JP2003289870A - 新規ポリペプチド及びそれをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍壊死因子レセプター関連因子(TRAF2)と
結合する新規なタンパク質及びそれをコードする核酸を
提供すること。 【解決手段】 マウスｃＤＮＡライブラリーから、哺乳
動物２−ハイブリッドアッセイ(mammalian two-hybrid
assay)により、TRAF2と結合する新規なタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡを見出し、かつ、これによりコードさ
れるタンパク質がTRAF2と結合することを実験的に確認
し、その塩基配列を決定した。 【効果】 本発明のポリペプチドは、TRAF2と結合する
ので、TRAF2が介在するシグナル伝達の研究において重
要である。また、本発明のポリペプチドは、NF-κBシグ
ナルを活性化させ、それがTNFを介した伝達であること
が示唆されることから、その機能を阻害することによ
り、NF-κBシグナルを減弱させることが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍壊死因子レセ
プター関連因子２(TRAF2)と結合する新規なポリペプチ
ド及びそれをコードする核酸に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子レセプター関連因子(TRAF
s)は、TNFレセプターファミリーを介したシグナル伝達
経路上のアダプタータンパク質であることがわかってい
る。TRAF遺伝子ファミリーは、TRAF1ないしTRAF6の６種
類の遺伝子から成り、各タンパク質のカルボキシ末端の
保存されたTRAFドメインにより特徴付けられる(1-5)。T
RAFファミリーの中で、TRAF2は、TNF-媒介シグナル伝達
経路に包含される。TNFレセプター１(TNFR1)がTNFによ
り刺激されると、TNFR1が、TRADD(TNFR-関連死ドメイン
タンパク質(TNFR-associated death domain protein)の
アミノ末端を介して間接的にTRAF2を集める(6,7)。活性
化されたTRAF2は、NF-κB及びAP-1の活性化を媒介するR
IP(8,9)及びASK1(10)を包含する数種類のタンパク質を
集め、その結果、細胞性又は免疫性の機能を有する多く
の遺伝子が誘導される(11,12)。TRAF2の相互作用に加
え、TRADDはまた、deathドメインを有するアダプター分
子であるFADDと相互作用する(13)。FADDは、細胞死プロ
テアーゼカスケードの開始プロテアーゼであるキャスパ
ーゼ(caspase)-8を集めて活性化し、アポトーシスを引
き起こす(14)。従って、TRAF2は、TNF-媒介細胞生存に
おいて鍵となる分子であり、ここでは種々のタンパク質
がTRAF2との相互作用によってシグナル伝達経路を制御
している。

【０００３】従って、TRAF2と結合する新規なタンパク
質を見出し、特徴付けることは、TNF-媒介シグナル伝達
経路に関与する生理学的及び病理学的過程の理解にとっ
て重要である。また、このようなタンパク質は、TNF-媒
介シグナル伝達経路が関与する疾病の診断および治療の
対象としての用途を有する可能性がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、TRAF2と結合する新規なタンパク質及びそれをコー
ドする核酸を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、マウスｃＤＮＡライブラリーから、哺乳動物
２−ハイブリッドアッセイ(mammalian two-hybrid assa
y)により、TRAF2と結合する新規なタンパク質をコード
するｃＤＮＡを見出し、かつ、これによりコードされる
タンパク質がTRAF2と結合することを実験的に確認して
本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に示されるアミノ酸配列の第１番目〜第１６２番目のア
ミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、
１〜４０個のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿
入されたアミノ酸配列を有する領域を含み、TRAF2との
結合能を有するポリペプチドを提供する。また、本発明
は、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の第１
番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有する領域又は該
アミノ酸配列において、１〜４０個のアミノ酸残基が置
換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有する
領域を含み、TRAF2との結合能を有するポリペプチドを
提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリペプチ
ドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、上
記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現する
ことができる発現ベクターを提供する。さらに、本発明
は、上記本発明の核酸が導入された細胞であって、上記
本発明のポリペプチドを発現する細胞を提供する。さら
に、本発明は、上記本発明の核酸とハイブリダイズする
核酸であって、上記本発明の核酸の検出に用いることが
できる核酸を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】下記実施例に詳述する方法によ
り、マウス生後3日目の胸腺由来のｃＤＮＡライブラリ
ーから、哺乳動物２−ハイブリッドアッセイの手法を用
いて、TRAF2と結合する新規なポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡを見出した。その塩基配列を、推定アミノ酸
配列と共に配列番号４に示す。配列番号３には、配列番
号４に示されるアミノ酸配列のみを取り出して示す。こ
のポリペプチドを、「T2BP」(TRAF2-binding protein)
と命名した。また、BLASTによる相同性検索により、ヒ
トの機能未知遺伝子の中からマウスT2BP cDNAと相同性
の高いｃＤＮＡを見出した。このヒト由来ｃＤＮＡの塩
基配列を、推定アミノ酸配列と共に配列番号２に示す。
配列番号１には、配列番号２に示されるアミノ酸配列の
みを取り出して示す。配列番号１記載のアミノ酸配列を
有するポリペプチドは、マウスT2BPと高い相同性（約７
８％）を有し、また、フォークヘッド関連(forkhead-as
sociated (FHA))ドメインのような特徴的なモチーフを
有することから、ヒトT2BPであることは明らかである。
このように、本発明のポリペプチド(T2BP)の好ましい実
施例は、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列を有
する。

【０００８】下記実施例において、具体的に示されるよ
うに、T2BPの第１番目から第１６２番目までの領域（以
下、例えば第１番目のアミノ酸残基を便宜的に「1aa」
のように、また、例えば第１番目から第１６２番目のア
ミノ酸残基から成る領域を「1-１６２aa」のように記載
することがある）のみから成る欠失変異体が、TRAF2と
の結合能を示したことから、この領域を含んでいればTR
AF2との結合能を有する。また、一般に生理活性を有す
るポリペプチドのうち、少数のアミノ酸配列が置換し、
欠失し又は挿入された場合でも、該生理活性が維持され
ることがあることは周知である。実際、ヒトとマウスの
T2BPでは、1-１６２aaの領域で３２個のアミノ酸残基が
相違している（相同性約８０％）。従って、本発明のポ
リペプチドは、配列表の配列番号１又は３に示されるア
ミノ酸配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を
有する領域又は該アミノ酸配列において、１〜４０個の
アミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミ
ノ酸配列を有する領域を含み、TRAF2との結合能を有す
るポリペプチドと定義される。置換、欠失、挿入される
アミノ酸数は、上記した３２個以下であることが好まし
い。

【０００９】配列番号１のアミノ酸配列の1-１６２aaに
おいて、配列番号３のアミノ酸配列の1-１６２aaと相違
しているアミノ酸残基は、２、３、２０、２６、２８、
３２、３５、３７、３８、４１、４４、５５、５７、６
８、７１、７４、７７、９５、９７、１００、１０１、
１１４、１１７、１２６、１２７、１３４、１３６、１
４３、１４５、１４７、１５６、１５７及び１５８aaで
ある。従って、これらのアミノ酸残基は重要ではなく、
置換又は欠失していてもよく、また、これらのアミノ酸
残基に隣接する位置に１〜３個のアミノ酸残基が挿入さ
れていてもよい。また、1aaのメチオニンは、転写開始
コドンであるのでほとんど全てのタンパク質は、翻訳直
後の1aaはメチオニンであるが、多くの生理活性タンパ
ク質では、1aaはメチオニン以外のアミノ酸であること
から、1aaのメチオニンがなくてもTRAF2との結合能は維
持されると考えられる。

【００１０】同様に、配列番号３のアミノ酸配列の1-１
６２aaにおいて、配列番号１の1-１６２aaのアミノ酸配
列と相違しているアミノ酸残基は、２、３、２０、２
７、３１、３４、３６、３７、３８、４１、４４、５
５、５７、６８、７１、７４、７７、９５、９７、１０
０、１０１、１１４、１１７、１２６、１２７、１３
４、１３６、１４３、１４５、１４７、１５６、１５７
及び１５８aaである。従って、これらのアミノ酸残基は
重要ではなく、置換又は欠失していてもよく、また、こ
れらのアミノ酸残基に隣接する位置に１〜３個のアミノ
酸残基が挿入されていてもよい。さらに、配列番号１で
は、配列番号３の25aaと26aaの間にアミノ酸残基が挿入
されていることから、配列番号３の25aaと26aaの間に１
〜３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。また、
1aaのメチオニンは、転写開始コドンであるのでほとん
ど全てのタンパク質は、翻訳直後の1aaはメチオニンで
あるが、多くの生理活性タンパク質では、1aaはメチオ
ニン以外のアミノ酸であることから、1aaのメチオニン
がなくてもTRAF2との結合能は維持されると考えられ
る。

【００１１】上記の通り、1-１６２aa断片がTRAF2との
結合能を有することは実験的に確認されているが、1-18
4aa（全長）を有する方がTRAF2との結合能がより高いこ
とからより好ましい。配列番号１のアミノ酸配列におい
て、配列番号３のアミノ酸配列と相違しているアミノ酸
残基は、２、３、２０、２６、２８、３２、３５、３
７、３８、４１、４４、５５、５７、６８、７１、７
４、７７、９５、９７、１００、１０１、１１４、１１
７、１２６、１２７、１３４、１３６、１４３、１４
５、１４７、１５６、１５７、１５８、１６３、１６
５、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７
３、１７７及び１８４aaである。従って、これらのアミ
ノ酸残基は重要ではなく、置換又は欠失していてもよ
く、また、これらのアミノ酸残基に隣接する位置に１〜
３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。また、上
記の通り、1aaのメチオニンは、転写開始コドンである
のでほとんど全てのタンパク質は、翻訳直後の1aaはメ
チオニンであるが、多くの生理活性タンパク質では、1a
aはメチオニン以外のアミノ酸であることから、1aaのメ
チオニンがなくてもTRAF2との結合能は維持されると考
えられる。同様に、配列番号３のアミノ酸配列におい
て、配列番号１のアミノ酸配列と相違しているアミノ酸
残基は、２、３、２０、２７、３１、３４、３６、３
７、３８、４１、４４、５５、５７、６８、７１、７
４、７７、９５、９７、１００、１０１、１１４、１１
７、１２６、１２７、１３４、１３６、１４３、１４
５、１４７、１５６、１５７、１５８、１６３、１６
５、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７
３、１７７及び１８４aaである。従って、これらのアミ
ノ酸残基は重要ではなく、置換又は欠失していてもよ
く、また、これらのアミノ酸残基に隣接する位置に１〜
３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。さらに、
上記の通り、配列番号１では、配列番号３の25aaと26aa
の間にアミノ酸残基が挿入されていることから、配列番
号３の25aaと26aaの間に１〜３個のアミノ酸残基が挿入
されていてもよい。また、上記の通り、1aaのメチオニ
ンは、転写開始コドンであるのでほとんど全てのタンパ
ク質は、翻訳直後の1aaはメチオニンであるが、多くの
生理活性タンパク質では、1aaはメチオニン以外のアミ
ノ酸であることから、1aaのメチオニンがなくてもTRAF2
との結合能は維持されると考えられる。

【００１２】本発明のポリペプチドを相同性に基づいて
規定すると、配列表の配列番号１又は３に示されるアミ
ノ酸配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有
する領域又は該アミノ酸配列と７０％以上の相同性を有
する領域を含み、TRAF2との結合能を有するポリペプチ
ドである。配列番号１と３の1-１６２aaの相同性は、約
８０％であるので、1-１６２aaの相同性は８０％以上で
あることが好ましい。また、上記の通り、配列番号１又
は３に示されるアミノ酸配列の全長を有することがより
好ましいが、この場合の両者の相同性は約７８％である
ので、全長の相同性は７８％以上であることが好まし
い。なお、ここで言う、相同性は、図１のＢに示される
ように、両者のポリペプチドのアミノ酸残基ができるだ
け多く一致するように整列させ、一致しているアミノ酸
残基の数を全体のアミノ酸残基の数で除することにより
計算できる。なお、このような相同性の計算は、BLAST
のような市販のソフトを用いて容易に行うことができ
る。長さが異なる配列同士を比較する場合には、短い方
のアミノ酸残基数で除する。

【００１３】本発明のポリペプチドは、下記実施例に詳
述する方法によっても生産できるし、本発明によりそれ
をコードするｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったの
で、RT-PCR等の常法によりポリペプチドをコードする核
酸を調製し、それを常法により細胞中で発現させること
により容易に生産することができる。

【００１４】本発明は、また、上記本発明のポリペプチ
ドをコードする核酸を提供する。ここで言う「核酸」に
は、ＤＮＡもＲＮＡも包含される。これらの核酸は、上
記本発明のポリペプチドを遺伝子工学的に産生する際の
鋳型として利用することができる。核酸の好ましい実施
例の具体的な塩基配列は、上記の通り配列番号２及び４
に示されている。また、上記の通り、置換、欠失、挿入
を含むポリペプチドであって、TRAF2との結合能を有す
るものをコードする核酸も本発明の核酸である。このよ
うな核酸は、配列番号２又は４で示される塩基配列を有
する核酸又は該核酸とストリンジェント条件下(すなわ
ち、5 x Denhardt's reagent, 6 x SSC,0.5% SDS又は0.
1% SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を
用いて５０〜６５℃で、好ましくは５０℃と６０℃の２
段階、又は、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃の４段階
で反応を行なう)でハイブリダイズするものであること
が好ましい。

【００１５】本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主
細胞中で該核酸を発現することができる発現ベクターを
も提供する。このような発現ベクターは、上記本発明の
核酸を市販の発現ベクターのクローニング部位に挿入す
ることにより容易に調製することができ、下記実施例に
も具体的に記載されている。また、本発明は、このよう
な本発明の発現ベクターにより上記本発明の核酸が導入
された細胞であって、上記本発明のポリペプチドを発現
する細胞をも提供する。このような細胞は、上記本発明
の発現ベクターを常法により宿主細胞にトランスフェク
トすることにより容易に調製でき、下記実施例にも具体
的に記載されている。

【００１６】本発明は、また、上記本発明の核酸とハイ
ブリダイズする核酸であって、上記本発明の核酸の検出
に用いることができる核酸（以下、便宜的に「検出用核
酸」と言うことがある）をも提供する。このような核酸
は、ＰＣＲやNASBA等の核酸増幅法のプライマーであっ
てもよいし、標識を付したプローブであってもよい。プ
ライマーの場合、ハイブリダイズしないと鋳型核酸の増
幅が起きないので、増幅が起きるか否かにより該プライ
マーとハイブリダイズする本発明の核酸が被検試料中に
含まれているか否かを調べることができる。また、プロ
ーブの場合、ハイブリダイズしないとプローブの標識が
検出されないので、プローブの標識を検出することによ
り被検試料中に本発明の核酸が存在するか否かを検出す
ることができる。これらの検出用核酸は、検出の特異性
を高めるために、塩基数が１５以上であることが好まし
く、プライマーの場合には塩基数が２０〜５０がより好
ましく、プローブの場合には塩基数が２０〜全長が好ま
しい。なお、このような検出用核酸は、リアルタイム検
出ＰＣＲのプライマーに用いることや、プローブの標識
を定量すること等により、本発明の核酸の定量に利用す
ることもできる。

【００１７】下記実施例で具体的に示されるように、本
発明のポリペプチドは、NF-κBシグナルを活性化させ、
それがTNFを介した伝達であることが示唆されることか
ら、その機能を阻害することにより、NF-κBシグナルを
減弱させることが可能である。よって、NF-κBシグナル
が関与する疾患として炎症、リウマチなどの治療薬開発
のためのターゲットとして有用である。また、NF-κBシ
グナルは破骨細胞の活性化にも関与しているので、骨そ
しょう症治療薬開発のためのターゲットとしても有用で
ある。さらに、本発明の検出用核酸は、T2BP遺伝子の発
現量の測定に用いることができるので、炎症、リウマ
チ、骨そしょう症などの病態のモニターに使用すること
が可能である。また、炎症、リウマチ、骨そしょう症な
どの治療薬が、T2BP遺伝子の発現を抑制するものである
場合やアンチセンスＲＮＡであるような場合には、これ
らの治療薬の薬効の評価に用いることもできる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。実験はすべてマウスT2BPを用いておこな
った。

【００１９】材料及び方法 細胞培養 10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、200 U/mlペニシリン及
び200μｇ/mlストレプトマイシンを添加した最少必須培
地中で、ヒト胎児腎臓セルライン２９３（Graham, F.
L., Smiley, J., Russell, W.C., Nairn, R.:J Gen Vir
ol,36,59-74 (1977)。理化学研究所細胞バンクから入
手）を培養した。293T細胞（DuBridge RB, Tang P, Hsi
a HC, Leong PM, Miller JH, Calos MP：Mol Cell Biol
7, 379-87 (1987)）及びCHO-K1細胞（Kao, F. T., Puc
k, T. T.:Proc Nat Acad Sci U S A,60,1275-1281 (196
8)。理化学研究所細胞バンクから入手）は、それぞれ10
% FBS及び抗生物質を添加した、ダルベッコ修飾イーグ
ル培地及びF-12栄養混合培地(Ham's F-12)中でそれぞれ
維持した。

【００２０】哺乳動物２−ハイブリッドアッセイ 公知の方法(15)に従い行った。すなわち、先ず、次のよ
うにして２段階ＰＣＲによりアッセイ用サンプルを調製
した。T2BP及びTRAF2のｃＤＮＡ（それぞれマウス生後3
日目の胸腺由来のｃＤＮＡライブラリー、成マウスの精
巣由来のｃＤＮＡライブラリー中に含まれる）を鋳型と
して各々のタンパク質コード領域を含む領域を、タグを
付けた遺伝子特異的プライマー（正鎖プライマーT2BP,
gaaggagccgccaccatgtccacctttgaagacg; 正鎖プライマー
TRAF2, gaaggagccgccaccatggctgcagccagtgt、公知のタ
ンパク領域予測ソフトを用いて設計）及びベクター配列
に対するプライマー（逆鎖プライマーP8； agcggata
acaatttcacacaggaaa）を用いたＰＣＲにより増幅した
（第１段）。また、SV40 poly-AシグナルのＤＮＡ断片
及びGal4 DNA-結合ドメイン又はヘルペスウイルスV16転
写活性化ドメインが後に続くヒトサイトメガロウイルス
(CMV)極初期プロモーターを増幅した（用いた正逆のプ
ライマーの塩基配列および鋳型は、それぞれ次のとお
り；SV40 poly-AシグナルのＤＮＡ断片, gtttcctgtgtga
aattgttatccgctgcagacatgataagatacattg(正)、agcaagtt
cagcctggttaagatccttatcgattttaccac（逆）、pG5luc(Pr
omega社製); Gal4断片、ccaatatgaccgccatgttggc
（正）、catggtggcggctccttccggcgatacagtcaactg
（逆）、 pBIND(Promega社製)； VP16断片、ccaatatgac
cgccatgttggc（正）、catggtggcggctccttcaagtcgacggat
ccctggc（逆）、 pACT(Promega社製)）。第２段のＰＣ
Ｒでは、第１のＰＣＲ産物と、SV40 poly-Aシグナル断
片と、Gal4又はVP16断片とを連結し、ＰＣＲ産物がGal4
又はVP16ドメインとの融合タンパク質として発現される
ように設計した。なお、第２段のＰＣＲで用いたプライ
マーの塩基配列は、gccatgttggcattgattattgac（正）及
びagcaagttcagcctggttaag（逆）であった。得られたＰ
ＣＲ産物(0.13μｌ)を、20 ngのレポータープラスミドp
G5lucとともに2.2 x 10⁴個のCHO-K1細胞にトランスフェ
クション試薬LF2000(Invitrogen社製）を用いてトラン
スフェクトした。２０時間インキュベートした後、Stea
dy-Glo（商品名）ルシフェラーゼアッセイシステム(Pro
mega社製）によりルシフェラーゼレポーター活性を測定
した。

【００２１】免疫共沈降分析 T2BP及びTRAF2 ｃＤＮＡのタンパク質コード領域を含
む領域を、遺伝子特異的プライマー（T2BPの正鎖用プラ
イマーの塩基配列; gacgcgtcgaccatgtccacctttgaagac
g、TRAF2の正鎖用プライマーの塩基配列；gacgcgtcgacc
atggctgcagccagtgt。逆鎖用プライマーはベクター部位
に対して作成し、塩基配列はccggttaagcggccgcagcggata
acaatttcacacaggaaac）を用いたＰＣＲにより増幅した
後に制限酵素SalIおよびNotIで消化した断片を、発現ベ
クターpCMV-HA及びpCMV-Myc（いずれもClontech社製）
にそれぞれサブクローニングした。トランスフェクショ
ン試薬LF2000（商品名）を用い、HA-T2BP又はMyc-T2BP
を発現するための発現用ベクター2.5μｇで293T細胞(1
x 10⁶個)をトランスフェクトした。なお、HA又はMycは
抗体が認識するタグ配列の名前を意味する。２４時間イ
ンキュベートした後、細胞を回収し、10 mM of Tris-HC
l (pH 7.8), 1% NP40（商品名）, 0.15 M NaCl, 1 mM E
DTA, 1 mM PMSF and 10 μｇ/mlロイペプチン(PEPTIDE
INSTITUTE Inc.製)から成るTNE緩衝液で溶解した。10,0
00 x gで１５分間遠心後、上清を単離し、５μｇの抗HA
タグ抗体（Santa Cruz社製）で免疫沈降させた。共沈殿
したMyc-TRAF2の検出は、ウェスタンブロット分析によ
り行った。Laemmuliサンプル緩衝液中の試料を５分間煮
沸し、12.5% SDS-PAGEにかけ、タンパク質をHybond-ECL
膜（Amersham社製）に転写した。ウェスタンブロット
は、抗Mycタグ抗体と１時間、次いでHRP-結合抗マウス
ＩｇＧ(Amersham社製）と１時間インキュベートし、次
いで洗浄を行う、通常の方法により行った。シグナルの
検出は、ECLシステム（Amersham社製）及びX-線フィル
ム(Kodak社製）を用いて行った。また、培養上清を、上
記した一次抗体及び二次抗体を用いた直接的なウェスタ
ンブロットに付すことにより、HA-T2BP及びMyc-TRAF2の
発現を確認した。

【００２２】ノーザン分析 T2BP及びTRAF2 cDNAを、ノーザンブロット分析のプロー
ブとして用いた。Random Primer Labeling Kit Ver. 2
（宝酒造社製）を用いて、プローブを[³²P]で標識し
た。マウスＭＴＮブロット膜およびマウスセルラインＭ
ＴＮブロット膜(いずれもClontech社製)を購入した。Ex
pressHyb（商品名）ハイブリダイゼーション溶液(Clont
ech社製)を用い、６８℃で30分間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｘ−
線フィルムにより検出した。

【００２３】シグナル伝達経路分析 T2BPの発現ベクターを、100 ngのレポーターベクターpN
FκB-Luc又はpAP1-Luc(Clontech社製）とともに、トラ
ンスフェクション試薬LF2000を用いて、９６穴アッセイ
プレート中の5 x 10⁴個の293細胞にトランスフェクトし
た。２４時間インキュベート後、細胞を5 ng/mlのTNFで
６時間処理し(+)又は処理しなかった(-)。レポーター遺
伝子のルシフェラーゼ活性は上記の通りに測定した。

【００２４】結果 FHAドメインを有する新規なTRAF2結合タンパク質T2BPの
同定 本願発明者らは、哺乳動物２ハイブリッド法に基づく、
ＰＣＲ−媒介サンプル調製及び高効率アッセイシステム
を開発したことを報告している(15)。このシステムを用
い、マウス全長ｃＤＮＡが豊富に含まれるライブラリー
から得た約6000個のｃＤＮＡをマトリックス的に分析し
た。T2BP(TRAF2結合タンパク質)と命名された新規なTRA
F2相互作用タンパク質が、VP16転写活性化ドメインに融
合されたTRAF2をプレイ(prey)として用いた時に同定さ
れた（図１のＡ）。マウスT2BPのｃＤＮＡ配列（配列番
号４）は、５個のA+TリッチモチーフATTTAを３’非翻訳
領域中に含む。これは、サイトカインや癌原遺伝子のよ
うな多くの短命ｍＲＮＡ中に見出されるものであり、従
って、潜在的な不安定化要素である(16,17)。図１のＢ
に示されるように、T2BPは、１８４個のアミノ酸残基か
ら成り、等電点(pI)が4.79で分子量が21560と計算され
る。Pfamモチーフデータベース検索(http://pfam.wust
l.edu/index.html)によりモチーフ解析を行ったとこ
ろ、リン酸化ペプチド結合モチーフ(18,19)として知ら
れるフォークヘッド関連(forkhead-associated (FHA))
ドメインがT2BPの中央領域に位置することがわかった。
さらに、BLASTにより相同性検索を行ったところ、マウ
スT2BPのヒトオーソログが同定された（図１のＢ、配列
番号１、２）。マウス及びヒトT2BPは、アミノ酸配列全
体に亘り高度に保存されていた。

【００２５】なお、図１のＡは、哺乳動物２−ハイブリ
ッドアッセイの結果を示す。プレイ-TRAF2及び／又はバ
イト(bait)-T2BPを、レポーターベクターpG5lucと共にC
HO-K1細胞にトランスフェクトしてレポーター遺伝子で
あるルシフェラーゼの活性を測定した。プレイ−TRAF2
又はバイト−T2BPトランスフェクションについての平均
値を基礎にして相対値を計算した。

【００２６】図１のＢは、マウス及びヒトT2BP(それぞ
れmT2BP及びhT2BPと記載）のアミノ酸配列を示す。両者
において同一のアミノ酸残基は、背景に影をつけて示し
た。FHA領域は枠で囲んで示す。マウス及びヒトT2BPの
アミノ酸配列は、ｃＤＮＡから推定したものである。

【００２７】T2BPは、TRAF2のTRAFドメインと相互作用
する TRAF2は、図２のＡに示すように、数種類の周知のモチ
ーフ(1-4)を有するアダプタータンパク質である。どの
モチーフがT2BPとの相互作用に関わるのかを調べるた
め、本願発明者らは、哺乳動物２−ハイブリッド法を用
いて野生型TRAF2及びその欠失変異体との相互作用を調
べた。その結果、最小の相互作用領域は、TRAFドメイン
として知られる、カルボキシ末端側の半分を包含するこ
とがわかった。TRAFドメインは、TRAF-N及びTRAF-Cサブ
ドメインに分けられる(20)。T2BPは、TRAF2[1-357]及び
TRAF2[348-501]のいずれとも相互作用しなかったので、
T2BPとの相互作用には両方のサブドメインが必要と考え
られる。また、インビトロでGST-プルダウンアッセイを
用いて同じ結果が得られている。次いで、TRAF2との相
互作用に関与するT2BP中の領域を調べた（図２のＢ）。
調べた欠失変異体のうち、T2BP[1-１６２]以外の変異体
は、TRAF2との結合能を喪失していた。

【００２８】なお、図２のＡは、TRAF2及びその欠失変
異体を模式的に示すもの並びにそれらと野生型T2BPとの
相互作用を示す。図２のＢは、T2BP及びその欠失変異体
を模式的に示すもの並びにそれらと野生型TRAF2との相
互作用を示す。

【００２９】T2BPとTRAF2との相互作用の免疫共沈降解
析 T2BPとTRAF2との相互作用は、免疫共沈降法によりin vi
voで確認された（図３）。本願発明者らは、HA-タグを
付けたT2BP及びMyc-タグを付けたTRAF2を産生する発現
ベクターを構築した。これらの発現ベクターを293T細胞
にトランスフェクトし、細胞抽出物を、抗HAタグ抗体を
用いて免疫沈降に付した。抗Mycタグ抗体を用いたウェ
スタンブロット（図３の上段）により、Myc-TRAF2がHA-
T2BPと特異的に免疫共沈降されたことが示された。

【００３０】なお、図３の中段は、細胞抽出物をウェス
タンブロットに付し、HA-T2BPの発現を確認したもの、
下段は同様にMyc-TRAF2の発現を確認したものである。
また、図３において、IP及びIBはそれぞれ免疫沈降及び
免疫ブロットを示す。

【００３１】T2BPの発現プロフィール TRAF2とT2BPがこれらの間で相互作用を行うためには、
これらが同じ組織で共に発現していることが必要である
ので、ノーザンブロット分析によりT2BP及びTRAF2の発
現プロフィールを調べた。T2BP cDNAをプローブとして
用いた場合、2.3kbのシグナルが検出された。これは得
られたｃＤＮＡのサイズである2.0 kbに対応する、合理
的なサイズであった。T2BPは、成体の主な組織において
普遍的に発現されていた（図４）。主なシグナルに加
え、T2BPについて3.0 kbと4.0 kbに弱い２つのシグナル
が観察された。TRAF2 cDNAをプローブとして用いた結果
からわかるように、TRAF2遺伝子は、成体の主な全ての
組織中で同様に発現されており、これは先の報告(21)と
一致している。次に、どのようなマウス培養細胞株にお
いてT2BPが良く発現しているかを調べた。調べた培養細
胞株は、PU5-1.8(PU5-R), RAW264.7, K-BALB(K-234), M
-MSV-BALB/3T3, L-M, P19, Hepa1-6, R1.1, L1210, P38
8D1, P815及びNB41A3であった。これらのうち、T2BP
は、RAW264.7, L1210, P388D1といった免疫系細胞由来
の培養細胞で高発現していることが明らかとなった。

【００３２】T2BPをトランスフェクトした２９３細胞中
でのNF-κB及びAP-1の活性化 NF-κB及びAP-1のTNF-誘導活性化は、２９３細胞を包含
する数種類のセルラインにおいて良く確立されており、
そこでは、TRAF2がシグナル伝達において鍵となる役割
を果たす(11,22)。これらの経路に対するT2BPの効果を
調べるために、ルシフェラーゼ活性によりNF-κBの活性
化を検出することを可能にするレポーターベクターと共
に、２９３細胞中でT2BPを過剰発現させた（図５の
左）。レポーターベクターのみをトランスフェクトした
２９３細胞をTNF処理すると、NF-κBの活性化が明瞭に
観察された。T2BPの過剰発現により、TNF処理なしでNF-
κBが濃度依存的に活性化された。T2BP-トランスフェク
ト２９３細胞をTNF処理した場合には、TNF処理していな
いT2BP-トランスフェクト２９３細胞と同等か僅かに低
いNF-κBの活性化が見られた。AP-1の活性化に対するT2
BPの効果を評価するために同様な実験を行った（図５の
右）。TNF処理したコントロール２９３細胞中で、AP-1
の活性化が観察された。TNFで処理していない２９３細
胞中でT2BPを過剰発現させると、AP-1が濃度依存的に活
性化された。T2BP-トランスフェクト細胞をTNF処理した
場合、TNF処理していないT2BP-トランスフェクト細胞よ
りもAP-1の活性化が少なかった。このように、これらの
結果は、T2BPの過剰発現により、NF-κB及びAP-1の両方
が、TNF処理なしで活性化されることを示している。

【００３３】文献 1. Bradley, J. R., and Pober, J. S. (20
01) Oncogene 20, 6482-6491. 2. Wajant, H., Henkler, F., and Scheuri
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【００３４】

【発明の効果】本発明により、TRAF2と結合する新規な
ポリペプチド及びそれをコードする核酸が初めて提供さ
れた。本発明のポリペプチドは、TRAF2と結合するの
で、TRAF2が介在するシグナル伝達の研究において重要
である。また、本発明のポリペプチドは、NF-κBシグナ
ルを活性化させ、それがTNFを介した伝達であることが
示唆されることから、その機能を阻害することにより、
NF-κBシグナルを減弱させることが可能である。よっ
て、NF-κBシグナルが関与する疾患として炎症、リウマ
チなどの治療薬開発のためのターゲットとして有用であ
る。また、NF-κBシグナルは破骨細胞の活性化にも関与
しているので、骨そしょう症治療薬開発のためのターゲ
ットとしても有用である。

【００３５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> <120> Novel Polypeptide and Nucleic Acid Encoding the Same <130> <160>

【００３６】 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ser Phe Glu Asp Ala Asp Thr Glu Glu Thr Val Thr Cys Leu 1 5 10 15 Gln Met Thr Val Tyr His Pro Gly Gln Leu Gln Cys Gly Ile Phe Gln 20 25 30 Ser Ile Ser Phe Asn Arg Glu Lys Leu Pro Ser Ser Glu Val Val Lys 35 40 45 Phe Gly Arg Asn Ser Asn Ile Cys His Tyr Thr Phe Gln Asp Lys Gln 50 55 60 Val Ser Arg Val Gln Phe Ser Leu Gln Leu Phe Lys Lys Phe Asn Ser 65 70 75 80 Ser Val Leu Ser Phe Glu Ile Lys Asn Met Ser Lys Lys Thr Asn Leu 85 90 95 Ile Val Asp Ser Arg Glu Leu Gly Tyr Leu Asn Lys Met Asp Leu Pro 100 105 110 Tyr Arg Cys Met Val Arg Phe Gly Glu Tyr Gln Phe Leu Met Glu Lys 115 120 125 Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Phe Phe Glu Thr Gln Phe Ile Leu Ser 130 135 140 Pro Arg Ser Leu Leu Gln Glu Asn Asn Trp Pro Pro His Arg Pro Ile 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Gly Thr Tyr Ser Leu Cys Ser Ser Gln Ser Ser Ser Pro 165 170 175 Thr Glu Met Asp Glu Asn Glu Ser 180

【００３７】 <210> 2 <211> 1613 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggcacgaggg agaggacgtg ctctgccagc cagtgggaag gcaggccgcg cgcgcgggag 60 cgcgggagga tcggcggctc gcggtcactg gtccctggct cggttccccg caccccgggg 120 ctcacactta cccgcgcgga ggagcagcgg ccgggtgtcc acccccatcc tgcgcccagt 180 ctcctcgatt cccctcgctc tgagccggga gagccgaaca gctgaagaga gttcactgac 240 tccccagccc caggtgggcc ttgtgcacat c atg acc agt ttt gaa gat gct 292 Met Thr Ser Phe Glu Asp Ala 1 5 gac aca gaa gag aca gta act tgt ctc cag atg acg gtt tac cat cct 340 Asp Thr Glu Glu Thr Val Thr Cys Leu Gln Met Thr Val Tyr His Pro 10 15 20 ggc cag ttg cag tgt gga ata ttt cag tca ata agt ttt aac aga gag 388 Gly Gln Leu Gln Cys Gly Ile Phe Gln Ser Ile Ser Phe Asn Arg Glu 25 30 35 aaa ctc cct tcc agc gaa gtg gtg aaa ttt ggc cga aat tcc aac atc 436 Lys Leu Pro Ser Ser Glu Val Val Lys Phe Gly Arg Asn Ser Asn Ile 40 45 50 55 tgt cat tat act ttt cag gac aaa cag gtt tcc cga gtt cag ttt tct 484 Cys His Tyr Thr Phe Gln Asp Lys Gln Val Ser Arg Val Gln Phe Ser 60 65 70 ctg cag ctg ttt aaa aaa ttc aac agc tca gtt ctc tcc ttt gaa ata 532 Leu Gln Leu Phe Lys Lys Phe Asn Ser Ser Val Leu Ser Phe Glu Ile 75 80 85 aaa aat atg agt aaa aag acc aat ctg atc gtg gac agc aga gag ctg 580 Lys Asn Met Ser Lys Lys Thr Asn Leu Ile Val Asp Ser Arg Glu Leu 90 95 100 ggc tac cta aat aaa atg gac ctg cca tac agg tgc atg gtc aga ttc 628 Gly Tyr Leu Asn Lys Met Asp Leu Pro Tyr Arg Cys Met Val Arg Phe 105 110 115 gga gag tat cag ttt ctg atg gag aag gaa gat ggc gag tca ttg gaa 676 Gly Glu Tyr Gln Phe Leu Met Glu Lys Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu 120 125 130 135 ttt ttt gag act caa ttt att tta tct cca aga tca ctc ttg caa gaa 724 Phe Phe Glu Thr Gln Phe Ile Leu Ser Pro Arg Ser Leu Leu Gln Glu 140 145 150 aac aac tgg cca cca cac agg ccc ata ccg gag tat ggc act tac tcg 772 Asn Asn Trp Pro Pro His Arg Pro Ile Pro Glu Tyr Gly Thr Tyr Ser 155 160 165 ctc tgc tcc tcc caa agc agt tct ccg aca gaa atg gat gaa aat gag 820 Leu Cys Ser Ser Gln Ser Ser Ser Pro Thr Glu Met Asp Glu Asn Glu 170 175 180 tca tgaacacaga aagtctaaga ggagaaatat gatggatgaa gagctctgta 873 Ser gatgctgtat agacactaaa taagagttga ttagggtagt atattatagt catctgttat 933 gctgtgaaat ttggaattca aaattttgaa gtctgtaaat tgtgttagtc attaacttag 993 tcacctgttg tattctggat ctacacaaaa ttattttaag tgctcttatt aatctgtgag 1053ga ttaatata caaaaagtat cctttgagat gaagtcgtgt tctcaaaata aggttatatt 1113 attttctttt tctgcttgat tttcatcttg tgttttgctt tgtttttgta aggaaccatc 1173 tcttggtttg gtcacatcag ttcacaacag ccatttgttt tcaaggtcaa ggctccaggc 1233 aggttgttac tggtgtttgc agcctgtcag tacttgcagt actggaatag gttctaggct 1293 agtgtctgcg cgtcactgtg gttttagcat gggaggactt atttgagaaa tactacctta 1353 cttttctatg atttcttttt acagagttat agtgtgttta ctcctaagat gacagttctc 1413 tttgtctata ttcagcatct aagacaaata tttaaacatt ttaaagaacc actgtgttaa 1473 gtttaggatt atttacttac caaattagaa gtttgacttt tatgtgttat acacaatctt 1533 aaaatttcac gaattcacct ttttaatagt atccatgtac ataataaaat caaagtttaa 1593 ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1613

【００３８】 <210> 3 <211> 184 <212> PRT <213> mouse <400> 3 Met Ser Thr Phe Glu Asp Ala Asp Thr Glu Glu Thr Val Thr Cys Leu 1 5 10 15 Gln Met Thr Ile Tyr His Pro Gly Gln Gln Ser Gly Ile Phe Lys Ser 20 25 30 Ile Arg Phe Cys Ser Lys Glu Lys Phe Pro Ser Ile Glu Val Val Lys 35 40 45 Phe Gly Arg Asn Ser Asn Met Cys Gln Tyr Thr Phe Gln Asp Lys Gln 50 55 60 Val Ser Arg Ile Gln Phe Val Leu Gln Pro Phe Lys Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Ser Val Leu Ser Phe Glu Ile Lys Asn Met Ser Lys Lys Thr Ser Leu 85 90 95 Met Val Asp Asn Gln Glu Leu Gly Tyr Leu Asn Lys Met Asp Leu Pro 100 105 110 Tyr Lys Cys Met Leu Arg Phe Gly Glu Tyr Gln Phe Leu Leu Gln Lys 115 120 125 Glu Asp Gly Glu Ser Val Glu Ser Phe Glu Thr Gln Phe Ile Met Ser 130 135 140 Ser Arg Pro Leu Leu Gln Glu Asn Asn Trp Pro Thr Gln Asn Pro Ile 145 150 155 160 Pro Glu Asp Gly Met Tyr Ser Ser Tyr Phe Thr His Arg Ser Ser Pro 165 170 175 Ser Glu Met Asp Glu Asn Glu Leu 180

【００３９】 <210> 4 <211> 1970 <212> DNA <213> Mouse <400> 4 gagttaggag cagcttgtcc cgcgtgcgca gctgggttgt cagtgctgcg gtgtacctaa 60 cacaccgaca cagacccctc ttttttctcc caggagagga gacaaggctc aggagtcctg 120 atctagctgt ggccactgga agactctcag gccggggagc gtc atg tcc acc ttt 175 Met Ser Thr Phe 1 gaa gac gct gat aca gag gag acg gtc act tgt ctc cag atg acc att 223 Glu Asp Ala Asp Thr Glu Glu Thr Val Thr Cys Leu Gln Met Thr Ile 5 10 15 20 tac cat cct ggc caa caa agt ggg ata ttt aaa tca ata agg ttt tgc 271 Tyr His Pro Gly Gln Gln Ser Gly Ile Phe Lys Ser Ile Arg Phe Cys 25 30 35 agc aaa gag aag ttt cct tcc att gaa gtg gtg aaa ttt gga cgc aat 319 Ser Lys Glu Lys Phe Pro Ser Ile Glu Val Val Lys Phe Gly Arg Asn 40 45 50 tcc aac atg tgc cag tat acg ttt cag gac aaa cag gtg tcc cga att 367 Ser Asn Met Cys Gln Tyr Thr Phe Gln Asp Lys Gln Val Ser Arg Ile 55 60 65 cag ttt gtt tta cag ccg ttt aaa cag ttc aac agc tcc gtt ctc tcg 415 Gln Phe Val Leu Gln Pro Phe Lys Gln Phe Asn Ser Ser Val Leu Ser 70 75 80 ttt gaa ata aaa aac atg agc aag aaa acc agt ttg atg gta gac aac 463 Phe Glu Ile Lys Asn Met Ser Lys Lys Thr Ser Leu Met Val Asp Asn 85 90 95 100 cag gag ctc ggc tac ctc aat aaa atg gac ctg cct tac aag tgt atg 511 Gln Glu Leu Gly Tyr Leu Asn Lys Met Asp Leu Pro Tyr Lys Cys Met 105 110 115 ctc agg ttc gga gag tat cag ttc ctg ttg cag aag gaa gac gga gag 559 Leu Arg Phe Gly Glu Tyr Gln Phe Leu Leu Gln Lys Glu Asp Gly Glu 120 125 130 tcg gtg gaa tct ttt gag act caa ttt atc atg tct tca aga cct ctc 607 Ser Val Glu Ser Phe Glu Thr Gln Phe Ile Met Ser Ser Arg Pro Leu 135 140 145 ttg caa gaa aac aac tgg cca aca cag aat ccc ata cca gag gat ggg 655 Leu Gln Glu Asn Asn Trp Pro Thr Gln Asn Pro Ile Pro Glu Asp Gly 150 155 160 atg tat tct tca tac ttc acc cac aga agt tct cct tca gaa atg gat 703 Met Tyr Ser Ser Tyr Phe Thr His Arg Ser Ser Pro Ser Glu Met Asp 165 170 175 180 gaa aac gaa ctg tgaagagggt ccaactggag acacattgaa ggatgaggac 755 Glu Asn Glu Leu acatgggtcg gatgtcaaga gacatcctac ttccgagttt gtgagtgtag cgtagcgcgg 815 ctgtcctcat gctgactttc gttttggtaa tagcatttgg aagtctctag actgtgttaa 875 tcatcaactt agtcaactga gtttcggctc tacaaagaat taagtgtaca tctgtaaggg 935 ttggtgcatc agacacgtct tctgggtaat gaggtcaccc ttgttgcttt tctgcatgat 995 gttaccccca tgctttgtct tggtggcagc catctcttgg cccggtcaca tcatttcgta 1055 gcagcctttg tttttcaggt ttagagctcg ggcagattgc tcactggtgt ctgtggcgtg 1115 ctagcgcttg tagaactaga gtcctggaat aagttctaga gtgctgagtc actgagtcac 1175 catggcttcc ttatggaaag acttgggaaa tagctccttg attttctttc tgtggaacgg 1235 tagtgtcgct ttcctatatg taggacctac aacaaacatt taaagaacac tgagatgaag 1295 atggttttct tacaatattg aaagtgaatt ttatgtatct cacagattta aaaatggcag 1355 aaatcaaaac ttttaacagc ctctttgcac atgataaagc cggagcccag ttccttagtt 1415 gcttctttgg aacttcttaa aggaaaacat gtattcttaa aggaaaacat ctattcttag 1475 gctgccctat agaagtcagt acctgtgaat atttatatta aatgcttaat tatttctaaa 1535 attttagttt cacataaagt tgtatttatt taaaagattc tcattcactt cattttggct 1595 agattaagat gaatgttagt gaacattatg taaaagagga tgaaagccat taagttaaga 1655 taaattctag cattactagt aagtaaggca ccctgtatag cttcctctgt aaatgaaatt 1715 taatgctgta acaggtacag gattttgggt aggggaggag gtcaggtggg ggaagttagc 1775 cacattcata ttttgttttt gtttttgttt ttgtttttgt ttttgttttc caacaatagc 1835 ttgctttgaa gctcaggctg gcttggaact cttgatcctc atacatcggc cccctgaatg 1895 ctgtgcctag cttaatgtaa ctgtatttct gcaacagccc tttgaaatta tttctaataa 1955 actgtttggc ctagt 1970

【００４０】 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 5 gaaggagccg ccaccatgtc cacctttgaa gacg 34

【００４１】 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 6 gaaggagccg ccaccatggc tgcagccagt gt 32

【００４２】 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 7 agcggataac aatttcacac aggaaa 26

【００４３】 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 8 gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctgca gacatgataa gatacattg 49

【００４４】 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 9 agcaagttca gcctggttaa gatccttatc gattttacca c 41

【００４５】 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 10 ccaatatgac cgccatgttg gc 22

【００４６】 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 11 catggtggcg gctccttccg gcgatacagt caactg 36

【００４７】 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 12 ccaatatgac cgccatgttg gc 22

【００４８】 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 13 catggtggcg gctccttcaa gtcgacggat ccctggc 37

【００４９】 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 14 gccatgttgg cattgattat tgac 24

【００５０】 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 15 agcaagttca gcctggttaa g 21

【００５１】 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 16 gacgcgtcga ccatgtccac ctttgaagac g 31

【００５２】 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 17 gacgcgtcga ccatggctgc agccagtgt 29

【００５３】 <210> 18 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 18 ccggttaagc ggccgcagcg gataacaatt tcacacagga aac 43

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａは、哺乳動物２−ハイブリッド法の結果を示
し、Ｂは、ヒト及びマウスT2BPのアミノ酸配列を比較し
て示す図である。

【図２】Ａは、TRAF2及びその欠失変異体を模式的に示
すもの並びにそれらと野生型T2BPとの相互作用を示し、
Ｂは、T2BP及びその欠失変異体を模式的に示すもの並び
にそれらと野生型TRAF2との相互作用を示す。

【図３】本発明の実施例で行った、T2BPがTRAF2と結合
することを示す免疫共沈降の結果を示す図である。

【図４】本発明の実施例で行った、各種組織中のT2BPの
発現を示す、ノーザンブロット分析の結果を示す図であ
る。

【図５】本発明の実施例で行った、T2BPをトランスフェ
クトした２９３細胞中でのNF-κB及びAP-1の活性化を示
す、T2BP量と相対ルシフェラーゼ活性の関係を示す図で
ある。

フロントページの続き (72)発明者 金森 睦 神奈川県横浜市鶴見区末広町１−７−22 (72)発明者 マチアス ハーバーズ 東京都港区三田一丁目３−35 株式会社ダ ナフォーム内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA80 CA01 HA20 4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有する
   領域又は該アミノ酸配列において、１〜４０個のアミノ
   酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配
   列を有する領域を含み、TRAF2との結合能を有するポリ
   ペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有する
   領域又は該アミノ酸配列において、１〜３２個のアミノ
   酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配
   列を有する領域を含む請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列中、第
   １、２、３、２０、２６、２８、３２、３５、３７、３
   ８、４１、４４、５５、５７、６８、７１、７４、７
   ７、９５、９７、１００、１０１、１１４、１１７、１
   ２６、１２７、１３４、１３６、１４３、１４５、１４
   ７、１５６、１５７及び１５８番目のアミノ酸のうち少
   なくとも１個が置換し若しくは欠失し、又はこれらのア
   ミノ酸の少なくとも１個に隣接する位置に各１〜３個の
   アミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有する領域を含む
   請求項２記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有する
   領域を含む請求項２記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列又は該アミノ酸配列中、第１、２、３、２０、２
   ６、２８、３２、３５、３７、３８、４１、４４、５
   ５、５７、６８、７１、７４、７７、９５、９７、１０
   ０、１０１、１１４、１１７、１２６、１２７、１３
   ４、１３６、１４３、１４５、１４７、１５６、１５
   ７、１５８、１６３、１６５、１６８、１６９、１７
   ０、１７１、１７２、１７３、１７７及び１８４番目の
   アミノ酸のうち少なくとも１個が置換し、欠失し、又は
   これらのアミノ酸の少なくとも１個に隣接する位置に１
   〜３個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有し、TR
   AF2との結合能を有する請求項２記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列を有する請求項w５記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号３に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有する
   領域又は該アミノ酸配列において、１〜４０個のアミノ
   酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配
   列を有する領域を含み、TRAF2との結合能を有するポリ
   ペプチド。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号３に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有する
   ペプチド又は該アミノ酸配列において、１〜３２個のア
   ミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ
   酸配列を有する領域を含む請求項７記載のポリペプチ
   ド。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号３に示されるアミノ酸
   配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列中、第
   １、２、３、２０、２７、３１、３４、３６、３７、３
   ８、４１、４４、５５、５７、６８、７１、７４、７
   ７、９５、９７、１００、１０１、１１４、１１７、１
   ２６、１２７、１３４、１３６、１４３、１４５、１４
   ７、１５６、１５７及び１５８番目のアミノ酸のうち少
   なくとも１個が置換し、欠失し、又はこれらのアミノ酸
   の少なくとも１個に隣接する位置並びに第２５番目と第
   ２６番目の間の位置の少なくともいずれかに各１〜３個
   のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有する領域を含
   む請求項８記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列を有す
    る領域を含む請求項８記載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列又は該アミノ酸配列中、第１、２、３、２０、２
    ７、３１、３４、３６、３７、３８、４１、４４、５
    ５、５７、６８、７１、７４、７７、９５、９７、１０
    ０、１０１、１１４、１１７、１２６、１２７、１３
    ４、１３６、１４３、１４５、１４７、１５６、１５
    ７、１５８、１６３、１６５、１６８、１６９、１７
    ０、１７１、１７２、１７３、１７７及び１８４番目の
    アミノ酸のうち少なくとも１個が置換し、欠失し、又は
    これらのアミノ酸の少なくとも１個に隣接する位置並び
    に第２５番目と第２６番目の間の位置の少なくともいず
    れかに１〜３個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を
    有する請求項８記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列を有する請求項１１記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 配列表の配列番号１又は３に示される
    アミノ酸配列の第１番目〜第１６２番目のアミノ酸配列
    を有する領域又は該アミノ酸配列と７０％以上の相同性
    を有する領域を含み、TRAF2との結合能を有するポリペ
    プチド。
14. 【請求項１４】 前記相同性が８０％以上である請求項
    １３記載のポリペプチド。
15. 【請求項１５】 配列表の配列番号１又は３に示される
    アミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、TRAF2との
    結合能を有するポリペプチド。
16. 【請求項１６】 前記相同性が７８％以上である請求項
    １５記載のポリペプチド。
17. 【請求項１７】 請求項１ないし１６のいずれか１項に
    記載のポリペプチドをコードする核酸。
18. 【請求項１８】 配列表の配列番号２又は４で示される
    塩基配列を有する核酸又は該核酸の相補配列とストリン
    ジェント条件下でハイブリダイズする請求項１７記載の
    核酸。
19. 【請求項１９】 請求項１７又は１８記載の核酸を含
    み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる発現ベ
    クター。
20. 【請求項２０】 請求項１７又は１８記載の核酸が導入
    された細胞であって、請求項１ないし１６のいずれか１
    項に記載のポリペプチドを発現する細胞。
21. 【請求項２１】 請求項１７又は１８記載の核酸とハイ
    ブリダイズする核酸であって、請求項１７又は１８記載
    の核酸の検出に用いることができる核酸。
22. 【請求項２２】 配列表の配列番号２又は４記載の塩基
    配列を有する核酸とハイブリダイズする請求項２１記載
    の核酸。
23. 【請求項２３】 プライマー又はプローブである請求項
    ２１又は２２記載の核酸。
24. 【請求項２４】 塩基数が１５以上である請求項２１な
    いし２３のいずれか１項に記載の核酸。