PT1373301E - Redução da imunogenicidade de proteínas de fusão - Google Patents

Redução da imunogenicidade de proteínas de fusão Download PDF

Info

Publication number
PT1373301E
PT1373301E PT02757870T PT02757870T PT1373301E PT 1373301 E PT1373301 E PT 1373301E PT 02757870 T PT02757870 T PT 02757870T PT 02757870 T PT02757870 T PT 02757870T PT 1373301 E PT1373301 E PT 1373301E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
ser
thr
leu
pro
ala
Prior art date
Application number
PT02757870T
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen D Gillies
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of PT1373301E publication Critical patent/PT1373301E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

1
DESCRIÇÃO "REDUÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DE PROTEÍNAS DE FUSÃO"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se em geral a métodos e composições para a produção e utilização de proteínas de fusão modificadas com imunogenicidade reduzida ou sem imunogenicidade como agentes terapêuticos. Mais especificamente, a invenção refere-se a proteínas de fusão, tornadas menos imunogénicas através da identificação de epítopos de células T candidatos e modificação da sequência de aminoácidos para eliminar tais epítopos.
Antecedentes da Invenção
Muitas proteínas terapêuticas são proteínas humanas normais. Por exemplo, a interleucina-2, a eritropoietina e a hormona de crescimento são todas proteínas humanas que são dadas a humanos que já produzem normalmente níveis endógenos destas proteínas. Em geral, as respostas imunológicas contra proteínas humanas completamente normais são raras quando estas proteínas são utilizadas como agentes terapêuticos.
Recentemente tornou-se evidente que muitas proteínas de fusão com actividades artificiais são úteis como proteínas terapêuticas. Por exemplo, a Enbrel é uma fusão do domínio extracelular de um receptor de TNF com uma região Fc de IgGl. A Enbrel é utilizada para tratar artrite reumatóide, e pensa-se que funciona por titulação do TNF e prevenção da acção do TNF. No entanto, foi observada uma incidência significativa de anticorpos anti-Enbrel em doentes tratados com Enbrel. 2
Um outro exemplo de uma classe de proteínas de fusão terapeuticamente úteis é as imunocitoquinas. Estas proteínas incluem uma unidade anticorpo e uma unidade citoquina, e são úteis para o direccionamento de citoquinas para células doentes, como as células cancerosas. No entanto, a utilização terapêutica de muitas destas proteínas de fusão está limitada devido à sua imunogenicidade em mamíferos, especialmente em seres humanos. A WO 02/066514 divulga proteínas de fusão de imunocitoquinas com imunogenicidade reduzida, em que a região de junção entre a molécula de Ig e a citoquina também pode ser menos imunogénica eliminando os epítopos de células T dessa região. No entanto, este documento não ensina modificações específicas dentro da referida região de junção. A WO 00/34317 ensina um conceito geral de redução da imunogenicidade de proteínas através da identificação e modificação de epítopos de células T. No entanto, este documento é omisso no que se refere a proteínas de fusão.
Por conseguinte, existe uma necessidade para gerar proteínas de fusão com imunogenicidade reduzida a fim de utilizar estas proteínas em terapia.
Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a métodos e composições úteis para a produção de proteínas de fusão com imunogenicidade reduzida para utilização em terapia. Por exemplo, a invenção refere-se a proteínas de fusão de imunocitoquinas, imunofusinas, imunoligandos, outros anticorpos e Fc, 3 proteínas de fusão citoquina-citoquina e proteínas de fusão de albumina com imunogenicidade reduzida. A invenção refere-se, em parte, à observação de que as proteínas de fusão contêm sequências que são "estranhas." Por exemplo, mesmo numa fusão entre duas proteínas humanas, a região que circunda a junção de fusão compreende uma sequência peptídica que não está normalmente presente no corpo humano. Por exemplo, um fármaco proteico como a Enbrel é derivado de proteínas humanas normais: receptor de TNF e IgGl. No entanto, a junção entre o receptor de TNF e a IgGl é uma sequência peptídica que não está normalmente presente no corpo humano.
Os métodos preferidos da invenção envolvem a redução da imunogenicidade de uma proteína de fusão reduzindo a capacidade de um epítopo da junção (péptido da junção) para interagir com um receptor de células T reduzindo a sua capacidade para se ligar (a sua afinidade de ligação) a moléculas de MHC. De acordo com a invenção, o epítopo ou péptido da junção é preferencialmente "estranho." Em geral, as proteínas, incluindo as proteínas terapêuticas, são imunogénicas, em parte porque as proteínas são incorporadas por endocitose por células apresentadoras de antigénio e sujeitas a proteólise, e os péptidos resultantes ligam-se a moléculas designadas por complexo principal de histocompatibilidade (MHC) que apresentam os péptidos a células T. 0 complexo péptido antigénico - MHC na superfície de uma célula apresentadora de antigénio (APC) activa as células T a proliferar, diferenciar-se e libertar citoquinas. Paralelamente é induzida a diferenciação de células B e a produção de anticorpos, o que pode limitar ainda mais a eficácia da proteína terapêutica devido a eliminação. Assim, o péptido antigénico, se for derivado de uma proteína terapêutica, é capaz de induzir uma série de 4 respostas imunológicas indesejadas. A eficácia da proteína terapêutica está restringida devido a titulação por anticorpos, e a indução de respostas de células T e células B é frequentemente prejudicial devido a reacções inflamatórias e alérgicas no doente. A invenção proporciona (1) a identificação de novas sequências de aminoácidos na região da junção de imunoglobulina - proteína alvo com um ou mais epítopos de células T candidatos; e (2) a modificação destas sequências de aminoácidos para reduzir ou eliminar a presença de péptidos, derivados da sequência da junção, que actuam como epítopos de células T. A invenção proporciona duas classes gerais de composições e métodos relacionados com a redução de imunogenicidade. De acordo com uma forma de realização da invenção, são identificados potenciais epítopos de células T estranhos em sequências que abarcam uma junção de fusão. Por exemplo, os potenciais epítopos de células T estranhos são identificados por métodos computacionais com base na modelação da ligação do péptido às moléculas de MHC de
Classe II. Em seguida são feitas substituições para que a capacidade dos péptidos derivados da região de junção para se ligarem ao MHC de Classe II seja reduzida ou eliminada. Este processo de identificação e modificação de péptidos que se ligam ao MHC de Classe II é designado "desimunização" e as moléculas proteicas modificadas resultantes são designadas "desimunizadas."
De acordo com outra forma de realização da invenção são introduzidos um ou mais sítios de glicosilação numa junção de fusão. É preferencialmente utilizado um sítio de glicosilação ligado a N, embora também se possa utilizar um 5 sítio de glicosilação ligado a 0. De acordo com uma forma de realização preferida, os aminoácidos numa região de junção que circunda uma junção de fusão da sequência de tipo selvagem são mutados de modo a que o último aminoácido do parceiro de fusão N-terminal seja mutado para uma asparagina, e os primeiros dois aminoácidos do segundo parceiro de fusão sejam mutados para uma glicina seguida de uma serina ou uma treonina.
De acordo com a invenção, a remoção da ligação ao MHC de Classe II é preferida em situações em que uma proteína é para ser produzida em bactérias ou em um organismo que não gere um padrão de glicosilação de mamífero, como as leveduras ou células de insectos. A introdução de sítios de glicosilação pode ser preferida quando a proteína é para ser produzida numa linha de células de mamífero ou numa linha de células que cria um padrão de glicosilação que é inócuo para mamíferos.
Numa forma de realização preferida, um componente da proteína de fusão é uma citoquina. 0 termo "citoquina" é aqui utilizado para descrever proteínas naturais ou recombinantes, seus análogos e seus fragmentos que desencadeiam uma resposta específica numa célula que possui um receptor para essa citoquina. Preferencialmente, as citoquinas são proteínas que podem ser produzidas e excretadas por uma célula. Preferencialmente, as citoquinas incluem interleucinas como as interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, II-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 e IL-18, factores hematopoiéticos como o factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), G-CSF e eritropoietina, factores de necrose de tumores (TNF) como o TNFa, linfocinas como a linfotoxina, 6 reguladores de processos metabólicos como a leptina, e interferões como o interferão a, interferão β e interferão γ e quimiocinas. Preferencialmente, a proteína de fusão anticorpo-citoquina da presente invenção exibe uma actividade biológica específica para a citoquina.
Noutra forma de realização, um componente da proteína de fusão é uma citoquina antiobesidade. Por exemplo, um componente é leptina, CNTF ou uma porção de Acrp30.
Numa forma de realização alternativa, um componente da proteína de fusão é uma hormona. Por exemplo, um componente pode ser insulina, hormona de crescimento ou péptido 1 tipo glucagina (GLP-1).
Ainda numa outra forma de realização alternativa, um componente da proteína de fusão é uma proteína de ligação a ligando com actividade biológica. Numa forma de realização é utilizado um domínio extracelular do receptor de TNF.
De acordo com uma série de formas de realização, uma proteína de fusão da invenção compreende a extremidade N-terminal de uma unidade não anticorpo fundida com a extremidade C-terminal de uma unidade de anticorpo. De acordo com outra série de formas de realização, uma proteína de fusão da invenção compreende a extremidade C-terminal de uma unidade não anticorpo fundida com a extremidade N-terminal de uma unidade de anticorpo. De acordo com a invenção, uma unidade de anticorpo pode ser uma imunoglobulina intacta ou uma porção de uma imunoglobulina intacta. Uma porção de uma imunoglobulina pode incluir uma região variável ou uma região constante ou ambas. As imunoglobulinas preferidas incluem regiões Fc ou porções destas. Uma forma de realização preferida da invenção inclui um isotipo de imunoglobulina IgGl, ou uma 7 porção deste, modificado para ser menos imunogénico e/ou para ter uma maior semivida no soro. Por exemplo, é preferida uma IgGl com modificação de resíduos de aminoácidos próximos da junção CH3 - citoquina. Para determinadas aplicações são preferidas unidades anticorpo dos isotipos IgG2 ou IgG4.
As imunocitoquinas são apenas um exemplo de uma terapia de proteínas de fusão dirigidas para tumores. Outras moléculas tóxicas para tumores também podem ser dirigidas para tumores por fusão com anticorpos específicos para tumores. Além disso, as proteínas de fusão de anticorpo podem atacar outros tipos de células doentes, como as células infectadas por vírus. Outra abordagem para manipular proteínas de fusão dirigidas tem sido a utilização de tecnologia Fc-X e X-Fc em que X é um polipéptido. Estas tecnologias utilizam o conhecimento de que a produção e colheita de uma proteína alvo é melhorada se o polipéptido de interesse estiver ligado à porção Fc de uma imunoglobulina. Para proteínas de fusão Fc-X, um péptido sinal, seguido do fragmento Fc de um gene de imunoglobulina é o parceiro de fusão N-terminal com a proteína alvo. Nalguns casos, é especificamente vantajoso manipular uma proteína de fusão na orientação X-Fc. Com estas construções, a proteína alvo é a proteína de fusão N-terminal e segue-se-lhe o fragmento Fc. Para algumas proteínas, esta abordagem é útil, como foi demonstrado com a glicoproteína da superfície celular de linfócitos (LHR) (Patente US 5,428,130) e o péptido tipo glucagina (GLP-1) .
Por conseguinte, os métodos e as composições da invenção proporcionam formas de proteínas de fusão Fc-X e X-Fc com imunogenicidade reduzida. De acordo com a invenção, a imunogenicidade de uma proteína de fusão pode ser avaliada segundo um método conhecido na técnica ou aqui descrito.
Os métodos e as composições da invenção também proporcionam proteínas de fusão de albumina com imunogenicidade reduzida. A albumina de soro humano (HSA), devido à sua semivida notavelmente longa, à sua distribuição vasta in vivo e à ausência de funções enzimáticas ou imunológicas, tem sido utilizada como um veículo para péptidos/proteínas terapêuticos (Yeh et al, PNAS 89:1904-1908, 1992). Uma fusão genética de um péptido bioactivo com a HSA é útil para recuperar um derivado terapêutico de HSA segregado. No entanto, de acordo com a invenção, as proteínas de fusão de albumina como a HSA-CD4 têm uma junção nova que contém geralmente um ou mais epítopos de células T capazes de serem apresentados por moléculas de MHC de Classe II. A invenção proporciona formas menos imunogénicas de proteínas de fusão de albumina, e métodos gerais para a redução da imunogenicidade de proteínas de fusão de albumina. De acordo com a invenção, as proteínas de albumina úteis incluem espécies, variantes alélicas e mutantes de albumina, incluindo seus fragmentos. As proteínas de albumina preferidas retêm as propriedades estruturais e funcionais de uma proteína de albumina de tipo selvagem como a HSA.
Noutro aspecto, a invenção proporciona proteínas de fusão de anticorpo desimunizadas com isotipos normais, mutantes ou híbridos que compreendem mutações úteis. Estas mutações podem estar próximas da junção ou em posições distintas da região da junção.
Por exemplo, a invenção proporciona uma imunocitoquina desimunizada, modificada na junção, com uma mutação pontual na junção entre as unidades de IgG e não IgG. A unidade de citoquina inclui qualquer citoquina, mas preferencialmente IL-2 ou IL-12. Numa forma de realização, a alteração de 9 aminoácido envolve a alteração da lisina C-terminal da unidade de anticorpo para um aminoácido hidrófobo tal como alanina ou leucina. Uma vantagem chave de combinar tais mutações com uma modificação desimunizante da invenção é que as mutações actuam em conjunto para aumentar a semivida no soro e para diminuir a imunogenicidade. Os métodos aqui descritos para combinar a desimunização de uma junção de fusão com uma mutação de alteração da semivida no soro são úteis para melhorar significativamente a eficácia clinica destas proteínas de fusão.
Noutro aspecto, a invenção proporciona imunocitoquinas compreendendo uma unidade híbrida de anticorpo que inclui domínios de isotipos diferentes de Ig, preferencialmente de ambos os isotipos IgGl e IgG2, e uma modificação desimunizante na junção de fusão. Por exemplo, a invenção proporciona uma imunocitoquina modificada na junção, desimunizada utilizando uma IgG2 e um híbrido de IgG2h (IgG2 modificada na região charneira com IgGl). Numa forma de realização preferida, a proteína de fusão híbrida consiste de uma unidade de imunoglobulina desimunizada constituída por uma IgG (yl:CHl-H) (γ2: CH2-CH3) e uma unidade de citoquina.
Noutro aspecto, a invenção proporciona novas sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão com imunogenicidade reduzida ou que facilitam a expressão, produção e secreção de proteínas de fusão com imunogenicidade reduzida. Tais ácidos nucleicos são gerados de acordo com técnicas correntes de ADN recombinante.
Numa forma de realização preferida, uma molécula de ácido nucleico codifica uma proteína de fusão de imunocitoquina. Uma imunocitoquina preferida inclui uma citoquina, por 10 exemplo, Interleucina 2, e um anticorpo monoclonal especifico contra um tumor como um anticorpo contra a molécula de adesão de células epiteliais humanas KSA (EP-CAM)(huKS).
Noutra forma de realização preferida, as moléculas de ácido nucleico codificam proteínas de fusão de Fc em várias configurações. A molécula de ácido nucleico codifica sequencialmente numa orientação de 5' para 3', (i) uma sequência sinal, uma região Fc de imunoglobulina e uma sequência da proteína alvo ou (ii) uma sequência sinal, uma proteína alvo e uma região Fc de imunoglobulina. Desse modo, a molécula de ácido nucleico resultante codifica uma estrutura Fc-X ou X-Fc em que X e Y são uma proteína alvo. Numa forma de realização alternativa, um ácido nucleico codifica uma proteína Fc-X ou X-Fc sem uma sequência sinal.
Noutra forma de realização preferida, um ácido nucleico da invenção codifica uma proteína de fusão de Ig com isotipos mutantes ou híbridos. Especificamente, o ácido nucleico proporciona unidades anticorpo com isotipos híbridos ou, alternativamente, com regiões charneira alteradas. Por exemplo, a proteína de fusão consiste de uma IgG2, modificada de modo a conter menos ligações dissulfureto na região charneira, ou uma região CH2 e CH3 de IgG2 na qual a região charneira é proveniente de outro anticorpo, preferencialmente uma região charneira de IgGl normal ou mutante.
Um ácido nucleico da invenção é preferencialmente incorporado em associação operativa num vector de expressão replicável que é então introduzido numa célula hospedeira de mamífero competente para produzir a proteína de fusão. A proteína de fusão resultante é produzida eficientemente e 11 segregada da célula hospedeira de mamífero. A proteína de fusão segregada é subsequentemente recolhida dos meios de cultura sem lise da célula hospedeira de mamífero. 0 produto proteico é avaliado em relação à actividade e/ou purificado utilizando reagentes comuns consoante desejado, e/ou dissociado do parceiro de fusão, tudo isto utilizando técnicas convencionais.
Assim, a invenção também proporciona métodos de produção de proteínas de fusão com imunogenicidade reduzida.
Os métodos e as composições da invenção também são úteis para proporcionar um tratamento terapêutico utilizando uma proteína de fusão que foi tornada menos imunogénica. Um objecto global da invenção é proporcionar processos que são eficientes e baratos, bem como proteínas que são menos imunogénicas. As composições terapêuticas preferidas da invenção incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de fusão desimunizada. Preferencialmente, a proteína de fusão desimunizada é administrada juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 precedente e outros aspectos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada, desenhos e reivindicações que se seguem.
Descrição Detalhada da Invenção
Todas as proteínas, incluindo os anticorpos, que são administradas a um doente para utilização terapêutica têm o potencial de induzir uma resposta imunológica no hospedeiro receptor. Esta resposta imunológica é mediada por linfócitos T (células T) que depois activam os linfócitos B (células B) para produzir anticorpos. A produção de 12 anticorpos contra o agente terapêutico é prejudicial uma vez que conduz a uma eliminação mais rápida do agente terapêutico e pode induzir uma resposta alérgica. A presente invenção proporciona métodos de redução da imunogenicidade de proteínas de fusão. De acordo com um método desta invenção, os epítopos de células T potenciais são identificados na região de junção de uma junção de fusão numa proteína de fusão. Os epítopos de células T são identificados por uma diversidade de métodos computacionais e não computacionais, incluindo a previsão assente na modelação computacional com base na estrutura ou por síntese de péptidos e avaliação em relação à ligação com moléculas de MHC de Classe II específicas ou num ensaio de imunogenicidade.
De acordo com a invenção, uma junção de fusão é definida como a posição entre o último aminoácido (C-terminal) de uma primeira proteína ou péptido e o primeiro aminoácido (N-terminal) de uma segunda proteína ou péptido numa proteína de fusão. Por conseguinte, uma junção de fusão inclui quaisquer aminoácidos entre o último aminoácido de uma proteína e o primeiro aminoácido de uma segunda proteína. Numa forma de realização, a junção de fusão inclui um grupo de ligação.
De acordo com a invenção, a região de junção é a região de uma proteína de fusão que circunda ou abarca a junção de fusão entre duas proteínas. A região de junção inclui preferencialmente entre 1 e cerca de 100 aminoácidos, mais preferencialmente entre 1 e cerca de 50 aminoácidos, ou entre 1 e cerca de 25 aminoácidos, e ainda mais preferencialmente entre 1 e cerca de 15 aminoácidos, ou entre 1 e 9 aminoácidos. Numa forma de realização, a região 13 de junção compreende um péptido espaçador ou de ligação inserido no ponto de junção entre as duas proteínas. De acordo com a invenção, a região de junção incluindo um péptido espaçador ou de ligação também pode ser desimunizada para minimizar a resposta de um doente a uma proteína de fusão incluindo o grupo espaçador ou de ligação.
De acordo com a invenção, um epítopo de células T da junção é definido como uma sequência peptídica capaz de ligar um MHC de Classe II contendo pelo menos um aminoácido derivado de cada uma de, pelo menos, duas proteínas parceiras de fusão diferentes. Por exemplo, Paul (Fundamental Immunology, Capítulo 8, Quadro 8, p. 276 [2000] 4th ed.) ilustra segmentos de 10 aminoácidos que se podem ligar a uma molécula de MHC de Classe II. Num epítopo de células T da junção, estes péptidos de 10 aminoácidos são provenientes dos diferentes parceiros de fusão. De acordo com a invenção um epítopo de células T potencial ou candidato que abarca uma junção de fusão (um epítopo de células T da junção candidato) inclui preferencialmente 1 a 8 aminoácidos de qualquer um dos lados da junção, e mais preferencialmente 1 a 10 ou 1 a 11 aminoácidos de qualquer um dos lados da junção. Os epítopos candidatos têm preferencialmente 9, 11, ou 12 aminoácidos de comprimento. Por conseguinte, uma vez que um epítopo de células T da junção da invenção inclui pelo menos um aminoácido de cada um dos lados da junção, os epítopos de células T candidatos preferidos são epítopos da junção que incluem 1-8 (ou 1-10, ou 11) aminoácidos de um lado da junção e também incluem um número complementar de aminoácidos do outro lado da junção para originar um epítopo com 9-12 aminoácidos, e muito preferencialmente 9 aminoácidos. 14
De acordo com a invenção, os resíduos de ancoragem num epítopo de células T da junção são então mutados para impedir a ligação a uma molécula de MHC de Classe II. Em geral, é tomado cuidado para não introduzir potenciais epítopos de células T adicionais e para conservar a função de cada parceiro de fusão.
De acordo com a invenção, uma fusão de sequências de tipo selvagem é uma fusão em que as sequências nos lados N-terminal e C-terminal da junção de fusão são directamente provenientes de sequências naturais.
De acordo com a invenção, uma junção de fusão desimunizada é uma sequência de junção em que foram introduzidas uma ou mais mutações de substituição em relação a uma junção de sequências de tipo selvagem. Numa forma de realização muito preferida, a desimunização de uma junção de fusão não envolve a introdução de um grupo de ligação, tal como um grupo de ligação de Gly-Ser 'não imunogénico', e a relação espacial entre os parceiros de fusão não está alterada numa proteína de fusão desimunizada. De acordo com a invenção, um ou mais aminoácidos podem estar substituídos ou alterados na região de junção quer em posição N-terminal em relação à junção de fusão, em posição C-terminal em relação à junção de fusão, ou em posição N-terminal e C-terminal em relação à junção de fusão.
De acordo com a invenção, um epítopo de células T potencial é uma sequência que, quando considerada como um péptido isolado, se prevê que se ligue a uma molécula de MHC de Classe II ou a um equivalente de uma espécie não humana. Um epítopo de células T potencial é definido sem serem considerados outros aspectos do processamento de antigénios, como a eficiência de captação da proteína para células apresentadoras de antigénio, a eficiência de 15 dissociação em sítios de uma proteína intacta para produzir um péptido que se pode ligar ao MHC de Classe II, e assim por diante. Assim, o conjunto de epítopos de células T que são realmente apresentados no MHC de Classe II após administração de uma proteína a um animal é um subconjunto dos epítopos de células T potenciais.
De acordo com a invenção, um epítopo de células T é um epítopo numa proteína que interage com uma molécula de MHC de Classe II. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, entende-se que um epítopo de células T é uma sequência de aminoácidos numa proteína ou uma proteína de fusão, que não conseguiu sofrer o processo negativo de selecção de células T durante o desenvolvimento de células T e, por conseguinte, será de esperar que seja apresentado por uma molécula de MHC de Classe II e reconhecido por um receptor de células T. Numa forma de realização preferida da invenção, os epítopos de células T estranhos estão presentes na região de junção na junção de fusão de duas proteínas que formam uma proteína de fusão. A invenção proporciona métodos não computacionais para reduzir ou eliminar o número de epítopos de células T numa junção da proteína de fusão sem que sejam necessárias simulações computacionais elaboradas ou estruturas tridimensionais da proteína. Numa forma de realização, um método da invenção tira partido do facto de um segmento central de nove aminoácidos interagir com a molécula de MHC de Classe II, bem como com o receptor de células T durante a apresentação do antigénio. 0 aminoácido mais N-terminal é designado um resíduo da posição "âncora" que se liga a uma cavidade profunda na molécula de MHC de Classe II. Um dos aminoácidos seguintes está tipicamente presente na posição âncora que é importante para a ligação a uma molécula de 16 MHC de Classe II: Leucina, Valina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina e Triptofano. De acordo com a invenção, uns 2 a 3 aminoácidos adicionais adjacentes aos 9 aminoácidos centrais também afectam a interacção com as moléculas de MHC. Além disso, o aminoácido mais C-terminal na primeira proteína da proteína de fusão pode ser geralmente substituído. Isto é especialmente útil quando o parceiro de fusão N-terminal ou a primeira proteína é conhecido por ser activo quando fundido com o parceiro de fusão C-terminal ou com a segunda proteína na extremidade C-terminal da primeira proteína.
Um método geral da invenção inclui a mutação de quaisquer Leucinas, Valinas, Isoleucinas, Metioninas, Fenilalaninas, Tirosinas ou Triptofanos que ocorrem nos oito aminoácidos mais C-terminais de um parceiro de fusão N-terminal de uma proteína de fusão. Numa forma de realização, um ou mais destes aminoácidos nos aminoácidos de um epítopo de células T da junção candidato é preferencialmente mutado para uma treonina, uma Alanina ou uma Prolina. Isto retém alguma da natureza hidrofóbica do aminoácido que é substituído. Noutras formas de realização da invenção, um ou mais dos aminoácidos supramencionados são suprimidos de um epítopo de células T da junção candidato ou potencial, ou são substituídos por um análogo de aminoácido apropriado. De acordo com a invenção, se um aminoácido é suprimido para destruir um epítopo de células T potencial, é tomado cuidado para não gerar um novo epítopo de células T que inclua aminoácidos próximos da supressão.
De acordo com a invenção, é frequentemente útil construir um construção de plasmídeo de expressão generalizada intermediária compreendendo a sequência de codificação para um parceiro de fusão N-terminal contendo uma mutação de um 17 ou mais resíduos hidrófobos nos últimos oito aminoácidos. Em geral, um tal plasmídeo tem um ou mais sítios de enzimas de restrição convenientes no, ou próximo do, ADN que codifica a extremidade C-terminal do parceiro de fusão N-terminal. A finalidade de uma construção de plasmídeo intermediária é a de construir plasmídeos de expressão que codificam uma proteína de fusão em que um ou mais parceiros de fusão N-terminais têm uma ou mais substituições de uma Leucina, Valina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina ou Triptofano por outro aminoácido nos oito aminoácidos C-terminais. A construção de tais plasmídeos de expressão finais pode ser efectuada por uma variedade de outros métodos bem conhecidos na técnica, como a geração de fragmentos de PCR ou ácido nucleicos sintéticos, seguida de ligação do fragmento num vector apropriado ou ligação com outras sequências através de técnicas de PCR bem conhecidas. 1,
Formas de realização preferidas específicas incluem plasmídeos de fusão Fc-X, plasmídeos de fusão albumina-X, plasmídeos de fusão scFv-X e plasmídeos de fusão Fab-X. No caso do Fc(gama)-X, é útil introduzir mutações na sequência de codificação para provocar substituições de aminoácidos no segmento de Leucina-Serina-Leucina-Serina próximo da extremidade C-terminal da região Fc de uma molécula de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4, como aqui representado em diagrama para a IgGl: As sequências de aminoácidos das regiões Fc humanas derivadas das IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 são representadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3 e 4, respectivamente. 18
Num exemplo, a KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5) é alterada para KSATATPGK (SEQ ID NO: 6) . Esta mutação é concebida para eliminar potenciais epitopos de células T da junção e também para remover um epitopo de células T em que a Fenilalanina ou Tirosina a montante serve como um resíduo âncora na posição 1.
Alternativamente, é por vezes útil combinar mutações que removem epitopos de células T da junção candidatos com uma mutação que prolonga a semivida no soro. Por exemplo, alterando a KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5) para KSATATPGA (SEQ ID NO: 7) .
Outras formas de realização incluem substituições no segmento LSLS para outros aminoácidos como a Glicina ou Prolina.
No caso de vectores de expressão utilizados para preparar proteínas de fusão de IgA, é útil suprimir alguns dos aminoácidos C-terminais, de modo a que a cisteína próxima da extremidade C-terminal que está envolvida na oligomerização da IgA seja suprimida. Por exemplo, podem ser suprimidos quinze aminoácidos, de modo a que a sequência da cadeia pesada de IgA termine com Prolina-Treonina-Histidina antes de ser fundida com uma segunda proteína. Além disso, é útil introduzir as seguintes alterações próximo de uma extremidade C-terminal do domínio CH3 da região Fc da IgA: QKTIDRLAGKPTH (SEQ ID NO: 8) alterada para QKTADRTAGKPTH (SEQ ID NO: 9) São sequências desimunizadas adicionais numa proteína de fusão IgA-X, QKTPTRTAGKPTH (SEQ ID NO: 10) QKTPTRPAGKPTH (SEQ ID NO: 11) QKTATRPAGKPTH (SEQ ID NO: 12). 19
No caso de uma fusão albumina-X, é útil introduzir as seguintes alterações num plasmideo de expressão albumina-X para que a extremidade C-terminal da albumina seja modificada do seguinte modo: KKLVMSQMLGL (SEQ ID NO: 13) alterada para KKLVMSQMTTA (SEQ ID NO: 14) .
Assim, a invenção proporciona sequências de ácido nucleico e proteínas que são úteis na construção de proteínas de fusão menos imunogénicas. Especificamente, a invenção proporciona proteínas com mutações de quaisquer Leucinas, Valinas, Isoleucinas, Metioninas, Fenilalaninas, Tirosinas, ou Triptofanos nos últimos oito aminoácidos. As proteínas são preferencialmente proteínas humanas com sequências que correspondem, em geral, a sequências presentes no corpo humano. A invenção também proporciona sequências de ácido nucleico que codificam tais proteínas. As sequências de ácido nucleico para este aspecto da invenção podem existir como plasmídeos, fragmentos gerados por PCR ou ácidos nucleicos produzidos por síntese química. A invenção também proporciona plasmídeos de expressão que codificam uma proteína de fusão em que um ou mais parceiros de fusão N-terminais têm uma ou mais mutações de uma Leucina, Valina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina ou Triptofano por outro aminoácido nos oito aminoácidos C-terminais.
Por exemplo, são proporcionados pela invenção plasmídeos que codificam uma proteína de fusão Fc-IL2 ou anticorpo completo-IL2 em que a região Fc está mutada como descrito acima. Além disso, são proporcionadas pela invenção fusões compreendendo uma região Fc mutada como descrito acima com 20 formas normais ou mutadas de eritropoietina, como as formas de eritropoietina descritas em WO01/36489. A invenção também proporciona um método de redução da imunogenicidade de uma junção da proteína de fusão através da introdução de um sítio de glicosilação ligado a N ou ligado a O próximo, ou preferencialmente, em uma junção de fusão. Por exemplo, os aminoácidos Asparagina, Serina ou Treonina, e um terceiro resíduo são introduzidos como se segue. Considere-se uma sequência em que os X representam aminoácidos de um parceiro de fusão N-terminal e os Z representam aminoácidos de um parceiro de fusão C-terminal. XÍX2X3X4X5X6Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9
XiX2X3X4X5NGSZ3Z4Z5Z6Z7Z8Z9
De acordo com este método, a ligação de um péptido da junção não é necessariamente bloqueada pela introdução do sítio de glicosilação. No entanto, qualquer péptido que esteja ligado na cavidade do MHC de Classe II e possua a asparagina glicosilada na extremidade C-terminal em relação ao resíduo de maior ancoragem na extremidade N-terminal não funcionará como um epítopo de células T. A presença da unidade de glicosilação grande impedirá estericamente o reconhecimento do complexo MHC de Classe II/péptido. Um sítio de glicosilação preferido inclui a sequência Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que X é preferencialmente Gly, mas pode ser qualquer aminoácido.
Além disso, a introdução de mutações que introduzem resíduos de Glicina e Serina não criam novos epítopos de células T. Nem a Glicina nem a Serina podem actuar como um resíduo de ancoragem. Durante o processamento do antigénio, uma proteína de fusão é, em princípio, dissociada entre a Asparagina glicosilada e a Glicina ou entre a Glicina e a 21
Serina. Em quaisquer dos casos, os péptidos têm os resíduos mutantes de Glicina e/ou Serina em posição N-terminal em relação ao resíduo de ancoragem e, desse modo, os resíduos mutantes de Glicina e/ou Serina não são reconhecidos por um receptor de células T, uma vez que os resíduos N-terminais em relação ao resíduo de ancoragem estão fora da região reconhecida pelo TCR.
Numa variação deste método, uma região da junção de fusão já contém uma Serina ou Treonina precedida de um resíduo de aminoácido como Glicina, Serina, Alanina, etc. 0 segundo método é preferencialmente utilizado quando uma região de junção é flexível e está deslocada do núcleo hidrófobo de cada parceiro de fusão, de modo a que a nova glicosilação ligada por N não interfere com a dobragem ou função de qualquer um dos parceiros de fusão. É uma questão simples e directa para os especialistas na técnica da engenharia de proteínas determinar quando é exequível a introdução de um sítio de glicosilação. Por exemplo, pode ser conhecida a estrutura tridimensional de cada parceiro de fusão ou de homólogos próximos dos parceiros de fusão. É muitas vezes o caso de que alguns aminoácidos na extremidade N-terminal ou C-terminal de uma proteína não estão resolvidos numa estrutura de raios X ou exibem muitas conformações possíveis numa estrutura de RMN. Em casos em que três ou mais aminoácidos estão desordenados em qualquer um dos lados de um sítio de glicosilação, existe alguma confiança de que a proteína de fusão resultante se dobrará correctamente e que ambos os parceiros serão activos. É necessária alguma experimentação de rotina para determinar se uma dada construção de proteína de fusão será funcional. 22
Em formas de realização preferidas da invenção, tanto o parceiro N-terminal como o parceiro C-terminal da proteína de fusão são proteínas humanas. Os epítopos de células T potenciais em tais proteínas de fusão são criados a partir dos 8 aminoácidos finais do parceiro N-terminal (primeira proteína) combinados com os primeiros 8 aminoácidos do parceiro C-terminal (segunda proteína). Isto proporciona uma série de 8 nonâmeros híbridos gerados a partir das primeira e segunda proteínas. Qualquer resíduo alifático ou aromático (Leucina, Valina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Triptofano ou Tirosina) nos últimos 8 aminoácidos da primeira proteína apresenta um risco elevado de criar um péptido de ligação ao MHC com o aminoácido na primeira posição (posição âncora) gue se liga à cavidade da molécula de MHC. Portanto, a substituição de qualquer um dos aminoácidos supramencionados por um aminoácido que não seja um dos aminoácidos supramencionados, e preferencialmente por Alanina, Prolina ou Treonina, removerá um candidato a epítopo de células T.
Por exemplo, no caso de uma proteína de fusão de Fc contendo a sequência: HNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGS (SEQIDNO: 15), os resíduos de leucina criam dois epítopos potenciais. Portanto, a sequência pode ser desimunizada como; HNHYTQKSATATPGKGGGGSGGGGSGGGGS (SEQIDNO: 16), alterando L para A e S para T. Estas alterações removem epítopos com Leucina como o primeiro aminoácido na cavidade de ligação ao MHC e Tirosina como o primeiro aminoácido na cavidade de ligação ao MHC, respectivamente.
Estas substituições para desimunização funcionam em humanos para todas as proteínas de fusão de Fc, com e sem sequências de ligação, preferencialmente quando 1) ambas as 23 proteínas na proteína de fusão são proteínas humanas; 2) são ignorados os péptidos de ligação ao MHC nas sequências naturais de ambas as proteínas; e 3) também são ignorados os nonâmeros idênticos às sequências originais.
Os métodos da invenção são geralmente aplicáveis em todos os organismos vertebrados, preferencialmente em mamíferos e muito preferencialmente em humanos. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não restritivos.
Exemplos
Exemplo 1: Dedução dos epítopos reactivos imunogénicos da imunocitoquina huKS-IL2. A HuKS-IL2 consista de regiões VH e VL humanizadas combinadas com regiões das cadeias constantes H e L humanas. A cadeia H foi fundida na sua extremidade carboxilo com a sequência madura da IL-2 humana como anteriormente descrito. Esta cadeia H é do isotipo γΐ e tem afinidade elevada para receptores Fc. Devido a esta afinidade elevada, a HuKS-IL2 foi rapidamente eliminada da circulação. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a eliminação de HuKS-IL2 ocorre provavelmente via células portadoras de FcR no fígado (células de Kupffer) e baço (células apresentadoras de antigénio).
Foi anteriormente estabelecido que determinados doentes produziam respostas imunológicas a alguma porção da molécula de huKS-IL2, contudo, não são conhecidos os epítopos reconhecidos por estes anticorpos. Para deduzir os epítopos reactivos, as reactividades relativas dos soros de doentes para a huKS-IL2 foram comparadas com outras proteínas relacionadas: 24 (1) Hul4.18-IL2, uma molécula com regiões V humanizadas completamente diferentes mas exactamente as mesmas regiões C e junção de fusão com IL-2; (2) VH1, uma forma desimunizada de huKS-IL2 sem epitopos de células T nas regiões VH e VL, derivada de regiões V de rato com epitopos de células B de rato expostos na superfície, coberta a resíduos humanos. (3) VH2, uma forma desimunizada de huKS-IL2 com um epítopo de células T remanescente na CDR3, derivada de regiões V de rato com epitopos de células B de rato expostos na superfície coberta a resíduos humanos, na qual a VH contém um epítopo de células T. (4) 425-IL2 construída com regiões KOL ou EU Cyl (em vez de KS) (para comparara a reactividade alotípica);
(5) huKS-mIL2 - uma molécula com as regiões huKS V fundidas com regiões C de rato e IL-2 de rato; (6) Fc-IL2 humana; (7) só Fc humana; (8) só IL-2 humana.
As proteínas de fusão de imunoglobulina e os fragmentos foram purificados por cromatografia em Sepharose de proteína A e foram aplicados em placas de 96 poços em tampão de bicarbonato e em seguida bloqueados com soro de cabra a 1% contendo 1% de BSA. As diluições dos soros dos doentes foram incubadas e em seguida o material não ligado foi removido por três lavagens com PBS-Tween. Os anticorpos humanos ligados dos soros dos doentes foram detectados com vários anticorpos conjugados com HRP dependendo da proteína ligada. Em geral, foi utilizado o conjugado de HRP de cadeia λ anti-humana de cabra porque a maioria das proteínas ligadas à placa consistiam de Fc humana e cadeias κ humanas. 25
Determinados soros de doentes mostraram uma reactividade clara à huKS-IL2 que não foi detectável nos soros de pré-injecção dos mesmos doentes. Foram utilizados anti-soros pré-imunes para definir um controlo de base, não imunizado. A reactividade observada nos soros dos doentes pode ser atribuída a (1) reactividade anti-IL2, (2) reactividade anti-Fc (alotípica), (3) reactividade à nova sequência da junção ou (4) reactividade anti-idiotípica com o idiotipo KS, ou uma combinação de reactividades.
Nenhum soro de doente reagiu significativamente com a IL-2 recombinante ou com a região Fc (1 e 2 acima) . Alguns doentes mostraram reactividade anti-idiotípica com as regiões V de KS. Todos os soros dos doentes mostraram reactividade com a Fc-IL2. Três dos quatro doentes mostraram reactividade a Fc-IL2. A presença de reactividade contra a Fc-IL2 mas não contra a Fc ou IL2 sugere que a junção entre a Fc e a IL2 foi reconhecida pelos anti-soros dos doentes.
Exemplo 2: Modificação de resíduos de aminoácido na junção de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina para reduzir a imunogenicidade por eliminação dos motivos de ligação ao MHC de Classe II A análise da formação de filamentos de péptidos identificou dois segmentos de péptidos sobrepostos com potencial de ligação forte ao MHC na junção entre a porção Fc e IL2 da imunocitoquina. A formação de filamentos de péptidos e a identificação de epítopos de células T potenciais foram realizadas como divulgado em Carr (WO00/34317). Foram introduzidas alterações de aminoácido de modo a que os epítopos potenciais de ligação a MHC de Classe II existentes fossem eliminados, mas não foram introduzidos novos epítopos potenciais de MHC de Classe II. 26 A modificação de uma sequência de junção LSLSPGK-AP (SEQ ID NO: 17) para ATATPGA-AP (SEQ ID NO: 18) ("LSLS para ATAT"), em que o hífen é a junção da imunocitoquina huKS-IL2, tornou as sequências peptídicas derivadas da junção incapazes de se ligar a qualquer MHC de Classe II humana com uma afinidade suficientemente alta para resultar em imunogenicidade.
Exemplo 3: Modificação de resíduos de aminoácidos na junção das proteínas de fusão de imunocitoquina para reduzir a imunogenicidade A modificação de uma sequência de junção LSLSPGK-AP(SEQ ID NO: 17) para LNLSPGA-AP (SEQ ID NO: 19)("LSLS para LNLS"), em que o hífen é a junção da imunocitoquina huKS-IL2, resulta sequências peptídicas derivadas da junção que ainda são capazes de se ligar a determinadas moléculas de MHC de Classe II. No entanto, quando a proteína KS-IL2 é expressada em células de mamíferos e segregada, a proteína está N-glicosilada próximo da junção devido à sequência NXS/T.
Os péptidos derivados da junção resultantes não são eficazes como epítopos de células T, porque quando os péptidos derivados da junção são apresentados a células T pelo MHC de Classe II, a unidade de N-glicosilação grande impede a conexão específica entre o receptor de células T e o MHC de Classe II.
Exemplo 4: Caracterização da reactividade imunológica de células apresentadoras de antigénio à imunocitoquina huKs-IL2 em comparação com uma imunocitoquina huKS-IL2 desimunizada. 27 A redução de imunogenicidade devido à modificação do epitopo reactivo de LSLS para ATAT é directamente testada como se segue. Os péptidos sintéticos que imitam esta sequência alteram a resposta imunológica de uma célula apresentadora de antigénios clássica como uma célula dendritica (DC). São utilizados os seguintes péptidos sintéticos KSLSLSP6K-APTS (SEQ ID NO: 20) e KSATATPGK-APTS (SEQ ID NO: 21), em que o hífen é a junção da KS-IL2, para estimular a apresentação de antigénio mediada por DC a células T autólogas. A capacidade daquelas células T para proliferar em resposta a uma prova subsequente com o antigénio peptídico serve como uma medida da imunogenicidade desse péptido.
Especificamente, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) são isoladas de leucocataplasmas por técnicas correntes de gradiente de densidade. As células mononucleares são ressuspendidas em meio de cultura Aim V isento de soro e deixadas aderir. Após 2 h a 37°C, as
células não aderentes são removidas. As células aderentes são cultivadas durante 7 dias em meio contendo GM-CSF humana (50 ng/mL) e IL-4 (20 ng/mL) para obter célula dendríticas (DC) imaturas. Após 7 dias, as células são colhidas e caracterizadas em termos de fenótipo por citometria de fluxo com Abs marcados com FITC apropriados para o MHC de classe I, MHC de Classe II, CD80 e CD40 para confirmar o fenotipo DC imaturo.
As células não aderentes são cultivadas com IL2 e IL7 para se obter células efectoras autólogas (células T) para serem utilizadas em estudos funcionais subsequentes. Para estudos funcionais, as células T são adicionadas a células 28 dendríticas imaturas (proporção 10:1) e co-cultivadas com huKS, huKS desimunizada, 13-mero da junção peptídica (KSLSLSPGK-APTS) (SEQ ID NO: 20) e o péptido 13-mero modificado, desimunizado (KSATATPGK-APTS) (SEQ ID NO: 21). A comparação do índice de proliferação, como medido pela incorporação de timidina tritiada após exposição a cada uma das imunocitoquinas ou péptidos imunogénicos e modificados, desimunizados, demonstram o grau de imunogenicidade de cada molécula. Nomeadamente, um aumento na incorporação radioactiva é aproximadamente proporcional à capacidade de cada péptido para se ligar a uma molécula de MHC de classe II em DC e ser apresentado a células T.
Exemplo 5: Dedução de epítopos reactivos imunogénicos encontrados em proteínas de fusão de albumina e modificação dos resíduos de aminoácidos numa junção de fusão para reduzir a imunogenicidade. A albumina de soro humano (HSA), devido à sua semivida notavelmente longa, à sua distribuição vasta in vivo e à ausência de funções enzimáticas ou imunológicas, tem sido utilizada como um veículo para péptidos/proteínas terapêuticos. Foi demonstrado que um híbrido de HSA-CD4 geneticamente manipulado bloqueia a entrada do vírus da imunodeficiência humana em células CD4 + , ao mesmo tempo que exibe propriedades antivirais in vitro semelhantes às de CD4 solúvel (Yeh et al, PNAS 89:1904-1908, 1992). Assim, a fusão genética de péptidos bioactivos com HSA é útil para conceber e recuperar derivados terapêuticos de HSA segregados. No entanto, como com todas as proteínas de fusão, a HSA-CD4 tem uma junção nova que pode ser imunogénica e conter epítopos de células T capazes de serem apresentados em moléculas de MHC de Classe II. A análise da junção entre a HSA e a CD4 utilizando os métodos dos Exemplos 1, 2, 3 e 4 identifica péptidos com potencial de 29 ligação a MHC. As sequências potencialmente imunogénicas são modificadas para diminuir ou eliminar os potenciais epitopos de células T e B para reduzir a imunogenicidade. Analogamente, pode introduzir-se um novo sitio de glicosilação na região de junção para reduzir a imunogenicidade.
Sequência de albumina sequência de CD4 TCFAEEGKKLVAASQAALGL - KKWLGKKGDTVELTCTAS (SEQ ID NO: 22) . É considerado pela invenção que a região de junção da proteína de fusão HSA-IFNalfa possua três epitopos de células T candidatos, KKLVAASQAALGL (SEQ ID NO: 13); KLVAASQAALGLC (SEQ ID NO: 23); e LGLCDLPQTHSLG (SEQ ID NO: 24).
Os epitopos de células T representados nas SEQ ID NOs: 13 e 23 sobrepõem-se e podem ser desimunizados alterando o LV (a negrito) para qualquer outro excepto F, I, L, Μ, V, W e Y. Alternativamente, o índice de formação de filamentos de péptidos pode ser reduzido significativamente alterando LG para TT. 0 epítopo de células T na SEQ ID NO: 24 pode ser desimunizado alterando o segundo L (a negrito) para um A.
Além disso, é considerado que no caso de uma fusão HSA-X, em que X pode ser qualquer proteína, a desimunização da junção de fusão seja conseguida alterando a sequência de aminoácidos AALGL(SEQ ID NO: 25) para TATTA (SEQ ID NO: 26). CFAEEGKKLVAASQTATTA (SEQ ID NO: 27).
Exemplo 6: Proteínas de fusão X-Fc e modificação de resíduos de aminoácidos numa junção de fusão para reduzir a imunogenicidade. 30
Nalguns casos é especificamente vantajoso manipular uma proteína de fusão na orientação X-Fc. Com estas construções, uma proteína alvo é uma proteína de fusão N-terminal e seguida de um fragmento Fc. Por exemplo, o péptido tipo glucagina (GLP-1) requer uma extremidade N-terminal livre para a sua actividade, pelo que é útil uma fusão GLP-l-Fc.
Uma proteína de fusão GLP-l-Fc é construída de acordo com técnicas correntes descritas na técnica. Esta proteína de fusão tem a extremidade C-terminal da GLP-1 ligada à charneira da cadeia pesada de γΐ. É utilizada a sequência charneira de γΐ contendo uma mutação Cys para Ser (resíduo 5) que elimina o resíduo Cys que forma uma ligação dissulfureto como a cadeia leve na IgGl (Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500). A sequência do Fc não mutante é EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 28) estando a região charneira sublinhada, seguida do começo da sequência do domínio CH2. A junção de fusão entre GLP-1 (7-37) e o Fc mutante é: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG - EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 29). A junção de fusão entre a GLP-1 (7-37) e o Fc normal é: SYLEGQAAKEFIAWLVKGRG - EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 30)
Os três epítopos potenciais são identificados pela formação de filamentos de péptidos na junção de fusão de GLP-l-Fc. KEFIAWLVKGRGE (SEQ ID NO: 31) EFIAWLVKGRGEP (SEQ ID NO: 32) 31 AWLVKGRGEPKSS (SEQ ID NO: 33) . A análise das junções de fusão entre a GLP-1 (texto a negrito) e o Fc (texto normal), realizada como nos Exemplos 1-3, identifica péptidos com potencial de ligação a MHC. Após identificação dos sítios potenciais por análise da formação de filamentos de péptidos, as sequências potencialmente imunogénicas são modificadas por substituição de aminoácidos para reduzir ou eliminar os potenciais epítopos de ligação a células B e T e diminuir a imunogenicidade.
Os epítopos de células T potenciais, supramencionados representados nas SEQ ID NOs: 31, 32 e 33 são desimunizados efectuando substituições simples de aminoácido. Por exemplo, o péptido mostrado na SEQ ID NO: 31 é desimunizado alterando a Lisina (mostrada a negrito) para uma treonina e a Arginina (mostrada a negrito) para uma treonina. O péptido mostrado na SEQ ID NO: 32 é desimunizado substituindo a Isoleucina (mostrada a negrito) por uma Alanina ou uma Prolina e o péptido na SEQ ID NO: 33 é desimunizado substituindo a Leucina por uma Alanina ou uma Prolina. A junção desimunizada resultante é:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFAAWAVTGTG-EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 34).
De acordo com um método ilustrativo para introduzir um sítio de glicosilação numa junção de fusão, são introduzidas as seguintes alterações: SYLEGQAAKEFIAWLVKGRN-GSKSSDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 35). 32
Exemplo 7: Dedução de epítopos reactivos imunogénicos de Enbrel, uma proteína de fusão TNFR-Fc e modificação de resíduos de aminoácidos numa junção de fusão para reduzir a imunoqenicidade. ENBREL ou etanercept, uma proteína de fusão X-Fc aprovada pela FDA, é um inibidor do factor de necrose tumoral (TNF) utilizado para tratar artrite reumatóide. ENBREL é uma proteína de fusão dimérica consistindo de um domínio extracelular de ligação a ligando do receptor de TNF ligado a uma proteína Fc da IgGl humana. A TNFR-Fc inibe competitivamente a ligação do TNF ao seu receptor e torna o TNF ligado biologicamente inactivo, resultando numa redução significativa da actividade inflamatória. Como descrito acima para a GLP-l-Fc, a TNFR-Fc tem uma junção nova que contém epítopos de células T potenciais. A junção entre uma fusão directa de uma porção C-terminal de TNF-R (texto a negrito) com a extremidade N-terminal da charneira gl (texto normal com a região sublinhada a representar a região charneira) é STSFLLPMGPSPPAEGSTGD-EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 36) A análise de uma junção entre o TNF-R e Fc, realizada como nos Exemplos 1-4, identifica péptidos com potencial de ligação a MHC. Após identificação de sítios potenciais por análise da formação de filamentos de péptidos, as sequências potencialmente imunogénicas são modificadas por substituição de aminoácidos para reduzir ou eliminar epítopos potenciais de ligação a células B e T e diminuir a imunogenicidade.
De acordo com um método ilustrativo para introduzir um sítio de glicosilação numa junção de fusão, são introduzidas as seguintes alterações: 33 STSFLLPMGPSPPAEGSTGN - GSKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 37) .
Exemplo 8: Dedução de epítopos reactivos imunogénicos para proteínas de fusão Fc-X-Y como a Fc-IL12-IL2 e modificação de resíduos de aminoácidos na junção de fusão para reduzir a imunoqenicidade.
As proteínas de fusão com uma orientação Fc-X-Y, como a Fc-IL12-IL2, têm mútiplas junções de fusão novas que são potencialmente imunogénicas. Por exemplo, a Fc-IL12 tem uma junção de fusão semelhante a outras proteínas de fusão Fc-X ou imunocitoquinas (Exemplo 1) mas é nova devido à utilização da citoquina TL12. A junção de fusão é analisada quanto à presença se sítios de ligação imunogénicos e modificada em conformidade. Em segundo lugar, existe uma junção de fusão X-Y comparável à descrita no Exemplo 5, com duas citoquinas diferentes a constituir uma proteína de fusão. É utilizada a análise de filamentos peptídicos para cada uma das junções de fusão.
Análise das junções: (1) MHEALHNHYTQKSLSLSPGK - RNLPVATPDPGMFPCLHH SQ (SEQ ID NO: 38) entre a extremidade C-terminal de Fc (texto a negrito) e a extremidade N-terminal de IL12p35 (texto normal), e (2) RAQDRYYSSSWSEWASVPCS - APTSSSTKKTQLQLEHLLLD (SEQ ID NO: 39) entre a extremidade C-terminal de IL12p40 (texto a negrito) e a extremidade N-terminal de IL2 (texto normal) por análise de formação de filamentos de péptidos identifica péptidos com potencial de ligação a MHC. As sequências 34 potencialmente imunogénicas são modificadas para diminuir ou eliminar epitopos de células T potenciais.
Por exemplo, na sequência (1) acima, são efectuadas as seguintes alterações: MHEALHNHYTQKSATATPGK - RNLPVATPDPGMFPCLHHSQ (SEQ ID NO: 40) .
Estas alterações reduzem ou eliminam o potencial de ligação a MHC de Classe II de vários epitopos de células T numa junção de Fc e da subunidade p35 da IL12.
Noutro exemplo, a sequência (2) acima é modificada para introduzir um sitio de glicosilação, por introdução de uma Asparagina e Glicina nas duas primeiras posições de IL-2. Esta estratégia utiliza a Treonina que ocorre naturalmente na posição 3 da IL-2 madura. Além disso, é importante não interromper a formação de uma ligação dissulfureto na unidade p40, pelo que é útil separar o sitio de glicosilação de pelo menos um ou dois aminoácidos da Cisteina em p40. RAQDRYY S S SWSEWASVPCS - NGTSSSTKKTQLQLEHLLLD (SEQ ID NO: 41) .
No caso da fusão IL12p40-IL2, a introdução de um sitio de glicosilação como discutido acima cria os seguintes epitopos de células T potenciais. SEWASVPCSNGTS (SEQ ID NO: 42) ASVPCSNGTSSST (SEQ ID NO: 43) 35
No entanto, a glicosilação do epítopo de células T impede a ligação ao MHC de Classe II, resultando assim numa imunogenicidade reduzida.
Exemplo 9: Modificação de resíduos de aminoácidos numa junção de fusão de imunocitoguinas e immunofusinas preparada com um isotipo híbrido para remover epítopos de células T. É frequentemente útil construir uma proteína de fusão de anticorpo ou à base de anticorpo com um isotipo híbrido, de modo a que características úteis de isotipos diferentes possam ser combinadas numa única molécula. As proteínas de fusão com isotipos híbridos podem ser modificadas de acordo com a invenção para reduzir a imunogenicidade.
Uma proteína de fusão de anticorpo com os seguintes componentes é construída por técnicas correntes de ADN recombinante: uma cadeia leve e uma cadeia pesada, as regiões V que reconhecem um antigénio específico para o tumor, sendo a cadeia leve uma cadeia leve típica, e compreendendo a cadeia pesada os domínios CHI, CH2 e CH3 de IgG2 e a região charneira de IgGl, com uma citoquina fundida com a extremidade C-terminal da cadeia pesada a envolver uma junção de fusão como descrita acima.
Esta proteína contém junções novas entre CHlg2 e a charneira gl, e a charneira gl e CH2g2. A identificação e modificação de epítopos de células T potenciais nestas junções é realizada como se segue. Para as imunocitoquinas e proteínas de fusão Fc-X preparadas com um isotipo IgG2 ou IgG2h, estas modificações são idênticas às descritas nos Exemplos 1, 2, 3 e 8 acima. Para as imunofusinas de IgG2h X-Fc, a nova junção também é idêntica uma vez que a extremidade N-terminal da Fc está localizada na região 36 charneira da proteína IgG2h que foi modificada para um tipo IgGl. No entanto, existem duas novas junções de fusão pelo facto da charneira de IgGl inserida numa imunoglobulina IgG2 criar duas novas junções entre o CHI da IgG2 e a charneira de IgGl e entre a charneira de IgGl e o CH2 da IgG2. CHI da IgG2 - charneira de IgGl - CH2 da IgG2 - CH3 da IgG2 - proteína alvo.
Assim, a análise das junções qtytcnvdhkpsntkvdktv - epkscdkthtcppcp (SEQ ID NO: 49) entre a extremidade C-terminal do CHI da IgG2 (texto a negrito) e a extremidade N-terminal da charneira de IgGl (texto normal), e epkscdkthteppcp - appvagpsvflfppkpkdtl (SEQ ID NO: 50) entre a extremidade C-terminal da charneira da IgGl (texto a negrito) e a extremidade N-terminal do F de CH2 da IgG2 (texto normal) por formação de filamentos de péptidos deveria identificar péptidos com potencial de ligação a MHC. As sequências potencialmente imunogénicas são modificadas para diminuir ou eliminar epítopos potenciais de células B e T para reduzir a imunogenicidade.
Dois epítopos de células T potenciais na junção de fusão de IgG2CHl-charneira de IgGl são, TKVDKTVEPKSCD (SEQ ID NO: 51) e KTVEPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 52) . 37 A junção de fusão lgG2CHl-charneira de IgGl é desimunizada alterando uma V (a negrito) para uma A, uma T ou uma P. A sequência da junção de fusão modificada é representada na SEQ ID NO: 53. qtytcnvdhkpsntkadkta - epkscdkthtcppcp (SEQ ID NO: 53).
Como referido acima, a sequência da charneira γΐ na pdCs-huFcyl pode conter uma mutação de Cys para Ser (sublinhada) que elimina o resíduo de Cys que forma uma ligação dissulfureto com a cadeia leve na IgGl (Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500), criando desse modo duas junções de fusão adicionais potencialmente imunogénicas para análise e modificação: (3) qtytcnvdbkpsntkvdkv - epksSdkthtcppcp (SEQ ID NO: 54) (4) epksSdkthtcppcp - appvagpsvflfppkpkdtl (SEQ ID NO: 55).
Exemplo 10: Geração da proteína de fusão Fc-EPO utilizando componentes Fc de isotipo híbrido das IgGl e IqG4. A fim de gerar uma proteína de fusão Fc-eritropoietina, construiu-se o seguinte plasmídeo de expressão utilizando técnicas correntes de biologia molecular. Foi utilizado um fragmento de ADN Xmal-Xhol contendo uma forma da sequência de codificação da eritropoietina humana com mutações que resultam nas substituições de aminoácidos His32Gly, Cys33Pro, Trp88Cys e Pro90Ala, como descrito em WOOl/36489. A sequência proteica correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 56.
APPRUCE>SR.VLERYLLEAKEAENrn'OCAECa,SLNENrrVPbTBP/NFYAWKRMíSVQQQÀVBV
WQGLAIiSBAVLRGQALLVNSSQPCEQLQLHVnKÀVSGLRSLTTLLRALOAQKRAISPPDAAS
AAPIATTr^JDTFRKLFRVYSNPLRGKLKLYTGEAC^TGbR
Este fragmento de ADN Xmal-Xhol foi inserido num vector de plasmídeo que codifica uma região charneira de IgGl e uma 38 região CH2 e CH3 de IgG2, excepto que existiam dois conjuntos de mutações que resultaram em substituições de aminoácidos na região da extremidade C-terminal de CH3, pelo que a sequência na junção da extremidade C-terminal de CH3 e a extremidade N-terminal da Epo é como se segue: ____ TQKSATATPGA-APPRLI ____ (SEQ ID NO: 57) 0 primeiro conjunto de mutações, que alteram a sequência KSLSLSPG (SEQ ID NO: 58) da região CH3 da IgG2 para KSATATPG (SEQ ID NO: 59), é descrita no Pedido de Patente U.S. com o N° de Série 60/280,625. O efeito da substituição de Leu-Ser-Leu-Ser (posição 3 a posição 6 da SEQ ID NO: 58) por Ala-Thr-Ala-Thr (posição 3 a posição 6 da SEQ ID NO: 59) é remover potenciais epitopos de células T estranhos humanos que possuam surgir porque a junção entre a Fc humana e a eritropoietina humana contém sequências peptidicas estranhas. O segundo conjunto que consiste da substituição de um único aminoácido de K para A no aminoácido C-terminal da região CH3, é descrito no Pedido de Patente U.S. com o N° de Série 09/780,668. O plasmideo resultante foi transfectado em células NS/0 e a proteína de fusão Fc-Epo foi expressada e purificada segundo procedimentos conhecidos na técnica. Após purificação, com base na ligação à proteína A, a proteína huFcY2h-huEpo contendo as substituições do CH3 de IgG2 e da eritropoietina descritas acima foi caracterizada por cromatografia de exclusão molecular e constatou-se que era constituída por 97% de monómero e 90% de monómero em duas preparações independentes. Constatou-se que a proteína huFcY2h-huEpo contendo as substituições do CH3 de IgG2 e da eritropoietina descritas acima era quase tão activa, numa base molar, quanto a eritropoietina humana num ensaio com 39 base em células que mediu a capacidade de uma proteína de eritropoietina para estimular a divisão de células TF-1. 0 ensaio foi realizado como descrito em WO01/36489.
Além disso, foram caracterizadas as fusões de eritropoietina humana não mutante com a extremidade C-terminal de uma região Fc consistindo de IgGl(charneira-CH2-CH3), IgG2 (charneira-CH2-CH3) ou IgGl(charneira)-IgG2 (CH2-CH3) . Os plasmídeos de expressão compreendendo sequências não mutantes de Fc humana e sequências de eritropoietina não mutante foram construídas de modo análogo ao plasmídeo descrito acima. Células NS/0 foram transfectadas com os plasmídeos de expressão Fcyl-Epo, Fcy2-Epo e Fcy2h-Epo, e os clones estáveis foram isolados depois de rastrear um número aproximadamente igual de clones para cada plasmídeo. Os clones melhores produtores originaram 50 pg/mL de Fcyl-Epo, 20 pg/mL de Fcy2-Epo e 120 pg/mL de Fcy2h-Epo. O exemplo seguinte descreve em detalhe um método preferido para a identificação de regiões com sequências imunogénicas (epítopos de células T) nas sequências das proteínas de fusão como divulgadas nesta invenção. No entanto, deve ser assinalado, que as referidas moléculas podem ser obtidas por outros métodos conhecidos.
Exemplo 11. Identificação de epítopos de células T por métodos computacionais
De acordo com a invenção, os epítopos numa região de junção de uma proteína de fusão podem ser modificados utilizando métodos de introdução de mutações em proteínas para modular a sua interacção com o sistema imunitário. De acordo com a invenção, os métodos conhecidos na técnica que podem ser adaptados de acordo com a invenção incluem aqueles 40 descritos na técnica antecedente (WO 92/10755 e WO 96/40792 (Novo Nordisk) , EP 0519 596 (Merck & Co.), EP 0699 755 (Centro de Immunologia Molecular), WO 98/52976 e WO 98/59244 (Biovation Ltd.) ou métodos relacionados.
No entanto podem obter-se proteínas mutantes vantajosas se a identificação dos referidos epítopos for realizada pelo método novo seguinte que é aqui descrito em detalhe e aplicado à região de junção de proteínas de fusão de acordo com a invenção.
Existe um número de factores que desempenha papéis importantes na determinação da estrutura total de uma proteína, polipéptido ou imunoglobulina. Primeiro, a ligação peptídica, isto é, aquela ligação que junta os aminoácidos na cadeia, é uma ligação covalente. Esta ligação é planar nas estruturas, essencialmente uma amida substituída. Uma "amida" é qualquer um de um grupo de compostos orgânicos que contêm o agrupamento -CONH-. A ligação peptídica planar que liga o Ca de aminoácidos adjacentes pode ser representada como delineado a seguir: \ /
/ \
Uma vez que os átomos 0=C e C-N assentam num plano relativamente rígido não há rotação livre em torno destes eixos. Por isso, um plano esquematicamente representado pela linha interrompida é por vezes referido como um plano de "amida" ou "plano de péptido" no qual assentam os átomos de oxigénio (O), carbono (C), azoto (N) e hidrogénio (H) do esqueleto do péptido. Em cantos opostos deste plano de amida estão localizados os átomos de Ca. Uma vez que essencialmente não há rotação em torno dos átomos 0=C e C-N 41 no plano do péptido ou amida, uma cadeia de polipéptido compreende assim uma série de ligações peptidicas planares que unem os átomos de Ca.
Um segundo factor que desempenha um papel importante na definição da estrutura ou conformação total de um polipéptido ou proteína é o ângulo de rotação de cada plano de amida em torno da ligação Ca comum. Os termos "ângulo de rotação" e "ângulo de torção" são daqui para a frente considerados como termos equivalentes. Assumindo que os átomos de 0, C, N e H permanecem no plano de amida (o que é geralmente uma hipótese válida, embora possam existir alguns ligeiros desvios da planaridade destes átomos para algumas conformações), estes ângulos de rotação definem a conformação N e R do esqueleto do polipéptido, isto é, a estrutura tal como existe entre resíduos adjacentes. Estes dois ângulos são conhecidos como φ e ψ. Um conjunto dos ângulos φι, ψι, em que o índice i representa um resíduo particular de uma cadeia polipeptídica, define assim efectivamente a estrutura secundária do polipéptido. As convenções utilizadas na definição dos ângulos φ, ψ, isto é, os pontos de referência nos quais os planos de amida formam um ângulo de zero graus, e a definição de qual é o ângulo φ e qual é o ângulo ψ, para um dado polipéptido, são definidas na literatura. Ver, por exemplo, "Ramachandran et al. Adv. Prot. Chem. 2_3:283—437 (1968), nas páginas 285-94. 0 presente método pode ser aplicado a qualquer proteína e baseia-se, em parte, na descoberta de que nos humanos a posição de ancoragem primária da Cavidade 1 das cavidades de ligação da molécula de MHC de Classe II tem uma especificidade bem concebida para cadeias laterais de aminoácido particulares. A especificidade desta cavidade é determinada pela identidade do aminoácido na posição 86 da 42 cadeia beta da molécula de MHC de Classe II. Este sítio está localizado no fundo da Cavidade 1 e determina o tamanho da cadeia lateral que pode ser acomodada por esta cavidade. Marshall, K.W., J. Immunol., 152:4946-4956 (1994) . Se este resíduo for uma glicina, então todos os aminoácidos alifáticos hidrófobos e aromáticos (sendo os alifáticos hidrófobos: valina, leucina, isoleucina, metionina e sendo os aromáticos: fenilalanina, tirosina e triptofano) podem ser acomodados na cavidade, havendo uma preferência pelas cadeias laterais aromáticas. Se este resíduo da cavidade for uma valina, então a cadeia lateral deste aminoácido projecta-se para a cavidade e restringe o tamanho das cadeias laterais do péptido que podem ser acomodadas, pelo que só podem ser acomodadas cadeias laterais alifáticas hidrófobas. Portanto, numa sequência de resíduos de aminoácido, sempre que estiver presente um aminoácido com uma cadeia lateral alifática hidrófoba ou aromática, há o potencial para estar presente um epítopo de células T restringido a MHC de Classe II. No entanto, se a cadeia lateral for alifática hidrófoba, tem aproximadamente o dobro da probabilidade de estar associada a um epítopo de células T do que uma cadeia lateral aromática (assumindo uma distribuição aproximadamente uniforme dos tipos de Cavidade 1 ao longo de toda a população global).
Um método computacional que concretiza a presente invenção retrata a probabilidade de regiões do péptido conterem epítopos de células T como se segue: (1) É explorada a sequência primária de um segmento peptídico de comprimento predeterminado e são identificadas todas as cadeias laterais alifáticas hidrófobas e aromáticas. (2) Às cadeias laterais alifáticas hidrófobas são atribuídos um valor maior do que às cadeias laterais aromáticas; preferencialmente cerca de duas vezes o valor atribuído às 43 cadeias laterais aromáticas, por exemplo, um valor de 2 para uma cadeia lateral alifática hidrófoba e um valor de 1 para uma cadeia lateral aromática. (3) Os valores determinados como estando presentes são somados para cada segmento de resíduos de aminoácidos sobrepostos (janela) de comprimento uniforme predeterminado no péptido, e o valor total para um segmento particular (janela) é atribuído a um único resíduo de aminoácido numa posição intermédia do segmento (janela), preferencialmente a um resíduo próximo do ponto central do segmento amostrado (janela). Este procedimento é repetido para cada segmento de resíduos de aminoácidos sobrepostos amostrado (janela). Assim, a cada resíduo de aminoácido do péptido é atribuído um valor que se relaciona com a probabilidade de um epítopo de células T estar presente nesse segmento particular (janela). (4) Os valores calculados e atribuídos como se descreve no Passo 3, acima, podem ser representados contra as coordenadas do aminoácido da sequência completa de resíduos de aminoácidos a ser avaliada. (5) Todas as porções da sequência que têm uma pontuação de um valor predeterminado, por exemplo, um valor de 1, são consideradas como contendo provavelmente um epítopo de células T e podem ser modificadas, se desejado. Este aspecto particular da presente invenção proporciona um método geral através do qual podem ser descritas as regiões peptídicas contendo provavelmente epítopos de células T. As modificações do péptido nestas regiões têm o potencial de modificar as características de ligação ao MHC de Classe li.
De acordo com outro da presente invenção, os epítopos de células T podem ser previstos com maior exactidão através da utilização de um método computacional mais sofisticado que tem em consideração as interacções de péptidos com modelos de alelos de MHC de Classe II. 44 A previsão computacional de epitopos de células T presentes num péptido de acordo com este aspecto particular contempla a construção de modelos de pelo menos 42 alelos de MHC de Classe II com base nas estruturas de todas as moléculas de MHC de Classe II conhecidas e um método para a utilização destes modelos na identificação computacional de epitopos de células T, a construção de bibliotecas de esqueletos de péptidos para cada modelo a fim de reconhecer a variabilidade conhecida em posições relativas do carbono alfa (Ca) do esqueleto do péptido, a construção de bibliotecas de conformações da cadeia lateral de aminoácidos para cada esqueleto com cada modelo para cada uma das 20 alternativas de aminoácidos em posições criticas para a interacção entre o péptido e a molécula de MHC de Classe II, e a utilização destas bibliotecas de esqueletos e conformações da cadeia lateral em conjunto com uma função de pontuação para seleccionar o esqueleto e a conformação da cadeia lateral óptimos para um péptido particular acoplado a uma molécula de MHC de Classe II particular e a obtenção de uma pontuação de ligação a partir desta interacção.
Os modelos de moléculas de MHC de Classe II podem ser obtidos via modelação por homologia a partir de um número de estruturas semelhantes presentes no Brookhaven Protein Data Bank ("PDB"). Estes podem ser preparados através da utilização de software semi-automático de modelação por homologia (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 2_3£: 779-815) que incorpora uma função de emparelhamento simulado, em conjunto com o campo de força CHARMm para minimização de energia (disponível de Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca.). Também podem ser utilizados métodos de modelação alternativos. 45 0 presente método difere significativamente de outros métodos computacionais que utilizam bibliotecas de dados de ligação obtidos experimentalmente de cada alternativa de aminoácido em cada posição na cavidade de ligação para um pequeno conjunto de moléculas de MHC de Classe II (Marshall, K.W., et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, jL (3) : 157-162) (1995) ou ainda de outros métodos computacionais que utilizam dados de ligação experimentais semelhantes para definir as caracteristicas de ligação de tipos particulares de cavidades de ligação no sulco, utilizando novamente um subconjunto relativamente pequeno de moléculas de MHC de Classe II, e em seguida 'combinam e fazem condizer' os tipos de cavidade desta biblioteca de cavidades com moléculas de MHC de Classe II 'virtuais' criadas artificialmente (Sturniolo T., et al., Nat. Biotech, 1_7 (6) : 555-561 (1999). Ambos os métodos antecedentes sofrem da desvantagem importante de, devido à complexidade dos ensaios e à necessidade de sintetizar um grande número de variante peptidicas, apenas um pequeno número de moléculas de MHC de Classe II poderem ser rastreadas experimentalmente. Por isso, o primeiro método antecedente apenas pode fazer previsões para um pequeno número de moléculas de MHC de Classe II. 0 segundo método precedente também assume que uma cavidade revestida com aminoácidos semelhantes numa molécula terá as mesmas caracteristicas de ligação quando no contexto de um alelo diferente de Classe II e tem ainda desvantagens adicionais de poderem ser "virtualmente" criadas apenas aquelas moléculas de MHC de Classe II que possuem cavidades contidas na biblioteca de cavidades. Utilizando a abordagem de modelação aqui descrita pode deduzir-se a estrutura de qualquer número e tipo de moléculas de MHC de Classe II, pelo que podem ser especificamente seleccionados alelos que 46 sejam representativos da população global. Além disso, o número de moléculas de MHC de Classe II rastreadas pode ser aumentado preparando modelos adicionais, em vez de gerar dados adicionais através de experimentação complexa. A utilização de uma biblioteca de esqueletos permite a variação nas posições dos átomos de Ca dos vários péptidos a serem rastreados quando acoplados com moléculas de MHC de Classe II particulares. Isto está, mais uma vez, em contraste com os métodos computacionais precedentes alternativos descritos acima, os quais assentam na utilização de esqueletos de péptidos simplificados para rastrear a ligação de aminoácidos em cavidades particulares. Estes esqueletos simplificados não são provavelmente representativos das conformações de esqueleto encontradas em péptidos 'reais' conduzindo a imprecisões na previsão da ligação do péptido. A actual biblioteca de esqueletos é criada sobrepondo os esqueletos de todos os péptidos ligados a moléculas de MHC de Classe II presente num Banco de Dados de Proteínas e anotando o desvio da raiz quadrada média (RMS) entre os átomos de Ca de cada um dos onze aminoácidos localizados na cavidade de ligação. Embora esta biblioteca possa ser derivada de um número pequeno de estruturas humanas e de rato apropriadas disponíveis (presentemente 13) , para permitir a possibilidade de uma variabilidade ainda maior, o valor de RMS para cada posição C"-a é aumentado em 50%. A posição Ca média de cada aminoácido é então determinada e desenhada uma esfera em torno deste ponto, cujo raio é igual ao desvio da RMS nessa posição mais 50%. Esta esfera representa todas as posições Ca permitidas.
Partindo do Ca com o desvio de RMS mínimo (o do aminoácido na Cavidade 1 como se mencionou acima, equivalente à 47
Posição 2 dos 11 resíduos na cavidade de ligação), a esfera é dividida tridimensionalmente em quadrículas, e cada vértice da grelha é então utilizado como uma localização possível para um Ca desse aminoácido. 0 plano de amida subsequente, que corresponde à ligação peptídica com o aminoácido subsequente, é introduzido em cada um destes Cas e os ângulos φ e ψ são rodados por passos em intervalos estabelecidos para posicionar o Ca subsequente. Se o Ca subsequente cai dentro da esfera de posições permitidas' para este Ca, então a orientação do dipéptido é aceite, enquanto se cair fora da esfera o dipéptido é rejeitado. Este processo é então repetido para cada uma das posições Ca subsequentes, de modo a que o péptido cresça a partir da 'semente' Ca da Cavidade 1, até que todos os nove Cas subsequentes tenham sido posicionados a partir de todas as permutações possíveis dos Cas precedentes. 0 processo é então repetido mais uma vez para o único Ca que precede a cavidade 1 para criar uma biblioteca de posições de Ca do esqueleto localizadas na cavidade de ligação. 0 número de esqueletos gerados depende de vários factores: do tamanho das 'esferas de posições permitidas'; da definição da grelha da 'esfera primária' na posição da Cavidade 1; da definição da rotação por passos dos ângulos φ e ψ utilizados para posicionar os Cas subsequentes. Utilizando este processo pode criar-se uma biblioteca grande esqueletos. Quanto maior a biblioteca de esqueletos maior será a probabilidade de que seja encontrado o ajuste óptimo para um péptido particular na cavidade de ligação de uma molécula de MHC de Classe II. Uma vez que nem todos os esqueletos serão adequados para se acoplarem a todos os modelos de moléculas de MHC de Classe II devido a colisões com aminoácidos dos domínios de ligação, para cada alelo é criado um subconjunto da biblioteca compreendendo 48 esqueletos que podem ser acomodados por esse alelo. A utilização da biblioteca de esqueletos, em conjunto com os modelos de moléculas de MHC de Classe II cria um banco de dados exaustivo que consiste de conformações de cadeia lateral permitidas para cada aminoácido em cada posição da cavidade de ligação para cada molécula de MHC de Classe II acoplada com cada esqueleto permitido. Este conjunto de dados é gerado utilizando uma função de sobreposição espacial simples em que uma molécula de MHC de Classe II está acoplada a um esqueleto e uma cadeia lateral de aminoácido é enxertada no esqueleto na posição desejada. Cada uma das ligações rotacionais da cadeia lateral é rodada por passos em intervalos estabelecidos e anotadas as posições resultantes dos átomos dependentes dessa ligação. A interacçâo do átomo com átomos de cadeias laterais da cavidade de ligação é anotada e as posições são aceites ou rejeitadas de acordo com os critérios seguintes: 0 total da soma da sobreposição de todos os átomos posicionados até então não podem exceder um valor predeterminado. Assim, o rigor da pesquisa conformacional é uma função do intervalo utilizado na rotação por passos da ligação e do limite predeterminado para a sobreposição total. Este último valor pode ser pequeno se for conhecido que uma cavidade particular é rigida, contudo o rigor pode ser aliviado se se souber que as posições das cadeias laterais da cavidade são relativamente flexíveis. Assim podem ser dadas permissões para imitar variações na flexibilidade das cavidades sulco de ligação. Esta pesquisa conformacional é então repetida para todos os aminoácidos em todas as posições de cada esqueleto quando acoplado com cada uma das moléculas de MHC de Classe II para criar o banco de dados exaustivo de conformações da cadeia lateral. 49
Uma expressão matemática adequada é utilizada para estimar a energia de ligação entre os modelos de moléculas de MHC de Classe II em conjunção com as conformações dos ligandos peptidicos que foram empiricamente derivados por rastreio da base de dados grande de conformações de esqueleto/cadeia lateral descrita acima. Assim, uma proteína é rastreada quanto à presença de epítopos de células T potenciais submetendo cada péptido possível com um comprimento entre 9 e 20 aminoácidos (embora o comprimento seja mantido constante em cada pesquisa) às computações seguintes: Uma molécula de MHC de Classe II é seleccionada em conjunto com um esqueleto de péptido permitido para essa molécula e são ali enxertadas as cadeias laterais correspondentes à sequência peptídica desejada. A identidade do átomo e os dados de distância interatómica relacionados com uma cadeia lateral particular numa posição particular do esqueleto são recolhidos para cada conformação permitida desse aminoácido (obtida da base de dados descrita acima). Isto é repetido para cada cadeia lateral ao longo do esqueleto e as pontuações do péptido obtidas utilizando uma função de pontuação. A melhor pontuação para esse esqueleto é retida e o processo repetido para cada esqueleto permitido para o modelo seleccionado. As pontuações de todos os esqueletos permitidos são comparadas e a pontuação mais elevada é considerada como sendo a pontuação de péptido para o péptido desejado nesse modelo de MHC de Classe II. Este processo é então repetido para cada modelo com todos os péptidos possíveis derivados da proteína a ser rastreada, e são apresentadas as pontuações para os péptidos versus modelos.
No contexto da presente invenção, cada ligando apresentado para o cálculo da afinidade de ligação é um segmento de aminoácido seleccionado de um péptido ou proteína como se 50 discutiu acima. Assim, o ligando é um trecho de aminoácidos seleccionado com cerca de 9 a 20 aminoácidos de comprimento derivado de um péptido, polipéptido ou proteína de sequência conhecida. Os termos "aminoácidos" e "resíduos" são daqui para a frente considerados termos equivalentes. O ligando, na forma dos aminoácidos consecutivos do péptido a ser examinado enxertado num esqueleto da biblioteca de esqueletos, é posicionado na fenda de ligação de uma molécula de MHC de Classe II da biblioteca de modelos de moléculas de MHC de Classe II via as coordenadas dos átomos C"-a do esqueleto do péptido e é seleccionada uma conformação permitida para cada cadeia lateral a partir da base de dados de conformações permitidas. As identidades do átomo relevante e as distâncias interatómicas também são obtidas desta base de dados e utilizadas para calcular a pontuação de ligação do péptido. Os ligandos com uma afinidade de ligação alta para a cavidade de ligação do MHC de Classe II são marcados como candidatos para mutagénese específica de um locus. São feitas substituições de aminoácido no ligando marcado (e, desse modo, na proteína de interesse) que é então reanalisado utilizando a função de pontuação para determinar alterações que reduzem a afinidade de ligação abaixo de um valor limiar predeterminado Estas alterações podem ser depois incorporadas numa proteína de interesse para remover epítopos de células T. A ligação entre o ligando peptídico e a cavidade de ligação das moléculas de MHC de Classe II envolve interacções não covalentes incluindo, mas não se limitando a: ligações de hidrogénio, interacções electrostáticas, interacções hidrófobas (lipófilas) e interacções de Van der Waal. Estes estão incluídas na função de pontuação do péptido como se descreve em detalhe abaixo. Entender-se-á que uma ligação 51 de hidrogénio é uma ligação não covalente que pode ser estabelecida entre grupos polares ou carregados e consiste de um átomo de hidrogénio partilhado por outros dois átomos. 0 hidrogénio do doador de hidrogénio tem uma carga positiva, enquanto o aceitador de hidrogénio tem uma carga parcial negativa. Para os efeitos das interacções péptido/proteina, os doadores de ligação de hidrogénio podem ser azotos com hidrogénio ligado ou hidrogénios ligados a oxigénio ou azoto. Os átomos aceitadores de ligação de hidrogénio podem ser oxigénios não ligados a hidrogénio, azotos sem hidrogénios ligados e com uma ou duas conexões, ou enxofres com apenas uma conexão.
Determinados átomos, tais como oxigénios ligados a hidrogénios ou azotos de imina (por exemplo C=NH) podem ser aceitadores ou doadores de hidrogénio. As energias da ligação de hidrogénio variam de 3 a 7 Kcal/mol e são muito mais fortes do que as ligações de Van der Waal, mas mais fracas do que as ligações covalentes. As ligações de hidrogénio também são extremamente direccionais e têm a máxima força quando o átomo doador, o átomo de hidrogénio e o átomo aceitador são colineares. As ligações electrostáticas formam-se entre pares de iões de carga oposta e a força da interacção é inversamente proporcional ao quadrado da distância entre os átomos segundo a lei de Coulomb. A distância óptima entre pares de iões é de cerca de 2,8Â. Nas interacções de proteínas/péptidos podem formar-se ligações electrostáticas entre a arginina, histidina ou lisina e o aspartato ou glutamato. A força da ligação dependerá do pKa do grupo ionizante e da constante dieléctrica do meio, embora sejam aproximadamente semelhantes em termos de força às ligações de hidrogénio.
As interacções lipófilas são contactos hidrófobos- hidrófobos favoráveis que ocorrem entre a proteina e o 52 ligando peptídico. Em geral, estas ocorrerão entre cadeias laterais hidrófobas de aminoácidos do péptido enterradas nas cavidades do sulco de ligação pelo que não estão expostas ao solvente. A exposição dos resíduos hidrófobos ao solvente é extremamente desfavorável, uma vez que as moléculas de solvente circundantes são forçadas a estabelecerem ligações de hidrogénio uma com as outras formando estruturas de clatrato tipo gaiola. A diminuição resultante na entropia é extremamente desfavorável. Os átomos lipófilos podem ser enxofres que não são polares nem aceitadores de hidrogénio e átomos de carbono que não são polares.
As ligações de Van der Waal são forças não específicas presentes entre átomos que estão afastados 3-4Â. São mais fracas e menos específicas do que as ligações de hidrogénio e electrostáticas. A distribuição da carga electrónica em torno de um átomo altera com o tempo e, em qualquer instante, a distribuição de carga não é simétrica. Esta assimetria transitória na carga electrónica induz uma assimetria semelhante em átomos vizinhos. As forças atractivas resultantes entre átomos atinge um máximo à distância de contacto de Van der Waal mas diminui muito rapidamente a cerca de 1Â até cerca de 2Â. Contrariamente, à medida que os átomos ficam separados por menos do que a distância de contacto, forças repulsivas cada vez mais fortes tornam-se dominantes à medida que as nuvens electrónicas exteriores dos átomos se sobrepõem Embora as forças atractivas sejam relativamente fracas em comparação com as ligações electrostáticas e de hidrogénio (cerca de 0,6 Kcal/mol) , as forças repulsivas em particular podem ser muito importantes para determinar se um ligando peptídico se pode ligar com sucesso a uma proteína. 53
Numa forma de realização, utiliza-se a função de pontuação de Bõhm (abordagem SCOREl) para estimar a constante de ligação. (Bõhm, H.J., J. Comput Aided Mol. Des., 8_(3):243-256 (1994)). Noutra forma de realização, utiliza-se a função de pontuação (abordagem SC0RE2) para estimar as afinidades de ligação como um indicador de um ligando contendo um epítopo de células T (Bõhm, H.J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4):309-323 (1998)). No entanto, as funções de pontuação de Bõhm como descritas nas referências acima são utilizadas para estimar a afinidade de ligação de um ligando com uma proteína quando já se sabe que o ligando se liga com sucesso com uma proteína e quando o complexo proteína/ligando tem a sua estrutura resolvida, estando a estrutura resolvida presente num Banco de Dados de Proteínas ("PDB") . Portanto, a função de pontuação foi desenvolvida beneficiando de dados conhecidos de ligação positiva. Para permitir a discriminação entre grupos de ligação positivos e negativos tem de ser adicionado um termo de repulsão à equação. Além disso, obtém-se uma estimativa mais satisfatória da energia de ligação através da computação das interacções lipófilas de um modo proporcional em vez de utilizar o termo de energia com base na área das funções de Bõhm acima. Por conseguinte, numa forma de realização preferida, a energia de ligação é estimada utilizando uma função de pontuação de Bõhm modificada. Na função de pontuação de Bõhm modificada, a energia de ligação entre a proteína e o ligando (AGiigaÇâo) é estimada considerando os parâmetros seguintes: A redução da energia de ligação devido à perda global de entropia translacional e rotacional do ligando (AGo) ; as contribuições de ligações de hidrogénio ideais (AGhb) em que pelo menos um parceiro é neutro; as contribuições de interacções iónicas não perturbadas (AGiónica) ; as interacções lipófilas entre átomos ligandos lipófilos e 54 átomos aceitadores lipófilos (AGiipo) ; a perda de energia de ligação devido ao congelamento de graus de liberdade internos do ligando, isto é, a liberdade de rotação em torno de cada ligação C-C é reduzida (AGrot) ; a energia da interacção entre a proteína e o ligando (EVciw) · A consideração destes termos dá a equação 1: (AGiigação ) — (AGo) t (AGhbXNftt)) t (AGiónica^EIiónica) t (AGiipo-^Niipo) + (AGrottNrot) t (E vdw)
Em que N é o número de interacções de qualificação para um termo específico e, numa forma de realização, ΔGo, AGhbf AGiónica , AGiipo e AGrot são constantes a que são dados os valores: 5,4, -4,7, -4,7, -0,17 e 1,4, respectivamente. O termo Nht) é calculado de acordo com a equação 2:
Nhb = Σ h-ligações f (AR, Ao) X f (Nvizinhança) x fpcs f(AR, Δα) é uma função penalizadora que tem em consideração desvios grandes das ligações de hidrogénio da situação ideal e é calculada de acordo com a equação 3: f (AR, A-a) = fl (AR) x f2 (Δα)
Em que: fl(AR) = 1 se AR <= TOL OU 1 - (AR - TOL)/0 ,4 se AR <= 0,4 + TOL ou 0 se AR > 0,4 + TOL E: f2(Δα) = 1 se Δα <30° ou 1 - (Δα - 30)/50 se Δα <= =80' 0 ou 0 se Δα >80° TOL é o desvio tolerado no comprimento da ligação hidrogénio = 0,25À AR é o desvio no comprimento da ligação de hidrogénio H-O/N em relação ao valor ideal = 1,9Â 55 Δα é o desvio do ângulo da ligação de hidrogénio Z n/o-h..o/n do seu valor idealizado de 180° f (Nvizinhança) distingue entre as partes côncava e convexa de uma superfície da proteína e, por conseguinte, confere um maior peso às interacções polares presentes em cavidades do que àquelas presentes na superfície da proteína. Esta função é calculada de acordo com a equação 4 abaixo: f (Nvizinhança) — (Nvizinhança /Nvizinhança,o) em que α 0,5 Nvizinhança é o número de átomos diferentes de hidrogénio da proteína que estão mais próximos do que 5Ã em relação a um dado átomo da proteína.
Nvizinhança,o é uma constante = 25 fpcs é uma função que reconhece a área superficial de contacto polar por ligação de hidrogénio e, por conseguinte, distingue entre ligações de hidrogénio fortes e fracas e o seu valor é determinado de acordo com os critérios seguintes fpc3= β quando Apoiar/NHB < 10 Â2 ou fpcs= 1 quando Ap0iar/NHB > 10 Â2
Apoiar é o tamanho da superfície de contacto polar proteína-ligando NHb é o número de ligações de hidrogénio β é uma constante cujo valor = 1,2
Para a implementação da função de pontuação de Bõhm modificada, as contribuições das interacções iónicas, AGiónica t são computadas de um modo semelhante às das ligações de hidrogénio descritas acima uma vez que é assumida a mesma dependência da geometria. O termo Νηρο é calculado de acordo com a equação 5 abaixo:
Nlipç = ZiLf (rlh) f(riL) é calculada para todos os átomos lipófilos do ligando, 1, e para todos os átomos lipófilos da proteína, L, de acordo com os critérios seguintes: 56 f(nL) =1 quando riL <= Rlf(riL) = (riL - Rl)/(R2-Rl) quando R2 <riL >R1 f (nL) =0 quando riL >= R2
Em que: RI = ri + rL +0,5 E R2 = RI + 3, 0
e rivdw é o raio de Van der Waal do átomo 1 e rLvdw é o raio de Van der Waal do átomo L O termo Nrot é o número de ligações rotacionais da cadeia lateral do aminoácido e é considerado como sendo o número de ligações sp3 - sp3 e sp3 - sp2 aciclicas. Não são consideradas as rotações de -CH3 ou -NH3 terminais. O termo final, Evdw, é calculado de acordo com a equação 6 abaixo:
Evdw = elE2((rrdw +r2vdw)12/r12 - (nvdw +r2vdw) 6/r6) , em que:
Ei e ε2 são constantes dependentes da identidade do átomo nvdw +r2vdw são os raios atómicos de Van der Waal r é a distância entre um par de átomos.
No que se refere à Equação 6, numa forma de realização, às constantes ε2 e ε2 são dados os valores dos átomos: C: 0,245, N: 0,283, O: 0,316, S: 0,316, respectivamente (isto é para os átomos de Carbono, Azoto, Oxigénio e Enxofre, respectivamente) . No que se refere às equações 5 e 6, aos raios de Van der Waal são dados os valores dos átomos C: 1,85, N: 1,75, O: 1,60, S: 2,00 Â.
Entender-se-á que todos os valores predeterminados e constantes dados nas equações acima são determinados dentro das limitações da compreensão actual das interacções ligando-proteína tendo uma atenção particular para o tipo de computação aqui seguida. Portanto, é possivel que, à 57 medida que esta função de pontuação é aperfeiçoada, estes valores e constantes possam mudar pelo que pode ser utilizado qualquer valor numérico adequado que origine os resultados desejados em termos de estimativa da energia de ligação de uma proteína a um ligando e, por este motivo, cai no âmbito da presente invenção.
Como se descreveu acima, a função de pontuação é aplicada a dados extraídos da base de dados de conformações da cadeia lateral, identidade de átomos e distâncias interatómicas. Para os efeitos da presente descrição, o número de moléculas de MHC de Classe II incluídas nesta base de dados é 42 modelos mais quatro estruturas resolvidas. Deverá ser evidente das descrições acima que a natureza modular da construção do método computacional da presente invenção significa que podem ser simplesmente adicionados novos modelos e rastreados com a biblioteca de esqueletos peptídicos e com a função de pesquisa conformacional da cadeia lateral para criar conjuntos de dados adicionais que podem ser processados pela função de pontuação de péptidos como se descreveu acima. Isto permite que o reportório de moléculas de MHC de Classe II rastreadas seja facilmente aumentado, ou que sejam substituídas estruturas e os dados associados se estiverem disponíveis dados para criar modelos mais exactos dos alelos existentes. 0 presente método de previsão pode ser calibrado contra um conjunto de dados compreendendo um grande número de péptidos cuja afinidade para várias moléculas de MHC de Classe II foi previamente determinada de modo experimental. Ao comparar os dados calculados contra os dados experimentais pode determinar-se um valor limiar acima do qual se sabe que todos os epítopos de células T determinados experimentalmente são previstos correctamente. 58
Entender-se-á que, embora a função de pontuação acima seja relativamente simples em comparação com algumas metodologias sofisticadas que se encontram disponíveis, os cálculos são realizados de modo extremamente rápido. Entender-se-á também que o objectivo não é calcular a verdadeira energia de ligação per se para cada péptido acoplado na cavidade de ligação de uma proteína MHC de Classe II. 0 objectivo subjacente é obter dados de energia de ligação comparativos como um auxiliar para prever a localização de epítopos de células T com base na estrutura primária (isto é sequência de aminoácidos) de uma proteína seleccionada. Uma energia de ligação relativamente alta ou uma energia de ligação acima de um valor limiar seleccionado sugeriria a presença de um epítopo de células T no ligando. 0 ligando pode ser então submetido a pelo menos um ciclo de substituição de aminoácidos e a energia de ligação recalculada. Devido à natureza rápida dos cálculos, estas manipulações da sequência do péptido podem ser realizadas de modo interactivo na interface do utilizador do programa no hardware de computadores económicos disponíveis. Não é assim necessário um investimento importante em hardware de computador.
Seria evidente para um especialista na técnica que poderiam ser utilizados para o mesmo fim outros softwares disponíveis. Em particular, pode utilizar-se um software mais sofisticado que é capaz de acoplar ligandos nos sítios de ligação da proteína em conjunção com minimização de energia. São exemplos de softwares de acoplamento: DOCK (Kuntz et al., J. Mol. Biol., 161:269-288 (1982)), LUDI (Bõhm, H.J., J. Comput Aided Mol. Des., 8^:623-632 (1994)) e FLEXX (Rarey M., et al., ISMB, 3:300-308 (1995)). Os exemplos de softwares de modelação e manipulação molecular 59 incluem: AMBER (Tripos) e CHARMm (Molecular Simulations Inc.). A utilização destes métodos computacionais limitaria seriamente a produtividade do método desta invenção devido aos intervalos de tempo de processamento necessários para fazer os cálculos necessários. No entanto, é possível que esses métodos possam ser utilizados como um 'rastreio secundário' para obter cálculos mais exactos da energia de ligação para péptidos que se determinem ser 'grupos de ligação positivos' através do método da presente invenção. A limitação do tempo de processamento para cálculos de mecânica molecular ou dinâmica molecular sofisticados é definida pela concepção do software que faz estes cálculos e pelas limitações tecnológicas actuais do hardware do computador. Pode antecipar-se que, no futuro, com a concepção de códigos mais eficientes e com o aumento contínuo da velocidade dos processadores dos computadores, pode tornar-se possível fazer esses cálculos num quadro temporal mais viável. Informação adicional sobre funções de energia aplicadas a macromoléculas e sobre a consideração das várias interacções que ocorrem numa estrutura proteica dobrada pode ser encontrada em: Brooks, B.R., et al., J. Comput. Chem., £:187-217 (1983) e informação adicional sobre interacções gerais proteína-ligando pode ser encontrada em: Dauber-Osguthorpe et al., Proteins £(1):31-47(1988), que são aqui incorporadas na sua totalidade por referência. Informação de base útil também pode ser encontrada, por exemplo, em Fasman, G.D., ed., Prediction of Protein Structure and the Principies of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9. 60
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Lexigen Pharmaceuticals Corp. <120> Redução da imunogenicidade de Proteínas de fusão
<130> LEX-017PCT <150> US 60/280,625 <151> 2001-03-30 <160> 59 <170> Patentln versão 3.0
<210> 1 <211> 330 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <221> características diversas <223> região C da cadeia pesada da Ig gama humana <400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95 Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 130 135 140 61
Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
< 2 1 0 > 2 <211> 326 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <221> características diversas <223> região C da cadeia da Ig gama-2 humana <400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 62
Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95 Thr Vai Glu Arg Lys Cys cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 130 135 140
Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 145 150 155 160
Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175
Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp 180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220
Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240
Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255
Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285
Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 290 295 300
Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 < 210 > 3 <211> 362
< 212 > PRT <213> Homo sapiens 63 < 2 2 Ο > <221> características diversas <223> região constante da Ig3 humana <400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 Θ0 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Vai Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 165 170 175 Vai Vai Vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys Trp 180 185 190 Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Trp Glu 195 200 205 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 210 215 220 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 225 230 235 240 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 245 250 255 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 260 265 270 Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 275 280 285 Pro Ser Asp Ile Ala Met Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn 290 295 300 64
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 325 330 335
Ile Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 340 345 350
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360
< 210 > 4 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0> <221> características diversas <223> região C da cadeia da Ig gama-4 <400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95 Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 130 135 140 Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 145 150 155 160 65
Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220
Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240
Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255
Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285
Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser 290 295 300
Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 < 210 > 5 <211> 9
< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> epitopo de célula T potencial <400> 5
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5
<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > 66 <223> epítopo de célula T potencial mutado <400> 6
Lys Ser Ala Thr Ala Thr pro Gly Lys 1 5
< 210 > 7 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epítopo de célula T potencial mutado <400> 7
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala 1 5
< 210 > 8 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0>
<223> sequência próxima da extremidade C-terminal do domínio CH3 da região Fc da IgA <400> 8
Gin Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10
< 210 > 9 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> sequência próxima da extremidade C-terminal do domínio CH3 da região Fc da IgA mutada 67 <4Ο0> 9
Gin Lys Thr Ala Asp Arg Thr Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10
<210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> sequência numa fusão IgA-X desimunizada <400> 10
Gin Lys Thr Pro Thr Arg Thr Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10
< 210 > 11 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> sequência numa fusão IgA-X desimunizada < 4 0 0 > 11
Gin Lys Thr Pro Thr Arg Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10
< 210 > 12 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> sequência numa fusão IgA-X desimunizada <400> 12 68
Gin Lys Thr Ala Thr Arg Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10
<210> 13 <211> 13 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epitopo de célula T potencial na junção HSA-IFNalfa <400> 13
Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu l_5_10_
<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> extremidade C-terminal modificada de albumina <4 0 0> 14
Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Thr Thr Ala 15 10
< 210 > 15 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> sequência numa proteína de fusão de Fc < 4 0 0 > 15
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 69
< 210 > 16 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> sequência numa proteína de fusão de Fc modificada < 4 0 0 > 16
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Lys Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30
< 210 > 17 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> sequência da junção <4 0 0> 17
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Pro 1 5
< 210 > 18 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> sequência da junção modificada <400> 18
Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro 1 5 70
< 210 > 19 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> sequência da junção modificada <4 0 0> 19
Leu Asn Leu Ser Pro Gly Ala Ala Pro 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> péptido sintético contendo um epitopo reactivo <400> 20
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Pro Thr Ser 15 10
< 210 > 21 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> péptido sintético contendo um epitopo reactivo modificado <400> 21
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Lys Ala Pro Thr Ser 15 10 <210> 22 <211> 39 71
< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> sequência da junção de albumina-CD4 <400> 22
Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala 15 10 15
Ala Leu Gly Leu Lys Lys Vai Vai Leu Gly Lys Lys Gly Asp Tbr Vai 20 25 30
Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser 35
<210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epitopo de célula T potencial na fusão HSA-IFNalfa <400> 23
Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly Leu Cys 15 10
<210> 24 < 211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epitopo de célula T potencial na fusão HSA-IFNalfa <400> 24
Leu Gly Leu Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly 15 io <210> 25 <211> 5 72
< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> sequência da extremidade C-terminal da albumina <400> 25
Ala Ala Leu Gly Leu 1 5
<210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> sequência da extremidade C-terminal da albumina mutada <400> 26
Thr Ala Thr Thr Ala 1 5
<210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> região da junção de albumina modificada <400> 27 cys phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Vai Ala Ala Ser Gin Thr Ala
1 5 XO IS
Thr Thr Ala
<210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > 73 <223> sequência da Fc não mutante <400> 28
Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly _20__ <210> 29 <211> 52 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> junção de fusão da GLP-l-Fc mutante <400> 29
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly Glu 20 25 30
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala Pro 35 40 45
Glu Leu Leu Gly 50
<210> 30 <211> 41 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da GLP-l-Fc normal <400> 30 74 Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala 1 5 10
Trp Leu Vai 15
Lys Gly Arg Gly Glu Pro Lys 20
Ser Cys Asp Lys Thr His 25
Thr Cys Pro 30
Leu Gly 40
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 35
<210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epitopo de célula T potencial na fusão GLP-l-Fc <400> 31
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly Glu 1 5 _10_
<210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> epitopo de célula T potencial na junção de fusão da GLP-1-Fc <400> 32
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly Glu Pro 15 10
<210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> epitopo de célula T potencial na junção de fusão da GLP-1-Fc 75 <4Ο0> 33
Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly Glu Pro Lys Ser Ser 15 io
<210> 34 <211> 52 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da GLP-lFc desimunizada <400> 34
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ala Ala Trp Ala Vai Thr Gly Thr Gly Glu 20 25 30
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 35 40 45
Glu Leu Leu Gly 50 <210> 35 < 211> 41
< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da GLP-l-Fc com um sítio de glicosilação <400> 35
Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Vai 1 5 10 15 Lys Gly Arg Asn Gly Ser Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40
<210> 36 <211> 41 < 212 > PRT 76 <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da TNF-R-gama-1 <400> 36 ser Thr ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pr o Pro Ala Glu Gly 15 10 15
Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40
<210> 37 <211> 41 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da TNF-R-Fc <400> 37
Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly 1 5 10 15
Ser Thr Gly Asn Gly Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40 <210> 38 <211> 40 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> junção de fusão da Fc <400> 38 77
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 15 10 15
Ser Pro Gly Lys Arg Asn Leu Pro Vai Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met 20 25 30
Phe Pro Cys Leu His His Ser Gin 35 40
<210> 39 <211> 40 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da IL-12p40-IL2 <400> 39
Arg Ala Gin Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser 15 10 15
Vai Pro Cys Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 25 30
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp 35 40
<210> 40 <211> 40 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> junção de fusão da Fc-IL12p35 modificada <400> 40
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Alâ 1 5 10 15 Thr Pro Gly Lys Arg Asn Leu Pro V'al Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met 20 25 30 Phe Pro cys Leu His His Ser Gin 35 40 <210> 41
<211> 40 <212> PRT 78 <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> junção de fusão da lL12p40-IL2 modificada < 4 0 0 > 41
Arg Tyr Tyr Ser Ser ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser 5 10 IS Asn Gly Thr Ser Ser Ser Thr Lya Lys Thr Gin heu 25 30 Leu Leu Leu Asp 40
Arg Ala Gin Asp 1
Vai pro Cys Ser 30
Gin Leu 61u His 35 <210> 42 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>
<223> epitopo de célula T potencial na fusão IL12p40-IL <400> 42
Ser Glu Trp Ala Ser Vai Pro Cys Ser Asn Gly Thr Ser 15 io
<210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epitopo de célula T potencial na junção de fusão da IL12p40-IL2 <400> 43
Ala ser Vai Pro cys Ser Asn Gly Thr Ser Ser Ser Thr 1 5 io <210> 44 <211> 41
<212> PRT <213> Sequência artificial 79 < 2 2 Ο > <223> junção de fusão da IL4-Fc <400> 44
Glu Asn Phô Leu Glu Arg hm Lys Thr Ile Mêt Arg Glu Lye Tyr Sor 5 10 15 Lys Cys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Qly 3S 40
<210> 45 <211> 40 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> junção de fusão da Fc-GMCSF <400> 45
Met His Glu Ala Leu His Asn Kis Tyr Tàr Gin Lys Ssx Leu Ser Leu 15 10 15
Ser pro Gly Lys Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp 20 25 30
Glu His Vai Asn Ala Ue Gl» Glu 35 40
<210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> epitopo de células T potencial na junção de fusão da IL4-Fc <400> 46
Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys 15 10 80
<210> 47 <211> 41 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fusão IL4-Fc modificada <400> 47
Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser 15 10 15
Lys Cys Ser Ser Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40
<210> 48 <211> 40 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da Fc-GMCSF desimunizada <400> 48
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala 15 10 15
Thr Pro Gly Lys Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp 20 25 30
Glu His Vai Asn Ala Ile Gin Glu 35 40
<210> 49 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> junção de fusão da IgG2CHl-charneira de IgGl 81 <4Ο0> 49_
Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai 15 10 15
Asp Lys Thr Vai Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro 35
<210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da charneira da IgGl-IgG2CH2 <400> 50
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15
Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys 2Õ 25 30
Asp Thr Leu 35 < 210 > 51 <211> 13
<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> epítopo de célula T potencial na junção de fusão da IgG2CHl-charneira da IgGl <400> 51
Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp 1_5_10__
<210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> epítopo de célula T potencial na junção de fusão IgG2CHl-charneira da IgGl 82 <4Ο0> 52
Lys Thr Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 15 10
<210> 53 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da IgG2CHl-charneira da IgGl modificada <400> 53
Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Ala 15 10 15
Asp Lys Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro 35
<210> 54 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> junção de fusão da IgG2CHl-charneira da IgGl modificada <400> 54
Gin Thr τyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai 15 10 15
Asp Lys Thr Vai glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro 35
<210> 55 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> junção de fusão da charneira da IgGl-IgG2CH2 modificada 83 <400> 55
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15
Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30
Asp Thr Leu 35 <210> 56
<211> 166 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> sequência de EPO mutante <400> 56
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Pro Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Vai Gly Gin Gin Ala Vai Glu Vai Trp 50 55 60 Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Vai Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80 Leu Vai Asn Ser Ser Gin Pro Cys Glu Gly Leu Gin Leu His Vai Asp 85 90 95 Lys Ala Vai Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120. 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai 130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 84
<210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> junção de fusão da CH3-EPO <400> 57
Thr Gin Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Pro Arg Leu 15 10 15
Ile
<210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> sequência do CH3 da IgG2 <400> 58
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5
<210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> sequência do CH3 da IgG2 modificada <400> 59
Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly 1 5
Lisboa, 25 de Fevereiro de 2011

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de redução da imunogenicidade pela remoção de epítopos de células T estranhos de uma proteína de fusão, o qual compreende uma primeira proteína e uma segunda proteína ligada à referida primeira proteína via uma junção de fusão; compreendendo o método uma modificação da sequência de aminoácidos da região de junção que circunda a referida junção de fusão, em que a modificação é realizada por um dos passos seguintes: (i) introdução de um sítio de glicosilação ligado a N ou ligado a 0, (ii) substituição de uma Leu, Vai, Ile, Met, Phe, Tyr ou Trp nos oito aminoácidos mais C-terminais do parceiro de fusão N-terminal na referida proteína de fusão por uma Thr, Ala ou Pro, ou (iii) substituição da sequência de aminoácidos Leu -Ser - Leu - Ser pela sequência de aminoácidos Ala - Thr - Ala - Thr no caso de a primeira proteína ser uma molécula de IgG ou um seu fragmento.
2. Método da reivindicação 1, em que o passo (i) é realizado introduzindo o sítio de glicosilação nos 10, 5 ou 2 aminoácidos da junção de fusão.
3. Método da reivindicação 1, em que o passo (i) é realizado introduzindo uma sequência de aminoácidos Asn - X - Ser/Thr, em que X é qualquer aminoácido,
4. Método da reivindicação 1, em que a primeira proteína é uma molécula de Ig ou um seu fragmento. 2
5. Método da reivindicação 1, em que a primeira proteina é uma molécula de Ig ou um seu fragmento e a segunda proteina é uma citoquina.
6. Método da reivindicação 5, em que - a fim de aumentar a semivida no soro - é realizada uma mutação adicional entre a IgG- e a unidade de citoquina da proteina de fusão substituindo uma lisina C-terminal da unidade de anticorpo por alanina ou leucina.
7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 - 6, em que a região de junção compreende entre 1 e 15 aminoácidos.
8. Método da reivindicação 7, em que a região de junção compreende entre 1 e 9 aminoácidos.
9. Proteina de fusão com imunogenicidade reduzida obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 - 8, em que a referida proteina de fusão é seleccionada do grupo consistindo de: (i) huKS - IL2 compreendendo Ala - Thr - Ala - Thr na sequência de IgG na região de junção em vez de Leu -Ser- Leu - Ser, em que huKS é um anticorpo dirigido contra a molécula de adesão de células epiteliais humanas KSA (EP-CAM); (ii) Fc-IL12-IL2 compreendendo Ala - Thr - Ala - Thr na sequência de IgG na região de junção em vez de Leu -Ser - Leu - Ser, em que Fc é a referida primeira proteina e a proteina de fusão IL12-IL2 é a referida segunda proteina; (iii) proteina de fusão Fc - IL12 -IL2 compreendendo um sitio de glicosilação de Asn - Gly nas primeiras posições na molécula de IL2; em que a proteina de fusão 3 Fc-IL12 é a referida primeira proteína e a IL2 é a referida segunda proteína; (iv) Fc - EPO compreendendo Ala - Thr-Ala -Thr na sequência de IgG na região de junção em vez de Leu -Ser - Leu - Ser; (v) Fc - EPO compreendendo Ala - Thr - Ala - Thr na sequência de IgG na região de junção em vez de Leu -Ser - Leu - Ser, em que a cadeia de Ig é a IgG2 compreendendo uma região charneira da IgGl.
10. Composição farmacêutica compreendendo numa quantidade terapeuticamente eficaz uma proteína de fusão da reivindicação 9 opcionalmente em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
11. Ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão da reivindicação 9. Lisboa, 25 de Fevereiro de 2011
PT02757870T 2001-03-30 2002-03-30 Redução da imunogenicidade de proteínas de fusão PT1373301E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28062501P 2001-03-30 2001-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1373301E true PT1373301E (pt) 2011-03-07

Family

ID=23073904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT02757870T PT1373301E (pt) 2001-03-30 2002-03-30 Redução da imunogenicidade de proteínas de fusão

Country Status (19)

Country Link
US (5) US6992174B2 (pt)
EP (2) EP2311882A1 (pt)
JP (2) JP4638129B2 (pt)
KR (1) KR20030087040A (pt)
CN (1) CN100488984C (pt)
AT (1) ATE490262T1 (pt)
AU (1) AU2002306976B2 (pt)
BR (1) BR0208207A (pt)
CA (1) CA2442363C (pt)
DE (1) DE60238472D1 (pt)
DK (1) DK1373301T3 (pt)
ES (1) ES2356620T3 (pt)
HU (1) HUP0303753A2 (pt)
MX (1) MXPA03008715A (pt)
PL (1) PL209110B1 (pt)
PT (1) PT1373301E (pt)
RU (1) RU2333919C2 (pt)
WO (2) WO2002079415A2 (pt)
ZA (1) ZA200308430B (pt)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1037927T3 (da) 1997-12-08 2004-09-06 Emd Lexigen Res Ct Corp Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
BR9909583A (pt) * 1998-04-15 2002-01-15 Lexigen Pharm Corp Aumento da resposta imune mediado por uma proteìna de fusão anticorpo-citocina por co-administração com inibidor de angiogênese
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CA2380331C (en) * 1999-08-09 2012-11-20 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
CN1270775C (zh) * 2000-06-29 2006-08-23 默克专利有限公司 通过与免疫细胞因子摄入促进剂联合治疗来增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫反应
DK1366067T3 (da) * 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US20120148585A1 (en) * 2001-05-01 2012-06-14 Andrew Saxon Fusion molecules and methods for treatment of immune diseases
CA2446087C (en) 2001-05-03 2013-06-18 Stephen D. Gillies Recombinant tumor specific antibody and use thereof
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
EP1454138B1 (en) 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7657380B2 (en) 2003-12-04 2010-02-02 Xencor, Inc. Methods of generating variant antibodies with increased host string content
WO2005056606A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
CA2498319A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
WO2004045583A1 (ja) * 2002-11-15 2004-06-03 Nipro Corporation リポソーム
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
ATE438662T1 (de) * 2003-03-26 2009-08-15 Apogenix Gmbh Verbesserte fc-fusionsproteine
US20070161087A1 (en) * 2003-05-29 2007-07-12 Wolfgang Glaesner Glp-1 fusion proteins
KR100758755B1 (ko) * 2003-06-12 2007-09-14 일라이 릴리 앤드 캄파니 Ｇｌｐ-1 유사체 융합 단백질
AU2004266159A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
KR20120125634A (ko) 2003-10-16 2012-11-16 마이크로메트 에이지 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
CN100427599C (zh) * 2003-12-26 2008-10-22 吉林大学第一医院 Albsin/il－18mat杂交细胞因子
BRPI0418286A (pt) * 2003-12-30 2007-05-02 Merck Patent Gmbh proteìnas de fusão de il-7
KR20060124656A (ko) * 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
CA2552590A1 (en) * 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
ES2330860T3 (es) * 2004-01-22 2009-12-16 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anticancerosos con fijacion del complemento reducida.
PT1737961E (pt) 2004-03-19 2013-08-26 Merck Patent Gmbh Proteínas buganina modificadas, citotoxinas e métodos e utilizações das mesmas
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
EP2380594B1 (en) 2004-04-06 2019-12-04 Affibody AB Use of a serum albumin binding peptide to reduce the immunogenicity of a protein
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
WO2006019447A1 (en) 2004-07-15 2006-02-23 Xencor, Inc. Optimized fc variants
RU2398882C2 (ru) * 2004-07-22 2010-09-10 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
US8647625B2 (en) 2004-07-26 2014-02-11 Biogen Idec Ma Inc. Anti-CD154 antibodies
EP1799713B1 (en) 2004-09-23 2014-11-05 VasGene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP2332985A3 (en) 2004-11-12 2012-01-25 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
DE602005020837D1 (de) * 2004-12-09 2010-06-02 Merck Patent Gmbh Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität
WO2006068910A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Eli Lilly And Company Glp-1 analog fusion protein formulations
WO2006076594A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
WO2007012188A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Qinghua Wang GLP/1/EXENDM 4 IgG Fc FUSION CONSTRUCTS FOR TREATMENT OF DIABETES
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
NZ569204A (en) 2005-12-21 2012-03-30 Micromet Ag Pharmaceutical compositions with resistance to soluble CEA - comprising antibodies that bind to CD3 and CEA
CA2635623C (en) * 2005-12-30 2015-02-17 Michael Super Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity
DK1966238T3 (da) * 2005-12-30 2012-07-16 Merck Patent Gmbh INTERLEUKIN-12P40-varianter med forbedret stabilitet
EP2441838A3 (en) * 2006-01-24 2013-07-10 Domantis Limited Fusion proteins that contain natural junctions
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
AU2007271398B2 (en) * 2006-07-06 2013-06-20 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of IL-2 mediated immune responses
US20080287320A1 (en) * 2006-10-04 2008-11-20 Codon Devices Libraries and their design and assembly
JP2010510794A (ja) 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
EP2423222B2 (en) 2007-01-30 2020-07-29 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
BRPI0810622A2 (pt) 2007-05-02 2020-10-13 Ambrx, Inc. polipeptídeos de interferon beta modificados e seus usos
EP2167528B1 (en) * 2007-06-21 2018-01-10 Angelica Therapeutics, INC. Modified toxins
US8137979B2 (en) * 2007-06-25 2012-03-20 Qinetiq Limited Preconcentrator device
US8067548B2 (en) 2007-07-26 2011-11-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
EP3492488A1 (en) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
SI2235059T1 (sl) 2007-12-26 2015-06-30 Xencor, Inc. Fc variante s spremenjeno vezjo na fcrn
WO2009110944A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-11 Angelica Therapeutics, Inc. Modified toxins
US10865233B2 (en) 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
DK2393828T3 (en) 2009-02-03 2017-01-23 Amunix Operating Inc Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CN102481341B (zh) 2009-02-23 2017-05-17 希托马克斯医疗有限公司 蛋白原及其使用方法
SG175233A1 (en) * 2009-04-22 2011-11-28 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified fcrn binding sites
DK2440241T3 (en) 2009-06-08 2017-10-02 Amunix Operating Inc GROWTH HORMON POLYPEPTIDES AND PROCEDURES FOR PREPARING AND USING THEREOF
ES2705249T3 (es) 2009-06-08 2019-03-22 Amunix Operating Inc Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso
BRPI1011236A2 (pt) 2009-06-15 2019-07-09 4S3 Bioscience Inc métodos e composições para tratamento de miopatia miotubular usando polipeptídeos quiméricos compreendendo polipeptídeos miotubularesih 1 (mtm1)
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AU2010314798B2 (en) 2009-11-05 2013-10-24 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Treatment of cancer involving mutated KRAS or BRAF genes
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
JP2013519392A (ja) 2010-02-16 2013-05-30 メディミューン，エルエルシー Ｈｓａ関連組成物および使用方法
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
ES2876421T3 (es) * 2011-04-13 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de fusión Fc que comprenden enlazadores o disposiciones nuevos
CN104011072B (zh) * 2011-05-05 2018-10-12 阿尔布梅迪克斯医疗有限公司 白蛋白变体
CN102222177A (zh) * 2011-07-08 2011-10-19 上海生物信息技术研究中心 抗体蛋白的分子改造辅助预测方法
EP2793944A4 (en) 2011-12-23 2015-09-02 Nicholas B Lydon IMMUNOGLOBULINS AND VARIANTS DIRECTED AGAINST PATHOGENIC MICROBES
US9988439B2 (en) 2011-12-23 2018-06-05 Nicholas B. Lydon Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
US10370430B2 (en) 2012-02-15 2019-08-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor VIII proteins
SG11201404885RA (en) 2012-02-15 2014-09-26 Amunix Operating Inc Factor viii compositions and methods of making and using same
EP3406347A3 (en) 2012-02-27 2019-02-13 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
BR112014030404A2 (pt) 2012-06-05 2017-06-27 Amunix Operating Inc proteína de fusão hgh-xten e seu uso no tratamento da deficiência de hormônio do crescimento
ES2773107T3 (es) 2012-10-05 2020-07-09 Kyowa Kirin Co Ltd Composición de proteína heterodimérica
EP2981551B1 (en) 2013-02-20 2020-06-03 Valerion Therapeutics, LLC Methods and compositions for treatment of pompe disease
WO2014141192A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Erasmus University Medical Center Generation of heavy chain-only antibodies
EP2968450A4 (en) 2013-03-15 2016-10-26 Angelica Therapeutics Inc MODIFIED TOXINS
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
EP3077048B1 (en) 2013-12-07 2019-07-17 Case Western Reserve University Compositions and methods of treating thrombosis
US10246501B2 (en) 2014-01-08 2019-04-02 Prosit Sole Biotechnology (Beijing) Co, Ltd Fusion polypeptides and methods of use
EP3094646B1 (en) 2014-01-13 2020-04-15 Valerion Therapeutics, LLC Internalizing moieties
NZ721364A (en) 2014-02-10 2023-04-28 Merck Patent Gmbh Targeted tgfβ inhibition
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
AU2015269210A1 (en) * 2014-06-06 2016-12-08 The California Institute For Biomedical Research Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
WO2016022597A1 (en) 2014-08-04 2016-02-11 Case Western Reserve University Targeting peptides and methods of use
KR20170063881A (ko) 2014-10-02 2017-06-08 시티 오브 호프 다가 메디토프, 메디토프 결합 항체 및 이의 용도
US20170269092A1 (en) 2014-12-02 2017-09-21 Cemm - Forschungszentrum Fuer Molekulare Medizin Gmbh Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies
WO2016149643A2 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 Omnicyte Fusion proteins comprising modified alpha virus surface glycoproteins and tumor associated antigen and methods thereof
EP3322736B1 (en) 2015-07-15 2021-09-01 Prosit Sole Biotechnology (Beijing) Co., Ltd Fusion polypeptides and methods of use
AU2016301303B2 (en) 2015-08-03 2021-10-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
EP3373970A4 (en) 2015-11-13 2019-07-10 Dana Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D IG FUSION PROTEIN FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
EP3387019B1 (en) 2015-12-09 2021-10-20 The Scripps Research Institute Relaxin immunoglobulin fusion proteins and methods of use
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
MX2019001503A (es) 2016-08-12 2019-06-03 Merck Patent Gmbh Tratamiento conjunto contra el cancer.
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
EP3496742A4 (en) 2016-12-01 2020-04-08 University Of South Florida PEPTICORPS, COMPOSITIONS THEREOF, AND METHODS FOR TREATING EAR FIBRILLATION
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN113272017A (zh) 2018-11-01 2021-08-17 默克专利有限公司 抗tim-3抗体
WO2020093024A2 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Merck Patent Gmbh Methods of administering anti-tim-3 antibodies
AU2020327000A1 (en) * 2019-08-08 2022-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel antigen binding molecule formats
JP2023501478A (ja) 2019-11-13 2023-01-18 アミュニックス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド バーコード化されたｘｔｅｎポリペプチドおよびその組成物、ならびにその作製および使用方法

Family Cites Families (243)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3529A (en) * 1844-04-10 yvolfe
US49227A (en) * 1865-08-08 Improvement in construction of railway trains and cars
US348237A (en) * 1886-08-31 richards
US192222A (en) * 1877-06-19 Improvement in watches
US166163A (en) * 1875-07-27 Improvement in bee-hives
US105294A (en) * 1870-07-12 Erasmus w
US166877A (en) * 1875-08-17 Improvement in electric lights
US142374A (en) * 1873-09-02 Improvement in stopping mechanisms for doubling and twisting machines
US147311A (en) * 1874-02-10 Improvement in electric telegraphs
US12789A (en) * 1855-05-01 Office
US44423A (en) * 1864-09-27 Improved screw for music-stools
US53539A (en) * 1866-03-27 Improvement in revolving fire-arms
US81664A (en) * 1868-09-01 Island
US193570A (en) * 1877-07-24 Improvement in washing-boards
US1803686A (en) * 1923-11-23 1931-05-05 Herman A Brassert Gas production
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4469797A (en) * 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4737462A (en) * 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US5082658A (en) * 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4667016A (en) * 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
JPS63267278A (ja) 1986-03-14 1988-11-04 Toray Ind Inc インタ−フエロン結合体を暗号化する塩基配列
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4732683A (en) * 1986-12-02 1988-03-22 Biospectrum, Inc. Purification method for alpha interferon
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
AU600575B2 (en) * 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE122238T1 (de) 1987-06-10 1995-05-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
DE3880766D1 (de) 1987-09-02 1993-06-09 Ciba Geigy Ag Konjugate von interferon alpha mit immunglobulinen.
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
ZA888978B (en) 1987-12-04 1990-07-25 Du Pont Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
DE3812605A1 (de) 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) * 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL91933A (en) 1988-10-11 1994-12-29 Univ Southern California Their immuno-bracelet and isophiles which are beneficial in increasing vascular permeability or blood supply to tumor or otherwise damaged tissue
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6750329B1 (en) * 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
ES2187598T3 (es) 1989-09-20 2003-06-16 Abbott Lab Metodos para producir proteinas de fusion.
AU646822B2 (en) 1989-10-13 1994-03-10 Kirin-Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US5856298A (en) * 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
ATE368112T1 (de) 1989-12-22 2007-08-15 Hoffmann La Roche Zytotoxischer lymphozyten-reifefaktor 40kd untereinheit und monoklonale antikörper spezifisch dafür
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
JPH07507440A (ja) 1990-03-02 1995-08-24 レプリゲン・コーポレーション 結合親和性を高めた抗体構築物
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
EP0541716A1 (en) 1990-07-27 1993-05-19 Repligen Corporation Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
EP0556328A4 (en) 1990-11-09 1994-06-08 Abbott Lab Bridging antibody fusion constructs
WO1992010755A1 (en) 1990-12-05 1992-06-25 Novo Nordisk A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US5709859A (en) * 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993003157A1 (en) 1991-07-29 1993-02-18 Dana Farber Cancer Institute Plasmids for the rapid preparation of modified proteins
US20020037558A1 (en) * 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US5376367A (en) 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
ATE260971T1 (de) 1992-04-01 2004-03-15 Univ Rockefeller Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung
AU687733B2 (en) 1992-04-01 1998-03-05 Rockefeller University, The Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens
CA2131003A1 (en) * 1992-05-26 1993-12-09 Raymond G. Goodwin Novel cytokine that binds cd30
AU4528493A (en) 1992-06-04 1994-01-04 Regents Of The University Of California, The In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
DE69332485T2 (de) 1992-08-11 2003-11-13 Harvard College Immunmodulierende peptide
US5429199A (en) * 1992-08-26 1995-07-04 Kennametal Inc. Cutting bit and cutting insert
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
ES2276390T3 (es) * 1992-11-05 2007-06-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antigeno de membrana especifico de la prostata.
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) * 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) * 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
US5738852A (en) * 1993-04-20 1998-04-14 Solis Therapeutics, Inc. Methods of enhancing antigen-specific T cell responses
AU6709794A (en) 1993-04-21 1994-11-08 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity
US5759551A (en) * 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
AU6776194A (en) 1993-04-28 1994-11-21 Hybritech Incorporated Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking
WO1994025055A1 (en) * 1993-04-29 1994-11-10 Abbott Laboratories Erythropoietin analog compositions and methods
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
IL110669A (en) 1993-08-17 2008-11-26 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
ATE203274T1 (de) 1994-02-01 2001-08-15 Nasa Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten
WO1995028427A1 (en) 1994-04-15 1995-10-26 Imclone Systems Incorporated Chimeric interleukin-3/mutein interleukin-6 lymphokine
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) * 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
CN1309833C (zh) * 1994-04-26 2007-04-11 儿童医学中心公司 血管生成抑制素及其在制备药物中的用途
AU701302B2 (en) 1994-05-13 1999-01-21 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Improvements in or relating to peptide delivery
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
MX9700764A (es) 1994-07-29 1997-05-31 Smithkline Beecham Plc Compuestos novedosos.
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5888773A (en) * 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
ATE208633T1 (de) 1994-09-16 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
EP1621206A1 (en) 1994-12-12 2006-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric cytokines and uses thereof
US6485726B1 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
EP0815224B1 (en) * 1995-03-10 2004-07-21 Genentech, Inc. Receptor activation by gas6
US5719266A (en) * 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
AU5539596A (en) 1995-04-06 1996-10-23 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Anti-obesity agents
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
WO1996040792A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
AU5985996A (en) 1995-06-07 1997-01-15 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
GB9511935D0 (en) 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
NL1000614C2 (nl) * 1995-06-20 1996-12-23 Leer Koninklijke Emballage Werkwijze voor het vervaardigen van een gelamineerd produkt.
US5736852A (en) * 1995-06-21 1998-04-07 Alliedsignal Truck Brake Systems Co. Circuit and method for conditioning a wheel speed sensor signal
EP0836479A2 (en) * 1995-06-30 1998-04-22 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
US6406689B1 (en) * 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
CN1202932A (zh) 1995-10-23 1998-12-23 儿童医学中心公司 治疗用抗血管生成的组合物和方法
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
AU1407997A (en) 1995-12-01 1997-06-19 Beth Israel Hospital Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof
ATE267255T1 (de) 1995-12-27 2004-06-15 Genentech Inc Ob proteinderivate mit verlängerter halbwertzeit
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6080409A (en) * 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US7063958B1 (en) 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
WO1997030089A1 (en) 1996-02-13 1997-08-21 Regents Of The University Of California Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same
US5756541A (en) 1996-03-11 1998-05-26 Qlt Phototherapeutics Inc Vision through photodynamic therapy of the eye
AU2527397A (en) 1996-03-13 1997-10-01 Protein Design Labs, Inc. Fas ligand fusion proteins and their uses
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
CA2205757C (en) * 1996-05-30 2006-01-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridazinone derivatives and their use as inhibitors of prostaglandin g/h synthase i and ii(cox i and ii)
US5922685A (en) * 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
AU3588097A (en) 1996-07-02 1998-01-21 Bar-Ilan University Retinoyloxy(substituted)alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases
WO1998006752A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 The Rockefeller University A leptin binding protein and its use in methods for diagnosing and treating abnormalities of the endogenous leptin pathway
EP0826696B1 (de) * 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
EA004790B1 (ru) 1996-12-20 2004-08-26 Амген Инк. Композиции на основе слитого белка ов и способы их применения
US6737057B1 (en) 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) * 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998046264A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 G.D. Searle & Co. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
CN1202862C (zh) 1997-04-17 2005-05-25 安姆根有限公司 包含具有抗体Fc链的稳定、有活性人OB蛋白的结合物的组合物及方法
EP0983303B1 (en) * 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
GB9712892D0 (en) 1997-06-20 1997-08-20 Eclagen Ltd Identification of mhc binding peptides
AU8182298A (en) * 1997-07-10 1999-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
DE69838552T2 (de) * 1997-07-14 2008-05-21 Bolder Biotechnology, Inc., Louisville Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
DK1037927T3 (da) * 1997-12-08 2004-09-06 Emd Lexigen Res Ct Corp Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering
HUP0100813A3 (en) 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
BR9909583A (pt) 1998-04-15 2002-01-15 Lexigen Pharm Corp Aumento da resposta imune mediado por uma proteìna de fusão anticorpo-citocina por co-administração com inibidor de angiogênese
HUP0101343A3 (en) 1998-04-17 2003-10-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
WO1999054484A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
WO1999058662A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6620382B1 (en) * 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
JP2002517186A (ja) 1998-06-03 2002-06-18 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション エンドスタチンタンパク質を含むタンパク質オリゴマー組成物およびその使用方法
EP1088084B1 (en) 1998-06-15 2006-09-13 GTC Biotherapeutics, Inc. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1107989B1 (en) 1998-08-25 2010-03-31 Merck Patent GmbH Expression and export of angiostatin and endostatin as immunofusins
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) * 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
DK1813624T3 (da) 1998-10-23 2010-11-22 Amgen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til forebyggelse og behandling af anæmi
WO2000034317A2 (en) * 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
KR20020007287A (ko) * 1999-01-07 2002-01-26 추후보정 Ｆｃ 융합 단백질로서 항-비만 단백질의 발현 및 이출
PT1151102E (pt) * 1999-02-12 2006-07-31 Amgen Inc Composicoes de leptina glicosilada e metodos afins
KR100922809B1 (ko) 1999-05-06 2009-10-21 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
AU766507B2 (en) 1999-05-07 2003-10-16 Genentech Inc. Novel chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6348192B1 (en) * 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
DE60035871T2 (de) * 1999-05-19 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
AU5617900A (en) 1999-06-17 2001-01-09 Robert C. Gallo Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
PE20010288A1 (es) * 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) * 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CA2380331C (en) 1999-08-09 2012-11-20 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
JP2003514552A (ja) 1999-11-12 2003-04-22 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
ATE526039T1 (de) * 2000-02-24 2011-10-15 Philogen Spa Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US6946134B1 (en) * 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
HUP0302299A2 (hu) * 2000-05-12 2003-10-28 Neose Technologies, Inc. Rekombináns glikopeptidek glikozilezési mintázatának in vitro módosítása
CN1270775C (zh) * 2000-06-29 2006-08-23 默克专利有限公司 通过与免疫细胞因子摄入促进剂联合治疗来增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫反应
WO2002057435A2 (en) * 2001-01-18 2002-07-25 Merck Patent Gmbh Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
AU2002233340B2 (en) * 2001-02-19 2008-05-22 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
EP1998266A3 (en) 2001-02-19 2009-02-11 Merck Patent GmbH Method for identification of T-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
DK1366067T3 (da) * 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
CA2446087C (en) 2001-05-03 2013-06-18 Stephen D. Gillies Recombinant tumor specific antibody and use thereof
US7371371B2 (en) 2001-08-13 2008-05-13 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
EP1454138B1 (en) * 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
CA2479212A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US6996009B2 (en) * 2002-06-21 2006-02-07 Micron Technology, Inc. NOR flash memory cell with high storage density
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
BRPI0418286A (pt) * 2003-12-30 2007-05-02 Merck Patent Gmbh proteìnas de fusão de il-7
KR20060124656A (ko) 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
ES2330860T3 (es) 2004-01-22 2009-12-16 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anticancerosos con fijacion del complemento reducida.
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
DE602005020837D1 (de) * 2004-12-09 2010-06-02 Merck Patent Gmbh Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
CA2635623C (en) 2005-12-30 2015-02-17 Michael Super Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity
DK1966238T3 (da) * 2005-12-30 2012-07-16 Merck Patent Gmbh INTERLEUKIN-12P40-varianter med forbedret stabilitet
CN101346395A (zh) 2005-12-30 2009-01-14 默克专利有限公司 阻止复合有IL-6Rα的IL-6与GP130结合的抗IL-6抗体
PL1999154T3 (pl) 2006-03-24 2013-03-29 Merck Patent Gmbh Skonstruowane metodami inżynierii heterodimeryczne domeny białkowe
AU2007271398B2 (en) * 2006-07-06 2013-06-20 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of IL-2 mediated immune responses

Also Published As

Publication number Publication date
US7601814B2 (en) 2009-10-13
US20150141626A1 (en) 2015-05-21
JP5291671B2 (ja) 2013-09-18
US20060025573A1 (en) 2006-02-02
WO2002079232A2 (en) 2002-10-10
ZA200308430B (en) 2004-09-03
US20030166877A1 (en) 2003-09-04
JP2004532020A (ja) 2004-10-21
MXPA03008715A (es) 2003-12-11
WO2002079415A2 (en) 2002-10-10
EP1373301B1 (en) 2010-12-01
RU2333919C2 (ru) 2008-09-20
RU2003129523A (ru) 2005-04-20
CN1531545A (zh) 2004-09-22
DE60238472D1 (de) 2011-01-13
HUP0303753A2 (hu) 2004-03-01
EP2311882A1 (en) 2011-04-20
US20100016562A1 (en) 2010-01-21
US6992174B2 (en) 2006-01-31
KR20030087040A (ko) 2003-11-12
AU2002306976B2 (en) 2008-01-03
EP1373301A4 (en) 2005-12-21
CN100488984C (zh) 2009-05-20
PL366826A1 (en) 2005-02-07
DK1373301T3 (da) 2011-01-31
ES2356620T3 (es) 2011-04-11
BR0208207A (pt) 2004-09-28
CA2442363A1 (en) 2002-10-10
US7973150B2 (en) 2011-07-05
EP1373301A2 (en) 2004-01-02
ATE490262T1 (de) 2010-12-15
CA2442363C (en) 2013-10-29
JP2010222380A (ja) 2010-10-07
US20120309936A1 (en) 2012-12-06
JP4638129B2 (ja) 2011-02-23
US8926973B2 (en) 2015-01-06
WO2002079232A3 (en) 2002-12-12
PL209110B1 (pl) 2011-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT1373301E (pt) Redução da imunogenicidade de proteínas de fusão
AU2002306976A1 (en) Reducing the immunogenicity of fusion proteins
JP2005501547A (ja) 修飾された第ｉｘ因子
JP2004532617A (ja) 低減された免疫原性を有する修飾されたヒト脳由来の好中性因子（ｂｄｎｆ）
JP2004529633A (ja) 低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンベータ
KR20030074790A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 인터루킨-1 수용체길항제(ｉｌ-1ｒａ)
JP2004535173A (ja) 低減された免疫原性を有する修飾されたインターフェロンアルファ
JP2004535777A (ja) 低減された免疫原性を有する修飾された顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｍ−ｃｓｆ）
KR20030081480A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 변형된 모양체 신경자극 인자（ｃｎｔｆ）
JP2005501546A (ja) 修飾されたヒト成長ホルモン
EP1392731B1 (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (g-csf) with reduced immunogenicity
JP2005535304A (ja) 低減された免疫原性を有する修飾されたｂｒｙｏｄｉｎ１
KR20030077632A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 트롬보포이에틴
KR20030085007A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 변형된 인슐린
AU2002257579A1 (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) with reduced immunogenicity