PL209110B1 - Sposób obniżania immunogenności białka fuzyjnego, białko fuzyjne otrzymane takim sposobem, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i kodujący je kwas nukleinowy - Google Patents

Sposób obniżania immunogenności białka fuzyjnego, białko fuzyjne otrzymane takim sposobem, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i kodujący je kwas nukleinowy

Info

Publication number
PL209110B1
PL209110B1 PL366826A PL36682602A PL209110B1 PL 209110 B1 PL209110 B1 PL 209110B1 PL 366826 A PL366826 A PL 366826A PL 36682602 A PL36682602 A PL 36682602A PL 209110 B1 PL209110 B1 PL 209110B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
thr
leu
protein
pro
ala
Prior art date
Application number
PL366826A
Other languages
English (en)
Other versions
PL366826A1 (pl
Inventor
Stephen D. Gillies
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of PL366826A1 publication Critical patent/PL366826A1/pl
Publication of PL209110B1 publication Critical patent/PL209110B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy ogólnie sposobu tworzenia i wykorzystywania zmodyfikowanych białek fuzyjnych o zredukowanej lub bez immunogenności jako czynników terapeutycznych. Wynalazek dotyczy szczególnie białek fuzyjnych, których immunogenność jest mniejsza poprzez zidentyfikowanie potencjalnych epitopów limfocytów T i modyfikowanie sekwencji aminokwasowej tak, aby wyeliminować rzeczone epitopy. Przedmiotem wynalazku jest w szczególności sposób obniżania immunogenności białek fuzyjnych poprzez usunięcie niewłasnych epitopów limfocytów T białka fuzyjnego zawierającego pierwsze białko oraz drugie białko przyłączone do pierwszego białka poprzez połączenie fuzyjne. Przedmiotem wynalazku jest również białko fuzyjne o obniżonej immunogenności otrzymane takim sposobem, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz kwas nukleinowy kodujący takie białko fuzyjne.
Wynalazek korzysta z pierwszeństwa ze zgłoszenia US 60/280,625 z dnia 30 marca 2001 r., którego ujawnienie jest załączone tu w całości poprzez odniesienie.
Wiele białek terapeutycznych to normalne ludzkie białka. Na przykład interleukina-2, erytropoetyna czy hormon wzrostu są białkami ludzkimi, które podaje się ludziom, u których już zazwyczaj występuje endogeniczny poziom tych białek. Ogólnie odpowiedzi układu odpornościowego przeciw zupełnie normalnym ludzkim białkom są rzadkie, gdy białka te są użyte w celach terapeutycznych.
Jak wykazano niedawno wiele białek fuzyjnych ze sztuczną aktywnością jest przydatnych jako białka terapeutyczne. Na przykład, Enbrel jest połączeniem pozakomórkowej domeny receptora TNF z regionem Fc lgG1. Enbrel jest u ż yty do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów i jest zaprojektowany do wiązania TNF, oraz zapobieganiu aktywności TNF. Jednakże, u pacjentów leczonych z wykorzystaniem Enbrel zaobserwowano znaczą ce wystę powanie przeciwciał anty-Enbrel.
Innym przykładem terapeutycznie przydatnej klasy białek fuzyjnych są immunocytokinazy. Białka te zawierają fragment przeciwciała i fragment cytokiny i są przydatne do dostarczania cytokinaz do choryck komórek, takich jak komórki raka. Jednakże w wielu przypadkach terapeutyczne wykorzystanie takich białek fuzyjnych jest zredukowane z powodu ich immunogenności u ssaków, a zwłaszcza u ludzi.
Dlatego też istnieje potrzeba stworzenia białek fuzyjnych o zredukowanej immunogenności, dla wykorzystania ich w terapii.
Istotą wynalazku jest sposób obniżania immunogenności poprzez usunięcie niewłasnych epitopów limfocytów T białka fuzyjnego zawierającego pierwsze białko oraz drugie białko przyłączone do pierwszego białka poprzez połączenie fuzyjne, który charakteryzuje się tym, że obejmuje modyfikacje sekwencji aminokwasowej regionu rzeczonego połączenia fuzyjnego, przy czym modyfikacje przeprowadza się w jednym z następujących etapów:
(i) wprowadzenie N-połączonego lub O-połączonego miejsca glikozylacji, (ii) zastąpienie Leu, Val, Ile, Met, Phe, Tyr lub Trp w obrębie co najwyżej ośmiu C-końcowych aminokwasów sekwencji N-końcowego partnera fuzyjnego w rzeczonym białku fuzyjnym przez Thr, Ala lub Pro, lub (iii) zastąpienie sekwencji aminokwasowej Leu-Ser-Leu-Ser sekwencją aminokwasową Ala-ThrAla-Thr w przypadku, gdy pierwsze białko jest cząsteczką IgG lub jej fragmentem.
Według korzystnego przykładu realizacji takiego sposobu etap (i) przeprowadza się poprzez wprowadzenie miejsca glikozylacji w obrębie 10, 5 lub 2 aminokwasów połączenia fuzyjnego.
W innym korzystnym przykł adzie realizacji sposobu wedł ug wynalazku etap (i) przeprowadza się poprzez wprowadzenie sekwencji aminokwasowej Asn-X-Ser/Thr, gdzie X oznacza dowolny aminokwas.
W sposobie według wynalazku pierwszym białkiem białka fuzyjnego jest korzystnie cząsteczka IgG lub jej fragment.
W innym korzystnym rozwiązaniu sposób dotyczy białka fuzyjnego, w którym pierwszym białkiem jest cząsteczka IgG lub jej fragment, zaś drugim białkiem jest cytokina.
W takim przypadku korzystne jest dodatkowo aby dla wydł u ż enia czasu pół trwania w surowicy, przeprowadzać korzystnie kolejną mutację pomiędzy jednostką IgG, a jednostką cytokiny białka fuzyjnego przez zastąpienie C-końcowej lizyny jednostki przeciwciała alaniną bądź leucyną.
Modyfikacje w sposobie według wynalazku dotyczą korzystnie regionu połączenia zawierającego od 1 do 15 aminokwasów, a wyjątkowo korzystnie regionu połączenia zawierającego od 1 do 9 aminokwasów.
PL 209 110 B1
Istotą wynalazku jest także białko fuzyjne o obniżonej immunogenności otrzymane zdefiniowanym powyżej sposobem według wynalazku, które charakteryzuje się tym, że jest wybrane z grupy obejmującej:
(i) huKS-IL2, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser, przy czym huKS jest przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiej cząsteczce adhezyjną komórki nabłonka KSA (EP-CAM);
(ii) Fc-IL12-IL2, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser, przy czym Fc jest rzeczonym pierwszym białkiem, zaś białko fuzyjne IL12-IL2 jest rzeczonym drugim białkiem;
(iii) białko fuzyjne Fc-IL12-IL2, które zawiera miejsce glikozylacji Asn-Gly na pierwszych pozycjach w obrębie cząsteczki IL2, przy czym białko fuzyjne Fc-IL12 jest rzeczonym pierwszym białkiem, zaś IL2 jest rzeczonym drugim białkiem;
(iv) Fc-EPO, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser;
(v) Fc-EPO, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser, przy czym łańcuch Ig jest łańcuchem lgG2 zawierającym region zawiasowy IgG1.
Istotą wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość zdefiniowanego powyżej białka fuzyjnego według wynalazku, opcjonalnie razem z farmaceutycznie tolerowanym nośnikiem.
Istotą wynalazku jest wreszcie kwas nukleinowy kodujący zdefiniowane powyżej białko fuzyjne według wynalazku.
W ogólnym ujęciu wynalazek dotyczy sposobów i kompozycji przydatnych dla tworzenia białek fuzyjnych o zredukowanej immunogeniczności dla wykorzystania ich w terapii. Na przykład, wynalazek może dostarczać immunocytokinazy, immunofuzyny, immunoligandy, innych przeciwciałowych i białek fuzyjnych Fc, białek fuzyjnych cytokina - cytokina i białek fuzyjnych albuminy ze zmniejszoną immunogennością.
Wynalazek wiąże się po części z odkryciem, że białka fuzyjne zawierają sekwencje, które są „nie-własne. Dla przykładu, nawet w połączeniu między dwoma ludzkimi białkami, region okalający miejsce fuzji posiada sekwencję peptydową, która normalnie nie występuje w ludzkim organizmie. Na przykład, białkowy lek taki jak Enbrel jest pochodną dwóch normalnych ludzkich białek: receptora TNF i lgG1. Jednakże, połączenie między receptorem TNF i lgG1 jest sekwencją peptydową, która normalnie nie znajduje się w ludzkim organizmie.
Korzystny sposób według wynalazku wiąże się ze zmniejszeniem immunogenności białka fuzyjnego przez zmniejszanie zdolności epitopu łączącego (peptydu łączącego) do oddziaływania z receptorami limfocytów T poprzez zmniejszanie jego zdolnoś ci do wią zania (jego powinowactwa do wiązania) do cząsteczek zwanych głównym kompleksem zgodności tkankowej (ang. Major Histocompatibility Complex -MHC). Według wynalazku, epitop łączący albo peptyd jest korzystnie nie-własny. Ogólnie, białka, w tym także białka terapeutyczne, są immunogenne, po części dlatego, że białka ulegają endocytozie do komórek prezentujących antygeny i są proteolizowane, a powstałe w ten sposób peptydy przyłączają się do cząsteczek MHC, który prezentuje peptydy komórkom limfocytów T. Połączenie antygenowy peptyd - MHC na powierzchni komórki prezentującej antygeny (ang. Antigen Presenting Cell - APC) aktywuje limfocyty T do proliferacji, różnicowania i uwalniania cytokinaz. Równolegle indukowane jest różnicowanie limfocytów B i produkcja przeciwciał, które może dalej ograniczyć skuteczność białka terapeutycznego na skutek ich usuwania. W ten sposób, antygenowy peptyd, o ile pochodzi od białka terapeutycznego, jest zdolny do wywoływania serii niepożądanych odpowiedzi immunologicznych. Skuteczność białka terapeutycznego jest ograniczona w związku z wiązaniem przeciwciał, a wyzwolona odpowiedź limfocytów T i B jest często niepożądana gdyż prowadzi do zapalnych i alergicznych reakcji u pacjenta.
Wynalazek dotyczy (1) identyfikacji nowych sekwencji aminokwasowych w regionie łączącym immunoglobulinę z białkiem docelowym za pomocą jednego albo kilku potencjalnych epitopów limfocytów T; (2) modyfikacji tych sekwencji aminokwasowych tak, aby zredukować albo wyeliminować obecność peptydów, wyprowadzonych jako sekwencje łączące, a które działają jako epitopy limfocytów T.
Wynalazek dotyczy dwóch ogólnych klas kompozycji i sposobów związanych z redukcją immunogenności. Według jednej realizacji wynalazku, potencjalne niewłasne epitopy limfocytów T są zidentyfikowane w sekwencjach okalających połączenia fuzji. Na przykład, potencjalne nie-własne epitopy
PL 209 110 B1 limfocytów T są identyfikowane poprzez metody obliczeniowe oparte na modelowaniu peptydów przyłączających się do molekuł MHC klasy II. Następnie wprowadzane są takie podstawienia, aby wyeliminować, bądź zredukować zdolność białka istniejącego w regionie złączenia peptydów pochodzących z regionu łączenia do wiązania się z MHC klasy II. Opisany proces identyfikacji i modyfikacji peptydów, które wiążą się z MHC klasy II określono terminem „deimmunizacja. Powstałe w jej wyniku zmodyfikowane białko określane jest jako „deimmunizowane.
Według innej realizacji wynalazku, w miejsce złączenia fuzyjnego wprowadzane jest jedno lub więcej miejsc glikozylacji. Korzystne jest tworzenie wiązań N-glikozydowych, choć może być również wykorzystana O-glikozydacja. Według korzystnej realizacji, aminokwasy w regionie okalającym połączenie fuzyjne w sekwencji typu dzikiego są mutowane tak, aby ostatni aminokwas N-końcowego partnera fuzji był asparaginą oraz aby pierwsze dwa aminokwasy drugiego partnera fuzyjnego zmienione były na glicynę, po której następuje seryna lub treonina.
Według wynalazku, usunięcie wiązania z białkami MHC klasy II jest korzystne w sytuacji, gdy białko ma być produkowane w bakterii lub w innym organizmie nie wytwarzającym wzoru glikolitycznego typowego dla komórek ssaków, takim jak drożdże lub komórki insektów.
Wprowadzenie miejsc dla glikolizy może być korzystne, gdy białko ma być produkowane w linii komórek ssaka lub w linii komórek, które tworzą wzorzec glikozylacji nieszkodliwy dla ssaków.
Według korzystnej realizacji wynalazku, częścią składową białka fuzyjnego jest cytokina. Termin „cytokina jest tu stosowany dla opisania białek naturalnie występujących lub rekombinowanych, ich analogów oraz fragmentów, które wywołują specyficzną odpowiedź w komórkach posiadających receptory rzeczonych cytokin. Korzystnie, cytokiny są białkami, które mogą być wyprodukowane i wydzielane poprzez komórkę. Korzystnie, do cytokin zaliczamy interleukiny takie jak interleukina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 oraz IL-17, czynniki hematopoetyczne takie jak czynnik stymulujący kolonie granulocytarno - makrofagowe (GM-SCF), G-CSF, erytropoetyna, czynniki nekrozy nowotworowej (ang. tumor necrosis factor - TNF) takie jak TNFa, limfokiny takie jak limfotoksyna, regulatory procesów metabolicznych, takie jak leptyna i interferony takie jak interferon α, interferon β, interferon γ i chemokiny. Korzystnie, białko fuzyjne przeciwciało-cytokina według wynalazku określa specyficzną dla cytokin aktywność biologiczną.
W innej korzystnej realizacji wynalazku, częścią składową białka fuzyjnego jest cytokina przeciwotyłościowa. Na przykład, komponentem jest leptyna, CNTF, albo część Acrp30.
W alternatywnej korzystnej realizacji, składowe białko fuzyjne jest hormonem. Na przykład komponentem może być insulina, hormon wzrostu, lub peptyd glukagonopodobny 1 (GLP-1).
W jeszcze jednej realizacji, częścią składową białka fuzyjnego jest białko wiążące ligand wykazujący aktywność biologiczną. W preferowanej realizacji wynalazku wykorzystywana jest pozakomórkowa domena receptora TNF.
Według pewnej serii realizacji wynalazku, białko fuzyjne według wynalazku posiada N-koniec cząsteczki nie będącej przeciwciałem przyłączony do C-końca cząsteczki o własnościach przeciwciała. Według innej serii realizacji wynalazku, białko fuzyjne według wynalazku zawiera C-koniec cząsteczki nie będącej przeciwciałem przyłączony do N-końca cząsteczki będącej przeciwciałem. Według wynalazku cząsteczką przeciwciała może być naturalna immunoglobulina lub fragment naturalnej immunoglobuliny. Fragment immunoglobuliny może zawierać region zmienny, stały lub obydwa. Korzystne immunoglobuliny zawierają regiony Fc lub ich fragmenty. Korzystna realizacja wynalazku wykorzystuje izotyp immunoglobuliny lgG1 lub jej fragment, zmodyfikowany tak, by był mniej immunogenny i/lub aby miał dłuższy okres półtrwania w surowicy. Dla przykładu, korzystna jest lgG1 z modyfikacjami aminokwasów w pobliżu złączenia CH3-cytokina. Dla pewnych zastosowań, jako fragment o własnościach przeciwciała, korzystne są izotypy immunoglobulin lgG2 lub lgG4.
Immunocytokinazy są tylko jednym z przykładów terapii nowotworowej z wykorzystaniem białek fuzyjnych. Inne molekuły toksyczne dla nowotworów mogą być dostarczane do komórek nowotworowych poprzez fuzję ze specyficznymi przeciwciałami nowotworowymi. Ponadto białka fuzyjne z przeciwciałami mogą atakować także inne chore komórki, jak na przykład komórki zakażone wirusami. Innym podejściem do projektowania specyficznych białek fuzyjnych jest wykorzystanie technologii Fc-X oraz X-Fc, gdzie X oznacza polipeptyd. Technologie te wykorzystują fakt, że produkcja i zbieranie docelowych białek poprawia się, jeżeli odpowiedni polipeptyd przyłączony jest do części Fc immunoglobuliny. W przypadku białek fuzyjnych Fc-X, peptyd sygnałowy, za którym następuje fragment genu kodujący immunoglobulinę jest N-terminalnym partnerem dla białka fuzyjnego. W pewnych specjalnie korzystne jest zaprojektowanie białka fuzyjnego w układzie X-Fc. W takim przypadku białko docelowe
PL 209 110 B1 stanowi N-koniec białka fuzyjnego, zaś fragment Fc następuje po nim. Dla pewnych białek takie podejście jest bardzo użyteczne, jak zostało pokazane w przypadku glikoproteiny powierzchni komórek limfocytów (LHR) (opis patentowy US 5,428,130) oraz w przypadku peptydu glukagonopodobnego - 1 (GLP-1).
Odpowiednio, sposoby i kompozycje według wynalazku prezentują formy białek fuzyjnych Fc-X oraz X-Fc o zredukowanej immunogenności. Według wynalazku immunogenność białka fuzyjnego może być określona metodami znanymi ze stanu techniki.
Sposoby i kompozycje według wynalazku opisują również albuminowe białka fuzyjne o zredukowanej immunogenności. Albumina surowicy ludzkiej (ang. human serum albumin - HSA), dzięki jej znacząco długiemu okresowi półtrwania w surowicy, jest szeroko rozpowszechniona in vivo. Ze względu na brak funkcji enzymatycznej lub immunologicznej, jest szeroko stosowana jako nośnik dla peptydów/białek terapeutycznych. (Yeh et al, PNAS 89:1904-1908, 1992). Genetyczne połączenie bioaktywnego peptydu z HSA jest użyteczne dla odzyskiwania wydzielanych terapeutycznych pochodnych HSA. Jednakże, według wynalazku, połączenie fuzji w albuminowym białku fuzyjnym takim jak HSA-CD4 wykazuje nowe połączenie, które ogólnie zawiera jeden lub większą liczbę epitopów limfocytów T, które mogą być zaprezentowane molekułom MHC klasy II. Wynalazek dostarcza mniej immunogennych form albuminowych białek fuzyjnych, oraz ogólny sposób redukcji immunogenności albuminowych białek fuzyjnych. Według wynalazku do użytecznych albumin należą gatunkowe, alleliczne oraz zmutowane warianty albumin, w tym także ich fragmenty. Korzystne białka albuminowe pozostają strukturalne oraz funkcjonalne cechy albumin typu dzikiego, takich jak na przykład HSA.
W innym aspekcie, wynalazek dotyczy deimmunizowanych przeciwciałowych białek fuzyjnych ze zmutowanymi, normalnymi, bądź hybrydowymi izotypami, które zawierają pożyteczne mutacje. Mutacje te mogą być w pobliżu regionu połączenia lub na pozycjach różnych od regionu połączenia.
Dla przykładu, wynalazek dotyczy deimmunizowanych immunocytokin zmodyfikowanych w rejonie połączenia, z punktowymi mutacjami na połączeniu pomiędzy fragmentami IgG a non-lgG. Fragmentem cytokinowym może być dowolna cytokina, ale korzystna jest IL-2 lub IL-12. W jednej realizacji, zamiany aminokwasów wymagają zamiany C-końcowej lizyny z fragmentu przeciwciałowego na aminokwas hydrofobowy, taki jak alanina, czy leucyna. Kluczową zaletą łączenia takich mutacji z deimmunizującymi modyfikacjami według wynalazku jest fakt, iż mutacje współdziałają ze sobą, zwiększając czas półtrwania w surowicy oraz zmniejszając immunogenność. Opisany tu sposób, służący do łączenia deimmunizacji połączeń w białkach fuzyjnych z mutacjami wydłużającymi czas półtnA/ania w surowicy jest bardzo użyteczny do istotnego poprawiania klinicznej skuteczności białek fuzyjnych.
W innym aspekcie, wynalazek dotyczy immunocytokinaz, zawierają cych hybrydową jednostkę przeciwciała, którą mogą być domeny z różnych izotypów Ig, korzystnie z zarówno izotypów lgG1 i lgG2; oraz deimmunizujace modyfikacje w rejonie złączenia fuzyjnego. Dla przykł adu, wynalazek dotyczy deimmunizowanej immunocytokiny ze zmodyfikowanym złączeniem, wykorzystując lgG2 oraz hybrydową lgG2h (lgG2 zmodyfikowana w rejonie zawiasu do lgG1). W korzystnej realizacji, hybrydowe białko fuzyjne składa się z deimmunizowanej immunoglobuliny zbudowanej z IgG (y1:CH1 - Η)(γ2: CH2 - CH3) i komponentu cytokiny.
W innym aspekcie, wynalazek dotyczy nowej sekwencji kwasów nukleinowych, która koduje białko fuzyjne o zredukowanej immunogenności lub ułatwia ekspresję, produkcję i sekrecję białka fuzyjnego o zredukowanej immunogenności. Takie sekwencje nukleotydowe są wygenerowane za pomocą standartowych technik rekombinacyjnych DNA.
W korzystnej realizacji wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego koduje immunocytokinowe białko fuzyjne. Korzystną immunocytokiną może być cytokina, na przykład Interleukina 2 i nowotworospecyficzne monoklonalne przeciwciało, takie jak ludzka molekuła przylegania komórek epitelium KSA (ER - CAM)(huKS).
W innej korzystnej realizacji, molekuła kwasu nukleinowego koduje białko fuzyjne Fc w różnych konfiguracjach. Molekuła kwasu nukleinowego koduje liniowo w kierunku od końca 5' do końca 3', (i) sekwencję sygnałową, region Fc immunoglobuliny oraz sekwencję docelowego białka (ii) sekwencję sygnałową, docelowe białko oraz region Fc immunoglobuliny, (iii) sekwencję sygnałową, pierwsze białko docelowe, region Fc immunoglobuliny oraz drugie białko docelowe. Tak więc wynikowa cząsteczka kwasu nukleinowego koduje strukturę Fc-X, X-Fc, lub X-Fc-Y, gdzie X i Y to białka docelowe. W alternatywnej realizacji, kwas nukleinowy koduje białko Fc-X, X-Fc lub X-Fc-Y bez sekwencji sygnałowej.
PL 209 110 B1
W innej korzystnej realizacji, sekwencja kwasu nukleinowego będąca przedmiotem wynalazku, koduje białko fuzyjne Ig ze zmutowanym lub hybrydowym izotypem. W szczególności, kwas nukleinowy dostarcza część przeciwciała z hybrydowego izotypu lub alternatywnie ze zmienionym regionem zawiasowym. Dla przykładu białko fuzyjne składające się z lgG2, zmodyfikowano tak, by zawierało mniej mostków dwusiarczkowych w regionie zawiasowym, lub region CH2 i CH2 lgG2, w którym region zawiasowy pochodzi z innego przeciwciała, korzystnie z normalnego lub zmutowanego regionu zawiasowego lgG1.
Kwas nukleinowy będący przedmiotem wynalazku jest korzystnie scalony z wektorem ekspresji, który może być wprowadzony do komórki ssaka - gospodarza w celu produkcji białka fuzyjnego. Wynikowe białko fuzyjne jest efektywnie produkowane i wydzielane z komórek ssaka - gospodarza. Wydzielone białko fuzyjne jest następnie pobierane ze środowiska hodowli bez lizy komórek gospodarza. Wyprodukowane białko jest oceniane pod kątem czystości i/lub aktywności przy wykorzystaniu powszechnych reagentów, zgodnie z potrzebą i/lub rozszczepiane w celu odcięcia jego fuzyjnego partnera przy wykorzystaniu konwencjonalnych technik.
Zatem wynalazek dostarcza również sposobów produkcji białek fuzyjnych o zredukowanej immunogenności.
Sposoby i kompozycje według wynalazku są również użyteczne do wykorzystania w leczeniu białkami fuzyjnymi zaprojektowanymi jako mniej immunogenne. Sposoby według wynalazku są zarówno tanie jak i efektywne a otrzymane w wyniku ich realizacji białka są mniej immunogenne. Korzystna kompozycja terapeutyczna według wynalazku zawiera terapeutycznie efektywną ilość deimmunizowanego białka fuzyjnego. Korzystnie, deimmunizowane białko fuzyjne jest podawane przez wszystkie farmaceutycznie dostępne nośniki.
Powyższe, oraz inne aspekty, cechy i zalety wynalazku staną się bardziej oczywiste dzięki szczegółowemu opisowi, rysunkom i zastrzeżeniom zamieszczonemu poniżej.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Wszystkie białka, w tym także przeciwciała, które są podawane pacjentom w celach terapeutycznych, mogą potencjalnie wyindukować odpowiedź immunologiczną organizmu docelowego gospodarza. W owej odpowiedzi immunologicznej pośredniczą limfocyty T (komórki T), które aktywują limfocyty B (komórki B) do wytwarzania przeciwciał. Produkcja przeciwciał skierowana przeciw czynnikowi terapeutycznemu jest niepożądana, gdyż prowadzi do szybszej eliminacji rzeczonego czynnika terapeutycznego a także może wywołać reakcję alergiczną.
Wynalazek dotyczy sposobów do redukcji immunogenności białek fuzyjnych związanej z potencjalnymi epitopami limfocytów T, znajdującymi się w regionie złączenia fuzyjnego komponentów białka fuzyjnego. Epitopy limfocytów T identyfikowane są poprzez różne metody komputerowe i nie komputerowe, w tym także poprzez przewidywanie oparte na modelowaniu komputerowym lub poprzez syntezę peptydów i ich testowanie ze względu na wiązanie się ze specyficznymi molekułami MHC klasy II, lub poprzez testy immunogenności.
Według wynalazku, miejsce złączenia (połączenie) - fuzji - jest zdefiniowane jako sekwencja aminokwasowa pomiędzy ostatnim (C-końcowym) aminokwasem pierwszego peptydu lub białka, a pierwszym (N-koń cowym) aminokwasem drugiego peptydu lub biał ka w biał ku fuzyjnym. Odpowiednio złączenie fuzyjne zawiera wszystkie aminokwasy pomiędzy ostatnim aminokwasem pierwszego białka a pierwszym aminokwasem drugiego białka. W jednej z realizacji, miejsce złączenia zawiera łącznik.
Według wynalazku, region złączenia jest regionem białka fuzyjnego okalającym miejsce fuzji dwóch białek. Korzystnie, region złączenia zawiera od 1 do 100 aminokwasów, bardziej korzystnie od 1 do 50 aminokwasów lub od 1 do 25 aminokwasów, lub jeszcze korzystniej od 1 to 15 aminokwasów lub od 1 do 9 S aminokwasów. W jednej z realizacji region złączenia zawiera łącznik wstawiony pomiędzy punkty złączenia obu białek. Według wynalazku, region złączenia zawierający peptyd łącznikowy również może być deimmunizowany w celu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej pacjenta na białko fuzyjne zawierające przerywacz lub łącznik.
Według wynalazku, łączeniowy epitop limfocytów T jest zdefiniowany jako sekwencja peptydu, zdolna do wiązania się z molekułą MHC klasy II, zawierająca co najmniej jeden aminokwas pochodzący z któregokolwiek z białek wchodzących w skład białka fuzyjnego (białek takich jest co najmniej 2). Na przykład Paul ((Fundamental Immunology, rozdział 8, tabela 8, s. 276 [2000] wydanie 4) przedstawia segmenty liczące 10 aminokwasów, które są w stanie związać się z molekułą MHC klasy II. W przypadku łączeniowego epitopu limfocytów T, owe dziesięcioaminokwasowe peptydy pochodzą od różPL 209 110 B1 nych białek - partnerów uczestniczących) w fuzji. Według wynalazku, kandydat, lub potencjalny epitop limfocytów T znajdujący się w regionie złączenia (kandydat, lub potencjalny łączeniowy epitop limfocytów T) korzystnie zawiera od 1 do 8 aminokwasów z każdej strony połączenia, lub bardziej korzystnie, od 1 do 10 lub od 1 do 11 aminokwasów z każdej strony złączenia. Korzystnie, potencjalne epitopy są długości 9, 11, lub 12 aminokwasów. Skoro łączeniowy epitop według wynalazku zawiera, co najmniej jeden aminokwas z każdej strony złączenia, korzystny kandydat na epitop limfocytów T jest łączeniowym epitopem zawierającym 1- 8 (lub 1-10 lub 1-11) aminokwasów z jednej strony złączenia oraz odpowiadającą liczbę po drugiej stronie złączenia tak, by uzyskany epitop miał długość od 9 do 12 aminokwasów, najkorzystniej 9 aminokwasów.
Według wynalazku, kotwiczące reszty łączeniowego epitopu limfocytów T są mutowane tak, aby zapobiec wiązaniu się do molekuły MHC klasy II. Ogólnie, dużą uwagę przykłada się, aby nie wprowadzić nowych potencjalnych epitopów limfocytów T, oraz aby zachować funkcję każdego z partnerów białka fuzyjnego.
Według wynalazku, fuzja białek typu dzikiego jest fuzją, w której sekwencje białek po N-końcowej stronie złączenia oraz po C-końcowej stronie złączenia są bezpośrednio sekwencjami występującymi w naturze.
Według wynalazku, deimmunizowanym miejscem złączenia w fuzji białek jest sekwencja złączenia w której wprowadzono jedną lub więcej mutacji - zastąpień w stosunku do złączenia sekwencji typu dzikiego. W korzystnej realizacji wynalazku, deimmunizacja złączenia fuzyjnego nie wymaga wprowadzania łącznika, takiego jak nie immunogenny łącznik Gly-Ser, jak również przestrzenne wzajemne ułożenie partnerów fuzji nie jest zmienione. Według wynalazku, jeden lub większa liczba aminokwasów w regionie złączenia może być zmodyfikowanych lub podstawionych, zarówno N-terminalnie względem złączenia fuzyjnego, C-terminalnie względem złączenia fuzyjnego, lub zarówno N-terminalnie jak i C-terminalnie względem złączenia fuzyjnego.
Według wynalazku, potencjalny epitop limfocytów T jest to sekwencja, dla której, rozpatrując ją jako izolowany peptyd, przewidziano wiązanie się z molekułą MHC klasy II lub jej odpowiednikiem w gatunkach innych niż człowiek. Potencjalny epitop limfocytów T zdefiniowany jest bez rozważania innych aspektów reakcji immunologicznej, takich jak efektywność pobierania białek przez komórki prezentujące antygeny, efektywność rozszczepiania naturalnego białka, w wyniku którego powstaje peptyd wiążący się z MHC klasy II, i tak dalej. Zatem zbiór epitopów limfocytów T, które są faktycznie prezentowane na MHC klasy II po podaniu białka zwierzęciu to jedynie podzbiór potencjalnych epitopów komórek T.
Według wynalazku, epitop limfocytu T jest epitopem białka, które oddziałuje z molekułą MHC klasy II. Bez konieczności ścisłego związku z teorią wiadomym jest, że epitop limfocytów T jest sekwencją aminokwasowa należącą do białka lub białka fuzyjnego, która nie uległa procesowi negatywnej selekcji przez limfocyty T podczas rozwoju limfocytów T i dlatego oczekuje się, iż epitop będzie prezentowany przez MHC klasy II i rozpoznawany poprzez receptory limfocytów T. W korzystnej realizacji wynalazku nie-własne epitopy limfocytów T są obecne w regionie złączenia dwóch białek, tworzących białko fuzyjne.
Wynalazek dotyczy również nie-komputerowych metod wyeliminowania bądź redukcji liczby epitopów limfocytów T w złączeniu białka fuzyjnego bez dokonywania skomplikowanych symulacji trójwymiarowych struktur białek. W pewnej realizacji, sposób według wynalazku, bazuje na fakcie, iż rdzeń dziewięcioaminokwasowego segmentu, podczas prezentowania przeciwciała, oddziałuje zarówno z MHC klasy II jak i z receptorem limfocytów T. Skrajny N-końcowy aminokwas zwany jest pozycją „kotwiczącą („resztą kotwiczącą), które wiąże się do głębokiej kieszeni wewnątrz molekuły MHC klasy II. Następujące aminokwasy typowo występują na pozycji kotwiczącej, co jest bardzo istotne dla wiązania się do molekuły MHC klasy II: leucyna, walina, izoleucyna, metionina, fenyloalanina, tyrozyna oraz tryptofan.
Według wynalazku, dwa lub trzy aminokwasy najbliższe owemu dziewięcioaminokwasowemu rdzeniowi również wpływają na oddziaływanie z molekułą MHC. Dodatkowo, skrajny C-końcowy aminokwas w pierwszym białku składającym się na białko fuzyjne, ogólnie może być podstawiony. Jest to użyteczne szczególnie wtedy, gdy wiadomo, że N-końcowy fuzyjny komponent białka fuzyjnego (lub pierwszy komponent białka fuzyjnego) jest aktywny, gdy jest połączony z C-końcowym partnerem fuzyjnym (lub drugim komponentem białka fuzyjnego I przyłączonym do C-końca pierwszego białka).
PL 209 110 B1
Sposób według wynalazku rozpatrywany ogólnie opisuje mutacje każdego aminokwasu będącego leucyną, waliną, izoleucyna, metionina, fenyloalanina, tyrozyną oraz tryptofanem, który występuje w C-końcowej ośmioaminokwasowej sekwencji N-terminalnego partnera fuzyjnego w białku fuzyjnym. W pewnej realizacji wynalazku, jeden lub większa liczba tych aminokwasów w sekwencji potencjalnego łączeniowego epitopu limfocytów T jest zamieniany na treoninę, alaninę lub prolinę. Zamiana ta pozostawia hydrofobową naturę aminokwasów, które podmieniono. W dalszej realizacji wynalazku, jeden lub większa liczba wymienionych powyżej aminokwasów jest usuwany z potencjalnego łączeniowego epitopu limfocytów T, lub zamieniany na odpowiedni aminokwas - analog. Według wynalazku, usuwając aminokwas w celu zniwelowania potencjalnego epitopu limfocytów T, uważa się, by nie wprowadzić nowego epitopu limfocytów T w pobliżu dokonanej delecji.
Według wynalazku, często użyteczne jest skonstruowanie ogólnego pośredniego plazmidu zawierającego kodowaną sekwencję N-końcowego partnera fuzyjnego ze zmutowanymi jedną, lub kilkoma hydrofobowymi aminokwasami, należącymi do odcinka ostatnich ośmiu aminokwasów. Ogólnie, plazmid taki zawiera przy lub w pobliżu odcinka DNA kodującego C-koniec N-końcowego partnera fuzyjnego jedno lub więcej dogodnych miejsc restrykcyjnych.
Celem pośrednika dla plazmidu jest skonstruowanie plazmidu kodującego białko fuzyjne, w którym w jego jednym lub w kilku N-końcowych fuzyjnych partnerach zamieniono jedną lub kilka reszt aminokwasowych, leżących w obrębie C-końcowego ośmioaminokwasowego fragmentu, będących leucyną, waliną, izoleucyną, metioniną, fenyloalaniną, tyrozyną lub tryptofanem, podstawiając je innym aminokwasem. Skonstruowanie końcowego plazmidu może być osiągnięte za pomocą dowolnego sposobu znanego ze stanu techniki, jak na przykład przy pomocy fragmentów PCR, czy syntetycznego kwasu nukleinowego i wklejeniu fragmentu do odpowiedniego wektora lub połączeniu z innymi sekwencjami za pomocą jednej z wielu znanych metod PCR.
Specyficznie korzystna realizacja wynalazku stanowi plazmidy fuzyjne: Fc-X, albumina-X, scFv-X i Fab-X. W przypadku Fc(gamma)-X użyteczne jest wprowadzenie mutacji do sekwencji kodują cej tak, aby osiągnąć segment leucyna-seryna-leucyna-seryna w pobliżu C-końca regionu Fc białka IgG1, lgG2, lgG3 lub lgG4, jak przedstawiono poniżej dla białka IgGI: Sekwencje aminokwasowe ludzkiego regionu Fc, pochodzące z białek IgG1, lgG2, lgG3 lub lgG4 zostały oznaczone jako sekwencje numer (ang. SEQ ID NO): 1, 2, 3 i 4 odpowiednio dla każdego z białek.
W jednym z przykł adów, KSLSLSPGK (sekwencja numer 5) został a zmieniona na KSATATPGK (sekwencja numer: 6). Mutacje te wprowadzono, aby wyeliminować potencjalny łączeniowy epitop limfocytów T oraz jednocześnie usunąć epitop limfocytów T, w którym leżąca powyżej (w stronę N - końca) fenyloalanina lub tyrozyna służą jako reszta kotwicząca w pozycji 1.
Alternatywnie, użyteczne jest czasami łączenie mutacji, które usuwają potencjalny łączeniowy epitop limfocytów T z mutacjami, które wydłużają czas półtrwania w surowicy. Na przykład, zamiana KSLSLSPGK (sekwencja numer 5) na sekwencję KSATATPGA (sekwencja numer: 7).
Inna realizacja wynalazku obejmuje substytucję w segmencie LSLS na inny aminokwas, jak na przykład na glicynę czy prolinę.
W przypadku wektorów sporzą dzonych dla ekspresji biał ka fuzyjnego IgA, uż yteczne jest usunięcie kilku C-końcowych aminokwasów, tak, aby leżąca w pobliżu C-końca cysteina, biorąca udział w oligomeryzacji IgA została usunięta. Na przykład, można usunąć piętnaście aminokwasów, aby sekwencja ciężkiego łańcucha IgA, przed fuzją z drugim białkiem, kończyła się na sekwencji: prolinatreonina-histydyna. Dodatkowo, użyteczne jest wprowadzenie następujących zmian w pobliżu C-końca domeny CH3 regionu Fc białka IgA:
QKTIDRLAGKPTH (sekwencja numer: 8) na
QKTADRTAGKPTH (sekwencja numer: 9).
Dodatkowe deimmunizowane sekwencje w białku fuzyjnym lgA-X to:
QKTPTRTAGKPTH (sekwencja numer: 10),
QKTPTRPAGKPPTH (sekwencja numer: 11),
QKTATRPAGKPTH (sekwencja numer: 12).
W przypadku fuzji albumina-X, korzystne jest wprowadzenie zmian do wektora plazmidowego kodującego fuzyjne białko albumina-X tak, aby C-koniec albuminy został zmodyfikowany jak następuje:
KKLVAASQAALGL (sekwencja numer: 13) na KKLVAASQAATTA (sekwencja numer: 14).
Wynalazek dostarcza, zatem sekwencji kwasów nukleinowych bądź sekwencji białkowych, które są użyteczne w konstruowaniu mniej immunogennych białek fuzyjnych. W szczególności wynalazek dostarcza sekwencji białkowych ze zmutowanym jakimkolwiek aminokwasem będącym leucyną, waliPL 209 110 B1 ną, izoleucyną, metionina, fenyloalaniną tyrozyną lub tryptofanem, który występuje w C-końcowej sekwencji ośmioaminokwasowej. Korzystne białka są białkami ludzkimi, których sekwencje odpowiadają sekwencjom spotykanym w ludzkim organizmie. Wynalazek dostarcza również sekwencji kwasów nukleinowych, kodujących takie białka. Sekwencje kwasów nukleinowych tej według wynalazku mogą funkcjonować jako sekwencje plazmidu, fragmenty wygenerowane dzięki PCR lub jako kwas nukleinowy powstały poprzez chemiczną syntezę.
Wynalazek dotyczy również sekwencji wektorów plazmidowych, kodujących białka fuzyjne, w których jeden lub wię ksza liczba N-terminalnych partnerów fuzyjnych posiada zmutowany jeden lub większą liczbę aminokwasów będących leucyną, waliną, izoleucyną, metioniną, fenyloalaniną, tyrozyną lub tryptofanem, na inny aminokwas w ósmym C-końcowym aminokwasie.
Na przykład, plazmid kodujący Fc-IL2 lub całe przeciwciało-IL2 białka fuzyjnego, w którym region Fc został zmutowany jak opisano powyżej, również jest związany z przedmiotem wynalazku. Ponadto wynalazek dotyczy także fuzji łączącej region Fc zmutowany jak opisano powyżej do normalnej bądź zmutowanej formy erytropoetyny, jak opisana w opisie patentowym WO01/36489.
Wynalazek dostarcza również sposoby redukcji immunogenności białek fuzyjnych poprzez wprowadzanie miejsc N-glikozylacji bądź O-glikozylacji w pobliżu lub korzystnie, przy miejscu złączenia. Dla przykładu, aminokwasy; asparagina, seryna lub treonina, oraz trzecia reszta, wprowadzane są jak następuje: Rozpatrzmy sekwencję, w której X oznacza aminokwas należący do N-terminalnego partnera fuzyjnego, Z zaś - aminokwas należący do C-terminalnego partnera fuzyjnego.
X1 X2X3X4X5X6Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9
X1X2X3X4X5NGSZ3Z4Z5Z6Z7Z8Z9
Według tego sposobu, nie jest konieczne, aby wiązanie peptydu łączącego było zablokowane poprzez miejsce glikozylacji. Jednakże, każdy peptyd który wiąże się z bruzdą molekuły MHC klasy II i posiada glikolizowaną asparaginę C-końcową względem skrajnej N-końcowej reszty kotwiczącej, nie będzie funkcjonował jako epitop limfocytów T. Obecność rozległych fragmentów glikozylacji ogranicza sterycznie rozpoznawanie peptydu przez molekułę MHC klasy II. Korzystnie, miejsca glikozylacji określone są sekwencją Asn-X-Ser lub Asn-X-Thr, gdzie X oznacza korzystnie Gly, choć może być dowolnym aminokwasem.
Ponadto wprowadzenie mutacji polegających na wprowadzeniu reszt glicyny lub seryny nie tworzy nowych epitopów limfocytów T. Ani glicyna, ani seryna nie mogą oddziaływać jako reszty kotwiczące. W trakcie przetwarzania antygenów, białko, a w szczególności białko fuzyjne, jest rozszczepiane pomiędzy glikolizowaną asparaginą i glicyną lub pomiędzy glicyną a seryną. W obydwu przypadkach, powstały peptyd posiada wstawione poprzez mutacje reszty glicyny i/lub seryny w pozycji N-końcowej w stosunku do reszty kotwiczącej. Wprowadzone jako mutacje reszty glicyny i/lub seryny nie są rozpoznawane przez receptory limfocytów T, dlatego też, ponieważ reszty N - terminalne w stosunku do reszty kotwiczącej leżą poza regionem rozpoznawanym przez TCR.
Jako pewną odmianę tego sposobu, w złączenie fuzyjne wprowadza się serynę lub treoninę poprzedzoną aminokwasem takim jak glicyna, seryna, alanina, itp. Wariant ten jest korzystny, gdy region złączenia jest elastyczny i odsunięty od hydrofobowego rdzenia obydwu partnerów fuzyjnych, tak aby Wprowadzona następnie nowa N-glikozylacja nie zaburzała procesu tworzenia lub funkcji żadnego z partnerów fuzyjnych.
Określenie, czy wprowadzenie nowego miejsca glikozylacji jest dogodne, jest rzeczą oczywistą dla osób zaznajomionych z inżynierią białkową. Na przykład może być znana struktura trzeciorzędowa każdego z partnerów fuzyjnych, lub ich bliskiego homologa. Często zdarza się, że struktura przestrzenna kilku ostatnich aminokwasów z N-końca lub C-końca białka nie została rozwiązana za pomocą metody dyfrakcji rentgenowskiej, bądź też, w przypadku struktur oznaczanych dzięki NMR, otrzymano dla tychże aminokwasów wiele możliwych konformacji. Istnieje pewne przekonanie, że w przypadku, gdy trzy lub kilka aminokwasów po którejś ze stron miejsca glikozylacji jest nieuporządkowanych, otrzymane białko fuzyjne zwinie się do poprawnej struktury oraz że obydwaj fuzyjni partnerzy będą aktywni. Potrzebne są pewne rutynowe eksperymenty, aby stwierdzić, czy otrzymane białko fuzyjne będzie funkcjonalne.
W korzystnej realizacji wynalazku, zarówno N-koń cowy, jak i C-koń cowy partner białka fuzyjnego są białkami ludzkimi. Potencjalne epitopy limfocytów T w takich białkach fuzyjnych są tworzone z poś ród ostatnich oś miu aminokwasów N-koń cowego partnera fuzyjnego (pierwsze biał ko) złączonych z pierwszymi ośmioma aminokwasami C-terminalnego partnera (drugie białko). W ten sposób możliwe jest utworzenie 8 hybrydowych 9-merów stworzonych na podstawie części pierwszego i dru10
PL 209 110 B1 giego białka. Każdy aromatyczny lub alifatyczny aminokwas (leucyna, walina, izoleucyna, metionina, fenyloalanina, tryptofan lub tyrozyna) znajdujący się w ośmioaminokwasowym fragmencie z C-końca pierwszego partnera fuzyjnego stanowi poważne zagrożenie stworzenia peptydu wiążącego się z MHC, w którym to peptydzie pierwszy aminokwas jest kotwiczący i wiąże się z kieszenią molekuły MHC. Zatem podstawienie każdego z powyżej wymienionych aminokwasów na aminokwas nie należący do zbioru powyżej wyspecyfikowanego, korzystnie na alaninę, prolinę lub treoninę, eliminuje potencjalny epitop limfocytów T.
Dla przykładu, w przypadku białka fuzyjnego Fc zawierającego sekwencję:
HNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGS (sekwencja numer: 15), reszty leucyny tworzą dwa potencjalne epitopy. Sekwencja ta może być, zatem deimmunizowana, jako:
HNHYTQKSATATPGKGGGGSGGGGSGGGGS (sekwencja numer: 16), poprzez zamianę L na A oraz S na T. Zmiany te usuwają kolejno epitopy: zawierający leucynę jako pierwszy aminokwas wiążący się do kieszeni MHC, bądź zawierający tyrozynę wiążącą się z kieszenią MHC jako pierwszy aminokwas peptydu.
Podstawienia te, mające na celu deimmunizację, sprawdzają się u ludzi dla wszystkich białek fuzyjnych Fc, zarówno zawierających, jak i niezawierających sekwencji łączącej, korzystnie, gdy:
1) obydwa komponenty białka fuzyjnego są białkami ludzkimi; 2) peptydy wiążące się do MHC, występujące w naturalnych sekwencjach obu białek składowych są ignorowane oraz 3) opisane powyżej 9-ciomery, identyczne z naturalnymi sekwencjami, również są ignorowane.
Sposoby według wynalazku generalnie można zastosować u wszystkich organizmów kręgowców, korzystnie u ssaków, najkorzystniej u ludzi. Wynalazek zilustrowany jest poniżej poprzez nie ograniczające go przykłady.
PRZYKŁADY
P r z y k ł a d 1: Wnioskowanie immunogennie reaktywnych epitopów dla immunocytokiny huKS- IL2 huKS - IL 2 składa się z humanizowanych regionów VH i VL połączonych z ludzkim stałym łańcuchem H i łańcuchem L. Łańcuch H poddany został fuzji na swoim C-końcu z dojrzałą sekwencją ludzkiej IL-2, jak opisano powyżej. Rzeczony łańcuch H jest izotypem γ1 i posiada wysokie powinowactwo do receptorów Fc. Na wskutek tego wysokiego powinowactwa huKS-IL2 jest szybko usuwane z obiegu. Bez odwoływania się do ścisłego związku z teorią, można przyjąć, że usuwanie huKS -IL2 najprawdopodobniej zachodzi poprzez komórki przenoszące FcR w wątrobie (komórki Kuppffera) i śledziony (komórki prezentujące antygeny).
Już wcześniej zostało ustalone, że podanie pewnych porcji huKS - IL2 u niektórych pacjentów wywołuje odpowiedź immunologiczną, jednakże epitopy rozpoznawane przez owe przeciwciała, nie są znane. W celu wykrycia reaktywnych epitopów, względne aktywności surowicy pacjentów z huKS - IL 2 zostały porównane z aktywnościami dla innych białek:
1) Hu14.18-IL2 - cząsteczka z całkowicie innym humanizowanym regionem V, ale identycznym regionem C, poddana fuzji z IL-2;
2) VH1 - deimmunizowana forma huKS - IL2 bez epitopów limfocytów T w domenach VH i VL, uzyskanych z regionów V myszy z wyeksponowanymi na powierzchni epitopami mysich limfocytów B upodobnionych do reszt ludzkich.
3) VH2 - deimmunizowana forma huKS - IL 2 z pozostawionym jednym epitopem limfocytów T w CDR3, uzyskana z regionu V u myszy z wyeksponowanymi na powierzchni epitopami mysich limfocytów B upodobnione do reszt ludzkich. Domena Vh zawiera jeden epitop limfocytów T.
4) 425-IL2 zbudowany z regionów KOL lub EU Cy1 (bardziej niż z KS) - dla porównania reaktywności allotypicznej.
5) huKS-mlL2 molekuła, w której region V huKS poddano fuzji z mysim regionem C oraz mysim IL-2.
6) Ludzkie Fc-IL2.
7) Tylko ludzkie Fc.
8) Tylko ludzkie IL-2.
Immunoglobulinowe białka fuzyjne oraz fragmenty oczyszczono poprzez chromatografię białek A na złożu sefarozowym i wprowadzono na 96 dołkowe płytki z buforem wodorowęglanowym a następnie zablokowano 1% kozią surowicą zawierającą 1% BSA. Roztwory ludzkiej surowicy inkubowano a następnie niezwiązany materiał został usunięty poprzez trzykrotne przemycie PBS-Tween. Związane ludzkie przeciwciała z surowicy pacjentów wykrywano poprzez różne HRP-sprzężone przeciwPL 209 110 B1 ciała, zależnie od związanego białka. Ogólnie, wykorzystany został konjugat HRP koziego antyludzkiego łańcucha λ, ponieważ większość białek wiążących się na płytkach zawierało ludzkie łańcuchy Fc oraz ludzkie łańcuchy κ.
Surowica pewnych pacjentów wykazuje oczywistą aktywność względem huKS-IL2, która nie była wykrywalna w surowicy przed wstrzyknięciem u tych samych pacjentów. Antysurowica przed wywołaniem reakcji immunologicznej posłużyła za poziom odniesienia dla nie-immunologicznej grupy kontrolnej. Reaktywność obserwowana w surowicy pacjentów może być przypisana: (1) reaktywności anty - IL- 2, (2) reaktywności Fc (allotypowej), (3) reaktywności względem nowo wprowadzonej sekwencji złączenia, (4) antyidiotypowej reaktywności z idiotypem KS, lub kombinacji wymienionych tu aktywności.
Surowica żadnego pacjenta nie reagowała znacząco z rekombinowanym IL-2 lub z regionem Fc (punkty 1 i 2 powyżej). Niektórzy pacjenci okazywali reaktywność antyidiotypową względem regionu V KS. Surowica od wszystkich pacjentów wykazywała reaktywność z Fc-IL2, ale nie przeciw zarówno Fc albo IL2. Sugeruje to, że to złączenie pomiędzy Fc a IL2 było wykrywane przez antysurowicę pacjentów.
P r z y k ł a d 2: Modyfikacja reszt aminokwasowych w miejscu złączenia białka fuzyjnego cytokiny w celu zmniejszenia immunogenności poprzez eliminacje motywów wiążących się do molekuły
MHC klasy II
Analiza przewlekania peptydów wykazała istnienie dwóch nakładających się segmentów o silnych zdolnościach do wiązania się z MHC, leżących na złączeniu pomiędzy fragmentami Fc a IL2 immunocytokiny. Przewlekanie peptydów oraz identyfikacja potencjalnych epitopów limfocytów T przeprowadzona została, jak ujawniono w Carr (opis patentowy WOOO/34317). Wprowadzono zmiany w sekwencji aminokwasów tak, aby wyeliminować istniejące potencjalne epitopy wiążące się do MHC klasy II, lecz aby nie wprowadzić jednocześnie nowych potencjalnych epitopów MHC klasy II.
Modyfikacja wprowadzona w sekwencji złączenia LSLSPGK - AP (sekwencja numer: 17) do ATATPGA - AP (sekwencja numer: 18) (LSLS do ATAT), gdzie myślnik oznacza miejsce złączenia immunocytokiny huKS-IL2, spowodowała, że sekwencja złączenia nie jest w stanie wiązać się do żadnej ludzkiej molekuły MHC klasy II z powinowactwem wystarczająco dużym, by wywołać reakcję immunogenną.
P r z y k ł a d 3: Modyfikacja reszt aminokwasowych w miejscu złączenia immunocytokinowego białka fuzyjnego w celu zredukowania immunogenności.
Modyfikacja sekwencji złączenia LSLSPGK - AP (sekwencja numer: 17) do LNLSPGA - AP (sekwencja numer: 19)(LSLS do LNLS), gdzie myślnik oznacza miejsce złączenia immunocytokiny huKS-IL2, spowodowała, że sekwencja peptydu pochodzącego z miejsca złączenia wciąż jest w stanie wiązać się do pewnych molekuł MHC klasy II. Jednakże, gdy białko KS-IL2 ulega ekspresji i sekrecji w komórkach ssaków, białko ulega N-glikolizie w pobliżu miejsca złączenia, z powodu występowania sekwencji NXS/T.
Wynikowy peptyd pochodzący z miejsca złączenia nie jest efektywnym epitopem limfocytów T, gdyż kiedy jest on prezentowany limfocytom T poprzez białka MHC klasy II, duży N-glikolizowany fragment uniemożliwia specyficzne dokowanie pomiędzy receptorem limfocytów T a białkiem MHC klasy II.
P r z y k ł a d 4: Charakteryzacja reaktywności odpornościowej komórek prezentujących antygen immunocytokinie huKs-IL2 w porównaniu z deimmunizowaną immunocytokiną huKS-IL2
Redukcja immunogenności na skutek modyfikacji reaktywnego epitopu poprzez zmutowanie sekwencji LSLS na ATAT jest bezpośrednio testowana jak następuje. Syntetyczne peptydy naśladujące tą sekwencję zmieniają odpowiedź odpornościową klasycznych komórek prezentujących antygeny, takich jak komórki dendrytyczne (ang. dendritic cell - DC). Poniższe syntetyczne peptydy:
KSLSLSPGK - APTS (sekwencja numer: 20) oraz
KSATATPGK - APTS (sekwencja numer: 21), gdzie myślnik oznacza złączenie KS - IL2, są użyte do stymulowania prezentowania antygenów limfocytom T za pośrednictwem komórek DC. Zdolność tychże limfocytów T do proliferacji w odpowiedzi na peptydowy antygen jest miarą immunogenności tego peptydu.
Peryferyjne jednojądrowe komórki krwi (PBMC) są izolowane z leukopaczek poprzez standardowe metody gradientowe. Jednojądrowe komórki są następnie umieszczone w pozbawionym osocza ośrodku do hodowli Aim V i pozostawione do przylgnięcia. Po dwóch godzinach w temperaturze 37°C komórki, które nie przylgnęły, zostały usunięte. Komórki, które przywarły, hodowano przez 7 dni w ośrodku zawierającym ludzką GM-CSF (50 ng/ml) oraz IL-4(20ng/ml) w celu uzyskania niedojrza12
PL 209 110 B1 łych komórek dendrytycznych (DC). Po siedmiu dniach komórki zostały zebrane i scharakteryzowane fenotypowo poprzez cytometrię przepływową z odpowiednim Abs znakowanym FITC dla MHC klasy I,
MHC klasy II, CD80 i CD40, aby potwierdzić fenotyp niedojrzałych komórek DC.
Komórki, które nie przywarły, były hodowane w obecności IL-2 i IL-7 w celu otrzymania autologicznych komórek efektorowych limfocytów T, wykorzystanych do kolejnych badań funkcjonalnych. Dla badań funkcjonalnych, limfocyty T dodane zostały do niedojrzałych komórek dendrytycznych (stosunek 10:1) i wspólnie hodowane w obecności huKS, deimmunizowanego huKS, peptydu złączeniowego: 13-to meru (KSLSLSPGK-APTS) (sekwencja numer: 20) oraz w obecności B zmodyfikowanego peptydu: 13-to meru (KSATATPGK - APTS) (sekwencja numer: 21). Porównanie indeksu proliferacji mierzonego poprzez miareczkowanie zawartości tymidyny po ekspozycji na każdą z immunocytokinaz, bądź immunogennych lub deimmunizowanych peptydów, pokazuje stopień immugeniczności tychże molekuł. Wzrost udziału radioaktywności jest z grubsza proporcjonalny do zdolności każdego H z peptydów do wiązania się z molekułą MHC klasy II na komórce DC i do zdolności do prezentowania limfocytom T.
P r z y k ł a d 5: Wnioskowanie reaktywności immunogennej epitopów znalezionych w albuminowym białku fuzyjnym oraz modyfikacja reszt aminokwasowych w miejscu złączenia w celu redukowania immunogenności
Albumina surowicy ludzkiej (HSA), z powodu jej znacząco długiego okresu półtrwania, jej szerokiego rozpowszechnienia in vivo, oraz braku enzymatycznej bądź immunologicznej funkcji była stosowana jako nośnik białek/peptydów terapeutycznych. Pokazano, iż genetycznie modyfikowana hybryda HSA-CD4 blokuje wejście wirusa ludzkiego obniżenia odporności (HIV) do komórek CD4+, podczas gdy wykazywane in-vitro własności przeciwwirusowe są podobne do tych, które wykazuje rozpuszczalna CD4 (Yeh et al., PNAS 89:1904-1908, 1992). Zatem genetyczna fuzja bioaktywnych peptydów z HSA jest pożyteczna do projektowania i odzyskiwania wydzielonych terapeutycznych pochodnych HSA. Jednakże, jak w przypadku wszystkich białek fuzyjnych, HSA-CD4 posiada nowe złączenie, które może być immunogenne, zawiera też epitopy limfocytów T, które mogą być zaprezentowane na molekułach MHC klasy II. Analiza połączenia pomiędzy HSA a CD4 przy użyciu sposobów pokazanych w przykładzie 1,2,3 i 4 identyfikuje peptydy potencjalnie wiążące się do MHC. Te potencjalnie immunogenne sekwencje są modyfikowane w celu obniżenia bądź wyeliminowania potencjalnych epitopów limfocytów T oraz limfocytów B, w celu obniżenia immunogenności. Podobnie, w celu obniżenia immunogenności, mogą być wprowadzone w regionie złączenia nowe miejsca glikozylacji.
sekwencja albuminy sekwencja CD4
TCFAEEGKKLVAASQAALGL - KKVVLGKKGDTVELTCTAS (sekwencja numer; 22).
Według wynalazku zakłada się, iż białko fuzyjne HSA-IFNa w złączeniu zawiera trzy potencjalne epitopy limfocytów T;
KKLVAASQAALGL (sekwencja numer: 13);
KLVAASQAALGLC (sekwencja numer: 23); i
LGLCDLPQTHSLG (sekwencja numer: 24).
Epitopy limfocytów T pokazane w sekwencji 13 i 23 nakładają się i mogą być deimmunizowane poprzez zamianę aminokwasów LV (pogrubione) na jakiekolwiek inne za wyjątkiem F, I, L, M, V, W, oraz Y. Alternatywnie, ocena obliczona poprzez przewlekanie peptydu może zostać zredukowana znacząco poprzez zamianę LG na TT. Epitop limfocytów T w sekwencji 24 może zostać deimmunizowany poprzez zastąpienie drugiej z kolei L (pogrubiona) na A.
Ponadto zakłada się też, że w przypadku białka fuzyjnego HSA-X, gdzie X oznacza jakiekolwiek białko, deimmunizacja miejsca złączenia może zostać osiągnięta poprzez zamianę sekwencji aminokwasów AALGL (sekwencja numer: 25) na TATTA (sekwencja numer: 26).
CFAEEGKKLVAASQTATTA(sekwencja numer: 27).
P r z y k ł a d 6: Białko fuzyjne X - Fc oraz modyfikacje reszt aminokwasowych w celu zredukowania immunogenności
W pewnych przypadkach szczególnie korzystne jest zaprojektowanie białka w orientacji X-Fc. W takich konstrukcjach docelowe białko jest N-końcowym partnerem B fuzji a fragment Fc następuje po nim. Dla przykładu, peptyd glukagonopodobny (GLP-1) wymaga dla swojej aktywności wolnego N-końca, tak więc połączenie GLP-1-Fc jest bardzo użyteczne.
Białko fuzyjne GLP-1-Fc utworzone jest zgodnie ze standartowymi regułami opisanymi w literaturze. Białko to ma C-koniec GLP-1 przyłączony do zawiasu ciężkiego łańcucha γ1. Wykorzystano sekwencję zawiasu γ1 zawierającą mutację Cys na Ser (reszta 5). Mutacja ta eliminuje resztę cysteiny
PL 209 110 B1 tworzącą mostek dwusiarczkowy z lekkim łańcuchem w IgG1 (Lo et al. (1998) Engineering Protein 11
495-500). Niezmutowana sekwencja to:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 28), w której region zawiasu został podkreślony, po której następuje sekwencja domeny CH2.
Złączenie fuzji pomiędzy GLP-1 (7-37) oraz mutanta Fc ma sekwencję:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 29).
Złączenie fuzji pomiędzy GLP-1 (7-37) oraz normalnego Fc ma sekwencję:
SYLEGQAAKEFIAWLVKGRG - EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 30)
Za pomocą przewlekania peptydu zidentyfikowano trzy potencjalne epitopy w złączeniu fuzji
GLP-1-Fc:
B KEFIAWLVKGRGE (sekwencja numer: 31)
EFIAWLVKGRGEP (sekwencja numer: 32)
AWLVKGRGEPKSS (sekwencja numer: 33)
Analiza złączeń fuzji pomiędzy GLP-1 (tekst pogrubiony) a Fc (tekst niepogrubiony), przeprowadzona w przykładach 1-3 zidentyfikowała peptydy potencjalnie wiążące się do MHC. Po zidentyfikowaniu potencjalnych miejsc poprzez analizę przewlekania peptydów, potencjalnie immunogenne sekwencje zostały zmodyfikowane poprzez podstawienia aminokwasów w celu obniżenia bądź eliminacji potencjalnych epitopów limfocytów T i B oraz w celu obniżenia immunogenności.
Wspomniane powyżej potencjalne epitopy limfocytów T pokazano na sekwencjach 31, 32 i 33. Deimmunizowano je poprzez podstawienia pojedynczych aminokwasów. Dla przykładu, peptyd o sekwencji numer 31 jest deimmunizowany przez zamianę lizyny (zaznaczona przez pogrubienie) na treoninę oraz argininę (zaznaczona przez pogrubienie) na treoninę. Peptyd o sekwencji 32 jest deimmunizowany poprzez zastąpienie izoleucyny (zaznaczona przez pogrubienie) alaniną bądź proliną. Peptyd o sekwencji 33 jest deimmunizowany poprzez zastąpienie leucyny alaniną bądź proliną. Wynikiem deimmunizacji jest sekwencja:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFAAWAVTGTG - EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 34).
Według przykładowej metody wprowadzania miejsc glikozylacji w miejscu złączenia, wprowadzono następujące zmiany:
SYLEGQAAKEFIAWLVKGRN - GSKSSDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 35).
P r z y k ł a d 7: Wnioskowanie immunogennie reaktywnych epitopów Enbrel, białka fuzyjnego
TNFR-Fc oraz modyfikacja reszt aminokwasowych w złączeniu dla redukcji immunogenności.
ENBREL - etanercept, białko fuzyjne X-Fc zatwierdzone przez FDA, jest inhibitorem B czynnika nekrozy nowotworowej używane w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. ENBREL jest dimerycznym białkiem fuzyjnym składającym się z pozakomórkowej domeny receptora TNF wiążącej ligand, połączonej z białkiem Fc ludzkiej IgG1. TNRF-Fc kompetycyjnie inhibituje wiązanie TNF do jego receptora i czyni związany TNF biologicznie nieaktywnym, co powoduje znaczące obniżenie aktywności zapalnej. Jak opisano powyżej dla GLP-1-Fc, TNFR-Fc ma nowe złączenie, które zawiera potencjalne epitopy limfocytów T.
Sekwencja bezpośredniego złączenia pomiędzy C-końcowego odcinka TNF-R (tekst pogrubiony) do N-końca zawiasu g1 (tekst zwykły z podkreśloną sekwencją zawiasu) to:
STSFLLPMGPSPPAEGSTGD - EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 36)
Analiza złączenia pomiędzy TNF-R a Fc, przeprowadzona jak w przykładach) 1-4, zidentyfikowała peptydy potencjalnie wiążące się do MHC. Po zidentyfikowaniu potencjalnych miejsc poprzez metodą przewlekania, potencjalnie immunogenne sekwencje zostały zmodyfikowane poprzez podstawienie aminokwasów tak, aby zredukować lub wyeliminować potencjalne epitopy limfocytów T i B oraz obniżyć immunogenność.
Zgodnie z przykładowymi sposobami wprowadzania miejsc glikozylacji w miejscu złączenia, wprowadzono następujące zmiany do sekwencji:
STSFLLPMGPSPPAEGSTGN - GSKSCDKTHTCPPCPAPELLG (sekwencja numer: 37).
P r z y k ł a d 8: Dedukcja immunogennie reaktywnych epitopów dla białek fuzyjnych Fc-X-Y, takich jak Fc-IL12-IL2 oraz modyfikacja reszt aminokwasowych w miejscu złączenia w celu zmniejszenia immunogenności
Białka fuzyjne typu Fc-X-Y, takie jak Fc-IL12-IL2 mają wielokrotne nowe miejsca złączenia, które mogą być potencjalnie immunogenne. Dla przykładu, Fc-IL12 ma miejsce złączenia podobne do
PL 209 110 B1 innych białek fuzyjnych typu Fc-X lub immunocytokinaz (przykład 1), ale jest inne na wskutek użycia cytokiny 1L12. Złączenie zostało przeanalizowane pod kątem immunogennych miejsc wiążących i odpowiednio zmodyfikowane. Istnieje też drugie złączenie, X-Y, podobne do opisanego w przykładzie 5, zawierające dwie różne cytokiny tworzące białko fuzyjne. Oba te złączenia zbadano metodą przewlekania.
Analiza złączeń:
(1) MHEALHNHYTQKSLSLSPGK - RNLPVATPDPGMFPCLHHSQ (sekwencja numer: 38) pomiędzy C-końcem Fc (tekst pogrubiony) a N-końcem IL12p35 (tekst zwykły) (2) RAQDRYYSSSWSEWASVPCS - APTSSSTKKTQLQLEHLLLD (sekwencja numer: 39) pomiędzy C-końcem IL12p40 (tekst pogrubiony) a N-końcem IL2 (tekst zwykły), przeprowadzona metodą przewlekania zidentyfikowała peptydy potencjalnie wiążące się do MHC. Potencjalnie immunogenne sekwencje zmodyfikowano tak, aby obniżyć bądź wyeliminować potencjalne epitopy limfocytów T.
Dla przykładu, w pierwszej z dwóch powyższych sekwencji, wprowadzono następujące zmiany:
MHEALHNHYTQKSATATPGK - RNLPVATPDPGMFPCLHHSQ (sekwencja numer: 40).
Zmiany te redukują, bądź eliminują potencjalne wiązanie się do molekuły MHC klasy II kilku epitopów w złączeniu Fc z podjednostką p35 IL12.
W innym przykładzie, druga z powyższych sekwencji została zmodyfikowana tak, aby wprowadzić miejsca glikozylacji, poprzez wprowadzenie asparaginy oraz glicyny na dwóch pierwszy pozycjach w IL2. Strategia ta wykorzystuje naturalnie występującą treoninę na pozycji 3 w dojrzałej IL2. Dodatkowo, ważne jest, aby nie zniszczyć mostka dwusiarczkowego we fragmencie p40, użyteczne jest zatem oddzielenie miejsca glikozylacji od cysteiny w p40 co najmniej jednym lub dwoma aminokwasami.
RAQDRYYSSSWSEWASVPCS - NGTSSSTKKTQLQLEHLLLD (sekwencja numer: 41).
W przypadku fuzji IL12p40-IL2, wprowadzenie miejsca glikozylacji, jak opisano powyżej, tworzy następujące potencjalne epitopy limfocytów T.
SEWASVPCSNGTS (sekwencja numer: 42) ASVPCSNGTSSST (sekwencja numer: 43)
Jednakże glikozylacja epitopów limfocytów T uniemożliwia wiązanie do MHC klasy II i w ten sposób redukuje immunogenność.
P r z y k ł a d 9: Dedukcja immunogennie reaktywnego epitopu w złączeniu białka fuzyjnego
X -Fc - Y oraz modyfikacje reszt aminokwasowych w miejscu złączenia w celu obniżenia wiązania do
IVll-IC klasy II
Białka fuzyjne w postaci X - Fc - Y, jak na przykład IL4-Fc-GMCSF maj wielokrotne nowe miejsca złączenia, które zawierają potencjalne epitopy limfocytów T. 1L4 - FC jest złączeniem analogicznym do innych białek fuzyjnych typu X-Fc (przykłady 6 i 7), jednakże nowym poprzez wykorzystanie cytokiny IL4. Dla przykładu, wykorzystuje się formę Fc z regionem zawiasowym, CH2 i domenę CH3 z ludzkiego gamma-1. Jak zaznaczono powyżej, sekwencja regionu zawiasowego gamma-1 w pdCshuFcK-1 może zawierać zmutowane CYS na SER (podkreślone), które eliminują reszty cysteiny tworzące mostki dwusiarczkowe z lekkim łańcuchem w IgGI (Lo. et al., (1998) Engineering Protein 11:495-500), tworząc tym samym trzecie potencjalnie immunogenne złączenie wymagające analizy. Złączenie jest analizowane pod kątem potencjalnych epitopów limfocytów T i modyfikowane zgodnie z metodami zawartymi w przykładach 1-4.
W szczególności, analiza złączeń:
(1) ENFLERLKTIMREKYSKCSS - epkscdkttntcppcpapellg (sekwencja numer: 44) pomiędzy C-końcem IL4 (tekst pogrubiony) a N-końcem Fc (zwykły tekst) oraz:
(2) MHEALHNHYTQKSLSLSPGK - parspspstqpwehvnaiqe (sekwencja numer: 45) pomiędzy C-końcem Fc (tekst pogrubiony) a N-końcem GMCSF (zwykły tekst), dokonana poprzez metodę przewlekania, zidentyfikowała peptydy potencjalne wiążące się do MHC. Potencjalne epitopy limfocytów T są modyfikowane w celu zmniejszenia immunogenności.
Potencjalny epitop na złączeniu IL4 - Fc białka fuzyjnego ma sekwencję:
EKYSKCSSEPKSC (sekwencja numer: 46), gdzie zmiana E (pogrubiono) na T redukuje znacząco ocenę przewlekania lub potencjał wiązania MHC klasy II. Sekwencja zmodyfikowanej fuzji IL4 - FC przedstawia się następująco:
ENFLERLKTIMREKYSKCSS - tpkscdkthtcppcpapellg (sekwencja numer: 47).
Połączenie fuzyjne Fc - GMCSF jest deimmunizowane poprzez zamianę sekwencji LSLS na AT
AT, jak pokazano poniżej:
PL 209 110 B1
MHEALHNHYTOKSATATPGK - parspspstqpwehvnaiqe (sekwencja numer: 48).
P r z y k ł a d 10: Modyfikacja reszt aminokwasowych w miejscu złączenia immunocytokinaz oraz immunofuzyn z hybrydowym izotypem w celu redukcji epitopów limfocytów T
[0106] Często przydatnym jest skonstruowanie przeciwciała lub opartego na przeciwciele białka fuzyjnego z hybrydowym izotypem, tak, że pożyteczne cechy różnych izotypów mogą być zawarte w jednej molekule. Białko fuzyjne z hybrydowym izotypem może być modyfikowane zgodnie z wynalazkiem w celu zmniejszenia immunogenności.
Przeciwciałowe białko fuzyjne z następującymi komponentami, konstruowane jest poprzez standardowe techniki rekombinacji DNA: lekki łańcuch i ciężki łańcuch, region V rozpoznający nowotworowo-specyficzny antygen, łańcuch lekki będący typowym łańcuchem lekkim oraz ciężki łańcuch składający się z domen CH1, CH2 i CH3 z białka lgG2 oraz region zawiasowy z IgG1, z cytokiną złączoną z C-końcem ciężkiego łańcucha, wymagającą złączenia jak opisano powyżej.
Białko to zawiera nowe złączenia pomiędzy CH1g2 a zawiasem-g1 oraz pomiędzy zawisem-g1 a CH2g2. Identyfikacja i modyfikacja potencjalnych epitopów limfocytów T w tych złączeniach została przeprowadzona jak następuje. Dla białek fuzyjnych immunocytokiny i Fc-X sporządzonych z izotypu lgG2 bądź z izotypu lgG2h, modyfikacje są identyczne z już ustalonymi w powyższych przykładach 1,2,318. Dla immunofuzyn X - Fc lgGh2, nowe złącza również są identyczne, ponieważ N -koniec Fc położony jest w rejonie zawiasowym białka lgGh2, które zostało zmodyfikowane do typu IgG1 Jednakże, są dwa nowe miejsca złączenia, w miejscu gdzie zawias IgG1 wstawiony do immunoglobuliny lgG2 tworzy dwa nowe złączenia pomiędzy domeną CH1 lgG2 a IgG1 oraz pomiędzy zawiasem IgGI a domeną CH2 lgG2.
lgG2 CHI - IgGI zawias -lgG2 CH2 - lgG2 CH3 - białko docelowe.
Tak więc, analiza połączenia qtytcnvdhkpsntkvdktv - epksfdkthtcppcp (sekwencja numer: 49) pomiędzy C - końcem lgG2 CH1 (tekst pogrubiony) a N - końcem zawiasu IgG1 (czysty tekst), oraz:
epksędkthtcppcp - appvagpsvflfppkpkdtl (sekwencja numer: 50) pomiędzy C-końcem zawiasu IgGI (tekst pogrubiony) a N - końcem lgG2 CH2 F metodą przewlekania peptydów powinna zidentyfikować peptydy potencjalnie wiążące się do MHC. Potencjalnie immunogenne sekwencje zostały zmodyfikowane tak, aby zredukować lub wyeliminować potencjalne epitopy limfocytów T i B.
Dwa potencjalne epitopy limfocytów T w regionie złączenia lgG2 CH1 - zawias IgG1 to:
TKVDKTVEPKSCD (sekwencja numer: 51) i KTVEPKSCDKTHT (sekwencja numer: 52).
Złączenie fuzyjne lgG2CH1 - IgG1 jest deimmunizowane poprzez zamianę V (pogrubiono) na A, T, lub P. Sekwencję zmienionego złączenia przedstawiono - poniżej (sekwencja numer 53).
qtytcnvdhkpsntkadkta - epkscdkthtcppcp (sekwencja numer: 53).
Jak zaznaczono powyżej, sekwencja zawiasu gamma-1 w pdCs-huFcKi może zawierać zmutowane CYS na SER (podkreślone), które eliminują reszty cysteiny tworzące mostki dwusiarczkowe z lekkim łańcuchem w IgGI (Lo., (1998) Engineering Protein 11 :495-500), tworząc tym samym dwa potencjalnie immunogenne złączenia wymagające analizy i modyfikacji.
(3) qtytcnvdhkpsntkvdktv - epksSdkttntcppcp (sekwencja numer: 54) (4) epksSdkthtcppcp - appvagpsvflfppkpkdtl (sekwencja numer: 55).
P r z y k ł a d 11: Generowanie białka fuzyjnego Fc-Epo przy wykorzystaniu komponentów hybrydowego izotypu Fc lgG1 i lgG4
W celu utworzenia białka fuzyjnego Fc - erytropoetyna, skonstruowano przy wykorzystaniu standartowych) technik biologii molekularnej następujący plazmid. Wykorzystano fragment DNA XmalXhol zawierający sekwencję kodującą ludzką formę erytropoetyny wraz z mutacjami, których skutkiem jest podstawienie aminokwasów His32Gly, Trp88Cys, Cys33Pro oraz Pro90Ala, ujawniony w patencie WO01/36489. Odpowiednia sekwencja białka jest pokazana w sekwencji numer: 56. APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVG
QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRAL
GAQKEAISPPDAAS AAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR
Fragment DNA Xmal - Xhol został wstawiony do wektora plazmidowego kodującego region zawiasowy z lgG1 oraz domeny Chl2 i CH3 z lgG2, przy czym dokonano dwóch grup mutacji na wskutek których zmieniono pewne aminokwasy w C-końcu CH3 tak, że sekwencja złączenia C - końca CH3 i N - końca Epo przedstawia się następująco:
PL 209 110 B1
......TQKSATATPGA - APPRLI......(sekwencja numer: 57)
Pierwszy zestaw mutacji, które zmieniają sekwencję KSLSLSPG (sekwencja numer: 58) regionu CH3 lgG2 na KSATATPG (sekwencja numer: 59), jest ujawniony w zgłoszeniu patentowym U.S. No. 60/280,625. Skutkiem substytucji Leu - Ser -Leu - Ser (pozycje 3 do 6 sekwencji 58) na Ala - Thr Ala - Thr (pozycje 3 do 6 sekwencji 59) jest usuniecie ludzkiego nie-własnego epitopu limfocytów T, który mógł powstać ponieważ złączenie pomiędzy ludzką Fc, a ludzką erytropoetyna zawiera nie własne sekwencje aminokwasowe. Na drugi zestaw mutacji składa się pojedyncza zamiana aminokwasu K na A w C-końcowym aminokwasie regionu CH3. Zestaw ten jest ujawniony w zgłoszeniu patentowym U.S. No. 09/780,668.
Otrzymany plazmid został wprowadzony do komórek NS/0 i białko Fc-Epo uległo ekspresji. Zostało następnie oczyszczone zgodnie z powszechnie znanymi procedurami. Po oczyszczeniu opartym na wiązaniu się do białka A, białko huFcy2h-huEpo zawierające podstawienia w regionie CH3 lgG2 oraz w erytropoetynie, opisane powyżej, scharakteryzowano dzięki chromatografii wykluczenia wg. rozmiarów. Okazało się, iż zawierało ono w niezależnych próbkach 97% i 90% monomerów. Okazało się, iż białko huFc/2h-huEpo zawierające podstawienia w regionie CH3 lgG2 oraz w erytropoetynie, opisane powyżej, było tak aktywne, w oparciu o kryterium stężenia, jak ludzka erytropoetyna, w oznaczeniach komórkowych, mierzących zdolność erytropoetyny do stymulowania podziału komórkowegoTF-1. Pomiar został przeprowadzony jak opisano w opisie patentowym WO01/36489.
Dodatkowo, scharakteryzowano fuzje niezmutowanej ludzkiej erytropoetyny do C-końca regionu Fc składającego się z IgG1 (zawias - CH2 - CH3) bądź lgG2(zawias - CH2 - CH3) bądź IgG1 (zawias) - lgG2(CH2 - CH3). Plazmidy składające się z sekwencji niezmutowanej ludzkiej Fc oraz sekwencji niezmutowanej ludzkiej erytropoetyny przygotowano analogicznie do plazmidów opisanych powyżej. Do komórek Ns/0 zostały wprowadzone plazmidy Fcy1-Epo, Fcy2-Epo oraz Fcyh-Epo. Stabilne klony zostały wyizolowane po przejrzeniu w przybliżeniu podobnej liczby klonów dla każdego plazmidu. Najwydajniejsze klony produkowały 50 μg/ml Fcy1 -Epo, 20 μg/ml Fcy2 - Epo, oraz 120 μg/ml FcYh - Epo.
Poniższy przykład opisuje szczegółowo korzystną metodę identyfikowania immunogennych regionów sekwencji (epitopów limfocytów T) wewnątrz sekwencji białek fuzyjnych, jak ujawni no w tym wynalazku. Jednakże należy zaznaczyć, że tak określone molekuły można otrzymać innymi znanymi metodami.
P r z y k ł a d 12. Identyfikacja epitopów limfocytów T metodami obliczeniowymi
Według wynalazku, epitop w regionie łączącym białka fuzyjnego może być zmodyfikowany przy wykorzystaniu metod wprowadzania mutacji, które zmieniają oddziaływanie białek z układem odpornościowym. Zgodnie z wynalazkiem, metody znane w literaturze mogą być zastosowane zgodnie z wynalazkiem, w szczególności metody opisane w stanie techniki (WO 92/10755 and WO 96/40792 (Novo Nordisk), EP 0519 596 (Merck & Co.), EP 0699 755(Centro de Immunologia Moelcular), WO 98/52976 and WO 98/59244 (Biovation Ltd.) i inne podobne metody.
Korzystne mutacje białek, jednakże, mogą być uzyskane, jeżeli identyfikacja opisanych epitopów jest zrealizowana poprzez nowy sposób opisany tu w szczegółach i zastosowany do regionu łączącego białka fuzyjnego, zgodnie z wynalazkiem.
Istnieje bardzo wiele czynników odgrywających istotną rolę w wyznaczaniu całkowitej struktury białek, polipeptydów, bądź immunoglobulin. Po pierwsze, wiązanie peptydowe, czyli wiązanie łączące dwa aminokwasy w jeden łańcuch, jest wiązaniem kowalencyjnym. Wiązanie to ma strukturę płaską, tworząc podstawiony amid. Amid to jakikolwiek związek organiczny, zawierający ugrupowanie - CONH-.
Płaskie wiązanie peptydowe łączące atomy Ca sąsiednich aminokwasów może być przedstawione jak zobrazowano poniżej:
□
PL 209 110 B1
Ponieważ atomy O=C i C-N leżą na relatywnie sztywnej płaszczyźnie, nie występuje swobodna rotacja wokół tych osi. Stąd, płaszczyzna zilustrowana schematycznie za pomocą linii przerywanej określana jest czasem jako płaszczyzna „amidowa lub „peptydowa, na której leżą atomy tlenu (O), węgla (C), azotu (N) i wodoru (H) głównego łańcucha peptydowego. W przeciwległych rogach płaszczyzny amidowej znajdują się atomy Ca. Ponieważ nie występuje zasadniczo żadna rotacja wokół atomów O=C i C-N w peptydzie albo płaszczyźnie peptydowej, łańcuch polipeptydowy składa się zasadniczo z serii płaskich połączeń łączących atomy Ca. Drugi czynnik, który odgrywa ważną rolę w określaniu całkowitej struktury lub konformacji polipeptydu czy białka, to kąt rotacji dla każdej płaszczyzny amidowej wokół wspólnego połączenia atomów Ca. Termin „kąt rotacji lub „kąt skrętu są tutaj traktowane jako terminy równoznaczne. Przyjmując, że atomy O,C, N i H pozostają na płaszczyźnie amidowej (założenie to jest przeważnie słuszne, chociaż mogą istnieć drobne odchylenia od występowania tych atomów na jednej płaszczyźnie dla niektórych konformacji), takie kąty skrętu określają konformacje N i R głównego łańcucha polipetydowego, to znaczy strukturę, jaka istnieje pomiędzy sąsiednimi resztami. Te dwa kąty są znane jako φ i ψ. Zbiór kątów φ i, ψ i, gdzie indeks dolny i przedstawia daną resztę łańcucha polipeptydowego, określa, zatem efektywnie drugorzędową strukturę polipeptydu. Konwencje, które mają zastosowanie w określaniu kątów φ, ψ, przykładowo punktów odniesienia, w których płaszczyzny amidowe tworzą kąt zero stopniowy i określenie, który z kątów dla danego polipeptydu to kąt φ, a który kąt ψ, przedstawiono w literaturze. Patrz na przykład Ramachandran et al, Adv.Prot.Chem. 23:283-437 (1968), na stronach 285-94, które to strony załączono tutaj jako odnośnik.
Sposób według wynalazku może mieć zastosowanie do dowolnego białka i bazuje częściowo na odkryciu, że u ludzi pozycja kotwicząca pierwszorzędowej Kieszonki 1 bruzdy wiążącej cząsteczki MHC klasy II ma dobrze określoną specyficzność dla poszczególnych bocznych łańcuchów aminokwasów. Specyficzność tej kieszonki jest określana poprzez tożsamość aminokwasu w pozycji 86 łańcucha beta cząsteczki MHC klasy II. Miejsce to znajduje się na spodzie Kieszonki 1 i określa rozmiar łańcucha bocznego, który może być ulokowany w tej kieszonce. Marshall, K.W., J.Immunol., 152:4946-4956 (1994). Jeśli tą resztą jest glicyna, wówczas wszystkie hydrofobowe alifatyczne i aromatyczne aminokwasy (związkami hydrofobowymi alifatycznymi są: walina, leucyna, izoleucyna, metionina a aromatycznymi są: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan) mogą być ulokowane w kieszonce. Korzystne są aromatyczne łańcuchy boczne. Jeśli resztą kieszonki jest walina, wówczas boczny łańcuch aminokwasu wystaje do wnętrza kieszonki i ogranicza rozmiar łańcuchów bocznych, które mogą być tam ulokowane, tak że tylko hydrofobowe alifatyczne łańcuchy boczne mogą zostać ulokowane. Zatem, w sekwencji reszt aminokwasów, gdziekolwiek znajduje się aminokwas z hydrofobowym alifatycznym lub aromatycznym łańcuchem bocznym, istnieje możliwość, że epitop restrykcyjny limfocytu T cząsteczki MHC klasy II będzie prezentowany. Jeśli boczny łańcuch jest hydrofobowy i alifatyczny wówczas, istnieje dwukrotnie większe powinowactwo do epitopu limfocytu T niż w przypadku aromatycznego łańcucha bocznego (nawet uwzględniając w przybliżeniu występowanie typów Kieszonki 1 w populacji globalnej).
Metoda obliczeniowa będąca realizacją wynalazku określa prawdopodobieństwo, że regiony białka będą zawierały epitopy limfocytu T w następujący sposób:
(1) Pierwszorzędowa sekwencja segmentu peptydowego o założonej długości jest skanowana i identyfikowane są wszystkie obecne hydrofobowe alifatyczne i aromatyczne łańcuchy boczne.
(2) Hydrofobowym alifatycznym bocznym łańcuchom przypisuje się wyższą wartość niż aromatycznym łańcuchom bocznym, korzystnie wartość dwukrotnie wyższą, na przykład wartość 2 dla hydrofobowych alifatycznych łańcuchów bocznych i wartość 1 dla aromatycznych łańcuchów bocznych.
(3) Określone wartości są sumowane dla każdego nakładającego się segmentu (okna) reszt aminokwasów o założonej jednakowej długości w obrębie peptydu, i całkowita wartość dla danego segmentu (okna) przypisana jest do pojedynczej reszty aminokwasu w środkowej pozycji segmentu (okna), korzystnie reszcie w okolicach punktu środkowego analizowanego segmentu (okna). Procedura ta jest powtarzana dla każdego wziętego do analizy nakładającego się segmentu (okna) reszt aminokwasów. Stąd każdej reszcie aminokwasu jest przypisana wartość, która odnosi się do prawdopodobieństwa występowania epitopu limfocytu T w danym segmencie (oknie). (4) Wartości wyliczone i przypisane jak opisano w etapie 3 powyżej, mogą zostać zobrazowane na wykresie współrzędnych aminokwasu dla całej sekwencji reszt aminokwasów, która była szacowana. (5) Wszystkie fragmenty sekwencji, które mają punktacje o założonej wartości, przykładowo wartości 1, są uważane za zawierające epitopy limfocytu T i jeśli właściwe, mogą być zmodyfikowane.
PL 209 110 B1
Ten szczególny aspekt obecnego wynalazku dotyczy ogólnego sposobu, za pomocą którego mogą zostać opisane regiony peptydu prawdopodobnie zawierające epitopy limfocytu T. Modyfikacje peptydu w tych regionach dają możliwość modyfikacji charakterystyki wiązania MHC klasy II.
Według innego aspektu obecnego wynalazku, epitopy limfocytu T mogą być określone z większą precyzją z zastosowaniem złożonych metod obliczeniowych, które prowadzą do oceny interakcji peptydów z modelami alleli MHC klasy II. Komputerowe przewidywanie epitopów występujących w peptydzie według tego szczególnego aspektu, uwzglę dnia konstrukcję modeli dla przynajmniej 42 alleli MHC klasy II opartej na strukturach znanych cząsteczek MHC klasy II oraz sposób zastosowania tych modeli w komputerowej identyfikacji epitopów limfocytów T, konstrukcję bibliotek głównych łańcuchów peptydowych dla każdego modelu w celu uwzględnienia znanej różnorodności w odpowiednich pozycjach atomu węgla alfa Ca głównego łańcucha peptydowego, konstrukcję bibliotek konformacji bocznych łańcuchów aminokwasu dla każdego głównego przyłączenia z poszczególnym modelem dla każdego z możliwych 20 aminokwasów w pozycjach znaczących dla interakcji między peptydem a czą steczką MHC klasy II, i zastosowanie tych bibliotek konformacji głównych i bocznych łańcuchów w połączeniu z funkcją punktacyjną (ang. scoring function) dla wyboru optymalnej konformacji ł a ń cucha głównego i bocznego dla poszczególnego peptydu przyłączonego do danej cząsteczki MHC klasy II i wyprowadzenie skali wiązania dla tego oddziaływania.
Modele cząsteczek MHC klasy II mogą być wyprowadzone poprzez modelowanie homologii z wielu podobnych struktur znajdują cych się w Banku Danych dla Biał ek w Brookhaven (Brookhaven Protein Data Bank - PDB). Może to zostać osiągnięte poprzez zastosowanie półautomatycznego oprogramowania modelującego homologię (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J.Mol Biol.
234:779-815), które zawiera funkcje symulowanego wyżarzania, w połączeniu z CHARMm pola siłowego dla minimalizacji energii (dostępny poprzez Molecular Simulation Inc., San Diego, Ca.). Alternatywne metody modelowania mogą być także zastosowane.
Obecna metoda różni się znacząco od innych metod obliczeniowych, które wykorzystują biblioteki danych dotyczących wiązań otrzymanych eksperymentalnie dla każdego aminokwasu, alternatywnie dla każdej pozycji w bruździe wiążącej dla małego zbioru cząsteczek MHC klasy II (Marshall, K.W. et al, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3):157-162) (1995), lub jeszcze innych metod obliczeniowych, które wykorzystują podobne dane eksperymentalne dotyczące wiązania, w celu określenia właściwości wiązania poszczególnych typów wiążących kieszonek w obszarze bruzdy, ponownie z wykorzystaniem względnie małego podzbioru cząsteczek MHC klasy II, a następnie „przestawiając i dopasowując typy kieszonki z tej biblioteki kieszonek do sztucznie stworzonych kolejnych „wirtualnych cząsteczek MHC klasy II (Sturniolo T. et al, Nat.Biotech, 17(6): 555-561 (1999). Obie wcześniejsze metody wykazują główną wadę, jaką jest to, iż z powodu złożoności metod i potrzeby generowania ogromnej liczby wariantów peptydów, tylko niewielka liczba cząsteczek MHC klasy II może być eksperymentalnie przeskanowana. Dlatego też pierwsza z powyższych metod może jedynie przeprowadzać prognozy dla małej liczby cząsteczek MHO klasy II. Druga z powyższych metod, także zakłada, że utworzona z podobnych aminokwasów kieszonka w jednej cząsteczce będzie miała podobne właściwości wiązania jak w odniesieniu do różnych alleli klasy II i metoda ta wykazuje dalsze wady, ze względu na to, że tylko te cząsteczki MHC klasy II mogą być „wirtualnie stworzone, które zawierają kieszonki zawarte w bibliotece kieszonek. Stosując podejście modelowe opisane tutaj, struktura każdej liczby i typu cząsteczek MHC klasy II może być wywnioskowana, zatem allele mogą być specyficznie wybrane, aby odpowiadać całej populacji. Dodatkowo, liczba cząsteczek MHC klasy II przeglądanych może być zwiększona bardziej poprzez przeprowadzenie kolejnych modeli, niż poprzez konieczność generowania dodatkowych danych poprzez złożone doświadczenia.
Zastosowanie biblioteki łańcuchów głównych uwzględnia zróżnicowanie w położeniach atomów Ca różnych peptydów skanowanych w czasie, kiedy są połączone z konkretnymi cząsteczkami MHC klasy II. Także i to jest przeciwne do alternatywnych znanych metod obliczeniowych opisanych powyżej, które polegają na wykorzystaniu uproszczonych łańcuchów głównych peptydu, dla poszukiwania wiązania aminokwasów w poszczególnych kieszonkach. Nie ma możliwości, aby te uproszczone łańcuchy były reprezentatywne dla konformacji łańcucha głównego występującego w „prawdziwych peptydach, co prowadzi do braku precyzji w przewidywaniu wiązania peptydów. Obecna biblioteka łańcuchów głównych jest tworzona poprzez nakładanie łańcuchów głównych wszystkich białek związanych z cząsteczkami MHC klasy II znajdującymi się w Banku Danych o Białkach (PDB) i rejestrowanie średniego odchylenia kwadratowego (ang. root mean square - RMS) pomiędzy atomami Ca każdego z jedenastu aminokwasów umieszczonych w bruździe wiążącej. Biblioteka ta może być wyprowadzoPL 209 110 B1 na z małej liczby odpowiednich i dostępnych mysich i ludzkich struktur (obecnie 13), dla uwzględnienia możliwości nawet większej różnorodności, wartość RMS dla każdej pozycji C-a jest zwiększana o 50%. Średnia pozycja Ca każdego aminokwasu jest wówczas określana i wykreślona zostaje sfera wokół tego punktu, której promień równa się odchyleniu RMS dla tej pozycji plus 50%. Sfera ta reprezentuje wszystkie dopuszczalne pozycje Ca.
Wychodząc z Ca o najmniejszym odchyleniu RMS (z aminokwasu w Kieszonce 1 jak zaznaczono powyżej, równoważnej Pozycji 2 11 reszt w bruździe wiążącej) sfera zostaje trójwymiarowo usieciowana, a każdy węzeł sieci jest zastosowany jako możliwa lokalizacja dla Ca tego aminokwasu. Kolejna płaszczyzna amidowa, odpowiadająca wiązaniu peptydowemu sąsiedniego aminokwasu jest przyczepiana do każdego z tych atomów Ca a kąty φ oraz ψ są obracane stopniowo o ustalone interwały w celu ustawienia sąsiedniego atomu Ca. Jeżeli sąsiedni atom Ca wchodzi w zakres „sfery dozwolonych pozycji dla takiego Ca położenie dipeptydu jest akceptowane, podczas gdy wypada on poza sferą wtedy dipeptyd jest odrzucany.
Proces ten jest powtarzany dla każdej sąsiedniej pozycji Ca, tak że peptyd rośnie od „ziarna Ca Kieszonki 1, aż wszystkie 9 kolejnych atomów Ca zostanie ustawionych dla wszystkich możliwych permutacji poprzedniego Ca. Proces jest powtarzany ponownie dla pojedynczego Ca poprzedzającego Kieszonkę 1, aby utworzyć bibliotekę pozycji Ca łańcucha głównego zlokalizowanych w obrębie bruzdy wiążącej.
Wygenerowana liczba łańcuchów głównych zależy od kilku czynników: rozmiarów „sfer dozwolonych pozycji, stopnia złożoności usieciowania „sfery pierwszorzędowej w pozycji Kieszonki 1; stopnia złożoności stopniowej rotacji kątów φ oraz ψ zastosowanej do ułożenia sąsiednich atomów Ca. Stosując ten proces można utworzyć ogromną bibliotekę łańcuchów głównych. Im większa jest biblioteka łańcuchów głównych, tym bardziej prawdopodobne, że dla danego peptydu optymalne dopasowanie zostanie znalezione w obszarze bruzdy wiążącej cząsteczki MHC klasy II. O ile wszystkie łańcuchy nie będą odpowiednie pod względem przyłączania dla wszystkich modeli cząsteczek MHC klasy II z powodu kolizji z aminokwasami domeny wiążącej, dla każdego allelu jest tworzona podjednostka biblioteki zawierająca łańcuchy główne, które mogą być ulokowane przez ten allel. Zastosowanie biblioteki łańcuchów głównych, w połączeniu z modelami cząsteczek MHC klasy II stwarza wyczerpującą bazę danych składającą się z dopuszczalnych konformacji łańcucha bocznego dla każdej pozycji bruzdy wiążącej dla każdej cząsteczki MHC klasy II połączonej z każdym z możliwych łańcuchów głównych. Ten zbiór danych jest generowany przy zastosowaniu prostej sferycznej funkcji zachodzenia, w której cząsteczka MHC klasy II połączona jest z głównym łańcuchem a boczny łańcuch aminokwasowy doczepiony jest do łańcucha głównego w pożądanej pozycji. Każde zdolne do obrotu wiązania łańcucha bocznego, obracane są stopniowo o ustalone interwały a ostateczne pozycje atomów należące od tego wiązania zostają odnotowane. Oddziaływanie atomu z atomami łańcucha bocznego bruzdy wiążącej jest odnotowane i pozycje są albo akceptowane albo odrzucane według następujących kryteriów: Całkowita suma zachodzenia wszystkich atomów dotąd ustawianych nie może przekraczać z góry założonej wartości. Zatem przejrzystość poszukiwania konformacji jest funkcją interwału zastosowanego w stopniowej rotacji wiązania i założonej z góry granicy dla całkowitego zachodzenia. Ta druga wartość może być mała, jeśli jest wiadome, że dana kieszonka jest sztywna, jednak przejrzystość może być osłabiona jeśli wiadomo, że pozycje łańcuchów bocznych kieszonki są względnie elastyczne. Zatem mogą być opracowane poprawki, aby odwzorować różnice w elastyczności w obrębie kieszonek bruzdy wiążącej. Takie poszukiwanie konformacji jest potem powtarzane dla każdego aminokwasu w każdej pozycji każdego łańcucha głównego, który jest połączony z każdą z cząsteczek MhHC klasy II w celu stworzenia wyczerpującej bazy danych konformacji łańcucha bocznego.
Zastosowano odpowiednie matematyczne wyrażenie, aby wyznaczyć energię modeli cząsteczek MhHC klasy II w połączeniu z konformacjami ligandu peptydu, który ma być empirycznie wyprowadzony poprzez przeglądanie ogromnej bazy danych konformacji głównych/bocznych łańcuchów opisanej powyżej. Zatem białko jest przeszukiwane w kierunku potencjalnych epitopów limfocytów T z uwzględnieniem każdego możliwego peptydu o długości różniącej się od 9 do 20 aminokwasów (chociaż długość jest stała dla każdego przeszukiwania) z zastosowaniem następujących obliczeń: Cząsteczka MHC klasy II jest wybierana łącznie z łańcuchem głównym peptydu uwzględnionym dla tej cząsteczki a boczne łańcuchy odnoszące się do pożądanej sekwencji peptydu są przyłączane. Identyfikacja atomu i odległość międzyatomowa związana z konkretnym bocznym łańcuchem w konkretnej pozycji w łańcuchu głównym, są zbierane dla każdej dozwolonej konformacji tego aminokwasu
PL 209 110 B1 (otrzymanej z bazy danych opisanej powyżej). Procedura ta jest powtarzana dla każdego bocznego łańcucha wzdłuż łańcucha głównego i z zastosowaniem funkcji punktacyjnej otrzymuje się punkty odnoszone do peptydu. Najlepsza punktacja dla tego łańcucha jest zachowywana a proces powtarzany dla każdego łańcucha głównego z wybranego modelu. Wyniki wszystkich dozwolonych łańcuchów głównych są porównywane, a najwyższy wynik jest uważany za wynik peptydu dla pożądanego peptydu w tym modelu MHC klasy II. Proces ten jest powtarzany dla każdego modelu z każdym możliwym peptydem pochodzącym z białka poddanego przeglądaniu i przedstawia się punktacje dla peptydów w funkcji modelów.
Według wynalazku, każdy ligand poddany obliczeniom powinowactwa wiązania jest segmentem aminokwasowym wybranym z peptydu lub białek jak omówiono powyżej. Zatem ligand jest wybranym odcinkiem aminokwasów długości około 9 do 20 aminokwasów pochodzącym z peptydu, polipeptydu lub białek o znanej sekwencji. Terminy „aminokwas i „reszta są tutaj traktowane jako terminy równoważne. Ligand w postaci kolejnych aminokwasów peptydu, który ma być zbadany, po przyczepieniu do łańcucha głównego wybranego z biblioteki łańcuchów głównych, jest umiejscawiany w bruździe wiążącej cząsteczki MHC klasy II z biblioteki modeli cząsteczek MHC klasy II poprzez współrzędne atomów C-a łańcucha głównego peptydu a dopuszczalna konformacja każdego łańcucha bocznego jest wybierana z bazy dopuszczalnych konformacji. Odpowiednie tożsamości atomu i odległości między atomowe są także wyszukiwane z tej bazy i stosowane do obliczenia wartości wiązania dla peptydu. Ligandy o wysokim powinowactwie wiązania do wiążącej kieszonki MHC klasy II są oznaczane jako pretendenci do ukierunkowanej mutagenezy. Substytucja aminokwasu jest przeprowadzana w oznaczonym ligandzie (i stąd także w białku leżącym w zakresie zainteresowania), który jest potem ponownie testowany przy zastosowaniu funkcji punktacyjnej dla określenia zmian, które obniżają powinowactwo wiązania poniżej założonej z góry wartości progowej. Zmiany te mogą, zatem być wbudowane w białko będące przedmiotem zainteresowania w celu usunięcia epitopów limfocytów T. Wiązanie między ligandem peptydu a bruzdą wiążącą cząsteczek MHC klasy II obejmuje niekowalencyjne oddziaływania włączając, ale nie ograniczając do: wiązań wodorowych, oddziaływań elektrostatycznych, hydrofobowych (lipofilowych) oddziaływań i oddziaływań Van der Waalsa. Są one zawarte w funkcji punktacyjnej jak opisano szczegółowo powyżej. Należy rozumieć, że wiązanie wodorowe jest wiązaniem niekowalencyjnym, które może zostać utworzone pomiędzy polarnymi lub naładowanymi grupami i składa się z atomu wodoru dzielonego przez dwa inne atomy. Wodór dawcy wodoru ma ładunek dodatni podczas, gdy akceptor wodoru ma częściowy ładunek ujemny. W kontekście oddziaływań peptyd/białko, donorami w wiązaniu wodorowym mogą być albo atomy azotu z przyłączonym atomem wodoru lub atomy wodoru przyłączone do atomu tlenu lub azotu. Atomami akceptorowymi w wiązaniu wodorowym mogą być atomy tlenu nieprzyłączone do atomu wodoru, atomy azotu bez przyłączonych atomów wodoru i z jednym lub dwoma połączeniami, lub atomy siarki tylko z jednym połączeniem. Pewne atomy główne, takie jak atomy tlenu przyłączone do atomu wodoru lub atomy azotu imin (przykład C=NH) mogą być zarówno akceptorami jak i donorami wodoru. Energia wiązania wodorowego waha się od 3 do 7 Kcal/mol i jest o wiele silniejsza niż w wiązaniach Van der Waalsa, ale słabsza niż w wiązaniach! kowalencyjnych. Wiązania wodorowe są wysoce zorientowane przestrzennie i są najsilniejsze wówczas, kiedy atom donorowy, atom wodoru i akceptor leżą na jednej linii.
Elektrostatyczne wiązania powstają między przeciwnie naładowanymi parami jonowymi i siła oddziaływania jest odwrotnie proporcjonalna do kwadratu odległości zgodnie z prawem Coulomba. Optymalna odległość między parami jonowymi wynosi około 2,8. W oddziaływaniach białko/peptyd, elektrostatyczne wiązania mogą powstawać pomiędzy argininą, histydyną lub lizyną a asparginianem lub glutaminianem. Siła wiązania zależy od wartości pKa zjonizowanej grupy i stałej dielektrycznej środowiska, chociaż jest w przybliżeniu zbliżona w sile do wiązania wodorowego. Lipofilowe oddziaływania są korzystnymi hydrofobowo-hydrofilowymi oddziaływaniami, które występują między białkiem a ligandem peptydowym. Przeważnie, występuje pomiędzy hydrofobowym łańcuchem bocznym aminokwasu peptydu schowanego we wnętrzu kieszonek bruzdy wiążącej, w taki sposób że nie są one narażone na rozpuszczalnik. Narażenie reszt hydrofobowych na rozpuszczalnik jest wysoce niekorzystne, gdyż otaczające cząsteczki rozpuszczalnika są wciskane w wiązanie wodorowe wspólnie tworząc klatkowe struktury klatratowe. Wynikający stąd spadek entropii jest wysoce niekorzystny. Atomami lipofilowymi mogą być atomy siarki, które nie są ani polarne ani nie są akceptorami wodoru oraz atomy węgla które nie są polarne.
Wiązania Van der Waalsa są niespecyficznymi siłami występującymi między atomami znajdującymi się w odległości 3-4. Są one słabsze i mniej specyficzne niż wiązania wodorowe i wiązania elekPL 209 110 B1 trostatyczne. Rozmieszczenie ładunku elektrycznego wokół atomu zmienia się w czasie, i w każdej chwili nie jest symetryczne. Nietrwała asymetria w ładunku elektrycznym indukuje podobną asymetrię w sąsiednich atomach. Powstałe siły przyciągania pomiędzy atomami osiągają maksimum w odległości kontaktu Van der Waalsa, ale zmniejszają się bardzo gwałtownie od 1 do 2. Odwrotnie, gdy atomy zostają rozdzielone na odległość mniejszą niż odległość kontaktu wzrastające silne siły odpychające stają się dominujące w momencie, kiedy zewnętrzne chmury elektronowe nakładają się. Chociaż siły przyciągania są relatywnie słabe w porównaniu do elektrostatycznych i wodorowych wiązań (około 0,6 Kcal/mol), jednak odpychające siły zasadniczo mogą odgrywać bardzo ważną rolę w określeniu czy ligand peptydowy może pomyślnie wiązać się z białkiem.
W jednej realizacji, funkcja punktacyjna Bohma (podejście SCORE1) jest stosowana do określenia stałej wiązania (Bohim, H.J., J.Comput Aided Mol. Des., 8(3):243-256 (1994), co niniejszym dołącza się tu całkowicie). W innej realizacji, funkcja punktacyjna (podejście SCORE2) jest używana aby wyznaczyć powinowactwo wiązania jako wskaźnik ligandu zawierającego epitop limfocytu T (Bohm, H.J., J.Comput Aided Mol. Des., 12(4):309-323 (1998) co niniejszym dołącza się tu całkowicie). Jednakże funkcja punktowa Bohma, jak opisano w powyższych odnośnikach, jest stosowana do wyznaczenia powinowactwa wiązania ligandu do białka gdzie, choć jest z góry wiadome, że ligand pomyślnie wiąże się z białkiem a kompleks białko/ligand ma swoją strukturę rozwiązaną, która to struktura jest obecna w Banku Danych o Białkach (PDB). Dlatego też funkcja punktowa została opracowana w oparciu o znane dane dotyczące dodatnich wiązań. Aby uwzględnić rozróżnienie pomiędzy dodatnimi a ujemnymi substancjami wiążącymi, parametr odpychania musi być dodany do równania. Dodatkowo, bardziej zadawalające określenie energii wiązania zostaje osiągnięte poprzez obliczenie lipofilowych oddziaływań sposobem parowania, niż stosując wyraz energii powierzchniowej, jak w powyższych funkcjach Bohma. Zatem, w korzystnej realizacji, energia wiązania jest określona przy zastosowaniu zmodyfikowanej funkcji punktacyjnej Bohma. W zmodyfikowanej funkcji punktacyjnej Bohma, energia wiązania pomiędzy białkiem a ligandem (Gbind) jest określona w oparciu o następujące parametry: redukcja energii wiązania z powodu całkowitej utraty entropii translokacyjnej i rotacyjnej ligandu (G0); udział doskonałych wiązań wodorowych (Ghb), gdzie przynajmniej jeden składnik jest obojętny; udział niezaburzonych oddziaływań jonowych (Gionic); lipofilowych oddziaływań pomiędzy atomami lipofilowego ligandu i atomami lipofilowego akceptora (Glipo); utrata energii wiązania z powodu zamrożenia wewnętrznych stopni swobody w ligandzie, przykładowo swoboda rotacji wokół każdego C-C wiązania jest ograniczona (Grot); energia oddziaływania pomiędzy białkiem a ligandem (EVdW). Zależność tych terminów daje równanie 1:
( Gbind) = ( G0) + ( GhbXNhb) + ( GionicxNionic) + ( GlipoxNlipo) + ( GrotxNrot) + (EVdW)
Gdzie N jest liczbą wskaźnikowych oddziaływań dla określonego wyrazu i w jednej realizacji, G0, Ghb, Gionic, Glipo i Grot są stałymi wyrażonymi wartościami wartościami wynoszą odpowiednio: 5.4, 4.7, -4.7, -0.17 i 1.4.
Wyraz Nhb jest wyliczany w oparciu o równanie 2:
Nhb = Σή -bonds f( R, α) x f(Nneighb) x fpcs f( R, α) jest funkcją kary (ang. penalty function), którą oblicza się dla dużych odchyleń wiązań wodorowych od stanu doskonałego i wylicza według równania 3:
f( R, -a) = f1( R) x f2 f( a)
gdzie: f1 ( R) = 1 jeśli R <= TOL
lub = 1-( R-TOL)/0.4 jeśli R <= 0.4 + TOL
lub = 0 jeśli R > 0.4 + TOL
oraz: f2 f( a) = 1 jeśli a < 30°
lub = 1 - ( a-30)/50 jeśli a <= 80°
lub = 0 jeśli a>80°.
TOL jest dopuszczalnym odchyleniem (ang. tolerated deviation) długości wiązania wodorowego wynoszącym 0,25 A.
R jest odchyleniem długości wiązania wodorowego H-O/N od wartości doskonałej wynoszącym 1,9 A.
a jest odchyleniem kąta wiązania wodorowego Z N/O-H...O/N od jego wartości wyidealizowanej 180°.
PL 209 110 B1 f(Nneighb) rozgranicza wklęsłe i wypukłe części powierzchni białka i dlatego kładzie większy nacisk na polarne oddziaływania znajdujące się w kieszonkach, niż na te znajdujące się na powierzchni białka. Funkcja ta jest obliczana według równania 4 przedstawionego poniżej:
f(Nneighb) = (Nneighb / Nneighb.0) gdzie α = O.5
Nneighb jest liczbą atomów białka, które nie są wodorami i znajdują się bliżej niż 5 A od dowolnego atomu białka.
Nneighb.O jest stałą = 25 fpcs jest funkcją, która uwzględnia stosunek powierzchni płaszczyzny polarnego styku do liczby atomów wodoru i dlatego rozróżnia mocne i słabe wiązania wodorowe, a jej wartość jest określona według następujących kryteriów:
fpcs = β gdy Apolar / NHB < 1O A2 lub fpcs= 1 gdy Apolar / NHB >1O A2
Apolar jest rozmiarem powierzchni płaszczyzny polarnego styku białko - ligand,
NHB jest liczbą wiązań wodorowych, β jest stałą o wartości = 1.2
Dla zastosowania zmodyfikowanej funkcji punktowej Bohma, udziały jonowych oddziaływań, Gjonowe, są wyliczane w podobnym stylu do tych dla wiązań wodorowych opisanych powyżej, jeśli przyjmie się taką samą zależność BP geometryczną.
Wyraz N|ipo jest wyliczany w oparciu o poniższe równanie 5:
Nlipo= 2'Lf(rIL) f(rIL) jest wyliczana dla wszystkich atomów lipofilowego ligandu, I, i dla wszystkich atomów białka lipofilowego, L, według następujących kryteriów:
f(r1L) = 1 gdy r1L <= R1 f(r1L)= (r1L - R1) / (R2 - R1) gdy R2 < r1L > R1 f(rIL) = O gdy r1L >= R2 Gdzie: R1 = r1vdw + rLvdw + O.5 iR2 = R1+3.O, r1vdw jest promieniem Van der Waalsa atomu I, a rLvdw jest promieniem Van der Waalsa atomu L.
Wyraz Nrot jest liczbą zdolnych do obrotu wiązań aminokwasu bocznego łańcucha i przyjętą jako liczba acyklicznych wiązań sp3-sp3 oraz sp3-sp2. Obroty terminalnej grupy -CH3 lub NH3 nie są brane pod uwagę.
Końcowy wyraz, Evdw jest wyliczany według równania 6 przedstawionego poniżej:
Evdw = eie2((rivdw = r2 vdw)12 / r12 - (r/dw + r2vdw)6 / r6), gdzie: e1 i e2 są stałymi zależnymi od tożsamości atomu, r1vdw + r2vdw są promieniami atomowymi Van der Waalsa, r jest odległością między parą atomów.
Ze względu na równanie 6, w jednej realizacji wynalazku, stałe e1i e2 nadają atomom wartości: C:O,245, N:O,283, C:O,316, S:O,316, odpowiednio (przykłady odpowiednio dla atomów węgla, azotu, tlenu i siarki). Ze względu na równania 5 i 6, promienie Van der Waalsa nadają atomom wartości: C:1,85, N:1,75, O:1,6O, S:2,OOA.
Należy rozumieć, że wszystkie założone wartości i stałe podane w powyższych równaniach są określone względem obecnego stanu wiedzy o oddziaływaniach ligandów białek ze szczególnym odniesieniem do typu obliczeń, jakie zostały BP przyjęte. Dlatego też możliwe jest, że jeśli funkcja punktacyjna będzie dalej przedefiniowywana, te wartości i stałe mogą się zmienić, dlatego tez dowolne odpowiednie wartości numeryczne, które dają pożądane wyniki w wyrazach wyznaczających energie wiązania białka do ligandu, mogą być zastosowane i tym samym wchodzą w obszar wynalazku.
Jak opisano powyżej, funkcja punktacyjna ma zastosowanie do danych otrzymanych z bazy danych o konformacjach łańcucha bocznego, rodzajów atomów, i odległości międzyatomowych. Dla celów obecnego opisu, liczba cząsteczek MHC klasy II zawartych w tej bazie wynosi 42 modele plus cztery rozwiązane struktury.
Oczywistym jest na podstawie powyższych opisów, że zmienna natura konstrukcji metody obliczeniowej według wynalazku oznacza, że nowe modele mogą być łatwo dodane i przeglądane z zastosowaniem biblioteki łańcuchów głównych peptydów oraz funkcji poszukiwania konformacji bocznego łańcucha, dla utworzenia dodatkowego zbioru danych, który może być przetwarzany przez funkcję punktową dla peptydu jak opisano powyżej. Umożliwia to łatwe powiększanie zestawu przeglądanych
PL 209 110 B1 cząsteczek MHC klasy II lub struktur i zastępowanie powiązanych) danych, jeśli będą dostępne dane do stworzenia bardziej dokładnych modeli istniejących alleli.
Obecna metoda prognozowania może być kalibrowana na zespół danych zawierający dużą liczbę peptydów, których powinowactwo do różnych cząsteczek MHC klasy II zostało wcześniej eksperymentalnie określone. Porównując wyliczone i doświadczalne dane, może zostać określona graniczna wartość, powyżej której wiadomo, że wszystkie eksperymentalnie określone epitopy limfocytów T są prawidłowo przewidziane.
Należy rozumieć, że chociaż powyższa funkcja punktacyjna jest względnie łatwo porównywana do niektórych wyspecjalizowanych znanych metod, obliczenia są wykonywane nader szybko. Należy także rozumieć, że celem nie jest wyliczenie prawdziwej energii wiązania per se dla każdego peptydu przyłączonego do bruzdy wiążącej wybranego białka MHC klasy II. Wyraźnym celem jest otrzymanie porównywalnych danych dotyczących energii wiązania jako pomocy w przewidywaniu lokalizacji epitopów limfocytów T w oparciu o strukturę pierwszorzędową (to znaczy sekwencje aminokwasów) wybranego białka. Względnie wysoka energia wiązania lub energia wiązania powyżej wybranego progu może sugerować obecność epitopu limfocytu T w ligandzie. Ligand może być wtedy poddany przynajmniej jednemu cyklowi substytucji aminokwasu i energia wiązania ponownie wyliczona. Ze względu na szybką naturę tych obliczeń, manipulacje z sekwencją peptydu mogą być przeprowadzone interaktywnie przez interfejs użytkownika programu na niedrogim sprzęcie komputerowym. Większe inwestycje w sprzęt komputerowy nie są tu wymagane. Dla znawcy techniki oczywistym jest, że do tych samych celów można także zastosować inne dostępne oprogramowanie. W szczególności, bardziej wyspecjalizowane oprogramowanie, które zdolne jest przyłączać ligandy do wiążących miejsc białka może być zastosowane łącznie z minimalizacją energii. Przykładami oprogramowania przyłączającego (ang. docking software) są: DOCK (Kuntz et al, J.Mol.Biol., 161:269-288 (1982)), LUDI (Bohm, H.J., J.Comput Aided Mol.Des., 8:623-632 (1994)) oraz FLEXX (Rarey M. et al, ISMB, 3:300-308 (1995)).
Przykłady oprogramowania przeznaczonego do modelowania molekularnego i manipulowania obejmują: AMBER (Tripos) i CHARMm (Molecular Simulations Inc.). Zastosowanie tych metod obliczeniowych może znacząco ograniczyć przepustowość sposobu według wynalazku z powodu długości czasu obróbki wymaganego do przeprowadzenia koniecznych obliczeń. Jednakże, możliwe jest zastosowanie takich metod jako „przeglądu drugorzędowego, dla otrzymania bardziej dokładnych obliczeń energii wiązania peptydów, które są traktowane jako „dodatnie cząsteczki wiążące przez sposób według wynalazku. Ograniczenia związane z czasem obróbki dla złożonych obliczeń molekularno-mechanicznych i molekularno-dynamicznych są określone zarówno przez projekt oprogramowania przeprowadzającego te obliczenia, jak i współczesne ograniczenia technologiczne sprzętu komputerowego. Można oczekiwać, że w przyszłości, poprzez stworzenie bardziej wydajnego kodu i stałego wzrostu szybkości procesorów komputerowych, można będzie osiągnąć przeprowadzenie takich obliczeń w bardziej elastycznych ramach czasowych. Dalsze informacje dotyczące funkcji energii zastosowanych do makromolekuł i rozważania dotyczące różnych oddziaływań, które mają miejsce w złożonych strukturach białkowych można znaleźć w: Brooks, B.R. et al, J.Comput.Chem., 4:187-217 (1983), a dalsze informacje dotyczące ogólnych oddziaływań białko-ligand można znaleźć w: DauberOsguthorpe et al, Proteins 4(1):31-47 (1988), które załączono tu w całości jako odniesienia. Użyteczne podstawowe informacje można również znaleźć w, na przykład Fasman, G.D., Prediction of Protein Structure and Principle of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9.
EKWIWALENTY
Wynalazek może być realizowany w innych specyficznych formach bez odejścia od jego istoty albo zasadniczych właściwości. Poprzedzające realizacje powinny być, zatem traktowane we wszystkich własnościach raczej jako ilustracje niż jako ograniczenia opisanego tutaj wynalazku. Istota wynalazku określona jest bardziej w zastrzeżeniach, niż w poprzedzającym opisie, i zakłada się, że wszystkie zmiany, które wchodzą w znaczenie i zakres równoważności zastrzeżeń zawierają się w nich.
ZAŁĄCZENIE POPRZEZ ODWOŁANIE
Wszystkie patenty, zgłoszenia patentowe i publikacje naukowe wymienione w opisie są w całości załączone poprzez odwołanie.
PL 209 110 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Lexigen Pharmaceuticals Corp.
<120>
<130> LEX-017PCT <150> US 60/280,625 <151> 2001-03-30 <160> 59 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> misc feature
<223 > Łańcuch ciężki ludzkiej Ig-gamma, region C
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 12 5
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Olu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
PL 209 110 B1
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu 195 Asn Gly Lys 200 Glu Tyr Lys Cys Lys Val 205 Ser Asn
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<2io> : 2
<2ii> : 326
<212? : PRT
<213> Homo sapiens
<220?
<221> i miśc feature
<223? Łańcuch ludzkiej Ig-gamma-2 , region C
<400? 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys ASp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
PL 209 110 B1
Pro Val Ala 115 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 120 Pro Pro Lys Pro Lys 125 Asp
Thr Leu Met 130 Ile Ser Arg Thr 135 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 140 Asp
Val 145 Ser His Glu Asp Pro Glu 150 Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 155 Gly 160
Val Glu Val His Asn 165 Ala Lys Thr Lys Pro 170 Arg Glu Glu Gin Phe 175 Asn
Ser Thr Phe Arg 180 Val Val Ser Val Leu Thr 185 Val Val His Gin Asp 190 Trp
Leu Asn Gly 195 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 200 Ser Asn Lys Gly Leu 205 Pro
Ala Pro Ile 210 Glu Lys Thr Ile 215 Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg 220 Glu
Pro 225 Gin Val Tyr Thr Leu Pro 230 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 235 Asn 240
Gin Val Ser Leu Thr 245 Cys Leu val Lys Gly 250 Phe Tyr Pro Ser Asp 255 Ile
Ala Val Glu Trp 260 Glu Ser Asn Gly Gin Pro 265 Glu Asn Asn Tyr Lys 270 Thr
Thr Pro Pro 275 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 280 Phe Phe Leu Tyr Ser 285 Lys
Leu Thr Val 290 Asp Lys Ser Arg 295 Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 300 Cys
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 305 310 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 3 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <22j> Stały region ludzkiej Ig3 <400> 3 Tyr Thr Gin Lys Ser 315 Leu 320
Ala 1 Ser Thr Lys Gly Pro Ser 5 Val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg
Ser Thr Ser Gly 20 Gly Thr Ala Ala Leu Gly 25 Cys Leu Val Lys Asp 30 Tyr
PL 209 110 B1
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys Trp 180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Trp Glu 195 200 205
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 210 215 220
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
245 250 255
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 260 265 270
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Met Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn 290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
325 330 335
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 340 . 345 350
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
PL 209 110 B1
355 360 <210> 4 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> misc_£eature <223> Łańcuch Ig-gamma-4, region C <400> 4
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg
Ser Thr Ser Glu 20 Ser Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu Val Lys 30 Asp Tyr
Phe Pro Glu 35 Pro Val Thr Val Ser 40 Trp Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser
Gly val 50 His Thr Phe Pro Ala 55 Val Leu Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser
Leu 65 Ser Ser Val Val Thr 70 Val Pro Ser Ser Ser 75 Leu Gly Thr Lys Thr 80
Tyr Thr Cys Asn Val 85 Asp His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys Val Asp 95 Lys
Arg Val Glu Ser 100 Lys Tyr Gly Pro Pro 105 Cys Pro Ser Cys Pro 110 Ala Pro
Glu Phe Leu 115 Gly Gly Pro Ser Yal 120 Phe Leu Phe Pro Pro 125 Lys Pro Lys
Asp Thr 130 Leu Met Ile 'Ser Arg 135 Thr Pro Glu Yal Thr 140 Cys Yal Val Val
Asp 145 Yal Ser Gin Glu Asp 150 Pro Glu Val Gin Phe 155 Asn Trp Tyr Val Asp 160
Gly Val Glu Val His 165 Asn Ala Lys Thr Lys 170 Pro Arg Glu Glu Gin 175 Phe
Asn Ser Thr Tyr 180 Arg Val Val Ser Val 185 Leu Thr Yal Leu His 190 Gin Asp
Trp Leu Asn 195 Gly Lys Glu Tyr Lys 200 Cys Lys Val Ser Asn 205 Lys Gly Leu
Pro Ser 210 Ser Ile Glu Lys Thr 215 Ile Ser Lys Ala Lys 220 Gly Gin Pro Arg
Glu 225 Pro Gin Val Tyr Thr 230 Leu Pro Pro Ser Gin 235 Glu Glu Met Thr Lys 240
Asn Gin Yal Ser Leu 245 Thr Cys Leu Yal Lys 250 Gly Phe Tyr Pro Ser 255 Asp
PL 209 110 B1
Ile Ala Val Glu 260 Trp Glu Ser Asn Gly 265 Gin Pro Glu Asn Asn 270 Tyr Lys
Thr Thr Pro 275 Pro Val Leu Asp Ser 280 Asp Gly Ser Phe Phe 285 Leu Tyr Ser
Arg Leu 290 Thr Val Asp Lys Ser 295 Arg Trp Gin Glu Gly 300 Asn Val Phe Ser
Cys 305 Ser Val Met His Glu 310 Ala Leu His Asn His 315 Tyr Thr Gin Lys Ser 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210? 5 <211? 9 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T <400? 5
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
5 <210? 6 <211? 9 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Zmutowany potencjalny epitop limfocytów T <400? 6
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Lys
5 <210? 7 <211? 9 <212? PRT <22.3? sekwencja sztuczna <220?
<223? Zmutowany potencjalny epitop limfocytów T <400? 7
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala 1 5 <210? 8 <211? 13 <212? PRT <213? sekwencja sztuczna <220?
PL 209 110 B1 <223> Sekwencja w pobliżu C-konca domeny CH3 regionu Fc białka IgA <400> 8
Gin Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His
10
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Sekwencj a sztuczna
<220>
<223> Zmutowana sekwencja w pobliżu C-konca domeny CH3 regionu
Fc białka IgA
<400> 9
Gin Lys Thr Ala Asp Arg Thr Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Deimmunizowana sekwencja w fuzji IgA-X <400> 10
Gin Lys Thr Pro Thr Arg Thr Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Deimmunizowana sekwencja w fuzji IgA-X <400> 11
Gin Lys Thr Pro Thr Arg Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Deimmunizowana sekwencja w fuzji IgA-X <400> 12
Gin Lys Thr Ala Thr Arg Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10 <210> 13
PL 209 110 B1 <211? 13 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223> potencjalny epitop limfocytów T w złączeniu HSA-IFNalfa <400? 13
Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu
10 <210? 14 <211> 13 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Modyfikowany C-koniec albuminy <400? 14
Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Thr Thr Ala
10
<210? <211? <212? <213? 15 30 PRT Sekwencj a sztuczna
<220?
<223? Sekwencj a w białku fuzyjnym Fc
<400? 15
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210? 16 <211? 30 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? zmodyfikowana sekwencja w białku fuzyjnym Fc <400? 16
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Lys Gly 15
1 5 10
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25
<210? 17
<211? 9
<212? PRT
<213? Sekwencja sztuczna
PL 209 110 B1 <220» <223> Sekwencja złączenia <400> 17
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Pro <210» <211» <212» <213» <220» <223»
PRT
Sekwencja sztuczna
Zmodyfikowana sekwencja złączenia <400»
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro <210» 19 <211» 9 <212» PRT <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Zmodyfikowana sekwencja złączenia <400» 19
Leu Asn Leu Ser Pro Gly Ala Ala Pro
5 <210» 20 <211» 13 <212» PRT <213> Sekwencja sztuczna <220» <223» Syntetyczny peptyd zawierający reaktywny epitop <400» 20
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Pro Thr Ser
10 <210» 21 <211» 13 <212» PRT <213> Sekwencja sztuczna <220» <223» Zmodyfikowany syntetyczny peptyd zawierający reaktywny epitop <400» 21
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Lys Ala Pro Thr Ser
10
PL 209 110 B1 <210? 22 <211? 39 <212? PRT <213? sekwencja sztuczna <220?
<223? Sekwencja złączenia CD4-albumina <400? 22
Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Leu Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val
20 25 30
Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser
35
<210? 23 <211? 13 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T w fuzji HSA-IFNalfa <400? 23
Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu Cys
10 <210? 24 <211? 13 <212? PRT <2i3? sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T w fuzji HSA-IFNalfa <400? 24
Leu Gly Leu Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly
10 <210? 25 <211? 5 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? Sekwencja C-konca albuminy <400? 25
Ala Ala Leu Gly Leu 1 5 <210? 26 <211? 5 <212? PRT
PL 209 110 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? Zmutowana sekwencja C-konca albuminy <400? 26
Thr Ala Thr Thr Ala <210? 27 <211? 19 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Zmutowany region złączenia albuminy <400? 27
Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gin Thr Ala 15 10 15
Thr Thr Ala <210? 28 <211? 21 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Niezmutowana sekwencja Fc <400? 28
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly 20 <210? 29 <211? 52 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? sekwencja miejsca fuzji mutanta GLP-1 z Fc <400? 29
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
35 40 45
PL 209 110 B1
Glu Leu Leu Gly 50
<210? 30
<211? 41
<212? PRT
<213? Sekwencja sztuczna
<220?
<223? Sekwencja miejsca fuzji normalnego GLP-1 z Fc
<400? 30
Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Lys Gly Arg Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
35 40
<210? 31 <211? 13 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T przy fuzji GLP-1 z Fc <400? 31
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu
10 <210? 32 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T przy fuzji GLP-1 z Fc <400? 32
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu Pro
10 <210? 33 <211? 13 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T w fuzji GLP-1 z Fc <400? 33
Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu Pro Lys Ser Ser
5 10
PL 209 110 B1 <210> 34 <211> 52 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Deimmunizowane miejsce złączenia GLP-1 - Fc <400> 34
His 1 Ala Glu Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Val 10 Ser Ser Tyr Leu Glu 15 Gly
Gin Ala Ala Lys 20 Glu Phe Ala Ala Trp 25 Ala Val Thr Gly Thr 30 Gly Glu
Pro Lys Ser 35 Ser Asp Lys Thr His 40 Thr Cys Pro Pro Cys 45 Pro Ala Pro
Glu Leu Leu Gly 50 <210> 35 <211> 41 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Miejsce złączenia GLP-1 - Fc z miejscem glikozylacji <400> 35
Ser 1 Tyr Leu Glu Gly 5 Gin Ala Ala Lys Glu 10 Phe Ile Ala Trp Leu 15 Val
Lys Gly Arg Asn 20 Gly Ser Lys Ser Ser 25 Asp Lys Thr His Thr 30 Cys Pro
Pro Cys Pro 35 Ala Pro Glu Leu Leu 40 Gly
<210> 35
<211> 41
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Miejsce złączenia TNF-R-gamma-1
<400> 36
Ser 1 Thr Ser Phe Leu 5 Leu Pro Met Gly Pro 10 Ser Pro Pro Ala Glu 15 Gly
Ser Thr Gly Asp 20 Glu Pro Lys Ser Cys 25 Asp Lys Thr His Thr 30 Cys Pro
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
40 <210> 37
PL 209 110 B1 <211> 41 <212» PRT c213> Sekwencja sztuczna <220»
<223» <400» Miejsce 37 złączenia TNF-R - Fc
Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Thr Gly Asn Gly Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
35 40
<210» 38
<211» 40
<212» PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220»
<223» Miej sce złączenia Fc -IL12p35
<400» 38
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Prc i Gly Lys Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met
20 25 30
Phe Pro > Cys Leu His His Ser Gin
35 40
<210» 39
<211» 40
<212» PRT
<213» Sekwencja sztuczna
<220»
<223» Miej sce złączenia IL· -12p40- IL2
<400» 39
Arg Ala Gin Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser
1 5 10 15
Val Pro Cys Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu
20 25 30
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
35 40
<210» 40 <211» 40 <212» PRT <213» Sekwencja sztuczna
PL 209 110 B1 <220?
<223? Zmodyfikowane miejsce złączenia Fc-IL12p35 <400? 40
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Pro Gly Lys Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met
20 25 30
Phe Pro Cys Leu His His Ser Gin
35 40
<210? 41 <211> 40 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?
<223? Zmodyfikowane miejsce złączenia IL12p40-IL2 <400? 41
Arg 1 Ala Gin Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser
5 10 15
Val Pro Cys Ser Asn Gly Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu
20 25 30
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp 35 40 <210? 42 <211? 13 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T w fuzji IL12p40-IL2 <400? 42
Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Asn Gly Thr Ser
1 5 10
<210? <211? <212? 43 13 PRT
<213? Sekwencja sztuczna
<220?
<223? Potencjalny epitop limfocytów T w miejscu
<400? złączenia 43 fuzyjnego IL12p40-IL2
Ala Ser Val Pro Cys Ser Asn Gly Thr Ser Ser Ser Thr 15 10 <210? 44 <211? 41
PL 209 110 B1 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Miejsce złączenia IL4 -Fc
<400> 44
Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg. Glu Lys Tyr Ser
1 5 10 15
Lys Cys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
35 40
<210=· 45
<211> 40
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220 =
<223> Miej sce złączenia Fc- GMCSF
<400> 45
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Pro Gly Lys Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp
20 25 30
Glu His Val Asn Ala Ile Gin Glu
35 40
<210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Potencjalny epitop limfocytów T w miejscu złączenia fuzyjnego IL4-Fc <400> 46
Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys
10 <210> 47 <211> 41 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Zmodyfikowane miejsce złączenia IL4-FC <400> 47
Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser 15 10 15
PL 209 110 B1
Lys Cys Ser Ser Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40 <210» 48 <211> 40 <212» PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223» Deimmunizowane miejsce złączenia Fc-GMCSF <400> 48
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Pro Gly Lys Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp
20 25 30
Glu His Val Asn Ala Ile Gin Glu
35 40
<210» 49 <211> 35 <212» PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Miejsce złączenia IgG2CHl-(zawias)IgGl <400» 49
Gin 1 Thr Tyr Thr Cys 5 Asn Val Asp His Lys 10 Pro Ser Asn Thr Lys 15 Val
Asp Lys Thr Val 20 Glu Pro Lys Ser Cys 25 Asp Lys Thr His Thr 30 Cys Pro
Pro Cys Pro 35 <210» 50 <211> 35 <212» PRT <213» Sekwencja sztuczna <220» <223> Miejsce złączenia (zawias)IgGl-IgG2CH2 <400» 50
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Yal Ala Gly Pro Ser Yal Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
PL 209 110 B1
Asp Thr Leu 35 <210> 51 <211? 13 <212 > PRT <213? Sekwencja sztuczna <220>
<223>
Potencjalny epitop limfocytów T w miejscu złączenia fuzyjnego IgG2CHl-IgGl(zawias) <400> 51
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
10 <210> 52 <211? 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Potencjalny epitop limfocytów T w miejscu złączenia fuzyjnego IgG2CHl-IgGl(zawias) <400> 52
Lys Thr Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
10 <210? 53 <211> 35 <212> PRT <2i3> sekwencja sztuczna <220>
<223?
Zmodyfikowane miejsce złączenia fuzyjnego IgG2CHl-IgGl(zawias) <400? 53
Gin 1 Thr Tyr Thr Cys 5 Asn Val Asp His Lys 10 Pro Ser Asn Thr Lys 15 Ala
Asp Lys Thr Ala 20 Glu Pro Lys Ser Cys 25 Asp Lys Thr His Thr 30 Cys Pro
Pro Cys Pro 35 <210> 54 <211? 35 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220> , Ί 4= · <223> Zmodyfikowane miejsce złączenia fuzyjnego
IgG2CHl-IgGl(zawias) <400> 54
Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
PL 209 110 B1
10 15
Asp Lys Thr Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Ero 20 25 30
Pro Cys Pro 35 <210? 55 <211? 35 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <22 0 >
<223? Zmodyfikowane miejsce złączenia fuzyjnego
IgGl(zawias)-IqG2CH2
<400? 55
Glu 1 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 5 His Thr 10 Cys Pro Pro Cys Pro 15 Ala
Pro Pro Vąl Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
25 30
Asp Thr Leu 35 <210? 56 <211? 166 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna
<220? <223? , Sekwencja mutanta EPO
<400? 56
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Pro Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Cys Glu Gly Leu Gin Leu His Val Asp
35 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
PL 209 110 B1
Pro Leu 130 Arg Thr Ile Thr Ala Asp 135 Thr Phe Arg Lys 140 Leu Phe Arg Val
Tyr 145 Ser Asn Phe Leu Arg 150 Gly Lys Leu Lys Leu 155 Tyr Thr Gly Glu Ala 160
Cys Arg Thr Gly Asp 165 Arg
<210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Miejsce złączenia fuzyjneąo CH3-EP0 <400> 57
Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Pro Arg Leu 15 10 15
Ile <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja CH3 IgG2 <400> 58
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Zmodyfikowana sekwencja CH3 IgG2 <400> 59
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly
5

Claims (11)

1. Sposób obniżania immunogenności poprzez usunięcie niewłasnych epitopów limfocytów T białka fuzyjnego zawierającego pierwsze białko oraz drugie białko przyłączone do pierwszego białka poprzez połączenie fuzyjne, znamienny tym, że obejmuje modyfikacje sekwencji aminokwasowej regionu rzeczonego połączenia fuzyjnego, przy czym modyfikacje przeprowadza się w jednym z następujących etapów:
(i) wprowadzenie N-połączonego lub O-połączonego miejsca glikozylacji, (ii) zastąpienie Leu, Val, Ile, Met, Phe, Tyr lub Trp w obrębie co najwyżej ośmiu C-końcowych aminokwasów sekwencji N-końcowego partnera fuzyjnego w rzeczonym białku fuzyjnym przez Thr, Ala lub Pro, lub (iii) zastąpienie sekwencji aminokwasowej Leu-Ser-Leu-Ser sekwencją aminokwasową Ala-ThrAla-Thr w przypadku gdy pierwsze białko jest cząsteczką IgG lub jej fragmentem.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) przeprowadza się poprzez wprowadzenie miejsca glikozylacji w obrębie 10, 5 lub 2 aminokwasów połączenia fuzyjnego.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) przeprowadza się poprzez wprowadzenie sekwencji aminokwasowej Asn-X-Ser/Thr, gdzie X oznacza dowolny aminokwas.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszym białkiem jest cząsteczka IgG lub jej fragment.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszym białkiem jest cząsteczka IgG lub jej fragment, zaś drugim białkiem jest cytokina.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że dla wydłużenia czasu półtrwania w surowicy, przeprowadza się kolejną mutację pomiędzy jednostką IgG a jednostką cytokiny białka fuzyjnego przez zastąpienie C-końcowej lizyny jednostki przeciwciała alaniną bądź leucyną.
7. Sposób według dowolnego zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że region połączenia zawiera od 1 do 15 aminokwasów.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że region połączenia zawiera od 1 do 9 aminokwasów.
9. Białko fuzyjne o obniżonej immunogenności otrzymane sposobem zdefiniowanym w dowolnym zastrz. 1 do 8, znamienne tym, że jest wybrane z grupy obejmującej:
(i) huKS-IL2, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser, przy czym huKS jest przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiej cząsteczce adhezyjną komórki nabłonka KSA (EP-CAM);
(ii) FC-IL12-IL2, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser, przy czym Fc jest rzeczonym pierwszym białkiem, zaś białko fuzyjne IL12IL2 jest rzeczonym drugim białkiem;
(iii) białko fuzyjne Fc-IL12-IL2, które zawiera miejsce glikozylacji Asn-Gly na pierwszych pozycjach w obrębie cząsteczki IL2, przy czym białko fuzyjne Fc-IL12 jest rzeczonym pierwszym białkiem, zaś IL2 jest rzeczonym drugim białkiem;
(iv) Fc-EPO, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser;
(v) Fc-EPO, które zawiera Ala-Thr-Ala-Thr w sekwencji IgG w obrębie regionu połączenia zamiast Leu-Ser-Leu-Ser, przy czym łańcuch Ig jest łańcuchem lgG2 zawierającym region zawiasowy IgG1.
10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość białka fuzyjnego zdefiniowanego w zastrz. 9, opcjonalnie razem z farmaceutycznie tolerowanym nośnikiem.
11. Kwas nukleinowy kodujący białko fuzyjne zdefiniowane w zastrz. 9.
PL366826A 2001-03-30 2002-03-30 Sposób obniżania immunogenności białka fuzyjnego, białko fuzyjne otrzymane takim sposobem, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i kodujący je kwas nukleinowy PL209110B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28062501P 2001-03-30 2001-03-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL366826A1 PL366826A1 (pl) 2005-02-07
PL209110B1 true PL209110B1 (pl) 2011-07-29

Family

ID=23073904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL366826A PL209110B1 (pl) 2001-03-30 2002-03-30 Sposób obniżania immunogenności białka fuzyjnego, białko fuzyjne otrzymane takim sposobem, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i kodujący je kwas nukleinowy

Country Status (19)

Country Link
US (5) US6992174B2 (pl)
EP (2) EP2311882A1 (pl)
JP (2) JP4638129B2 (pl)
KR (1) KR20030087040A (pl)
CN (1) CN100488984C (pl)
AT (1) ATE490262T1 (pl)
AU (1) AU2002306976B2 (pl)
BR (1) BR0208207A (pl)
CA (1) CA2442363C (pl)
DE (1) DE60238472D1 (pl)
DK (1) DK1373301T3 (pl)
ES (1) ES2356620T3 (pl)
HU (1) HUP0303753A2 (pl)
MX (1) MXPA03008715A (pl)
PL (1) PL209110B1 (pl)
PT (1) PT1373301E (pl)
RU (1) RU2333919C2 (pl)
WO (2) WO2002079415A2 (pl)
ZA (1) ZA200308430B (pl)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE267215T1 (de) * 1997-12-08 2004-06-15 Lexigen Pharm Corp Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
JP2002511432A (ja) * 1998-04-15 2002-04-16 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
HUP0202442A3 (en) * 1999-08-09 2005-01-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
PT1294401E (pt) * 2000-06-29 2007-11-09 Merck Patent Gmbh Aumento das respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina por tratamento combinado com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas
KR20090010127A (ko) 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US20120148585A1 (en) * 2001-05-01 2012-06-14 Andrew Saxon Fusion molecules and methods for treatment of immune diseases
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
ATE542137T1 (de) * 2001-12-04 2012-02-15 Merck Patent Gmbh Immunocytokine mit modulierter selektivität
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7611700B2 (en) * 2002-09-09 2009-11-03 Hanall Pharmaceuticals, Co., Ltd. Protease resistant modified interferon alpha polypeptides
KR101197500B1 (ko) * 2002-11-15 2012-11-09 니프로 가부시키가이샤 리포솜
WO2004055056A1 (en) 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
CA2520254A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Apogenix Gmbh Treatment of viral infections
US20070161087A1 (en) * 2003-05-29 2007-07-12 Wolfgang Glaesner Glp-1 fusion proteins
US7452966B2 (en) * 2003-06-12 2008-11-18 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
CN100453556C (zh) 2003-10-16 2009-01-21 麦克罗梅特股份公司 多特异性的去免疫化cd3结合物
US20050142133A1 (en) * 2003-12-03 2005-06-30 Xencor, Inc. Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor
EP2221315A1 (en) 2003-12-04 2010-08-25 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
CN100427599C (zh) * 2003-12-26 2008-10-22 吉林大学第一医院 Albsin/il－18mat杂交细胞因子
DE602004013372T2 (de) 2003-12-30 2009-07-02 Merck Patent Gmbh Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung
RU2370276C2 (ru) * 2003-12-31 2009-10-20 Мерк Патент Гмбх Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ
AU2005203962C1 (en) * 2004-01-05 2012-11-08 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
ES2330860T3 (es) 2004-01-22 2009-12-16 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anticancerosos con fijacion del complemento reducida.
PL1737961T3 (pl) 2004-03-19 2013-12-31 Merck Patent Gmbh Zmodyfikowane białka bouganiny, cytotoksyny i sposoby oraz ich zastosowania
AU2005227326B2 (en) 2004-03-24 2009-12-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
WO2005097202A2 (en) * 2004-04-06 2005-10-20 Affibody Ab Use of serum albumin binding peptides conjugates for the preparation of a medicament
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
MX2007000921A (es) 2004-07-22 2007-11-09 Univ Erasmus Medical Ct Moleculas de union.
EA014226B1 (ru) 2004-07-26 2010-10-29 Байоджен Айдек Ма Инк. Антитела к cd154, их фрагменты и способы применения антител и фрагментов
CA2581423A1 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Vasgene Therapeutics, Inc. Polipeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
JP4652414B2 (ja) 2004-11-12 2011-03-16 ゼンコー・インコーポレイテッド ＦｃＲｎとの変化した結合を有するＦｃ変異体
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CN101072793B (zh) * 2004-12-09 2012-06-20 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的il-7变体
WO2006068910A1 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Eli Lilly And Company Glp-1 analog fusion protein formulations
CA2595169A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
WO2007012188A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Qinghua Wang GLP/1/EXENDM 4 IgG Fc FUSION CONSTRUCTS FOR TREATMENT OF DIABETES
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
ES2856451T3 (es) 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
RU2426743C2 (ru) 2005-12-21 2011-08-20 Микромет Аг Фармацевтические композиции с устойчивостью к растворимому сеа
KR101397290B1 (ko) * 2005-12-30 2014-05-21 메르크 파텐트 게엠베하 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체
PT1966238E (pt) 2005-12-30 2012-07-31 Merck Patent Gmbh Uso de hsp70 como um regulador de atividade enzimática
WO2007085814A1 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Domantis Limited Fusion proteins that contain natural junctions
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
EP2038417A2 (en) * 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
WO2008045380A2 (en) * 2006-10-04 2008-04-17 Codon Devices, Inc. Nucleic acid libraries and their design and assembly
WO2008065372A2 (en) 2006-11-28 2008-06-05 Nautilus Biotech, S.A. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
CN103755789B (zh) 2007-01-30 2016-12-07 埃皮瓦克斯公司 调节性t细胞表位、组合物及其用途
MX2009011870A (es) 2007-05-02 2009-11-12 Ambrx Inc Polipeptidos de interferon beta modificados y usos de los mismos.
GB2451928B (en) * 2007-06-21 2011-03-16 Angelica Therapeutics Inc Modified Toxins
US8137979B2 (en) * 2007-06-25 2012-03-20 Qinetiq Limited Preconcentrator device
WO2009012600A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
PL2808343T3 (pl) 2007-12-26 2019-11-29 Xencor Inc Warianty Fc ze zmienionym wiązaniem do FcRn
WO2009110944A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-11 Angelica Therapeutics, Inc. Modified toxins
EP2376105B1 (en) 2008-12-18 2015-07-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Nkg2d-fc for immunotherapy
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
EP2398494A4 (en) 2009-02-23 2015-10-28 Cytomx Therapeutics Inc Proproteins and their methods of use
EA201171259A1 (ru) * 2009-04-22 2012-05-30 Мерк Патент Гмбх Антительные гибридные белки с модифицированными сайтами связывания fcrn
MX354555B (es) 2009-06-08 2018-03-09 Amunix Operating Inc Polipeptidos de la hormona de crecimiento y metodos de preparacion y su uso.
PT2440228T (pt) 2009-06-08 2018-12-24 Amunix Operating Inc Polipéptidos de regulação da glicose e métodos de preparação e utilização dos mesmos
JP6166041B2 (ja) 2009-06-15 2017-07-19 バレリオン セラピューティクス， エルエルシー ミオチューブラリン１（ｍｔｍ１）ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを使用して筋細管ミオパシーを処置するための方法および組成物
WO2011028229A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US8932588B2 (en) 2009-11-05 2015-01-13 Teva Pharmaceuticals Australia Pty. Ltd. Treatment of cancer involving mutated KRAS or BRAF genes
WO2011091078A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Xencor, Inc. Antibody fc variants with enhanced complement activity
EP2536756B1 (en) 2010-02-16 2018-04-25 MedImmune, LLC Hsa-related compositions and methods of use
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
ES2876421T3 (es) * 2011-04-13 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de fusión Fc que comprenden enlazadores o disposiciones nuevos
JP6430828B2 (ja) * 2011-05-05 2018-11-28 アルブミディクス リミティド アルブミン変異体
CN102222177A (zh) * 2011-07-08 2011-10-19 上海生物信息技术研究中心 抗体蛋白的分子改造辅助预测方法
WO2013096948A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Lydon Nicholas B Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
US9988439B2 (en) 2011-12-23 2018-06-05 Nicholas B. Lydon Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
CA2864904C (en) 2012-02-15 2023-04-25 Amunix Operating Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
CN107496932A (zh) 2012-02-27 2017-12-22 阿穆尼克斯运营公司 Xten缀合组合物和制造其的方法
WO2013184216A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 Amunix Operating Inc. Hgh-xten fusion protein and its use in the treatment of growth hormone deficiency
US9714291B2 (en) * 2012-10-05 2017-07-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Heterodimer protein composition
US10017581B2 (en) 2013-02-20 2018-07-10 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of Pompe disease
WO2014141192A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Erasmus University Medical Center Generation of heavy chain-only antibodies
JP2016519651A (ja) 2013-03-15 2016-07-07 アンジェリカ セラピューティックス，インク． 改質された毒素
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
WO2015085311A1 (en) 2013-12-07 2015-06-11 Case Western Reserve University Compositions and methods of treating thrombosis
JP6730926B2 (ja) 2014-01-08 2020-07-29 プロージット ソウル バイオテクノロジー （ベイジン） カンパニー リミテッド 融合ポリペプチドおよび使用方法
US10221250B2 (en) 2014-01-13 2019-03-05 Valerion Therapeutics, Llc Internalizing moieties
JP6731346B2 (ja) 2014-02-10 2020-07-29 メルク パテント ゲーエムベーハー 標的ＴＧＦβ阻害
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CA2950178A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 The California Institute For Biomedical Research Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
US10124073B2 (en) 2014-08-04 2018-11-13 Case Western Reserve University Targeting peptides and methods of use
JP2017536091A (ja) 2014-10-02 2017-12-07 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 多価メディトープ、メディトープ結合性抗体およびそれらの使用
WO2016087514A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies
WO2016149643A2 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 Omnicyte Fusion proteins comprising modified alpha virus surface glycoproteins and tumor associated antigen and methods thereof
US11020454B2 (en) 2015-07-15 2021-06-01 Prosit Sole Biotechnology (Beijing) Co. Ltd Fusion polypeptides and methods of use
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
CN114853907A (zh) 2015-11-13 2022-08-05 达纳-法伯癌症研究所有限公司 用于癌症免疫疗法的nkg2d-ig融合蛋白
EP4011919A3 (en) 2015-12-09 2022-10-12 The Scripps Research Institute Relaxin immunoglobulin fusion proteins and methods of use
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CA3031168A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Merck Patent Gmbh Combination therapy for cancer
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
EP3496742A4 (en) 2016-12-01 2020-04-08 University Of South Florida PEPTICORPS, COMPOSITIONS THEREOF, AND METHODS FOR TREATING EAR FIBRILLATION
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3873611A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Merck Patent GmbH Anti-tim-3 antibodies
EP3873612A2 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Merck Patent GmbH Methods of administering anti-tim-3 antibodies
JP2022530216A (ja) * 2019-04-23 2022-06-28 エルジー・ケム・リミテッド 免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチド
JP2022543669A (ja) * 2019-08-08 2022-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規抗原結合分子フォーマット
US20230287040A1 (en) 2019-11-13 2023-09-14 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same

Family Cites Families (243)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US166877A (en) * 1875-08-17 Improvement in electric lights
US193570A (en) * 1877-07-24 Improvement in washing-boards
US147311A (en) * 1874-02-10 Improvement in electric telegraphs
US44423A (en) * 1864-09-27 Improved screw for music-stools
US142374A (en) * 1873-09-02 Improvement in stopping mechanisms for doubling and twisting machines
US49227A (en) * 1865-08-08 Improvement in construction of railway trains and cars
US12789A (en) * 1855-05-01 Office
US166163A (en) * 1875-07-27 Improvement in bee-hives
US192222A (en) * 1877-06-19 Improvement in watches
US53539A (en) * 1866-03-27 Improvement in revolving fire-arms
US105294A (en) * 1870-07-12 Erasmus w
US3529A (en) * 1844-04-10 yvolfe
US81664A (en) * 1868-09-01 Island
US348237A (en) * 1886-08-31 richards
US1803686A (en) * 1923-11-23 1931-05-05 Herman A Brassert Gas production
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4469797A (en) * 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4737462A (en) * 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5082658A (en) * 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4667016A (en) * 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
JPS63267278A (ja) 1986-03-14 1988-11-04 Toray Ind Inc インタ−フエロン結合体を暗号化する塩基配列
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4732683A (en) * 1986-12-02 1988-03-22 Biospectrum, Inc. Purification method for alpha interferon
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
EP0318554B2 (en) 1987-05-21 2005-01-12 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
DE3853740T2 (de) 1987-06-10 1995-11-09 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle Antikörperkonstruktionen und Verfahren zur selektiven Tötung von Zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
PH26813A (en) 1987-09-02 1992-11-05 Ciba Geigy Ag Conjugates of cytokines with immunoglobulins
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
PT89121A (pt) 1987-12-04 1989-12-29 Du Pont Processo para a preparacao de interleuquina-2 imobilizada e interleuquina-2 contendo uma extensao no terminal-carboxilo com actividade de interleuquina-2 natural
WO1989006692A1 (en) * 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
DE3812605A1 (de) 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) * 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL91933A (en) 1988-10-11 1994-12-29 Univ Southern California Their immuno-bracelet and isophiles which are beneficial in increasing vascular permeability or blood supply to tumor or otherwise damaged tissue
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) * 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
CA2062795A1 (en) 1989-06-29 1990-12-30 Michael W. Fanger Bispecific reagents for aids therapy
ATE123065T1 (de) * 1989-07-07 1995-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren herstellung.
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
EP0765937B1 (en) 1989-09-20 2002-11-27 Abbott Laboratories Method of producing fusion proteins
US5856298A (en) * 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
KR100221066B1 (ko) 1989-10-13 1999-10-01 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 유사체와 그를 포함하는 제약학적 조성물
DK0433827T3 (da) 1989-12-22 1998-09-28 Hoffmann La Roche Cytotoksisk lumfocytmodningsfaktor
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991013166A1 (en) 1990-03-02 1991-09-05 Abbott Biotech, Inc. Antibody constructs with enhanced binding affinity
ATE158615T1 (de) 1990-03-20 1997-10-15 Univ Columbia Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
JPH06504262A (ja) 1990-07-27 1994-05-19 レブリゲン　コーポレーション 脈管形成性の病気の処置用の新規な方法と組成物
EP0556328A4 (en) 1990-11-09 1994-06-08 Abbott Lab Bridging antibody fusion constructs
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
KR100237968B1 (ko) 1990-12-05 2000-01-15 한센 핀 베네드 변화된 에피토프를 지닌 단백질 및 그 제조방법
US5709859A (en) * 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993003157A1 (en) 1991-07-29 1993-02-18 Dana Farber Cancer Institute Plasmids for the rapid preparation of modified proteins
US20020037558A1 (en) * 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US5376367A (en) 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
ATE260971T1 (de) 1992-04-01 2004-03-15 Univ Rockefeller Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung
WO1993020185A1 (en) 1992-04-01 1993-10-14 Steinman Ralph M Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens
EP0615451B1 (en) * 1992-05-26 2005-12-07 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
US5429199A (en) * 1992-08-26 1995-07-04 Kennametal Inc. Cutting bit and cutting insert
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
CA2147499C (en) * 1992-11-05 2010-10-19 Ron S. Israeli Prostate-specific membrane antigen
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) * 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) * 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
AU6816194A (en) * 1993-04-20 1994-11-08 Robinson, William S. Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents
WO1994024160A2 (en) 1993-04-21 1994-10-27 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity
US5759551A (en) * 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
AU6776194A (en) 1993-04-28 1994-11-21 Hybritech Incorporated Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking
WO1994025055A1 (en) * 1993-04-29 1994-11-10 Abbott Laboratories Erythropoietin analog compositions and methods
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
ZA946122B (en) 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
AU689214B2 (en) 1994-02-01 1998-03-26 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions
WO1995028427A1 (en) 1994-04-15 1995-10-26 Imclone Systems Incorporated Chimeric interleukin-3/mutein interleukin-6 lymphokine
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) * 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
IL113509A (en) * 1994-04-26 2005-12-18 Childrens Medical Center Angiostatin protein preparations and methods of use
DE69522216T2 (de) 1994-05-13 2002-05-02 Biovation Ltd Zielzellen-bindende chimäre Peptide
CU22615A1 (es) 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
WO1996004388A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5888773A (en) * 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
EP0706799B1 (en) 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
WO1996018412A1 (en) 1994-12-12 1996-06-20 Beth Israel Hospital Association Chimeric cytokines and uses thereof
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
AU712585B2 (en) * 1995-03-10 1999-11-11 Genentech Inc. Receptor activation by gas6
US5719266A (en) * 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
WO1996031526A1 (en) 1995-04-06 1996-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Anti-obesity agents
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
AU5893796A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
WO1997000317A1 (en) 1995-06-07 1997-01-03 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
GB9511935D0 (en) 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
NL1000614C2 (nl) * 1995-06-20 1996-12-23 Leer Koninklijke Emballage Werkwijze voor het vervaardigen van een gelamineerd produkt.
US5736852A (en) * 1995-06-21 1998-04-07 Alliedsignal Truck Brake Systems Co. Circuit and method for conditioning a wheel speed sensor signal
CN1195293A (zh) * 1995-06-30 1998-10-07 伊莱利利公司 治疗糖尿病的方法
US6406689B1 (en) * 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
KR19990066981A (ko) 1995-10-23 1999-08-16 윌리엄 뉴우 치료용 맥관형성억제 조성물 및 방법
AU1407997A (en) 1995-12-01 1997-06-19 Beth Israel Hospital Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof
CZ9802013A3 (cs) 1995-12-27 1998-09-16 Genentech, Inc. Deriváty OB proteinu, chimerní OB polypeptidy, prostředky pro léčbu obezity a dalších fyziologických stavů a způsob léčení těmito prostředky, kódující sekvence pro OB protein, expresní vektor nesoucí tuto sekvenci, buňky transformované tímto vektorem a způsob jejich kultivace, a způsob navození růstu buněk s pomocí OB proteinu
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6080409A (en) * 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US7063958B1 (en) 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
WO1997030089A1 (en) 1996-02-13 1997-08-21 Regents Of The University Of California Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same
US5756541A (en) 1996-03-11 1998-05-26 Qlt Phototherapeutics Inc Vision through photodynamic therapy of the eye
US6046310A (en) 1996-03-13 2000-04-04 Protein Design Labs., Inc. FAS ligand fusion proteins and their uses
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
CN1136197C (zh) * 1996-05-30 2004-01-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新的哒嗪酮衍生物
US5922685A (en) * 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
JP2002514161A (ja) 1996-07-02 2002-05-14 バー イラン ユニバーシティー ガンおよび他の細胞増殖性疾患の治療に有用なレチノイルオキシ（置換）アルキレンブチレート
AU4075897A (en) 1996-08-16 1998-03-06 Roger Lallone A leptin binding protein and its use in methods for diagnosing and treating abnormalities of the endogenous leptin pathway
EP0826696B1 (de) * 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
CA2275183A1 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Amgen Inc. Ob fusion protein compositions and methods
US6737057B1 (en) 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) * 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0973550B1 (en) * 1997-04-11 2002-10-09 G.D. SEARLE &amp; CO. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
JP4086908B2 (ja) 1997-04-17 2008-05-14 アムジエン・インコーポレーテツド 安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質と抗体Ｆｃ鎖とのコンジュゲートを含む組成物および方法
GB2339430A (en) * 1997-05-21 2000-01-26 Biovation Ltd Method for the production of non-immunogenic proteins
GB9712892D0 (en) * 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
WO1999002709A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-21 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
CA2296770A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
ATE267215T1 (de) * 1997-12-08 2004-06-15 Lexigen Pharm Corp Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
WO1999043713A1 (en) 1998-02-25 1999-09-02 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
JP2002511432A (ja) 1998-04-15 2002-04-16 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強
RU2217168C2 (ru) * 1998-04-17 2003-11-27 Лексиген Фармасьютикэлс Корпорейшн Усиление иммунных ответов, опосредованных белками, слитыми из антитела и цитокина, посредством совместного введения ингибитора простагландина
AU3655899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 Regents Of The University Of California, The Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
CA2328490A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fused protein
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6620382B1 (en) * 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
WO1999062944A2 (en) 1998-06-03 1999-12-09 The Children's Medical Center Corporation Protein oligomer compositions comprising endostatin protein and methods of using the same
DE69933216T2 (de) 1998-06-15 2007-09-20 GTC Biotherapeutics, Inc., Framingham Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ATE462725T1 (de) 1998-08-25 2010-04-15 Merck Patent Gmbh Expression und export von angiostatin und endostatin als immunofusins
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) * 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
EP1813624B1 (en) 1998-10-23 2010-08-11 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
CN1202128C (zh) * 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
HUP0105090A2 (hu) * 1999-01-07 2002-04-29 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Kóros elhízás elleni fehérjék expressziója és exportja Fc fúziós fehérje formájában
DE60027409T2 (de) * 1999-02-12 2007-04-12 Amgen Inc., Thousand Oaks Glykosylierte leptinzusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE60041183D1 (de) 1999-05-06 2009-02-05 Univ Wake Forest Zusammensetzungen und methoden zur identifikation von antigenen, die eine immunantwort hervorrufen
JP3660880B2 (ja) 1999-05-07 2005-06-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 新規なチンパンジーエリスロポエチン（ｃｈｅｐｏ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸
US6348192B1 (en) * 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
BR0010725A (pt) * 1999-05-19 2002-02-19 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas de interferon-alfa como proteìnas de fusão de fc
WO2000078334A1 (en) 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US7067110B1 (en) * 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
HUP0202442A3 (en) * 1999-08-09 2005-01-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
EP1228214A2 (en) 1999-11-12 2002-08-07 MERCK PATENT GmbH Erythropoietin forms with improved properties
ATE336514T1 (de) * 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
WO2001062298A2 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US6946134B1 (en) * 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001088117A2 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Neose Technologies, Inc. In vitro fucosylation recombinant glycopeptides
PT1294401E (pt) * 2000-06-29 2007-11-09 Merck Patent Gmbh Aumento das respostas imunológicas mediadas por proteínas de fusão anticorpo-citoquina por tratamento combinado com agentes que aumentam a captação de imunocitoquinas
HUP0401300A3 (en) * 2001-01-18 2005-06-28 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
CA2438652A1 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
EP1361891A2 (en) * 2001-02-19 2003-11-19 MERCK PATENT GmbH Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
KR20090010127A (ko) 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DK1383785T3 (da) 2001-05-03 2011-05-23 Merck Patent Gmbh Rekombinant tumorspecifikt antistof og anvendelse deraf
US7371371B2 (en) 2001-08-13 2008-05-13 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
ATE542137T1 (de) * 2001-12-04 2012-02-15 Merck Patent Gmbh Immunocytokine mit modulierter selektivität
AU2002316574B2 (en) 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US6996009B2 (en) * 2002-06-21 2006-02-07 Micron Technology, Inc. NOR flash memory cell with high storage density
WO2004055056A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
DE602004013372T2 (de) * 2003-12-30 2009-07-02 Merck Patent Gmbh Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung
RU2370276C2 (ru) 2003-12-31 2009-10-20 Мерк Патент Гмбх Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ
ES2330860T3 (es) 2004-01-22 2009-12-16 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anticancerosos con fijacion del complemento reducida.
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CN101072793B (zh) * 2004-12-09 2012-06-20 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的il-7变体
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
PT1966238E (pt) * 2005-12-30 2012-07-31 Merck Patent Gmbh Uso de hsp70 como um regulador de atividade enzimática
DK1966244T3 (da) 2005-12-30 2012-04-23 Merck Patent Gmbh Anti-il-6-antistoffer der forebygger bindingen af il-6 sammensat af il-6ralfa til gp130
KR101397290B1 (ko) 2005-12-30 2014-05-21 메르크 파텐트 게엠베하 감소한 면역원성을 가지는 항-ｃｄ19 항체
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
EP2038417A2 (en) * 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses

Also Published As

Publication number Publication date
US7973150B2 (en) 2011-07-05
EP2311882A1 (en) 2011-04-20
CN100488984C (zh) 2009-05-20
RU2003129523A (ru) 2005-04-20
US7601814B2 (en) 2009-10-13
AU2002306976B2 (en) 2008-01-03
EP1373301A2 (en) 2004-01-02
HUP0303753A2 (hu) 2004-03-01
WO2002079415A2 (en) 2002-10-10
RU2333919C2 (ru) 2008-09-20
EP1373301A4 (en) 2005-12-21
WO2002079232A3 (en) 2002-12-12
US6992174B2 (en) 2006-01-31
JP4638129B2 (ja) 2011-02-23
PL366826A1 (pl) 2005-02-07
BR0208207A (pt) 2004-09-28
US20150141626A1 (en) 2015-05-21
ES2356620T3 (es) 2011-04-11
MXPA03008715A (es) 2003-12-11
ATE490262T1 (de) 2010-12-15
US20030166877A1 (en) 2003-09-04
US20060025573A1 (en) 2006-02-02
US20100016562A1 (en) 2010-01-21
US20120309936A1 (en) 2012-12-06
JP2010222380A (ja) 2010-10-07
PT1373301E (pt) 2011-03-07
EP1373301B1 (en) 2010-12-01
US8926973B2 (en) 2015-01-06
DK1373301T3 (da) 2011-01-31
DE60238472D1 (de) 2011-01-13
JP2004532020A (ja) 2004-10-21
KR20030087040A (ko) 2003-11-12
CA2442363A1 (en) 2002-10-10
CA2442363C (en) 2013-10-29
WO2002079232A2 (en) 2002-10-10
ZA200308430B (en) 2004-09-03
CN1531545A (zh) 2004-09-22
JP5291671B2 (ja) 2013-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL209110B1 (pl) Sposób obniżania immunogenności białka fuzyjnego, białko fuzyjne otrzymane takim sposobem, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i kodujący je kwas nukleinowy
AU2002306976A1 (en) Reducing the immunogenicity of fusion proteins
JP4937132B2 (ja) 免疫原性の低下したｉｌ−７変種
US7615615B2 (en) Modified interferon beta with reduced immunogenicity
KR20030074784A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 에리트로포이에틴 (ｅｐｏ)
KR20030081479A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 인터페론 알파
KR20030074790A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 인터루킨-1 수용체길항제(ｉｌ-1ｒａ)
US7392141B2 (en) Method of preparing a modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) with reduced immunogenicity
KR20030077632A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 트롬보포이에틴
AU2002256681A1 (en) Modified interferon beta with reduced immunogenicity
AU2002257579A1 (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) with reduced immunogenicity