PT79261B

PT79261B - A method of genetically modifying a plant cell for obtaining insect resistant plants

Info

Publication number: PT79261B
Application number: PT79261A
Authority: PT
Original assignee: Agrigenetics Res Ass
Priority date: 1983-09-26
Filing date: 1984-09-24
Publication date: 1986-08-28
Also published as: ES8506418A1; AU3347384A; EP0142924A2; ATE74962T1; AU574101B2; BR8404834A; PT79261A; JP2004000239A; EP0142924A3; ES536196A0; JPS6094041A; DE3485655D1; JP2002159230A; ZA847509B; NZ209657A; CA1341622C; MX26440A; EP0142924B1

Description

Descrição do objecto do invento que

AGRIGENETICS RESEARCH ASSOCIATES LIMITED, norte-americana, industrial, com sede em 3375 Mitchell Lane, Boulder, Colorado, 80301 -2244, Estados Unidos da América, pretende obter em Portugal, para PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTE UMA CÉLULA VEGETAL DE MODO A OBTEREM-SE PLANTAS RESISTENTES A INSECTOS”

0 presente invento refere-se a um processo para modificar, genèticamente uma célula vegetal de modo a obterem-se plantas resistentes a insectos, situando-se assim nas áreas da engenharia genética, da agricultura e dos sistemas para a obtenção de compostos bacterianos bio-afectantes especialmente os derivados do género Bacillus.

0 Bacillus thuringiensis, uma espécie de bactéria-intimamente relacionada com B. cereus, forma uma inclusão cristalina proteica durante a esporulação. Este cristal é para-esporal, formando-se dentro da célula na extremidade oposta ao esporo em desenvolvimento. A proteína cristalina, frequentemente denominada ó-endotoxina,-possui duas formas: uma protoxina não tóxica com pêso molecular (PM) de aproximadamente 130 quilodaltons (KD), e uma toxina com um PM de aproximadamente 67 KD. 0 cristal contém a protei na de protoxina que é activada nos intestinos de larvas de

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um certo número de espécies de lnsectos. M.J. Klowden et al. (1983) Appl. Envir. Microbiol. 46;312-315demonstrou que a protoxina solubilizada do B. thuringiensis var. israelaneis é tóxica para os Aedes aegyptl adultos. Durante a activação, a protoxina é clivada em dois polipeptidos, dos quais um ou ambos são tóxicos. In vivo, o cristal é activado ao ser solubilizado e convertido em forma tóxica pela alcalinidade e protéases do intestino. In vitro, a protoxina pode ser solubilizada por um pH extremamente elevado (p. ex. pH 12) por agentes redutores sob condições moderadamente básicas (p. ex., - pH 10), ou por desnaturantes far tes (guanidium, ureia), sob condições neutras (pH 7) e, uma vez solubilizada, pode ser activada pela acção da tripsina da protease. Tem sido relatado que a proteína cristalina se relaciona antigenicamente com proteínas tanto dentro do tegumento do esporo como da parede da célula vegetativa.

Os hidratos de carbono não estão envolvidos nas propriedades tóxicas da proteína.

0 B. thuringiensis ea sua endotoxina cristalina são úteis porque o cristal proteico e uma proteína insecticida reconhecidamente venenosa para as larvas de mais de uma cen tena de espécies de lnsectos, nomeadamente os das ordens dos Lepidopteros e Dlpteros. Os lnsectos susceptíveis á acção da proteína cristalina do B. thuringiensis incluem, sem porem se limitarem a eles os relacionados na Tabela 1. Muitas dessas espécies de lnsectos são pragas economicamente importantes. As plantas que podem ser protegidas pela aplicação da proteína cristalina incluem, sem porém se limitarem a elas as relacionadas na Tabela 2. Diferentes variedades de B. thuringiensis, que incluem, sem porém se limitarem a elas as relacionadas na Tabela 3, têm diferentes gamas de hospedeiros (R. N. Faust et al. (1982) in Genetlc Englneerlng in the Plant Sciences, ed. N. J. Panapopous,

pp, 225-254); provávelmente isto reflecte a toxicidade de uma da proteína cristalina num determinado hospedeiro.

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0 cristal proteico é altamente especifico quanto aos ihsectos; em mais de duas décadas de aplicação comercial de células esporuladas de B. thurlnglensls a safras e plantas or namentais não tem havido nenhum caso conhecido de efeitos sobre plantas ou animais que não sejam insectos. A eficácia e segurança da endotoxina foram revistas por R. M. Faast et al., supra. Outras revisões úteis incluem as de P.G. Fast (1981) in Mlcroblal Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980, ed. : H. D. Burges, pp. 223-248, e Η. E. Huber & P. Luthy (I98I) in Pathogenesls of Invertebrate Mlcroblal Diseases, ed. : E. W. Davidson, pp. 209-234.

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A presença do gene da proteina cristalina pode geral mente verificar-se num de vários grandes plasmidios que tem sido encontrados no Bacillus thurlnglensls, apesar de em algumas variedades o mesmo poder ser encontrado no cromossoma (J. W. Kronstad et al. (1983) J· Bacteriol. lj?4s 419-428). Vários dos genes foram clonados em plasmidios que podem crescer no E. coli. 0 grupo de Whiteley (H. R. Whiteley et al. (1982) in Molecular Clonlng and Gene Regulatlon in Bacllll, ed, ! A.T. Ganesan et al., pp. 131-144, Η. E. Schelf & H. R. Whiteley (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA $£893-2857e pedido de patente europeu 63.949) relataram a clonagem da toxina do B. thurlnglensls, variedade Kurstaki estirpes Ηΰ-1-Dipel e HD-73, usando as enzimas Sau3AI (sob condições de digestão parcial) e BglII, respectivamente, para inserir grandes fragmentos portadores de genes, com as dimensões aproximadas de 12 Kbp e 16 Kbp, no local BamHI do vector de plasmídio pBR322 do E. coli. Observou-se que a proteina cristalina HD-1 estava localizada num fragmento HindIII de 6,6 quilobase par(kpb). A proteina cristalina do gene HD-l-Dipel que era tóxica para as larvas, imunológicamente identificável, e do mesmo tamanho que a protoxina autentica, foi observada a ser produzida por células de E. coli transformadas que continham clones ou sub-clones pBR322. Isto indicava que o gene do Bacillus era transcri-355.71P

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to, provávelmente pelo seu proprio promotor, e traduzido em E. coli. Adicionalmente, isto sugere que a actividade tóxica do produto da proteína é independente da localização de sua síntese. 0 facto de o gene se expressar quando o fragmento que o continha era inserido no vector em qualquer uma das orientações, sugere que a transcrição era controlada pelo seu proprio promotor. Os loci de partida transcritios e.translativos bem como a sequência deduzida para os aminoácidos de terminal amino 333 da protoxina HD-1-Dipel, foram determinados pela sequenciação do ácido nucléico (H. C. Wong et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:1960-I967). 0 gene insecticida revelou possuir os esperados

pontos de fixação do ribossoma bacteriano e translativo de partida (ATG), juntamente com sequências geralmente encontradas em -10 e -35 (relativamente à extremidade 5’ do mRNA) que estão envolvidas, no inicio da transcrição, em bactérias tais como B. subtil!s. A Klier et al. (1982) EMBO J. 1: 791-799, comunicaram a clonagem do gene da proteína cristalina do B. thurlngiensis, estirpe berllner 1715 em pBR322. Usando a enzima BamHI, um grande fragmento de 14 Kbp contendo gene da proteína cristalina foi intro duzido no vector pHV33, que pode reproduzir-se nos E. coli e Baclllus. Em ambos, E. coli β B. subtilis esporulante, o clone baseado em pHV33 dirigiu a síntese de protoxina de dimensão integral (I30 KD) que formou corpos de inclusão cito plasmatica e reagiu com anticorpos preparados contra a protoxina autêntica. Extractos de células de E. coli por tadores dos plasmidios baseados em pBR322 ou pHV33 foram tó xicos para as larvas. Em trabalho adicional, A. Klier et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 3973-398?, transcreverem o gene de proteína cristalina do berllner, In vitro e relataram a sequência da região promotora, juntamente com os 11 primeiros codãos da proteína cristalina. Os loci de partida de aderência e translativos do ribossoma bacteriano foram identificados. Apesar de ter sido identificada a esperada sequência "-10", não foi vista no entanto homologia

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com outros promotores, próxima de -35· Held et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77/6065-6069 relataram a clonagem de um gene de proteína cristalina da variedade Kurstakl no vector de clonagem baseada no fagócitoACharon4A. Células de B. coli infectadas com um dos clones Charon produziranjãntigenio que era de dimensão igual à da protoxina (I30 KD) e era tóxico para as larvas. Um fragmento BcoRI de 4,6 Kpb deste clone Charon foi introduzido em pHV33 ® num vector de plasmidio de E. coli, pBR328. Novamente,foi produzida proteina cristalina antigénioamente identificável de I30 KD por estirpes de E. coli e B. subtills, que apresentavam ambos plasmidios apropriados. Uma sequência cromos somica de B. thurlngiensls que teve hibridização cruzada com o gene cionado de proteína cristalina foi identificada em estirpes de B. thurlngiensls que não produzem proteína cristalina durante a esporulação.

Além da proteína cristalina, o B. thurlngiensls produz pelo menos tres outras toxinas. Duas das mesmas, a «4-exotoxina e a*f -exotoxina, são enzimas de fosfolipase que degradam lipidos. Sabe-se também que o B. cereus também produz fosfolipases (ou lecitinases) que são toxicas para larvas de insectos. Outras enzimas bacterianas que estão envolvidas na patogénese de insectos incluem, não se limitando porem a elas hialuronidases, fosfatases, e proteases.

A protease produzida pelo Pseudomonas aeruglnosa tem demons trado possuir uma afinidade específica por proteínas de lar vas de Gallerla mellonella (vide 0. Lysenko & M. Kucera (1971) in Mlcroblal Cont rol of Insects and Mites.eds.; H:D. Burges & N. W. Hussey, pp. 205-227).

Vectores de Transporte

Os vectores de transporte, desenvolvidos por G.B. Ruvkun e F. M. Ausubel (1981) Nature 298:85-88, fornecem um mo

do de inserir materiais genéticos estranhos na posição es-

►β-eo — xa οοοε — te. -aow

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colhida, num grande plasmidio virus ou genoma. Dois grandes problemas surgem ao lidar-se com grandes plasmidios ou genomas. Em primeiro lugar, os grandes plasmidios podem ter muitos locais para cada enzima de restrição. As reações singulares de clivagem localizada específicas não são repro duzíveis e as reacções de clivagem em locais múltiplos, seguidas de fixação, levam a grandes dificuldades devidas à mistura dos muitos fragmentos cuja ordem e orientação não se deseja alterar. Em segundo lugar, a eficiência da trans formação com grandes plasmidios de DNA é muito baixa. Os vectores de transporte permitem superar essas dificuldades ao facilitarem a inserção, frequentemente in vitro., do material genético estranho num plasmidio menor, transferindo en tão geralmente por técnicas in vivo, para o plasmidio maion

Um vector de transporte consiste numa molécula de DNA, geralmente um plasmidio, capaz de ser introduzida na bactéria receptora final. 0 mesmo inclui também uma cópia do fragmento do genoma receptor, no qual o material genético deve ser inserido, e um código segmentar de DNA para uma caracteristica seleccionável, que é também inserida no frag mento de genoma receptora. A caracteristica seleccionável ("marcador”) é convenientemente inserida por mutagenese de transposons ou por enzimas restritivas e llgases.

0 vector de transporte pode ser introduzido na célula receptora final, tipicamente uma bactéria da familia Rhizobiaceae (que contém o genero Agrobacterlum), por uma união tripla (Ruvkin & Ausubel, supra), transferencia directa de um vector autó-mobilizado numa união dupla, tomada directa de DNA exógeno por células de Agrobacterlum ("transformação", usando as condições de M.Holsters et al. (1978) Molec. Gen. Genet. 163:181-187). por fusão de esferoplastos de Agrobacterlum com outra célula bacteriana, por absorção de DNa encapsulado em lipossoma, ou infecção com ura vector de transporte que seja baseado num vírus capaz de ser embalado

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in vitro. Uma união tripla envolve a união de uma estirpe contendo um plasmidio mobilizável, que contém genes para mobilização do plasmidio e transferência conjugativa, com a estirpe que contém o vector de transporte. Se o vector de transporte puder ser mobilizado pelos genes do plasmidio o vector de transporte é transferido para a célula receptora que contém o grande genoma, por exemplo, os plasmidios Ti ou Ri das estirpes de Agrobacterium.

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Após o vector de transporte ser introduzido na célula receptora possíveis ocurrências incluem um duplo cruzamento com uma ocorrência de recombinação em qualquer dos lados do marcador. Esta ocorrência resultará em transferencia de um segmento de DNA contendo o marcador para o genoma receptor, substituindo um segmento homólogo carente da inserção.

Para selecionar células que tenham perdido o vector de transporte original, o vector de transporte deve ser incapaz de reproduzir-se na célula hospedeira final ou ser imcompativel com um plasmidio independentemente selecionável, pré-existente na célula receptora. Um meio comum de conseguir isto é proporcionar no terceiro genitor um outro plasmidio que seja incompatível com o vector de transporte e que contem um diferente marcador de resistência á droga. Portanto, quando se faz uma selecção para resistência a ambas as drogas, as únicas células sobreviventes são aquelas nas quais o marcador no vector de transporte se tenha recom binado com o genoma receptor. Se o vector de transporte contiver um marcador extra, pode-se então separar e descartar células que contém plasmidios resultantes de uma só ocorrência de cruzamento entre o vector de transporte e o plasmidio receptor, resultando em conglomerados nos quais todo o vector de transporte está integrado no plasmidio receptor. Se o material genético estranho estiver inserido no, ou adjacente ao marcador seleccionado, o mesmo será tam bém integrado no plasmidio receptor como resultado da mesma dupla recombinação. Ele poderia também ser transportado

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conjuntamente quando inserido no fragmento homólogo num ponto que não esteja dentro do, ou adjacente ao marcador, porém, quanto maior a distância que separe o material genético estranho do marcador, tanto mais provável será a ocorrência de uma recombinação entre 0 material genético estranho e 0 marcador, impedindo a transferencia do material genético estranho.

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Se 0 vector de transporte for usado para introduzir uma caracteristica fenotipicamente dominante (por exemplo, um novo gene estrutural insecticida expressável, porém não um gene de T-DNA oncogénico inactivo), não é necessário depender de uma recombinação homóloga dupla. As células resultantes de uma única ocorrência de cruzamento que resulta em plasmidios conjugados podem transferir a caracteristica desejada para o interior de células de plantas. Pode-se mes mo usar uma variante de vector de transporte com uma única sequência ininterrupta de T-DNA. Contudo, como o T-DNA resultante terá agora uma duplicação em par, deve-se estar vi gilante em relação a um possivel raro supressão do vector de transporte pela ocorrência de um efeito de recombinação homólogo único entre as duas sequências homólogas em qualquer elemento dentre o Agrobacterium e as células da planta.

Os vectores de transporte têm demonstrado ser úteis na manipulação de plasmidios de Agrobacterium; vide D. J. Garfinkel et al. (1981) Cell 27:143-153, A. J. M. Matzke & M. D. Chilton (I98I) J. Molee. Appl. Genet. 1:39-4-9, 0 J.Leemans et al. (1981) J. Molee. Appl. Genet. 1:149-164, os quais se referiram aos vectores de transporte pelo termo "vectores intermediários”.

Uma variação recentemente divulgado do sistema de vector de transporte para inserir alterações em grandes moléculas de DNA é 0 "vector suicida". Neste sistema, conforme é descrito por A. Puhler et al. Pedido dos E.U.A. N® de série 5IG.37G β R. Simon et al. (IO83) no prelo, 0 vector de

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transporte não pode ser mantido dentro da célula receptora. Ssta propriedade elimina a necessidade de introduzir um plasmidio incompatível na célula receptora para excluir o vector de transporte, como é comumente feito durante uma união tripla. Todos os vectores que não se integram nalgun DNA já presente efectivamente "cometem suicídio’’ ao não se replicarem· Como com os tipos tradicionais de vectores de transporte, pode-se distinguir entre homólogos duplos ou simples separados por um gene de resistência a antibióticos que não se situe entre as duas regiões de homologia. 0 uso de um vector suicida baseado em pBR322 para transferir sequências de DNA para dentro de um plasmidio Ti foi relatado por E. Van Haoute et al. (1983) SMB0 J. 2:411-417, e L. Cornai et al. (1982) Plant Molec. Biol. 1:291-300.

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Uma alternativa para o uso de vectores de transporte para a introdução de novas sequências de DNA dentro de T-DNA por meio de recombinação homóloga envolve os transposons bacterianos. Conforme descrito na secção Genes de Agrobacterium nos Plasmidios TIP, os transposons podem "pular” para dentro do T-DNA de um plasmidio TIP vide por exora pio, D. J. Garfinkel et al. (1981) Ce11 27:143-153). Caso o transposon seja modificado in vitro pela inserção da nova sequência, aquele novo DNA pode ser transfrido para dentro do T-DNA do plasmidio TIP pelo transposon. 0 TIP pode então transferir a nova combinação DNA transposon T-DNA para uma célula de planta quando o mesmo estiver estavelmente integrado.

Incluídas na farailia bacteriana gram-negativa Rhizobiaceae no género Agrobacterium estão as espécies A. tumefaciens e A. rhizogenes. Essas espécies são, respectivamente, os agentes causadores da doença do bugalho e da doença das raízes fibrosas nas plantas. A doença do bugalho é caracterizado pelo crescimento de um bugalho de tecido não diferenciado. A raiz fibrosa é um teratoma caracterizado pela indução inadequada de raízes no tecido infectado.

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Em ambas as doenças, o tecido vegetal impropriamente desenvolvido produz um ou mais derivados de aminoácidos, conheci dos como opinas, não produzidos normalmente pela planta, que são catabolizados pela bactéria infectante. As opinas conhecidas tem sido classificadas em tres famílias principais cujos membros-tipo são a octopina, a nopalina e a agro pina. As células de tecidos com crescimento inadequado podem ser desenvolvidas em cultura e, sob condições apropriadas, ser regeneradas em plantas completas que retêm certos fenotipos transformados.

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Estirpes virulentas de Agrobac ter lutn grandes plasmldios conhecidos por plasmidios II (indutores de tumor) no A. tumefaciens e plasmidios Ri (indutores de raizes) no A. rhizogenes. A cura de uma estirpe desses plasmidios resulta numa perda de patogenia. 0 plasmidio Ti comtém uma região, denominada T-DNA (DNA transferido) que nos tumores, se verifica estar integrado no genoma da planta hospedeira. 0 T-DNA codifica várias transcrições. Estudos mutacionais tem demonstrado que algumas dessas estão envolvidas na indução de crescimento tumoroso. Mutantes nos genes para tml, tmr, e tms, resultam respectivamente em grandes tumores (no tabaco), numa propensão para gerar raízes e numa tenden cia para a indução de ramificações. 0 T-DNA também codifica um gene de pelo menos uma sintese de opina, e os plasmidios Ti são frequentemente classificados pela opina cuja sintese eles provocaram. Cada um dos genes de T-DNA está sob o controle de um promotor de T-DNA. Os promotores de Τ-DNa assemelham-se na sua estrutura a promotores eucariéticos, e parecem funcionar apenas na célula vegetal transformada. 0 plasmidio Ti também contem genes fora da região do T-DNA. Esses genes estão envolvidos em funções que incluem o catabolismo da opina, oncogenia, sensibilidade á agrocina, replicação, e auto-transferência para as células bacterlanas. 0 plasmidio Ri está organizado de um modo anã logo ao plasmidio Ti. 0 conjunto de genes e sequências de

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DNA responsáveis pela transformação da célula vegetai é doravante denominado colectivamente como o principio indutor de transformação (TIP). A designação TIP inclui, portanto, ambos os plasmidios Ti e Ri. 0 segmento integrado de um TIP e aqui denominado "T-DNA” (DNA transferido), quer seja derivado de um plasmidio Ti ou de um plasmidlo Ri.

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M,. D, Chilton (Junho de 1983) Sei. amer. 248(6): 50-59, apresentou recentemente um artigo introdutório sobre 0 uso dos plasmidios Ti como vectores. Recentes revisões gerais sobre doenças causadas pelo Agrobacterium incluem as de D. J. Merlo (19θ2). Adv. Plant Pathol. 1:139-178, D. W. Ream & Μ. P, Gordon (1982), Science 218:854 859, β M.W. Bevan & M.-D. Chilton (1982), Ann. Rev. Genet. ΐ6:357-3θ4·;

G. Kahl & J. Schell (1982) Molecular Blology of Plant Tumor s, β K. A. Barton & M. -D. Chilton (1983) Met. Enzymol. 101:527-539.

Infecção de Tecidos Vegetais pelo Agrobacterium

As células vegetais podem ser transformadas pelo Agrobacterium através de um certo número de métodos conhecidos da técnica que incluem, não se limitando a eles a cultura conjunta de células vegetais com o Agrobacterium, infecção directa de uma planta, fusão de protoplastos de planta com esferoplastos de Agrobacterium, transformação directa pela absorção de DNA livre pelos protoplastos de células vegetais, transformação de protoplastos, com paredes celulares parcialmente regenaradas pela transformação de protoplastos por bactérias intactas, por lipossomas contendo T-DNA,

0 uso de um virus para conter o T-DNA, micro-injecção, e semelhantes. Qualquer método será suficiente desde que o gene seja expresso fielmente, e seja transmitido estavelmente através de mitose e meloso.

A infecção de tecido vegetal pelo Agrobacterium é uma

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técnica simples, bem conhecida dos especialistas da arte (como exemplo, vide D. N. Butcher et al. (19θθ) in Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingram & J. P. Helgeson, pp. 203-208). Tipicamente, uma planta é ferida por qualquer um dentre um certo número de modos, que incluem o corte com uma navalha, perfuração com uma agulha, ou friccionamento com um abrasivo. 0 ferimento é então ino culado com uma solução contendo bactérias indutoras de tumores. Uma alternativa à infecção de plantas intactas é a inoculação de pedaços de tecidos tais como discos de tubérculos de batatas (D. K, Anand &. G. T. Heberlein (1977) Amer. J. Bot. 64: 153-158) ou segmentos de hastes de tabaco (K.A. Barton, et al. (1983) Ce11 32:1033-1043). Após a indução, os tumores podem ser colocados em cultura de tecido, em meios carentes de fito-hormona. 0 crescimento independente de hormóni é tipico do tecido vegetal transformado e está em grande contraste com as condições usuais de crescimento de tal tecido em cultura (A. C. Braun (1956) Câncer Res. 16:53-56).

⁰ Agrobacterlum também é capaz de infeccionar células isoladas e células criadas em cultura (L. Marton et al. (1979) Nature 277:129-131). e protoplastos mesófilos do tabaco. Nesta última técnica, após se dar algum tempo para a regeneração parcial de novas paredes celulares, as células do Agrobacterlum foram acrescentadas à cultura durante um certo periodo sendo então mortas pela adição de antibióticos. Apenas as células expostas às células de A.tumefacien^sontendo o plasmidio Ti foram capazes de formar calos ao serem colocadas em meios carentes de hormónio. A maioria dos calos demonstrou conter uma actividade enzimática envol vida no anabolismo da opina. Outros pesquisadores (R.B.Hor sch & R. T. Fraley (18 de Janeiro de 1983) I5th Miami Winter Symposium) relataram transformações pela cultura conjun ta que conduziu a uma elevada taxa (maior que 10$6) de calos que apresentavam crescimento independente de hormónio com 95$ desses calos produzindo opinas. M. R. Davey et al.

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(1980) in Ingram & Helgeson, supra, pp. 209-219, descrevem a infecção de células mais antigas que haviam sido regeneradas de protoplastos.

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Os protoplastos de plantas podem ser transformados pela tomada directa de plasmidios TIP. M. R. Davey et al. (1980) Plant Sei. Lett. 18:307-313, θ M. R. Davey et al. (1980) in Ingram & Helgeson, supra, conseguiram transformar protoplastos com o plasmidio Ti na presença de poli-L-<Áornitina num fenotipo de sintese de opina e de crescimento hormonal independente em cultura. Foi subsequentemente demonstrado (J. Draper et al. (1982) Plant and Cell Physiol. 23:451-458, M. R. Davey et al. (1982) in Plant Tissue Culture 19θ2, ed: A. Fujiwara, pp. 515-516) que o polietileno glicol estimulava a absorção de plasmidio Ti e que algumas sequências de T-DNA eram integradas no genoma. F. A.Krens et al. (1982) Nature 296:72-74, relataram resultados similares usando polietileno glicol seguido de um choque com cálcio, apesar de os seus dados sugerirem que 0 T-DNA integrado incluia sequências laterais de plasmidio Ti.

Um método alternativo para se conseguir a absorção de DNA envolve a uso de lipossomas. A preparação de lipossomas contendo DNA e ensinada por Papahadjopoulos nas Patentes dos EUA 4.078.052 e 4.235.871· Preparados para a intro dução de Ti-DNA através de lipossomas tem sido relatados (T Nagata et al. (1982) in Fujiwara, supra, pp. 509-510, β T. Nagata (I98I) Mol. Gen. Genet. 184;161-165). Um sistema análogo envolve a fusão de células vegetais e bactéria nas após a remoção das suas paredes celulares. Um exemplo desta técnica é a transformação de protoplastos de Vinca por esferoplastos de Agrobacterium, relatada por S.Haswzawa et al. (I98I) Mol. Gen. Genet. 182:206-210. Os protopLastos de plantas podem absorver células de Agrobacterium delimitadas por parede celular (S. Hasezawa et al (1982) in Fujiwara, supra pp. 517-518).

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0 T-DNA pode ser transmitido ao tecido regenerado de uma fusão de dois protoplastos, dos quais apenas um foi transformado (G. J. Wullems et al. (1980) Theor. Appl. Genet. 56:203-208). Conforme detalhado na secção sobre Regeneração de Plantas, o T-DNA pode passar através da meiose e ser transmitido à progénie como uma simples característica Mondeliana.

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Agrobacterium—Regeneração de Plantas

Tecidos vegetais diferenciados com morfologia normal tem sido obtidos de tumores de bugalho. A. C. Braun & H.

N. Wood (1976) Proc. Natl. Acad. Scii USA 73:496-500* implantaram teratomas de tabaco em plantas normais e consegui ram obter ramificações de aparência normal que podiam florescer. As ramificações retiveram a capacidade de produzir opinas e crescer independentemente de fito hormónios quando colocadas em cultura. Nas plantas estudadas, não se observou que estes fenotipos tumorosos fossem transmitidos à pro génie, perdendo-se aparentemente, durante a meiose (R. Turgeon et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73:3562^3564 As plantas que haviam espontaneamente perdido as propriedades tumorosas, ou que eram derivadas de semente de teratoma demonstraram inicialmente ter perdido todo o seu T-DNA F. -M. Yang et al. (1980) In Vitro 16:87-92; F. Yang et al. (1980). Mole. Gen. Genet. 177»707-714, M. Lemmers et al. (1980) J. Mol. Biol. 144:353-376). Contudo, trabalhos subsequentes com plantas que haviam revertido após tratamento hormonal (1 mg/l de cinetina) mostraram que as plantas que haviam passado por meio se, apesar de haverem perdido os genes de T-DNA responsáveis pelo fenotipo transformado, poderiam reter sequências homólogas a ambas as extremidades do T-DNA (F. Yang e R. B. Simpson (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 28:4151-4155). Adicionalraente G. J. Wullems et al (I98I) Cell 24:719-724, demonstraram que os genes envolvidos no anabolismo da opina eram capazes de passar através

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da meloso, mesmo se as plantas fossem machos estéreis e que o T-DNA aparentemente inalterado pudesse ser herdado de maneira Mendeliana (G. Wullems et al. (1982) in Fujiwara, supra) L. Otten et al. (1981) Molee. Gen. Genet: 183:209-213, utilizou mutantes de plasmidio Ti gerados pelo transposon Tn7 no local tms (indutor de ramificações) para criar tumoree que proliferavam ramificações. Quando essas ramificações foranyregeneradas em plantas, demonstraram originar flores auto-fertilizadas. As sementes resultantes germinaram em plantas que continham T-DNA e produziam opinas. Em experiências subsequentes, H. DeGreve et al. (I982) Nature 300:752-755 descobriram que a sintase de octopina pode ser herdada como um único gene Mendeliano dominante. Contudo, o T-DNA sofrerá extensa supressão de funções que não a ocs, ao passar pela regeneração a partir do calo. Experiências similares com um mutante tmr (indutor de raízes) mostraram que um T-DNA de comprimento integral poderia ser transmitido à progénie através de meiose, que, nessa progénie poderiam estar expressos genes de nopalina, apeser de a níveis variados e que o gene I co-transformado de dehidrogenase de álcool de levedo não estava expresso (K. A. Barton et al. (1983) Cell ^2:1033-1043). Parece agora que os tecidos regenerados que carecem de sequências de T-DNA descendem provávelmente de células não transformadas que "contaminam” o tumor (G. Ooms et al.(1982) Cell 30:5θ9-597). Um recente trabalho de A. N. Binns (1983) Planta 1^8:272-279, indica que os genes tumoro génlcos, nes te caso tmr, podem ser "desligados" durante a regeneração e "religados" ao colocar-se o tecido regenerado em cultura.

As raízes resultantes da transformação de A. rhlzogenes tem demonstrado ser relativamente fáceis de regenerar directamente em plantinhas (M.-D. Chllton et al. (1982) Nature 225:432-434.

Genes de Agrobacterium nos Plasmidlos TIP

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Um certo número de genes tem sido identificado dentro do T-DNA dos plasmidios TIP. Cerca de meia dúzia de transcrições do T-DNA de plasmidios de oetipina foram inventariais (S. B. Gelvin et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei USA 22:76-80, L. Willmitzer et al. (1982) BMBO J. 1:139-146) e algumas funções indicadas (J Leeraans et al. (1982) EMBO J. 1:147-152). Algumas dessas transcrições, especialmente as da região .com as codificações tmr e tms, podem também ser transcritas em células procarióticas (G. Schrõder et al (19θ3) EMBO J. 2:403-409). Os quatro genes de um plasmidio do tipo octopina que foram bem definidos por mutagénese do transposon incluem tms, tmr, e tml (D. J. Garfinkel et al. (I98I) Cell 27:143-153)«Os plasmidios Ti que contém mutações nesses genes incitam respeetivamente calos turaorosos de Nicotlana tabacum que geram ramificações, proliferam raí zes, e são maiores que os normais. Noutros hospedeiros,os mutantes desses genes podem induzir diferentes fenotipos (vide M. W. Bevan & M.-D. Chilton (1982) Ann. Rev. Genet.

16í357-384). Os fenotipos de Tms e tmr estão correlacionados com diferençasnos níveis de fito hormónio presentes no tumor. As diferenças nas razões de citocinina:auxina são similares âs que, na cultura, induzem a ramificação ou a formação de raízes em tecido de calos não transformada (D.

E. Akiyoshi et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:407-411). 0 T-DNA contendo um gene funcional quer para

tms como para tmr isolados mas não para o tml funcional sózinho, pode promover um significativo crescimento tumoral A promoção de ramificações e raízes é respeetivamente estimulada e inibida pelo tml funcional (L. W. Ream et al.

(1983) Proc, Natl. Acad. Sei. USA 80:1660-1664.As mutações em genes de T-DNA não parecem afectar a inserção do T-DNA dentro do genoma da planta (Leemans et al. (1982) supra, Ream et al. (19θ3) supra). o gene oes codifica a sintase de octopina, que foi sequenciada por H. De Greve et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:499-511)· θ mesmo não contém introns (sequências intervenientes encontradas comumente

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em genes eucarióticos que são desligados pós-transcritivamente para fora do percursor mensageiro durante a maturação do mRNA). 0 mesmo tem sequências que se assemelham a um sinal transcritos encariótico ("caixa TATA"), e um local de poliadenilação . Todos os sinais necessários para a exprej são do gene ocs são encontrados dentro de 295 hp do local transcritivo de partida do ocs (C. Koncz et al. (EMBO J. 2:1597-1603. '

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Os plasraidios Ti de nopalina codificam o gene da sintase de nopalina (nos), que foi sequenciado por A. Depicker et al. (1932) J. Mol. Appl. Genet. li 561-573· Tal como se verificou em relação ao gene ocs, o nos não é interrompido por introns. Possui dois locais putativos de poliadenilação e uma "caixa TATA" potencial. Em contraste com o ocs ^{0 nos} é precedido de uma sequência que pode ser um sinal transcritor conhecido como uma "caixa CAT". Todos os sinais necessários para a expressão do gene nos são encontrados den tro de 261 pb do local transcritivo de partida do nos (C. Koncz et al., supra). Um gene para a sintase de agrocinopina e genes equivalentes a tms e tmr foram identificados num plasraidio do tipo nopalina (H. Hoos et al. (1983) Cell ^2:1057-1067, um certo número de transcrições foi mapeado (L. Willmitzer et al. (1983) Cell ^2:1045G1056). J.C. McPherson et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2666-2670, relataram a translação in vltro de nRNAs codificados em T-DNA, de tecidos de bugalho.

A transcrição do T-DNA da raiz fibrosa foi também detectada (L. Willmitzer et al. (1982) Mol. Gen, Genet.

186i16-22). Funcionalmente, 0 sindrome de raiz fibrosa parece ser equivalente à de um tumor de bugalho incitado por um plasmidio Ti transformado em tmr (F. F. White & E, W. Nester (1980) J. Bacteriol. 144i710-720.

Nos eucariotas, a metilação (especialmente de resíduos

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de citosina) do DNA está correlacionada com a inactivação transcritiva; os genes que estão relativamente sub-metilado3 são transcritos em mRNA. S. B. Gelvin et al. (19θ3) Nucleic Acids Res. 11;159-174, verificaram que o T-DNA nos tumores de bugalho está sempre presente em pelo menos uma cópia não metilada. 0 facto de o mesmo genoma poder conter numerosas outras cópias de T-DNA que são metiladas sugere que as cópias de T-DNA superiores a um podem ser biologicamente inertes. (Vide também G. Ooms et al. (1982) Cell

^0:589-597).

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0 plasmidio Ti codifica outros genes que estão fora da região do T-DNA e são necessários ao processo de infecção. (Vide M. Holsters et al. (1980) Plasmid ^:212-230 quanto aos plasmidios de nopalina, e H. De Greve et al. (1981). Plasmid 6:235-248, D. J. Garfinkel e E. W. Nester (1980)

J. Bacteriol. 144:732-743. e G. Ooms (1980) J. Bacteriol. 144;82-91 quanto aos plasmidios de octopina). Mais importantes são os genes onc, que, quando modificados resultam em plasmidios Ti incapazes de oncogenidade. (Estes locais sâo também conhecidos como vir, para virulência). Vários genes onc tem sido mapeados com precisão e tem demonstrado estar localizados em regiões conservadas entre vários plasmidios Ti (H. J. Klee et al. (1983) J. Bacteriol. 153:878-883, V. N. Iyer et al. (1982) Mol. Genet.

188:418-424). Os genes onc funcionam em trans, sendo capazes de causar a transformação de células vegetais com T-DNA de um diferente tipo de plasmidio e fisicamente localizado em outro plasmida (J. Hille et al. (1982) Plasmid 7:107-218

H. J. Klee et al. (1982) J. Bacteriol. 150:327-331. A. J de Framond et al. (1983) Biotechnol. 1:262-269). 0 DNA de

Ti de nopalina possui repetições directas de cerca de 25 pa

res de base imediatamente adjacentes aos limites esquerdo e

direito do T-DNA., que poderiam estar envolvidos quer na excis&o do plasmidio Ti quer na integração dentro do genoma

hospedeiro (N. S. Yadav et al. (1982) Proc. Natl. Acad.

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Sei. USA 79:6322-6326), e uma sequência homóloga foi observada adjacente ao limite de T-DNA da octopina (R.B.Simpson et al. (1982) Cell 29:1005-1014). 0 catabolismo da opina é especificado respectivamente, pelos genes occ e noc de pias midios de octopina e de nopalina. 0 plasraidio Ti também codifica funções necessárias a sua própria reprodução, incluindo uma origem de replicação. Transcrições de plasmidlo Ti foram detectadas em células de A. tumefaciens por

S. B. Gelvin et al. (1981) Plasmid 6:17-29» os quais verificaram que regiões as de T-DNA eram fracamente transcritas juntamente com sequências que não eram de T-DNA. As características determinadas pelo plasmídio Ti foram revistas por Merlo, supra (vide especialmente a Tabela II), e Ream & Gordon, supra.

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DNA do Plasmídio TIp do Agrobacterium

Diferentes plasmidios Ti do tipo octopina são quase 100# homólogos uns aos outros quando examinados por hibridização de DNA (T.C. Currier & E, W. Nester (1976) J.Bacteriol. 126:157-165) ou análise com enzima de restrição (D. Sciaky et al. (197θ) Plasmid 1:238-253)· Os plasmidios Ti do tipo nopalina têm tanto como 67# de homologia entre si (Currier & Nester, supra). Uma pesquisa revelou que diferentes plasmidios Ri são muito homólogos uns aos outros (P. Costantino et al. (1981) Plasmid £:170-182). N, H. Drummond ά M. -D. Chilton (197θ) J. Bacteriol.

136:1178-1183, mostraram que secções proporcionalmente pequenas de plasmidios Ti do tipo octopina r nopalina eram homólogas umas ás outras. Essas homologias foram mapeadas detalhadamente por G. Engler et al. (1981) J. Mol. Biol. 152:I83-208). Os mesmos verificaram que três das quatro regiões homólogas eram subdivididas em tres (sobre pondo-se ao T-DNA), quatro (contendo alguns genes onc), e nove (tendo genes onc) sequências homólogas. A homologia ininterrupta contém pelo menos um gene tra (para transferência conjungada do plasmídio Ti a outras células bacterianas,)e

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genes envolvidos em replicação e incompatibilidade. Esta região ininterrupta possui homologia com um plasraidio Sym (envolvido na fixação simbiótica do nitrogénio de uma espécie de Rhizoblum, um genero diferente na família Rhlzobiaceae R. K. Prakash et al. (19θ2) Plasmid £:271-280). A ordem das quatro regiões não se conserva apesar de estarem todas elas orientadas na mesma direcção. Parte da sequência do T-DNA é 'altamente conservada entre os plasmidas de nopalina e octopina (M.-D. Chilton et al. (1978) Nature 275? 147-149, A. Depicker et al. (1978) Nature 275? 150-353) Os plasmidas Ri tem demonstrado possuir extensa homologia entre si, e aos plasmidios Ti da octopina (F. F. White & E. W. Nester (19θθ) J. Bacteriol. 144:710-720) e da nopalina (G. Risuleo et al. (1982) Plasmid £:45-51), primáriamente nas regiões que codificam genes onc. 0 T-DNA Ri contém homologias extensas, se bem que fracas, ao T-DNA de ambos os tipos de plasraidio Ti (L. Willmitzer et al. (19θ2) Mol.Gen. Genet. 186:16-22). 0 DNA de plantas de Nicotiana glauca não infectada contém sequências, denominadas cT-DNA (T-DNA celular), que apresentam homologia com uma parte do T-DNA Ri (F.F. White et al. (1983) Nature 301?348-350. L. Spanõ et al. (19θ2) Plant Molee. Biol. 1:291-300), G. A. Huffman et al. (1983) J, Bacteriol., inventariaram a região de hibridizaçâo cruzada e demonstraram que o plasmidio pRiA4b está mais intimamente relacionado com um pTiAÓ (do tipo octopina) que o pTiT37 (do tipo nopalina) e que este plasmidio Ri parece trazer sequências homólogas ao tms, porém não ao tmr. Os seus resultados também sugerem que o T-DNA de Ri pode ser descontínuo, análogo ao caso do T-DNA de octopina.

Tem sido demonstrado que uma parte do plasmidio Ti (T. -D. Chilton et al. (1977) Cell 11:263-271) ou Ri (M. -D. Chilton (1982) Nature 295?432-434, F. F. White et al. (1982) Proc. Natil. Acad. Sei. USA £2?3193-3197, L. Willmitzer (I982) Mol. Gen, Genet. 186? 16-22) se encontra

no DNA de células vegetais tumorais. 0 DNA transferido é

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conhecido por T-DNA. 0 T-DNA entrega-se no DNA hospedeiro (M. F. Thomashow et al. (1980) rroc. Natl. Acad. Sei.

USA 27:6448-6452, N. S. Yadav et al. (1980) Nature 28?: 458-461) no núcleo (Μ. P. Nuti et al. (1980) Plant Sei. Lett. I85I-6, L. Willmitzer et al. (1980) Nature 287:359-361), M. -D. Chilton et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4060-4o64).

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M. F. Thomashow et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2Z»⁶⁴⁴⁸-⁶⁴5², « ^M· ^F· Thomashow et al. (1980) Cell 19:729-739, verificaram que 0 T-DNA de plasmidios Ti do tipo octopina havia sido integrado em duas secções separadas, TL-DNA e TR-DNA, T-DNAs esquerdo e direito, respectivamente 0 número de cópias do TR e do TL pode variar (D.J. Merlo et al. (I98O) Molec. Gen. Genet. 177:637-643). Um núcleo de T-DNA é altamente homólogo ao T-DNA de nopalina (Chilton et al. (1978) supra, e Depicker et al. (1978) supra), é necessário para a manutenção do tumor, encontra-se no TL, está geralmente presente numa cópia por célula, e codifica os genes tms, tmr, β tml. Por outro lado, o TR pode ser to talmente dispensado (M. De Beuckeleer et al. (1981) Molec. Gen. Genet. 183:283-288, G. Ooms et al. (1982) Cell 30:589-597). apesar de ser encontrado em um maior número de cópias (Merlo et al. (1980) supra). G. Ooms et al. (1982) Plasmid 2:5-29, levantaram a hipótese de o TR estar envolvido na integração do T-DNA, apesar de considerarem que quando o TR é cancelado no plasmidio Ti, o A. tumefaclens retém alguma virulência, G. Ooms et al. (1982) Cell 30:589-597, demonstraram que apesar do T-DNA ser ocasionalmente cancelado após a integração no genoma da planta, é geralmente estável e que os tumores contendo uma mistura de células que diferem em organização do T-DNA, são o resul tado de múltiplas ocorrências de transformação. 0 oes encontra- se no TL mas pode ser cancelado do genoma da planta sem perda de fenotipos relacionados com o crescimento tumoral. Observou-se que o limite esquerdo do TL integrado é

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composto de repetições de sequências de T-DNA que têm oritações quer directas, quer invertidas (R. B. Slmpson et al. (1982) Cell 29:1005-1014).

Em contraste com a situação em tumores do tipo octopina, o T-DNA de nopalina está integrado dentro do genoma hospedeiro num fragmento continuo (M. Lemraers et al. (19Ô0) J. Mol. Biol. 144: 353-376, P. Zambryski et al. (1980) Science 209:1385-1391). Foram observadas repetições paralelas directas. 0 T-DNA de plantas regeneradas de teratomas possuia pequenas modificações nos fragmentos liminares do DNA inserido (Lemmers et al., supra). A análise sequencial da junção entre os limites direito e esquerdo revelou um certo número de repetições directas e uma repetição invertida. A última abarcava toda a junção (Zambryski et al. (1980)

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supra. A junção esquerda tem demonstrado variar em pelo menos 70 pares de base, enquanto que a junção direita varia em não mais que um único nucleótido. (P. Zambryski et al. (1982) J. Molec. Appl. Genet. 1:361-370)· 0s limites esquerdo e direito em junções de disposições paralelas estavam separados por espaçadores que poderiam ter mais que 130 bp. Os espaçadores eram de origem desconhecida e continham algumas sequências de T-DNA. Verificou-se que o

T-DNA estava integrado em sequências hospedeiras simultânea mente repetidas e com baixo número de cópias. H. Joos et al. (1983) ^2:1057-1067, demonstraram que a virulência não é eliminada após o cancelamento de qualquer dos limites usuais de T-DNA da nopalina.

Slmpson et al. (1982) supra, e Zambryski et al.(1980) supra sugeriram que as repetições directas nas regiões liminares estão envolvidas na integração do T-DNA no DNA da planta. 0 facto de os T-DNA, tendo limites de dois diferec tes plasmidas Ti, serem menos especificamente integrados que os limites homólogos sustenta esta sugestão (G. Ooms et al. (1982) Plant Molec. Biol. 1:265-276).

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N. S. Yadav et al. (1982) Froe. Natl. Acad. Sei. USA 22:6322-6326, descobriram um locus chi, que no bacterlófago Afaz com que aumente a recombinação geral no DNA envolvente até uma distância de 10 quilobases, num plasmidio Ti de nopalina, logo fora da extremidade esquerda do T-DNA. R. B. Simpson et al. (1982) Cell 29:1005-1014, nâo observaram uma sequência chi num plasmidio Ti de octopina, apesar de o possível raio de ação não elimine a possibilidade de um ser necessário e estar presente, mas fora da região sequenciada. 0 significado do chi no plasmidio Ti não 6 conhecido. Se o chi tiver uma função, é provavelmente usado nas células do Agrobacterium e não nas plantas, pois o chi não se encontra dentro do T-DNA.

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Manipulações dos Plasmidlos TIP pelo Agrobacterium

Conforme 0 detalhado na secção sobre Vectores de Transpor te, tem sido desenvolvida tecnologia para a introdução de sequências alteradas de DNA em locais desejados, num plasmidio TIP. 0s transposons podem ser facilmente inseridos usando-se esta tecnologia (D. J. Garfinkel et al. (19θ1)

Cell 27:143-153). J. -P. Hernalsteen et al. (1980) Nature 287:654-656 tâm demonstrado que uma sequência de DNA (aqui um transposon) bacteriano inserido no T-DNA do plasmidio Ti é transferido e integrado no genoma da planta hospedeira. Apesar de a inserção de DNA estranho ter sido realizada com um certo número de genes de diferentes fontes, até ao presente os genes estranhos não se têm geralmente expressado sob o controlo de seus próprios promotores. As fontes desses genes incluem a desidrogenase de álcool (Adh) do levedo (K. A. Barton et al. (1983) Cell 32:1033-1043), Adhl ( J. Bennetzen, não publicado) e zeína do milho, interferon e globina de mamíferos, e o vírus 5V40 de mamíferos (J. Schell não publicado). Contudo, quando o gene de sintase de nopalina foi inserido no T-DNA de octopina e transformado em te eido vegetal, demonstrou ser totalmente funcional (C. L.

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Fink (19θ2) tese de Mestrado em Ciências, Universidade de Wisconsin-Madison). A faseolina codificadora de genes a proteína de armazenagem encontrada nas sementes do feijão Phaseolus vulgaris L., tem sido transferida para e expressada em, tumores de girassóis. Este último trabalho constitui o primeiro exemplo de um gene de planta a expressar-se sob controlo do seu próprio promotor em tecido vegetal estranho. A •transcrição começou e parou nas posições correctas, e os introns foram adequadamente processados pos-transcritivamente (T. C. Hall et al., pedido dos E.U.A.

N⁸ de Série 485.613, que é incorporado ao presente através de referencia. M. Holsters et al. (1982) Mol. Gem.

Genet. 185:283-289¾ mostraram que um transposon bacteriano (Tn7) inserido no T-DNA, poderia ser recuperado sob uma forma totalmente funcional e aparentemente inalterada após integração num genoma vegetal.

Os cancelamentos podem ser gerados num plasmidio TIP por vários métodos. Pode-se usar vectores de transporte para introduzir cancelamentos construídos por técnicas padrão de recombinação de DNA (Cohen & Boyer, Patente dos E.U.A. 4.237.224). Cancelamentos com uma extremidade predeterminada podem ser criados pela excisão imprópria de "transposons" (Β. P. Koekman et al. (1979) Plasmld 2:347-357, θ G. Ooms et al. (1982) Plasmld 2*^5-29. J. Hllle & R. Schilperoot (1981) Plasmld 6:151-154, demonstraram que cancelamentos tendo ambas extremidades em posições predeterminadas podem ser gerados pelo uso de dois transposons, a técnica pode também ser utilizada para construir moléculas de "DNa recombinante” in vivo.

0 gene da sintase da nopalina tem sido usado para a inserção de segmentos de DNa que codificam para a resistência às drogas, os quais podem ser usados para fazer a selec ção de células vegetais transformadas. Nas células vegetais, o gene de resistência à Kanamicina do Tn5 não é trans

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crito sob controlo de seu próprio promotor (J. D. Kemp et al (18 de maio de 1982) Beltsville Symp. VII, Beltsville, MD, a ser publicado (1983) in Genetic Engineering: Applicat lons to Agricultura, ed. L. D. Owens; e C. L. Flnk (1982) supra). M· W. Bevan et al. (19θ3) Nature 3θ4:184-187 e R.

T. Fraleu et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA J30:4803-4807, inseriram 0 gene de resistência à Kanamicina (fosfotransferase de neomicina II) do Tn5 atrás do (Isto 6, sob o controle do) promotor da nopalina. A construção foi usada para transformar células vegetais que, na cultura, apresentavam resistência à Kanamicina e seus análogos,tais como o G418. J. Schell et al. (18 de Janeiro de 1983) l^th Miami Winter Symp. (vide também J. L. Marx (1983) Science 219:830), relataram uma construção similar, na qual o gene de resistência ao metotrexato (redutase de dihidrofolato) do Tn7 era colocado atrás do promotor da sintase da nopalina. As células transformadas eram resistentes ao metotrexato. Similarmente, L. Herrera Est relia et al. (1983) Nature 209-213, obtiveram a expressão, em células vegetais, da sintase de octopina e de acetiltransferase do cloranfenicol, uma enzima que, nas bactérias, confere resisten cia ao cloranfenicol, ao colocar os genes estruturais dessas duas enzimas sob o controle de promotores nos.

T. C. Hall et al., pedido dos E.U.A. N^fi de Série 485.614, que é incorporado ao presente através de referencia, fundiu o promotor oes e a extremidade 5' do gene estru tural da sintase da octopina ao gene estrutural da proteína faseolina da semente de feijão. Uma proteína de fusão tendo o término amino da sintase de octopina e carecendo do término de amino da faseolina foi produzida sob 0 controlo do promotor do T-DNa. Os introns, que foram fornecidos pelas sequências de faseolina, foram adequadamente processados pós-transcritivamente.

A. J. de Framond et al. (1983) Biotechnol.1:202-209, relataram isso na construção de um ‘plasmidio mini-Ti". No

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T-DNa da nopalina existe apenas normalmente um locus seccionado pela enzima de restrição Kpnl, Um mutante sem esse locus foi construído e um fragmento de Kpnl, contendo todo o T-DNA de nopalina foi isolado. Este fragmento, juntamente com um gene de resistência à Kanamlcina, foi inserido em pRK290, resultando daí um plasmidio que podia ser mantido na A. tumefaclens e carecia de quase todas as sequências Ti que não eram de T-DNA. Este plasmidio por si só não era capaz de transformar células vegetais. Contudo, quando colocado numa estirpe de A. tumefaclens contendo um plasmidio Ti de octopina, foram provocados tumores que sintetizavam tanto a octopina como a nopalina. Os plasmidios minl-Ti foram também transferidos para o interior de células vegetais quando complementados com um plasmidio Ti cancelado quanto ao seu próprio T-DNa. Esses resultados indicavam que as funções não T-DNa. actuaram em trans com o T-DNA, que as funções ausentes do plasmidio Ti da nopalina foram complementadas pelo plasmidio Ti da octopina, e que o “mini-Ti” da nopalina era funcional na transformação de células vegetais. Um par semelhante de plasmidios complementares, cada um contendo os genes quer do T-DNa da octopina, quer da onc, foi construído por A. Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-180.

Chilton et al. (18 de janeiro de 19θ3) l5th Miami WinterSymp., também relataram a construção de um plasmidio "mlcro-Ti” feito por meio da ressecção do mini-Ti com Smal para cancelar praticamente todo o T-DNA excepto o gene da sintase da nopalina e os limites esquerdo e direito. 0 micro-Tl foi inserido num plasmidio pRK290 modificado que ca recia do seu locus Smal, e foi empregue de maneira similar à do mini-Ti, com resultados comparáveis.

0 objeeto do presente invento é conferir as plantas resistência a pragas, especif icamente resistência a insoctos. Na busca deste objectivo, outros objectos são inserir

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Ref: 384116

de maneira estável uma codificação genética de uma proteina insecticida no genoma da célula vegetal, fazer com que esse gene seja expresso nos tecidos vegetais, que a expressão se ja ou regulada, ou constitutiva, e que os tecidos vegetais estejam numa planta normal. Outro objectivo é proporcionar novos tecidos insecticidas especializados numa planta, em particular um meio para produzir, num dicoteledonea normal, um bugalho que contenha um tecido insecticida dentro de seu próprio tecido. Outros objectivos e vantagens tornar-se-ão evidentes pela descrição que segue.

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0 invento divulgado na presente memória descritiva pro porciona uma planta que compreende uma célula vegetal genéticamente modificada com um gene estrutural insecticida ηβίε introduzido e expresso sob o control de um promotor expressável numa planta. Ademais, o invento proporciona tecido vegetal compreendendo uma célula vegetal cujo genoma inclui T-DNA, que contém um gene estrutural insecticida inserido numa tal orientação e espaçamento em relação a um promotor expressável numa planta, que seja expressável na planta sob o controle daquele promotor. São também proporcionadas novas estirpes de bactérias contendo e replicando T-DNA, conforme definido na presente, sendo o T-DNA modificado para conter um gene estrutural insecticida inserido com tal orientação e espaçamento em relação a um promotor expressável na planta, que seja expressável numa célula vegetal sob o controlo do citado promotor. Além disso o invento proporcio na novos plasmidios com a capacidade de se replicarem no E. coli e compreendendo T-DNA, e possuindo, além disso um gene estrutural insecticida inserido no T-DNA contido no plasmidio de tal maneira que seja expressável numa célula vegetai sob o controle de um promotor expressável na planta. Adicionalraente, este invento divulga novos plasmidios nos quais o gene estrutural insecticida é passível de expressão em E. coli ou Baclllus subtillis, e divulga também estirpes de bactérias que obrigam os citados plasmidios de expressão

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becteriana,

0 presente invento compreende um gene estrutural insecticida sob o controlo de um promotor expressável em células vegetais, sendo a citada combinação de gene/promotor inserida numa célula vegetal por quaisquer meios conhecidos da técnica. Mais especificamente na realização preferida, o invento divulgado na presente memória compreende, além disso a expressão, em células vegetais, de um gene estrutural insecticida sob o controlo de um promotor expressável em plantas, após a introdução através do T-DNA, ou seja, pela inserção do gene estrutural insecticida no T-DNa sob o controlo de um promotor expressável em plantas e a introdução do T-DNk contendo a inserção, numa célula vegetal, por métodos conhecidos.

0 invento serve para modificar geneticamente células vegetais e plantas inteiras pela inserção de genes estruturais insecticidas úteis a partir de várias espécies ou estirpes bacterianas. Tais genes estruturais insecticidas úteis incluem sem a eles se limitarem os genes que codificam proteínas insecticidas conforme definido abaixo, especialmente a proteína cristalina do Bacillus thurlngiensls proteínas relacionadas, e similares. 0 invento é exemplificado pela introdução e expressão de um gene estrutural de lana proteína cristalina de B. thurlngiensls var Kurstakl HD-73 nas células vegetais de algodão ou tabaco. Uma vez que sejam obtidas células vegetais expressando um gene estrutural insecticida sob o controlo de um promotor expressável na planta, tecidos vegetais e plantas inteiras podem ser regeneradas a partir do mesmo usando métodos e técnicas bem conhecidos na técnica. As plantas regeneradas são então reproduzidas por meios convencionais e os genes introduzidos podem ser transferidos a outras estirpes cultivadas por técnicas conhecidas de cultivo de plantas.

A introdução e expressão do gene estrutural de uma pro

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teina insecticida pode ser usada para proteger uma safra contra a infestação por larvas de insectos tais como o"hornworm" (Manduca sp.) ou a broca do milho (Ostrinnia nubilalls). Outros usos do invento explorando as propriedades de outros genes estruturais insecticidas introduzidos noutras espécies de plantas, tornar-se-ão claramente visíveis aos especialistas na arte. 0 invento aplica-se, em principio, a qualquer introdução de um gene estrutural insecticida em qualquer espécie de planta, na qual DNA estranho (T-DNa na realização preferida) possa ser introduzido e em que o citado DNA possa permanecer estávelmente replicado.

De modo geral essas classes incluem, sem porém se limitarem a elas, plantas gimnospermicas e dicoliledonias tais como gi. rassol (família Compositaae), tabaco (família Solanaceae), alfafa, soja e outros legumes (família Leguminoseae), algodão (família Malvaceae) e a maioria das verduras. As pragas que podem ser controladas por melo do presente invento e as safras que podem ser protegidas contra as mesmas inclu em, sem porém estarem limitadas a elas as relacionadas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Devido à sua susceptibilidade a um certo número de larvas, o algodão é uma escolha ideal para a inserção de um gene de proteína insecticida. Cada uma das que seguem é uma grande praga do algodão e é também susceptível á proteína insecticida do B.thurlnglensls: Hellothis zea (lagarta do algodão), Pectinophora gossypie11a (lagarta rosa), Hellothis vlrescens (lagarta do broto de tabaco), Trichoplusla ni (lagarta da couve). A aplicação de proteína insecticida preparada a partir de B. thuringiensis esporulante não controla no campo insectos tais como a lagarta rosa devido aos seus ciclos vitais e hábitos de alimentação particulares. Uma planta que contenha proteína insecticida nos seus tecidos controlará este recalcitrante tipo de insecto, proporcionando assim uma vantagem sobre os usos insecticidas anteriores do B.thuringiensis. Pela incorporação da proteína insecticida nos tecidos de

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Ref;384116

uma planta, o presente invento proporciona uma vantagem adi. cional sobre tais utilizações da técnica anterior, ao eliminar os casos de aplicação não uniforme e os custos de com. pra e aplicação de preparados insecticidas no campo. Ademais, o presente invento elimina a necessidade da temporização cuidadosa de tais preparados, visto que as larvas pequenas são as mais sensiveis á proteína insecticida e a pro teina está sempre presente, reduzido ao minimo os danos ás safras, que de outro modo resultariam do ataque larval antes da aplicação.

A figura 1 apresenta a sequência do gene cristalina de ρ123/5θ-10, descrito no Exemplo

de proteína

1.

Mod. 71 - 10 000 βχ.

A figura e transcrição

2 apresenta um mapa de posições de restrição do T-DNA de pT115955.

A figura 3 é um diagrama de uma construção descrita no Exemplo 2, de um vector de DNa recombinante transportando um gene estrutural insectida sob o controlo de um pro motor expressável na planta.

As definições que seguem são proporcionadas para afastar ambiguidades quanto à intenção do seu uso na especifica ção e reivindicações.

T-DNA: Um segmento de DNA derivado do principio indutor de

transformação (TIP) que se integra no genoma da planta. 0 _xusado

termo, conforme é/na presente descrição inclui DNA original mente derivado de qualquer estirpe de Agrobacterium indutora de tumor, incluindo A. tumef aciens e A.rhiogenes, sen do o segmento inserido deste último algumas vezes denominado, na técnica anterior, por R-DNA. Além disso o termo T-DNA, conforme é usado aqui inclui quaisquer alterações, modificações, mutações, substituições, inserções e cancelamentos sejam naturais sejam introduzidos por técnicas de la boratório, sendo uma necessidade e limitação estrutural irin

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clpal de tais modificações que esteja presente o suficiente das extremidades direita e esquerda dos T-DNAs para asse gurar a esperada função, de integração estável no genoraa da célula vegetal transformada, que 6 earacteristica do T-DNA. 0 T-DNA pode, por si só ser um composto de segmentos derivados de uma pluralidade de fontes de ocorrência natural ou sintética. Além disso o T-DNA deve conter pelo menos ura promotor expressável na planta na posição 5’ ou "^a montante” do local de inserção do gene estrutural insecticida, de forma suf icienteraente completa para controlar o inicio da transcrição e o início da translação de um gene estrutural insecticida inserido. Este promotor pode ser derivado de um gene de T-DNA, um gene de planta, ou qualquer outro gene cora um promotor que seja funcionayientro de uma célula vegetal em pelo menos um tecido e pelo menos um estágio de desenvolvimento. Preferivelmente, será proporcionado um ponto de inserção "a jusante”, na direcção de transcrição e translação iniciada pelo promotor (3* para o promotor localizado de tal modo em relação ao promotor que permita que um gene estrutural insecticida inserido no mesmo possa ser expresso sob o controlo do promotor, quer directamente quer como uma proteína de fusão. 0 T-DNA pode também incluir uma região 3' não traduzida a jusante do locus de inserção do gene estrutural insecticida, o qual pode funcionar para regular o término da transcrição, poliadenilação, e 0 processamento pós-transcritivo de DNA. Opcionalmente, uma proteína de fusão pode ser formada entre o gene estrutural insectida e a extremidade 3’ do gene estrutural que fornece a região 3' não traduzida. Os elementos do promotor e da região não traduzida 3’ podem ser derivados dos mesmos ou de diferentes genes pré-existentes, e podem ser derivados da mesma planta ou de outra diferente, de T-DNA ou de outras fontes. Por exemplo, ura gene estrutural insecticida, conforme exemplificado no presente, poderia estar instalado entre ura promotor de gene vegetal e uma sequência 3’ do mesmo gene, ou poderia ser uma construção com

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preendendo a região não traduzida 3’ de um gene e 0 promotor de outra, derivado da mesma ou de diferente espécie vegetal ou T-DNA. A região de codificação de um gene vegeta| conforme definida aqui pode incluir uma cópia cDNA da parte estrutural de um gene vegetal. As regiões do promotor o não traduzida 3’ podem incluir modificações, quer de ocor rência natural quer artificialmente induzidas, e podem incluir segmentos sintetizados quimicamente.

Promotor vegetal: Conforme usado na presente memória inclui elementos reguladores, e pode além disso incluir elementos estruturais de ura gene vegetal, os citados sendo elementos exógenos aos genes do próprio T-DNA. Estes incluem, sem a eles estarem limitados promotores dos genes de faseolina e a pequena sub-unidade de ribulose-l,5-bifosfato carboxilase, Ademais, ura promotor de gene vegetal é uma região do gene que proporciona e pode regular o inicio da transcrição e o inicio da tradução. Adicionalraente, as sequências de gene estrutural vegetal (a região que codifica total ou parcialmente uma proteína e que pode ou não conter um ou mais ”intron3”) podem ser introduzidos no T-DNA. (Um intron é uma região de uma transcrição de gene que é removida pós-transcritivamente antes do mRNA ser traduzido). A expressão sob o controlo de um promotor vegetal pode assumir a forma de expressão directa, na qual o gene estrutural normalraente controlado pelo promotor é removido total ou parcialmente e substituido pelo gene estrutural insecticida inserido, sendo proporcionado ura codon de partida quer como um resquí cio do gene estrutural vegetal quer como parte do gene estrutural insecticida inserido, ou por expressão de fusão de proteína, na qual todo ou parte do gene estrutural insecticida e inserido em fase de armação de leitura correcta dentro do gene estrutural vegetal existente. No último caso,

0 produto de expressão é denominado proteína de fusão. 0 segmento promotor pode ser, ele proprio, um composto de segmentos derivados de uma pluralidade de fontes de ocorrência natural ou sintética. As fontes de um promotor vegetal in-3255.710

Refi 384116

cluem, não estando porém limitadas a elas as plantas relacionadas na Tabela 2.

Promotor de T-DNA: Refere-se a qualquer ura dos promotores

X. 000 Ol - U Ί

de ocorrência natural corauraente associados ao T-DNA integra do. Estes incluem,não estando porém limitados a eles promotores da transcrição ”1,6”, genes de sintase de octópina (ocs), genes de sintase de nopalina (nos), genes de tms, tml, e tmr, e podem depender parcialmente da fonte TIP do T-DNA. A expressão sob controlo de um promotor de T-DNA pode assumir a forma de expressão directa, na qual o gene estrutural,normalmente controlado pelo promotor, é removido total ou parcialraente e substituido pelo gene estrutural in secticida inserido, um condon de partida sendo proporcionado quer corao um resquício do gene estrutural de T-DNa, como parte do gene estrutural insecticida inserido, ou pela expressão de proteina de fusão, na qual todo ou parte do ge ne estrutural vegetal é inserido em fase de armação de leitura eorrecta dentro do gene estrutural de T-DNA existente. No último caso, o produto da expressão é denominado proteína de fusão. 0 segmento promotor pode, ele proprio, ser um composto de segmentos derivados de uma pluralidade de fontes, de ocorrência natural ou sintéticas.

Promotor expressâvel em Planta: Conforme é usado na presente descrição,inclui as definições de promotor de T-DNA e promotor vegetal, supra. Contudo, ura aspecto essencial do promotor componente do presente invento é que o gene estrutural insecticida esteja sob o controlo de promotor expressável numa célula vegetal. Portanto, o promotor expressável na planta refere-se adicionalmente a qualquer promotor expressâvel numa célula vegetal, que seja expresso em pelo menos um tecido durante pelo menos um estágio de desenvolvimento. As fontes podem incluir, sem no entanto se limitarem a eles virus vegetais (por exemplo, os promotores das transcrições 35§ e 19S do virus do mosaico da couve-flor, (CaMV), virus animais, eucarlotas não vegetais (por exemplo,

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animais, levedo), ou plastidios (por exemplo, um promotor de cloroplasto ou procariótico, se o gene insecticida tiver que ser inserido no DNA do cloroplasto). As propriedades e componentes de um promotor derivado de uma fonte que não seja um DNA ou T-DNA vegetal (por exemplo, “caixas TATA, pontos de partida translativos ATG, locais de emenda de introns, etc.) são as mesmas que as descritas supra para os promotores de T-DNA e promotores vegetais, e estão também incluídas dentro da presente definição. 0 segmento promotor pode, ele proprio, ser um composto de segmentos derivados de uma pluralidade de fontes de ocorrência natural ou sintética.

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Gene estrutural Insecticida: Conforme usado na presente descrição inclui a parte de um gene insecricida que compreende um DNA codificado duma proteína, um polipeptido insecticida ou parte do mesmo, possivelmente um codon inicial de tradução, carecendo porém de outros elementos funcionais de ura gene bacteriano que regulara o início da transcrição e o inicio da tradução, corauraente denominados região promotora. (Note-se que, no presente invento tais elementos funcionais bacterianos podem estar presentes após a transferencia do gene estrutural insecticida dentro do T-DNA. Contudo, como eles não são funcionais dentro de uma célula vegetal, tais elementos não são mencionados pelo termo "gene estrutural insecticida¹¹). Um gene estrutural insecticida pode ser derivado total ou parcialraente do DNA plasmidio, DNA genomlco cDNA e DNA quimicamente sintetizados. Pretende-se, ainda, que um gene estrutural insecticida possa conter uma ou mais modificações, quer nos segmentos de codificação quer nas re giões não traduzidas, que possam afectar a actividade biológica ou estrutura quiraica do produto da expressão, a razão da expressão ou a maneira de controlar a expressão.

Tais modificações poderiam incluir, sem porém a isso se limitarem mutações, inserções, cancelamentos, substituições, e modificações “silenciosas” que não alteram a estrutura

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quimica do produto de expressão, mas que afectam a localização intercelular, transporte, excreção ou estabilidade do produto de expressão. 0 gene estrutural pode constituir uma sequência de codificação ininterrupta ou incluir um ou mais introns, vinculados pelas junções apropriadas de enlace "vegetal” funcional, que podem ser obtidas de uraa fonte sintética ou de ocorrência natural. 0 gene estrutural pode ser um composto de segmentos derivados de uma pluralida de de fontes de ocorrência natural ou sintética, codificando uma proteína composta sendo a proteína composta insecticida ou parcialmente derivada de uma proteína insecticida.

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Proteína insecticida: Conforme usado na presente descrição, inclui uma proteína bacteriana tóxica de qualquer modo aos insectos. Isto inclui uma proteína ou peptido que seja directa ou indirectamente tóxico ou inibidor de crescimento de insectos, sob quaisquer circunstâncias. Isto também inclui proteínas que são toxicas quando do contacto, ingestão ou respiração, quer sozinhas quer em combinação com outro material, em qualquer ocasião dentro do ciclo vital de um insecto, incluindo os estágios de ova_z.larva^pupa, ninfa e adulto. Isto inclui proteínas tóxicas a insectos, especialmente os das famílias dos Lepidópteros e Dlpteros, e os dos géneros Ostrinla, Hellothls, Pectinophora, e Trichoplusia, por exemplo, M. sexta, 0. nubilalis, H. zea, H.vire scens, P. gossyplella, I. ni. Outras elasses que poderiam ser escolhidas como alvos incluem, sem porem se limitarem a elas relacionados na Tabela 1, Exemplos de proteínas insecticidas incluem, porém não estão limitados a diversas va riedades, relacionadas na Tabela 3j úe Bacillus thuring iensis ou de outras espécies de Bacillus, por exemplo, B. cereus, B. polllliae, e B. sphaerlcus. Os genes que são usados para construir ou de outro modo codificar sequências, codificando proteínas tóxicas aos insectos incluem, porém não estando limitados a fosfolipases, hialuronidases, fosfatases proteases, e as várias proteínas cristalinas de B. thuringiensis. 0 termo proteína cristalina deve ser enten-3555.710

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dido como referindo-se a ambas as formas de protoxina e toxina, a proteinas tóxicas relacionadas com a proteína que é encontrada nos corpos de inclusão cristalinos do Baclllu s thurlnglensis, e às modificações artificiais de proteínas cristalinas de ocorrência natural. As proteinas relacionadas poderiam ser indentificadas por homologia de ácido nucleico, estrutural de proteína ou de sequência, reactividade cruzada imunológica, ou hibridização cruzada de ácidos nuclélcos.

Tecido vegetal: Inclui os tecidos diferenciados e não diferenciados de plantas incluindo sem porém a eles se limitar as raízes, ramificações, pólen, sementes, tecido tumoral, tal como bugalho, e várias formas de agregações de células vegetais em culturas, tais como embriões e calos. 0 tecido vegetal pode ser in planta ou em órgão ou tecido ou cultura de células, e pode ser derivado de plantas que incluem, mas não estão limitadas, a elas as relacionadas na Tabela 2

Célula vegetal: Conforme usado no presente, inclui células vegetais in planta e células vegetais e protoplastos em cul tura, e pode ser derivado de plantas que incluem, mas sem se limitarem a elas às relacionadas na Tabela 2.

A produção de uma planta genéticamente modificada expressando um gene estrutural insecticida introduzido via T-DNA combina os ensinamentos específicos da presente divul gação com uma variedade de técnicas e expedientes conhecidos da técnica. Na maioria dos casos, existem expedientes alternativos para cada estágio do processo geral. A escolha de expedientes depende de variáveis tais como a escolha do TIP básico ou outros sistemas vectores para a introdução e manutenção estável do gene estrutural insecticida expressável, a espécie de planta a ser modificada e a estra tégia de regeneração desejada, e o gene estrutural insecticida particular a ser usado, que apresentem todos estágios

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de processo alternativos que os possuidores de habilidade comum podem selecionar e usar para alcançar um resultado desejável. Por exemplo, apesar do facto de o ponto de partida para obter um gene estrutural insecticida estar exemplificado no presente pedido por DNA isolado de B. thurlngiensjs var. Kurstaki HD-73, 0 DNA de outras estirpes bacterianas transportando genes de proteína insecticida ou moléculas de DNA recombinante poderiam ser usados em sua subs tituição desde que fossem feitas modificações apropriadas nos processos de isolamento e manipulação de genes á medida em que novos meios sejam desenvolvidos para a expressão con trolada e/ou a inserção estável de genes estranhos em células vegetais, os peritos do ramo estarão aptos a escolher dentre esses estágios de processo alternativos para atingir um resultado desejado. Os aspectos fundamentais do invento são a natureza e a estrutura do gene insecticida e seus mel. os de inserção e expressão num genoma vegetal. Os estágios restantes da incorporação preferida, para obter uma planta genéticamente modificada, incluem a inserção da combinação de promotor/gene estrutural insecticida no T-DNA, transferir o T-DNA modificado para uma célula vegetal onde o T-DNA modificado se torna parte do genoma da célula vegetal, técnicas para a cultura in vitro e eventual regeneração em plantas integrais, que podem incluir estágios de selecionar· e detectar células vegetais transformadas e estágios de transferencia do gene introduzido desde a estirpe originalmente transformada, em cultivos comercialmente aceitáveis.

Uma característica principal do presente invento na sua forma de realização preferida é a construção de T-DNA com um gene estrutural insecticida inserido sob 0 controlo de um promotor expressável em planta,ou, mais preferivelmen te, um promotor de T-DNA, conforme estes termos foram definidos, supra. 0 gene estrutural insecticida deve ser inserido em posição e orientação correctas em relação ao promotor desejado. A posição possui dois aspectos. 0 primeiro

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relaciona-se com qual o lado do promotor em que está inserido o gene estrutural. Sabe-se que a maioria dos promotores controla o início da transcrição e tradução em apenas uma direcção ao longo do DNA. A região de DNA que permanece sob o controlo do promotor é denominada como estando “a jusante” ou, alternativamente, ”atrás” ou ” 3’ quanto ao pre motor. Portanto, para ser controlado pelo promotor, a posição correcta de inserção do gene estrutural vegetal deve ser "a jusante” do promotor. (Reconhece-se que alguns promotores conhecidos exercem controle bidireccional, caso em que qualquer lado do promotor poderia ser considerado como estando "a jusante" do mesmo). 0 segundo aspecto de posição refere-se à distância, em pares de base, entre os elementos funcionais conhecidos do promotor, por exemplo, o local de inicio de transcrição, e o local de inicio de trans lação do gene estrutural. Uma substancial variação parece existir em relação a esta distância, de promotor para promotor. Portanto, as exigências estruturais em relação a isso são melhor descritas era termos funcionais. Como uma primeira aproximação, uma razoável operacionalidade pode ser obtida quando a distância entre 0 promotor e o gene estrutu ral insecticida inserido é semelhante á distância entre o promotor e o gene de T-DNA que ele normalmente controla. A orientação refere-se á direccionalidade do gene estrutural. A parte do gene estrutural que finalmente codifica o término de amino da proteína vegetal é denominado a extremidade 5’ do gene estrutural, ao passo que a extremidade que codifica os aminoácidos proximos da extremidade carboxilo da proteína é denominada a extremidade 3‘ do gene estrutural, a orientação correcta do gene estrutural insecticida é com a extremidade 5’ do mesmo próximo do promotor. Uma exigência adicional no caso de construções que levam á expressão de proteina de fusão é que a inserção do gene estrutural insecticida na sequência de gene estrutural doado por prorao tor seja tal que as sequências de codificação dos dois genes estejam na mesma fase de armação de leitura, uma exigên_

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cia estrutural que é bem entendida na técnica. Uma excepção a esta exigência, de importância para 0 presente invento dár -se no caso de um "intron” separar sequências de codificação derivadas de um gene de proteína insecticida do primeiro seg_ mento de codificação do gene estrutural insecticida. Nesse caso, o gene estrutural insecticida deve ser dotado de um locus de união compatível com a junção de união a montante proporcionada pelas sequências de codificação não insecticidas a os loci de união de posicionados de modo tal que a armação de leitura correcta para o gene estrutural doado pelo promotor e o gene estrutural insecticida sejam restaurados em fase após 0 “intron" ser removido pelo processamento pós-transcritivo. Diferenças em razõe3 de expressão ou controlo de desenvolvimento podem ser observadas quando um dado gene estrutural insecticida é inserido sob 0 controlo de diferentes promotores expressáveis em plantas. Diferentes propriedades incluindo, porém não se limitando a elas propriedades tais como estabilidade, localização intercelular ou intracelular ou excreção, solubilidade, especificidade de alvo, e outras propriedades funcionais da própria proteína expressa podem ser observadas no caso de proteínas de fusão que dependem do lugar de inserção, o comprimento β propriedades do segmento de proteína de T-DNA incluído dentro da proteína de fusão e as interações mútuas entre os componentes da proteína de fusão que efectuam a configuração dobrada da mesma, que apresentam todas numerosas oportunidades para manipular e controlar as propriedades funcionais do pro duto de proteína insecticida, dependendo das desejadas propriedades fisiológicas dentro da célula vegetal, tecido vegetal, e na planta integral.

A localização do locus de inserção da combinação promotor/gene estrutural insecticida não é crítica, contanto que a função de transferência de sequências envolvendo imediatamente os limites do T-DNx não seja interrompidas, visto que, por estudos da técnica anterior, essas regiõe3 parecem ser essenciais para a inserção do T-DNA modificado no genoma da

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planta. Os loci de inserção preferidos são aqueles que existem em áreas que são as mais activamente transcritas, em particular o gene tml e uma área designada ”1,6” existente no fragmento H IndIII-f, e equivalente & transcrição 24, conforme mostrado na figura 2. 0 termo ”1,6" 6 usado aqui para designar esta região activamente transcrita do T-DNa. 0 T-DNA no qual a combinação de promotor/gene insectida e inserida, e obtido de qualquer um dos plasmidio TIP. 0 gene insecticida é inserido por técnicas padrão bem conhecidas dos especialistas na arte. A orientação do gene vegetal inserido, em relação á direcção de transcrição e translação dos genes T-DNA endógeneos, não é crítica e qual quer uma das duas orientações possíveis é funcional. Diferenças na razão de expressão podem ser observadas quando um dado gene é inserido em diferentes localizações dentro do T-DNa, possivelmente devido a factores tais como a metilação do DNA e a estrutura da cromatina. Níveis rápidamente detectáveis de expressão de ura promotor vegetal do gene de faseolina têm sido obtidos onde aquele gene foi inserido em ΡΤ115955, um plasmidio do tipo octopina de A. tumefaclens num local Smal encontrado dentro do gene tml ou um local Hpal encontrado dentro de tmr.

Um meio conveniente para inserir uma combinação de promotor/gene estrutural insecticida no T-DNA envolve o uso de ura vector de transporte, conforme descrito supra,tendo segmentos de DNA (os segmentos entre os quais se deseja a inserção) incorporado num plasmidio capaz de replicar -se em E. coli. 0 segmento de T-DNA contém um locus de ies_ trição, preferivelmente ura que seja singular dentro do vector de transporte. 0 gene estrutural insecticida pode ser inserido no locus singular nas sequências de T-DNA e o vector de transporte e transferido para dentro de células da estirpe apropriada de Agrobacterium, preferivelmente uma cujo T-DNA seja homólogo aos segmentos de T-DNA do vector de transporte. A estirpe transformada de Agrobacterium é,

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preferivelmente cultivada em condições que permitam a selec ção de ura resultado de recombinação homólogo duplo que resulte na substituição de ura segmento pré-existente do plasnri_ dio Ti por um segmento de T-DNA do vector de transporte. Contudo, deve-se notar que o presente invento não se limita à introdução da combinação de promotor/gene estrutural insecticida no T-DNA por um mecanismo de recombinação homólogo duplo; um resultado de recombinação homólogo com um vector de transporte (talvez exista apenas uma só região conti nua de homologia com o T-DNA) em ura único local ou uma inserção de um promotor transposos bacteriano portador de gene também demonstrará ser um meio eficaz para inserir a combinação no T-DNA.

Seguindo a estratégia acima descrita, o T-DNA modificado pode ser transferido para células vegetais por qualquer técnica conhecida no ramo. Por exemplo, esta transferencia pode realizar-se da maneira mais conveniente, seja pela infecção directa de plantas com a nova estirpe de Agro bacterlum contendo um gene insecticida incorporado ao T-DNA, seja pela co-cultivaçâo da estirpe de Agrobacterium com células vegetais. A primeira técnica, de infecção directa, resulta, oportunaraente no aparecimento duma massa tu moral ou bugalho no local de infecção. As células de bugalho podem sub se quente mente ser reproduzidas em cultura e, em circunstâncias apropriadas conhecidas dos peritos do ramo regeneradas em plantas integrais que comtém o segmento de T-DNA inserido. Usando o método de co-cultivação, uma certa proporção das células vegetais é transformada, ou seja, terão T-DNA transferido nas mesmas β inserido no genoma celular da planta. Em qualquer dos casos, as células transformadas devem ser seleccionadas ou separadas para distingui-las das células não trnasformadas. A selecção é mais rapidamente realizada proporcionando-se um marcador seleccinável incorporado no T-DNA em adição ao gene estrutural insecticida. Os exemplos incluem a redutase de dihidrofo-419jlMódÍull$i< j-JL

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lato ou a fosfotransferase de neomicina expressa sob o controlo de um promotor da sintase da nopalina. Esses marcadores são seleccionados pelo crescimento num melo contendo respectivamente metotrexato ou Kanamlcina, ou seus análogos. Ademais, 0 T-DNA proporciona marcadores endógenos tais como o gene ou genes que controlara o crescimento indepen dente de hormonas dos tumores provocados pela Ti em cultura o gene ou genes que controlam a morfologia anormal de raízes tumorais induzidas pelo Rl, e os genes que controlam a resistência a compostos tóxicos tais como análogos de aminoácido , sendo essa resistência proporcionada por uma sintase de opina. Os métodos de separação bem conhecidos dos especialistas do ramo incluem ensaios quanto à produção de opina, hibridização para sequências caracteristicas de RNA ou T-DNA, ou ensaios imunológicos para proteínas específicas, incluindo ELISAs (acrónimo para “ensaio de luzimas imuno-absorventes encadeadas ensaios rádio imunes e borrões "western". Adicionalmente, as propriedades tóxicas da proteína insectida expressa podem ser usadas para identificar o tecido transformado.

Uma alternativa à estratégia do vector de transporte envolve o uso de plasmidios que compreendem T-DNA ou T-DNA modificado, no qual é inserido um gene estrutural insecticida, sendo os citado plasmidios capazes de replicação independente numa estirpe de Agrobacterium. Provas recentes revistas no Histórico indicam que o T-DNA de tais plasmidios pode ser transferido de uma estirpe de Agrobacterium para uma célula vegetal, contanto que a estirpe de Agrobacterium contenha certos genes de transactuação cuja função é promover a transferência de T-DNA para uma célula vegetal. Os plasmidios que contêm T-DNA e são capazes de se replicar independent emente numa estirpe de Agrobacterium são aqui denominados plasmidios "sub-TIP", É possível um espectro de variações nas quais os plasmidios sub-TIP diferem na quantidade de T-DNA que contém. Uma extremidade do espec-42

tro retém todo o T-DNa do plasmidio TIP e é algumas vezes denominada plasmidio "mini-TIP”. Na outra extremidade do espectro, é cancelada toda menos a quantidade miniraa de DNA que envolve o limite do T-DNA, sendo as partes restantes o mínimo necessário para serem transferíveis para e integráveis na célula hospedeira. Tais plasmidios são denomi nados "micro-TIP". 03 plasmidios sub-TIP são vantajosos pe lo facto de serem pequenos e relativaraente fáceis de manipular directamente, eliminando a necessidade de transferir o gene para o T-DNA a partir de um vector de transporte, através de recombinação homóloga. Depois do gene estrutural desejado ter sido inserido, eles podem ser introduzidos directamente numa célula vegetal contendo os genes de trans -actuação que promovem a transferencia do T-DNA. A introdu ção numa estirpe de Agrobacterlum é convenientemente realizada quer por transformação da estirpe de Agrobacterlum, quer pela transferencia conjunta de uma célula bacteriana doadora, para o que as técnicas são bem conhecidas de qualquer técnica. Para fins de introdução de novas sequências de DNA num genoma de planta, os plasmidios TIP e os plasmldios mini-TIP devem ser considerados funcionalmente equivalentes.

Apesar da forma de realização preferida deste invento incorporar um sistema em que se utiliza como meio o Agrobacterlum baseado em T-DNA para a incorporação do gene insecticida no genoma da planta que deve ser tornada resisten te aos insectos, outros meios para transferir e incorporar o gene estão também incluídos no âmbito deste invento. Outros meios para a incorporação estável do gene insecticida num genoma de planta incluem, não estando porém limitados a eles, o uso de vectores baseados em genomas virais, mini-cromossomas, transposons, e recombinação homóloga ou não homóloga em cromossomas de plantas. Fornias alternativas de aplicação desses vectores numa célula vegetal incluem também não estando porém limitadas a elas a absorção directa de de ácido nucléico, fusão com lipossomas contendo o vector,

-4355.71o

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I

micro-injecção, e encapsulação em proteina da capa virótica, seguida de um processo semelhante á infecção. Os sismas baseados em células de Agrobacterium e TIPs podem ser usados para transformar dicotiledóneas e gimnospéúnicas pela transferência de DNA duma bactéria para uma célula vegetal; sistemas baseados em vectores alternativos ou meios para a aplicação de vectores podem ser usados para transformar todas as gimnospérmias e todas as angiospermicas incluindo tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas.

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A regeneração de células e tecidos transformados é realizada recorrendo-se a técnicas conhecidas. Um objecto da fase de regeneração é obter uma planta completa que cresça e se reproduza nonnalmente, mas que retenha o T-DNA integrado. As técnicas de regeneração variam um pouco de acor do com princípios conhecidos da técnica, dependendo da origem do T-DNA, da natureza de quaisquer modificações no mesmo, e da espécie de planta transformada. As células vegetais transformadas por ura T-DNA do tipo Ri são rápidamente regeneradas, utilizando-se técnicas bem conhecidas de qualquer técnico do ramo sem experimentação indevida. As células vegetais transformadas por T-DNA do tipo Ti podem ser regeneradas, em alguns casos, pela adequada manipulação dos níveis hormonais na cultura. Preferivelmente, contudo, o tecido transformado por Ti é mais facilmente regenerado se o T-DNA tiver sido transformado num ou ambos os genes tmr e tms. A inactivaçâo desses genes devolve ao normal o equi librio hormonal no tecido transformado e aumenta grandemente a facilidade e a manipulação dos níveis de hormonio na cultura, levando a uma planta que é fàclimente regenerada devido à sua fisiologia hormonal mais normal. Ê importante notar que se as mutações em tmr e tms forem introduzidas no T-DNA através de recombinação homóloga dupla com um vector de transporte, a incorporação das mutações deve ser seleccionada de maneira diferente da incorporação do promotoq/ /gene estrutural insecticida. Por exemplo, no primeiro ca-4455.710

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so poder-se-ia seleccionar para resistência ao cloranfenicol, ao passo que a última selecção poderia ser para resistência à kanamicina. A inactivação dos loci tms e tmr poderia ser realizada por uma inserção supressão,ou substitui ção de um ou mais nucleótidos dentro das regiões de codificação ou promotoras desses genes, sendo a mutação projectada para inactivar o promotor ou interromper a estrutura da proteína. (A'construção de mutações adequadas foi exemplificada por T. C, Hall et al., números de série

485.613 e 485.614). Nalguns casos, as células tumorais são capazes de regenerar ramificações que contém T-DNA integrado e expressam genes de T-DNA, tais como a sintase de nopalina, e que também expressam um gene estrutural insecticida inserido. As ramificações podem ser mantidas vegetativamen te por enxerto em plantas arraigadas e podem desenvolver flores férteis. As ramificações servem assim como material vegetal genitor para plantas de progénie normal que contém o T-DNA e expressam do o gene estrutural insecticida inserido nas mesmas.

0 genotipo do tecido vegetal transformado é frequentemente escolhido pela facilidade com que as suas células podem crescer e regenerar-se na cultura in vitro. Caso uma cultura de interesse agronomico seja inadequada para essas manipulações, uma variedade mais sensível é primeiramente transformada. Após a regeneração, o gene de proteína insec ticida estranho recém-introduzido é fácilmente transferido para o cultivo agronomico desejado através de técnicas bem conhecidas dos especialistas na arte de cultivo de plantas e genética vegetal. Os cruzamentos sexuais de plantas cultivadas com as culturas agronómicas resultaram num hibrido inicial. Esses hibridos podem então voltar a cruzar-se com plantas possuidoras do fundo genético desejado. A progénie é continuamente examinada e seleccionada quanto â presença contínua do T-DNA integrado ou quanto a um novo fenotipo re sultante da expressão do gene de proteína insecticida inse-45

tu

I

55-710

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rido. Desta maneira, após um certo número de ciclos de

cruzamento de retorno e selecção, podem-se produzir plantas com um genotipo idêntico aos pais agronomicamente desejados, com o acréscimo do gene de proteína insecticida inserido.

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Num método alternativo para conferir a uma safra a resistência a insectos, pode-se infectar as plantas dentro de um campo que deva ser protegido com uma célula de Agrobacterlum abrigando um plasmídio TIP tendo T-DNA não incapacitado que contenha um gene de proteína insecticida expressável. Verificámos que as larvas se alimentarão com o tecido dos bugalhos. Quando as larvas de insectos que infestan o campo se alimentarem de tecido transformado contendo um gene insecticida, serão afectadas pela proteína insecticida existente naquele tecido. 0 Agrobacterium e o TIP poderiam ainda codificar genes de atraentes de insectos. A pre_ sença de tais atraentes no tecido transformado aumentará a preferência dos insectos por tal tecido como fonte de alimentação, relativamente ao resto do material de safra no campo.

EXEMPLOS

Os Exemplos que seguem utilizam muitas técnicas bem conhecidas e acessíveis aos especialistas nos ramos de biologia molecular e manipulação de TIPs e Agrobacterium;tais métodos estão totalmente descritos numa ou mais das referên cias, citadas quando não descritos detalhadamente na presen te descrição. As enzimas são obtidas de fontes comerciais e utilizadas de acordo com as recomendações do fornecedor ou outras variantes conhecidas da técnica. Os reagentes, tampões e condições de cultura são também conhecidas dos técnicos do ramo. Trabalhos de referência contendo tais técnicas padrão incluem os seguintes: R. Wu, ed. (1979) Met. Enzymol. 68, R. Wu et al^edsfl.983) Meth. Enzymol. 100 e 101, L. Grossman ά K. Moldave, eds. (1980) Meth. Enzymol.

-46-

55*710

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i

65, J. H. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics, R. Davis et al. (1980) Advanced Bacterial Genetics, R. F. Schleif «χ P. C. Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Blology, e T. Maniatis et al. (1982) Molecular Clonlng. Adicionalmente, R. F. Lathe et al. (1983) Genet. Engin, 4: 1-56, fazem comentários úteis sobre manipulações de DNA.

Μοβ. 71 - 10 000 ·χ.

0 uso textual isolado do nome de uma endonuclease de restrição, por exemplo "Bell"refere-se ao uso daquela enzima numa digestão enzimática, excepto num diagrama onde 0 mes mo se possa referir ao locus de uma sequência susceptivel â acção daquela enzima, por exemplo, um locus de restrição.

No texto, os loci de restrição são indicados pelo uso adicio nal da palavra "locus" por exemplo, locus.BeD,buso adicional da palavra "fragmento", por exemplo, "fragmento Bell", indica uma molécula linear de DNA com entrançado duplo, com extremidades geradas pela acção da enzima mencionada (por exem pio, um fragmento de restrição). Uma frase como "fragmento BclI/Smal" indica que 0 fragmento de restrição foi gerado pela acção de duas diferentes enzimas, aqui Bell e Smal, resultando as duas extremidades da acção de diferentes enzimas, Note-se que as extremidades terão as características de serem •hombudas" ou"aderentes" (isto é, terão uma pro tuberância de um só cordão passível de acoplamento de base com um oligonucleótido complementar de cordão único), e que a sequência de uma extremidade aderente será determinada pela especificidade da enzima que a produz.

Nestes exemplos, são usados símbolos especiais para tornar as sequências mais facilmente compreensíveis. As sequências que codificam proteína estão sublinhadas, e os codons estão separados por barras (/), As posições de seccio namentos ou espaçamentos em cada cordão, causados por endou nucleases de restrição ou de outro modo, são indicadas pela colocação de asteriscos (<).

Os plasmidios, e sómente os plasmidios, são precedidos

-4755.7X0

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de um ”p", por exemplo, pTil5955 ou pKS-4, e a estirpe com parênteses indica um plasmidio abrigado na mesma, por exemplo, A. tumefaciens (1T115955) ou kÔ02( pKS-4). A Tabela 4 provê um indice útil para identificar plasmidios e seus inter-relacionamentos, A Tabela 5 fornece uraa relação de estirpes depositadas,

Exemplo 1

0 primeiro estágio no desenvolvimento de uma safra resistente a insectos foi clonar o gene de proteína insecticida do B. thuringlensis var. Kurstaki HD-73, que está depositado junto á Colecção de Culturas de Pesquisa Agrícola (Agricultura! Research Culture Collection), no Northern Regional Re search Laboratory, em Peoria, IL,, e tem o número NRRL B-4488.

1,1 Clonagem do gene de proteína insecticida do Bacillns

thuringlensis.

0 plasmidio de 5θ megadaltons (MD) foi enriquecido a partir do HD-72 por meio de centrifugação com gradiente de sacarose. Foi construída uma biblioteca de HD73 digerindo-se primeiramente este plasmidio com HindIII. Os fragmentos resultantes foram misturados a, e ligados com pBR322 linearizado com HindIII (F. Bolivar et al. (1978) Gene 2:95-113) © transformado em S. coli HB101, Os transformadores resistentes á amplicilina e sensíveis á tetracilina foram separados pela digestão do DNA isolado do plasmidio com HindIII e escolhe ndo-se os clones com inserções de pares de 6,6 quilobases (kbp). As colónias contendo os plasmidios pl23/58**3 ® pl23/58-10 foram selecionadas dentre a biblioteca de HD-73 para análise subsquente, usando um ensaio biológico com insectos (vide Sxeinplo 8). Esses clones foram alimentados em caldo L e uraa suspensão de células numa concentração de 2^0 vezes foi precipitada com ultra-sons

4855*710 Refi 38411o

Mod. 71 - 10 000 ·χ.

ÍpORYUGq"

' I*' - ·* ·.

e o extrato, aplicado à superfície da dieta dos inseétos. Larvas recem-nascidas de Manduca sexta (larva do tabaco) foram colocadas sobre a dieta durante uma semana, as larvas do insectos alimentadas com extractos de estirpes contendo o pl23/58-3 ou o pl23/58-10 não cresceram e todas as larvas morreram em 2 a 5 dias. Não houve diferença aparente entre as larvas alimentadas com esses extractos e as alimentadas com proteína insecticida purificada de células do B. thurlngiensls.

A análise do enzima de restrição do pl23/58”3 ^e¢123/58-10 mostrou que os dois plasraidios eram idênticos excepto quanto ao facto de terem 0 fragmento de DNA de B. thurlngiensis de 6,6 kbp inserido no vector pBR322 em orientações opostas. Note-se que ambos esses plasraidios podem ser convertidos um no outro pela digestão com HindIII, reli gação, e transformação em HB 101, seguido de estágios apropriados de selecção e separação.

0 pl23/58-lO foi ainda usado para sondar os transformantes na biblioteca de plasraidios HD-73* Dezasseis das 572 colónias hibridizaram-se na inserção do clone pl23/58-10 e todas tinham 0 fragmento característico de HindIII de 6,6 kbp. Uma subsequente análise de enzima de restrição mostrou que esses clones eram todos de uma das duas possíveis orien tações no pBkj22 do mesmo fragmento de DNA. Isto sugeria que poderia haver um só gene de proteína cristalina na estirpe HD-73* θ facto de que esses clones representam o únl_ co gene de proteína insecticida no HD-73 foi confirmado pela hibridização da sonda rotulada pl23/58-10 cora borrões Sulinos de DNA de plasraidio HD-73 digerido com HindIII, Bglll ou Sall. Nenhuma dessas enzimas tinha um locus de restrição em nosso gene de proteína cristalina clonado. Os resultados da hibridização mostraram um só cordão de DNA ce lular de B. thuring iensis hibridizado com ρ123/5θ-1Ο e indicaram ainda que o HD-73 possuía um só gene de proteína

-49-

55.710

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cristalina insecticida. Identificámos ura certo número de outros clones por hibridização com uma sonda feita de pl23/58-10. 0 mapeamento de restrição mostrou que esses

clones são todos idênticos quer ao ρ123/5θ-3 Quer ao pl23/58-10, apoiando ainda a conclusão de que o HD-73 possui um só gene de proteína cristalina.

Mod. 71 - 10 OOO ex. - 09-84

1.2 Análise imunológica

As análises da proteina produzida por clones de E. coli mostram que a proteina codificada como ρ123/5θ“3 ©

pl23/58-10, que formou urna faixa de precipitina com o antisoro da proteina insecticida do B. thuringiensis em placas de difusão de Ouchterlony. Os extractos de células foram analizados em geleias de SDS-poli-acrilamida a 10$, transferidos para nitrocelulose, e reações imunológicas feitas com anticorpo e proteína A 125 (Mancha Western, Exemplo 7λ Nenhuma faixa foi encontrada a I30 kD (quilodalton, onde é observada a protoxina desnaturada, contudo, foi visto um peptido de cerca de 65 KD, o qual vincula o anticorpo da proteína cristalina (Manchas Western feitos como no Exemplo 7), e era de dimensão idêntica à da toxina activada. Este peptido representava aproximadamente q 1$ da proteína total do S. coli.

1.3 análise sequencial

Comparamos os nossos resultados sequenciais do DNa (figura 1), obtidos por métodos bem conhecidos dos especialistas técnica de sequenclamento de DNA (por exemplo, vide A. M. Maxam ά Y/, Gilbert (1980) Meth. Enzymol. 65? 499-560), com sequências publicadas (vide Histórico). As sequências publicadas apresentavam apenas uma homologia parcial com nossa sequência. Foi observada uma moldura de leitura aber ta de cerca de 2,8 kbp, que estava vinculada à extremidade 5' por um sinal de partida de expressão (ATG) e não parava até encontrar o local HindIII na junção entre o DNA do B.

-5055.710 Λ6£:304110

thuringiensis e 0 vector pBlí322. A dimensão da proteína codificada por esta moldura de leitura aberta do ATG até 0 local HindIII era maior que a da proteina de 67 ED que observamos estar expressam»nte no E. coli, porém menor do que é necessário para codificar a proteína cristalina nativa de I30 KD. 0 facto de o meio exacto de término da expressão no peptido de leitura, codificado em pBH 322 não ser importéinte ó sugerido pela verificação de que a actividade insecticida era codificada pelas inserções de DNA do Bo thuringiensis com qualquer uma das duas orientações dentro do vector pBR322. Presumivelmente os resíduos de aminoácido carboxi-terminais inicialmente trasladados para o término carboxi final do polipeptido expresso foram removidos no E coli por um processo proteolitico semelhante ao que activa naturalmente a proteina cristalina.

Mod. 71 - 10 000 ex.

Exemplo 2

Este exemplo indica a inserção do gene insecticida do Baclllus thuringiensis entre um promotor de gene de T-DNA e um sinal de poliadonilação (acréscimo poli (A), a transferencia do gene insecticida a várias espécies vegetais através de um plasmidio Ti, e a regeneração de plantas que expressam este gene sob o controlo do promotor de T-DNA.

Uma grande parte da estratégia usada nosta construção está diagramada na figura 3» que representa de maneira esquemáti ca plasmidios e não esta nece ssár lamente desenhada em escala.

2.1 Introdução do locus BamHI no gene de proteina lnsecticida.

-51Um locus BamHI é introduzida no gene de proteina insecticida do ρ123/5θ-10 num locus logo 5’ da partida da

sequência de codificação. À sequência de base de tipo selvagem (b) e as bases alteradas num activador de ollgonucleó

tido (a) são como segue:

55.710

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Mod. 71 -lOOOOex.

BamHI

a) 5' AGATGGaG*G£TCCTT ATG GAT AAC AAT 3«

b) ...AGáTGGAG GTAaCTT/ATG/GAT/aAQ/.··

Met Asp Asn Asn

_áls bases alteradas são a sequência ATG sublínaha em (a). Note-se, que são asseguradas boas propriedades de hibridização, porque apenas três dentre 27 pares de bases são alterados.

0 ρ123/5θ“1° θ digerido com HindIII e é misturado com, e ligado a DNa m»,'B2344 RF (forma replicante) lenearizado com HindIII. A mistura transformada em JM103 e as colónias transformadas são separadas por isolamento de plasmidio, seguido de análise de restrição quanto á presença da inserção de uma única cópia do fragmento contendo gene de proteína insecticida. Os vectores que contám as duas possíveis orientações são rotulados iíl3-3t-A e M13-S.

Eles contém os cordões em contra sentido e era sentido dtecto respectivamente, dc gene estrutural insecticida quando na forma virótica.

0 Ml3-Bta é hibridizado com o activador oligonucleótido, 5’ AGATGGAGGATCCTTATGGATAACAAT3‘, préviaraente sintetizado conforme descrito no Exemplo 10.1. 0 oligonucleótido:M13-3t-A híbrido é cincubado com o fragmento Klenow da polimerase I de DNA do S. coli, o DNa circular covalente mente fechado (cccDNA) é enriquecido, e a mistura é transformada em MJ103. Os "virions” produzidos pelos transformantes são isolados e usados para infeccionar células a uma baixa miltiplicidade de infecção. 0 DNA RF é isolado dentre um número de colónias infectadas e é caracterizado por mapeamento de restrição. Os clones derivados do mutante oligonucleótido-cordão activado são identificados pela presença de um novo locus BamHI na extremidade 5' do gene estrutural insecticida, e um tal vector é denominado M13-5255.710

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-5t-A(Bam).

0 DNA RF λ13-3ϊ-λ(Bam) é digerido com BamHI e HindIII, e é misturado com, e ligado a um conector, sintetizado conforme descrito no Exemplo 10.1, e tendo a seguinte estrutura:

Mod. 71 - 10 000 «x.

HindIII BamHI

5 '^GCTAGCTGACTaG3 '

3’TCGhCTGaTCCTaG5’

Mote-se que este conector contém sinais de parada de expres_ são (sublinhados) em todas as tres possíveis fases de leitura. Cs conectores são removidos por digestão com BamHI e um fragmento de DNa contendo 0 gene estrutural insecticida é purificado por eletroforese de gel de agarose.

2.2 Construção e modificação de um veiculo promotor

0 gene de T-DNA ”1,6” é resumido como segue:

Ciai 960 bp 25C bp Clal 60 bp

5'. o. TaCACCAAT*CG/ATG/GãCATG/. o o o /TGA/.....ATCGAT.....

aaataâí*?. MôaTAa. .. 3 ’

promotor lí D M..... parada sinais de poliadenilação,

Ao remover o fragmento Clal, a região promotora do gene ”1,6“ pode ser trazida até proximo da região 3' a jusante do gene. Esta região 3’ inclui sinais de poliadenilação.

A estrutura resultante é resumida como segue:

5¹.«« ATaCACCjíAAT*GGãTAGT ···«··»··. ΑΑλΤΑΑ ··*······· ΑΑΑΤλΑΑΑ...

3’ promotor sinais de poliadenilação

0 pKSlll, que é um clone de pRK29C correspondente ao clo-.^3.

55.710

hef:384116

Mod. 71 - 10 000 βχ.

ne de T-DNA p403 (que codifica o gene "1,6” que foi descrito na Descrição Detalhada, transcrição 24 na figura 2, vide também CJ.Fink(L982), tese de Mestrado em Ciências, Uni ver sidade de Wisconsi-Madison), é digerido com Cls.J e então re ligado, (Alternativamente, estas mesmas manipulações descritas aqui podem ser realizadas directamente no p4C3, que é um clone baseado em pBR322, substituindo a tetracicllna pela ampicilina durante a selecção), A mistura de ligação é trnsformada em E. coli Κδ02 (W. B. Wood (1966) J. Mol, Biol. 16;118) e seleccionada para resistência á tetracicllna. Os plasmidios são isolados fazendo “minipreparados" (preparados de plasmídio de culturas de células de pequeno volume) e obtém-se mapas de restrição para se provar a estrutura. 0 novo veículo, pKS-prol (vide T. C. Hall et al., pedido dos E.U.A. N^ô de série 485.614), pode ser linearizado por Ciai.

⁰ PKS-prol desenvolvido em K.802 foi seccionado com Ciai misturado com, e ligado a um conector BamHI/Clal que não tinha 5’-f°^sfuto, 5'CGGaTG3'. A mistura resultante foi digerida con; Ciai para remover o pKS-prol religado, e transformada em K802. Os plasmidios dos transformantes resisten tes á tetracicllna são separados por análise de restriçãoe um plasmídio com o locus Ciai na partida de translação ATG substituída por uma locus BamHI é denominado pKS-prol (Bam),

2.3 Introdução de um GeneResistente á Kanamiclna no pKS-prol(Bam).

E vantajoso ter um gene de resistência á kanamiclna (Kan) inserido peoximo da combinação de promotor/gene inseoticida, de modo a permitir a seleccção de recombinantes duplos homólogos após um acasalamento triplo. A fonte do Kan foi o pKS-4 (Exemplo 2,5). No pKS-4 o gene Kan é flanqueado em cada lado por uma locus Ciai. Para remover um gene Kan contendo fragmento de pKS-4 com Ciai (isto é num frag-54-

55.71ο

Ref:384116

mento "Clal/Ran"), é necessário introduzir uma Clal naquele plasmidio, no lado oposto ao Kan partindo do locus Clal

existente. Isso e realizado convertendo-se uma BamHl convenientemente colocada (5’··«G*GATCC...3’) á especificidade de Clal (5’ ..,AT*CGaT...3’).

0 pKS-4 é linearizado por digestão com BamHl, gerando assim extremidades aderentes com as seguintes estruturas:

5'...G GATCC...3'

3’...CGTAG C...3'

χβ οοο 01 - 12 ροιιιι

as extremidades reentrantes desta estrutura são preenchidas por incubação com o fragmento Klenow da polimerase I do DNA de E. coli, formando as seguintes extremidades rombudas:

...GGaTG gatcc...

...CCTAG CTaGG...

Quando essas extremidades estiverem rombudas e ligadas uinas ás outras, a sutura resultante possui a seguinte sequência:

Clal

...GGaT^CG aTCC... —CCTA GC*TAGG...

Note-se que a estrutura resultante é susceptível á acção do Clal mas não á acção do BamHl.

Alternativamente á construção acima, pode-se converter o locus BamH, ou outro locus de restrição convenientemente localizado, num locus Clal pele uso dos conectores apropriados. 0 pKS-4 foi digerido com Smal,misturado com e ligado a Clal/ conectores de extremidade rombuda com a

-5555.710 Ref:38411o

·»

€

Mod. 71 - 10 OOO βχ.

sequência 5' CaTCGATG3’, digerido com Ciai, religado, e transformado em Κδ02. Os plasmidios isolados de transformantes resistentes á Kanamicina foram examinados quanto á presença de uma novo locus Ciai na posição anteriormente ocupada por um locus posição Smal. Um fragmento Clal/Kan pode ser isolado de tal plasmidio.

Quando desenvolvido no E. coli Κ8θ2, o pKS-proI(Bam) β metilado em dois loci Ciai restantes: um está a cerca de 145 bases da junção de poliadenilação do promotor (isto é cei’ca de 3° bases além do segundo locus de adenilação), o outro está a cerca de 200 bases da locus direita de p403 EcoRI (Vide figura 2). A metilação bloqueia o seccionamento pela endonuclease de restrição Ciai num locus de outro modo susceptível. Portanto, essas metilações protegem esses locais e efectivamente dirigem a acção da enzima Ciai para outros loci. 0 pKS-pro(Bam) é transferido para e desenvolvido no Ξ. coli GM33, uma estii-pe que não metila resíduos de adenosina no DNA, de modo que as loci Ciai, de outro modo metilados podem ser seccionados. Após a purificação desse plasmidio do GM33 (pKS-pro(Bam), é realizada uma digestão parcial com Ciai e a mistura resultante é ligada ao fragmento Clal/Kan descrito acima. Após a transformação em E. coli Κδ02, os transformantes são seleccionados em meios contendo tetraciclina e kanamicina. Após o isolamento do plasmidio e o mapeamento de restrição é identificado um clone com a construção desejada e o plasmidio encon trado neste clone é rotulado como pll-83a (figura 3).

0 pll-83a possui um fragmento que contém gene kan, ligado na locus Ciai "mediana” cerca de 3° bp além do segundo locus podição de poliadenilação. 0 fragmento BamHI do gene insecticida, isolado do vector modificado construído no Exemplo 2.1, é agora ligado na posição BamHI do pll-83a linearizado com BamHI que foi transferido para e desenvolvido no Κ8θ2 θ é metilado. Após transformação em K802, se-5655.71ο

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Med. η · ίο οοο ·χ.

/

lecção por tetraciclina e kanamicina, isolamento do plasmidio e mapeamento da enzima de restrição, a construção desejada com o gene estrutural insecticida inserido entre o promotor "1,6” pTil5955 © © locus de polladenilação e identificada, e o plasmidio abrigado na mesma é rotulado pll-83b (figura 3).

2.4 Introdução do pll-83b nos plasmidios Ti

0 pll-836 é introduzido no pTil5955j pTiA66 (equivalente a pTil5955, mas com um gene tms não funcional), e os mutantes são cancelados em regeneração que afecta os genes, através de recombinação homóloga (Exemplo 10). As plantas de tabaco são transformadas por um sistema descrito no Exemplo 6, e os transformantes são identificados por borrões Southern e Northern (técnicas bem conhecidas dos especialistas do ramo), com sondas apropriadas e pela presença de octopina e proteína cristalina. 0 tecido de tabaco transfoi*mado ó letal ás larvas do tabaco. As plantas de tabaco são regeneradas de células transformadas, conforme descrito no Exemplo 6, e admitidas em programas de cultivo. Os campos de plantas regeneradas e seus descendentes que contém proteína insecticida são resistentes á infestação por lavras de insectos tais como as larvas do tabaco, em virtude do efeito tóxico sofrido por tais larvas ao alimen tarem-se do tecido de tais plantas.

2.5 Clonagem e isolamento de um gene de resistência â

kanamicina.

0 pkzl02 (R. A. Jorgenson et al. (1979) Mol Gen. Genet. 177:65-72), um plasmidio ColSl que contém uma cópia do "transposon" Tn5, foi digerido com BamHI e HindlII» misturado com pBR322 anteriormente linearizado com as mesmas duas enzimas, ligado, e transformado em k802. Os plasmidios, isolados de transformantes seleccionados para resistência tanto à ampicilina como a kanamicina, foram mapeados quan-57-

55.710

Ref:3θ411ό

Mod. 71 - 10 OOO «X.

to á restrição θ ura, tendo a estrutura mostrada na figura 3, foi rotulado pK3-4.

Exemplo 3

Sste exemplo ensina outro método para inserir um gene expressável para a proteína insecticida do B. thuringiensis num genoma de .planta. 0 vector de transporte ó semelhante ao usado por C. L. Fink (1982), teee de Mestrado em Ciências, Universidade de Wisconsin-Madison, para colocar, 0 gene nos num plasmidio Ti de octopina. No presente invento, as sequências de codificação de proteína para nos são removidas e substituídas por um gene insecticida antes da inserção no plasmidio Ti. 0 resultado eventual é um plasmidio Ti tipo octopina contendo um gene insecticida expressável em células vegetais sob o controle de um promotor da sintase da nopalina.

3*1 Movimentação do gene nos para o interior do H13mp7

0 pCF44 (Fink, supra) foi digerido com Xhol, religado a si próprio, e transformado de novo em k802. 0 DNA do

plasmidio isolado de transformantes resistentes á ampicilina foi analizado com enzimas de restrição. Um plasmidio com um único ponto Xhol dentro das suas sequências de DNA derivadas de plasmidio Ti foi denominado pCF44a. A única posição Xhol foi o resultado do cancelamento de um fragmento de DNA entre as duas posições pCF44 Xhol. A expressão ueste fragmento Xhol resultou na completa remoção de dois loci Ciai inconvenientes.

0 pCF44A foi digerido com HindiII e BamHl, misturado com e ligado ao pBR322, que havia sido digerido com as mesmas duas enzimas de restrição e transformado em k802. Os transformantes resistentes á arap icilina foram seleccionados e examinados por anállso do enzima de restrição do DNA

-58I

Mod. 71 - 10 ΟΟΟ βχ.

55.710 Ref· 304116

"Γ

de plasmidio e foi identificada uma colónia que continha um plasmidio tendo o gene nos, rotulado pNS5.0 pN35 foi digerido com Bell e BamHI e foi misturado com e ligado a uma forma replicants circular de cordão duplo (RF) do vector de DMA de cordão único Ml3mp7, que havia sido linearizado com BamHI. Após a transformação da mistura em JM103 e. a selecção de placas brancas, foram identificadas duas colónias por mapeamento de restrição após isolamento de RF, denominadas M13-1 e M13-3, que continha os cordões nos sentidos directo e retrógrado respectivamente, quando em forma de cordão único.

Colocação do locus Ncol atrás do promotor nos

Um activador oligonucleótido tendo a sequência 5’ AGTCTCATÀCTCACTCTCAATCCAAaTÁATCTGC£ATGGAT3‘ foi sintetizado conforme descrito no Exemplo 10.1, Este oligonucleótido foi alterado na base sublinhada na sequência de ocorrência natural, na extremidade 5’ do gene estrutural nos. a alteração resultou na introdução de uma posição Mcol, 5’...C* CATGG...3’, no inicio de translação do ATG do gene nos. 0 oligonucleótido foi hibridizado ao DNA MI3-3 circular de cordão único Isolado de"virions" que haviam sido removidos do meio de cultura por sedimentação. 0 oligonucleó tido MI3-3 hibrido foi incubado cora ligase de DNA e o fragmento Klenow da polimerase I do DNa de E. coli, DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) foi enriquecido, e a mistura foi transformada em JM103. Os"virion^’produzidos pelos transformantes foram isolados e usados para infectar células a uma baixa multiplicidade de infecção. 0 DNA de RF foi isolado de um certo número dessas colónias infectadas e caracterizado por mapeamento de restrição. Os clones derivados do cordão activado com oligonucleótido mutante fo ram identificados pela presença de uma única posição Ncol,

0 que permitia aos mesmos serem linearizados por aquela enmutados

zima. Os clones/foram ainda caracterizados para localizar -59-

Mod. 71 - 10 000 βχ.

55.710

Ref:384116

~~T

o locus Ncol pela digestão com Clal, BamHI (para identificar moléculas linearizadas), e Ciai juntamente cora Ncol.

0 vector M13-3 mutado foi denominado M13-3a/Bl8a

3.3 Movimentação do gene insecticida para o interior de M13mp8

0 gene pl23/58-10 (Exemplo 1.1) foi digerido com EcoRI e misturado com, e ligado ao DNA de RF Ml3mp8 linearizado com EcoRI. Após a transformação da mistura em JM103 e a selecção das placas brancas, duas colónias tendo o fragmento portador do gene insecticida inserido em orlen tações opostas foram identificadas por mapeamento de restrição. Elas foram rotuladas MBT14 e MBT3 e tinham, respectivamente, os cordões em sentido directo e retrogrado quando em forma de cordão único.

3.4 Colocação de um locus Ncol no inicio da translacção do gene insecticida

Um activador oligonucleótido com a sequência 5’ GAGGTAACCCATGGATAACAAT3' é sintetizado como descrito no Exemplo 10.1. Este oligonucleótido é alterado nas duas bases sublinhadas a partir da sequência de ocorrência natural na extremidade 5’ do gene estrutural insecticida. A alteração resulta na introdução de um locus Ncol, 5'···

C*CATGG...3’, no inicio da translação de aTG do gene insecticida. 0 oligonucleótido ó hibridizado em DNA ΜΒΤ3 cir cular de cordão único isolado de virions que haviam sido removidos do meio de cultura por sedimentação. 0 hibrido oligonucleótido: MBT3 é incubado com ligase de DNA e o fragmento Klenow da polimerase II do DNa do E. coli, ccDNA, ó enriquecido, e a mistura e transformada em JM103· Os"virions” produzidos pelos trnaformantes são isolados e usados para infectar células a uma baixa multiplicidade de infecção. 0 DNa de RF é isolado de um certo número dessas colónias infectadas e caracterizado por mapeamento de restri-6Oíi......ítí.:

55.710

Ref:384116

Mod. Π - ίο 000 οχ.

ção os clones derivados do cordão activado por oligonucleétido são identificados pela presença de um único locus Ncol que permite aos mesmos ser linearizados por aquela enzima. 0 clone mutado é caracterizado, além disso por análise de enzima de restrição e a presença da sequência do mutante é confirmada por sequenciamento. 0 plasmidio cora a sequência desejada é rotulado MBT3 (Nco).

3·5 Montagem de um gene insecticida expressável em planta num vector de transporte.

0 DNA do RF de MBT3(Nco) digerido com Ncol e HindIII é misturado com, e ligado a um conector, sintetizado conforme descrito no Sxemplo 11.1, tendo a seguinte β estrutura: extremidade HindIII BamHI

5’ aGCTGACTAACTAG3»

3‘CTGÁTTGATCCTaT?’

Sste conector codifica os codons de paragem (sublinhados) em todas as três fases de leitura, e é terminado por um locus BamHI funcional e uma extremidade adesiva compatível com HindIII e incapaz de reconstruir um locus HindIII. 0 fragmento de DNA portador do geno insecticida é então aparado por digestaâo com Ncol e BamHI e é isolado por eletroforese em gel de agarose.

C pK3111-N (Flnk, supra) ó um plasmidio com um gene nos inserido no DNA Tn? (de pKS-4), que tem um gene kan fun cional, que está ele proprio, inserido no T-DNA do pKSlll-N.0 pKSlll-N é linearizado com SstII e digerido atá o fim com BamHI. 0 M13-3A/Bl8a é digerido com Ncol e SstII e o fragmento promotor SstII/Ncol é isolado por eletroforese de gel de agarose. 0 promotor SstII/Ncol e os fragmentos de gene Ncol/Bamlil são misturados com, e ligados aos produtores de reacção pK3111-N SstII/BamHI. A mistura de ligação é então transferida para o interior de E. coli k802. 0 plasrai dio isolado de transformantes resistentes á kanaraicina eáte

-6155.710

Ref: 384116

Mod. 71 - 10 000 ex. - 09-84

tracicllna é submetido á análise de enzima de restrição e

são identificadas as colonías contendo plasmidios idênticos ao pES131-N, excepto pela substituição de una parte 5’

do gene nos com um gene estrutural insecticida. Tal plesmidio é denominado pKSlll-NpBt.

3,6 Inserção dentro de plasmidios TIP, infecção de planta e regeneração.

0 S. coli k8c2 (pKS113-NpBt) é acasalado com A. tumefaciens conforme descrito no Exemplo 9· As estirpes de Agrobacteriura escolhidas abrigam plasmidios TIP, baseados em pTil5955, contendo mutações, tais como as descritas no Histórico, que facilitam a regeneração. Recombinantes homólogos são escolhidos conforme descrito no Exemplo 9 θ caracterizados por mapeamento de restrição. A eficácia da construção é rapidamente testada pela infecção de hastes de girassol. Os bugalhos resultantes são ensaiados por ELISA e borrões Western conforme descrito no Exemplo 7» θ por análise biológica, conforme descrito no Exemplo 8.

De acordo com o descrito no Exemplo 6, as estirpes de jigrohacterlum são usadas para infectar células de tabaco que são então regeneradas. As plantas resultantes são usadas como material reprodutor a ser cruzado com diversas variedades comerciais, para as quais se desejam propriedades de resistência a insectos. As plantas regeneradas e os campos dos seus descendentes que contém proteína insecticida são resistentes à infestação por lavras de insectos tais como a larva do tabaco, em virtude do efeito tóxico sofrido por tais lavras ao alimentarem-se de tecido de tais plantas. Exemple 4.

Este exemplo ensina outro método de inserção de um gene expressável da proteína insecticida do B. thurlngiensls num genoma de planta. A estratégia é semelhante á descrita no Exemplo 3, mas difere pelo facto de ser usado um prornotor vegetal ao invés de um promotor de T-DNA. 0 gene vege-6255.7io

Ref:384116

Mod. 71 - 10 000 βχ.

tal que fornece o promotor 6 a faseolira, que tem demonstra do ser activa em espécies diferentes da sua origem, o feijão Phaseolus vulgar! s L.

4. 1 Mudança do gene faseolina para o interior do Mljmp?

Conectores BamHI, tendo a sequência 5’ GGaTCC3', são temperados pai*a foxm;ar estruturas de cordão duplo, e ligados em extremidade rombuda para formar c onc ate nad ores. Estes concatâmeros são pare3almente digeridos com BamBI para expor as extremidades adesivas 5'GaTC. . .3’, que são compati veis com as extremidades adesivas geradas pelas enzimas BamHi, BÇII, BglII, Mbol, Sau3Al, e XhoII (5’GáTC...3*1 um clone de faseolina 177.4 fagócito de Charon 24A (S. M.

3um et al. (1981) Nature 289:37-41, J. L. Slighton et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U3a 80í1897-1901, também designado como AG-PVPh.177.4) é digerido com BglII e BamHi, misturado cor.: e ligado aos conectores concatenados, e completaraente digerido com BaraHI, para aparar os conectores e expox· as extremidades adesivas BamHi, um fragmento de 3:8 kbp contendo o gene da faseolina e sequências laterais 5’ ® 3’ é isolado por eletroforese de gel de agarose seguido de eluição. Este fragmento possui loci BamHi em qualquer uma das duas extremidades, visto que o local de conexão BamHi/ /BglII não é suscetível à acção de qualquer uma das enzimas. 0 fragmento de BglII/BamHI de 3:8 kbp pode também ser obtido de p8.8, um sub-clone de 177.4 baseado em pBR322,

0 fragmento de 3:8 kbp é misturado com e ligado ao M13mp7 RF linearizado com BamHi. Após a transformação da mistura em JM103 e a selecção de placas brancas, são seleccionadas duas colónias após a caracterização por anál3 se de restrição e hibridizaçâo dos RFs e do DWa fagócito. As formas virais do M13-3j8A θ M13-3,83 demonstram conter respectivamente, dos cordões de sentido retxOgrado e dix*ecto do ge da faseolina.

-63-

4,2 Colocação do locus Ncol atrás do promotor de faseollni

55.710

Refj384II6

0 Dna do Phaseolvs do iíl3-3,8a possui uma posição Ncol cerca d© 450 bp a montante da partida de transcrição da faseolina. A presença deste locus será inconveniente quando se desejar clivar o plasmidie no Ncol para que seja introduzido no Inicio de translacção da faseolina. 0 DNA de RF do Ml3-3,7a isolado é linearizado con Ncol e as extremidades salientes 5’ são preenchidas pelo fragmento Klenow da polimerase I do DNa do 3. coll. Após ligação da extremidade rombuda e transformação em JMlOj, os DNAS de RF são isc lados e caracterizados por mapeamento de restrição. S escolhide uma colónia que uibrigue um vector, denominado M13~3° 8ac, que carece do locus Ncol do DNA do Phaseolus, mas que de outro modo fica inalterado em relação ao Ml3-d, 8A.

-moqom - u-eon

Um activador oligonueleótido cora a sequencia 5’ ATaCTaCTCTACCATGGTGAGAGCAAGGG3’ Ó alterado nas bases sub linhadas em relação à sequencia de ocorrência natural na extremidade 5’ 80 gene da faseolina. 0 oligonueleótido é hibridizado com DNa de M13-d,8Ac de cordão ónico circular isolado de"virions'¹ que haviam sido removidos do meio de cultura através de sedimentação. 0 hibriao oligonueleótido:

1113-3 j8ac é incubado com ligase de DNA e o fragmento klenow de polimerase I de DNA do 3. coli, cccDNA é enriquecido, e a mistura é transformada em JM103· Os 'Virions" produzidos peles transformantes são isolados e usados para infectar células a uma baixa multiplicidade de infecção. 0 DNA de RF e isolado dentre um certo número dessas colónias infectadas e caracterizado por mapeamento de restrição. Os clones derivados do cordão mutante activado por oligonueleótido são identificados pela presença de um novo locus Ncol posicionado na extremidade 5' da sequencia de codificação. Os cio nes são, além disso caracterizados para localizar o locus Ncol por digestão com Ciai e Clal juntamente com Ncol. 0 vector íí13-3,9ac é rotulado Μ13-3>8αη.

-64- ·^!

55.71o

Ref: 384116

4· 3 Colocação de uru 10cus HindITT na extremidade 3 ¹⁷ ào

gene da faseolina.

Mod. 71 - 10 000 βχ.

Para introduzir convenientemente o gene insecticida no gene da faseolina, duas alterações adicionais devem ser feitas naquele gene da faseolina. A primeira alteração envolve a adição do locus HlndTTI (5’...AtAGCTT...3’) 5' ao locus de políadenilaçãc -> próximo da extremidade 3’ do gene de faseolina. A outra alteração importante envolve a colocação de paragem de translação (por exemplo, TAA,TAG, ou TGa, sublinhados abaixo) em todas astrês molduras de leitura. Quando o oligonucleótido

5»AGGGTGCATTTGAAGCTTGAATaAGTaAGAACTAAAATGC3' (a) é comparado com a extremidade 3’ da sequência de codificação do gene de faseolina (b), pode-se ver que o mesmo tem as proprieda des desejadas, como segue:

HindIII

a) 5'AGGGTGCaTTTGA* AGCTTGaATAAGTáAGaACTAAAATGC3’

b) ...aGGGTGCATTTGT gtactgaataagtatgaactaaaatgc... não coincidências: t TtTt T

Note-se também que este 3θ-^ιηθΓ° tem apenas 6 não coincidências, assegurando assim boas propriedades de hibridização durante a activação. 0 oligonucleótido

5^,aGGGTGCáTTTGAaGCTTGaATAAGTaàGaACTãAàATGC3’, sintetizado como descrito no Exemplo 10.1, é hibridizado em DNA de M13-3.8Aa circular de cordão único purificado de virions isolados pela centrifugação do meio de cultura. 0 higrido de oligonucleótido/M13-3»8Aa é incubado com ligase de DNA e 0 fragmento klenow de polimerase I de DNA de E, coli, cccDNA é enriquecido, e a mistura é transformada em JM103. Os virions produzidos pelos transformantes são isolados para infeccionar células a uma baixa multiplicidade de infecçâo. 0 DNA de Rl·' é isolado dentre um certo número das coió nias infectadas e caracterizado por análise de enzima de res

-6555710

Ref:384116

trição. Os clor.es derivados do cordão mutante activado por oligonuclsótido são identificados pela presença de um traçado de locus HindIII na extremidade 3’ Go gene da faseolina, e a presença de sequências mutantes em ambas as extremidades do gene estrutural 6 confirmada por sequênciamento.

Um vector contendo as desejadas sequências é rotulado como iíl3-3.8Ab,

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03*84

4.4 Inserção do gene insectlcida

0 DNA de RF de MBT3(Nco) é digerido com Nçol· e HindIII e é misturado com, e ligado ao DNA de M13-3«8Ab digerido com Ifcol e Hindi ll . A mistura é transformada em K802 o o DNA de plasmidio de transformantes resistentes à Kanamicina e/ou tetraciclina é isolado θ caracterizado por análise de enzima de restrição. Um plasmidio tendo o gene estrutural inseticida inserido entre 0 promotor de faseolina e o local de poliadenilaçâo é rotulado M13PpBt, e é escolhida uma colónia abrigando 0 mesmo.

4.5 Mudança do gene de faseolina modificado para dentro de

um vector de transpox^te.

0 pKSlll-K (Fink, supra ) possui 0 gene kan Tn5 do pKS-4 inserido entre os locais HindIII do T-DNA do pKSlll.

0 DNA de RF/1113-PpBt é digerido com BamHI e misturado com, e ligado ao pKSlll-k linearizado com BamHI (Fink, supra )<, Os plasmidios de transformantes de k802 resistentes â kanamicina e/ou à tetraciclina são isolados e caracterizados por traçado de restrição, á escolhida uma colónia que abrigue um plasmidio rotulado pKolll-PpBt, que contém a combinação de promotor de faseolina/gene estrutural insectlcida/ /local de poliadenilaçâo, que, juntamente com um gene Kan, e envolvido por T-DNA de octopina.

6 Inserção dentro de plasmidios TIP, infecção da planta,

e regeneração.

55.710

Ref:384116

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-34

⁰ Poli K802 (pK3111-PpBt ) é acasalado cora 1. tumefaciens conforme descrito no Exemplo 9. As estirpes de agrobacterium escolhidas abrigam plasmidios TIP, baseados em pT115955, contendo mutações, tais como as descritas no Histórico, qu© facilitam a regeneração. Recombinantes homólogos são seleccionados conforme descrito no Exemplo 9 e caracterizados por mapeamento de restrição. A eficácia da construção é rapidamente testada pela infecção de hastes de girassol. Os bugalhos resultantes são ensaiados por ELISA e borrões Western, como ó descrito no Exemplo 7 e por ensaio biológico, como se descreve no Exemplo 8. Conforme descrito no Exemplo 6, as estirpes de Agrobacterium são usadas para infectar células de tabaco que são então regeneradas, as plantas resultantes são usadas como material de criação para serem cruzadas com diversas variedades comerciais, para as quais se desejam propriedades de resistência a insectos. Os campos de plantas regeneradas e seus descendentes contendo proteína insecticida são resistentes à infestação por larvas de insectos tais como a larva do tabaco, em virtude do efeito tóxico sofrido por tais larvas ao alimentarem-se com o tecido de tais plantas.

Exemplo 5

Neste Exemplo a regeneração envolve tumore3 da cenoura despertados por plasmidios TIP baseados em Ri e é efectuada esseneialraente conforme é descrita por lí-D, Chilton et al. (1982 ) Nature 295:432-434,

5o1 Infecção cora raiz fibrosa

9

Discos de cenoura são inoculados com cerca de 10 bactérias em 0,1 ml de água . São cortados segmentos de ura a 1,5 cm das extermidades das raízes obtidas , colocadas em meio Uonier sólido (1-1,5# agar) carente de hormonas (D„ A« Tepfer ά J_o C„ Tempe (1981) Cr₀ hebd, Seanc, Acad. Sei., Paris 295:153-156), e desenvolvidos entre 25 C e 27 C no escu-67-

55.710

Ref:384116

ro. às culturas não contaminadas por bactérias s5o transferidas a cada 2 a 3 semanas e são sub-cultivadas em meio Monier sem hormonios nem agar₀ As raízes transformadas podem ser reconhecidas pela sua morfologia aberrante e selec cionadas .

MOD. 71 — 9.000 EX. — 03-84

5o2 Regeneração de raízes em plantas

0 tecido de raízes cultivado descrito no Exemplo 5«1 é colocado em meio Monier solidificado (0,8# agar) suplementado com 0,3/fM 2,4-D e 0,72hií de cinetina. Após 4 semanas, o tecido calosso resultante é colocado em meio Monier liquido sem hormonas, Durante a incubação a 22-25°C num agitador (150 r₀ p_o m. ) durante um mes, o calo disassocia-se numa cultura em suspensão da qual se diferenciara embriões que, quando colocados em discos de Petri contendo meio Monier desprovido hormónio, se desenvolvem em plantinhas, Essas plantirihas são desenvolvidas em cultura, e após "endurecimento" por exposição a atmosferas de humidade progressivamente decrescente, são transferidas para o solo, quer numa estufa quer num lote no campo»

Σύ 0 uso de vectores de raiz não fibrosa

Cs vectores baseados em Ti que não têm genes tmr funcionais são usados em vez de vectores baseados em Ri, conforme descrito por T. C. Hall et al., pedidos dos EUA números de série 485o613 β 485.614. A construção de mutantes adequados pode ser feita pelos especialistas na arte, e é revista no Histórico.

Exemplo 6

A regeneração deste Exemplo envolve tumores de tabaco incitados por um plasmidio TXP baseado em Ti e é essencialmente efectuada conforme descrito por K. A. Barton et al. (1983) Cell 32 :1033-1043.

-68-

55.710

Ref: 384116

6.1 Infecção com bugalho

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84

0 tecido de tabaco é transformado segundo uma abordagem que utiliza segmentos de haste invertidos, primeiramente descritos por λ. C. Braun (1956) Canc. Res, 16:53-56. As superficies das hastes esterilizadas com uraa solução que era de 7/o de Chlorox comercial e 80# de etanol, enxaguada com água destilada estéril, cortada em segmentos de 1 cm, colocada com a extermidade basal em discos de Petri contendo meio M3 solifiçado com agar (T. Murashige & F. Skoog (1962) Physiol. Planto 15 : 473-497 ) desprovido de hormônios, A inoculação é efectuada perfurando-se a superfície basal cor. tada da haste com uma agulha de seringa e injectando bactérias,, as hastes são cultivadas a 25°C com 16 horas de luz por dia. as calosidades que se desenvolvem são removidas da superfície superior dos segmentos de haste, colocados sobre meio MS solidificado contendo 0,2 mg/ml de carbenicili_ na e desprovidos de hormônios transferidos para meio fresco de MS-carbeniciclina, três vezes a intervalos de cerca de um mês, e testados para assegurar que as culturas estão livres de bactérias. Os tecidos axámicos sâo mantidos sobre meios MS solidificados desprovido de suplementos, sob as condições de cultura (25^CTC;l6 h. :8h. luz/escuro) descritas acima.

6,2 Cultura de tecido transformado

Os clones sâo obtidos dos tecidos axémlcos transformados conforme descrito por A. Binns & F_o iíeins (1979) Planta 145:365-369* as calosidades são convertidas em suspensões de células através de cultura em MS liquido tendo 0,02 mg/1 de ácido acético denaftaleno (NMA a 25^eC durante 2 ou 3 dias enquanto 3ão agitados a 135 r.p.m., β filtrando- se alternadamente, através de malhas ds aço de 543 «213 >um

0 filtrado passado é concentrado, colocado em 5 ml de meio MS contendo 0,5$ de agar derretido, 2,0 mg/1 NAA, 0,3 mg/1 de cinetina e 0,4 g/1 de extracto de levedo Difco a uma den

-6955.710

Ref:384116

MOD. 71 — 3 000 EX. — 03-84

sidade de cêrca de 8 x 10^ células/ml. Quando as colónias alcançam uia diâmetro de cêrca de 1 mm são recolhidas a ponta de bisturi, colocadas sobre e cultivadas em meio M3 tendo 2,0 rng/1 NAA, 0,3 nig/1 de quinetina e cerca de 10 ug/rnl de S-(2-aminoetilo)-L-cisteXna (aEC). (É tentada uma gama de concentrações de AEC, entre cerca de 2ug/ml e cerca de 30ug/ml, visto que a concentração eficaz exacta para a selec ção dependerá 'da variedade de tabaco usada e das condições de crescimento às quais a planta de fonte e os tecidos deri vados da mesma são submetidos). A AEC tem demonstrado ser um agente capaz de seleccionar tecido contendo sintase de octopina (G. a. Dahl A J. Tempó (1983) Theor. Appl. Genet., no prelo). Alternativamente, o filtrado é colocado a baixa densidade (várias centenas de células por ml) sobre um papel de filtro sobrepondo-se a uma camada ds alimentação de células de tabaco crescendo sobre o meio de MS/NAa/ quinetina/ extracto de levedo. Quando colónias de 1 mm tiverem sido formadas, todo o papel de filtro é transferido para uma placa de Petri contendo o meio MS/NaA quinetina/AEC solidifica doo Os calos resultantes, que não apresentem o efeito de toxicidade pela AEC são seleccionadas, divididas em pedaços, e testadas quanto a outros fenotipos transformados tais como a produção de octopina e o crescimento independente de hormonio.

Regeneração de plantas

Os clones transformados são colocados sobre meio MS solidificado com 0,3 mg/1 quinetina, e cultivados conforme descrito no Exemplo 6.1. As ramificações que se formam são enraizadas colocando-as num meio sólido 1,0# agar) contendo sais de meio MS com 1/10 de força, 0,4 rag/1 de tiamina, carente de sacarose e hormónios, e tendo ura pH de 7,C. As plantinhas arraigadas são desenvolvidas em cultura, endurecidas conforme descrito no Exemplo 5· 2, e transferidas para

—70—

ΟΙ Λ

Ref: 38413 6

c solo , quer numa estufa quer num lote no campo. As plantas são examinadas quanto à retenção dos fenotipos transformados por métodos bem conhecidos dos especialistas do ramo, tais como manchas Southern, Northern e de ponte com sondas apropriadas, ensaios de octopina, ensaios imunológícos (Vide Exemplo 7), ou biológicos (Exemplo 8) quanto à presença da proteína cristalina.

6c, 4

Vectores usados

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84

àas construções descritas por T. C, Hall et al,, pedidos dos EUa Números de série 485.613 e 485.614 são vectores baseados em Ti adequados, carecendo de genes tmr funcionais, 0 método descrito no Exemplo 6.3. para a infecção de segmentos de haste invertidos é frequentemente útil para o estabelecimento de linhas de células vegetais transformadas por TIP₀

Exemplo 7

Um anticorpo de proteína anti-insecticida foi produzido por métodos bem conhecidos dos especialistas do ramo da Irounologiac Manchas “Western”, para detectar antígenies após electroforese com gel de 5DS-poliacrilamida, foram feitos essencialmente conforme descrito por R. P. legocki 4 D. P. S. Verma (1981) Analyt. Biocbem. 111

Ensaios micro-ELISA (ensaio imuno-sorvente de enzima encadeada)são feitos utilizando-se placas tipo Immulon con 96 cavidades, através dos seguintes estágios:

Vinculação do anticorpo às placas

No dia 1, as cavidades são revestidos com uma diluição a 1:1000 de anticorpo (proteína IgG anti-insecticida de coelho) em tampão de revestimento. 200, yul/cavidades são incubados a 37^CC durante 2-4 horas. As placas são cobertas com Envoltório Saran durante esta incubação. Subsequentewei te, as placas são enxaguadas três vezes com Tween salino

-7155-710

Ref·ββΑΙΙό

tamponado com fosfato (PBS-Tween) com uma espera de 5 minuentre cada estágir de lavagem. Então é aci-e scentado albumi na de serum com borína a 1$ (BSA) ao enxaguamento e, após adição à cavidade e deixada ern repouso durante 20 minutos antes de ser descartada. 0 enxaguamento é repetido mais cin co vezes com PBS-Tween.

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84

7.2 Homogeneização do tecido

0 tecido é cortado em pequenos pedaços e então homogeneizado com um politron usando 1 gm tecido/ml de Tween salino tsmponado coro fosfato-poliviniio pirrolidona-40 (PBS-Tween-2$ PVP-4C) Todas as amostras são mantidas em gelo antes e após a moagem e são obtidas curvas padrão. Uma curva padrão é obtida dos homogenatos de tecido e uma curva pa drão 6 também obtido no tampão para se verificar a recupera ção da proteína insecticida do tecido ou células homogenizadas. A.pós a centrifugação das células homogenizadas, iCOul de cada amostra são colocadas num furo e deixadas durante a noite a 4°C. Para evitar erros, são feitas cópias de cada amostra duz^arite a incubação. As placas são seladas.

Enzima de vlnculação

Após a incubação durante a noite, o antígénio é descartado e as cavidades são lavados cinco vezes com PBS-Tween esperando-se 5 minutos entre cada enxaguamento.

Um conjugado (proteína anti-insecticida IgG de coelho encadeada coro fosfatase alcalina) é então dlluido a 1:3000 no PBS-Tween-2$ PVP contendo 0,2$ de BSA θ acrescentam-se a cada cavidade seguido de incubação durante 3“6 horas a 37°C. Após a incubação, o conjugado é descartado e as cavidades são enxaguados cinco vezes com PBS-Tween, esperando-se cinc-o minutos entre cada enxaguamento, como anteriormente. 7.4 Ensaio

-7255.71c

Ref:384116

I

Imediatamente antes de realizar o ensaio, um comprimido de 5 mg de fosfato de P-nitrojenito (obtido da Sigma e guardado congelado no escuro) ó acrescentado, para cada 10 ml de substracto e centrifugado ate que o comprimido seja dissolvido. 200 yul da solução à temperatura ambiente são ràpidamente acrescentados a cada furo, A reacção é medida er.i vários tempos, por exemplo, t-0, 10, 20, 40, 60, 90,θ 120 minutos, usando-se um leitor Dynatech Micro-ELISA. Quando 0 fosfato de p-n3trofenilo que é incolor, for hídrclizado pela fnsfatase alcalina em fosfato inorgânico e p-nitrofenol, o último composto Confere uma côr amarela à solução, que pode ser lida espectrnfotométricamente a 410 nm.

MOD. 71 — 9.000 EX. — 09*94

Exemplo 8

Insectos de fontes comerciais foram obtidos e mantidos essencialmente conforme descrito por R. A. Bell & F. G. Joé> chim (1976) Ann. Entomol Soc. Amer. 69?3^5-373} ou R.T. Yamamotc (1969) J. Scon. Entomol. 62:1427-1431. Ensaios biológicos de proteína insecticida foram realizados alimentan. do larvas de Manduca sexta com extraetos daquela,virtualmente conforme descrito por J, H. Echesser et al. (1977) Appl. Environ. Microbiol. 33? 878-880.

Exemplo 9

Acasalamentos triplos forem geralmente realizados conforme descrito abaixo; outras variações conhecidas dos especialistas do ramo são também aceitáveis. 0 Ξ. coli k802 (vector de transporte baseado em pRK290) foi acasalado com E. celi (pRK2013) e um plasmidio TIP portador da estirpe cepa de A. tumef aciens resistente à estreptomicina. 0 pRK2013 foi transferido à estirpe levando o vector de transporte e mobilizou o vector de transporte para transferencia ao Agrobacterium. 0 crescimento num meio contendo simultaneamente a estreptomicina e a medicação à qual o vector de transporte

-7355.710

Ref: 384116

ΜΟΒ. 7» — 3.ΟΟΟΕΧ. — 03-84

e resistente, fre que nte me nte kanamicina ou cloranfenicol, resultou na selecção de células de /agrobacterium com sequên cias do vector de transporte. Um acasalamento dessas células com E. coli (ppHlJl) resultou na transferência de pPHlJl ks células de Agrobacterium. Os vectores de transporte baseados em pPHlJl e pRK290 não podem coexistir por muito tempo na mesma célula. 0 crescimento em gentamicina, a qual o pFHlJl trés um gene de resistência, resultou na selecção de células que tinham perdido as sequências pRK2?C. ás únicas células resistentes à estreptomicina, ge nt utiu ic ina, e kanamicina são aquelas que têm plasmidlos Ti que foram submetidos a recombinação homologa dupla com o vector de transporte e agora são portadores da construção desejada. 0 pRK290 e o pRK2013 foram divulgados por G. Di-

Exempln 1

Este exemplo descreve técnicas para a sintesn e uso de oligonucleótidos sintéticos. Outras referências úteis podem ser encontradas na lista de trabalhos citados na secção introdutória a estes Exemplos.

10.1 Sintese de oligonucleótidos

as técnicas de sintese quimica de fragmentos de DNA usadas nestes Exemplos utilizam um certo número de técnicas bem cpnhccidas dos especialistas do ramo da sintese do DMA.

G. kliorana (1965) J. amer. Chem. Soc. 52:2990» a preparação de fosforamiditas de desoxi-nucloosideos é descrita por 3. L. Beaucage u M. lí. Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1559· a preparação da resina de fase sólida é descrita por 3. P, Adams et al. (19θ3) J· Amer. Chem, Os processos

.e-eo — Χ3 ooo e — ií -qow

de hibridação úteis durante a formação de conectares sintéticos de cordão duplo estão descritos por J. J. Rossi el al. (1982) J. Biol. Chem. 257:11C70.

10»2 Uso dos Oiigonucleótidos

0 uso de oligonucleótidos sintéticos para reconstruir um segmente cancelado de um gene tem sido exemplificado por Hall »t al.» pedido dos EUà número de série 485.614. 0 uso

de oiigonucleótidos para conectar extremidades aderentes do loci de restrição de nutro modo incompatíveis tem sido exemplificado por Hcill st al., podido dos ELA número de série 485.814 o é bem cor.hocído des especialistas na arte de manip ul a ções de DI'A re c o m L i n an t e.

10.3 Mutagenese dirigida por Oiigonucleótidos

Záétodos gerais de mutagenese dirigida foram revistos recente mente por D. Shortle et al. (Γ981) Ann. Rev, Genet. 1^:205-294. De especial utilidade na manipulação ds gene é a mutagenese dirigida por oiigonucleótidos específica a uma posição revista recente mente por K. J. Zoller a M. Smith (1963) He th, Ensymol. 100:468-500 e il. Smith A S. Gillam (1981) in Genetic Engineering; Principais and Methods; Vol. 3, eds: J, K. Setlow a A. Hollaender, e íí. Smith (1964) Trends in Biochem. ^:440-442. Esta técnica permite a alteração de um ou mais pares de bases numa sequência de DNA ou a introdução de pequenas inserções ou cancelamentos. Exemplos recentes do uso da mutagenese dirigida por nucleotidos incluem LI.J, Zoller A il. Smith (1983) supra), il. J. Zoller A hl. Smith (1932) Nucleic ..cids Res, 10:6487-0500, G. Dalbadie-McFarland et al. (1962) Proc. Acad. Sei. USa 79:6409-6413, G, F. M. Simons et al. (1982) Nucleic Acids Res. 3O:b2l-832, e C. a. Hutchison III et al. (1978) J.BioL Chem, 253:6551-6500. Vectores úteis baseados em M13 (por

-75-

Aid: 3S4II0

>5.710

Mod. 71 * 10 000 ex.

exemplo, ra7»B2344) foram relatados por 7/. M. Barne s et al. U'z'83; Me th. Ensymol. 101:98-122, e M, Barne 3 ã M. Be van (1983) Nucleíc Acids lies, 11:349-308.

a sequência a ser modificada á introduzida usualmente num vector bacteriófago de cordão simples, aqui u;a derivado de Mio, por técnicas padrão bem conhecida dos que se dedicara ao ramo. 0 vector Dna está geraimente na forma replicanto de cordão duplo (hl·'), visto que a forma virai de cordão único não pode ordi.iár lamente ser “cortada e amarrada’’ por enzymas dc restrição θ ligases₀ Após a ligação in vi_tir do fragmento ao Γώ', transformação nura hospedeiro adequado, e produção ds DBA de cordão único (ssDBA) como parte do cicio vital do vector. 0 ssDNA é isolado das particulas do b^cteriófagos e Mbridado com um oligonucleótido Com suíici ente compi·Imanto θ homologia de sequência para so hibridar ao vector na localização apropriada, 0 oligonucleótido deverá ter a sequência desejada como produto final e,outrossim, nâo diferir de modo algum da sequencia a ser alterada.

U: <i vez que seja formado um híbrido compreendendo um círculo de ssDNA ligado com bnso de pares ao oligonucleótido que contém a sequência matar, to, o oligonucleótido activa a síntese de um cordão de DKA complementar pelo fragmento Elanow da polimerase I do DBA do E.coli, uma polímeras® sem «ctivi dade de exonuele >se 5’-a-3’· C vector é, opcionalmente, incuhixdo com lígase do LBA θ as reacções de polímera so e liga se podem ser feitas simultaneamente. Moléculas de DBA de cre dão duplo circular (c ,preferivelmente fechadas de maneira covalente, podem ser seleccionudas antes da transfor mação por técnicas que incluem centrifugação com gradiente de sacarose alcalina, extracção com fenol sob condições alcalinas, e incubação com nuclease Sl. 0 vector pode agora ser transformado numa célula bacteriana hospedeira especial, as narticulas de vírus desta infeccão inicial são isoladas

-,c55.710

Ref:384116

9 usadas para formar placas, infectando-se uma camada de bactérias. Nos casos em que se esteja mudando um locus de restrição, pode-so rapidamente examinar os RFs por análise de enzima de restrição. Pode-se também fazer separação po: bibridação em condições cuidadosamente escolhidas, usando o activador oligonucleótldo mutante sintético como uma sonda, ou por sequenciamento de DNA. Quando um clone contendo a alteração desejada for isolado, pode-se manipular o novo DNA mutante conforme desejado, usando-se técnicas bem conhe cidas dos especialistas.

Exemplo 11: Construção, transformação e expressão do gene insecticida

MOD. 71 — 3.000 EX. — O3G4

Para reconstruir um gene de protoxina completo, foram identificados locais de restrição de flanqueamento DNA por intermédio de borrões "Southern’’ de dissolução de restrição, uma técnica bem conhecida, e foram escolhidos clones de sobreposição ae uma biblioteca Pstl feita de 50 MD de DNA de plasmidio enriquecido, as extremidades 5’“ ® 3‘“ do gene ue protoxina foram, em seguida, fundidas em conjunto local único HindIII para formar um gene completo de protoxina, como será compreendido pelos peritos na arte, transportado por um plasmidio denominado p3t73-i6· 0 S. coli HB101

(pBt73"l6> está depositado como NRRL B-15759.

0 pK3-prol foi construído essencialmente confirme se descreveu no Exemplo 2.2. 0 DNa pK3-prof foi digerido com

Ciai, preenchido com polimerase de DNA TH e ligado a um conector 5’CGGaTCCG3’, para formar o pK3-proI (Bam). C DNa pBR325 (F.Bolivar (1978) Gene 4:121-136) tendo crescido em E. coli GM43 (M.G. Marinus (1973) Molsc. Gen. Genet. 127:47-55)j foi digerido com Bcl I e BamH I, religaao a si próprio, formando por isso um plasmidio denominado pBR325aBB{ carente do fragmento Bcl Ι/BamHI de pBR325. Um fragmento de 4.2 Kbp EcoRI de pK8-prol (Bam), foi clonado no ponto

-77-

55.710

Ref:304116

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84

BcoRI do pBR325 a BB, formando assim um plasmidio denominado p403B, que possui o T-LIU de pKS-proI(Bam) transferido do vector baseado em pRK 290 para um vector baseado em pBR325.

Em seguida o DNA p3T73-l6 foi digerido com Nd cl e as extremidades tornadas rombudas cora polimerase de DNA de T4. 0 DNA Bacillu-s de extremidades rombudas foi misturado com e ligado a um DNA RF Ml3mpl9 de cordão duplo, linearizado-ftnal (J. Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106),formando ura vector, denominado 1.6.4, possuindo um DNA Bacillus 3.6 kpb, de tal modo orientado que a forma de cordão simples era complementar à proteína cristalina mRNA (isto é, a fase que transporta o cordão de sentido retrógado). Uma posição BamHl foi introduzido no interior do DNA Bacillus próximo de 5^,-Pára a posição de partida translactiva da proteína crsitalina, essencialmente conforme descrito no Sxemplo 10, utilizando um local BamHl que continha activador de oligonucleótido com a extremidade 5'“ do gene estrutural insecticida da sequência 5^AGaTGGAGGaTCCTTaTGGaTáACJ, que resulta num vector denominado 1.6.4B-3·θ·3· 0 gene estrutural de proteína insecticida pode ser removido do DNA Rl·' 1.6.4B-3.8.3 de cordão duplo num fragmento BamHl do 3,75 kpb.

Os DNAs ρ 403B e 1.6.43-3.8,3 digeridos com BamHl foram misturados ura Cora 0 outro e ligados era conjunto, forman do um plasmidio, denominado p’03B/BTB4<3, possuinso um comprimento total de gene estrutural de proteína insecticida, situado entre o promotor ”1.6” e a posição de poliadenilaçãc. A orientação desta construção resulta na síntese de proteína cristalina com o código mRNA quando transcrita do promotor ”1.6".

0 ^c°lí ^c 800 (pRK-203“kan-103-Lec), que está depositado como NRRL B-15821, 6 ura derivado pRK290 que contém

-7855.710 Ref: 364 Uc-

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-34

as sequências T-DNA de pTil5955 de entre os locais EcoRI nas posições 4,494 e 12, 823, conforme definido por R.F. Parker et al. (1983) Plant Vol, Biol. 2:335-350, excepto para a substituição de um gene kan derivado de Tn£ e un gene lectin para T-DNA entre o local de posiçSo 5,512 HindiTI e o local de posição 9,062 BamHI. 0 gene lectina é suprimido de pRK-2C3-kan-3OJ-Lee por digestão com IlindlII seguida de religação, que resulta nnn vector denominado pRK-203-kan-103. 0 pRP-203-kan-103 -fni introduzido num ÁTCC15995

A. tumefaciens essencialmente conforme descrito no Exemplo 9 Identificou-se um duplo recombinante homólogo, denominado R32014, possuindo um T-DIÍA pTil5955 modificado. Esta substitição suprime alguiric s sequências tmr e tms. Conforme referido na Descrição Pormenorizada. 0 T-DNA RS2014 transforma o tecido vegetal inoculado sem conferir o fenotipo d« descimento independente .ie hormonas. Os tecidos de tabaco tx*ansformados por derivados de R32014 poderá ser regenerados ei.i plantas normais utilizando registos bem conhecidos da técnica.

Ho agrobacterlum, os derivados pBR325 são "vectores suicidas" conforme descrito na Secção Histórico era Vectores Suicidas. Foram acasalados Ξ. coli MC10Ó1 (p403/BTB/^ 3),

E. coli (pRK2013) e A. tumefaclens. ?oi isolada uma. estirpe denominada Pg-H, contendo células de A.tumefaclens que possuem p4C3/BTB/y 3 cointegradas era pTil.5955 trar"tms ”, por meio de uma recombiraçSo homóloga simples num lado da posição de poliadenilação, isto é, para a esquerda, do gene estrutural "1.6". (0 gene "1.6" corresponde a 0RF24 de Baker

et al. supi'v>).

Segmentos de hastes de Nicotiana tabacum var. Xanthi,

foram inoculados com células de R3-11 essenoialmente confor

me descrito no Exemplo 6. Uma vez livres da bactéria de incitamento, os tecidos vegetais transformados são postos em

-79-

55.710

Ref; 384116

cultura, clonodos com célula única, e regenerados em plantas normais utilizando processos bem conhecidos da técnica da cultura de tecidos vegetais.

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03*84

Larvas de túbaco alimentadas com tecido de calosidade de tabaco, que continha o comprimento total do gene de proteína insecticida expressável em vegetal foram observadas a revelar sintomas atribuíveis à toxicidade da proteína cris talina 3. thuring Iensis.

Borrões de "ponto” imonulógicos análogos aos borrões "Western" (Exemplo 7) indicaram que o antigénio de proteína cristalina B. thuringiensis estava presente em extractoí de tecido transformado contendo o comprimento total de gene da proteína insecticida expressável em vegetal.

-8055.710

Εθχ:3θ411ό

ΤλΒΕΙα 1

lnsectos susceptíveis à proteina insecticida do P. thuring 3en.;l s

MOO. 71 — 3.000 EX. — 03-84

COLEOPTSRa

Popillia japonica (besouro japonês)

Sitophilus granarius (lagarta do silo)

DIPTERA

Aedes aegyptl ( mosquito da febre amarela)

A atlanticus

A cantans

a.capsius

a. cinereus

Á communis

a. detritus

A_o dnrsalls

A. dupreei

a. menalinon

Ao nigrcmaculis (mosquito da pastagem)

A. puneter

Ã. sierrensis (mosquito de ôcn de árvore ocidental)

A. sollícitans (mosquito castanho de pântano salgado) Aedes sp.

A. Taeniorhynchus (mosquito negro de pântano salgado) A. tarsalls A. tormentor a. triserlatus

A. V3Xans (mosquito de alagado continental)

Anophele s cruc ians

AA· freeborni

a. quadrimaculatus (mosquito comum da malária)

Ai* sergeritii A. stephensi Anopheles sp.

Chíronomus plumosus (Chironomus:mosquito-pólvora)

- 815571o

Ref: 384116

Chironomus sp.

C. tummi Culox erraticus

MOO. 71 — 3.000 ex. — 03*84

C. 1 rior nata

C. nigrup_c.lus

C.peus

C. pipiens (mosquito doméstico do norte)

C. quinquefasc-iatus (C. pipiens fatigans) (mosquito domés tico do sul).

C. restuans

Culex sp

C. t r i t ae n i o r 1 iy nc hu s

C. tarsalis (mosquito da encefalite ocidental).

C. territans

C. inivittatus

Culiseta incidens (Culíseta: mosquitos)

C. iriornata

Diamessa sp.

Dixa sp. (Dixa: mosquito pólvora)

Susimulium (oimulium) latipes (Susimulium: mosquitos)

Goe1d i ch ir n nomu s ho lo pr a. s i nus Haematobia irritans (mosquito trombeteiro)

Híppelates collusor

Ogdamia ornata

Pales pavida

Polpomyia- sp. (Polpolyiaj mosquito pólvora, mordedor) Psoi-ophora ciliata

P. columiae (eonfinnis)(mosquito do3 Glades da Flórida, mosquito negro do arrozal).

P. ferox

Simulium alcocki (Simulium: pulgões do algodão)

3. argus

3. carvicornutum

3. d&inttosum

3. jenningsi

3. pjperi.

“· o

55.710

Ref:384116

3₀ tescorum

MOD. 71 — 3.000 EX. -03-84

S. tubere sum

3 o unjcnrni.ituni

3, ve nu st um

3. verecundum

3. vlttatum

Vranotaenia inguiculata

U. lowii

Wyeomia mitchellii (Wyeomyiaj mosquitos)

W. vanduzeei

HYMENOPTEÍU

athalia rosae (as colibri)

Ner.iatus (Ptercnidea) ribesii (lagarta da groselha importada) Neodipricn banksianae (mosca do pinheiro)

Priophorus tristis

Pristiphora erichsorJ.i (môsca do lariço)

LEPIDOPTSRÀ

acba&eu janata

Àchroia grisella (traça da cera, pequena)

Àchyra rantalis

acieris varlana (lagarta dos brotos de cabeça negra) Acrobasis sp. acrolepia alliella

acrolepiopsis (^crolepia) assectella

ádoxophyes orana (enrnladora da folha de macieira) Áegeria (3anriinoldea) exitinsa (perfui^adora de folha de.

pe s segue iro)

Aglais urticae

agriopsis (Erannis) aurantiaria (Erannis: larvas) λ, (E,) leucophaearia a. marginaria

Ágrotis ipsilon (as ypsilon) (lagarta cortadora negra) Á. segeturn

^labaraa argj.lacea (lagarta da folha do algodoeiro) Alsophila aescularia.

8355.71c

R©f:38411b

MOD. 71 “ 9.000 EX. — 09*04

/

a. pometaria (lagarta do cancro de outono)

Amorbia assigana

Anadevidia (Plusia) peponis

Anisota senatoria (lagarta do carvalho riscada, côr de laranja)

Anomis flava

a. (cosmophila) sabulifera

Antheraea perriyi

Anticarsis gemraatalis (lagarta aveludada do feijão) apocheima (Biston) hlspldaria a, pilosaria (pediria)

Aporia crataegi (traça branca com veios negros)

Archips argurospilus (enr-ladora de folha de árvores frutíferas) .

a. cerasivoranus (lagarta de ninho feio)

xi. crataegana

a· poaana

A. (Cacoecia)rosana

A. xylosteana

Arctia caja

.Argyrotaenia inariana (enroladora de folhas de risca cinzent^ A. velut inana (enroladora de folhas de risca vermelha)

Ascia (Pieris) monuste orseis

Ascotis sele nar ia

Atteva aurea (laganta de teia do alianto)

Autographa californica(lai'va da alfafa)

A. Plusia) gamma

A nigrísigna

Autoplusia egena (devoradora de folhas de feijão)

^.zochis gripusalis

Bissetia steniella

Bombyx mori (bicho da seda )

Brachyonicha sphinx

Bucculatrix thurberiella (perfuradora da folha do algodoeiro) Bupolus piniarius (Bupolus:larva)

C ac oe c imorpha pro nubana

-8455.710

Refi384116

MOD. 7t — 3.000 EX. — 03*84

/

Cactoblastis cactorura

Callptilia (Gracillaria) invariabilis

G_e (G.) syringella (mineira da folha de lilás)

Co (G.) theivora

Canephora asiatica

Carposina niponensis

Ceramidia sp. .

Cerapteryx graminis

Chilo auricilius

Co sacchariphagus indicus

C. suppressalis (perfuradora da haste do arrozeiro) Choristoneura fumiferana (lagarta do broto do abeto verme

lho)

Co murinana (enroladora do broto do abeto)

Clirysodeixis (Plusia) chalcites

Cie psi s spectrana

Criaphalocrocis medinalis

Coleotecbnite s (Recurvaria) mi lie ri (mino ira de agulha das

e stacas)

C. nane11a

Colias eurythema (lagarta da alfafa)

C, lesbia

Colntois penriarla

Crambus boiijfatellus (traça fulva dos relvados lagarta da grama).

C. sperruellus

Crambus spp.

Cryptobla.be s gnidiella

Cydia funebrana

Co (Grapholitha) molesta(traça oriental da fruta)

C. (Laspeyresta) pomonella (traça dos promídeos)

Datana integerrima (lagarta da noz)

D. ministra (lagai*ta de gola amarela)

Dendrolimus pini

D. sibirlcus

-6555.71c

Ref:384116

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-04

De pres sar 1a marcella (uraa lagarta tecelã)

Desmia funeralis (enroladora da folha da uva)

Diaehrisia (Plusia) orichalcea (uma semi-larva)

Diacrisia virginica (lagarta lanosa amarela)

Diaphania (Margamnia) indica

D. nitidalis (lagarta do picles)

Diaphnra mendica

Diatraea grandinsella (bmca do milho do sudoeste)

D. saccharalis (broca da cana de açúcar)

Dicomeris marginella (lagarta tecelã do junipero)

Drymnnia ruficornis (as chaonia)

Drymonia sp

Dryncampa rubicunda

Earias insulana

Ectropis (Boarmia) crepuscularia

Ennomos subsignarius (lagarta do olmo)

Ephastis (Cadra) cautella) (traça da amendoeira)

Ξ. Elutella (traça do tabaco)

E. («nagasta) kuehniella (traça meditsrrânica da farinha) Epiriotia tsugana (una devoradora de folhas)

Epiphyas postvitanna

Erannis defoliaria (traça mosqueada castanha)

Ε. tiliaria (larva da tilia Erinnysis ello

Eriogaster henkei

3. lanestris

Estigmene acrea (lagarta dos pântanos salgados)

Eublemma omabilis

Euphydryas chalcedona

Eupoecilia ambiguella

Euproctis chrysorrhoea (Nygml phaeorrhoea)(traça de cauda castanha)

3. fraterna

3. pseudoconspersa

Eupterotõ fahia

-86-

55.710

Ref: 384HÓ

Eattomula (Simacthis) pariana

Euxoa messoria (lagarta cortadora de flancos escuros) Gallerla mollonella (traça da cêra, grande) dastropacha quercifolia

Ilalisdota argantata

H. caryao (traça dos tufns da nogeuira)

Marrisina brillians (devoradora das folhas da uva ocidentaj) lledya nubi.ferana (tr*ça tortrix das árvores frutíferas) Heliothis (Helicoverpa) argigera (Heliothis Chloridea)

(broca da vigera d,-> grão de bico)

8. k. H.) as sul ta Heliothis peltigera

H. virescens (lagarta do broto de tabaco)

ii. viriplaca

Π. zea (lagarta do algodão, lagarta do .milho, lagarta da soja, lagarta do tomate, lagarta do sorgo, etc.)

Rnllula undalis (lagarta tecelã do repolho)

Herpetograrama phaerpt^ralis

Heterocampa guttivitta (saliente selada)

H. manter, (lagarta variável da folha do carvalho)

xíolco.c.era p uive rea

Homoôo soma electelluin traça do girassol)

Horaona magnanima

Hyloicus pi nastri

Hypeuryntis Coricopa

iíyphantria cunea (lagarta tecelã do outono)

Hypogimnu morio

Itamô (Thamnonoma) wauaria (uma lagarta)

Junonia coenia (lagartas do castanheiro)

kakivoría flavofasciata

Keiferia (dnorismoschema) lycopersicella (lagarta do tomate) Lacanobía (Polia) olsracea L. fiscellaria fisceliaria (larva do abeto)

L. fi se liaria lugubrosa L. fisceliaria somníaria Lampides boeticus

55.710

Ref:3Ô411c

MOD. 71 — 9.000 EX. — 03-34

Leucoma (Stilpnotis) salicia (traça de cetim)

1. wiltshirei

Lobesia ( = Polychrosís) botrana

LoXostcge ronmaixtalis (lagarta tecelã da alfafa)

L. stieticalis (lagarta tecelã da beterraba)

L/ifiantria (Porthetria) dispar (traça cigana) (lymantria

traças das moitas)

L, monacha (lagarta da traça freira)

lalacosoma americana (lagarta de tenda oriental)

M. Lisstria (lagarta de tenda da floresta)

M. fragilis (--fragile) (lagarta de tenda da Grande Bacia) Mo neustria (lagarta de tenda, traça lacaio)

M. neustria var. testacea

M. pluviale (lagarta de tenda ocidental)

Mamerstra brassicae (traça do repolho)

Manduca (inotoparce) quinquemaculata (lagarta do tomate) Lí. (I.) sexta (lagarta do tabaco)

I-Iaruca te sιulali s

Líelancliphia imitata

Mesographu forficalis

Moeis r-_A.aada (Mocísj semi-larva)

Molippa sabina

Monema flavescens

Mythimoa (Pseudaletia) unipuncta (lagarta militar)

Nephantis serinopa

Noctua (Triphaena) pronuba

Nomophila noctuella (tr^ça da lucerna)

Nymphalis antiopa (borboleta de luto)

Oiketicus moyanoi Cramatoptcryx texans

Operophtera brumata (traça de inverno)

Opsophanes sp.

0· fagata

Orgyia (Hemerocampa) antiqua

0. leucostigma (traça das moitas, com marcas brancas)

-8355.710

Ref:38411ό

*e-eo — xa ooo e — »£ ·οοη

/

O. (Ho) pseudotsugata (traça do tufo do pinheiro Douglas)

0 thyellina

Orthosia gothica

Cstrinia (pyraustra nubilalis (broca de milho europeia) Paleacrita vernata (lagarta do cancro de primavera).

Paramene juliana

Panderais Dutuetana

P. purusana

Panolis flaramea

Papllio cresphontes (cão laranja)

P. demoleus

P. philencr

Paraiipsa (Aphomia) gularis

Paralobesis viteans

Paramyelois transite11a

Parara guttata

Pectlnophora gossypiela (lagarta cõr de rosa)

Pericailis ricini

Peridroma s*ucia (lagarta cortadora variegada)

Phalera bucephala

Phlogophora meticulosa

Phryganidia californica (lagarta do carvalho da Califórnia) Phthorimaea (=Gnorimoschema)operculella (lagartas do tubérculo da batata)

Phyllonorycter (Lithocolletis) blancardella

Pieris brassicae (borboleta branca grande)

P. canidia sórdida

Po rapae (lagarta do repolho importada, borboleta branca pequena)

Plathypena scabra (larva verde do trevo)

Platynota sp.

Po stultana

Platyptilia Carduidactyla (traça d<*. pluma de alcachofra) PIodia interpunctella (traça da comida india)

Plutella xylostella as maculipennis (traça de costas em dia

mante)

-89y >♦

Prays citri(traça da flor dos citrinos)

Oe oleae (traça da oliveira)

Pseudnplusia includens (larva da soja)

Pygaera anastomosis

Ref:384116

Rachiplusis nu

Rhyaeionia buoliana (traça europeia do broto d« pinheiro) Sabulodes caberata Samia cynthiaSaturnia pavonla

Schizura concinna (lagarta de corcova vermelha) Schoenobius bipunctifer Se lene phe ra lunigera Sesamia inforens

MOD. 71 — 9.000 EX. — 03-84

Gibine apicalis

Sitotroga carealella (mariposa ^ngoumois dos cereais) Sparganoti pilleriana

Spilonota (Tmetocera) ocellana (traça dos brotos com manchas de olhos)

Spilosoma lubricipeda (as merithastri)

S. virginica

Spilosoma sp.

Spodoptera (prodenia) aridania (lagarta militar sulina)

3. exigua (lagarta da beterraba, lagarta da lucerna)

S. frugiperda

S, littoralis

S. litura

3. mauritia

So (P.) ornithogalli (lagarta de faixas amarelas)

S. (P.) praefica

Syllepte derogata

S. silicalis

Symnerista canicosta

Thauinetopoea pityocampa (lagarta processionária do pinheiro)

T. processionea

T. wauaria (lagarta tecelã da groseleira)

Thymelicus leneola (saltadora europeia)

55.71o Ref:384116

Thyridopteryz ephemeraeferais (lagarta de saco) Tineela hisselliella (traças das roupas)

Tortriz viridana (tortricida de carvalho) Tricheplusia ni (larva do repolho)

Udea profundalis (amarradora de folha do aipo)

U. rubigalis

Vanessa cardui (dama pintada)

V. io

MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84

Zanthopustis tinais

Xestia (Amathea, Agrotis) c-nigrum (lagarta cortadeira manchada)

yjjonomeuta cognatella (=U. evonymi) (yponeutra = Hyponomeuta).

Y. evonyraella

Y, mahaiebella

Y. malino11a (pequena traça arminho)

Y. padella (pequena traça arminho)

Y. rorrella

Zeiraphera diniana

àULLOPlLuGA

Bovicola bovis (piolho do gado)

B. crassipes

B. limbata

B. ovis

Lipeurus caponis (piolho alado) ifenaonathus stramineus Menopon gallinae (piolho das árvores) TRICR0PTE1U

Hydropsyche pellucida

Ptamophylax rotundipennis

-91-

Plantas recomendadas para protecção pela proteína insecticldgido Β, thuringiensis

55-710 Ref:384116

Mod. 71 - 10 000 βχ.

alfafa	e scarola	batatas
amendoeiras	milho de campo	rabanetes
maças	aveleiras	pastagens
alcachofras	f lore s	framboe sa
abacate s	plantações de forragem	açafrão
bananas	árvores florestais	árvore s de sombra
feijões	árvores frutíferas	shingiku
Beterrabas	alho	cereais pequenos
amoras negras	uvas	soja
mirtilos	feno	espinafre
bróculos	cáli	abóbora
couve de Bruxelas	kiwi	frutas de caroço
repolho	couve rábano	milho ensilados
oxicoCo s	lentilhas	cereais ensilados
cenouras	alface	sementes oleaginosas armazenadas
couve-flor	me ] õe s	amendoins armazenados
aipo	hortelã	soja armazenada
ace Iga	folhas de mostarda	tabaco armazenado
cerejas	ne c t ar ina s (var, pe ssego)	morangos
repolho chinês	cebolas	beterrabas açucareiras
crisântemo s	laranjas	bordo açucareiro
citrinos	árvores ornamentais	girassol
collards (Brassica Oleracea var. acephala)	salsa	milho doce

->255.710

Ref:304110

alface cos	pastagem	batata doce
algodão	pêssegos	tabaco
oxicoco	amendoim	tomate s
plantações de	peras	relva
sementes
pepinos	ervilhas	folhas de nabo
groselha	nogueira-peca	nozes
amoras negras	pimentas	melancia
berinjela	pomidios
eudivia	romã

Mod. 71 . 10 000 βχ.

TáBBLa 3

Variedades de 3₀ thlringiensis

alesti

aizawai

cnu.de nsis

dakota

darmstadiensis

dendrolimus

entomocidus

finltimus

fowleri

gallsriae

indiana

israelensis

ke ny ae

kurstaki

kyushuensis

morrisoni

o striniae

paki stani

sntto

-9322./XU Refi384116

Mod. 71 - 10 000 βχ.

tbompsoni

thuringiensis

tolworthi

toumanoffi wuhanensis

iABEhn 4

índice de plasmidios e estirpes

Construído ou usado Vide

Estirpe Plasmidio no Exemplo Figura Feito de (A Comentários)

A. tumefaclens	6	(ubiquo)
A. rhizogenes	5	(vide também 0histórico)
B. thuringiensis	var.
kurtaki HD-73	1.1	1
ColEl	2.5
E. coli GM33	2.3
Ξ. coli HB101	1.1
E. coli J1Í103	2.1
E. coli K802	2o2
MBT3	3o3	M13mp8, pl23/58-lO
MBT3(Nco)	3.4	MBT3
ΜΒΤ14	3.3	M13mp8, P123/53-10
mV<B2344	2„ 1
mWB2344	2.1
Ml3“Bt-À	2.3	mWB2344, pl23/58-10
M13-Bt-A(Bam)	2.1	M13-Bt-A

-94-

Índice de plasmidlos e estirpes

Mod. 71 - 10 000 ex

55710

Ref:384116

Construído ou usado Vide

E stirpe Pla sm i d ί o	no Exemplo	Figura	Feito de (& Com«ntáiÍ!
Kl3-3t-3	2₀1		mWB2344, pl23/5S-lO
M13mp7	3o 1
i?13mp8	3.3
Mlj-PpBt	4.4		MBT3(Mco), M13-3.8Ab
M13-1	3.1		Kl3mp7, pMS5
1113-3	3o 1		M13mp7, pNS5
M13-3A/B18&	3.2		M13-3
ií13-3«8á	4o 1		M13mp7, 177.4
μ!3-3.8αη	4.2		F13-3.8àc
K13-3.8Ab	4.3		M13-3.8Aa
M13-3.8ac	4.2		M13-3.8A
V-ΓΊ *1 Λ 0 j· V9	4.1		Mljmp7, 177°4
PBh.322	lo!
PCF44	3.1		pBR322, pTiC58
pCT44^	3o 1		pCF44
pK3-f.ro!	ΖΛ /“> — 0 í-	3	pKSlll
pK3-proI(Bam)	2_Λ Aw φ fc-.		pKS-prol
pK3-4	2 * ✓	2	p3R322, pRZ102
pKSlll	9 9 Z. 0 £.	2,3	pKK290,pTi15955
pKSlll-K	4.5		pK34(pRZlO2), pKSll!
pKSlll-K	3o 5		pCF44, pKSlll-K
pKSlll-NpBt			MBT3(Nco) ,M13-3^/B18u
			pKSlll-N
pKsw-ppBt	4o5		M13-PpBt,pKSlll-K
pNS5	3o 1		PBR322, pCF44Á
pPh.Ijl	9
pRK29C	2.2,9
PRK2013	9
pRZlC2	2 * 4-0 _z		ColEl,Tn5
pTÍAÓÓ	2₀ 4
ΡΪ15955	2.4	2

-95-

55.71c

Ref:384116

Mod. 71 - 10 000 οχ

índice _de_ p) 0 suúdios e e stlrpes

Construído ni.i usado Vide

Estirpe Plasmidio no Exemplo Figura Feito de (ÁComentários)

ρδ, δ	4.1	pBE322,177.4
pll-83a	2.3	3	pKS-prol(Bam), pE3-4
pll-83b	2.3	3	pll-83a,M13-Bt-A(Bam)
P123/5S-3	Id	1	B. thurlng iensis, var. Eurstaki HD-73,PRR322
Ρ123/58-10	lol	1	Bo thuring iensis, var. Kurstaki,HD-73,pBR322
P4C3	2.2	2	pBR322, _PTil5955
"1.6"	2.2	2	(^transcrição 24,vide também Descrição Detalhada)
177o 4	4.1		Charon 24A, P.vulgaris cv. Tendergreen.
pBt73-ló	11.2	4	pBt73-10( Bam) ,pBt73“l6l
PBR325	12 d	4
pPJt325aBB	12.1	4	pBR325
p403B	12,1	4	pBR325aBB,pTfi-prnI(Bam)
K13ml9	12₀ 2	4
1.6.4	12.2	4	M13mpl9, pBt?3-lb
1.6.4B-3.8.3	12.2	4	1.6.4
p4C3B_z ^,BTB^3	12o 3	4	1.6.4-B-3.8<.3,p403B
pRK-203-Ean- 103-Lec	12.4	4
pRK-203-K&n-103	12.4	4	pRK-2 0>Sar>-103-Le c

-96-

9

55.710

Ref:38411b

TABELA 5

Estirpes Depositadas

NSRL B-4488 NERL B-14 3 94 NERL B-11371 NSRL B-12014 ATCC 37017

atcc 15955 NSRL B-15393 NSRL B-15612 NRRL B-15759 NRRL B-15821

Bac 3llus thuringle nsl s var₀ Kurstaki HD-73 Escherichia coli C600 (pKS-4)

Ξ scherlehla coli HB101 Escherichia coli RR1 (pBR322) pBR322

Agrobacterium tumefaciens (pT115955) Escherichia coli HB 101 (p8„8)

Escherichia coli HB101 (pl23/5S-3C)

E„ coli EB101 (pBt?3-!6)

E. coli CóOO (pRK-203-Kan-103-Lec)

0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América en 24 de Setembro de 1983 sob o n«. 535.354;

-

Claims

REIVINDICAÇÕESI^a. Processo para modificar geneticamente uma célula vegetal, caracterizado pelo facto de se transformar a célula que possui um gene estrutural insecticida e um promotor expressável vegetal, por meio do qual o gene é expressável na célula vegetal sob o controlo do promotor.

2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o gene insecticida estar sob o con-971

55.710

Ref* 384116

trolo de um promotor vegetal

3®. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac

terizado pelo facto de o gene insecticida estar sob o controlo de um promotor escolhido do grupo de ger#ssvegetais

constituido por faseolina e a sub-unidade pequena de ribulo sa-1,5-bisfo sfatocarboxila se.

4®, - Processo de acordo Com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o gene estrutural insecticida estar sob o controlo de um promotor de T-DNA.

Mod. 71 - 10 000 βχ.

5®. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o gene estrutural estar sob o conr trolo de um promotor escolhido de um grupo de genes de T-DNA constituido por tmr, tml, tms, nos, ocs e a transcri ção "1,6“.

6», - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o gene insecticida estar sob o Controlo de um promotor escolhido do grupo de promotores de CaMV que controlam as transcrições 353 θ 19S.

7^ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o gene insecticida é modificado, caracterizado pelo facto de a modificação sei· obtida por uma inserção, uma supressão ou urna substituição de um ou mais nucleotidos na sequência do nucleotido gene estrutural.

3®. - Processo de acordo Com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o gene ser inserido em T-DNA.

9®. - Processo de acordo com a reivindicação 8, em que

se modifica o T-DNA, caracterizado pelo facto de a modificação ser uma inserção, uma supressão ou uma substituição de um ou mais nucleotidos na sequência do nucleotido de

-98-

55.71ο

ro f:3Ò4lló

T-DNA

Mod 71 - ΙΟΟΟΟβχ,

lC^e. - Processo de acordo com a reivindicação 8, carac

terizado pelo facto de a célula transformada ser de uma gimnosperma.

11». - Processo de acordo com a reivindicação 8, carsr terizado pelo- facto de a célula transformada ser de uma angiosperma.

12^a. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a angiospemia ser uma monocotiledónea.

13^a. -Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a angiosperma ser uma dicotiledónea.

14^a. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a dicotiledónea ser um membro da família das Solanaceae.

15^a. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a dicotiledónea ser um membro da família das Compositeae.

16®. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a dicotiledónea ser um membro da família das Leguminoseae.

17^ô. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a dicotiledónea ser um membro da família das Malvaceae.

18^a. - Processo de acordo Com a reivindicação 11, ca-9955.710

Ref:384116

a'

racterizado pelo facto de a dicrtiledónea ser um legume.

lúfe. - Pmcesso de acordo cora a reivindicação 8, carac terizado pelo facto de 0 gene insecticida ser inserido num local transcrito activamento no interior do gene tml ou do gene ocs, ou da região ⁿ1.6" do T-DNA.

20^δο -Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a célula vegetal ser transformada por transferencia de DNA de uma bactéria para a célula vegetal»

Mod. 71 - 10 000 βχ.

21«. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a célula vegetal ser transformada por captação directa de DNA ou micro-injecção de DNA na célula vegetal.

22«. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de compreender ainda a fase de regenarar a referida célula transferida para produzir tecido vegetal regenerado, transformado, capaz de expressar o gene estrutural insecticida.

21«. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o gene estrutural insecticida se obter a partir de B» thuringiensis.

24«o - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o gene estrutural insecticida ser hibridizável com o encontrado no p!23/58-10.

Entrelinhei: na pg· 30 "usado” e na pg· 59 “mutados”· List,., 24.SEt19M

Frr AGEIOETETJCS BESExRCII ASSOCIATES ΠΚΙΤΣ

AACTCCATTTTATATArAACTATAAAXACrMTAACACnrAAAATAACrTAAC6CAATAÇAAACCCTTAATCCATTCCTTAAACATTÇTAAACTCTAAA

..-..,.-4.....----4---.----4-....---.4---..---.+-.--.-.--4....,....4..--,--..4....,....¼

6CATGGATAATGGGCCAGAAGTAAGTA6ATTGTTAACACCCTGG6TCAAAAATTGATATTTACTAAAAT7AGTTCCACTTTGTGCATTTTTTCATAAGAT 4—.,——4——.-—4——.——4..—,—4..—.....4—.-,-...4....,-..-4

gagtcatatgttttaaattgtagtaatcaaaaacagyattatatcataatgaattgctatcttaataaaagagatggaggta/íttatggataacaatcc

....,..-4.........4......---4-.--...--+----,--.+ -.--,---.+----..--.+----,.---+---,---.+----..---+

MetAipAjftAjnAr

caacatcaatgaatgcattccttataattgtttaagtaaccctgaagtagaagtattaggtggagaaagaatagaaactggttacaccccaatcgatatt

oAlnlleAsAGluCyjIleProTyrAsnCyJleuSrrAsnProGlyYalGIuYaKeuGtyGlyGluArjíIeGÍuThrCtyTyrrhrProfleAiplle

tccttgtcgctaacgcaatttcttttgágtcaatttgttcccggtcctggatttctgttaggactacttgatataatatggggaatttttggtccctctc

— ,..—4.—.,——4—.——4 —.....4—.—+—,—4 —.—4—,—4.—.,—.4 —.—4

5ert«vS«rltvThr6lnPhelevlevStrCluPhtYilProG1yA1aG1yPhtVi1LeuGlyL«uVi1Aipllel1eTrpG1ylkPheG1yProSirG

aatgggacgcatttcttgtacaaattgaacagttaattaaccaaagaatagaagaattcgctaggaaccaagccatttctagattagaaggactaagcaa

...4..·.,....4....,....+....,..-.+--..,.---4.,....4.........4.........4

InTrpAspAhPheLeuYalGInlíeGIuGIftLeulleAsnGlnArgneGluGluPheAI lArgAjnGI nAlalkSerArglevGlvGlyUvStrAs

tctttatcaaatttacgcagaatcttttagagagtgggaagcagatcctactaatccagcattaagagaagagatccgtattcaattcaatgacatcaac

nLcuTyrGlAneTyrAliG1u5crPheArgG1vTrpGlvA1iAspProThrA>nPr9AULtuAr9GluClvHetArg!leClnPh«AsftAspHetAsn

agtgcccttacaaccgctattcctctttttgcagttcaaaattatcaagttcctcttttatcagtatatgttcaagctgcaaatttacatttatcagttt

....,....4....,....4..-...-+......-.+.-., ..-.4-..-.....4....,---4.--.,----4....,....4-.--,.-..+

SerAlilevThrThrAlalleProLeuPheAI>Ya1C1nAsnTyrG1nVa1Pr6LtuleuSerYa1TyrVa1G1nA1aA1aAsníeuH1sLeuSerYa1L IGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAAAGGTGGGGATTTGATGCCGCGACTAGCAATAGTCfJTATAATGATTTAACTAGGCTTATTGGCAACTATACAGA evArgAspYtlSerYalPheGlyGIftArgTrpGlyPheAtpAliÂlaThrStrAinSerArgTyrAsnAjpLevThrArgleulleGlyAsnTyrThrAs TTATGCTGTACGCTGGTACAATACGGGATTAGAACGTGTATGGGGACCGGATTCTAGAGATTGGGTAAGGTATAATCAATTIAGAAGAGAATTAACACTA

....,....4.-, — ..4 — ..,....4....,—..4 — ...—4-........4 — , —..4. —.4—..«—4

pTyrAlaYlUrgTrpTyrAinThrGlyleu61uArgY4lTrp61yProAjp$trArgA»pTrpYalArjTyrAinG1ftPh«ArgArgG1ul.tvÍhrlM

ACTGTATTAGATATCGTTGCTCTGTTCCCGAATTATGATAGTAGAACATATCCAATTCGAACAGTTTCCCAATTAACAAGAGAAATTTATACAAKCCCAG

— ,—+.—...—4—— .—4....,—4—— .—4 — ,—4—,—4—,.—4—,—4—,—4

TkrYa1Le«AipneYa1A1aLeuPhePreAiftTyrAjpS<rArgArgTyrPreneArgThrYi15erGlnLevThrArgG1uIlaTyrThrAjnPreV

tattagaaaattttgatggtagttttcgacgctcggctcagggcatagaaagaagtattaggagttcacatttgatggatatacttaacagtatÁaccat

— —4 —,—.4. — '—— 4 —— + — , —4 —.—4 a1leuG1tfA|nPheAapGlyStrPhcArgG1yS<rAliC1nGly flcG1vArgScrn«ArgSerScrHtsLcuKetAspn(teuAtnScrllcTkrH

CTATACGGATGCTCATAGGGGTTATTATTATTCGTCAGGGCATCAAATAATGGCTTCTCCTGTAGGGTTYTCGGGGCCAGAATTCACTTnCCGCTATAr

....,....4....,-.4..-.....4..-.,.-..4....,....4....,.. ..4·—....-4..-,....4....,.-..4....,..-4

aTyrThrAjpAIiKltArgGlyTyrTyrTyrTrpSerGlyHljGlnlleHetAlaSerPreValGIyPheSerGlyProGluPheThrPheProteuTyr

GGAACTATCGGAAATGCAGCTCCACAACAACGTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGCCGTCTATACAACATTATCGTCCACTTTATATAGKAGACCTTTTA 4·· — ,-·—4 — -.,. — 4. —,—.4. —,. — .4- —,. — . + —., — ..4 —-.,. — 4......—4 — .——♦

GlyThrHctGlyAsnAIaAlaPrpGlnGInArglicValAIaGlnltuGlyGInGlyYaUyrArgThrlevSerSerThrlevTyrArgArfPrpPheA

atatagggataaataatcaacaactatctgttcttgacgggacagaatttgcttatccaacctcctcaaatttgccatcccctgtatacagaaaaagcgg

....,....4......-..4....,....4....,....4...-..-—4.·..,-...4—4·.·......4·...,....4....,....4

inl1tGlyI1tAjnAjnGlnG1M.tvS<rYatleuAspGlyThr61vPheAlaTyrG1yThf3trSe/^,AiflUuProStrAliYa1TyrArglyiSirC1

FIG. 1 - 1

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

AACGÇ7A6ATTCGC7GGATGAAA7ACCGCCACAGAATAACAACGTGCCACCTAG6CAACGATTTAG7CATCGATTAAGCCA7Ç77TCAATGTT7CGTTCA ....,....+....,,...+....,....+....,....4..,....+ .........4.-...-..-4—

yThrYalAjp$efltuAip61vntProPr®GlAAínAihAjnYalPreProArgGlnG1yPhtStrHHArgUvStrHI»YalSerHttPhtArjS«r GCC7TTACTAA7AGTAGTGTAAG7ATAATAAGAGCTCCTA7GTTCTC7TGGA7ACATCG7AGTGCTeAATT7AATAATATAATTGCATC6GATAeTATTA .... ,....+....,....+....,.^..+....,—+--,-.-4

6lyPheStrAin5erSerYa15trÍ1<UeArgA1*Pr©H«tPh»StrTrpl1»H1tArgS«rA1aGlvPhtAinAjnI1tll«KliStrAip3trI1tT

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