KR100237968B1 - 변화된 에피토프를 지닌 단백질 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감소된 면역 반응을 일으키는 단백질 변형물을 얻기 위한 변형된 단백질의 아미노산 서열의 선택방법 및 단백질 변형물의 제조방법에 관한 것이다.
또한 변형물을 함유하는 조성물, 및 특히 그의 세제 및 의약에의 용도가 개시되어 있다.

Description

[발명의 명칭]
변화된 에피토프를 지닌 단백질 및 그 제조방법
[도면의 간단한 설명]
제1도 내지 제6도는 변이체 농도의 함수로서 많은 효소 변이체와 관련 항혈청의 결합을 보여주는 도면이다.
[발명의 분야]
본 발명은 단백질, 특히 산업적으로 이용되는 효소, 및 의약용 단백질을 변형시키는 방법, 그와 같이 생산된 변형 단백질, 그러한 단백질 변이체를 함유하는 조성물, 및 의학을 포함한 여러 분야에서 변이체의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 단백질은 면역학 및 단백질화학적 방법을 이용하여 에피토프 맵핑되고 실제적으로 그 아미노산 서열을 유전공학을 통해 변화되고 그것에 의해 면역학적 활성이 변화되므로서 면역원성이 감소되고 그것에 의해 본 발명의 효소에 노출되기 쉬운, 사람을 포함하여 동물의 알레르기 반응의 발명 위험이 감소시킨다.
[발명의 배경]
효소 등의 각종 단백질은 산업 및 가정에서 사용이 증가되어 왔다. 단백질이기 때문에 그것들은 사람 및 동물에 있어서 면역학적 반응을 일으킨다.
호로몬 등의 다른 단백질도 각종 질병 및 질환이 증상을 치료 및/또는 진단하기 위한 의학에서 사용이 증가되고 있으며, 이들 단백질은 사람을 포함하여 동물의 면역계에 주사되거나 또는 다른 방법으로 제공되어진다.
제공 방식에 의거하여 자극은 각종 항체의 생산을 야기시키고, 또한 세포반응도 일으킨다. 한 종류의 항체를 유발하는 이들 경로중의 적어도 하나는 사람과 동물에 있어서 해로운 작용을 일으킬 수 있다. 1gE 및 아미도 1gG4의 생산은 알레르기 상태를 유발하여, 비염, 결막염 등의 증상을 일으킬 수 있다.
다른 해로운 면역학적 작용이 이들 단백질의 사용이 증가하면서 나타날 수 있음을 배제할 수 없다.
이들 단백질 용도의 결점이 여러해 동안 공지되어 왔고 다양한 해결책이 이들 문제를 해결하기 위해 이용되어 왔다.
산업적으로 효소 분야에서 생산물에 노출되어 일어나는 알레르기 반응문제를 해결하기 위해 가장 빈번하게 이용되는 방법은 효소의 고정화, 입자화 및 코팅 등의 각종 방법으로 효소를 제조하여 정상적인 조작 및 저장시에 단백질성 물질의 방출을 방지하는 것이다.
그러나 이러한 해결책은 효소를 용액에 넣어 작용시키는, 물질과 효소의 접촉에 대한 여러 문제를 야기시키며 또한 일부 효소의 방출은 노출에 민감한 환자에 있어서 알레르기 반응을 일으킬 수 있다.
의학분야에서 많이 이용하는 방법은 특히 사람 또는 대응하는 동물기원의 단백질, 또는 적어도 사람(또는 문제의 동물) 단백질과 동일한 2차 구조를 갖는 단백질을 이용하는 것이다.
이것은 많은 예에서 성공적이었으나, 문제의 단백질에 상응하는 동물의 존재를 확립하는 것이 항상 가능한 것만은 아니며, 또한 어떤 변형된 단백질은 모 단백질에 비해 확실한 장점을 지니는 것으로 밝혀졌다. 그러한 예를 통해 알 수 있듯이 치료 또는 진단을 받는 환자에 있어서 알레르기 반응의 발병위험은 존재한다.
결과적으로 알레르기 반응이 감소되거나 일어나지 않으며, 활성이 있어서 본래 의도에 따라 사용될 수 있는 정도로 원래의 활성을 보유하는 단백질을 제조할 필요가 있다.
면역학적으로 인식되어 결합되는 단백질 분자이 그 부분은 에피토프라고 불린다. 예를들어 30000 달톤 범위의 분자량에 대해서는 12개의 에피토프가 존재할 것이다.
에페토프는 면역학적 세포 및 항체와 결합된다. 어떤 에피토프는 다른 것보다 중요하여 주요하지 않은(minor) 에피토프에 대해 주요한(major) 에피토프라고 불린다.
에피토프에서 적은 변화가 이들 결합의 결합력에 영향을 끼친다는 것이 밝혀졌다(Walsh. B.J. 및 Howden. M.E.H. (1989) : A method for the detection of IgE binding sequences of allergens based on a modification of epitope mapping, Jouranl of Immunological Methods, 121. 275-280 ; Geysen, H.M. Tainen, J.A., Rodda, S.J. Mason, T.J.. Alexander, H., Getzoff, E.D. 및 Lerner, R.A(1987) : Chemistry of Antibody Binding to a Protein. Science. 135, 1184-90 ; Geysen, H.M., Mason, T.J. 및 Rodda, S.J. (1988) : Cognitive Features of Continuous Antigenic Determinants. Journal of molecular recognition. 1, 32-41).
이것은 주요한 에피토프를 주요하지 않은 에피토프로 전환시켜 그러한 변화된 에피토프의 주요성을 감소시키며, 또한 결합력은 효과적인 결합이 일어나지 않는 높은 가역성 수준까지 감소될 것이다. 이 현상은 에피토프 손실이라고 불린다.
위의 모든 연구는 연구하는 에피토프에 존재하는 아미노산 잔기의 상대적인 주요성을 확립하기 위해 문제의 에피토프를 의태하는 합성 팹티드 및 그것의 변이체에 대해 수행하였으며, 결과적으로 이들 연구는 접힘 또는 염다리 등, 단백질들의 3차 구조에서만 발견되는 현상이 작용하는 경우, 완전한 단백질의 부분으로서 그들의 본래 환경에서 에피토프에 대한 어떠한 효과도 입증하지 않는다.
[발명의 개요]
본 발명의 목적은 감소된 면역학적 반응을 유발하는 단백질 변이체를 얻기 위해 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 방법, 및 이들 단백질 변이체에 관한 것이다.
따라서 제1면에 있어서, 본 발명은 사람을 포함하여 동물에 있어서 모(母) 단백질에 의해 야기되는 반응에 비해 면역학적 반응을 감소시키는 단백질 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이로 인해 단백질을 면역학 및 단백질화학적 방법을 이용하여 에피토프 맵핑되고, 각종 에피토프가 결정되고 특성화되었다.
이에 따라 적어도 하나의 상기 에피토프는 상기 모 단백질의 발현을 암호화하는 DNA 분자의 돌연변이, 또는 상기의 변형 단백질의 발현을 암호화하는 DNA 분자의 합성을 통해 변화된다. 이것은 단백질 공학업계에 공지된 잘 확립된 기술은 이용하여 수행된다.
돌연변이된 또는 제조된 DNA 분자는 이어서 적합한 숙주내로의 형질전환 또는 트랜스펙션을 위해 백터에 삽입된다. 거기에서 상기 백터는 기능적이고 그에 의해 상기 돌연변이된 또는 제조된 DNA 분자는 기능적으로 상기 숙주의 게놈에 삽입되어 관심있는 단백질 변이체가 숙주에서 발현된다.
최종적으로 단백질 변이체는 회수되어 정제된다.
제2면에 있어서 본 발명은 위의 방버브로 생산한 단백질에 관한 것이다. 이런 면에 있어서 특히 중요한 것에는 산업효소, 예컨대 세제효소, 예를들어 프로테아제, 리파제, 셀룰라제, 아밀라제, 또는 옥시다제, 공정효소, 예컨대 아밀라제, 리아제, 리파제, 또는 셀롤라제, 의약 단백질, 예를 들어 호르몬, 예컨대 인슐린, HCG, 또는 성장호르몬, 또는 의약효소, 예컨대 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 또는 다른 단백질, 예컨대 인터루킨, 또는 인터페론 등이 있다.
제3면에 있어서 본 발명은 제2면의 단백질을 함유하는 조성물, 예컨대 세제 조성물, 사람을 포함하여 동물체내의 각종 증상의 예방/또는 경감 치료 및/또는 진단에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
제4면에 있어서 본 발명은 사람을 포함하여 동물체의 각종 증상의 예방 및/또는 경감치료 및/또는 진단에 관한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 제1면에 따라 에피토프 맵핑이 단백질에 기능적으로 존재하는 각종 에피토프를 특성화하고 위치를 알아내는데 이용된다. 그러므로 이 정보는 에피토프에서 어느 아미노산 잔기가 변화되어야 하는 가를 선택하는데 이용된다.
변화가 현재 잘 확리보디어 있는 유전공학 기술을 이용하여 수행되는 경우, 단백질 변이체가 생성되며, 그 변화는 주요한 에피토피시티(epitipicity)를 주요하지 않는 에피토피시티로 전환시키거나 또는 에페토프 손실을 야기시키는지의 여부를 결정하고 새로운 단백질 변이체를 분석하는데 면역학 및 단백질화학 기술이 이용된다.
또한 이러한 정보는 단백질 변이체(들)이 단백질에 대해 확립된 요구에 상응하는지의 여부, 또는 그 이상의 다른 변화가 일어났는지의 여부를 결정하는데 이요된다.
그러므로 본 발명을 통하여 특히 문제의 단백질(들)에 노출된 동물 및 환경에 대한 면역학적, 예컨대 잠재성 알레르기의 위험을 감소시키는 이약 단백질 및 산업효소 등의 단백질을 생산하는 것이 가능하다.
따라서 본 발명의 단백질 또는 효소 변이체는 제조 및 사용에 있어서 사람(및 동물) 또는 환경에 대한 낮은 위험성을 제공할 것이다.
단백질 맵핑을 수행하는데 있어, 관심있는 단백질(기준 단백질이라고도 불림) 및 유전공학 또는 화학적 변형을 통해 제조한 그 변이체가 항체의 생산에 이용된다. 항체는 항원의 많은 에피토프를 인식할 수 있는 폴리클로날(항혈청과 유사함)일 수 있으며, 이경우 하나의 항원으로 인식되는 연관된 단일 특이성 항원, 하나의 에피토프로 인식되는 단일 특이성 에피토프와 교차반응할 수 있다. 항체는 또한 하나의 에피토프를 인식하는 모노클로날일 수 있으며, 이는 항체를 생산하는 세포와 암세포 등의 불멸화 세포의 융합을 통해 생산된다.
폴리클로날 항체는 다특이성(polyspecific) 방식으로 단백질 항원과 반응할 것이다. 즉, 많은 특이성이 존재하여 항원의 각 에피토프와 각각 반응하거나 또는 다른 관련된 에피토프에 대해 다른 반응성을 나타낸다. 또한, 폴리클로날 항체는 대개 관련 항원과 교차-반응을 한다. 단일 특이성 항체는 하나의 확실한 항원에 대한 특이성에 따라 분리되는 폴리클로날 항체이며, 그러한 단일 특이성 항체는 일반적으로 매우 한정된 수의 에피토프, 대개는 하나의 에피토프에 대해서만 특이적이다.
에피토프 단일 특이성 항체는 하나의 확실한 에피토프에 대한 특이성을 따라 분리되는 폴리클로날 항체이다. 그러한 에피토프 단일 특이성 항체는 단지 하나의 에피토프에만 특이 하나, 대개 다수의 항체생산세포에 의해 생산될 수 있으며, 결과적으로 동일하지 않다.
모노클로날 항체는 항체생산세포와 불멸화 세포간의 최근에 잘 확립되어 있는 세포융합기술로 생산된 에피토프 특이성 항체이다. 하나의 클론에 의해 생산된 모든 모노클로날 항체는 동일하다.
생산된 항체는 면역화 단백질 항원에 결합할 수 있다. 더욱이, 완전히 또는 부분적으로 동일한 에피토프가 다른 단백질에 존재하는 경우, 항체는 또한 이것들에도 결합할 수 있다. 만일 완전한 동일성이 존재할 경우, 인식 및 결합은 동일할 것이다. 만일 부분적으로 동일한 에피토프가 존재할 경우 인식은 다를 것이고 결합력은 낮아질 것이다. 만일 에피토프가 존재하지 않을 경우 항체는 결합하지 않을 것이다. 폴리클로날 항체를 이용한 맵핑은 2단계로 나누어진다 :
-i) 관심있는 모든 단백질에 대한 항체 제제의 반응성 측정.
-ii) 다른 하나의 항원과 반응한 후 하나의 항원과 반응할 수 있도록 잔존하는 반응성의 측정.
(i)의 결과는 연구된 변이체의 면역유발 및 알레르기 유발 가능성에 대한 정보를 제공한다. 이에 따라서 감소된 가능성을 나타내는 몇가지 변이체는 관심있는 변이체임이 입증되었고, 반면에 증가된 가능성을 나타내는 다른 것은 면역학적 관점에서 관심있는 것으로 간주되지 않았다.
(ii)의 결과는 다음에 관한 정보를 제공할 것이다 :
-iia) 다소의 면역성성/알레르기원성을 나타내는 에피토프(들)에서의 변화.
-iib) 에피토프(들)의 손실(항원의 가장 높은 농도 조차도 기준 항원에 대한 모든 반응성을 일소하지 못할 것이다).
-iic) 새로운 에피토프(들)의 확립(기준 항원의 가장 높은 농도 조차도 변이체에 대한 모든 반응성을 일소하지 못할 것이다).
이러한 정보로부터 제조에 이용할 수 있는 변이체를 결정할 수 있다.
선택된 단백질 변이체는 현재 단백질 공학 업계의 사람들에게 잘 공지되어 있는 방법을 통해 생산될 수 있다. 방법은 많은 공보, 예컨대 국제공보 No. WO/06279(NOVO INDUSTRI A/S), 및 국제특허출원 No. PCT/DK90/00164(NOVO-NORDISK A/S)에 기재되어 있으며, 관련부분이 여기에 전부 참고로 포함되어 있다.
[실시예]
선택한 기준 단백질 항원은 알칼리 프로테아제, 서브틸리신 309의 변이체인 SP436이었으며, 구조 및 제조가 위에 언급된 국제공보 No. WO/06279(NOVO INDUSTRI A/S)에 상세히 기재되어 있으며 (i)로 표기하였다. SP436 변이체는 야생형 서브틸리신 309에 대해 아미노산 서열의 2개 변화, 즉 G195E + M222A를 포함한다. 국제특허출원 No. PCT/DK90/00164(NOVO-NORDISK A/S)는 유전공학에 의해 제조된 더 나아가서의 변이체의 제조를 보여준다. 야생형 효소는 정상적인 발효에 의해 생산되었고, 항체는 래트의 폴리클로날 항체였다.
SP436 분자는 269개의 아미노산 잔기를 포함하는 단백질로서, 잘 공지된 서브틸리신 BPN'6 결실물(deletion)과 비교되었다. 각종 서브틸리신의 아미노산 서열에 대한 더나아가서의 참고가 국제공보 No. WO/06279(NOVO INDUSTRI A/S) 및 국제특허출원 No.PCT/DK90/00164(NOVO-NORDISK A/S)에 나타나 있으며, 거기에는 많은 프로테아제에 대한 아미노산 서열, 서브틸리신 BPN'의 서열에 근거한 서브틸리신 효소의 번호매김(numbering) 시스템, 및 아미노산 서열의 변화를 나타내는 표시법이 기재되어 있다. 거기서부터 번호메김 및 표시법은 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위를 통해 계속될 것이다.
[면역화]
문헌에 의하면 레트는 그 비만세포 및 백혈구 막에 사람 IgE를 결합시킬 수 있으며, 동시에 사람 비만세포 및 백혈구 막에 결합할 수 있는 IgE를 지니고 있는 유일하게 일반적으로 실험동물이기 때문에 레트를 실험동물로 선택하였다.
동물을 각 3마리의 래트로 구성된 12군으로 나누었다. 면역화를 위해 야생형(wt) 서브틸리신 309 및 그 11 변이체를 선택하였다. 이들을 하기 표 1에 나타냈다.
[표 1]
투여량은 일정하게 30㎍/동물/면역화하였다. 각 동물에 6회 투여하였다.
모든 선택된 12 단백질을 프로인트 컴플리트 애주번트(Freunds Complete Adjuvant)로 1회 투여하였고, 프로인트 인컴플리트 애주번트(Freunds Incomplete Adjuvant)로 1회 및 NcC ℓ 0.9%로 4회 투여하였다.
최종 면역후 5일만에 수행한 최종 채혈을 제외하고는 각 면역화 후 1주일만에 혈액을 얻었다.
응고 후, 각 군의 모든 3마리 동물에서 얻은 혈청을 모았다.
세번째 혈액을 얻은 후 12혈청 풀에 대해 본 명세서에 기재된 분석 연구를 수행하였다.
[분석]
분석 연구를 ELISA 기술의 두 시리즈의 분석, A 및 D로 수행하였다.
[시리즈 A]
한가지 단백질을 하나 또는 그이상의 ELISA-플레이트의 웰을 코팅하는데 사용하였다. 이 단백질은 모 단백질(야생형) 또는 변이체이었을 것이다.
이 분석에서 12가지의 다른 혈청 풀을 코팅된 웰에서 배양하였다. 모든 혈청이 다른 단백질에 대해 증가하였다. 만일 변이체가 유사한 경우, 혈청은 그 반응 양상도 유사할 것으로 예측하였다. 각 혈청 웰의 원래 시리즈에서 희석 시리즈로 시험하였다.
래트 항체의 가능한 결합은 퍼옥시다제로 표시된 항-래트 항체의 결합을 통해 관찰하였다.
만약 래트 항체가 효소 코팅물에 결합하는 경우, 항체는 퍼옥시다제로 표시된 항-래트 항체를 통해 비례 방식으로 결합하였다.
이 방식에서 색의 출현은 효소 특이성 래트 항체의 존재를 비례하는 시각 및 측정 지표로 제공하였다.
간단한 단계별 서열에서 순서는 다음과 같다:
1) 고체상의 효소 코팅.
2) 잔기의 고체상 스폿에 대한 결합의 알부인 억제.
3) 효소 활성 항체가 코팅된 효소에 결합하도록 희석 시리즈에서 혈청을 배양.
4) 퍼옥시다제로 표지된 항 래트(IgX) 항체.
5) 발색.
6) 측정.
12 혈청군을 상기 순서에 따라 한가지 종류의 단백질(즉, 야생형 또는 변이체)에 대해 반응성을 시험하였다. 다른 단백질을 차례대로 12 혈청군과 시험하였다.
반응을 주어진 단백질, 즉 기준 단백질로 원래 면역화된 혈청군과 비교하였다.
결과는 각 단백질의 항체 인식능력에 대한 정보를 제공하였다. 기준에 대해 3가지 종류의 반응성 즉, 동일한/보다 높은/보나 낮은 반응성으로 나누었다. 하기 표 2를 참조하라. 분석 디자인때문에 에피토프 손상 및/또는 에피토프 변화(결합력 감소) 현상을 서로 구별할 수 없었다.
[표 2]
IgG 반응(표 2)은 세가지 효과를 나타냈다:
1) 각 혈청군(항-SP436 제외)은 다른 것보다는 자신의 면역원과 보다 강하게 반응하였다.
특히 혈청 no 12(항-wt)는 다른 단백질에 대해 낮은 반응을 보였다.
2) 일부 혈청은 일반적으로 다른 것보다 높은 반응은 나타냈다.
이 마지막 특징은 IgG 및 IgG의 분포와 함께 매우 중요하다. 여하튼 반응하는 동물의 몇가지 특성에 속하는 것은 제외되지 않았다. 그러한 특징은 대개 소수의 동물 혈청이 모아졌을 때(3가지가 모아진 이 경우와 유사함)에만 나타난다.
3) S023를 제외하고 시험한 각 단백질에 대해 불규칙적인 효과가 나타났다.
이것은 시험 단백질이 아닌 단백질로 면역화된 동물의 혈청이 시험 단백질로 면역화된 동물의 혈청보다 더 강하게 반응함을 의미한다(수평 값).
이것은 본래 (보다 큰) 단백질에 대해 항체를 생산하는데 사용되는 작은 합성 펩티드로 연구할 경우에도 관찰되는 특징이다. 여기서 그것은 본래의 단백질에 유리한 구조의 차이로 설명된다.
IgG 반응(표 2)의 IgG 반응에 대해 언급한 (1), (2), 및 (3)에 필적하는 효과를 나타낸다.
한 면역화 단백질로부터 다른 유사한 단백질로의 전환은 SP436을 제외한 모든 것에 대해 보다 낮은 IgG 및 IgG 반응성을 제공하였다. SP436의 다른 것으로의 전환은 이 실제 신호를 다른 것에서 나타나는 것에 필적할만한 수준까지 증가시켰다. 더욱이 불규칙적인 효과가 나타났는데, 이것은 더나아가서 하기 시리즈 D와 함께 토의되어질 것이다.
[시리즈 A]
선택한 혈청을 각 분석에서 하나 및 동일한 변이체와 시험하였다. 변이체를 50㎍/㎖(인산염 완충제)의 농도에서 고체상을 코팅하는데 이용하였으며, 이는 밀접-단층 면역화를 제공하였다. 표면의 잔기 결합 스폿은 소 혈청 알부민(BSA)에 의해 억제되었다.
혈청은 희석 시리즈로 시험하였는데, 제1희석은 혈청 강도에 근거하여 20 내지 800배였고, 이 희석으로부터 2-배 시리즈로 희석하였다. 억제제(blocking agent)를 포함하여, 인삼염 완충제는 BSA 및 세제를 포함하였다.
퍼옥시다제에 결합한 마우스-항-래트-항체에 의해 결합한 항변이체-항체를 이용하여 조사를 수행하였다.(혈청용으로 사용한 동일한 완충제에서 1000배 희석한 Kem-En-Tec cat. no. Y 3300).
시각화는 OPD-기질상의 퍼옥시다제의 효소 반응을 통해 달성하였는데, 존재하는 퍼옥시다제에 비례하여 색을 나타냈으며, 이것은 존재하는 래트 항 변이체 항체에 비례한다.
높은 반응 가능성을 갖는 혈청은 다른 것보다 높은 반응을 하게 되는데, 이것은 강도 및 가능한 상호간의 반응성의 측정을 가능하게 하였다.
4.A.4. 시리즈 A, 분석 2+3
하기 방법을 이용하여 분석을 수행하였다. 동일한 반응을 나타내는 흐석을 계산하여 기준(즉, 각 혈청과 그 면역화 변이체의 반응)에 대해 “표준화(normalizing)”하였다.
낮은 값은 혈청이 기준만큼 희석될 수 없음을 의미하고, 높은 값은 혈청이 기준보다 더 희석될 수 있음을 의미한다. 그러므로 49는 기준 반응의 0.49배, 즉 기준 1000배에 있어서 샘플이 490배로 희석될 수 있음을 의미한다.
이들 결과를 하기 표 3에 나타냈다:
[표 3]
이 결과의 설명이 하기의 결론에서 상세히 토의되어 있다.
[시리즈 D]
한가지 단백질을 다시 ELISA 플레이트의 웰을 코팅하는데 이용하였다. 더욱이 한가지 혈청 폴만 기준으로 시험하였다. 이 혈청은 한가지 희석으로만 시험하였다.
혈청을 코팅된 웰에 첨가하기전에 다른 세트의 웰에 잇는 야생형 또는 변이체와 예비배양하였다.
이 경우 다른 웰에 있어서 야생형 및 변이체의 희석 시리즈를 동일한 농도의 기준물과 배양하였다. 그러므로 각 웰은 희석 시리즈의 특성 희석에 있는 야생형 또는 변이체와 합쳐진 혈청을 포함한다.
희석 시리즈의 한쪽 끝에서 항원이 과량으로 존재하고, 다른쪽 끝에서는 반응이 일어나지 않도록 단백질의 농도를 선택하였다. 결과적으로 단백질은 만일 특이성이 일치하는 경우, 일부 웰에서, 모든 래트 항-단백질 반응성을 방해하였다. 다른 웰에서는 더욱더 많은 래트 항체가 미반응 상태로 남아 있었다. 만일 공-배양된 단백질이 래트 항체를 생산하는데 이용한 것과 매우 다른 경우, 미반응 항체는 이용한 농도의 무관하게 모든 웰에 남아 있었다.
혈청과 희석된 단백질을 공배양한 후, 반응한 혼합물을 코팅된 웰로 옮겼다.
만약 래트 항체 활성이 남아있는 경우 웰의 코팅된 단백질에 결합하여, 실질적으로 래트 항체는 퍼옥시다제 표지 항 래트(IgX) 항체에 의해 결합되고, 상기 시리즈 A에서와 같이 발색이 수행되었다.
이 분석의 결과는 공-배양된 단백질이 코팅된 것에 관련되어 있는지의 여부를 보여준다. 에피토프 동일성(부분적 또는 완전한 동일성) 또는 에피토프 존재의 둘다를 보여준다.
이 시리즈에 사용된 변이체를 하기 표 4에 나타냈다:
[표 4]
한가지 혈청 군을 22개의 아분석(subassay)으로 구성된 분석에 사용하였다. 각 아-분석에서 혈청은 희석 시리즈에서 wt 또는 하나의 변이체와 함께 액체상에 흡수되었다. 최종적으로 잔존하는 항체를 한가지 및 동일한 모든 단백질에 대해 시험하였다.
그러므로 각 아-분석을 통해 항체 반응성을 제거하고 잔존하는 것을 측정하였다. 이 절차에서, 한가지 혈청 군을 모든 21 단백질에 흡수시키고, 최종적으로 원래 면역화에 사용한 동일한 종류와 함께 시험하였다.
시험한 단백질과 비교한 흡수된 단백질에서의 에피토프 손실은 흡수 단백질의 최고 농도에서 양성 결과를 나타냈다. 제1도 내지 제6도에 나타낸 바와 같이 플로트는 그러한 변이체에 대해 절대적인 기준 흡수에서 나타난 완전한 효과에 이르지 않고 수평하게 되어 있다.
에피토프의 변화는 결합력의 약화를 의미한다.
그러므로 아-분석 플로트는 농도축에 대해 다르게 위치하며, 절대적인 기준 흡수에 비해 다른 데이터를 제공하였다.
이제까지 SP436에 대한 항혈청만 시험하였다.
제1도 내지 제6도에서 흡수효과를 플로트로 나타냈다. 제1 웰은 흡착할 변이체 또는 wt. 예컨대 내부 컨트롤이 없었다. 다음 웰은 농도가 증가한 흡수 단백질을 포함하였다.
기본적으로 두가지 종류의 플로트가 있다. 하나는 전반적으로 감소하는 값을 나타내는 것이다. 다른 하나는 최고 농도의 흡수 단백질의 존재시에는 일부 반응만을 나타냈으며, 수평 상태를 나타냈다. 첫째 종류는 흡수 단백질의 존재시에도 일부 반응만을 나타냈으며, 수평 상태를 나타냈다. 첫째 종류는 에피토프의 변화에 대응할 것이며, 반면에 둘째 종류는 에피토프의 손상에 대응할 것이다(결합 에너지의 일반적으로 감소를 의미하며, 항체 결합에 있어서 고도의 가역성을 가능하게 함).
제1도 내지 제6도에서 다음의 S 번호는 “수평 상태”를 나타낸다 : S003, S012, S019, S020, S022, S023, S024 및 S026, S026은 변이체 E136R을 포함하며 시험한 위치에서 유일한 변이체이었고, 평가에 완전히 포함되지 않았다.
표 5에서, 흡착 효과는 세가지 부분으로 분류된 기준 SP436을 포함하여 모든 21 단백질에 대하여 열거하였다.
첫째 부분은 위치 no.195 및 222에서의 아미노산 변화, 및 다른 하나의 위치 변화와의 조합의 효과를 나타낸다.
둘째 부분은 모든 다른 시험한 변화와 조합된 위치 no.170에서의 변화를 나타낸다.
셋째 부분은 모든 다른 시험한 변화와 조합된 위치 no.251의 변화를 나타낸다.
시험 혈청은 혈청 군 no 1(항-SP436)이었다.
결과를 고정된 판독 값에서 타이터로 측정하였고, 기준에 대한 흡수용량(퍼센트)으로 다시 계산하였다.
[표 5]
[시리즈 D의 결과]
표 5로부터 아미노산을 하나씩 교환하면서, 흡수용량을 기준과 비교하였다:
(ND - 현재 절차에서 구별 불가능)
결과를 표 6의 데이타의 비교하였으며, Cα′의 원자간 거리를 기록하였다.
에피토프 크기는 전형적으로 반경이 10 내지 15Å이고, 아미노산은 작용위치에서와 같이 노출되어 있다.
이 정보를 3-차원적인(3D)면과 관련지어, 동일한 에피토프에 속하여 동일한 항체에 의해 결합되는 아미노산을 추정하는 것이 가능하다.
[표 6]
초기에 no 120+235는 하나의 에피토프에서 공동작용하고, no 195+251은 다른 하나의 에피토프에서 공동작용하는 것으로 나타났다.
더욱이 no 89 및 181은 둘다 IgE와 IgG의 훨씬 높은 흡수를 제공할 것이다. no 251은 둘을 다소 흡수하고, no 271은 IgG를 다소 흡수하였다.
아미노산 no 170은 다른 인용된 모든 번호에서 변화하여UT고, 에피토프의 손상을 초래하였다. 가장 높은 농도의 이들 단백질 조차도 제제로부터 모든 항체를 제거하지 못하였다.
이 단일 에피토프는 약 30%의 반응성을 나타내며, 따라서 전체 에피토프 수는 낮을 것으로 예측되었다.
또한, 위치 136이 중요한 에피토프(제4도 참조)와 연결되어 있는 것처럼 보였다. S206은 위치 136이 변화된 유일한 변이체이므로, 명확한 결론을 내리기 위해서는 좀더 연구해야 한다.
하기 표 7에 동일한 에피토프에 속하는, 본 발명에서의 연구한 위치의 여러 쌍에 대한 가능성을 나타냈다.
[표 7]
상기로부터 서브틸리신 309의 면역학적 포텐셜(potential)에 영향을 미치는 변화를 위해 하기 아미노산 잔기를 선택하였다.
전하를 띠는 아미노산 잔기의 변화는 서브틸리신 309의 면역학적 포텐셜에 가장 큰 영향을 끼친다.
[결론]
시리즈 A, “데이타 발췌”페이지, 표 3에는 아미노산(AA) 교환으로부터 얻은 결과가 열거되어 있다. 표 3은 두 변이체에 대한 혈청에 관한 것이며, 이것들을 면역원 및 동일한 위치(들)가 변화된 다른 변이체와 시험하였다.
야생형을 변이체로 변화시켜 하기 효과를 관찰하였다.
하기에서 “필수적인(essential)”, “결정적인(critical)” 및 “문제가 되는(present)” 용어는 특정위치에 존재하는 아미노산과 연관되어 사용된다. 이 표현은 Geysen 등, Scienc 135(1987) 1184-90에 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
I. AA no. 120은 WT에서는 “필수적”이지 않으니 변이체에서는 그렇지 않다.
AA no. 235는 120에 대한 것과 동일하다.
AA no. 271은 120에 대한 것과 동일하다.
II. AA no. 251은 WT에서는 “필수적”이나 변이체에서는 그렇지 않다.
III. AA no. 181은 변화된 D181N에서 불규칙적이고 효과를 나타냈고, 역으로 변환된 N181D에서는 “필수적”이었다.
IV. AA no. 136은 교환의 두 방식으로 반응에 큰 영향을 끼친다.
AA no. 170은 136에 대한 것과 동일하다.
AA no 195은 136에 대한 것과 동일하다.
하기의 교환 데이타는 대강 2군(각 13 및 11)으로 나누어질 수 있다.
V. 줄(row)9, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 26, 27 및 32는 하나의 돌연변이에 있어서 계산된 축적효과로부터 예측되어지는 효과를 나타낸다.
VI. 줄 10, 16, 18, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 30, 및 31은 하나의 돌연변이에 있어서 계산된 축적효과로부터 예측될 수 없는 효과를 나타낸다.
V. 및 VI.은 AA no. 36을 포함시키지 않고 계산하였으며, 이 변화에 대한 2-방식 데이타가 없음에 유의해야 한다. 그러므로 줄 24, 25, 27, 29 및 32는 AA no. 36 교환을 포함하여 차후에 계산되어 다르게 나타날 것이다.
모든 AA의 두가지 방식의 데이타가 일부 에피토프에 관여하는 것으로서 정렬되어 있다. 항체의 인식 및 결합에 대한 영향은 크게 다르나 어느 것도 효과가 없지는 않다.
군 I. 및 II. 는 일부 AA가 비-필수적인 반면 동일한 위치에서 다른 것은 필수적인 것을 예시하고 있다.
이것으로부터 마치 시험한 AA의 120, 235 및 271의 변화가 아마도 변이체의 에피토프에서 필수적인 AA를 만드는 것으로 보인다.
또한 no 251의 변화는 필수 AA를 제거한 것처럼 보였다.
이것은 야생형 효소에 대한 반응에 비해 새로운 변이체가 감소된 알레르기 반응을 일으키도록 할 것이다. 변이체 분자에 대한 새로운 항체의 생성후에 WT 노출에 대한 전향에 대해 완전한 능력을 어떻게든 회복시키도록 여전히 낮은 방응을 나타냈다(항-WT 및 항-변이체 항체 둘다에 의해).
가장 중요한 군은 no 181의 변화가 불규칙적인 효과(즉 항-WT 혈청은 자신의 WT 면역원보다 변이체와 더 강하게 반응한다)를 제공하는 III이며, 이 AA는 항-변이체 혈청에 필수적인 것으로 보인다.
그러므로 이것은 매우 중요한 위치이며, 그 위치에서의 변화는 제1회의 베이시스(basis)에서 분자에 노출된 사람뿐만 아니라 WT 효소에 대한 항체를 이미 보유하고 있는 사람에서도 반응을 증가시켜 변이체와 더욱 강하게 반응시킬 것으로 예측된다.
면역학적 관점에서 이 위치의 변화는 회피해야함을 의미한다.
군 IV는 두가지 방식으로 그 자체의 면역원과 더 강하게 반응하는 항혈청을 제공하는 변화를 보여준다. 두가지 방식에서 변화는 감소된 반응을 나타내며, 반응은 그 자신의 면역원으로부터 복귀에 의해 회복되었다.
사람에 있어서 이것은 변이체로의 전환에 의한 반응의 즉각적인 감소를 의미하나, 새로운 항-변이체 항체가 나타남에 따라 반응은 회복될 것이다.
면역학적 관점에서 이 변화는 뚜렷하지 않거나 또는 이로운 것으로 보인다.
표 3의 나머지 줄은 부분적으로 상기를 확증하며, 효과의 단순한 축적이 다수의 AA 교환 변이체에서 예측될 수 없음을 부분적으로 예증한다. 더나아가서의 분석이 면역학적 효과의 축적을 확중하는데 요구된다.
하나 또는 소수의 아미노산의 변화된 분자를 사요하여 하기 효과를 관찰하였다:
1. 특허위치에서 어떤 아미노산은 에피토프에 필수적이지 않으나, 반면에 다른 것은 필수적으로 나타났다.
2. 특정위치에서 시험한 모든 아미노산은 에피토프에 필수적인 것으로 나타났다.
3. 한 아미노산의 다른 것으로의 교환은 불규칙적인 효과를 제공할 수 있다.
더욱이 새로운 아미노산은 “변이체” 분자에 필수적일 것이다.
이러한 발견으로부터 만일 원래 분자에 이미 민감한 사람이 변화된 분자(들)에 노출되었을 경우 하기 반응(증상 포함)이 나타날 것이다:
i. 어떠한 변화되 즉시 일어나지 않으나, 잠시후에 반응이 증가한다.
ii. 변화에 대해반응이 감소한다.
원래 분자에 노출되면 반응이 회복된다.
iii. 변화에 대해 반응이 증가한다.
원래 분자에 노출되면 즉각적인 감소가 나타나며, 최종적으로 변이체에 대한 변화전의 원래의 반응 강도로 돌아간다.
iv. 초기에 반응이 감소하였다가 회복된다.
원래 분자로 교환되면 반응이 감소되었다가 즉기 회복된다.
면역학적 관점에서, 바람직한 교환은 균 II형이나, 군 IV형의 변화되 또한 만족스러울 것이다.
비록 본 발명이 특정한 구체예와 관련되어 예시되었지만, 이것은 어떠한 방식으로도 본 발명이 구체예에 한정되는 것으로 이해해서는 안된다. 본 발명은 명세서 전체 및 첨부된 청구범위에 의해 한정된다.

Claims (9)

  1. 사람을 포함하여 동물에 있어서 모 서브틸리신 프로테아제에 의해 일어나는 면역원성 반응과 비교하여 감소된 면역원성 반응을 일으키는 서브틸리신 프로테아제 변이체의 제조방법으로, 상기 단백질을 면역학적 및 단백질화학적 방법을 이용하여 에피토프 맵핑하고, 에피토프들을 결정하고, 상기 에피토프중 적어도 하나를 상기 모 서브틸리신 프로테아제의 발현을 암호화하는 DNA 분자의 돌연변이이 또는 상기 변이체 서브틸리신 프로테아제의 발현을 암호화하는 DNA 분자의 합성을 통해 변화시키고, 상기 돌연변이된 또는 제조된 DNA 분자를 이어서 적합한 숙주내로의 형질전환 또는 트랜스펙션을 위한 기능적인 벡터로 삽입시키거나, 또는 상기 돌연변이된 또는 제조된 DNA 분자를 기능적으로 상기 숙주의 게놈에 통합시키고, 상기 단백질 변이체를 숙주에서 발현시키고 그리고 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모 서브틸리신 프로테아제는 서브틸리신 BPN′, 서브틸리신 아밀로사카리티쿠스, 서브틸리신 168, 서브틸리신 메센테리코펩티다제, 서브틸리신 칼스버거, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 309, 서브틸린신 147, 테르미타제, 아쿠알리신, 바실런스 PB2 프로테아제, 프로테인아제 K, 프로테아제 TW17 및 프로테아제 TW3에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 모 서브틸리신 프로테아제는 서브틸리신 309인 것을 특징으로 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 모 서브틸리신 프로테아제는 서브틸리신 147인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 모 서브틸리신 프로테아제는 서브틸리신 칼스버그인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 모 서브틸리신 프로테아제는 바실러스 PB92 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 모 서브틸리신 프로테아제에 비하여 면역학적 포텐셜이 변화되어 있는 서브틸리신 프로테아제 변이체로, 상기 프로테아제에서 위치 151, 174, 176, 193 및 196들중 하나 이상의 아미노산 잔기에 결실, 치환 또는 지시된 위치들에 인접한 삽입(단일 또는 다수)에 의해 변화가 이루어짐으로써 모 프로테아제에 비하여 감소된 면역학적 포텐셜을 갖고, 위치 151 174 176 193 및 196의 군으로부터 선택되는 하나의 위치에 있는 아미노산 잔기에 영향을 주는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제
  8. 제7항에 있어서, 위치 세트 : 36+209, 89+120, 136+170, 36_39, 89+235, 136+195, 181+222, 209+222 및 235+251의 군에서 선택되는 위치에 있는 아미노산 잔기들에 영향을 주는 하나 이상의 돌연변이 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
  9. 제7항 또는 제8항의 서브틸리신 프로테아제 변이체를 포함하는 세제 조성물.
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