72號之Ala置換為Val、第74號之Thr置換為Lys、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第20號之Val置換為Leu、第38號之Arg置換為Lys、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及第98 號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及第98 號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第丨2號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第丨2號之LyS置換為 Va卜第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第72號之Ala置換為Val、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 156912.doc •37- 201207397 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第74號之Thr置換為Lys、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、 第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及第98 號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第6*7號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、及第98 號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第67號之Arg置換為Lys、第72號之Ala置換為Val、及第98 號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (10) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、 第67號之Arg置換為Lys、第74號之Thr置換為Lys、及第98 號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (11) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為Ala、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 156912.doc -38- 201207397 (12) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為Ue、第 67號之Arg置換為Lys、第72號之Ala置換為Va卜及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (13) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、第74號之Thr置換為Lys、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (14) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 68號之Val置換為Ala、第72號之Ala置換為Val、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (15) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 68號之Val置換為Ala、第74號之Thr置換為Lys、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (16) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 72號之Ala置換為Va卜第74號之Thr置換為Lys、及第98號 之Arg置換為Gly之胺基酸序列 作為導入有5個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜(7)之胺基酸序列。 (1)將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置換為Ile、第 156912.doc -39· 201207397 67號之Arg置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Lys置換為 Va卜第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、第 67號之Arg置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 68號之Val置換為Ala、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 70號之lie置換為Leu、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 72號之Ala置換為Val、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第 156912.doc •40- 201207397 74號之Thr置換為Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸 序列 作為導入有4個修飾之VH之胺基酸序列’具體而言’例 如可列舉以下（1)~(8)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第3 8號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及 第74號之Thr置換為Lys之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為lie、及 第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、第48號之Met置換為Ile' 及第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、第4δ號之Met置換為lie、及 第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及 第68號之Val置換為Ala之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及 第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及 156912.doc -41- 201207397 第72號之Ala置換為Val之胺基酸序列 (8)將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、第67號之Arg置換為Lys、及 第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 作為導入有3個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜(9)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、及第98號之Arg置換為Gly之 胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Val、第38號之Arg置換為Lys、及第48號之Met置換為116之 胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、第38號之Arg置換為Lys、及第48號之Met置換為ne 之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第40號之Ala置換為Arg、及第48號之Met置換為ue之 胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、及第67號之Arg置換為Lys之 胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、及第68號之Val置換為Ala之 胺基酸序列 156912.doc -42- 201207397 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、及第7〇號之Ile置換為Leu之 胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第3 8號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、及第72號之Ala置換為Val之 胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、第48號之Met置換為lie、及第74號之Thr置換為Lys之 • 胺基酸序列 作為導入有2個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（21)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜及第38號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、及第38號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Φ Lys、及第40號之Ala置換為Arg之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之‘Arg置換為 Lys、及第48號之Met置換為lie之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之ArS置換為 Lys、及第68號之Val置換為Ala之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 156912.doc -43- 201207397
Lys、及第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及第72號之Ala置換為Val之胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及第74號之Thr置換為Lys之胺基酸序列 (10) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (11) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為 Lys、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 (12) 將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為 Va卜及第48號之Met置換為lie之胺基酸序列 (13) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為 Leu、及第48號之Met置換為lie之胺基酸序列 (14) 將序列編號67之胺基酸序列中之第40號之Ala置換為 Arg、及第48號之Met置換為lie之胺基酸序列 (15) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及第67號之Arg置換為Lys之胺基酸序列 (16) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及第68號之Val置換為Ala之胺基酸序列 (17) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及第70號之lie置換為Leu之胺基酸序列 (18) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及第72號之Ala置換為Val之胺基酸序列 (19) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 156912.doc -44 - 201207397 lie、及第74號之Thr置換為Lys之胺基酸序列 (20) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及第98號之Arg置換為Gly之胺基酸序列 (21) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為 lie、及第113號之Val置換為Leu之胺基酸序列 作為導入有1個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（12)之胺基酸序列。 (〇將序列編號67之胺基酸序列中之第12號之Lys置換為Val φ 之胺基酸序列 (2) 將序列編號67之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Leu 之胺基酸序列 (3) 將序列編號67之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys 之胺基酸序列 (4) 將序列編號67之胺基酸序列中之第40號之Ala置換為Arg 之胺基酸序列 (5) 將序列編號67之胺基酸序列中之第48號之Met置換為lie _ 之胺基酸序列 (6) 將序列編號67之胺基酸序列中之第67號之Arg置換為Lys 之胺基酸序列 (7) 將序列編號67之胺基酸序列中之第68號之Val置換為Ala 之胺基酸序列 (8) 將序列編號67之胺基酸序列中之第70號之lie置換為Leu 之胺基酸序列 (9) 將序列編號67之胺基酸序列中之第72號之Ala置換為Val 156912.doc -45- 201207397 之胺基酸序列 (10) 將序列編號67之胺基酸序列中之第74號之Thr置換為 Ly s之胺基酸序列 (11) 將序列編號67之胺基酸序列中之第98號之Arg置換為 Gly之胺基酸序列 (12) 將序列編號67之胺基酸序列中之第113號之Val置換為 Leu之胺基酸序列 又，作為本發明之人類化抗體所含之VL ’較佳為以下 ⑴〜⑹。 · (1) 含有序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu、第13
號之Ala、第15號之Va卜第36號之Tyr、第43號之Ala、第 44號之Pro、第46號之Leu、第71號之Phe、及第85號之Thr 被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL (2) 含有序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu、第15 號之Va卜第36號之Tyr、第44號之Pro、第46號之Leu、第 71號之Phe、及第85號之Thr被置換為其他胺基酸殘基之胺 基酸序列的VL #
(3) 含有序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val、第36 號之Tyr、第44號之Pro、第46號之Leu、第71號之Phe、及 第85號之Thr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL
(4) 含有序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr、第43 號之Ala、第44號之Pro、第46號之Leu、及第85號之Thr被 置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL (5) 含有序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val、第36 156912.doc -46 · 201207397
號之Tyr、第46號之Leu、及第71號之Phe被置換為其他胺 基酸殘基之胺基酸序列的VL (6)含有序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr、及第 44號之Pro被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL 作為上述VL之胺基酸序列，可列舉：導入有將序列編 號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為Met、第13號之 Ala置換為Val、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換 為Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為 Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、 及第85號之Thr置換為Asp之修飾中之至少1個修飾的胺基 酸序列。 作為導入有9個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉：將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu 置換為Met、第13號之Ala置換為Val、第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序 列。 作為導入有8個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（Γ)〜(9)之胺基酸序列。 (1)將序列編號69之胺基酸序列中之第π號之Ala置換為 Val、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第 43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號之 LeU置換為⑴乂、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr 156912.doc -47- 201207397 置換為Asp之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號 之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第36號之Tyr置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號 之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第15號之Val置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號 之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第15號之Val置換為Leu、 第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe'第46號 之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第U號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Va卜第15號之Val置換為Leu' 第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、第46號 156912.doc -48- 201207397 之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第15號之Val置換為Leu、 第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號 之Pro置換為Phe、第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (8) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第15號之Val置換為Leu、 第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號 之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、及第85號之 Thr置換為Asp之胺基酸序列 (9) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第15號之Val置換為Leu、 第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號 之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、及第71號之 Phe置換為Tyr之胺基酸序列 作為導入有7個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜(9)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 156912.doc •49- 201207397
Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第44號之ΡΓΟ置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第46號之Leu置換為Gly、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第71號 之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (8) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 156912.doc -50- 201207397
Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號 之Leu置換為Gly、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (9)將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第15號之Val置換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、 第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號 之Leu置換為Gly、及第71號之Phe置換為Tyr之胺基酸序列 作為導入有6個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（6)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85 號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85 號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、及第85 號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、及第85 156912.doc -51- 201207397 號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、及第85 號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、第13號之Ala置換為Val、第36號之Tyr置換為Leu、 第44號之ΡΓ0置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、及第85 號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 作為導入有5個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜(7)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、及第85號之Thr置換為Asp之胺基 酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為Ser、 第44號之Pro置換為Phe、及第46號之Leu置換為Gly之胺基 酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、及第71號之Phe置換為Tyr之胺基 酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 156912.doc -52- 201207397
Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之pro置換為phe、 第46號之Leu置換為Gly、及第85號之Thr置換為Asp之胺基 酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、及第71號之Phe置換為Tyr之胺基 酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 φ Leu、第43號之Ala置換為Ser、第44號之Pro置換為Phe、 第46號之Leu置換為Gly、及第85號之Thr置換為Asp之胺基 酸序列 (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、 第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp之胺基 酸序列 作為導入有4個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（10)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第46號之Leu置換為Gly、 及第71號之Phe置換為Tyr之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe、 及第46號之Leu置換為Gly之胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 156912.doc -53- 201207397
Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe、 及第71號之Phe置換為Tyr之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第丨5號之Val置換為 LeU、第36號之Tyr置換為Leu、第44號之Pro置換為Phe、 及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第46號之Leu置換為Gly、 及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第71號之Phe置換為Tyr、 及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、 及第71號之Phe置換為Tyr之胺基酸序列 (8) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、 及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (9) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、第71號之Phe置換為Tyr、 及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (10) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第46號之Leu置換為Gly、第71號之Phe置換為Tyr、 及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 作為導入有3個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 156912.doc • 54· 201207397 如可列舉以下（1)〜(7)之胺基酸序列。 (1) 將序列編號69之胺基酸序列中之第丨丨號之Leu置換為 Met、第36號之Tyr置換為Leu、及第44號之pro置換為phe 之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第π號之Ala置換為 Val、第36號之Tyr置換為Leu、及第44號之ΡΓ0置換為phe之 胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、第36號之Tyr置換為Leu、及第44號之Pro置換為Phe 之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第43號之Ala置換為Ser、及第44號之Pro置換為Phe 之胺基酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、及第46號之Leu置換為Gly 之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、及第71號之Phe置換為Tyr 之胺基酸序列 (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、第44號之Pro置換為Phe、及第85號之Thr置換為Asp 之胺基酸序列 作為導入有2個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜（15)之胺基酸序列。 156912.doc 55- 201207397 (1) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、及第44號之Pro置換為Phe之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met、及第36號之Tyr置換為Leu之胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第13號之Ala置換為 Va卜及第36號之Tyr置換為Leu之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、及第36號之Tyr置換為Leu之胺基酸序列 (5) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、及第43號之Ala置換為Ser之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、及第46號之Leu置換為Gly之胺基酸序列 (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、及第71號之Phe置換為Tyr之胺基酸序列 (8) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為 Leu、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 (9) 將序列編號69之胺基酸序列中之第Π號之Leu置換為 Met、及第44號之Pro置換為Phe之胺基酸序列 (10) 將序列編號69之胺基酸序列中之第13號之Ala置換為 Val、及第44號之Pro置換為Phe之胺基酸序列 (11) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為 Leu、及第44號之Pro置換為Phe之胺基酸序列 (12) 將序列編號69之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為 Ser、及第44號之Pro置換為Phe之胺基酸序列 156912.doc • 56- 201207397 (13) 將序列編號69之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為 Phe、及第46號之Leu置換為Gly之胺基酸序列 (14) 將序列編號69之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為 Phe '及第71號之Phe置換為Tyr之胺基酸序列 (15) 將序列編號69之胺基酸序列中之第44號之ΡΓ0置換為 Phe、及第85號之Thr置換為Asp之胺基酸序列 作為導入有1個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例 如可列舉以下（1)〜(9)之胺基酸序列。 φ (1)將序列編號69之胺基酸序列中之第11號之Leu置換為 Met之胺基酸序列 (2) 將序列編號69之胺基酸序列中之第13號之Ala置換為Val 之胺基酸序列 (3) 將序列編號69之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu 之胺基酸序列 (4) 將序列編號69之胺基酸序列中之第36號之Tyr置換為Leu 之胺基酸序列 ® (5)將序列編號69之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為Ser 之胺基酸序列 (6) 將序列編號69之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為Phe 之胺基酸序列 - (7) 將序列編號69之胺基酸序列中之第46號之Leu置換為 Gly之胺基酸序列 (8) 將序列編號69之胺基酸序列中之第71號之Phe置換為Tyr 之胺基酸序列 156912.doc •57- 201207397 (9)將序列編號69之胺基酸序列中之第85號之Thr置換為 Asp之胺基酸序列 又，作為本發明之人類化抗體之具體例，可列舉：抗體 之VH含有序列編號67及/或抗體之VL含有序列編號69之胺 基酸序列的人類化抗體、抗體之VH含有序列編號67及/或 抗體之VL含有圖2所示之任一胺基酸序列的人類化抗體、 或抗體之VH含有圖1所示之任一胺基酸序列及/或抗體之 VL含有序列編號69之胺基酸序列的人類化抗體等。 進而’作為本發明之人類化抗體，可列舉：與本發明之 _ 單株抗體競爭而與人類TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列 或其立體結構之人類化抗體、及與和上述人類化抗體所結 合之人類TIM-3之細胞外區域上存在之抗原決定位相同之 抗原決定位結合的人類化抗體。 人類抗體原本係指人類體内天然存在之抗體，包括由藉 由近來之基因工程學、細胞工程學、發育工程學之技術進 步而製作之人類抗體噬菌體基因庫及產生人類抗體之基因 轉殖動物所獲得之抗體等。 _ 對於人類體内天然存在之抗體，例如可將人類周邊血液 淋巴細胞單獨分離，使其感染EB病毒等而實現不朽化，並 進行選殖，藉此可培養產生該抗體之淋巴細胞，自培養上 清液中純化該抗體。 人類抗體噬菌體基因庫係藉由將由人類B細胞製備之抗 體基因插入噬菌體基因中，使Fab、scFv等抗體片段表現 於嗤菌體表面的基因庫。根據該基因庫，以針對固定有抗 1569l2.doc -58- 201207397 原之觉質的結合活性作為指標，可回收於表面表現有所需 抗原結合活性之抗體片段的噬菌體。該抗體片段亦可進而 藉由基因工程學手法而轉化為包含2條完整之η鍵及2條完 整之L鏈的人類抗體分子。 產生人類抗體之基因轉殖動物係指將人類抗體基因組入 至細胞内之動物。具體而言，例如可將人類抗體基因導入 小鼠ES細胞中，將該ES細胞移植至小鼠之早期胚後，使 之發育，藉此製作產生人類抗體之基因轉殖小鼠。源自產 生人類抗體之基因轉殖動物的人類抗體可藉由如下方式製 作：使用通常之人類以外之動物所進行之融合瘤製作方 法’取得產生人類抗體之融合瘤並進行培養，藉此使人類 抗體產生蓄積於培養上清液中》 於構成上述抗體或抗體片段之胺基酸序列中有1個以上 之胺基酸缺失、附加、置換或插入’，且具有與上述抗體或 其抗體片段相同之活性的單株抗體或其抗體片段亦包含在 本發明之單株抗體或其抗體片段中。 缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之數量為1個以 上’該數量並無特別限定，係藉由部位特異性變異導入法 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ' Current Protocols inmolecular Biology，John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research，10, 6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34，3 15 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) > Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 156912.doc -59- 201207397 488 (1985)]等公知技術可缺失、置換或者附加之程度之數 量。例如較佳為1〜數十個’更佳為^20個，更佳為卜1〇 個，尤佳為1〜5個。 上述抗體之胺基酸序列中缺失、置換、插入或附加有上 個以上之胺基酸殘基之情況係表示如下。即，表示於同— 序列中之任意、且1個或者複數個胺基酸序列中缺失、置 換、插入或附加有1個或複數個胺基酸殘基。又，存在同 時發生缺失、置換、插入或附加之情形，亦存在置換、插 入或附加之胺基酸殘基為天然型與非天然型之任一者之产 形。 作為天然型胺基酸殘基’例如可列舉：L-丙胺酸、L-天 冬醯胺、L-天冬醯胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺峻、 L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫膝 酸、L-苯丙胺酸、L-捕胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L- & 胺酸、L-路胺酸、L_綠胺酸、或L-半胱胺酸等。 以下，揭示可相互置換之胺基酸殘基之較佳例β包含於 同一群中之胺基酸殘基可相互置換。 Α群：白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、正罐胺 酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、〇_甲基絲胺酸、第 三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸 B群：天冬醯胺酸、楚胺酸、異天冬醯胺酸、異麵胺 酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸 C群：天冬醯胺、麩醯胺 D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3_ 156912.doc •60· 201207397 二胺基丙酸 E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸 F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺駿 g群.苯丙胺酸' 路胺酸 於本發明中，作為抗體片段，可列舉：Fab、F(ab，）2、 Fab·、單鏈抗體（scFv)、二聚化v區域（diab〇dy)、二硫鍵穩 定化V區域（dsFv)及含有CDRi肽等。
Fab係於利用作為蛋白質分解酶之木瓜酶處理而獲得 之片段中（於Η鏈之第224號之胺基酸殘基處切斷），η鏈之 Ν末端側約一半與整條L鏈以二硫鍵結合而成之分子量約 為5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。 本發明之Fab可利用木瓜酶對特異性識別人類tim_3且與 。亥細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構結合之單株抗體 進行處理而獲彳于。又，亦可藉由將編碼該抗體之之 NA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體 中再將该載體導入原核生物或真核生物中進行表現’而 製造Fab。 質分解酶之胃蛋白酶將IgG之鉸 部分解而獲得的2個Fab區域利用 F(ab’)2係利用作為蛋白 鍵區域之2個二硫鍵之下 鉸鏈部分結合而構点八 稱成之刀子量約為1〇萬之具有抗原結合活 性之片段。 本發明之F(ab1可*每丨丨田田-I? h 利用月蛋白酶對特異性識別人類TIm-3且與該細胞外區域 域之胺基酸序列或其立體結構結合之單 株抗體進行處理而媒p 獲仔。又’亦可使下述Fabi以硫醚鍵或 I56912.doc -61 - 201207397 二硫鍵進行結合而製作。
Fab’係將上述F(ab·)2之鉸鏈區域之二硫鍵切斷而成之分 子量約為5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之 Fab·可利用二硫代蘇糖醇等還原劑對本發明之特異性識別 人類TIM-3且與該細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構 結合之F(ab’）2進行處理而獲得。又，亦可將編碼該抗體之 FaW片段之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用 表現載體中，再將該載體導入原核生物或真核生物中進行 表現，而製造Fab· » scFv係使用適當之肽連接子（以下，記為p)將1條vh與1 條VL連接而成的VH-P-VL或者VL-P-VH多肽，且係具有抗 原結合活性之抗體片段。 本發明之scFv可藉由取得編碼本發明之特異性識別人類 TIM-3且與該細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構結合 之單株抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼scFv2DNA，將 該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體 中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現 而製造。 diabody係將scFv二聚化而成之抗體片段，且係具有二價 之抗原結合活性之抗體片段。二價之抗原結合活性可相 同，亦可將一方設為不同之抗原結合活性。 本發明之diabody可藉由取得編碼本發明之特異性識別 人類TIM-3且與該細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構 結合之單株抗體之VH及VL的cDNA，以肽連接子之胺基酸 1569l2.doc •62- 201207397 序列之長度成為8個殘基以下之方式構建編碼scFv之 DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用 表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中 進行表現而製造。 dsFv係指經由半胱胺酸殘基間之二硫鍵將VH及VL中之 各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基之多肽結合而成 者。置換為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依據現有方法 [Protein Engineering, 7，697 (1994)]，根據抗體之立體結 構預測進行選擇。 本發明之dsFv可藉由取得編碼本發明之特異性識別人類 TIM-3且與該細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構結合 之單株抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼dsFv之DNA，將 該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體 中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現 而製造。 含有CDR之肽係含有VH或VL之CDR之至少1個區域以上 而構成。含有複數個CDR之肽可直接或經由適當之肽連接 子而結合。 本發明之含有CDR之肽可藉由構建編碼本發明之特異性 識別人類TIM-3且與該細胞外區域之胺基酸序列或其立體 結構結合之單株抗體之VH及VL之CDR的DNA，將該DNA 插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再 將該表現載體導入原核生物或真核生物中進行表現而製 造。又，含有CDR之肽亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學 156912.doc -63- 201207397 合成法而製造。 本發明之單株抗體包括：藉由化學或基因工程學方法， 於本發明之特異性識別人類TIM-3之細胞外區域之胺基酸 序列或其立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或其 抗體片段上結合放射性同位元素、低分子之藥劑、高分子 之藥劑、蛋白質、或抗體醫藥等而成之抗體之衍生物。 本發明之抗體之衍生物可藉由利用化學手法[抗體工程 學入門、地人書館（1994)]，於本發明之特異性識別人類 TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構且與該細 胞外區域結合之單株抗體或其抗體片段之H鏈或L鏈之N末 端側或C末端側、抗體或其抗體片段中之適當之取代基或 側鏈、進而單株抗體或其抗體片段中之糖鏈等上結合放射 性同位元素、低分子之藥劑' 高分子之藥劑、免疫刺激 劑、蛋白質或抗體醫藥等而製造。 又，可藉由如下之基因工程學手法製造：將編碼本發明 之特異性識別人類ΤΙΜ·3之細胞外區域之胺基酸序列或其
中進行表現。 4班崎释合之單株抗體或抗體片段的 _ 之蛋白質或抗體醫藥之DNA連結，並 再將该表現載體導入適當之宿主細胞
胺Τ法等而與抗體直接結合。 元素之物質與抗體結合。作$ & °又，亦可使螯合放射性同位 作為螯合劑，可列舉1-異硫氰酸 156912.doc -64 - 201207397 苄酯基-3-甲基二乙三胺五乙酸（ΜΧ-DTPA)等。
作為低分子之藥劑，例如可列舉：烧基化劑、亞墙基尿 素劑、代謝括抗劑、抗生素、植物生物驗、定位異構轉化 酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香環轉化酶抑制 劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、Μ期抑制劑或者 激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學、癌與化學療法社 (1996)]，或氫化可的松、潑尼松等類固醇劑，阿司匹林、 吲哚美辛等非類固醇劑，硫蘋果酸金鹽、青黴胺等免疫調 節劑，環填醯胺、硫。坐°票。令等免疫抑制劑，馬來酸氣菲安 明或者氣馬斯汀之類的抗組織胺劑等抗炎症劑[炎症與抗 炎症療法、醫歯藥出版股份有限公司（1982)]等。 作為抗癌劑，例如，Amifostim (Ethyol)、順始、達卡 巴仁（Aacarbazine，DTIC)、可美淨（Dactinomycin)、氮芥 (mechlorethamine 、 nitrogen mustard) 、鍵 佐星 (streptozocin)、環填酿胺（cyclophosphamide)、異環碗醯胺 (ifosfamide)、卡莫司、;丁（carmustine，BCNU)、洛莫司汀 (lomustine ， CCNU)、多柔比星（doxorubicin 、 adriamycin)、表柔比星（epirubicin)、吉西他濱（健擇）、唐 黴素、甲T胼、絲裂黴素（mitomycin)、阿糖胞苷 (cytarabine)、依託泊芽（etoposide)、曱胺嗓吟 (methotrexate)、5-氣尿嗔 °定（5-fluorouracil)、氟尿嘴咬 (fluorouracil)、長春花驗（vinblastine)、長春新驗 (vincristine)、博來黴素（bleomycin)、道諾黴素 (daunomycin)、培洛黴素（peplomycin)、雌莫司、;丁 156912.doc -65- 201207397 (estramustine)、太平洋紫杉醇（紫杉醇驗）、歐洲紫杉醇（克 癌易）、普留淨（aldesleukin)、樂拿舒（asparaginase)、補束 克（busulfan)、卡翻（carboplatin)、奥沙利銘（oxaliplatin)、 奈達銘（nedaplatin)、克拉屈濱（cladribine)、喜樹驗 (camptothecin)、10-經基-7-乙基喜樹驗（SN38)、氣尿苦 (floxuridine)、福達樂（fludarabine)、經基脲、異環麟酿胺 (ifosfamide)、艾達黴素（idarubicin)、美司鈉（mesna)、抗 癌妥（CPT-11)、拓撲替康（nogitecan)、雙羥蒽酿 (mitoxantrone)、拓撲替康（topotecan)、柳菩林 (leuprolide)、曱地孕酮（megestrol)、美法侖（melphalan)、 疏基嘌吟（mercaptopurine)、經基碳醯胺、普卡黴素 (plicamycin)、米托坦（mitotane)、培門冬酶 (pegaspargase)、喷司他丁（pentostatin)、派泊溴垸 (pipobroman)、鍵佐星（streptozocin)、泰莫西芬 (tamoxifen)、戈舍瑞林（goserelin)、柳菩林（leuprorelin)、 氟他胺（flutamide)、替尼泊普（teniposide)、睾内醋 (testolactone)、硫鳥嘌吟（thioguanine)、塞替派 (thiotepa)、烏拉莫司(uracil mustard)、長春瑞濱 (vinorelbine)、苯丁 酸氮芬（chlorambucil)、氫化可體松 (hydrocortisone)、潑尼松龍（prednisolone)、甲潑尼龍 (methylprednisolone)、長春地辛（vindesine)、尼莫司汀 (nimustine)、司莫司幻· (semustine)、卡培他濱 (capecitabine)、雷替曲塞（tomudex)、阿紮胞芽 (azacitidine)、UFT(替加氟·尿嘧啶）、奥沙利鉑 156912.doc • 66 - 201207397
(oxaliplatin)、吉非替尼（艾瑞莎）、依麥替尼布（STI571)、 埃羅替尼（Erlotinib)、Flt3抑制劑、管内皮生長因子受體 (vascular endothelial growth facoti receptor，VEGFR)抑制 劑、纖維芽細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR)抑制劑、艾瑞莎、得舒緩等上皮細胞生長 因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制 劑、根赤殼菌素（radicicol)、17-烯丙胺基-1 7-去甲氧基格 爾德黴素、雷帕黴素（rapamycin)、安吖咬（amsacrine)、全 反式維生素A酸（all-trans retinoic acid)、沙利竇邁 (thalidomide)、安美達疑（anastrozole)、法偶0坐 (Fadrozole)、來曲吐（letrozole)、依西美坦（exemestane)、 硫蘋果酸金鹽（gold thiomalate)、D青黴胺（D-penicillamine)、布西拉明（bucillamine)、硫0坐嗓0令 (azathioprine)、咪0坐利賓（mizoribine)、環抱靈 (cyclosporin)、雷帕黴素（rapamycin)、氳化可體松 (hydrocortisone)、貝沙羅汀（塔革雷汀）、泰莫西芬 (tamoxifen)、地塞美松（dexamethasone)、黃體素類、雌激 素類、阿那曲β坐（瑞甯得）、柳菩林（leuplin)、阿斯匹林、 °弓I 0朵美辛（indomethacin)、塞來考昔（celecoxib)、硫》坐嗓呤 (azathioprine)、青黴胺（penicillamine)、硫蘋果酸金鹽 (gold thiomalate)、馬來酸氯菲安明（chlorpheniramine maleate)、氣菲安明（chlorpheniramine)、氯馬斯汀 (clemastine)、全反式維生素A酸（tretinoin)、貝沙羅汀 (bexarotene)、石申、棚替左米（bortezomib)、安樂普謹 156912.doc -67- 201207397 (allopurinol)、卡奇黴素（caiicheamicin)、替伊莫單抗 (ibritumomab tiuxetan)、塔革雷汀（targretin)、奥唑米星 (ozogamicin)、克拉黴素（ciarithromycin)、亞葉酸 (leucovorin)、異環磷醯胺（ifosfamide)、酮康唑 (ketoconazole)、氨苯派酮（amin〇giutethimide)、舒拉明 (suramin)、曱氣蝶吟(methotrexate)、美登醇 (Maytansinoid)、或其衍生物等。 作為使低分子之藥劑與抗體結合的方法，例如可列舉： 經由戊二醛使藥劑與抗體之胺基之間結合的方法、或經由 水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與抗體之羧基結合的方法 等。 作為高分子之藥劑’例如可列舉：聚乙二醇（以下，記 為PEG)、白蛋白、聚葡萄糖、聚氧乙烯、苯乙烯順丁烯二 酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚物、或羥丙基甲 基丙稀酿胺4。藉由使該等高分子化合物與抗體或抗體片 段結合，可期待如下效果：（1)對化學、物理或生物之各種 因子的穩定性之提昇、（2)血漿半衰期之顯著延長、（3)免 疫原性之消失或抗體產生之抑制等[生物交聯醫藥品、廣 川書店（1993)]。例如作為使peg與抗體結合之方法，可列 舉與PEG化修飾試劑進行反應之方法等[生物交聯醫藥品、 廣川書店（1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉：離胺酸 之ε-胺基之修飾劑（曰本專利特開昭61_178926號公報）、天 冬醯胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑（日本專利特開昭56_ 23587號公報）、或精胺酸之胍基之修飾劑（曰本專利特開平 156912.doc •68· 201207397 2-117920號公報）等。 作為免疫刺激劑，例如 J』馬作為免疫佐劑而已知之天鈇 物’關於具體例，作為使 巧1文充疫几進之藥劑，可列舉： β( 1 — 3)葡聚糖（香菇多糖、 西佐喃）、或α半乳糖基腦醯胺 等。 作為蛋白f例如可列舉將Νκ細胞、巨嗔細胞、或嗜 中杜白細胞等免疫活性細胞活化之細胞介素或者增殖因 子、或毒素蛋白質等。 作為細胞介素或增殖因子，例如可列舉：IFNa、IFNj3、 IFNY、介白素（以下，記為IL)_2、IL12、比_15、α ΐ8、 IL-21、IL-23、顆粒細胞菌落刺激因子（G_CSF)、顆粒細胞/ 巨噬細胞菌落刺激因子（gm-csf)、或巨噬細胞菌落刺激 因子（M-CSF)等。 作為毒素蛋白質，例如可列舉蓖麻毒素、白喉毒素、或 ONTAK等，亦包括為了調節毒性而對蛋白質導入變異而成 之蛋白毒素。 作為抗體醫藥，例如可列舉針對如下抗原之抗體：藉由 與抗體結合而誘導細胞凋亡之抗原、與腫瘤之病情形成相 關之抗原或調郎免疫功能之抗原、與病變部位之血管新生 相關之抗原。 作為藉由與抗體結合而誘導細胞凋亡之抗原，例如可列 舉：表面抗原分化簇（Cluster of differentiation)(以下，記 載為 CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、 CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、 156912.doc ·69· 201207397 CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80 (B7.1)、CD81、 CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86 (B7.2)、人類白細胞 抗原（human leukocyte antigen，HLA)第II型、或表皮生長 因子受體（Epidermalgrowth Factor Receptor，EGFR)等。 作為與腫瘤之病情形成相關之抗原或調節免疫功能之抗 體之抗原，例如可列舉：CD40、CD40配體、B7家族分子 (CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、或 B7-H4)、B7家族分子之配體（CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、 或3丁1^)、0又-40、0乂-40配體、00137、腫瘤壞死因子 籲 (tumor necrosis factor，TNF)受體家族分子（DR4、DR5、 TNFR1、或TNFR2)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAIL) 家族分子、TRAIL家族分子之受體家族（TRAIL-R1、 TRAIL-R2、TRAIL-R3、或 TRAIL-R4)、核因子 κΒ 受體活 4匕因子酋己體（receptor activator of nuclear factor kappa Β ， RANK)、RANK配體、CD-25、葉酸受體4、細胞介素[11^-1α、IL-Ιβ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長 籲 因子（transforminggrowth factor，TGF) β、或TNFa等]、該 等細胞介素之受體、趨化激素（SLC、ELC、1-309、 TARC、MDC、或CTACK等）、或該等趨化激素之受體。 作為抑制病變部位之血管新生的抗體之抗原，例如可列 舉：血管内皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、促血管生成素（Angiopoietin)、纖維母細 胞生長因子（fibroblastgrowth factor，FGF)、EGF、血小板 156912.doc -70- 201207397 衍生生長因子（platelet-derivedgrowth factor，PDGF)、類 胰島素生長因子（insulin-likegrowth factor，IGF)、促紅血 球生成素（erythropoietin，EPO)、TGFP、IL-8、Ephilin、 SDF-1、或該等之受體等。 作為與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可藉由如下方式製 造：使編碼單株抗體或抗體片段之cDNA與編碼蛋白質之 cDNA連結，構建編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至 原核生物或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入
原核生物或真核生物中進行表現而製造。 於將上述抗體之衍生物用於檢測方法、定量方法，用作 檢測用試劑、定量用試劑或診斷藥之情形時，作為與本發 明之特異性識別人類T〗M - 3之細胞外區域之胺基酸序列或 其立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或其抗體片 段結合的藥劑，可列舉通常之免疫學之檢測或測定法所使 用之標記物。 作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或者 螢光酶等酶，吖啶鏽酯或者咯吩等發光物質，或螢光素異 硫氰酸鹽（FITC)或者四甲基羅丹明異硫氰酸鹽（ritc)等榮 光物質等。 體 療 又，本發明係關於-種含有本發明之單株抗體或其抗 片段作為有效成分的與ΤΙΜ·3陽性細胞相關之疾病之治 作為與ΤΙΜ-3陽性細胞相關 3之細胞相關之疾病則可為任 之疾病’只要為與表現ΤΙΜ-意，例如可列舉：癌、自體 156912.doc -71 · 201207397 免疫疾病、過敏性疾病。 作為癌，例如可列舉：血液癌、乳癌、子宮癌、大腸 癌、食道癌、胃癌、印巢癌、肺癌、腎臟癌、直腸癌、甲 狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、攝護腺癌或胰臟癌等；較佳 可列舉.血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌或攝護腺 癌。 作為金液癌’例如可列舉：急性骨髓性白血病（acute myeloid leukemia、AML)、慢性骨髓性白血病（chr〇nic myeloid leukemia、CML)、骨髓發育不良症候群 (myelodysplasticsyndromes、MDS)、多發性骨髓瘤 (multiple myeloma)、皮膚 τ細胞性淋巴瘤（cutane〇us τ cen lymphoma、CTCL)、周邊 τ細胞性淋巴瘤（peripherai τ cell lymphoma、PTCL)、退行分化大細胞型淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma、ALCL)、急性淋巴性白血病（acute lympatic leukemia、ALL)、慢性淋巴性白血病（chr〇nic lympatic leukemia、CLL)、其他淋巴性白也病、NK細胞淋 巴瘤、何傑金氏淋巴瘤、或以伯奇氏淋巴瘤為首之非何傑 金氏淋巴瘤等。 作為自體免疫疾病，例如可列舉：類風濕性關節炎、乾 癬、克隆氏症、強直性脊椎炎、多發性硬化症、I型糖尿 病、肝炎、心肌炎、修格蘭氏症候群、移植後排斥反應自 體免疫性溶血性貧血、水皰性類天疱瘡、葛瑞夫茲氏病、 橋本甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡（SLE)、重症肌無力症、 天疱瘡及惡性貧血等。 156912.doc •72- 201207397 作為過敏性疾病，例如可列舉：急性或慢性氣管過敏 症、支氣管哮喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、蓴麻疹、 PIE症候群、食物過敏、花粉症、過敏性鼻炎、支氣管哮 0而、異位性皮膚炎及過敏性休克等。 本發明之治療劑含有上述本發明之單株抗體或該抗體片 段作為有效成分。 含有本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物的治 療劑可為僅含有作為有效成分之該抗體或者該抗體片段、 或该等之衍生物者，但較期待提供通常與藥理學上所容許 之1種以上之載體一併混合並藉由製劑學技術領域公知之 任意方法而製造之醫藥製劑。 投予途徑較佳為使用治療時最有效之途徑，可列舉：經 口投予、或口腔内、呼吸道内、直腸内、皮下、肌肉内或 者靜脈内等非經口投予，較佳為靜脈内投予。 作為投予形態，例如可列舉：喷霧劑、膠囊劑、錠劑、 散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、或 貼劑等。 投予量或投予次數根據目標治療效果、投予方法、治療 時間、年齡、及體重等而有所不同，通常成人每天10 pg/kg〜1〇 mg/kg。 進而’本發明係關於如下者：含有特異性識別TIM-3之 細胞外區域之胺基酸序列或其立體結構且與該細胞外區域 結合之單株抗體或其抗體片段作為有效成分的tim_3之免 疫學之檢測或測定方法、ΤΙΜ_3之免疫學之檢測用或測定 156912.doc -73- 201207397 用試劑、表現TIM-3之細胞之免疫學之檢測或測定方法、 及與TIM-3陽性細胞相關之疾病之診斷藥。 於本發明中，作為檢測或測定tim_3之量的方法，可列 舉任意之公知方法。例如可列舉免疫學之檢測或測定方法 等。 所謂免疫學之檢測或測定方法，係使用實施標記之抗原 或抗體並檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學 之檢測或測定方法，可列舉：放射性物質標記免疫抗體法 (RIA)、酶免疫測定法（EIA或eusa)、螢光免疫測定法 (FIA)發光免疫測定法（luminescent immunoassay)、西方 墨點法或物理化學手法等。 藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段來檢測或測定 表現TIM-3之細胞，可診斷與ΤΙΜ·3相關之疾病。 表現該多肽之細胞之檢測可使用公知之免疫學之檢測 法，較佳為使用免疫沈澱法、螢光細胞染色法、或免疫組 織染色法等。又，亦可使用FMAT81〇〇HTS系統（Appiied
Bi〇SyStems公司製造）等螢光抗體染色法等。 於本發明中，作為成為檢測或測定TIM-3之對象的生物 樣本，只要為組織細胞、血液、企漿、血清、騰液、尿、 糞便組織液、或培養液等可能含有表現TIM-3之細胞者 則無特別限定。 含有本發明之單株抗體或者其抗體片段、或該等之衍生 物的診斷藥亦可根據目標之診斷法而含有用於進行抗原抗 體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用於進行抗原 156912.doc 201207397 抗體反應之試劑，例如可列舉緩衝劑、鹽等。作為檢測用 試劑，例如可列舉：識別該單株抗體或者其抗體片段、或 該等之衍生物之經標記之二次抗體、或與標記對應之受質 等通常之免疫學之檢測或測定法所使用之試劑。 以下，具體地說明本發明之抗體之製造方法、疾病之治 療方法、及疾病之診斷方法。 1.單株抗體之製造方法 (1)抗原之製備 成為抗原之TIM-3或表現TIM-3之細胞可藉由將含有編 碼TIM-3全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入大腸桿 菌、酵母、見蟲細胞、或動物細胞等中而獲得。又，可自 大量表現TIM-3之各種人類腫瘤培養細胞、人類組織等中 純化TIM-3而獲得。又，亦可將該腫瘤培養細胞、或該組 織等直接用作抗原。進而，亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等 化學合成法，製備具有TIM-3之部分序列之合成肽而用於 抗原。 本發明所使用之TIM-3可使用Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)或 Current Protocols inmolecular Biology、John Wiley & Sons (1987-1997)等所記載之方法 等，例如藉由以下方法，使編碼該TIM-3之DNA於宿主細 胞中進行表現而製造。 首先，藉由將含有編碼TIM-3之部分的全長cDNA插入至 適當表現載體之啟動子之下游，而製作重組載體。亦可使 156912.doc -75- 201207397 用基於全長cDNA而製備之含有編碼多肽之部分的適當長 度之DNA片段來代替上述全長cDNA。其次，藉由將所獲 得之該重組載體導入適合該表現載體之宿主細胞中，可獲 得生產多肽之轉形體。 作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中自主複 製或可組入染色體中，且於可轉錄編碼多肽之dna之位置 含有適當之啟動子者，則可使用任意者。 作為宿主細胞，只要為大腸桿菌等屬於埃希氏桿菌屬等 之微生物、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等可表現目標基 因者，則可使用任意者。 · 於大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載 體較佳為可於原核生物中自主複製，同時含有啟動子、核 糖體結合序列、含有編碼TIM_3i部分的DNA、及轉錄終 止序列的載體。又，該重組載體中，轉錄終止序列並非必 須，較佳為緊接結構基因配置轉錄終止序列。進而，該重 組载體亦可含有控制啟動子之基因。 作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之_ 香德氏序列（亦稱為SD序列）與起始密碼子之間調節為適當 距離（例如6〜18個驗基）之質體。 又，作為編碼該TIM.3之DNA之驗基序列，可以成為最 適合宿主内之表現之密碼子的方式置換驗基，藉此可提昇 目標之TIM-3之生產率。 作為表現載體’只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功 月&者’則可使用任意者，例如可列舉：pBTrp2、ρΒτ扣卜 156912.doc • 76 · 201207397 pBTac2(以上為 Roche Diagnostics 公司製造）、ρΚΚ233-2 (Pharmacia公司製造）、pSE280 (Invitrogen 公司製造）、 pGEMEX-1 (Promega公司製造）、pQE-8 (QIAGEN公司製 造）、pKYPIO(日本專利特開昭58-110600號公報）、 ρΚΥΡ2 00 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、pLSAl[Agric Biol. Chem·，53，277 (1989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82，4306 (1985)]、 pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造）、pTrs30[由大腸 桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸 桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸 桿菌IGHA2 (FERM BP-400)製備、日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP6798)製備、曰本專利特開昭60-221091號公報]、 pTerm2 (US4686191 、US4939094、US5160735)、 pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol·， 172, 2392 (1990)]、pGEX (Pharmacia公司製造）、pET系統 (Novagen公司製造）、或 pME18SFL3 等。 作為啟動子，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能 者，則可使用任意者。例如可列舉：trp啟動子（Ptrp)、lac 啟動子、PL啟動子、PR啟動子、或T7啟動子等源自大腸 桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用將2個Ptrp串聯而 成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、或let I啟動 子等人工設計修飾而成之啟動子等。 作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL-lBlue、大腸 156912.doc •77· 201207397 桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DHl、大腸桿菌MC1000、大腸 桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿 菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌 NY49、或大腸桿菌DH5a等。 作為對宿主細胞導入重組載體之方法，只要為對所使用 之宿主細胞導入DNA之方法，則可使用任意方法，例如可 列舉：使用弼離子之方法[Proc· Natl. Acad. Sci. USA，69, 2110 (1972)、Gene, 17，107 (1982)、Molecular & General Genetics，168, 111 (1979)]。 於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只 要為可於動物細胞中發揮功能者則可使用任意者，例如可 列舉：pcDNA I 、pcDM8(Funakoshi 公司製造）、 PAGE107[曰本專利特開平3-22979號公報’ Cytotechnology，3，133 (1990)]、pAS3-3(日本專利特開乎 2-227075 號公報）、pcDM8 [Nature，329，840 (1987)]、 pcDNA I/Amp (Invitrogen 公司製造）、pcDNA3.1 (Invitrogen 公司製造）、pREP4 (Invitrogen 公司製造）、 pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)] ' pAGE21〇 ' pME18SFL3、或pKANTEX93(國際公開第 97/10354號）等。 作為啟動子，只要為可於動物細胞中發揮功能者則可使 用任意者，例如可列舉：巨細胞病毒（CMV)之IE (immediate early，即刻早期）基因之啟動子、SV40之初期 啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休 克啟動子、SRa啟動子、或莫洛尼鼠類白血病病毒之啟動 156912.doc -78 - 201207397 子或者促進子。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與 啟動子並用。
作為宿主細胞，例如可列舉：人類白血病細胞Namalwa 細胞、猴細胞COS細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞 (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968) ； Genetics, 55, 513 (1968) ； Chromosoma, 41, 129 (1973) ； Methods in Cell Science, 18, 115 (1996) ； Radiation Research, 148, 260 (1997) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968) ； Cell, 6, 121 (1975) ； Molecular Cellgenetics, Appendix I, II (pp. 883-900))、CHO/DG44、CHO-K1 (ATCC 編號：CCL-61)、 DUkXBll (ATCC編號：CCL-9096)、Pro-5(ATCC編號： CCL-1781)、CHO_S (Life Technologies、Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20(或稱為 YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Agl4、黃金鼠細胞BHK或HBT5637(曰本專利特開昭63-000299號公報）等： 作為對宿主細胞導入重組載體之方法，只要為對動物細 胞導入DNA之方法，則可使用任意方法。例如可列舉：電 穿孔法[Cytotechnology，3，133 (1990)]、填酸弼法（曰本專 利特開平2-227075號公報）、或脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84, 7413 (1987)]等。
將藉由以上方式獲得之源自保有組入編碼TIM-3之DNA 156912.doc -79- 201207397 之重組載體的微生物、或動物細胞等之轉形體於培養基中 進行培養’使該TIM_3生成蓄積於培養物中，再自該培養 物進行採集，藉此可製造TIM_3。將該轉形體於培養基中 進行培養之方法可依據宿主培養所使用之通常方法而進 行。 於源自真核生物之細胞中進行表現之情形時，可獲得附 加有糖或糖鍵之TIM-3。 對利用使用有誘導性啟動子之重組載體進行轉形之微生 物進行培養時’視需要亦可於培養基中添加誘導子。例如 於對利用使用有lac啟動子之重組載體進行轉形之微生物進 行培養之情形時’亦可於培養基中添加異丙基_p_D_硫代 半乳糖酿喃糖普（isopropyl_P_D-l-thiogalactopyranoside) 等’於對利用使用有trp啟動子之重組载體進行轉形之微生 物進行培養之情形時’亦可於培養基中添加吲哚丙烯酸 等。 作為培養以動物細胞作為宿主而獲得之轉形體的培養 基’例如可列舉：通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、Eagle之MEM培養基[Science, 122，501 (1952)]、 杜貝可改良MEM 培養基[Virology，8，396 (1959)]、199 培 養基[Proc. Soc. Exp· Biol. Med·，73，1 (1950)]、伊思考夫 改良杜貝可培養基（Iscove’s Modified Dulbecco's Medium， IMDM)培養基、或於該等培養基中胎牛血清（FBS)等而成 之培養基等。培養通常於pH值6〜8、30〜40°C、5% C02存 156912.doc -80- 201207397 在下等條件下進行1〜7天。又，於培養中，視需要亦可於 培養基中添加康黴素或青黴素等抗生素。 作為編碼TIM-3之基因之表現方法，除直接表現以外， 亦可使用分泌生產或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]。 作為TIM-3之生產方法，有生產於宿主細胞内之方法、 分泌至宿主細胞外之方法、或生產於宿主細胞外膜上之方 法’可藉由改變所使用之宿主細胞、或所生產之TIM_3之 結構’而選擇適當之方法。 於使TIM-3生產於宿主細胞内或宿主細胞外膜上之情形 時’可藉由使用Paulson等人之方法[j. Biol. Chem” 264, 17619 (1989)]、Lowe 等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86，8227 (1989)、Genes Develop·, 4, 1288 (1990)]、 日本專利特開平05-336963號公報、或國際公開第94/23021 號等所記载之方法，積極地使ΤΙΜ·3分泌至宿主細胞外。 又，亦可利用使用有二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增 系（日本專利特開平2_227〇75號公報）而使τιμ_3之生產量上 升。 所獲得之ΤΙΜ-3例如可藉由以下方式進行單獨分離、純 化。 於Tm-3在細胞内以溶解狀態進行表現之情形時，於培 養完畢後藉由離心分離回收細胞，懸浮於水线衝液中之 後’利用超音波粉碎機、弗氏細胞破碎儀、μ—.— 1569l2.doc -81 - 201207397 均質機、或球磨機等將細胞粉碎，而獲得無細胞萃取液。 單獨或組合使用通常之蛋白質之單獨分離純化法，自藉 由將上述無細胞萃取液離心分離所獲得之上清液獲得純化 標準品，該蛋白質之單獨分離純化法係溶劑萃取法、利用 硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使 用二乙基胺基乙基（DEAE)-瓊脂糖、dIAI〇n ΗΡΑ·75(三菱 化學公司製造）等樹脂之陰離子交換層析法、使用s_瓊脂 糖FF(Pharmacia公司製造）等樹脂之陽離子交換層析法、使 用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂之疏水性層析法、使用 分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、或等電 聚焦電泳等電泳法等》 於TIM-3在細胞内形成不溶體而進行表現之情形時，與 上述同樣地回收細胞後進行粉碎，再進行離心分離，藉此 回收該TIM-3之不溶體作為沈殿組分。利用蛋白質改性 劑，將所回收之該ΠΜ-3之不溶體可溶化。可藉由稀釋或 透析該可溶化液，將該TIM_3恢復至正常立體結構後’藉 由與上述相同之單獨分離純化法而獲得多肽之純化標準 品。 於使TIM-3或其糖修飾體等衍生物分泌至細胞外之情形 時，可於培養上清液中回收該tim_3或其糖修飾體等衍生 物。將該培養物與上述同樣地藉由離心分離等手法進行處 理，藉此取得可溶性組分，可藉由使用與上述相同之單獨 分離純化法’自該可溶性組分獲得純化標準品。 又，本發明中所使用之TIM-3亦可藉由1^10(1法、或tB〇c 156912.doc -82- 201207397 法等化學合成法而製造。又，亦可利用Advanced ChemTech公司製造、PerkinElmer公司製造、Pharmacia公 司製造、Protein Technology Instrument 公司製造、 Synthecell-Vega公司製造、PerSeptive公司製造、或島津製 作所公司製造等之肽合成機進行化學合成。 (2)動物之免疫與融合用抗體產生細胞之製備 對3〜20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物免疫（1)中所獲 得之抗原，採集該動物之脾臟、淋巴節、周邊血液中之抗 體產生細胞。又，於免疫原性較低，於上述動物體内未見 充分之抗體效價提昇之情形時，亦可將TIM-3敲出小鼠用 作被免疫動物。 免疫係藉由向動物之皮下、靜脈内或腹腔内一併投予例 如Freund之完整佐劑、或氫氧化鋁凝膠及百日咳菌疫苗等 適當佐劑與抗原而進行。於抗原為部分肽之情形時，係與 BSA(牛血清白蛋白）或 KLH (Keyhole Limpet Hemocy an in， 匙孔血藍蛋）等載體蛋白質製成結合體，並將其用作免疫 原。 抗原之投予係於第1次投予後，以1〜2週為間隔進行5〜10 次。於各投予後第3〜7天自眼底靜脈叢採血，使用酶免疫 測定法[Antibodies-A Laboratory Manual ' Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測定其jk清之抗體效價。將其 血清對用於免疫之抗原顯示出充分之抗體效價的動物作為 融合用抗體產生細胞之供給源。 於抗原之最終投予後第3〜7天，自經免疫之動物摘取脾 156912.doc -83 - 201207397 臟等含有抗體產生細胞之組織’採集抗體產生細胞°於使 用脾臟細胞之情形時，將脾臟切細、擢碎後’進行離心分 離，進而除去紅血球’取得融合用抗體產生細胞。 (3) 骨髓瘤細胞之製備 骨髓瘤細胞係使用自小鼠獲得之株化細胞’例如可列 舉：8-氮鳥嘌呤耐性小鼠（源自Balb/C)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18，1 (1978)]、P3-NSl/lAg41 (NS-1) [European J. Immunology，6，511 (1976)]、SP2/0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)] ' P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immqnology，123，1548 (1979)]、或 P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)]等。 該骨髓瘤細胞係於正常培養基[添加有麵醢胺、2_疏基 乙醇、慶大黴素、FBS、及8-氮鳥嘌呤之RPMI1640培養 基]中進行繼代，於細胞融合之3〜4天前於正常培養基中進 行繼代，而於融合當天確保2x107個以上之細胞數。 (4) 細胞融合與單株抗體產生融合瘤之製備 將（2)中所獲得之融合用抗體產生細胞與（3)中所獲得之 骨髓瘤細胞利用MEM(Minimum Essential Medium，最低必 需培養基）培養基或PBS(磷酸氫二鈉1.83 g、磷酸二氫鉀 0.21 g、食鹽7.65 g、蒸餾水1升、pH值7.2)充分清洗，以 細胞數成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5〜10 : 1之 方式進行混合，並離心分離後，除去上清液。 將沈澱之細胞群充分擢碎後，一邊於37°C下添加聚乙二 156912.doc -84 - 201207397 醇-IOOO(PEG-IOOO)、MEM培養基及二曱基亞砜之混合 液，一邊攪拌。進而每1~2分鐘添加MEM培養基1〜2 mL， 數次後，以總量成為50 mL之方式添加MEM培養基。離心 分離後，除去上清液。將沈澱之細胞群缓慢擢碎後，將細 胞緩慢懸浮於融合用抗體產生細胞之HAT培養基[添加有次 黃嘌呤、胸苷、及胺基喋呤之正常培養基]中。將該懸浮 液於5% C02培養箱中，於37。(：下培養7~14天。 培養後，取培養上清液之一部分，藉由下述結合分析等 融合瘤之選擇方法，選擇與含有TIM-3之抗原反應且不與 不含TIM-3之抗原反應的細胞群。繼而，藉由極限稀釋法 重複選殖2次[第1次係使用HT培養基（自HAT培養基中除去 胺基喋呤之培養基），第2次係使用正常培養基]，選擇可見 穩定且較強之抗體效價者作為單株抗體產生融合瘤。 (5)純化單株抗體之製備 對經異十九烷處理[腹腔内投予2,6,10,14-四甲基十五烧 (Pristane) 0.5 mL，並飼養2週]之8〜10週齡之小鼠或裸小 鼠’將（4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤注射至腹腔内。 融合瘤經10〜21天腹水癌化❶自該小鼠採集腹水，進行離 心分離除去固形物成分後，利用40〜50%硫酸錄進行鹽 析’進行辛酸沈澱法、利用DEAE-瓊脂糖管柱、蛋白Α·管 柱或凝膠過濾管柱之純化，收集IgG4IgM組分作為純化單 株抗體。 又’將（4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤於添加有1〇% FBS之RPMI1640培養基等中進行培養後，藉由離心分離除 156912.doc •85· 201207397 去上清液，懸浮於Hybridoma-SFM培養基中，培養3~7 天。亦可將所獲得之細胞懸浮液離心分離，自所獲得之上 清液藉由蛋白A-管柱或蛋白G-管柱進行純化，收集IgG組 为’而獲付純化單株抗體。再者’ Hybridoma-SFM培養基 中亦可添加5% Daigo GF21。 抗體之亞型之確定係使用亞型鑑定試劑盒並藉由酶免疫 測定法而進行。蛋白量之定量係根據勞立法（L〇wry method)或280 nm下之吸光度而算出。 (6)單株抗體之選擇 單株抗體之選擇係藉由以下所示之利用酶免疫測定法之 結合分析、及利用Biacore之動力學（kinetics)分析而進行。 (6-a)結合分析 抗原係使用如下者：將（1)中所獲得之含有編碼ΤΙΜ·3之 cDNA之表現載體導入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動 物細胞等中所獲得之基因導入細胞、重組蛋白質、或自人 類組織所獲得之純化多肽或部分肽等。於抗原為部分肽之 情形時，係與BSA或KLH等載體蛋白質製成結合體而使 用。 將抗原分注至96孔培養盤等培養盤中並固相化後，分注 血清、融合瘤之培養上清液或純化單株抗體等受檢物質作 為第1抗體而進行反應。利用PBS或PBS-Tween等充分清洗 後，分注生物素、酶、經化學發光物質或放射線化合物等 標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體而進行反應。利用 PBS-Tween充分清洗後，進行與第2抗體之標記物質對應之 156912.doc -86- 201207397 反應’選擇特異性地與免疫原反應之單株抗體。 又’與本發明之抗ΤΙΜ·3單株抗體競爭而與tim_3結合 之單株抗體可藉由於上述結合分析系中添加受檢抗體進行 反應而取得。即，藉由於添加受檢抗體時篩選單株抗體之 結合受到抑制之抗體，可取得於與TIM_3i細胞外區域之 胺基酸序列或其立體結構結合方面與所取得之單株抗體競 爭的單株抗體。 進而本發明之結合於和與TIM-3之細胞外區域之胺基 _ 酸序列或其立體結構結合之單株抗體所識別之抗原決定位 相同之抗原決定位的抗體可藉由鑑定上述結合分析系所取 得之抗體之抗原決定位，製作模擬所鑑定之抗原決定位之 部分之合成肽、或抗原決定位之立體結構的合成肽等，並 進行免疫而取得。 (6-b)利用Biacore之動力學分析 使用Biacore T100,測定抗原與受檢物間之結合之動力 學，利用機器隨附之分析軟體分析其結果。藉由胺偶合 ® 法，將抗小鼠IgG抗體固定於感測片CM5上之後，通入融 合瘤培養上清液或純化單株抗體等受檢物質，使適當量結 合，進而濃度已知之複數種濃度之抗原，測定結合、解 離。 使用機器隨附之軟體，藉由i :丨結合模型對所獲得之資 料進行動力學分析，而取得各種參數。或藉由例如胺偶合 法將人類TIM-3固定於感測片上之後，通入濃度已知之複 數種濃度之純化單株抗體，測定結合、解離。使用機器隨 156912.doc -87· 201207397 附之軟體，藉由雙價結合模蜇對所獲得之資料進行動力學 分析，而取得各種參數。 2.基因重組抗體之製作 作為基因重組抗體之製作例，以下揭示人類型嵌合抗體 及人類型CDR移植抗體之製作方法。 (1)基因重組抗體表現用載體之構建 基因重組抗體表現用載體係組入有編碼人類抗體之CH 及CL之DNA的動物細胞用表現載體’其可藉由於動物細 胞用表現載體中分別選殖編碼人類抗體之CH& CL之DNA 而構建。 人類抗體之C區域可使用任意之人類抗體之CH及CL。例 如可使用：人類抗體之γΐ亞梨之CH&KS2CL等。編碼人 類抗體之CH及CL之DNA係使用cDNA ’亦可使用包含外顯 子與内含子之染色體DNA。 作為動物細胞用表現載體，只要為可組入並表現編碼人 類抗體之C區域之基因者’則可使用任意者°例如可列 舉：pAGE107 [Cytotechnol·，3，133 (1990)]、pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] ' pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)] ' pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]、pSGlbd2-4 [Cytotechnol.，4，173 (1990)]、或 pSElUKlSedl-3 [Cytotechnol.，13, 79 (1993)]等。 動物細胞用表現載體中之啟動子與促進子係使用SV40 之初期啟動子[J. Biochem.，101，1307 (1987)]、莫洛尼鼠 類白血病病毒LTR [Biochem. Biophys· Res. Commun·，149, 156912.doc -88- 201207397 960 (1987)]、或免疫球蛋白Η鏈之啟動子[Cell，41，479 (1985)]與促進子[Cell，33, 717 (1983)]等。 就構建基因重組抗體表現載體之容易程度、導入至動物 細胞中之容易程度、動物細胞内之抗體Η鏈及L鏈之表現 量達到均衡等方面而言，基因重組抗體表現用載體係使用 抗體Η鏈及L鏈存在於同一載體上之類型（串聯型）之基因重 組抗體表現用載體[J. Immunol. Methods, 167，271 (1994)]，亦可使用抗體η鏈及L鏈存在於不同載體上之類 籲 型。串聯型之基因重組抗體表現用載體係使用 ρΚΑΝΤΕΧ93(國際公開第 97/10354 號公報）、pEEl8 [Hybridoma，17, 559 (1998)]等。 (2)編碼源自人類以外之動物之抗體之v區域的cdNA之取 得及胺基酸序列之分析 編碼非人類抗體之VH及VL之cDNA之取得及胺基酸序列 之分析可藉由以下方式進行。 自產生非人類抗體之融合瘤細胞萃取mRNA，合成 籲 cDNA。將所合成之cDNA於噬菌體或質體等載體上進行選 殖，而製作cDNA基因庫。 使用編碼小鼠抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作 為探針’自上述基因庫分別單獨分離具有編碼VH或VL之 cDNA的重組噬菌體或重組質體。分別確定重組嗤菌體或 重組質體上之目標小鼠抗體之VH或VL之全鹼基序列，自 鹼基序列分別推測VH或VL之全胺基酸序列。 製作產生非人類抗體之融合瘤.細胞的人類以外之動物係 156912.doc •89- 201207397 使用小鼠、大鼠、倉鼠、或兔子等，只要可製作融合瘤細 胞，則可使用任意動物。 源自融合瘤細胞之全RNA之製備係使用硫氰酸胍-三氟 乙酸鉋法[Methods in Enzymol.，154，3 (1987)]、或 RNA easykit(QIAGEN公司製造）等試劑盒等。 源自全RNA之mRNA之製備係使用寡聚（dT)固定化纖維 素管柱法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]、或 Oligo-dT30<Super>mRNA純化試劑盒（Takara Bio公司製造）^ 等試劑盒等。又，亦可使用Fast Track mRNA分離試劑盒 (Invitrogen公司製造）、或QuickPrep mRNA純化試劑盒 (Pharmacia公司製造）等試劑盒，由融合瘤細胞製備 mRNA 〇 cDNA之合成及cDNA基因庫之製作係使用公知之方法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ' Current
Protocols inmolecular Biology, Supplement 1，John Wiley & ·
Sons (1987-1997)]、或 cDNA合成及質粒選殖用 Superscript 質粒系統（Invitrogen公司製造）、或ZAP-cDNA合成試劑盒 (Stratagene公司製造）等試劑盒等。 於製作cDNA基因庫時，組入以自融合瘤細胞萃取之 mRNA作為模板而合成之cDNA的載體，只要為可組入該 cDNA之載體，則可使用任意者。例如使用：ZAP ExPress [Strategies, 5, 58 (1992)] ' pBluescript II SK(+) [Nucleic I56912.doc •90· 201207397
Acids Research, 17，9494 (1989)]、λΖΑΡΙΙ (Stratagene公司 製造）、XgtlO、Xgtll[DNA Cloning : A Practical Approach, I，49 (1985)]、Lambda BlueMid (Clontech公司製造）、λΕχ Cell、pT7T3-18U (Pharmacia公司製造）、pcD2 [Mol. Cell. Biol.，3, 280 (1983)]、或 pUC18[Gene，33, 103 (1985)]等。
作為導入由噬菌體或質體載體構建之cDNA基因庫的大 腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA基因庫者， 則可使用任意者.。例如可使用：XL-lBlue MRF [Strategies，5，81 (1992)] ' C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] ' Y1088 ' Y1090 [Science, 222, 778 (1983)] > NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)] ' K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]、或 JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]等。 編碼源自cDNA基因庫之非人類抗體之VH或VL的cDNA 純系之選擇係使用利用經同位素或螢光標記之探針之菌落 雜交法、或嗜菌斑雜交法[Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]等。 又，亦可製備引子，以由mRNA合成之cDNA或cDNA基 因庫作為模板，藉由聚合酶鏈鎖反應（Polymerase Chain Reaction)法[以下記為 PCR 法，Molecular Cloning，A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)、Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1，John Wiley&Sons (1987-1997)]而製 備編碼VH或VL之cDNA。 156912.doc -91 - 201207397 利用適當之限制酶等，將所選擇之cDNA切斷後，於 pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造）等質體上進行選 殖，藉由通常使用之鹼基序列分析方法等確定該cDNA之 鹼基序列。鹼基序列分析方法例如為：進行雙脫氧法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA，74，5463 (1977)]等之反應 後，使用 ABI PRISM3700 (PE BioSystems公司製造）或 A. L. F. DNA定序儀（Pharmacia公司製造）等鹼基序列自動分 析裝置等進行分析。 藉由自所確定之鹼基序列分別推測VH及VL之全胺基酸 鲁 序列，並與已知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比 較，分別確認所取得之cDNA是否編碼了含有分泌訊號序 列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列。 關於含有分泌訊號序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸 序列，藉由與已知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[八.1 F. DNA，US Dept· Health and Human Services (1991)]進行 比較，可推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列， 鲁 進而可知此等所屬之亞群。又’ VH及VL之各CDR之胺基 酸序列亦可藉由與已知之抗體之VH及VL之胺基酸序列[A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services (1991)]進 行比較而找出。 又，可使用所獲得之VH及VL之完整胺基酸序列’對例 如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫進行BLAST 法[J. Mol. Biol.，215、403 (1990)]等之同源性檢索，而確 156912.doc 92· 201207397 認VH及VL之完整胺基酸序列是否新穎。 (3) 人類型嵌合抗體表現載體之構建 於（1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類 抗體之CH或CL的各基因之上游分別選殖編碼非人類抗體 之VH或VL之cDNA，藉此可構建人類型嵌合抗體表現載 體。 為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側、 與人類抗體之CH或CL之5'末端側連結，而製作以連結部 分之鹼基序列編碼適當之胺基酸且成為適當之限制酶識別 序列之方式設計的VH及VL之cDNA。 以將所製作之VH及VL之cDNA以適當之形式分別表現於 (1)中所獲得之人類型CDR移植抗體表現用載體之編碼人類 抗體之CH或CL的各基因之上游的方式分別進行選殖，而 構建人類型嵌合抗體表現載體。 又，亦可使用兩端具有適當之限制酶之識別序列之合成 DNA，並藉由PCR法分別對編碼非人類抗體VH或VL之 cDNA進行擴增，而將該等分別選殖於（1)中所獲得之基因 重組抗體表現用載體上。 (4) 編碼人類型CDR移植抗體之V區域的cDNA之構建 編碼人類型CDR移植抗體之VH或VL的cDNA可藉由以下 方式構建。 分別選擇移植非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序 列的人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列。所選擇之FR 之胺基酸序列只要為源自人類抗體者，則可使用任意者。 156912.doc -93- 201207397 例如使用：蛋白質資料庫（Protein Data Bank)等資料庫 中所登録之人類抗體之FR之胺基酸序列、或人類抗體之 FR之各亞群之共同胺基酸序列[A. L. F. DNA，US Dept. Health and Human Services( 1991)]等。為了抑制抗體之結 合活性之降低，而選擇與原本之抗體之VH或VL之FR之胺 基酸序列具有儘可能高之同源性（至少60%以上）之FR之胺 基酸序列。 其次，於所選擇之人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序 列上分別移植原抗體之CDR之胺基酸序列，而分別設計人 φ 類型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮到可見 於抗體之基因之鹼基序列中之密碼子之使用頻率[A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]，而將 所設計之胺基酸序列變換為DNA序列，分別設計編碼人類 型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列。 基於所設計之DNA序列而合成包含100個鹼基左右之長 度之數條合成DNA，並使用此等進行PCR反應。於該情形 時，係根據PCR反應時之反應效率及可合成之DNA之長度 _ 而設計較佳為Η鏈、L鏈均為6條之合成DNA。 又，藉由在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限 制酶之識別序列，可於（1)中所獲得之人類型CDR移植抗體 表現用載體上容易地選殖編碼人類型CDR移植抗體之VH 或VL之cDNA。 或者，可藉由使用基於所設計之DNA序列而合成為1條 DNA之各Η鏈、L鏈全長合成DNA進行實施。 156912.doc • 94· 201207397 於PCR反應後，將擴增產物分別於pBluescript SK(-) (Stratagene公司製造）等質體上進行選殖，藉由與（2)所記 載之方法相同之方法確定鹼基序列，而取得具有編碼所需 之人類型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序 列的質體。 (5)人類型CDR移植抗體之V區域之胺基酸序列之修飾 人類型CDR移植抗體於僅將非人類抗體之VH及VL之 CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR上時，其抗原結合活 性與原非人類抗體相比有所降低[BIO/TECHNOLOGY，9, 266 (1991)]。 對於人類型CDR移植抗體，鑑定人類抗體之VH及VL之 FR之胺基酸序列之中直接地和與抗原之結合相關之胺基酸 殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維 持抗體之立體結構而間接地和與抗原之結合相關之胺基酸 殘基，並將此等胺基酸殘基置換為原非人類抗體之胺基酸 殘基，藉此可使降低之抗原結合活性上升。 為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，可藉 由使用X線結晶分析[J_ Mol_ Biol.，1 12, 535 (1977)]或電腦 模擬[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等而進行抗體之 立體結構之構建及分析。又，可針對各個抗體製作數種修 飾體，反覆研究各自與抗原結合活性之相關性，而進行錯 誤嘗試，藉此取得具有所需抗原結合活性之修飾人類型 CDR移植抗體。 人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用修飾 156912.doc -95- 201207397 用合成DNA，進行（4)中所記載之PCR反應，而進行修飾。 針對PCR反應後之擴增產物，藉由（2)中所記載之方法，確 定鹼基序列，而確認實施有目標修飾。 (6) 人類型CDR移植抗體表現載體之構建 可於（1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人 類抗體之CH或CL之各基因之上游分別選殖編碼所構建之 基因重組抗體之VH或VL的cDNA，而構建人類型CDR移植 抗體表現載體。 例如，可於構建（4)及（5)中所獲得之人類型CDR移植抗 體之VH或VL時所使用之合成DNA中，在位於兩端之合成 DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，藉此以如下 方式分別進行選殖：此等以適當之形式表現於（1)中所獲得 之人類型CDR移植抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH 或CL的各基因之上游。 (7) 基因重組抗體之短暫表現（transient expression) 可使用（3)及（6)中所獲得之基因重組抗體表現載體、或 修飾此等而獲得之表現載體，進行基因重組抗體之短暫表 現，對所製作之多種人類型CDR移植抗體之抗原結合活性 進行有效率地評價。 導入表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之 宿主細胞，則可使用任何細胞，例如使用COS-7細胞 (ATCC 編號：CRL165 l)[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press，283 (1991)]。 對COS-7細胞導入表現載體，係使用DEAE-聚葡萄糖法 156912.doc -96- 201207397 [Methods in Nucleic Acids Res·，CRC Press，（1991)]、或脂 質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，7413 (1987)] 等。 導入表現載體後，培養上清液中之基因重組抗體之表現 量及抗原結合活性係使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition 、 Academic Press (1996) ' Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、單株抗體實驗指南 講談社科學（1987)]等進行測定。 (8)穩定表現基因重組抗體之轉形株之取得與基因重組抗體 之製備 可藉由將（3)及（6)中所獲得之基因重組抗體表現載體導 入適當之宿主細胞中，而獲得穩定表現基因重組抗體之轉 形株。 對宿主細胞導入表現載體，係使用電穿孔法[日本專利 特開平 2-257891 號公報、Cytotechnology，3，133 (1990)] 等。 導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞只要為可表現基 因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞。例如使用： CHO-K1 (ATCC編號：CCL-61)、DUkXBll (ATCC編號： CCL-9096)、Pro-5 (ATCC編號：CCL-1781)、CHO-S (Life Technologies，Cat#11619)、大鼠骨髓瘤細胞 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag.20(或稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠 骨髓瘤細胞 SP2/0-Agl4 (ATCC編號：CRL1581)、小鼠 P3- 156912.doc -97- 201207397 X63-Ag8653細胞（ATCC編號：CRL1580)、二氫葉酸還原 酶基因缺失之CHO細胞[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216 (1980)]、獲得凝聚素耐性之Lecl3 [Somatic Cell and
Molecular Genetics，12，55 (1986)]、al，6-岩藻糖轉移酶基 因缺失之CHO細胞（國際公開第2005/035586號、國際公開 第 02/31140號）、大鼠YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞 (ATCC編號：CRL1662)等。 又，亦可使用：與細胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成 相關之酶等蛋白質、或與岩藻糖之1位a結合於N-糖芽結合 複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位的糠鏈修 飾相關之酶等蛋白質、或與細胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖 向向爾基體之輸送相關之蛋白質等之活性降低或缺失之宿 主細胞、例如a 1，6-岩藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞（國 際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號）等。 導入表現載體後，穩定表現基因重組抗體之轉形株係藉 由於含有G418硫酸鹽等藥劑之動物細胞培養用培養基中進 行培養而選擇（日本專利特開平2-257891號公報）。 動物細胞培養用培養基係使用RPMI1640培養基 (Invitrogen公司製造）、GIT培養基（日本製藥公司製造）、 EX-CELL301培養基（JRH公司製造）、IMDM培養基 (Invitrogen公司製造）、Hybridoma-SFM培養基（Invitrogen 公司製造）、或於該等培養基中添加FBS等各種添加物而成 之培養基等。 藉由將所獲得之轉形株於培養基中進行培養’可使基因 136912.doc • 98 - 201207397 重組抗體表現蓄積於培養上清液中。培養上清液中之基因 重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行 測定。又，轉形株可利用DHFR擴增系（日本專利特開平2-257891號公報）等，使基因重組抗體之表現量上升。 基因重組抗體係使用蛋白A-管柱自轉形株之培養上清液 中系屯 4匕[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。又，亦可組合凝膠過濾、離子交換層析法及超濾 等蛋白質純化所使用之方法。 經純化之基因重組抗體之Η鏈、L鏈或者抗體分子整體 之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature，227, 680 (1970)]、或西方墨點法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、
Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等進行測定。 3.純化單株抗體或其抗體片段之活性評價 經純化之本發明之單株抗體或其抗體片段之活性評價可 藉由以下方式進行。 對TIM-3表現細胞株之結合活性係使用上述1 -(6a)中所記 載之結合分析及（6b)中所記載之使用Biacore系統等之表面 離體子共振法而測定。又，可使用螢光抗體法[Cancer Immunol. Immunother.，36，373(1993)]等而測定。 對抗原陽性培養細胞株之補體依賴性毒殺活性（以下， 156912.doc -99- 201207397 記為CDC活性）、或ADCC活性係藉由公知之測定方法 [Cancer Immunol. Immunother·，36，373(1993)]而測定0 4.控制抗體之效應活性之方法 作為控制本發明之抗TIM-3單株抗體之效應活性的方 法，已知有：對與抗體之Fc區域之第297號之天冬醯胺 (Asn)結合之N結合複合型糖鏈之還原末端所存在之N-乙醯 基葡糖胺（GlcNAc)控制al，6-結合之岩藻糖（亦稱為核心岩 藻糖）之量的方法（國際公開第2005/035586號、國際公開第 2002/31140號、國際公開第00/61739號）；或藉由修飾抗體 之Fc區域之胺基酸殘基而進行控制之方法等。本發明之抗 TIM-3單株抗體使用任一方法均可控制效應活性。 所謂效應活性，係指經由抗體之Fc區域而引起之抗體依 賴性活性，已知有ADCC活性、CDC活性、或巨噬細胞或 者樹狀細胞等吞噬細胞之抗體依賴性吞噬作用（Antibody-dependent phagocytosis ， ADP 活性）等。 藉由控制抗體之Fc之N結合複合型糖鏈之核心岩藻糖之 含量，可增加或降低抗體之效應活性。作為降低與抗體之 Fc結合之N結合複合型糖鏈所結合之岩藻糖之含量的方 法，藉由使用al，6-岩藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞而表 現抗體，可取的未結合岩藻糖之抗體。未結合岩藻糖之抗 體具有高ADCC活性。 另一方面，作為增加與抗體之Fc結合之N結合複合型糖 鏈所結合之岩藻糖之含量的方法，藉由使用導入有al，6-岩 藻糖轉移酶基因之宿主細胞而表現抗體，可取得結合有岩 156912.doc -100- 201207397 藻糖之抗體。結合有岩藻糖之抗體之ADCC活性低於未結 合岩藻糖之抗體。 又，藉由修飾抗體之Fc區域之胺基酸殘基，可增加或降 低ADCC活性或CDC活性。例如藉由使用美國專利申請公 開第2007/0148165號說明書中所記載之FC區域之胺基酸序 列’可增加抗體之CDC活性。又，亦可藉由進行美國專利 第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美 國專利第7,317,091號說明書中所記載之胺基酸修飾，而增 加或降低ADCC活性或CDC活性。 進而’可藉由組合上述方法並用於一個抗體’而取得抗 體之效應活性經控制之抗體。 5.使用本發明之抗TIM-3單株抗體或其抗體片段之疾病之 治療方法 本發明之單株抗體或其抗體片段可用於治療與丁1]^_3陽 性細胞相關之疾病。 含有本發明之單株抗體或其抗體片段或該等之衍生物的 治療劑可僅含有作為有效成分之該抗體或者該抗體片段或 該等之衍生物，通常與藥理學上所容許之丨種以上之載體 一併混合，而提供藉由於製劑學之技術領域中公知之方 所製造之醫藥製劑。 作為投予途徑，例如可列舉：經口投予，或口腔内、呼 吸道内、直腸内、皮下、肌肉内或者靜脈内等非經口投 予。作為投予形態，例如可列舉：喷霧劑、膠囊劑、錠 劑、散劑、顆粒劑、糖衆劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟 156912.doc 201207397 膏、或貼劑等。 作為適合經口投予劍 劑、一劑=顆 糖聚劑之類的液體製備物係使用水、嚴糖、山半 =者果糖等糖類1乙二醇或者丙二醇等二元醇類:、 =、撤视油或者大豆油等油類，對經基苯甲酸酷類等 :腐劑’或草㈣料或者薄荷等香料類等作為添加劑而製 0 —膠囊劑鍵劑、散劑或顆粒劑等係、使用乳糖、葡萄糖、 庶糖或者甘露料賦形劑，崎或者海㈣㈣崩散劑， 硬脂酸鎂或者滑石粉等潤滑劑，$乙婦醇、經丙基纖維素 或者明膝等黏合劑，脂肪酸酯等界面活性劑或甘油等塑化 劑等作為添加劑而製造。 作為適合非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓 劑或噴霧劑等。 注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或此兩者之混 合物的載體等而製造。 检劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製造。 噴霧劑係使用不會刺激使用者之口腔及氣管黏膜且使本 發明之單株抗體或其抗體片段以微細粒子之形式分散而使 其變得容易吸收之載體等而製造。作為載體，例如可使用 乳糖或甘油等。又，亦可以氣霧劑或乾粉劑之形式製造。 進而，上述非經口劑中亦可添加適合經口投予之製劑中 作為添加劑而例示之成分。 156912.doc •102- 201207397 6.使用本發明之抗TIM-3單株抗體或其抗體片段的疾病 之診斷方法 藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段來檢測或測定 TIM-3或表現有TIM-3之細胞，可診斷與TIM-3相關之疾 病。 與TIM-3相關之疾病之一的癌之診斷例如可藉由以下方 式檢測或測定TIM-3而進行。 可藉由使用流式細胞儀等免疫學手法檢測患者體内之癌 細胞中所表現之TIM-3而進行診斷。 所謂免疫學手法，係指使用經標記之抗原或抗體來檢測 或測定抗體量或抗原量之方法。例如使用：放射性物質標 記免疫抗體法、酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免 疫測定法、西方墨點法或物理化學手法等。 關於放射性物質標記免疫抗體法，例如係使本發明之抗 體或該抗體片段與抗原或表現抗原之細胞等進行反應，進 而與經放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應 後，利用閃爍計數器等進行測定。 關於酶免疫測定法，例如係使本發明之抗體或該抗體片 段與抗原或表現抗原之細胞等進行反應，進而與經標記之 抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用吸光光度計測 定顯色色素。例如使用三明治ELIS A法等。 作為酶免疫測定法所使用之標記物，可使用公知[酶免 疫測定法’醫學書院（1987)]之酶標記。例如可列舉：驗性 磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光酶標記、或生物素標記 156912.doc 201207397 等。 三明治ELISA法係使抗體與固相結合後，捕捉作為檢測 或測定對象之抗原，使被捕捉之抗原與第2抗體進行反應 之方法。於該ELISA法中，準備係識別欲檢測或測定之抗 原的抗體或抗體片段且抗原識別部位不同之2種抗體，其 中使第1抗體或抗體片段預先吸附於培養盤（例如96孔培養 盤）上，繼而利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、或生 物素等標記第2抗體或抗體片段。 使吸附有上述抗體之培養盤與自生物體内分離之細胞或 其粉碎液、組織或其粉碎液、細胞培養上清液、血清、胸 水、腹水、或眼液等進行反應後，與經標記之單株抗體或 抗體片段反應，進行與標記物質對應之檢測反應。根據階 段性地稀釋濃度已知之抗原而製作之校準曲線，算出試驗 樣本中之抗原濃度。 作為三明治ELISA法所使用之抗體，可使用多株抗體或 單株抗體中之任一者，亦可使用Fab、Fab，、或F(ab,)2等抗 體片段。作為三明治ELISA法所使用之2種抗體之組合， 可為識別不同抗原決定位之單株抗體或抗體片段之組合， 亦可為多株抗體與單株抗體或抗體片段之組合。 榮光免疫測定法係採用文獻|^〇11〇<；1〇11&1八11仙〇(^3_ Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、單株抗體實驗指南講談社科學（1987)]等所記載 之方法進行測定。作為螢光免疫測定法所使用之標記物， 例如可列舉公知[螢光抗體法，§〇伙Seience社（1983)]之螢 156912.doc 201207397 光標記。例如可列舉：FlTC、或RITC等。 發光免疫測定法係採用文獻[生物發光與化學發光臨床 檢査42、廣川書店（1998)]等所記載之方法進行測定。作為 發光免疫測定法所使用之標記物，例如可列舉公知之發光 體標記，可列舉吖啶鏽酯、„各吩等。 西方墨點法係藉由如下方式進行：藉由SDS(十二烷基硫 酸納）-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring
Harbor Laboratory (1988)]將抗原或表現抗原之細胞等分步 • 分離後’將該凝膠轉漬至聚偏二氟乙烯（PVDF)膜或硝基纖 維素膜上’使識別抗原之抗體或抗體片段與該膜反應’進 而與經FITC等螢光物質、過氧化酶等酶標記、或生物素標 記等之抗小鼠IgG抗體或結合片段反應後，使該標記可見 化’藉此進行測定。以下揭示一例。 將表現具有序列編號53所示之胺基酸序列之多肽的細胞 或組織溶解，於還原條件下以每條泳道之蛋白量為〇 · 1 ~3 〇 pg之條件藉由SDS-PAGE法進行泳動。將泳動之蛋白質轉 _ 印至PVDF膜上，於室溫下使其與含有卜BSA之 PBS(以下，記為BSA-PBS)反應30分鐘而進行阻斷操作。 此處，使本發明之單株抗體反應’利用含有〇·05〜0.1〇/〇 之Tween-20之PBS(以下，記為Tween-PBS)進行清洗’於室 溫下使其與經過氧化酶標記之山羊抗小鼠反應2小時。 利用Tween-PBS進行清洗，使用ECL西方墨點價測試劑 (Amersham公司製造）等檢測結合有單株抗體之條帶’藉此 檢測具有序列編號53所示之胺基酸序列的多肽°作為西方 156912.doc -105- 201207397 墨點之檢測中所使用之抗體，係使用可與未保持天然型立 體結構之多肽結合的抗體。 物理化學手法例如藉由如下方式進行：藉由使作為抗原 iTJM-S與本發明之單株抗體或其抗體片段結合，而形成 凝集體，並檢測該凝集體。作為其他物理化學手法，例如 可列舉，·毛細管法、單向免疫擴散法（single radial immunodiffusion)、免疫比濁法（turbidimetric immim〇assay)或乳膠免疫比濁法[臨床檢査法提要，金原出 版（1998)]等。 於乳膠免疫比濁法中，若使用使抗體或抗原過敏之粒徑 為0.1〜1 μηι左右之聚苯乙烯乳膠等載體，利用對應之抗原 或抗體引起抗原抗體反應，則反應液中之散亂光增加，透 射光減少。藉由測定吸光度或積分球濁度而檢測該變化， 從而測定試驗樣本中之抗原濃度等。 另一方面，表現ΤΙΜ-3之細胞之檢測或測定可使用公知 之免疫學檢測法，例如較佳為免疫沈澱法、免疫細胞染色 法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。 免疫沈澱法係使表現ΤΙΜ-3之細胞等與本發明之單株抗 體或其抗體片段反應後’添加蛋白G-瓊脂糖等具有與免疫 球蛋白特異性結合之能力的載體，而使抗原抗體複合體沈 殿。或者’亦可藉由以下方法來進行。MELISA用96孔培 養盤上固定上述本發明之單株抗體或其抗體片段後，藉由 BSA-PBS進行阻斷。 於抗體為例如融合瘤培養上清液等未經純化之狀態之情 156912.doc •106- 201207397 形時’係將抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋 白-A或蛋白G等預先固定在eLISA用96孔培養盤上，並利 用BSA-PBS進行阻斷後，分注融合瘤培養上清液而進行結 合。其次’去除BSA-PBS，利用PBS充分清洗後，使其與 表現TIM-3之細胞或組織之溶解液反應。利用SDS-PAGE用 樣本緩衝液，自充分清洗後之培養盤萃取免疫沈澱物，並 藉由上述西方墨點進行檢測。 免疫細胞染色法或免疫組織染色法係如下方法：視情況 為了改良抗體之通透性而利用界面活性劑或甲醇等對表現 抗原之細胞或組織等進行處理後，使其與本發明之單株抗 體反應，進而與施加等螢光標記、過氧化酶等酶標 記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段反應 後，使該標記可見化，利用顯微鏡進行顯鏡。 又，可藉由使螢光標記之抗體與細胞進行反應並利用流 式細胞儀進行分析之螢光抗體染色法[M〇n〇cl〇nai Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、單株抗體實驗指南講談社科學（1987)]進行 檢測。 尤其是，與TIM-3之細胞外區域之胺基酸序列或其立體 結構結合的本發明之單株抗體或其抗體片段可藉由螢光抗 體染色法檢測保持並表現天然型立體結構之細胞。 又’於使用螢光抗體染色法中之FMAT8100HTS系統 (Applied Bi〇Systems公司製造）等之情形時，可在不將所形 成之抗體-抗原複合體、和與抗體·抗原複合體之形成無關 156912.doc -107- 201207397 的游離之抗體或抗原分離的情況下測定抗原量或抗體量。 以下，藉由實施例更加具體地說明本發明，但本發明並 不限定於下述實施例。 實施例 [實施例1] (人類TIM-3 cDNA之分子選殖與穩定表現株製作） 人類 TIM-3 之 cDNA係以 Human MTC Panel(Clontech公司 製造）作為模板並藉由使用ExTaq(Takara Bio公司製造）之 PCR法進行擴增。引子係使用TIM-3 Fw2(序列編號31)及 TIM-3 Re2(序列編號32)。將所獲得之PCR產物插入至 pGEM-T Easy vector(Promega 公司製造）中，於TOPIO One Shot(Invitrogen公司製造）中進行轉形使其擴增後，藉由小 量製備法萃取質體DNA。 針對經純化之質體DNA，進行使用引子TIM-3 Fw2及 TIM-3 Re2之DNA序列分析，選定具有與GenBank登錄編 號NM_032782之編碼區域相同之鹼基序列的純系。將所選 定之純系之插入子重組於pMCs-IRES-GFP載體（CELL BIOLABS 公司製造）上（hTIM-3/pMCs-IG)，並使用 Retrovirus Constructive System Ampho(Takara Bio公司製 造）製備人類TIM-3反轉錄病毒。 使該人類TIM-3反轉錄病毒分別感染預先利用流式細胞 儀分析確認未内在性地表現TIM-3之Jurkat細胞（ATCC編 號：CRL-2063)、EoL-1 細胞（RIKEN CELL BANK編號： RCB0641)及L929細胞（Sigma-Aldrich公司製造）。於數次繼 156912.doc -108- 201207397 代後，利用FACSAria(BD Biosciences公司製造）採集TIM-3 陽性細胞。進而於數次繼代後，再次利用FACSAria採集 TIM-3陽性細胞，藉此製作人類ΉΜ-3穩定表現細胞株。 [實施例2] (可溶型細胞膜外人類TIM-3人類Fc融合蛋白質表現載體之 製備） 以實施例1所構建之hTIM-3/pMCs-IG作為模板並藉由使 用ExTaq(Takara Bio公司製造）之PCR法，對編碼人類TIM-3之細胞外區域之cDNA進行擴增。引子係使用pMCs-Fw(序列編號33)及TIM3ED-FcReXba(序列編號34)。 將所獲得之PCR產物插入至pTracer-CMV-FLAG-humanFc 載體[於卩1^。61*-〇]^\^(111¥^1>〇§611公司製造）之乂5&1 部位與Apa I部位導入有FLAG及人類IgGl之Fc區域的修飾 載體]中，於TOPIO One Shot(Invitrogen公司製造）中進行 轉形使其擴增後’藉由小量製備法萃取質體DNA(sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV)。 經純化之 sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV 係藉由以 T7(序 列編號35)及hTIM-3 Fwl(序列編號36)作為引子之DNA序 列分析，而確認具有與GenBank登錄編號NM_032782之該 區域相同之鹼基序列。插入子（EcoRI識別部位之後至Apal 識別部位之前）之序列如序列編號3 7所示。 [實施例3] (可溶型細胞膜外人類TIM-3表現載體之製備） 以實施例2所構建之sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV作為 156912.doc •109- 201207397 模板並藉由使用ExTaq(Takara Bio公司製造）之PCR法，對 編碼人類TIM-3之細胞外區域之cDNA進行擴增。引子係使 用TIM-3 Fw2(序列編號31)及TIM3ED-FLAG4aa(序列編號 39)。 其次，以所獲得之PCR產物作為模板，藉由利用以TIM-3 Fw2(序列編號31)及C-FLAG-NotR2(序列編號40)作為引 子之ExTaq(Takara Bio公司製造）的PCR法而連結FLAG抗原 決定位。將所獲得之PCR產物插入至pGEM-T Easy vector (Promega公司製造）中，於TOPIO One Shot(Invitrogen公司 製造）中進行轉形使其擴增後，藉由小量製備法萃取質體 DNA(sTIM-3-FLAG/pEF6 Myc_HisC)。 經純化之sTIM-3-FLAG/pEF6 Myc_HisC係藉由以T7(序 列編號35)及BGH-R(序列編號41)作為引子之DNA序列分 析，確認具有與GenBank登錄編號ΝΜ_032782之該區域相 同之鹼基序列。插入子（Not I識別部位之後至Not I識別部 位之前）之序列如序列編號42所示。 [實施例4] (可溶型細胞膜外人類TIM-3人類Fc融合蛋白質及可溶型細 胞膜外人類TIM-3之製備） 將實施例2及實施例3中所獲得之sTIM-3-FLAG-Fc/pTracerCMV 質體 DNA及 sTIM-3-FLAG/pEF6 Myc_HisC 質體DNA分別導入至HEK293F細胞（Invitrogen公司製造） 中，短暫地使其表現。6天後，回收細胞上清液並用於蛋 白純化。 156912.doc -110- 201207397 於基因導入起6天後藉由離心分離回收含有可溶型細胞 膜外人類TIM-3人類Fc融合蛋白質或可溶型細胞膜外人類 TIM-3之培養上清液，使用利用'Anti-FLAG M2 Agarose Affinitygel(Sigma公司製造）所製作之Anti-FLAG管柱與 FLAG肽（Sigma公司製造）依據指南進行純化。 區分溶出液，將各組分於還原條件下進行SDS-PAGE 後，進行銀染色及西方墨點。西方墨點係使用抗FLAG M2 抗體（Sigma公司製造）與鹼性磷酸酶標記兔抗小鼠免疫球 蛋白抗體（Dako公司製造）。使用Amicon Ultra-4 10K(Millipore公司製造）濃縮可見目標蛋白質之組分，使 用Superdex 200gp(GE Healthcare公司製造）進行凝膠過渡 層析。 進行區分，將各組分於還原條件下進行SDS-PAGE後， 進行銀染色及西方墨點。濃縮Γ見目標蛋白質之組分，利 用PBS 0.5 mL進行清洗。利用孔徑0.22 μιη之過濾膜 MILLEX-GV(Millipore公司製造）進行過濾滅菌，獲得可溶 型細胞膜外人類TIM-3人類Fc融合蛋白質或可溶型細胞膜 外人類TIM-3。使用作為内毒素測定用專用試劑之Limulus ES-II kit Wako(和光純藥公司製造）測定純化度，確認已充 分純化。 [實施例5] (人類抗體產生小鼠之製作） 用於免疫之小鼠針對内源性Ig重鏈及κ輕鏈破壞之兩者 具有同質接合體之遺傳學背景，且同時保持含有人類Ig重 156912.doc -111 - 201207397 鏈基因座之第14號染色體片段（SC20)及人類IgK鏈轉殖基
因（KC〇5)。該小鼠係藉由具有人類Ig重鏈基因座之系統A 之小鼠、與具有人類IgK鏈轉殖基因之系統B之小鼠之交配 而製作。 系統A係針對内源性Ig重鏈及κ輕鏈破壞之兩者之同質接 合體，係保持可遺傳之第14號染色體片段（SC20)之小鼠系 統例如於虽圭冢等人之報告[Tomizuka. et al·，Proc Natl
Acad Sci USA·，2000 v〇197 : 722]中有記載。 又’系統B係針對内源性Ig重鏈及κ輕鏈破壞之兩者之同 質接合體，係保持人類IgK鏈轉殖基因（KCo5)之小鼠系統 (基因轉殖小鼠），例如於Fishwild等人之報告[Nat
Biotechnol，1996, 14 : 845]中有記載。 將藉由系統A之雄小鼠與系統B之雌小鼠、或系統a之雌 小鼠與系統B之雄小鼠之交配而獲得的血清中同時檢測到 人類Ig重鏈及κ輕鏈之個體[Ishida & L〇nberg，IBC,s uth
Antibody Engineering, Abstract 2000]用於以下之免疫實 驗。再者，上述人類抗體產生小鼠（以下，記為KM小鼠）可 通過簽訂合同而自協和醱酵麒麟股份有限公司獲得。 [實施例6] (針對人類TIM-3之人類單株抗體之製作） 本實施例之單株抗體之製作係依據單株抗體實驗操作入 門（女東民衛等人、講談社發行、丨99丨年）等中所記載之一 般方法而製備。作為免疫原之TIM_3係使用實施例j中所獲 得之TIM-3表現L929細胞或實施例4中所獲得之可溶型細胞 156912.doc -112- 201207397 膜外人類TIM-3人類Fc融合蛋白質。被免疫動物係使用上 述KM小鼠。 首先，利用TIM-3表現L929細胞，以每隻小鼠ΙχΙΟ7個、 腹腔内之條件對KM小鼠進行免疫。自初次免疫以後，將 相同細胞免疫3次或3次以上。於取得脾臟3天前，尾靜脈 投予實施例4中所獲得之可溶型細胞膜外人類TIM-3人類Fc 融合蛋白質20 pg/小鼠個體。自經免疫之小鼠外科取得脾 臟後，將脾臟放入PBS 4 mL中，於篩網（細胞過濾網： Falcon公司製造）上使用注射器之活塞進行粉碎。 將通過篩網之細胞懸浮液離心分離，使細胞沈澱後，利 用紅血球溶胞緩衝液（Sigma公司製造）1 mL進行再懸浮。 於室溫下培養5分鐘後，添加含有50單位/mL青黴素、50 pg/mL鏈黴素之無金清DMEM培養基（Invitrogen公司製 造）（以下，記為無血清DMEM培養基）10 mL，藉由離心分 離使細胞沈澱。 將沈澱之細胞再次懸浮於無血清DMEM培養基中。另一 方面，骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC編號：CRL-1581)係利用含 有10% FCS(Invitrogen公司製造）、50單位/mL青黴素、50 pg/mL鏈黴素之DMEM培養基（Invitrogen公司製造）（以下， 記為添加有血清之DMEM培養基），於37°C、5%二氧化碳 氣體之存在下以細胞濃度不超過1 X 1 〇6細胞/mL之方式進行 培養。 將SP2/0細胞與源自脾臟之細胞同樣地利用無血清 DMEM培養基1 0 mL進行清洗，並懸浮於無血清DMEM培 156912.doc -113- 201207397 養基中。將該等源自脾臟之細胞之懸浮液與小鼠骨髓瘤懸 浮液以細胞數5 : 1進行混合，於離心分離後，完全除去上 清液。一邊利用移液管之尖端攪拌該顆粒（pellet)，一邊對 顆粒緩慢添加作為融合劑之50%(w/v)聚乙二醇1500 (Boeringer Mannheim公司製造）1 mL後，緩慢添加預先加 熱至37°C之無血清DMEM培養基1 mL。進而，緩慢添加5 mL及10 mL之無血清DMEM培養基。其後，於37°C、5%二 氧化碳氣體之存在下靜置5分鐘。 將離心分離後除去上清液而獲得之融合細胞懸浮於含有 10% FCS(Invitrogen公司製造）、青黴素-鏈黴素-麩醯胺 (Invitrogen公司製造，將目錄編號10378-016稀釋100倍）、 IL-6(5 ng/mL)、2-疏基乙醇（Invitrogen公司製造，將目錄 編號21985-023稀釋1000倍）的DMEM培養基（Invitrogen公 司製造）（以下，記為添加有IL-6之DMEM培養基）50 mL， 於37°C、5%二氧化碳氣體之存在下進行培養。 次日，藉由吸液回收細胞，將藉由離心分離而沈殿之細 胞顆粒再懸浮於添加有10 mL之IL-6之DMEM培養基中。 次日，添加次黃°票°令-胺基蝶吟-胸普（Hypoxanthine-aminopterin-thymidine)(以下，記為 HAT，Sigma 公司製 造），約7〜1 0天後，回收培養上清液，用於融合瘤篩選。 [實施例7] (針對人類TIM-3之小鼠單株抗體之製作） 本實施例之單株抗體之製作係依據單株抗體實驗操作入 門（安東民衛等人、講談社發行、1991年）等中所記載之一 156912.doc -114- 201207397 般方法而製備。作為免疫原之TIM-3係使芎實施例i中所獲 得之TIM-3表現L929細胞或實施例4中所獲得之可溶型細胞 膜外人類TIM-3。被免疫動物係使用Balb/C小鼠（自曰本 Charles River公司購入）〇 .首先，利用TIM-3表現L929細胞，以每隻小鼠lxl〇7個、 腹腔内之條件，對Balb/C小鼠進行免疫。自初次免疫以 後’將相同細胞免疫3次或3次以上。於取得脾臟3天前， 尾靜脈投予實施例4中所獲得之可溶型細胞膜外人類tim_3 20 pg/小鼠個體。自經免疫之小鼠外科取得脾臟後，將脾 臟放入PBS 4 mL中，於篩網（細胞過濾網：Faic〇n&司製 造）上使用注射器之活塞進行粉碎。 將通過筛網之細胞懸浮液離心分離使細胞沈澱後，將其 再懸洋於紅jk球溶胞緩衝液（Sigma公司製造）1 mL中。於 室溫下培養5分鐘後，添加無血清DMEM培養基1〇 mL，藉 由離心分離使細胞沈澱。將沈澱之細胞再次懸浮於無血清 DMEM培養基中。另一方面，骨髓瘤細胞sp2/〇(ATCC編 號：CRL-1581)係利用添加有血清之DMEM培養基，於 37 C、5%二氧化碳氣體之存在下以細胞濃度不超過ιχΐ〇6 細胞/mL之方式進行培養。 將SP2/0細胞與源自脾臟之細胞同樣地利用無血清 DMEM培養基10 mL進行清洗，並懸浮於無血清 養基中。將該等源自脾臟之細胞之懸浮液與小鼠骨髓瘤懸 浮液以細胞數5 : 1進行混合，於離心分離後，完全除去上 清液。一邊利用移液管之尖端攪拌該顆粒，一邊對該顆粒 156912.doc •115· 201207397 緩慢添加作為融合劑之50°/〇(w/v)聚乙二醇1500(Boeringer Mannheim公司製造）1 mL後，緩慢添加預先加熱至37°C之 無血清DMEM培養基1 mL。 向該細胞懸浮液中缓慢添加5 mL之無血清DMEM培養基 後，進而添加10 mL之無血清DMEM培養基，於37°C、5% 二氧化碳氣體之存在下靜置5分鐘。將離心分離後除去上 清液而獲得之融合細胞懸浮於添加有IL-6之DMEM培養基 50 mL中，於37°C、5%二氧化碳氣體之存在下進行培養。 次曰，藉由吸液回收細胞，將藉由離心分離而沈澱之細胞 顆粒再懸浮於10 mL之添加有IL-6之DMEM培養基中。次 曰，添加HAT(Sigma公司製造），於約7〜10天後回收培養上 清液，用於融合瘤篩選。 [實施例8] (與人類TIM-3結合之人類及小鼠單株抗體產生融合瘤之篩 選） 使用實施例6及7所製作之細胞上清液，進行融合瘤之篩 選。方法係藉由利用人類TIM-3穩定表現細胞株之流式細 胞儀法而進行。首先，利用染色培養基（含有2% FCS及 0.05%之疊氮化鈉的PBS)將實施例1中所獲得之人類TIM-3 表現Jurkat細胞或EoL-1細胞進行清洗，以每1 mL成為 1 X 107個之方式再次懸浮於染色培養基中。將細胞懸浮液 以10 pL每次移至96孔培養盤中。 進而，添加融合瘤之上清液50 pL，於4°C下靜置30分 鐘。利用染色培養基清洗2次後，以50 μι每次添加利用染 156912.doc -116- 201207397 色培養基稀釋200倍之標記抗體，於4°C下靜置30分鐘。關 於標記抗體，對於人類單株抗體係使用山羊F(ab')2抗人類 IgG(Y鏈特異性）-R-PE(Southern Biotech公司製造），對於小 鼠單株抗體係使用山羊F(ab’）2抗小鼠IgG(H+L)R-PE (Southern Biotech公司製造）。 利用染色培養基清洗2次後，利用FACSCalibur(BD Biosciences公司製造）進行分析，作為一次篩選。於擴大 培養陽性純系後，利用FACSAria(BD Biosciences公司製 造）進行純系分選，並於含有Hypoxanthine-thymidine(以下 記為HT，Sigma公司製造）之添加有IL-6之DMEM培養基中 培養約7天。 針對所回收之上清液，與一次筛選同樣地進行篩選，選 殖抗人類TIM-3人類單株抗體產生融合瘤及抗人類TIM-3 小鼠單株抗體產生融合瘤，用於單株抗體之純化。 [實施例9] (源自融合瘤之單株抗體之純化） 自實施例8所取得之抗人類TIM-3人類或小鼠單株抗體產 生融合瘤，純化抗TIM-3人類或小鼠單株抗體。簡單而 言，係使用CELLine抗體產生系統（BD Biosciences公司製 造），製備高濃度含有抗TIM-3抗體之融合瘤上清液，純化 抗人類TIM-3單株抗體。首先，為了使純系化之融合瘤於 無血清培養基中馴化，而於將含有HT之添加有IL-6之 DMEM培養基與BD Cell MAb無血清培養基（BD Biosciences公司製造）以1: 1混合而成之培養基中培養數 156912.doc •117- 201207397 天，進而於以1 : 2混合而成之培養基中培養數天。 其後，於BD Cell MAb無血清培養基（BD Biosciences公 司製造）中進行培養，將融合瘤無血清化。無血清化之融 合瘤係利用CL-1000燒瓶等中依據指南進行培養，回收高 濃度含有抗TIM-3抗體之融合瘤上清液。自融合瘤上清液 之抗體純化係藉由使用蛋白質A之標準方法而實施。 具體而言，將MabSelect(GE Healthcare公司製造）填充入 空心柱中，使利用PBS稀釋2倍之上清液通過，使用0.1 mol/L 之 Glycin-HCl(pH 值 2.7)進行溶出，並使用 Amicon Ultra(Millipore公司製造）進行濃縮。其後，利用NAP-5管 柱（GE Healthcare公司製造）置換為PBS並進行過濾滅菌， 藉此以4純系（512抗體、644抗體、4545抗體、4177抗體）取 得純化抗人類TIM-3人類單株抗體，以1純系（8213抗體）取 得純化抗人類TIM-3小鼠單株抗體。 [實施例10] (抗TIM-3人類單株抗體之同型之確定） 實施例9中所獲得之抗TIM-3人類單株抗體之同型係藉由 抗原固相ELISA法及流式細胞儀法而確定。 具體而言，於抗原固相ELISA法中，首先，於ELISA用 96孔微量盤（Maxisorp，Nunc公司製造）之各孔添加將實施 例4中所獲得之可溶型細胞膜外人類TIM-3製備為1 pg/mL 之碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液（Sigma公司製造）而成者50 pL。 於4°C下培養一晚，使可溶型細胞膜外人類TIM-3吸附至微 量盤上。 156912.doc •118· 201207397 去除上清液後’添加SuperBlock阻斷緩衝液in TBS (PIERCE公司製造），於室溫下培養1〇分鐘，進而添加融合 瘤培養上清液50 μί，於室溫下培養3〇分鐘。利用含有 0.1% Tween20之Tris緩衝生理食鹽水（TBS_T)清洗各孔後， 分別添加經HRP標記之小鼠抗人類IgG1抗體、小鼠抗人類 IgG2抗體、小鼠抗人類lgG3抗體或小鼠抗人類IgG4抗體 (利用含有10% SuperBlock阻斷緩衝液之TBS-T分別稀釋 2000、2000、2000 ' 4〇〇〇倍而成者；s〇uthernBi〇tech>^ 司 • 製造）5〇 pL，於室溫下培養30分鐘ό 利用TBS-T清洗各孔，添加受質緩衝液（TMB、DAK〇公 司製造）50 pL，於室溫下培養2〇分鐘後，添加〇 5 m〇i/L硫 酸（和光純藥工業株式會公司製造）5〇 pL，停止反應。利用 微量盤分析儀（VersaMax、Molecular Device公司製造）測定 波長450 nm(參照波長570 nm)下之吸光度。 又’於流式細胞儀法中’首先利用染色培養基清洗實施 例1中所獲得之人類TIM-3表現Jurkat細胞後，添加融合瘤 ® 之上清液50 μί ’於4°C下靜置30分鐘。清洗後，分別以50 pL每次添加利用染色培養基稀釋1 〇〇倍左右之小鼠抗人類 IgGl-PE、小鼠抗人類IgG2-PE、小鼠抗人類IgG3(Hinge)-PE及鼠抗人類IgG 4(Fc)-PE(均為Southern Biotech公司製 造），於4°C下靜置30分鐘，利用FACSCalibur(BD Biosciences公司製造）進行分析。 由以上結果明確，512抗體、644抗體、4545抗體之同型 分別為 IgGl、IgG4、IgG2。 156912.doc -119- 201207397 [實施例11] (針對人類TIM-3之小鼠單株抗體之同型之確定） 實施例9中所獲得之抗人類τ IΜ - 3小鼠單株抗體之同型係 使用IsoStrip小鼠單株抗體同型鑑定試劑盒（R〇che Diagnostics公司製造）而確定。使用含有實施例8中所獲得 之抗TIM-3抗體的融合瘤上清液’依據指南進行操作。結 果明破8213抗體之同型為16〇21>。 [實施例12] (抗TIM-3單株抗體基因之單獨分離） 自實施例9所取得之抗人類TIM-3人類或小鼠單株抗體產 生融合瘤’單獨分離抗TIM-3人類或小鼠單株抗體基因。 總RNA之萃取係使用高純度RNA分離試劑盒（Roche Diagnostics公司製造）並依據指南，自純系化之融合瘤而實 施。抗體cDNA之可變區域之選殖係使用SMART RACE cDNA擴增s式劑盒（Clontech公司製造），依據隨附之說明書 而進行。 人類單株抗體重鏈（VH)之PCR係使用UPM(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech公司製造）與引子hh- 6(序列編號44) ’進而以該反應液之一部分作為模板，且使 用NUP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech公司製 造）與引子hh-3(序列編號45)。使用Zero Blunt TOPO PCR 選殖試劑盒（Invitrogen公司製造）等對PCR產物進行選殖， 使用載體之通用引子（例如T7或Ml 3R引子）分析鹼基序列 及胺基酸序列。 156912.doc -120- 201207397 結果明確·· 512抗體之VH之鹼基序列以序列編號54表 示，胺基酸序列以55表示；644抗體之VH之鹼基序列以序 列編號58表示，胺基酸序列以59表示；4545抗體之VH之 鹼基序列以序列編號7表示，胺基酸序列以序列編號8表 示；4177抗體之VH之鹼基序列以序列編號17表示，胺基 酸序列以序列編號1 8表示。將所獲得之各可變區域與人類 IgGl之恆定區域組入表現載體N5KGl(Biogen IDEC Inc公 司製造）而進行連結。 人類單株抗體輕鏈（VL)之PCR係使用UPM(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech公司製造）與引子hk-2(序列編號46)，進而將該反應液之一部分作為模板，使用 N’UP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech公司製造） 與引子hk-6(序列編號47)。使用Zero Blunt TOPO PCR選殖 試劑盒（Invitrogen公司製造）等對PCR產物進行選殖，使用 載體之通用引子（例如T7或M13R引子）分析鹼基序列及胺 基酸序列。 結果明確：512抗體之VL之鹼基序列以序列編號56表 示，胺基酸序列以57表示；644抗體之VL之鹼基序列以序 列編號60表示，胺基酸序列以61表示；4545抗體之VL之 鹼基序列以序列編號9表示，胺基酸序列以序列編號10表 示；4177抗體之VH之鹼基序列以序列編號19表示，胺基 酸序列以序列編號20表示。將所獲得之各可變區域與κ鏈 之恆定區域組入表現載體N5KGl(Biogen IDEC Inc公司製 造）中而進行連結。 156912.doc -121 - 201207397 小鼠單株抗體重鏈（VH)之PCR係使用UPM(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech公司製造）與引子 mH_Rv 1 (序列編號48)，進而以該反應液之一部分作為模 板，使用 NUP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech 公司）與引子mH_Rv2(序列編號49)。， 使用Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒（Invitrogen公司製 造）等對PCR產物進行選殖，使用載體之通用引子（例如T7 或Ml 3R引子）分析鹼基序列及胺基酸序列。 結果明確：8213抗體之VH之鹼基序列以序列編號27表 示，胺基酸序列以序列編號2 8表示。將所獲得之可變區域 與小鼠IgG2a恆定區域連結，組入表現載體N5KGl(Biogen IDEC Inc公司製造）。 小鼠單株抗體輕鏈（VL)之PCR係使用UPM(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech公司製造）與引子 mK_Rv 1 (序列編號50)，進而以該反應液之一部分作為模 板，使用 NUP(SMART RACE cDNA擴增試劑盒；Clontech 公司製造）與引子mK_Rv2(序列編號51)。使用Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒（Invitrogen公司製造）等對PCR產物 進行選殖，使用載體之通用引子（例如T7或M13R引子）分 析鹼基序列及胺基酸序列。 結果明確：8213抗體之VL之鹼基序列以序列編號29表 示，胺基酸序列以序列編號3 0表示。將所獲得之可變區域 與小鼠κ鍵之恆定區域連結，插入至組入有上述8213抗體 之VH之表現載體中。 156912.doc -122- 201207397 又，為了獲得作為陰性對照之抗二硝基苯酚（DNP)人類 IgGl抗體，而將抗重鏈（VH)之鹼基序列（序列編號62)、抗 體輕鏈（VL)之鹼基序列（序列編號64)、人類IgGl及κ鏈之 恆定區域組入表現載體N5KGl(Biogen IDEC Inc公司製造） 中。 [實施例13] (重組抗TIΜ - 3人類單株無岩藻糖抗體之純化） 將實施例12所構建之重組型抗體表現載體導入宿主細胞 中，而製作重組型抗體表現細胞。用於表現之宿主細胞係 依據現有報告而使用FUT8·" CHO細胞（Clin Cancer Res 2006 ： 12(9)Iida等人）。首先，使角 FreeStyleTM MAX試劑 (Invitrogen公司製造），將實施例12中所獲得之512、644、 4545、或、4177之表現載體分別導入FUT8·" CHO細胞 中。FUT8·/- CHO細胞係使用振盪器，於C02 5%、37°C之 環境下進行培養，約5天後回收培養上清液。 根據蛋白質A(GE Healthcare公司製造）及純化量，使用 0.8x40 cm管柱（Bio-Rad公司製造）等，使用PBS作為吸附緩 衝液且使用0.02 mol/L之檸檬酸鈉緩衝液（pH值2.7、50 mmol/L之NaCl)作為溶出緩衝液，對所回收之培養上清液 進行親和純化。於溶出組分中添加0.2 mol/L磷酸鈉緩衝液 (pH值 7.0) » 所製備之抗體溶液係使用NAP-25(GE Healthcare公司製 造）及 Amicon Ultra(10000 cut、Millipore公司製造），於 PBS中進行置換及濃縮，並進行過濾滅菌後，獲得重組抗 156912.doc •123- 201207397 TIM-3人類單株無岩藻糖抗體（512抗體、644抗體、4545抗 體、4177抗體）。使用Limulus ES-II kit Wako(和光純藥公 司製造）測定純化度，確認已充分純化。 又，將實施例12中所獲得之抗DNP抗體之表現載體導入 CHO-DG44細胞中。CHO-DG44細胞係使用振盪器，於C02 5%、3 7°C之環境下進行培養，約5天後回收培養上清液。 同樣地根據純化蛋白質A(GE Healthcare公司製造）及純化 量，使用0.8x40 cm管柱（Bio-Rad公司製造）等，使用PBS作 為吸附緩衝液且使用0.02 mol/L之檸檬酸鈉緩衝液（pH值 2.7、50 mmol/L NaCl)作為溶出缓衝液，對所回收之培養 上清液進行親和純化。於溶出組分中添加0.2 mol/L之填酸 鈉緩衝液（pH值7.0)。所製備之抗體溶液係使用NAP-25(GE Healthcare公司製造）及 Amicon Ultra(10000 cut、Millipore 公司製造），於PBS中進行置換及濃縮，並進行過濾滅菌 後，獲得重組抗DNP抗體。使用Limulus ES-Π kit Wako(和 光純藥公司製造）測定純化度，確認已充分純化。 [實施例14] (重組抗TIM-3小鼠單株抗體之純化） 實施例12中所獲得之8213抗體之表現載體係使用293 Fectin(Invitrogen公司製造）而導入HEK293F細胞 (Invitrogen公司製造）中。HEK293F細胞係使用振蘯器，於 C02 5%、3 7°C之環境下進行培養，約5天後回收培養上清 液。根據蛋白質A(GE Healthcare公司製造）及純化量，使 用0.8x40 cm管柱（Bio-Rad公司製造）等，使用PBS作為吸附 156912.doc -124- 201207397 緩衝液且使用0·02 mol/L之檸檬酸鈉緩衝液（pH值2.7、50 mmol/L NaCl)作為溶出緩衝液，對所回收之培養上清液進 行親和純化。 於溶出組分中添加0.2 mol/L之磷酸鈉緩衝液（pH值 7.0)。所製備之抗體溶液係使用NAP-25(GE Healthcare公 司製造）及 Amicon Ultra(10000 cut、Millipore公司製造）， 於PBS中進行置換及濃縮，並進行過濾滅菌後，獲得重組 抗TIM_3小鼠單株抗體（8213抗體）。使用LimulusES-IIkit Wako(和光純藥公司製造）測定純化度，確認已充分純化。 [實施例15] (純化單株抗體之螢光標記） 源自融合瘤之單株抗體及重組單株抗體之螢光標記係使 用 Alexa Fluor 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit(Invitrogen公司製造）並依據指南而實施。於標記操作 後，利用針對TIM-3表現細胞之FACSCalibur(BD Biosciences公司製造），確認各抗體已被Alexa Fluor 647 (以下，記為Alexa-647)所標記。 [實施例16] (藉由競爭試驗之抗原決定位分類-1) 藉由競爭試驗，對實施例13及14中所獲得之抗體、以及 作為市售之抗TIM-3抗體的344823抗體（Clone 344823、 R&D Systems公司製造）之抗原決定位之關係進行研究。簡 單而言，係使實驗抗體與實施例1中所獲得之TIM-3表現細 胞進行反應，並藉由流式細胞儀法，對經標記之另一抗 156912.doc •125- 201207397 TIM-3抗體是否可進而與TIM-3表現細胞結合之情況進行 評價》 作為第一階段，分別研究實施例13及14所製作之單株抗 體（512抗體、644抗體、4545抗體、4177抗體、8213抗體） 有無與344823抗體之競爭。首先，使經純化之實驗單株抗 體（512抗體、644抗體、4545抗體、4177抗體、8213抗體） 分別與利用染色培養基清洗之人類TIM-3表現EoL-1細胞與 母株EoL-1細胞進行反應（4°C、30分鐘）。最終濃度設為10 pg/mL。繼而，添加 PE標記 344823 抗體（Clone 344823、 R&D Systems公司製造），使其反應（4°C、30分鐘）。利用 染色培養基進行清洗後，添加7-AAD(BD Biosciences公司 製造），並利用FACSCalibur(BD Biosciences公司製造）進行 分析。 其結果為：用作陽性對照之源自山羊之抗人類TIM-3多 株抗體（R&D Systems公司製造）及644抗體幾乎完全抑制PE 標記344823抗體與TIM-3表現細胞之結合。另一方面， 512、4545及82 13抗體未抑制PE標記344823抗體與TIM-3 表現細胞之結合。又，4177抗體雖然抑制PE標記344823抗 體與TIM-3表現細胞之結合，但其抑制與644抗體相比極 低。因此明確，644抗體與344823抗體，另一方面，512、 4545及8213抗體不與344823抗體競爭，4177抗體雖然與 344823抗體競爭，但為部分競爭。 作為第二階段，對至今實驗之抗TIM-3單株抗體中未與 344823抗體競爭之512、4545及8213抗體有無競爭進行研 156912.doc -126- 201207397 究。關於方法’除使用實施例15中所獲得之Alexa-647標 記512抗體或入^\&-647標記8213抗體作為標記抗體以外， 與第一階段同樣地進行《其結果為，4545及8213抗體未抑 制Alexa-647標記5 12抗體與TIM-3表現細胞之結合。 另一方面’ 4545抗體抑制Alexa-647標記8213抗體與 TIM-3表現細胞之結合β因此明確，4545抗體與8213抗體 競爭，另一方面，該等兩種抗體不與512抗體競爭。該結 果提示，512抗體係識別與344823抗體及8213抗體不同之 抗原決定位》 作為第三階段，針對第一階段明確與344823抗體部分競 爭之4177抗體，研究與512及8213抗體有無競爭。方法係 與第二階段同樣地進行。其結果為，41 77抗體不抑制 Alexa-647標記512抗體與ΤΙΜ-3表現細胞之結合，另一方 面’抑制Alexa-647標記8213抗體與TIM-3表現細胞之結 合’由此明確4177抗體不與512抗體競爭，而與8213抗體 競爭。 由以上結果提示’實施例13及14中所獲得之5抗體中， 644抗體識別344823抗體所識別之抗原決定位之附近，512 抗體識別與344823抗體或其他4種抗體（644抗體、4545抗 體、4177抗體、8213抗體）所識別之抗原決定位不同之抗 原決定位。 又，提示8213抗體係識別與344823抗體或512抗體所識 別之抗原決定位不同之抗原決定位。提示4545抗體識別該 8213抗體所識別之抗原決定位之附近。另一方面，提示 156912.doc •127· 201207397 4177抗體識別8213抗體所識別之抗原決定位之附近，並且 亦微小識別344823抗體所識別之抗原決定位之附近。 [實施例17] (利用重組抗TIM-3人類單株無岩藻糖抗體之抗體依賴性細 胞毒殺活性試驗） 經由抗體之細胞性之細胞毒殺活性係於抗體之存在下， 使用源自人類周邊血液之單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，以下記為PBMC)作為效應器，測定對 靶細胞之ADCC活性。首先，自健康志願者採集周邊血 液，添加抗凝血劑。將該血液於Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare公司製造）上靜置，以不破壞界面之方式，使用 大型離心分離機（CF9RX、日立工機公司製造）以2000 rpm 離心分離20分鐘。 收集含有細胞之中間層，使用PBS進行清洗，將藉由 900 rpm之20分鐘之離心分離除去血小板者作為PBMC而用 於測定。其次，將用於靶細胞之Daudi細胞與PBMC以效應 器/乾細胞比=5 0進行混合。 將實施例13及14中所獲得之重組抗TIM-3人類單株無岩 藻糖抗體（512抗體、644抗體、4545抗體、4177抗體）及作 為人類IgGl對照之抗DNP抗體分別懸浮於培養基中，以最 終濃度成為1 pg/rnL、總量成為100 μι之方式進行添加。 混合後，於37°C、5% C02存在下培養4小時。根據釋放至 培養基中之LDH量評價靶細胞之溶解度。LDH之測定與溶 解度之計算係使用CytoTox 96非放射性細胞毒殺活性分析 156912.doc -128- 201207397 試劑（Promega公司製造）並依據指南而進行。顯著差異檢 驗係使用標準之學生T檢驗，將顯著水平（p)為0.05以下者 作為具有顯著差異者。 測定針對Daudi細胞之ADCC活性，結果與抗DNP抗體相 比，4545抗體及4177抗體可見靶細胞溶解率之顯著增加。 該結果提示，抗TIM-3小鼠抗體8213、及與抗TIM-3小鼠 抗體8213競爭之抗TIM-3抗體具有高ADCC活性。 同樣地，使用實施例13中所獲得之重組抗TIM-3人類單 株無岩藻糖抗體（4545抗體、4177抗體）、作為市售抗人類 TIM-3單株抗體之344823抗體、及作為陰性對照之抗DNP 抗體，同樣地測定ADCC活性。 首先，自健康志願者採集周邊血液，添加抗凝血劑。將 該血液於 Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare公司製造）上靜 置，以不破壞界面之方式，使用大型離心分離機 (CF9RX、曰立工機公司製造）以2000 rpm離心分離20分 鐘。收集含有細胞之中間層，使用PBS進行清洗，將藉由 900 rpm之20分鐘之離心分離除去血小板者作為PBMC而用 於測定。 其次，將用於輕細胞之Daudi細胞與PBMC以效應器/乾 細胞比=25進行混合。將4545抗體、4177抗體、344823抗 體、抗DNP抗體及PBS懸浮於培養基中，以最終濃度成為1 pg/mL、總量成為100 μ!^之方式進行添加。混合後，於 37°C、5% C02存在下培養4小時。根據釋放至培養基中之 LDH量評價靶細胞之溶解度。 156912.doc -129- 201207397 LDH之測定與溶解度之計算係使用CytoTox 96非放射性 細胞毒殺活性分析試劑（Promega公司製造）並依據指南而 進行。顯著差異檢驗係使用標準學生T檢驗，將顯著水平 (p)為0.05以下者作為具有顯著差異者。測定針對Daudi細 胞之ADCC活性，結果4545抗體、及4177抗體與抗DNP抗 體相比，可見靶細胞溶解率之顯著增加。另一方面， 344823抗體與抗DNP抗體及PBS相比，未見靶細胞溶解率 之顯著增加。 [實施例18] (使用抗TIM-3抗體之結合解離常數之計算） 使用藉由表面離體子共振之原理的分析裝置（Biacore、 GE Healthcare公司製造）分析抗TIM-3抗體之結合解離常 數。簡單而言，係將抗人類抗體或抗小鼠抗體於CM5感測 片上固相化，繼而流下抗TIM-3人類或小鼠抗體使其結 合，接著流下實施例4所製作之可溶型細胞膜外人類TIM-3，藉此觀察TIM-3針對抗TIM-3抗體之結合解離。全部實 驗步驟基本上參照GE Healthcare公司之用於計算結合解離 常數之實驗方法。 具體而言，感測片係使用CM5(研究級、GE Healthcare 公司製造）。首先，將 400 mmol/L 之 EDC(N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽）與100 mmol/L之 NHS(N-hydroxysuccinimide，N-經基 丁二醯亞胺）等量混 合，使所獲得者於CM5晶片上流動使之活化。其次，將人 156912.doc -130- 201207397 類抗體捕捉試劑盒（GE Healthcare公司製造）隨附之抗人類 抗體抗體流入試劑盒隨附之溶液中進行稀釋，使必須量之 針對人類抗體之抗體於CM5晶片上固相化。 又，關於小鼠抗體，使小鼠抗體捕捉試劑盒（GE Healthcare公司製造）隨附之針對小鼠抗體之抗體流入試劑 盒隨附之溶液中進行稀釋，使必須量於CM5晶片上固相 化。其次，流下1 mol/L之乙醇醯胺鹽酸鹽（ethanolamide hydrochloride)，將活化之晶片表面阻斷使其純化。 其次，以每1個流槽1種抗TIM-3抗體之方式將流入HBS-EP緩衝液（GE Healthcare公司製造）中進行稀釋，並使其與 經固相化之針對人類抗體之抗體或針對小鼠抗體之抗體結 合。其次，流下可溶型細胞膜外人類TIM-3。為了使經結 合之抗TIM-3抗體及可溶型細胞膜外人類TIM-3解離，而 以試劑盒隨附之量流下人類抗體捕捉試劑盒隨附之3 mol/L之MgCl2、或小鼠抗體捕捉試劑盒隨附之pH值1.7之 甘胺酸鹽酸鹽（Glycine-HCl)。 將至此為止之步驟設為1個步驟，針對可溶型細胞膜外 人類TIM-3以複數個濃度重複相同之步驟，藉此取得用於 算出結合解離常數之資料（感應圖）。作為分析對象而流下 之可溶型細胞膜外人類TIM-3之濃度係測定280 nm下之吸 光度並將1 mg/mL作為1.4 OD而算出。 可溶型細胞膜外人類TIM-3之分子量根據電泳之泳動度 算出約為42.8 kDa。分析係使用Biaevaluation軟體（GE Healthcare 公司製造），並參照 Biaevaluation Software 156912.doc -131 - 201207397
Handbook。具體而言，係實施動力學分析之同時分析，採 用基本上為1 : 1 Langmuir結合之反應模型進行擬合，算 出結合速度常數（Ka)及解離速度常數（Kd)，並藉由Kd/Ka 之計算而算出解離常數KD值。 抗人類TIM-3人類單株抗體之KD值對於多數抗體而言達 到10·9 mol/L級。根據該情況，於以TIM-3作為標靶之 ADCC活性與結合親和性之間未見相關性。 抗人類TIM-3小鼠單株抗體於進行觀察之期間（例如觀察 解離相30分鐘左右）未見與作為抗原之可溶型細胞膜外人 類TIM-3之解離。該情況揭示可製作對人類TIM-3具有極 高結合性之單株抗體。 [實施例19] (藉由競爭試驗之抗原決定位分類-2) 藉由競爭試驗，對作為抗TIM-3抗體之5 12抗體、644抗 體、4545抗體、8213抗體、344823抗體、F38-2E2抗體、 及對照之抗DNP抗體之抗原決定位進行研究。簡單而言， 係使未標記之實驗抗體與實施例1中所獲得之TIM-3表現細 胞進行反應，並藉由流式細胞儀法，對經螢光標記之另一 抗TIM-3抗體是否可進而與TIM-3表現細胞結合之情況進 行評價。 使經純化之實驗單株抗體[抗DNP抗體、512抗體、644 抗體、4545 抗體、8213 抗體、344823 抗體（R&D Systems 公 司製造）、F38-2E2抗體（Imgenex公司製造）]分別與利用染 色培養基清洗之人類TIM-3表現EoL-1細胞進行反應（4°C、 156912.doc -132- 201207397 30分鐘）。最終濃度設為10 Kg/mL。繼而’添加Alexa_647 或APC標記抗TIM-3抗體[344823抗體（R&D Systems公 司）、F38-2E2抗體（eBioscience公司製造）]’進行反應 (4°C、3 0分鐘）。利用染色培養基進行清洗後’添加7_AAD (BD Biosciences 公司製造）’並利用 FACSCalibur(BD Biosciences公司製造）進行分析。 將結果示於表1。於表1中’將可見與未標記抗TIM-3抗 體所結合之TIM-3表現細胞的結合與陰性對照為相同程度 之情形表示為「+」’將可見與未標記抗TIM_3抗體所結合 之TIM-3表現細胞的結合減弱之情形表示為「+/·」，將未 見與未標記抗TIM-3抗體所結合之TIM-3表現細胞的結合 之情形表示為「_」。 [表1] 未標記抗體 DNP 512 644 4545 8213 344823 F38-2E2 Alexa-647或 APC標記抗體 DNP - - - - - - 512 + + + + + + 644 + +/· + + +/· +/- 4545 + + + • + + 8213 344823 + + -- + ----- - + + F38-2E2 -- ---- —L_ __ + + - +/- + - 抗丁〗!^^抗體所結合之TII；C512抗體可見與其他未標記 其識別不與644抗體、454、3表現細胞的結合，由此提示 體、F38-2E2抗體競爭之輝立杬體、8213抗體、344823抗
Alexa-647標記644抗體之抗原決定位。 344823抗體或F38-2E2抗體見與未標δ己抗TIM_3抗體 所結合之TIM-3表現細胞的結 156912.doc '133, 201207397 合，或者結合減弱，由此提示其識別與344823抗體、F38-2E2抗體競爭之相互接近之抗原決定位。
Alexa-647標記4545抗體未見與未標記抗TIM-3抗體8213 抗體所結合之TIM-3表現細胞的結合，由此提示其識別與 82 1 3抗體競爭之相互接近之抗原決定位。
Alexa-647標記8213抗體未見與未標記抗TIM-3抗體4545 抗體所結合之TIM-3表現細胞的結合，由此提示其識別與 4545抗體競爭之相互接近之抗原決定位。 APC標記344823抗體未見與未標記抗TIM-3抗體644抗體 或F38-2E2抗體所結合之TIM-3表現細胞的結合，或者結合 減弱，由此提示其識別與644抗體或F38-2E2抗體競爭之相 互接近之抗原決定位。 APC標記F38-2E2抗體未見與未標記抗TIM-3抗體644抗 體或344823抗體所結合之TIM-3表現細胞的結合，由此提 示其識別與644抗體或344823抗體競爭之相互接近之抗原 決定位。 [實施例20] (小鼠TIM-3 cDNA之分子選殖） 小鼠TIM-3之cDNA係與實施例1同樣地取得。使用高純 度RNA分離試劑盒（Roche公司製造），自源自Balb/c小鼠之 骨髓細胞萃取總RNA，使用ThermoScript RT-PCR System(Invitrogen公司製造）而合成模板cDNA。引子係使 用mTim-3 Fw3(序列編號70)及mTim-3 Re3(序列編號71)。 插入至pGEM-T Easy vector(Promega公司製造）上之後，藉 156912.doc -134- 201207397 由DNA序列分析，選定與GenBank登錄編號AF450241之編 碼區域具有相同驗基序列之純系。 藉由以所選定之純系作為模板之PCR，插入至 pEF6/Myc-HisC 載體（Invitrogen 公司製造）之 Notl 部位 (mTim-3/pEF6 Myc_HisC) » PCR 之引子係使用 mTim-3 Fw4NotI(序列編號72)及mTim-3 Re4NotI(序列編號73) » [實施例21] (hTim_3/pEF6 Myc_HisC之構建） 將實施例1所製作之hTIM-3/pMCs-IG質體DNA與pEF6 Myc_HisC分別利用Notl消化，構建人類TIM-3表現pEF6 Myc_HisC 載體（hTim-3/pEF6 Myc_HisC)。進行 DNA序列分 析，確認具有與GenBank登錄編號NM_032782之編碼區域 相同之驗基序列。 [實施例22] (抗人類TIM-3抗體與小鼠TIM-3抗體之交叉性評價） 將實施例20及實施例21所製作之mTim-3/pEF6 Myc_HisC、hTim-3/pEF6 Myc_HisC 質體 DNA、及對照之 空載體與實施例4同樣地分別於HEK293F細胞中進行轉 染。2天後，與實施例15同樣地利用流式細胞儀’評價經 Alexa-647標記之抗人類TIM-3抗體（512抗體、644抗體、 4545抗體、8213抗體）、八卩(：標記市售抗人類1'1]^1-3抗體 (344823抗體及F38-2E2抗體）及PE標記市售抗小鼠TIM-3抗 體（RMT3-23抗體、BioLegend公司製造）對人類TIM-3及小 鼠TIM-3之結合性。 156912.doc -135- 201207397 其結果為，512抗體、644抗體、4545抗體、8213抗體、 344823抗體及F3 8-2E2抗體僅與人類TIM-3表現293F細胞結 合。另一方面，RMT3-23抗體僅與小鼠TIM-3表現293F細 胞結合。由該情況得知’ 512抗體、644抗體、4545抗體、 8213抗體、344823抗體及？38-2£2抗體不與小鼠丁1厘-3進行 交叉反應。 [實施例23] (將IgV區域置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋白質表現系 之構建） 將hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為模板，使用 hTIM3+mIgV_vecRl 引子（序列編號 74)及 hTIM3+mIgV_ vecFl引子（序列編號75)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。將mTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為模板，使用hTIM3 + mIgV」nsF 1引子（序列編號76)及hTIM3+mIgv」nsR1引子 (序列編號77)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 (Takara Bio公司製造）ipCR進行擴增。
使用GENEART無縫選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit ’ Invitrogen公司製造）， 使所獲得之2個PCRI物結合°分析由轉形體獲得之純系 之序列，確認為目標序列（!gV嵌合體TIM_3/PEF6 Myc_HisC、序列編號78) ° [實施例24] (將Mucin區域置換為小鼠TIM_3之TIM_3嵌合體蛋白質表現 156912.doc -136- 201207397 系之構建） 將hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為模板’使用 hTIM3+mMucin_vecR2 引子（序列編號 80)及 hTlM3 + mMucin_vecF2引子（序列編號81)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。 將mTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為模板，使用 hTIM3+mMucin」nsF2 弓| 子（序列編號 82)及 hTIM3 + mMucin—insR2引子（序列編號83)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。 使用GENEART無縫選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit，Invitrogen公司製造）， 使所獲得之2個PCR產物結合。分析由轉形體獲得之純系 之序列，確認為目標序列（Mucin嵌合體TIM-3/pEF6 Myc_HisC、序列編號 84)。 [實施例25] (抗TIM-3抗體對將IgV區域置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合 體蛋白質及將Mucin區域置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體 蛋白質的結合性評價） 將實施例23及24所製作之IgV嵌合體TIM-3/pEF6 Myc_HisC、Mucin嵌合體 TIM-3/pEF6 Myc_HisC、hTim-3/pEF6 Myc_HisC、mTim-3/pEF6 Myc_HisC 質體 DNA、及 對照之空載體與實施例4同樣地於HEK293F細胞中進行轉 染。2天後，與實施例22同樣地利用流式細胞儀評價抗 TIM-3抗體之結合性。 156912.doc -137- 201207397 其結果為，512抗體、644抗體、4545抗體、8213抗體、 4177抗體、344823抗體及F38-2E2抗體僅與人類TIM-3表現 細胞及Mucin嵌合體TIM-3表現細胞結合。另一方面， RMT3-23抗體僅與小鼠TIM-3表現細胞及IgV嵌合體TIM-3 表現細胞結合。 該情況揭示，經實驗之全部抗人類TIM-3抗體（512抗 體、644抗體、4545抗體、8213抗體、4177抗體、344823 抗體、F3 8-2E2抗體）及小鼠TIM-3抗體（RMT3-23抗體）均識 別IgV區域。 [實施例26] (TIM-3 嵌合體 22-47/pEF6 Myc_HisC之構建） 構建用於表現將相當於人類TIM-3(序列編號53)之第22 號至第47號之胺基酸置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋 白質的表現載體（以下，記為TIM-3嵌合體22-47)。方法係 將實施例2 1所製作之hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為 模板，使用hTIM3嵌合體22-47F1引子（序列編號86)及 hTIM3嵌合體22-47R1引子（序列編號87)，藉由使用 PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR 進行擴增。 將所獲得之PCR產物作為模板，使用hTIM3嵌合體22-47F2引子（序列編號88)及hTIM3嵌合體22-47R2引子（序列 編號89)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。 將所獲得之PCR產物作為模板，使用hTIM3嵌合體22- 156912.doc -138- 201207397 47F3引子（序列編號90)及hTIM3嵌合體22-47R3引子（序列 編號91)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。 將第3次PCR所獲得之PCR產物利用DpnI(New England Biolabs公司製造）消化後，進行瓊脂糖電泳。萃取DNA， 使用GENEART無縫選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit，Invitrogen公司製造）使其結合。 分析由轉形體獲得之純系之序列，確認為目標序列（TIM-3 嵌合體 22-47/pEF6 Myc_HisC、序列編號 92)。 [實施例27] (TIM-3嵌合體 57-66/pEF6 Myc_HisC之構建） 構建用於表現將相當於人類TIM-3(序列編號53)之第57 號至第66號之胺基酸置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋 白質的表現載體（以下，記為TIM-3嵌合體57-66)。方法係 將實施例21所製作之hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為 模板，使用利用T4聚核苷酸激酶（New England Biolabs公 司製造）進行磷酸化之hTIM3嵌合體57-66F引子（序列編號 94)及hTIM3嵌合體57-66R引子（序列編號95)，藉由使用 PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR 進行擴增。 將所獲得之PCR產物利用DpnI(New England Biolabs公司 製造）消化後，進行瓊脂糖電泳。萃取DNA，使用 LigaFastTMDNA快速連接系統（Promega公司製造），使其結 合。分析由轉形體獲得之純系之序列，確認為目標序列 156912.doc -139- 201207397 (TIM-3嵌合體 57-66/pEF6 Myc_HisC、序列編號96)。 [實施例28] (TIM-3嵌合體 67-105/pEF6 Myc_HisC之構建） 構建用於表現將相當於人類TIM-3(序列編號53)之第67 號至第105號之胺基酸置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋 白質的表現載體（以下，記為TIM-3嵌合體67-105)。將 hTim-3/pEF6 Myc_HisC 質體 DNA作為模板，使用 hTIM3 嵌 合體67-105F引子（序列編號98)及hTIM3嵌合體67-105R引 子（序列編號99)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 (TakaraBio公司製造）之PCR進行擴增。 將mTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為模板，使用 mTIM3嵌合體67-105F引子（序列編號100)及mTIM3嵌合體 67-105R引子（序列編號101)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。使用 GENEART無縫選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit，Invitrogen公司製造）使所獲得之 2個PCR產物結合。分析由轉形體獲得之純系之序列，確 認為目標序列（TIM-3嵌合體67-105/pEF6 Myc_HisC、序列 編號102)。 [實施例29] (TIM-3嵌合體 74-81/pEF6 Myc_HisC之構建） 構建用於表現將相當於人類TIM-3(序列編號53)之第74 號至第81號之胺基酸置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋 白質的表現載體（以下，記為TIM-3嵌合體74-81)。方法係 156912.doc -140- 201207397
將實施例21所製作之hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作為 模板，使用hTIM3嵌合體74-8 IF引子（序列編號104)及 hTIM3嵌合體74-81R引子（序列編號105)，藉由使用 PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶（Takara Bio 公司製造）之 PCR 進行擴增。 將所獲得之PCR產物利用DpnI(New England Biolabs公司 製造）消化後，進行瓊脂糖電泳。萃取DNA，使用 GENEART無缝選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit，Invitrogen公司製造）使其結合。 分析由轉形體獲得之純系之序列，確認為目標序列（TIM-3 嵌合體 74-81/pEF6 Myc_HisC、序列編號 106)。 [實施例30] (TIM-3嵌合體 88-96/pEF6 Myc_HisC之構建） 構建用於表現將相當於人類TIM-3(序列編號53)之第88 號至第96號之胺基酸置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋 白質的表現載體（以下，記為TIM-3嵌合體88-96)。方法係 使用實施例21所製作之hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作 為模板，hTIM3嵌合體88-96F引子（序列編號108)及hTIM3 嵌合體88-96R引子（序列編號109)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。 將所獲得之PCR產物利用DpnI(New England Biolabs公司 製造）消化後，進行瓊脂糖電泳。萃取DNA，使用 GENEART無縫選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit，Invitrogen公司製造）使其結合。 156912.doc -141 - 201207397 分析由轉形體獲得之純系之序列，確認為目標序列（TIM-3 嵌合體 88-96/pEF6 Myc_HisC、序列編號 110)。 [實施例31] (TIM-3嵌合體 96-105/pEF6 Myc_HisC之構建） 構建用於表現將相當於人類TIM-3(序列編號53)之第96 號至第105號之胺基酸置換為小鼠TIM-3之TIM-3嵌合體蛋 白質的表現載體（以下，記為TIM-3嵌合體96-105)。方法係 使用實施例21所製作之hTim-3/pEF6 Myc_HisC質體DNA作 為模板，hTIM3嵌合體96-105F引子（序列編號112)及hTIM3 嵌合體96-105R引子（序列編號113)，藉由使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio公司製造）之PCR進行擴增。 將所獲得之PCR產物利用DpnI(New England Biolabs公司 製造）消化後，進行瓊脂糖電泳。萃取DNA，使用 GENEART無縫選殖及組裝試劑盒（GENEART seamless cloning and assembly kit，Invitrogen公司製造）使其結合。 分析由轉形體獲得之純系之序列，確認為目標序列（TIM-3 嵌合體96-105/pEF6 Myc_HisC、序列編號114)。 [實施例32] (抗TIM-3抗體對將IgV區域之一部分置換為小鼠TIM-3之 TIM-3嵌合體蛋白質的結合性評價） 將實施例26至3 1所製作之各種TIM-3嵌合體蛋白質之表 現載體及對照之空載體與實施例4同樣地分別於HEK293F 細胞中進行轉染。所導入之表現載體及利用該載體表現之 TIM-3嵌合體蛋白質如下。 156912.doc -142- 201207397 (1) TIM-3嵌合體22-47 :將相當於人類ΤΙΜ-3(序列編號53) 之第22號至第47號之胺基酸置換為小鼠ΤΙΜ-3之ΤΙΜ-3嵌 合體蛋白質 (2) ΤΙΜ-3嵌合體57-66 :將相當於人類ΤΙΜ-3(序列編號53) 之第57號至第66號之胺基酸置換為小鼠ΤΙΜ-3之ΤΙΜ-3嵌 合體蛋白質 (3) ΤΙΜ-3嵌合體67-105 :將相當於人類ΤΙΜ-3(序列編號 53)之第67號至第105號之胺基酸置換為小鼠ΤΙΜ-3之ΤΙΜ-3 嵌合體蛋白質 (4) ΤΙΜ-3嵌合體74-81 :將相當於人類ΤΙΜ-3(序列編號53) 之第74號至第81號之胺基酸置換為小鼠ΤΙΜ-3之ΤΙΜ-3嵌 合體蛋白質 (5) ΤΙΜ-3嵌合體88-96:將相當於人類ΤΙΜ-3(序列編號53) 之第88號至第96號之胺基酸置換為小鼠ΤΙΜ-3之ΤΙΜ-3嵌_ 合體蛋白質 (6) ΤΙΜ-3嵌合體96-105 :將相當於人類ΤΙΜ-3(序列編號 53)之第96號至第1〇5號之胺基酸置換為小ιτιμ_3之ΤΙΜ-3 嵌合體蛋白質 轉染2天後，與實施例22同樣地利用流式細胞儀評價抗 ΤΙΜ-3抗體之結合性。 將其結果示於表2。於表2中，將可見抗體對經轉染之細 胞之結合之情形表示為「+」，將可見抗體對經轉染之細胞 之結合減弱之情形表示為「+/_」，將未見抗體對經轉染之 細胞之結合之情形表示為「_」。 156912.doc -143 - 201207397 [表2] 載體名稱 4545 8213 4177 512 644 344823 F38-2E2 TIM-3 嵌合體 22-47 + + +/- - + + + TIM-3 嵌合體 57-66 + + +/- + - - 丁1^1-3嵌合體67-105 - - +/_ + + + + TIM-3 嵌合體 74-81 _ - + + + + + TIM-3 嵌合體 88-96 + + + + + + + ΉΜ-3 嵌合體 96-105 + + + + + + + 如表2所示，4545抗體及8213抗體與轉染TIM-3嵌合體 22-47、TIM-3 嵌合體 57-66、TIM-3 嵌合體 88-96、TIM-3 嵌 合體96-105之細胞結合。另一方面，未與轉染TIM-3嵌合 體67-105之細胞結合。 512抗體與轉染TIM-3嵌合體57-66、TIM-3嵌合體88-96、TIM-3 嵌合體 96-105、TIM-3 嵌合體 67-105、及 TIM-3 嵌合體74-81之細胞結合。另一方面，未與轉染TIM-3嵌合 體22-47之細胞結合。 644抗體、344823抗體、及F38-2E2抗體與轉染TIM-3嵌 合體 22-47、TIM-3 嵌合體 88-96、TIM-3 嵌合體 96-105、 TIM-3嵌合體67-105、及TIM-3嵌合體74-81之細胞結合。 另一方面，未與轉染TIM-3嵌合體57-66之細胞結合。 4177抗體與轉染TIM-3嵌合體88-96、ΉΜ-3嵌合體96-105、及TIM-3嵌合體74-81之細胞結合。又，與轉染TIM-3 嵌合體22-47、TIM-3嵌合體57-66、TIM-3嵌合體67-105之 細胞較弱地結合。 以上之結果與實施例16及實施例19之結果揭示，4545抗 體及8213抗體與人類TIM-3之第67號至第87號之胺基酸結 156912.doc •144- 201207397 合。進而，未與轉染TIM-3嵌合體74-81之細胞結合，由此 提示4545抗體及8213抗體對人類TIM-3之結合所需之胺基 酸包含於第74號至第81號之胺基酸中。 又，提示512抗體與人類TIM-3之第47號為止之胺基酸結 合，644抗體、344823抗體、及F38-2E2抗體與人類TIM-3 之第57號至第66號之胺基酸結合。 進而，提示4177抗體亦與4545抗體或8213抗體結合且 512抗體、644抗體、344823抗體、及F38-2E2抗體不結合 之人類TIM-3之第67號至第87號之胺基酸所含之胺基酸中 之除第74號至第8 1號以外之胺基酸結合。 [實施例33] (抗人類TIM-3 821；3抗體人類化抗體之製作） (1) 8 213抗體人類化抗體之V Η及V L之胺基酸序列之設計 藉由以下方式設計82 13抗體人類化抗體之VH之胺基酸 序列。藉由以下方式選擇適合8213抗體VH之CDR1〜3之胺 基酸序列（序列編號21〜23)之移植的人類抗體之VH之FR之 胺基酸序列。
Kabat等人將現有之各種人類抗體之VH根據其胺基酸序 列之同源性而分為亞群（HSG I〜III)，此等亞群之每個均報 告有共同序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]。因 此，實施人類抗體之VH之亞群I〜III之共同序列之FR之胺 基酸序列與8213抗體VH之FR之胺基酸序列之同源性檢 索。 156912.doc -145- 201207397 檢索同源性之結果為HSGI、HSGII、及HSGIII之同源性 分別為 77.0%、55.2〇/〇、58.60/〇。因此 ’ 8213 抗體 VH 之 FR 之 胺基酸序列與亞群I具有最高同源性。 基於以上結果，於人類抗體之VH之亞群I之共同序列之 FR之胺基酸序列之適當位置移植8213抗體VH之CDR之胺 基酸序列（序列編號21 ~23)。如此設計序列編號67所表示 之抗人類TIM-3 8213抗體人類化抗體之VH之胺基酸序列 8213 抗體 HV0。 其次，藉由以下方式設計U13抗體人類化抗體之VL之 胺基酸序列。藉由以下方式選擇使8213抗體VL之CDR1〜3 之胺基酸序列（序列編號24〜26)適合移植之人類抗體之VL 之FR之胺基酸序列。
Kabat等人將現有之各種人類抗體之VL根據其胺基酸序 列之同源性而分為亞群（HSG I〜IV)，此等亞群之每個均報 告有共同序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]。因 此，實施人類抗體之VL之亞群I〜IV之共同序列之FR之胺 基酸序列與8213抗體VL之FR之胺基酸序列之同源性檢 索。 檢索同源性之結果為HSGI、HSGII、HSGIII、及HSGIV 之同源性分別為76.3%、61.3%、61.3%、68.8%。因此’ 8213抗體VL之FR之胺基酸序列與亞群I具有最高同源性》 基於以上結果，於人類抗體之VL之亞群I之共同序列之 FR之胺基酸序列之適當位置移植8213抗體VL之CDR之胺 156912.doc • 146- 201207397 基酸序列（序列編號24〜26)。如此設計序列編號69所表示 之抗人類TIM-3 8213抗體人類化抗體之VL之胺基酸序列 8213 抗體 LV0。 上述所設計之8213抗體人類化抗體之VH之胺基酸序列 8213抗體11¥0、及¥[之胺基酸序列8213抗體1^0係於所選 擇之人類抗體之FR之胺基酸序列僅移植有作為小鼠單株抗 體之8213抗體之CDR之胺基酸序列的序列。 但是，通常於製作人類化抗體之情形時，僅將小鼠抗體 之CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之FR時，結合活性降 低之情形居多。為了避免此種結合活性之降低，而於移植 CDR之胺基酸序列之同時，修飾人類抗體與小鼠抗體之間 有所不同之FR之胺基酸殘基中認為可影響結合活性之胺基 酸殘基。因此，本實施例亦藉由以下方式鑑定認為可影響 結合活性之FR之胺基酸殘基並進行修飾。 首先，使用電腦模擬之手法，構建由上述所設計之8213 抗體人類化抗體之¥11之胺基酸序列8213抗體11¥0、及乂1^ 之胺基酸序列8213抗體LV0所組成之抗體V區域（以下，記 為HV0LV0)之立體結構。關於立體結構座標之製作及立體 結構之顯示係使用Discovery Studio (Accelrys公司）。又， 亦藉由相同方式構建8213抗體之V區域之立體結構之電腦 模型。 進而，於HV0LV0之VH及VL之FR之胺基酸序列中，選 擇與8213抗體不同之胺基酸殘基，製作對8213抗體之胺基 酸殘基進行修飾之胺基酸序列，同樣地構建立體結構模 156912.doc •147· 201207397 型。對該等所製作之8213抗體、HV0LV0及修飾體之各V區 域之立體結構進行比較，鑑定預測可影響抗體之結合活性 的胺基酸殘基。 其結果為，作為HV0LV0之FR之胺基酸殘基中認為使抗 原結合部位之立體結構發生變化而影響抗體之結合活性的 胺基酸殘基， 8213抗體HV0係選擇第12號之Lys、第20號之Va卜第38 號之Arg、第40號之Ala、第48號之Met、第67號之Arg、第 68號之Va卜第70號之lie、第72號之Ala、第74號之Thr、 第98號之Arg、及第113號之Val，8213抗體LV0係選擇第11 號之Leu、第13號之Ala、第15號之Val、第36號之Tyr、第 43號之Ala、第44號之Pro、第46號之Leu、第71號之Phe、 及第85號之Thr。 利用該等所選擇之胺基酸殘基中之至少1個以上之胺基 酸序列修飾8213抗體之相同部位所存在之胺基酸殘基，而 設計具有各種修飾之人類化抗體之VH及VL。 具體而言，對VH導入將序列編號67之胺基酸序列之第 12號之Lys置換為Va卜第2〇號之Val置換為Leu、第38號之 Arg置換為Lys、第40號之Ala置換為Arg、第48號之Met置 換為lie、第67號之Arg置換為Lys、第68號之Val置換為 Ala、第70號之lie置換為Leu、第72號之Ala置換為Va卜第 74號之Thr置換為Lys、第98號之Arg置換為Gly、或第113 號之Val置換為Leu的胺基酸修飾中之至少1個修飾。 又，對VL導入將序列編號69之胺基酸序列之第丨丨號之 156912.doc •148· 201207397
Leu置換為Met、第13號之Ala置換為Va卜第15號之Val置 換為Leu、第36號之Tyr置換為Leu、第43號之Ala置換為 Ser、第44號之Pro置換為Phe、第46號之Leu置換為Gly、 第71號之Phe置換為Tyr、及第85號之Thr置換為Asp的胺基 酸修飾中之至少1個修飾。 作為修飾有HV0LV0之FR上存在之至少1個胺基酸殘基 的8213抗體人類化抗體之抗體V區域，分別設計HV0LV0、
HV0LV2 、 HV0LV9 、 HV3LV6 、 HV4LV4 、 HV5LV0 、 HV5LV7 、 HV6LV5 、 HV7LV2 、 HV7LV9 、 HV8LV6 、 HV0LV4 、 HV3LV0 、 HV3LV7 、 HV4LV5 、 HV5LV2 、 HV5LV9 、 HV6LV6 、 HV7LV4 、 HV8LV0 、 HV8LV7 、 HV0LV5 、 HV0LV6 HV3LV2 、 HV3LV4 HV3LV9 、 HV4LV0 HV4LV6 、 HV4LV7 HV5LV4 、 HV5LV5 HV6LV0 、 HV6LV2 HV6LV7 、 HV6LV9 HV7LV5 、 HV7LV6 HV8LV2 ' HV8LV4 HV8LV9 、 HV10LV0 HV10LV4 、 HV10LV5 、 HV10LV9 、 HV12LV0 、 HV10LV6 、 HV12LV2 、 、HV0LV7、 、HV3LV5 、 、HV4LV2 、 、HV4LV9 、 、HV5LV6 、 、HV6LV4 、 、HV7LV0 、 、HV7LV7 、 、HV8LV5 、 、HV10LV2、 HV10LV7 、 HV12LV4 、 HV12LV5、HV12LV6、HV12LV7、及 HV12LV9。 將 Η鏈可變區域 HV3、HV4，HV5，HV6、HV7、HV8， HV10、HV12、及 L鏈可變區域LV2、LV4、LV5、LV6、 LV7、LV9之胺基酸序列分別示於圖1及2。 (2) 8213抗體人類化抗體之製作 156912.doc -149- 201207397 編碼8213抗體人類化抗體之可變區域之胺基酸序列的 DNA，於利用編碼8213抗體VH及8213抗體乂1^之胺基酸序 列的DNA(序列編號27、29)所使用之密碼子進行設計而進 行胺基酸修飾之情形時’係使用哺乳動物細胞中高頻率使 用之密碼子進行設計而分別製作。 使用該等DNA序列’進行抗體表現載體之構建及人類化 抗體之表現。 雖然本發明已使用特疋態樣進行詳細說明，但本領域技 術人員均明瞭’只要不脫離本發明之意圖與範圍，則可進 行各種變更及變形。再者，本申請案係基於2〇1〇年6月11 曰提出申請之美國臨時申請案（61/353 836)者，將其全部内 容引用至本文中。 產業上之可利用性 根據本發明，可提供如下者：與人類ΉΜ-3之細胞外區 域之胺基酸序列或其立體結構結合且發揮ADCC活性之單 株抗體或其抗體片段、產生該抗體之融合瘤、編碼該抗體 之DNA、含有該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形 體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造 方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分之治療藥及診 斷藥。 序列表自由内容 序列編號1 :人類4545 Η鏈CDR1之胺基酸序列 序列編號2 :人類4545 Η鏈CDR2之胺基酸序列 序列編號3 :人類4545 Η鏈CDR3之胺基酸序列 156912.doc •150- 201207397 序列編號4:人類4545 L鏈CDR1之胺基酸序列 序列編號5 :人類4545 L鏈CDR2之胺基酸序列 序列編號6 :人類4545 L鏈CDR3之胺基酸序列 序列編號11 :人類4177 Η鏈CDR1之胺基酸序列 序列編號12:人類4177 Η鏈CDR2之胺基酸序列 序列編號13:人類4177 Η鏈CDR3之胺基酸序列 序列編號14:人類4177 L鏈CDR1之胺基酸序列 序列編號15:人類4177 L鏈CDR2之胺基酸序列 序列編號16:人類4177 L鏈CDR3之胺基酸序列 序列編號21 :小鼠8213 Η鏈CDR1之胺基酸序列 序列編號22:小鼠8213 Η鏈CDR2之胺基酸序列 序列編號23 :小鼠8213 Η鏈CDR3之胺基酸序列 序列編號24 :小鼠8213 L鏈CDR1之胺基酸序列 序列編號25:小鼠8213 L鏈CDR2之胺基酸序列 序列編號26:小鼠8213 L鏈CDR3之胺基酸序列 序列編號31:引子TIM-3Fw2之鹼基序列 序列編號32:引子TIM-3Re2之鹼基序列 序列編號33:引子pMCs-Fw之鹼基序列 序列編號34 :引子TIM3ED-FcReXba之鹼基序列 序列編號35:引子T7之鹼基序列 序列編號36:引子hTIM-3Fwl之鹼基序列 序列編號37 :插入子hTIM-3 ECD Fc融合之鹼基序列 序列編號38 :插入子hTIM-3 ECD Fc融合之胺基酸序列 序列編號39 :引子TIM3ED-FLAG4aa之鹼基序列 156912.doc -151 - 201207397 序列編號40 ： 序列編號41 ： 序列編號42 : 序列編號43 : 序列編號44 ： 序列編號45 ： 序列編號46 ： 序列編號47 ： 序列編號48 ： 序列編號49 ： 序列編號50 ： 序列編號5 1 : 序列編號66 ： 序列編號67 ： 序列編號68 : 序列編號69 : 序列編號70 : 序列編號71 : 序列編號72 : 序列編號73 : 序列編號74 : 序列編號75 : 序列編號76 : 序列編號77 : 引子C-FLAG-NotR2之鹼基序列 引子BGH-R之鹼基序列 插入子hTIM-3 ECD之鹼基序列 插入子hTIM-3 ECD之胺基酸序列 引子hh-6之驗基序列 引子hh-3之鹼基序列 引子hk-2之鹼基序列 引子hk-6之鹼基序列 引子mH_Rvl之鹼基序列 φ 引子mH_Rv2之鹼基序列 引子mK—Rvl之鹼基序列 引子mK_Rv2之鹼基序列 82 13抗體HV0可變區域之鹼基序列 82 13抗體HV0可變區域之胺基酸序列 82 13抗體LV0可變區域之鹼基序列 82 13抗體LV0可變區域之胺基酸序列 引子mTim-3 Fw3之鹼基序列 會 引子mTim-3 Re3之鹼基序列 引子mTim-3 Fw4NotI之驗基序列 引子mTim-3 Re4NotI之鹼基序列 引子hTIM3+mIgV_vecRl之驗基序列 引子hTIM3+mIgV_vecFl之鹼基序列 引子hTIM3+mIgV」nsFl之鹼基序列 引子hTIM3+mIgV_insRl之鹼基序列 156912.doc • 152· 201207397 序列編號78 :插入子IgV嵌合體TIM-3/pEF6 Myc_HisC之鹼 基序列 序列編號79 :插入子IgV嵌合體TIM-3/pEF6 Myc_HisC之胺 基酸序列
序列編號80 :引子hTIM3+mMucin_VecR2之驗基序列 序列編號81 :引子hTIM3+mMucin_vecF2之鹼基序列 序列編號82 :引子hTIM3+mMucin_insF2之鹼基序列 序列編號83 :引子hTIM3+mMucin_insR2之鹼基序列 序列編號84:插入子Mucin嵌合體TIM-3/pEF6 Myc_HisC 之鹼基序列 序列編號85:插入子Mucin嵌合體TIM-3/pEF6 Myc_HisC 之胺基酸序列 序列編號86 :引子hTIM3嵌合體22-47F1之鹼基序列 序列編號87 :引子hTIM3嵌合體22-47R1之鹼基序列 序列編號88 :引子hTIM3嵌合體22-47F2之鹼基序列 序列編號89 :引子hTIM3嵌合體22-47R2之鹼基序列 序列編號90 :引子hTIM3嵌合體22-47F3之鹼基序列 序列編號91 :引子hTIM3嵌合體22-47R3之鹼基序列 序列編號92:插入子TIM-3嵌合體22-47/pEF6 Myc_HisC之 驗基序列 序列編號93 :插入子TIM-3嵌合體22-47/pEF6 Myc_HisC之 胺基酸序列 序列編號94 :引子hTIM3嵌合體57-66F之鹼基序列 序列編號95 :引子hTIM3嵌合體57-66R之鹼基序列 156912.doc -153- 201207397 序列編號96:插入子TIM-3嵌合體57-66/pEF6 Myc_HisC之 鹼基序列 序列編號97:插入子TIM-3嵌合體57-66/pEF6 Myc_HisC之 胺基酸序列 序列編號98 :引子hTIM3嵌合體67-105F之鹼基序列 序列編號99 :引子hTIM3嵌合體67-105R之鹼基序列 序列編號100 :引子mTIM3嵌合體67-105F之鹼基序列 序列編號101 :引子mTIM3嵌合體67-105R之鹼基序列 序列編號102 :插入子TIM-3嵌合體67-105/pEF6 Myc_HisC φ 之驗基序列 序列編號103 :插入子TIM-3嵌合體67-105/pEF6 Myc_HisC 之胺基酸序列 序列編號104 :引子hTIM3嵌合體74-81F之鹼基序列 序列編號105 :引子hTIM3嵌合體74-81R之鹼基序列 序列編號106 :插入子TIM-3嵌合體74-81/pEF6 Myc_HisC 之驗基序列 序列編號107 :插入子TIM-3嵌合體74-81/pEF6 Myc_HisC φ 之胺基酸序列 序列編號108 :引子hTIM3嵌合體88-96F之鹼基序列 序列編號109 :引子hTIM3嵌合體88-96R之鹼基序列 序列編號110 :插入子TIM-3嵌合體88-96/pEF6 Myc_HisC 之鹼基序列 序列編號111 :插入子TIM-3嵌合體88-96/pEF6 Myc_HisC 之胺基酸序列 156912.doc -154- 201207397 序列編號112 :引子hTIM3嵌合體96-105F之鹼基序列 序列編號113 :引子hTIM3嵌合體96-105R之鹼基序列 序列編號114 :插入子TIM-3嵌合體96-105/pEF6 Myc_HisC 之驗基序列 序列編號115 :插入子TIM-3嵌合體96-105/pEF6 Myc_HisC 之胺基酸序列 【圖式簡單說明】 圖1係表示所設計之8213抗體之Η鏈可變區域HV0、 HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10、HV12之胺 基酸序列。 圖2係表示所設計之8213抗體之L鏈可變區域LV0、 LV2、LV4、LV5、LV6、LV7、LV9之胺基酸序列。
156912.doc -155- 201207397 序列表 <110>日商協和醏酵麒麟有限公司 <120> 抗丁1^[-3抗體 <130> W502531 <140> 100120605 <141> 2011-06-10 <150> US61/353,836 <151> 2010-06-11 <160> 115 <n〇> Patentln第3.3版
以> > > 0 12 3 1 i— <1 <2<2<2<2 <220〉 <223> 人類4545H鏈CDR1 <400> 1 rg A5 rp Tyr5 Tyr ΪΤ工 216PR人 0>[>2>3> 4— 1— <2<2<2<2 <22〇> <223> 人類454511鏈00112 <400> 2 Tyr I [e Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 1 5 10
Lys Ser t5 T工‘ 3^^人 f— 1m <2<2<2<2 1569丨2-序列表.doc 201207397 <220> <223〉人類4545H鏈CDR3 <4〇〇> 3
Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 T 二 4T1PR人 α > > > o t 2 3 4t 1» 4— 1 2 2 2 2 y\ y\ <220> <223> 人類4545L鏈CDR1 <400> 4
Arg Ala $er Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala I 5 10 T工 5 7阳人 泛> > > 0 12 3 <2I<21<21<21 <Z20> <223〉人類4545L鏈CDR2 <400> 5
Asp Ala Ser Αεπ krg Ala Thr 1 S <21〇> 6 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 <22〇> <223> 人類4545L鏈CDR3 <400> 6 156912-序列表.doc 201207397
Gin Gin Are Ser Asn Trp Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 420 <2t2> ONA <213>智人 <22D> <221> CDS <222> 〇)..(«0) <400> 7 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc OtO otc ctg gcg gca get ecc ag8 tgg 48
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg A®i> His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp 115 120 125 tB〇 tgg ggo cag gga acc ctg stc acc gto t〇〇 tea 420 156912-序列表.doc 201207397
Tyr Trp Sly Oln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210〉 8 <211> 140 <212> PRT <213〉智人 <400> 8
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ala.AJa Pro Arg Trp 15 10 15
Val Leu Ser Ofn Val Gin Leu G(n Glu Ser Gly Pro 6ly Leu Vel Lys 20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Sly Qly Ser Phe 35 AO 45
Ser Arg Gly 6fy Tyr TTyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lye 50 55 $0 fily Leu Glu Trp lie Qly Tyr lie Tyr Tyr Ser Sly Ser Thr Asn Tyr 65 70 75 80
Asn Pro Ser Uu Lys Ser Arg Val Thr Me Ser Leu Asp Thr Ser Lys 85 90 95
Asn Gin Phe $er Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 丨05 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Tyr Ser Ser Ser Trp Thr Phe Asp Π5 120 125
Tyr Trp Gly Sin 6Iy Thr Leu Vel Thr Val Ser Sar 130 135 140 <210> 9 4- 156912-序列表.doc 201207397 <211> 381<212> m <2ί3>智人 <220> <221> COS <222> (1)..(381) <400> 9 atg gaa ^cc cca get ceg ott etc ttc etc otg eta etc tgg etc cca Met Gtu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Uu Leu Trp Leu Pro t 5 10 15 gat acc aco gga gaa att gtg tte aca cag tot 068 £〇〇 ace ctg tet A$p Thr Thr Gly G[u lie Val Leu Thr βΐη Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 48 96 ttg tat oce ggg gaa age gee aoo etc tee tgc sgg gee agt oag egt Leu Ser Pro Gly GIu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 144 gtt age tac tta gee tgg teo oaa cag aaa cot ggo cag ^ot ccc Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly filn Ala Pro 50 55 60 192 agg cto cto ate tat gat gca too aao agg gao act ggc ate cce gee 240 Arg Leu Leu 1 le Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Qly lie Pro Ala 6B 70 75 80 8gg ttc agt ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc act etc aco ato ago 288 Arg Pha Ser Gly Ser Gly Ser 6ly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
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<210> 15 <2T1> 7 <212> PRT <213>人工 156912-序列表.doc 201207397 <223> 人類4177L鏈CDR2 <400> 15
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 T工 1S9PR人 0>1>2>3> 4— 4— 1— <2<2<2<2 <ZZ0> <223> 人類4177L鏈CDR3 <400> 16
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0 T人 1814PR智 0>1>2>3> 1 1· 1β <2<2<2<2 <4〇〇> ia
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 15 10 IS
Val Leu Ser Gin Val 6ln Leu Qln Glu Ser Gly Pro Qty Leu Val Lys 20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie 3S 40 45
Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro 6|y Lys Gly Leu SO 55 60
Glu Trp lie Gly tyr lie Phe Hie Ser Sly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 9- 156912-序列表.doc 201207397
Ser Leu Lys Ser Arg val Thr (le Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Qln 85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp fhr Ala Val Tyr 100 丨邱 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Glu Tyr Phe Asp Met Leu Thr Gly Phe Asp Π5 120 t25
Tyr Trp Qly Gin Sly Thr Leu Vel Thr Val Ser Ser 130 135 140 Γ'· A 人 1938DK智 0>t>2>3> 21212121 < V < < <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <40〇> 19 ats eac atg agg etc etc get cag otc ctg ggg cto otg otg etc tgt 48
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Qlπ Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys t E 10 15 tto ocb igt goo aea tgt fao ato cag atg acc oag tot cca tec tea 96
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp 1le Gin Met Thr 6ln Ser Pro Ser 5er 20 25 30 ctg tet eoa tot gta gga gac ega gtc acc ate act tgt egg geg agt 144
Ueu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 cag ggi： ett ago 8go tgg tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa 192
Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Qlu Ly$ 50 55 60 gcc cct aag tcc ct容 ate tat sot gee toe agt ttg caa agt ggg gtc 240
Ala Pro Lys Ser Leu lie Tyr Ala A(a Ser Ser Leu 61n Ssr Gly Val 65 70 75 80 10· 156912·序列表,doc 201207397 cca tea agg ttc ago 雜g agt gga tot g枕 aca gat tto act etc acc
Pro Ser Arg Phe Ser Q|y Ser Qly Ser Gly Thr Asp Pho Thf Leu Thr 8E 90 95 ate age age ctg ca^ cct gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag
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Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe 6ly Q!n Gly Thr Ly$ Val Qlu lie 115 120 125 aaa
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Leu Ser Ala Ser Val Qly A$p Arg Val Thr lie Thr Cy$ Arg Ala Sor 35 40 45 β!η flly I le $©r Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin 6tn Lys Pro Blu Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Sep Leu I le Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser fity Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Sgi* Gly Ser Gly Ser G丨y Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 -11 - 156912-序列表.doc 201207397 I le Ser Ser Leu Qln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly 6ln fily Thr Lys Val Glu Mb Π5 120 125
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<210> 21 <2t1> 5 <212> PRT <213>人工 <220〉 <223> 小鼠8213H鏈CDR1 <400> 21
Ser Tyr Trp Met Hie 1 5 T工 2217PR人 > > /S > o 1 z 3 t 1 1 2 2 2 2 y\ y\ y\ c <220〉 <223〉小鼠821311鏈00112 <400〉 22
Glu lie Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 t5
Thr <2t0> 23 <210 8 <212> PRT <2t3>人工 156912·序列表.doc •12· 201207397 <220> <223〉小鼠8213H鏈CDR3 <400> 23
Gly Tyr Tyr Uu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 T工 2411PR人 0?1>^3> Ϊ 1 ti <2<2<2<2 <220> <223〉小鼠 8213L鏈CDR1 <400> 24
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τ ^ fPR人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> 小鼠8213L鏈CDR2 <400> 23
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T工 269PR人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> 小鼠8213[鏈CDR3 <400> 26 156912·序列表.doc 201207397 G,y Tyr n 5 v3,1 rp 8 A路 2740^家 <220> <221> CDS <m> (1)..(408) <400> 27 atg gga tgg ago ato etc cto ttt ttg gca 扣a gcg aca gat Met Gly Trp Ser Tyr lie lie Leu Pha Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 15 10 t5 48 gtc cac tco cag gtc caa otg cct ggg got gaa otg aai 96 Vel Hh Ser Oln Val Gin Leu Gin Gin Pro Qly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct get tea gtg as^ otg tco tgc aag get tot ggo tao acc ttc 144 Pro flly Ala Ser Val Lys Leu $er Cy$ Lys Ala Ser 6Iy Tyr Thr Phe 35 40 45 aco ago teo t^g atg oao tgg gtg aag cag agg oot gga caa ggc ett Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Bln Arg Pro 6ly Gin Gly Leu 50 BB 60 192 gag tgg att gga gag att aat cct age aac ggt cgt act aao tac aat Glu Trp lie 6Jy Glu lie Asn Pro Ser Asn Q!y Arg Thr Asn Tyr A$n 65 70 75 80 240 gag aag ttc aag bcg 的g geo sea ctg act gta gao 肋a too tco ago Glu Lys Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ly$ Ser Ser Ser 8fi 90 95 283 aoa goo tao at£ oaa cto age age ctg aca tot gag gsc tet geg gtc Thr Ala Tyr Net filn Leu Ser Ser Leu Thr Ser 6Iu Asp Ser Ala Val too 105 no 336 tat tac tgt geg ggg ggt t的 tao etc tac ttt gac t抑 tgg ggc caa Tyr Tyr Cys Ala Gty Qty Tyr Tyr Leu Tyr Phe A$〇 Tyr Trp Sly 6ln 115 120 125 m ggo acc act etc aca gto tcc tea 408 156912·序列表.doc 14 · 201207397
Gly Thr Thr Leu Thr Va丨 Ser Ser 130 135 28 136
PRT 家鼷鼠 <400> 28
Met Gly Trp Ser Tyr lie tie Leu Phe Leu Val Aid Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu 6\tt Qin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Lgu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Va) Lys Gin Arg Pro Gly Gin flly Leu 50 55 60
Glu Trp I le Gly Glu I le Αδη Pro Ser Asn Gly Arg Thr A$n Tyr Asn 6S 70 75 80
Glu Lys Pha Lye Thr Ly$ Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met flln Leu Ser Ser Uu Thr Ser Giu Asp Ser Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys* Ala Gly Gly Tyr Tyr Leu Tyr Phe A$p Tyr Trp Gly Gin 11S 120 125
Sly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 29 15- 156912-序列表.doc 201207397 <211> 387 <212> DM <213>家鼷鼠 <220> <221> CDS <222> ⑴..(387) <400> 29 atg gac atg atg gtc ott got cag ttt ctt gca tto tts tte ctt tgg
Met Asp Met Met Va> leu Ala Glh Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp 15 10 15 ttt cca ggt gca aca t^t gao ato otg atg acc caa tot ooa too too
Phe Pro 6ly Ala Thr Cya Asp lie leu Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30 atg tct gta tot otg gga gac aca grto eae ato aot tgc cat gca agt
Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Asn lie Thr Gys His Ala Ser 35 40 45 cag ggc att agg att aat eta ggg Xgg ttg oaf cag aag ooa ggg βββ
Gin Gly He Ars lie Asn lie Gly Trp Leu Gin 〇ln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 tea ttt asg ggc ctg ate tat cat gga acc aac ttg gaa gat gga gtt
Ser Phe Lys Gly Leu lie Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val 65 70 75 80 cca tea agg tto $gt S£〇 agt gga tot gga cca gat tat tct etc acc
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 ate ago egc ctg gsa tot gaa pt ttt sea gBD tat teo tgt gta cag lie Ser Ser Leu Glu Ser Qlu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Qln
100 105 ItO tat ggt cag ttt ccg tgg aeg tta ggt gga 时〇 acc a时 ctg gaa at?
Tyr Gly Gin Phe Pro Trp Thr Phe Gly Sly 6ly Thr Lys Leu Glu Met 115 丨20 125 aaa
Lys <210> 30 16- 156912-序列表.doc 201207397 <211> 129 <212> PRT <213>家鼷鼠 <40O> 30
Met Asp Met Met Val Leu Ala Gin Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Thr Cys Asp He Leu Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Asn lie Thr Cys Hts Ala Ser 35 40 45
Gin 6ly Me Arg lie Asn lie Qly Trp Leu Gin Gin Lys Pro Gly L.ys 50 55 60
Ser Phe Lys Gly Leu lie Tyr His 6ly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Vat 65 70 7S 80
Pro Ser Arg Phe Ser Qly Ser 61y Ser Qly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 I le $er Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Al$i Asp Tyr Tyr Cys Val Gin 100 10E 1T0
Tyr Sly Gin Phe Pro Trp Thr Phe Gly fily Qly Thr Lys Leu Glu Met 1!S 120 125
Lys w工 3126D 人 0>1>2>3> 1J 1— It 2 -17· 156912·序列表.doc 201207397 <223〉引子TIM-3Fw2 <400> 31 gccaccatgt tttcacatct taoott
3220膽人 ^ V/ 0 12 3 4— 2 2 2 2 ✓N ys /X <220> <22於引子 TIM-3Re2 <32 otatggeatt ecaaagcgac A工 ^^^人 <1 1 fi 1. <2<2<2<2 <220> <223〉引子pMCs-Fw <400> 33 tee的gtaga oggcatogca g <210〉 34 <211> 27 <212〉DNA <213〉人工 <220> <223〉引子TEM3ED-FcReXba <400> 34 ttttctasat ctgatggttg ctccaga A 二 3520DN人 0>1>2>3>0> rfl» t— n Ac ^¢1^¾}<2 156912-序列表.doc 201207397 <223> 引子T7 <400> 36 taatacgact oaotetsggg 20 认工 3618i 人 6 > /s > D 1 z 3 1/ 1. 2 2 2 2 /% ys y> y\ <220> <223> 引子 hTIM-3Fwl <400> 35 actctggagc aaccatca 18 33丨工 3713诎人 0>T>2>3> 6^^1¾ <220> <223〉插入子hTIM-3ECDFc融合 <ζζα> <220 CDS <222> 〇1).. (1333) <400> 37 gattgccacc at? ttt tea cat ctt ccg ttt gac tst gtc ctg ctg ctg Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu 1 5 10 49 ctg ctg eta ett aca agg tcc tea gea gtg 辟a tac aga gc? p? Leu Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser $er Glu Val Qlu Tyr Arg Ala Glu 15 20 25 97 gto ggt cag aat goo tot otg ccc tgc ttc tac acc cca gcc gcc cca Vat Gly Gin Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro 30 35 40 45 t45 ggg aac etc gtg cco gt& tgc tgg ggo aaa gga gcc tgt cot gtg ttt Gly Asn Leu Val Pro Val Gys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Vai Phe 50 55 60 193 156912-序列表.doc 19- 201207397
Saa &BC St? StS 〇to agg act gat gea agg gat gtg aat tat 241
Olu Cys Gly Asn Vel Val Leu Arg Thr Asp filu Ars A6p Vdl A$n Tyr 65 70 75 tgg eoa tea aga tac tgg eta aat gEg gat ttc Ggo aaa gga gat gtg 289
Trp Thr Ser Arg tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lya Qly A$p V$l 80 85 90 tco otg aco ate gag aat gtg act ota gca gac agt ggg ato tac tgo 337
Ser Leu Thr lie GIu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ssr fily I le Tyr Cys 95 100 105 tgc ce：g ato caa ate coa ggo eta atg aat gat pa aaa ttt aaa ctg 385
Cys Arg Me Gin tie Pro Gly lie Met Asn Asp Gtu Lys Phe Asn Leu 110 115 120 125 aag tt^ gto ato aad Ota tzQ stc bgc cct eca ccg act c^g oag 433
Lys LeirVal lie Ly$ Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gin 130 135 140 sga gao ttc act gca geo tit coa atg ett aoo ecc agg gga cat 481
Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Uu Thr Thr Arg Gly His 145 150 155 ggc cca gca gag aca cag aoa otg ggg age cto cot gat ata aat eta 529 fily Pro Ala Qlu Thr Gin Thr Lou Gly Ser Lbu Pro Asp Me Asn Leu 160 165 170 aca caa ata tcc aca ttg gcc aat g&s tta ogg gao tot Bga tt; goo 577
Thr Gin lie Ser Thr Leu Ala Asn GIu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala 175 180 185 aat gac tta egg gac tet gga 取a acc ate aga tot Bga gca gac tac 625
Asn Asp Leu Arg Asp Ser Qly Ala Thr lie Arg Ser Arg AU Asp Tyr 190 195 200 205 eas 抑c gso get 篇ac 的g act agt gac a的 act esc aca tgc cca ccs 673
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 tgo cca fca cct gaa etc &tg ggg gga 如g t加 gtc tto etc ttc coo 721 0y5 Pro Ala Pro Qlu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 2^0 235 cca aaa ccc sag gac aoo etc atg ate tcc $〇〇 cct gag aca 769
Pro Lye Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro GIu Val Thr 240 245 2S0 •20·
156912·序列表.doc 877 877
201207397 tgc gt& £tg gas 拉g age cac gaa gac cct gag 抗c aag ttc aac
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Gfu Asp Pro Glu Vet Lys Phe Asn 255 260 265 tgs tac itg, gac ggc gtg gag gtg cat aat geo aag aca aas ccg egg
Trp Tyr Val Asp Bly Val Βία Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 270 275 280 285 gag gag cag tac aac age aeg tac o^t £tg gto ago gtc etc acc gtc
Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 299 300 0½ ΟΘΟ Cd$ ctg; aat ggo esg geg tac asg tgc aag pto tee
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Tyr Pro Ser Asp lie Ala Ala Olu Trp Qlu Sor Asn Qty Gh Pro Glu 370 375 380 aac aac tac aag aco aeg cct ccc gtg ctg gae tee gao ggo tc〇 tto Asn Asn iyr Lye Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 6ly Ser Phe 邡 5 390 395 ttc etc tac age sag etc aco gtg gac aag age agg tgg cag oag ggg
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser krg Trp Gin 6In Gly 400 40S 410 aac gt〇 tto tea tgc too gts atg oat gag got otg cac aao cac tac
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 415 420 426 ac^ GBg aag ego etc too otg tet cc^ sst aea tga Thr Gin Ly$ Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ly$ 430 435 440 156912-序列表.doc 8S5 913 961 1009 1057 Π05 11S3 1201 1249 1297 1333 -21 · 201207397 <2J0> 38 <2!J> 440 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉合成構建物 <400> 38
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu L^ir 1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser GIu Val Glu Tyr Arg Ala &lu Val Q(y QIn 20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Dir Pro Ala Ala Pro Sly Asn Leu 35 40 45
Val Pro Val Cys Trp 61y Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys 6ly 50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp 6lu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 7 0 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Oly Asp Phe Arg Lys fily Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95
He Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Qly lie Tyr Cys Cys Ar^ lie 100 105 110
Gin lie Pro &ly He Met Asn Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 12G
lie Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg (5丨n Arg Asp Pha 130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Qly His G|y Pro Ala 156912·序列表.doc 22- 201207397 145 150 155 160
Olu Thr Gin Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp lie A$n Leu Thr Gin He 165 170 175
Ser Thr Leu Ala A$n Glu Leu Arg Acp Ser Ar^ Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 (90
Arg A«p $er Gly Ala Thr lie Arg Ser Arg Ala A$p Tyr Lys Asp Asp 195 200 205
Aep Asp Lys Thr Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220
Pro 6lu Leu Leu fily Gly Pro Ser Va| Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Are Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255
Val Asp Val Ser His filu Asp Pro Qlu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270
Asp 6!y Val Qlu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 6Ju Gin 275 280 285
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 6ln 290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Qys Lys Val Ser Αδη Lys Ala 305 310 3t5 320
Leu Pro A[a Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 325 330 335
Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 6lu Met Thr 23- 156912-序列表.doc 201207397 240 345 360
Lye Asn Qln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 6ly Phe Tyr Pro Ser 355 360 3 明
Mp lie Ala Ala 61u Trp Glu Ser Asn Qly θΐπ Pro 6lu Asn Asn Tyr 370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Uu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 40Q
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Qln Qly Asn Val Phe 405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His QIu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 w工 S30隱人 0>1>2>3> 1β 4— <1 <2<2<2<2 <220〉 <223〉引子TIM3ED-FLAG4aa <400> 39 tototgatgg ttgctccaga A工 4039DN人 0>1>»3> n ii t 1 <2<2<2<2 <220> <223〉引子 C-FLAG-NotR2 <400> 40 24- 156912·序列表.doc 201207397 aaaagcgKco gotcaottgt cgtcatcgtc ettgta^te 39 <210> 41 <211> IB <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子BGH-R <400> 41 tasaaggeae agtegagg 18 5 A 42SDN人 0>1>2>3> <21<21<21<21
<220> <2M> 插入子hmWECD <220> <221> COS <222> (19)..(645) <400> 42 gggaattoge ttgcoaco ttt tea cat ett cc« ttt gae t^t gtc ctg Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu 1 5 10 51 ct氐 ctg ctg cts eta cte ett aca agg too t〇B gsa gt? eea tac aga Leu Leu Leu Leu Leu Uu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Vel Glu Tyr Arg 15 20 25 99 geg gag gtc ggt cag aat gec tat ctg 〇〇〇 tso tto tao dec cca gee Ala fllu Val Gly 6ln Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala 30 35 40 147 geo。站辟g eiac etc etg cco gt。tgo tgg ggo 的3 £ga goo tgt cct Ala Pro Qly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp Gly Lys 〇|y Ala Cys Pro 45 50 55 195 gte ttt gaa tgt ggc aac gt£ gtg cte agg act 辟t gaa agg gat gtg Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val 60 6S 70 75 243 156912-序列表.doc 25· 291201207397 aat tgg eca tcc aga tac tgg eta aat 踩g gat ttc cgc asa gga Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Qly Asp Phe Arg Lys flly 80 &5 90 gat gtg too ote a〇〇 dta gag aat gtg act eta gca gac agt gSS ate Asp Va! Ser Leu Thr Ite Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly lie 95 100 105 . 339 tao tgc t£C egg dtc caa ate cca ggc ata atg aat gat 辟a aaa ttt Tyr Cy8 Cys Arg lie 6ln Ife Pro Gly lie Met Asn Asp Glu Lys Phe 110 115 120 387 esc otg eag ttg gto dto dda Cca geo aag gto aoo cot goa ccg act Asn Leu Lys Leu Vat He Lys Pro Ala Lys Vai Thr Pro Ala Pro Thr 125 130 135 435 egg eag aga gac ttc act gca goc ttt1 coa age atg ett aco βαο ugg Arg Gin Arg Asp PhB Thr Ala Ala Phe Pro Aner Met Leu Thr TTir Arg 140 145 150 155 483
gga oat ggo ooa go^ d〇a eca cts ggg ego cto cot eat dta 531 Gly Kis Gly Pro Ala Glu Thr Qln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp (|e 160 (65 170 aat ota aoa 〇$a ate tcc aca ttg gcc aat gag tta ogg gac tet aga 579 Asn Leu Thr Qln Il$ $$r Thr Leu Ala Αβπ Glu Leu krg Asp Ser Arg 175 180 t8S ttg geo aat gac tta egg gao tet g辟 gca dec; ate aga gac tac aa尽 Leu Ala k$n Asp Leu Ar^ Asp Ser Qly Aid Thr I te Arg Asp Tyr Lys 190 195 200 fi27
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8 T工 4320PR人 0>t>2>3> <21<21<Z1<2I <220> <223〉合成構建物 <400> 43 156912-序列表.doc 26 · 201207397
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val GIu Tyr Arg Ala Glu Val 6ly Gin 20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ale Ala Pro Sly Asn Leu 35 40 45
Val Pro Val Oys Trp Qly Lya Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly SO 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Qly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr &5 90 95 lie 6tu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly lie Tyr Cys Cys Arg Ile 100 彳05 110
Gin lie Pro Gly lie Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125
Me Lys Pco Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg 6ln Arg Asp Phe 130 135 140
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Glu Thr Gin Thr Leu Gly Ser Lau Pro Asp lie A«n Leu Thr filn lie 165 丨70 175
Ser thr Leu Ale A$n Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn A$p Leu ISO 18S 190 27- 156912-序列表.doc 201207397
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115 120 12S ate daa cca gee aeg gto ace cct gca ccg act egg cag ega gee ttc 30- 156912·序列表.doc 480201207397 lie Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ale Pro Thr Arg Gin Arg Asp Phe 130 135 140 aot goo ttt coa a?g atg ctt aoc acc egg gga cat ggc coa gca Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg fily His 6ly Pro Ala 145 150 155 160 gBg aoa oag aca cte； sgc etc oct gat ata aat eta aca caa ata Glu Thr Gin Thr Leu Sly Ser Leu Pro Asp lie Asn leu Thr Sin lie 165 170 175 528 tco sea ttg goo aat tta egg gac tot aga ttg goo aat gac tta Ser Thr Leu Ala A$n Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu ISO 185 t90 576 egg gac; tet £ga gca eco eto aga ata ggc ate tac ate gga gca g雜 Arg Asp Ser 6!y Ala Thr lie Arg lie Qty lie Tyr lie Gly Ala Gty 195 200 205 624 8t〇 tgt get 辟g cte get ctg get ctt at。tt。gg(； get tta att ttc 672 Me Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu lie Phe (ily Ala Leu Ile Phe 210 215 m aaa tgg tat tet cat ago aaa gsg aag ata cag aat tta age etc ate 720 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys lie Gin Asn Leu Ser Leu I le 225 230 23S 240 tet ttg ^cg aec etc cct cco tea igs ttg gca aat gca gta gca gag 76B Ser Uu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gty Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 2叨 255 gga att ego t〇d gaa gaa aac ate tat acc att gaa gag dac gta tat Gly lie Arg Ser S(u Glu Asn lie Tyr Thr 11« 6tu Qlu Asn Val Tyr Z60 M5 270 81$ g抑躭g gag gag ccc aat ga芪 tat tat tgG tat gtc age age agg cag Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gin 275 280 285 864 caa coo toa caa 卯t Ug £gt tgt ege ttt gca atg cca tsg Gin Pro Ser Gin Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 906 S301PRT智 V? V7 0 12 3 1— 2 2 2 2 < < < c -31 - 156912-序列表.doc 201207397 <400> 53
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180 185 1SQ
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U6912-序列表.doc 201207397
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Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Pha Ale Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 no
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Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 40- 1569】2·序列表.doc 201207397 100 105 110
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Ly« Ala Ser 0ly Tyr Thr Phe 35 40 45
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Gin Lys Uu Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ser Ser Ser Trp Ser Phe Asp Tyr Trp 115 120 t2S • 42- 156912-序列表.doc 201207397
Gly Gin (Hy Thr Leu Va丨 Thr Va丨 Ser Ser 130 135 CS A人 S39DN% p > > > 0 12 3 1t 4— 1— 艾2 2 2 v* < < c <220> <221> CDS <222> (1).,(390) <400> 64 atg gac atg agg gtc etc get cag etc otg ggg etc ctg ctg etc tgt Met Asp Met Ar^r Val Leu Ala Qln Leu Leu 6ly Leu Leu Leu Leu Cy$ 15 10 15
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156912·序列表.doc 201207397 275 280 285 gca Btg oca tBg Ala Met Pro 290 1 T工 8529PR人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <zzo> <Z23>合成構建物 <400> 85
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Thr Qln Thr Leu Val Thr L«u His Asn Asn Asn Gly Thr Lys I le Ser 165 170 175
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<210> 91 <211> 33 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 引子hTIM3嵌合體22*47R3 <400> 91 ggcagatagg catttttaoo aacutcaaco tta <210> 92 <211> 906 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> ΉΜ-3嵌合體22-47/pEF6Myc_HisC <220> <221 > CDS <222> (1)..(905) <400> 02 atg ttt tea cat ett coo ttt gac tgt gtc ctg otg ctg ctg ctg ota
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Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys fily 50 55 60
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Arg Tyr Trp Uu A$n Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Leu Thr 85 90 95 62- 156912-序列表.doc 201207397 lie OIu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Qly lie Tyr Cy$ Cys Arg lie 100 10S 110 6ln 1 le Pro Qly I le Met Asn Asd Qlu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 丨 20 125 I le Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Qln Arg Asp Phe 130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Sly His fily Pro Ala 145 150 〗S5 160
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Glu Val Glu Glu Pro Asn GIu Tyr Tyr Cys Tyr Va! Ser Ser Ar? Gin 275 280 285 -63- 156912-序列表.doc 201207397 6ln Pro Ser Gin Pro Leu 6ly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 4 55^ 9 3 D人 0>l>2>3> <21<21<21<21 <220> <223>引子ΜΊΜ3嵌合體57*66F <400> 94 aeagtgtaco aatgag^tgo tcaggaotga tgaae A工 B 3 N 】 9 3 o A 0>1>2>3> 1— 1» <1 2 2 2 2 < < < V/ <220> <223〉引子ΜΊΜ3嵌合體57*66R <400> 95 geeeeaggao agaatoottt ((仰c〇8£cag acg
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Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Lbu Leu 1 5 tO 15 64- 156912-序列表.doc 96 96
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Leu Leu Thr Arg Ser Ser Qlu Val Glu Tyr Ar^ A1b 6Iu Val Gly Gin 20 25 30
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Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys 6ly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95
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Glu Thr Gin Thr Leu ^ly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr 6ln Jle t65 170 175 $er Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190
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Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 67- 156912-序列表.doc 201207397 245 2S0 255 6ly lie Arg Ser ΘΙυ Glu Asn He Tyr Thr lie GIu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 6lu Val Qlu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cye Tyr Val Ser Ser* Arg Gin 275 280 2昉 6ln Pro Ser Qln Pro Leu fily-Cys Are Phe Ala Met Pro 290 295 300 8 4na^ 9 3 D人 0>1>2>3> <218<21<21 <220> <2Z3> 引子hTIM3嵌合體67-105F <400> 98 34 ctg^atgaco atgggatcta ctgctgccgg atcc 9 3naj 9 3 o A e0»^ 1— 1— it 2 2 2 2 V c c <220> <223〉引子hTIM3嵌合體67-105R <400> 99 33 atoagttotg egcaacacgt tgccacettc aaa <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213>人工 <220> <223〉引子mTIM3嵌合體67-105F <400> 100 156912-序列表.doc •68· 201207397 20 ttgctcagaa ct$atgaaag <210> 101 <211> 20 <212> DNA <2Ϊ3>人工 <220>
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Leu Leu Thr Arg Ser Ser 6Iu Val filu Tyr Ar? Ala Glu Val 6ly Gin 20 25 30
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Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Ly$ Glu Lys lie Gin Αεπ Leu Ser Leu 156912-序列表.doc 74- 201207397 225 230 235 240 ato tct ttg geo aac etc cct cco tea gga ttg gca aat gca gta gca lie Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ata Asn Ala Val Aia 245 250 255 gag gga att ogo tea Kda gaa aao ate tat acc att gaa gBg eac gta 6tu Gly lie Arg Ser Glu 6[u Asn Me Tyr Thr He 6Iu Glu Asn Val 260 265 270 tat gea gtg 辟g g郎 ccc aat sag tat tat tgc tat gtc ago dgc a 甜
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7 2 T工 toMPR/VJ 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223〉合成構建物 <400> 107
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Leu L^i Thr Arg Ser Ser Qlu Vat Qlu Tyr Arg Ala Glu Val Sly Gin 20 28 30
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Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Olu Cys Gly 50 55 $0
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arff Asn Val Thr Tyr Gin Lys Ser 65 70 75 80 75- 156912-序列表.doc 201207397
Ser Arg Tyr Trp Leu Asn Qly Asp Phe Arg Lys 6ly A$p Val Ser Leu 85 90 95
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Val lie Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gin Arg Asp 130 135 140
Phe Thr Ala AJa Phe Pr〇_Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Qly Pro 145 ISO 155 160
Ala Glu Thr Gin Thr Uu Gly Ser Leu Pro Asp lie Asn Uu Thr 6ln 165 170 175
Me Ser Thr Leu Ala Asn Gtu Leu Arg Asp Ser Arg Uu Ala Asn Asp 180 IBS 100
Leu Ars Asp Ser Gly Ala Thr Me keg He Gly lie Tyr Me fily Ala 195 200 205
Gly lie Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu He Phe Gly Ala Leu tie 2t〇 215 220
Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys lie Gin Asn Leu Ser Leu 225 230 235 240
Me Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Qly Leu Me Asn Ala Val Ala 245 250 255
Glu Gly lie Arg $er 6)u filu Asn lie Tyr Thr lie 6lu Qlu Asn Val 260 265 270 156912-序列表.doc • 76· 201207397
Tyr Glu Val Qlu Qlu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val S®r Ser Arg 275 2S0 挪
Gin Gin Pro Ser Gin Pro Leu fily Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 8 A工 o 5 N j 1. 3 D o > > > 0 12 3 1— 1 1— 1. <2<2<2<2 <220> <223> 引子hTIM3嵌合體88-96F <400> 108 aaaggagatf tgtototliet cataga^aat gtgao 0>1>2>3> 1· 1— t— n <2<2<2<2
9 w工 10351AJ <22〇> <223> 引子hTIM3 嵌合體88-96R <400> 109 agacacatct cctttgttga gatccccatt tAgco
<210> Π0 <2Π> 906 <Z12> DNA <213>人工 <220>
<223> TIM-3 嵌合體88-96/pEF6Myc_HisC
<220> <221> CDS <m> (1)..(905) <400> 110 atg ttt tea cat ett cco ttt gac tgt gtc ctg otg ctg ctg otg eta 77- 156912·序列表.doe 201207397
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Ser Thr Leu Ala Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 160 185 190 egg gee tot gga goa acc ata agq ata m etc tao Bto ggd gca ggg 624 156912·序列表.doc 78· 672 672
201207397
Arg Asp Ser Gly Ala Thr lie Arg Ile Qly lie Tyr I[e Gly Ala Gly 195 200 205 ate tgt get ggg ctg get ctg get ett etc tte ggc get tta att ttc
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Met Phe Ser His Leu Pro fhe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15 720 768 816 8S4 906
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Qlu Val 8lu Tyr Arg Ala Glu Vat Sly Gin 20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ata Ala Pro Sly Asn Leu 35 40 45 79- 156912-序列表.doc 201207397
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Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80
Arg Tyr Trp leu Asn Gly Asp Leu Asn lys Qly Asp Val Ser Leu tie 85 90 95 lie Glu Asn Val Thr Uu Ala Asp Ser Qly jk Tyr Cys Cy6 Arg (le 100 105 110
Gin lie Pro Gly lie Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 lie Lys Pro Ala Ly$ Vil Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gin Arg Aep Phe 130 丨35 t40
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Glu Thr Gin Thr Leu Qly Ser Leu Pro Asp lie Asn Leu Thr Gin He 165 170 175
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Arg Asp Ser fily Ala Thr lie Arg He Q]y He Tyr lie Gly Ala Gly 195 200 205 lie Cys Ale Gly Uu Ala Leu Ala Leu lie Phe Qly Ala Leu lie Phe 2t0 215 220
Lys Trp T/r Ser His Ser Lye Slu Lys ΙΓβ Gl/ι Asn Uu Ser Leu lie 225 230 235 240 80- 156912-序列表.doc 201207397
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255
Gly lie Ser 61 u Glu Asn lie Tyr Thr lie Q\u &lu Asn Val Tyr 260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Slu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Bin 275 286 8ίη Pro Ser Gin Pro Leu Qly Gys Arg Pho Ala Met Pro 290 295 300 112sri b > o 1 z 3 41 1· 1— 2 2 2 2 < < <220> <223>
引子hTIM3嵌合體96-105F <400> 112 35 gaatstgact ctggat^acc atgsgatcta ctgct 3 A工 ij CJ J 4J ou 人 ^^&^ Hi t* 2 2 2 2 /> /Λ /> /> <220> <223> 引子hTIM3嵌合體96-105R <400> Π3 tcoagegtoe cattctttat gatoaggeac acato 35
1406NAj Ί 9 D人 0>1>2>3>0> <21C21<21<21<22 -81 - 156912·序列表.doc 201207397
<223〉TIM-3嵌合體96-105/pEF6 Myc_HisC <220> <221> CDS <222> (1)..(906) <400> 114 atg ttt tea cat ett ccc ttt gao tgt gtc ctg ctg ctg ctg ctg eta 48
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Arg Tyr Tr〇 Leu Asn Gly Asp Phe Are Lys Gly Asp Val Ser Leu lie 85 90 95 ata sag aat gtg act ctg gat gac cat ggg ato tao tgQ tgo ogg ato 336 I le Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp Hi$ QJy lie Tyr Cys Cys Arg Me 100 105 110 caa ate cca ggc ata at^ aat get gaa aaa ttt aac ctg aag tts eto 3B4 8tn lie Pro Gly lie Met A$n Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 ate a的 cca gcc aag gtc aco cct gca ccg act egg cag aga gao tto 432 I le Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gin Arg Asp Phe 130 136 140 act gca gcc ttt 〇〇〇 egg atg ett aco aco agg gga cat ssc cca gca 4S0
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg fily His Gly Pro Ala 145 150 155 160 82-
156912-序列表.doc 528201207397 gas aca cag aca ctg ggg ago etc cot gat ata aat eta dca caa ata Qlu Thr Gin Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp lie Asn Leu Thr Gin lie t65 170 175 tcc sea ttg goo aat gag tta egg gaa tot aga ttg gec aat sao tta Ser Thr Leu Ata Asn Glu Leu Ar; Asp $er Arf Leu Als A$n Asp Leu ISO 185 t90 576 egg gac tot ggQ gca see ato age eta ate tac ato ^ga goa ggg Arg Asp Ser Gly Ala Thr lie Arg He Gly lie Tyr lie Gly Ala Gly 195 200 205 624 ate tst £〇t ggg otg get otg got ott ato ttc ggo got tta att ttc lie Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu lie Phe 6(y Ala leu lie Phe 210 215 220 672 aaa tgg tat tet cat age daa gag asg eta cag Sdt tta age ctG ato 720 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Giu Lys lie (3ln Asn Uu Ser Uu tie 225 230 m 240 tet ttg geo aac etc cct ccq tea gga ttg gee aat gca gta gca gag 768 Ser Leu Ata Asn Leu Pro Pro Ssr G!y Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 gga fitt ege tea gaa gaa aac ate tat acc att gea gag aac gta tat Gly Me Arg Ser Gtu Glu Asn Ue Tyr Thr lie Qlu Qlu Asn Val Tyr 260 265 270 81 β gaa gtg ge? gsg coo aat gag tet tat tgc tat gi：c age ago agg cag Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Qln 275 280 285 m cs& ccc tea caa cct ttg ggt tgt ege ttt gCQ atg 從a tag Gin Pro Ser Gin Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300 906
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Met Ph4 Ser His Uu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 83- 156912-序列表.doc 201207397 1 E 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Giu Tyr Arg Ala Qlu Val 6|y Gin 20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Aia Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe filu Cys Sly 50 BS 60 A$n Val Val Leu Ar? Thr Asp Qlu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Qly Asp Phe Arg Lys Qiy A$p Val Ser Leu I le 85 90 95 lie Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly lie Tyr Cys Cys Arg lie 100 105 110
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Glu Thr Gin Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp lie Asn Leu Thr Qln lie 165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser ktg Leu Ala Asn Asp Leu 180 1 85 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr lie Arg lie Gly II& Tyr lie Gl/ Ala Qly 84- 1569丨2·序列表.doc 201207397 195 200 205 I le Cys A(a G(y Ueu Ala Leu Ala Leu lie Phd Qly Ala Leu I le Phe 210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys lie Gin Asn Leu Ser Leu 1 le 225 230 235 240
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Gtu Val fllu Glu Pro Asn filu Tyr Tyr Cys Tyr VaJ Ser $er Arg Qln 275 280 285
Qln Pro Ser Gin Pro Leu Gly Cys Arg Phe Alfl Met Pro 29D 295 300
85- 156912-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201207397 七、申請專利範圍： 1_ 一種單株抗體或該抗體片段，其與選自以下中之 1種抗體競爭而與人類TIM-3之細胞外區域結合， (i) 含有CDR1-3分別含有序列編號1〜3所表示之胺基酸序 列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號4~6 所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的抗體 (ii) 含有CDR1〜3分別含有序列編號11〜13所表示之胺基酸 序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1-3分別含有序列編號 14〜16所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的抗體 (iii) 含有CDR1〜3分別含有序列編號21〜23所表示之胺基 酸序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號 24〜26所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的抗體。 2. 如請求項1之單株抗體或該抗體片段，其係與和選自上 述（i)〜（iii)中之1種抗體相同之抗原決定位結合之單株抗 體。 3. 一種單株抗體或該抗體片段，其與以下（a)或之抗體競 爭而與人類TIM-3之細胞外區域結合， (a) 含有包含序列編號8所表示之胺基酸序列的抗體之 VH，且含有包含序列編號1 〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的抗體 (b) 含有包含序列編號1 8所表示之胺基酸序列的抗體之 VH，且含有包含序列編號2〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的抗體。 4. 如請求項3之單株抗體或該抗體片段，其係與和上述（a) 156912.doc 201207397 或（b)之抗體相同之抗原決定位結合之單株抗體。 5.如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段，其係 基因重組抗體。 6·如請求項5之單株抗體或該抗體片段，其係選自人類型 嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。 7. 一種單株抗體或該抗體片段，其係選自以下（i)〜(iii)中之 1種， (i)含有CDR1〜3分別含有序列编號1〜3所表示之胺基酸序 列的抗體之Η鏈’且含有CDR1〜3分別含有序列編號4〜6 所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈的單株抗體及該抗體 片段； (π)含有CDR1~3分別含有序列編號η〜π所表示之胺基酸 序列的抗體之Η鏈’且含有CDR1〜3分別含有序列編號 14〜16所表示之胺基酸序列的抗體之l鏈的單株抗體及該 抗體片段； (π〇含有CDR1〜3分別含有序列編號21〜23所表示之胺基 酸序列的抗體之Η鏈，且含有CDR1〜3分別含有序列編號 24〜26所表示之胺基酸序列的抗體之匕鏈的單株抗體及該 抗體片段。 8· 一種單株抗體及該抗體片段，其係以下（a)或（b)， (a) 含有包含序列編號8所表示之胺基酸序列的抗體之 VH，且含有包含序列編號1〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的單株抗體及該抗體片段； (b) 含有包含序列編號1 8所表示之胺基酸序列的抗體之 156912.doc 201207397 VH，且含有包含序列編號2〇所表示之胺基酸序列的抗體 之VL的單株抗體及該抗體片段。 9· 一種單株抗體及該抗體片段，其與序列編號53所表示之 人類TIM-3之IgV區域之胺基酸序列中之第67號至第1〇5 號之胺基酸序列、第67號至第96號之胺基酸序列或第67 號至第87號之胺基酸序列結合。· 10. 如請求項1至9中任一項之抗體片段，其係選自Fab、 Fab·、F(ab，)2、單鏈抗體（scFv)、二聚化v區域 (diabody)、二硫鍵穩定化v區域（dsFv)及含有CDR之肽中 之抗體片段。 11. 一種DNA，其編碼請求項丨至10中任一項之單株抗體或 該抗體片段》 12. —種重組體載體，其含有請求項UiDNA。 13. —種轉形株，其係將請求項12之重組體載體導入宿主細 胞而獲得。 14. 一種請求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體片段之 製造方法，其係於培養基中培養請求項13之轉形株，使 請求項1至1.0中任一項之單株抗體或該抗體片段生成蓄 積於培養物中，再自培養物中採集該抗體或該抗體片 段。 15_ —種人類TIM-3之免疫學之檢測或測定方法，其使用請 求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體片段。 16. —種人類TIM-3之檢測或測定用試劑，其含有請求項1至 10中任一項之單株抗體或該抗體片段。 156912.doc 201207397 17· —種與人類TIM_3陽性細胞相關之疾病之診斷藥，其含 有請求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體片段。 18. —種與人類TIM-3陽性細胞相關之疾病之診斷方法，其 包括使用請求項H0中任一項之單株抗體或該抗體片 段而檢測或測定人類TIM-3陽性細胞。 19. 一種與人類TIM_3陽性細胞相關之疾病之診斷方法，其 包括使用請求項中任一項之單株抗體或該抗體片 段而檢測或測定人類TIM-3。 20· -種請求項中任一項之單株抗體或該抗體片段之 用途，其係、用於製造與人類謂_3陽性細胞相關之疾病 之診斷藥。 21. —種與人類ΤΙΜ·3陽性細胞相關之疾病之心療藥，其含 ： 有請求項1至1〇中任-項之單株抗體或該抗體片段。 22. 一種與人類丁 im_3陽性細胞相關之疾病之治療方法，其 匕括使用4求項1至1()中任一項之單株抗體或該抗體片 段而誘導人類TIM-3陽性細胞之細胞死亡。 23. 種明求項m中任一項之單株抗體或該抗體片段之 用途，其係用於製造與人類讀_3陽性細胞相關之疾病 之治療藥。 I56912.doc
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI618717B (zh) * 2014-11-06 2018-03-21 赫孚孟拉羅股份公司 抗ｔｉｍ３抗體及使用方法
TWI752950B (zh) * 2016-04-12 2022-01-21 丹麥商賽門弗鎭公司 抗tim-3抗體及組成物
TWI769174B (zh) * 2016-08-26 2022-07-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗tim-3抗體及其用途

Families Citing this family (284)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX340784B (es) 2006-03-15 2016-07-26 Alexion Pharma Inc Inhibidores de complemento para usarse en el tratamiento de pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna.
EP2271673B1 (en) * 2008-03-26 2016-02-24 Cellerant Therapeutics, Inc. Cytokine receptors associated with myelogenous haematological proliferative disorders and uses thereof
JP5748653B2 (ja) * 2009-04-10 2015-07-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ−３抗体を用いた血液腫瘍治療法
CA2769464C (en) * 2009-08-07 2017-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Humanized anti-amyloid-.beta. oligomer antibody
CN103079644B (zh) * 2010-06-11 2017-02-15 协和发酵麒麟株式会社 抗tim‑3抗体
ES2670874T3 (es) 2011-03-16 2018-06-01 Argenx Bvba Anticuerpos contra CD70
US8841418B2 (en) 2011-07-01 2014-09-23 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to TIM3
DK3409278T3 (da) 2011-07-21 2020-11-09 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology Inc Heterocykliske proteinkinaseinhibitorer
RS63930B1 (sr) 2011-10-28 2023-02-28 Prothena Biosciences Ltd Humanizovana antitela koja prepoznaju alfa-sinuklein
KR102086061B1 (ko) * 2012-01-27 2020-03-11 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 알파-시누클레인을 인식하는 인간화된 항체
CA2916638C (en) * 2012-07-31 2021-01-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of the immune response
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
PE20151893A1 (es) 2013-03-14 2015-12-30 Parkash Gill Tratamiento del cancer usando anticuerpos que se unen a grp78 en la superficie celular
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
CN104072615B (zh) * 2014-01-26 2016-08-24 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3融合蛋白
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
EP3925622A1 (en) 2014-09-13 2021-12-22 Novartis AG Combination therapies
CN107106687A (zh) 2014-10-03 2017-08-29 诺华股份有限公司 组合治疗
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
EP4245376A3 (en) 2014-10-14 2023-12-13 Novartis AG Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
SG11201703403TA (en) * 2014-10-27 2017-05-30 Agency Science Tech & Res Anti-tim-3 antibodies
GB201419094D0 (en) * 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-TIM-3-antibodies
WO2016073860A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Medimmune, Llc Binding molecules specific for staphylococcus protein a and uses thereof
SI3221355T1 (sl) 2014-11-20 2021-01-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirano zdravljenje z bispecifičnimi molekulami CD3, ki aktivirajo celice T in vežejo antigene in folatni receptor 1 (FoIR1) ter antagonisti za vezavo osi PD-1
EP3233918A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Novartis AG Combination therapies
US20160200815A1 (en) * 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3265486A4 (en) * 2015-03-06 2018-11-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind tim3
BR112017018908A2 (pt) 2015-03-10 2018-04-17 Aduro Biotech, Inc. composições e métodos para ativar a sinalização dependente do "estimulador do gene de interferon
MA41867A (fr) 2015-04-01 2018-02-06 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de cellule t et protéine 3 de mucine (tim-3)
TW201713332A (zh) 2015-07-14 2017-04-16 協和醱酵麒麟有限公司 包含與抗體組合投予之ｉｄｏ抑制物之腫瘤治療劑
AU2016291817A1 (en) 2015-07-16 2018-02-22 Biolinerx Ltd. Compositions and methods for treating cancer
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
DK3317301T3 (da) 2015-07-29 2021-06-28 Immutep Sas Kombinationsterapier omfattende antistofmolekyler mod lag-3
US11014983B2 (en) 2015-08-20 2021-05-25 Sutro Biopharma, Inc. Anti-Tim-3 antibodies, compositions comprising anti-Tim-3 antibodies and methods of making and using anti-Tim-3 antibodies
JP6653054B2 (ja) * 2015-09-17 2020-02-26 ナショナル キャンサー センター Ｔｉｍ−３をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法
US10947598B2 (en) 2015-09-29 2021-03-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods for determining the metabolic status of lymphomas
HUE055407T2 (hu) 2015-10-02 2021-11-29 Hoffmann La Roche PD1-re és TIM3-ra specifikus bispecifikus antitestek
BR112018008904A2 (pt) 2015-11-03 2018-11-27 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a tim-3 e seus usos
MX2018007423A (es) 2015-12-17 2018-11-09 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-1 y usos de las mismas.
ES2837155T3 (es) 2016-01-04 2021-06-29 Inst Nat Sante Rech Med Uso de PD-1 y Tim-3 como medida de células CD8+ para predecir y tratar el carcinoma de células renales
JP6993699B2 (ja) 2016-01-11 2022-02-03 ウニヴェルズィテート・ツューリヒ ヒトインターロイキン－２に対する免疫刺激性ヒト化モノクローナル抗体及びその融合タンパク質
ES2924775T3 (es) 2016-01-28 2022-10-10 Inst Nat Sante Rech Med Métodos y composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer
US10822415B2 (en) 2016-01-28 2020-11-03 Inserm (Institut National De La Santéet De La Recherche Médicale) Methods for enhancing the potency of the immune checkpoint inhibitors
EP3419999B1 (en) 2016-02-26 2021-08-04 (INSERM) Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity for btla and uses thereof
SG11201808909WA (en) 2016-04-13 2018-11-29 Vivia Biotech Sl Ex vivo bite-activated t cells
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US20190292259A1 (en) 2016-05-24 2019-09-26 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of non small cell lung cancer (nsclc) that coexists with chronic obstructive pulmonary disease (copd)
WO2017205721A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Agenus Inc. Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
AU2017283480A1 (en) 2016-06-13 2019-01-24 Torque Therapeutics, Inc. Methods and compositions for promoting immune cell function
WO2017214943A1 (zh) * 2016-06-16 2017-12-21 毛侃琅 促进 tim-3 基因表达的慢病毒表达载体及其应用
EP3471753A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
EP3507367A4 (en) 2016-07-05 2020-03-25 Aduro BioTech, Inc. CYCLIC DINUCLEOTID COMPOUNDS WITH INCLUDED NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF
PE20190418A1 (es) 2016-07-14 2019-03-19 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra proteina 3 que contiene el dominio de mucina e inmunoglobulina de linfocitos t (tim3) y sus usos
JOP20190013A1 (ar) 2016-08-25 2019-01-31 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ (تي آي ام -3)
WO2018046736A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from cancer
WO2018046738A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from cancer
EP3515453A1 (en) 2016-09-22 2019-07-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for reprograming immune environment in a subject in need thereof
AU2017331277A1 (en) 2016-09-23 2019-03-28 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains
EP3535586A4 (en) 2016-11-01 2020-08-05 AnaptysBio, Inc. ANTIBODIES DIRECTED AGAINST T CELL IMMUNOGUE LOBULIN AND MUCIN PROTEIN 3 (TIM-3)
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
JOP20190133A1 (ar) * 2016-12-08 2019-06-02 Innovent Biologics Suzhou Co Ltd أجسام مضادة لـ Tim-3 لمزجها بأجسام مضادة لـ PD-1
CN110023338A (zh) * 2016-12-08 2019-07-16 伊莱利利公司 用于与抗pd-l1抗体组合的抗tim-3抗体
CA3047508A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Virttu Biologics Limited Treatment of cancer
WO2018122249A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from a microsatellite stable colorectal cancer
WO2018122245A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting the survival time of patients suffering from cms3 colorectal cancer
JP7118073B2 (ja) 2017-01-09 2022-08-15 テサロ， インコーポレイテッド 抗ｔｉｍ－３抗体を用いてがんを処置する方法
WO2018146148A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A method for predicting the response to checkpoint blockade cancer immunotherapy
WO2018146128A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Detection of kit polymorphism for predicting the response to checkpoint blockade cancer immunotherapy
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3587452A4 (en) * 2017-02-27 2021-03-03 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ANTI-TIM-3 ANTIBODIES, ANTIGEN BINDING FRAGMENT OF IT, AND MEDICAL USES OF IT
US20210186982A1 (en) 2017-03-24 2021-06-24 Universite Nice Sophia Antipolis Methods and compositions for treating melanoma
HUE059885T2 (hu) 2017-04-03 2023-01-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-1 antitest immunkonjugátumai mutáns il-2-vel vagy il-15-tel
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
EA201992350A1 (ru) 2017-04-05 2020-03-23 Симфоген А/С Комбинированные лекарственные средства, нацеленные на pd-1, tim-3 и lag-3
WO2018195283A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
US20200385472A1 (en) 2017-04-28 2020-12-10 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof
AR111651A1 (es) 2017-04-28 2019-08-07 Novartis Ag Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
JP7090347B2 (ja) 2017-05-12 2022-06-24 ハープーン セラピューティクス，インク． メソテリン結合タンパク質
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2018223004A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3
EP3630839A1 (en) 2017-06-01 2020-04-08 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd 123 cd3
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
WO2018234367A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Institut Curie SUV39H1 HISTONE METHYLTRANSFERASE INHIBITOR FOR USE IN ANTICANCER POLYTHERAPY
CA3061874A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag Il-1beta binding antibodies for use in treating cancer
AU2018290237A1 (en) 2017-06-22 2020-01-16 Novartis Ag Antibody molecules to CD73 and uses thereof
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2018235056A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag IL-1BETA BINDING ANTIBODIES FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER
CA3066747A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof
CN111163798A (zh) 2017-07-20 2020-05-15 诺华股份有限公司 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途
EP3658173A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating monocytopoiesis
JP2021500916A (ja) * 2017-07-28 2021-01-14 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｉｍ−３抗体及びその使用
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11787859B2 (en) * 2017-08-28 2023-10-17 Bristol-Myers Squibb Company TIM-3 antagonists for the treatment and diagnosis of cancers
NZ761401A (en) 2017-08-31 2022-11-25 Io Therapeutics Inc Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
JP7196160B2 (ja) 2017-09-12 2022-12-26 スミトモ ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド Ｍｃｌ－１阻害剤アルボシジブを用いた、ｂｃｌ－２阻害剤に対して非感受性である癌の治療レジメン
US20210060158A1 (en) 2017-09-19 2021-03-04 Institut Curie Agonist of aryl hydrocarbon receptor for use in cancer combination therapy
WO2019077062A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Vivia Biotech, S.L. C-CELLS ACTIVATED BY BIT
EP3700933A1 (en) 2017-10-25 2020-09-02 Novartis AG Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
CN111315398A (zh) 2017-11-10 2020-06-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 白介素-10与免疫检查点途径抑制剂的组合的组合物和使用方法
US20200277378A1 (en) 2017-11-16 2020-09-03 Novartis Ag Combination therapies
EP3717907A1 (en) 2017-11-30 2020-10-07 Novartis AG Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
US20200377571A1 (en) 2017-12-08 2020-12-03 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
CN108794630A (zh) * 2017-12-18 2018-11-13 镇江爱必梦生物科技有限公司 鼠抗人tim3蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途
EP3735590A1 (en) 2018-01-04 2020-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
JP7358361B2 (ja) * 2018-01-12 2023-10-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
WO2019143607A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer with antibodies against tim3
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
CA3090249A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20200399383A1 (en) 2018-02-13 2020-12-24 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US20210080467A1 (en) 2018-02-21 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sk1 as biomarker for predicting response to immunecheckpoint inhibitors
US20200405853A1 (en) 2018-03-06 2020-12-31 Institut Curie Inhibitor of setdb1 histone methyltransferase for use in cancer combination therapy
EP3765085A1 (en) 2018-03-12 2021-01-20 Université de Paris Use of caloric restriction mimetics for potentiating chemo-immunotherapy for the treatment of cancers
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20210009711A1 (en) 2018-03-14 2021-01-14 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
CN110272489B (zh) * 2018-03-15 2023-08-22 上海健信生物医药科技有限公司 一种针对tim-3的全人源化抗体分子, 抗原结合片段及其医药用途
CN110305216B (zh) * 2018-03-20 2022-09-02 无锡智康弘义生物科技有限公司 新型抗tim-3抗体
WO2019179420A1 (en) * 2018-03-20 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel anti-tim-3 antibodies
CN111886256A (zh) 2018-03-23 2020-11-03 百时美施贵宝公司 抗mica和/或micb抗体及其用途
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
US11807683B2 (en) 2018-04-12 2023-11-07 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibody binding TIM-3 and use thereof
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
US20190365861A1 (en) 2018-04-18 2019-12-05 Xencor, Inc. Il-15/il-15ra heterodimeric fc fusion proteins and uses thereof
KR20210027254A (ko) * 2018-04-24 2021-03-10 앰프소스 바이오파마 상하이 인코포레이티드 Tim-3에 대한 항체 및 그의 용도
WO2019207030A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting a response with an immune checkpoint inhibitor in a patient suffering from a lung cancer
UY38247A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
CA3098420A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
CA3102256A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that bind cd123 and cd3
AU2019287765A1 (en) 2018-06-15 2021-01-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
EP3810189A1 (en) 2018-06-19 2021-04-28 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of il-10 agents in conjunction with chimeric antigen receptor cell therapy
TW202016145A (zh) * 2018-06-29 2020-05-01 財團法人生物技術開發中心 抗人類tim-3之人類化抗體及其用途
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
AU2019301944B2 (en) 2018-07-10 2022-02-24 Novartis Ag 3-(5-hydroxy-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and their use in the treatment of IKAROS Family Zinc Finger 2 (IKZF2)-dependent diseases
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
MX2020013428A (es) * 2018-08-21 2021-07-16 Albert Einstein College Of Medicine Anticuerpos monoclonales contra inmunoglobulina de celulas t y molecula que contiene dominio de mucina-3 (tim-3) humana.
EP3848049A4 (en) * 2018-08-28 2022-05-18 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND THEIR USE
KR20210070287A (ko) 2018-08-30 2021-06-14 에이치씨더블유 바이올로직스, 인크. 다중-사슬 키메라 폴리펩타이드 및 이의 용도
US11401324B2 (en) 2018-08-30 2022-08-02 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN113015744A (zh) 2018-08-30 2021-06-22 Hcw生物科技公司 单链嵌合多肽和多链嵌合多肽以及其用途
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
WO2020058372A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of cancers resistant to immune checkpoint therapy
CN113286817A (zh) 2018-09-25 2021-08-20 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
US20220242957A1 (en) 2018-09-27 2022-08-04 Marengo Therapeutics, Inc. Csf1r/ccr2 multispecific antibodies
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
WO2020070053A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of stress granule formation for targeting the regulation of immune responses
CN113195523A (zh) 2018-10-03 2021-07-30 Xencor股份有限公司 IL-12异源二聚体Fc融合蛋白
WO2020079164A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combination of a big-h3 antagonist and an immune checkpoint inhibitor for the treatment of solid tumor
CN110655566B (zh) * 2018-10-25 2021-06-18 浙江大学 可溶性Tim-3重组蛋白及其突变型蛋白的制备和应用
EP3883964A1 (en) 2018-11-20 2021-09-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bispecific antibody targeting transferrin receptor 1 and soluble antigen
WO2020104479A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers and resistant cancers with anti transferrin receptor 1 antibodies
EP3887823B1 (en) 2018-11-28 2024-01-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and kit for assaying lytic potential of immune effector cells
CN111253485A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 上海开拓者生物医药有限公司 抗人tim-3单克隆抗体及其应用
JP2022511029A (ja) 2018-12-04 2022-01-28 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド がんの処置のための薬剤としての使用のためのｃｄｋ９インヒビターおよびその多形
US20220018835A1 (en) 2018-12-07 2022-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of cd26 and cd39 as new phenotypic markers for assessing maturation of foxp3+ t cells and uses thereof for diagnostic purposes
WO2020115261A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2020120592A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating melanoma
WO2020119719A1 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Anti-tim-3 antibodies and uses thereof
WO2020127059A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sulconazole as a furin inhibitor
TW202038958A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
WO2020127411A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers by immuno-modulation using antibodies against cathespin-d
JP2022514280A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ノバルティス アーゲー Ｍｄｍ２阻害剤のための延長低用量レジメン
EP3897853A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and nkg2d antigen binding domains
CN113271945A (zh) 2018-12-20 2021-08-17 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案和药物组合
KR20210107730A (ko) 2018-12-21 2021-09-01 노파르티스 아게 골수 형성이상 증후군의 치료 또는 예방에서의 il-1 베타 항체의 용도
WO2020127885A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions for treating cancers and resistant cancers
CN113166762A (zh) 2018-12-21 2021-07-23 欧恩科斯欧公司 新的偶联核酸分子及其用途
US20230071889A1 (en) 2018-12-21 2023-03-09 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule
US20220025036A1 (en) 2018-12-21 2022-01-27 Novartis Ag Use of il-1beta binding antibodies
WO2020128637A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novartis Ag Use of il-1 binding antibodies in the treatment of a msi-h cancer
WO2020128620A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novartis Ag Use of il-1beta binding antibodies
AU2020205150A1 (en) 2019-01-03 2021-07-22 Assistance Publique-Hôpitaux De Paris (Aphp) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing CD8+ T cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
CN113508129A (zh) 2019-01-15 2021-10-15 法国国家健康和医学研究院 突变的白介素-34(il-34)多肽及其在治疗中的用途
JP7442536B2 (ja) 2019-01-30 2024-03-04 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ガンを患っている被験体が免疫チェックポイント阻害剤で反応を達成するかを特定するための方法及び組成物
US20220117911A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
US11471456B2 (en) 2019-02-12 2022-10-18 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Formulations comprising heterocyclic protein kinase inhibitors
EP3924520A1 (en) 2019-02-13 2021-12-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for selecting a cancer treatment in a subject suffering from cancer
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
JP2022520448A (ja) 2019-02-15 2022-03-30 ノバルティス アーゲー 置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
US11793802B2 (en) 2019-03-20 2023-10-24 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure
CA3133460A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising pkm2 modulators and methods of treatment using the same
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
EP3952850A1 (en) 2019-04-09 2022-02-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of sk2 inhibitors in combination with immune checkpoint blockade therapy for the treatment of cancer
EP3956446A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treatment of nlrp3 inflammasome mediated il-1beta dependent disorders
EP3963109A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
CN114174537A (zh) 2019-05-30 2022-03-11 百时美施贵宝公司 细胞定位特征和组合疗法
JP2022534982A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在化シグネチャーおよびその使用
JP2022534967A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 多腫瘍遺伝子シグネチャーおよびその使用
JP2022537054A (ja) 2019-06-21 2022-08-23 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 多鎖キメラポリペプチドおよびその使用
CN114729383A (zh) 2019-07-02 2022-07-08 弗莱德哈钦森癌症研究中心 重组ad35载体及相关基因疗法改进
MX2022000164A (es) 2019-07-03 2022-04-01 Sumitomo Pharma Oncology Inc Inhibidores de tirosina cinasa no receptora 1 (tnk1) y usos de los mismos.
CN110498855A (zh) * 2019-07-25 2019-11-26 钟小泉 一种tim-3抗体及其用途
CN110407938B (zh) * 2019-08-12 2020-03-06 北京昭衍生物技术有限公司 抗tim-3单克隆抗体、表达载体及其应用
WO2021048292A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
JP2022548627A (ja) 2019-09-16 2022-11-21 ノバルティス アーゲー 骨髄線維症の治療のための、高親和性のリガンドを遮断するヒト化抗ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ｔｉｍ－３）ｉｇｇ４抗体の使用
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
CN113166264B (zh) * 2019-09-19 2024-02-27 上药生物治疗（香港）有限公司 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
EP3800201A1 (en) 2019-10-01 2021-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd28h stimulation enhances nk cell killing activities
WO2021064180A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
US11851466B2 (en) 2019-10-03 2023-12-26 Xencor, Inc. Targeted IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
EP4037710A1 (en) 2019-10-04 2022-08-10 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of ovarian cancer, breast cancer or pancreatic cancer
EP4045686A1 (en) 2019-10-17 2022-08-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for diagnosing nasal intestinal type adenocarcinomas
CA3158298A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Novartis Ag Combination therapies with venetoclax and tim-3 inhibitors
KR20220087498A (ko) 2019-10-21 2022-06-24 노파르티스 아게 Tim-3 억제제 및 그의 용도
WO2021083959A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating uveal melanoma
JP2023500506A (ja) 2019-11-04 2023-01-06 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 癌を治療するための組み合わせ療法
WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
EP4076508A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and vaccine compositions to treat cancers
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
AU2021207348A1 (en) 2020-01-17 2022-08-11 Novartis Ag Combination comprising a TIM-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
EP4090770A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4100126A1 (en) 2020-02-05 2022-12-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for discontinuing a treatment with a tyrosine kinase inhibitor (tki)
WO2021163298A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of activating regulatory t cells
EP4103601A2 (en) 2020-02-11 2022-12-21 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
CN115362169A (zh) 2020-02-11 2022-11-18 Hcw生物科技公司 色谱树脂以及其用途
WO2021171264A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that binds cd123 and cd3
WO2021170777A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer
WO2021175191A1 (zh) * 2020-03-02 2021-09-10 信达生物制药(苏州)有限公司 抗tim-3抗体及其用途
CN115836087A (zh) 2020-04-29 2023-03-21 Hcw生物科技公司 抗cd26蛋白及其用途
EP4157460A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
AR122644A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Onxeo Nuevas moléculas de ácido nucleico conjugado y sus usos
IL298262A (en) 2020-06-23 2023-01-01 Novartis Ag A dosage regimen that includes derivatives of 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione
CA3184366A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Darby Rye Schmidt Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
EP4172628A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapy and radical surgery
JP2023531305A (ja) 2020-06-30 2023-07-21 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 術前補助療法後の固形癌患者の再発及び／又は死亡のリスクを予測するための方法。
US20230266332A1 (en) 2020-07-28 2023-08-24 Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherch Médicale) Methods and compositions for preventing and treating a cancer
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
AU2021333779A1 (en) 2020-08-26 2023-04-13 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting TRBC1 or TRBC2
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4204453A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and immunotherapy
EP4204020A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
CA3187272A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Thorsten Ross Trispecific binders
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
EP4240491A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2022101481A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
US20230416838A1 (en) 2020-11-16 2023-12-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
TW202237119A (zh) 2020-12-10 2022-10-01 美商住友製藥腫瘤公司 Ａｌｋ﹘５抑制劑和彼之用途
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2022146948A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
WO2022150788A2 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Synthekine, Inc. Compositions and methods related to receptor pairing
CN112979809B (zh) * 2021-02-24 2021-11-09 北京昭衍生物技术有限公司 一种与抗原tim-3结合的靶向分子
CN112961239B (zh) * 2021-02-24 2021-09-10 北京昭衍生物技术有限公司 Tim抑制剂及其应用
EP4308118A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating melanoma
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
KR20240005741A (ko) 2021-04-09 2024-01-12 오제 이뮈노테라프틱스 특성이 향상된 이작용성 분자용 신규한 스캐폴드
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
TW202309022A (zh) 2021-04-13 2023-03-01 美商努法倫特公司 用於治療具egfr突變之癌症之胺基取代雜環
EP4326903A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
KR20240026507A (ko) 2021-06-29 2024-02-28 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도
IL308154A (en) 2021-07-30 2023-12-01 Affimed Gmbh Double structure antibodies
WO2023078900A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
CN114934065A (zh) * 2021-11-25 2022-08-23 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司 携带免疫检查点分子tim-3抗体基因的溶瘤腺病毒构建方法和应用
WO2023111203A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Onxeo New conjugated nucleic acid molecules and their uses
WO2023118165A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2023168363A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 HCW Biologics, Inc. Method of treating pancreatic cancer
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
WO2024033399A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sigmar1 ligand for the treatment of pancreatic cancer
WO2024033400A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Sk2 inhibitor for the treatment of pancreatic cancer
WO2024052356A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitors of the ceramide metabolic pathway for overcoming immunotherapy resistance in cancer
WO2024056716A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of dilated cardiomyopathy
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5623587A (en) 1979-08-03 1981-03-05 Mitsuwa Seiki Co Ltd Vane type compressor
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
WO1985003934A1 (en) 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
JP2564268B2 (ja) 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
JP2958019B2 (ja) 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
DE69434749T2 (de) 1993-03-29 2007-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alpha-1,3-Fucosyltransferase
US6066322A (en) 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
AU690474B2 (en) 1995-09-11 1998-04-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody againts alpha-chain of human interleukin 5 receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270147T4 (da) 1999-04-09 2020-08-31 Kyowa Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1467759A4 (en) 2002-01-30 2006-05-31 Brigham & Womens Hospital COMPOSITIONS AND METHODS ASSOCIATED WITH TIM-3, TH1-SPECIFIC CELL SURFACE MOLECULE
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
CN101035561A (zh) * 2004-03-24 2007-09-12 特罗斯药品公司 作为改善对疫苗的免疫反应的佐剂的组合物和使用方法
EA200601761A1 (ru) * 2004-03-24 2007-06-29 Телос Фармасьютикалз, Инк. Композиции в качестве адъювантов для усиления иммунных ответов на вакцины и способы их применения
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
WO2008060617A2 (en) * 2006-11-15 2008-05-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic uses of tim-3 modulators
CA2711557A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 The University Of Tokyo Anti-cldn6 antibody
CA3221018A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Ravindra Majeti Markers of acute myeloid leukemia stem cells
JP5748653B2 (ja) 2009-04-10 2015-07-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ−３抗体を用いた血液腫瘍治療法
CN103079644B (zh) * 2010-06-11 2017-02-15 协和发酵麒麟株式会社 抗tim‑3抗体

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI618717B (zh) * 2014-11-06 2018-03-21 赫孚孟拉羅股份公司 抗ｔｉｍ３抗體及使用方法
TWI752950B (zh) * 2016-04-12 2022-01-21 丹麥商賽門弗鎭公司 抗tim-3抗體及組成物
TWI769174B (zh) * 2016-08-26 2022-07-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗tim-3抗體及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130132695A (ko) 2013-12-05
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US8552156B2 (en) 2013-10-08
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CN103079644B (zh) 2017-02-15
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WO2011155607A1 (ja) 2011-12-15
EP2581113B1 (en) 2018-05-09

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