JP2023501478A - バーコード化されたxtenポリペプチドおよびその組成物、ならびにその作製および使用方法 - Google Patents
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Abstract
プロテアーゼ消化時に遊離可能で、全ての他のタンパク分解性に遊離可能な断片から検出可能な、複数の重複する配列モチーフおよび一つ以上のバーコード断片からなる拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドが本明細書に開示される。これらのポリペプチドのある特定の実施形態は、生物学的に活性なポリペプチドをさらに含み、その有利な実施形態は、XTENポリペプチドと生物学的に活性なポリペプチドの間の結合を切断するタンパク質分解性切断可能な遊離可能なセグメントを含む。前記ポリペプチドを作製する方法および使用する方法も開示される。【選択図】図3
Description
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2020年11月6日に作成された当該ASCIIコピーは、20-1761-WO_Sequence_Listing_ST25.txtと名付けられ、サイズは1494バイトである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2020年11月6日に作成された当該ASCIIコピーは、20-1761-WO_Sequence_Listing_ST25.txtと名付けられ、サイズは1494バイトである。
ポリペプチドは、ポリペプチドの混合物をもたらす様式で生成することができる。ポリペプチドの混合物は、多くの場合、そのサイズのバリアント(例えば、切断)と共に全長ポリペプチドを含み得る。サイズが所望の全長生成物と異なるバリアントの存在は、ポリペプチド原薬の生物学的挙動に影響を与え、ポリペプチド原薬の安全性および/または有効性に影響を与える可能性がある。例えば、癌療法のためのタンパク質ベースのプロドラッグは、腫瘍標的化活性化機序を用いて操作することができる。より具体的には、全長治療用タンパク質は、不活性(非細胞毒性)なプロドラッグ形態で生成され、投与されてもよく、これは、意図される生物学的側面(例えば、腫瘍)でプロドラッグポリペプチドの一部の優先的な除去によって活性な薬物に変換される。完全長構築物の切断バリアントは、保護配列を失い、細胞傷害性(活性)となり得、これにより、プロドラッグ組成物に「混入し」、意図される生物学的部位外で意図せずに活性である構成要素を有する混合物が生成される。ある場合では、このようなより短い長さのバリアントは、全長タンパク質と比較して、免疫原性のリスクをより大きくし、腫瘍細胞に対してより低い選択的毒性を有し、またはあまり所望の薬物動態特性を示し得ない(例えば、治療ウィンドウの縮小をもたらす)か、または意図される部位(例えば、健康な組織において)外でレシピエントにおいて意図されない効果を有害に有する。結果として、タンパク質構造バリエーションの検出および定量は、生物学的治療剤の生物学的特性(例えば、臨床安全性および薬理学的有効性)の評価、および新規の生物学的治療剤の開発(例えば、有効性が増加し、副作用が低減した)に重要であり得る。「混入している」切断生成物の量を同定し、定量するための既存の技術および方法は、限定された感度、容易さ、効率、または有効性など、一つまたは複数の欠点を含み得る。
複数の重複しない配列モチーフからなる拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドが本明細書に開示される。本発明のXTENポリペプチドにおいて、複数の重複しない配列モチーフは、重複しない配列モチーフのセットを含み、当該配列モチーフの各々は、XTENポリペプチドにおいて少なくとも2回繰り返され、また、XTENポリペプチド内で1回のみ生じる固有の重複しない配列モチーフであって、ポリペプチドは、プロテアーゼによる消化時にポリペプチドから遊離可能な第一のバーコード断片をさらに含む。前述の実施形態では、第一のバーコード断片は、XTEN内で1回のみ生じ、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能なすべての他のペプチド断片と配列および分子量が異なる配列モチーフの少なくとも一部を含むXTENの一部である。さらに、本明細書に提供される本発明のXTENの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸を含まない。本明細書にさらに開示されるように、本発明のXTENポリペプチドは、少なくとも150アミノ酸長、より具体的には、150~3000アミノ酸長を含むとして特徴付けられる。本発明のXTENポリペプチドを含むアミノ酸が特徴付けられ、これらの残基の少なくとも90%が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)、またはプロリン(P)であり、XTENポリペプチドが、これらのアミノ酸(G、A、S、T、E、またはP)のうちの少なくとも四つを含む。さらに、本明細書に提供されるXTENポリペプチドは、長さが9~14のアミノ酸配列である重複しない配列モチーフを含み、前述の重複しないモチーフの各々内で、G、A、S、T、E、またはPアミノ酸の配列は、XTENポリペプチドを含む任意の他の重複しない配列モチーフに関して実質的に無作為化される。
いくつかの実施形態では、バーコード断片は、XTEN中の別のグルタミン酸にすぐ隣接するグルタミン酸を含まない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、そのC末端にグルタミン酸を有する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、グルタミン酸残基のすぐ前にあるN末端アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、N末端アミノ酸に先行するグルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基にすぐ隣接しない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、グルタミン酸の直後がプロリンでない限り、バーコード断片のC末端以外の位置にグルタミン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端またはポリペプチドのC末端のいずれかから10アミノ酸~150アミノ酸に位置する。
いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのセットの配列モチーフは、配列番号182~203および1715~1722によって本明細書において同定される。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのセットの配列モチーフは、配列番号186~189によって本明細書において同定される。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのセットは、配列番号186~189の配列モチーフのうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、本明細書に開示されるXTENポリペプチドを含み、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸を含まず、XTEN中の別のグルタミン酸にすぐ隣接するグルタミン酸を含まず、そのC末端にグルタミン酸を有し、グルタミン酸残基のすぐ前にあるN末端アミノ酸を有し、ポリペプチドのN末端またはポリペプチドのC末端のいずれかから10アミノ酸~125アミノ酸に位置する。
これらの実施形態のいくつかでは、N末端アミノ酸に先行するグルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基にすぐ隣接しない。これらの実施形態のいくつかでは、バーコード断片は、グルタミン酸の直後がプロリンでない限り、バーコード断片のC末端以外の位置にグルタミン酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるXTENポリペプチドは、複数の重複しない配列モチーフを含み、各々の前述の配列モチーフは、XTENポリペプチドにおいて少なくとも2回繰り返され、9~14アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのセットの配列モチーフは、配列番号182~203および1715~1722によって本明細書において同定される。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのセットの配列モチーフは、配列番号186~189によって本明細書において同定される。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのセットは、配列番号186~189の配列モチーフのうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%は、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)またはプロリン(P)の組み合わせであり、XTENポリペプチドは、これらのアミノ酸(G、A、S、T、E、またはE)のうちの少なくとも四つを含む。いくつかの実施形態では、XTENは、150~3000アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、XTENは、150~1000アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、後がプロリンでないグルタミン酸残基のC末端側で切断するプロテアーゼによって切断され得る。ある特定の実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。
本明細書に提供されるXTENポリペプチドのいくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端の200、150、100、または50アミノ酸内に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、タンパク質のN末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのC末端の200、150、100、または50アミノ酸内に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、タンパク質のC末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、少なくとも4アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、4~20、5~15、6~12、または7~10アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、配列番号8020~8030(BAR001-BAR011)により本明細書において同定される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第二のバーコード断片をさらに含み、第二のバーコード断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なるXTENの一部である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第三のバーコード断片をさらに含み、第三のバーコード断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なるXTENの一部である。
いくつかの実施形態では、XTENは、配列番号8001~8019により本明細書において同定される配列と少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、XTENは、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、または少なくとも500アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、XTENポリペプチド(BPXTEN)に連結された生物学的に活性なポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、XTENのアミノ末端またはカルボキシル末端で生物学的に活性なポリペプチドに連結される。いずれの配置においても、バーコード断片は、生物学的に活性なポリペプチドに連結されたアミノ末端またはカルボキシル末端から測定された場合、XTENの長さの5%~50%、7%~40%、または10%~30%を拡大するXTENの領域内に位置する。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、プロテアーゼによる消化時にポリペプチドから遊離可能な一つまたは複数の参照断片をさらに含み、一つまたは複数の参照断片は各々、生物学的に活性なポリペプチドの一部を含む。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の参照断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる単一の参照断片である。いくつかの実施形態では、前述の参照断片は、ポリペプチド混合物中の存在が、その存在または完全性を示す(すなわち、タンパク質が分解されていないか、またはタンパク分解性に切断されていない)ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、XTENと生物学的に活性なポリペプチドの間に位置する第一の放出セグメント(RS1)をさらに含む。いくつかの実施形態では、RS1は、表4a~4hにおける配列のいずれか一つにより本明細書において同定される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、表4a~4hおよび8a~8bの配列のいずれか一つまたは組み合わせにより本明細書において同定される。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、XTENに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも2倍長い終末相半減期を有利に有する。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、有利には、XTENに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、より低い免疫原性であり、免疫原性は、同等の用量のヒトまたは動物への投与後に生物学的に活性なポリペプチドに選択的に結合するIgG抗体の生成を測定することによって確認することができる。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、約6より大きい生理学的条件下での見かけの分子量係数を呈する。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、第二のXTENポリペプチドをさらに含み、第二のXTENポリペプチドは、上記およびBPXTENのこれらの実施形態の第一のXTEN構成要素についての本開示全体を通じて記載されるいくつかの特徴を有するアミノ酸配列を含み、第一のXTENポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドのN末端に位置し、第二のXTENポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドのC末端に位置する。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、BPXTENのこれらの実施形態を含む第一のXTENのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第二のXTENポリペプチドのアミノ酸配列は、第一のXTENポリペプチドのアミノ酸配列よりも長い。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドと第二のXTENポリペプチドの間に位置する第二の放出セグメント(RS2)をさらに含む。いくつかの実施形態では、第一のXTENポリペプチドのRS1および第二のXTENポリペプチドのRS2は、配列が同一である。いくつかの実施形態では、第一のXTENポリペプチドのRS1および第二のXTENポリペプチドのRS2は各々、各々の放出セグメント配列内の一つ、または二つ、もしくは三つ、またはそれ以上の切断部位での複数のプロテアーゼによる切断の基質である。
これらの実施形態のいくつかでは、BPXTENポリペプチドは、第二のXTENポリペプチドの一部であり、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なるバーコード断片をさらに含む。これらの実施形態のいくつかでは、さらなるバーコード断片は、ポリペプチドのC末端アミノ酸を含まない。これらの実施形態のいくつかでは、さらなるバーコード断片は、そのC末端にグルタミン酸残基を含む。これらの実施形態のいくつかでは、第二のXTENポリペプチドのさらなるバーコード断片は、BPXTENポリペプチドの第二のXTEN構成要素のC末端の200、150、100、または50アミノ酸以内に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、第二のXTENポリペプチドのさらなるバーコード断片は、BPXTENポリペプチドの第二のXTEN構成要素のC末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間の位置に位置する。これらの実施形態のいくつかでは、さらなるバーコード断片は、4~20、5~15、6~12、または7~10アミノ酸長である。これらの実施形態のいくつかでは、さらなるバーコード断片は、配列番号8020~8030(BAR001-BAR011)により本明細書において同定される。
いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、さらなるバーコード断片および少なくとも一つの追加のバーコード断片を含むバーコード断片のセットをさらに含み、バーコード断片のセットの各バーコード断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にBPXTENポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、配列番号8001~8019により同定される。いくつかの実施形態では、さらなるバーコード断片は、ポリペプチド中の別のグルタミン酸残基にすぐ隣接するグルタミン酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%は、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)およびプロリン(P)の組み合わせであり、XTENポリペプチドは、これらのアミノ酸(G、A、S、T、E、またはP)のうちの少なくとも四つを含む。いくつかの実施形態では、第一のXTENポリペプチド中のアミノ酸の総数および第二のXTENポリペプチド中のアミノ酸の総数の合計は、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも800のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、複数の重複しない配列モチーフを含み、前述の配列モチーフの各々は、第二のXTENポリペプチド配列において少なくとも2回繰り返され、長さが9~14アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドについて、複数の重複しない配列モチーフの配列モチーフは、配列番号182~203および1715~1722により本明細書において同定される。いくつかの実施形態では、複数の重複しない配列モチーフの配列モチーフは、配列番号186~189により本明細書において同定される。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドについて、複数の重複しない配列モチーフは、以下のモチーフである配列番号186~189のうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、150~3000アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、150~1000アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、配列番号8001~8019により本明細書において同定されるに対して少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、または少なくとも500アミノ酸長である。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるBPXTENポリペプチドは、タンデムに共有結合された第一および第二の生物学的に活性なポリペプチドに共有結合された、ポリペプチドのC末端に近位の第一のRS配列を含むが、ポリペプチドのC末端を含まない第一のXTENポリペプチドを含み、第二のXTENポリペプチドは、タンデムに結合された生物学的に活性なポリペプチドのC末端に共有結合され、第二のXTENポリペプチドは、第二のXTENポリペプチドのN末端に近位の第二のRS配列を含むが、第二のXTENポリペプチドのN末端を含まず、第一および第二のRS配列は、同じであるか、または異なっていてもよい。特定の実施形態では、第二のXTENポリペプチドは、第一のXTENポリペプチドのアミノ酸配列より長いアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第一もしくは第二の生物学的に活性なタンパク質または両方が、特異的結合タンパク質を含み、ある特定の実施形態では、特異的結合タンパク質は、所望の生物学的部位で発現される抗原またはアゴニストに特異的に結合する。特定の実施形態では、所望の生物学的部位は腫瘍であり、抗原は腫瘍特異的抗原である。特定の実施形態では、第一および第二の生物学的に活性なポリペプチドは、異なり、非限定的に、異なる特異的結合親和性を有するものを含む。
本明細書に開示される任意のXTENもしくはBPXTENポリペプチドなどのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは前述のポリヌクレオチドの逆相補鎖を含む核酸が、本明細書にさらに開示される。
本明細書に開示される任意のポリヌクレオチド配列および前述のポリヌクレオチドの発現または他の生物学的活性を調節する、ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結された制御配列を含む発現ベクターもまた、本明細書に開示される。
本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。これらの実施形態のいくつかでは、宿主細胞は、大腸菌である。いくつかの代替の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物の細胞である。
加えて、本明細書に開示されるポリペプチドおよび一つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、動物、特に、ヒトへの投与のため製剤化され、前述の投与は、任意の治療上有効な投与経路によるものであってもよく、本明細書に開示される医薬組成物は、当該技術分野で公知の、特に、投与経路、部位、およびヒトまたは動物に対する意図される効果に適合した任意の製剤において調製され、使用され得る。
ヒトまたは動物における疾患、障害、または状態の治療のための医薬の調製における本明細書に開示されるポリペプチド、特に、BPXTENポリペプチドの使用が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または状態は癌であってもよい。
本明細書において上で、および本開示全体を通じて開示されたヒトまたは動物における疾患を治療する方法であって、それを必要とするヒトまたは動物に一つ以上の、治療有効用量の医薬組成物を投与することを含む方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、臨床上適切なスケジュールで、毎日、毎週、毎月、または毎年、臨床上適切な用量で投与される一つ以上の治療有効用量として、ヒトまたは動物に投与される。
様々な長さの、複数のポリペプチド、具体的には、本明細書に開示されるXTENおよびBPXTENポリペプチドを含む混合物であって、
第一のポリペプチドセットであって、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能で、第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、第一のポリペプチドセット;および
第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く第二のポリペプチドセット、を含み;
第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により生成される参照断片を含み;
参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比が、0.7より大きい、混合物が本明細書に開示される。
第一のポリペプチドセットであって、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能で、第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、第一のポリペプチドセット;および
第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く第二のポリペプチドセット、を含み;
第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により生成される参照断片を含み;
参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比が、0.7より大きい、混合物が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.8、0.9、0.95、または0.98より大きい。いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、グルタミン酸残基のC末端側で切断するプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットを含むポリペプチドからのバーコード放出は、ペプシン、エラスターゼ、サーモリシン、またはGlu-Cプロテアーゼにより促進される。いくつかの実施形態では、バーコード放出は、Glu-Cプロテアーゼにより促進される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書に記載される少なくとも一つのXTENポリペプチドを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットは、全長ポリペプチドを含み、バーコード断片は、全長ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に開示される任意のポリペプチド、特に、XTENおよびBPXTENポリペプチドである。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、全長ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸のいずれかを含まない。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはNとC末端切断の両方に起因して互いに異なる。
様々な長さのポリペプチド、特に、本明細書に開示されるXTENおよびBPXTENポリペプチドを含む混合物において、混合物中の第二のポリペプチドセットに対する混合物中の第一のポリペプチドセットの相対量を評価する方法であって、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドは、ポリペプチドで1回および1回のみ生じるバーコード断片を共有し、第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドは、第一のセットのポリペプチドにより共有されるバーコード断片を欠き、第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方の個々のポリペプチド各々は、参照断片を含み、
混合物を、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの切断から生じる複数のタンパク分解性断片を生成するためのプロテアーゼと接触させること、複数のタンパク分解性断片は、複数の参照断片および複数のバーコード断片を含み;および
参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定し、これにより、第二のポリペプチドセットに対する第一のポリペプチドセットの相対量を評価することを含む、方法が本明細書に開示される。
混合物を、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの切断から生じる複数のタンパク分解性断片を生成するためのプロテアーゼと接触させること、複数のタンパク分解性断片は、複数の参照断片および複数のバーコード断片を含み;および
参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定し、これにより、第二のポリペプチドセットに対する第一のポリペプチドセットの相対量を評価することを含む、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、後にプロリン残基がないグルタミン酸残基のC末端側上の様々な長さのポリペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。いくつかの実施形態では、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定することは、ポリペプチドの混合物が、プロテアーゼと接触された後に、混合物由来のバーコード断片および参照断片を定量することを含む。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、それらのそれぞれの質量に基づき同定される。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、質量分析を介して同定される。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を介して同定される。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比を決定することは、等圧標識または安定な同位体標識を含む。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比を決定することは、混合物を同位体標識された参照断片および同位体標識されたバーコード断片の一方または両方に添加することを含む。
これらの実施形態のいくつかでは、様々な長さのポリペプチドは、全長ポリペプチドおよびその切断断片を含む。これらの実施形態のいくつかでは、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはN末端とC末端切断に起因して互いに異なる。これらの実施形態のいくつかでは、参照断片に対するバーコード断片の量の比は、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.98、または0.99より大きい。
複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物であって、第一のポリペプチドセットを含み、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドは、プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能であり、第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量が異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、混合物が本明細書に開示される。前述の実施形態はまた、第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く第二のポリペプチドセットを含み、第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含む。前述の実施形態では、プロテアーゼ消化後のポリペプチド混合物において定量される参照断片の数は、混合物中の第一および第二のポリペプチドセットの数の合計と等しく、プロテアーゼ消化後のポリペプチド混合物において定量されるバーコード断片の数は、混合物中の第一のポリペプチドセットの数と等しく、前述の実施形態では、第一のポリペプチドセットは、参照断片を含み、参照断片を含む混合物中のポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.7より大きい。
いくつかの実施形態では、混合物は、0.8、0.9、または0.95より大きい、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比を有する。
特定の実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる。代替の実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで2回生じる。
いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットは、全長ポリペプチドを含み、バーコード断片は、全長ポリペプチドの一部である。
いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドを含む。
特定の実施形態では、混合物バーコード断片は、全長ポリペプチドのN末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を含まない。
いくつかの実施形態では、混合物は、全長ポリペプチドの、N末端切断、C末端切断、またはN末端とC末端切断の両方に起因して互いに異なる様々な長さのポリペプチドを含有する。
いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる。代替の実施形態では、第一のポリペプチドセットにおける参照断片の数は、第二のポリペプチドセットにおける参照断片の数と異なり得るが、各セットの各ポリペプチドにおけるその数は、同じでなければならない。
一つの特定の実施形態では、混合物のポリペプチドにおける参照断片の各々は、全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有する。
複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物であって、第一のポリペプチドセットを含み、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドは、
プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能であり、第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、混合物が本明細書に開示される。混合物は、第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く第二のポリペプチドセットをさらに含み、第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含む。混合物中のポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、方程式:
[バーコード含有ポリペプチド]/[(参照ペプチド含有ポリペプチド)×N]を有し、
式中、Nは、混合物中の各ポリペプチドから放出される参照ペプチドの発生数であり、第一のポリペプチドセットが、一つの参照断片を含むとき、
参照断片を含む混合物中のポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.7より大きい。
プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能であり、第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、混合物が本明細書に開示される。混合物は、第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く第二のポリペプチドセットをさらに含み、第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含む。混合物中のポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、方程式:
[バーコード含有ポリペプチド]/[(参照ペプチド含有ポリペプチド)×N]を有し、
式中、Nは、混合物中の各ポリペプチドから放出される参照ペプチドの発生数であり、第一のポリペプチドセットが、一つの参照断片を含むとき、
参照断片を含む混合物中のポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.7より大きい。
特定の実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.8、0.9、または0.95より大きい。
いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。
いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで2回生じる。
特定の実施形態では、第一のポリペプチドセットは、全長ポリペプチドを含み、バーコード断片は、全長ポリペプチドの一部である。
いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドを含む。特定の実施形態では、バーコード断片は、全長ポリペプチドのN末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を含まない。
いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはN末端とC末端切断に起因して互いに異なる。
いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる。さらなる実施形態では、第一のポリペプチドセットにおける参照断片の数は、第二のポリペプチドセットにおける参照断片の数と異なり得るが、各セットの各ポリペプチドにおけるその数は、同じでなければならない。いくつかの実施形態では、混合物のポリペプチドにおける参照断片の各々は、全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有する。
本明細書に開示される混合物中の第一のポリペプチドセットを含むポリペプチドの配列完全性を検出する方法であって、ポリペプチドの混合物を、第一のポリペプチドセットからバーコード断片および参照断片を放出し、第二のポリペプチドセットから参照断片を放出するプロテアーゼで消化する工程、ならびに第一および第二のポリペプチドセット由来の参照断片に対する第一のポリペプチドセット由来のバーコード断片の比を決定する工程を含む、方法が本明細書に開示される。特定の実施形態では、第一のポリペプチドセットのポリペプチドの配列完全性は、第一および第二のポリペプチドセットを含むポリペプチド中のバーコード断片および参照断片数に基づく断片の予測比に対する断片の比の比較により検出される。
本明細書において企図される方法は、例えば、LC/MSを用いた、バーコードおよび/または参照断片を含有するポリペプチドの定性的および定量的解析に容易に受け入れられる。一つの特定の実施形態では、LC/MSは、定量的であり、同位体的に区別可能な量のバーコード断片、参照断片、または両方を検出する。例示的なこのような方法において、ポリペプチドの混合物に、公知の量の、このような解析を促進するための「標準物質」が添加される。例えば、このような標準物質は、解析されるべき複数の様々な長さのポリペプチドの前述の混合物の同位体的に標識されたバージョンを含むものである。この同位体的に標識された標準は、前述のプロテアーゼによる消化の前に、完全配列として混合物に加えられてもよい。あるいは、様々な長さのポリペプチドおよび同位体的に標識された標準物質の混合物の試験試料は、別々の反応においてプロテアーゼにより消化され、プロテアーゼにより消化された同位体的に標識された標準物質は、LC/MSによる解析の前に試験試料に加えられる。本発明の方法は、試験試料由来のバーコード断片、参照断片または両方の量を、バーコード断片、参照断片、または両方の検出された同位体的に区別可能な量の定量に対する比較により定量することをさらに含む。
これらの実施形態のバリエーションおよび修飾は、本開示を検討した後に当業者にとって生じるであろう。前述の特徴および態様は、本明細書に記載される一つ以上の他の特徴との、任意の組み合わせおよび半組み合わせ(複数の従属的な組み合わせおよび半組み合わせを含む)で備えることができる。任意のその構成要素を含む、上記または上で説明される様々な特徴は、他の実施形態で組み合わせるか、または統合することができる。さらに、ある特定の特徴は、省略されるか、または備えられないことがある。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の様々な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のさらなる理解は、本発明の原理が利用される例証的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態および添付の図面を参照することにより得ることができる。
特許または出願ファイルは、少なくとも一つの色付きの図面を含む。色付きの図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、要請があり、必要な料金を支払うと庁により提供される。
用語
本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が別段明確に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語を、本明細書において互換的に使用して、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖または分岐であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質形成、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびDまたはL光学異性体の両方を含むが、これらに限定されない、天然および/もしくは非天然または合成アミノ酸のいずれか、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を指す。標準の一文字または三文字コードを使用して、アミノ酸が指定される。
「宿主細胞」は、ヒトベクターまたは動物ベクターのレシピエントであってもよく、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれる。子孫は、天然に存在するかまたは遺伝子操作されたバリエーションに起因して、元の親細胞に必ずしも完全に同一ではない(全DNA相補鎖の形態において、またはゲノムにおいて)。
「キメラ」タンパク質は、天然で生じる位置とは異なる配列内の位置に領域を含む少なくとも一つのポリペプチドを含有する。領域は、通常、別々のタンパク質に存在し得、融合ポリペプチド中で一緒にされるか、または通常、同じタンパク質に存在し得るが、融合ポリペプチド中で新たな配置で配置される。前述のタンパク質は、「コンジュゲートされる」、「連結される」、「融合される」、または「融合」タンパク質として記載することができ、これらの用語は、本明細書において互換的に使用され、化学コンジュゲーションまたは組み換え手段を含む任意の手段による、二つのさらなるポリペプチド配列の結合を指す。キメラタンパク質は、例えば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することにより作製され得る。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知であるか、または発見もしくは開発されるべき任意の機能を遂行し得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリー前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに修飾され得る。
「ポリヌクレオチドの相補鎖」という用語は、参照配列と比較して相補性の塩基配列および逆の向きを有するヌクレオチド分子を示し、これは、完全な忠実性で参照配列とハイブリダイズすることができる。
本明細書で使用される場合、「相同性」を有するか、または「相同」であるポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、これらの配列に対して少なくとも70%、好ましくは、少なくとも80%、より好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは、95%、より好ましくは、97%、より好ましくは、98%、およびなおより好ましくは、99%の配列同一性を有するものである。
ポリヌクレオチド配列に適用される「パーセント同一性」および「%同一性」という用語は、標準化されたアルゴリズムを使用して整列させた少なくとも二つのポリヌクレオチド配列の間の残基一致のパーセンテージを指す。このようなアルゴリズムは、二つの配列間のアライメントを最適化するために比較される配列内にギャップを標準化され、再現可能な方法で挿入し、それ故に、二つの配列のより有意義な比較を達成することができる。パーセント同一性は、例えば、特定の配列番号により定義される、完全な定義されるポリヌクレオチド配列の長さにわたり測定することができるか、またはより短い長さにわたり、例えば、より長い定義されるポリヌクレオチド配列、例えば、少なくとも45、少なくとも60、少なくとも90、少なくとも120、少なくとも150、少なくとも210もしくは少なくとも450の連続する残基から取られた断片の長さにわたり測定することができる。このような長さは、例示に過ぎず、本明細書、表、図または配列表に示される配列により支持される任意の断片長を使用して、同一性パーセンテージが測定され得る長さを記載することができることは、理解される。
本明細書において同定されるポリペプチド配列に関して、「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するため、かつ配列同一性の一部分としてしての保存的置換を考慮せず、配列を整列させ、ギャップを導入した後に、第二の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基と同一のクエリー配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術の範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。パーセント同一性は、例えば、特定の配列番号により定義される、完全な定義されるポリペプチド配列の長さにわたり測定することができるか、またはより短い長さにわたり、例えば、より長い定義されるポリペプチド配列、例えば、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも70もしくは少なくとも150の連続する残基から取られた断片の長さにわたり測定することができる。このような長さは、例示に過ぎず、本明細書、表、図または配列表に示される配列により支持される任意の断片長を使用して、同一性パーセンテージが測定され得る長さを記載することができることは、理解される。
本明細書で使用される場合、XTENポリペプチドアミノ酸配列の「反復性」は、3merの反復性を指し、コンピュータプログラムもしくはアルゴリズムによって、または当該技術分野で公知の他の手段によって測定することができる。XTENポリペプチドアミノ酸配列の3merの反復性は、ポリペプチド内の重複する3mer配列の発生数を決定することによって評価することができる。例えば、200個のアミノ酸残基のポリペプチドは、198個の重複する3アミノ酸配列(3mer)を有するが、固有の3mer配列の数は、配列内の反復性の量に依存する。全体的なポリペプチド配列中の3merの反復性の程度を反映するスコア(本明細書で以下「サブシーケンススコア」)が生じ得る。本発明の文脈において、「サブシーケンススコア」は、200アミノ酸配列内の固有の3merサブシーケンスの絶対数で割った、ポリペプチドの200の連続するアミノ酸配列にわたる各固有の3merのフレームの発生合計を意味する。反復ポリペプチドおよび非反復ポリペプチドの最初の200アミノ酸に由来するこのようなサブシーケンススコアの例は、全体が参照により取り込まれる、国際特許出願公開第WO2010/091122A1号の実施例73において提示される。いくつかの実施形態では、本発明は、各々が少なくとも一つのXTENポリペプチドを含むBPXTENポリペプチドを提供し、XTENポリペプチドアミノ酸配列は、16未満、または14未満、または12未満、またはより好ましくは10未満のサブシーケンススコアを有し得る。
「実質的に非反復性のXTENポリペプチドアミノ酸配列」という用語は、本明細書で使用される場合、XTENポリペプチドを指し、同一のアミノ酸タイプであるXTENポリペプチドアミノ酸配列中の四つの連続するアミノ酸の例は少ないか、または存在せず、XTENポリペプチドアミノ酸配列は、12、または10以下のサブシーケンススコア(本明細書の先行する段落で定義された)を有するか、またはポリペプチド配列を構成する配列モチーフのN末端からC末端の順のパターンは存在しない。
本明細書に記載される場合、「重複しない配列モチーフ」という用語は、完全に重複しない配列モチーフ、ならびに一部分のみが重複しない配列モチーフを含むが、但し、前述の一部分のみが重複しない配列モチーフは完全には重複しない。
「ベクター」は、核酸分子、好ましくは、適切な宿主において自己複製する核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞に、および/または宿主細胞間で伝達する。この用語には、主にDNAまたはRNAの細胞内への挿入のために機能するベクター、主にDNAまたはRNAの複製のために機能するベクターの複製、ならびにDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。上記の機能のうちの二つより多くをもたらすベクターも含まれる。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入されると、ポリペプチドに転写され、翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターを含む適当な宿主細胞を暗示する。
「t1/2」という用語は、本明細書で使用される場合、ln(2)/Kelとして計算される終末相半減期を意味する。Kelは、時間曲線に対するlog濃度の終末相の線形部分の線形回帰により計算される終末相消失速度定数である。半減期とは、典型的には、生きている生物に堆積する投与された物質の半分の量が通常の生物学的プロセスによって代謝または除去されるのに必要な時間を指す。「t1/2」、「終末相半減期」、「除去半減期」および「循環半減期」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「抗原」、「標的抗原」、または「免疫原」という用語は、本明細書で互換的に使用され、構造または結合決定基であって、抗体断片または抗体断片ベースの治療剤がそれに結合するか、またはそれに対する特異性を有する、構造または結合決定基を指す。
「ペイロード」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的活性または治療活性を有するタンパク質またはペプチド配列、低分子のファーマコフォアの対応物を指す。ペイロードの例としては、サイトカイン、酵素、ホルモン、ならびに血液および成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。ペイロードは、化学療法剤、抗ウイルス化合物、毒素、または造影剤などの遺伝子的に融合された部分または化学的にコンジュゲートされた部分をさらに含むことができる。これらのコンジュゲートされた部分は、切断可能または切断不可能なリンカーを介してポリペプチドの残りの部分に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」、「軽減すること」および「緩和すること」は、本明細書において互換的に使用され、非限定的に、治療利益および/または予防利益を含む、有益または所望の結果を得るためのアプローチを指す。「治療利益」とは、治療される根底にある障害の根絶または緩和を意味する。また、治療利益は、根底にある疾患の状態と関連する生理学的症状のうちの一つ以上の根絶または緩和で達成され、ヒトまたは動物が、依然として根底にある障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、改善はヒトまたは動物において観察される。予防利益については、組成物は、特定の疾患状態を発症するリスクのあるヒトもしくは動物に、またはこの疾患の診断が行われていなくても、疾患の生理学的症状のうちの一つ以上を報告するヒトまたは動物に投与することができる。
「治療効果」は、本明細書で使用される場合、生物学的に活性なタンパク質が有する抗原エピトープに対する抗体の生成を誘導する能力以外の、本発明の融合ポリペプチドにより引き起こされる、非限定的に、ヒトもしくは他の動物における疾患状態の治癒、軽減、緩和、もしくは予防を含む、またはそうでなければ、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を増強するための、生理的効果を指す。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な説明に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物に1回用量または反復用量で投与されるとき、病状または疾患状態のいずれかの症状、態様、測定されたパラメーターまたは特徴に何らかの検出可能な有益な効果をもたらすことができる、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部分としてのいずれかでの生物学的に活性なタンパク質の量を指す。このような効果は、有益であるために絶対的である必要はない。疾患状態は、障害または疾患を指し得る。
「治療有効用量レジメン」という用語は、本明細書で使用される場合、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部分としてのいずれかでの生物学的に活性なタンパク質の継続的に投与される用量のスケジュールを指し、用量は、病状または疾患状態のいずれかの症状、態様、測定されたパラメーターまたは特徴に持続的利益をもたらす治療上有効量で与えられる。
融合ポリペプチド
別のポリペプチド、特に、生物学的に活性なポリペプチドに融合されるか、またはそうでなければコンジュゲートされ得る一つ以上の拡張組み換えポリペプチド(XTENまたは複数のXTEN)(本明細書において以下でより完全に記載される)を含むポリペプチドが本明細書に開示され、前述の実施形態は、本明細書においてBPXTENと称される。
別のポリペプチド、特に、生物学的に活性なポリペプチドに融合されるか、またはそうでなければコンジュゲートされ得る一つ以上の拡張組み換えポリペプチド(XTENまたは複数のXTEN)(本明細書において以下でより完全に記載される)を含むポリペプチドが本明細書に開示され、前述の実施形態は、本明細書においてBPXTENと称される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第一のXTENポリペプチド(「拡張組み換えポリペプチド(XTEN)」の節に以下で記載されるか、または本明細書に他で記載されるものなど)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第二のXTENポリペプチド(「拡張組み換えポリペプチド(XTEN)」の節に以下で記載されるか、または本明細書に他で記載されるものなど)をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、そのN末端にまたはその近くにXTENポリペプチド(「N末端XTEN」)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、そのC末端にまたはその近くにXTENポリペプチド(「C末端XTEN」)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、N末端XTENポリペプチドとC末端XTENポリペプチドの両方を含む。いくつかの実施形態では、第一のXTENポリペプチドは、N末端XTENポリペプチドであり、第二のXTENポリペプチドは、C末端XTENポリペプチドである。
ポリペプチドは、XTENポリペプチドに連結された生物学的に活性なポリペプチド(「BP」)をさらに含み、これにより、本明細書で「BPXTEN」ポリペプチドと称されるXTEN含有融合ポリペプチドを形成することができる。
XTENポリペプチドは、プロテアーゼによる融合ポリペプチド(またはBPXTEN)の消化時にXTENポリペプチドから遊離可能な(放出されるよう形成される)一つ以上のバーコード断片(以下でより完全に記載される)を含み得る。いくつかの実施形態では、各バーコード断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片(存在する場合、全ての他のバーコード断片を含む)と異なる。
(融合)ポリペプチドは、例えば、バーコード断片をポリペプチドから放出するプロテアーゼ消化時にポリペプチドから遊離可能な(放出されるよう形成される)一つ以上の参照断片(以下でより完全に記載される)を含み得る。いくつかの実施形態では、各参照断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる単一の参照断片であり得る。
拡張組み換えポリペプチド(XTEN)
鎖長およびアミノ酸組成
いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、少なくとも150のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、150~3,000アミノ酸長、または150~1,000アミノ酸長、または少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、または少なくとも500のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも90%は、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)またはプロリン(P)である。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%は、G、A、S、T、E、またはPから選択される。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、少なくとも四つの異なるタイプG、A、S、T、E、またはPアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、少なくとも150アミノ酸を含み、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも90%が、G、A、S、T、E、またはPであり、XTENポリペプチドを含む任意の他の重複しない配列モチーフに関して実質的に無作為化されるG、A、S、T、E、およびPから選択されるアミノ酸のうち少なくとも四つの異なるタイプを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、XTEN含有融合ポリペプチド(例えば、これとコンジュゲートした生物学的に活性なポリペプチドを含む融合ポリペプチド)は、第一のXTENポリペプチドおよび第二のXTENポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第一のXTEN中のアミノ酸の総数および第二のXTENポリペプチド中のアミノ酸の総数の合計は、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも800のアミノ酸である。
鎖長およびアミノ酸組成
いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、少なくとも150のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、150~3,000アミノ酸長、または150~1,000アミノ酸長、または少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、または少なくとも500のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも90%は、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)またはプロリン(P)である。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%は、G、A、S、T、E、またはPから選択される。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、少なくとも四つの異なるタイプG、A、S、T、E、またはPアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、少なくとも150アミノ酸を含み、XTENポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも90%が、G、A、S、T、E、またはPであり、XTENポリペプチドを含む任意の他の重複しない配列モチーフに関して実質的に無作為化されるG、A、S、T、E、およびPから選択されるアミノ酸のうち少なくとも四つの異なるタイプを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、XTEN含有融合ポリペプチド(例えば、これとコンジュゲートした生物学的に活性なポリペプチドを含む融合ポリペプチド)は、第一のXTENポリペプチドおよび第二のXTENポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第一のXTEN中のアミノ酸の総数および第二のXTENポリペプチド中のアミノ酸の総数の合計は、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも800のアミノ酸である。
重複しない配列モチーフ
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるXTENポリペプチドは、複数の重複しない配列モチーフを含むか、またはそれから形成される。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのうちの少なくとも一つは、繰り返し生じ(XTEN内で少なくとも2回繰り返される)、重複しない配列モチーフのうちの少なくとも別の一つは、繰り返し生じない(またはXTEN内で1回のみ見られる)。いくつかの実施形態では、複数の重複しない配列モチーフは、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフ、前述の配列モチーフの各々は、XTEN内で少なくとも2回繰り返され、およびXTEN内で1回のみ生じる(または見られない)重複しない(繰り返し生じない)配列モチーフのセットを含む。いくつかの実施形態では、各重複しない配列モチーフは、9~14(または10~14、または11~13)アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、各重複しない配列モチーフは、12アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、複数の重複しない配列モチーフは、重複しない(繰り返し生じる)配列モチーフのセットを含み、前述の配列モチーフの各々は、XTEN内で少なくとも2回繰り返され、9~14アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフのセットは、表1の配列番号182~203および1715~1722により本明細書において同定される12merの配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフのセットは、表1の配列番号186~189により本明細書において同定される12merの配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフのセットは、表1の配列番号186~189の12merの配列モチーフのうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるXTENポリペプチドは、複数の重複しない配列モチーフを含むか、またはそれから形成される。いくつかの実施形態では、重複しない配列モチーフのうちの少なくとも一つは、繰り返し生じ(XTEN内で少なくとも2回繰り返される)、重複しない配列モチーフのうちの少なくとも別の一つは、繰り返し生じない(またはXTEN内で1回のみ見られる)。いくつかの実施形態では、複数の重複しない配列モチーフは、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフ、前述の配列モチーフの各々は、XTEN内で少なくとも2回繰り返され、およびXTEN内で1回のみ生じる(または見られない)重複しない(繰り返し生じない)配列モチーフのセットを含む。いくつかの実施形態では、各重複しない配列モチーフは、9~14(または10~14、または11~13)アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、各重複しない配列モチーフは、12アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、複数の重複しない配列モチーフは、重複しない(繰り返し生じる)配列モチーフのセットを含み、前述の配列モチーフの各々は、XTEN内で少なくとも2回繰り返され、9~14アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフのセットは、表1の配列番号182~203および1715~1722により本明細書において同定される12merの配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフのセットは、表1の配列番号186~189により本明細書において同定される12merの配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、(繰り返し生じる)重複しない配列モチーフのセットは、表1の配列番号186~189の12merの配列モチーフのうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む。
バーコード断片
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、プロテアーゼによる消化時にポリペプチドから遊離可能なバーコード断片(例えば、XTENポリペプチドの第一、第二、または第三のバーコード断片)を含む。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、XTEN内で1回のみ生じる(または見られる)(繰り返し生じない、重複しない)配列モチーフの少なくとも一部分を含み、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる。当業者であれば、「バーコード断片」(または「バーコード」、もしくは「バーコード配列」)という用語が、ポリペプチド内で切断可能に融合される本明細書において同定されるXTENの一部、またはポリペプチドから放出された、得られたペプチド断片のいずれかを指し得ることを理解するだろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、プロテアーゼによる消化時にポリペプチドから遊離可能なバーコード断片(例えば、XTENポリペプチドの第一、第二、または第三のバーコード断片)を含む。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、XTEN内で1回のみ生じる(または見られる)(繰り返し生じない、重複しない)配列モチーフの少なくとも一部分を含み、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる。当業者であれば、「バーコード断片」(または「バーコード」、もしくは「バーコード配列」)という用語が、ポリペプチド内で切断可能に融合される本明細書において同定されるXTENの一部、またはポリペプチドから放出された、得られたペプチド断片のいずれかを指し得ることを理解するだろう。
いくつかの実施形態では、バーコード断片は、XTENポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸を含まない。以下でより詳細に記載されるか、または本明細書に他で記載されるように、いくつかの実施形態では、バーコード断片は、融合ポリペプチドのGlu-C消化時に遊離可能である(放出されるよう形成される)。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、XTENポリペプチド中の別のグルタミン酸にすぐ隣接するグルタミン酸を含まない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、そのC末端にグルタミン酸を有する。当業者であれは、たとえ他の「非バーコード」アミノ酸残基が、同じXTENポリペプチド内のバーコード断片に対してC末端に位置しても、XTENポリペプチド内に切断可能に融合されるとき、バーコード断片のC末端は、バーコード断片内の「最終」(または大部分のC末端)アミノ酸残基を指し得ることは理解するであろう。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、グルタミン酸残基のすぐ前にあるN末端アミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、N末端アミノ酸に先行するグルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基にすぐ隣接しない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、グルタミン酸の直後がプロリンでない限り、バーコード断片のC末端以外の位置にグルタミン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端またはポリペプチドのC末端のいずれかから10~150、または10~125アミノ酸に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端から300、280、260、250、240、220、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、48、40、36、30、24、20、12、もしくは10アミノ酸内または位置、あるいは前述のいずれかの間の範囲にある位置に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端の200、150、100、または50アミノ酸以内に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのC末端から300、280、260、250、240、220、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、48、40、36、30、24、20、12、もしくは10アミノ酸以内、または前述のいずれかの間の範囲内に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのC末端の200、150、100、または50アミノ酸内に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのC末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸を含まず、XTEN中の別のグルタミン酸にすぐ隣接するグルタミン酸を含まず、そのC末端にグルタミン酸を有し、グルタミン酸残基のすぐ前にあるN末端アミノ酸を有し、(v)ポリペプチドのN末端またはポリペプチドのC末端のいずれかから10~150、または10~125アミノ酸に位置する。いくつかの実施形態では、N末端アミノ酸に先行するグルタミン酸残基は、別のグルタミン酸残基にすぐ隣接しない。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、グルタミン酸の直後がプロリンでない限り、バーコード断片のC末端以外の位置にグルタミン酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドに融合されたバーコード化XTENポリペプチドについて、バーコード化XTENに含有される少なくとも一つのバーコード断片(または少なくとも二つのバーコード断片、または三つのバーコード断片)は、生物学的に活性なポリペプチドから少なくとも50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300アミノ酸に位置する。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、少なくとも4アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25アミノ酸長、または前述の値のいずれかの間の範囲内である。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、4~20、5~15、6~12、または7~10アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、表2の配列番号8020~8030(BAR001~BAR011)から選択される。
いくつかの実施形態では、バーコード化XTENポリペプチドは、一つのみのバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、バーコード化XTENポリペプチドは、上で記載された、または本明細書の他で記載されるものなどの、第一のバーコード断片を含む、バーコード断片のセットを含む。これらの実施形態では、バーコード配列のセットの各メンバーは、アミノ酸配列または分子量に基づき、全ての他のバーコード配列から区別することができる(異なるバーコード配列を区別するこれらの方法が関連するであろう)。いくつかの実施形態では、バーコード断片のセットは、上でまたは本明細書の他で記載されるものなどの第二のバーコード断片(またはさらなるバーコード断片)を含む。いくつかの実施形態では、バーコード断片のセットは、上でまたは本明細書の他で記載されるものなどの、第三のバーコード断片を含む。N末端XTENポリペプチド内で融合されるバーコード断片のセットは、バーコードのN末端セット(「N末端セット」)と呼ぶことができる。C末端XTENポリペプチド内に融合されるバーコード断片のセットは、バーコードのC末端セット(「C末端セット」)と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、N末端セットは、第一のバーコード断片および第二のバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、N末端セットは、第三のバーコード断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、C末端セットは、第一のバーコード断片および第二のバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、C末端セットは、第三のバーコード断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、第二のバーコード断片は、同じセットの第一のバーコード断片に対してN末端に位置する。いくつかの実施形態では、第二のバーコード断片は、同じセットの第一のバーコード断片に対してC末端に位置する。いくつかの実施形態では、第三のバーコード断片は、第一と第二のバーコード断片の両方に対してN末端に位置する。いくつかの実施形態では、第三のバーコード断片は、第一と第二のバーコード断片の両方に対してC末端に位置する。いくつかの実施形態では、第三のバーコード断片は、第一と第二のバーコード断片の間に位置する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第一のバーコード断片、さらなる(第二の)バーコード断片、および少なくとも一つの追加のバーコード断片を含むバーコード断片のセットを含み、バーコード断片のセットの各バーコード断片は、第二のXTENポリペプチドの一部であり、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの完全な消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる。
例示的なバーコード化XTEN
一つのバーコード(例えば、配列番号8002~8003、8005~8009、および8013)、または二つのバーコード(例えば、配列番号8001、8004、8010、および8012)、または三つのバーコード(例えば、配列番号8011)を含有する、13の例示的なバーコード化XTENのアミノ酸配列は、表3aに説明される。これらの13の例示的なバーコード化XTENポリペプチドのうち、6つ(配列番号8001~8003、8008~8009、および8011)は、生物学的に活性なタンパク質のC末端で生物学的に活性なタンパク質に融合することができ、7つ(配列番号8004~8007、8010、および8012-8013)は、生物学的に活性なタンパク質のN末端に融合することができる。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、表3aの配列番号8001~8019から選択される配列と少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する。
一つのバーコード(例えば、配列番号8002~8003、8005~8009、および8013)、または二つのバーコード(例えば、配列番号8001、8004、8010、および8012)、または三つのバーコード(例えば、配列番号8011)を含有する、13の例示的なバーコード化XTENのアミノ酸配列は、表3aに説明される。これらの13の例示的なバーコード化XTENポリペプチドのうち、6つ(配列番号8001~8003、8008~8009、および8011)は、生物学的に活性なタンパク質のC末端で生物学的に活性なタンパク質に融合することができ、7つ(配列番号8004~8007、8010、および8012-8013)は、生物学的に活性なタンパク質のN末端に融合することができる。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、表3aの配列番号8001~8019から選択される配列と少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、バーコード化XTENポリペプチドは、以下の基準:XTENポリペプチド内の配列変化を最小にすること、XTENポリペプチド内のアミノ酸組成の変化を最小にすること、XTENポリペプチドの正味の変化を実質的に維持すること、XTENポリペプチドの低い免疫原性を実質的に維持すること(または改善すること)、およびXTENポリペプチドの薬物動態特性を実質的に維持すること(または改善すること)のうちの一つ以上に従い、表3bに列挙されるいずれかなどの、汎用XTENポリペプチドに一つ以上の変異を生じさせることにより、得ることができる。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸配列は、表3bに挙げられる配列番号676~734のいずれか一つと少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、表3bに挙げられる配列番号676~734のいずれかと少なくとも90%(例えば、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%)、だが100%未満の配列同一性を有するXTEN配列は、表3bの対応する配列の一つ以上の変異(例えば、10未満、8未満、6未満、5未満、4未満、3未満、2未満の変異)により得られる。いくつかの実施形態では、一つ以上の変異は、グルタミン酸残基の欠失、グルタミン酸残基の挿入、グルタミン酸残基の置換、もしくはグルタミン酸残基への置換、または任意のその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸配列が、表3bに挙げられる配列番号676~734のいずれかと異なるが、少なくとも90%(例えば、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%)の配列同一性を有する場合、XTENポリペプチドのアミノ酸配列と表3bの対応する配列の間の相違の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または約100%は、グルタミン酸残基の欠失、グルタミン酸残基の挿入、グルタミン酸残基の置換、もしくはグルタミン酸残基への置換、または任意のその組み合わせを含む。いくつかのこのような実施形態では、XTENポリペプチドのアミノ酸配列と表3bの対応する配列の間の相違の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または約100%は、グルタミン酸残基の置換、もしくはグルタミン酸残基への置換、または両方を含む。「第一のアミノ酸の置換」という用語は、本明細書で使用される場合、第一のアミノ酸残基の第二のアミノ酸残基への置換を指し、これにより、得られた配列の置換位置で生じる第二のアミノ酸残基をもたらす。例えば、「グルタミン酸の置換」は、グルタミン酸(E)残基の非グルタミン酸残基(例えば、セリン(S))への置換を指す。「第一のアミノ酸への置換」という用語は、本明細書で使用される場合、第二のアミノ酸残基の第一のアミノ酸残基への置換を指し、これにより、得られた配列の置換位置で生じる第一のアミノ酸残基をもたらす。例えば、「グルタミン酸への置換」は、非グルタミン酸残基(例えば、セリン(S))のグルタミン酸残基への置換を指す。
いくつかの実施形態では、バーコード化XTENポリペプチドの配列を構築するため、アミノ酸変異は、中間の長さのXTENポリペプチド上で、表3bのものならびに表1の一つ以上の12merのモチーフが、表3bの汎用XTENのNまたはC末端に付加されているものなどの、表3bのものより長い長さのXTENポリペプチドに行われる。
本開示に従って使用することができる汎用XTENポリペプチドのアミノ酸配列の追加の例は、開示各々が、参照により本明細書に明示的に取り込まれる、米国特許公開第2010/0239554A1号、同第2010/0323956A1号、同第2011/0046060A1号、同第2011/0046061A1号、同第2011/0077199A1号、もしくは同第2011/0172146A1号、または国際特許公開第2010091122A1号、同第2010144502A2号、同第2010144508A1号、同第2011028228A1号、同第2011028229A1号、同第2011028344A2号、同第2014/011819A2号、もしくは同第2015/023891号に記載される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖のN末端に隣接するポリペプチド鎖内に融合されるバーコード化XTENポリペプチド(「N末端XTEN」)は、融合ポリペプチドの精製を促進するためにN末端に6~8個のHis残基を含む、複数のポリ(His)残基を含むHisタグに結合することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖のC末端でポリペプチド鎖内に融合されるバーコード化XTENポリペプチド(「C末端XTENポリペプチド」)は、融合ポリペプチドの精製を促進するためにC末端で配列EPEAに含まれるか、または結合され得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、N末端バーコード化XTENポリペプチドとC末端バーコード化XTENポリペプチドの両方を含み、N末端バーコード化XTENは、N末端に6~8個のHis残基を含む、複数のポリ(His)残基を含むHisタグに結合され、C末端バーコード化XTENポリペプチドは、C末端で配列EPEAに結合され、これにより、非限定的にIMACクロマトグラフィーを含む、当該技術分野で公知のクロマトグラフィー方法、C-タグXL親和性基質、および非限定的に以下の実施例の節で記載されるものを含む、他のこのような方法による、融合ポリペプチドの、例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の純度への精製を促進する。
プロテアーゼ消化
上記または本明細書で他で記載されるバーコード断片は、XTENポリペプチド内に切断可能に融合され、プロテアーゼによるポリペプチドの消化時にXTENポリペプチドから遊離可能(放出されるよう形成される)であり得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、後にプロリンがないグルタミン酸残基のC末端側で切断する。当業者であれば、バーコード化XTENポリペプチド(その内部にバーコード断片を含有するXTENポリペプチド)が、高い効率、精度および正確さのプロテアーゼ消化を達成するよう設計されることを理解するであろう。例えば、当業者であれば、XTEN配列中の隣接するGlu-Glu(EE)残基が、Glu-C消化時に様々な切断パターンをもたらし得ることを理解するであろう。したがって、Glu-Cプロテアーゼがバーコード放出に使用されるとき、バーコード化XTENポリペプチドまたはバーコード断片は、Glu-Glu(EE)配列を有し得ない。当業者であれば、融合ポリペプチドに存在する場合、ジ-ペプチドGlu-Pro(EP)配列が、バーコード放出プロセス中にGlu-Cプロテアーゼによる切断が不可能であり得ることも理解するであろう。
上記または本明細書で他で記載されるバーコード断片は、XTENポリペプチド内に切断可能に融合され、プロテアーゼによるポリペプチドの消化時にXTENポリペプチドから遊離可能(放出されるよう形成される)であり得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、後にプロリンがないグルタミン酸残基のC末端側で切断する。当業者であれば、バーコード化XTENポリペプチド(その内部にバーコード断片を含有するXTENポリペプチド)が、高い効率、精度および正確さのプロテアーゼ消化を達成するよう設計されることを理解するであろう。例えば、当業者であれば、XTEN配列中の隣接するGlu-Glu(EE)残基が、Glu-C消化時に様々な切断パターンをもたらし得ることを理解するであろう。したがって、Glu-Cプロテアーゼがバーコード放出に使用されるとき、バーコード化XTENポリペプチドまたはバーコード断片は、Glu-Glu(EE)配列を有し得ない。当業者であれば、融合ポリペプチドに存在する場合、ジ-ペプチドGlu-Pro(EP)配列が、バーコード放出プロセス中にGlu-Cプロテアーゼによる切断が不可能であり得ることも理解するであろう。
BPXTENの構造配置
いくつかの実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、単一のBPポリペプチドおよび単一のXTENポリペプチドを含む。このようなBPXTENタンパク質は、各々がN末端からC末端の向きで挙げられる、少なくとも以下配置の並べ替え:BP-XTEN、XTEN-BP、BP-S-XTEN、およびXTEN-S-BP(式中、「S」は、以下で記載されるスペーサー配列である)を有し得る。
いくつかの実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、単一のBPポリペプチドおよび単一のXTENポリペプチドを含む。このようなBPXTENタンパク質は、各々がN末端からC末端の向きで挙げられる、少なくとも以下配置の並べ替え:BP-XTEN、XTEN-BP、BP-S-XTEN、およびXTEN-S-BP(式中、「S」は、以下で記載されるスペーサー配列である)を有し得る。
いくつかの実施形態では、BPXTENタンパク質は、C末端XTENポリペプチド、および任意選択で、XTENポリペプチドとBPポリペプチドの間にスペーサー配列(S)を含む。このようなBPXTENタンパク質は、式I(N末端からC末端に示される):
(BP)-(S)x-(XTEN)(I)、
(式中、BPは、本明細書に以下で記載される生物学的に活性なタンパク質であり、Sは、任意選択で、BP放出セグメント(本明細書において以下でより完全に記載される)を含み得る1~約50個のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、xは、0または1のいずれかであり、XTENは、本明細書に記載される任意のXTENポリペプチドであり得る)により表わすことができる。
(BP)-(S)x-(XTEN)(I)、
(式中、BPは、本明細書に以下で記載される生物学的に活性なタンパク質であり、Sは、任意選択で、BP放出セグメント(本明細書において以下でより完全に記載される)を含み得る1~約50個のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、xは、0または1のいずれかであり、XTENは、本明細書に記載される任意のXTENポリペプチドであり得る)により表わすことができる。
いくつかの実施形態では、BPXTENタンパク質は、N末端XTENポリペプチド、および任意選択で、XTENポリペプチドとBPタンパク質の間にスペーサー配列(S)を含む。このようなBPXTENタンパク質は、式II(N末端からC末端に示される):
(XTEN)-(S)x-(BP)(II)、
(式中、BPは、本明細書に以下で記載される生物学的に活性なタンパク質であり、Sは、任意選択で、BP放出セグメント(本明細書において以下でより完全に記載される)を含み得る1~約50個のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、xは、0または1のいずれかであり、XTENは、本明細書に記載されるように任意のXTENポリペプチドであり得る)により表わすことができる。
(XTEN)-(S)x-(BP)(II)、
(式中、BPは、本明細書に以下で記載される生物学的に活性なタンパク質であり、Sは、任意選択で、BP放出セグメント(本明細書において以下でより完全に記載される)を含み得る1~約50個のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、xは、0または1のいずれかであり、XTENは、本明細書に記載されるように任意のXTENポリペプチドであり得る)により表わすことができる。
いくつかの実施形態では、BPXTENタンパク質は、N末端XTENポリペプチドとC末端XTENポリペプチドの両方を含む。このようなBPXTENタンパク質(例えば、図1~2のXPAT)は、式III:
(XTEN)-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)(III)
(式中、BPは、本明細書に以下で記載される生物学的に活性なタンパク質であり、Sは、任意選択で、BP放出セグメント(本明細書において以下でより完全に記載される)を含み得る1~約50個のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、yは、0または1のいずれかであり、zは、0または1のいずれかであり、XTENは、本明細書に記載される任意のXTENポリペプチドであり得る)により表わすことができる。
(XTEN)-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)(III)
(式中、BPは、本明細書に以下で記載される生物学的に活性なタンパク質であり、Sは、任意選択で、BP放出セグメント(本明細書において以下でより完全に記載される)を含み得る1~約50個のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、yは、0または1のいずれかであり、zは、0または1のいずれかであり、XTENは、本明細書に記載される任意のXTENポリペプチドであり得る)により表わすことができる。
生物学的に活性なポリペプチド
表4a~4hおよび表6a~6fにより本明細書において同定される配列を、その対応する核酸およびアミノ酸配列と一緒に含む、一つ以上のXTENポリペプチド(本明細書に記載される)、特に、本明細書に以下で開示されるものに融合され得る生物学的に活性なタンパク質(BP)は、当該技術分野で周知である。これらのBPの説明および配列は、Chemical Abstracts Services Databases(例えば、CAS Registry)、GenBank、The Universal Protein Source(UniProt)、およびGenSeq(例えば、Derwent)などの購読提供されるデータベースなどの公開データベースで入手可能である。BPをコードするポリヌクレオチド配列は、天然のBP(例えば、全長もしくは成熟型のいずれか)をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であり得、またはある場合では、配列は、野生型ポリヌクレオチド配列(例えば、野生型の生物学的に活性なタンパク質をコードするポリヌクレオチド)のバリアント、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、特定の種における発現について最適化されており、または部位指定変異もしくは対立遺伝子バリアントなどの、野生型タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドであり得る。当該技術分野で公知の方法を使用して、ならびに/または本明細書に提供されるガイダンスおよび方法と併せて本発明により企図されるBPXTEN構築物を作製するためにBPの野生型もしくは共通cDNA配列またはコドン最適化バリアントを使用することは十分に当業者の能力の範囲内である。
表4a~4hおよび表6a~6fにより本明細書において同定される配列を、その対応する核酸およびアミノ酸配列と一緒に含む、一つ以上のXTENポリペプチド(本明細書に記載される)、特に、本明細書に以下で開示されるものに融合され得る生物学的に活性なタンパク質(BP)は、当該技術分野で周知である。これらのBPの説明および配列は、Chemical Abstracts Services Databases(例えば、CAS Registry)、GenBank、The Universal Protein Source(UniProt)、およびGenSeq(例えば、Derwent)などの購読提供されるデータベースなどの公開データベースで入手可能である。BPをコードするポリヌクレオチド配列は、天然のBP(例えば、全長もしくは成熟型のいずれか)をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であり得、またはある場合では、配列は、野生型ポリヌクレオチド配列(例えば、野生型の生物学的に活性なタンパク質をコードするポリヌクレオチド)のバリアント、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、特定の種における発現について最適化されており、または部位指定変異もしくは対立遺伝子バリアントなどの、野生型タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドであり得る。当該技術分野で公知の方法を使用して、ならびに/または本明細書に提供されるガイダンスおよび方法と併せて本発明により企図されるBPXTEN構築物を作製するためにBPの野生型もしくは共通cDNA配列またはコドン最適化バリアントを使用することは十分に当業者の能力の範囲内である。
本明細書に開示されるBPXTENタンパク質における含有のためのBP(例えば、少なくとも一つのBPおよび少なくとも一つのXTENポリペプチドを含む融合ポリペプチド)は、生物学的、治療、予防、もしくは診断利益または機能の、あるいはヒトまたは動物に投与されるとき、生物学的活性を維持するため、または疾患、障害あるいは状態を予防もしくは緩和するため有用である、任意のタンパク質を含み得る。特に、薬物動態パラメーターの増加、溶解性の増加、安定性の増加、活性のマスキング、もしくはいくつかの他の医薬特性の増強を求めるBP、あるいは終末相半減期が長くすることで、有効性、安全性を改善し、または投薬頻度の低下をもたらし、および/もしくは患者コンプライアンスを改善するBPが有利である。したがって、XTENポリペプチドに連結されていないBPと比較して、ヒトまたは動物に投与されたとき、BPXTEN融合タンパク質組成物は、例えば、in vivo曝露またはBPXTENが治療ウィンドウにとどまる時間の長さを増加させることにより、生物活性な化合物の治療有効性を改善することを含む、様々な目的を考慮して調製することができる。
BPは、天然の全長タンパク質であり得るか、または天然のタンパク質の生物学的活性の少なくとも一部を保持する生物学的に活性なタンパク質の断片もしくは配列バリアントであり得る。
一実施形態では、ヒトまたは動物組成物に取り込まれたBPは、天然で見られるタンパク質に対応する配列を有する組み換えポリペプチドであり得る。別の実施形態では、BPは、天然のBPの生物学的活性の少なくとも一部を保持する天然の配列の配列バリアント、断片、相同体、およびミメティックであり得る。非限定的な例では、BPは、表4a~4hから選択されるタンパク質配列と少なくとも約80%の配列同一性、または代わりに、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈する配列であり得る。さらなる非限定的な例では、BPは、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む二重特異性配列であり得、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対する特異的結合親和性を有する第一の結合ドメインは、表6fに同定される抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約80%配列同一性、または代わりに、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈し、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する第二の結合ドメインは、表6aに同定される抗標的細胞抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約80%配列同一性、または代わりに、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈する。一実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、XTENポリペプチドに連結された単一のBPタンパク質を含み得る。別の実施形態では、BPXTENタンパク質は、第一のBPおよび同じBPの第二の分子を含み得、これにより、一つ以上のXTENポリペプチドに連結された二つのBP(例えば、2分子のグルカゴン、または2分子のhGH)を含む融合タンパク質がもたらされる。
一般的に、インビボで使用されるとき、またはインビトロアッセイで利用されるとき、BPは、所定の標的(もしくは所定数の標的)に対する結合特異性または別の所望の生物学的特徴を呈する。例えば、BPは、アゴニスト、受容体、リガンド、アンタゴニスト、酵素、抗体(例えば、一重もしくは二重特異性)、またはホルモンであり得る。特に目的であるのは、天然のBPは、比較的に短い終末相半減期を有し、薬物動態パラメーター(任意選択で、スペーサー配列の切断により融合タンパク質から放出され得る)の増強が、少ない頻度の投薬または薬理学的効果の増強を可能にする、疾患または障害のため使用される、または有用であることが知られているBPである。また、最小有効用量または血中濃度(Cmin)と最大許容用量または血中濃度(Cmax)との間に小さい治療ウィンドウを有するBPも目的である。このような場合、BPの、選択XTENポリペプチド配列を含む融合タンパク質への連結は、これらの特性の改善をもたらし、それを、一つ以上のXTENポリペプチドに連結されていないBPと比較して、治療剤または予防剤としてより有用にすることができる。
グルコース調節ペプチド
内分泌および肥満関連疾患または障害は、ほとんどの先進国で流行性の割合に達しており、大部分の先進国では、身体の臓器、組織、および循環系に影響を与える多種多様な状態を含む、実質的かつ増加する医療負担を示している。特に懸念されるのは、内分泌疾患および肥満関連疾患ならびに障害であり、中でも、米国における主要な死因の一つである糖尿病である。
内分泌および肥満関連疾患または障害は、ほとんどの先進国で流行性の割合に達しており、大部分の先進国では、身体の臓器、組織、および循環系に影響を与える多種多様な状態を含む、実質的かつ増加する医療負担を示している。特に懸念されるのは、内分泌疾患および肥満関連疾患ならびに障害であり、中でも、米国における主要な死因の一つである糖尿病である。
グルコース恒常性およびインスリン応答における大部分の代謝プロセスは、複数のペプチドおよびホルモンにより調節され、多くのこのようなペプチドおよびホルモン、ならびにそのアナログは、代謝疾患および障害の治療における有用性を見出した。これらのペプチドの多くは、たとえそれらが反対の生物学的機能を有するときでも、互いに高度に相同である傾向がある。グルコース増加ペプチドは、ペプチドホルモングルカゴンにより例示され、一方、グルコース低下ペプチドは、エキセンディン-4、グルカゴン様ペプチド1、およびアミリンを含む。しかしながら、治療用ペプチドおよび/またはホルモンの使用は、小分子薬物の使用により増強されたときでさえ、このような疾患および障害の管理において限られた成功となる。特に、用量最適化は、代謝性疾患、特に、小さい治療ウィンドウを有するものの治療において使用される薬物および生物製剤に重要である。ホルモンは、一般的に、およびグルコース恒常性に関与するペプチドは、多くの場合、小さい治療ウィンドウを有する。小さい治療ウィンドウは、このようなホルモンおよびペプチドが、典型的には、短い半減期を有するという事実と結び付いて、臨床上の利益を達成するために頻繁な投薬を必要とし、このような患者の管理を困難にする。ペグ化などの治療用タンパク質に対する化学修飾は、そのin vivoクリアランス速度およびその後の血清半減期を修飾することができる一方、追加の製造工程を必要とし、不均一な最終製品をもたらす。加えて、慢性投与からの許容できない副作用が報告されている。あるいは、Fcドメインの治療用タンパク質またはペプチドへの融合による遺伝子修飾は、治療用タンパク質のサイズを増加させ、腎臓を通るクリアランス速度を低下し、FcRn受容体によるリソソームからの再利用を促進する。残念なことに、Fcドメインは、組み換え発現中に効率的に折り畳まれず、封入体として知られる不溶性沈殿物を形成する傾向がある。これらの封入体は、可溶化されなければならず、機能的タンパク質は、再生されなければならず、これは、時間がかかり、非効率的で、高価なプロセスである。
したがって、本発明の一態様は、グルコース、インスリン、および肥満障害、疾患ならびに関連する状態の治療において有用性を有する組成物を作製するための、グルコース恒常性、インスリン抵抗性および肥満(まとめて、「グルコース調節ペプチド」)に関与するペプチドの取り込みである。BPXTENタンパク質を作製するための本明細書に開示されるXTENポリペプチドに連結され得る適当なグルコース調節ペプチドは、全ての生物学的に活性なポリペプチド、とりわけ、膵ベータ細胞によるインスリンのグルコース依存性分泌を増加させるか、またはインスリン作用を増強するペプチドを含む。グルコース調節ペプチドはまた、膵ベータ-細胞におけるプロ-インスリン遺伝子転写を刺激する生物学的に活性なポリペプチドも含み得る。さらに、グルコース調節ペプチドはまた、胃排出時間を遅くし、食物摂取を低下する生物学的に活性なポリペプチドも含み得る。グルコース調節ペプチドはまた、ランゲルハンス島のアルファ細胞からのグルカゴン放出を阻害する生物学的に活性なポリペプチドも含み得る。表4aは、本発明のBPXTEN融合タンパク質によって包含され得るグルコース調節ペプチドの配列の非限定的なリストを提供する。本明細書に開示される本BPXTEN組成物のグルコース調節ペプチドは、表4aから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性)を呈するペプチドであり得る。
「アドレノメデュリン」または「ADM」は、成熟ADMの生物学的活性の一部を少なくとも有する、ヒトアドレノメデュリンペプチドホルモンならびにその種および配列バリアントを意味する。ADMは、185のアミノ酸プレプロホルモンから連続する酵素切断およびアミド化を通じて生じ、これにより、測定血漿半減期22分を有する52アミノ酸 の生物活性ペプチドがもたらされる。本発明のADM含有融合タンパク質は、グルコース調節のためまたは持続性低血圧を有するヒトもしくは動物において膵島細胞からのインスリン分泌に対する刺激効果のため糖尿病において特定の使用を見出だし得る。ヒトAMの完全なゲノム基盤が、報告されており(Ishimitsu et al.,1994,Biochem.Biophys.Res.Commun 203:631-639)、ADMペプチドのアナログは、米国特許第6,320,022号に記載されるとおり、クローニングされている。
「アミリン」は、アミリン、プラムリンチド、および成熟アミリンの生物学的活性の一部を少なくとも有する、米国特許第5,234,906号に記載されるその種バリエーションと呼ばれるヒトペプチドホルモンを意味する。アミリンは、栄養摂取に対する反応において膵ベータ細胞によりインスリンと共分泌される37アミノ酸のポリペプチドホルモンであり(Koda et al.,1992,Lancet 339:1179-1180)、グルコースのグリコーゲンへの取り込みを含む、炭水化物代謝のいくつかの鍵となる経路を調節することが報告されている。本発明のアミリン含有融合タンパク質は、インスリンの作用を補完し、循環からのグルコース消失速度および抹消組織によるその取り込みを調節し得る。アミリンアナログは、米国特許第5,686,411号および同第7,271,238号に記載される通り、クローニングされる。
生物学的活性を保持するアミリンミメティックが作製され得る。例えば、プラムリンチドは、配列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(配列番号43)を有し、ラットアミリン配列由来のアミノ酸は、ヒトアミリン配列におけるアミノ酸に置換されている。一実施形態では、本発明は、配列KCNTATCATX1RLANFLVHSSNNFGX2ILX2X2TNVGSNTY(配列番号44)、
式中、X1は、独立してNまたはQであり、X2は、独立してS、PまたはGである、のアミリンミメティックを含む融合タンパク質を企図する。一実施形態では、BPXTENに取り込まれたアミリンミメティックは、配列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(配列番号45)を有し得る。アミリンミメティックが、BPXTENのC末端で使用される別の実施形態では、ミメティックは、配列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(NH2)(配列番号46)を有し得る。
式中、X1は、独立してNまたはQであり、X2は、独立してS、PまたはGである、のアミリンミメティックを含む融合タンパク質を企図する。一実施形態では、BPXTENに取り込まれたアミリンミメティックは、配列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(配列番号45)を有し得る。アミリンミメティックが、BPXTENのC末端で使用される別の実施形態では、ミメティックは、配列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(NH2)(配列番号46)を有し得る。
「カルシトニン」(CT)は、ヒトカルシトニンタンパク質ならびに成熟CTの生物学的活性の一部を少なくとも有する、サケカルシトニン(「sCT」)を含む、その種および配列バリアントを意味する。CTは、神経系および血管系において機能すると思われるが、満腹反射の強力なホルモンメディエーターであることも報告されている、甲状腺のより大きなプロホルモンから切断される32のアミノ酸のペプチドである。(Becker,JCEM,89(4):1512-1525(2004)およびSexton,Current Medicinal Chemistry 6:1067-1093(1999)で概説されている)。本発明のカルシトニン含有融合タンパク質は、骨粗鬆症の治療のため、および骨ページェット病のための療法としての特定の使用を見出し得る。合成カルシトニンペプチドは、米国特許第5,175,146号および同第5,364,840号に記載されるとおり、作製される。
「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」または「CGRP」は、ヒトにおいて、二つの形態α-CGRP(37のアミノ酸のペプチド)およびβ-CGRPに存在する、ペプチドのカルシトニンファミリーのメンバーである、ヒトCGRPペプチドならびに成熟CGRPの生物学的活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。CGRPは、ヒトアミリンとの43~46%の配列同一性を有する。本発明のCGRP含有融合タンパク質は、糖尿病と関連する罹患率の減少、高血糖およびインスリン欠乏の緩和、膵島へのリンパ球浸潤の阻害、ならびに自己免疫破壊に対するベータ細胞の保護における特定の使用を見出し得る。合成および組み換えCGRPを作製する方法は、米国特許第5,374,618号に記載される。
「コレシストキニン」または「CCK」は、ヒトCCKペプチドならびに成熟CCKの生物学的活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。CCK-58は成熟配列であり、一方、ヒトで最初に同定されたCCK-33アミノ酸配列は、主要な循環形態のペプチドである。CCKファミリーはまた、8つのアミノ酸のin vivo C末端断片(「CCK-8」)、ペンタガストリンまたはC末端ペプチドCCK(29-33)であるCCK-5、およびC末端テトラペプチドCCK(30-33)であるCCK-4も含む。CCKは、脂肪およびタンパク質の消化を刺激するのに関与する胃腸系のペプチドホルモンである。本発明のCCK-33およびCCK-8含有融合タンパク質は、食事摂取後の循環グルコースの増加の低下および循環インスリンの増加の増強において特定の使用を見出し得る。CCK-8のアナログは、米国特許第5,631,230号に記載されるとおり、調製される。
「エキセンディン-3」は、メキシコドクトカゲから単離されたグルコース調節ペプチドおよび成熟エキセンディン-3の生物学的活性の一部を少なくとも有するその配列バリアントを意味する。エキセンディン-3アミドは、膵cAMPの増加、ならびにインスリンおよびアミラーゼの放出を介在するもの由来の特異的エキセンディン受容体アンタゴニストである。本発明のエキセンディン-3含有融合タンパク質は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害の治療における特定の使用を見出し得る。そのアッセイのための配列および方法は、米国特許第5,4242,86号に記載される。
「エキセンディン-4」は、ヒラモンスターアメリカドクトカゲの唾液において見いだされたグルコース調節ペプチド、ならびにその種および配列バリアントを意味し、天然の39のアミノ酸の配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEYLKNGGPSSGAPPPS(配列番号47)ならびに成熟エキセンディン-4の生物学的活性の一部を少なくとも有する、その相同な配列およびペプチドミメティック、およびバリアント、霊長類由来などの天然配列および非天然配列を含む。エキセンディン-4は、血液グルコースを増加し、インスリン分泌を促進し、胃排出を遅らせ、満腹を改善し、これにより、食後高血糖の顕著な改善をもたらすインクレチンポリペプチドホルモンである。表4bは、多岐に渡る種由来の配列を示し、一方、表4cは、合成GLP-1アナログのリストを示し、その全ては、本明細書に記載されるBPXTENタンパク質における使用が企図される。
線維芽細胞成長因子21、または「FGF-21」は、FGF-21遺伝子によりコードされるヒトタンパク質、または成熟FGF-21の生物学的活性の少なくとも一部を有する、その種および配列バリアントを意味する。FGF-21は、脂肪細胞においてグルコース取り込みを刺激するが、他の細胞タイプにおいては刺激せず、効果は、インスリン活性に付加的である。本発明のFGF-21含有融合タンパク質は、エネルギー消費、脂肪利用および脂質排出を引き起こすことを含む、糖尿病の治療における特定の使用を見出し得る。FGF-21は、米国特許第6,716,626号に記載されるとおり、クローニングされる。
線維芽細胞成長因子19、または「FGF-19」は、FGF-19遺伝子によりコードされるヒトタンパク質、または成熟FGF-19の生物学的活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。FGF-19は、線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーのタンパク質メンバーである。レプチン受容体の肝臓発現、代謝速度を増加させ、脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激し、肥満マウスモデルにおいて体重減少を導く(Fu et al.,2004,Endocrinology 145:2504-2603)。FGF-19は、本発明のFGF-19含有融合タンパク質は、代謝速度の増加ならびに食事性およびレプチン欠損糖尿病の回復において特定の使用を見出し得る。FGF-19は、米国特許公開第20020042367号に記載されるとおり、クローニングされ、発現される。
「ガストリン」は、ヒトガストリンペプチド、切断バージョン、ならびに成熟ガストリンの生物学的活性の一部を少なくとも有する、種および配列バリアントを意味する。ガストリンは、三つの形態:ガストリン-34(「大きいガストリン」)、ガストリン-17(「小さいガストリン」)、およびガストリン-14(「最小のガストリン」)で主に見られ、CCKとの配列相同性を共有する。本発明のガストリン含有融合タンパク質は、グルコース調節のため肥満および糖尿病の治療における特定の使用を見出し得る。ガストリンは、米国特許第5,843,446号に記載されるとおり、合成される。
「グレリン」は、飽和を誘導するヒトホルモン、または天然の処理された27もしくは28のアミノ酸配列および相同の配列を含む、種および配列バリアントを意味する。グレリンレベルは、食前に増加し、食後に減少し、視床下部のレベルで発揮される作用により、食物摂取の増加をもたらし、脂肪量を増加させ得る。本発明のグレリン含有融合タンパク質は、アゴニストとして、例えば、胃腸の運動性障害におけるGI管の運動性を選択的に刺激するため、胃排出を促進するため、または成長ホルモンの放出を刺激するため、特定の使用を見出し得る。米国特許第7,385,026号に記載されるものなどの、配列置換を有するグレリンアナログまたは切断バリアントは、改善されたグルコース恒常性のアンタゴニストとして、インスリン抵抗性の治療および肥満の治療のための使用のための、XTENポリペプチドを有する融合パートナーとしての特定の使用を見出し得る。グレリンの単離および特徴が報告されており(Kojima et al.,1999,Nature.402:656-660)、合成アナログは、米国特許第6,967,237号に記載されるとおり、ペプチド合成により調製される。
「グルカゴン」は、ヒトグルカゴングルコース調節ペプチド、または成熟グルカゴンの生物学的活性の一部を少なくとも有する、天然の29アミノ酸配列および相同な配列を含む、その種および配列バリアント、霊長類由来などの天然配列バリアント、および非天然の配列バリアントを意味する。「グルカゴン」という用語は、本明細書で使用される場合、グルカゴンのペプチドミメティックも含む。本発明のグルカゴン含有融合タンパク質は、既存の肝グリコーゲン保存を有する個体における血液グルコースレベルの増加および糖尿病におけるグルコース恒常性の維持における特定の使用を見出し得る。グルカゴンは、米国特許第4,826,763号に記載されるとおり、クローニングされる。
「GLP-1」は、ヒトグルカゴン様ペプチド-1および成熟GLP-1の生物学的活性の一部を少なくとも有するその配列バリアントを意味する。用語「GLP-1」は、ヒトGLP-1(1-37)、GLP-1(7-37)、およびGLP-1(7-36)アミドを含む。GLP-1は、インスリン分泌を刺激するが、高血糖期間中のみである。インスリンと比較したGLP-1の安全性は、この特性により、および分泌されたインスリンの量が、高血糖の大きさの一部であるという知見により強化される。GLP-1(7-37)OHの生物学的半減期は、ほんの3~5分である(米国特許第5,118,666号)。本発明のGLP-1含有融合タンパク質は、グルコース調節のための糖尿病およびインスリン抵抗性障害の治療における特定の使用を見出し得る。GLP-1は、米国特許第5,118,666号に記載されるとおり、クローニングされ、誘導体が調製される。多岐に渡る種由来のGLP-1配列の非限定的な例は、表4bに示され、一方、表4cは、多数の合成GLP-1アナログの配列を示し、その全てが、本明細書に記載されるBPXTEN組成物における使用のため企図される。
GLP天然の配列は、以下で提示される、いくつかの配列モチーフにより記載することができる。括弧内の文字は、各配列位置の許容可能なアミノ酸を表す:{HVY}{AGISTV}{DEHQ}{AG}{ILMPSTV}{FLY}{DINST}{ADEKNST}{ADENSTV}{LMVY}{ANRSTY}{EHIKNQRST}{AHILMQVY}{LMRT}{ADEGKQS}{ADEGKNQSY}{AEIKLMQR}{AKQRSVY}{{AILMQSTV}{GKQR}{DEKLQR}{FHLVWY}{ILV}{ADEGHIKNQRST}{ADEGNRSTW}{GILVW}{AIKLMQSV}{ADGIKNQRST}{GKRSY}(配列番号9399)。加えて、GLP-1の合成アナログは、グルコース関連障害の治療において有用な生物学的活性を有するBPXTENタンパク質を作製するためのXTENポリペプチドへの融合パートナーとして有用であり得る。
「GLP-2」は、ヒトグルカゴン様ペプチド-2および成熟GLP-2の生物学的活性の一部を少なくとも有するその配列バリアントを意味する。より具体的には、GLP-2は、小腸および大腸における腸内分泌罹患細胞から、GLP-1と共に共分泌される33のアミノ酸のペプチドである。
「インスリン様成長因子1」または「IGF-1」は、ヒトIGF-1タンパク質ならびに成熟IGF-1の生物学的活性の一部を少なくとも有するその種および配列バリアントを意味する。IGF-1は、70のアミノ酸からなり、内分泌疾患ホルモンとして肝臓二より、ならびにパラクライン/オートクライン様式で標的組織において主に生成される。本発明のIGF-1含有融合タンパク質は、グルコース調節のための糖尿病およびインスリン抵抗性障害の治療における特定の使用を見出し得る。IGF-1は、米国特許第5,324,639号に記載されるとおり、クローニングされ、大腸菌および酵母において発現される。
「インスリン様成長因子2」または「IGF-2」は、ヒトIGF-2タンパク質ならびに成熟IGF-2の生物学的活性の一部を少なくとも有するその種および配列バリアントを意味する。IGF-2は、Bell et al.,1985,Proc Natl Acad Sci USA.82:6450-4に記載されるとおり、クローニングされる。
「膵島新生関連タンパク質」(INGAP)、または「膵ベータ細胞成長因子」は、ヒトINGAPペプチドならびに成熟INGAPの生物学的活性の一部を少なくとも有する、種および配列バリアントである。本発明のINGAP含有融合タンパク質は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害の治療または予防における特定の使用を見出し得る。INGAPは、R Rafaeloff et al.,1997,J Clin Invest.99(9):2100-2109に記載されるとおり、クローニングされ、発現される。
「インターメジン」または「AFP-6」は、ヒトインターメジンペプチドならびに成熟インターメジンの生物学的活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。インターメジン治療は、正常なヒトまたは動物と高血圧のヒトまたは動物の両方における血圧低下、ならびに胃排出活性の抑制を導き、グルコース恒常性に関係付けられる。本発明のインターメジン含有融合タンパク質は、糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の治療における特定の使用を見出し得る。インターメジンペプチドおよびバリアントは、米国特許第6,965,013号に記載されるとおり、クローニングされる。
「レプチン」は、任意の種由来の天然に存在するレプチン、ならびに生物学的に活性なD-アイソフォーム、またはその断片および配列バリアントを意味する。本発明のレプチン含有融合タンパク質は、グルコース調節のため糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の治療における特定の使用を見出し得る。レプチンは、米国特許第7,112,659号に記載されるとおり、クローニングされ、レプチンアナログおよび断片は、米国特許第5,521,283号、米国特許第5,532,336号、PCT/US96/22308およびPCT/US96/01471に記載されるとおり、クローニングされる。
「ニューロメジン」は、ニューロメジンUおよびSペプチド、ならびにその配列バリアントを含む、ペプチドのニューロメジンファミリーを意味する。様々な切断またはスプライスバリアント、例えば、FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN(配列番号180)が、ニューロメジンUファミリーに含まれる。ニューロメジンSファミリーの例は、配列ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN(配列番号181)を有するヒトニューロメジンS、特に、そのアミド形態である。本発明のニューロメジン融合タンパク質は、肥満、糖尿病の治療、食物摂取の低下、ならびに本明細書に記載される他の関連する状態および障害において特定の使用を見出し得る。
「オキシントモジュリン」、または「OXM」は、ヒトオキシントモジュリンならびに成熟OXMの生物学的活性の一部を少なくとも有する、種および配列バリアントを意味する。OXMは、結腸で生成される、29のアミノ酸の配列のグルカゴン、その後8つのアミノ酸のカルボキシ末端拡大を含有する37のアミノ酸ペプチドである。本発明のOXM含有融合タンパク質は、グルコース調節のための糖尿病、インスリン抵抗性障害、肥満の治療における特定の使用を見出し得、体重減少の治療として使用することができる。
「PYY」は、ヒトペプチドYYポリペプチドならびに成熟PYYの生物学的活性の一部を少なくとも有する、種および配列バリアントを意味する。本発明のPPY含有融合タンパク質は、グルコース調節のため糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の治療における特定の使用を見出し得る。PYYのアナログは、米国特許第5,604,203号、同第5,574,010号および同第7,166,575号に記載されるとおり、調製される。
「ウロコルチン」は、ヒトウロコルチンペプチドホルモンおよび成熟ウロコルチンの生物学的活性の一部を少なくとも有する、その配列バリアントを意味する。三つのヒトウロコルチン:Ucn-1、Ucn-2およびUcn-3が存在する。さらなるウロコルチンおよびアナログは、米国特許第6,214,797号に記載されている。本発明のウロコルチンを含むBPXTENタンパク質はまた、ACTH放出の刺激と関連する状態、血管拡張作用に起因する高血圧、ACTH上昇以外を介して介在される炎症、高熱、食欲障害、鬱血性心不全、ストレス、不安、および乾癬の治療または予防において特定の使用を見出し得る。ウロコルチン含有融合タンパク質はまた、ナトリウム利尿ペプチドモジュール、アミリンファミリー、およびエキセンディンファミリー、または心血管利益の増強、例えば、有益な血管拡張効果をもたらすことによるCHFの治療をもたらすためのGLP1ファミリーモジュールと組み合わすことができる。
代謝性疾患および心血管タンパク質
代謝疾患および心血管疾患は、ほとんどの先進国において相当な医療負担を負っており、心血管疾患は米国およびほとんどの欧州諸国において死亡および障害の第一の原因のままである。代謝性疾患および障害には、身体の臓器、組織、および循環系に影響を与える多種多様な状態が含まれる。
代謝疾患および心血管疾患は、ほとんどの先進国において相当な医療負担を負っており、心血管疾患は米国およびほとんどの欧州諸国において死亡および障害の第一の原因のままである。代謝性疾患および障害には、身体の臓器、組織、および循環系に影響を与える多種多様な状態が含まれる。
異常脂質血症は、糖尿病ならびに心血管疾患、典型的には、血漿トリグリセリドの上昇、低HDL(高密度リポタンパク質)コレステロール、正常から上昇したレベルのLDL(低密度リポタンパク質)コレステロールおよび血中の上昇したレベルの低密度のLDL粒子などのパラメーターにより特徴付けられる心血管疾患を有するヒトまたは動物で頻繁に生じる。異常脂質血症および高血圧は、冠動脈イベント、腎疾患、ならびに糖尿病および心血管疾患の様な代謝性疾患を有するヒトまたは動物での死の発生率上昇の主要な関与因子である。
心血管疾患は、多くの障害、症状ならびにとりわけ、動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害(脳卒中)、脳血管疾患、鬱血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心拍出の低下および末梢血管疾患、高血圧、低血圧、血液マーカー(例えば、C反応タンパク質、BNP、およびCPK、LDH、SGPT、SGOTなどの酵素)を含む、心臓、身体全体を通じた脈管構造および臓器系に関与する臨床パラメーターにより明らかであり得る。
大部分の代謝プロセスおよび多くの心血管パラメーターは、複数のペプチドおよびホルモン(「代謝タンパク質」)により調節され、多くのこのようなペプチドおよびホルモン、ならびにそのアナログは、このような疾患および障害の治療における有用性を見出した。しかしながら、治療用ペプチドおよび/またはホルモンの使用は、小分子薬物の使用により増強されたときでさえ、このような疾患および障害の管理において限られた成功となる。特に、用量最適化は、代謝性疾患、特に、小さい治療ウィンドウを有するものの治療において使用される薬物および生物製剤に重要である。ホルモンは、一般的に、およびグルコース恒常性に関与するペプチドは、多くの場合、小さい治療ウィンドウを有する。小さい治療ウィンドウは、このようなホルモンおよびペプチドが、典型的には、短い半減期を有するという事実と結び付いて、臨床上の利益を達成するために頻繁な投薬を必要とし、このような患者の管理を困難にする。したがって、代謝性疾患の治療における有効性および安全性の増加を伴った治療の必要が依然としてある。
したがって、本発明の一態様は、代謝性疾患および心血管疾患ならびに障害の治療に関与するか、または使用される、生物学的に活性な代謝タンパク質の、このような障害、疾患および関連する状態の治療における有用性を有する組成物を作製するためのBPXTEN融合タンパク質への取り込みである。代謝タンパク質は、代謝または心血管疾患、障害もしくは状態の予防、治療、介在、または緩和に有用である、生物学的、治療、または予防利益もしくは機能の任意のタンパク質を含み得る。表4dは、本発明のBPXTEN融合タンパク質により包含される代謝BPのこのような配列の非限定的なリストを提供する。本発明のBPXTEN組成物の代謝タンパク質は、表4dから選択されるタンパク質配列と少なくとも約80%の配列同一性、または代わりに、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈するタンパク質であり得る。
「抗CD3」は、T細胞表面タンパク質CD3に対するモノクローナル抗体、OKT3(ムロモナブとも呼ばれる)およびヒト化抗CD3モノクローナル抗体(hOKT31(Ala-Ala))(Herold et al.,2002,New England Journal of Medicine 346:1692-1698)を含む、その種および配列バリアント、ならびに断片を意味する。本発明の抗CD3含有融合タンパク質は、治療エフェクターならびにBPXTEN組成物における第二の治療BPのための標的化部分としての抗CD3の使用を含む、新規発症の1型糖尿病を遅延させるための特定の使用を見出し得る。可変領域の配列および抗CD3の作製は、米国特許第5,885,573号および同第6,491,916号に記載される。
「IL-1ra」は、ヒトIL-1受容体アンタゴニストタンパク質ならびに成熟IL-1raの生物学的活性の一部を少なくとも有する、配列バリアントアナキンラ(Kineret(登録商標))を含む、種および配列バリアントを意味する。アナキンラは、非グリコシル化組み換えヒトIL-1raであり、N末端メチオニンの付加により内在性ヒトIL-1raと異なる。アナキンラの商品化バージョンは、Kineret(登録商標)として市販されている。これは、天然IL-1raおよびIL-1bと同じアビディティでIL-1受容体に結合するが、IL-1ra上の一つのみの受容体結合モチーフ対IL-1αおよびIL-1β上の二つのこのようなモチーフの存在に寄与する効果である受容体活性化(シグナル伝達)をもたらさない。アナキンラは、153のアミノ酸、サイズ17.3kDを有し、報告されたおよそ4~6時間の半減期を有する。
IL-1生成の増加は、様々な微生物感染性疾患および様々な他の疾患を有する患者において報告されている。本発明のIL-1ra含有融合タンパク質は、前述の疾患および障害のいずれかの治療における特定の使用を見出し得る。IL-1raは、米国特許第5,075,222号および同第6,858,409号に記載されるとおり、クローニングされる。
「ナトリウム利尿ペプチド」は、心房性ナトリウム利尿のペプチド(ANP)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNPまたはB型ナトリウム利尿ペプチド)およびC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)、成熟対応物ナトリウム利尿ペプチドの生物学的活性の一部を少なくとも有する、ヒトと非ヒト両方のその種および配列バリアントを意味する。ナトリウム利尿ペプチドの有用な形態の配列は、米国特許公開第20010027181号に開示される。ANPの例としては、ヒトANP(Kangawa et al.,1984,BBRC 118:131)またはブタおよびラットANP(Kangawa et al.,1984,BBRC 121:585)を含む、様々な種由来のものが挙げられる。配列解析により、preproBNPが、134残基からなり、108のアミノ酸のProBNPに切断されることが明らかになった。ProBNPのC末端から32のアミノ酸の配列の切断は、循環する生理的に活性な形態である、ヒトBNP(77-108)をもたらす。32のアミノ酸のヒトBNPは、ジスルフィド結合(Sudoh et al.,1989,BBRC 159:1420)ならびに米国特許第5,114,923号、同第5,674,710号、同第5,674,710号、および同第5,948,761号の形成に関与する。一つ以上のナトリウム利尿機能を有するBPXTENは、高血圧の治療、利尿誘導、ナトリウム利尿誘導、血管伝道の拡大または弛緩、ナトリウム利尿ペプチド受容体(例えば、NPR-A)結合、副腎からのアルドステロンの分泌の抑制、心血管疾患および障害の治療、心臓イベント後または鬱血性心不全の結果としての心臓の組織修復の停止または逆転、腎疾患および障害の治療、虚血性脳卒中の治療または予防、ならびに喘息の治療において有用であり得る。
「ヘパリン結合成長因子2」または「FGF-2」は、ヒトFGF-2タンパク質ならびに成熟対応物の生物学的活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。FGF-2は、Burgess,W.H.and Maciag,T.,Ann.Rev.Biochem.,58:575-606(1989);Coulier,F.,et al.,1994,Prog.Growth Factor Res.5:1、およびPCT公開第87/01728号に記載されるとおり、クローニングされる。
「TNF受容体」は、TNFのヒト受容体、ならびに成熟TNFRの生物学的受容体活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。ヒトp55 TNF受容体およびTNFβの細胞外ドメインにより形成される複合体のX線結晶構造は、決定されている(参照により本明細書に取り込まれる、Banner et al.,1993 Cell 73:431)。
凝固因子
血友病では、血液の凝固は、ある特定の血漿血液凝固因子の欠如によって妨げられる。ヒト第IX(FIX)因子は、血液凝固カスケードの内在経路の重要な構成要素であるセリンプロテアーゼの酵素前駆体である。第VIIa(FVIIa)因子タンパク質は、FVIIIまたはFIXの阻害剤を用いた、血友病AまたはB患者および後天性の血友病を有する患者における出血エピソードの治療、ならびにFVIIIまたはFIXに対する阻害剤を用いた、血友病AまたはB患者における外科的処置または侵襲的手技のための有用性を見出した。したがって、血友病Bのための予防および/または治療計画の一部分として投与されるとき、拡張半減期および活性の維持を伴う第IX因子および第VIIa因子組成物、ならびに副作用を低下し、静脈内経路と皮下経路の両方により投与され得る製剤の必要が依然として存在する。
血友病では、血液の凝固は、ある特定の血漿血液凝固因子の欠如によって妨げられる。ヒト第IX(FIX)因子は、血液凝固カスケードの内在経路の重要な構成要素であるセリンプロテアーゼの酵素前駆体である。第VIIa(FVIIa)因子タンパク質は、FVIIIまたはFIXの阻害剤を用いた、血友病AまたはB患者および後天性の血友病を有する患者における出血エピソードの治療、ならびにFVIIIまたはFIXに対する阻害剤を用いた、血友病AまたはB患者における外科的処置または侵襲的手技のための有用性を見出した。したがって、血友病Bのための予防および/または治療計画の一部分として投与されるとき、拡張半減期および活性の維持を伴う第IX因子および第VIIa因子組成物、ならびに副作用を低下し、静脈内経路と皮下経路の両方により投与され得る製剤の必要が依然として存在する。
本発明のBPXTENに包含するための凝固因子は、血液凝固障害、疾患、または欠乏症の予防、治療、介在、または緩和に有用である生物学的、治療、または予防利益もしくは機能のタンパク質を含み得る。適当な凝固タンパク質は、基質、酵素または補助因子として凝固カスケードに関与する生物学的に活性なポリペプチドを含む。
表4eは、本発明のBPXTEN融合タンパク質により包含される凝固因子の配列の非限定的なリストを提供する。本発明のBPXTENに包含するための凝固因子は、表4eから選択されるタンパク質配列と少なくとも約80%の配列同一性、または代わりに81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈するタンパク質であり得る。
「第IX因子」(「FIX」)は、ヒト第IX因子タンパク質ならびに成熟第IX因子の生物学的受容体活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを含む。いくつかの実施形態では、FIXペプチドは、表4eの配列を含む、本明細書に記載されるFIXペプチドのいずれかの構造アナログまたはペプチドミメティックである。いくつかの実施形態では、FIXペプチドは、表4eの配列を含む、本明細書に記載されるFIXペプチドのいずれかの構造アナログまたはペプチドミメティックである。本発明の一つの具体的な例では、FIXはヒトFIXである。別の実施形態では、FIXは、表4eのポリペプチド配列である。成熟第IX因子は、およそ17重量%炭水化物を含有する415のアミノ酸残基の1本鎖タンパク質である(Schmidt 2003,Trends Cardiovasc Med,13:39)。
ある場合では、凝固因子は、第IX因子、第IX因子の配列バリアント、または表4eの例示的配列などの第IX因子部分、ならびに生物学的特性が第IX因子の活性をもたらすそれと実質的に相同な任意のタンパク質もしくはポリペプチドである。
「第VII因子」(FVII)は、ヒトタンパク質、ならびに活性化第VII因子の生物学的活性の一部を少なくとも有する、その種および配列バリアントを意味する。第VII因子および組み換えヒトFVIIaは、補充凝固因子に対する阻害因子を発生した血友病患者(第VIII因子または第IX因子欠乏を有する)における制御不可能な出血における使用のため導入されている。組み換えヒト第VIIa因子は、補充凝固因子に対する阻害因子を発生したものを含む、血友病患者(第VIII因子または第IX因子欠乏を有する)における制御不可能な出血の治療における有用性を有する。いくつかの実施形態では、FVIIペプチドは、表4eの配列を含む、本明細書に記載されるFVIIペプチドのいずれかの構造アナログまたはペプチドミメティックである活性化形態(FVIIa)である。第VII因子および第VIIa因子は、米国特許第6,806,063号および米国特許出願第20080261886号に記載されるとおり、クローニングされる。
成長ホルモンタンパク質
「成長ホルモン」または「GH」は、ヒト成長ホルモンタンパク質ならびにその種および配列バリアントを意味し、191の1本鎖アミノ酸のヒト配列のGHを含むが、これらに限定されない。本発明は、霊長類、哺乳動物(飼育動物を含む)など由来の天然およびGHの生物学的活性もしくは生物学的機能の一部を少なくとも保持する非天然の配列バリアントである配列断片、ならびに/またはGH関連疾患、欠乏、障害もしくは状態の予防、治療、介在、もしくは緩和に有用である配列断片である、任意のGH相同配列のBPXTENにおける包含を企図する。非哺乳動物GH配列は、文献において十分に記載される。例えば、フィッシュGHの配列アライメントは、Genetics and Molecular Biology 2003 26 p.295-300において見ることができる。加えて、ヒトGHに相同な天然の配列は、NCBI BLASTなどの標準的な相同性検索技術によって見出すことができる。
「成長ホルモン」または「GH」は、ヒト成長ホルモンタンパク質ならびにその種および配列バリアントを意味し、191の1本鎖アミノ酸のヒト配列のGHを含むが、これらに限定されない。本発明は、霊長類、哺乳動物(飼育動物を含む)など由来の天然およびGHの生物学的活性もしくは生物学的機能の一部を少なくとも保持する非天然の配列バリアントである配列断片、ならびに/またはGH関連疾患、欠乏、障害もしくは状態の予防、治療、介在、もしくは緩和に有用である配列断片である、任意のGH相同配列のBPXTENにおける包含を企図する。非哺乳動物GH配列は、文献において十分に記載される。例えば、フィッシュGHの配列アライメントは、Genetics and Molecular Biology 2003 26 p.295-300において見ることができる。加えて、ヒトGHに相同な天然の配列は、NCBI BLASTなどの標準的な相同性検索技術によって見出すことができる。
一実施形態では、ヒトまたは動物組成物に取り込まれたGHは、天然で見られるタンパク質に対応する配列を有する組み換えポリペプチドであり得る。別の実施形態では、GHは、天然のGHの生物学的活性の一部を少なくとも保持する、天然の配列の配列バリアント、断片、相同体、またはミメティックであり得る。表4fは、本発明のBPXTEN融合タンパク質により包含される多岐に渡る哺乳動物種由来のGHの配列の非限定的なリストを提供する。種またはファミリー間の個々の変異を組み換えることにより構築されるこれらのGH配列または相同な誘導体のいずれかは、本発明の融合タンパク質に有用であり得る。BPXTEN融合タンパク質に取り込まれ得るGHは、表4fから選択されるタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性、または代わりに81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈するタンパク質を含み得る。
サイトカイン
BPは、サイトカインまたは一つ以上のサイトカインであり得る。サイトカインは、細胞挙動に影響を与え得る細胞により放出されるタンパク質(例えば、ケモカイン、インターフェロン、リンホカイン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子)を指す。サイトカインは、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球およびマスト細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質性細胞を含む、広範囲の細胞により産生され得る。所定のサイトカインは、一つより多くのタイプの細胞により産生され得る。サイトカインは、全身または局所免疫調節効果を生み出すのに関与し得る。
BPは、サイトカインまたは一つ以上のサイトカインであり得る。サイトカインは、細胞挙動に影響を与え得る細胞により放出されるタンパク質(例えば、ケモカイン、インターフェロン、リンホカイン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子)を指す。サイトカインは、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球およびマスト細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質性細胞を含む、広範囲の細胞により産生され得る。所定のサイトカインは、一つより多くのタイプの細胞により産生され得る。サイトカインは、全身または局所免疫調節効果を生み出すのに関与し得る。
ある特定のサイトカインは、炎症促進性サイトカインとして機能し得る。炎症促進性サイトカインは、炎症反応の誘導または増幅に関与するサイトカインを指す。炎症促進性サイトカインは、免疫応答を生じるための、好中球および白血球などの免疫系の様々な細胞と共に働き得る。ある特定のサイトカインは、抗炎症性サイトカインとして機能し得る。抗炎症性サイトカインは、炎症反応の低下に関与するサイトカインを指す。抗炎症性サイトカインは、ある場合では、炎症促進性サイトカイン反応を調節し得る。いくつかのサイトカインは、炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカインの両方として機能し得る。
本発明の組成物により包含されるサイトカインは、非限定的に、癌、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、ウイルス感染(例えば、慢性C型肝炎、AIDS)、アレルギー性喘息、網膜神経変性過程、代謝障害、インスリン抵抗性、および糖尿病性心筋症を含む、様々な治療または疾患カテゴリーの治療において有用性を有し得る。サイトカインは、炎症性状態および自己免疫状態の治療において特に有用であり得る。
本開示の系および組成物により調節可能なサイトカインの例としては、ヒト成長ホルモンを除いて、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインの中でも、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体形成ホルモン(LH)などの糖タンパク質ホルモン、肝成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子-アルファ、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポエチン(TPO)、NGF-アルファなdの神経成長因子、血小板成長因子、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、およびTGF-ベータ3などのトランスフォーミング成長因子(TGF)、インスリン様成長因子-IおよびII、エリスロポエチン(EPO)、Flt-3L、幹細胞因子(SCF)、骨誘導因子、IFN-α、IFN-β、IFN-γなどのインターフェロン(IFN)、マクロファージ-CSF(M-CSF)などのコロニー刺激因子(CSF)、顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、顆粒球-CSF(G-CSF)、マクロファージ刺激因子(MSP)、IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12b、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-20などのインターロイキン(IL)、CD154、LT-ベータ、TNF-アルファ、TNF-ベータ、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCEなどの腫瘍壊死因子、ならびにLIF、オンコスタチンM(OSM)およびキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。サイトカイン受容体は、サイトカインに結合する受容体タンパク質を指す。サイトカイン受容体は、膜結合と溶解性の両方であり得る。
標的ポリヌクレオチドは、サイトカインをコードし得る。サイトカインの非限定的な例としては、4-1BBL、アクチビンβA、アクチビンβB、アクチビンβC、アクチビンβE、アルテミン(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形成タンパク質1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5,CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fasリガンド/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、グリア細胞株由来の神経栄養因子(GDNF)、増殖分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、インヒビン-A、インヒビン-B、レプチン、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、ニュールツリン(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、パーセフィン(PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-アルファ/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1、およびXCL2が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、免疫チェックポイント阻害因子をコードする。このような免疫チェックポイント阻害因子の非限定的な例としては、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、およびVISTAが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、T細胞受容体(TCR)アルファ、ベータ、ガンマ、および/またはデルタ鎖をコードする。
ある場合では、サイトカインはケモカインであり得る。ケモカインは、非限定的には、ARMCX2、BCA-1/CXCL13、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL15/MIP-5/MIP-1デルタ、CCL16/HCC-4/NCC4、CCL17/TARC、CCL18/PARC/MIP-4、CCL19/MIP-3b、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3アルファ/MIP3A、CCL21/6Ckine、CCL22/MDC、CCL23/MIP 3、CCL24/エオタキシン-2/MPIF-2、CCL25/TECK、CCL26/エオタキシン-3、CCL27/CTACK、CCL28、CCL3/Mip1a、CCL4/MIP1B、CCL4L1/LAG-1、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL8/MCP-2、CCL9、CML5、CXCL1、CXCL10/Crg-2、CXCL12/SDF-1 ベータ、CXCL14/BRAK、CXCL15/ラング力イン、CXCL16/SR-PSOX、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3/GROガンマ、CXCL4/PF4、CXCL5、CXCL6/GCP-2、CXCL9/MIG、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4/TAFA4、FAM19A5、フラクタルカイン/CX3CL1、I-309/CCL1/TCA-3、IL-8/CXCL8、MCP-3/CCL7、NAP-2/PPBP/CXCL7、XCL2、およびアルモIL10を含む群から選択され得る。
表4gは、本発明のBPXTEN融合タンパク質により包含されるBPのこのような配列の非限定的なリストを提供する。本発明のBPXTEN組成物の代謝タンパク質は、表4gから選択されるタンパク質配列と少なくとも約80%の配列同一性、または代わりに81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈するタンパク質であり得る。
「IL-1ra」は、ヒトIL-1受容体アンタゴニストタンパク質ならびに成熟IL-1raの生物学的活性の一部を少なくとも有する、配列バリアントアナキンラ(Kineret(登録商標))を含む、種および配列バリアントを意味する。ヒトIL-1raは、152のアミノ酸残基の成熟糖タンパク質である。本発明のIL-1ra含有融合タンパク質は、前述の疾患および障害のいずれかの治療における特定の使用を見出し得る。IL-1raは、米国特許第5,075,222号および同第6,858,409号に記載されるとおり、クローニングされる。
ある場合では、BPは、IL-10であり得る。IL-10は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの生成を抑制する有効な抗炎症性サイトカインであり得る。IL-10は、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、統合失調症、 アレルギー性喘息、網膜神経変性過程、および糖尿病などの自己免疫疾患ならびに炎症性疾患の治療に有用であり得る。
ある場合では、IL-10を改変して、安定性を改善し、熱分解を減少することができる。改変は、一つ以上のアミド結合置換であり得る。ある場合では、IL-10の骨格内の一つ以上のアミド結合を置換して、上述の効果を達成することができる。IL-10中の一つ以上のアミド結合(-CONH-)は、
-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-または-CH2SO-などのアミド結合のアイソスターである結合で置換することができる。さらに、IL-10におけるアミド結合はまた、還元型アイソスター偽ペプチド結合により置き換えることができる。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Couder et al.(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184を参照のこと。
-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-または-CH2SO-などのアミド結合のアイソスターである結合で置換することができる。さらに、IL-10におけるアミド結合はまた、還元型アイソスター偽ペプチド結合により置き換えることができる。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Couder et al.(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184を参照のこと。
アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、ならびに2,4-ジアミノプリオピオン酸、オルニチンまたはリジンおよびテトラゾール置換アルキルアミノ酸のヘテロアリールスルホンアミドを含む一つ以上の酸性アミノ酸、ならびにアスパラギン、グルタミン、およびアルキルなどの側鎖アミド残基またはアスパラギンもしくはグルタミンの芳香族置換誘導体、ならびにセリン、スレオニン、ホモセリン、2,3-ジアミノプロピオン酸、およびセリンもしくはスレオニンのアルキルもしくは芳香族置換誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸が置換され得る。
アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、(S)-2-アミノ酪酸、(S)-シクロヘキシルアラニンまたは他の単純なアルファ-アミノ酸などのIL-10における一つ以上の疎水性アミノ酸は、非限定的に、分岐、環状および直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル置換を含むC1~C10炭素の脂肪族側鎖を含む、アミノ酸で置換され得る。
ある場合では、IL-10における一つ以上の疎水性アミノ酸は、実例が、2-、3-または4-アミノフェニルアラニン、2-、3-または4-クロロフェニルアラニン、2-、3-または4-メチルフェニルアラニン、2-、3-または4-メトキシフェニルアラニン、5-アミノ-、5-クロロ-、5-メチル-または5-メトキシトリプトファン、2’-、3’-、または4’-アミノ-、2’-、3’-、または4’-クロロ-、2、3、または4-ビフェニルアラニン、2’-、3’-、または4’-メチル-、2-、3-または4-ビフェニルアラニン、および2-または3-ピリジルアラニンである、上で列挙された芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化(フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード)またはアルコキシ(C1~C4)置換形態を含む、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナフチルアラニン、2-ベンゾチエニルアラニン、3-ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含む、芳香族置換疎水性アミノ酸の置換で置換され得る。
アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化(フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード)またはアルコキシを含む、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナフチルアラニン、2-ベンゾチエニルアラニン、3-ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンなどのIL-10における一つ以上の疎水性アミノ酸は、2-、3-または4-アミノフェニルアラニン、2-、3-または4-クロロフェニルアラニン、2-、3-または4-メチルフェニルアラニン、2-、3-または4-メトキシフェニルアラニン、5-アミノ-、5-クロロ-、5-メチル-または5-メトキシトリプトファン、2’-、3’-、または4’-アミノ-、2’-、3’-、または4’-クロロ-、2、3、または4-ビフェニルアラニン、2’-、3’-、または4’-メチル-、2-、3-または4-ビフェニルアラニン、および2-または3-ピリジルアラニンを含む芳香族アミノ酸により置換され得る。
前述のアミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換誘導体を含む、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む塩基性側鎖を含むアミノ酸は、置換され得る。例としては、アルキル基がアルファ-炭素のプロ-R位置を占める、N-イプシロン-イソプロピル-リジン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-グリシン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-アラニン、N,N-ガンマ、ガンマ’-ジエチル-ホモアルギニン、アルファ-メチル-アルギニン、アルファ-メチル-2,3-ジアミノプロピオン酸、アルファ-メチル-ヒスチジン、およびアルファ-メチル-オルニチンである。改変されたIL-10は、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族、オルニチン、もしくは2,3-ジアミノプロピオン酸、カルボン酸の任意の組合せまたは酸塩化物、活性なエステル、活性なアゾライドおよび関連する誘導体、リジン、ならびにオルニチンなどの多くの周知の活性化誘導体のいずれかから形成されるアミドを含み得る。
ある場合では、IL-10は、一つ以上の天然に存在するL-アミノ酸、合成L-アミノ酸、および/またはアミノ酸のD-エナンチオマーを含み得る。IL-10ポリペプチドは、以下のアミノ酸:ω-アミノデカン酸、ω-アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、δ-アミノ吉草酸、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、オルニチン、シトルリン、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、ピリジルアラニン3-ベンゾチエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、β-アラニン、o-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、m-アミノメチル安息香酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン(サルコシン)、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、β-2-チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、N-アセチルリジン、2,4-ジアミノ酪酸、rho-アミノフェニルアラニン、N-メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε-アミノヘキサン酸、ω-アミノヘキサン酸、ω-アミノヘプタン酸、ω-アミノオクタン酸、および2,3-ジアミノ酪酸のうちの一つ以上を含み得る。
IL-10は、ジスルフィド結合を介して別のペプチドへのリンカーとして作用し得るか、またはIL-10ポリペプチドの環化をもたらすよう作用し得る、システイン残基またはシステインを含み得る。システインまたはシステインアナログを導入する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第8,067,532号を参照のこと。IL-10ポリペプチドは、環化され得る。他の手段の環化は、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入を含み、例えば、米国特許第8,044,175号を参照のこと。環化結合を形成し得るアミノ酸(または非アミノ酸部分)の任意の組み合わせは、使用され、および/または導入され得る。環化結合は、架橋結合の導入を可能にする官能基との(またはアミノ酸および-(CH2)nCO-または-(CH2)nC6H4-CO-との)アミノ酸の任意の組み合わせが生じ得る。いくつかの例としては、ジスルフィド、-(CH2)n-カルバ架橋、チオアセタール、チオエーテル架橋(シスタチオニンまたはランチオニン)ならびにエステルおよびエーテルを含有する架橋などのジスルフィドミメティックである。
IL-10は、構築物ラクタムならびにアルキルアミドおよびヒドラジドなどの置換されたアミドを含む、他の環状構造、C末端ヒドロキシメチル誘導体、o-改変誘導体、N末端改変誘導体に架橋結合しているN-アルキル、アリール、または骨格で置換され得る。ある場合では、IL-10ポリペプチドは、レトロインバーソアナログである。
IL-10は、天然のタンパク質、天然のIL-10の生物学的活性の一部を少なくとも有する、ペプチド断片IL-10、または改変ペプチドであり得るIL-10であり得る。IL-10は改変して、細胞内取り込みを改善し得る。一つのこのような改変は、タンパク質伝達ドメインの結合であり得る。タンパク質伝達ドメインは、IL-10のC末端に結合され得る。あるいは、タンパク質伝達ドメインは、IL-10のN末端に結合され得る。タンパク質伝達ドメインは、共有結合を介してIL-10に結合され得る。タンパク質伝達ドメインは、表4hに挙げられる配列のいずれかから選択することができる。
ヒトまたは動物組成物のBPは、天然の全長ポリペプチドに限定されず、組み換えバージョンならびに生物学的および/または薬理学的に活性なそのバリアントもしくは断片も含む。例えば、当業者であれば、様々なアミノ酸置換をBPで行い、BPの生物学的活性または薬理学的特性に関して、本発明の精神と逸脱することなく、バリアントを作製することができることは、理解するであろう。ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存的置換の例は、表5に示される。しかしながら、BPの配列同一性が、本明細書に開示される具体的な配列と比較して100%未満である、BPXTENの実施形態では、本発明は、隣接するアミノ酸残基を含む、BPの配列内の任意の位置にあり得る、所定のBPの所定のアミノ酸残基への他の19の天然のL-アミノ酸のいずれかの置換を企図する。任意の特定の置換が、生物学的活性の所望されない変化をもたらす場合、次いで、代替のアミノ酸が利用され、構築物が、本明細書に記載される方法により、または例えば、内容が参照によりその全体が取り込まれる米国特許第5,364,934号に記載される、保存的および非保存的変異についての技術およびガイドラインのいずれかを使用して、もしくは当業者に一般的に知られた方法を使用して評価され得る。加えて、バリアントは、例えば、一つ以上のアミノ酸残基が、天然のペプチドの生物学的活性の一部を少なくとも保持するBPの全長天然アミノ酸配列のNまたはC末端で付加されているか、または欠失されているポリペプチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、BPXTENポリペプチドに取り込まれたBPは、表4a~4hの配列と少なくとも約80%の配列同一性、代わりに、表4a~4hの配列と比較して、少なくとも約81%、または約82%、または約83%、または約84%、または約85%、または約86%、または約87%、または約88%、または約89%、または約90%、または約91%、または約92%、または約93%、または約94%、または約95%、または約96%、または約97%、または約98%、または約99%、または100%の配列同一性を呈する配列を有し得る。いくつかの実施形態では、BPXTENに取り込まれたBPは、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む二重特異性配列であり得、標的細胞の腫瘍特異的マーカーまたは抗原に対する特異的結合親和性を有する第一の結合ドメインは、表6fから選択される抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約80%配列同一性、または代わりに、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈し、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する第二の結合ドメインは、表6aから選択される抗標的細胞抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約80%配列同一性、または代わりに、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を呈する。前述の実施形態のBPは、本明細書に記載されるアッセイまたは測定もしくは決定されるパラメーターを使用して活性について評価され得、対応する天然のBP配列と比較して、少なくとも約40%、または約50%、または約55%、または約60%、または約70%、または約80%、または約90%、または約95%以上の活性を保持するその配列は、ヒトまたは動物BPXTENにおける包含に適しているとみなされるであろう。適当なレベルの活性を保持することが見出されたBPは、本明細書に上記されるか、または本明細書の他で記載される一つ以上のXTENポリペプチドに連結され得る。一実施形態では、適当なレベルの活性を保持することが見出されたBPは、表3a~3bの配列と少なくとも約80%の配列同一性(例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%の配列同一性)を有する一つ以上のXTENポリペプチドに連結され、これにより、キメラ融合タンパク質がもたらされ得る。
T細胞エンゲイジャー
BPXTENの追加の構造構成式は、XTEN化プロテアーゼ活性化T細胞エンゲイジャー(「XPAT」または「複数のXPAT」)に関し、BPは、二重特異的抗体(例えば、二重特異的T細胞エンゲイジャー)である。いくつかの実施形態では、XPAT組成物は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む第一の部分、放出セグメントを含む第二の部分、ならびにXTENバルキング部分を含む第三の部分を含む。いくつかの実施形態では、XPAT組成物は、式Ia(N末端からC末端に示される):
(第一の部分)-(第二の部分)-(第三の部分)(Ia)
(式中、第一の部分は、二つのscFvを含む二重特異的であり、第一の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有し、第二の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み(本明細書において以下でより完全に記載されるとおり、プロテアーゼは、腫瘍または抗原特異的であり、これにより、活性化であり得る)、第三の部分は、バルキング部分である)の配置を有する。前述の実施形態では、第一の部分の結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、もしくは(VH-VL)1-(VL-VH)2、もしくは(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、ポリペプチドリンカー(本明細書において以下でより完全に記載される)により連結される)であり得る。一実施形態では、第一の部分VLおよびVHの代替は、表6a~6fで同定され、RSの代替は、表8a~8b(本明細書において以下でより完全に記載される)に記載される配列に同定され、バルキング部分の代替は、XTEN、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド、脂肪酸、Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、PLGAならびにヒドキシエチルデンプンにより本明細書において同定される。所望される場合、バルキング部分は、表3a~3bに記載される配列により同定される配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組み換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学コンジュゲーションにより結合される。
BPXTENの追加の構造構成式は、XTEN化プロテアーゼ活性化T細胞エンゲイジャー(「XPAT」または「複数のXPAT」)に関し、BPは、二重特異的抗体(例えば、二重特異的T細胞エンゲイジャー)である。いくつかの実施形態では、XPAT組成物は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む第一の部分、放出セグメントを含む第二の部分、ならびにXTENバルキング部分を含む第三の部分を含む。いくつかの実施形態では、XPAT組成物は、式Ia(N末端からC末端に示される):
(第一の部分)-(第二の部分)-(第三の部分)(Ia)
(式中、第一の部分は、二つのscFvを含む二重特異的であり、第一の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有し、第二の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み(本明細書において以下でより完全に記載されるとおり、プロテアーゼは、腫瘍または抗原特異的であり、これにより、活性化であり得る)、第三の部分は、バルキング部分である)の配置を有する。前述の実施形態では、第一の部分の結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、もしくは(VH-VL)1-(VL-VH)2、もしくは(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、ポリペプチドリンカー(本明細書において以下でより完全に記載される)により連結される)であり得る。一実施形態では、第一の部分VLおよびVHの代替は、表6a~6fで同定され、RSの代替は、表8a~8b(本明細書において以下でより完全に記載される)に記載される配列に同定され、バルキング部分の代替は、XTEN、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド、脂肪酸、Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、PLGAならびにヒドキシエチルデンプンにより本明細書において同定される。所望される場合、バルキング部分は、表3a~3bに記載される配列により同定される配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組み換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学コンジュゲーションにより結合される。
別の実施形態では、XPAT組成物は、式IIa(N末端からC末端に示される):
(第三の部分)-(第二の部分)-(第一の部分)(IIa)
(式中、第一の部分は、二つのscFvを含む二重特異的であり、第一の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有し、第二の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み、第三の部分は、バルキング部分である)の配置を有する。前述の実施形態では、第一の部分の結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、もしくは(VH-VL)1-(VL-VH)2、もしくは(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、本明細書において以下で記載されるポリペプチドリンカーにより連結される)であり得る。一実施形態では、第一の部分VLおよびVHの代替は、表6a~6fで同定され、RSの代替は、表8a~8bに記載される配列に同定され、バルキング部分の代替は、XTEN、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド、脂肪酸、ならびにFcドメインにより本明細書において同定される。所望される場合、バルキング部分は、表3a~3bに記載される配列の群から選択される配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組み換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学コンジュゲーションにより結合される。
(第三の部分)-(第二の部分)-(第一の部分)(IIa)
(式中、第一の部分は、二つのscFvを含む二重特異的であり、第一の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有し、第二の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み、第三の部分は、バルキング部分である)の配置を有する。前述の実施形態では、第一の部分の結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、もしくは(VH-VL)1-(VL-VH)2、もしくは(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、本明細書において以下で記載されるポリペプチドリンカーにより連結される)であり得る。一実施形態では、第一の部分VLおよびVHの代替は、表6a~6fで同定され、RSの代替は、表8a~8bに記載される配列に同定され、バルキング部分の代替は、XTEN、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド、脂肪酸、ならびにFcドメインにより本明細書において同定される。所望される場合、バルキング部分は、表3a~3bに記載される配列の群から選択される配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組み換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学コンジュゲーションにより結合される。
別の実施形態では、XPAT組成物は、式IIIa(N末端からC末端に示される):
(第五の部分)-(第四の部分)-(第一の部分)-(第二の部分)-(第三の部分)(IIIa)
(式中、第一の部分は、二つのscFvを含む二重特異的であり、第一の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有し、第二の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み、第三の部分が、バルキング部分であり、第四の部分が、第二の部分と同一であるか、または異なり得る哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み、第五の部分は、第三の部分と同一であるか、または異なり得るバルキング部分である)の配置を有する。前述の実施形態では、第一の部分の結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、もしくは(VH-VL)1-(VL-VH)2、もしくは(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、本明細書において以下で記載されるポリペプチドリンカーにより連結される)であり得る。前述の実施形態では、RSの代替は、表8a~8bに記載される配列において同定される。前述の実施形態では、バルキング部分の代替は、XTEN、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド、脂肪酸、ならびにFcドメインにより本明細書において同定される。所望される場合、バルキング部分は、表3a~3bに記載される配列の群から選択される配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組み換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学コンジュゲーションにより結合される。
(第五の部分)-(第四の部分)-(第一の部分)-(第二の部分)-(第三の部分)(IIIa)
(式中、第一の部分は、二つのscFvを含む二重特異的であり、第一の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有し、第二の部分は、哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み、第三の部分が、バルキング部分であり、第四の部分が、第二の部分と同一であるか、または異なり得る哺乳動物プロテアーゼにより切断される能力がある放出セグメント(RS)を含み、第五の部分は、第三の部分と同一であるか、または異なり得るバルキング部分である)の配置を有する。前述の実施形態では、第一の部分の結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、もしくは(VH-VL)1-(VL-VH)2、もしくは(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、本明細書において以下で記載されるポリペプチドリンカーにより連結される)であり得る。前述の実施形態では、RSの代替は、表8a~8bに記載される配列において同定される。前述の実施形態では、バルキング部分の代替は、XTEN、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド、脂肪酸、ならびにFcドメインにより本明細書において同定される。所望される場合、バルキング部分は、表3a~3bに記載される配列の群から選択される配列と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組み換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学コンジュゲーションにより結合される。
ヒトまたは動物組成物は、その設計および特定の構成要素に基づき、有利には、より高い選択性、より長い半減期を有する二重特異的治療剤をもたらし、これらは、疾患によって不健康な状態となった標的組織または組織と関連して見出されるプロテアーゼによって切断されると、より低い毒性で、より少ない副作用をもたらし、ヒトまたは動物組成物は、当該技術分野で公知の二重特異的抗体組成物と比較して、改善された治療指標を有する。このような組成物は、本明細書に記載される癌を含むが、これに限定されない、ある特定の疾患の治療において有用である。いかなる機械論にも縛られることを望まないが、当業者であれば、本発明の組成物が、結合ドメインを嵩高いXTEN分子に位置付けることにより立体障害を含む、機序の組み合わせにより非特異的相互作用のこの低下を達成し、組成物により繋留されることによる、XTENポリペプチドの可動性の不定形の特徴は、結合ドメイン周囲で変動し、動くことができ、これにより、組成物と組織または細胞の間での遮断をもたらし、ならびに個々の結合ドメインのサイズと比較して、大きな分子量に起因した(XTENポリペプチドの両方の実際の分子量が関与し、不定形なXTENポリペプチドの大きな水力学的半径に起因した)細胞または組織に侵入するインタクトな組成物の能力の低下をもたらすことを理解するであろう。しかしながら、RSを切断する能力があるプロテアーゼを生じるかまたは分泌する標的組織または細胞に近位であるとき、または結合ドメインがリガンドに結合するとき、標的細胞もしくは組織に内部移行されるとき、二重特異的結合ドメインが、プロテアーゼの作用によりXTENのバルクから遊離され、これにより、立体障害バリアが取り除かれ、その薬理学的作用を自由に発揮する、組成物が設計される。ヒトまたは動物組成物は、細胞、組織または臓器への選択的送達が所望される、様々な状態の治療における使用を見出す。一実施形態では、標的組織は、白血病、リンパ腫、または臓器もしくは系の腫瘍であり得る、癌である。
結合ドメイン
本開示は、非限定的に、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、直線抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ科抗体、1本鎖抗体分子(scFv)、ならびに癌、腫瘍、または他の悪性組織である疾患組織または細胞のエフェクター細胞および抗原と関連するリガンドまたは受容体と結合する能力があるディアボディなどの1本鎖結合ドメインの使用を企図する。いくつかの実施形態では、二重特異的抗体は、標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第一の結合ドメインおよびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第二の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第一および第二の結合ドメインは、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、DARPinなどの非抗体足場であり得る。他の実施形態では、腫瘍細胞標的の結合ドメインは、腫瘍細胞により過剰発現されるタンパク質のペプチド断片と共に負荷されるMHCに結合するよう操作されたT細胞受容体の可変ドメインである。いくつかの実施形態では、XPAT組成物は、大きい治療ウィンドウをもたらすために、標的組織プロテアーゼの位置ならびに標的化されることが意図されない健康な組織における同じプロテアーゼの存在、ならびに健康な組織における標的リガンドの存在だが、不健康な標的組織におけるリガンドのより多い存在を考慮して、設計される。「治療ウィンドウ」は、所定の治療組成物についての最小有効用量と最大許容用量の間の最大の相違を指す。広い治療ウィンドウを達成するのを助けるために、組成物の第一の部分の結合ドメインは、バルキング部分(例えば、XTENポリペプチド)の近位により遮蔽され、リガンドの一方または両方についてのインタクトな組成物の結合親和性は、哺乳動物プロテアーゼにより切断された組成物と比較して低下し、これにより、バルキング部分の遮蔽効果から第一の部分が放出される。
本開示は、非限定的に、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、直線抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ科抗体、1本鎖抗体分子(scFv)、ならびに癌、腫瘍、または他の悪性組織である疾患組織または細胞のエフェクター細胞および抗原と関連するリガンドまたは受容体と結合する能力があるディアボディなどの1本鎖結合ドメインの使用を企図する。いくつかの実施形態では、二重特異的抗体は、標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第一の結合ドメインおよびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第二の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第一および第二の結合ドメインは、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、DARPinなどの非抗体足場であり得る。他の実施形態では、腫瘍細胞標的の結合ドメインは、腫瘍細胞により過剰発現されるタンパク質のペプチド断片と共に負荷されるMHCに結合するよう操作されたT細胞受容体の可変ドメインである。いくつかの実施形態では、XPAT組成物は、大きい治療ウィンドウをもたらすために、標的組織プロテアーゼの位置ならびに標的化されることが意図されない健康な組織における同じプロテアーゼの存在、ならびに健康な組織における標的リガンドの存在だが、不健康な標的組織におけるリガンドのより多い存在を考慮して、設計される。「治療ウィンドウ」は、所定の治療組成物についての最小有効用量と最大許容用量の間の最大の相違を指す。広い治療ウィンドウを達成するのを助けるために、組成物の第一の部分の結合ドメインは、バルキング部分(例えば、XTENポリペプチド)の近位により遮蔽され、リガンドの一方または両方についてのインタクトな組成物の結合親和性は、哺乳動物プロテアーゼにより切断された組成物と比較して低下し、これにより、バルキング部分の遮蔽効果から第一の部分が放出される。
1本鎖結合ドメインに関して、Fvが、非共有結合性会合で一つの重鎖(VH)および一つの軽鎖可変ドメイン(VL)のダイマーからなる、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片であることは、当該技術分野において十分に確立されている。各VHおよびVL鎖内には、VH-VLダイマーの表面上の抗原結合部位を定義するよう相互作用する三つの相補性決定領域(CDR)があり、結合ドメインの6つのCDRは、抗原結合特異性を抗体または1本鎖結合ドメインに付与する。ある場合では、各々が、各結合ドメイン内に3、4、または5つのCHRを有するscFvが作製される。CDRに隣接するフレームワーク配列は、種にわたり天然の免疫グロブリンで本質的に保存される3次構造を有し、フレームワーク残基(FR)は、その適切な向きでCDRを保持するよう働く。定常ドメインは、結合機能のため必要とされないが、VH-VL相互作用を安定化することを目的とし得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの結合部位のドメインは、同じまたは異なる免疫グロブリンのいずれかのVH-VL、VH-VHまたはVL-VLドメインの対であり得るが、概して、親抗体由来のそれぞれのVHおよびVL鎖を使用して1本鎖結合ドメインを作製することが好ましい。ポリペプチド鎖内のVHおよびVLドメインの順は、本発明について限定されず、所定のドメインの順は、通常、機能を喪失することなく逆転され得るが、VHおよびVLドメインは、抗原結合部位が正しく折り畳まれ得るように、配置されることは理解される。したがって、ヒトまたは動物組成物の二重特異的scFv実施形態の1本鎖結合ドメインは、順(VL-VH)1-(VL-VH)2(式中、「1」および「2」は、それぞれ、第一および第二の結合ドメインを表す)、または(VL-VH)1-(VH-VL)2、または(VH-VL)1-(VL-VH)2、または(VH-VL)1-(VH-VL)2(式中、対形成された結合ドメインは、本明細書に以下で記載されるポリペプチドリンカーにより連結される)であり得る。
したがって、本明細書に開示される例示的な二重特異的1本鎖抗体における結合ドメインの配置は、第一の結合ドメインが、第二の結合ドメインに対してC末端に位置するものであり得る。V鎖の配置は、VH(標的細胞表面抗原)-VL(標的細胞表面抗原)-VL(エフェクター細胞抗原)-VH(エフェクター細胞抗原)、VH(標的細胞表面抗原)-VL(標的細胞表面抗原)-VH(エフェクター細胞抗原)-VL(エフェクター細胞抗原)、VL(標的細胞表面抗原)-VH(標的細胞表面抗原)-VL(エフェクター細胞抗原)-VH(エフェクター細胞抗原)またはVL(標的細胞表面抗原)-VH(標的細胞表面抗原)-VH(エフェクター細胞抗原)-VL(エフェクター細胞抗原)であり得る。第二の結合ドメインが、第一の結合ドメインに対してN末端に位置する、配置について、以下の順が可能である:VH(エフェクター細胞抗原)-VL(エフェクター細胞抗原)-VL(標的細胞表面抗原)-VH(標的細胞表面抗原)、VH(エフェクター細胞抗原)-VL(エフェクター細胞抗原)-VH(標的細胞表面抗原)-VL(標的細胞表面抗原)、VL(エフェクター細胞抗原)-VH(エフェクター細胞抗原)-VL(標的細胞表面抗原)-VH(標的細胞表面抗原)またはVL(エフェクター細胞抗原)-VH(エフェクター細胞抗原)-VH(標的細胞表面抗原)-VL(標的細胞表面抗原)。本明細書で使用される場合、「N末端に」または「C末端に」およびその文法上の変形は、二重特異的1本鎖抗体の絶対的なNまたはC末端での置換よりむしろ、一次アミノ酸配列内の相対的な位置を示す。故に、非限定的な例として、「第二の結合ドメインに対してC末端に位置する」第一の結合ドメインは、第一の結合が、二重特異的1本鎖抗体内の第二の結合ドメインのカルボキシル側に位置し、追加の配列、例えば、His-タグ、またはラジオアイソトープなどの別の化合物が、二重特異的1本鎖抗体のC末端に位置する可能性を除外しないことを示す。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む第一の部分を含み、前述の結合ドメインの各々が、scFvであり、各scFvは、一つのVLおよび一つのVHを含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む第一の部分を含み、前述の結合ドメインは、ディアボディ配置にあり、各ドメインは、一つのVLドメインおよび一つのVHを含む。前述の実施形態では、第一ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、第二の結合ドメインは、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する。前述のうちの一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞上または内で発現される。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、CD4+、CD8+、またはナチュラルキラー(NK)細胞などのT細胞上で発現される。別の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、B細胞、マスター細胞、樹状細胞、または骨髄系細胞上で発現される。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、細胞障害性T細胞の分化3抗原のクラスターであるCD3である。前述のうちのいくつかの実施形態では、第一の結合ドメインは、腫瘍細胞と関連する腫瘍特異的マーカーに対する結合特異性を呈する。一実施形態では、結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有し、腫瘍細胞は、間質細胞腫瘍、線維芽細胞腫瘍、筋線維芽細胞腫瘍、グリア細胞腫瘍、上皮細胞腫瘍、脂肪細胞腫瘍、免疫細胞腫瘍、血管細胞腫瘍、および平滑筋細胞腫瘍由来の細胞を限定することなく含み得る。一実施形態では、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原は、アルファ4インテグリン、Ang2、B7-H3、B7-H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1,EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD-L1、PSMA、CEA、TROP-2、MUC1(ムチン)、MUC-2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、ルイス-Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9-O-アセチル-GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、ネクチン-4、ソニックヘッジホッグ(Shh)、Wue-1、血漿細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6-膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly-6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、癌抗原19-9(CA19-9)、癌抗原125(CA-125)、ミュラー管阻害物質受容体タイプII(MISIIR)、シアル酸付加Tn抗原(sTN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、トムゼン-フリーデンライヒ抗原(TF-抗原)、インスリン様成長因子I受容体(IGF-IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT-MMPs、F19抗原、CA19-9、CA-125、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2であり得る。一実施形態では、CD70に対する結合親和性を呈する第一の結合ドメインは、抗体断片よりむしろその天然のリガンドCD27である。別の実施形態では、B7-H6に対する結合親和性を呈する第一の結合ドメインは、抗体断片よりむしろその天然のリガンドNkp30である。
本発明のXPAT組成物のscFv実施形態は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、VLおよびVHドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体からもたらされる。他の場合では、第一および第二の結合ドメインは各々、それぞれ、腫瘍特異的マーカーなどの標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体からもたらされる6つのCDRを含む。他の実施形態では、ヒトまたは動物組成物の第一の部分の第一および第二の結合ドメインは、各結合ドメイン内に3つ、4つ、または5つのCHRを有する 他の実施形態では、本発明の実施形態は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、各々は、CDR-H1領域、CDR-H2領域、CDR-H3領域、CDR-L1領域、CDR-L2領域、およびCDR-H3領域を含み、前述の領域の各々は、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合する能力があるモノクローナル抗体からもたらされる。一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第二の結合ドメインは、ヒトCD3に結合する能力があるモノクローナル抗体からもたらされるVHおよびVL領域を含む。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、scFv第二の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6aに記載される抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を呈するか、または同一である。別の態様では、本発明の第二ドメイン実施形態は、CDR-H1領域、CDR-H2領域、CDR-H3領域、CDR-L1領域、CDR-L2領域、およびCDR-H3領域を含み、前述の領域の各々は、表6aに記載されるモノクローナル抗体からもたらされる。前述の実施形態では、VHおよび/またはVLドメインは、scFv、ディアボディ、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ科抗体として構成され得る。
他の実施形態では、ヒトまたは動物組成物の第二ドメインは、表6aに記載される抗CD3抗体からもたらされる。前述の一実施形態では、ヒトまたは動物組成物の第二ドメインは、表6aに記載される抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH領域配列を含む。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第二の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6aに記載されるhuUCHT1抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を呈するか、または同一である。前述の実施形態では、VHおよび/またはVLドメインは、scFv、ディアボディの一部、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ科抗体として構成され得る。
他の実施形態では、組成物の第一ドメインのscFvは、表6fに記載される抗腫瘍細胞抗体からもたらされる。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第一の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6fに記載される抗腫瘍細胞抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、または91%、または92%、または93%、または94%、または95%、または96%、または97%、または98%、または99%の同一性を呈する。前述の一実施形態では、列挙される組成物の第一ドメインは、本明細書に開示される抗腫瘍細胞抗体の対形成されるVLおよびVH領域配列を含む。前述の実施形態では、VHおよび/またはVLドメインは、scFv、ディアボディの一部、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ科抗体として構成され得る。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む第一の部分を含み、前述の結合ドメインは、ディアボディ配置にあり、前述の結合ドメインの各々は、一つのVLドメインおよび一つのVHドメインを含む。一実施形態では、本発明のディアボディ実施形態は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、VLおよびVHドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体からもたらされる。別の実施形態では、本発明のディアボディ実施形態は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、各々は、CDR-H1領域、CDR-H2領域、CDR-H3領域、CDR-L1領域、CDR-L2領域、およびCDR-H3領域を含み、前述の領域の各々は、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合する能力があるモノクローナル抗体からもたらされる。本発明のディアボディ実施形態は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、VLおよびVHドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体からもたらされると想像される。別の態様では、本発明のディアボディ実施形態は、第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、各々は、CDR-H1領域、CDR-H2領域、CDR-H3領域、CDR-L1領域、CDR-L2領域、およびCDR-H3領域を含み、前述の領域の各々は、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合する能力があるモノクローナル抗体からもたらされる。一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、ディアボディ第二の結合ドメインは、ヒトCD3に結合する能力があるモノクローナル抗体からもたらされる対形成されたVHおよびVL領域を含む。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、ディアボディ第二の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6aに記載される抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を呈するか、または同一である。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、ディアボディ第二の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6aに記載されるhuUCHT1抗体のVLおよびVH配列と少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を呈するか、または同一である。他の実施形態では、組成物のディアボディ第二ドメインは、本明細書に記載される抗CD3抗体からもたらされる。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、ディアボディ第一の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6fに記載される抗腫瘍細胞抗体のVLおよびVH配列と少なくとも約90%、または91%、または92%、または93%、または94%、または95%、または96%、または97%、または98%、または99%の同一性を呈する。他の実施形態では、組成物のディアボディ第一ドメインは、本明細書に記載される抗腫瘍細胞抗体からもたらされる。
ヒトまたは動物組成物のため、VLおよびVHならびにCDRドメインがもたらされ得る治療モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。上記抗体の配列は、公的に入手可能なデータベース、特許、または文献参照から得ることができる。加えて、表6aに記載されるモノクローナル抗体ならびに抗CD3抗体由来のVHおよびVL配列の非限定的な例ならびに表6fに記載される癌、腫瘍、または標的細胞マーカーに対するモノクローナル抗体ならびにVHおよびVL配列の非限定的な例。
抗CD3結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本発明は、T細胞に対する結合親和性を有する、第一の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、第二の部分の結合ドメインは、CD3の抗原に対するモノクローナル抗体からもたらされるVLおよびVHを含む。別の実施形態では、結合ドメインは、CD3イプシロンおよびCD3デルタに対するモノクローナル抗体からもたらされるVLおよびVHを含む。CD3neuに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。CD3に対するモノクローナル抗体のVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表6aに記載される。一実施形態では、本発明は、表6aに記載される抗CD3VLおよびVH配列を含むCD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、表6aに記載される抗CD3イプシロンVLおよびVH配列を含むCD3イプシロンに対する結合親和性を有する第一の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第一の部分のscFv第二の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6aに記載されるhuUCHT1抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を呈するか、または同一である。別の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含むCD3に対する結合親和性で結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、各々は、表6aに記載されるそれぞれの抗CD3VLおよびVH配列からもたらされる。別の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含むCD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、CDR配列は、RASQDIRNYLN(配列番号8034)、YTSRLES(配列番号8035)、QQGNTLPWT(配列番号8036)、GYSFTGYTMN(配列番号8037)、LINPYKGVST(配列番号8038)、およびSGYYGDSDWYFDV(配列番号8039)である。
いくつかの実施形態では、本発明は、T細胞に対する結合親和性を有する、第一の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、第二の部分の結合ドメインは、CD3の抗原に対するモノクローナル抗体からもたらされるVLおよびVHを含む。別の実施形態では、結合ドメインは、CD3イプシロンおよびCD3デルタに対するモノクローナル抗体からもたらされるVLおよびVHを含む。CD3neuに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。CD3に対するモノクローナル抗体のVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表6aに記載される。一実施形態では、本発明は、表6aに記載される抗CD3VLおよびVH配列を含むCD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、表6aに記載される抗CD3イプシロンVLおよびVH配列を含むCD3イプシロンに対する結合親和性を有する第一の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第一の部分のscFv第二の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6aに記載されるhuUCHT1抗CD3抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を呈するか、または同一である。別の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含むCD3に対する結合親和性で結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、各々は、表6aに記載されるそれぞれの抗CD3VLおよびVH配列からもたらされる。別の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含むCD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、CDR配列は、RASQDIRNYLN(配列番号8034)、YTSRLES(配列番号8035)、QQGNTLPWT(配列番号8036)、GYSFTGYTMN(配列番号8037)、LINPYKGVST(配列番号8038)、およびSGYYGDSDWYFDV(配列番号8039)である。
CD3複合体は、T細胞抗原受容体(TCR)と会合し、TCRの細胞表面発現およびペプチド:MHCリガンドがTCRに結合したとき、生じるシグナル伝達伝達カスケードにおいて機能する、細胞表面分子の群である。典型的には、抗原がT細胞受容体に結合するとき、CD3は、細胞膜を通してT細胞内部の細胞質にシグナルを送る。これにより、TCRが曝露された特定の抗原を攻撃するよう感作された新規T細胞を生成するよう迅速に分割するT細胞の活性化が引き起こされる。CD3複合体は、四つの他の膜結合ポリペプチド(CD3-ガンマ、デルタ、ゼータ、およびベータ)と共にCD3イプシロン分子からなる。ヒトでは、CD3-イプシロンは、染色体11上のCD3E遺伝子によりコードされる。CD3鎖の各々の細胞内ドメインは、T細胞受容体会合時に細胞内シグナル伝達機構のための核形成点として働く、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含有する。
多数の治療ストラテジーは、TCRシグナル伝達、特に、免疫抑制レジメンで臨床上広く使用される抗ヒトCD3モノクローナル抗体(mAb)を標的化することによる、T細胞免疫を調整する。CD3特異的マウスmAb OKT3は、ヒトでの使用がライセンス提供された第一のmAbであり(Sgro,C.Side-effects of a monoclonal antibody,muromonab CD3/orthoclone OKT3:bibliographic review.Toxicology 105:23-29,1995)、移植での免疫抑制剤として、1型糖尿病、および乾癬において臨床上広く使用され(Chatenoud,Clin.Transplant 7:422-430,(1993);Chatenoud,Nat.Rev.Immunol.3:123-132(2003);Kumar,Transplant.Proc.30:1351-1352(1998))。重要なことに、抗CD3mAbは、部分的なT細胞シグナル伝達およびクローン麻痺を誘導し得る(Smith,JA,Nonmitogenic Anti-CD3 Monoclonal Antibodies Deliver a Partial T Cell Receptor Signal and Induce Clonal Anergy J.Exp.Med.185:1413-1422(1997))。OKT3は、T細胞マイトジェンならびに強力なT細胞キラーとして文献において記載されている(Wong,JT.The mechanism of anti-CD3 monoclonal antibodies.Mediation of cytolysis by inter-T cell bridging.Transplantation 50:683-689(1990))。特に、Wongの研究により、CD3T細胞および標的細胞を架橋することにより、標的の殺傷を達成することができ、FcRにより介在されるADCCも相補鎖固定化も、標的細胞を溶解するための二価抗CD3MABが必要でないことが示された。
OKT3は、時間依存性の様式:サイトカイン放出をもたらすT細胞の早期活性化に続いて、さらなる投与の後、OKT3は、既知のT細胞機能をすべて遮断する、でマイトジェン活性とT細胞殺傷活性の両方を呈する。OKT3が、同種移植片の組織拒絶を低減または消滅さえするための療法レジメンにおける免疫抑制剤として、このような幅広い用途を発見したのは、この後のT細胞機能の遮断による。CD3分子に特異的な他の抗体は、Tunnacliffe,Int.Immunol.1(1989),546-50に開示され、国際公開第2007/033230号は、抗ヒトモノクローナルCD3イプシロン抗体を記載し、米国特許第5,821,337号は、マウス抗CD3モノクローナルAb UCHT1のVLおよびVH配列(muxCD3、Shalaby et al.,J.Exp.Med.175,217-225(1992))、ならびにこの抗体のヒト化バリアント(hu UCHT1)を記載し、米国特許出願第20120034228号は、ヒトおよびチンパンジーでない霊長類CD3イプシロン鎖のエピトープに結合する能力がある結合ドメインを開示する。
CD3細胞抗原結合断片
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかに組み込むことができる、エフェクター細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する抗原結合断片(AF2)に関する。ある場合では、エフェクター細胞抗原は、形質細胞、T細胞、B細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(CIK細胞)、マスト細胞、樹状細胞、制御性T細胞(RegT細胞)、ヘルパーT細胞、骨髄細胞、およびNK細胞から選択されるエフェクター細胞の表面上に発現される。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかに組み込むことができる、エフェクター細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する抗原結合断片(AF2)に関する。ある場合では、エフェクター細胞抗原は、形質細胞、T細胞、B細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(CIK細胞)、マスト細胞、樹状細胞、制御性T細胞(RegT細胞)、ヘルパーT細胞、骨髄細胞、およびNK細胞から選択されるエフェクター細胞の表面上に発現される。
エフェクター細胞抗原に結合する様々なAF2は、罹患細胞または組織の細胞死滅をもたらすような組成形式で罹患細胞または組織に関連するEGFR抗原に対する結合親和性を有する抗原結合断片と対合するのに特に有用である。結合特異性は、相補性決定領域、または軽鎖CDRもしくは重鎖CDRなどのCDRによって決定することができる。多くの事例では、結合特異性は、軽鎖CDRおよび重鎖CDRによって決定される。重鎖CDRおよび軽鎖CDRの所与の組み合わせは、他の参照抗原と比較してエフェクター細胞抗原に対するより高い親和性および/または特異性を付与する所与の結合ポケットを提供する。短い可動性のペプチドリンカーによって、EGFRに対する第一の抗原結合断片(AF1)を、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第二の抗原結合断片(AF2)に連結させた結果として生じる二重特異性組成物は、各々の抗原結合断片がそれらのそれぞれのリガンドに対する特異的結合親和性を有する二重特異性である。当業者であれば、かかる組成物では、エフェクター細胞を罹患組織の細胞に密接に近づけて、罹患組織の細胞の細胞溶解をもたらすために、罹患組織のEGFRに対して指向されたAF1がエフェクター細胞マーカーに向かって指向されたAF2と組み合わせて使用されることが理解するであろう。さらに、AF1およびAF2は、切断可能な放出セグメントおよびXTENを含む特異的に設計されたポリペプチドに組み込まれて、放出セグメント配列の一つ以上の位置で放出セグメントを切断することができるプロテアーゼを有する罹患組織の近くにあるときに、放出セグメントの切断時に融合されたAF1およびAF2の放出によって活性化される組成物にプロドラッグ特性を付与する。
一実施形態では、ヒトまたは動物組成物のAF2は、T細胞の表面上に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を有する。別の実施形態では、ヒトまたは動物組成物のAF2は、CD3に対する結合親和性を有する。別の実施形態では、ヒトまたは動物組成物のAF2は、CD3複合体のすべての既知のCD3サブユニット、例えば、CD3イプシロン、CD3デルタ、CD3ガンマ、CD3ゼータ、CD3アルファ、およびCD3ベータを、個々の形態でまたは独立して組み合わせた形態で含む、CD3複合体のメンバーに対する結合親和性を有する。別の実施形態では、AF2は、CD3イプシロン、CD3デルタ、CD3ガンマ、CD3ゼータ、CD3アルファ、またはCD3ベータに対する結合親和性を有する。
本開示によって企図される抗原結合断片の起源は、天然に存在する抗体もしくはその断片、天然に存在しない抗体もしくはその断片、ヒト化抗体もしくはその断片、合成抗体もしくはその断片、ハイブリッド抗体もしくはその断片、または操作された抗体もしくはその断片に由来し得る。所与の標的マーカーに対する抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)によって最初に記載されているハイブリドーマ法を使用して作製することができ、または組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。抗体およびその断片の構造、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域(VHおよびVL)、一本鎖可変領域(scFv)、相補性決定領域(CDR)、およびドメイン抗体(dAb)が十分に理解されている。所与の抗原に対して結合親和性を有する所望の抗原結合断片を有するポリペプチドを生成するための方法は、当該技術分野で既知である。
当業者であれば、本明細書に開示される組成物実施形態に対する「抗原結合断片」という用語の使用が、対応するインタクトな抗体のリガンドである抗原に結合する能力を保持する抗体の部分または断片を含むよう意図されていることを理解するであろう。かかる実施形態では、抗原結合断片は、CDRおよび介在フレームワーク領域、抗体の軽鎖および/重鎖の可変もしくは超可変領域(VL、VH)、可変断片(Fv)、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fab断片、一本鎖抗体(scAb)、VHHラクダ科抗体、一本鎖可変断片(scFv)、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、相補性決定領域(CDR)、ドメイン抗体(dAb)、BHH型もしくはBNAR型の単一ドメイン重鎖免疫グロブリン、単一ドメイン軽鎖免疫グロブリン、または抗原に結合することができる抗体の断片を含む当該技術分野で既知の他のポリペプチドである得るが、これらに限定されない。CDR-HおよびCDR-Lを有する抗原結合断片は、N末端からC末端に(CDR-H)-(CDR-L)または(CDR-H)-(CDR-L)配向で構成され得る。二つの抗原結合断片のVLおよびVHを一本鎖ディアボディ構成で構成することもでき、すなわち、AF1およびAF2のVLおよびVHが適切な長さのリンカーで構成されて、ディアボディとしての配置が可能になる。
本開示の様々なCD3結合AF2は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態におけるそれらの安定性を増強するように特異的に修飾されている。抗体のタンパク質凝集は、それらの開発可能性において引き続き重大な問題であり、抗体産生において依然として焦点を当てるべき主要分野である。抗体凝集は、そのドメインの部分的なアンフォールディングによって誘発され、単量体-単量体会合に続いて、核形成および凝集物成長をもたらす可能性がある。抗体および抗体ベースのタンパク質の凝集傾向は、外部実験条件の影響を受ける可能性があるが、それらは、それらの配列および構造によって決定される内因性抗体特性に強く依存する。タンパク質が折り畳まれた状態でわずかに安定していることは周知であるが、多くの場合、ほとんどのタンパク質が、その折り畳まれていない状態または部分的に折り畳まれていない状態では本質的に凝集しやすく、かつ結果として生じる凝集体が極めて安定しており、寿命が長い可能異性があることはあまり理解されていない。凝集傾向の減少が発現力価の増加を伴うことも示されており、タンパク質凝集の減少が開発プロセス全体を通じて有益であり、かつ臨床試験へのより効率的な道につながる可能性があることを示す。治療用タンパク質の場合、凝集体は、患者における有害な免疫反応の重大な危険因子であり、様々な機序を介して生じる可能性がある。凝集を制御することにより、タンパク質の安定性、製造可能性、摩耗率、安全性、製剤、力価、免疫原性、および溶解性を改善することができる。サイズ、疎水性、静電気、および電荷分布などのタンパク質の固有の特性は、タンパク質の溶解性において重要な役割を果たす。表面疎水性のため治療用タンパク質の溶解度が低い場合、製剤開発がより困難になり、インビボでの不良な生体内分布、望ましくない薬物動態挙動、および免疫原性につながり得ることが示されている。候補モノクローナル抗体の全体的な表面疎水性を減少させることにより、精製および投与レジメンに関連する利益およびコスト削減を提供することもできる。個別のアミノ酸は、構造分析によって抗体の凝集能に寄与するものとして特定することができ、CDRにもフレームワーク領域にも位置することができる。特に、残基は、所与の抗体に疎水性問題を引き起こすリスクが高いと予測され得る。一実施形態では、本開示は、親抗体または抗体断片に対して、AF2がフレームワーク領域内に疎水性アミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸置換を有するCD3に特異的に結合する能力を有するAF2を提供し、疎水性アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニンから選択される。別の実施形態では、CD3 AF2は、一つ以上のフレームワーク領域内に疎水性アミノ酸の少なくとも二つのアミノ酸置換を有し、疎水性アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニンから選択される。
ポリペプチドの正味電荷の変化は、特に、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を含む抗体または抗体断片に関して、本明細書に記載される実施形態のAF2の配列の設計において考慮され、個々のアミノ酸置換は、出発点として利用される親抗体に対してなされている。これらの設計上の考慮事項に関連するのは、ポリペプチドの等電点(pI)であり、これは、抗体または抗体断片が正味電荷を持たないpHである。抗体または抗体断片は、典型的には、血中クリアランスの増加および組織保持の増加と相関する傾向にある正味陽性電荷を有し、概して、短い半減期を有する一方、正味陰性電荷は、組織取り込みの減少およびより長い半減期をもたらす。変異を介してフレームワーク残基に対するこの電荷を操作することが可能である。ポリペプチドの等電点は、インビトロアッセイで数学的(例えば、計算的)または実験的に決定することができる。いくつかの実施形態では、AF1およびAF2の等電点は、互いの特定の範囲内であるように設計され、それによって安定性を促進する。
一実施形態では、本開示は、CDR-LおよびCDR-Hを含む本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2を提供し、AF2は、(a)表面抗原分類3 T細胞受容体(CD3)に特異的に結合し、(b)それぞれ、配列番号742、743、および744のアミノ酸配列を有するCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。別の実施形態では、本開示は、CDR-LおよびCDR-Hを含む本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2を提供し、AF2は、(a)表面抗原分類3 T細胞受容体(CD3)に特異的に結合し、(b)それぞれ、配列番号742、743、および744のアミノ酸配列を有する、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、(c)CDR-Lを含み、CDR-Lは、配列番号735または736のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号738または739のアミノ酸配列を有するCDR-L2、および配列番号740のアミノ酸配列を有するCDR-L3を含む。別の実施形態では、本段落の実施形態の前述のAF2実施形態は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)をさらに含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号748~751のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755もしくは配列番号756のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、
AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号748のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号749のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物ポリペプチド実施形態のAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号750のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物ポリペプチド実施形態のAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号751のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号756のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。
AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号748のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号749のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物ポリペプチド実施形態のAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号750のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号755のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物ポリペプチド実施形態のAF2は、軽鎖フレームワーク領域(FR-L)および重鎖フレームワーク領域(FR-H)を含み、AF2は、配列番号746のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L1と、配列番号747のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L2と、配列番号751のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L3と、配列番号754のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-L4と、配列番号756のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H1と、配列番号759のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H2と、配列番号760のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H3と、配列番号764のアミノ酸配列と少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を呈するか、またはそれと同一であるFR-H4とを含む。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2を提供し、AF2は、配列番号766または配列番号769のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するか、またはそれと同一である可変重(VH)アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2を提供し、AF2は、配列番号765、767、768、770、または771のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するか、またはそれと同一である可変軽(VL)アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2を提供し、AF2は、配列番号766または配列番号769のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するか、またはそれと同一である可変重(VH)アミノ酸配列、および配列番号765、767、768、770、または771のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するか、またはそれと同一である可変軽(VL)アミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド実施形態のうちのいずれかにおける使用のためのAF2を提供し、AF2は、配列番号776~780のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するか、またはそれと同一であるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、CD3タンパク質複合体に結合し、かつ当該技術分野で既知のCD3結合抗体または抗原結合断片と比較して増強された安定性を有するAF2抗原結合断片を提供する。加えて、本開示のCD3抗原結合断片は、それらが組み込まれるキメラ二重特異性抗原結合断片組成物により高い安定度を付与するよう設計されており、これにより、ヒトまたは動物に投与されたときに、融合タンパク質の発現および回収の改善、貯蔵寿命の増加、および安定性の増強がもたらされる。一つのアプローチでは、本開示のCD3 AF2は、当該技術分野で既知のある特定のCD3結合抗体および抗原結合断片と比較してより高い熱安定度を有するように設計されている。結果として、それらが組み込まれたキメラ二重特異性抗原結合断片組成物の成分として利用されるCD3 AF2は、高い熱安定性および低い凝集傾向を含む好ましい医薬特性を呈し、製造および貯蔵中の発現および回収の改善をもたらし、長い血清半減期を促進する。熱安定性などの生物物理学的特性は、多くの場合、抗体可変ドメインによって制限され、それらの固有の特性は大きく異なる。高い熱安定性は、多くの場合、高い発現レベルおよび他の所望の特性、例えば、凝集に対する感受性が低いことと関連している(Buchanan A,et al.Engineering a therapeutic IgG molecule to address cysteinylation,aggregation and enhance thermal stability and expression.MAbs 2013;5:255)。熱安定性は、分子の半分が変性する温度として定義される「融解温度」(Tm)を測定することによって決定される。各ヘテロ二量体の融解温度は、その熱安定性を示す。以下の実施例に記載される方法を含むTmを決定するためのインビトロアッセイは、当該技術分野で既知である。ヘテロ二量体の融点は、示差走査熱量測定法などの技法を使用して測定され得る(Chen et al(2003)Pharm Res 20:1952-60、Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68:47-52)。あるいは、ヘテロ二量体の熱安定性は、円偏光二色性(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して、または以下の実施例に記載されるように測定され得る。
本開示のCD3結合断片および当該抗CD3結合断片と参照結合断片とを含む抗CD3二重特異性抗体の熱変性曲線は、本開示の構築物が、配列番号781に示される配列からなる抗原結合断片または対照二重特異性抗体よりも熱変性に耐性を示すことを示し、当該対照二重特異性抗原結合断片は、配列番号781と本明細書に記載のEGFR実施形態に結合する参照抗原結合断片とを含む。一実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、本明細書に記載の実施形態の抗CD3 AF2を含み、AF2のTmは、インビトロアッセイでの融解温度の増加によって決定された場合、配列番号781の配列からなる抗原結合断片のTmよりも少なくとも2℃高い、または少なくとも3℃高い、または少なくとも4℃高い、または少なくとも5℃高い、または少なくとも6℃高い、または少なくとも7℃高い、または少なくとも8℃高い、または少なくとも9℃高い、または少なくとも10℃高い。
別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、ヒトまたはcyno CD3抗原を含むインビトロ抗原結合アッセイで決定された場合、約10nM~約400nM、または約50nM~約350nM、または約100nM~300nMの解離定数(Kd)定数でヒトまたはcyno CD3に特異的に結合するAF2を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、インビトロ抗原結合アッセイで決定された場合、約10nM、または約50nM、または約100nM、または約150nM、または約200nM、または約250nM、または約300nM、または約350nM、または約400nMよりも弱い解離定数(Kd)で、ヒトまたはcyno CD3に特異的に結合するAF2を含む。明確にするために、400のKdを有する抗原結合断片は、10nMのKdを有するものよりも弱くそのリガンドに結合する。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、インビトロ抗原結合アッセイでそれぞれの解離定数(Kd)によって決定された場合、配列番号781のアミノ酸配列からなる抗体結合断片よりも少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または少なくとも10倍弱い結合親和性でヒトまたはcyno CD3に特異的に結合するAF2を含む。別の実施形態では、本開示は、インビトロ抗原結合アッセイでそれぞれの解離定数(Kd)によって決定された場合、ヒトまたは動物ポリペプチドに組み込まれたAF1 EGFR実施形態の結合親和性に対して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍 10倍、20倍、50倍 100倍、または少なくとも1000倍弱いCD3に対する結合親和性を呈するAF2を含む二重特異性ポリペプチドを提供する。標的リガンドに対するヒトまたは動物組成物の結合親和性は、結合アッセイもしくは競合的結合アッセイ、例えば、チップ結合受容体もしくは結合タンパク質を用いたBiacoreアッセイ、または米国特許第5,534,617号に記載のELISAアッセイ、本明細書の実施例に記載のアッセイ、放射受容体アッセイ、または当該技術分野で既知の他のアッセイを使用してアッセイすることができる。次いで、結合親和性定数は、van Zoelen,et al.,Trends Pharmacol Sciences(1998)19)12):487によって説明されるScatchard分析などの標準方法、または当該技術分野で既知の他の方法を使用して決定することができる。
関連態様では、本開示は、CD3に結合し、かつ当該技術分野で既知のCD3結合抗体または抗原結合断片を含む対応する組成物と比較して増強された安定性を本開示の組成物に付与する等電点(pI)を有するように設計されたキメラ二重特異性ポリペプチド組成物に組み込まれるAF2を提供する。一実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、CD3に結合するAF2を含み、AF2は、6.0~6.6(境界値も含む)であるpIを呈する。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、CD3に結合するAF2を含み、AF2は、配列番号781に示される配列からなる参照抗原結合断片のpIよりも少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1.0pH単位低いpIを呈する。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、EGFR抗原に結合するAF1に融合されたCD3に結合するAF2を含み、AF2は、EGFR抗原またはそのエピトープに結合するAF1のpIの少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、または1.5pH単位以内であるpIを呈する。別の実施形態では、本明細書に記載のヒトまたは動物組成物実施形態のうちのいずれかのポリペプチドは、EGFR抗原に結合するAF1に融合したCD3に結合するAF2を含み、AF2は、AF1のpIの少なくとも約0.1~約1.5、または少なくとも約0.3~約1.2、または少なくとも約0.5~約1.0、または少なくとも約0.7~約0.9pH単位以内であるpIを呈する。これらの二つの抗原結合断片のpIがかかる範囲内である設計により、結果として生じる融合された抗原結合断片が、それらが組み込まれるキメラ二重特異性抗原結合断片組成物により高い安定度を付与し、可溶性の非凝集形態での融合タンパク質の改善された発現の改善および回収の増強、製剤化されたキメラ二重特異性ポリペプチド組成物の貯蔵寿命の増加、ならびに組成物がヒトまたは動物に投与されたときに安定性の増強をもたらすことが具体的に意図されている。別々に述べると、AF2およびAF1を比較的狭いpI範囲内に有することにより、AF2およびAF1の両方が安定している緩衝液または他の溶液の選択を可能することができ、それによって組成物の全体的な安定性が促進される。
ある特定の実施形態では、抗原結合断片のVLおよびVHは、一緒に連結されると、可動性特性を有する、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個の親水性アミノ酸を含む比較的長いリンカーによって融合される。一実施形態では、本明細書に記載されるscFv実施形態のいずれかのVLおよびVHは、GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG(配列番号8058)
TGSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSGT(配列番号8059)、
GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEG(配列番号8060)、または
GSAAPTAGTTPSASPAPPTGGSSAAGSPST(配列番号8061)である親水性アミノ酸の比較的長いリンカーによって連結される。別の実施形態では、AF1およびAF2は、3、4、5、6、または7個のアミノ酸を有する親水性アミノ酸の短いリンカーによって一緒に連結される。一実施形態では、短いリンカー配列は、配列SGGGGS(配列番号8062)、GGGGS(配列番号8063)、GGSGGS(配列番号8064)、GGS、またはGSPである。別の実施形態では、本開示は、折り畳み後に、第一のドメイン(VLまたはVH)が最後のドメイン(VHまたはVL)と対になって一方のscFvを形成し、これらの二つのドメインが中間で対になって他方のscFvを形成し、ここで、第一および第二のドメインならびに第3および最後のドメインが前述の短いリンカーのうちの一つによって一緒に融合されており、第2および第3の可変ドメインが前述の比較的長いリンカーのうちの一つによって融合されている、一本鎖ディアボディを含む組成物を提供する。当業者によって理解されるように、短いリンカーおよび比較的長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインの誤った対合を防止するためであり、それにより、第一の抗原結合断片および第二の抗原結合断片のVLおよびVHを含む一本鎖ディアボディ構成の形成を促進する。
TGSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSGT(配列番号8059)、
GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEG(配列番号8060)、または
GSAAPTAGTTPSASPAPPTGGSSAAGSPST(配列番号8061)である親水性アミノ酸の比較的長いリンカーによって連結される。別の実施形態では、AF1およびAF2は、3、4、5、6、または7個のアミノ酸を有する親水性アミノ酸の短いリンカーによって一緒に連結される。一実施形態では、短いリンカー配列は、配列SGGGGS(配列番号8062)、GGGGS(配列番号8063)、GGSGGS(配列番号8064)、GGS、またはGSPである。別の実施形態では、本開示は、折り畳み後に、第一のドメイン(VLまたはVH)が最後のドメイン(VHまたはVL)と対になって一方のscFvを形成し、これらの二つのドメインが中間で対になって他方のscFvを形成し、ここで、第一および第二のドメインならびに第3および最後のドメインが前述の短いリンカーのうちの一つによって一緒に融合されており、第2および第3の可変ドメインが前述の比較的長いリンカーのうちの一つによって融合されている、一本鎖ディアボディを含む組成物を提供する。当業者によって理解されるように、短いリンカーおよび比較的長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインの誤った対合を防止するためであり、それにより、第一の抗原結合断片および第二の抗原結合断片のVLおよびVHを含む一本鎖ディアボディ構成の形成を促進する。
抗EpCAM結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーEpCAMに対する結合親和性を有する、結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、EpCAMに対するモノクローナル抗体からもたらされるVLおよびVHを含む。EpCAMに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。EpCAMモノクローナル抗体ならびにそのVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表6fに記載される。一実施形態では、本発明は、表6fに記載される抗EpCAM VLおよびVH配列を含む腫瘍特異的マーカーEpCAMに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第一の部分の第一の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6fに記載される4D5MUCB抗EpCAM抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、または91%、または92%、または93%、または94%、または95%、または96%、または97%、または98%、または99%の同一性を呈する。別の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性で結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、各々は、表6fに記載されるそれぞれのVLおよびVH配列からもたらされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーEpCAMに対する結合親和性を有する、結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、EpCAMに対するモノクローナル抗体からもたらされるVLおよびVHを含む。EpCAMに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。EpCAMモノクローナル抗体ならびにそのVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表6fに記載される。一実施形態では、本発明は、表6fに記載される抗EpCAM VLおよびVH配列を含む腫瘍特異的マーカーEpCAMに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、第一の部分の第一の結合ドメインは、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域は、表6fに記載される4D5MUCB抗EpCAM抗体の対形成されたVLおよびVH配列と少なくとも約90%、または91%、または92%、または93%、または94%、または95%、または96%、または97%、または98%、または99%の同一性を呈する。別の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性で結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、各々は、表6fに記載されるそれぞれのVLおよびVH配列からもたらされる。
上皮細胞接着分子(EpCAM、17-1A抗原としても知られている)は、ある特定の上皮および多くのヒト癌腫で発現された314のアミノ酸からなる40kDaの膜統合糖タンパク質である(Balzar,The biology of the 17-1A antigen(Ep-CAM),J.Mol.Med.1999,77:699-712を参照のこと)。上皮細胞起源のため、ほとんどの癌腫由来の腫瘍細胞は、原発性、転移性、および播種性非小細胞肺癌細胞(Passlick,B.,et al.The 17-1A antigen is expressed on primary,metastatic and disseminated non-small cell lung carcinoma cells.Int.J.Cancer 87(4):548-552,2000)、胃および胃食道接合部腺癌(Martin,I.G.,Expression of the 17-1A antigen in gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinomas:a potential immunotherapeutic target? J Clin Pathol 1999;52:701-704)、ならびに乳癌にける乳癌および結腸直腸癌(Packeisen J,et al.Detection of surface antigen 17-1A in breast and colorectal cancer.Hybridoma.1999 18(1):37-40)の大部分を含む、EpCAMをその表面上に発現し(正常な健康細胞よりも多い)、腫瘍細胞上のEpCAMの過剰発現は、生存の予測因子である(Gastl,Lancet.2000,356,1981-1982)。上皮細胞起源のため、ほとんどの癌腫由来の腫瘍細胞は、その表面上でEpCAMを発現する。
一実施形態では、EpCAMに特異的な結合ドメインおよびCD3に特異的な結合ドメインを有する第一の部分を有する二重特異的キメラポリペプチドアセンブリー組成物が、本明細書に提供される。解決すべき技術的問題は、腫瘍性疾患の有効な治療および、または緩和のための、忍容性良好でより簡便な医薬(より少ない頻度の投与)の特性を呈する、改善された組成物の生成のための手段および方法を提供することであった。前述の技術的問題の解決策は、本明細書に開示される実施形態によって達成され、特許請求の範囲において特徴付けられる。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物に関し、前述の組成物は、少なくとも二つの結合ドメインを含む二重特異的1本鎖抗体組成物を含む第一の部分を含み、前述のドメインの一つは、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合し、第二ドメインは、EpCAM抗原に結合し、前述の結合ドメインは、EpCAMに特異的なVLおよびVHならびにヒトCD3抗原に特異的なVLおよびVHを含む。好ましくは、実施形態では、EpCAMに特異的な前述の結合ドメインは、インビトロ結合アッセイで決定される、10-7~10-10M未満のKd値を有する。前述の一実施形態では、結合ドメインはscFv形式である。前述の別の実施形態では、結合ドメインは、1本鎖ディアボディ形式である。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第一の部分の結合ドメインおよびCD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第二の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。本発明のこれらの実施形態を含む腫瘍特異的マーカーは、CCR5、CD19、HER-2、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、ルイス-Y、CD-20、CD33、CD30、ガングリオシドGD3、9-O-アセチル-GD3、Globo H、fucosyl GM1、GD-2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、ソニックヘッジホッグ、Wue-1、血漿細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、CCR8、前立腺の6-膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、LY-6、SAS、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体、CD-25、癌抗原19-9(CA 19-9)、癌抗原125(CA-125)、ミュラー管阻害物質II型受容体(MISIIR)、シアル酸付加Tn抗原、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、CD-63、TAG-72、トムゼン-フリーデンライヒ抗原(TF-抗原)、インスリン様成長因子I受容体(IGF-IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD79a、CD79b、G250、F19、EphA2、およびMT-MMを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、抗マーカーVLおよびVH配列を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する、第一の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。ある特定のこれらの腫瘍マーカーに特異的なVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表6fに記載される。他の実施形態では、本発明は、CDR-L1領域、CDR-L2領域、CDR-L3領域、CDR-H1領域、CDR-H2領域、およびCDR-H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性で第一の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供し、各々は、それぞれのVLおよびVH配列からもたらされる。好ましくは、実施形態では、前述の結合ドメインは、インビトロ結合アッセイで決定される、10-7~10-10M未満のKd値を有する。
バリアントが、所望の抗原に対する結合特異性を呈する限り、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、前述の結合ドメインまたはその配列バリアントのいずれか一つを含み得ることが、具体的に企図される。一実施形態では、配列バリアントは、VLまたはVH配列中のアミノ酸の異なるアミノ酸での置換により作製される。欠失バリアントでは、本明細書に記載されるVLまたはVH配列中の一つ以上のアミノ酸残基は、除去される。したがって、欠失バリアントは、結合ドメインポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換バリアントでは、VLまたはVH(もしくはCDR)ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸残基は、取り除かれ、別の残基で置換される。一態様では、置換は、本質的に保存的であり、このタイプの保存的置換は、当該技術分野で周知である。加えて、本明細書に開示される第一および第二の結合ドメインを含む組成物は、本明細書に開示される方法のいずれかで利用され得ることが、具体的に企図される。
非構造化立体構造
典型的には、本明細書に開示される融合タンパク質のXTENポリペプチド構成要素は、拡張した長さのポリマーにも関わらず、生理学的条件下で変性ペプチド配列のように挙動するように設計される。「変性」は、ペプチド骨格の大きな立体構造自由度によって特徴付けられる溶液中のペプチドの状態を記載する。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性物の存在下または高温で変性した立体構造を取る。変性した構造中のペプチドは、例えば、特徴的な円二色性(CD)スペクトルを有し、NMRによって決定される広い範囲の相互作用の欠如によって特徴付けられる。「変性立体構造」および「不定形の立体構造」が本明細書で同義で使用される。ある場合では、本発明は、生理的条件下で、二次構造において主に欠失した変性配列に類似し得るXTENポリペプチドを提供する。他の場合では、XTENポリペプチドは、生理的条件下で二次構造を実質的に欠いてもよい。「主に欠失した」は、この文脈で使用される場合、各XTENポリペプチドのXTENアミノ酸残基の50%未満が、本明細書に記載される手段によって測定または決定される二次構造に寄与することを意味する。「実質的に欠失した」は、本文脈で使用される場合、XTEN配列のXTENアミノ酸残基の少なくとも約60%、または約70%、または約80%、または約90%、または約95%、または少なくとも約99%が、本明細書に記載される手段により測定または決定される二次構造に寄与しないことを意味する。
典型的には、本明細書に開示される融合タンパク質のXTENポリペプチド構成要素は、拡張した長さのポリマーにも関わらず、生理学的条件下で変性ペプチド配列のように挙動するように設計される。「変性」は、ペプチド骨格の大きな立体構造自由度によって特徴付けられる溶液中のペプチドの状態を記載する。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性物の存在下または高温で変性した立体構造を取る。変性した構造中のペプチドは、例えば、特徴的な円二色性(CD)スペクトルを有し、NMRによって決定される広い範囲の相互作用の欠如によって特徴付けられる。「変性立体構造」および「不定形の立体構造」が本明細書で同義で使用される。ある場合では、本発明は、生理的条件下で、二次構造において主に欠失した変性配列に類似し得るXTENポリペプチドを提供する。他の場合では、XTENポリペプチドは、生理的条件下で二次構造を実質的に欠いてもよい。「主に欠失した」は、この文脈で使用される場合、各XTENポリペプチドのXTENアミノ酸残基の50%未満が、本明細書に記載される手段によって測定または決定される二次構造に寄与することを意味する。「実質的に欠失した」は、本文脈で使用される場合、XTEN配列のXTENアミノ酸残基の少なくとも約60%、または約70%、または約80%、または約90%、または約95%、または少なくとも約99%が、本明細書に記載される手段により測定または決定される二次構造に寄与しないことを意味する。
所定のポリペプチド中の二次構造および三次構造の存在または不存在を識別するための様々な方法が、当該技術分野で確立されている。特に、XTEN二次構造は、例えば、遠紫外線スペクトル領域(190~250nm)における円形二色性分光法によって、分光光度を測定することができる。アルファヘリックスおよびベータシートなどの二次構造要素は各々、CDスペクトルの特徴的な形状および大きさを生じさせる。二次構造はまた、米国特許公開第20030228309A1に記載される周知のチョウ・ファスマンアルゴリズム(Chou,P.Y.,et al.(1974) Biochemistry,13:222-45)およびガルニエ・オスグソープ・ロブソン(「GOR」)アルゴリズム(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996),GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence.Methods Enzymol 266:540-553)などのある特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介してポリペプチド配列について推定される。所定の配列について、アルゴリズムは、例えば、アルファ-らせん体もしくはベータシートを形成する配列の残基の合計および/または割合、またはランダムなコイル形成(二次構造を欠く)をもたらすと予測される配列の残基の割合として表される、いくつかの二次構造が存在するか、または存在しないかを予測することができる。
ある場合では、本融合タンパク質組成物において使用されるXTENポリペプチドは、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより決定される、0%から約5%未満の範囲にあるアルファ-らせん体割合を有し得る。他の場合では、融合タンパク質組成物を含むXTENポリペプチドは、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより決定される、0%から約5%未満の範囲にあるベータシート割合を有し得る。ある場合では、融合タンパク質組成物のXTEN配列は、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより決定される、0%から約5%未満の範囲にあるアルファ-らせん体割合および0%から約5%未満の範囲にあるベータ-シート割合を有し得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質組成物を含むXTENポリペプチドは、約2%未満のアルファ-らせん体割合および約2%未満のベータ-シート割合を有し得る。他の場合では、融合タンパク質組成物のXTEN配列は、GORアルゴリズムにより決定される、高い程度のランダムコイル割合を有し得る。いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、GORアルゴリズムにより決定される、少なくとも約80%、より好ましくは、少なくとも約90%、より好ましくは、少なくとも約91%、より好ましくは、少なくとも約92%、より好ましくは、少なくとも約93%、より好ましくは、少なくとも約94%、より好ましくは、少なくとも約95%、より好ましくは、少なくとも約96%、より好ましくは、少なくとも約97%、より好ましくは、少なくとも約98%、最も好ましくは、少なくとも約99%のランダムコイルを有し得る。
正味電荷
他の場合では、XTENポリペプチドは、正味の電荷を有するアミノ酸残基の取り込みおよび/またはXTENポリペプチド中の疎水性アミノ酸の割合の低下により付与される不定形の特徴を有し得る。全体的な正味電荷および正味電荷密度は、XTENポリペプチド中の荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御することができる。ある場合では、組成物のXTENの正味の電荷密度は、+0.1より上または-0.1より下の電荷/残基であり得る。他の場合では、XTENポリペプチドの正味の電荷は、約0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10% 約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、または約20%以上であり得る。
他の場合では、XTENポリペプチドは、正味の電荷を有するアミノ酸残基の取り込みおよび/またはXTENポリペプチド中の疎水性アミノ酸の割合の低下により付与される不定形の特徴を有し得る。全体的な正味電荷および正味電荷密度は、XTENポリペプチド中の荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御することができる。ある場合では、組成物のXTENの正味の電荷密度は、+0.1より上または-0.1より下の電荷/残基であり得る。他の場合では、XTENポリペプチドの正味の電荷は、約0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10% 約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、または約20%以上であり得る。
ヒトまたは動物のほとんどの組織および表面は正味の負電荷を有するため、XTENポリペプチドは、XTENポリペプチド含有組成物と、血管、健康な組織、または様々な受容体などの様々な表面との間の非特異的相互作用を最小にするために、正味の負電荷を有するように設計され得る。特定の理論に拘束されるものではないが、XTENポリペプチドは、高い正味の負の電荷を個々に担持し、XTENポリペプチドの配列全体に分布するXTENポリペプチドの個々のアミノ酸間の静電反発により、開放構造を取ることができる。XTENポリペプチドの拡大した配列の長さにおけるこうした正味の負の電荷の分布は、不定形の立体構造をもたらし、次に流体力学半径の有効な増加をもたらし得る。したがって、一実施形態では、本発明は、約8、10、15、20、25、または約30%のグルタミン酸さえ含有するXTENポリペプチドを提供する。本発明の組成物のXTENポリペプチドは、概して、正に荷電したアミノ酸を有しないか、または低い程度の正に荷電したアミノ酸を有する。ある場合では、XTENポリペプチドは、正の電荷を有する約10%未満のアミノ酸残基、または正の電荷を有する約7%未満、もしくは約5%未満、もしくは約2%未満のアミノ酸残基を有し得る。しかしながら、本発明は、リジンなどの正の電荷を有する、限られた数のアミノ酸が、リジンのイプシロンアミンとペプチド上の反応基、リンカー架橋、またはXTENポリペプチド骨格にコンジュゲートされるべき薬物もしくは低分子上の反応基の間のコンジュゲーションを許可するために、XTENポリペプチドに取り込まれ得る構築物を企図する。前述において、一つ以上のXTENポリペプチド、生物学的に活性なタンパク質、および代謝性疾患または障害の治療において有用な化学療法剤を含む融合タンパク質が構築され得、最大数の、XTENポリペプチド構成要素に取り込まれた剤の分子は、リジンの数またはXTENに取り込まれる反応側鎖(例えば、システイン)を有する他のアミノ酸により決定される。
ある場合では、XTENポリペプチドは、り良好な発現または精製挙動を導き得る、セリンまたはグリシンなどの他の残基により分離された荷電残基を含む。正味の電荷に基き、ヒトまたは動物組成物のXTENポリペプチドは、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、または6.5の等電点(pI)を有し得る。好ましい実施形態では、XTENポリペプチドは、1.5~4.5の等電点を有する。これらの実施形態では、本発明のBPXTEN融合タンパク質組成物に取り込まれるXTENは、不定形の立体構造およびXTENポリペプチド構成要素の哺乳動物タンパク質および組織への結合の低下に寄与し得る生理的条件下で正味の負の電荷を有するだろう。
疎水性アミノ酸は、ポリペプチドに構造を付与することができるため、本発明は、XTENポリペプチド中の疎水性アミノ酸の含有量が、典型的には、5%未満、または2%未満、または1%未満の疎水性アミノ酸含有量であることをもたらす。一実施形態では、BPXTEN融合タンパク質のXTEN構成要素中のメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含有量は、典型的には、5%未満、または2%未満、最も好ましくは、1%未満である。別の実施形態では、XTENポリペプチドは、正の電荷を有する10%未満のアミノ酸残基、または正の電荷を有する約7%未満、もしくは約5%未満、もしくは約2%未満のアミノ酸残基を有し、メチオニンおよびトリプトファン残基の合計は、2%未満であり、アスパラギンおよびグルタミン残基の合計は、総XTENポリペプチドの10%未満である。
流体力学半径の増加
いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、XTENポリペプチドを取り込むBPXTEN融合タンパク質に、対応する見かけの分子量の増加を付与する、長い流体力学半径を有し得る。XTENポリペプチドのBP配列への連結は、XTENポリペプチドに連結されていないBPと比較して、流体力学半径の増加、見かけの分子量の増加、および見かけの分子量係数の増加を有し得るBPXTEN組成物をもたらし得る。例えば、半減期の延長が望ましい治療用途では、大きな流体力学半径を有するXTENポリペプチドが、一つ以上のBPを含む融合タンパク質に取り込まれる組成物は、およそ3~5nmの糸球体孔サイズを超えて組成物の流体力学半径を有効に拡大し(約70kDAの見かけの分子量に対応する)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv.Drug Deliv.Rev.55:1261-1277)、これにより、循環タンパク質の腎クリアランスの低下がもたらされる。特定の理論に拘束されるものではないが、XTENポリペプチドは、ペプチドの個々の電荷間の静電反発または二次構造を付与する可能性を欠く配列中の特定のアミノ酸によって与えられる固有の可動正に起因して、開放構造を取り得る。XTENポリペプチドの開放的拡張かつ不定形の構造は、典型的な球状タンパク質などの二次構造および/または三次構造を有する同等の配列長および/または分子量のポリペプチドと比較して、より大きな部分的流体力学半径を有し得る。米国特許第6,406,632号および同第7,294,513号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの使用による流体力学半径を決定する方法は、当該技術分野で周知である。XTENポリペプチドの増加する長さを加えることで、流体力学半径、見かけの分子量、および見かけの分子量係数のパラメーターの部分的な増加をもたらし、これにより、BPXTENを所望の特徴的カットオフの見かけの分子量または流体力学半径に合わせることが可能になる。したがって、ある特定の実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、XTENポリペプチドで構成することができ、融合タンパク質は、少なくとも約5nm、または少なくとも約8nm、または少なくとも約10nm、または12nm、または少なくとも約15nmの流体力学半径を有し得る。前述の実施形態では、BPXTEN融合タンパク質においてXTENポリペプチドにより構成される大きな流体力学半径は、得られた融合タンパク質の腎クリアランスの低下を導き得、これにより、終末相半減期の対応する増長、平均滞留時間の増長、および/または腎クリアランス速度の増加を導く。
いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、XTENポリペプチドを取り込むBPXTEN融合タンパク質に、対応する見かけの分子量の増加を付与する、長い流体力学半径を有し得る。XTENポリペプチドのBP配列への連結は、XTENポリペプチドに連結されていないBPと比較して、流体力学半径の増加、見かけの分子量の増加、および見かけの分子量係数の増加を有し得るBPXTEN組成物をもたらし得る。例えば、半減期の延長が望ましい治療用途では、大きな流体力学半径を有するXTENポリペプチドが、一つ以上のBPを含む融合タンパク質に取り込まれる組成物は、およそ3~5nmの糸球体孔サイズを超えて組成物の流体力学半径を有効に拡大し(約70kDAの見かけの分子量に対応する)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv.Drug Deliv.Rev.55:1261-1277)、これにより、循環タンパク質の腎クリアランスの低下がもたらされる。特定の理論に拘束されるものではないが、XTENポリペプチドは、ペプチドの個々の電荷間の静電反発または二次構造を付与する可能性を欠く配列中の特定のアミノ酸によって与えられる固有の可動正に起因して、開放構造を取り得る。XTENポリペプチドの開放的拡張かつ不定形の構造は、典型的な球状タンパク質などの二次構造および/または三次構造を有する同等の配列長および/または分子量のポリペプチドと比較して、より大きな部分的流体力学半径を有し得る。米国特許第6,406,632号および同第7,294,513号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの使用による流体力学半径を決定する方法は、当該技術分野で周知である。XTENポリペプチドの増加する長さを加えることで、流体力学半径、見かけの分子量、および見かけの分子量係数のパラメーターの部分的な増加をもたらし、これにより、BPXTENを所望の特徴的カットオフの見かけの分子量または流体力学半径に合わせることが可能になる。したがって、ある特定の実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、XTENポリペプチドで構成することができ、融合タンパク質は、少なくとも約5nm、または少なくとも約8nm、または少なくとも約10nm、または12nm、または少なくとも約15nmの流体力学半径を有し得る。前述の実施形態では、BPXTEN融合タンパク質においてXTENポリペプチドにより構成される大きな流体力学半径は、得られた融合タンパク質の腎クリアランスの低下を導き得、これにより、終末相半減期の対応する増長、平均滞留時間の増長、および/または腎クリアランス速度の増加を導く。
別の実施形態では、選択された長さおよび配列のXTENポリペプチドをBPXTENに選択的に取り込んで、生理的条件下で、少なくとも約150kDa、または少なくとも約300kDa、または少なくとも約400kDa、または少なくとも約500 kDA、または少なくとも約600kDa、または少なくとも約700 kDA、または少なくとも約800kDa、または少なくとも約900kDa、または少なくとも約1000kDa、または少なくとも約1200kDa、または少なくとも約1500kDa、または少なくとも約1800kDa、または少なくとも約2000kDa、または少なくとも約2300kDa以上の見かけの分子量を有する融合タンパク質を作製することができる。別の実施形態では、選択された長さおよび配列のXTENポリペプチドを、BPに選択的に連結させて、生理的条件下で、少なくとも3、代わりに少なくとも4、代わりに少なくとも5、代わりに少なくとも6、代わりに少なくとも8、代わりに少なくとも10、代わりに少なくとも15の見かけの分子量係数、または少なくとも20以上の見かけの分子量係数を有するBPXTEN融合タンパク質をもたらし得る。別の実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、生理的条件下で、融合タンパク質の実際の分子量と比べて、約4~約20、または約6~約15、または約8~約12、または約9~約10である見かけの分子量係数を有する。いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、生理学的条件下で、約6より大きい見かけの分子量係数を呈する。
終末相半減期の延長
いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、XTENポリペプチドに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも2倍長い、または少なくとも3倍長い、または少なくとも4倍長い、または少なくとも5倍長い終末相半減期を有する。いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、XTENポリペプチドに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも2倍長い終末相半減期を有する。
いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、XTENポリペプチドに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも2倍長い、または少なくとも3倍長い、または少なくとも4倍長い、または少なくとも5倍長い終末相半減期を有する。いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、XTENポリペプチドに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも2倍長い終末相半減期を有する。
治療有効用量の、本明細書に記載されるBPXTEN融合タンパク質の実施形態のいずれかのそれを必要とするヒトまたは動物への投与は、XTENポリペプチドに連結されていない対応するBPおよびヒトまたは動物への同等用量での投与と比較して、融合タンパク質についての治療ウィンドウ内で費やされる少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍以上の時間の拡張をもたらし得る。
低免疫原性
別の態様では、本発明は、XTENポリペプチドが、低い程度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子は、XTENポリペプチドの低免疫原性、例えば、実質的な非反復配列、その不定形の構造、高い程度の溶解度、低い程度の自己凝集または自己凝集の欠如、配列内の低い程度のタンパク分解性部位またはタンパク分解性部位の欠如、およびXTENポリペプチド中の低い程度のエピトープまたはエピトープの欠如に寄与し得る。
別の態様では、本発明は、XTENポリペプチドが、低い程度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子は、XTENポリペプチドの低免疫原性、例えば、実質的な非反復配列、その不定形の構造、高い程度の溶解度、低い程度の自己凝集または自己凝集の欠如、配列内の低い程度のタンパク分解性部位またはタンパク分解性部位の欠如、およびXTENポリペプチド中の低い程度のエピトープまたはエピトープの欠如に寄与し得る。
当業者であれば、概して、高度に反復の短いアミノ酸配列を有する(例えば、200アミノ酸長の配列は、平均20反復または3もしくは4merの限られたセットを含有する)および/あるいは連続する反復アミノ酸残基を有する(例えば、5または6merの配列は、同一のアミノ酸残基を有する)ポリペプチドが、より高いオーダーの構造を凝集するか、もしくは形成し、または結晶もしくは偽結晶構造をもたらす密着を形成する傾向を有することを理解するだろう。
いくつかの実施形態では、XTENポリペプチドは、実質的な非反復であり、XTENアミノ酸配列は、アミノ酸がセリンでない限り、同一のアミノ酸タイプである三つの連続するアミノ酸を有せず、その場合では、三つ以下の連続するアミノ酸が、セリン残基であり得、XTENアミノ酸配列は、XTENポリペプチド200アミノ酸長の配列内に、16回より多く、14回より多く、12回より多く、または10回より多く生じる三つのアミノ酸の配列(3mer)を含有しない。当業者であれば、このような実質的な非反復配列が、凝集する傾向をほとんど有さず、したがって、配列またはアミノ酸残基が、そうでなければより反復である場合、凝集するようである比較的に低い頻度の荷電したアミノ酸を有する長い配列XTENの設計を可能にすることを理解するであろう。
立体構造エピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続なアミノ酸配列からなるタンパク質表面の領域により形成される。タンパク質の正確な折り畳みにより、これらの配列が明確に定義された安定な空間的配置、またはエピトープに取り込まれ、これは宿主液性免疫システムによって「外来性」として認識され、これにより、タンパク質に対する抗体の産生が生じるか、または細胞介在性免疫応答が誘発される。後者の場合、個体のタンパク質に対する免疫反応は、その個体のHLA-DRアロタイプのペプチド結合特異性の機能であるT細胞エピトープ認識によって大きく影響を受ける。T細胞表面上の同族T細胞受容体によるMHCクラスIIペプチド複合体の会合は、CD4分子などのある特定の他の共受容体の交差結合と共に、T細胞内の活性化状態を誘導することができる。活性化は、サイトカインの放出につながり、これにより、B細胞などの他のリンパ球をさらに活性化して抗体を産生するか、または完全な細胞免疫応答としてTキラー細胞を活性化する。
APC(抗原提示細胞)の表面上に提示するために、所定のMHCクラスII分子に結合するペプチドの能力は、多数の因子、特に、その一次配列に依存する。一実施形態では、より低い程度の免疫原性は、抗原提示細胞における抗原プロセシングに抵抗するXTENポリペプチドを設計すること、および/またはMHC受容体に十分に結合しない配列を選択することによって達成することができる。本発明は、MHC II受容体との結合を低下し、ならびにT細胞受容体または抗体結合のためのエピトープの形成を回避し、これにより、低い程度の免疫原性をもたらすよう設計された実質的に反復しないXTENポリペプチドを有するBPXTEN融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、部分的には、XTENポリペプチドの立体構造の可動性の直接的な結果であり、すなわち、アミノ酸残基の選択および順序による二次構造の欠如である。例えば、特に興味深いのは、水溶液中で、または立体構造エピトープをもたらし得る生理的条件下で、コンパクトに折り畳まれた立体構造を取る傾向が低い配列である。従来の治療実施および投与を使用した、XTENポリペプチドを含む融合タンパク質の投与は、概して、XTENポリペプチドに対する中和抗体の形成をもたらさず、BPXTEN組成物中のBP融合パートナーの免疫原性も低減し得る。
一実施形態では、ヒトまたは動物融合タンパク質で利用されるXTENポリペプチドは、ヒトT細胞により認識されるエピトープを実質的に含まない場合がある。より低い免疫原性のタンパク質を生じる目的でのこのようなエピトープの除去は、既に開示されていおり、例えば、本明細書に参照により取り込まれる、国際公開第98/52976号、国際公開第02/079232号、および国際公開第00/3317号を参照のこと。ヒトT細胞エピトープについてのアッセイは、記載されている(Stickler,M.,et al.(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。特に興味深いのは、T細胞エピトープまたは非ヒト配列を生じることなくオリゴマー化することができるペプチド配列である。これは、T細胞エピトープの存在、および6~15mer、特にヒトではない9mer配列の発生について、これらの配列の直接的な反復を試験し、次いで、エピトープ配列を除去または破壊するためにXTENポリペプチドの設計を変更することによって達成することができる。ある場合では、XTENポリペプチドは、MHC受容体に結合すると予測されるXTENポリペプチドのエピトープの数の制限によって実質的に非免疫原性である。MHC受容体に結合することができるエピトープ数の減少に伴い、T細胞活性化ならびにT細胞ヘルパー機能の可能性の同時低下、B細胞活性化または上方制御の減少、および抗体産生の低下がある。低い程度の予想T細胞エピトープは、参照によりその全体が取り込まれる、国際特許出願公開第2010/144502A2号の実施例74に示される、例えば、Tエピトープ(Sturniolo,T.,et al.(1999) Nat Biotechnol,17:555-61)などのエピトープ推定アルゴリズムにより決定することができる。タンパク質内の所定のペプチドフレームのTEPITOPEスコアは、Sturniolo,T.et al.(1999) Nature Biotechnology 17:555)に開示される、最も多いヒトMHCアレルの複数へのそのペプチドフレームの結合のKd(解離定数、親和性、オフレート)のlogである。スコアは、少なくとも20log、約10~約-10(10e10Kd~10e-10Kdの有効な制約に対応する)にわたり、M、I、L、V、FなどのMHC上でのペプチド提示ちゅうにアンカー残基として働き得る疎水性アミノ酸を回避することにより低下し得る。いくつかの実施形態では、BPXTENに取り込まれたXTENポリペプチドは、約-5以上、または-6以上、または-7以上、または-8以上のTエピトープスコア、または-9以上のTエピトープスコアの予想T細胞エピトープを有さない。本明細書で使用される場合、「-9以下」のスコアは、包括的に10~-9のTエピトープスコアを包含するであろうが、-10は、-9未満であるので、-10のスコアを包含しないであろう。
別の実施形態では、ヒトまたは動物BPXTEN融合タンパク質に取り込まれたものを含む、本発明のXTENポリペプチドは、XTENポリペプチドの配列由来の公知のタンパク分解性部位の制限により、非免疫原性を実質的に低減し得、これにより、MHC II受容体に結合し得る小ペプチドへのXTENポリペプチドのプロセッシングを低減する。別の実施形態では、XTENポリペプチドは、二次構造を実質的に欠く配列の使用により、実質的に非免疫原性を低減し得、これにより、高エントロピーの構造による多くのプロテアーゼに対する抵抗性を付与する。したがって、Tエピトープスコアの低下およびXTENポリペプチド由来の公知のタンパク分解性部位の除去は、免疫系のものを含む、哺乳動物受容体により実質的に結合できない、BPXTEN融合タンパク質組成物のXTENポリペプチドを含む、XTEN-ポリペプチド組成物を与え得る。一実施形態では、BPXTEN融合タンパク質のXTENポリペプチドは、哺乳動物受容体への>100nM Kd結合、または哺乳動物の細胞表面または循環ポリペプチド受容体に対する500nMより大きいKd、または1μMより大きいKdを有し得る。
加えて、XTENポリペプチドのこのような実施形態のエピトープの実質的に反復しない配列および対応する欠如は、XTENポリペプチドと結合するか、またはXTENポリペプチドにより活性化されるB細胞の能力を制限し得る。XTENポリペプチドは、その拡大した配列にわたり多くの異なるB細胞と接触させ得る一方、各個々のB細胞は、個々のXTENポリペプチドとの1回または数回接触し得るのみである。結果として、XTENポリペプチドは、典型的には、B細胞の増殖、したがって、免疫応答を刺激するずっと低い傾向を有し得る。一実施形態では、BPXTENは、融合されていない対応するBPと比較して、低減した免疫原性を有し得る。一実施形態では、哺乳動物への最大3回の非経口用量の投与は、1:100の血清希釈の検出可能な抗BPXTEN IgGをもたらし得るが、1:1000の希釈ではもたらし得ない。別の実施形態では、哺乳動物への最大3回の非経口用量の投与は、1:100の血清希釈の検出可能な抗BP IgGをもたらし得るが、1:1000の希釈ではもたらし得ない。別の実施形態では、哺乳動物への最大3回の非経口用量の投与は、1:100の血清希釈の検出可能な抗XTEN IgGをもたらし得るが、1:1000の希釈ではもたらし得ない。前述の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであり得る。
それらのより少ない非反復配列(例えば、同一である三つの連続するアミノ酸を有するものなど)と比べて、実質的に非反復配列を有するXTENポリペプチドのある特定の実施形態の追加の特徴は、非反復XTENポリペプチドが抗体との弱い接触(例えば、1価の相互作用)を形成し、これにより、BPXTEN組成物がより長い期間、循環に留まり得る、免疫クリアランスの可能性の減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、XTENポリペプチドに連結されていない生物学的に活性なポリペプチドと比較して、より低い免疫原性であり、免疫原性は、同等の用量のヒトまたは動物への投与後に生物学的に活性なポリペプチドに選択的に結合するIgG抗体の生成を測定することにより確認される。
スペーサーおよびBP放出セグメント
いくつかの実施形態では、それぞれのBPの生物学的活性の少なくとも一部は、インタクトなBPXTENにより保持される。いくつかの実施形態では、BP構成要素は、本明細書において以下でより完全に記載される、BPXTENへの、スペーサー配列内に取り込まれた配列の任意の切断によるXTENポリペプチドからのその放出時に、生物学的に活性になるか、または生物学的活性の増加を有するかのいずれかである。
いくつかの実施形態では、それぞれのBPの生物学的活性の少なくとも一部は、インタクトなBPXTENにより保持される。いくつかの実施形態では、BP構成要素は、本明細書において以下でより完全に記載される、BPXTENへの、スペーサー配列内に取り込まれた配列の任意の切断によるXTENポリペプチドからのその放出時に、生物学的に活性になるか、または生物学的活性の増加を有するかのいずれかである。
任意のスペーサー配列群は、本発明により包含される融合タンパク質において任意である。スペーサーは、宿主細胞由来の融合タンパク質の発現を増強するか、またはBP構成要素が、その所望の3次構造を想定し、および/またはその標的分子と適切に相互作用し得る立体障害を増加するために提供され得る。スペーサーおよび望ましいスペーサーを同定する方法について、例えば、参照により本明細書に具体的に取り込まれる、George,et al.(2003) Protein Engineering 15:871-879を参照のこと。一実施形態では、スペーサーは、1~50のアミノ酸残基長、または約1~25の残基、または約1~10の残基長である一つ以上のペプチド配列を含む。切断部位を含まないスペーサー配列は、20の天然のLアミノ酸のいずれかを含み得、好ましくは、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)およびプロリン(P)を含み得るが、これらに限定されない、立体的に抑制されない親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリグリシンもしくはポリアラニン、または主に、グリシンとアラニン残基の組み合わせの混合物であり得る。切断配列を含まないスペーサーポリペプチドは、主に、二次構造を実質的に欠く。一実施形態では、BPXTEN融合タンパク質組成物における一方または両方のスペーサー配列各々は、同一であり得るか、または異なり得る、切断配列をさらに含有することができ、切断配列は、融合タンパク質からBPを放出するためのプロテアーゼにより作用し得る。
ある場合では、BPXTENへの切断配列の取り込みは、XTENポリペプチドからのその放出時に活性になるか、またはより活性になるBPの放出を可能にするよう設計される。切断配列は、BP配列に十分に近く、概して、BP配列末端の18、または12、または6、または2アミノ酸以内に位置し、切断後にBPに結合した任意の残る残基は、BPの活性(例えば、受容体への結合など)とはっきりと相互作用せず、切断配列の切断に作用することができるプロテアーゼの十分な評価をもたらす。いくつかの実施形態では、切断部位は、哺乳動物ヒトまたは動物に内在性のプロテアーゼにより切断され得る配列であり、BPXTENは、ヒトまたは動物への投与後に切断され得る。このような場合では、BPXTENは、プロドラッグまたはBPの循環デポーとして働き得る。本発明により企図される切断部位の例は、FXIa、FXIIa、カリクレイン、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(トロンビン)、エラスターゼ-2、グランザイムB、MMP-12、MMP-13、MMP-17もしくはMMP-20から選択される哺乳動物内在性プロテアーゼ、またはTEV、エンテロキナーゼ、PreScission(商標)プロテアーゼ(ライノウイルス3Cプロテアーゼ)、およびソルターゼAなどの非哺乳動物プロテアーゼによるポリペプチド配列切断を含むが、これらに限定されない。前述のプロテアーゼにより切断されることが公知の配列は、当該技術分野で公知である。配列内の例示的な切断配列および切断部位は、表7a、ならびに配列バリアントに記載される。例えば、トロンビン(活性化凝固因子II)は、配列中の位置4のアルギニンの後で切断される、配列LTPRSLLV(配列番号222){Rawlings N.D.,et al.(2008) Nucleic Acids Res.,36:D320}で作用する。活性化FIIaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのFXaによるFIIの切断により生成され、凝固経路において第IX因子から下流に位置する。凝固にける活性化されたその天然の役割がフィブリノーゲンを切断すると、次いで、順に血栓形成し始める。FIIa活性は、厳密に制御され、凝固が、適切な止血に必要であるときのみ生じる。しかしながら、凝固は哺乳動物において進行中のプロセスであるため、BPとXTENポリペプチドの間でのBPXTENへのLTPRSLLV(配列番号223)配列の取り込みにより、XTENポリペプチドは、凝固が生理的に必要とされるとき、外来性または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時発生する隣接するBPから除去され、これにより、BPが経時的に放出される。同様に、内在性プロテアーゼにより作用するBPXTENへの他の配列の取り込みは、BPの持続放出をもたらし、ある特定の場合では、「プロドラッグ」形態のBPXTENからBPにより高い程度の活性をもたらし得る。
ある場合では、切断部位の両側に隣接する二つまたは三つのアミノ酸のみ(計4~6つのアミノ酸)は、切断配列に取り込まれるであろう。他の場合では、公知の切断配列は、公知の配列において任意の一つまたは二つまたは三つのアミノ酸への一つ以上の欠失もしくは挿入または一つもしくは二つもしくは三つのアミノ酸置換を有し得、欠失、挿入または置換は、プロテアーゼに対する感受性の低下または増強をもたらすが、プロテアーゼに対する感受性の不存在をもたらさず、これにより、XTENからのBPの放出速度を合わせる能力をもたらす。例示的な置換は、表7aに示される。
いくつかの実施形態では、BPXTEN融合タンパク質は、プロテアーゼにより作用されるとき、融合タンパク質からBPを放出するよう形成される一つ以上の切断配列をさらに含み得るスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、一つ以上の切断配列は、表7aに記載される配列と少なくとも約80%(例えば、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%)の配列同一性を有する配列であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、罹患組織または罹患組織の近くに見られる細胞に関連するか、またはそれによって産生される一つ以上の哺乳類プロテアーゼの基質である放出セグメントペプチド(または放出セグメント(RS))に関する。このようなプロテアーゼは、表7bに記載されるプロテアーゼを含むが、これらに限定されない、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼなどのプロテアーゼのクラスが含まれるが、これらに限定されない。RSは、とりわけ、ヒトまたは動物組み換えポリペプチドへの取り込みに有用であり、哺乳動物プロテアーゼによるRSの切断により活性化され得るプロドラッグ形態を付与する。本明細書に記載されるように、RSは、ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物に取り込まれ、取り込まれた結合部分をXTENに連結し(その配置は、以下でより完全に記載される)、RSが基質である一つ以上のプロテアーゼの作用によるRSの切断時に、結合部分およびXTENは、組成物および結合部位から放出され、XTENによってもはや遮蔽されず、それらのリガンドに結合する可能性を完全に取り戻す。第一および第二の抗体断片をその組み換えポリペプチド組成物において、組成物は、活性化可能な抗体組成物(AAC)と本明細書で呼ばれる。
一実施形態では、本開示は、最適に整列されたとき、表8aに記載される配列から選択される配列と少なくとも88%、または少なくとも94%、または100%の配列同一性を有する第一の放出セグメント(RS1)配列を含む活性化可能な組み換えポリペプチドを提供し、RS1は、一つ以上の哺乳動物プロテアーゼの基質である。他の実施形態では、本開示は、最適に整列されたとき、表8aに記載される配列から選択される配列と各々少なくとも88%、または少なくとも94%、または100%の配列同一性を有する、RS1および第二の放出セグメント(RS2)配列を含む活性化可能な組み換えポリペプチドを提供し、RS1およびRS2は各々、一つ以上の哺乳動物プロテアーゼの基質である。別の実施形態では、本開示は、最適に整列されたとき、表8bに記載される配列から選択される配列と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも97%、または100%の同一性を有する第一のRS(RS1)配列を含む活性化可能な組み換えポリペプチドを提供し、RSは、一つ以上の哺乳動物プロテアーゼの基質である。他の実施形態では、本開示は、最適に整列されたとき、表8bに記載される配列から選択される配列と各々少なくとも88%、または少なくとも94%、または100%の配列同一性を有する、RS1および第二の放出セグメント(RS2)配列を含む活性化可能な組み換えポリペプチドを提供し、RS1およびRS2は、一つ以上の哺乳動物プロテアーゼの基質である。RS1およびRS2を含む活性化可能な組み換えポリペプチドの実施形態では、二つの放出セグメントは、同一であり得るか、または配列は、異なり得る。
本開示は、表7bに記載されるプロテアーゼを含む、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼから選択される一つ、二つ、または三つの異なる種類のプロテアーゼの基質である放出セグメントを企図する。具体的な特徴では、RSは、腫瘍、がん細胞、および炎症組織などであるが、これらに限定されない罹患組織または細胞と密接に関連して見つけられるか、または罹患組織もしくは細胞と共局在するプロテアーゼの基質としての機能を果たし、RSの切断時に、ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物のXTENによって別様に遮蔽される(それ故に、それぞれのリガンドに対してより低い結合親和性を有する)結合部分が組成物から放出され、標的および/またはエフェクター細胞リガンドに結合する能力を完全に取り戻す。別の実施形態では、ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物のRSは、表7bに記載されるプロテアーゼを含むが、これらに限定されない、標的化細胞内に位置する細胞プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物の別の特定の特徴では、二つまたは三つの種類のプロテアーゼの基質であるRSは、異なるプロテアーゼによるRS配列の異なる位置で切断される能力がある配列と共に設計された。したがって、二つ、三つ、またはそれ以上のクラスのプロテアーゼの基質であるRSは、RS配列中に二つ、三つ、または複数の別個の切断部位を有するが、それにもかかわらず、単一のプロテアーゼによる切断により、RSを含む組み換えポリペプチド組成物からの結合部分およびXTENの放出がもたらされる。
一実施形態では、ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物への取り込みのための本開示のRSは、メプリン、ネプリライシン(CD10)、PSMA、BMP-1、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAM)、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、トロンボスポンジンモチーフを有するADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(コラゲナーゼ 1)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1(MMP-1)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP-2、ゼラチナーゼA)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-3(MMP-3、ストロメライシン1)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-7(MMP-7、マトリライシン1)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-8(MMP-8、コラゲナーゼ2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-9(MMP-9、ゼラチナーゼB)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-10(MMP-10、ストロメライシン2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-11(MMP-11、ストロメライシン3)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-12(MMP-12、マクロファージエラスターゼ)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-13(MMP-13、コラゲナーゼ3)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-14(MMP-14、MT1-MMP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-15(MMP-15、MT2-MMP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-19(MMP-19)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-23(MMP-23、CA-MMP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-24(MMP-24、MT5-MMP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-26(MMP-26、マトリライシン2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-27(MMP-27、CMMP)、レグマイン、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンK、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンX、カテプシンD、カテプシンE、セクレターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原(PSA、KLK3)、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)、エラスターゼ、トリプターゼ、II型膜貫通セリンプロテアーゼ(TTSP)、DESC1、ヘプシン(HPN)、マトリプターゼ、マトリプターゼ-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、カリクレイン関連ペプチダーゼ(KLKファミリー)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、およびKLK14を含む一つ以上のプロテアーゼの基質である。一実施形態では、RSは、ADAM17の基質である。一実施形態では、RSは、BMP-1の基質である。一実施形態では、RSは、カテプシンの基質である。一実施形態では、RSは、HtrA1の基質である。一実施形態では、RSは、レグマインの基質である。一実施形態では、RSは、MMP-1の基質である。一実施形態では、RSは、MMP-2の基質である。一実施形態では、RSは、MMP-7の基質である。一実施形態では、RSは、MMP-9の基質である。一実施形態では、RSは、MMP-11の基質である。一実施形態では、RSは、MMP-14の基質である。一実施形態では、RSは、uPAの基質である。一実施形態では、RSは、マトリプターゼの基質である。一実施形態では、RSは、MT-SP1の基質である。一実施形態では、RSは、好中球エラスターゼの基質である。一実施形態では、RSは、トロンビンの基質である。一実施形態では、RSは、TMPRSS3の基質である。一実施形態では、RSは、TMPRSS4の基質である。一実施形態では、ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物のRSは、レグマイン、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA、およびマトリプターゼである少なくとも二つのプロテアーゼの基質である。別の実施形態では、ヒトまたは動物組み換えポリペプチド組成物のRSは、レグマイン、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA、およびマトリプターゼの基質である。
別の態様では、ヒトまたは動物組み換えポリペプチドへの取り込みのためのRSは、それらが基質である様々なプロテアーゼに対して異なる切断速度および異なる切断効率を有するように選択的に感受性であるように設計され得る。所定のプロテアーゼが、健康な組織または循環中と比較して、腫瘍、血液癌、または炎症組織もしくは炎症部位を含むが、これらに限定されない罹患組織中で異なる濃度で見つけられ得るため、本開示は、組み換えポリペプチドが、健康な組織または循環におけるRSの切断速度と比較して、標的細胞または組織およびその共局在するプロテアーゼの近くにあるとき、プロドラッグ形態から活性な形態に(すなわち、RSの切断後の組み換えポリペプチドからの結合部分およびXTENの分離および放出により)優先的に変換されることを確かにするために、所定のプロテアーゼについてより高いまたはより低い切断効率を有するよう操作された個々のアミノ酸配列を有しているRSを提供し、放出された抗体断片結合部分は、循環中に残存するプロドラッグ形態と比較して、罹患組織中のリガンドに結合するより高い濃度を有する。かかる選択的設計により、結果として生じる組成物の治療指数が改善され、かかる部位特異的活性化を組み込まない従来の治療薬と比較して副作用を軽減することができる。
本明細書で使用される場合、切断効率は、各々、反応が行われる生化学的アッセイ(実施例でさらに詳述される)においてプロテアーゼ酵素にヒトまたは動物であるときの切断されたRSを含む試験基質のパーセンテージの、切断された対照基質AC1611のパーセンテージに対する比率のlog2値として定義され、ここで、初期基質濃度が6μMであり、反応が37℃で2時間インキュベートされた後にEDTAの添加により停止され、消化生成物の量および切断されていない基質が非還元SDS-PAGEを用いて分析されて、切断されたパーセンテージの比率を確立する。切断効率は、以下のように計算される。
したがって、-1の切断効率は、試験基質の切断量が対照基質の切断量と比較して50%であったことを意味し、+1の切断効率は、試験基質の切断量が対照基質の切断量と比較して200%であったことを意味する。対照と比較してより高い試験プロテアーゼによる切断速度は、より高い切断効率をもたらし、対照と比較してより遅い試験プロテアーゼによる切断速度は、より低い切断効率をもたらす。実施例に詳述されるように、個々のプロテアーゼによる切断速度についてインビトロ生化学的アッセイで試験したときに、アミノ酸配列EAGRSANHEPLGLVAT(配列番号8261)を有する対照RS配列AC1611(RSR-1517)を、プロテアーゼであるレグマイン、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、uPA、およびマトリプターゼによる適切なベースライン切断効率を有するものとして確立した。RSペプチド中の個々の位置でのアミノ酸の選択的置換により、RSのライブラリを作製し、7つのプロテアーゼのパネルに対して評価し(実施例でより完全に詳述される)、プロファイルを得て、これを所望の切断効率を有するRSを達成するために適切なアミノ酸置換のガイドラインを確立するために使用した。所望の切断効率を有する放出セグメントを作製する際に、親水性アミノ酸A、E、G、P、S、およびTを使用した置換が好ましいが、放出セグメントがプロテアーゼによる切断に対して少なくともいくらかの感受性を保持する限り、他のL-アミノ酸を所与の位置で置換して、切断効率を調節することができる。活性を保持または影響を与えるためのペプチド中のアミノ酸の保存的置換は、十分に当業者の知識および能力内である。一実施形態では、本開示は、RSが、配列EAGRSANHEPLGLVAT(配列番号8261)を有する対照配列RSR-1517の同じプロテアーゼによる切断と比較して、インビトロ生化学的競合アッセイにおいて少なくとも0.2log2、または0.4log2、または0.8log2、または1.0log2高い切断効率で、レグマイン、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼにより切断されるRSを提供する。別の実施形態では、本開示は、RSが、配列EAGRSANHEPLGLVAT(配列番号8261)を有する対照配列RSR-1517の同じプロテアーゼによる切断と比較して、インビトロ生化学的競合アッセイにおいて少なくとも0.2log2、または0.4log2、または0.8log2、または1.0log2低い切断効率で、レグマイン、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼにより切断されるRSを提供する。一実施形態では、本開示は、レグマイン、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによるRSの切断速度が、配列EAGRSANHEPLGLVAT(配列番号8261)を有する対照配列RSR-1517と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも4倍、または少なくとも8倍、または少なくとも16倍速いRSを提供する。別の実施形態では、本開示は、レグマイン、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA、またはマトリプターゼから選択されるプロテアーゼによるRSの切断速度が、配列EAGRSANHEPLGLVAT(配列番号8261)を有する対照配列RSR-1517と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも4倍、または少なくとも8倍、または少なくとも16倍遅いRSを提供する。
別の態様では、本開示は、各RS配列が、表8aに記載される配列の群から選択され、RSが、グリシン、セリン、アラニン、およびスレオニンから選択される1~6のアミノ酸で互いに連結される、複数のRSを含むAACを提供する。一実施形態では、AACは、第一のRSおよび第一のRSと異なる第二のRSを含み、各RS配列が、表8aに記載される配列の群から選択され、RSが、グリシン、セリン、アラニン、およびスレオニンから選択される1~6のアミノ酸で互いに連結される。別の実施形態では、AACは、第一のRS、第一のRSと異なる第二のRS、ならびに第一および第二のRSと異なる第三のRSを含み、各配列は、表8aに記載される配列の群から選択され、第一および第二および第三のRSは、グリシン、セリン、アラニン、およびスレオニンから選択される1~6のアミノ酸で互いに連結される。AACの複数のRSを連結して、異なる切断速度または切断効率で複数のプロテアーゼによって切断され得る配列を形成することができることが具体的に意図される。別の実施形態では、本開示は、表8a~8bに記載される配列の群ならびに本明細書に上記されるまたは本明細書の他の箇所で記載されるものなどのXTEN1およびXTEN2から選択されるRS1およびRS2を含むAACを提供し、RS1は、XTEN1と結合部分の間で融合され、RS2は、XTEN2と結合部分の間で融合される。このような組成物は、健康な組織と比較して、または正常な循環にあるときと比較して、複数のプロテアーゼを発現する罹患標的組織によってより容易に開裂され、結果として生じる結合部分を有する断片は、標的組織、例えば、腫瘍をより容易に透過し、標的細胞とエフェクター細胞(または単一の結合部分を用いて設計されたAACの場合、標的細胞のみ)を結合および連結する強化された能力を有することが企図される。
本開示のRSは、癌、自己免疫性疾患、炎症性疾患および組み換えポリペプチドの局所的活性化が望ましい他の状態の治療のための治療薬として組み換えポリペプチドに含有するのに有用である。ヒトまたは動物組成物は、アンメットニーズに対応し、注射時に活性である従来の抗体治療剤または二重特異性抗体治療剤と比較して、強化した終末相半減期、標的化送達、および健康な組織に対する毒性が低下した改善された治療比を含む一つ以上の態様で優れている。
いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、(第一)XTENと生物学的に活性なポリペプチドの間に位置する第一の放出セグメント(RS1)を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドと第二のXTENの間に位置する第二の放出セグメント(RS2)をさらに含む。いくつかの実施形態では、RS1およびRS2は、配列が同一である。いくつかの実施形態では、RS1およびRS2は、配列が同一でない。いくつかの実施形態では、RS1は、表8a~8bに記載される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、RS2は、表8a~8bに記載される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、RS1およびRS2は各々、各放出セグメント配列内の一つ、二つ、または三つの切断部位における複数のプロテアーゼによる切断のための基質である。
参照断片
いくつかの実施形態では、(融合)ポリペプチドは、プロテアーゼによる消化時にポリペプチドから遊離可能な一つ以上の参照断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の参照断片は各々、生物学的に活性なポリペプチドの一部を含む。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の参照断片は、配列および分子量が、プロテアーゼによるポリペプチドの消化時にポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる単一の参照断片である。
ポリペプチド混合物
複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットを含む混合物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドは、(a)プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能で、(b)第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、第二のポリペプチドセットは、第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々は、(a)第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含む。いくつかの実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.70より大きい。いくつかの実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.8、0.9、0.95、または0.98より大きい。いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、グルタミン酸残基のC末端側で切断するプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書に上記されるまたは本明細書に他で記載されるいずれかなどの、少なくとも一つの拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットは、全長ポリペプチドを含み、バーコード断片は、全長ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に上記されるまたは本明細書に他で記載されるいずれかなどの(融合)ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、全長ポリペプチドのN末端アミノ酸とC末端アミノ酸の両方を欠く(含まない)。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはNとC末端切断の両方に起因して互いに異なる。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットは、一つ以上の薬理学的特性が異なり得る。非限定的な例示的特性は含む。
複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットを含む混合物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドは、(a)プロテアーゼでの消化によりポリペプチドから遊離可能で、(b)第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、第二のポリペプチドセットは、第一のポリペプチドセットのバーコード断片を欠く。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットと第二のポリペプチドセットの両方各々は、(a)第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットに共通し、プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含む。いくつかの実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.70より大きい。いくつかの実施形態では、参照断片を含むポリペプチドに対する第一のポリペプチドセットの比は、0.8、0.9、0.95、または0.98より大きい。いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、グルタミン酸残基のC末端側で切断するプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書に上記されるまたは本明細書に他で記載されるいずれかなどの、少なくとも一つの拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットは、全長ポリペプチドを含み、バーコード断片は、全長ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に上記されるまたは本明細書に他で記載されるいずれかなどの(融合)ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、全長ポリペプチドのN末端アミノ酸とC末端アミノ酸の両方を欠く(含まない)。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはNとC末端切断の両方に起因して互いに異なる。いくつかの実施形態では、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットは、一つ以上の薬理学的特性が異なり得る。非限定的な例示的特性は含む。
ポリペプチド特徴決定方法
様々な長さのポリペプチドを含む混合物において、混合物中の第二のポリペプチドセットに対する混合物中の第一のポリペプチドセットの相対量を評価する方法であって、(1)第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、ポリペプチドで1回生じるバーコード断片を共有し、(2)第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、第一のセットのポリペプチドにより共有される前述のバーコード断片を欠き、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドセットの両方の個々のポリペプチド各々が、参照断片を含む方法が本明細書で開示される。方法は、混合物を、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの切断から生じる複数のタンパク分解性断片を生成するためのプロテアーゼと接触させることを含み得、複数のタンパク分解性断片は、複数の参照断片、および複数のバーコード断片を含む。方法は、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定し、これにより、第二のポリペプチドセットに対する第一のポリペプチドセットの相対量を評価することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、複数のタンパク分解性断片は、複数の参照断片、および複数のバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、後にプロリン残基がないグルタミン酸残基のC末端側上の第一および第二のポリペプチドセット(または様々な長さのポリペプチド)を切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。いくつかの実施形態では、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定する工程は、ポリペプチドの混合物が、プロテアーゼと接触された後に、混合物由来のバーコード断片および参照断片を定量することを含む。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、それらのそれぞれの質量に基づき同定される。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、質量分析を介して同定される。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を介して同定される。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比を決定する工程は、等圧標識を含む。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比を決定する工程は、混合物を同位体標識された参照断片および同位体標識されたバーコード断片の一方または両方に添加することを含む。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書に上記されるまたは本明細書に他で記載される少なくとも一つの拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、XTENは、(i)これが、少なくとも150のアミノ酸を含むこと、(ii)XTENのアミノ酸残基の少なくとも90%が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)およびプロリン(P)から選択されること、ならびに(iii)これが、G、A、S、T、E、およびPから選択される少なくとも4つの異なるタイプのアミノ酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、存在するとき、XTENの一部である。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、全長ポリペプチドおよびその切断断片を含む。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本質的に、全長ポリペプチドおよびその切断断片からなる。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはNとC末端切断の両方に起因して互いに異なる。いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の量の比は、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.98、または0.99より大きい。
様々な長さのポリペプチドを含む混合物において、混合物中の第二のポリペプチドセットに対する混合物中の第一のポリペプチドセットの相対量を評価する方法であって、(1)第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、ポリペプチドで1回生じるバーコード断片を共有し、(2)第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、第一のセットのポリペプチドにより共有される前述のバーコード断片を欠き、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドセットの両方の個々のポリペプチド各々が、参照断片を含む方法が本明細書で開示される。方法は、混合物を、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの切断から生じる複数のタンパク分解性断片を生成するためのプロテアーゼと接触させることを含み得、複数のタンパク分解性断片は、複数の参照断片、および複数のバーコード断片を含む。方法は、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定し、これにより、第二のポリペプチドセットに対する第一のポリペプチドセットの相対量を評価することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、参照断片は、第一のポリペプチドセットおよび第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで、1回以下で生じる。いくつかの実施形態では、複数のタンパク分解性断片は、複数の参照断片、および複数のバーコード断片を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、後にプロリン残基がないグルタミン酸残基のC末端側上の第一および第二のポリペプチドセット(または様々な長さのポリペプチド)を切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Glu-Cプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンではない。いくつかの実施形態では、参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定する工程は、ポリペプチドの混合物が、プロテアーゼと接触された後に、混合物由来のバーコード断片および参照断片を定量することを含む。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、それらのそれぞれの質量に基づき同定される。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、質量分析を介して同定される。いくつかの実施形態では、バーコード断片および参照断片は、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を介して同定される。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比を決定する工程は、等圧標識を含む。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の比を決定する工程は、混合物を同位体標識された参照断片および同位体標識されたバーコード断片の一方または両方に添加することを含む。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本明細書に上記されるまたは本明細書に他で記載される少なくとも一つの拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、XTENは、(i)これが、少なくとも150のアミノ酸を含むこと、(ii)XTENのアミノ酸残基の少なくとも90%が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)およびプロリン(P)から選択されること、ならびに(iii)これが、G、A、S、T、E、およびPから選択される少なくとも4つの異なるタイプのアミノ酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、バーコード断片は、存在するとき、XTENの一部である。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、全長ポリペプチドおよびその切断断片を含む。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドは、本質的に、全長ポリペプチドおよびその切断断片からなる。いくつかの実施形態では、様々な長さのポリペプチドの混合物は、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはNとC末端切断の両方に起因して互いに異なる。いくつかの実施形態では、全長ポリペプチドは、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、参照断片に対するバーコード断片の量の比は、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.98、または0.99より大きい。
ペプチドの等圧標識ベースの定量
いくつかの実施形態では、等圧標識は、参照断片に対するバーコード断片の比を決定するため使用することができる。当業者であれば、等圧標識は、定量的プロテオミクスで使用される質量分析戦略であり、ペプチドまたはタンパク質(もしくはその一部)は、等圧(質量が同一)であるが、その構造の周りに重い同位体の分布に関して変化する様々な化学基で標識されることを認識するであろう。これらのタグは、一般にタンデム質量タグと呼ばれ、質量タグが、タンデム質量分析中に高エネルギー衝突誘導解離(CID)時に特定のリンカー領域で切断され、これによって、異なる質量のレポーターイオンが生じるように設計される。当業者であれば、最も多い等圧タグの一つは、アミン反応性タグであることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、等圧標識は、参照断片に対するバーコード断片の比を決定するため使用することができる。当業者であれば、等圧標識は、定量的プロテオミクスで使用される質量分析戦略であり、ペプチドまたはタンパク質(もしくはその一部)は、等圧(質量が同一)であるが、その構造の周りに重い同位体の分布に関して変化する様々な化学基で標識されることを認識するであろう。これらのタグは、一般にタンデム質量タグと呼ばれ、質量タグが、タンデム質量分析中に高エネルギー衝突誘導解離(CID)時に特定のリンカー領域で切断され、これによって、異なる質量のレポーターイオンが生じるように設計される。当業者であれば、最も多い等圧タグの一つは、アミン反応性タグであることを理解するであろう。
切断生成物を検出および定量する能力の強化(例えば、等圧標識を介して)は、精製された原薬/生成物中の望ましくないバリアントの存在を最小にするための精製工程を含む製造プロセスの設計を助け得ることよりも、知識を生み出し得る。
組み換え生成
本明細書の開示は、核酸を含む。核酸は、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかなどの、(融合)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(もしくはポリヌクレオチド配列)を含むことができるか、または核酸は、このようなポリヌクレオチド(もしくはポリヌクレオチド配列)の逆相補鎖を含むことができる。
本明細書の開示は、核酸を含む。核酸は、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかなどの、(融合)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(もしくはポリヌクレオチド配列)を含むことができるか、または核酸は、このようなポリヌクレオチド(もしくはポリヌクレオチド配列)の逆相補鎖を含むことができる。
本明細書の本開示は、上記の段落に記載されるいずれかなどの、ポリヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチド配列に動作可能に連結された制御配列を含む発現ベクターを含む。
本発明の本開示は、上記の段落に記載されるような、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物の細胞である。
別の態様では、本開示は、ヒトまたは動物組成物を製造する方法を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのポリペプチドまたはXTEN含有組成物をコードする核酸構築物を含む宿主細胞を、ポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養すること、続いて、標準的な精製方法(例えば、カラムクロマトグラフィー、HPLCなど)を使用して、ポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドを回収することを含み、組成物が回収され、発現されたポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドの結合断片の少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも97%、または少なくとも99%が、正しく折り畳まれている。作製方法の別の実施形態では、発現されたポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドが回収され、ポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドの少なくとももしくは少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも97%、または少なくとも99%が、単量体可溶性形態で回収される。
別の態様では、本開示は、大腸菌または哺乳動物宿主細胞を使用して機能的タンパク質の高い発酵発現レベルでポリペプチドおよびBPXTEN融合ポリペプチドを作製する方法、ならびに高い発現レベルで細胞毒性的に活性なポリペプチド構築物組成物を生成する方法に有用な構築物をコードする発現ベクターを提供する方法に関する。一実施形態では、本方法は、1)本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する工程と、2)ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングすることであって、発現ベクターが、生物系における高レベルのタンパク質発現に適切な転写および翻訳配列の制御下にあるプラスミドまたは他のベクターであり得る、クローニングする工程と、3)発現ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換する工程と、4)ポリペプチド組成物の発現に好適な条件下で、従来の栄養培地中で宿主細胞を培養する工程とを含む。所望の場合、宿主細胞は、大腸菌である。方法により、ポリペプチドの発現は、宿主細胞の少なくとも0.05g/L、または少なくとも0.1g/L、または少なくとも0.2g/L、または少なくとも0.3g/L、または少なくとも0.5g/L、または少なくとも0.6g/L、または少なくとも0.7g/L、または少なくとも0.8g/L、または少なくとも0.9g/L、または少なくとも1g/L、または少なくとも2g/L、または少なくとも3g/L、または少なくとも4g/L、または少なくとも5g/Lの発現産物の発酵力価をもたらし、発現されるタンパク質の少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも97%、または少なくとも99%は、正しく折り畳まれている。本明細書で使用される場合、「正しく折り畳まれている」という用語は、組成物の抗原結合断片構成要素が、その標的リガンドに特異的に結合する能力を有することを意味する。別の実施形態では、本開示は、ポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドを生成する方法であって、発酵反応が、600nmの波長で少なくとも130の光学密度に達するとき、発酵反応液において、ポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、約10ミリグラム/宿主細胞の乾燥重量1グラム(mg/g)、または少なくとも約250mg/g、もしくは約300mg/g、もしくは約350mg/g、もしくは約400mg/g、もしくは約450mg/g、もしくは約500mg/g前述のポリペプチドより高い濃度でポリペプチド生成物を発現するのに有効な条件下で培養することを含み、発現されたタンパク質の抗原結合断片は、正しく折り畳まれている、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ポリペプチドまたはBPXTEN融合ポリペプチドを産生する方法であって、発酵反応液において、発酵反応が600nmの波長で少なくとも130の光学密度に達したときに、当該ポリペプチドの約10ミリグラム/グラム(mg/g)超、または少なくとも約250mg/g、または約300mg/g、または約350mg/g、または約400mg/g、または約450mg/g、または約500mg/gの乾燥重量宿主細胞の濃度で、組成物をコードするベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチド生成物を発現するのに有効な条件下で培養することを含み、発現されたポリペプチド生成物が可溶性である、方法を提供する。
医薬組成物
本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかのようなBPXTENポリペプチド、および一つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹内、腹腔内、硝子体内、くも膜下腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体形態である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼または別の身体部分に移植されるデバイス内にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回注射用のプレフィルドシリンジ中にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される。
本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかのようなBPXTENポリペプチド、および一つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹内、腹腔内、硝子体内、くも膜下腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体形態である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼または別の身体部分に移植されるデバイス内にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回注射用のプレフィルドシリンジ中にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉末として製剤化される。
いくつかの実施形態では、用量は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹内、腹腔内、硝子体内(もしくはそうでなければ眼に注射される)、くも膜下腔内、または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼または別の身体部分に移植されるデバイスを使用して投与される。いくつかの実施形態では、ヒトまたは動物は、マウス、ラット、サル、またはヒトである。
医薬組成物は、任意の適当な経路による療法のために投与され得、加えて、医薬組成物は、本発明の他の薬学的に活性な化合物または複数の化合物も含有することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効用量で投与することができる。前述のある場合では、治療有効用量は、融合タンパク質に連結されず、ヒトまたは動物と同等の用量で投与される融合タンパク質の対応するBPと比較して、融合タンパク質の治療ウィンドウ内で費やされる時間の増加をもたらす。
別の実施形態では、本発明は、疾患、障害または状態を治療する方法であって、治療有効用量レジメンを使用して投与される複数回の連続する用量の医薬組成物を使用して、上記の医薬組成物をヒトまたは動物に投与することを含む方法を提供する。
本発明のBPXTENポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法に従い製剤化することができ、これにより、ポリペプチドは、水溶液または緩衝液などの薬学的に許容可能な担体ビークルとの混合物、薬学的に許容可能な懸濁液およびエマルジョンにおいて混合される。治療製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)に記載される、所望の純度を有する有効成分を、最適な生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、保存用に調製される。
医薬キット
別の態様では、本発明は、BPXTENポリペプチドの使用を促進するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、少なくとも第一の容器内に、(a)それを必要とするヒトまたは動物への投与時に疾患、状態または障害を治療するのに十分なBPXTEN融合タンパク質組成物の量、および(b)薬学的に許容可能な担体の量を、注射または無菌水、緩衝液、またはデキストロースでの注射または再構成の用意ができた製剤において一緒に、BPXTEN薬物を同定する標識および取扱状態、ならびに薬物の承認された適応症のシート、承認された適応症の予防および/または治療のための使用のためのBPXTEN薬物の再構成および/または投与についての指示書、適切な投薬量および安全性情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を同定する情報と一緒に含む。前述の別の実施形態では、キットは、ヒトまたは動物に送達されるべき適切な濃度のBPXTENを使用者に提供する、BPXTEN組成物に適当な希釈剤を有し得る第二の容器を含むことができる。
別の態様では、本発明は、BPXTENポリペプチドの使用を促進するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、少なくとも第一の容器内に、(a)それを必要とするヒトまたは動物への投与時に疾患、状態または障害を治療するのに十分なBPXTEN融合タンパク質組成物の量、および(b)薬学的に許容可能な担体の量を、注射または無菌水、緩衝液、またはデキストロースでの注射または再構成の用意ができた製剤において一緒に、BPXTEN薬物を同定する標識および取扱状態、ならびに薬物の承認された適応症のシート、承認された適応症の予防および/または治療のための使用のためのBPXTEN薬物の再構成および/または投与についての指示書、適切な投薬量および安全性情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を同定する情報と一緒に含む。前述の別の実施形態では、キットは、ヒトまたは動物に送達されるべき適切な濃度のBPXTENを使用者に提供する、BPXTEN組成物に適当な希釈剤を有し得る第二の容器を含むことができる。
治療方法
ヒトまたは動物における疾患の治療用医薬の調製における、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかなどの、ポリペプチドの使用が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、治療されるべき特定の疾患は、生物学的に活性なタンパク質の選択に依存する。一部の実施形態では、疾患は癌である。
ヒトまたは動物における疾患の治療用医薬の調製における、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかなどの、ポリペプチドの使用が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、治療されるべき特定の疾患は、生物学的に活性なタンパク質の選択に依存する。一部の実施形態では、疾患は癌である。
ヒトまたは動物において疾患を治療する方法であって、それを必要とするヒトまたは動物に、本明細書に上記されるか、または本明細書に他で記載されるいずれかなどの、一つ以上の治療有効用量の医薬組成物を投与することを含む、方法が本明細書で開示される。一部の実施形態では、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投薬レジメンに従い投与される一つ以上の治療有効用量として、ヒトまたは動物に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトまたは動物は、マウス、ラット、サル、またはヒトである。
以下は、本開示の組成物および組成物の評価の実施例である。上に提供される概要を考慮して、様々な他の実施形態を実施することができることが理解される。
実施例1.汎用XTENからの最小限の変異によるバーコード化XTENの設計
本実施例は、汎用XTENポリペプチド(本明細書の上の表3bのうちの一つなど)のアミノ酸配列の最小限の変異をなすことによる、バーコード化XTENポリペプチドについての例示的な設計アプローチを説明する。最小限の変異を行うための関連する基準には、以下:(a)対応するXTENポリペプチドの配列変化を最小限にすることと、(b)対応するXTENポリペプチドにおけるアミノ酸組成物変化を最小限にすることと、(c)対応するXTENポリペプチドにおける正味の電荷を実質的に維持することと、(d)対応するXTENポリペプチドの低免疫原性を実質的に維持することと、(e)XTENポリペプチドによりもたらされる薬物動態特性を実質的に維持することのうちの一つ以上を含む。
本実施例は、汎用XTENポリペプチド(本明細書の上の表3bのうちの一つなど)のアミノ酸配列の最小限の変異をなすことによる、バーコード化XTENポリペプチドについての例示的な設計アプローチを説明する。最小限の変異を行うための関連する基準には、以下:(a)対応するXTENポリペプチドの配列変化を最小限にすることと、(b)対応するXTENポリペプチドにおけるアミノ酸組成物変化を最小限にすることと、(c)対応するXTENポリペプチドにおける正味の電荷を実質的に維持することと、(d)対応するXTENポリペプチドの低免疫原性を実質的に維持することと、(e)XTENポリペプチドによりもたらされる薬物動態特性を実質的に維持することのうちの一つ以上を含む。
例えば、グルタミン酸残基の欠失、グルタミン酸残基の挿入、グルタミン酸残基の置換、またはグルタミン酸残基への置換、または任意のその組み合わせを含む一つ以上の変異を、表9の汎用XTENに対して行うことにより、バーコード化XTENを構築した。
実施例2.生物学的に活性なポリペプチド(「BP」)への融合のための、バーコード化XTENポリペプチドの配列解析およびその選択
本実施例は、生物学的に活性なポリペプチドへの融合のための、バーコード化XTENポリペプチド(および一つより多くのバーコード化XTENのセットへのアセンブリー)の設計および選択を説明する。XTEN内のバーコード断片の位置、およびXTENポリペプチドを生物学的に活性なタンパク質に融合させて、XTENポリペプチド含有構築物(例えば、XTEN化プロテアーゼ活性化T細胞エンゲイジャー(XPAT))を形成する様式に応じて、バーコード断片は、XTENポリペプチドの切断を示すことができる。
本実施例は、生物学的に活性なポリペプチドへの融合のための、バーコード化XTENポリペプチド(および一つより多くのバーコード化XTENのセットへのアセンブリー)の設計および選択を説明する。XTEN内のバーコード断片の位置、およびXTENポリペプチドを生物学的に活性なタンパク質に融合させて、XTENポリペプチド含有構築物(例えば、XTEN化プロテアーゼ活性化T細胞エンゲイジャー(XPAT))を形成する様式に応じて、バーコード断片は、XTENポリペプチドの切断を示すことができる。
インシリコGluC消化解析を、二つの例示的なXTENポリペプチド(XTEN864およびXTEN288_1)で行い、XTENポリペプチドの完全なGluC消化時に遊離可能なペプチド断片を定量した。インシリコ解析は、連続するグルタミン酸残基(例えば、「EE」)を有するXTENポリペプチドに関して、GluCがグルタミン酸残基のいずれか一つの後で切断し得ることを考慮する。以下の表10に要約した結果に示すように、10merのペプチドの配列「TPGTSTEPSE(配列番号8880)」および14merのペプチドの配列「GSAPGSEPATSGSE(配列番号8881)」は各々、より長いXTEN864において1回および1回のみ生じる一方、全ての他のペプチド配列は、XTEN864において2回以上生じる。また、14merのペプチドの配列「GSAPGSEPATSGSE(配列番号8881)」も、より短いXTEN288_1で1回および1回のみ生じる。
候補バーコードの特有性を、XTENポリペプチド含有構築物から遊離可能な全ての他のペプチド断片に関して評価する。したがって、一つのXTENポリペプチド中のバーコード配列は、その中に含有される任意の他のXTENポリペプチド、その中に含有される任意の生物学的に活性なタンパク質、またはその隣接構成要素の間の任意の結合を含む、XTENポリペプチド含有構築物中の他のどこでも生じることはできない。例えば、表11は、二つのXTENポリペプチドのセットについてのペプチドの「特有性」の表を示す。XXTEN864とXTEN288の両方でのその存在のため、14merのペプチドの配列「GSAPGSEPATSGSE(配列番号8881)」は、XTEN864とXTEN288の両方を含むXTENポリペプチドのセットに固有ではなく、したがって、二つのXTENポリペプチドの両方を含有するポリペプチド生成物中の切断を検出するためのバーコードとして使用することができない。
バーコード(またはバーコードのセット)の選択は、XTENポリペプチド内の候補バーコードの正しい場所または位置を同定し、決定することをさらに含み得る。候補バーコードの場所または位置は、臨界長を超えたXTENポリペプチドの切断および/またはXTENポリペプチド中の欠失などの、XTENポリペプチド(および全体としてのXTENポリペプチド含有構築物)の薬理学的に関連する情報と関連し得る。XXTEN864がXTENポリペプチド含有生成物のN末端に配置され、かつ生成物のN末端からの238のアミノ酸の切断が生成物の薬理学的特性に著しい影響を与えない場合、10merのペプチド「TPGTSTEPSE(配列番号8880)」は、適切なバーコード断片として作用し得る。
例示的なバーコードペプチド配列を、以下の表12に示す。これらのバーコード配列は、構造式(I):
AAA-Glu-バーコードペプチド-BBB、
(式中、「AAA」は、Gly、Ala、Ser、ThrまたはProを表し、「BBB」は、GluC消化によりバーコードペプチドの効率的な放出を促進するよう構成されたGly、Ala、Ser、またはThrを表す)に従い隣接させるべきである。特に、XTENにおける各バーコードペプチドの挿入は、挿入されたバーコードペプチドの直前または直後に、追加の固有の配列をもたらすことができる。
AAA-Glu-バーコードペプチド-BBB、
(式中、「AAA」は、Gly、Ala、Ser、ThrまたはProを表し、「BBB」は、GluC消化によりバーコードペプチドの効率的な放出を促進するよう構成されたGly、Ala、Ser、またはThrを表す)に従い隣接させるべきである。特に、XTENにおける各バーコードペプチドの挿入は、挿入されたバーコードペプチドの直前または直後に、追加の固有の配列をもたらすことができる。
実施例3:完全配列のXTEN化ポリペプチド構築物におけるXTENの設計および選択
本実施例は、二つのXTENポリペプチドであるN末端の一方およびC末端の他方を含有する完全配列ポリペプチド構築物の設計を説明する。
本実施例は、二つのXTENポリペプチドであるN末端の一方およびC末端の他方を含有する完全配列ポリペプチド構築物の設計を説明する。
以下の表13は、代表的なバーコード化BPXTEN(N末端とC末端の両方でバーコード化XTENポリペプチドを含有する)および参照BPXTEN(N末端とC末端の両方で汎用XTENを含有する)で使用するXTENポリペプチドを示す。典型的なバーコード化BPXTENでは、バーコード化XTENポリペプチド(配列番号8014)をBPのN末端で融合し、別のバーコード化XTENポリペプチド(配列番号8015)をBPのC末端で融合する。参照BPXTENでは、「Ref-N」XTENポリペプチド(配列番号8896)をBPのN末端で融合し、「Ref-C」XTENポリペプチド(配列番号8897)をBPのC末端で融合する。「Ref-N」XTENポリペプチド(配列番号8896)は、バーコード化XTENポリペプチド配列番号8014と長さが同等であり、「Ref-C」XTENポリペプチド(配列番号8897)は、バーコード化XTENポリペプチド配列番号8015と長さが同等である。バーコード化BPXTENおよび参照BPXTENは各々、BP構成要素中に参照配列を含有する。参照配列は固有であり、分子量が、GluCプロテアーゼによる完全消化時に対応するBPXTENから遊離可能な全ての他のペプチド断片とは異なる(例えば、実施例5に記載)。参照配列の固有性を、BPXTEN構築物から遊離可能な全ての他のペプチド断片に関して評価する。
実施例4:バーコード化XTEN化融合ポリペプチドの組み換え構築および産生
実施例4a~4bは、本明細書に開示される方法を使用した、バーコード化XTENポリペプチドを含有する全長ポリペプチドの組み換え構築、生成、および精製を説明する。
実施例4a~4bは、本明細書に開示される方法を使用した、バーコード化XTENポリペプチドを含有する全長ポリペプチドの組み換え構築、生成、および精製を説明する。
実施例4a.C末端にバーコード化XTENを含有するXTEN化融合ポリペプチド
発現:C末端に抗EpCAM1本鎖可変断片(scFv)および864アミノ酸長のバーコード化XTEN配列(配列番号8008)を含有するXTEN化融合ポリペプチドをコードする構築物を、専有の大腸菌AmE098株で発現させ、N末端分泌リーダー配列(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-)(配列番号8898)を介して周縁に分配させ、転座中に切断する。発酵培養物を、動物を含まない複合体培地を用いて37℃で成長させ、リン酸塩枯渇の前に、温度を26℃にシフトする。採取中、発酵全ブロスを遠心分離して、細胞をペレット化する。採取時、総体積および湿潤細胞重量(WCW、ペレットと上清との比率)を記録し、ペレット化した細胞を回収し、-80℃で凍結させた。
発現:C末端に抗EpCAM1本鎖可変断片(scFv)および864アミノ酸長のバーコード化XTEN配列(配列番号8008)を含有するXTEN化融合ポリペプチドをコードする構築物を、専有の大腸菌AmE098株で発現させ、N末端分泌リーダー配列(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-)(配列番号8898)を介して周縁に分配させ、転座中に切断する。発酵培養物を、動物を含まない複合体培地を用いて37℃で成長させ、リン酸塩枯渇の前に、温度を26℃にシフトする。採取中、発酵全ブロスを遠心分離して、細胞をペレット化する。採取時、総体積および湿潤細胞重量(WCW、ペレットと上清との比率)を記録し、ペレット化した細胞を回収し、-80℃で凍結させた。
回収:凍結細胞ペレットを、30%の湿潤細胞重量を標的として、溶解緩衝液(17.7mMクエン酸、22.3mM Na2HPO4、75mM NaCl、2mM EDTA、pH4.0)に再懸濁する。再懸濁液を、pH4で平衡化し、次いで、800±50barで2回通すことを介して均質化し、一方出力温度を、15±5℃でモニターし、維持する。ホモジネートのpHが、指定した範囲(pH4.0±0.2)内であることを確認する。
清澄:エンドトキシンおよび宿主細胞の不純物を低減するために、ホモジネートは、一晩(15~20時間)、低温(10±5℃)、酸性(pH4.0±0.2)凝集させる。不溶性分画を除去するために、凝結ホモジネートを、2~8℃で16,900RCFで40分間遠心分離し、上清を貯蔵する。上清をMilli-Q水(MQ)でおよそ3倍希釈し、次いで5M NaClで7±1mS/cmに調整した。核酸、脂質、およびエンドトキシンを除去し、フィルター補助剤として作用させるために、上清を0.1%(m/m)珪藻土に調整する。懸濁した濾過助剤を維持するために、上清をインペラを介して混合し、30分間平衡化させる。奥行きフィルター、続いて0.22μmのフィルターからなるフィルタートレーンを組み立て、次いでMQで洗い流す。25±5psigの圧力降下を維持するように流量を調節しながら、フィルタートレーンを通して上清をポンプ注入する。複合緩衝系(クエン酸とNa2HPO4の比に基づく)を捕捉クロマトグラフィーの所望の範囲に調整するために、濾液を、クエン酸に対するNa2HPO4の最終比が9.33:1である500mM Na2HPO4で調整し、緩衝濾液のpHが指定範囲内(pH7.0±0.2)であることを確認する。
精製
AEX捕捉:二量体、凝集体、および大きな切断物を単量体生成物から分離し、エンドトキシンおよび核酸を除去するために、陰イオン交換(AEX)クロマトグラフィーを利用して、負の電荷のC末端XTENドメインを捕捉する。AEX1固定相(GE Q Sepharose FF)、AEX1移動相A(12.2mM Na2HPO4、7.8mM NaH2PO4、40mM NaCl)、およびAEX1移動相B(12.2mM Na2HPO4、7.8mM NaH2PO4、500mM NaCl)をここで使用する。カラムをAEX1移動相Aで平衡化する。ビシンコニン酸(BCA)アッセイにより測定する総タンパク質濃度に基づき、濾液を28±4g/L-樹脂を標的化するカラムに装填し、AEX1移動相Aを用いて追跡し、次いで、30%Bまでの工程で洗浄する。結合した物質を、20CVにわたって30%B~60%Bの勾配で溶出する。分画を、ベースラインより上(局所)のA220≧100mAUで1CVアリコートで収集する。溶出分画を、SDS-PAGEおよびSE-HPLCに基づいて分析し、プールする。
IMAC中間体精製:C末端の完全性を確実にするために、固定した金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)を使用して、C末端ポリヒスチジンタグ(His(6)(配列番号8031))を捕捉する。IMAC固定相(GE IMAC Sepharose FF)、IMAC移動相A(18.3mM Na2HPO4、1.7mM NaH2PO4、500mM NaCl、1mMイミダゾール)、およびIMAC移動相B(18.3mM Na2HPO4、1.7mM NaH2PO4、500mM NaCl、500mMイミダゾール)をここで使用する。カラムを亜鉛溶液で荷電し、IMAC移動相Aで平衡化する。AEX1プールをpH7.8±0.1、50±5mS/cm(5M NaClで)、および1mMイミダゾールに調整し、2g/L樹脂を標的化するIMACカラムに装填し、280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、IMAC移動相Aで追跡する。結合した物質を、25%IMAC移動相Bまでの工程で溶出する。ベースラインより上のA280≧10mAU(局所)を、2CVを2mM EDTAにさせるのに十分なEDTAを予め添加した容器に送り、2CVを収集した時点で終結させるとき、IMAC溶出収集を開始する。溶出物をSDS-PAGEにより解析する。
タンパク質-L中間体精製:N末端完全性を確保するために、タンパク質Lを使用して、BPXTEN分子(具体的には、aEpCAM scFv)のN末端の近くに存在するカッパードメインを捕捉する。タンパク質-L固定相(GE Capto L)、タンパク質L移動相A(16.0mMクエン酸、20.0mM Na2HPO4、pH4.0±0.1)、タンパク質L移動相B(29.0mMクエン酸、7.0mM Na2HPO4、pH2.60±0.02)、およびタンパク質L移動相C(3.5mMクエン酸、32.5mM Na2HPO4、250mM NaCl、pH7.0±0.1)をここで使用する。カラムを、タンパク質L移動相Cで平衡化する。IMAC溶出液を、pH7.0±0.1および30±3mS/cm(5M NaClおよびMQで)に調整し、2g/L樹脂を標的化するタンパク質Lカラム上に装填し、次いで280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、タンパク質L移動相Cで追跡する。カラムを、タンパク質L移動相Aで洗浄し、タンパク質L移動相AおよびBを使用して、低pH溶出を行う。結合した物質を、およそpH3.0で溶出し、収集した体積10重量部ごとに0.5M Na2HPO4重量部を予め加えた容器に収集する。分画をSDS-PAGEにより解析する。
HIC 研磨:N末端バリアント(絶対N末端の4残基は、タンパク質L結合に必須ではない)および全体的構造バリアントを分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用する。HIC固定相(GE Capto Phenyl ImpRes)、HIC移動相A(20mMヒスチジン、0.02%(w/v)ポリソルベート80、pH6.5±0.1)およびHIC移動相B(1M硫酸アンモニウム、20mMヒスチジン、0.02%(w/v)ポリソルベート80、pH6.5±0.1)をここで使用する。カラムを、HIC移動相Bで平衡化する。調整したタンパク質L溶出液を、2g/L樹脂を標的化するHICカラムに装填し、280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、HIC移動相Bで追跡する。カラムを50%Bで洗浄する。結合した物質を、75CVにわたって50%B~0%Bの勾配で溶出する。分画を、ベースラインより上(局所)のA280≧3mAUで1CVアリコートで収集する。溶出分画を、SE-HPLCおよびHI-HPLCに基づいて分析し、プールする。
製剤:生成物を製剤緩衝液に交換し、生成物を標的濃度(0.5g/L)にするために、陰イオン交換を再び使用して、C末端XTENを捕捉する。AEX2固定相(GE Q Sepharose FF)、AEX2移動相A(20mMヒスチジン、40mM NaCl、0.02%(w/v)ポリソルベート80、pH6.5±0.2)、AEX2移動相B(20mMヒスチジン、1M NaCl、0.02%(w/v)ポリソルベート80、pH6.5±0.2)、およびAEX2移動相C(12.2mM Na2HPO4、7.8mM NaH2PO4、40mM NaCl、0.02%(w/v)ポリソルベート80、pH7.0±0.2)をここで使用する。カラムを、AEX2移動相Cで平衡化する。HICプールを、pH 7.0±0.1および7±1mS/cm(MQで)調整し、2g/L樹脂を標的化するAEX2カラムに充填し、次いで、A280が(局所)ベースラインに戻るまで、AEX2移動相Cで追跡する。カラムを、AEX2移動相A(20mMヒスチジン、40mM NaCl、0.02%(w/v)ポリソルベート80、pH6.5±0.2)で洗浄する。AEX2移動相AおよびBを使用して、{NaCl}工程を生成し、溶出させる。結合した物質を、38%AEX2移動相Bまでの工程で溶出する。AEX2溶出収集を、A280≧5mAUがベースライン(局所的)を上回るときに開始し、二つのカラム体積を収集したら終了する。AEX2溶出液を、BSC内で0.22μmで濾過し、分注し、標識し、バルク原薬(BDS)として-80℃で保存する。バルク原薬(BDS)を、全てのロット放出基準を満たすことを様々な解析方法によって確認する。全体的な品質を、SDS-PAGEにより解析し、二量体に対する単量体の比を、SE-HPLCにより解析し、N末端の品質および生成物の均一性を、HI-HPLCにより解析する。
実施例4.C末端にバーコード化XTENおよびN末端にバーコード化XTENを含有するXTEN化融合ポリペプチド
発現:C末端に抗EGFR1本鎖可変断片(scFv)、864アミノ酸長のバーコード化XTEN(配列番号8008)、およびN末端に288アミノ酸長のバーコード化XTEN(配列番号8007)を含有するXTEN化融合ポリペプチドをコードする構築物を、専有の大腸菌AmE098株で発現させ、N末端分泌リーダー配列(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-)(配列番号8898)を介して周縁に分配させ、転座中に切断する。発酵培養物を、動物を含まない複合体培地を用いて37℃で成長させ、リン酸塩枯渇の前に、温度を26℃にシフトする。採取中、発酵全ブロスを遠心分離して、細胞をペレット化する。採取時、総体積および湿潤細胞重量(WCW、ペレットと上清との比率)を記録し、ペレット化した細胞を回収し、-80℃で凍結する。
発現:C末端に抗EGFR1本鎖可変断片(scFv)、864アミノ酸長のバーコード化XTEN(配列番号8008)、およびN末端に288アミノ酸長のバーコード化XTEN(配列番号8007)を含有するXTEN化融合ポリペプチドをコードする構築物を、専有の大腸菌AmE098株で発現させ、N末端分泌リーダー配列(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-)(配列番号8898)を介して周縁に分配させ、転座中に切断する。発酵培養物を、動物を含まない複合体培地を用いて37℃で成長させ、リン酸塩枯渇の前に、温度を26℃にシフトする。採取中、発酵全ブロスを遠心分離して、細胞をペレット化する。採取時、総体積および湿潤細胞重量(WCW、ペレットと上清との比率)を記録し、ペレット化した細胞を回収し、-80℃で凍結する。
回収:凍結細胞ペレットを、30%の湿潤細胞重量を標的として、溶解緩衝液(100mMクエン酸)に再懸濁する。再懸濁液を、pH4.4で平衡化し、次いで、17,000±200barで均質化し、一方出力温度を、15±5℃でモニターし、維持する。ホモジネートのpHが、指定した範囲(pH4.4±0.1)内であることを確認する。
清澄:エンドトキシンおよび宿主細胞の不純物を低減するために、ホモジネートは、一晩(15~20時間)、低温(10±5℃)、酸性(pH 4.4±0.1)凝集させる。不溶性分画を除去するために、凝結ホモジネートを、8,000RCFおよび2~8℃で40分間遠心分離し、上清を貯蔵する。核酸、脂質、およびエンドトキシンを除去し、フィルター補助剤として作用させるために、上清を0.1%(m/m)珪藻土に調整する。懸濁した濾過助剤を維持するために、上清をインペラを介して混合し、30分間平衡化させる。奥行きフィルター、続いて0.22μmのフィルターからなるフィルタートレーンを組み立て、次いでMQで洗い流す。25±5psigの圧力降下を維持するように流量を調節しながら、フィルタートレーンを通して上清をポンプ注入する。
精製
タンパク質L捕捉:宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、および核酸を除去するために、タンパク質Lを使用して、BPXTEN分子のaEGFR scFv内に存在するカッパードメインを捕捉する。タンパク質L固定相(Tosoh TP AF-rProtein L-650F)、タンパク質L移動相A(11.5mMクエン酸、24.5mM Na2HPO4、125mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH5.0)、およびタンパク質L移動相B(11mMリン酸、0.005%ポリソルベート80、pH2.0)をここで使用する。カラムを、タンパク質L移動相Aで平衡化する。濾液を、pH 5.5±0.2に調整し、2~4g/L樹脂を標的化するタンパク質Lカラム上に装填し、次いで280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、タンパク質L移動相Aで追跡する。結合した物質を、移動相Bで溶出し、0.4CVの0.5M Na2HPO4を予め添加した2CV画分として収集し、SDS-PAGEにより解析する。
IMAC中間体精製:N末端の完全性を確保するために、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)を使用して、融合ポリペプチド分子のN末端ポリヒスチジンタグ(His(6);(配列番号8031))を捕捉する。IMAC固定相(GE IMAC Sepharose FF)、IMAC移動相A(12.2mM Na2HPO4、7.8mM NaH2PO4、500mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH7.0)、およびIMAC移動相B(50mMヒスチジン、200mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH6.5)をここで使用する。カラムを、IMAC移動相Aで平衡化する。タンパク質L溶出液を、pH7.8±0.1および50±5mS/cm(5M NaClで)に調整する。調整したタンパク質Lプールを、2g/L樹脂を標的化するIMACカラムに充填し、280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、IMAC移動相Aで追跡する。結合した物質を、IMAC移動相Bで溶出する。IMAC溶出液を、0.02CV 200mM EDTAを予め添加した2CV分画として収集し、SDS-PAGEにより解析する。
C-タグ中間体精製:C末端完全性を確保するために、Cタグ親和性ークロマトグラフィーを使用して、C末端-EPEAタグ(配列番号8033)を捕捉する。Cタグ固定相(Thermo C-tagXL)、Cタグ移動相A(50mMヒスチジン、200mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH6.5)、およびCタグ移動相B(20mM Tris、0.6M MgCl2、0.005%ポリソルベート80、pH7.0)をここで使用する。カラムを、Cタグ移動相Aで平衡化する。IMAC溶出液を、2g/L樹脂を標的化するCタグカラムに充填し、280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、Cタグ移動相Aで追跡する。結合した物質を、Cタグ移動相Bで溶出する。Cタグ溶出液を、2CV分画として収集し、SDS-PAGEにより解析する。
AEX研磨:二量体および凝集体を単量体生成物から分離するために、陰イオン交換(AEX)クロマトグラフィーを利用して、負の電荷のNおよびC末端XTENドメインを捕捉する。AEX1固定相(BIA QA-80)、AEX1移動相A(50mMヒスチジン、200mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH6.5)、およびAEX1移動相B(50mMヒスチジン、500mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH6.5)をここで使用する。カラムを、AEX移動相Aで平衡化する。Cタグ溶出液を、MQで10mS/cmに希釈し、2g/L樹脂を標的化に充填し、次いで280nm(A280)での吸光度が(局所)ベースラインに戻るまで、AEX移動相Aで追跡する。結合した物質を、60CVにわたって0%B~100%Bの勾配で溶出する。分画をベースラインより上(局所)のA280≧2mAUで1CVアリコートで収集する。溶出分画を、SDS-PAGEおよびSE-HPLCにより解析し、≧98%単量体であることを見出した分画を、さらなる処理のためプールする(AEXプール)。
製剤:生成物を製剤緩衝液に交換し、生成物を標的濃度(0.5g/L)にするために、限外濾過/透析濾過(UF/DF)を使用する。0.1m2の範囲を有する10kDaの膜および15psiのTMP標的を使用して、AEXプールを0.5g/Lに濃縮し、次いで製剤緩衝液(50mMヒスチジン、200mM NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH6.5)で10倍希釈する。AEXプールを10倍濃縮し、さらに2回、10倍希釈する。回収した製剤化生成物を、BSC内で0.22μmで濾過し、分注し、標識し、バルク原薬(BDS)として-80℃で保存する。BDSを、全てのロット放出基準を満たすことを様々な解析方法によって確認する。全体的な品質を、SDS-PAGEにより解析し、二量体に対する単量体の比を、SE-HPLCにより解析し、N末端の品質および生成物の均一性を、HI-HPLCにより解析する。同一性をESI-MSにより確認する。
実施例5.プロテアーゼ消化によるバーコードペプチドの放出
本実施例は、本明細書に開示される方法を使用して、様々な長さまたは切断形態のXTEN含有構築物を含有するポリペプチド混合物からのバーコード断片および参照断片の放出を説明する。
本実施例は、本明細書に開示される方法を使用して、様々な長さまたは切断形態のXTEN含有構築物を含有するポリペプチド混合物からのバーコード断片および参照断片の放出を説明する。
XTEN含有構築物の試料を還元し、DTT、次いでヨードアセトアミド中でのインキュベーションを介して、順次アルキル化する。次いで、試料を、緩衝液交換し、サイズ排除スピンカートリッジを使用して脱塩する。Glu-Cプロテアーゼを、1:5の基質に対する酵素比で試料に加え、試料を、消化のため37℃でインキュベートする。次いで、試料を4℃にし、タンパク分解性反応を停止させ、解析のためオートサンプラーバイアルに入れる。
実施例6.バーコードペプチドおよび参照ペプチドの検出および定量
本実施例は、個々のバーコードペプチドの定量的測定値を得るために使用される質量分析方法を説明する。LC並行反応モニタリング(PRM)法を、高分解能精密質量(HRAM)質量分析計にプログラムする。従来のデータ依存的取得(DDA)質量分析法とは異なり、PRM法は、1回の実行で15~30個のペプチドの特定のセットに焦点を当て、1回のデューティ周期毎に1回のMS-MSによりそれぞれを配列決定する。このように、本方法は、インタクトなペプチドの非断片化前駆物質、ならびにペプチドの各断片についてその配列を確認するための、eXtractedイオンクロマトグラム(XIC)を得る。断片イオンXICは、多くの場合、前駆物質イオン断片よりも感度が高く、選択的に定量的である。使用するLC-PRM法は、7つのバーコードペプチドの軽鎖および重鎖バージョンを含む。これら14のペプチドのすべての断片イオンのクロマトグラフィーピーク範囲を、取得後に測定し、最も強い断片イオンを、定量的測定のため使用する。次いで、PATバーコードペプチドに対するXTENバーコードペプチドのピーク範囲比を、XTEN分子にわたる様々な点で相対的XTEN:PAT存在量について計算する。
本実施例は、個々のバーコードペプチドの定量的測定値を得るために使用される質量分析方法を説明する。LC並行反応モニタリング(PRM)法を、高分解能精密質量(HRAM)質量分析計にプログラムする。従来のデータ依存的取得(DDA)質量分析法とは異なり、PRM法は、1回の実行で15~30個のペプチドの特定のセットに焦点を当て、1回のデューティ周期毎に1回のMS-MSによりそれぞれを配列決定する。このように、本方法は、インタクトなペプチドの非断片化前駆物質、ならびにペプチドの各断片についてその配列を確認するための、eXtractedイオンクロマトグラム(XIC)を得る。断片イオンXICは、多くの場合、前駆物質イオン断片よりも感度が高く、選択的に定量的である。使用するLC-PRM法は、7つのバーコードペプチドの軽鎖および重鎖バージョンを含む。これら14のペプチドのすべての断片イオンのクロマトグラフィーピーク範囲を、取得後に測定し、最も強い断片イオンを、定量的測定のため使用する。次いで、PATバーコードペプチドに対するXTENバーコードペプチドのピーク範囲比を、XTEN分子にわたる様々な点で相対的XTEN:PAT存在量について計算する。
実施例7.質量分析(MS)によりペプチドを定量するための安定な同位体標識
本実施例は、XTEN含有ポリペプチドからのバーコードペプチドの絶対的(相対的ではなく)定量を可能にする、安定な同位体標識スキームを説明する。標準的な標識された重鎖アミノ酸の定量的スキームを利用し、C末端グルタミン酸が(13C)5H7(15N)O3 標識された重鎖アナログで置換されたバーコードペプチドの合成アナログを専門の売主から調達する。既知の量のXTENバーコード含有ポリペプチドを、重鎖標識合成ペプチドを一定濃度で保持するマトリックスに連続希釈する、キャリブレーション曲線を調製する。同じ添加レベルの重鎖標識ペプチドを含有する研究試料に対する曲線からクロマトグラフィーピーク面積重鎖:軽鎖比を較正することにより、正確な定量を行うことができる。
本実施例は、XTEN含有ポリペプチドからのバーコードペプチドの絶対的(相対的ではなく)定量を可能にする、安定な同位体標識スキームを説明する。標準的な標識された重鎖アミノ酸の定量的スキームを利用し、C末端グルタミン酸が(13C)5H7(15N)O3 標識された重鎖アナログで置換されたバーコードペプチドの合成アナログを専門の売主から調達する。既知の量のXTENバーコード含有ポリペプチドを、重鎖標識合成ペプチドを一定濃度で保持するマトリックスに連続希釈する、キャリブレーション曲線を調製する。同じ添加レベルの重鎖標識ペプチドを含有する研究試料に対する曲線からクロマトグラフィーピーク面積重鎖:軽鎖比を較正することにより、正確な定量を行うことができる。
実施例8.XTEN含有ポリペプチドの切断の定量
本実施例は、XTEN含有ポリペプチドの混合物における長さのバリアントまたは切断のバリアントの定量を説明する。
本実施例は、XTEN含有ポリペプチドの混合物における長さのバリアントまたは切断のバリアントの定量を説明する。
例えば、バーコードペプチド「SGPGSTPAESGSE」(配列番号8899)は、76のアミノ酸を、実施例3に記載し、得られた典型的なバーコード化BPXTEN配列に置き、BPXTENのN末端でのXTENの重度の切断を示す。また、可能性のあるバーコード断片「SPAGSPTSTESGTSE」(配列番号8260)がN末端に位置することも考慮する。実施例6の手法に従った、生物学的に活性なタンパク質(例えば、scFv断片)配列からの固有の参照ペプチド配列に対する各バーコードペプチドの存在量測定比は、全長ポリペプチドおよび試料混合物における薬理学的有効性に影響を与え得る切断を有するバリアントの総量を示す。少なくとも一つの参照断片の存在量測定を使用して、試料混合物中のポリペプチドの全てのバリアントの総量を示す。したがって、参照断片とバーコード断片との間の相違存在量は、切断ポリペプチドバリアントの量を示す。LC-MSデータを解析し、ポリペプチド混合物中の薬理学的に効果的なバリアントの相対量を示す、参照断片に対するバーコード断片の量の比を決定する。
二つ(または三つ)のバーコードのセットを使用して、異なるレベルのポリペプチド切断を示す。LC-MSデータを使用して、参照断片の量に対する各バーコード断片の量の比を決定し、これにより、ポリペプチド混合物中の切断バリアントの分布を定量する。
実施例9.XTEN含有ポリペプチドの切断の定量
AC2329の精製工程は、QIR陰イオン交換クロマトグラフィーである。このカラムからの主要な溶出ピークの後半分は、全長タンパク質を含有し、一方、ピークの前半分は、全長タンパク質の混合物ならびに多くの切断形態を含有する。バーコードペプチド評価のため、二つの分画を採取した。一つの分画は、以前は「完全」分画と呼ばれたピークの後半分のみを含んでいた。第二の分画は、以前は本明細書に記載の合成タンパク質および切断物分画と呼ばれたピークの前半分を含んでいた。
AC2329の精製工程は、QIR陰イオン交換クロマトグラフィーである。このカラムからの主要な溶出ピークの後半分は、全長タンパク質を含有し、一方、ピークの前半分は、全長タンパク質の混合物ならびに多くの切断形態を含有する。バーコードペプチド評価のため、二つの分画を採取した。一つの分画は、以前は「完全」分画と呼ばれたピークの後半分のみを含んでいた。第二の分画は、以前は本明細書に記載の合成タンパク質および切断物分画と呼ばれたピークの前半分を含んでいた。
全長(青色)分画および全長+切断物分画(黒色)に渡る解析サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)。合成タンパク質+切断物画分は、インタクトな合成タンパク質と同じ大きさの断片を含むが、多くのより小さな、ならびにピークの右側の急勾配が示す構成要素を含むことは明らかである。
次いで、400nMの試料各々を、50mM Tris-HCl、pH7.5+0.1%Rapigest(Waters 186001861)を含有する反応緩衝液中の1mg/mL GluC(Roche 10791156001)で消化した。GluC消化を、振とうインキュベーターにおいて37℃で一晩行った。消化後、ギ酸を、10%の最終濃度まで加え、37℃で45分間インキュベートした。Rapigest沈殿物を、16,000×gで10分間の遠心分離により除去し、重鎖ペプチド標準混合物を400nMの最終濃度まで加えた。各消化物のLC-MS解析を、記載のとおり行った。各試料を2回測定した。
LC-MSによる解析
消化物を、Q-Exactive Plus質量分析計(Thermo)を備えたVanquish(Thermo)UHPLCシステムを使用して、Waters HSS-T3カラム(176003994)での30分間の勾配法を使用して解析した。MS法は、上位10個のペプチドを、各MSスキャン後にMSMS解析により配列決定する、トップテンDDA法からなる。得られたデータファイルを、各バーコードペプチドの重鎖ペプチド正規化濃度を計算し、測定できるSkylineソフトウエア(MacCoss Lab、UW)を使用して処理した。
消化物を、Q-Exactive Plus質量分析計(Thermo)を備えたVanquish(Thermo)UHPLCシステムを使用して、Waters HSS-T3カラム(176003994)での30分間の勾配法を使用して解析した。MS法は、上位10個のペプチドを、各MSスキャン後にMSMS解析により配列決定する、トップテンDDA法からなる。得られたデータファイルを、各バーコードペプチドの重鎖ペプチド正規化濃度を計算し、測定できるSkylineソフトウエア(MacCoss Lab、UW)を使用して処理した。
図5Bに示す各測定は、その対応する重同位体標識した合成ペプチドの400nMスパイクに標準化した、NバーコードSGPGSTPAE(配列番号8029)およびCバーコードGSAPGTE(配列番号8023)のXIC範囲である。希釈液1は、最も少ない量の切断物を有し、希釈液9は、最も多い量を有する。これらのデータは、N-バーコードペプチドを、切断物および非切断物含有試料にわたる相対的に類似の存在量で測定することを示す。しかしながら、C-バーコードペプチドの存在量の減少が、切断物含有分画に見られる。これは、原核生物における翻訳がN末端で開始するため、翻訳終結が切断種にとって最も強い関与因子であることを示唆している。
本発明を詳細に説明し、その特定の態様および/または実施形態を参照して、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修正および変形が可能であることは明らかである。より具体的には、本発明のいくつかの態様は、本明細書において特に有利であると特定され得るが、本発明は、本発明のこれらの特定の態様に限定されないことが企図される。
Claims (133)
- 拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドであって、
(a) (i)重複しない配列モチーフのセットであって、前記セットの各重複しない配列モチーフが、前記XTENポリペプチドにおいて少なくとも2回繰り返される、セット;および
(ii)前記XTENポリペプチド内で1回のみ生じるさらなる重複しない配列モチーフ、を含む、拡張組み換えポリペプチド(XTEN);ならびに
(b)プロテアーゼによる部分的または完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な第一のバーコード断片であって、前記第一のバーコード断片が、前記XTENポリペプチド内で1回のみ生じ、配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる前記配列モチーフを含む前記XTENポリペプチドの一部である、第一のバーコード断片、を含み、
前記バーコード断片が、前記ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸を含まない、ポリペプチド。 - 前記バーコード断片が、前記XTENポリペプチド中の別のグルタミン酸にすぐ隣接するグルタミン酸を含まない、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、そのC末端にグルタミン酸を有する、請求項1~2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、グルタミン酸残基のすぐ後ろにあるN末端アミノ酸を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記N末端アミノ酸に先行する前記グルタミン酸残基が、別のグルタミン酸残基にすぐ隣接しない、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、グルタミン酸の直後がプロリンでない限り、前記バーコード断片の前記C末端以外の位置にグルタミン酸残基を含まない、請求項1~4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、前記ポリペプチドのN末端またはC末端から10アミノ酸~150アミノ酸に位置する、請求項1~6に記載のポリペプチド。
- 重複しない配列モチーフの前記セットの前記配列モチーフが、配列番号182~203および1715~1722により同定される、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 重複しない配列モチーフの前記セットの前記配列モチーフが、配列番号186~189により同定される、請求項8に記載のポリペプチド。
- 重複しない配列モチーフの前記セットが、配列番号186~189により同定される前記配列モチーフのうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む、請求項9に記載のポリペプチド。
- 拡張組み換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドであって、前記XTENポリペプチドの一部である、プロテアーゼによる消化時に前記ポリペプチドから遊離可能で、配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる、第一のバーコード断片を含み、前記バーコード断片が、
(i)前記ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸を含まず;
(ii)前記XTENポリペプチド中の別のグルタミン酸にすぐ隣接するグルタミン酸を含まず;
(iii)そのC末端にグルタミン酸を有し;
(iv)グルタミン酸残基が直前にあるN末端アミノ酸を有し;
(v)前記ポリペプチドの前記N末端またはC末端のいずれかから10アミノ酸~125アミノ酸に位置する、ポリペプチド。 - 前記N末端アミノ酸に先行する前記グルタミン酸残基が、別のグルタミン酸残基にすぐ隣接しない、請求項11に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、グルタミン酸の直後がプロリンでない限り、前記バーコード断片の前記C末端以外の位置にグルタミン酸残基を含まない、請求項11または請求項12に記載のポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドが、複数の重複しない配列モチーフを含み、前記配列モチーフの各々が、9~14アミノ酸長である、請求項11に記載のポリペプチド。
- 重複しない配列モチーフの前記セットの前記配列モチーフが、配列番号182~203および1715~1722により同定される、請求項12に記載のポリペプチド。
- 重複しない配列モチーフの前記セットの前記配列モチーフが、配列番号186~189により同定される、請求項15に記載のポリペプチド。
- 重複しない配列モチーフの前記セットが、前記配列モチーフ配列番号186~189のうちの少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドの前記アミノ酸残基の少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)またはプロリン(P)である、請求項1~17のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドが、150~3000アミノ酸長である、請求項1~17のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドが、150~1000アミノ酸長である、請求項19に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、前記ポリペプチドの前記N末端の200、150、100、または50アミノ酸以内に位置する、請求項1~20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、前記タンパク質の前記N末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する、請求項1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、前記ポリペプチドの前記C末端の200、150、100、または50アミノ酸以内に位置する、請求項1~22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、前記タンパク質の前記C末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する、請求項23に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、少なくとも4アミノ酸長である、請求項1~24のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、4~20、5~15、6~12、または7~10アミノ酸長である、請求項1~24のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記バーコード断片が、配列番号8020~8030(BAR001~BAR011)により同定される、請求項1~26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、第二のバーコード断片をさらに含み、前記第二のバーコード断片が、前記XTENポリペプチド内で1回のみ生じ、配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる前記配列モチーフを含む前記XTENポリペプチドの一部である、請求項1~27のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、第三のバーコード断片をさらに含み、前記第三のバーコード断片が、前記XTENポリペプチドの一部であり、配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる、請求項28に記載のポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドが、配列番号8001~8019により同定される配列と少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する、請求項1~29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドが、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、または少なくとも500アミノ酸長である、請求項1~31のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1~31に記載のポリペプチドに連結された、生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドが、前記生物学的に活性なポリペプチドに関して近位末端および遠位末端を有し、前記近位末端が、前記遠位末端と比べて、前記生物学的に活性なポリペプチド近くに位置し、前記バーコード断片が、前記遠位末端から測定して、前記XTENポリペプチドの長さの5%~50%、7%~40%、または10%~30%拡大する前記XTENポリペプチドの領域内に位置する、請求項32に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記プロテアーゼによる消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な一つ以上の参照断片をさらに含み、前記一つ以上の参照断片が各々、前記生物学的に活性なポリペプチドの一部を含む、請求項32または請求項33のいずれかに記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記一つ以上の参照断片が、配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる単一の参照断片である、請求項34に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記XTENポリペプチドと前記生物学的に活性なポリペプチドの間に位置する第一の放出セグメント(RS1)をさらに含む、請求項32~35のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記RS1が、表8a~8bに同定される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記生物学的に活性なポリペプチドが、表4a~4hおよび6a~6fの配列のいずれか一つまたは組み合わせによりここで同定される、請求項32~37のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、いずれのXTENポリペプチドにも連結されていない前記生物学的に活性なポリペプチドと比較して、少なくとも2倍長い終末相半減期を有する、請求項32~38のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、いずれのXTENポリペプチドにも連結されていない前記生物学的に活性なポリペプチドと比較して、より低い免疫原性であり、免疫原性が、同等の用量のヒトまたは動物への投与後に前記生物学的に活性なポリペプチドに選択的に結合するIgG抗体の生成を測定することにより確認される、請求項32~39のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、生理学的条件下で、約6より大きい、見かけの分子量係数を呈する、請求項32~40のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 第二のXTENポリペプチドをさらに含み、前記第一のXTENポリペプチドが、前記生物学的に活性なポリペプチドのN末端に位置し、前記第二のXTENポリペプチドが、前記生物学的に活性なポリペプチドのC末端に位置する、請求項32~41のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記生物学的に活性なポリペプチドと前記第二のXTENの間に位置する第二の放出セグメント(RS2)をさらに含む、請求項42に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- RS1およびRS2が、配列において同一である、請求項43に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- RS1およびRS2が、配列において同一ではない、請求項43に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記RS1およびRS2各々が、各放出セグメント配列内の一つ、二つまたは三つの切断部位での複数のプロテアーゼによる切断の基質である、請求項43~45のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記第二のXTENの一部であり、かつ配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる、バーコード断片をさらに含む、請求項42~46のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記さらなるバーコード断片が、前記ポリペプチドの前記C末端アミノ酸を含まない、請求項47に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記さらなるバーコード断片が、そのC末端でグルタミン酸残基を含む、請求項47または請求項48に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENの前記さらなるバーコード断片が、前記ポリペプチドの前記C末端の200、150、100、または50アミノ酸以内に位置する、請求項47~49のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENの前記さらなるバーコード断片が、前記ポリペプチドのC末端から10~200、30~200、40~150、または50~100アミノ酸の間に位置する、請求項47~50のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記さらなるバーコード断片が、4~20、5~15、6~12、または7~10アミノ酸長である、請求項47~51のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記さらなるバーコード断片が、配列番号8020~8030(BAR001~BAR011)により同定される、請求項47~52のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記さらなるバーコード断片および少なくとも一つの追加のバーコード断片を含むバーコード断片のセットをさらに含み、バーコード断片の前記セットの各バーコード断片が、前記第二のXTENポリペプチドの一部であり、配列および分子量が、前記プロテアーゼによる前記ポリペプチドの完全な消化時に前記ポリペプチドから遊離可能な全ての他のペプチド断片と異なる、請求項47~53のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENが、配列番号8001~8019により同定される、請求項42~55のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記さらなるバーコード断片が、前記ポリペプチド中の別のグルタミン酸残基にすぐ隣接するグルタミン酸残基を含まない、請求項47~55のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドの前記アミノ酸残基の少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタミン酸(E)またはプロリン(P)である、請求項42~56のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第一のXTENポリペプチド中のアミノ酸の総数および前記第二のXTENポリペプチド中のアミノ酸の総数の合計が、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも800アミノ酸である、請求項42~57のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドが、複数の重複しない配列モチーフを含み、前記第二のXTENポリペプチド中の各配列モチーフが、9~14アミノ酸長である、請求項42~58のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドについて、前記複数の重複しない配列モチーフの前記配列モチーフが、配列番号182~203および1715~1722により同定される、請求項59に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記複数の重複しない配列モチーフの前記配列モチーフが、配列番号186~189により同定される、請求項60に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドについて、前記複数の重複しない配列モチーフが、以下のモチーフ:配列番号186~189の少なくとも二つ、少なくとも三つ、または全四つを含む、請求項59または請求項60に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドが、150~3000アミノ酸長である、請求項42~62のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドが、150~1000アミノ酸長である、請求項63に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドが、配列番号8001~8019により同定される配列と少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する、請求項42~64のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 前記第二のXTENポリペプチドが、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、または少なくとも500アミノ酸長である、請求項42~64のいずれか一項に記載の生物学的に活性なポリペプチド。
- 複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物であって、
第一のポリペプチドセットであって、前記第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、プロテアーゼでの消化により前記ポリペプチドから遊離可能で、前記第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、第一のポリペプチドセット;および
前記第一のポリペプチドセットの前記バーコード断片を欠く、第二のポリペプチドセット、を含み;
前記第一のポリペプチドセットと前記第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットと共通し、前記プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含み;
前記参照断片を含むポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が0.70より大きい、混合物。 - 前記参照断片を含むポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が、0.8、0.9、0.95より大きい、請求項67に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで2回生じる、請求項67または請求項68に記載の混合物。
- 前記第一のポリペプチドセットが、全長ポリペプチドを含み、前記バーコード断片が、前記全長ポリペプチドの一部である、請求項67に記載の混合物。
- 前記全長ポリペプチドが、請求項1~68のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項67に記載の混合物。
- 前記バーコード断片が、前記全長ポリペプチドの前記N末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を含まない、請求項70~71のいずれか一項に記載の混合物。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物が、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはN末端とC末端切断の両方に起因して互いに異なる、請求項67~72のいずれか一項に記載の混合物。
- 請求項1~75のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのその逆相補鎖を含む、核酸。
- 請求項74に記載のポリヌクレオチド配列および前記ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結された制御配列を含む、発現ベクター。
- 請求項75に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核生物である、請求項76に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項77に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が哺乳動物の細胞である、請求項78に記載の宿主細胞。
- 請求項1~73のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび一つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
- ヒトまたは動物における疾患の治療のための医薬の調製における、請求項1~68のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項67~73のその混合物の、使用。
- 前記疾患が癌である、請求項81に記載の使用。
- ヒトまたは動物において疾患を治療する方法であって、それを必要とする前記ヒトまたは動物に、一つ以上の治療有効用量の請求項80に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記疾患が癌である、請求項83に記載の方法。
- 前記ヒトまたは動物がヒトである、請求項83に記載の方法。
- 様々な長さのポリペプチドを含む混合物において、前記混合物中の第二のポリペプチドセットに対する前記混合物中の第一のポリペプチドセットの相対量を評価する方法であって、前記第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、前記ポリペプチドで1回生じるバーコード断片を共有し、前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、前記第一のセットのポリペプチドにより共有される前記バーコード断片を欠き、前記第一のポリペプチドセットと前記第二のポリペプチドセットの両方の個々のポリペプチド各々が、参照断片を含み、
前記混合物を、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの切断から生じる複数のタンパク分解性断片を生成するためのプロテアーゼと接触させることであって、前記複数のタンパク分解性断片が、
複数の参照断片;および
複数のバーコード断片を含む、接触させること;ならびに
参照断片の量に対するバーコード断片の量の比を決定し、これにより、前記第二のポリペプチドセットに対する前記第一のポリペプチドセットの前記相対量を評価すること、を含む、方法。 - 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる、請求項86に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、後にプロリン残基がないグルタミン酸残基のC末端側で前記様々な長さのポリペプチドを切断する、請求項86または87に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、Glu-Cプロテアーゼである、請求項86~88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、トリプシンではない、請求項86~89のいずれか一項に記載の方法。
- 参照断片の前記量に対するバーコード断片の前記量の比を決定することが、前記プロテアーゼと接触された後の、前記混合物由来のバーコード断片および参照断片を定量することを含む、請求項86~90のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコード断片および前記参照断片が、それらのそれぞれの質量に基づき同定される、請求項91に記載の方法。
- 前記バーコード断片および前記参照断片が、質量分析を介して同定される、請求項91または請求項92に記載の方法。
- 前記バーコード断片および参照断片が、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を介して同定される、請求項91~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記参照断片に対する前記バーコード断片の比を決定することが、等圧標識を含む、請求項86~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記参照断片に対する前記バーコード断片の比を決定することが、前記混合物に同位体標識された参照断片および同位体標識されたバーコード断片の一方または両方を添加することを含む、請求項86~95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バーコード断片が、存在するとき、XTENポリペプチドの一部である、請求項96に記載の方法。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物が、請求項1~68のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、請求項86~97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記様々な長さのポリペプチドが、全長ポリペプチドおよびその切断断片を含む、請求項86~98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記様々な長さのポリペプチドが、前記全長ポリペプチドおよびその切断断片である、請求項99に記載の方法。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物が、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはNとC末端切断の両方に起因して互いに異なる、請求項86~100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記全長ポリペプチドが、請求項1~68のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項101に記載の方法。
- 参照断片に対するバーコード断片の前記量の比が、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または0.95より大きい、請求項86~102のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物であって、
第一のポリペプチドセットであって、前記第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、プロテアーゼでの消化により前記ポリペプチドから遊離可能で、前記第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、第一のポリペプチドセット;および
前記第一のポリペプチドセットの前記バーコード断片を欠く、第二のポリペプチドセット、を含み;
前記第一のポリペプチドセットと前記第二のポリペプチドセットの両方各々が、
第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットに共通し、前記プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含み;
プロテアーゼ消化後の前記ポリペプチド混合物において定量される参照断片の数が、前記混合物中の前記第一および第二のポリペプチドセットの数の合計と等しく、プロテアーゼ消化後の前記ポリペプチド混合物において定量されるバーコード断片の数が、前記混合物中の前記第一のポリペプチドセットの数と等しい、混合物。 - 前記第一のポリペプチドセットが、一つの参照断片を含み、前記参照断片を含む前記混合物中のポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が、0.7より大きい、請求項104に記載の混合物。
- 前記参照断片を含むポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が、0.8、0.9、または0.95より大きい、請求項105に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる、請求項104~106のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで2回生じる、請求項104~106のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記第一のポリペプチドセットが、全長ポリペプチドを含み、前記バーコード断片が、前記全長ポリペプチドの一部である、請求項104~106のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記全長ポリペプチドが、請求項1~66のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項104または請求項105に記載の混合物。
- 前記バーコード断片が、前記全長ポリペプチドの前記N末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を含まない、請求項108または請求項109に記載の混合物。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物が、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはN末端とC末端切断の両方に起因して互いに異なる、請求項104~111のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる、請求項104~106のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記第一のポリペプチドセットにおける参照断片の数が、前記第二のポリペプチドセットにおける参照断片の前記数と異なり得るが、各セットの各ポリペプチドにおける前記その数が、同じでなければならない、請求項104または請求項105に記載の混合物。
- 前記混合物中の前記ポリペプチドにおける前記参照断片の各々が、全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有する、請求項108に記載の混合物。
- 複数の様々な長さのポリペプチドを含む混合物であって、
第一のポリペプチドセットであって、前記第一のポリペプチドセットの各ポリペプチドが、
プロテアーゼでの消化により前記ポリペプチドから遊離可能で、前記第一のポリペプチドセットから遊離可能な全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有するバーコード断片を含む、第一のポリペプチドセット;および
前記第一のポリペプチドセットの前記バーコード断片を欠く、第二のポリペプチドセット、を含み;
前記第一のポリペプチドセットと前記第二のポリペプチドセットの両方各々が、第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットと共通し、前記プロテアーゼでの消化により遊離可能な参照断片を含み;
前記混合物中のポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が、方程式
[バーコード含有ポリペプチド]/[(参照ペプチド含有ポリペプチド)×N]を有し、
式中、Nは、前記混合物中の各ポリペプチドから放出される前記参照ペプチドの発生数である、混合物。 - 前記第一のポリペプチドセットが、一つの参照断片を含み、前記参照断片を含む前記混合物中のポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が、0.7より大きい、請求項116に記載の混合物。
- 前記参照断片を含むポリペプチドに対する前記第一のポリペプチドセットの比が、0.8、0.9、または0.95より大きい、請求項117に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる、請求項116~118のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで2回生じる、請求項116~118のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記第一のポリペプチドセットが、全長ポリペプチドを含み、前記バーコード断片が、前記全長ポリペプチドの一部である、請求項115または請求項116に記載の混合物。
- 前記全長ポリペプチドが、請求項1~66のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項116~118のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記バーコード断片が、前記全長ポリペプチドの前記N末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を含まない、請求項120または請求項121に記載の混合物。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物が、全長ポリペプチドのN末端切断、C末端切断、またはN末端とC末端切断の両方に起因して互いに異なる、請求項115~123のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記参照断片が、前記第一のポリペプチドセットおよび前記第二のポリペプチドセットの各ポリペプチドで1回以下で生じる、請求項115~117のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記第一のポリペプチドセットにおける参照断片の数が、前記第二のポリペプチドセットにおける参照断片の数と異なり得るが、各セットの各ポリペプチドにおける前記その数が、同じでなければならない、請求項115または請求項116に記載の混合物。
- 前記混合物中の前記ポリペプチドにおける前記参照断片の各々が、全ての他の断片の配列および分子量と異なる配列および分子量を有する、請求項120に記載の混合物。
- 請求項104~127に記載のポリペプチドの混合物中の第一のポリペプチドセットを含むポリペプチドの配列完全性を検出する方法であって、ポリペプチドの前記混合物を、前記第一のポリペプチドセットから前記バーコード断片および前記参照断片を放出し、前記第二のポリペプチドセットから前記参照断片を放出するプロテアーゼで消化する工程、ならびに前記第一および第二のポリペプチドセット由来の前記参照断片に対する前記第一のポリペプチドセット由来の前記バーコード断片の比を決定する工程を含み、前記第一のポリペプチドセットのポリペプチドの前記配列完全性が、前記第一および第二のポリペプチドセットを含むポリペプチドにおけるバーコード断片および参照断片の数に基づく前記断片の予想比との前記断片の比の比較により検出される、方法。
- 前記バーコード断片および前記参照断片が、LC/MSにより検出される、請求項128に記載の方法。
- ポリペプチドの前記混合物に、公知の量の標準物質が添加され、前記標準物質が、複数の様々な長さのポリペプチドの前記混合物の同位体的に標識されたバージョンを含む、請求項129に記載の方法。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物の前記同位体的に標識されたバージョンが、前記プロテアーゼによる消化の前に前記混合物に加えられる、請求項130に記載の方法。
- 様々な長さのポリペプチドの前記混合物の前記同位体的に標識されたバージョンが、前記混合物が、前記プロテアーゼにより消化された後、請求項129に記載の混合物に加えられる前に前記プロテアーゼにより消化される、請求項130に記載の方法。
- バーコード断片、参照断片、または両方の検出された同位体的に区別可能な量の定量をさらに含む、請求項130~132のいずれか一項に記載の方法。
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