NO310177B1 - Fremgangsmåte for å innkapsle en aktiv substans samt vedvarende frigivelsesmikro- eller nanopartikler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er innen området innkapsling av aktive substanser, f.eks. medikamenter, i biodegraderbare polymerer. Mer spesifikt, vedrører oppfinnelsen en ny fordelaktig innkapslingsmetode som er egnet for vannløselig så vel som vannuløselige aktive substanser og som gir svært aktive mikro- så vel som nanopartikler med høy inn-kapslingseffektivitet.

Innkapsling av materialer kan tilveiebringe fordelaktige egenskaper. For eksempel, kan medikamenter som er kapslet inn tilveiebringe økt stabilitet, lengre varighet for virkning og økt effektivitet. For letthets skyld, er medikamenter ofte innkapslet i faste materialer som har en størrelse egnet for injeksjon, som er generelt under 200 um i diameter, og prosessen refereres til som en mikroinnkapsling.

Mikroinnkapslingsprosedyrer kan gi mikrokapsler, mikrosfærer eller mikropartikler. Mikrokapsler består av en kjerne og et skjell som dekker kjernen. Kjernen kan sam-mensettes av andre polymerer enn skjellet eller av annet materiale, f.eks. av den aktive substansen i seg selv. Den aktive substansen blir generelt lokalisert til kjernen, men kan også lokaliseres til det ytre skjellet. Mikrosfærer er sfæriske i form og har en mer ho-mogen matriks. Mikropartikler er en mer generell betegnelse enn mikrosfærer ved at det ikke begrenset til sfæriske former. Noen ganger kan det være vanskelig å sjeldne mellom mikrokapsler, mikrosfærer og mikropartikler, og betegnelsen mikropartikler vil bli brukt heri med referanse til alle tre klassene.

Metodene for å fremstille mikropartikler innen teknikkens stand har blitt beskrevet ut-førlig i både patent- og den vitenskapelige litteraturen (se f.eks. Jalil R., Nixon JR. Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactide-co-glycolide) microcapsules: problems associated with preparative techniques and release properties. J. Microencapsul 1990, 7:297-325). De kan generelt bli klassifisert i tre typer, som er eksemplifisert under i sammenheng med fremstillingen av mikrosfærer av poly(laktid-ko-glykolid) (PLGA). PLGA er en vel akseptert polymer for fremstilling av vedvarende frigivelsesmikrosfærer og ofte det første valg for fremstilling av biokompatible mikrosfærer som har til hensikt å bli parenteralt administrert hos mennesker. Nevnte polymer er ikke løselig i vann. 1. Faseseparasjonsteknikker som bruker ko-opphopningsmidler midler eller ikke løs-ningsmidler, slik som mineraloljer og vegetabilske oljer. Den aktive substansen, f.eks. et polypeptid blir ført løst i den vandige fasen i en vann-i-oljeemulsjon. Polypeptidet kan også bli dispersert direkte i polymerfasen som et fint pulver. Polymeren blir presi-pitert enten rundt de vandige dråpene, eller på polypeptidpulveret, ved tilsetning av et ikke-løsningsmiddel for polymeren, slik som silikonolje. Deretter tilsettes et herdings-middel for å ekstrahere de organiske løsningsmidlene fra mikrosfærene. Hovedulempen med nevnte prosess er den store mengden av organisk løsningsmiddel som trengs for ekstraksjon og for vasking. De tidligere brukte herdingsmidler inkluderer freoner, hek-san, heptan, cykloheksan eller andre alkanløsningsmidler som etterlot substansielle mengder av herdingsmiddelrester i mikrosfærene og/eller nødvendiggjorde utstrakte prosedyrer for å fjerne løsningsmidlene. Ofte var det nødvendig med svært store mengder av det andre organiske løsningsmidlet og de er ofte uønskede av helse-, økonomi-og miljømessige grunner. Eksempler gjeldende kjent teknikk inkluderer heptan (EP 0 052 510), alifatiske fluorinerte og fluorohalogenerte hydrokarboner som selges som freoner (SE 462 780), og andre (US 5,000,886). En ytterligere ulempe når en bruker f.eks. et alkenherdingsløsningsmiddel er at de er brennbare. En annen ulempe er deres innvirkning på miljøet.

2. Spraytørking og sprayovertrekking

I spraytørking blir polymeren og medikamentet blandet sammen i et løsningsmiddel for polymeren. Løsningsmidlet blir deretter evaporert ved spraying av løsningen. Dette resulterer i polymere dråper som inneholder medikamentet. Imidlertid kan sensitive substanser, slik som proteiner, bli inakivert under prosessen på grunn av økte temperaturer som blir brukt og eksponering for organiske løsningsmidler/luftinterfaser. Ytterligere ulemper inkluderer dannelse av høy porøsitet på grunn av rask fjerning av det organiske løsningsmidlet. En variasjon som har blitt introdusert for å unngå disse tilkortkommen-heter er anvendelse av lav temperatur under mikrosfæredannelsen (US 5,019,400, WO 90/13780 og US 4,166,800). Mikrokapsler har blitt fremstilt ved å bruke spraybelegging av medikamentinneholdende mikropartikler med PLGA-polymerer (US 4,568,559).

3. Løsningsmiddelevaporering

I løsnmgsmiddelevaporeringsteknikker blir polymeren løst i et organisk løsningsmiddel som inneholder dispersert aktivt medikament, løsningen blir deretter tilsatt til en blandet vandig ytterfase som er ublandbar med polymeren. Den vandige ytterfasen inneholder vanligvis surfaktanter for å stabilisere olje-i-vann-emulsjonen og hindre agglomerering. Emulgeringsmidlet bruk er typisk polyvinylalkohol. Emulgeringsmidlet er inkludert i den vandige fasen for å stabilisere olje-i-vann-emulsjonen. Det organiske løsningsmid-let blir deretter evaporert i en periode på flere timer eller mer, for derved å størkne polymeren for å danne en polymermatriks. Løsningsmidlet kan også bli ekstrahert ved å tilsette den ovenfor nevnte suspensjonen til et stort volum av vann (US 5,407,609). Sluttformuleringen som blir brukt for farmasøytiske anvendelser, spesielt for parenteral administrering, skulle bestå av diskrete, ikke-agglomererte mikrosfærer med ønsket størrelsesdistribusjon og som ikke inneholder toksiske eller noen andre uønskede substanser. For å erverve fremstillinger som har disse karakteristika beskrevet over, er det nødvendig å anvende emuleringsmidler. Emulgeringsmidler kan tjene flere formål: (1) å assistere i å erverve korrekte dråpestørrelsesspredning av emulsjonen; (2) stabilisere olje-i-vann-emulsjonen for å unngå ko-opphopningsmidler av dråpene; og (3) forhindre de størknede mikrosfærene å feste seg til hverandre. Det mest vanlige emuleringsmidlet for å fremstille PLGA-mikrosfærer er polyvinylalkohol. Imidlertid, siden polyvinylalkohol står på listen i 1976-registeret av toksiske effekter av kjemiske substanser og også er implisert som karcinogent når det blir introdusert parenteralt til dyr ("Carcinogenic studies on Water-Soluble and Insoluble Macromolecules", Archives of Pathology, 67, 589-617, 1959), er det uønsket for farmasøytiske fremstillinger administrert ved injeksjon. Dette problemet har gjort at polyvinylalkohol er erstattet med andre emulgeringsmidler innen kjent teknikk, f.eks. i US 4,384,975, hvori karboksylsyresaltsurfaktant, f.eks. natriumoleat blir brukt for å stabilisere en olje-i-vann-emulsjon. Imidlertid, på tross av dets ulemper er polyvinylalkohol fortsatt den mest brukt surfaktanten. Imidlertid, for de ovenfor nevnte grunnene, vil det være svært ønskelig å unngå anvendelse av polyvinylalkohol og andre surfaktanter i mikrosfærefremstillinger.

Løsningsmiddelevaporering virker godt for hydrofobe medikamenter, men for hydrofile medikamenter slik som mange peptider og proteiner, kan mengden av inkorporert medikament bli lav på grunn av tap av medikament i den vandige fasen som blir brukt for å ekstrahere det organiske løsningsmidlet. Forsøk på å omgå dette problemet inkluderer modifisering av det hydrofile medikamentet inn i en mindre løsbar form (WO 96/07399) som øker viskositeten av den indre vandige løsningen som inneholder det aktive medikamentet i en prosess hvor en vann-i-olje-emulsjon først blir dannet og det organiske løsningsmidlet deretter ekstrahert med vann (US 4,652,441) og derved redusere tiden som er tilgjengelig for diffusjon (US 5,407,609).

Anvendelse av vanlige anvendte organiske løsningsmidler, som metylenklorid eller

etylacetat, resulterer ofte i tap av biologisk aktivitet for sensitive medikamenter. Derfor, f.eks. for proteiner, hvor den tredimensjonale konformasjonen er påkrevet for biologisk aktivitet går ofte tap. Forsøk på å omgå dette problemet inkluderer modifisering av den aktive substansen inn i en mer stabil form (US 5,654,010 og WO 96/40074) som holder temperaturen så lav som mulig under prosessen (WO 90/13780) og ved å bruke forskjellige projeinstabilisatorer (US 5,589,167, Cleland JL, Jones AJS, "Development of

stable protein formulations for microencapsulation in biodegradable polymers". Procee-dings of the International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials 1995; 22:514-5). Imidlertid er proteiner generelt sensitive for organiske løsningsmidler og reduksjon eller eliminering av eksponeringen er svært ønskelig.

En annen ulempe med løsningsmiddelevaporeringsmetoden er behovet for anvendelse av blanding med høy skjæreeffekt for å erverve små mikrosfærer eller nanosfærer. Dette kan resultere i degradering eller konformasjonsendringer i den aktive substansen, spesielt hvis det er et protein som er avhengig av tredimensjonal konformasjon for dets biologiske aktivitet. Anvendelse av blanding med høy skjæreeffekt er også energikrevende.

I samsvar med kjent teknikk kan det også tilføyes at prosesser for å fremstille mikrosfærer fra polymerer løselige i vann er kjent fra f.eks. US 4,822,535 og US 5,578,709.1 nevnte prosesser blir to gjensidig ikke blandbare vandige flytende faser brukt, hvor en størknes til mikrosfærer. Imidlertid, som nevnt, kan disse metodene ikke bli brukt for fremstilling av mikrosfærer fra polymerer som ikke kan løses i vann.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny metode for innkapsling av aktive substanser i biodegraderbare polymerer hvorved kjent teknikks ulemper er eliminert eller idet minste vesentlig redusert. For eksempel, gjør oppfinnelsen det mulig å erverve høy in-korporeringseffektivitet av den aktive substansen i den biodegraderbar polymer og/eller å fremstille mindre mikropartikler eller til og med nanopartikler som inneholder høy aktive doser av de aktive substansene. Videre, er mengden av organiske løsningsmidler svært redusert. Sammenlignet med tidligere brukte metoder muliggjør også oppfinnelsen en reduksjon av energiinnskudd som kreves for å erverve mikro- eller nanopartikler.

En hensikt med oppfinnelsen er å tilveiebringe en metode for å fremstille kontrollerte eller vedvarende frigivelsespartikler som har en høy innkapsling av vannløselige substanser, f.eks. sensitive medikamenter, uten anvendelse av store volum av organiske løsningsmidler.

Et annet formål er å tilveiebringe en metode hvori kun lavenergiblanding blir utnyttet, som også er fordelaktig sammen med sensitive substanser.

Et annet formål er å tilveiebringe en metode hvorved små partikkelstørrelser, slik som mikro- eller til og med nanostørrelsespartikler kan erverves på en enkel måte.

Et annet formål er å tilveiebringe en metode hvorved kravet for å anvende PVA og andre surfaktanter blir eliminert.

Andre formål av oppfinnelsen skulle være tydelig for en person som kjenner fagfeltet når vedkommende leser beskrivelsen over og under.

Mer spesifikt vedrører foreliggende oppfinnelse en metode for å innkapsle en aktiv substans i en biodegraderbar polymer, hvis metode omfatter: a) å løse nevnte biodegraderbare polymer i et organisk løsningsmiddel; bi) dispergere nevnte aktive substans i den organiske løsningen ervervet i trinn a), for å tilveiebringe en dispersjon med den aktive substansen som den indre fase derav; eller alternativt b2) emulgere nevnte aktive substans, løst i vann eller annet vandig løsningsmiddel, i den organiske løsningen ervervet i trinn a), for å tilveiebringe en emulsjon med den substansen som den indre vandige fasen; og c) utsette dispersjonen ervervet i trinn bi), eller alternativt emulsjonen ervervet i trinn b2), til en innkapslingsbehandling med en vandig polyetylenglykolløsning som en kontinuerlig fase, for å erverve mikro- eller nanopartikler som har den aktive substansen kapslet deri.

Derfor, ifølge et aspekt av oppfinnelsen, blir det tilveiebragt en enkel metode for å fremstille mikro- eller nanopartikler som inneholder et sensitivt biologisk aktivt materiale, f.eks. et protein, mens man bruker minimale mengder av organisk løsningsmiddel. Det er overraskende blitt funnet mulig å erstatte det normalt brukte organiske løsnings-midlet som den kontinuerlige eller ekstraksjonsfasen med en vandig løsning av ikke-toksisk og farmasøytisk akseptabel polymer polyetylenglykol (polyetylenoksid) som en kontinuerlig fase og som et ektraksjonsmedium.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også vedvarende frigivelsesmikro- eller nanopartikler, kjennetegnet ved at de inneholder en aktiv substans innkapslet i en biodegradebar polymer, ervervet ved en metode som nevnt ovenfor.

Det er også blitt funnet at opptak av aktiv ingrediens inn i partiklene kan merkbart for-bedre nevnte anvendelse av polyetylenglykol i vann eller annet vandig løsningsmiddel som ytre (ekstern) fase. Anvendelse av løsningsmiddelevaporeringsteknikker med en vandig ytre fase resulterer ofte i dårlig innkapsling siden vandige løselige polypeptider blir distribuert også til den eksterne fasen, spesielt når små mikrosfærer er ervervet. Med den foreliggende oppfinnelse kan høy ladning kombinert med liten partikkelstør-relse erverves forutsatt at konsentrasjonen av polyetylenglykol, og andre betingelser, blir kontrollert slik at den aktive substansen ikke blir distribuert til den eksterne fasen.

Mikropartiklene kan lett bli vasket og renset med vann. Dette er en fordel sammenlignet med faseseparasjonsteknikk hvor store mengder av organiske løsningsmidler blir brukt. Andre overraskende funn i samsvar med anvendelse av polyetylenglykoL/vandig løs-ningsmiddel som ytre fase er at små størrelsespartikler erverves selv ved lav blandings-kraft og at ingen surfaktanter behøves.

De ervervede mikropartiklene er vel egnet for vedvarende frigivelsesformål og er spesielt tilpasset oral og parenteral administrering. Når den blir fremstilt med størrelser og diametere som er mindre enn 10 um, og fortrinnsvis 0,5-3 um, er de også egnet for nasal og lungeadministrering for å tilveiebringe enten lokal eller systemisk effekt.

I tillegg til de uventede funnene referert ovenfor, skal det også bemerkes at polyetylenglykol (PEG) er tidligere kjent per se å ha unike egenskaper for forskjellige biotekniske og biomedisinske anvendelser, som gjør den foreliggende oppfinnelse mer fordelaktig for biotekniske og biomedisinske anvendelser.

Disse unike egenskapene er f.eks. gjengitt i Harris, J.M. (red.) Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications. 1992, Plenum Press, New York.

PEG har unike egenskaper og er svært viktig for dets anvendelse i forskjellige biotekniske og biomedisinske anvendelser. En av disse er dets utmerkede effektivitet i å eks-kludere andre polymerer fra volumet den okkuperer i den vannløsning, som har blitt utnyttet for å erverve avvisning av proteiner, f.eks. i liposomer og små partikler med lang sirkulasjonstid etter intravenøs injeksjon, åpen overfor biologiske materialer, ikke-immunogenisitet og ikke-antigenisitet. En annen er dannelse av vandige tofasesystemer med andre polymerer (Per Åke Albertsson, Partition of cell particles of biomolecules, cell organelles, membranes, and cels in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. 3. utgave, 1986, John Siley & Sons). PEG er et ikke-toksisk og generelt ufarlig for proteiner og celler. Av de mange anvendelser av PEG kan det nevnes: (1) som et ko-oppløsningsmiddel for noen medikamenter for injeksjon, (2) som en volumekskluderer for å øke konsentrasjonen av f.eks. proteiner for å indusere krystallisering, (3) som en del av vandige to-fasesystemer brukt f.eks. for rensing av biologiske materialer under milde betingelser, (4) induksjon av cellefusjon for å erverve f.eks. hybridomer brukt for produksjon av monoklonale antistoffer, (5) dekke overflaten til f.eks. liposomer og nanopartikler for å øke deres tilstedeværelsestid i sirkulasjonen, og (6) kovalent binding av PEG til proteiner for å erverve konjugater som fortsatt er biologisk aktive, men ikke lenger immunogene og antigene; slike PEG-proteinaddukter har blitt godkjent for parenteralt bruk i mennesker.

PEG blir også noen ganger referert til som poly(etylenoksid) PEO, poly(oksyetylen) og polyoksiran. I generell anvendelse, refereres poly(etylenglykol) seg til molekylvekter mellom 20 000 og poly(etylen)oksid refererer seg til høyere molekylvektspolymerer. Med andre ord, betegnelsen polyetylenglykol som blir brukt sammen med oppfinnelsen dekker altså poly(oksyetylen) og polyoksiran.

Disse formålene så vel som andre formål og fordeler av den foreliggende oppfinnelse vil være tydelig for de som kjenner fagfeltet fra beskrivelsen som følger under.

De aktive substansene som blir brukt i metoden fra oppfinnelsen er fortrinnsvis biologisk aktive substanser, f.eks. medikamenter, slik som proteiner, peptider, polypeptider, polynukleotider, oligonukleotider, plasmider eller DNA. Eksempler på proteinmedikamenter er veksthormon, erytropoietin, interferon (a, 6, y-typen), vaksiner, epidermal vekstfaktor og faktor VIII. Eksempler på peptidmedikamenter er LHRH-analoger, insulin, somatostatin, kalcintonin, vasopressin og dets derivater.

I tilfelle av proteiner kan de også være i kompleks med forskjellige substanser, f.eks.

metaller, aminosyrer, salter, syrer, baser og aminer, for å minske løseligheten eller øke stabiliteten. De kan ytterligere fremstilt i form av et promedikament eller PEG kan bin-des f.eks. til proteinene for å øke løselighet eller stabilitet, modifisere farmakokinetikk eller redusere immunogenitet.

Eksempler på ikke-proteinmedikamenter som er egnet for anvendelse i metoden for oppfinnelsen kan finnes f.eks. i følgende grupper: anti-tumormidler, antibiotika, anti-flammatoriske mmidler, antihistaminer, sedativer, muskelavslapningsmidler, antiepileptiske midler, antidepressiva, antiallergiske midler, bronkoutvidere, kardiotonikum, antiarrytmiske midler, vasodilatorere, antidiabetiske midler, antikoagulanter, hemostatika, narkotiske midler og steroider.

De aktive substansene som kan kapsles inn i samsvar med metoden som kreves er, imidlertid, ikke begrenset til biologisk aktive substanser, ikke-biologiske substanser kan kapsles inn, f.eks. pesticider, dufter, smaksmidler, katalysatorer og herbicider.

Den korrekte mengden av aktiv substans som blir innkapslet er avhengig av type av substans, varighet og ønsket effekt, og blir selvfølgelig kontrollert til en mengde som i hvert spesifikt tilfelle blir kapslet inn ved metoden ifølge oppfinnelsen. Generelt blir nevnte mengder valgt innen området på omtrent 0,001% til 90%, fortrinnsvis omtrent 0,01 til 70%), mest foretrukket omtrent 0,1 til 45% og mest foretrukket omtrent 0,1 til 40%, hvor nevnte prosenter ved vekt er basert på vekten av de endelige partiklene.

I tilfellet av et medikament kan substansen bli brukt per se eller i form av et farmasøy-tisk salt. Når medikamentet har en basisk gruppe, slik som aminogrupper, kan den danne salter med karbonsyre, saltsyre, svovelsyre, eddiksyre, sitronsyre, metansulfonsyre eller dets like. Når medikamentet har en sur gruppe, slik som en karboksylgruppe, kan det danne salter med metaller (f.eks. Ca2+, Zn2+), organiske aminer (f.eks. etanolamin) eller basiske aminosyrer (f.eks. arginin). Medikamentet kan ytterligere presipitere ved å bruke forskjellige metoder, eventuelt etterfulgt av størrelsesreduksjon, slik som presipi-tering med divalente metaller (f.eks. Ca<2+>, Zn<2+>). Medikamentet kan også bli krystalli-sert.

Den biodegraderbare polymeren som kan brukes i den foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til noe spesifikt materiale som lenge den kan bli løst i et organisk løsnings-middel og er litt løselig eller uløselig i den ytre fasen, f.eks. poly(etylenglykol)/vandig fase og er på annen måte egnet for fremstilling av vedvarende frigivelsesmikro- eller nanopartikler.

Fortrinnsvis har den biodegraderbare polymeren som blir brukt i metoden som kreves en gjennomsnitts molekylvekt inneholdende fra omtrent 2 000 til 200 000, mer foretrukket omtrent 2 000 til 110 000.

Eksempler på biodegraderbare polymerer er polyestere, poly-B-hydroksysmørsyre, po-lyhydroksyvalerinsyre, polykaprolaceton, polyesteramider, polycyanoakrylater, poly-(aminosyrer), polykarbonater og polyanhydrider.

En foretrukket biodegraderbar polymer er en alifatisk polyester, f.eks. homo- eller kopolymerer fremstilt fra a-hydroksysyrer, fortrinnsvis melkesyre og glykolsyre, og/eller cykliske dimerer av a-hydroksysyrer, fortrinnsvis laktider og glykolider.

Når melkesyre/glykolsyre blir brukt som de ovenfor nevnte polymerer, blir sammensetningen eller vektforholdet (poly)melkesyre/(poly)glykolsyre fortrinnsvis omtrent 99/1 til 35/65, mer foretrukket 95/5 til 50/50. De kan bli brukt i form av en kopolymer eller en blanding av disse to eller flere polymerer. Den eksakte sammensetningen av polymeren avhenger av den ønskede frigivelseskinetikken, spesielt varigheten for frigivelse.

Det organiske løsningsmidlet brukt i trinn A kan være et hvert løsningsmiddel som er i stand til å danne en emulsjon med en vann/PEG-blanding, som kan bli fjernet fra olje-dråpene gjennom nevnte vann/PEG-blanding og er i stand å oppløse den biodegraderbare polymeren. Med andre ord, bør løsningsmidlet ikke være blandbart eller idet vesentlige ikke blandbar, eller meget svakt, løselig i nevnte vann/PEG-blanding. Eksempler på egnede løsningsmidler er etylacetat, diklormetan, metyletylketon og metylisobutylketon. Disse løsningsmidlene kan bli brukt alene eller i kombinasjoner.

Den indre vandige fasen kan inneholde midler for å kontrollere stabiliteten og, hvis ønskelig, løseligheten av den biologiske aktive substansen. Slike midler kan være pH-kontrollerende midler og stabilisatorer for medikamenter eller andre aktive substanser.

Som det kan forstås fra det som er nevnt over, kan metoden ifølge oppfinnelsen bli utnyttet for å innkapsle vannløselig, så vel som vannuløselige aktive substanser.

Eksempler på utførelsesformer av disse to tilfellene vil nå bli presentert under.

Innkapslingsmetoden, som eksemplifisert ved et vannløselig medikament, slik som et peptid eller proteinmedikament kan inneholde følgende trinn. Medikamentløsningen kan fremstilles på enhver konvensjonell måte og eventuelt ved å bruke pH-kontroller-ende eller medikamentstabiliserende midler. Denne vandige løsningen av medikamentet, som skal danne den indre vandige fasen, blir heilt opp til en ekstern (olje)- fase som inneholder en biodegraderbar polymer løst i et egnet organisk løsningsmiddel og blandingen blir emulgert for å tilveiebringe en W/O-emulsjon. Emulgeringsmidlet kan fremstilles ved å bruke konvensjonell emulgeringsteknikker, slik som propellblanding, tur-binblanding, ultrasonikering eller anvendelse av statiske blandere.

Hvis den aktive substansen skal disperseres direkte i polymerløsningen, uten å løses i vann, skal medikamentet ha en egnet partikkelstørrelse. En egnet partikkelstørrelse er omtrent 0,5-20 um, fortrinnsvis 0,5-10 um, slik som 0,5-3 um. Ellers, kan disperse-ringstrinnet bli utført som beskrevet over for emulgeringstrinnet.

Den resulterende W/O-emulsjon/dispersjonen blir deretter utsatt for en innkapslingsbehandling. W/O-emulsjon/dispersjonen blir tilsatt til en vandig løsning som inneholder polyetylenglykol. Polyetylenglykol/vandig løsning blir omrørt under tilsetning av den aktive substansen/polymerløsningen. W/O-emulsjon/dispersjonen kan også bli blandet med polyetylenglykolløsninger ved å bruke bevegelsesløs blander.

Typisk er molekylvekten på polyetylenglykol innenfor området på omtrent 1 000 til 40 000 Da, fortrinnsvis 5 000 til 35 000 Da, avhengig av nevnte molekylvekt, og egenskapene til substansen som skal innkapsles, er konsentrasjonen av polyetylenglykol kontrollert innenfor området av 20-80% (vekt/vekt), fortrinnsvis 20-60%> (vekt/vekt), slik som 30-55% (vekt/vekt) eller 30-50% (vekt/vekt). Med andre ord, blir en relativt høy PEG-konsentrasjon brukt i den ytre fasen, for å erverve en stabil emulsjon og for å hindre diffusjon av aktiv ingrediens fra dråpene/partiklene. Bestemmelsen av den opti-male konsentrasjonen kan bli utført ved eksperimentering som er relativt rett frem for de som kjenner fagfeltet.

Partiklene som dermed blir dannet blir generelt samlet ved sentrifugering eller filtrering og renset med destillert vann eller egnede vandige buffer, flere ganger for å fjerne over-skudd av polyetylenglykol fra overflatene. For å hindre aggregering under vaskingen og tørkeprosedyrene, kan mannitol, Tween 80, eller andre egnede substanser, bli tilsatt til skyllevannet. Partiklene som derved erverves kan deretter bli tørket på konvensjonelle måter, f.eks. i vakuum eller ved en strøm av nitrogengass eller ved lyofilisering eller luftsuspensj onstørking.

Partikkelstørrelsene til partiklene ervervet ved oppfinnelsen er avhengig av den ønskede anvendelsen av nevnte partikler som er vel kjent innen dette tekniske området.

Derfor, når partiklene skal anvendes for injeksjon, bør partikkelstørrelsen tilfredsstille dispersibilitet og nålepassasjekrav. Videre, kan partiklene bli håndtert eller behandlet med enhver måte som er tidligere kjent for en person som kjenner fagfeltet. Derfor, kan en kontrollert frigivende injiserbar fremstilling av nevnte partikler, f.eks. bli dispersert med en suspenderingsmiddel, som inneholder f.eks. mannitol, polysorbat 80, eller natri-umkarboksymetylcellulose.

Andre utførelsesformer av metoden ifølge oppfinnelsen er definert i underkravene eller i eksemplene som presenteres under.

Ifølge et annet aspekt av oppfinnelsen blir det også tilveiebragt opprettholdelsesfrigivel-sesmikro- eller nanoparitkler per se som inneholder en aktiv substans innkapslet i et biodegraderbart materiale, hvis partikler er ervervet ved en metode som er krevet i et hvert av metodekravene.

Derfor, er foretrukne utførelsesformer derav de samme som de utførelsesformene som er beskrevet sammen med metoden. Spesielt foretrukket er, imidlertid, partikler som er tilpasset for oral, parenteral, nasal eller pulmonal administrering av den aktive substansen.

Videre, for fremstilling av farmasøytiske fremstillinger for oral administrering, mikrosfærene fremstilt ved metoden som beskrevet kan bli formulert med en eksipient (f.eks. laktose, sukrose, stivelse, etc.), en disintegrant (f.eks. stivelse, kalsiumkarbonat, etc), en binder (f.eks. stivelse, arabisk gummi, karboksymetylcellulose, polyvinylpyr-rolidon, etc.) og/eller et smøremiddel (f.eks. talkum, magnesiumstearat, polyetylenglykol, etc.) og den resulterende sammensetningen kan kompressjonsstøpes på konvensjonell måte. Partiklene kan også fylles i gelatinkapsler.

FIGURER

I de vedlagte tegningsfigurene er resultatene av in vitro-frigivelsestestene presentert for partikler ervervet med metoden fra foreliggende oppfinnelse så vel som partikler ervervet i samsvar med kjent teknikk.

Fremstillingene av nevnte partikler og testmetoden er beskrevet i eksempel 1-5 og resultatene er presentert som kumulativ frigivelse i % versus tid i dager.

I denne sammenheng, skal det også tillegges at frigivelsesprofilen kan kontrolleres ved faktorer vel kjent for en fagperson, f.eks. sammensetningen av polymer brukt for innkapsling av det aktive materialet, løseligheten av materialet, tilsetning av substanser som innvirker på løseligheten av det aktive materialet og/eller degradering av polymeren, mengden av aktivt materiale i mikropartiklene og størrelsen på mikropartiklene.

EKSEMPEL 1

Følgende prosedyre ble brukt for å innkapsle bovint serumalbumin (BSA) i PLGA (po-ly(DL-laktid-ko-glykolid)). Først ble en polymerløsning fremstilt ved å oppløse 0,47 g PLGA (RG504H, Boehringer Ingelheim) i 3 ml etylacetat i et testrør. Deretter, ble 44 mg BSA, (bovint serumalbumin; Sigma A-0281) oppløst i 300 ul av 10 mM Na-fosfatbuffer pH 6,4. BSA-oppløsningen ble tilsatt til polymerløsningen og BSA ble ho-mogent dispersert i polymerløsningen ved vortekssentrifugering (VF2, IKA-WERK) i 1 minutt. Dispersjonen ble plassert i en 5 ml sprøyte med en 18 G nål.

Et 500 ml beger som inneholdt 300 ml av 40% (vekt/vekt) polyetylenglykol 20000 ble tilpasset med en 4-bladet propellomrører. BSA/polymerdispersjonen ble overført til be-geret med en langsom injeksjon av BSA/polymerdispersjonen i PEG-løsningen. Omrø-ringshastigheten ble deretter redusert og blandingen fikk stå over natt.

Omrøringshastigheten ble igjen satt på 8 og deretter ble 400 ml deionisert vann tilsatt for å redusere viskositeten for å kunne gjennomføre en filtrering. Suspensjonen ble deretter filtrert ved å bruke Millipore-membranfilter, Type DV, porestørrelse 0,65 um, vasket med vann (3 x 300 ml) og tørket i vakuum over natt.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 10-50 um og inneholdt 6,3% av BSA (vekt/vekt).

De resulterende mikropartiklene ble deretter utsatt for en in vitro-frigjørelsestest i 30 mM natriumfosfat pH 7,4 ved 37°C, med periodevis agitering. Studiene ble utført ved å suspendere 40 mg av mikrosfærer i 1,5 ml buffer. Ved spesifikke tidspunkter, ble 1 ml av bufferen tatt ut og erstattet med fersk buffer. Resultatene er vist i figur 1. Opprettholdt frigivelse av BSA ble oppnådd i 28 dager som vist i figur 1.

EKSEMPEL 2

Den samme prosedyren ble utført som i eksempel 1, med unntak av at 2% (vekt/vekt) polyvinylalkohol (PVA, mw = 22000, Fluka) i vann ble brukt isteden for polyetylengly-kolløsning.

De resulterende mikrosfærene hadde en partikkeldiameter på 1-2 mm og inneholdt 7,0% BSA. En in vitro-frigivelsestest ble utført som i eksempel 1 og resultatene er vist i figur 1. Opprettholdt frigivelse i omtrent 2 dager ble oppnådd med denne formuleringen. Den store størrelsen ville ikke ha tillatt injeksjon ved å bruke akseptable nåler.

EKSEMPEL 3

Den samme prosedyren ble utført som i eksempel 1, med unntak av at en Ystral-homogenisator ble brukt isteden for nevnte omrører når man tilsatt BSA/polymerdispersjonen. Etter tilsetning av BSA/polymerdispersjonen ble homogeni-sereren erstattet med en 4-bladet propellomrører.

De resulterende mikrosfærene hadde en partikkeldiameter på 1-5 um og inneholdt 5,5% BSA. En in vitro-frigivelsestest ble utført som i eksempel 1 og resultatene er vist i figur 1.

EKSEMPEL 4

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 2, med unntak av at Ystral-homogenisa-toren ble brukt isteden for en omrører, når man tilsatt BSA/polymerdispersjonen.

De resulterende mikrosfærene hadde en gjennomsnittspartikkeldiameter på 10-40 um og inneholdt 5,8% BSA. En in vitro-frigivelsestest ble utført som i eksempel 1 og resultatene er vist i figur 1. Lignende løsningsprofiler ble ervervet for fremstillingene i eksemplene 3 og 4 selv om størrelsen på partikkelen i eksempel 3 var mye mindre.

EKSEMPEL 5

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 1, med unntak av at ultrasonisk bad (Trans-sonic 470/H, Eima) ble anvendt etter vortekssentirfugeringen, for å erverve en finere vann-i-olje-emulsjon. BSA/polymerdispersjonen ble sonikert i 1 minutt.

De resulterende mikrosfærene hadde en gjennomsnittspartikkeldiameter på 10-50 um og inneholdt 6,8% BSA. En in vitro-test ble utført som i eksempel 1 og resultaltene er vist i figur 1. Opprettholdt frigivelse i 28 dager ble oppnådd. Dette viser at en mer effektiv emulgering av den indre vandige fasen resulterer i en lavere rask initieringsfrigivelse (burst) under de første dagene.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av BSA- ladede mikrosfærer

Den følgende fremgangsmåte ble anvendt for å innkapsle bovint serumalbumin (BSA) i PLGA-mikrosfærer.

Først ble en polymeroppløsning fremstilt ved oppløsning av 0,126 g polymer (Resomer 504H, Boehringer Ingelheim) med 0,734 etylacetat i et testrør. Deretter ble 15 mg BSA (Sigma A-0281) oppløst i 100 ul av 10 mM natriumfosfat pH 6,4.

BSA-oppløsningen ble blandet med polymeroppløsningen ved vorteksblanding (VF2, IKA-WERK) i 1 minutt. Løsningen ble tatt opp i en 2 ml sprøyte med en 21G nål. Et 200 ml beger som inneholdt 50 ml av 40% (vekt/vekt) polyetylenglykol 20000 ble tilpasset med en 4 bladet propellomrører. BSA/polymerdispersjonen ble langsomt injisert inn i PEG-løsningen under omrøring ved 240 rpm. Omrøringshastigheten ble økt til 400 rpm i 10 sekunder, deretter var omrøringshastigheten 60 rpm i 1 minutt. Blandingen fikk stå uten omrøring i 4 timer.

200 ml vann ble deretter tilsatt før filtrering. Mikrosfæresuspensjonen ble filtrert ved å bruke et Millipore membranfilter, type DV, porestørrelse 0,65 um, vasket med vann og deretter frysetørket over natt.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 10-50 um og inneholdt 9,7% BSA (92% utbytte).

EKSEMPEL 7

Fremstilling av laktoglobulinlastede mikrosfærer

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 6, med unntak av at 15 mg laktoglobulin (Sigma L-0130) i 100 ul 10 mM natriumfosfat pH 6,4 ble brukt for innkapsling.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 10-100 um og inneholdt 9,9% av laktoglobulin (93% utbytte).

EKSEMPEL 8

Fremstilling av triptorelinlastede mikrosfærer

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 6, med unntak av at 15 mg triptorelinpamo-at (Bachem) ble emulgert direkte i polymerløsningen ved vortekssentrifugering i 1 minutt. Partikkelstørrelsen til triptorelinpartiklene var omkring 2-4 um.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 20-100 um og inneholdt 6,3% av triptorelin (59% utbytte).

EKSEMPEL 9

Fremstillin<g> av desmopressinlastede mikrosfærer

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 6, med unntak av at 15 ml desmopressina-cetat i 100 ^110 mM natriumfosfat pH 6,4 ble brukt for innkapsling.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 10-50 um og inneholdt 8,3% av desmopressin (78% utbytte).

EKSEMPEL 10

Fremstilling av insulinlastede mikrosfærer

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 6, med unntak av at 15 mg insulin (Sigma 1-5500) ble emulgert direkte i polymerløsningen ved vortekssentrifugering i 1 minutt. Partikkelstørrelsen på insulinpartiklene var omtrent 5-10 um.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 10-50 um og inneholdt 9,3% av insulin (88% utbytte).

EKSEMPEL 11

Fremstilling av DNA- lastede mikrosfærer

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 6, med unntak av at 100 ul av sildesperm-DNA (Promega) (10 mg/ml) ble brukt for innkapsling.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske med en partikkeldiameter på 10-50 nm og inneholdt 0,07% av DNA (10% utbytte).

EKSEMPEL 12

Fremstilling av bovint serumalbumin i 50% PEG lOk

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 6, med unntak av at 50% av PEG 10k ble brukt som ekstern fase.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske og inneholdt 1,77% BSA. Dette skal sammenlignes med 6,3% i eksempel 1.

EKSEMPEL 13

Fremstilling av bovint serumalbumin i 30% PEG 35k

Samme prosedyre ble utført som i eksempel 1, med unntak av at 30% PEG 35k ble brukt som ekstern fase.

De resulterende mikropartiklene var sfæriske og inneholdt 5,42% BSA. Dette bør sammenlignes med en kjernelasting på 6,3% i eksempel 1.

Claims (22)

1. Fremgangsmåte for å innkapsle en aktiv substans i en biodegraderbar polymer, karakterisert ved at den omfatter: a) å løse nevnte biodegraderbare polymer i et organisk løsningsmiddel; bi) dispergere nevnte aktive substans i den organiske løsningen ervervet i trinn a), for å tilveiebringe en dispersjon med den aktive substansen som den indre fase derav; eller alternativt b2) emulgere nevnte aktive substans, løst i vann eller annet vandig løsningsmiddel, i den organiske løsningen ervervet i trinn a), for å tilveiebringe en emulsjon med den aktive substansen som i den indre vandige fasen; og c) utsette dispersjonen ervervet i trinn bi), eller alternativt emulsjonen ervervet i trinn b2), til en innkapslingsoperasjon med en vandig polyetylenglykolløsning som en kontinuerlig fase, slik at mikro- eller nanopartikler som har den aktive substansen kapslet inn erverves.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroinnkapslingsoperasjonen i trinn c) blir utført ved tilstedeværelse av en vandig po-lyetylenglykolløsning som har en polyetylenglykolkonsentrasjon innen området 20-80% (vekt/vekt), fortrinnsvis 20-60% (vekt/vekt), slik som 30-55% (vekt/vekt) eller 30-50% (vekt/vekt).

3. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at polyetylenglykol har en molekylvekt på 1000 til 40000 Da, fortrinnsvis 5000 til 35000 Da.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1, 2 og 3, karakterisert ved at innkapslingsoperasjonen i trinn c) blir utført ved å tilsette dispersjonen ervervet i trinn bi), eller alternativt emulsjonen ervervet i trinn b2), til nevnte vandige polyetylenglykolløsning mens sistnevnte vandige løsning utsettes for omrøring og/eller homogeniseringsoperasjon.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at omrøringen og/eller homogeniseringsoperasjonen blir utført ved lav intensitet og/eller lav energiprosess, f.eks. propellblanding eller anvendelse av bevegelsesløs blander.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte innkapslingsoperasjon i trinn c) ble utført ved fravær av surfaktant.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte biodegraderbare polymer er uløselig, eller noe løselig, i vandig polyetylenglykoløsning brukt i trinn c), fortrinnsvis en alifatisk polyester.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte biodegraderbare polymer har en molekylgjen-nomsnittsvekt i området på 2000 til 200000, fortrinnsvis 2000 til 110000.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte biodegraderbare polymer er selektert fra homo-eller kopolymerer fremstilt fra a-hydroksysyre, fortrinnsvis melkesyre og glykolsyre, og/eller cykliske dimerer fra a-hydroksysyrer, fortrinnsvis laktider og glykolider.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved en kopolymer av melkesyre/glykolsyre eller en blanding av polymelkesyre/polyglykolsyre blir brukt som nevnte biodegradebare polymer, vektforholdet av (poly)melkesyre/- (poly)glykolsyre som er innenfor området på 99/1 til 35/65, fortrinnsvis 95/5 til 50/50.

11. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte organiske løsningsmiddel brukt i trinn a) ikke er blandbart eller idet vesentlige ikke blandbart med nevnte vandige polyetylenglykolløs-ning brukt i trinn c), men lite eller svært lite løselig deri, og i stand til å løse nevnte biodegraderbare polymer, og er fortrinnsvis selektert fra etylacetat, diklormetan, metyletylketon og/eller metylisobutylketon.

12. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den aktive substansen som blir dispergert i trinn bi) har en partikkelstørrelse innenfor området på 0,5 til 20 um, fortrinnsvis 0,5-10 um, mer foretrukket 0,5-3 um.

13. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte aktive substans er en biologisk aktive substans, som fortrinnsvis blir selektert fra proteiner, (poly)peptider, (poly)nukleotider, plasmider og DNA.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte biologiske aktive substans er selektert fra veksthormon, erytropoiktin, interferon (a,6,y-typen), vaksine, epidermal vekstfaktor, faktor VIII, LHRH-analog, insulin, mak-rofagkolonistimulerende faktor, granulocyttkolonistimulerende faktor og interleukin.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, karakterisert ved at nevnte aktive substans er en biologisk aktive substans i form av et ikke-proteinmedikament selektert fra følgende grupper: anti-tumormidler, antibiotika, anti-inflammatoriske midler, antihistaminer, sedativer, muskelavslapningsmidler, antiepileptiske midler, antidepressiva, antiallergene midler, bronkoutvidere, kardiotonikum, antiarrytmiske midler, vasodilatorer, antidiabetiske midler, antikoagulanter, hemostatika, narkotiske midler og steroider.

16. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, karakterisert ved at den aktive substansen er en ikke-biologisk substans, som fortrinnsvis blir selektert fra pesticid, duft (fragrance), smaksmidler, katalysator og herbi-cid.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at mengden av den aktive substans er i området 0,001% til 90%, fortrinnsvis 0,01% til 70%, mer foretrukket omtrent 0,1 til 45%, og mest foretrukket 0,1 til 40%, hvor nevnte prosent er vektbasert på vekten av sluttpartiklene.

18. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at partiklene ervervet i trinn c) er separert fra nevnte kontinuerlige fase, fortrinnsvis ved sentrifugering eller filtrering etterfulgt av rensing med vann eller annet vandig medium, og tørket eller tillatt å tørke, f.eks. i et vakuum, ved tilstedeværelse av en nitrogengasstrøm, ved lyofilisering og luftsuspensjonstørking.

19. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de foregående krav, karakterisert ved at trinn c) blir utført slik at partiklene ervervet er mikrosfærer eller kapsler eller nanosfærer eller kapsler.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte partikler har en gjennomsnittsstørrelse i området fra 10-200 nm, fortrinnsvis 20-100 um.

21. Vedvarende frigivelsesmikro- eller nanopartikler, karakterisert ved at de inneholder en aktiv substans innkapslet i en biodegradebar polymer, ervervet ved en metode ifølge et hvert av kravene 1-20.

22. Partikler ifølge krav 21, karakterisert ved at de er egnet for parenteral, nasal, pulmonal eller oral administrering av nevnte aktive substans.