JP2003512816A - ヒト前立腺癌関連遺伝子配列およびポリペプチド - Google Patents

ヒト前立腺癌関連遺伝子配列およびポリペプチド

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規に同定された前立腺または前立腺癌関連のポリヌクレオチド、および「前立腺癌抗原」として本明細書中で集合的にわかるこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関し、そしてこれらに関連する完全な遺伝子配列に関し、そしてそれらの発現産物、ならびにこのような前立腺癌抗原の、前立腺の障害、特に前立腺癌の存在の検出、予防および処置のための使用に関する。本発明は、前立腺癌抗原、ならびにベクター、宿主細胞、前立腺癌抗原に対する抗体、ならびに組換えおよび合成によるこれらの産生方法に関する。前立腺に関連する障害（前立腺癌を含む）を診断および処置、予防および／または予後するための診断方法、ならびにこのような障害を処置するための治療方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、「前立腺癌抗原」として集合的に公知である本明細書中のポリヌク
レオチドによってコードされる、新規に同定された前立腺および前立腺癌関連の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれに関連する完全な遺伝子配列
、およびその発現産物に関し、ならびに、前立腺の障害（特に前立腺癌の存在）
の検出、予防、および処置のためのそのような前立腺癌抗原の使用に関する。本
発明は、前立腺癌抗原ならびにベクター、宿主細胞、前立腺癌に対する抗体、な
らびにそれらを産生するための組換え方法および合成方法に関する。前立腺に関
する障害（前立腺癌を含む）の診断および処置、予防、および／または予後判定
のための診断方法、ならびにそのような障害を処置するための治療方法もまた提
供される。本発明はさらに、本発明の前立腺癌抗原のアゴニストおよびアンタゴ
ニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、本発明
のポリペプチドの産生および／または機能を阻害するための方法および／または
組成物に関する。
【０００２】 （発明の背景） 細胞増殖は、身体の特定の必要性に応答する、注意深く調節されるプロセスで
ある。時折、細胞分裂の支配を指示する複雑かつ高度に調節された制御が破壊さ
れる。このことが起こる場合、細胞は、そのホメオスタシスの調節とは独立して
増殖および分裂し始め、一般的に癌といわれる状態を生じる。実際、癌は、２５
歳〜４５歳までの米国人の間で２番目に多い死因である。
【０００３】 前立腺癌は、米国の男性の間で最も一般的な癌になっており、そして肺癌のみ
が、癌によるより多くの死の原因である（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａ
ｔｉｓｔｉｃｓ，４１：１９−３６（１９９１））。年齢特異的な死亡率は、５
０歳を超えて緩やかに増大し、そして黒人の米国男性は、白人の米国男性で見出
される死亡率の約２倍である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，１６：３９−
４８（１９９０））。前立腺癌は、５５歳を超える年齢の男性におけるすべての
死のうちの約３％の原因である（Ｓｅｉｄｍａｎら、Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅ
ｓ ｏｆ Ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｏｒ Ｄｙｉｎｇ
ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ−Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，３５：３６−５６（１９８
５））。前立腺癌の発生率は、他のいかなる癌よりも年齢とともに急速に増加し
、そして米国男性の平均年齢が上昇しているので、前立腺癌を有する患者の数は
次の十年間にわたって劇的に増加することが予想される。
【０００４】 前立腺癌を有する約３０％の男性は、診断の時点で遠くの転移を有する（Ｓｃ
ｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１３６：４１６−４２１（１９８６））。ホル
モン処置（アンドロゲン誘導）に対する転移の印象的な症候性応答に関わらず、
これらの患者についての生存率はよくない：生存の中間時間は、３年未満である
（Ｅｙａｒ、Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔ
ｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、ＬｅａおよびＦｅｂｉｇｅｒ、２４１
−２６７（１９７７））。５年までに、７５％を超えて、そして１０年までに９
０％より多い、これらの患者が、癌と共存するのではなく、癌によって死ぬ（Ｓ
ｉｌｖｅｒｂｅｒｇ、Ｃａｎｃｅｒ、６０：６９２−７１７（１９８７）（補遺
））。前立腺癌に伴う問題は、多くの型の前立腺癌が潜伏性であり、言い換えれ
ば、このような型は検出するのが困難である。前立腺癌の臨床的な証拠を有さな
い、５０歳を超える男性の約３０％は、前立腺において癌の病巣を有する（Ｍｃ
Ｎｅａｌら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、１月号、１１：６０−６３（１９８６））
。剖検における、他の器官には見られないこの顕著に高い前立腺癌の有病率は、
前立腺癌を、ヒトにおける最も一般的な悪性疾患にする（Ｄｈｏｍ，Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０６：２１０−２１８（１９８３
））。前立腺癌の病因における多段階プロセスの概念についての強力なサポート
が存在し、ここで潜在的な癌は、十分に悪性の発現について必要であるいくつか
の工程を通して発現するが、そのすべての工程を通してではない（Ｕｔｔｅｒら
、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４３：７４２−７４６（１９９０））。
【０００５】 前立腺癌の早期の検出および特徴付けのための種々の技術が存在するが、それ
らのいずれもが問題を有する。前立腺癌は、ほとんど初期の症状を有さない、有
名な無症候性の疾患である。従って、正常状態および疾患状態の両方において、
前立腺癌の活性化および分化を調節する因子の同定および特徴付けの必要性が存
在する。特に、中でも、前立腺に関連する機能不全または疾患を検出、予防、改
善、または矯正する際に役割を果たし得る、アポトーシス、ＤＮＡ修復、腫瘍媒
介血管形成、遺伝的インプリンティング、腫瘍および腫瘍抗原に対する免疫応答
を媒介するさらなる分子を単離および特徴付ける必要性が存在する。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、配列表（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１〜９４０として）に
開示され、そして／または表１、２、および５に記載されかつＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託さ
れたヒトｃＤＮＡクローンに含まれる、前立腺および／または前立腺癌に関連す
るポリヌクレオチド配列を含むか、または代替的に、その配列からなる単離され
た核酸分子を含む。これらの核酸分子のフラグメント、改変体、および誘導体も
また、本発明に含まれる。本発明はまた、前立腺または前立腺癌のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれらのポリヌクレオ
チドからなる単離された核酸分子を含む。本発明は、これらのポリヌクレオチド
によってコードされる前立腺および／または前立腺癌のポリペプチドをさらに含
む。配列表（配列番号９４１〜１８８０として）に開示され、そして／または表
１、２、および５に記載されかつＡＴＣＣに寄託されたヒトｃＤＮＡクローンに
コードされるような前立腺および／または前立腺癌のポリペプチドを含むか、ま
たは代替的にそれらのポリペプチドからなるアミノ酸配列が、さらに提供される
。これらのポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。これらのア
ミノ酸配列のポリペプチドフラグメント、改変体、および誘導体もまた、これら
のポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを結合する抗体をコードするポリヌ
クレオチドと同様に、本発明に含まれる。前立腺に関連する障害（前立腺癌を含
む）を診断ならびに処置、予防、および／または予後判定するための診断方法、
ならびにこのような障害を処置するための方法もまた、提供される。本発明はさ
らに、本発明の前立腺癌抗原のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため
のスクリーニング方法に関する。
【０００７】 （詳細な説明） （表） 表１は、本発明に含まれるいくつかの前立腺癌抗原（コンティグ配列（配列番
号Ｘ）およびコンティグ配列に関連するｃＤＮＡクローンを含む）を要約し、そ
してさらに、前立腺癌ポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペ
プチドの特定の性質を要約する。第１欄（ｃｏｌｕｍｎ）は、本発明の９４０の
前立腺癌抗原ポリヌクレオチド配列の各々の「配列番号」を示す。第２欄は、各
々の前立腺および／または前立腺癌の関連配列についての独特な「配列／コンテ
ィグＩＤ」の同定を提供する。第３欄「遺伝子の名称」および第４欄「重複」は
、公的にアクセス可能な遺伝子データベースおよび類似性を有するデータベース
配列についてのデータベース登録番号においてそれぞれ見出されるアミノ酸配列
に対して、その翻訳産物の配列類似性に基づく、推定の遺伝子の同定を提供する
。第５欄および第６欄は、配列番号Ｙとして配列表に示される好ましいＯＲＦを
示すポリヌクレオチド配列「配列番号Ｘ」における、位置（コンティグ内のヌク
レオチド位置番号）、「始まり」および「終わり」を提供する。第７欄および第
８欄は、配列番号Ｘおよびデータベース配列の翻訳産物の整列された配列セグメ
ント間で観察される「同一性％」（同一性パーセント）および「類似性％」（類
似性パーセント）を、それぞれ提供する。第９のカラムは、各コンティグ配列に
関連するｃＤＮＡクローンについての独特の「クローンＩＤ」を提供する。
【０００８】 表２は、ＡＴＣＣ寄託物、寄託日、および本願に関連してＡＴＣＣによって作
成された寄託物のＡＴＣＣ登録番号を要約する。
【０００９】 表３は、公的なＥＳＴ（これらの公的なＥＳＴ配列の任意の１以上の少なくと
も１、２、３、４、５、１０、１５より多く）が、本発明の特定の実施形態から
必要に応じて除外されることを示す。
【００１０】 表４は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９８８）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂ
ｉｏｓｃｉ．４：１８１−１８６のアルゴリズムを使用して本発明者らによって
予測されるような、表１において記載される前立腺または前立腺癌の関連ポリヌ
クレオチドの大部分において存在する抗原性エピトープ保有フラグメントの抗原
性エピトープを含む残基を列挙する。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析を、
コンピュータープログラムＰＲＯＴＥＡＮ（バージョン３．１１ ｆｏｒ Ｐｏ
ｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ、ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、１２２８ Ｓｏｕｔ
ｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して行った。前立
腺および前立腺癌の関連ポリペプチド（例えば、配列番号Ｙ、配列番号Ｘによっ
てコードされるポリペプチド、または関連するｃＤＮＡクローンにおいてｃＤＮ
Ａによってコードされるポリペプチド）は、表４において記載される残基を含む
１以上の抗原性エピトープを有し得る。抗原決定基を予測するために使用される
分析的な判断基準に依存して、その決定基の正確な位置はわずかに変化し得るこ
とが理解される。表４の第２欄において示される残基および位置は、配列表にお
いて示される大部分の前立腺および前立腺癌の関連ポリペプチド配列についての
アミノ酸配列に対応する。
【００１１】 表５は、配列決定されたｃＤＮＡ配列、ならびにＡＴＣＣ登録番号およびこれ
らのｃＤＮＡライブラリーに関連するベクター情報を示す。
【００１２】 （定義） 以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にす
るために提供される。
【００１３】 本発明において、「単離された（単離した）」とは、その本来の環境（例えば
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは物質の組成物の一部であり得るか
、あるいは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離され」得る。なぜなら、そのベ
クター、物質の組成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境で
はないからである。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡ
ライブラリー、丸ごとの細胞全体またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（
電気泳動により分離されたものおよびブロットへのトランスファーされたものを
含む）、せん断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物あるいは、当該分野が本発明の
ポリヌクレオチド／配列の識別する特徴を示せない他の組成物をいわない。
【００１４】 本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、（表１の第１欄に
記載にされる）配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列を有
する分子、または（表１の第９欄に記載され、そしてＡＴＣＣに寄託されたライ
ブラリー内に含まれる）関連するｃＤＮＡクローンをいう。例えば、このポリヌ
クレオチドは、５’および３’非翻訳配列、コード領域、ならびにこの核酸配列
のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含み得る。さらに、本
明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、広く定義される本発明のポリ
ヌクレオチド（ｃＤＮＡに対応する配列のポリＡテールの翻訳から生じるポリフ
ェニルアラニンペプチド配列もポリリジンペプチド配列も明らかに除く）によっ
てコードされるアミノ酸配列を有する分子をいう。
【００１５】 本発明では、「配列番号Ｘ」は、しばしば、複数のクローンに含まれる配列を
重複させることによって生成された（コンティグ分析）。配列番号Ｘについての
配列のすべてまたはほとんどを含む代表的クローンが、目録に載せられ、そして
保管されたライブラリーにおいてヒューマンジノームサイエンシーズインコーポ
レーテッド（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ＨＧＳ
））に寄託されている。表１の第９欄に示すように、各クローンは、ｃＤＮＡク
ローンＩＤによって同定される。各クローンＩＤは、個々のクローンＩＤについ
て独特であり、そしてそのクローンＩＤは、ＨＧＳライブラリーからの所定のク
ローンを検索するために必要なすべての情報である。個々のｃＤＮＡクローン寄
託物に加えて、クローンが由来したｃＤＮＡライブラリーの大部分は、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（本明細書中以下
、「ＡＴＣＣ」）に寄託された。表５は、寄託されたｃＤＮＡライブラリーの一
覧を提供する。表２および５に対する参照によってライブラリーの供給源を決定
するためにクローンＩＤを使用し得る。表５は、寄託されたｃＤＮＡライブラリ
ーを名称によって列挙し、そして各ライブラリーをＡＴＣＣ寄託物にリンクさせ
る。ライブラリーの名称は４文字を含む（例えば、「ＨＩＷＥ」）。そのライブ
ラリーから単離されたｃＤＮＡクローンの名称（「クローンＩＤ」）は、同じ４
文字で始まる（例えば、「ＨＴＷＥＰ０７」）。以下で言及するように、表１は
、クローンＩＤの名称を配列番号と相関させる。従って、配列番号で開始して、
表１、２、および５を使用して、対応するクローンＩＤ、それが由来するライブ
ラリー、およびそのライブラリーが含まれるＡＴＣＣ寄託物を決定し得る。さら
に、所定のｃＤＮＡクローンを、当該分野で公知の技術および本明細書中の他の
箇所に記載される技術によって、供給源のライブラリーから検索することが可能
である。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ
，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置
する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【００１６】 本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、その相補体（例えば、本明細書中
に記載されるポリヌクレオチドフラグメントのうちのいずれか１つ、２つ、３つ
、４つ以上の相補体）、および／またはＡＴＣＣに寄託されたライブラリー内の
関連するｃＤＮＡクローンに含まれる配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオ
チドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリ
ウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０
％デキストランサルフェート、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを
含む溶液中での４２℃での一晩インキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で
約６５℃にてフィルターを洗浄することをいう。
【００１７】 本発明の「ポリヌクレオチド」には、より低いストリンジェンシーのハイブリ
ダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子
もまた含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル
検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが
、低下したストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じて
達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０
×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ
、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサ
ケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション；
次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに
、さらにより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳ
Ｃ）で行われ得る。
【００１８】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬と
しては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、およ
び市販の特許処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性の
問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１９】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオ
リゴｄＴを用いて生成される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブ
リダイズするからである。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域
の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得
る。さらに、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよ
びＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた
、安定性のために、または他の理由のために改変された、１つ以上の改変された
塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては
、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げ
られる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがって、「
ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む
。
【００２１】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５、少
なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なく
とも５００または少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドであるが、長さ
が３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．
５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂまたは１ｋｂ以下である。さらなる実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において開示される場
合、コード配列の一部を含むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含まない
。別の実施形態において、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム隣接遺
伝子（すなわち、ゲノムにおける目的の遺伝子に対して５’側または３’側）の
コード配列を含まない。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１０
００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、
２、または１より多いゲノム隣接遺伝子コード配列を含まない。
【００２２】 「配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）」とは、表１に記載される前立腺癌
抗原ポリヌクレオチド配列をいう。配列番号Ｘは、表１の第１欄において特定さ
れる整数によって同定される。ポリペプチド配列の配列番号Ｙは、ポリヌクレオ
チド配列番号Ｘによってコードされる、翻訳されたオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）である。表１に記載される９４０の前立腺癌抗原ポリヌクレオチド
配列が存在し、そして配列表（配列番号１〜配列番号９４０）に示される。同様
に、配列表に示される９４０のポリペプチド配列、各ポリヌクレオチド配列につ
いて１つのポリペプチド配列が存在する（配列番号９４１〜配列番号１８８０）
。ポリヌクレオチド配列は配列表に示され、すぐ後にすべてのポリペプチドが続
く。従って、ポリヌクレオチド配列の配列番号１に対応するポリペプチド配列は
、配列表に示される最初のポリペプチド配列である。以下、第２のポリペプチド
配列は、配列番号２に示されるようなポリヌクレオチド配列に対応する、などと
なる。言い換えれば、任意のポリヌクレオチド配列配列番号Ｘについて、９４０
ポリヌクレオチド配列が存在しているので、対応するポリペプチド配列番号Ｙは
、式Ｘ＋９４０＝Ｙによって決定され得る。さらに、表１の第２欄において規定
される独特な「配列／コンティグＩＤ」のいずれかは、表４を参照することによ
って、対応するポリペプチド配列番号Ｙにリンクされ得る。
【００２３】 本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。このポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセ
スによって、または当該技術分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで、
改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、
ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこにで
も生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じま
たは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多
くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として
分枝状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状で
あり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プ
ロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、
アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、
ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔ
ｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成
、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏ
ｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ
イル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファ
ーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥ
Ｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩ
ＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００２４】 本発明の前立腺および前立腺癌のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製さ
れ得る。このようなポリペプチドには、天然に存在する単離されたポリペプチド
、組換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、また
はこれらの方法の組み合わせによって産生されたポリペプチドが含まれる。この
ようなポリペプチドを調製するための手段は、当該分野で十分に理解されている
。
【００２５】 そのポリペプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟型を含む）であり得るか、
またはより大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質（以下を参照のこと））
の一部であり得る。さらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利である。
このアミノ酸配列には、分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製において
補助を行う配列（例えば、複数のヒスチジン配列）、または組換え産生の間の安
定性のためのさらなる配列が含まれる。
【００２６】 本発明の前立腺および前立腺癌のポリペプチドは、好ましくは、単離された形
態で提供され、そして好ましくは実質的に精製される。ポリペプチドの組換え的
に産生されたバージョン（分泌ポリペプチドを含む）は、本明細書中に記載され
るかまたはさもなくば当該分野で公知の技術を使用して（例えば、Ｓｍｉｔｈお
よびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）において記載さ
れる１段階方法によって）、実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはま
た、本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の技術（例えば
、当該分野において周知である方法において本発明のポリペプチドに対して惹起
された本発明の抗体）を使用して、天然の、合成の、または組換えの供給源から
精製され得る。
【００２７】 「機能的活性」を実証するポリペプチドによって、本発明の全長（完全）タン
パク質に関連する１以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドが意味され
る。このような機能的活性には、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に
結合（または結合についてポリペプチドと競合）する能力］、免疫原性（本発明
の特異的ポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチド
とマルチマーを形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターまたは
リガンドに結合する能力が含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】 「機能的活性を有するポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの活性と類
似の活性であるが、その活性と必ずしも同一でない活性を示すポリペプチド（用
量依存性ありまたはなしで、特定のアッセイ（例えば、生物学的アッセイ）にお
いて測定されるような、成熟型を含む）をいう。用量依存性が存在する場合、用
量依存性は、そのポリペプチドの用量依存性と同一である必要はなく、むしろ本
発明のポリペプチドと比較した所定の活性における用量依存性と実質的に類似で
ある（すなわち、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較してより高
い活性、すなわち約１／２５以上、好ましくは１／１０以上、そして最も好まし
くは、約１／３以上の活性）。
【００２９】 前立腺癌抗原ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、お
よびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【００３０】 例えば、全長ポリペプチド抗体に対する抗体の結合について本発明の全長ポリ
ペプチドと結合または競合する能力についてアッセイする１つの実施形態におい
て、当該分野で公知の種々のイムノアッセイ系が使用され得、これらのアッセイ
系には、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法
）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫ラジオメトリック測定法、ゲル拡
散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイ
ド状金、酵素標識または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット
、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、
補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気
泳動アッセイなどのような技術を使用する競合的および非競合的アッセイ系が含
まれるがこれらに限定されない。１つの実施形態において、抗体結合は、一次抗
体上の標識を検出することにより検出される。別の実施形態において、一次抗体
は、二次抗体の結合または一次抗体に対する試薬を検出することによって検出さ
れる。さらなる実施形態において、二次抗体が標識される。イムノアッセイにお
ける結合を検出するための多くの手段が当該分野において公知であり、そして本
発明の範囲内にある。
【００３１】 別の実施形態において、リガンドが同定されるか、または本発明のポリペプチ
ドフラグメント、改変体、または誘導体のマルチマー化する能力が評価される場
合、結合は、例えば、当該分野で周知の手段（例えば、還元または非還元ゲルク
ロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフ
ィニティーブロッティング）によってアッセイされ得る。一般的には、Ｐｈｉｚ
ｉｃｋｙ，Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９
５）を参照のこと。別の実施形態において、その基質に結合する本発明の生理学
的に相関するポリペプチド（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００３２】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例を参照のこと）およびさも
なくば当該分野で公知のアッセイが、慣用的に、本発明のポリペプチドならびに
そのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの、ポリペプチド関連生物
学的活性（インビトロまたはインビボのいずれかにおいて）を誘発する能力を測
定するために適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の
範囲にある。
【００３３】 （前立腺および前立腺癌関連の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
） 表１において記載されるポリヌクレオチドは、ヒト前立腺および／または前立
腺癌組織において有意に増強したレベルで発現されることが、本発明において見
出された。従って、このようなポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドに特異的な
抗体は、以下により十分に記載されるように、前立腺関連障害（前立腺癌を含む
）の予測、診断、予防、および処置における用途を見出す。
【００３４】 表１は、本発明によって含まれるポリヌクレオチドのいくつかを要約し（コン
ティグ配列（配列番号Ｘ）および関連するｃＤＮＡクローンを含む）、そしてさ
らに、これらの前立腺および／または前立腺癌関連ポリヌクレオチドおよびそれ
によってコードされるポリペプチドの特定の性質を要約する。
【００３５】
【表１】 表１の第１欄は、本発明の９４０個の前立腺癌抗原ポリヌクレオチド配列の各
々についての「配列番号」を示す。
【００３６】 表１の第２欄は、前立腺および／または前立腺癌の関連の配列の各々について
の独特な「配列／コンティグＩＤ」の同定を提供する。表１の第３のカラム「遺
伝子名」は、公的にアクセス可能な遺伝子データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎ
ｋ（ＮＣＢＩ））において見出されるアミノ酸配列に対するその翻訳産物の配列
類似性に基づく遺伝子の推定の同定を提供する。表１において報告されるｃＤＮ
Ａ配列の大部分は、文献において以前に記載されたいかなる配列とも関連しない
。表１の第４欄「重複」は、類似性を有するデータベース配列についてのデータ
ベース登録番号を提供する。表１の第５欄および第６欄は、配列番号Ｙとして配
列表に示される好ましいＯＲＦを示すポリヌクレオチド配列「配列番号Ｘ」にお
ける位置（コンティグ内のヌクレオチド位置番号）、「始まり」および「終わり
」を提供する。１つの実施形態において、本発明は、ヌクレオチド位置番号「開
始」および「最後」によって示される配列番号Ｘの一部によってコードされるポ
リペプチドを含むか、または代替的に、そのポリペプチドからなるタンパク質を
提供する。このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに対
する相補鎖もまた、提供される。第７欄および第８欄は、配列番号Ｘおよびデー
タベース配列の翻訳産物の整列された配列セグメント間で観察される「同一性％
」（同一性パーセント）および「類似性％」（類似性パーセント）を提供する。
【００３７】 表１の第９欄は、各コンティグ配列に関連するクローンについての独特な「ク
ローンＩＤ」を提供する。このクローンＩＤは、アセンブルされたコンティグの
５’の大部分のオリゴヌクレオチド配列を少なくとも含むｃＤＮＡクローンを参
照し、そして少なくとも配列番号Ｘの一部は、参照されたクローンを直接配列決
定することによって決定された。この参照クローンは、配列表において記載され
るよりも多くの配列を有し得るか、またはそのクローンはより少ない配列を有し
得る。しかし、大部分の場合において、そのクローンは、全長ポリペプチドをコ
ードすると考えられている。クローンが全長でない場合において、全長ｃＤＮＡ
は、本明細書中の別の箇所に記載される方法によって得られ得る。
【００３８】 表３は、公的なＥＳＴ（これらの公的なＥＳＴ配列の任意の１以上の少なくと
も１、２、３、４、５、１０より多く）が、本発明から必要に応じて除外される
ことを示す。
【００３９】 配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ；ここでＸは、配列表に配列番号１〜配
列番号９４０として開示される任意のポリヌクレオチド配列であり得る）および
翻訳された配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ；ここでＹは、配列表に配列番
号９４１〜配列番号１８８０として開示される任意のポリペプチド配列であり得
る）は、十分に正確であり、そしてそうでなければ、当該分野において周知の種
々の用途および以下でさらに記載される種々の用途に適切である。例えば、配列
番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）
において含まれる核酸配列またはＡＴＣＣに寄託されたライブラリーに含まれる
関連するｃＤＮＡクローンを検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブを設
計することを含むがこれに限定されない用途を有する。これらのプローブはまた
、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、それによって染色体マッ
ピング、連鎖分析、組織同定および／または分類（ｔｙｐｉｎｇ））ならびに本
発明の種々の法医学的方法および診断方法における即座の適用を可能にする。同
様に、配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）から同定されるポリぺプチドは、
前立腺癌抗原ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、および／または表１に
おいて同定されるｃＤＮＡクローンによってコードされる前立腺癌抗原ポリペプ
チドに特異的に結合する抗体を作製することを含むがこれに限定されない用途を
有する。
【００４０】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。このエラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、
または生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存
在する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸
配列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場
合において、作製されるＤＮＡ配列が、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば
、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入ま
たは欠失）を超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のアミ
ノ酸配列とは異なる。
【００４１】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）として
同定される作製されたヌクレオチド配列、配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ
）として同定される推定の翻訳されたアミノ酸配列のみならず、（表１において
記載されるような、ＡＴＣＣに寄託された）関連するｃＤＮＡクローンを含むプ
ラスミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。各々の寄託されたクローンのヌクレ
オチド配列は、公知の方法に従って、寄託されたクローンを配列決定することに
よって容易に決定され得る。さらに、当該分野で公知の技術を用いて、配列番号
Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）のヌクレオチド配列を確認し得る。
【００４２】 次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から証明され得る。さらに、
特定のクローンによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチ
ド配列決定によって、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中で
タンパク質を発現させ、このタンパク質を収集し、そしてその配列を決定するこ
とによって、直接的に決定され得る。
【００４３】 本発明はまた、このようなＤＮＡ配列ならびにＤＮＡ配列の使用を含む、ベク
ターまたはプラスミドに関する。ＡＴＣＣへの寄託物は以下であり：
【００４４】
【表２】 各々は、表５に示されるように、種々のヒト組織に由来しかつプラスミドベクタ
ーまたはファージベクターのいずれかにおいてクローニングされたｃＤＮＡクロ
ーンの混合物である。これらの寄託物は、本明細書中で「寄託物」といわれる。
クローンが由来する組織は、表５において列挙され、そしてｃＤＮＡが含まれる
ベクターもまた、表５に示される。寄託物は、部分的に配列決定されたｃＤＮＡ
クローンを含み、そして表１（第９欄）において記載される配列番号Ｘに関連す
る。従って、配列番号Ｘとして列挙された配列の使用によってＡＴＣＣ寄託物か
ら単離可能なクローンは、ヒト遺伝子の完全なコンティグ領域を含み得るか、ま
たは他の場合において、そのようなクローンは、ヒト遺伝子のコード領域の実質
的な部分を含み得る。配列表は、ＡＴＣＣ寄託物中に含まれるクローン中のＤＮ
Ａ配列の一部のみを列挙するが、それは、本明細書中以下でさらに記載される手
順、および当業者に明らかである他の手順によって、表１に列挙された配列（ま
たはその部分）の使用による１つのＡＴＣＣ寄託物の能力内に十分にある。
【００４５】 ｃＤＮＡクローンを含むベクターの名称もまた、表５に提供される。各ベクタ
ーは当該分野で慣用的に使用される。以下のさらなる情報は、便宜のために提供
される。
【００４６】 ベクターλＺａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，
６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５６号および同
第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第５，１２８，
２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ
）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７
５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．およびＳｈ
ｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：９４９４（１
９８９））およびｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｔｒａｔｅ
ｇｉｅｓ ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，１１０１１Ｎ，Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ
Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販されている。ｐＢＳ
は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマイシン耐性遺伝子を
含む。ファージミドｐＢＳは、λＺａｐベクターおよびＵｎｉ−Ｚａｐ ＸＲベ
クターから切除され得、そしてファージミドｐＢＫはＺａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓベ
クターから切除され得る。両方のファージミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−Ｂｌｕ
ｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得
る。
【００４７】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ １．０、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ
２．０、およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６００９，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ ２０８９７から入手した。すべてのＳｐｏｒｔベクターは、アンピシリン
耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまたＬｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｇ
ｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：５９（１９９３）を参照のこと。
ベクターｌａｆｍｉｄＢＡ（Ｂｅｎｔｏ Ｓｏａｒｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を
含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクターｐＣ
Ｒ（登録商標）２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａ
ｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ９２００８から入手可能）は、アンピシ
リン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｃｌａｒ
ｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９
８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９
１）を参照のこと。
【００４８】 本発明はまた、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）、配列番号Ｙ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：Ｙ）、および／または寄託されたｃＤＮＡクローンに含まれるｃ
ＤＮＡに対応する遺伝子に関する。対応する遺伝子は、本明細書中に開示される
配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、開
示された配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム物質
の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅する工程を包含するがこれ
らに限定されない。
【００４９】 本発明においてまた、対立遺伝子改変体、オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、
および／または種ホモログが提供される。当該分野において公知の手順を使用し
、本明細書中に開示される配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンからの情報
を用いて、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）、配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：Ｙ）および／または寄託物における関連するｃＤＮＡクローンに含まれ
るｃＤＮＡに対応する遺伝子の全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライシング
改変体、全長のコード部分、オーソログ、および／または種ホモログを獲得し得
る。例えば、対立遺伝子改変体および／または種ホモログは、本明細書中に提供
される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝子改
変体および／または所望のホモログについて適切な核酸供給源をスクリーニング
することによって単離および同定され得る。
【００５０】 本発明は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）の核酸配列、および／また
は関連するｃＤＮＡクローン（表１の第１欄および第９欄を参照のこと）を含む
か、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配列
番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）のポリペプチド配列、配列番号Ｘ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：Ｘ）によりコードされるポリペプチド、および／または寄託された
ライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおけるｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドを提供す
る。配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）のポリペプチド配列、配列番号Ｘ（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）によりコードされるポリペプチド、および／または寄
託されたライブラリー中に含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおいてｃＤＮＡ
（ｄＤＮＡ）によりコードされるポリペプチド配列を含むか、あるいはそれらか
らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される
。本発明はさらに、配列番号Ｘの核酸配列の相補物、および／または寄託された
ライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンのコンティグ鎖の相補物を含
むか、または代替的にそれからなるポリヌクレオチドを含む。
【００５１】 多くのポリヌクレオチド配列（例えばＥＳＴ配列）は、公的に使用可能であり
かつ配列データベースを通してアクセス可能であり、そして本発明の着想の前に
公的に利用可能であったかもしれない。好ましくは、そのような関連するポリヌ
クレオチドは、本発明の範囲から特異的に除外される。すべての関連する配列を
列挙することは本願の開示には過度の負担である。従って、表３の第１欄におい
て列挙される各「コンティグＩｄ」について、好ましくは、一般式ａ−ｂによっ
て表３の第２欄において記載されるヌクレオチド配列を含む１以上のポリヌクレ
オチドが除外され、これらの各々は、表１におけるそのコンティグＩｄに対応す
る配列番号Ｘについて独特に規定される。さらに、特定の実施形態は、表３の第
３欄に含まれ得る各コンティグＩｄについて、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号によって
参照される特定のポリヌクレオチド配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０
より多くを除外するポリヌクレオチド配列を指向する。この配列表は、一般式に
よって除外され得る配列のすべてを含むことを意味しない。これは代表的な例に
過ぎない。
【００５２】
【表３】 （ポリヌクレオチドおよびポリぺプチド改変体） 本発明は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）に開示されたポリヌクレオ
チド配列、それに対する相補鎖、および／または寄託物に含まれるｃＤＮＡクロ
ーン中に含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関する。
【００５３】 本発明はまた、配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）に開示される前立腺お
よび前立腺癌ポリペプチド配列、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）におけ
るポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列、および／また
は寄託物に含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおけるｃＤＮＡによりコードさ
れるポリペプチド配列の改変体を包含する。
【００５４】 「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドとは異なるが
、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドをいう
。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域において、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドに同一である。
【００５５】 本発明はまた、例えば、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）のヌクレオチ
ドをコードする配列またはその相補鎖、寄託されたライブラリーに含まれる関連
するｃＤＮＡのヌクレオチドをコードする配列またはその相補鎖、配列番号Ｙ（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列
番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）によってコードされるポリペプチド配列をコ
ードするヌクレオチド配列、寄託されたライブラリーに含まれる関連するｃＤＮ
ＡにおけるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列、および／またはこれらの核酸分子のいずれかのポリヌクレオチドフラグ
メント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）に対して、少なくとも
８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１０
０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる核酸分子に
関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
含まれる。別の実施形態において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で、あるいは低いストリンジェント条件下で、配列番号Ｘ中の
ヌクレオチドコード配列、寄託されたライブラリーに含まれる関連ｃＤＮＡクロ
ーンのヌクレオチドコード配列、配列番号Ｙのポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列、配列番号Ｘ中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチ
ド配列をコードするヌクレオチド配列、寄託されたライブラリーに含まれる関連
ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列、および／またはこれらの任意の核酸分子のポリペプチドフラ
グメント（例えば、本明細書中に記載のこれらのフラグメント）にハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる核酸分子を含む。ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件あるいはより低いストリンジェン
トな条件の下で、これらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドもまた、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同様
に本発明により包含される。
【００５６】 本発明はまた、例えば、配列番号Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）に示されるポ
リペプチド配列、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）におけるヌクレオチド
配列によってコードされるポリペプチド配列、寄託されたライブラリーにおいて
含まれる関連するｃＤＮＡクローン中におけるｃＤＮＡによりコードされるポリ
ペプチド配列、および／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチド
フラグメント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）に対して、少な
くとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％また
は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプ
チドに関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、あるいは低
いストリンジェント条件下で、これらのポリペプチドをコードする核酸分子の相
補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドもまた、
これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に本発明に
含まれる。
【００５７】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸によって、核酸のヌクレオチド配列が、ヌクレオ
チド配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオ
チドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に対して同一で
あることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９
５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列のヌクレオチ
ドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、
または参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列
中に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、例えば、表１に言及され
る配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で記
載されるように特定される任意のフラグメントであり得る。
【００５８】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象
配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照さ
れる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ
． Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づく
ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列にお
いて、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ
配列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列
の結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するた
めにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは
：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚ
ａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか
より短い方）である。
【００５９】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【００６０】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００６１】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【００６２】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号Ｙ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：Ｙ）におけるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントに対して、
配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）におけるヌクレオチド配列によってコー
ドされるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または寄託されたライブラリ
ーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされ
るアミノ酸配列もしくはそのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは
、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問い合
わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配
列整列としても参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ
ら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のア
ルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され
得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオ
チド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記
の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ
酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−
ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ
＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより
短い方）である。
【００６３】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【００６４】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００６５】 改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて５
０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２５
、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加される
改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特
定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、
Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のため
に、生成され得る。
【００６６】 天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【００６７】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、本明細書中に考察するように、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質
的な欠損を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失され
得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９
９３）の著者らは、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失さ
せた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。
同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０
個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂ
ｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８）
）。
【００６８】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
【００６９】 さらに、本明細書中に考察されるように、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端
からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失
を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌される
形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌
される形態の大多数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合
に保持されるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定
のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的
な方法によって容易に決定され得る。
【００７０】 従って、本発明はさらに、改変体である、本発明のポリペプチドの機能的活性
（例えば、生物学的活性）を示すポリぺプチド改変体を含む。このような改変体
としては、活性に対する影響をほとんど有さないように、当該分野において公知
の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位、反復、および置換が挙
げられる。
【００７１】 本出願は、本明細書中で開示される核酸配列またはそのフラグメント（例えば
、Ｎ末端および/またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするフラグメントを含むが、これらに限定されない）に対して少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一の核酸分子に関し、それらが機能活性を有するポリペプチドをコードするか
否かに無関係である。なぜならば、特定の核酸分子が、機能活性を有するポリペ
プチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を（例えば、ハイブリダ
イゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして
）使用する方法をなお知っているからである。機能活性を有するポリペプチドを
コードしない本発明の核酸分子の使用は、特に、以下：（１）ｃＤＮＡライブラ
リーにおける遺伝子またはその対立遺伝子改変体もしくはそのスプライス改変体
を単離する工程；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるように、遺伝子の
正確な染色体位置を提供する中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）にインサイ
チュハイブリダイゼーションする工程（例えば「ＦＩＳＨ」）；および（３）特
異的組織におけるｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析、を包含
する。
【００７２】 しかし、本明細書中で開示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配
列を有する核酸分子が好ましく、これらの核酸分子は、実際に、本発明のポリペ
プチドの機能活性を有するポリペプチドをコードする。
【００７３】 当然のことながら、遺伝子コードの縮重に起因して、例えば、寄託されたライ
ブラリー中に含まれる関連したｃＤＮＡクローンにおけるｃＤＮＡの核酸配列、
表１（配列番号Ｘ）中に言及される核酸配列またはそのフラグメントに対して少
なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
または１００％同一の配列を有する多数の核酸分子が、「機能活性を有する」ポ
リペプチドをコードするということを、当業者は、直ちに理解する。実際に、こ
れらのヌクレオチド配列のいずれかの縮重改変体すべてが、同じポリぺプチドを
コードするので、多くの場合、このことは、上記の比較アッセイを実行しなくて
も、当業者に明らかである。縮重改変体でないような核酸分子について、合理的
な数がまた、機能活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさ
らに理解される。なぜならば、当業者が、さらに以下に記載されるように、タン
パク質を有意に機能させるかまたは機能しそうにないアミノ酸置換（例えば、１
つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を完全に知ってい
るからである。
【００７４】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎ
ｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３
０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは変化に対する
アミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを
指摘する。
【００７５】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。
【００７６】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る
。
【００７７】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なア
ミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸
残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコード
されるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、または（ｉ
ｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉｉｉ）別の化
合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増加するための
化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチドの融合、ま
たは（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、また
はリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列のような）とのポリ
ぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教示か
ら、当業者の範囲内であると考えられる。
【００７８】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（
１９９３））。
【００７９】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸
配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、ポリペプチドは、好ましさが常に
増大する順番で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、
６、５、４、３、２、または１アミノ酸置換を超えない、配列番号Ｙのポリペプ
チドのアミノ酸配列、配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列、および／
または寄託されたライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおけるｃ
ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが非
常に好ましい。特定の実施形態において、配列番号Ｙのアミノ酸配列もしくはそ
のフラグメント（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフラグ
メント）、配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列もしくはそのフラグメ
ント、および／または寄託されたライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクロ
ーンにおけるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列もしくはそのフラグメ
ントにおける付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜
２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換
が好ましい。
【００８０】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント） 本発明はまた、本発明の前立腺および前立腺癌のポリヌクレオチド（核酸）の
ポリヌクレオチドフラグメントに関する。本発明において、「ポリヌクレオチド
フラグメント」とは、例えば、以下である核酸配列を有するポリヌクレオチドを
いう：寄託されたｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡの一部であるか；または
寄託されたｃＤＮＡクローン中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列の一部であるか；または配列番号Ｘもし
くはそれらの相補鎖におけるポリヌクレオチド配列の一部であるか；または配列
番号Ｙのポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列であるか；また
は配列番号Ｘもしくはそれらの相補鎖によってコードされるポリペプチドの一部
をコードするポリヌクレオチド配列である。本発明のヌクレオチドフラグメント
は、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２
０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましく
は少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少な
くとも約１００ｎｔ、少なくとも約１２５ｎｔまたは少なくとも約１５０ｎｔの
長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」のフラグメントは、例え
ば、寄託されたライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおけるｃＤ
ＮＡに含まれる配列、配列番号Ｘに示されるヌクレオチド配列またはそれらに対
する相補鎖由来の２０以上の連続する塩基を含むことが意図される。この文脈に
おいて「約（おおよそ）」は、特に記載された値またはこれより数個（５、４、
３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これら
のヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブ
およびプライマーとしての使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。
もちろん、より大きなフラグメント（例えば、少なくとも、１５０、１７５、２
００、２５０、５００、６００、１０００または２０００ヌクレオチド長）もま
た本発明に包含される。
【００８１】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下からなるフラグ
メントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２０
０、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０
１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７０
０、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０
１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１
１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３
００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５
１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０
、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜
１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、２
００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２２
００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３００、２３０１〜２３５０、２３５
１〜２４００、２４０１〜２４５０、２４５１〜２５００、２５０１〜２５５０
、２５５１〜２６００、２６０１〜２６５０、２６５１〜２７００、２７０１〜
２７５０、２７５１〜２８００、２８０１〜２８５０、２８５１〜２９００、２
９０１〜２９５０、２９５１〜３０００、３００１〜３０５０、３０５１〜３１
００、３１０１〜３１５０、３１５１〜３２００、３２０１〜３２５０、３２５
１〜３３００、３３０１〜３３５０、３３５１〜３４００、３４０１〜３４５０
、３４５１〜３５００、３５０１〜３５５０、および３５５１から配列番号Ｘの
末端、またはそれらの相補鎖。この文脈において、「約（おおよそ）」は、特に
記載された範囲、またはおよびいずれかの末端もしくは両方の末端において、こ
れより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小
さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、その配列が一部である
ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの機能的活性（例えば、生
物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのフ
ラグメントは、本明細書中、上記で議論されるようにプローブまたはプライマー
として使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下あるい
はより低いストリンジェンシー条件下でこれらの核酸分子のうちの１以上にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドまたはフラ
グメントによりコードされるポリペプチドと同様に本発明に含まれる。
【００８２】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表的例は、例えば、寄託
されたｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列のヌクレオチド番
号約１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５
０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５
１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５
０、７５１〜８００、８０１〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５
１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０
、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜
１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１
５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７
００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５
１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、２００１〜２０５０
、２０５１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２２００、２２０１〜
２２５０、２２５１〜２３００、２３０１〜２３５０、２３５１〜２４００、２
４０１〜２４５０、２４５１〜２５００、２５０１〜２５５０、２５５１〜２６
００、２６０１〜２６５０、２６５１〜２７００、２７０１〜２７５０、２７５
１〜２８００、２８０１〜２８５０、２８５１〜２９００、２９０１〜２９５０
、２９５１〜３０００、３００１〜３０５０、３０５１〜３１００、３１０１〜
３１５０、３１５１〜３２００、３２０１〜３２５０、３２５１〜３３００、３
３０１〜３３５０、３３５１〜３４００、３４０１〜３４５０、３４５１〜３５
００、３５０１〜３５５０、および３５５１から末端までの配列を含むか、ある
いはこれからなるフラグメント、またはその相補鎖を含む。この状況において、
「約」は、いずれかの末端または両末端で、特に記載された範囲または数個（５
，４，３，２または１個）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さい範囲を含む
。好ましくは、これらのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡクローン中に含ま
れるｃＤＮＡヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能活性（
例えば、生物活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これ
らのフラグメントは、本明細書中で議論されるようなプローブまたはプライマー
として使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ある
いは低度のストリンジェンシー条件下で、１以上のこれらのフラグメントにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれ、これらのポリヌクレ
オチドまたはフラグメントによってコードされるポリペプチドも同様である。
【００８３】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれる
アミノ酸配列の一部であるか、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列によってコー
ドされる、および／または寄託されたライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡ
クローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、アミノ酸配列の一部である
、アミノ酸配列をいう。タンパク質（ポリペプチド）フラグメントは、「自立構
造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺ
プチド内（そのフラグメントが、部分または領域を（最も好ましくは単一の連続
した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメント
の代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列を
含むか、あるいは以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列からなるフラグメ
ントが挙げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１
００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１
８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２
８０、２８１〜３００、３０１〜３２０、３２１〜３４０、３４１〜３６０、３
６１〜３８０、３８１〜４００、４０１〜４２０、４２１〜４４０、４４１〜４
６０、４６１〜４８０、４８１〜５００、５０１〜５２０、５２１〜５４０、５
４１〜５６０、５６１〜５８０、５８１〜６００、６０１〜６２０、６２１〜６
４０、６４１〜６６０、６６１〜６８０、６８１〜７００、７０１〜７２０、７
２１〜７４０、７４１〜７６０、７６１〜７８０、７８１〜８００、８０１〜８
２０、８２１〜８４０、８４１〜８６０、８６１〜８８０、８８１〜９００、９
０１〜９２０、９２１〜９４０、９４１〜９６０、９６１〜９８０、９８１〜１
０００、１００１〜１０２０、１０２１〜１０４０、１０４１〜１０６０、１０
６１〜１０８０、１０８１〜１１００、１１０１〜１１２０、１１２１〜１１４
０、１１４１〜１１６０、１１６１〜１１８０、および１１８１から配列番号Ｙ
の末端まで。さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、少なくとも約１０
、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０
、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または
１５０アミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約（おおよそ）」とは
、特に記載された範囲または値、またはいずれかの末端もしくは両方の末端にお
いて、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまた
は小さな範囲または値を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、本発明に含まれる。
【００８４】 １以上のアミノ酸の、タンパク質のＮ末端からの欠失が、このタンパク質の１
以上の生物学的機能の欠失という改変を生じたとしても、他の機能活性（例えば
、生物学的活性、多量体化する能力、リガンドを結合する能力）はなお、維持さ
れ得る。例えば、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導
および/またはこれに結合する短縮化ムテインの能力は、完全ポリペプチドまた
は成熟ポリペプチドの過半数の残基より少ない残基が、Ｎ末端から除去される場
合、一般に維持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠失する特定のポリペ
プチドが、このような免疫学的活性を維持するか否かは、本明細書中で記載され
かそうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
多くの欠失されたＮ末端アミノ酸残基を有するムテインが、幾らかの生物学的活
性または免疫学的活性を維持し得ることは、ありそうにない。実際に、わずか６
アミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば、免疫応答を引き起こす。
【００８５】 従って、本発明のポリペプチドフラグメントは、分泌タンパク質ならびに成熟
形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントは、アミノ末端またはカ
ルボキシ末端あるいはその両方から残基を欠失された連続した一連の残基を有す
る分泌タンパク質または成熟形態を含む。例えば、１〜６０の範囲の任意の数の
アミノ酸は、分泌ポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失
され得る。同様に、１〜３０の範囲の任意の数のアミノ酸は、分泌タンパク質ま
たは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端欠
失およびカルボキシ末端欠失の任意の組合せが、好ましい。同様に、これらのポ
リペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、好ましい。
【００８６】 本発明はさらに、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号Ｙ
のポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によってコードさ
れるポリペプチド、および/または寄託されたライブラリー中に含まれる関連し
たｃＤＮＡクローン中に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド）
のアミノ酸配列のアミノ末端を欠失した１以上の残基を有するポリペプチドを提
供する。特に、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ−ｑで記載され得、ここでｑは、本発明
のポリペプチド（例えば、配列番号Ｙに開示されるポリペプチド）におけるアミ
ノ酸残基の総数を表す整数であり、そしてｍは、２〜ｑ−６の範囲の任意の整数
として定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
、本発明に含まれる。
【００８７】 また上述のように、たとえ、タンパク質のＣ末端での１以上のアミノ酸の欠失
が、このタンパク質の１以上の生物学的機能の損失の改変を生じたとしても、他
の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンドを結合させる
能力）は、なお維持され得る。例えば、ポリペプチドの完全形態または成熟形態
を認識する抗体を誘導および/またはこれに結合する短縮化ムテインの能力は、
完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の過半数より少ない残基が、Ｃ
末端から除去される場合、一般的に維持される。完全ポリペプチドのＣ末端残基
を欠失する特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を維持するか否かは、
本明細書中で記載されるかそうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法によっ
て容易に決定され得る。多数の欠失Ｃ末端アミノ酸残基を有するムテインは、幾
らかの生物学的活性または免疫学的活性を維持し得る。実際に、わずか６アミノ
酸残基で構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を引き起こす。
【００８８】 従って、本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号
Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によってコード
されるポリペプチド、および/または表１中に参照される寄託されたｃＤＮＡク
ローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列
のカルボキシ末端からの１以上の残基を有するポリペプチドをさらに提供する。
特に、Ｃ末端欠失は、一般式１−ｎと記載され得、ここで、ｎは、６〜ｑ−１の
範囲の任意の整数であり、ここで、ｎは、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基
の位置に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた
、本発明に含まれる。
【００８９】 さらに、上記のＮ末端またはＣ末端欠失のいずれかは、Ｎ末端およびＣ末端を
欠失したポリペプチドを生じるように組み合わせら得る。本発明はまた、アミノ
末端およびカルボキシ末端の両方を欠失した１以上のアミノ酸を有するポリペプ
チドを提供し、このポリペプチドは、配列番号Ｘによってコードされるポリペプ
チド（例えば、配列番号Ｙとして開示される好ましいポリペプチドを含むが、こ
れに限定されない）および/または寄託されたライブラリー中に含まれる関連し
たｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの残基ｍ−ｎ
を有するとして一般的に記載され得、ここで、ｎおよびｍは、上記されるような
整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発
明に含まれる。
【００９０】 配列番号Ｙのポリペプチド中に含まれるか、配列番号Ｘとして示されるポリヌ
クレオチド配列によってコードされるか、または寄託されたライブラリー中に含
まれる関連したｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされる、任意のポ
リペプチド配列は、このポリペプチドの特定の好ましい領域を決定するために分
析され得る。例えば、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列または寄託されたｃＤ
ＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は
、ＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて分
析され得る（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔ
ａｒ．ｃｏｍ／）。
【００９１】 ＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズムを使用して慣例的に得られ得るポ
リぺプチド領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｇａｒ
ｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎα領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｃｈｏ
ｕ−Ｆａｓｍａｎα領域、β領域、およびターン領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ親水性領域および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇα両親媒性領域および
β両親媒性領域；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形
成領域ならびに高抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域。いくつかの構造
的特徴（例えば、数種（例えば、１、２、３または４種）の上述の特徴）を組合
せた領域を含むポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドは、この点において
本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドである。
【００９２】 さらに、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｍｉ
ｎｉ表面形成領域、ならびに高抗原性指標（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌ
ｆプログラムのデフォルトパラメーターを用いて同定されるように、１．５以上
の抗原性指標を有する４つ以上の連続的なアミノ酸を含む）のＪａｍｅｓｏｎ−
Ｗｏｌｆ領域は、抗原性について高度の有効性を示すポリぺプチドの領域を決定
するために、慣用的に使用される。高い抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の
開始プロセスにおいて起こり得る環境において、ポリペプチドの表面上に露出さ
れているようであるポリぺプチドの領域を示す値を選択することにより、ＤＮＡ
ＳＴＡＲ分析によるデータから決定される。
【００９３】 本発明の好ましいポリぺプチドフラグメントは、アミノ酸配列を含むかまたは
アミノ酸配列からなるフラグメントであり、このアミノ酸配列は、このアミノ酸
配列がフラグメントであるポリぺプチド配列の機能的活性を提示する。
【００９４】 「機能的活性」を実証するポリぺプチドとは、本発明の全長（完全）タンパク
質に関する１つ以上の公知の機能的活性を提示し得るポリぺプチドを意味する。
このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリぺプチド抗体に
結合する（かまたは結合についてポリぺプチドと競合する）能力］、免疫原性（
本発明の特定のポリぺプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリぺ
プチドとともにマルチマーと形成する能力、およびポリぺプチドのレセプターま
たはリガンドと結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、類似の活性を示すが本発明のポリペプ
チドの活性とは必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメントの
生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した所望でない活性を含み得
る。
【００９６】 好ましい実施形態では、本発明のポリぺプチドは、配列番号Ｙのポリぺプチド
またはその部分の１、２、３、４、５個またはより多くの抗原性フラグメントを
含むかあるいはその抗原性フラグメントからなる。これらのポリぺプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
【００９７】
【表４】 本発明は、配列番号Ｙに示すポリペプチド配列のエピトープ、もしくは寄託さ
れたライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおけるｃＤＮＡによっ
てコードされるかもしくは配列番号Ｘのエピトープコード配列の相補物にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピト
ープ、または上記で規定されたようなストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下あるいはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下
で寄託されたｃＤＮＡクローンに含まれるエピトープコード配列を含むか、ある
いはそれらからなるポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチ
ド配列（例えば、配列番号Ｘで開示された配列）のエピトープをコードするポリ
ヌクレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相
補鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義されたようなストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件あるいはより低いストリンジェンシーのハイブリ
ダイゼーション条件で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む
。
【００９８】 本明細書中で使用される用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物
、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポ
リペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、このポリペプ
チドをコードするエピトープならびにポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含
む。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物における抗体
応答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知の任意の方
法（例えば、以下に記載された抗体作製の方法）によって測定された。（例えば
、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３
９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、
用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細
書中に記載されたイムノアッセイ）によって測定されるように、抗体がその抗原
に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的な結
合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除外す
る必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を必要とはしない。
【００９９】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６
３１，２１１号にさらに記載される）を参照のこと）。
【０１００】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なく
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。好ましいポ
リペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、
５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００
アミノ酸残基長の免疫原性エピトープあるいは抗原性エピトープを含む。さらな
る非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書で開示された抗原性エピト
ープ、ならびにそれらの一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、このエピト
ープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有
用である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書に開示された抗原性エピトー
プ、ならびにこれらの抗原性エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の
組み合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイの標的分子として使用
され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９
８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１
９８３）を参照のこと）。
【０１０１】 同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に
従って抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓ
ｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６
６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピト
ープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性
エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上
の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、ア
ルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を
惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十分に長い場合で
は（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリアなしで提示され
得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、
変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を惹
起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにお
いて）。
【０１０２】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔ
ｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を
参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し
得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソ
イド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイン
トアジュバントまたは免疫応答を刺激すると知られる任意の他のアジュバントを
含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブー
スター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週
間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離の
ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の
血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で
周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出に
よる）により上昇し得る。
【０１０３】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、本発明のポリペ
プチド、ならびにそれらの免疫原性エピトープフラグメントおよび／または抗原
性エピトープフラグメントは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、
本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）
の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの
任意の組み合わせおよびそれらの部分）と融合され得、キメラポリペプチドを生
じる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボでの半
減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメイ
ンおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメイ
ンからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、ＥＰ ３９４，８
２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８
）を参照のこと。免疫系に対して上皮障害を横切る抗原の増強された送達は、Ｉ
ｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーへ結合された抗原
（例えば、インシュリン）について実証された（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／
２２０２４および同ＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスル
フィド結合に起因するジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク
質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分
子の結合および中和においてより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏ
ｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４
（１９９５）を参照のこと。
【０１０４】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）
。
【０１０５】 さらに、本発明のポリペプチドはマーカー配列（例えば、融合されたポリペプ
チドの精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において
、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐ
ＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，
Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、
これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１
９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の
良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグ
は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
【０１０６】 従って、任意のこれら上記の融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを使用して操作され得る。
【０１０７】 上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球
凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子
と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば
、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株中で発現される非
変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ら、１９
９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９
７）。この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドへサブクロ
ーン化され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つの
ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融
合タンパク質についての基質結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシ
ニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−
アガロースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミ
ダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１０８】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
方法を使用することにより、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこ
れらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には
、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３
０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、
ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ
およびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３
（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によってその全体に
おいて参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番
号Ｘに対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポリヌクレ
オチド配列において変化を生じるように２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブ
ルすることを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはそ
のコードされるポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏ
ｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダム変異
誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクシ
ョン、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の、１つ以上
の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換え
られ得る。
【０１０９】 本明細書中で議論されるように、本発明の任意のポリペプチドは、融合タンパ
ク質を産生するために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、第２の
タンパク質と融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。本発明のポリペ
プチドに対して惹起される抗体は、ポリペプチドに結合することによって、第２
のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌されるタン
パク質は、細胞位置を輸送シグナルに基づいて標的化するので、分泌されること
が示されている本発明のポリペプチドは、他のタンパク質に一旦融合されると標
的化分子として使用され得る。
【０１１０】 本発明のポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみ
ならず、他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要はな
いが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１１１】 特定の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、融合タンパク質を
含む。ここで、このポリペプチドは、N末端欠失変異体および／またはC末端欠失
変異体である。好ましい実施形態において、適用は、特異的なN末端欠失変異体
およびC末端欠失変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸
配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％同一である核酸分子に関する。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、本発明により含まれる。
【０１１２】 さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改良するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改良
するためにポリペプチドのＮ末端へ付加され得る。また、ペプチド部分は精製を
容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ポリペプチ
ドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするための
ペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られる慣用の技術である。
【０１１３】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの産生に関連する。例えば、ベクターは、ファー
ジベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベ
クターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製
欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【０１１４】 本発明のポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含む
ベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈
澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクター
がウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用し
てインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１１５】 ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば
、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プ
ロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲの
プロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは
当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、
および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。この構築物
によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン
、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（Ｕ
ＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０１１６】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他
の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシ
リン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ
Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細
胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植
物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培
地および条件は、当該分野で公知である。
【０１１７】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中
には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系における使
用のために好ましいベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚ
ｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂ
ａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な
ベクターは当業者に容易に明らかである。
【０１１８】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的研究室マニュアルに記載される。本発明のポリペプチドは、実際、組換
えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【０１１９】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
が精製のために使用される。
【０１２０】 本発明のポリペプチドはまた、以下から回収され得る：直接単離されるかまた
は培養されるかにかかわらず、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精
製された産物；化学的合成手順の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞
、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真
核生物宿主から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順に使用され
る宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリ
コシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒
介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の改変されたメチオニ
ン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末
端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から
高い効率で除去されることは当該分野において周知である。ほとんどのタンパク
質においてＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原核生物において効果的に除去
されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末
端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存しており、非効率的である。
【０１２１】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核生物
系において本発明のポリペプチドを発現するために使用され得る。Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓは、その唯一の炭素減としてメタノールを代謝しうるメチル
資化性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝経路の主
要な工程は、Ｏ2を用いてメタノールをホルムアルデヒドへ酸化することである
。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒される。メタノールをそ
の唯一の炭素源として代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、ア
ルコールオキシダーゼのＯ2に対する比較的低い親和性に一部起因して、高レベ
ルのアルコールデヒドロゲナーゼを生成しなければならない。結論として、主要
炭素源としてのメタノールに依存して、増殖培地中に２つのアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子のうちの１つ（ＡＯＸ１）のプロモーター領域は、非常に活性で
ある。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から生成されたアルコールオキシ
ダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質の約３
０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：
１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ５：１６７
−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参照のこと。従って、異種コード配
列（例えば、本発明のポリヌクレオチド）は、ＡＯＸ１調節配列の全てまたは一
部の調節転写の下で、メタノールの存在下で増殖するＰｉｃｈｉａ酵母において
例外的に高レベルで発現される。
【０１２２】 １つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、上記のように、Ｐｉ
ｃｈｉａ酵母系において、本質的に以下に記載されるように本発明のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを発現するために使用される：「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、
Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，１９９８。この発現ベクターは、マルチプル
クローニング部位の上流に配置されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリ
ホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結
された強力なＡＯＸ１プロモーターによって、本発明のポリペプチドの発現およ
び分泌を可能にする。
【０１２３】 多くの他の酵母ベクターは、提唱された発現構築物が転写、翻訳、分泌（必要
であれば）などについての適切に配置されたシグナル（必要に応じて、インフレ
ームＡＵＧを含む）を提供する限り、当業者が容易に理解するように、ｐＰＩＣ
９Ｋの代わりに使用され得る（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚ
ｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ、ｐ
ＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５
Ｋ、およびＰＡＯ８１５）。
【０１２４】 別の実施形態において、例えば、本発明のポリヌクレオチドのような異種コー
ド配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺ
ａｌｐｈａ）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニングし、そしてメタノ
ールの非存在下で酵母培養物を増殖させることにより達成され得る。
【０１２５】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失ま
たは置換するように操作されており、そして／または本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含む
ように操作され、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／ま
たは増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種制
御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）ならびに内因性ポ
リヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９
７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月
２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日
に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９
８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体において参考として援
用される）。
【０１２６】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリ
ペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用によ
り合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸
アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古
典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミ
ノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸
、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、
Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイ
シン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトル
リン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリ
シン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナー
アミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチ
ルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）
またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１２７】 天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され
得る。これらの技術としては、例えば、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラ
ニンスキャニングＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、ａｒｔｅｒら
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌ
ｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照
のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５
（１９８５）を参照のこと）、制限選択（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃ
ｔｉｏｎ）（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．
Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）変異誘発
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変される本発明のポリペプチドをさらに含む。任意の多数の化学的改変は、以下
を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、
トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による
特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存
在下での代謝合成；など。
【０１２９】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０１３０】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの
分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を
含み得る。
【０１３１】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポ
リエチレングリコールは、約２００；５００；１０００；１５００；２０００；
２５００；３０００；３５００；４０００；４５００；５０００；６０００；６
５００；７０００；７５００；８０００；８５００；９０００；９５００；１０
，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，０００；１２，
５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５００；１５，０
００；１５，５００；１６，０００；１６，５００；１７，０００；１７，５０
０；１８，０００；１８，５００；１９，０００；１９，５００：２０，０００
；２５，０００；３０，０００；３５，０，００００００；４０，０００；５
０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７５
，０００；８０，０００；８５，０００；９０，０００；９５，０００；または
１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１３２】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝鎖を有していてもよい。分枝
ポリエチレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４３
，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓ
ｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５− ２７５０（１９９９）
；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−
６４６（１９９９）（これらの各々の開示は、参考として援用される）。
【０１３３】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【０１３４】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学系を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）またはタ
ンパク質の１つより多くの型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸またはシステインおよびそれらの組み合わせ）にポ
リエチレングリコールを結合し得る。
【０１３５】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１３６】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、か
なり多数の手段によって、達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、
直接的または介在性リンカーによってのいずれかによってタンパク質に付着され
得る。タンパク質にポリエチレングリコールを付着させるためのリンカーレス（
ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）システムは、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）
；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１
８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０
５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載される。こ
れらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１３７】 介在性リンカーを伴わずに、ポリエチレングリコールを直接、タンパク質のア
ミノ酸残基に付着させるための一つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ
）されたＭＰＥＧを利用する。トレシル化されたＭＰＥＧは、塩化トレシル（Ｃ
ｌＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエ
チレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される。トレシル化されたＭ
ＰＥＧを用いるタンパク質の反応の際に、ポリエチレングリコールが、直接タン
パク質のアミン基と付着される。従って、本発明は、２，２，２−トリフルオロ
エタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレン
グリコール分子と本発明のタンパク質を反応させることによって産生されるタン
パク質ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０１３８】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在性リンカーを使用して、タ
ンパク質と付着され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この全体
の開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質とポリエチレン
グリコールを連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエ
チレングリコール抱合体（ここで、ポリエチレングリコールは、リンカーによっ
てタンパク質と接着される）はまた、化合物（例えば、ＭＰＥＧ−スクシンイミ
ジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥ
Ｇ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニ
トロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧスクシネート誘導体）とタ
ンパク質との反応によって、産生され得る。多数のさらなるポリエチレングリコ
ール誘導体およびポリエチレングリコールをタンパク質に付着するための反応化
学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その全体の開示は、本明細書中に参考
として援用される。本明細書中で設定された反応化学を使用して産生されるペグ
化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３９】 本発明の各タンパク質に付着されるポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０、以上のポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、タンパク質分
子当たりの置換の平均程度は、例えば、１−３、２−４、３−５、４−６、５−
７、６−８、７−９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１
４、１３−１５、１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９、または１
８−２０のポリエチレングリコール部分の範囲内である。置換の程度を決定する
ための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議
論される。
【０１４０】 本発明の前立腺癌抗原ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち
、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。
従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のポリペプチド、それら
の調製ならびにそれらを含む組成物（好ましくは治療薬）に関する。特定の実施
形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテト
ラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイ
マー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。
【０１４１】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列ま
たは配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列、および／または寄託された
ライブラリーに含まれる関連するｃＤＮＡクローンにおけるｃＤＮＡによってコ
ードされるアミノ酸配列に対応するポリペプチド（本明細書中に記載されるこれ
らのうちのいずれか１つに対応する、フラグメント、改変体、スプライス改変体
および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマー
は、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。特定の実
施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの
みを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異
なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形
態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを含む）あるいはホモトリマー（例えば、同一お
よび／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）である。さらな
る実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、
少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０１４２】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに
加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド
）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテ
ロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態
では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なく
ともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。
【０１４３】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチ
ドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質に
おける異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される
。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、およ
び／または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このよう
な共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号Ｙに記載されるか、または
配列番号Ｘによって、および／または寄託されたライブラリーに含まれる関連す
るｃＤＮＡクローンにおけるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドに含ま
れる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例
では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチド
において相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋
である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果であ
る。あるいは、このような共有結合は、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペ
プチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有
結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特
許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（
本明細書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配
列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結
合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテゲリン
（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間に
ある（例えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が
本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形態では、２以
上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連結される。例として
は、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に
記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられ
た本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を
用いて生成され得る。
【０１４４】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質
において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成ま
たはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを
含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可
溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から
回収される。
【０１４５】 本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性という利点を提供
し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを
優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏ
ｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および
米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタント
プロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するト
リマータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製
において用いられ得る。
【０１４６】 別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質
の会合は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペ
プチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。
【０１４７】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポ
リペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的
に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポ
リペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書
中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれるこ
とが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得
る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。
【０１４８】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、
そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリ
ペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１４９】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号Ｙの改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、
免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち
、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グ
ロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラ
スであり得る。
【０１５０】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのア
ミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは
１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因
性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、およ
び例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号
において記載のような）を含む。
【０１５１】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１５２】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように特定さ
れ得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体
はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結
合し、そして本発明のポリペプチドの排除を可能にする抗体を含む。
【０１５３】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク
質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに
対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９
５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６
５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有する
ポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原
性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性お
よび／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、
本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-2Ｍ未満、１０-2Ｍ未満、５×
１０-3Ｍ未満、１０-3Ｍ未満、５×１０-4Ｍ未満、１０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ
未満、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１
０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未
満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、
５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×
１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離
定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０１５４】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０１５５】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続いてウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を
検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存
在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、
少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、
少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が
提供される。
【０１５６】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例
えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性
化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性
化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物
学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆ア
ゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法
を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第
５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９
８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６
８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４
）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８
（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９
７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１
９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１
２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４
）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（
９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考
として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１５７】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有す。例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第
２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照のこ
と。
【０１５８】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１５９】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１６０】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１６１】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてその生成
される方法に由来する抗体ではない。
【０１６２】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される。非限
定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプ
チドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応用が検出される（例えば
、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集
しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切
な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に
融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次
に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌
する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高い
レベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドー
マクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。
【０１６３】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０１６４】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１６５】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパー三量
体たはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発
現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合す
る抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得
る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉され
た抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には
、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の
いずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化された
Ｆｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメ
インを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発
明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては
、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔ
ｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（
１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕ
ｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−
２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公
開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７
；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２
；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５
，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；
同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４
７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６
，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，
７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書
中でその全体が参考として援用される）。
【０１６６】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０１６７】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を
変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残
基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によっ
て同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣ
ＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置に
おける異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、
Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が
参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の
種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９
，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３
９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリ
ング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎ
ｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（
１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９
１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉ
ｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０１６８】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。
【０１６９】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
【０１７０】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１７１】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０１７２】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、あるいはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例
えば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特
異的に結合する、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチド
に結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドを含む。
【０１７３】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０１７４】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１７５】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０１７６】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０１７７】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１７８】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１７９】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０１８０】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０１８１】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０１８２】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロ
モーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスタ
ーの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系
である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋ
ｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１８３】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１８４】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１８５】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１８６】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異
種ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能
マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色
体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はク
ローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分
子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作さ
れた細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリー
ニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０１８８】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４
８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎ
ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１
７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２
１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ
技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に
適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）
；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ
−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これ
らはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０１８９】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０１９０】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、
過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含
み得る。
【０１９１】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０１９２】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、
抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた
、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法にお
いて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３
／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇ
ｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこ
と。これらは、その全体が参考として援用される。
【０１９３】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多重体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を形成する。例えば、本発明
のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合
を通して二量体を形成し得る。より高度の多重体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡ
およびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプ
チドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において公知で
ある。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；
同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５
１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６
６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａ
ｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−
１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９
０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献
はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１９４】 上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号Ｙの変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半
減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセ
イにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに
、配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して
、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初
の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領
域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，
８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８
８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合
または結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質または
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさら
に効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７
０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部
分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動
態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパ
ク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させること
が望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場
合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、
ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定する
ための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合さ
れてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０１９５】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限
定されない。
【０１９６】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結合さ
れ得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る
金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な
酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補
欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／
ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオ
レセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジ
ニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げら
れ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては
、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切
な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが
挙げられる。
【０１９７】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒
または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パ
クリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、
臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎ
ｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈ
ｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオ
ン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グル
ココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、
およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる
。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン
、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆ
ｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、
メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、
カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド
（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール
、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン
白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノ
ルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば
、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイ
シン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、なら
びに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、
それらに限定されない。
【０１９８】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例
えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９
号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照の
こと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１
０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオス
タチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカ
イン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ
−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」
）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０１９９】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２００】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２０１】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
【０２０２】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０２０３】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０２０４】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。
【０２０５】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。
【０２０６】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認め得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２０７】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含す
る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウン
ドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウエ
スタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２０８】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬ
ＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２０９】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の
抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む
。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に
結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２１０】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害ま
たは予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それ
らの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定
されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載
されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２１１】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０２１２】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２１３】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２１４】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4 Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7 Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０- 10 Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ
、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２１５】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２１６】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２１７】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２１８】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。
【０２１９】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２２０】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６
３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ
９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得
、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（
ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２２１】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０２２２】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２２３】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２２４】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選択下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０２２５】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０２２６】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２２７】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２２８】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２２９】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。
【０２３０】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能であ
る。
【０２３１】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２３２】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明のポリペプチドまたは抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を
提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その
効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被
験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げ
られるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、
そして最も好ましくはヒトである。
【０２３３】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２３４】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合
物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注
射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を
包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２３５】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプ
ラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよ
うな膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達
成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０２３６】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２３７】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部の
みを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２３８】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２３９】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０２４０】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２４１】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２４２】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２４３】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外插され得る。
【０２４４】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２４５】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２４６】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出に
ついて提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を
使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする
工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較
する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッ
セイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示
す。
【０２４７】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０２４８】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１
２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。
【０２４９】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０２５０】 被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜
２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。
インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒ
ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編
、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０２５１】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標
識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与
後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。
別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日
間である。
【０２５２】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患また
は障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最
初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０２５３】 標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法
を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされない
が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影
法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が
挙げられる。
【０２５４】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を
用いて患者から検出される。
【０２５５】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器中に、本発明の抗体（好ましくは精製さ
れた抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に分離
されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態にお
いては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合（例えば、この
抗体は、検出可能な基質（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合
物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第
二の抗体は、検出可能な基質と結合体化され得る）を検出するための手段を備え
る。
【０２５６】 本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピ
トープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、この
ようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイト
メトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化
合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態にお
いては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に
合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた
、固体支持体に付着され得る。
【０２５７】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗
原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０２５８】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質
的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗
体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナ
ール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競
合抗原を含み得る。
【０２５９】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または
比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイン
キュベートすることにより検出される酵素である。
【０２６０】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０２６１】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。
【０２６２】 （ポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定された各々のポリヌクレオチドは、試薬として多数の方法に
おいて使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そし
て公知の技術を利用する。
【０２６３】 本発明の前立腺癌抗原ポリヌクレオチドは、染色体同定のために有用である。
実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんど
利用可能ではないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するまま
である。各々の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特に標的化され、そ
してこの位置にハイブリダイズされ得る。従って、本発明の各々のポリヌクレオ
チドは、当該分野で公知の技術を用いて染色体マーカーとして慣用的に使用され
得る。
【０２６４】 簡単に言うと、配列は、配列番号Ｘで示される配列またはそれに対する相補体
からＰＣＲプライマー（好ましくは、少なくとも１５ｂｐ（例えば、１５〜２５
ｂｐ））を調製することによって染色体にマッピングされ得る。プライマーが、
ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまたがらないように、プ
ライマーは、コンピューター分析を使用して必要に応じて選択され得る。次いで
、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲ
スクリーニングのために使用される。配列番号Ｘに対応するヒト遺伝子を含むハ
イブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。
【０２６５】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチ
ドの下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグ
メントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピング戦略
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌａｂｅｌｅｄ
ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、染色体特異的ｃＤ
ＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択、およ
びコンピューターマッピング技術（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：４５
６−４５９（１９９８）など）を含む。
【０２６６】 ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド（ｓｐｒ
ｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して獲
得され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチド
を使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい
。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｐｅ
ｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。
【０２６７】 染色体マッピングについては、ポリヌクレオチドは、個々に（単一染色体また
はその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位およ
び／または複数染色体をマークするために）使用され得る。
【０２６８】 従って、本発明はまた、染色体の位置決定のための方法も提供し、この方法は
、（ａ）表３におけるポリヌクレオチド配列および配列番号ＸからＰＣＲプライ
マーを調製する工程、ならびに（ｂ）個々の染色体を含む体細胞ハイブリッドを
スクリーニングする工程を包含する。
【０２６９】 本発明のポリヌクレオチドは、同様に、放射線ハイブリッドマッピング、ＨＡ
ＰＰＹマッピング、および長範囲制限マッピングに有用である。これらの技術お
よび当該分野で公知の他の技術の概説について、例えば、Ｄｅａｒ「Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄ
ｏｎ（１９９７）；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１〜６９４（
１９９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３〜４９
２（１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０
９〜４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．６２：２６５〜２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ、Ｊ．Ｈｅ
ｒｅｄ．９０：６８〜７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考とし
て本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２７０】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌ
ｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通し
てオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピ
ング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体
領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の
うちの１つであり得る。
【０２７１】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間での本
発明のポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。ま
ず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッド
において、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点
変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で観察されたが、正常
な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ること
を示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝
子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求される。新しい多型
性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用さ
れ得る。
【０２７２】 さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現
が、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（
変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカ
ーとして使用され得る。
【０２７３】 従って、本発明は、罹患していない個体と比較して、罹患した個体における前
立腺癌ポリヌクレオチドの発現レベルの増加または減少を検出する方法を提供し
、この方法は、本発明のポリヌクレオチド、および実施例１１に記載される方法
を含むがこれに限定されない、当該分野で公知の技術を使用する。これらの変化
（発現の変化、染色体再配列または変異）のいずれもが、診断マーカーまたは予
後マーカーとして使用され得る。
【０２７４】 従って、本発明はまた、前立腺癌を含む前立腺関連障害の診断の間に有用な診
断方法を提供し、この方法は、個体由来の前立腺組織または他の細胞または体液
中の前立腺癌ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および測定された
遺伝子発現レベルを標準の前立腺癌ポリヌクレオチド発現レベルと比較する工程
を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子発現レベルの増加または減少
が、前立腺関連障害の指標になる。
【０２７５】 なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／またはガン性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキット
を含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと
特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌク
レオチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、この
キットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオ
チドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー
末端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０２７６】 例えば、腫瘍の診断を含む、前立腺関連障害の診断が既に従来方法によって行
われている場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、それによっ
て増強または抑制された前立腺癌ポリヌクレオチドの発現を示す患者が、標準レ
ベルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経
験する。
【０２７７】 「前立腺癌ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、前
立腺癌ポリペプチドのレベルまたは前立腺癌ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
のレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク
質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対
的（例えば、第２の生物学的サンプル中の前立腺癌ポリペプチドレベルまたはｍ
ＲＮＡレベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的
に測定または評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル
中の前立腺癌ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、
そして標準の前立腺癌ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較さ
れ、この標準は、前立腺関連障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サ
ンプルから得られるかまたは前立腺関連障害を有さない個体の集団由来のレベル
を平均することによって決定される。当該分野で認識されるように、一旦標準的
な前立腺癌ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になれば、これを、
比較のための標準として反復して用い得る。
【０２７８】 「生物学的サンプル」によって、前立腺癌ポリペプチドまたは対応するｍＲＮ
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意
の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、前立
腺癌のポリペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液
および髄液）、前立腺組織および前立腺癌ポリペプチドを発現することが見出さ
れた他の組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法
は、当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検
が好ましい供給源である。
【０２７９】 上記で提供された方法は好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適
用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，
８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載さ
れる、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、前立腺
癌ポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、前立腺癌ポ
リヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチドとの間の多
型性を同定し得る。このような多型の知識（すなわち、その多型の位置、および
その多型の存在）は、多くの障害（例えば、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、
生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖性障害、ならびに／ま
たは癌性疾患および癌性状態）について、疾患遺伝子座を同定する際に有益であ
るが、最も好ましくは、前立腺関連の増殖性および／または癌性の疾患および状
態において、疾患遺伝子座を同定する際に有益である。このような方法は、米国
特許第５，８５８，６５９号および同第５，８５６，１０４号に記載される。上
記に参照した米国特許は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２８０】 本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、前立腺癌ポリ
ヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体支
持体、すなわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として役立つ
。本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡア
ナログであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについてのモ
ノマー単位が市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｃｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
。ＤＮＡの特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体
）は、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ
．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９
７（１９９７）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈ
ｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄ
ｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．
Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開示
されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、
そしてヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合
するよりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力
が存在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これに
よって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリ
ンジェンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容
易にする。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用い
られ得る。さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブ
リダイゼーションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マー
における単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃
〜１６℃であるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるか
らである。また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーショ
ンが、低いイオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を減
少させることを意味する。
【０２８１】 本発明は、哺乳動物におけるガンの検出を含むがこれらに限定されない用途を
有する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増
殖新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性
骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血
病、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨
髄性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好まし
い哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒト
である。
【０２８２】 病理学的細胞増殖障害はしばしば、原癌遺伝子の不適切な活性化に関連する（
Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕｔｅ
Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｖｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖｉｒ
ａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８２
（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性に転
写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正常な
細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じると
考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変更さ
れた発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因と関
与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形成に
関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例にお
いて増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０２８３】 例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６０において高
度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公
開番号ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’
末端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタン
パク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍ
ＲＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起
こすことが示されている（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓｔ
ｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８
）；Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７
９（１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種々
の起源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血性の細胞
および組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０２８４】 前記に加えて、前立腺癌抗原ポリヌクレオチドは、三重らせん形成を通して、
またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために
使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．５６：５６０（１９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１
９８８）において考察される。三重らせん形成は例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅ
ｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）において考察される。両方の方
法は、相補的ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依存する
。これらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長
のオリゴヌクレオチドであり、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−
Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏ
ｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲ
ＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０
（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれか
に相補的である。三重らせん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を
生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍ
ＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンス
ＲＮＡまたはＤＮＡが、インビボで発現されて本発明の抗原のポリペプチド産生
を阻害し得るように細胞に送達され得る。両方の技術は、モデル系において効果
的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾患を処置するための試みにお
いて、特に、増殖性疾患および／または状態の処置のために、アンチセンスまた
は三重らせんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【０２８５】 本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、
高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標
は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主
細胞中に新しい形質を生成することである。
【０２８６】 ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
ＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバン
ドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認識
票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれた
りすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない
。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとし
て使用され得る。
【０２８７】 本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使
用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして単離
するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択さ
れたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有する
ので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベー
スが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡してい
ようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプル
からなされ得る。
【０２８８】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｐ
ｕｔｕｍ）またはサーファクタント、尿、糞便物質など）のような非常に小さな
生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。
ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子
座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使
用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が
増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについ
てのバンドの同定セットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医
学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
【０２８９】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、前立腺または前
立腺癌ポリヌクレオチドに特異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る
。このような試薬のパネルは、種および／または器官型によって組織を同定し得
る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニン
グするために使用され得る。
【０２９０】 本発明のポリヌクレオチドはまた、生物学的サンプル中に存在する組織または
細胞型の示差的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。同様に、本発明のポリペプチドに関するポリペプチドおよび抗体は、組織（例
えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞学アッセイ）の
示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用である。さらに、「標
準」遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有しない個体からの健康組織の発現レ
ベル）と比較して、上記の組織または細胞の多くの障害に対して、本発明のポリ
ヌクレオチド／ポリペプチドの有意に高いかまたは低いレベルの遺伝子発現が、
例えば、障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、本発明の組織発
現ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、前立腺および前立腺癌組織お
よび／または癌性組織および／または創傷組織）または体液（例えば、漿液、血
漿、尿、滑液または髄液）において検出され得る。
【０２９１】 従って、本発明は、障害の診断的方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）個
体の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）遺伝子発
現レベルを標準発現レベルと比較する工程であって、これによって、標準発現レ
ベルと比較してアッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害の指標
となる、工程、を包含する。
【０２９２】 少なくとも、本発明のポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして
、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」す
るためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるため
のオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体
を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
【０２９３】 （ポリペプチドの使用） 本明細書中に同定される各ポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下
の説明は、例示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０２９４】 本発明のポリペプチドに指向されたポリペプチドおよび抗体は、組織（例えば
、ＡＢＣイムノペルオキシダーゼ（Ｈｓｕら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔ
ｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８８（１９８１）））または細胞型（例えば、免
疫細胞学アッセイ）の示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用
である。
【０２９５】 抗体は、当業者にとって公知の古典的な免疫組織化学方法を使用して生物学的
サンプル中の本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレ
ベルをアッセイするために使用され得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋｎｅｎら、
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこ
と）。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用な他の抗体をベースとする方法
は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセイを含む。適切な抗体アッセイ標識は、当
該分野で公知であり、例えば、グルコースオキシダーゼのような酵素標識；放射
性同位体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫
黄（35Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、 111 Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、
ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）
、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐ
ｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、 105 Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例え
ば、フルオロセインおよびローダミン）、およびビオチンが挙げられる。
【０２９６】 生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルをアッセイすることに加
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質を
インビボで画像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線ラジオグ
ラフィー、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオ
グラフィーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に
対して明白には有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含
む。ＮＭＲおよびＥＳＲに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能
な特徴的なスピンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのた
めの栄養素を標識することにより抗体に取り込まれ得る。
【０２９７】 放射性同位体（例えば、131Ｉ、121Ｉ、99mＴｃ、（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、12 1 Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩ
ｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）
、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）
、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、17 7 Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒ
ｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁
気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識された
、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫系の障害について調べ
られるために哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入され
る。被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するた
めに必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位
体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、99m
Ｔｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドを発現する細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ
．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏ
ｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ
．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０２９８】 １実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と関連した本発
明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドおよび／または抗体によって
コードされたポリペプチド）を投与することによって細胞への本発明の組成物の
特異的送達のための方法を提供する。１実施例において、本発明は、標的化細胞
に治療用タンパク質を送達するための方法を提供する。別の実施例において、本
発明は、一重鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二重鎖核
酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソーム的に複製され
得、そして転写され得るＤＮＡ）を標的化された細胞に送達するための方法を提
供する。
【０２９９】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞障害性プロドラッグと関連
する本発明のポリペプチドを投与することによって細胞の特異的な破壊（例えば
、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０３００】 「毒素」とは、内因性細胞障害性エフェクター系、放射性同位体、ホロトキシ
ン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触媒性サブユニット、または規定
された条件下で細胞死をもたらす細胞表面においてもしくは細胞表面上で通常存
在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意
味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素として、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、例えば、固有のまたは
誘発性の内因性細胞障害性エフェクター系と結合する抗体（またはそれらの部分
を含有して結合する相補結合）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮ
Ａアーゼ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ、ジ
フテリア毒素、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）
、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質（
ｐｏｋｅｗｅｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、α−サルシン（ａ
ｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素のような化合物。「毒素」として、
また、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤、治療薬剤または放射性金属イオン（例
えば、213Ｂｉまたは他の放射性同位体（例えば、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68 Ｇａ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙ
ｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イットリウム、117スズ、186レニウ
ム、166ホルミウム、および188レニウム）のようなα−放射体）；発光標識（例
えば、ルミノール）および蛍光標識（例えば、フルオロセインおよびローダミン
）、およびビオチンが挙げられる。
【０３０１】 当該分野において公知の技術は、本発明（抗体を含む）のポリペプチドを標識
するために適用され得る。このような技術として、二官能性結合剤の使用（例え
ば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６
９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第
５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号
；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５
６０号；および同第５，８０８，００３号（それぞれの内容は、本明細書中にお
いて、全体を通して参考として援用される）を参照のこと）が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０３０２】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中の本発明の前立腺癌ポリペプチドの発現レベルをアッセイする工程
、より好ましくは個体の前立腺細胞または精液における本発明の前立腺癌ポリペ
プチドの発現レベルをアッセイする工程；および（ｂ）アッセイされたポリペプ
チド発現レベルを標準のポリペプチド発現レベルと比較する工程を包含し、これ
によって、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチドの発現
レベルの増加または減少が、障害の指標になる。癌に関しては、個体由来の生検
組織中での比較的多量の転写物の存在は、この疾患の発症の素因を示し得るか、
または実際の臨床症状の出現前にこの疾患を検出するための手段を提供し得る。
この型のより決定的な診断は、保健専門家が、より早期に予防的測定または積極
的処置を用い、それによって癌の発症またはさらなる進行を予防することを可能
にし得る。
【０３０３】 さらに、本発明の前立腺癌抗原ポリペプチドを用いて、疾患または状態（例え
ば、ニューロン障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心臓
血管障害、腎臓障害、増殖性障害ならびに／または癌性疾患および状態、好まし
くは前立腺の増殖性障害ならびに／または癌性疾患および状態）を処置または予
防し得る。例えば、患者には、ポリペプチド（例えば、インスリン）の非存在ま
たはレベルの減少を置換すること、異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビン
Ｂに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）の非
存在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチド（例えば、ガン遺伝子ま
たは腫瘍サプレッサー）の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を（例えば
、レセプターに結合することによって）活性化すること、遊離リガンド（例えば
、炎症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）について、膜結合
レセプターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること
、または所望の応答（例えば、血管の増殖阻害、増殖細胞または組織に対する免
疫応答の増強）をもたらすことに取り組む際に、本発明のポリペプチドが投与さ
れ得る。
【０３０４】 同様に、本発明のポリペプチドに対する抗体もまた使用されて（上記の、およ
び本明細書のどこかに記載の）疾患を処置し得る。例えば、本発明のポリペプチ
ドに対する抗体の投与によって、そのポリペプチドに結合して、および／または
ポリペプチドを中和して、および／またはそのポリペプチドの過剰産生を低減し
得る。同様に、抗体の投与によって、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセ
プター）へ結合することにより、そのポリペプチドを活性化し得る。
【０３０５】 少なくとも本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得
る。ポリペプチドを用いてもまた、抗体を惹起し得、次いで、この抗体を使用し
て、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞からのタンパク質発
現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドを使用して、以下の生物学的活性
を試験し得る。
【０３０６】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置または予防するための遺
伝子治療方法に関する。この遺伝子治療法は、本発明のポリペプチドの発現を達
成するために、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ
）配列を動物へ導入することに関する。この方法は、プロモーター、および標的
組織によるこのポリペプチドの発現のために必要な任意の他の遺伝的エレメント
に作動可能に連結された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を必要とする。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公知であ
り、例えば、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９０／１１０９２を参照の
こと。
【０３０７】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、本発明のポリペプチ
ドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知であ
る。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｓｔ．，８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら
，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：１０７−１１１２（１９９３）；Ｆ
ｅｒｒａｎｔｉｎｉ、Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−
４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０
：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，
Ｌ．ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；
Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−
１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらの文
献は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態では、操作される細
胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈周囲の組織への直接注射に
よって、またはカテーテル注射によって患者に再度導入され得る。
【０３０８】 以下でより詳細に考察するように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可能
な物質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、
肺、肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。このポリヌクレオ
チド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリアにて送達され得る。
【０３０９】 １つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドと
して送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞
への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（
ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈殿
剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはま
た、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物などは、当
業者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、本明細書
中に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９
，４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。
【０３１０】 遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は好まし
くは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含まない、構築物で
ある。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮ
ＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＩ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、および
ｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明白で
ある。
【０３１１】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌク
レオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３１２】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３１３】 ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓
、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精
巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空
間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間の
ムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラー
ゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリクスまたは骨の裂孔
中の結合組織内の同じマトリクスを含む。これは、同様に、循環の血漿およびリ
ンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間へ
の送達は、以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド
構築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。
本発明のポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞
に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化
細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維
芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを
取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０３１４】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。
【０３１５】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられる
カテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３１６】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０３１７】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３１８】 特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で
複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性
（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する
。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷
電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性
リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考とし
て援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考と
して援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本
明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１
９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示さ
れている。
【０３１９】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より
入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３２０】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。
【０３２１】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知であ
る。
【０３２２】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの
各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴が、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
【０３２３】 このリポソームとしては、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソー
ム（ＳＵＶ）または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好
ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調
製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅ
ｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７
（１９８３）を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブ
の壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質
の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理
により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を
、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン
性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸
濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合す
る。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソー
ムおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメン
トを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製
される。一般に使用される方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐ
ａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１
９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７
；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：
８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１
９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉ
ｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１
９７９）７６：１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅ
ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ
、Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｕｏｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄ
ｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの
文献は本明細書中で参考として援用される。
【０３２４】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３２５】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３２６】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮ
Ａを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操
作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとして
は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０３２７】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１
２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに
限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケー
ジング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定さ
れない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポ
ソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０３２８】 このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞
は、本発明のポリペプチドを発現する。
【０３２９】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるポリヌク
レオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイル
スは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そして発現し、それと同時に通
常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように
操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体へ
の組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減さ
れる。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れた安
全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔ，Ａ．Ｒ．ら、（１９７
４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終
的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アン
チトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１
〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５
５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとす
る広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６）。
【０３３０】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。
【０３３１】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたは
Ｌ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３３２】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中では
ない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。
３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組
み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。その
ようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特
許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７
８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８
，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３３３】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフ
ェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意
の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに
感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイ
ルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、
またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェ
クトおよび感染されると、それらはポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶ
ウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、こ
れらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞
は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発明の
ポリペプチドを発現する。
【０３３４】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコード
している配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存
在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベ
ルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３３５】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プ
ロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３３６】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３３７】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０３３８】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモ
ーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現
を駆動する。
【０３３９】 好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、そのタ
ンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配
列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で
発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列
は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランス
フェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公
知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０３４０】 その投与形態によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投
与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイ
オリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝
子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅ
ｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐
剤用の固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングま
たは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウ
ム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミ
ド直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａ
ｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０３４１】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域内部に直接注射によ
り投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成
物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリ
メートルで注射することを言う。
【０３４２】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０３４３】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０３４４】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１
１２８１、１９９２を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える
能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成す
ることにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当
該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられ
る。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレ
オチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０３４５】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０３４６】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、特にヒトが好ましい。
【０３４７】 （生物学的活性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをアッセイに使用し、１つ以上の生物学的活性について試験し得
る。本発明のこれらのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニス
トもしくはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示す場合、これらの
分子はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るようである。従って、この
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニ
ストを使用し、関連した疾患を処置し得る。
【０３４８】 （免疫活性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化ま
たは阻害することにより、免疫系の欠損または障害の処置において有用であり得
る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性幹細胞から骨
髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞
（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫の欠損または障害の病
因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己免
疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であ
り得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーま
たは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０３４９】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、造血細胞の欠損または障害の処置または検出において有用で
あり得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連
した障害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増
殖を増加させるために用いられ得る。免疫不全症候群の例としては、血液タンパ
ク質の障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛
細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感
染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺細
菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ
障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、それらに限
定されない。
【０３５０】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を止めること）また
は血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活
性を増大させることにより、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液凝固の障害（例えば、
無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板の障害（例えば、血小板減少症）、
あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止
血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、凝血を阻害ま
たは溶解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置に
おいて、これらの分子は重要であり得る。
【０３５１】 自己免疫障害の処置または検出において、本発明のポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、有用であり得
る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質として不適切に自己認
識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす免疫応
答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻
害し得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストも
しくはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の防止において効果的な治療であ
り得る。
【０３５２】 処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力
症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、類天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ラ
イター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデ
ス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、
および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３５３】 同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、
アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る
。さらに、これらの分子を使用し、抗原性分子に対するアナフィラキシー、過敏
症または血液型不適合性を処置し得る。
【０３５４】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをまた使用し、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を
処置および／または予防し得る。器官拒絶は、免疫応答を介して宿主免疫細胞に
よる移植組織の破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与
しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答
、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、本発明のポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、器
官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。
【０３５５】 同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストをもまた使用し、炎症を調節し得る。例えば、このポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使
用して、慢性の前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関連
する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群（Ｓ
ＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節
炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症
、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾
患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、Ｔ
ＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両方
の状態の炎症状態を処置し得る。
【０３５６】 （過増殖障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用し、新生物を含む過増殖性障害を処置または検出し得る。
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、直接的または間接的な相互作用を介してこの障害の増殖を阻害
し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、過増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖さ
せ得る。
【０３５７】 例えば、免疫応答を増大させること、特に過増殖障害の抗原性の質を増大させ
ることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、
過増殖性障害を処置し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応
答を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、
免疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過増殖性障害を処置す
る方法であり得る。
【０３５８】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置または検出され得る過増殖性障害の例としては、結
腸、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下
垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭および首、神経（中枢および末梢）
、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、ならびに尿生殖器に位置する新
生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５９】 同様に、他の過増殖性障害もまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得
る。そのような過増殖性障害の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増
殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、セザリー症候群、ヴァルデン
ストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の
過増殖疾患、さらに上記に収載されている器官系に位置している新生物が挙げら
れるが、それらに限定されない。
【０３６０】 １つの好ましい実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを利用して、本発明、
および／またはタンパク質融合物もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療
により、異常な細胞分裂を阻害する。
【０３６１】 従って、本発明は、異常に増殖している細胞に、本発明のポリヌクレオチドを
挿入することにより細胞増殖障害を処置するための方法を提供する。ここで、上
記のポリヌクレオチドは、上記の発現を抑制する。
【０３６２】 本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖障害を処置する方法を提供し
、この方法は、異常に増殖している細胞に本発明の１つ以上の活性な遺伝子コピ
ーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチドは、上記のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効
な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形
態において、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築物を細胞に挿入
して、レトロウイルス（または、より好ましくは、アデノウイルスベクター）を
利用して処置する（参考として本明細書中に援用される、Ｇ Ｊ．Ｎａｂｅｌら
、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４−３２６を参照のこと）。最も好ましい実
施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして非増殖細胞を形
質転換せず、増殖細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい実施形態において
、増殖している細胞に、単独で、または他のポリヌクレオチドとともに、もしく
は他のポリヌクレオチドと融合して挿入される本発明のポリヌクレオチドは、次
いで、外部刺激（すなわち、磁性、特定の低分子、化学物質、または薬物投与な
ど）により調節され得る。この刺激は、上記のポリヌクレオチドの上流にあるプ
ロモーターに作用して、コードされたタンパク質産物の発現を誘導する。このよ
うにして、本発明の有益な治療効果は、上記の外部刺激に基づいて、明らかに調
節され得る（すなわち、本発明のポリヌクレオチドの発現を増加、減少、または
阻害するために）。
【０３６３】 本発明のポリヌクレオチドは、発癌性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」により、遺伝子の転写の抑
制、遺伝子転写物（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）の分
解、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後
修飾の妨げ、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図する
。
【０３６４】 異常に増殖する細胞に対する局所的な投与に関しては、本発明のポリヌクレオ
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション
、例えば、リポソームのようなビヒクルにおいて、リポフェクチン、または裸の
ポリヌクレオチド、または本明細書中全体を通して記載される任意の他の方法が
挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺
伝子送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ
３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３０１４）；ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａ
ｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５））また
は他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２（
１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの参考文献は、例示
にすぎず、そして本明細書中に参考として援用される。異常に増殖している細胞
に特異的に送達するか、またはそれをトランスフェクトし、そして非分裂細胞を
残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスまたはアデノウイル
ス（例えば、当該分野または本明細書中で記載される）送達系を利用することが
好ましい。宿主ＤＮＡ複製は組み込むためにレトロウイルスＤＮＡが必要である
ので、このレトロウイルスは、その生活環についての必要とされるレトロウイル
ス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明のポリヌクレオチドのため
に、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上記の遺伝子および構築物を
、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂性の正常細胞を残す。
【０３６５】 本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接注射針を導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時に
疾患部位に投与され得る。
【０３６６】 「細胞増殖性障害」により、任意のヒトもしくは動物の疾患または障害が、器
官、腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒して
いることを意味される。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、細胞群
、もしくは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけられる。
【０３６７】 本発明のポリヌクレオチドの任意の量は、この量が、処置細胞の増殖に対して
生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の１つよ
り多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能である。「
生物学的に阻害性の」により、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞の増
殖または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、標的
の悪性または組織培養において異常に増殖している細胞の成長、動物および細胞
培養物における腫瘍成長に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価するこ
と、あるいは当業者に公知の任意の他の方法により決定され得る。
【０３６８】 本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この方法は、上記の障害の１つ以
上を処置するために、哺乳動物患者（好ましくはヒト患者）に抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体）を生成するための方法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。この
ような抗体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように
薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０３６９】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の概要は、例えば、補体（ＣＤＣ）
もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるように、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、ま
たは抗体の直接的な細胞傷害性により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
【０３７０】 詳細には、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載さ
れるように、細胞増殖性障害および／または分化障害を有するか、または発症し
ている被験体を処置するために有用である。このような処置は、単一用量または
複数用量の抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、または結合体を投与する
工程を包含する。
【０３７１】 本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
【０３７２】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのフラグメントもしくは
領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または
中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に関する障害に関するイムノアッセイおよびその治療
の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ま
しくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×
１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×
１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ
、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、お
よび１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性を含む。
【０３７３】 さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載されるように
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の
阻害を通じて、間接的に達成され得る（本明細書中に参考として援用される、Ｊ
ｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：
１６４８−５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生じ
得る（本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を参
照のこと）。
【０３７４】 本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）、またはそのフラグメント
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならび
にＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２（
本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ，ら、
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照
のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形
態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシス
を活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発現
を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガレ
クチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれかで
刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参考
として援用される、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１
９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９
８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２
；２３−３４（１９９８））、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２
（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５
（１９９８）を参照のこと）。
【０３７５】 本発明のポリペプチド（それに対するタンパク質融合物を含む）、またはその
フラグメントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害
は、本明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプ
チドに対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば
、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５
−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分
子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０３７６】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプ
チドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核酸、毒素、ま
たはプロドラッグを含む組成物）を含む組成物を、本発明のポリペプチドを発現
する、標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッ
グと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて
結合され得る。本発明のポリペプチド、それに対するタンパク質融合物、または
そのフラグメントは、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発
明のポリペプチドが「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対
して応答するように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強
することが公知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することに
おいて）のいずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または
抗原性を増強する際に有用である。
【０３７７】 （心臓血管障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障
害を処置し得る。
【０３７８】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０３７９】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。
【０３８０】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０３８１】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０３８２】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症（、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋
症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、
および心筋炎が挙げられる。
【０３８３】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０３８４】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞
疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静
脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａ
ｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静
脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる
。
【０３８５】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０３８６】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０３８７】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈
瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の
塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出
血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症
候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃ
ｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０３８８】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０３８９】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０３９０】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効
である。
【０３９１】 ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、こ
れらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、
カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォ
ームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固
形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙
げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。
本発明のポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、治療剤（Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ）の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本
明細書中でより詳細に記載される。
【０３９２】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０３９３】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質
をコードする他のポリヌクレオチドとともに投与され得る。脈管形成タンパク質
の例には、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１
、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子α、上皮増殖因子β、血小板誘導
内皮細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝実質細胞増殖因子
、インシュリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因
子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、および一酸化窒素シンターゼが
挙げられるが、これらには限定されない。
【０３９４】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態およ
び転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに
当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ
ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限
定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置
の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、その処置の必要な個体
に投与する工程を包含する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置するために
、種々のさらなる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アン
タゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺
癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌
、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲
状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポージ肉腫
；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾
患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限
定されない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび
／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のよ
うな癌を処置するために、局所送達され得る。
【０３９５】 なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もしくはカテーテルを
介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するよう
に、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本
明細書中において議論される。
【０３９６】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る
。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫
瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫
）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜
症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシ
ス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒ
ｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；
子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮
症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ
ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成
；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生
血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創
傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０３９７】 例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
【０３９８】 本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前
に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、
角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖お
よび黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０３９９】 さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障
、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症
、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、
および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａ
ｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧ
ａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８
）による総説を参照のこと。
【０４００】 従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織
である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢か
ら角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁され
るようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａ
ｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例え
ば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、
単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロ
セス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカ
リやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならび
にコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０４０１】 特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物に
おいて一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与の
ために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、そ
の純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記の
ように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい
実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーと
ともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形
成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治
療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有す
ることが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合に
おいて、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を
予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
【０４０２】 他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下
で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化
し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すな
わち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において
、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌ
ｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防
ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角
膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に
注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血
管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜
３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自
体から生じる炎症を低減し得る。
【０４０３】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効
量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供
される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置
するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前方角
（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入によって移植
され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放
出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、患者に
、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含する、
増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０４０４】 本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
【０４０５】 本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を
介して局所投与され得る。
【０４０６】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷
治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェー
バー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、
および血管接着。
【０４０７】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角
膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞
腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｃｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈
管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ
、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔ
ｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−
ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血
管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化
症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防す
ることによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍ
ｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌ
ｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する
疾患。
【０４０８】 出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の
有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を提供す
る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは
また、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置に
おける腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０４０９】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０４１０】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メ
ッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄ
ｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子
を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得
る。
【０４１１】 本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血
管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫
瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態におい
て、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラ
ッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切
除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、
投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態
において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手
術後に適用される。
【０４１２】 本発明の１つの局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍
、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、
その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０４１３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の
代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその
誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビ
ター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化
インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態
のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０４１４】 より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステ
ン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、
遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
【０４１５】 バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体の
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネート
および硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のよう
な硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０４１６】 タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０４１７】 広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫
酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製され
る）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）
；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ス
テロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によっ
て、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリ
ンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チ
アプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）
；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトト
レキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリ
ン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキスト
リンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（
Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリ
ンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲ
ナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（
Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａ
ｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋ
ｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９
２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カ
ルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ
）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０４１８】 （細胞レベルでの疾患） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアンタゴニストも
しくはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポ
トーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異
を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、
膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌
、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、
骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが
、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレ
ン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免
疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘ
ルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移
植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／ま
たはアンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／また
は転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０４１９】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさ
らなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下の
ような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性
、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例
えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤
血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄
腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（
肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉
腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リ
ンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、
横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細
胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気
管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、
ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経
膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫
、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）
、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されな
い）。
【０４２０】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポトーシスの増大に関連
する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハ
イマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性およ
び脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、
シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃ
ｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデ
スおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群
（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作
および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝
臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害
）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるよ
うなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０４２１】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを、治療目的のため、例
えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激す
るため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するた
めのプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激する
ことにおいて臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真
皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖
尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝
露または化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症
、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬
物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症）。本発明のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、皮膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０４２２】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増
大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以
下は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：
自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己
表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕ
ｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移
植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異
種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇ
ｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片
、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大
網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層
移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改
善するために使用され得る。
【０４２３】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍ
ａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における変化
を生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、なら
びにアゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅ
ｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐ
ｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚
、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニ
ストは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し
得る。
【０４２４】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸
の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、小腸粘膜上
で細胞保護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイル
ス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る
。
【０４２５】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損におけ
る皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬の
ような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、表
皮水疱症、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼
痛性の水疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために
使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴ
ニストもしくはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そ
して粘膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の
内層の再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、ク
ーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の
崩壊を生じる疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（ｒ
ｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症
性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドも
しくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸
管全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜
を、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得
る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもし
くはアンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処
置するために使用され得る。
【０４２６】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防およ
び治癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、急性または慢性の肺
損傷を予防または処置するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞およ
び気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上
皮および肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の
損失を生じる）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は
、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴ
ニストを使用して効果的に処置され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細
胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児に
おける硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のよ
うな疾患を処置または予防することを助け得る。
【０４２７】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、
肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスお
よび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔ
ｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生
じる肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
【０４２８】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使
用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、
いくつかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、その疾患の持続性
の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使用さ
れ得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくポリペプチド、ならびにアゴニ
ストまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移
植における補助として使用され得る。
【０４２９】 （神経学的疾患） 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストを、治療目的のため（例えば、
神経細胞増殖および／または分化を刺激するため）に使用するためのプロセスが
提供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストお
よび／またはアンタゴニストを使用して、神経性疾患を処置および／または検出
し得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または障害のマーカーまた
は検出剤として使用され得る。
【０４３０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、および／またはアン
タゴニストを用いて処置または検出され得る神経性疾患の例としては、以下が挙
げられる：脳疾患（例えば、代謝脳疾患（母体性フェニルケトン尿症のようなフ
ェニルケトン尿症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損、ピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼ欠損、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫を含む）、小脳新生物のような脳新生物
（テント下新生物、脈絡叢新生物のような脳室新生物、視床下部新生物、テント
上新生物、キャナヴァン病を含む）、小脳性運動失調のような小脳疾患（脊髄小
脳変性（例えば、毛細血管拡張性運動失調）、小脳性共同運動障害、フリートラ
イヒ運動失調、マチャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮を含む）、テント下
新生物のような小脳新生物、広汎性脳硬化症（例えば、軸周囲性脳炎、球様細胞
白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎）、脳血管障害（例え
ば、頸動脈疾患（頸動脈血栓症、頸動脈狭窄症およびモヤモヤ病を含む）、脳の
アミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳酸素欠乏症、大脳動脈硬化症、大脳
動静脈先天異常、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓症（例えば、頸動脈血栓症
、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群）、脳出血（例えば、硬膜上血腫、硬膜
下血腫およびクモ膜下出血）、脳梗塞、脳虚血（例えば、一過性脳虚血、鎖骨下
動脈盗血症候群および椎骨基部不全）、血管性痴呆（例えば、多発脳梗塞性痴呆
）、室周白斑、血管性頭痛（例えば、群発性頭痛、片頭痛）、痴呆（例えば、Ａ
ＩＤＳ痴呆複合症、初老期痴呆（例えば、アルツハイマー病およびクロイツフェ
ルト−ヤーコプ病）、老年痴呆（例えば、アルツハイマー病および進行性核上性
麻痺）、血管性痴呆（例えば、多発脳梗塞性痴呆））、脳炎（軸周囲性脳炎、ウ
イルス性脳炎（例えば、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳
炎および西ナイル熱）を含む）、急性播種性脳脊髄炎、髄膜脳炎（例えば、ブド
ウ膜脳炎症候群、脳炎後のパーキンソン病および亜急性硬化性汎脳炎）、脳軟化
症（例えば、室周白斑）、てんかん（例えば、全身てんかん（点灯麻痺を含む）
、アプサンスてんかん、ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ症候群、強直性間
代性てんかんを含む）、部分てんかん（例えば、複雑部分てんかん、前頭葉てん
かんおよび側頭葉てんかん）、外傷後てんかん、てんかん重積持続状態（例えば
、持続性部分てんかん）を含む）、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、水頭
症（例えば、ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症）、視床下部疾患
（例えば、視床下部新生物）、大脳マラリア、ナルコレプシー（脱力発作を含む
）、延髄ポリオ、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、トキソプ
ラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、中枢神経系感染（例え
ば、ＡＩＤＳ痴呆複合症、ブレーン膿瘍、硬膜下蓄膿、脳脊髄炎（例えば、ウマ
脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎）、ビスナ、大脳マ
ラリア、髄膜炎（例えば、クモ膜炎、無菌性髄膜炎（例えば、ウイルス性髄膜炎
（リンパ球性脈絡髄膜炎を含む）、細菌性髄膜炎（ヘモフィルス髄膜炎、リステ
リア髄膜炎を含む）、髄膜炎菌性髄膜炎（例えば、ウォーターハウス−フリーデ
リックセン症候群、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核）、真菌類髄膜炎（例えば、
クリプトコックス髄膜炎）、硬膜下滲出、髄膜脳炎（例えば、ブドウ膜髄膜脳炎
症候群）、脊髄炎（例えば、横断脊髄炎）、神経梅毒（例えば、脊髄ろう）、ポ
リオ（延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含む）、プリオン疾患（例えば、クロ
イツフェルト−ヤーコプ症候群、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン−シュトロイス
ラー症候群、クールー、スクラピー）、大脳トキソプラスマ症、中枢神経系新生
物（例えば、脳新生物（小脳新生物（例えば、テント下新生物）、脳室新生物（
例えば、脈絡叢新生物）、視床下部新生物およびテント上新生物を含む）、髄膜
新生物、脊髄新生物（硬膜外新生物を含む）、脱髄疾患（例えば、キャナヴァン
病）、広汎性脳硬化症（副腎脳白質ジストロフィー、軸周囲性脳炎、球様細胞白
質萎縮症、異染性白質萎縮症のような広汎性脳硬化症を含む）、アレルギー性脳
脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋
中央ミエリン溶解、横断脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性
疲労症候群、ビスナ、高圧神経症候群、髄膜症、脊髄疾患（例えば、先天性筋無
緊張症、筋萎縮性側索硬化症）、棘筋萎縮症（例えば、ヴェルドニッヒ−ホフマ
ン病）、脊髄圧迫、脊髄新生物（例えば、硬膜外新生物）、脊髄空洞症、脊髄ろ
う、スティッフマン症候群、精神遅滞（例えば、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群、ネコ
鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群）、ガングリオシドーシス（例え
ば、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）、ザントホフ病、テイ−サックス病）、ハ
ートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッ
シュ−ナイハン症候群、カエデシロップ病、ムコリピドーシス（例えば、フコー
ス蓄積症）、セロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、フェニルケトン尿症（例え
ば、母体フェニルケトン尿症）、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ル
ービンスタイン−テービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、神経系異常（例
えば、全前脳症、神経管欠損（例えば、無脳症（水無脳症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎ
ｃｅｐｈａｌｙ）を含む）））、アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜
瘤、髄膜脊髄瘤、脊椎癒合不全（例えば、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎
）、遺伝性感覚ニューロン障害および運動ニューロン障害（シャルコー−マリー
病を含む）、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ
−ホフマン病、遺伝性運動ニューロン障害および感覚ニューロン障害（例えば、
先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害）、神経症的発現（例えば、認知不
能症（ゲルストマン症候群を含む）、健忘症（例えば、逆向性健忘症）、失行症
、神経因性膀胱障害、脱力発作、伝達障害（例えば、聴覚障害（難聴、部分的聴
力欠損、大声（ｌｏｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴を含む）、言語
障害（例えば、失語症（失書症、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ
失語症を含む）、失読症（例えば、後天性失読症）、言語発達障害、発語障害（
例えば、失語症（名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む）
）、構音障害、伝達障害（例えば、発語障害（構語障害、反響言語、無言症およ
びどもりを含む）、発声障害（例えば、失声症および嗄声））、除脳硬直状態、
せん妄、束形成、幻覚、髄膜症、運動障害（例えば、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群、
運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋緊張低下、ミオクロ
ヌス、チック、斜頸および振せん）、筋緊張亢進（例えば、筋硬直（例えば、ス
ティッフマン症候群）、筋痙性、麻痺（例えば、顔面神経麻痺（耳帯状疱疹を含
む）、胃不全麻痺、片麻痺、眼筋麻痺（例えば、複視、デュエーン症候群、ホル
ナー症候群、慢性進行性外眼筋麻痺症（例えば、キーンズ症候群））、延髄麻痺
、熱帯性痙性不全対麻痺、対麻痺（例えば、ブラウン−セカール症候群、四肢麻
痺）、呼吸性麻痺および声帯麻痺、不全麻痺）、幻影肢、味覚障害（例えば、無
味覚症および味覚不全）、視覚障害（例えば、弱視、失明、色覚障害、複視、半
盲、暗点および正常以下の視覚）、睡眠障害（例えば、睡眠過剰（クライネ−レ
ヴィン症候群を含む）、不眠症、および夢遊症）、痙縮（例えば、開口障害）、
意識消失（例えば、昏睡、持続性植物状態および失神）および眩暈、神経筋障害
（例えば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無
力症症候群、運動ニューロン疾患、筋萎縮（例えば、棘筋萎縮、シャルコー−マ
リー病およびヴェルドニッヒ−ホフマン病）、ポリオ後症候群、筋ジストロフィ
ー、重症筋無力症、萎縮性ミオトニー、先天性ミオトニー、ネマリンミオパシー
、家族性周期性四肢麻痺、多発性パラミオクロヌス（ｐａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎ
ｕｓ）、熱帯性痙性不全対麻痺およびスティッフマン症候群）、末梢神経系障害
（例えば、先端疼痛症）、アミロイドニューロパシー、自律神経系疾患（例えば
、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホ
ルナー症候群、反射性交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候
群）、脳神経疾患（例えば、聴神経疾患（例えば、聴神経腫（２型神経線維腫症
を含む））、顔面神経疾患（例えば、顔面神経痛、メルカーソン−ローゼンター
ル症候群、眼球運動障害（弱視、眼振、動眼神経麻痺を含む）、眼筋麻痺（例え
ば、デュエーン症候群、ホルナー症候群、慢性進行性外眼筋麻痺症（キーンズ症
候群を含む））、斜視（例えば、内斜視および外斜視）、視神経麻痺、視神経疾
患（例えば、眼萎縮症（遺伝性眼萎縮症を含む）、視神経円板結晶腔、視神経炎
（例えば、視神経脊髄炎、乳頭水腫））、三叉神経痛、声帯麻痺、脱髄疾患（例
えば、視神経脊髄炎および脊柱前弯症）、糖尿病性ニューロパシー（例えば、糖
尿病足）、神経圧挫症候群（例えば、手根管症候群、足根管症候群）、胸郭出口
症候群（例えば、頸肋症候群）、尺骨神経圧挫症候群、神経痛（例えば、カウザ
ルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛）、神経炎（例えば、実験的
アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発神経根神経炎および神経根
炎（例えば、多発性神経根炎））、遺伝性運動ニューロン障害および感覚ニュー
ロン障害（例えば、シャルコー−マリー病）、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺
伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性感覚ニューロン障害
および自律神経ニューロン障害（先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害を
含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症およびテタニー）。
【０４３１】 （感染性疾患） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例え
ば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増
殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答
は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのい
ずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応
答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０４３２】 ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または
症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤ
ＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定され
ない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイル
ス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス
科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩ
Ｖ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例
えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウ
イルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹
ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエ
ンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス
、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイル
ス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイル
ス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、
およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイル
スは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得
る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウ
ムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、
肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アルゼ
ンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（
例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性
耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染
症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のポリペ
プチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを
用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。特定の実施
形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、以下の処置に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ
、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態におい
て、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアン
タゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するた
めに使用される。さらに具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド
、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置
するために使用される。
【０４３３】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性お
よびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅ
ａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒ
ｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅ
ｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃ
ｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａ
ｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）、
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒ
ｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏ
ｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉ
ａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例え
ば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａ
ｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ
、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌならびにＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の
科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌
血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染
症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、
ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、
ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎
（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、
パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、
猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙ
ｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリペプチドもし
くはポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこ
れらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。具体的な実施形態において、
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは
、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヅム、および
／またはＢ型髄膜炎。
【０４３４】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る、寄生生物性因
子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げら
れるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリ
プトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交
疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレ
リア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃ
ｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕ
ｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏ
ｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾
患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例
えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば
、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明の
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニ
ストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置または検出し得る。
【０４３５】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者か
ら細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操
作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る
。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原と
して用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０４３６】 （再生） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織
の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照の
こと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰
瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害
、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、また
は保護し得る。
【０４３７】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０４３８】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。
例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。
処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯
欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不
全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０４３９】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得
る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械
的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（
ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神
経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、
および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチン
トン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを用いて処置され得る。
【０４４０】 （走化性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単
球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または
内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部
位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常
性を撃退および／または治癒し得る。
【０４４１】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの
走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させる
ことによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し
得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引する
ことによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性
分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る
。
【０４４２】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分
子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走
化性のインヒビターとして使用され得る。
【０４４３】 （結合活性） 本発明のポリペプチドは、このポリペプチドに結合する分子、またはこのポリ
ペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この
ポリペプチドとこの分子との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を
活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。
そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば
、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０４４４】 好ましくは、この分子は、このポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガ
ンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは
機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）を参
照のこと）。同様に、この分子は、このポリペプチドが結合する天然のレセプタ
ー、または少なくとも、このポリペプチドによって結合され得るレセプターのフ
ラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても
、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０４４５】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ポリペプチドを発現
する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、
酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次
いで、このポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含
む細胞膜）を、好ましくは、このポリペプチドまたはこの分子のいずれかの結合
、活性の刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合
物と接触させる。
【０４４６】 アッセイは、このポリペプチドへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここ
で結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイに
おいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこのポリペプチドへの結
合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０４４７】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、ポリペプチドを含む溶液と混合する工程、ポリペ
プチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分子の活
性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０４４８】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的のいずれかの結合、または基質についてのポリペプチドとの競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０４４９】 さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、
第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポ
リアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用
いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対
する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、および
このＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そして
このポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクト
するために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされ
た細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。この
ポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位
のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０４５０】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０４５１】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセ
プター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出
し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィル
ムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、
ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され
得る。微小配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定
レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０４５２】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、それ
によって本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生
成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号
、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３
７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，
Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８
）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７
６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これら
の特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照
のこと。１つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポ
リペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャ
ッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡ
セグメントの、本発明の分子の所望の分子への構築を含む。別の実施態様におい
て、ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換えの前に、誤りがち
な（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方
法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施態様
において、本発明のポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ド
メイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ
、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施態
様において、この異種分子は、ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実
施態様において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）
−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭ
Ｐ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐ
ｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓ
ａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビ
ン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神
経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０４５３】 他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラ
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活
性に類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラ
グメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されな
い活性を含み得る。
【０４５４】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。
【０４５５】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における
特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッ
セイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産生を
阻害または増強し得る因子を発見し得る。
【０４５７】 従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する
方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ポリペプ
チドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【０４５８】 （標的化された送達） 別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のポリペプチドについて
のレセプターを発現する標的化細胞、または本発明のポリペプチドの細胞結合形
態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０４５９】 本明細書中で議論される場合、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリ
ペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性お
よび／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態におい
て、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のポリペプチド（
抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達の
ための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細
胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写さ
れ得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０４６０】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体
）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための
方法を提供する。
【０４６１】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に
従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性
エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固
定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、
アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモ
ルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボ
ウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「
細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害
性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用
され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤の
グルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシ
ンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトア
ミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６２】 （薬物スクリーニング） 本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択さ
れた化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性
をアッセイする工程を包含する。
【０４６３】 本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリ
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合
物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポ
リペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発
現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリ
ーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核
酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利
用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対して
スクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のポリペプチドと
の間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０４６４】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これ
らの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペ
プチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリ
ペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする
工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる
薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結
合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない
標識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０４６５】 薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適
切な結合親和性を有する化合物に対する高処理能力スクリーニングを提供し、そ
して欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本
明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、
大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピ
ンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明
のポリペプチドと反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したポリペプチドは
、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、前述
の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされ
る。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持
体上にそれを固定し得る。
【０４６６】 本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
【０４６７】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号Ｘに含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／表１において同定される関連
するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列に対応す
る核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内
部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（
例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を
参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス
技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重ら
せんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏ
ｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅ
ｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７
９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；および
Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において考察
される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの
結合に基づく。
【０４６８】 例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害す
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ ＴＲ
ＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レ
トロウイルスベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される
（ＷＯ９１／１５５８０）。
【０４６９】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
【０４７０】 １つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転
写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写され、本
発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、アンチ
センス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが転写されて
所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得るか、また
は染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において標準的な組
換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞において複
製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミド、ウイルスなど
であり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列またはそのフラグメントの
発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該分野で公知の任
意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性または構成性
であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅ
ｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１
９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙ
ａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペス
チミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン
遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（
１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７１】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも本発明の遺伝子のＲＮＡ転写物の一
部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必要
ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列
は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成
する配列を意味し；従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二重鎖Ｄ
ＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブ
リダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存
する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより多くの塩
基ミスマッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る
）を含み得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を
決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確
認し得る。
【０４７２】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３
５を参照のこと。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の５’
−または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチド
は、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。
ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドン
の相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従
って使用され得る。本発明のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域に
ハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は
、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０
ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、この
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオ
チド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０４７３】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒ
ｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５
２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参
照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４
（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切
断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ
ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８
−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚ
ｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）を
含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプ
チド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘
引切断剤など）に結合体化され得る。
【０４７４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０４７５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０４７６】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０４７７】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２
’−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５
：３２７−３３０）。
【０４７８】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８
８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）により合成され得、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４
５１）などの使用により調製され得る。
【０４７９】 一方、コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用され得、
転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０４８０】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用
が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を
形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。たった１つの
必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである：５’−
ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野で周知で
あり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：
５８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。配列番号Ｘの各ヌクレオ
チド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。
好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がｍＲＮＡの５’末端付近に位置
するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内
蓄積を最小化するように、操作される。
【０４８１】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいて発現する細胞に送達されるべきである。リボザイムを
コードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入のための上
記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は、強力な構
成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｌ ＩＩプロモーターのよ
うな）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを
含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因性メッセージを破壊し、そして
翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リボザイムはアンチセンス
分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率のために必要とされ
る。
【０４８２】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、
それにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において
）遅延または防止する。
【０４８３】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を阻害し得、そ
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求さ
れ得る。
【０４８４】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
防止し得る。
【０４８５】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。
【０４８６】 従って、本発明は、疾患、障害および／または状態（本発明のポリヌクレオチ
ドの過剰発現に関連する、本願の全体に渡って列挙される疾患、障害および／ま
たは状態が含まれるが、これらに限定されない）を、（ａ）本発明のポリヌクレ
オチドに指向されたアンチセンス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌク
レオチドに指向されたリボザイムを、患者に投与することによって処置する方法
を提供する。
【０４８７】 （他の活性） 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
は、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、
血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生
を刺激するための処置において利用され得る。これらのポリペプチド、ポリヌク
レオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論される
ように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
【０４８８】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
を、傷害、熱傷、手術後組織修復、および瘢痕に起因する創傷の処置にもまた利
用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞お
よび骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえダメージを受けた組
織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０４８９】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経
変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複
合体）において生じるニューロンのダメージを処置、予防および／または診断す
るために利用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストま
たはアンタゴニストは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、骨お
よび歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助の
ために利用され得る。
【０４９０】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する
皮膚の老化を予防し得る。
【０４９１】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメ
ンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからであ
る。同じ系列にそって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト
またはアンタゴニストを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場
合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０４９２】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または始原組織の細胞培養を支
持するために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。
【０４９３】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増
殖を増加または減少し得る。
【０４９４】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組
織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するため
に使用され得る。同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、および
エネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る
。
【０４９５】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
は、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑
うつ性の疾患、障害および／または状態を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、
生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモ
ンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知
の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更す
るために使用され得る。
【０４９６】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミ
ン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品
添加物または保存剤として使用され得る。
【０４９７】 上記で引用される適用は、広範な種々の宿主において使用されている。そのよ
うな宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワト
リ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ま
しい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０４９８】 （他の好ましい実施形態） 本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそ
れに対する相補鎖、および／または寄託物に含まれる関連するｃＤＮＡクローン
中のｃＤＮＡにおける少なくとも約５０の連続したヌクレオチドの配列に、少な
くとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含み、
ここで、Ｘは表１に規定されるような任意の整数である。
【０４９９】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表１中の配列番号Ｘについて第７欄およ
び第８欄で規定されるような、「始まり」および「終わり」として同定される位
置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好まし
い。
【０５００】 配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および／または寄託物中に
含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列中の、少なくと
も約１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５０１】 配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および／または寄託物中に
含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列中の、少なくと
も約５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸分子は、さらに好ましい。
【０５０２】 さらに好ましい実施形態は、表１において配列番号Ｘについて規定されるよう
な第７欄および第８欄において「始まり（Ｓｔａｒｔ）」および「終わり（Ｅｎ
ｄ）」として同定された位置の範囲における配列番号Ｘのヌクレオチド配列に少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【０５０３】 さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘの完全ヌクレオチド配列もしくはその
相補鎖、および／または寄託物中に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離
された核酸分子である。
【０５０４】 配列番号Ｘのヌクレオチド配列もしくはその相補鎖、および／または寄託物中
に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含む核酸分
子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
単離された核酸分子もまた好ましく、ここで上記のハイブリダイズする核酸分子
は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ
残基のみからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない。
【０５０５】 寄託物中に含まれるｃＤＮＡクローンを含むＤＮＡ分子を含む物質の組成物も
また、好ましい。
【０５０６】 寄託物中に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列中
の少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５０７】 少なくとも５０の連続するヌクレオチドの上記配列が、寄託物中に含まれる関
連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによりコードされるオープンリーディングフレ
ーム配列のヌクレオチド配列に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５０８】 寄託物中に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによりコードされるヌ
クレオチド配列において少なくとも１５０の連続するヌクレオチドの配列に少な
くとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ま
しい。
【０５０９】 さらに好ましい実施形態は、寄託物中に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃ
ＤＮＡによりコードされるヌクレオチド配列中の少なくとも５００の連続するヌ
クレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離さ
れた核酸分子である。
【０５１０】 さらに好ましい実施形態は、寄託物中に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃ
ＤＮＡによりコードされる完全ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【０５１１】 さらに好ましい実施形態は、以下からなる群から選択される配列中の少なくと
も５０の連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子を生物学的サンプルにおいて検出するための方法である：
配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および寄託物中に含まれる関
連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列。この方法は、上記群から
選択される配列と上記サンプル中の少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配
列とを比較する工程、および上記サンプル中の上記核酸分子の配列が、上記選択
配列に少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。核酸分子
は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０５１２】 配列を比較する上記工程が上記サンプル中の核酸分子と上記群から選択される
上記配列を含む核酸分子との間で核酸ハイブリダイゼーションの前後を決定する
ことを含む方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記工程が、上記群か
ら選択される上記配列と上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド
配列とを比較することにより行われる、上記方法もまた好ましい。
【０５１３】 さらに好ましい実施形態は、以下からなる群から選択される配列において少な
くとも５０の連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレ
オチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を（もしあれば）検出する工程を包
含する、生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定するための方法である
：配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および寄託物中に含まれる
関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【０５１４】 生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同定するための、少なくとも２
つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する
工程を包含する方法はまた好ましく、ここで上記パネル中の少なくとも１つの配
列は、上記の群から選択される配列中の少なくとも５０の連続したヌクレオチド
の配列に少なくとも９５％同一である。
【０５１５】 表１において同定される関連ｃＤＭＡクローンにおける配列番号ＸまたはｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列の異常な構造または発現と関連する病理学的状態を、被
験体において診断するための方法もまた好ましく、この方法は、以下からなる群
から選択される配列中の少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を（もしあれば）上記被
験体から得られた生物学的サンプルにおいて核酸分子を検出する工程を包含する
：配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および寄託物中に含まれる
関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【０５１６】 病的状態を診断するための上記の方法がまた好ましく、この方法は、少なくと
も２つのヌクレオチド配列のパネル（ｐａｎｅｌ）中にヌクレオチド配列を含む
核酸分子を検出する工程を包含し、ここで、上記パネル中の少なくとも１つの配
列は、上記の群から選択された配列中の少なくとも５０個の連続ヌクレオチドの
配列に、少なくとも９５％同一である。
【０５１７】 単離された核酸分子を含む問題の組成物がまた、好ましく、ここで、上記核酸
分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネルを含み
、ここで、上記パネル中の少なくとも１つの配列が、以下からなる群より選択さ
れる配列中の少なくとも５０個の連続ヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％
同一である：配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそれに対する相補鎖；および
寄託物に含まれた関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるヌク
レオチド配列。この核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０５１８】 単離された核酸分子を含む問題の組成物がまた、好ましく、ここで、上記核酸
分子のヌクレオチド配列が、ＤＮＡマイクロアレイまたは少なくとも１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１０
０、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、３０００
もしくは４０００個のヌクレオチド配列の「チップ」を含み、ここで、上記ＤＮ
Ａマイクロアレイまたは「チップ」の中の少なくとも１つの配列が、以下からな
る群より選択される配列中の少なくとも５０個の連続ヌクレオチドの配列に、少
なくとも９５％同一である：配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそれに対する
相補鎖；および表１に参照されるｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコード
されるヌクレオチド配列。この核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み
得る。
【０５１９】 配列番号Ｙのポリペプチド配列中の少なくとも約１０個の連続アミノ酸の配列
に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配
列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および／または寄託物に含まれる
関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドがまた、
好ましい。
【０５２０】 配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約３０個の連続アミノ酸の配列に少
なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番
号Ｘによってコードされるポリペプチド；および／または寄託物に含まれる関連
ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドがまた、好ま
しい。
【０５２１】 配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約１００個の連続アミノ酸の配列に
少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列
番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および／または寄託物に含まれる関
連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドがさらに、
好ましい。
【０５２２】 配列番号Ｙの完全アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を
含む単離されたポリペプチド；配列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；
および／または寄託物に含まれる関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコ
ードされるポリペプチドがさらに、好ましい。
【０５２３】 表１に参照されるｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドの完全
アミノ酸配列中の、少なくとも約１０個の連続アミノ酸の配列に、少なくとも９
０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドがさらに、好ましい
。
【０５２４】 上記連続アミノ酸の配列が、表１に参照されるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされるポリペプチドの部分のアミノ酸配列中に含まれる、ポリペプチド；配列
番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および／または配列番号Ｙのポリペ
プチド配列がまた、好ましい。
【０５２５】 表１に参照されるｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列中の、少なくとも約３０個の連続アミノ酸の配列に、少なくとも９５％
同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドがまた、好ましい。
【０５２６】 表１に参照されるｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列における、少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列に、少なくと
も９５％同一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５２７】 表１に参照されるｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列に、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチ
ドもまた好ましい。
【０５２８】 以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的
に結合する、単離された抗体はさらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列
；配列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および寄託物中に含まれる関
連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
【０５２９】 以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生物
学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチ
ド配列；配列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および表１に参照され
る関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド；この
方法は、このサンプル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸
配列を、この群から選択される配列と比較する工程、およびこのサンプル中のこ
のポリペプチド分子の配列が、少なくとも１０の連続したアミノ酸のこの配列と
少なくとも９０％同一であるかどうかを決定する工程を包含する。
【０５３０】 このサンプル中の少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を、この
群から選択される配列と比較する上記の工程が、このサンプル中のポリペプチド
の、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的
に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含む、上記の方法
もまた、好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘによってコード
されるポリペプチド；および表１に参照される関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮ
Ａによってコードされるポリペプチド。
【０５３１】 配列を比較する上記の工程が、このサンプル中のポリペプチド分子から決定さ
れたアミノ酸配列を、この群から選択される配列と比較することによって行われ
る、上記の方法もまた好ましい。
【０５３２】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する方法もまた好ましく、こ
の方法は、以下からなる群から選択される配列における少なくとも１０の連続し
たアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド分子（もし存在すれば）をこのサンプル中で検出する工程を含む：配列番号Ｙ
のポリペプチド配列；配列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および表
１に参照される関連ｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡによってコードされるポリペ
プチド。
【０５３３】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する上記の方法もまた好まし
く、この方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列
を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくと
も１つの配列は、上記の群から選択される配列における少なくとも１０の連続し
たアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
【０５３４】 被験体において、表１において同定された、ポリペプチドをコードする核酸配
列の異常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ましい
。この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて、少なくとも
２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を検
出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも１つの配列は、以下からな
る群から選択される配列における少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列と少
なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘによっ
てコードされるポリペプチド；および表１に参照される関連ｃＤＮＡクローン中
のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
【０５３５】 これらの方法のいずれかにおいて、このポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を使用することを包含する。
【０５３６】 また好ましいのは、ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。この
ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも
９５％同一である。ここでこのポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチド配列
；配列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；および表１に参照された関連
するｃＤＮＡクローン内のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドからなる
群より選択される配列内の少なくとも１０の連続するアミノ酸の配列に少なくと
も９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０５３７】 また好ましいのは、単離された核酸分子であり、ポリペプチドをコードするこ
の核酸配列は、原核生物宿主におけるポリペプチドの発現のために最適化されて
いる。
【０５３８】 また好ましいのは、単離された核酸分子であり、このポリペプチドは、配列番
号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘによってコードされるポリペプチド；およ
び表１に参照される関連するｃＤＮＡクローン内のｃＤＮＡによってコードされ
るポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０５３９】 さらに好ましいのは、組換えベクターの作製方法であり、この方法は、上記の
単離された核酸分子のいずれかをベクターに挿入する工程を包含する。また好ま
しいのは、この方法によって産生される組換えベクターである。また好ましいの
は、組換え宿主細胞の作製方法であり、この方法は、ベクターを宿主細胞に導入
する工程を包含する。ならびに、この方法によって産生される組換え宿主細胞も
また好ましい。
【０５４０】 また好ましいのは、単離されたポリペプチドの作製方法であり、この方法は、
このポリペプチドが発現され、そしてこのポリペプチドが収集される条件化で、
この組換え宿主細胞を培養する工程を包含する。また好ましいのは、単離された
ポリペプチドのこの作製方法であり、ここで組換え宿主細胞は、真核生物細胞で
あり、そしてこのポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘ
によってコードされるポリペプチド；および表１に参照される関連するｃＤＮＡ
クローン内のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドからなる群より選択さ
れるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。この方法によって産生される
単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５４１】 また好ましいのは、上昇したレベルのタンパク質活性を必要とする個体の処置
方法であり、この方法は、このような個体に治療剤（この個体における、このタ
ンパク質活性のレベルを増加するのに有効な本発明の量の単離されたポリペプチ
ド、ポリヌクレオチド、免疫原性フラグメントあるいはそのアナログ、結合試薬
、抗体、または抗原結合フラグメントを含む）を投与する工程を包含する。
【０５４２】 また好ましいのは、減少したレベルのタンパク質活性を必要とする個体の処置
方法であり、この方法は、このような個体に治療物（この個体における、このタ
ンパク質の活性のレベルを減少するのに有効な本発明の量の単離されたポリペプ
チド、ポリヌクレオチド、免疫原性フラグメントあるいはそのアナログ、結合薬
剤、抗体、または抗原結合フラグメントを含む）を投与する工程を包含する。
【０５４３】 概して、本発明を記載してきたが、例示の目的のために提供され、そして限定
を意図しない、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解
される。
【０５４４】 （実施例） （実施例１：選択されたｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離） 引用されるＡＴＣＣ寄託物中の各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター中
に含まれる。表５は、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構築する
ために用いられたベクターを同定する。多くの場合において、ライブラリーを構
築するために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクタ
ーである。以下は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各ファージ
ベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のクローンが
ベクター「Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐ」中に単離されていると表５に同定される場合
、対応する寄託クローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
【０５４５】
【化１】 ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ
．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７
：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．
ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔｏｒ
ｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販
されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマ
イシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（これ
もまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得る。ｐＢ
Ｓは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４形態で入荷する。ＳおよびＫとは
、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そして「Ｋ」とは、ＫｐｎＩ
のことであり、これらは、リンカーのそれぞれの各末端での最初の部位である）
に隣接するＴ７およびＴ３プライマー配列に対するポリリンカーの配向をいう。
「＋」または「−」とは 、ある方向においてｆ１ ｏｒｉから開始される一本
鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして他方においてアンチセンスであ
るようなｆ１複製起点（「ｏｒｉ」）の配向をいう。
【０５４６】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏ
ｒｔ３．０をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８９７から入手した。全ての
Ｓｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であ
る）に形質転換され得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ
１５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎ
ｔｏ Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、ア
ンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質
転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２
００８から入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である
）に形質転換され得る（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９１）を参照のこと）。好ましくは、本
発明のポリヌクレオチドは、表５における特定のクローンについて同定されたフ
ァージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクター配列
を含まない。
【０５４７】 表２および表５を参照して引用される、任意の所定のｃＤＮＡクローンについ
てＡＴＣＣ受託番号を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、１つ
以上のさらなるプラスミド（これは各々、その所定のクローンとは異なるｃＤＮ
Ａクローンを含む）を含み得る。従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託
物は、表１に同定される各ｃＤＮＡクローンのためのプラスミドを少なくとも含
む。
【０５４８】
【表５】 表５における特定のクローンについて引用されるプラスミドＤＮＡの寄託サン
プルからそのクローンを単離するために２つのアプローチが使用され得る。第一
に、プラスミドを、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド
プローブを使用して、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する
。
【０５４９】 特に、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告され
ている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用的な方法に従って精製
する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミド
混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技
術または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）
を用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選
択薬剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転
換体（コロニー）の密度でプレーティングする。これらのプレートを、細菌コロ
ニースクリーニングについての慣用的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の
技術に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０５５０】 あるいは、配列番号Ｘのヌクレオチド配列の両端に由来する、１７〜２０ヌク
レオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃ
ＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望のｃＤＮＡを増幅する。
ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用的な条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮ
Ａテンプレートとの反応混合物の２５μｌ中で実施する。便利な反応混合物は、
１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーお
よび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９
４℃での変性を１分間；５５℃でのアニールを１分間；７２℃での伸長を１分間
）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用い
て実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想され
る分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産
物をサブクローニングおよび配列決定することによって、選択された配列である
ことを確認する。
【０５５１】 寄託されたクローンに存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分また
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異
的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３
’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’
ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の欠けている５’末端を生成する
ために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０５５２】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
【０５５３】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮ
Ａの５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。
この反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに
連結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０５５４】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のた
めのテンプレートとして使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そし
て分析して５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０５５５】 （実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応する配列について選
択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋもまた参照のこと）。
【０５５６】 （実施例３：組織特異的発現分析） Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（ＨＧ ｓ）データベースは、組織特異的ｃＤＮＡライブラリーを配列決定することから
得られる。特定の組織より産生されるライブラリーを選択し、そしてこれらのラ
イブラリー内のＥＳＴグループまたは構築されたコンティーグの特異的組織発現
パターンを、全体のデータベース内のこれらのグループまたはコンティークの発
現パターンと比較することによって決定する。組織特異的発現を示すＥＳＴを選
択する。
【０５５７】 特異的ＥＳＴ配列を産生した本来のクローンを、目録にあるクローンのライブ
ラリーおよび挿入物（当該分野で公知の方法を使用してＰＣＲによって増幅され
た）より得る。ＰＣＲ産物を変性し、次いでナイロン膜に対する９６ウェル型内
に移し（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｅｕｌｌ）、組織特異的クローンの
アレイフィルターを産生する。ハウスキーピング遺伝子、トウモロコシ遺伝子、
および公知の組織特異的遺伝子を、このフィルター上に含む。これらの標的を、
シグナル正規化において、およびアッセイ感受性を確認するために使用し得る。
さらなる標的としては、モニタープローブの長さおよびハイブリダイゼーション
の特異性が挙げられる。
【０５５８】 放射性標識されたハイブリダイゼーションプローブを、分析される特定の組織
より調製されたｍＲＮＡ／ＲＮＡサンプルからの第１の鎖のｃＤＮＡ合成によっ
て産生する（製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示による）。ハ
イブリダイゼーションプローブを、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製し
、定量し、そして６５℃で一晩、ハイブリダイゼーションボトル中で、アレイフ
ィルターとハイブリダイズする。ストリンジェントな条件下でフィルターを洗浄
し、そしてシグナルをＦｕｊｉ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを使用して捕捉
した。
【０５５９】 ＡＩＳソフトウェアを使用してデータを抽出し、そしてバックグラウンドをサ
ブトラクトした後、シグナル正規化を行う。これは、異なる実験間のフィルター
の広い発現レベルの基準化を含む。目的の組織において示差的に発現する遺伝子
を同定し、そしてこれらのクローンの全長配列を産生する。
【０５６０】 （実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０５６１】 （実施例５：ポリペプチドの細菌性発現） 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説する
ように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅して挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿入物を
増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニン
グするために、プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限
部位を好ましくは含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌
性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（
Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモーター／
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ
（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【０５６２】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲ
ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、ＬＢプレート上で生
育するそれらの能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認す
る。
【０５６３】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種
するために使用する。細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ
．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化により誘導され、Ｐ／Ｏの障害物を除去し、遺伝子発現の
増加を導く。
【０５６４】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩ
ＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有する
タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手
順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１
９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
【０５６５】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、そのカラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０５６６】 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５
０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して
透析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに
固定化している間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を
使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、
タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出させる。イミダゾール
を、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ
ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、４
℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
【０５６７】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５
、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカ
ーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配
列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサ
ー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレータ
ー配列を合成的に作製する。
【０５６８】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。
【０５６９】 操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。
【０５７０】 （実施例６：封入体からのポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定され
ない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０５７１】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０５７２】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０５７３】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０５７４】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０５７５】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。このカラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩
衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣ
ｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に
モニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する
。
【０５７６】 次いでポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次
いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ
−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂および弱アニ
オン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを１０
カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範囲
）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタリング下で収集する
。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した）ポリペプチ
ドを含む画分をプールする。
【０５７７】 得られたポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５％より高
い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合、いかな
る主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
から観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰＳ
混在について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従
って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０５７８】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングお
よび発現） この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ポリヌ
クレオチドをバキュロウイルスに挿入し、ポリペプチドを発現する。この発現ベ
クターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（
ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、Ｘｂａ
Ｉ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使
用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同方向の弱
いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含
む。挿入された遺伝子は、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能
なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのた
めのウイルス配列と両方の側で隣接する。
【０５７９】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０５８０】 具体的には、ＡＵＧ開始コドンを含む、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮ
Ａ配列を、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然
に存在するシグナル配列を使用して本発明のポリペプチドを産生する場合、ｐＡ
２ベクターは第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒ
ｓら、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＮＯ．：１５５５（１９
８７）に記載される標準的な方法を用いて、このベクターを、バキュロウイルス
リーダー配列を含むように改変し得る（ｐＡ２ＧＰ）。
【０５８１】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロース
ゲルから単離する。次いで、このフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そし
て再び１％アガロースゲル上で精製する。
【０５８２】 このプラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野
で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る
。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。
【０５８３】 このフラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕ
ｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。このプラスミドを含む細菌を、個々のコロ
ニー由来のＤＮＡを消化し、そしてゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とにより同定する。クローニングしたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定に
よって確認する。
【０５８４】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時
トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ウイルスＤＮＡおよ
び５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清のグレー
ス培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いで、このプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をこのプレートから
除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。次いで、培養を２７℃で４日間継続する。
【０５８５】 ４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によっ
て記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラ
ークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする。（この型の「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養お
よびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチッ
プ（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そ
して組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播
種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集
し、次いで４℃に貯蔵する。
【０５８６】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染効率（「ＭＯ
Ｉ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。
放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）
に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ
−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６
時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質
ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオートラジオ
グラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。
【０５８７】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０５８８】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現） 本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞において発現させ得る。代表的な哺乳
動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント
、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必
要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚ
ａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の
初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、Ｈ
ＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
の初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、
ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。
【０５８９】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａ
ｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃｏ
ｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、およ
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０５９０】 あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トラ
ンスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０５９１】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７
−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９
０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択
マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５（１９９２））。こ
れらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっ
とも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれ
た、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳ
Ｏ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０５９２】 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロ
インスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、ならびに、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０５９３】 具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を、適切な制限酵素を用いて消化し、
次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ）を使用して脱リン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから
単離する。
【０５９４】 本発明のポリヌクレオチドは、実施例１に概説するプロトコルに従って増幅さ
れる。分泌タンパク質の産生のために天然に存在するシグナル配列が用いられる
場合、このベクターは、第２のシグナルペプチドを含む必要はない。あるいは、
天然に存在するシグナル配列が用いられない場合、このベクターは、異種シグナ
ル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと
）。
【０５９５】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。次いで、このフラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再
び１％アガロースゲルで精製する。
【０５９６】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸したベクターを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞ま
たはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入され
たフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０５９７】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６およびｐｃ４を、リ
ポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと同時トランスフ
ェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性
で選択可能なマーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐
性を付与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、
１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この
細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレ
キサートおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブ
リドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種す
る。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度
のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００
ｎＭ）を使用して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。
次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度の
メトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新た
な６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖する
クローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によっ
て分析する。
【０５９８】 （実施例９：タンパク質融合物） 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、本発明のポリぺプチ
ドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトー
ス結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ
Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、お
よびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺ
プチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的化
し得る。一方、共有結合ヘテロ二量体またはホモ二量体は、融合タンパク質の活
性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有す
るキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比
較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の
融合タンパク質の全ての型は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチドの融合を概説する以
下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改変することによっ
て作製され得る。
【０５９９】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０６００】 例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は
、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊され
るべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、Ｂ
ａｍＨＩを用いて再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載さ
れるＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、このＢ
ａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニン
グされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。
【０６０１】 天然に存在するシグナル配列が本発明のポリペプチドを産生するために使用さ
れる場合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然
に存在するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を
含むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６０２】
【化２】 （実施例１０：ポリペプチドからの抗体の産生） （（ａ）ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、本発明のポリペプチ
ドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよ
うにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するため
に、このような調製物は、動物に導入される。
【０６０３】 本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術
を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９
７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６
）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；
Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎ
ｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６
３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、本発明の
ポリペプチドで、またはより好ましくは本発明の分泌ポリペプチド発現細胞で免
疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地にお
いて培養される；好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補
充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリ
ン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変
イーグル培地において培養される。
【０６０４】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞を、このポリぺプチド
に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
【０６０５】 あるいは、本発明のポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞は、抗体の本発明のポリペプチドに特異的な抗体に結合する能力が本発明の
ポリペプチドによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するため
にスクリーニングされる。このような抗体は、本発明のポリペプチドに特異的な
抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなる本発
明のポリペプチドに特異的な抗体の形成を誘導するために使用される。
【０６０６】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、ヒト化される。このよう
な抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する
遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト化抗
体を産生するための方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に考察さ
れる。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。
【０６０７】 （（ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからの本発明のポリペプチドに対して指向
される抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかった本発明のポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメ
ントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（そ
の全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０６０８】 ライブラリーのレスキュー。 ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のよ
うに、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラ
グメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約
１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を
接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５
ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵの
Δ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７
を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュ
ベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養
物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットル
の２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン
を含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ
９２／０１０４７に記載のように調製する。
【０６０９】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０13形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０６１０】 ライブラリーのパニング。 Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明
のポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを
用いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて
３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのフ
ァージをチューブに適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室
温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チュー
ブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する
。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上
下に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１
．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したフ
ァージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファー
ジを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
有するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを
、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のた
めのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４
回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで２０倍に増加する。
【０６１１】 結合剤の特徴付け。 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用
いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッ
セイのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ
炭酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれか
で被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳ
Ａ中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公報Ｗ
Ｏ９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付
ける。これらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（
例えば、エピトープマッピング、結合親和性、レセプターシグナル形質導入、抗
体／抗原結合をブロックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴ
ニスト活性または競合的アンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得
る。
【０６１２】 （実施例１１：ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号Ｘおよび／または寄託したライブラリーに含ま
れるｃＤＮＡクローンにおける関連するｃＤＮＡのヌクレオチド配列における目
的の領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。
示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜
５８℃で６０〜１２０秒間；および７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルか
らなる。
【０６１３】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。選択したエキソ
ンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分析してその
結果を確認する。次に、疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配
列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【０６１４】 ＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記
載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹
患個体には存在しない変異により同定する。
【０６１５】 ゲノム再配置もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における改変を決定
する方法として観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキ
シゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈ
ｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９（１９９１）
に記載のようにＦＩＳＨを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリ
ダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プロー
ブとのハイブリダイゼーションを行う。
【０６１６】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐ
ｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａ
ｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析およ
び染色体部分長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたゲノム領域の染色体
変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらの変化を関連疾患の診断
マーカーとして使用する。
【０６１７】 （実施例１２：生物学的サンプル中のポリペプチドの異常レベルを検出する方
法） 本発明のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてポリペプチ
ドレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表現型
のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッ
セイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０６１８】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティングする
。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、実施
例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するポリペプチドの非特異的
結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０６１９】 次に、コーティングしたウェルを、ポリペプチド含有サンプルを用いてＲＴで
２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用し
て結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗
浄し、非結合ポリペプチドを除去する。
【０６２０】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０６２１】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または吸
光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度を補間す
る。
【０６２２】 （実施例１３：処方） 本発明はまた、有効量の治療剤を被験体に投与することによって、疾患または
障害（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾患など）を処置および
／または予防する方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（
例えば、滅菌キャリア）と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、それらのアゴニストまたはア
ンタゴニスト、ならびに／あるいはそれらに対する抗体を意味する。
【０６２３】 治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、分泌ポリペプチド単独処置の副作用
）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ
、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方
式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、
このような考慮を行って決定される。
【０６２４】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ
／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポ
ンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得
る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、
所望の効果に応じて変化するようである。
【０６２５】 治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌ
ｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチに
よるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に
受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤
、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的
」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入
を含む投与の様式をいう。
【０６２６】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。治療剤は、
経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、
腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、
口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬学的に受容可能な
キャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材ま
たは任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静
脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与
の様式をいう。
【０６２７】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまた
はマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性
物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、お
よび貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【０６２８】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０６２９】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の組成物を包含する（一
般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０
）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｅｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治
療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：
ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９
８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３
，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国
特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１
０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型で
あり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択
された割合が、最適な治療剤のために調整される。
【０６３０】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０６３１】 他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。
【０６３２】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合すること
により処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤
に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０６３３】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０６３４】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【０６３５】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。
【０６３６】 治療的投与に用いられる任意の治療剤は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。
【０６３７】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。
凍結乾燥したポリペプチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製
する。
【０６３８】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。
【０６３９】 本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸
（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２
１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、ならびにＭＰＬ。特定の実施形
態において、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ２１と組み合わせて投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａｄｊ
ｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム
塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤
とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘
、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗ
ｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイル
ス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、灰白髄炎（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂
犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向する
ワクチン。組み合わせは、付随的にか（例えば、混合物として、別々であるが同
時にもしくは並行して）；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは
、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与されるプレゼンテーション
（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々である
が同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手
順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物
または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０６４０】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、単独で、または他の治療的薬
剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬
剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの
他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗
炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わ
せは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；ま
たは逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治
療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々
であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与さ
れる手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与
えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０６４１】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ分子、Ｔ
ＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮ
Ｆ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βの状態で
見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４
−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４
３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（
ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際
公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔ
ｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および
神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０
、可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ
、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９
７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国
際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９
４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国
際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２
０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、
ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態の
ＣＤ１５３。
【０６４２】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
ＺTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲ
ＩＴTM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン／３ＴＣ）、およ
びＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩ
ＰＴＯＲTM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンツ）。本
発明の治療剤と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インディナ
ビル）、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル））
、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗
レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵
素阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するた
め、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の治療剤
との任意の組み合わせで使用され得る。
【０６４３】 他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスチ
ム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａ
ｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明の治療剤は
、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置ま
たは予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺ
ＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴ
ＯＶＡＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複
合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡ
ＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯ
ＬTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明
の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感
染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTMとの任意の組
み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和
見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩ
ＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM との任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治
療剤は、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡ
ＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺ
ＯＬＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本
発明の治療剤は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を
予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTMおよび／またはＦＡ
ＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の治療剤は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染
を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／
またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態において、本発明の治療剤は、日和見細菌感染を予防的に処置または予
防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの
任意の組み合わせで使用される。
【０６４４】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４５】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質とともに投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、
マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファン
ピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリ
ム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０６４６】 本発明の治療剤とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０６４７】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／Ｓ
ＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥ
ＬＬＣＥＰＴTM（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコルチコステロ
イド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM （シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態におい
て、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る
。
【０６４８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶ
ＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTM およびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施
形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０６４９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０６５０】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０６５１】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共
に投与される。
【０６５２】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意
のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１
１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１
７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに
限定されない）と共に投与され得る。
【０６５３】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【０６５４】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬ
ＧＲＡＳＴＩＭTM）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５５】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０６５６】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
【０６５７】 （実施例１４：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内における本発明のポリペプチドのレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明のアゴニ
スト（本発明のポリペプチドを含む）を含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。さらに、個体における本発明のポリペプチドの標準の発現レベ
ルまたは正常発現レベルの低下により引き起こされる状態は、本発明のアゴニス
トまたはアンタゴニストを投与することにより処置し得ることが理解される。従
って、本発明はまた、このポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法
を提供する。この方法は、このような個体に、このような個体でこのポリペプチ
ドの活性レベルを増加させる量のアゴニストまたはアンタゴニストを含む治療剤
を投与する工程を包含する。
【０６５８】 例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、そのアゴニストまたはアン
タゴニストを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。投与
および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例１３に提供されている。
【０６５９】 （実施例１５：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内における本発明のポリペプチドのレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明のア
ンタゴニスト（本発明のポリペプチドおよび抗体を含む）を含む組成物をそのよ
うな個体に投与する工程を包含する。
【０６６０】 １つの例において、アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生
を阻害する。この技術は、ガンのような様々な病因に起因するポリペプチドのレ
ベルを低下させる方法の１つの例である。
【０６６１】 例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ／日で２１日間、静脈内投与する。この処置に対して十分に寛容化された
場合は、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。このアンチセンスポリヌ
クレオチドの処方は、実施例１３に提供されている。
【０６６２】 （実施例１６：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた
組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラス
コの湿潤表面に置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、し
っかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転さ
せ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮な培地（例えば、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２
培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０６６３】 この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週
間培養した後に、単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、
さらに大きなフラスコにスケールアップする。
【０６６４】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃ
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。
線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製
する。
【０６６５】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用
いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載のそ
れぞれ５’ 末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用し
て増幅し得る。好ましくは、この５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そし
てこの３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニーマウス肉
腫ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、こ
の２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合
物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含
む寒天上にプレーティングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有す
ることを確認する。
【０６６６】 アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１
０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増殖
させる。次に、その目的の遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパ
ッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このとき、このパッケージン
グ細胞は、その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッ
ケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０６６７】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、次いでこの培地を
１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性
ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、は
がれたプロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感
染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そし
てプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そ
して新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線
維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまた
はｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用すること
が必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、その線維芽細胞を分
析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０６６８】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。
【０６６９】 （実施例１７：本発明のポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子を使用する
遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ポリヌクレオチド配列
を、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；
国際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開
番号ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８
（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能
に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細
胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝
子の活性化を包含する。
【０６７０】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ポリヌクレオチド配列の５’非
コード配列に相同である。この標的化配列は、このポリヌクレオチド配列の５’
末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因
性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲ
を使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端お
よび３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の
３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そし
て第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限
部位を含む。
【０６７１】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。
【０６７２】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【０６７３】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。これは、この細
胞中におけるこのポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドの発現を生じる
。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出さ
れ得る。
【０６７４】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。
【０６７５】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、本発明のポリヌ
クレオチドに対応する遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために
、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ
）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部
位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つの非コ
ード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方の非コード配列（フラグメント１）を
、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位を備えて増幅す
る；他方の非コード配列（フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位およ
び３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターお
よびこれらのフラグメント（１および２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター
−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；フラグメント１−ＸｂａＩ；フラグメント２−Ｂ
ａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する
。
【０６７６】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０６７７】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０６７８】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【０６７９】 （実施例１８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ポリペプチドの発現を
増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアン
チセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の導入に関する。本発明のポリヌクレオチド
は、プロモーター、または標的組織によるそのポリペプチドの発現に必要な任意
の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療お
よび送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１
０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１
５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅ
ｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒ
ｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１（１９９６
）；Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３
２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０６８０】 ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方
法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入
）によって送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な
液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０６８１】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはまた、当業者に
周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ
Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１
３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（
１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０６８２】 この遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、
好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築
物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動す
るために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細
胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一
過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ
月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０６８３】 このポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、
脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸
、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間
隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維
間のムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコ
ラーゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリクスまたは骨の
裂孔中の結合組織内の同じマトリクスを含む。これは、同様に、循環の血漿およ
びリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空
間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞
を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、
分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが
、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、
血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉
細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、
特に適格である。
【０６８４】 裸のポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約
０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、こ
の投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより
好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業
者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配
列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置さ
れる状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間へ
の非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、
これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達の
ためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のポリヌクレオチド構
築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動
脈に送達され得る。
【０６８５】 インビボでの筋肉における注入ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下のよ
うにして決定する。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のための
適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮ
Ａ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用する
か、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四
頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０６８６】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャ
リアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋肉の
遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注入する
。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚をステ
ンレス鋼クリップで閉じる。
【０６８７】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、タ
ンパク質発現について組織化学的に染色する。タンパク質発現についてのタイム
コースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な
様式で行い得る。注入後の筋肉中のＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコ
ントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザ
ンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のＤ
ＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメ
ーターを外挿するために使用し得る。
【０６８８】 （実施例１９：トランスジェニック動物） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー
）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を
作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される
かまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部と
して、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。
【０６８９】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレク
トロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０
３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導
入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を
参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物
の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。
【０６９０】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【０６９１】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手
短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ない
くつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介
して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機
能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に
選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型において
のみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされ
る調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかで
ある。
【０６９２】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０６９３】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。
【０６９４】 本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのよう
な状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有
用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【０６９５】 （実施例２０：ノックアウト動物） 内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用して遺伝子および／
またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって
減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２
３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５
０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２
１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考と
して援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード
領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発明の変異
体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選
択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いずに使用
し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る
。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが、発
現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的化された相同組
換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生
じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標的化され
た遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究および農業分野
に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７および
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは
、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物がイ
ンビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化される場合、ヒトに
おける使用に慣用的に適合され得る。
【０６９６】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。
【０６９７】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０６９８】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【０６９９】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のポリペ
プチドの生物学的機能の詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の
研究、ならびにこのような状態および／または障害を寛解させるに有効な化合物
のスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに限定されない
用途を有する。
【０７００】 （実施例２２：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性化、増殖、分化、ホーミン
グ、耐性、および死を誘導し得る。
【０７０１】 Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団上に、増殖および分化の点で有し
得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細胞
集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように
設計された２つのアッセイである。
【０７０２】 （インビトロアッセイ）−本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、Ｂ細
胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化もしくは阻害および／
または死を誘導する能力について評価し得る。精製したヒト扁桃腺Ｂ細胞への本
発明のポリペプチドの活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範
囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッセイにおいて評価
する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞を、プライミング因子として、
ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ
（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。
ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチウム化チミジン取
り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と協同してＢ細胞増殖を誘
発する。新規な協同因子を、このアッセイを用いて容易に同定し得る。このアッ
セイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によりヒト扁桃腺Ｂ細胞
を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発
現により評価する場合、９５％のＢ細胞より大きい。
【０７０３】 種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳＡＣを
含有するＲＰＭＩ １６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０5Ｂ細
胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３Ｈ−
チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量
する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地
である。
【０７０４】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または本発明の
２ｍｇ／ｋｇのアゴニストまたはアンタゴニスト、またはそれらの短縮形態を、
１日２回注射（腹腔内）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時
点でそれらを屠殺し、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正
常な脾臓および本発明のアゴニストまたはアンタゴニストで処理した脾臓由来の
Ｈ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞でのこのアゴニストまたはアンタゴニストの
活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および／または赤色脾髄領域の
有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化
を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）
を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への任意の生理的な変化（例え
ば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤する漠然と規定されたＢ細
胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定する。
【０７０５】 アゴニストまたはアンタゴニストで処置したマウス由来の脾臓のフローサイト
メトリー分析を用いて、このアゴニストまたはアンタゴニストが、ＴｈＢ＋であ
るＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウスで観察
される比よりも特異的に増加するか否かを示す。
【０７０６】 同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価の相対的な増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを緩衝液
処置マウスとポリペプチド処置マウスとの間で比較する。
【０７０７】 本実施例において記載する試験は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニスト
の活性を試験した。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドの活性（例えば、遺伝子治療）を試験するために、例示する研究を容易に
改変し得る。
【０７０８】 （実施例２３：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、
コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾
配遠心分離により単離し、そして本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの種
々の濃度での存在下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡ
ｂでコートしたプレートの４通りのウェル（５×１０4／ウェル）に添加する（
総量２００μｌ）。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールで
ある。３７℃での培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転さ
せ、そして１００μｌの上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場合
、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウ
ェルに０．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そ
して３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そして3Ｈ−チミジン
の取り込みを増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロール
である。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとし
て用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体を本発明のアゴニストま
たはアンタゴニストの効果についての陰性コントロールとして用いる。
【０７０９】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
トの活性を試験した。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの活性（例えば、遺伝子治療）を試験するために、例示する研究を容易
に改変し得る。
【０７１０】 （実施例２４：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化への本発明のポリペプチドの効
果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。
【０７１１】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、本発明のアゴニスト
もしくはアンタゴニストまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１
〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体また
はＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。
さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０７１２】 （サイトカインの生成への効果） 樹状細胞により生成されるサイトカイン、
特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１
２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性
Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩ
Ｌ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6／ｍｌ）を、本発明のアゴニストま
たはアンタゴニストの漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／
ｍｌ）を、陽性コントロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養から
の上清を収集し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析
する。キットに提供される標準的プロトコールを用いる。
【０７１３】 （ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果） 細胞表
面抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦ
ｃレセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同
時刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提
示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプター
の発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と
相関し得る。
【０７１４】 ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、本発明のアゴニストもしくはアンタゴニストまたはＬＰＳ（陽性コントロール
）の漸増する濃度で１〜５日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナト
リウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モ
ノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間
インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０７１５】 （単球活性化および／または生存の増加） 単球を活性化する（あるいは、不
活化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下さ
せる）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子
が単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するた
めに慣用的に適用され得る。本発明のアゴニストまたはアンタゴニストは、以下
に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。これらのアッセイの
それぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配
（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製す
る。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔ
ｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。
【０７１６】 （単球生存アッセイ） ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で
培養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（
アポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇
的に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード
（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００
ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々
の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コン
トロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含
有するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析
の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイム
におけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【０７１７】 （サイトカイン放出への影響） 単球／マクロファージの重要な機能は、刺激
後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性で
ある。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する
。ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、本発明のアゴニストまたはアン
タゴニストの漸増する濃度とともに、および同じ条件下でアゴニストまたはアン
タゴニストの非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の生成については、
この細胞を、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの存在下でＩＦＮ（１０
０Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加す
る。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで
、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳ
Ａキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）
を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用して実施する。
【０７１８】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）） 精製した単球を９
６ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。本発明のアゴ
ニストまたはアンタゴニストの漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（
ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。
３日間のインキュベーション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェ
ルから除く。マクロファージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノール
レッド溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．
０、５．５ｍＭデキストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／
ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。この
プレートを３７℃で２時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの
１Ｎ ＮａＯＨを添加して反応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロフ
ァージにより生成されるＨ2Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶
液の標準曲線をそれぞれの実験について実施する。
【０７１９】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
トの活性を試験した。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの活性（例えば、遺伝子治療）の活性を試験するために、例示する研究
を容易に改変し得る。
【０７２０】 （実施例２５：本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、皮質ニューロン細胞の生存、
神経突起成長または表現形分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸
性タンパク質免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオ
アッセイのための皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２
の広く行き渡っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン
生存の以前に報告された増強に基づく。チミジン取り込みアッセイを用いて、例
えば、これらの細胞への本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの活性を解明
し得る。
【０７２１】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら
、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ
ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２〜３０
１６（１９８６）、アッセイは、本明細書でその全体が参考として援用される）
。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つの応答
が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでなく、どの
レセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する。神経
突起成長を誘導する本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの能力を、一次の
皮質ニューロン培養パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを
用いてＦＧＦ−２で得られた応答と比較し得る。
【０７２２】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ2アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはアゴニストも
しくはアンタゴニストと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥ
ＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ2につい
てアッセイする。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェ
ルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基
礎培地に培地を変換した後、細胞を本発明のＩＬ−１αのアゴニストまたはアン
タゴニストとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２と２４時間インキ
ュベートする。上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセイする。
【０７２３】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
トとともに基礎培地中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評
価するためＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、本発明のアゴニ
ストまたはアンタゴニストでの刺激に匹敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ
／ｍｌの刺激を示すはずである。
【０７２４】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ+）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ+は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ+は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミド二リン酸
：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達
を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
【０７２５】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒
性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証
している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９０）。
【０７２６】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、本発明のアゴニストまたはアンタゴニ
ストは、インビトロにおけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際にお
いて、本発明のポリペプチドがＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを
決定するために評価され得、そして、本発明のアゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ処理と関連す
る損傷からの防御についてインビボで試験され得る。本発明のアゴニストまたは
アンタゴニストの潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイ
ムにおいてインビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中
脳底板を解剖することにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、
そしてポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細
胞／ｃｍ2の密度で播いた。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホル
モン補充物（ＮＩ）を含有するＦ１２培地中で維持する。インビトロで８日後培
養物をパラホルムアミドで固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミ
ン作動性ニューロンについての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために
処理する。分離した細胞培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごと
に変化させ、そしてこの因子をまたその時点ごとに添加する。
【０７２７】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もし本発明のアゴニストまた
はアンタゴニストがドーパミン作動性の生存を延長するように作用するならば、
このアゴニストまたはアンタゴニストがパーキンソン病に関与し得ることを示唆
する。
【０７２８】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
トの活性を試験した。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの活性（例えば、遺伝子治療）を試験するために、例示する研究を容易
に改変し得る。
【０７２９】 （実施例２６：血管内皮細胞の増殖への本発明のアゴニストまたはアンタゴニ
ストの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。本発明のアゴニストまたはアンタゴニストおよび陽性コントロール
（例えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する
。４日目および６日目に、培地を交換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎ
ｔｅｒを用いて細胞数を決定する。
【０７３０】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、本発明の化合物が血管内皮細胞を増殖し得ること
を示し、一方、ＨＵＶＥＣ細胞数の減少は、本発明の化合物が血管内皮細胞を阻
害することを示す。
【０７３１】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験するために、例示す
る研究を容易に改変し得る。
【０７３２】 （実施例２７：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの、新生血管形
成に対する効果を示す。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から支質層へと１〜１．５ｍｍの長さの切開を作ること。
【０７３３】 ｂ）眼の外側の角に面する切開の唇縁の下にへらを挿入すること。
【０７３４】 ｃ）ポケットを作ること（その基底は、眼の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍ
ｍである）。
【０７３５】 ｄ）５０ｎｇ〜５μｇの本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを含む小丸
剤を、ポケット内に配置すること。
【０７３６】 ｅ）本発明のアゴニストまたはアンタゴニストでの処置をまた、２０ｍｇ〜５
００ｍｇの範囲の投薬量範囲内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適
用し得ること。
【０７３７】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
トの活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発
明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、遺伝子治療）の活性を試験
し得る。
【０７３８】 （実施例２８：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド損傷創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） 本発明のアゴニストまたはアンタゴニストが治癒プロセスを促進することを実
証するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄ
ｂ＋マウスにおける全層（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、
損傷創傷治癒の十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能
なモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および
再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．
５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐ
ａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。
【０７３９】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体上に単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａ
ｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａ
ｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１
−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：
４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、
基底膜肥厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（
Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（
１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６
７（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）
：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高
血糖症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対し
て耐性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３
７７（１９７８））。
【０７４０】 これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖
尿病において観察される治癒に類似し得ることを示す（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら
、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））
。
【０７４１】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いる（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、
そしてこれらの動物は研究の開始時に８週齢である。動物を個別に飼育し、そし
て自由に食物および水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この実
験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラ
インに従って行う。
【０７４２】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷を開放させる。処
置の適用を、創傷させた日から開始して５日間連続で、局所的に与える。処置の
前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する
。
【０７４３】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを
用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創
傷を連続した上皮が覆う場合に治癒したとみなす。
【０７４４】 本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、ビヒクル中で８日間、異なる用
量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒ
クルコントロール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【０７４５】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０７４６】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）非処置群、および３）処置群
を、評価する。
【０７４７】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、本発明のアゴニストまたはアンタ
ゴニストを用いる処置によって改変したかどうかを評価する。この評価は、細胞
蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検
証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３
６：１２３５（１９９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者
（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。
【０７４８】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。
【０７４９】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし、そしてヒ
ト脳組織を、陰性組織コントロールとして用いる。各標本は、１次抗体の脱落お
よび非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位は、
０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい増殖
を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【０７５０】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【０７５１】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎ
ｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅ
ｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７
：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害
すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７
０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃ
ｋら、Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙ
ｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））
を低下させること、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙ
ｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；
Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌ
ｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ
：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって創
傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラッ
トにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８） ；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃｏ
ｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎ
ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【０７５２】 本発明のアゴニストまたはアンタゴニストが治癒プロセスを促進し得ることを
実証するために、治癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる
、ラットの全層切除皮膚創傷に対する本発明のアゴニストまたはアンタゴニスト
の複数の局所適用の効果を評価する。
【０７５３】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラットの
治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋ
ｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食
物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈ
ｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行
う。
【０７５４】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５ｍ
ｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動
物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄
する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷
をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放する
。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した日
から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷を
滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【０７５５】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷
を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。
【０７５６】 本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、ビヒクル中で８日間、異なる用
量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒ
クルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【０７５７】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０７５８】 各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、および３）処置群。
【０７５９】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見を、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処
置によって改善したかどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマ
イクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、
創傷の隙間の距離を決定する。
【０７６０】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【０７６１】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
ト活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、遺伝子治療）の活性を試験し
得る。
【０７６２】 （実施例２９：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立における本発明のアゴ
ニストまたはアンタゴニストの治療的効果を試験するための、適切かつ一貫した
リンパ水腫モデルを作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リ
ンパの脈管の量の定量、総血漿タンパク質の量、および組織病理学により測定さ
れる。急性リンパ水腫は、７〜１０日間観察される。恐らくより重要なことは、
水腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
【０７６３】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、
０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の
注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【０７６４】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固縫合結紮（ｅｌｅ
ｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｓｕｔｕｒｅ ｌｉｇａｔｅ）する。
【０７６５】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【０７６６】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。
【０７６７】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【０７６８】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。
【０７６９】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。
【０７７０】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【０７７１】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【０７７２】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【０７７３】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
ト活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、遺伝子治療）の活性を試験し
得る。
【０７７４】 （実施例３０：ＴＮＦα誘導性接着分子発現の本発明のアゴニストまたはアン
タゴニストによる抑制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の
間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所
濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【０７７５】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【０７７６】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のアゴニストまたはアン
タゴニストの潜在能力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相
吸着剤としてＥＣを使用する）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメ
ンバーを用いて同時刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣ
ＡＭ発現の量を測定する。
【０７７７】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０4細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。
【０７７８】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【０７７９】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＡＣＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ
および抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ
／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境におい
て、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ
）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
【０７８０】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０0）＞１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０
ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。
【０７８１】 本実施例において記載される研究は、本発明のアゴニストまたはアンタゴニス
ト活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、遺伝子治療）の活性を試験し
得る。
【０７８２】 （実施例３１：ハイスループットスクリーニングアッセイのための本発明のポ
リペプチドの産生） 以下のプロトコルは、試験されるべき本発明のポリぺプチドを含有する上清を
産生する。次いで、この上清は、実施例３３〜４２に記載されるスクリーニング
アッセイにおいて使用され得る。
【０７８３】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。
【０７８４】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０７８５】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。
【０７８６】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０７８７】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2
Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ
ｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ2；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2 Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4−
７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ
ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
トオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
チン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グ
ルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６
．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン
２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５
ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８
．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ
−Ｈ2Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４
０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１
．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファ
ン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２
Ｈ2Ｏ；および９９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビ
オチン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化
コリン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３
．０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ
；０．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビ
ン；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；０．
６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ12；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／
ＬのＮａヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌの
プトレシンナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；
０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；
０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合
体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と
複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；１０ｍｇ／Ｌの酢酸レチナール
と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調
製する。２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて容量オスモル濃度
を３２７ｍＯｓｍに調節する（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭ
ＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。培地
を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニ
カル中に収集する。
【０７８８】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０７８９】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例３３〜４
０に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０７９０】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、本発明のポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質とし
て）か、または他のタンパク質の発現を誘導する本発明のポリぺプチドによって
（このポリペプチドは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来すること
が特に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によ
って特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【０７９１】 （実施例３２：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋｓ−ＳＴ
ＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質
は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメン
トまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。
これらのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化
させる。
【０７９２】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広
範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定さ
れており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘ
ルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼
ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。そ
れは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０７９３】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
の代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。
これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞におい
て触媒的に不活性である。
【０７９４】 Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋｓ
を活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：
（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプ
ターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−
１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保
存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳ
モチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号１８８２）をコ
ードする膜近接領域）を共有する。
【０７９５】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。
【０７９６】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従っ
て、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０７９７】
【表６】 実施例３３〜３４に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−
４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わ
りに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対し
て相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライ
マーの配列は以下である：
【０７９８】
【化３】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号１８８４）。
【０７９９】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０８００】
【化４】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク
質が挙げられる。
【０８０１】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０８０２】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１３〜１４に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０８０３】 他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例３５および３６に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０８０４】 （実施例３３：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、および本発明のポリペプ
チドを含有する上清がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定するこ
とによって、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例３２で作製したＧＡ
Ｓ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加さ
せる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。
このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｔ
ＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５
２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた
使用し得る。
【０８０５】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。
【０８０６】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ
−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組
み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを
添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０８０７】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０7個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。
【０８０８】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞は、本発明のポリペプチドを含む上清で処理されるか、または実施
例３１に記載のプロトコールにより産生されるような誘導された本発明のポリペ
プチドで処理される。
【０８０９】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。
【０８１０】 １２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を分与する
ために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チャ
ンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。
【０８１１】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。
【０８１２】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカ
バーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１７に記載のＳＥＡＰアッセイを
実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプ
レートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを
繰り返すための物質の供給源として供する。
【０８１３】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０８１４】 上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作
製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。
【０８１５】 （実施例３４：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、本発明のポリペプチドが骨髄性細胞を増殖およ
び／または分化させるか否かを決定することにより、本発明のポリペプチドの骨
髄性の活性を評価する。骨髄性細胞の活性を実施例３２において産生されたＧＡ
Ｓ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加さ
せる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す
。このアッセイに使用した骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏ
ｃｙｔｅ）細胞株）であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る
。
【０８１６】 Ｕ９３７細胞を、実施例３２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中
で増殖させる。
【０８１７】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０８１８】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０８１９】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０８２０】 これらの細胞を１×１０8個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０5細胞／ウェル）をプレートする。
【０８２１】 実施例３１に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０μｌを添加す
る。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１
００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化
させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロー
ルウェルにおいて観察される。実施例３７に記載のプロトコルに従って上清をＳ
ＥＡＰアッセイする。
【０８２２】 （実施例３５：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、細胞の活性化を本発明のポリペプチドによって評価
し得る。
【０８２３】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカ
ノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮
増殖因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、本発明のポリペプチドによるＰＣ１２細胞の活性化を
評価し得る。
【０８２４】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る： ５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号１８８６） ５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３
’（配列番号１８８７）。
【０８２５】 次いで、実施例３２において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡ
Ｓ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を
用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターと
を連結する。
【０８２６】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８
−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０ｃ
ｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添
加し、そして２時間風乾させる。
【０８２７】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０８２８】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例３１に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが
、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖
させるべきである。
【０８２９】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニン
グする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次い
で、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。
【０８３０】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし、そして
より低血清の培地を添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させる
。
【０８３１】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例３１により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間添加する。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰ
Ｃ１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経
成長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導
が陽性コントロールウェルにおいて見られる。実施例３７に従って、上清をＳＥ
ＡＰアッセイする。
【０８３２】 （実施例３６：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−ＫＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０８３３】 刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そ
して分解され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これ
により標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝
子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１
ＭＨＣが挙げられる。
【０８３４】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例３１におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−ＫＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置、予防および／または診断に有用であ
る。例えば、ＮＦ−ＫＢのインヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活
性化に関連する疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る
。
【０８３５】 ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１８８８）の４つの直列のコピー、ＳＶ
４０初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、
そしてＸｈｏＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号１８８９）。
【０８３６】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号１８８４）。
【０８３７】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：
【０８３８】
【化５】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。
【０８３９】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０８４０】 一旦、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例３３に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例３３に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０８４１】 （実施例３７：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例３３〜３６に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０８４２】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０８４３】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。
【０８４４】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０８４５】
【表７】 （実施例３８：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定するハイスル
ープットスクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変し得る。
【０８４６】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに使用し得る。
【０８４７】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。
【０８４８】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー
トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。
【０８４９】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたり、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４の１０％プルロ
ン酸ＤＭＳＯ溶液４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ Ｗ
ａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌ
にする。
【０８５０】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０８５１】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、本発明のポ
リペプチドまたは本発明のポリペプチドによって誘導される分子のいずれかであ
る分子によって引き起こされる、細胞内Ｃａ++濃度の増加を生じた、細胞外シグ
ナル伝達事象を示す。
【０８５２】 （実施例４０：チロシンキナーゼ活性を同定するハイスループットスクリーニ
ングアッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。
【０８５３】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナ
ーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（
例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシン
キナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質
ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカ
インスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ
−ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介
する。
【０８５４】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、本発明のポ
リペプチドまたは本発明のポリペプチドによって誘導される分子がチロシンキナ
ーゼシグナル伝達経路を活性化し得るか否か同定は興味深い。従って、以下のプ
ロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこのよ
うな分子を同定する。
【０８５５】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し、
Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖
実験において使用し得る。
【０８５６】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例３１で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．
１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した
プロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加し
、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを真
空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉｆｏ
ｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底の０
．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェル捕
獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明澄化
した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有物を
取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０８５７】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。
【０８５８】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
【０８５９】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ2+（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０
ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５μｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始させる。
【０８６０】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、その反応物を氷上に置く。
【０８６１】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように
洗浄する。
【０８６２】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０８６３】 （実施例４１：リン酸化活性を同定するハイスループットスクリーニングアッ
セイ） 実施例４０に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８Ｍ
ＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異
的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子
、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン分
子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥｒ
ｋ−２を置き換えることにより検出し得る。
【０８６４】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
ＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。
【０８６５】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例３
１で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物
を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。
【０８６６】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤とＷａｌｌａｃ ＤＥＬＦ
ＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定量
する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、本発明のポリペプチド
または本発明のポリペプチドによって誘導される分子によるリン酸化を示す。
【０８６７】 （実施例４２：骨髄ＣＤ４３＋細胞増殖の刺激についてのアッセイ） このアッセイは、ヒトＣＤ３４＋が、造血増殖因子の存在下で増殖する能力に
基づき、そしてこのアッセイは、哺乳動物細胞において発現された単離ポリペプ
チドが、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を評価する。
【０８６８】 最も熟成した前駆体は、単一シグナルのみに応答することが以前に示されてい
る。より未熟な前駆体は、応答するために少なくとも２つのシグナルを必要とす
る。従って、ポリペプチドの広範な先祖細胞の造血活性に対する効果を試験する
ために、このアッセイは、他の造血増殖因子の存在下または非存在下において、
所定のポリペプチドを含む。単離された細胞を、試験サンプルと組み合わせて、
幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、５日間培養する。ＳＣＦのみは、骨髄（ＢＭ
）細胞の増殖に対して、非常に制限された効果を有し、「生存」因子としてのみ
、このような条件下で作用する。しかし、これらの細胞（例えば、ＩＬ−３）に
対する刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣＦは、相乗効果を生じ
る。従って、試験されたポリペプチドが、造血祖先に対する刺激効果を有する場
合、このような活性は、容易に検出され得る。正常なＢＭ細胞は、低レベルの細
胞周期（ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｅｌｌ）を有するので、所望のポリペプチド、ある
いはそのアゴニストまたはアンタゴニストのいかなる阻害効果も検出されないよ
うである。従って、先祖に対する阻害効果のためのアッセイが、好ましくは、Ｓ
ＣＦ＋ＩＬ＋３でのインビトロ刺激に最初に供され、次いで、このような誘起増
殖の阻害のために評価される化合物と接触させられる細胞において試験される。
【０８６９】 簡潔には、ＣＤ３４＋細胞は、当該分野で公知の方法を使用して単離される。
これらの細胞は、解凍され、そして、培地（１％ Ｌ−グルタミンを有するＱＢ
ＳＦ ６０ 血清のない培地（５００ｍｌ）（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ Ｃａｔ＃ １６０−２０
４−１０１））に再懸濁される。２００×ｇでのいくらか穏やかな遠心分離の後
、細胞は、１時間静置される。細胞数を２．５×１０5細胞／ｍｌに調節する。
この時間の間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周辺ウェルに添加す
る。このアッセイにおいて、所定のポリペプチドで試験され得るサイトカインは
、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃ ２５５−ＳＣ）のみであり、そして３０ｎｇ／ｍｌのｒ
ｈＳＣＦとｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＭＮ，Ｃａｔ＃ ２０３−ＭＬ）との組み合わせである。１時間後、１０μｌの
調製されたサイトカイン、５０μｌの上清（実施例３１で調製された）（１：２
希釈での上清＝５０μｌ）および２０μｌの希釈された細胞を、培地に添加し、
この培地は、１００μｌの最終全体積にするためにすでにウェル中に存在する。
次いで、このプレートを３７℃／５％ ＣＯ2インキュベータに５日間置く。
【０８７０】 アッセイを行う（ｈａｒｖｅｓｔ）１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［
３Ｈ］チミジンを、各ウェルに１０μｌの体積で添加し、増殖率を決定する。こ
の実験は、Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６を使用して、細胞を、各９
６ウェルプレートからフィルターマットに収集することによって終結される。収
集後、フィルターマットを乾燥し、トリムし、そして１つのＯｍｎｉｆｉｌｔｅ
ｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒトレイからなるＯｍｎｉｆｉｌｔ
ｅｒアセンブリに置く。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに添加し、
そしてプレートをＴｏｐＳｅａｌ-Ａプレスオンフィルムで密閉する。バーコー
ド１５ステッカーを計数のために、第１のプレートに固定する。次いで、密閉さ
れたプレートを充填し、そして放射能のレベルを、Ｐａｒｃｋａｒｄ Ｔｏｐ
Ｃｏｕｎｔを介して決定し、プリントされたデータを分析のために収集する。放
射能レベルは、細胞増殖の量を反映する。
【０８７１】 本実施例に記載される研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖を刺激する、所定のポ
リペプチドの活性を試験する。当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治
療）、抗体、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト、ならびにそれらのフ
ラグメントおよび改変体の活性を試験するために、例示された実施例を容易に改
変し得る。非限定的な実施例として、このアッセイで試験される可能性のあるア
ンタゴニストは、サイトカインの存在下で細胞増殖を阻害すること、および／ま
たはサイトカインおよび所定のポリペプチドの存在下で細胞増殖の阻害を増加さ
せることが期待される。対照的に、このアッセイで試験される可能性のあるアゴ
ニストは、細胞増殖を増強し、そして／またはサイトカインおよび所定のポリペ
プチドの存在下で、細胞増殖の阻害を減少させることが期待される。
【０８７２】 骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する遺伝子の能力は、この遺伝子に対応する
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、診断および免疫系および造血に影響す
る障害の処置に有用であることを示す。代表的な用途は、上記の「免疫活性」お
よび「感染疾患」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。
【０８７３】 （実施例４３：細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）についてのア
ッセイ） 細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マ
トリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用する遺伝子産
物（例えば、単離されたポリペプチド）を同定することである。
【０８７４】 周囲のミクロ環境から受けるシグナルに関連して、細胞は、調節因子に応答す
る。例えば、線維芽細胞、ならびに内皮幹細胞および上皮幹細胞は、ＥＣＭから
のシグナルの非存在下で、複製することができない。造血幹細胞は、骨髄中で自
己再生を起こし得るが、インビトロ懸濁液培養ではそうではない。インビトロで
自己再生を起こす幹細胞の能力は、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞およびＥＣＭタ
ンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）とのそれらの相互作用に依存する。細胞のｆ
ｎへの吸着は、α5．β1およびα4．β1インテグリンレセプターによって媒介さ
れ、これらのレセプターは、ヒトおよびマウス造血幹細胞によって発現される。
ＥＣＭ環境で組み込み、そして幹細胞の自己再生の刺激の原因である因子は未だ
同定されていない。このような因子の発見は、遺伝子治療および脊髄移植適用に
おける重要な目的である。
【０８７５】 簡潔には、ポリスチレンの組織培養処理されていない９６ウェルプレートは、
０．２μｌ／ｃｍ2のコーティング濃度でｆｎフラグメントでコートされる。マ
ウス骨髄細胞を、０．２ｍｌの血清のない培地（１，０００細胞／ウェル）にプ
レートする。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で
培養された細胞は、幹細胞の自己再生が期待されず、明確な分化が期待される条
件で、ポジティブコントロールとして作用する。本発明の遺伝子産物（本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに実施例３１で作製された上清を
含むが、これらに限定されない）は、ＳＣＦ（５．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ま
たは非存在下で適切なネガティブコントロールとともに試験され、ここで、試験
因子の上清は、全アッセイ体積の１０％を示す。次いで、プレートされた細胞を
、低酸素環境（５％ＣＯ2、７％Ｏ2および８８％Ｎ2）の組織培養インキュベー
タで７日間インキュベートすることによって増殖させる。次いで、ウェル内の増
殖細胞の数を、細胞ＤＮＡへのチミジン組込みを測定することによって定量する
。アッセイにおけるポジティブヒットの確認は、細胞の表現型の特徴付けを必要
とし、この特徴付けは、培養系をスケールアップし、そして細胞表面抗原および
ＳＣＦＳｃａｎに対する適切な抗体試薬を使用することによって達成される。
【０８７６】 当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、抗体、アゴニスト、お
よび／またはアンタゴニストならびにそのフラグメントおよび改変体の活性を試
験するための例示的な研究を容易に改変し得る。
【０８７７】 本発明の特定のポリペプチドは、造血祖先の刺激薬であることが見出される場
合、このポリペプチドをコードする遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドは、診断、ならびに免疫系および造血に影響する障害の処置に有用で
あり得る。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染疾患」の節、なら
びに本明細書の他の箇所に記載される。遺伝子産物はまた、種々の血液連鎖の幹
細胞および先駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の拡張におい
て、そして種々の細胞の型の分化および／または増殖において有用であり得る。
【０８７８】 さらに、目的の遺伝子のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、なら
びに／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、造血細胞の
増殖および分化を阻害するために使用され、そしてそれによって、化学療法の間
に、化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用され得る。この抗増殖効
果は、より高い用量の化学療法薬剤の投与、従って、より有効な化学治療処置を
可能にし得る。
【０８７９】 さらに、目的の遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた
、造血関連障害（例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、
または白血病）の処置および診断に有用であり得る。なぜなら、間質細胞は、造
血系列の細胞の生成において重要であるからである。これらの用途としては、骨
髄細胞エキソビボ培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成の放射線療法または化学
療法が、挙げられる。
【０８８０】 （実施例４４：ヒト皮膚線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖） 目的のポリペプチドを、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大
動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養物に添加し、そして２つの同時アッセイを
各サンプルを用いて実施する。第１のアッセイは、正常なヒト線維芽細胞（ＮＨ
ＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖に対する、目的のポリペプ
チドの効果を試験する。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な増殖は、いくつか
の病理学的プロセス（繊維症および再狭窄を含む）の一部である。第２のアッセ
イは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６産生を試験する。ＩＬ６産生は
、機能的活性化の指標である、活性化細胞は、多数のサイトカインおよび他の因
子の産生の増加を有し、これは、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
）または免疫調節性の結果を生じ得る。アッセイは、同時刺激活性または阻害活
性をチェックするために、同時ＴＮＦ刺激とともに行い、そして同時ＴＮＦ刺激
なしで行う。
【０８８１】 簡単に述べると、１日目に、９６ウェルの黒いプレートに、１００μｌ培養培
地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳ
ＭＣ）を配置する。ＮＨＤＦ培養培地は、以下：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＦＢ基礎
培地、１ｍｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、５０μｇ／ｍｌゲン
タマイシン、２％ ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｓ ＳＭ基礎培地、０．５μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、
１μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ Ａ
ｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、５％ ＦＢＳを含む。３７℃で少なくとも４〜５
時間のインキュベーション後、培養培地を吸引し、増殖停止培地で置換する。Ｎ
ＨＦＤ用の増殖停止培地は、線維芽細胞基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシ
ン、２％ ＦＢＳを含み、一方ＡｐＳＭＣ用の増殖停止培地は、ＳＭ基礎培地、
５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ
Ｂ、０．４％ ＦＢＳを含む。３７℃で２日目までインキュベートする。
【０８８２】 ２日目、目的のポリペプチドの系列希釈物およびテンプレートを、それらが常
に、培地コントロールおよび既知のタンパク質コントロールを含むように、設計
する。刺激実験および阻害実験の両方について、タンパク質を増殖停止培地で希
釈する、阻害実験について、ＴＮＦａを、最終濃度２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）ま
たは５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）まで添加する。コントロールまたは本発明のポ
リペプチドを含む１／３容量の培地を添加し、そして５日目まで、３７℃／５％
ＣＯ2にてインキュベートする。
【０８８３】 各ウェルから６０μｌを別の標識９６ウェルプレートに移し、プレートシーラ
ーで覆い、そして６日目まで４℃で（ＩＬ６ ＥＬＩＳＡのために）保存する。
細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、その培養物容量の１０％に等しい量
（１０μｌ）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを無菌的に添加する。プレートを３〜４
時間の間インキュベーターに戻す。次いで、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎ
ｍでの放射を伴う蛍光を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを使用して測定する。これにより
、増殖刺激／阻害のデータを得る。
【０８８４】 ５日目、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した５０〜１
００μ／ウェルの抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体で９６ウェルプレートをコ
ーティングすることによって実施し、室温でＯＮをインキュベートする。
【０８８５】 ６日目、プレートの中身を流しに空け、そしてペーパータオル上で吸い取る。
４％ ＢＳＡを含むＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を調製する。プレートを、ＰＢ
Ｓ中の２００μ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋブロッキング
緩衝液で１〜２時間ブロックし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上で吸い取
る。次いで、０．５０ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＩＬ−６モノクローナルビオ
チン標識抗体５０μｌ／ウェルを添加する。ＩＬ−６ストックの培地中の希釈物
を作製する（３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、
０．３ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌ）。二連のサンプルをプレートの最上列に添加
する。プレートを覆い、そして振盪機上で室温で２時間インキュベートする。プ
レートを洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。ＥＵ標識ストレプ
トアビジンをアッセイ緩衝液中に１：１０００希釈し、そして１００μｌ／ウェ
ルを添加する。プレートを覆い、そして室温で１時間インキュベートする。プレ
ートを再び洗浄緩衝液で洗浄し、そしてペーパータオル上で吸い取る。１００μ
ｌ／ウェルの増強溶液を添加し、そして５分間振盪する。Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬ
ＦＩＡ蛍光測定器でプレートを読み取る。各アッセイでの三連のサンプルからの
読み取りを、表にして平均をとる。
【０８８６】 このアッセイにおける陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆し、そして本
発明のポリペプチドが皮膚線維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与
し得ることを示唆する。陽性の結果はまた、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、
陽性の結果を与える本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドのアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストの多くの潜在的な使用を示唆する。例えば、本明細書
の全体にわたって記載されるように、炎症および免疫応答、創傷の治癒、ならび
に新脈管形成。特に、本発明のポリペプチドおよび本発明のポリヌクレオチドは
、創傷の治癒および皮膚の再生、ならびに脈管形成（血管およびリンパ管の両方
）の促進に使用され得る。脈管の成長は、例えば、心臓血管疾患の処置において
使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのアンタ
ゴニストは、抗脈管（例えば、抗新脈管形成）として作用することによって、新
脈管形成を含む、疾患、障害、および／または状態を処置する際に有用であり得
る。これらの疾患、障害、および／または状態、例えば以下：悪性腫瘍、固形腫
瘍、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化
膿性肉芽腫）；関節硬化性斑（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｉｃ ｐｌａｑｕｅ）
；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜障害、未熟児の網膜障害、黄斑変性
、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、網膜芽細胞
腫、ぶどう膜炎、および眼の翼状片（異常な血管の成長））；慢性関節リウマチ
；乾癬；遅延性の創傷の治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒形成；過形成性瘢痕
（ケロイド）；非結合性骨折（ｎｏｎｕｎｉｏｎ ｆｒａｃｔｕｒｅ）；強皮症
；トラコーマ；脈管接着；心筋新脈管形成；冠状側副枝；大脳側副枝；動静脈奇
形；虚血性の肢の新脈管形成；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；斑の新生血管
形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維性筋性形成異常症；創
傷肉芽化；クローン病；およびアテローム性硬化症などは、当該分野において公
知でありそして／または本明細書中で記載される。さらに、本発明のポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドのアンタゴニストは、当該分野において公知でありそ
して／または本明細書中で記載される、抗過増殖性疾患および／または抗炎症性
疾患を処置する際に有用であり得る。
【０８８７】 当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、抗体、アゴニスト、お
よび／またはアンタゴニスト、ならびにそのフラグメントおよび改変体の活性を
試験するために例示された研究を容易に改変し得る。
【０８８８】 （実施例４５：内皮細胞上での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現） リンパ球の、炎症および新脈管形成の領域に対する漸増は、リンパ球上の細胞
表面接着分子（ＣＡＭ）と脈管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互
作用を含む。接着プロセスは、通常の環境および病的な環境の両方において、多
段階のカスケードに続き、このカスケードは、内皮細胞（ＥＣ）上での細胞内接
着分子１（ＩＣＡＭ−１）、脈管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮
性白血球接着分子１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む。脈管内皮上でのこれらの
分子などの発現は、白血球が局所的な脈環構造と接着し、そして炎症性応答の進
行の間に局所的な組織へと溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖
因子の局所的濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【０８８９】 簡単には、内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））は、標準
９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖する。増殖培地を、細胞から除
去し、そして１００μｌの１９９ Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ
））で置き換える。試験のためのサンプルおよび陽性または陰性のコントロール
を、３部構成（１０μｌの容量ずつ）のプレートに添加する。次いで、プレート
を、３７℃で、５時間（セレクチンおよびインテグリンの発現）かまたは２４時
間（インテグリンの発現のみ）のいずれかの間インキュベートする。プレートを
、培地を除去するために吸引し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデ
ヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）を各ウェルに添加する。プレート
を４℃で３０分間保持する。固定剤をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ
（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで１回洗浄し、そして水気を切る。１０μｌ
の希釈した第１抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗Ｉ
ＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−
ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌの貯蔵抗体の１：１０希
釈）で使用する。細胞を３７℃で３０分間、加湿された環境においてインキュベ
ートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する
。２０μｌの希釈されたＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈、本明細書中で実用的な希釈液といわれる）
を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、
ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する。５ｍｌのグリシン緩
衝液（ｐＨ１０．４）につき１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰ
Ｐ）を溶解する。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を各試験ウェル
に添加する。３部構成の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉ
ｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ；１：５，０００（１０0）＞
１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5の実用的な希釈液から調製する。各希釈液の５μｌ
を３部構成のウェルに添加すると、各ウェル中の得られるＡＰ含有量は、５．５
ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ、である。次いで、１００μ
ｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルの各々に添加する。このプレートを、３７℃で４
時間インキュベートする。５０μｌの容量の３Ｍ ＮａＯＨを、全てのウェルに
添加する。このプレートを、グリシン緩衝液のみを充填したブランクウェルでの
バックグラウンド除去オプションを使用して、４０５ｎｍのプレートリーダーで
読む。さらに、テンプレートを、各標準ウェル［５．５０ｎｇ；１．７４ｎｇ；
０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］中のＡＰ共重合体の濃度を示すようにセットアッ
プする。結果を、各サンプル中の結合したＡＰ共重合体の量として示す。
【０８９０】 （実施例４６：Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ） このアッセイを使用して、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細
胞（ＢＡＥＣ）、またはヒト微小血管子宮筋細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ誘導
増殖のタンパク質媒介性阻害を定量的に決定し得る。このアッセイは、代謝活性
の検出に基づいて、蛍光定量的な増殖インジケーターを組み込む。標準Ａｌａｍ
ａｒ Ｂｌｕｅ増殖アッセイを、内皮細胞刺激の供給源として添加した１０ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦを含むＥＧＭ−２ＭＶ中で調整する。このアッセイは、増殖培
地および細胞濃度がわずかに変化した様々な内皮細胞と共に使用され得る。試験
されるべきタンパク質バッチの希釈物を、適切に希釈する。ｂＦＧＦなしの血清
を含有しない培地（ＢＩＢＣＯ ＳＦＭ）を、非刺激コントロールとして使用し
、そしてＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎまたはＴＳＰ−１は、既知の阻害コントロール
として含まれる。
【０８９１】 簡単には、ＬＥＣ、ＢＡＥＣまたはＵＴＭＥＣを、９６ウェルプレートに、５
０００〜２０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地に播種し、そして３７℃で一
晩放置する。この細胞の一晩のインキュベーションの後、増殖培地を除去し、そ
してＧＩＢＣＯ ＥＣ−ＳＦＭで置き換える。この細胞を、追加のｂＦＧＦを含
む３つのウェル中で、目的のタンパク質またはコントロールタンパク質サンプル
の適切な希釈物（ＳＦＭ中で調製）で、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで処理する。一
旦、細胞をサンプルで処理すると、プレート（単数または複数）を、３７℃のイ
ンキュベーターに３日間戻す。３日後、１０ｍｌのストックＡｌａｍａｒ Ｂｌ
ｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃａｔ＃ ＤＡＬ１１００）を、各ウェルに添加し
、そしてプレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに４時間戻
す。次いで、このプレート（単数または複数）を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リー
ダーを使用して、５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光で読みとる。直接出力を
、相対蛍光単位で記録する。
【０８９２】 Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応答
して、蛍光を発しかつ色を変化する、酸化−還元指示薬である。培地中で細胞が
増殖するにつれて、生得代謝活性によりすぐ周辺の環境の化学的還元が生じる。
増殖に関する還元により、この指示薬は、酸化（非蛍光性の青色）形態から還元
（蛍光性赤色）形態に変化し得る。すなわち、刺激された増殖は、より強いシグ
ナルを生成し、そして阻害された増殖は、より弱いシグナルを生成し、そして全
シグナルは細胞の総数ならびにそれらの代謝活性に比例する。活性のバックグラ
ウンドレベルは、飢餓性培地のみを用いて観察される。これを陽性コントロール
サンプル（増殖培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質希釈物から観察される出力
と比較する。
【０８９３】 （実施例４７：混合リンパ球反応の阻害の検出） このアッセイを使用して、遺伝子産物（例えば、単離されたポリペプチド）に
よる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出および評価し得る。ＭＬＲの阻害
は、細胞増殖および生存度、相互作用する細胞における同時刺激分子の変調、リ
ンパ球と副細胞との間の接着の変調、または副細胞によるサイトカイン産生の変
調に対する直接効果に起因し得る。複数の細胞は、これらのポリペプチドによっ
て標的化され得る。なぜなら、このアッセイで使用される末梢血液単核画分は、
Ｔ、Ｂおよびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹状細胞を含むた
めである。
【０８９４】 ＭＬＲを阻害することが見出された目的のポリペプチドは、リンパ球および単
球の活性化または増殖に関する疾患における用途を見出し得る。これには、喘息
、関節炎、糖尿病、炎症性の皮膚状態、乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス、
多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬
化症、肝硬変、対宿主性移植片病、対移植片性宿主病、肝炎、白血病およびリン
パ腫のような疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９５】 簡単には、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ（登録商標）、密度 １．００７０ｇ／ｍｌ
、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｃｈ
ｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用する密度勾配遠心分離によって精製する。２つのドナ
ー由来のＰＢＭＣを、１０％ ＦＣＳおよび２ｍＭ グルタミンを補ったＲＰＭ
Ｉ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ、ＮＹ）中、２×１０6細胞／ｍｌに調整する。第３のドナー由来のＰＢＭＣ
を、２×１０5細胞／ｍｌに調整する。各ドナー由来の５０μｌのＰＢＭＣを、
９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。試験材料の希釈
物（５０μｌ）を、三連でマイクロタイターウェルに添加する。（目的のタンパ
ク質の）試験サンプル１：４の最終希釈になるまで添加し；ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号 ２０２
−ＩＬ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加し；抗−ＣＤ４ ｍＡｂ（
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン ３４９３０．１１、カタログ番号 ＭＡＢ
３７９）を１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加する。細胞を、５％ ＣＯ 2 中、３７℃で７〜８時間培養し、そして１μＣの［3Ｈ］チミジンを、培養の最
後の１６時間でウェルに添加する。細胞を収集し、そしてチミジンの取込みを、
Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して決定する。データを、３つの測定
値の平均および標準偏差として表す。
【０８９６】 目的のタンパク質のサンプルを、別個の実験でスクリーンし、そして陰性コン
トロール処理、抗−ＤＣ４ ｍＡＢ（これはリンパ球の増殖を阻害する）、およ
び陽性コントロール処理、ＩＬ−２（組換え物質または上清として）（これは、
リンパ球の増殖を促進する）と比較する。
【０８９７】 当業者は、例示の研究を容易に改変して、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子
治療）、抗体、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト、ならびにそれらの
フラグメントおよび改変体の活性を試験し得る。
【０８９８】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【０８９９】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書にとともに提出され
た配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し形態は、両方と
も本明細書中にその全体が参考として援用される。さらに、出願番号６０／１２
４，２７０号の配列表のハードコピーおよび対応するコンピューター読み取り可
能な形態もまた、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０９００】
【表８】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０５９） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９０１】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０２】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９０３】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９０４】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９０５】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０５９） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０６】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０７】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９０８】
【表９】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６０） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９０９】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１０】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９１１】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９１２】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９１３】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６０） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１４】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１５】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９１６】
【表１０】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６１） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９１７】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１８】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９１９】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９２０】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９２１】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６１） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２２】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２３】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９２４】
【表１１】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６２） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９２５】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２６】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９２７】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９２８】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９２９】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６２） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３０】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３１】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９３２】
【表１２】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６３） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９３３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９３５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９３６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９３７】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６３） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３８】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３９】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９４０】
【表１３】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６４） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９４１】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９４２】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９４３】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９４４】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９４５】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６４） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９４６】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９４７】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９４８】
【表１４】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６５） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９４９】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９５０】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９５１】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９５２】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９５３】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６５） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９５４】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９５５】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９５６】
【表１５】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６６） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９５７】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９５８】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９５９】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９６０】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９６１】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６６） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９６２】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９６３】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９６４】
【表１６】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６７） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９６５】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９６６】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９６７】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９６８】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９６９】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６７） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９７０】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９７１】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９７２】
【表１７】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６８） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９７３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９７４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９７５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９７６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９７７】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６８） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９７８】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９７９】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９８０】
【表１８】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６９） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９８１】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９８２】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９８３】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９８４】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９８５】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９０６９） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９８６】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９８７】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９８８】
【表１９】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９５７９） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９８９】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９９０】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９９１】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９９２】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９９３】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９５７９） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９９４】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９９５】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９９６】
【表２０】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９５７８） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９９７】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９９８】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９９９】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０００】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１００１】 （ＡＴＣＣ受託番号２０９５７８） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１００２】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１００３】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１００４】
【表２１】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３０６７） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１００５】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１００６】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１００７】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１００８】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１００９】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３０６７） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０１０】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０１１】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０１２】
【表２２】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３０６８） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０１３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０１４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０１５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０１６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０１７】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３０６８） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０１８】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０１９】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０２０】
【表２３】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３６０９） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０２１】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０２２】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０２３】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０２４】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０２５】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３６０９） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０２６】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０２７】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０２８】
【表２４】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３６１０） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０２９】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０３０】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０３１】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０３２】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０３３】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３６１０） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０３４】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０３５】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０３６】
【表２５】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３４８５） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０３７】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０３８】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０３９】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０４０】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０４１】 （ＡＴＣＣ受託番号２０３４８５） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０４２】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０４３】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０４４】
【表２６】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２５２） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０４５】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０４６】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０４７】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０４８】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０４９】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２５２） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０５０】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０５１】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０５２】
【表２７】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２５３） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０５３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０５４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０５５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０５６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０５７】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２５３） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０５８】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０５９】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【１０６０】
【表２８】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０８１） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０６１】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０６２】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０６３】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０６４】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０６５】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０８１） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０６６】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０６７】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許施行規則３１Ｆ（１
）に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ 16/32 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ヘリテイジ ヒルズ ドライブ 18528 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB20 BB46 BB50 BB51 CB01 FB02 FB03 GC10 4B024 AA01 AA12 BA36 BA45 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ43 QR56 QR62 QS34 QX07 4B064 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA30 CA53 CA56 DA27 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA41 DA76 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号Ｘのポリヌクレオチドフラグメント、または配列番号Ｘにハイ
    ブリダイズし得る関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌク
    レオチドフラグメント； （ｂ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント、または配列番号Ｘにハイブリ
    ダイズし得る関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡ配列によってコード
    されるポリペプチドフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号Ｘによってコードされるポリペプチドのポリペプチドフラグメ
    ント、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得る関連するｃＤＮＡクローンに含
    まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドフラグメントをコードす
    る、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号Ｙのポリペプチドドメイン、または配列番号Ｘにハイブリダイ
    ズし得る関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされ
    るポリペプチドドメインをコードする、ポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、または配列番号Ｘにハイブリダ
    イズし得る関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードさ
    れるポリペプチドエピトープをコードする、ポリヌクレオチド； （ｆ）生物学的活性を有する、配列番号Ｙのポリペプチドをコードするポリヌ
    クレオチド、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得る関連するｃＤＮＡクロー
    ンに含まれるｃＤＮＡ配列； （ｇ）配列番号Ｘの改変体であるポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号Ｘの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド； （ｉ）配列番号Ｙの種相同体をコードするポリヌクレオチド； （ｊ）（ａ）〜（ｉ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
    ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
    こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
    を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
    クレオチド、 からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、タンパク質をコード
    するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｙとして同
    定される配列、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得る関連するｃＤＮＡクロ
    ーンに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドをコードするヌ
    クレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｘの全体の
    ヌクレオチド配列、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得る関連するｃＤＮＡ
    クローンに含まれるｃＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子
    。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
    の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む組換え宿主細胞
    を、作製する方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
    。
  10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号Ｙの、または関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡに
    よってコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号Ｙの、または関連するｃＤＮＡクロー
    ンに含まれるｃＤＮＡによってコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント
    ； （ｃ）配列番号Ｙの、または関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡに
    よってコードされた配列の、ポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号Ｙの、または関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡに
    よってコードされた配列の、ポリペプチドエピトープ； （ｅ）配列番号Ｙの、または関連するｃＤＮＡクローンに含まれるｃＤＮＡに
    よってコードされた配列の、全長タンパク質； （ｆ）配列番号Ｙの改変体； （ｇ）配列番号Ｙの対立遺伝子改変体；または （ｈ）配列番号Ｙの種相同体、 からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記全長タンパク質が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド
    。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、 （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの治
    療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
    る感受性を診断する方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する
    感受性を診断する方法であって、 （ａ）生物学的サンプルにおける請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
    在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、 （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすかどうかを決定す
    る工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号ＹのｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
  22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号Ｘを発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２０に記載の方法によって産生される、産物。
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