MXPA01012181A - Proteina-31 alfa-helicoidal secretada. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a polinucleotidos y moleculas de polipeptidos para la proteina- 31 alfa helicoidal secretada de mamifero (zalfa31). Los polipeptidos y polinucleotidos que los codifican, son una nueva citosina de cuatro helices atadas y pueden ser usadas para regular el funcionamiento del sistema inmune. La presente invencion tambien incluye anticuerpos a los polipeptidos Zalfa3l.

Description

PROTEINA-31 ALFA-HELICOIDAL SECRETADA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las hormonas y los factores de crecimiento de 5 polipéptidos controlan la proliferación, mantenimiento, supervivencia y diferenciación de las células de los organismos multicelulares. Estas moléculas difundibles permiten a las células comunicarse entre sí y actuar de acuerdo para formar tejidos y órganos y reparar y regenerar el tejido dañado. Ejemplos de hormonas y factores del crecimiento, incluyen las hormonas esteroides (por ejemplo, estrógeno, testosterona) , la hormona paratiroides, la hormona folículo estimulante, las interleucinas, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) , el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , y el factor estimulante de las colonias granulocito-macrófago (GM-CSF) , eritropoyetina (EPO), y calcitonina. Las hormonas y los factores de crecimiento influencian el metabolismo celular aglutinándose a las proteínas. Las proteínas pueden ser proteínas de membranas integrales que están enlazadas con las trayectorias de señalización dentro de la célula, tal como segundos sistemas mensajeros. Otras clases de proteínas son las moléculas REF. : 134497 »,:aa—«átai. solubles, tales como los factores de transcripción. De especial interés, son las citocinas, moléculas que promueven la proliferación, mantenimiento, supervivencia o diferenciación de las células. Ejemplos de citocinas incluyen eritropoyetina (EPO) , la cual estimula el desarrollo de las células rojas de la sangre; trombopoietina (TPO), la cuál estimula el desarrollo de las células del linaje de los megacariocitos; y el factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-CSF) , el cual estimula el desarrollo de neutrófilos. Estas citocinas son empleadas en la restauración de los niveles normales de células de la sangre en pacientes que sufren de anemia o que reciben quimioterapia por cáncer. Las actividades in vivo demostradas de estas citocinas, ilustran el enorme potencial clínico de, y necesario para, otras citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas. La presente invención dirige esta necesidad proporcionado nuevos polipéptidos y composiciones y métodos relacionados. Estos y otros aspectos de la invención, llegarán a ser evidentes sobre la referencia a la siguientes descripción detallada de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las enseñanzas de todas las referencias citadas -£^m^y¿m^s ^^^ aquí, están incorporadas en su totalidad aquí por referencia. Previo a la exposición de la invención en detalle, puede ser provechoso al entendimiento de la misma, definir los siguientes términos: El término "etiqueta de afinidad" es usado aquí para denotar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar purificación o detección del segundo polipéptido, o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un substrato. En principio, cualquier polipéptido o proteína por la cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico está disponible, puede ser usado como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4 : 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol . 198 : 3 , 1991), transferasa S de glutationa, Smith y Johnson, Gene 67: 31 , 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu, Grussenmeyer et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 82 : 1952-4 , 1985), sustancia P, péptido Flag™, Hopp et al . , Biotechnology 6: 1204-10, 1988), péptido de enlace a la estreptavidina, u otro epítope antigénico o dominio de enlace. Véase en general, Ford et al . , Protein Expression and Purifica tion 2 : 95-107, 1991. Las etiquetas de afinidad que codifican a los ADNs, están disponibles a partir de proveedores comerciales (por ejemplo Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El término "variante alélica" es usado aquí para denotar cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa los mismos locus o sitios cromosomales. La variación alélica se logra naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones del gen pueden ser silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácido alteradas. El término variante alélica es también usado aquí para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxil-terminal" son usados aquí para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos son usados con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia carboxil-terminal colocada a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está localizada próxima al término carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el término carboxilo del polipéptido completo. y^^^^^ "Angiogénico" denota la habilidad de un compuesto para estimular la formación de nuevos bazos sanguíneos a partir de los bazos existentes, actuado solo o de acuerdo con uno o más compuestos adicionales. La actividad angiogénica es medible como la activación celular endotelial, estimulación de la secreción de proteasa mediante células endoteliales, migración de las células endoteliales, formación de brotes capilares y proliferación de las células endoteliales. El término "par complemento/anticomplemento", denota porciones no idénticas que forman un par estable, asociado no covalentemente, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son elementos fenotípicos de un par complemento/anti-complemento. Otros pares ejemplares de complemento/anti-complemento, incluyen pares de receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope) , pares de polinucleótido sentido/antisentido, y similares. En donde la disociación subsecuente del par complemento/anticomplemento es deseable, el par complemento/anticomplemento preferiblemente tiene una afinidad de enlace de <109 "1. El término "complementos de una molécula de polinucleótido" es una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia base complementaria y orientación inversa comparada con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT3' . El término "contigo" (o contiguo) denota un polinucleótido que tiene un alargamiento contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Las secuencias contiguas son las que "traslapan" un alargamiento dado de secuencia de polinucleótido ya sea en su totalidad o junto a un alargamiento parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los contigos (o contiguos) representativos a la secuencia de polinucleótido 5'-ATGGAGCTT-3' son 5' -AGCTTgagt-3' y 3' -tcgacTACC-5' . El término "secuencia de nucleótido degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (como los comparados a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica a un polipéptido) .

Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican al mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifican a Asp) . El término "vector de expresión" es usado para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica a un polipéptido de interés operablemente ligado a segmentos adicionales que se proporcionan para su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y pueden también incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un incrementador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión se derivan de manera general, del plásmido o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. El término "aislado" cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido se ha removido de su medio genético natural y está además, libre de otras secuencias codificantes no deseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para usarse con sistemas de producción de proteína diseñadas genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que están separadas de su ambiente natural e incluyen clones genómicos y ADNc. Las moléculas ADN aisladas de la presente invención, están libres de otros genes con los cuales están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se originan naturalmente, tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para un ordinario experto en la técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Na ture 316: 774-78, 1985) . Un polipéptido o proteína "aislada" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como aparte de la sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, mayores del 95% puro, más preferiblemente mayores del 99% puro. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas . El término "operablemente ligado", cuando se refiere a los segmentos ADN, indica que los segmentos están colocados de tal forma que funcionan de acorde a sus propósitos propuestos, por ejemplo, inician la transcripción en el promotor y proceden a través del segmento de codificación al terminador. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenida a partir de unas especies que son la contraparte funcional de un polipéptido o proteína de unas especies diferentes. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la evolución de las especies. "Parálogas" son proteínas distintas, pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Las parálogas se cree se logran a través de la duplicación del gen. Por ejemplo, a-globina, ß-globina, y mioglobina, son parálogas entre sí. 5 Un "polinucleótido" es un polímero de hebra sencilla o doble de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leídas a partir del extremo 5' hasta el 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, sintetizados in vi tro, o preparados a partir de una combinación de moléculas sintéticas o naturales. Los tamaños de polinucleótidos están expresados como pares base (abreviados "pb") , nucleótidos ("nt") , o kilobases ("kb") . Cuando el contexto lo permite, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de hebra sencilla o doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para denotar la longitud completa y se entenderán como equivalentes al término "pares base". Se reconocerá por aquellos expertos en la técnica, que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en la longitud y que los extremos de la misma pueden ser escalonados como un resultado del desdoblamiento enzimático; así, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra no ¿-«-^fiE lAA-arf pueden ser apareados. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, de algún modo producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente referidos como "péptidos". El término "promotor" es usado aquí por su significado reconocido en la técnica para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que se proporcionan para el enlace de la polimerasa de ARN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente pero no siempre, encontradas en las regiones no codificantes 5' de los genes. Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidratos. Los carbohidratos y otros substituyentes no-peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual la proteína se produce, y variará con el tipo de célula. Las proteínas están definidas aquí en términos de sus estructuras de esqueletos de aminoácidos; los substituyentes tales como los grupos carbohidratos no están especificados de manera general, pero sin embargo pueden estar presentes.

El término "receptor" denota una proteína asociada a la célula que se enlaza a una molécula bioactiva (es decir, un ligando), y media el efecto del ligando en la célula. Los receptores que se enlazan a la membrana están caracterizados 5 por una estructura de dominios múltiples que comprende un dominio extracelular que se enlaza al ligando y un dominio efector intracelular que está típicamente involucrado en la transducción de la señal. El enlace del ligando al receptor resulta en un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula (s) en la célula. Esta interacción en cambio, conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están ligados a las interacciones ligando- receptor, incluyen la transcripción del gen, fosforilación, desfosforilación, incremento en la producción cíclica de AMP, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de los fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar enlazados a la membrana, citosólica o nuclear; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona que estimula la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor PDFG, receptor de la hormona de crecimiento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor eritropoietina y receptor IL-6) . El término "secuencia de señal secretoria" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipéptido más largo, dirige el polipéptido más largo a través de una trayectoria secretoria de una célula en la cual es sintetizado. El polipéptido más largo es comúnmente escindido para remover el péptido secretor durante el tránsito a través de la trayectoria secretoria. El término "variante de unión" se usa aquí para denotar formas alternativas de ARN transcrito de un gen. La variación de unión se logra naturalmente a través del uso de sitios de unión alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre las moléculas de ARN transcritas separadamente, y puede resultar en varios ARNsm transcritos a partir de los mismos genes. Las variantes de unión pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido alterada. El término variante de unión es también usado aquí para denotar una proteína codificada por una variante de unión de un ARNm transcrito a partir de un gen. Los pesos moleculares y longitudes de los polímeros determinados por los métodos analíticos imprecisos (por ?tMamMtímt ejemplo, electroforesis en gel) , se entenderán como valores aproximados. Cuando tal valor está expresado como "aproximado" X o "aproximadamente" X, el valor declarado de X será entendido como exacto hasta + 10%. La presente invención proporciona nuevos polipéptidos de citocinas/proteínas. La nueva citocina, llamada "proteína-31 alfa helicoidal", aquí posteriormente referida como "Zalfa31", se descubrió e identificó como una citocina por la presencia de polipéptidos y polinucleótidos factores característicos de cuatro citocinas de hélices-atadas (por ejemplo, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, IL-2, IL-4, leptina y hormona del crecimiento) . La secuencia del polipéptido zalfa31 se obtuvo a partir de un solo clon que se cree contiene su secuencia de polinucleótido correspondiente. Las bibliotecas que deberán ser buscadas para tales secuencias incluyen corazón, cerebro, tiroides, hígado, médula espinal, glándula adrenal, testículos, macrófagos, células linfoides, células inmune activadas y similares. La secuencia de nucleótido de un ADN que codifica a un zalfa-31 representativo, se describe en la SEC ID No. 1, y su secuencia deducida de 142 aminoácidos se describe en la SEC ID NO: 2. En su totalidad, el polipéptido zalfa31 (SEC ID _^__wjtíitóa§g^ NO: 2), representa un segmento de polipéptido de longitud completa (residuo 1 (Met) hasta el residuo 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2). Los dominios y factores estructurales de zalfa31 son además, descritos abajo. 5 Los análisis del polipéptido zalfa31 codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID No.l, revelan una estructura lectora abierta que codifica 142 aminoácidos (SEC ID N0:2), que comprende un péptido de señal predicha de residuos de 19 aminoácidos (residuo 1 (Met) hasta residuos 19 (Asp) de la 10 SEC ID NO:2), y un polipéptido maduro de 122 aminoácidos (residuo 20 (Asp) hasta residuos 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2) . En general, las citocinas se predicen por tener una estructura de cuatro-alfa hélices, con las hélices A, C y D 15 siendo más importantes en las interacciones ligando-receptor, y están más altamente conservadas entre los elementos de la familia. Las hélices A-D en zalfa31 definen un dominio de enlace al receptor biológicamente activo, que comprende 37 aminoácidos (lie) hasta 132 (Leu) de la SEC ID NO: 2. El 20 polipéptido Zalfa31 maduro, tiene un peso molecular no glicosilado de aproximadamente 14,009 Daltons (D) . Análisis adicionales de la SEC ID NO: 2 indican la presencia de cuatro regiones alfa-helicoidales, anfipáticas, a saber, las hélices fi?íl,"Tftih<ÉÍÉMih-**'t*a'*^>,- i -» m . ... é. ?*MA , t i ,. > . - . . .. .... - í ¿*23lÁl &^¿ A, B, C y D: 1) "hélice A" (que corresponde a aminoácidos 37 (He) hasta 51 (Tyr) de la SEC ID N0:2); 2) "hélice B" (que corresponde a aminoácidos 65 (Leu) hasta 79 (Glu) de la SEC ID N0:2); 3) "hélice C" (que corresponde a aminoácidos 87 (He) hasta 101 (Leu) de la SEC ID NO:2). 4) "hélice D" (que corresponde a aminoácidos 118 (Leu) hasta 132 (Leu) de la SEC ID NO:2). Alternativamente, la Hélice A puede corresponder a aminoácidos 26 (Ala) hasta 40 (Leu) de la SEC ID NO: 2; y la Hélice B puede corresponder a aminoácidos 59 (Leu) hasta 73 (Thr) de la SEC ID NO: 2. Como tal, las Hélices A-D en zalfa31 pueden definir un dominio de enlace al receptor biológicamente activo extendido que comprende aminoácidos 26 (Ala) hasta 132 (Leu) de la SEC ID NO: 2. Cada hélice contiene una región externa que tiene residuos de aminoácidos, los cuales son generalmente hidrófilos, y una región internamente localizada, la cual generalmente contiene residuos de aminoácidos hidrófobos. Los residuos de aminoácidos los cuales están colocados en el exterior de las hélices son considerados cruciales para el enlace receptor y no deberán cambiarse a otro residuo de aminoácido, excepto por uno que es casi idéntico en carga. Los residuos de aminoácidos los cuales están colocados en el interior de la hélice pueden ser cambiados a cualquier residuo de aminoácido hidrófobo. En la hélice A, los residuos de aminoácidos 37, 40, 41, 44, 47 y 48 y 51 de la SEC ID NO:2, están colocados hacia el interior de la hélice A, mientras los residuos de aminoácidos 38, 39, 42, 43, 45, 46, 49 y 50 de la SEC ID NO: 2, están colocados en la porción externa de la hélice A. En la hélice B, los residuos de aminoácidos 65, 68, 69, 72, 75, 76 y 79 de la SEC ID N0:2, están colocados hacia el interior de la hélice A, mientras los residuos de aminoácidos 66, 67, 70, 71, 73, 74, 77 y 78 de la SEC ID NO: 2, están colocados en la porción externa de la hélice B. En la hélice C, los residuos de aminoácidos 87, 90, 91, 94, 97, 98 y 101 de la SEC ID NO:2, están colocados hacia el interior de la hélice A, mientras los residuos de aminoácidos 88, 89, 92.92, 95, 96, 99 y 100 de la SEC ID NO: 2, están colocados en la porción externa de la hélice C. En la hélice D, los residuos de aminoácidos 118, 121, 122, 125, 128, 129 y 132 de la SEC ID NO:2, están colocados hacia el interior de la hélice A, mientras los residuos de aminoácidos 119, 120, 123, 124, 126, 127, 130 y 131 de la SEC ID NO: 2, están colocados en la porción externa de la hélice D. Las hélices 1 hasta 4, son separadas aparte del N- término al C-término en una configuración representada por lo 5 siguiente: Asp20- { 16 } -Hl- { 13 } -H2- { 7 } -H3- { 16 } -H4- { 9 } -Arg?42, en donde Asp2o es el residuo iniciador del polipéptido maduro (como se muestra en la SEC ID N0:2), Arg?2 es el residuo final del polipéptido maduro 10 (como se muestra en la SEC ID NO:2), H# denota la hélice específica descrita anteriormente (por ejemplo, Hl es la Hélice A, H2 es la Hélice B, etc. ) , y {#} denota el número aproximado de residuos de 15 aminoácidos entre las porciones, hasta más o menos 2 residuos . Los polinucleótidos correspondientes que codifican a las regiones del polipéptido zalfa31, dominios, porciones, residuos y secuencias descritas anteriormente, son como se 20 muestran en la SEC ID No.l. Las cuatro citocinas hélicoidalmente atadas también son agrupadas por la longitud de sus hélices componentes. Las citocinas que forman "hélices largas", generalmente consisten de entre 24-30 residuos de hélices, e incluyen IL-6, factor neutrotrófico ciliar (CNTF) , factor inhibitorio de la leucemia (LIF) y hormona de crecimiento humano (hGH) . Las citocinas que forman "hélices cortas", consisten generalmente de entre 18-21 residuos de hélices e incluyen IL-2, IL-4 y GM-CSF. La zalfa31 se cree es un nuevo elemento del grupo de citocinas que forman hélices cortas. Estudios que usan CNTF y IL-6, demostraron que una hélice CNTF puede ser intercambiada por la hélice equivalente en IL-6, confiriendo propiedades enlazantes de CTNF a la quimera. Así, parece que los dominios funcionales de cuatro citocinas helicoidales, son determinados en base de la homología estructural, irrespectiva de una identidad de secuencia, y puede mantener la integridad funcional en una quimera (Kallen et al., J^_ Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999) . Por lo tanto, los dominios helicoidales de zalfa31 se emplearán para la preparación de moléculas de fusión quimérica, particularmente con otras citocinas que forman hélices cortas para determinar y modular la especificidad del enlace del receptor. De particular interés son las proteínas de fusión, diseñadas genéticamente con la hélice A y/o la hélice D, y las proteínas de fusión que combinan dominios helicoidales y de bucles a partir de otras citocinas que forman cortas tales como IL-2, IL-4, IL-5 y GM-CSF. Los residuos de aminoácidos que comprenden hélices A, B, C y D, y los bucles A/B, B/C y C/D para zalfa31, IL-2, IL-4, IL-15 y GM-CSF, se muestran en la Tabla 1. Tabla 1 POLINUCLEOTIDOS La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos zalfa31 descritos aquí. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación considerable de la secuencia entre esas moléculas de polinucleótidos. La SEC ID NO: 3 es una secuencia de ADN degenerada que abarca todos los ADNs que codifican los polipéptidos zalfa31 de la SEC ID NO: 2. Aquellos con experiencia en la técnica, reconocerán que las secuencias degeneradas de la SEC ID NO: 3, proporcionan también todas las secuencias de ARN que codifican la SEC ID NO: 2, mediante la substitución de U por T. De este modo, los polinucleótidos que codifican al polipéptido zalfa31 que comprenden el nucleótido 1 hasta el nucleótido 426 de la SEC ID No.3 y sus equivalentes de ARN, están contemplados por la presente invención. La tabla 2 expone los códigos de una letra, usados dentro de la SEC ID NO: 3, para denotar las posiciones del nucleótido degenerado. Las "resoluciones", son los nucleótidos denotados por un código de letra. El "complemento", indica el código para el (los) nucleótido (s) complementarios. Por ejemplo, el código Y denota ya sea C o T, y su complemento R, denota A o G, A es complementario a T, y G es complementario a C.

TABLA 2 Los codones degenerados usados en la SEC ID NO: 3, que abarcan todos los codones posibles para un aminoácido dado, se exponen en la Tabla 3.

TABLA 3 Una persona de experiencia ordinaria en la técnica, apreciará que se introduce alguna ambigüedad en la determinación de un codón degenerado, representativo de todos los posibles codones que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar la arginina (ARG) , y el codón degenerado por la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar la serina (AGY) . Existe una relación similar entre los codones que codifican la fenilalanina y la leucina. De este modo, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar las secuencias variantes de aminoácidos, pero una persona con experiencia ordinaria en la técnica, puede identificar fácilmente tales secuencias variantes mediante la referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Las secuencias variantes pueden ser sometidas a prueba fácilmente para su funcionalidad como se describe aquí. Uno de habilidad ordinaria en la técnica, también apreciará que diferentes especies pueden exhibir "uso de codones preferenciales". En general, ver Grantham et al . , Nuc . Acids Res . 8:1893-1912 (1980), Haas et al . , Curr. Biol . 65:315-324 (1996), Wain-Hobson et al . , Gene 13:355-364 (1981), Grosjean y Fiers, Gene 18:199-209 (1982), Holm, Nuc . Acids Res . 14 : 3015-3081 (1986), Ike ura, J. Mol Biol . 158 : 513 (1982) . Como se usa aquí, el término "uso de codones preferenciales", o "codones preferenciales", es un término de la técnica que se refiere a los codones de traducción de la proteína que se usan más frecuentemente en las células de ciertas especies, favoreciendo de este modo, a uno o unos cuantos representativos de los posibles codones que codifican cada aminoácido (Véase la Tabla 3) . Por ejemplo, el amino ácido Treonina (Thr) pueden ser codificado por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en las células de mamíferos, el ACC es el codón usado más frecuentemente; en otras especies, por ejemplo, en las células de insectos, levaduras, virus o bacterias, pueden ser preferenciales diferentes codones de Thr. Los codones preferenciales para una especie particular pueden ser introducidos en los polinucleótidos de la presente invención, mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de las secuencias de los codones preferenciales en el ADN recombinante, puede, por ejemplo, mejorar la producción de la proteína haciendo más eficiente la traducción de la proteína dentro de un tipo o especies de células particulares. Las secuencias que contienen los codones preferenciales pueden ser sometidas a prueba y optimizadas para la expresión en varias especies, y se someten a prueba para su funcionalidad como se describe aquí. Dentro de modalidades preferidas de la invención, los polinucleótidos aislados hibridizarán a regiones de tamaños similares de la SEC ID No.l, o una secuencia complementaria a esta, bajo condiciones severas. En general, las condiciones severas, se seleccionan por ser aproximadamente 5°C o más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica, a una fuerza iónica y un pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente igualada. Las ecuaciones numerosas para calcular la Tm se conocen en la técnica, y son específicas para ADN-ARN, y ADN-ARN híbridos y secuencias de sondas de polinucleótidos de longitud variante (véase por ejemplo, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Labora tory Manual , Segunda Edición (Cold Spring Harbor Ppres 1989); Ausubel et al . , (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds). Guide to Molecular Cloning Techniques , (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Cri t . Rev. Biochem . Mol . Biol . 26: 221 (199)). El conjunto de programas o software de análisis de la secuencia es OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) , y Primer Premier 4 . 0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) , así como también sitios en la Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular el Tm basado en el criterio definido del usuario. Tales programas pueden también analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar secuencias de sonda adecuadas. Típicamente, la hibridación de secuencias de polinucleótidos más largas, >50 pares base, se realiza a temperaturas de aproximadamente 20-25°C por debajo de la Tm calculada. Para sondas más pequeñas, <50 pares base, la hibridación se lleva a cabo típicamente a la Tm de o por debajo de 5-10°C. Esto permite la velocidad máxima de hibridación para los híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN. Los grados superiores de severidad a bajas temperaturas, pueden alcanzarse con la adición de formamida, lo cual reduce la Tm del híbrido a aproximadamente 1°C por cada 1% de formamida en la solución amortiguadora. Las condiciones de hibridación severas adecuadas son equivalentes a aproximadamente unas 5 h a incubación durante la noche a aproximadamente 42 °C en una solución que comprende: aproximadamente 40-50% de formamida, hasta aproximadamente 6X SSC, aproximadamente 5X de solución Denhart, cero hasta aproximadamente 10% de sulfato de dextrano, y aproximadamente 10-20 µg/ml de portador de ADN desnaturalizado comercialmente disponible. De manera general, tales condiciones severas incluyen temperaturas de 20-70 °C y un amortiguador de hibridación que contiene hasta 6X SSC y 0-50% de formamida; la hibridación entonces se sigue por el lavado de los filtros en hasta aproximadamente 2X SSC. Por ejemplo, una severidad adecuada del lavado es equivalente a 0.1X SCC hasta 2X SSC, 0.1% de SDS, a 55°C hasta 65°C. Los grados diferentes de severidad se pueden usar durante la hibridación y el lavado para alcanzar el enlace específico máximo a la secuencia objetivo. Típicamente, los lavados después de la hibridación se realizan a grados incrementados de severidad para remover las sondas de polinucleótidos no hibridizadas a partir de los complejos sometidos a hibridación. La hibridación severa y las condiciones de lavados dependen de la longitud de la sonda, reflejadas en la Tm, hibridación y soluciones de lavado usadas, y son rutinariamente determinadas de manera empírica por uno de habilidades en la técnica. Como se notó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para la preparación de ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN es aislado a partir de una célula o tejido que produce grandes cantidades de ARN Zalfa31. Tales tejidos y células están identificados por los ? á& 3 t * manchados de Northern, Thomas, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 77:5201, (1980), y se discuten abajo. El ARN total puede prepararse usando la extracción de HCl de guanidina, seguida por el aislamiento mediante centrifugación en un gradiente CsCl Chirgwin et al . , Biochemistry 18:52-94, (1979). El Poli(A)+ARN se prepara a partir del ARN total usando el método de Aviv y Leder, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 63:1408-12, 1972. El ADN complementario (ADNc) se prepara de poli(A)+ARN usando métodos conocidos. En la alternativa, el ADN genómico puede ser aislado. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Zalfa31 son entonces identificados y asilados mediante, por ejemplo, hibridación o PCR. Un clon de longitud completa que codifica al Zalfa31 se puede obtener por procedimientos de clonación convencionales. Los clones de ADN complementarios (ADNc) son preferidos, aunque para algunas aplicaciones (por ejemplo, expresión en animales transgénicos) puede ser preferible, usar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc para incluir al menos, un intron genómico. Los métodos para la preparación del ADNc y los clones genómicos son bien conocidos y están dentro del nivel del ordinario experto en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita aquí, o partes de la misma, para someter a sondas o someter a cebadores una biblioteca. Las bibliotecas de expresión pueden ser sondeadas con anticuerpos a Zalfa31, fragmentos de receptores, u otros patrones de enlace específicos. Los polinucleótidos de la presente invención pueden también ser sintetizados usando sintetizadores de ADN. Si el ADN de doble hebra químicamente sintetizado es requerido para una aplicación, tal como la síntesis de un ADN o fragmento de ADN, entonces cada hebra complementaria se elabora separadamente, por ejemplo, vía el método de fosforamidita conocido en la técnica. La producción de polinucleótidos cortos (60 a 80 bp) es técnicamente de manera directa y puede estar acompañada por la sintetización de las hebras complementarias y después el alineamiento de éstas. Sin embargo, para producir polinucleótidos más largos (>300 bp) , son empleadas de manera usual, estrategias especiales. Por ejemplo, los ADNs sintéticos (de doble hebra) , son ensamblados en forma modular a partir de fragmentos de hebras únicas que son de 20 hasta 100 nucleótidos de longitud. Un método para construir un ADN sintético, involucra producir una serie de oligonucleótidos complementarios, traslapantes. Cada sección interna del ADN tiene extensiones terminales 3' y 5' complementarias designadas como pares base precisamente con una sección adyacente. Después que el ADN es ensamblado, el proceso es completado por la ligación de los cortes junto con las estructuras de las dos hebras. Además de la secuencia codificante de proteína, el ADNs sintético puede ser designado con secuencias terminales que facilitan la inserción en un sitio de una endonucleasa de restricción de un vector de clonación. Las formas alternativas para preparar una ADN de longitud completa, también se conocen en la técnica. Véase Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C, 1994); Itakura et al . , Annu. Rev. Biochem. 53: 323-356 (1984) y Cumie et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 633-637 (1990) . La presente invención además proporciona contrapartes de polipéptidos y polinucleótidos de otras especies (ortólogos) . Estas especies incluyen, pero no están limitadas a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. De interés particular son los polipéptidos Zalfa31 de otras especies de mamíferos, que incluyen murina, porcina, ovina, bovina, canina, felina, equina y otros polipéptidos de primates. Los ortólogos de Zalfa31 humano pueden ser clonados usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado usando ARNm obtenido a partir de un tipo de tejido o célula que expresa el Zalfa31 como se describe aquí. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden ser identificadas al someter a sondas los manchados Northern con sondas designadas de las secuencias descritas aquí. Una biblioteca es entonces preparada del ARNm de una línea celular o tejido positivo. Un ADNc que codifica al Zalfa31 puede entonces ser aislado por una variedad de métodos, tal como por el sondeo con un ADNc humano parcial o completo o con una o más series de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADNc puede también ser clonado usando la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullís, Patente Estadounidense No. 4,683,202), usando cebadores designados de la secuencia Zalfa31 humana representativa descrita aquí. Dentro de un método adicional, la biblioteca de ADNc puede ser usada para transformar o transfectar las células hospederas, y la expresión del ADNc de interés puede ser detectada con un anticuerpo al polipéptido Zalfa31. Las técnicas similares pueden también ser aplicadas al aislamiento de los clones genómicos . Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEC ID NO:l representa un alelo único de Zalfa31 humano y se espera que ocurra tal variación alélica y uniones alternativas. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas mediante el ADNc de sondeo o las bibliotecas genómicas a partir de individuos diferentes de conformidad con los procedimientos estándares. Las variantes alélicas de la secuencia del ADN mostradas en la SEC ID NO:l, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silentes y aquellas en las cuales las mutaciones resultan en los cambios de la secuencia de aminoácido, están dentro del ámbito de la presente invención, como son las proteínas las cuales son variantes alélicas de la SEC ID NO: 2. Los ADNsc generados a partir de los ARNms alternativamente unidos, los cuales retienen las propiedades del polipéptido Zalfa31, están incluidos dentro del ámbito de la presente invención, como son los polipéptidos que codifican para tales ADNsc y ARNsm. Las variantes alélicas y variantes de unión de estas secuencias pueden ser clonadas mediante el sondeo de ADNc o bibliotecas genómicas de diferentes individuos o tejidos de conformidad con los procedimientos estándares conocidos en la técnica. La presente invención también proporciona polipéptidos Zalfa31 aislados que son substancialmente similares a los polipéptidos de la SEC ID NO: 2 y sus ortólogos. El término "substancialmente similar" se usa aquí para denotar polipéptidos que tienen al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente al menos 85% de identidad a las secuencias mostradas en la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos. Tales polipéptidos, serán más preferiblemente al menos 90% idénticos y más preferiblemente 95% o más idénticos a la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos. El porcentaje de identidad de la secuencia está determinado por los métodos convencionales. Véase por ejemplo, Altschul et al . , Bull . Ma th . Biol . 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 83:10915-9, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos son alineadas para optimizar los registros de alineación usando una falta de apertura de separación de 10, una falta de extensión de separación de 1, y la matriz de registro "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff ( ibid. ) , como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos están indicados por los códigos estándares de una letra) . El porcentaje de identidad entonces es calculado como: Número total de pares idénticos x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de separaciones introducidas en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias] A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 10 ? -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 15 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 20 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 w -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 4- V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 La identidad de la secuencia de las moléculas de polinucleótidos se determina por los métodos similares, usando una proporción como se describe anteriormente. Aquellos con experiencia en la técnica, apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineación de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita aquí y la secuencia de aminoácidos de una variante de Zalfa31 putativa. El algoritmo FASTA se describe por Pearson y Lipman, Proc. Na t f 1 Acad. Sci . EUA 85: 2444 (1988), y por Pearson, Meth . Enzymol . 183 : 63 (1990). Brevemente, el FASTA, caracteriza primero la similitud de la secuencia identificando las regiones compartidas por la secuencia en cuestión (por ejemplo, la SEC ID NO: 2) y la secuencia de prueba que tiene ya sea, la densidad más alta de identidades (si la variable ktup es 1) o los pares de identidades (si ktup=2) sin considerar las substituciones conservativas, inserciones o eliminaciones de aminoácidos. Las diez regiones con la densidad más alta de identidades, entonces se registran nuevamente, comparando la similitud de todos los aminoácidos apareados, usando una matriz de substitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "aparean" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen al registro más alto. Si existen varias regiones con registros más grandes que el valor de "cutoff" (calculado mediante una fórmula predeterminada, basada en la longitud de la secuencia y el valor de ktup) , entonces, las regiones iniciales apareadas se examinan para determinar si las regiones pueden ser enlazadas para formar una alineación aproximada con las separaciones. Finalmente, las regiones con registros más altos de las dos secuencias de aminoácidos, se alinean usando una modificación del algoritmo Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl . Ma th . 26: 181 (1974), lo cual permite las inserciones y eliminaciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA, son: ktup=l, penalidad por abertura de la separac?ón=10, penalidad por extensión de la separación=l, y matriz de substitución=BLOSUM62, con otros parámetros como omisión. Estos parámetros pueden ser introducidos en un programa FASTA, modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX") , como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth . Enzymol . 183 : 63 (1990). El programa FASTA puede también ser usado para determinar la identidad de la secuencia de moléculas de ácidos nucleicos, usando una relación como se describe arriba. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor de ktup puede variar entre uno a seis, preferiblemente desde tres a seis, más preferiblemente tres, con los otros parámetros establecidos como omisión. La tabla BLOSUM62 (Tabla 4) es una matriz de substitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2,000 alineaciones locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc . Na t ' l Acad. Sci . EUA 83:10915 (1992)). Por consiguiente, las frecuencias de substitución de BLOSUM62 pueden ser usadas para definir las substituciones conservativas de aminoácidos, que pueden ser introducidas en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar substituciones de aminoácidos basadas solamente en las propiedades químicas (como se discute abajo), el lenguaje "substituciones conservativas de aminoácidos", se refiere preferiblemente a una substitución representada por un valor de BLOSUM62, más grande que -1. Por ejemplo, una substitución de aminoácido es conservativa si la substitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 o 3. Por consiguiente, para este sistema, las substituciones conservativas de aminoácidos preferidas, se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las substituciones conservativas de aminoácidos más preferidas, se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3) . La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene uno o más cambios conservativos de aminoácidos, comparados con la secuencia de aminoácido de la SEC ID No.3. La tabla BLOSUM62 es una matriz de substitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2,000 alineaciones locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Na t ' l Acad. Sci . EUA 83:10915 (1992) ) . Por consiguiente, las frecuencias de substitución de BLOSUM62 pueden ser usadas para definir las substituciones conservativas de aminoácidos, que pueden ser introducidas en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Como se usa aquí, el lenguaje "substituciones conservativas de aminoácidos", se refiere a una substitución representada por un valor de BLOSUM62, más grande que -1. Por ejemplo, una substitución de aminoácido es conservativa si la substitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 o 3. Las substituciones conservativas de aminoácidos preferidas, se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las substituciones conservativas de aminoácidos más preferidas, se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3) . Por consiguiente, la presente invención incluye aquellos polipéptidos los cuales son al menos 90%, preferiblemente 95%, y más preferiblemente 99% idénticos a la SEC ID No.3, y los cuales son capaces de estimular la producción de anticuerpos en un mamífero, y dichos anticuerpos son capaces de enlazarse a la secuencia nativa de la SEC ID No.3. Las variantes de los polipéptidos Zalfa31 o polipéptidos Zalfa31 substancialmente homólogos, están caracterizadas por tener una o más substituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, que son substituciones conservativas de aminoácidos (véase Tabla 5) y otras substituciones que no afectan significantemente el desdoblamiento o actividad del polipéptido; supresiones menores, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxil-terminal menores, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad. La presente invención así, incluye polipéptidos desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 175 residuos de aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, y más preferiblemente 99% o más idéntica a la región correspondiente de la SEC ID NO: 2. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad pueden además comprender un sitio de desdoblamiento proteolítico entre el polipéptido Zalfa31 y la etiqueta de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen los sitios de desdoblamiento de trombina y los sitios de desdoblamiento del factor Xa.

Tabla 5 Substituciones conservativas de aminoácidos Básicas: arginina lisina histidina Acídicas: ácido glutámico ácido aspártico Polares: glutamina asparagina Hidrófobas: leucina isoleucina valina 5 Aromáticas: fenilalanina triptofano tirosina Pequeñas: glicina alanina 10 serina treonina metionina La presente invención además proporciona una 15 variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, un polipéptido Zalfa31 puede ser preparado como una fusión a una proteína dimerizante como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,155,027 y 20 5,567,584. Las proteínas dimerizantes preferidas en este sentido, incluyen dominios de región constante de inmunoglobulina. Las fusiones del polipéptido Zalfa31 de inmunoglobulina, pueden ser expresadas en células diseñadas genéticamente para producir una variedad de análogos Zalfa31 multiméricos. Los dominios auxiliares pueden ser fusionados a los polipéptidos Zalfa31 para ser objetivos a las células específicas, tejidos o macromoléculas (por ejemplo, colágeno) . Por ejemplo, un polipéptido Zalfa31 o proteína, podrían ser objetivos a un tipo celular predeterminado al someter a fusión un polipéptido Zalfa31 a un ligando que se enlaza específicamente a un receptor en la superficie de la célula objetivo. En esta forma, los polipéptidos y proteínas pueden ser objetivos para los propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido Zalfa31 puede ser fusionado a dos o más porciones, tal como una etiqueta de afinidad para la purificación y un dominio de objetivo. Las fusiones de polipéptidos pueden también comprender uno o más sitios de desdoblamiento, particularmente entre dominios. Véase, Tuan et al., Connective Tissue Research 34 : 1- 9 , 1996. Las proteínas de la presente invención pueden también comprender residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente. Los aminoácidos que no se originan naturalmente incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, allo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina . Se conocen varios métodos en la técnica para la incorporación de residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente en las proteínas. Por ejemplo, un sistema in vi tro puede ser empleado cuando las mutaciones no sentido se suprimen usando tARNs de supresión químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y tARN aminoacilantes se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de los plásmidos que contienen mutaciones no sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprenden un extracto E. coli S30 y sistemas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase por ejemplo, Robertson et al., J. Am . Chem . Soc . 113 : 2122 , 1991; Ellman et al., Methods Enzymol . 202 : 301 , 1991; Chung et al., Science 259: 806-9 , (1993); y Chung et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90:10145-1019, (1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus por la microinyección de ARNm mutados y tARNs supresores químicamente aminoacilados, Turcatti et al . , J. Biol . Chem . 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, las células E. coli son cultivadas en la ausencia de un aminoácido natural que es reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia de aminoácido (s) deseados que no se originan naturalmente (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 5 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina) . El aminoácido que no se origina naturalmente, es incorporado en la proteína en lugar de su contraparte natural. Véase Koide et al., Biohem . 33: 1470-6, 1994. Los residuos de aminoácidos que se originan naturalmente pueden ser convertidos a especies que no se originan naturalmente por la modificación química in vi tro . La modificación química puede ser combinada con mutagénesis dirigida al sitio para expandir además el rango de substituciones, Wynn y Richards, Protein Sci . 2:395-403, 1993) . 15 Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que no se originan naturalmente y aminoácidos no naturales pueden ser substituidos por los residuos de aminoácidos Zalfa31. 20 Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden ser identificados de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración i r nnuJMWriñr r de alanina, Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989; Bass et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 88:4498-502, (1991). En la última técnica, las mutaciones únicas de alanina son introducidas a todos los residuos en la molécula, y las 5 moléculas mutantes resultantes son sometidas a prueba por su actividad biológica como se describen abajo para identificar residuos de aminoácidos que son críticos a la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al . , J. Biol . Chem . 271 : 4699-108 , 1996. Los sitios de interacción del receptor- 10 ligando pueden también ser determinados por los análisis físicos de estructura, como se determinan por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción del electrón, o etiquetación de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase por ejemplo, de Vos et al., Science 255 : 306- 12, (1992); Smith et al . , J. Mol . Biol . 244 : 899-904 , 1992; Wlodaver et al . , FEBS Lett . 309: 59-64 , (1992). La determinación de residuos de aminoácidos que están dentro de regiones o dominios que son críticos para mantener la integridad estructural, puede ser determinada. Dentro de estas regiones, uno puede determinar residuos específicos que serán más o menos "tolerantes de cambio y mantienen la estructura terciaria completa de la molécula.

Los métodos para analizar la estructura de secuencia incluyen, pero no se limitan a, alineación de secuencias múltiples con aminoácidos superiores o identidad de nucleótidos y análisis por computadora usando conjuntos de 5 programas o software disponibles (por ejemplo, las herramientas de modelación de homología y revisor Insight II®; MSI, San Diego, CA) , las propensidades de estructura secundaria, patrones binarios, paquetes complementarios e interacciones polares enmascaradas (Barton, Current Opin.

Struct. Biol. 5:372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10 (1996). En general, cuando diseñamos modificaciones a las moléculas o identificamos fragmentos específicos, la determinación de estructura será acompañada por la actividad evaluante de las moléculas modificadas. 15 Los cambios de la secuencia de aminoácido se hacen en los polipéptidos zalfa31 para así minimizar el rompimiento de la estructura de orden superior esencial para la actividad biológica. Por ejemplo, cuando el polipéptido zalfa31 comprende una o más hélices, los cambios en los residuos de aminoácidos se harán en tanto no se rompa la geometría de la hélice y otros componentes de la molécula en donde los cambios en la conformación abaten alguna función crítica, por ejemplo, el enlace de la molécula a sus patrones de enlaces. ^gg^g^ Los efectos de los cambios de secuencia de aminoácido pueden predecirse mediante por ejemplo, modelación por computadora como se describe anteriormente, o determinarse mediante análisis de estructura de cristal (véase por ejemplo, Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995). Otras técnicas que son bien conocidas en el arte comparan pliegues de una proteína variante a una molécula estándar (por ejemplo, la proteína nativa) . Por ejemplo, la comparación del patrón de cisteína en unas moléculas variantes y estándares puede hacerse. La espectrometría de masas y la modificación química usando reducción y alquilación, proporciona métodos para determinar residuos de cisteína los cuales están asociados con los enlaces disulfuro o están libres de tales asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Proteina Sci. 2:1732-1748, 1993; y Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Se cree de manera general, que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de enlace disulfuro, como podrían afectarse los pliegues de la molécula estándar. Otro método bien conocido y aceptado para medir el pliegue es el dicrosismo circular (DC) . La medición y comparación del espectro de DC generado por una molécula modificada y la molécula estándar es de rutina (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). La cristalografía es otro método bien conocido para analizar pliegues y estructura. La resonancia magnética nuclear (RMN) , formación de mapas péptidos digestivos y formación de mapas de epítopes, son también métodos conocidos para analizar los pliegues y similitudes estructurales entre las proteínas y los polipéptidos (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992). Se puede generar un perfil de hidrofilicidad de Hopp/Woods de la secuencia de proteína zalfa31 como se muestra en la SEC ID NO: 2 (Hopp et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 1_1:153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana de seis residuos deslizantes. Los residuos G, S y T enmascarados y los residuos H, Y y W expuestos, se ignoraron. Por ejemplo, en las regiones hidrofílicas zalfa31, incluyen: (1) residuos de aminoácidos 14 (Asp) hasta 19 (Asp) de la SEC ID NO: 2, (2) residuos de aminoácidos 26 (Ala) hasta 31 (Glu) de la SEC ID NO:2, (3) aminoácido 27 (Glu) hasta 32 (Pro) de la SEC ID NO:2, (4) residuos de aminoácidos 136 (Tyr) hasta 141 (Lys) de la SEC ID NO: 2, y (5) residuos de aminoácidos 137 (Lys) hasta 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la hidrofilicidad o hidrofobicidad se tomarán en cuenta cuando se diseñen modificaciones en la secuencia de aminoácido de un polipéptido zalfa31, en tanto no se rompa con la estructura total y perfil biológico. De interés particular para el reemplazo, son los residuos hidrofóbicos seleccionados del 5 grupo que consiste de Val, Leu e He o el grupo que consiste de Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp. Por ejemplo, residuos tolerantes de substitución podrían incluir tales residuos como se muestra en la SEC ID NO: 2. Sin embargo, los residuos de cisteína podrían ser relativamente intolerantes de 10 substitución. Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden también ser inferidas de análisis de similitud de secuencias entre otros miembros de la familia de citocinas con zalfa31. Usando los métodos tales como el análisis 15 "FASTA" descrito previamente, las regiones de alta similitud están identificadas dentro de una familia de proteínas y se usan para analizar secuencias de aminoácidos para regiones conservadas. Un procedimiento alternativo para identificar un polinucleótido zalfa31 variante en las bases de la estructura 20 es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica a un polinucleótido zalfa31 variante potencial puede hibridizar a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No.l, como se discute J--'-^^"l'IIÍllffltft-|'Bl1*--T- • Uj., --.-y. . M. Lm?*ím. MMM.m ... y y y, yy *,.. * , .^. , .... , , y..y . yy. * ~<M»»^ anteriormente . Otros métodos para identificar aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención, son procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081(1989), Bass et al . , Proc. Nati Acad. Sci. EUA 88:4498(1991); Coombs y Corey "Site-Directed Mutagénesis and Protein Engineering" en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la ultima técnica. Las mutaciones de la alanina sola, se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes, son sometidas a pruebas por su actividad biológica como se describe abajo para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos a la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al . , J. Biol . Chem . 271:4699(1996). La presente invención incluye también fragmentos funcionales de polipéptidos zalfa31 y moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales fragmentos funcionales. Un zalfa31 "funcional" o fragmento del mismo definido aquí, está caracterizado por su actividad proliferativa y de diferenciación, por su habilidad para inducir o inhibir las funciones especializadas de la célula, o por su habilidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-zalfa31 o receptor zalfa31 (ya sea soluble o inmovilizado) . Como se describe previamente aquí, el zalfa31 está caracterizado por una estructura de cuatro hélices atadas que comprende una hélice A (residuos de aminoácidos 37-51), hélice B (residuos de aminoácidos 65-79, hélice C (residuos de aminoácidos 87-101) y hélice D (residuos de aminoácidos 118-132), como se muestra en la SEC ID NO: 2. Así, la presente invención además proporciona proteínas de fusión que abarcan: (a) moléculas de polipéptidos que comprenden una o más de las hélices descritas anteriormente, y (b) fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas hélices. La otra porción de polipéptido de la proteína de fusión pude ser contribuida por otras citocinas de cuatro hélices atadas, tal como IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF, o por un péptido de señal secretoria no relacionado y/o no nativo que facilita la secreción de la proteína de fusión. Los análisis de eliminación de rutina de las moléculas de ácidos nucleicos, pueden ser realizados para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido zalfa31. Como una ilustración, las moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1, o fragmentos de la misma, pueden ser digeridas con la nucleasa Sal31 para obtener una serie de eliminaciones anidadas. Estos fragmentos de ADN son entonces insertados en los vectores de expresión en estructuras lectoras apropiadas, y los polipéptidos expresados son aislados y sometidos a prueba por su actividad zalfa31, o por la habilidad para enlazarse a los anticuerpos anti-Zalrfa31 o receptores zalfa31. Una alternativa a la digestión por exonucleasas, es usar la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para introducir las eliminaciones o codones de detención a la producción especifica de un fragmento zalfa31 deseado. Alternativamente, los fragmentos particulares de un polinucleótido zalfa31, pueden ser sintetizados usando la reacción en cadena de la polimerasa. Los métodos estándares para identificar los dominios funcionales son bien conocidos por aquellos de habilidades en la técnica. Por ejemplo, los estudios sobre la truncación en cualquiera o ambas terminales de las interferonas, han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507(1995). Además, las técnicas estándares para el análisis funcional de proteínas, se describen en, por ejemplo, Treuter et al . , Mol. Gen Genet. 240:113(1993), Content et al . , "Expression and Preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", en Biological Interferon Systems, Proceeding of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1978), Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation, 1 , Boynton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al . , J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Fukunaga et al . , J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al . , Biochem. Pharmacol. 5_0j_1295 (1995), y Meisel et al . , Plant Molec. Biol. 30:1(1996) . Las substituciones múltiples de aminoácidos pueden hacerse y someterse apruebas usando los métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer Science 241:53(1988) o Bowie y Sauer Proc. Na t ' l . Acad. Sci . EUA 86: 2152 (1989). Brevemente, estos autores describen los métodos para escoger aleatoriamente de manera simultánea, dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional, y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de substituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser usados, incluyen despliegue de fagos (por ejemplo, Lowman et al . , Biochem . 30:10832(1991), Ladner et al . , Patente Norteamericana No. 5,223,409, Huse, Publicación Internacional No. WO 92/06204, y la mutagénesis dirigida a ¿AL. la región o sitio Derbyshire et al . , Gene 46:145(1986), y Ner et al . , DNA 7:127, (1988). Las variantes de las secuencias de polipéptidos y ADN de Zalfa31 descritas, pueden ser generadas a través del mezclado del ADN como se describe por Stemmer, Na ture 370:389(1994), Stemmer Proc . Na ti Acad. Sci . EUA 91 : 10141 , y la Publicación Internacional No. WO 97/20078. Brevemente, los ADNs variantes se generan mediante recombinación de homólogos in vi tro, mediante fragmentación aleatoria de un ADN original, seguida por el reensamble usando PCR, resultando e mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente. Esta técnica puede ser modificada usando una familia de ADNs originales, tales como las variantes alélicas o ADNs de diferentes especies, para introducir una variabilidad adicional en el proceso. La selección o separación para la actividad deseada, seguida por las iteraciones adicionales de la mutagénesis y el ensayo, proporcionan la "evolución" rápida de las secuencias mediante la selección de las mutaciones deseables mientras que simultáneamente se seleccionan contra los cambios perjudiciales. Los métodos de mutagénesis como se describen aquí, pueden ser combinados con los métodos de selección automatizados de alto rendimiento, para detectar la actividad de los polipéptidos clonados mutagenizados en las células hospederas. Los ensayos preferidos en este sentido incluyen, ensayos de proliferación celular y ensayos de enlace al ligando a base de biosensores, los cuales se describen abajo. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican los polipéptidos activos, pueden ser recuperadas a partir de las células hospederas y secuenciadas rápidamente usando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos en un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructura desconocida. Además, las proteínas de la presente invención (o fragmentos polipéptidos de los mismos) , pueden unirse a otras moléculas bioactivas, particularmente otras citocinas, para proporcionar moléculas multi-funcionales . Por ejemplo, una o más hélices de zalfa31 pueden unirse a otras citocinas para incrementar sus propiedades biológicas o eficiencia de producción. La presente invención así proporciona una serie de nuevas moléculas híbridas, en las cuales un segmento que comprende una o más de las hélices de zalfa31 es fusionado a otro polipéptido. La fusión preferiblemente se hace por la división al nivel del ADN para permitir la expresión de las moléculas quiméricas en los sistemas de reproducción recombinantes. Las moléculas resultantes son entonces ensayadas por tales propiedades como solubilidad mejorada, estabilidad mejorada, media vida de desgaste prolongada, 5 expresión mejorada y niveles de secreción, y farmacodinámicos. Tales moléculas híbridas pueden además, comprender residuos de aminoácidos adicionales (pro ejemplo, un enlazador de polipéptido) , entre las proteínas o polipéptidos componentes. 10 Usando los métodos discutidos aquí, uno de habilidad ordinaria en la técnica, puede identificar y/o preparar una variedad de fragmentos de polipéptidos o variantes de las SEC ID NOS. 2, 4 o 6 o que retienen las propiedades de la proteína Zalfa31 de tipo silvestre. Para cualquier polipéptido Zalfa31, incluyendo variantes y proteínas de fusión, uno de habilidad ordinaria en la técnica puede fácilmente generar una secuencia de polinucleótido completamente degenerada, que codifica tal variante usando la información expuesta en las Tablas 2 y 3 anteriores. 20 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Los polipéptidos Zalfa31 de la presente invención, que incluyen los polipéptidos de longitud completa, los •^•^tfc^MrfMjten-llJl' ñ.at .» *.*¡M,,MÍ. JM. I fragmentos biológicamente activos y las proteínas de fusión, pueden ser producidos en células hospederas diseñadas genéticamente, de conformidad con las técnicas convencionales. Las células hospederas adecuadas, son aquellos tipos celulares que pueden ser transformados o transfectados con el ADN exógeno y que crece en cultivo, e incluye células bacterianas, fúngicas, y células eucarióticas superiores cultivadas. Las células eucarióticas, particularmente las células cultivadas de organismos multicelulares, son preferidas. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células hospederas se describen por Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2da. Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y Ausubel et al . , eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987). En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido Zalfa31 está operablemente ligada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, generalmente incluyendo un promotor y terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también comúnmente contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que con ciertos sistemas de marcadores seleccionables pueden ser proporcionados en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada por la integración en el 5 genoma en la célula hospedera. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos, es un tema de rutina designado dentro del nivel del experto en la técnica. Muchos elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido Zalfa31 en la trayectoria secretoria de una célula hospedera, una secuencia de señal secretoria (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) se proporcionan en el vector de expresión. La secuencia de la señal secretoria puede ser aquella del Zalfa31 o puede derivarse de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretoria está operablemente ligada a la secuencia ADN Zalfa31, es decir, las dos secuencias están unidas en la estructura lectora correcta y colocadas para dirigir el polipéptido nuevamente sintetizado en la trayectoria secretoria de la célula hospedera. Las secuencias de señal secretorias son comúnmente colocadas en el 5' a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal secretorias pueden ser colocadas de cualquier modo en la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch et al . , Patente Norteamericana No. 5,037,743; Holland et al . , Patente Estadounidense No. 5,143,830). Alternativamente, la secuencia de señal secretoria contenida en los polipéptidos de la presente invención se usa para dirigir otros polipéptidos en la trayectoria secretoria. La presente invención proporciona tales polipéptidos de fusión. Un polipéptido de fusión de señal puede elaborarse en donde una secuencia de señal secretoria que codifica un péptido de señal a partir de aminoácidos 1 (Met) hasta 19 (Asp) de la SEC ID NO: 2, está operablemente ligada a otro segmento de ADN que codifica un polipéptido usando métodos conocidos en la técnica y descritos aquí. La secuencia de señal secretoria contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención, está preferiblemente amino terminalmente fusionada a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional en la trayectoria secretoria. Tales constructos tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estos nuevos constructos de fusión de la secuencia de señal secretora pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada. Tales fusiones pueden ser usadas in vivo o in vi tro para dirigir los péptidos a través de la trayectoria secretoria. Las células de mamíferos cultivadas son hospederos adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir el ADN exógeno en las células hospederas de mamíferos incluyen transfección mediada por fosfato de calcio. Wigler et al . , Cell 14 : 125 , (1978); Corsaro y Pearson, Soma tic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52:456, (1973), electroporación, Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, (1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al . , ibid. , y transfección mediada por el liposoma Hawley-Nelson et al . , Focus 15 : 13 , (1993); Ciccarone et al . , Focus 15: 80 , (1993), y vectores virales Miller y Rosman, BioTechniques 7:980-90 (1989); Wang y Finer, Na ture Med. 2:714, (1996). Se describe la producción de los polipéptidos recombinantes en las células cultivadas de mamíferos, por ejemplo por Levinson et al . , Patente Estadounidense No. 4,713,339; Hagen et al . , Patente Estadounidense No. 4,784,950; Palmiter et al . , Patente Estadounidense No. 4,579,821; y Ringold, Patente Estadounidense No. 4,656,134. Las células cultivadas de r( , mamíferos adecuadas incluyen las líneas celulares de COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC NO. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al . , J. Gen . Virol . 36: 59-12 , (1977) y ovario de Hámster Chino (por ejemplo CHO-Kl; ATCC No. CCL 61) . Las líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en la técnica y están disponibles de depósitos públicos tal como la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Maryland. En general, se prefieren los promotores fuertes de la transcripción, tal como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de metalotioneina (Patentes Estadounidenses Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío principal del adenovirus. La selección del fármaco es usada de manera general para seleccionar células cultivadas de mamíferos en las cuales el ADN extraño ha sido insertado. Tales células son comúnmente referidas como "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en la presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés en su progenie son referidas como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia lli li i???l¡lülI i de la neomicina al antibiótico. La selección se lleva a cabo en la presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección pueden también ser usados para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo mediante la cultivación de los transfectantes en la presencia de un nivel bajo del agente selectivo y después incrementar la cantidad del agente selectivo seleccionado para las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificado preferido es la reductasa de dihidrofolato, la cual confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a los fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, acetiltransferasa de puromicina) pueden también ser usados. Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde, o proteínas de superficie celular tal como CD4, CD8, MHC Clase I, fosfatasa alcalina placental, pueden ser usados para distribuir células transfectadas de células no transfectadas por tales medios como FACS de distribución o tecnología de separación de cama magnética. Otras células eucarióticas superiores que pueden -is^? SAIMt también ser usadas como hospederas, incluyen células de plantas, células de insectos y células de aves. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un vector para expresar genes en las células de plantas ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11. : 47-58, 1987. La transformación de las células de insectos y la producción de los polipéptidos ajenos se describen por Guarino et al., Patente Estadounidense No. 5,162,222 y Publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insectos pueden ser infectadas con vectores de baculovirus recombinantes, los cuales son comúnmente derivados de virus de polihedrosis nuclear múl tiples de Autographa calif ornica (AcNPV) . Véase, King, L.A. y Posee, R. D. , The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D. R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual New York, Oxford University Press., 1994; y Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. El segundo método de preparación de baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones, descritos por Luckow (Luckow, V.A, et al . , J. Virol. 67:4566-79, 1993). Este sistema se vende en el equipo Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD) .

Este sistema utiliza un vector de trasferencia, pFastBacl TM (Life Technologies), que contiene un transposon Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido de Zalfa31 en un genoma de baculovirus mantenido en E. coli, como un plásmido grande llamado "bacmido". El vector de transferencia pFastBacl™ utiliza el promotor de polihedrina AcNPV para accionar la expresión del gen de interés, en este caso zalfa31. Sin embargo, el pFastBacl™ puede ser modificado a un grado considerable. El promotor de polihedrina puede removerse y substituirse con el promotor de proteína básica del baculovirus (también conocido como promotor Peor, p6.9 o MP) , el cual es expresado tempranamente en la infección del baculovirus, y se ha mostrado como ventajoso para expresar las proteínas secretadas. Véase Hill-Perkins, M.S. y Posee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J^ Gen. Virol 75:1551-6, 1994; y, Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. En tales constructos del vector de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Sin embargo, se pueden construir los vectores de transferencia, los cuales reemplazan las secuencias de señales secretorias zalfa31 nativas con las secuencias de señales secretorias derivadas de proteínas de insectos. Por ejemplo, una secuencia de señal secretoria de Glucosiltransferasa de Ecdisteroide (EGT) , ^ ** ? .+. ?,, Melitina de miel de abeja (Invitrogen, Carisbad, CA) , o baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) , puede ser usada en los constructos para reemplazar la secuencia de señal secretoria zalfa31 nativa. Además, los factores de trasferencia pueden incluir una fusión en estructura con el ADN que codifica un extremo del epítope en el C- o N-término del polipéptido de Zalfa31 expresado, por ejemplo, un extremo del epítope Glu-Glu (Grussenmeyer et al . , Proc. Nati Acad. Sci. EUA 82:7952-4 1985) . Usando una técnica conocida en el arte, un vector de trasferencia que contiene un gen Zalfa31, se trasforma en E. coli, y se selecciona por bacmidos, los cuales contienen un gen indicativo lacz interrumpido del baculovirus recombinante. El ADN del bacmido, que contiene el genoma del baculovirus recombinante, se aisla entonces, usando las técnicas comunes, y se usa para transfectar células de Spodoptera frugiperda , por ejemplo, células Sf9. Los virus recombinantes que expresan zalfa31 son producidos de manera subsecuente. Los depósitos virales recombinantes se elaboran por métodos comúnmente usados en la técnica. El virus recombinante resultante se usa para infectar células hospederas, típicamente una línea celular derivada del gusano soldado, Spodoptera frugiperda . Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant ADN, ASM Pres, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular alta FiveO™ (Invitrogen) , derivada de Trichoplusia ni (Patente Estadounidense No. 5,300,435). El medio libre de suero comercialmente disponible, se usa para crecer y mantener las células. El medio estable es Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cell0405™ (JRH Biosciences, Lexena, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células T. ni . Las células se hacen crecer hasta una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células hasta una densidad de 1-2 x 106 células al tiempo del cuál, un depósito viral recombinante se agrega a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 hasta 10, más típicamente, cercana a 3. Los procedimientos usados se describen de manera general en manuales de laboratorio disponibles (King, L. A. y Possee, R. D., ibid. , O'Reilly, D. R. et al., ibid. ; Richardson, C.D. ibid. ) . La purificación subsecuente del polipéptido de Zalfa31 a partir del sobrenadante, se puede alcanzar usando métodos descritos aquí. Las células fúngicas, incluyendo células de levaduras, pueden ser usadas dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés particular en este sentido, incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris , y Pichia methanolica . Los métodos para la transformación de las células S . cerevisiae con ADN exógeno y que producen polipéptidos recombinantes a partir de estos, se describen 5 mediante, por ejemplo, Kawasaki, Patente Estadounidense No. 4,599,311; Kawasaki et al . , Patente Estadounidense No. 4,931,373; Brake, Patente Estadounidense No. 4,870,008; Welch et al . , Patente Estadounidense No. 5,037,743; y Murray et al . , Patente Estadounidense No. 4,845,075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente de resistencia al fármaco o por la habilidad para crecer en la ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vector preferido para usarse en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POTl descrito por Kawasaki et al . , (Patente Estadounidense No. 4,931,373), el cual permite a las células transformadas ser seleccionadas por el crecimiento en el medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usarse en la levadura incluyen aquellos a partir de las enzimas glicolíticas (véase por ejemplo, Kawasaki, Patente Norteamericana No., 4,599,311; Kingsman et al . , Patente Estadounidense No. 4,615,974; y Bitter, Patente Estadounidense No. 4,977,092) y genes de deshidrogenasa del gJ--*^-J8 alcohol. Véase también Patentes Estadounidenses Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras incluyen Hansenula polymorpha , Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago mayáis, Pichia pastoris, Pichia methanolica , Pichia guíllermondii y Candida maltosa , son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen . Microbiol . 132: 3459-65 , 1986 y Cregg, Patente Estadounidense No. 4,882,279. Las células Aspergillus pueden ser utilizadas de conformidad con los métodos de McKnight et al . , Patente Estadounidense No. 4,935,349. Se describen los métodos para la transformación de Acremonium chrysogenum por Su ino et al . , Patente Estadounidense No. 5,162,228. Los métodos para la transformación de Neurospora se describen por Lambowitz, Patente Estadounidense No. 4,486,533. El uso de la Pichia methanolica como hospederos para la producción de las proteínas recombinantes se describe en las Publicaciones WIPO WO 97/17450 y W097/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para usarse en la transformación de P. methanolica serán comúnmente preparadas como plásmidos circulares de doble hebra, los cuales son preferiblemente linealizados antes de la transformación. Para la producción del polipéptido en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sea aquel de un gen P. methanolica , tal como un gen de utilización de alcohol P. methanolica (AUG1 o AUG2) . Otros promotores empleados incluyen aquellos de la sintasa de dihidroxiacetona (DHAS), deshidrogenasa de formiato (FMD), y genes catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospedero, se prefiere tener el segmento de expresión total del plásmido flanqueado en ambos extremos por las secuencias del ADN hospederas. Un marcador seleccionable preferido para usarse en Pichia methanolica es el gen P. methanolica ADE2 , el cual codifica al de fosforibosil-5-aminoimidazolcarboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), los cuales permiten a las células hospederas ade2, crecer en la ausencia de adenina. Para gran escala, los procesos industriales en donde es deseable minimizar el uso de metanol, prefieren usar células hospederas en las cuales ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2) son suprimidos. Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren las células hospederas deficientes en los genes proteasa vacuolar ( PEP4 y PRB1) . La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene un ADN que codifica a un polipéptido de interés en las células P. methanolica . Se prefiere transformar las células P. . . c . ^a Ataa ** methanolica mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsado, exponencialmente descompuesto, que tiene un campo de extensión de 2.5 a 4.5 kV/cm, preferiblemente, de aproximadamente 3.75 kV/cm, y un tiempo constante (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferiblemente de aproximadamente 20 milisegundos . Las células hospederas procarióticas, incluyendo hebras de la bacteria Escherichia coli , Bacillus y otros géneros son también empleadas como células hospederas dentro de la presente invención. Las técnicas para la transformación de estos hospederos y que expresan las secuencias de ADN extrañas, clonadas aquí, son bien conocidas en la técnica véase por ejemplo, Sambrook et al . , ibid. Cuando se expresa un polipéptido Zalfa31 en la bacteria tal como E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso formador, las células son lisadas, y los granulos son recuperados y desnaturalizados usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede entonces ser replegado y dimerizado diluyendo el desnaturalizante, tal como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguida por diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido puede ser recuperado del espacio periplasmático en una forma soluble y funcional por el rompimiento de las célula (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) , para liberar los contenidos del espacio periplasmático y recuperar la proteína, con ello se obvia la necesidad de la desnaturalización y repliegue. Las células hospederas transformadas o transfectadas son cultivadas de conformidad con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento y la selección de las células hospederas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo el medio definido y el medio complejo, se conocen en la técnica y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. El medio puede también contener tales componentes como los factores del crecimiento o el suero, como se requiera. El medio de crecimiento generalmente se seleccionará para células que contienen el ADN exógenamente agregado por ejemplo, la selección o deficiencia del fármaco, en un nutriente esencial el cual es complementado por el marcador seleccionable llevado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula hospedera. Las células P. methanolica son cultivadas en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y rastros de nutrientes a una temperatura de aproximadamente 25°C hasta 35°C. Los cultivos líquidos se proporcionan con suficiente aireación por medios convencionales, tal como sacudimiento de frascos pequeños o rocío de fermentadores . Un medio de cultivo preferido para P. methanolica es YEPD (D-glucosa al 2%, Peptone Bacto™ al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto™ al 1% (Difco Laboratories), 0.004% de adenina y L-leucina al 0.006%) . Otra modalidad de la presente invención se proporciona para un péptido o polipéptido que comprende una porción que porta el epítope de un polipéptido Zalfa31 de la invención. El epítope de esta porción de polipéptido es un epítope inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la invención. Una región de una proteína a la cual un anticuerpo se puede enlazar está definida como un "epítope antigénico". Véase por ejemplo, Geysen, H.M. et al . , Proc . Na ti . Acad Sci . USA 81:3998-4002 (1984). Para la selección de péptidos o polipéptidos que portan un epítope antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula de proteína a la cual un anticuerpo puede enlazarse) , es bien conocido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia de proteína, son rutinariamente capaces de estimular un antisuero que reacciona con la 5 proteína parcialmente imitada. Véase Sutcliffe, J.G. et al . , Science 219:660-666 (1983) . Los péptidos capaces de estimular el suero reactivo a la proteína son representados frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, pueden ser caracterizados por una serie de simples reglas químicas, y ni aún son confinados a las regiones inmunodominantes de las proteínas intactas (es decir, epítopes inmunogénicos) , ni a las terminales amino o carboxilo. Los péptidos que son extremadamente hidrofóbicos y aquellos de seis o unos cuantos residuos, generalmente son infectivos en la inducción de anticuerpos que se enlazan a la proteína imitada; péptidos solubles más largos, especialmente aquellos que contienen residuos de prolina, usualmente son efectivos. Los péptidos que portan epítopes antigénicos y los polipéptidos de la invención, son por lo tanto, empleados para originar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se enlazan específicamente a un polipéptido de la invención. Los péptidos que portan epítopes antigénicos ^¡j||gi^ y polipéptidos de la presente invención, contienen una secuencia de al menos nueve, preferiblemente entre 15 hasta aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácido de un polipéptido de la invención. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más larga de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen desde 30 hasta 50 aminoácidos, o cualquier longitud por arriba, e incluyendo la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de la invención, también son útiles para inducir los anticuerpos que reaccionan con la proteína. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del péptido que porta el epítope es seleccionada para proporcionar solubilidad substancial en solventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos, y se evitan preferiblemente los residuos hidrofóbicos) ; y las secuencias que contienen residuos de prolina son particularmente preferidas. Todos los polipéptidos mostrados en el listado de secuencia contienen epítopes antigénicos como se usa de conformidad con la presente invención, sin embargo, los epítopes antigénicos específicamente diseñados incluyen los péptidos predichos, por ejemplo, un manchado Jameson-Wolf comprende: (1) residuos de aminoácidos 11 (Thr) hasta 20 (Asp) de la SEC ID NO: 2; (2) residuos de aminoácidos 60 (Ser) hasta 64 (Lys) de la SEC ID No.2; (3) residuos de aminoácidos 88 (Ser) hasta 96 (Gln) de la SEC ID No.2; (4) residuos de aminoácidos 127 (Ala) hasta 135 (Lys) de la SEC ID No.2; y (5) residuos de aminoácidos 127 (Ala) hasta 139 (Leu) de la SEC ID No.2. La presente invención también proporciona fragmentos de polipéptidos o polipéptidos que comprenden una porción que porta un epítope de un polipéptido Zalfa31 descrito aquí. Tales fragmentos o polipéptidos pueden comprender un "epítope inmunogénico", el cual es una parte de una proteína que estimula una respuesta anticuerpo cuando la proteína completa es usada como un inmunógeno. Los péptidos que portan al epítope inmunogénico, pueden ser identificados usando los métodos estándares (ver, por ejemplo, Geysen et al . , supra . Véase también, Patente Estadounidense No. 4,708,781 (1987), además describe como identificar un péptido que porta un epítope inmunogénico de una proteína deseada.

AISLAMIENTO DE LA PROTEINA Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a >80% de pureza, más preferiblemente a > 90% de pureza, aún más preferiblemente >95% de pureza, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es mayor de 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Los polipéptidos Zalfa31 recombinantes expresados (o polipéptidos Zalfa31 quiméricos o de fusión) pueden ser purificados usando métodos y medios de fraccionación y/o purificación convencional. La precipitación de sulfato de amonio y ácido o extracción de caotropos pueden ser usadas para el fraccionamiento de muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. El medio cromatográfico adecuado incluye dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad y similares. Son preferidos los derivados PEÍ, DEAE, QAE y Q. El medio cromatográfico ejemplar incluye aquellos medios derivatizados con los grupos fenilo, butilo u octilo, tal como Fenil-Sefarosa FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octil-Sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tal como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen camas vitreas, resinas a base de sílice, resinas celulósicas, camas de agarosa, camas de agarosa reticuladas, camas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y las similares que son insolubles bajo condiciones en las cuales son usadas. Estos soportes pueden ser modificados con grupos reactivos que permiten la unión de las proteínas por los grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones de carbohidratos. Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epóxidos, activación de sulfh.idrilo, activación de hidrazida, y derivados amino y carboxilo para las químicas de acoplamiento de carbodiimidas. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente usados en la técnica y son disponibles de los proveedores comerciales. Los métodos para enlazar los polipéptidos del receptor al medio de soporte son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es un tema de diseño de rutina y se determina en parte por las propiedades del soporte seleccionado. Véase por ejemplo, Affini ty Chroma tography: Principies & Methods, ( harmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden 1988). Los polipéptidos de la presente invención pueden ser aislados por explotación de sus propiedades estructurales y biológicas. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de ion metálico inmovilizado (IMAC) , puede ser usada para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden etiquetas de polihistidina. Brevemente, un gel es cargado primero con iones de metal divalente para formar un quelato Sulkowski, Trends in Biochem . 3: 1-1 , (1985). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán por esta matriz con afinidades que difieren, dependiendo del ion metálico usado, y serán eluidas por elución competitiva, disminuyendo el pH o usando agentes de quelación fuertes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas por cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio de iones. Methods in Enzymol . , Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), página 529-539 (Acad. Press, San Diego, 1990) . Dentro de las modalidades adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y un etiqueta de afinidad (por ejemplo la proteína de enlace a la maltosa, un dominio de inmunoglobulina) pueden ser construidos para facilitar la purificación. Sin embargo, usando los métodos descritos en la técnica, se construyen las fusiones de polipéptidos o proteínas Zalfa31 híbridas, usando regiones o dominios de la Zalfa31 inventiva, Sambrook et al . , ibid. , Altschul et al . , ibid. , Picard, Cur. Opin . Biology, 5:511 (1994). Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de dominios o regiones grandes en un polipéptido de interés. Tales híbridos pueden alterar los cinéticos de reacción, enlaces, contraer o expandir la especificidad del substrato, o alterar el tejido y la localización celular de un polipéptido, y pueden aplicarse a los polipéptidos de estructura desconocida. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica por la preparación de cada componente de la proteína de fusión y químicamente conjugándolos. Alternativamente, un polinucleótido que codifica a ambos componentes de la proteína de fusión en la estructura lectora apropiada, puede ser generado usando técnicas conocidas y expresado por los métodos descritos aquí. Por ejemplo, parte o todos los dominios que confieren una función biológica, se pueden escalonar entre Zalfa31 de la presente invención con el dominio o dominios funcionalmente equivalentes de otros miembros de la familia, por ejemplo, IL-2, IL-4, GM-CSF, u otros elementos de la familia de citocinas de cuatro hélices atadas. Tales dominios incluyen, pero no están limitados a, la secuencia de señal secretoria, hélices A hasta D, conservada y dominios o regiones significantes en esta familia. Tales proteínas de fusión podría esperarse tengan un perfil funcional biológico que es el mismo o similar a los polipéptidos de la presente invención u otra familia conocida de proteínas, dependiendo de la fusión construida. Sin embargo, tales proteínas de fusión pueden presentar otras propiedades como se describe aquí. Usando los métodos discutidos aquí, uno de habilidad ordinaria en la técnica, puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que tienen identidad de secuencia substancialmente similar a los residuos 1-142 o 20-142 de la SEC ID NO: 2, o fragmentos funcionales y fusiones del mismo, en donde dichos polipéptidos o fragmentos o fusiones, retienen las propiedades de la proteína de tipo nativa, tal como la habilidad para estimular la proliferación, diferenciación, inducir la función celular especializada o enlazarse a una célula o receptor zalfa31 o anticuerpos anti-zalfa31. Las técnicas de clonación y biológicas moleculares estándares, pueden ser usadas para intercambiar los dominios equivalentes entre el polipéptido zalfa31 y aquellos polipéptidos a los cuales están fusionados. De manera general, un segmento de ADN que codifica un dominio de interés, por ejemplo, una hélice A hasta D de zalfa31, o porción descrita aquí, está operablemente ligada en estructura al menos a otro segmento de ADN que codifica un polipéptido adicional y se inserta en un vector de expresión apropiado como se describe aquí. De manera general, los constructos de ADN son elaborados de manera tal que los varios segmentos de ADN que codifican las regiones correspondientes de un polipéptido, están operablemente ligadas en estructura para hacer un único constructo que codifica la proteína de fusión completa, o una porción funcional de la misma. Por ejemplo, un constructo de ADN podrá codificar del N-término al C-término, a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de señal, seguido por un polipéptido maduro; o un constructo de ADN podrá codificar del N-término al C-termino, a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de señal, seguido por la Hélice A, seguido por la Hélice B, seguido por la Hélice C, seguido por la Hélice D, o como intercambiada con las regiones equivalentes a partir de otra proteína. Tales proteínas de fusión pueden ser expresadas, aisladas y ensayadas por su actividad como se describe aquí. Los polipéptidos Zalfa31 o fragmentos del mismo, i sa¡i^s*^ «?í?&í? pueden ser preparados a través de síntesis química. Los polipéptidos Zalfa31 pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo aminoácido de metionina inicial. Los polipéptidos de la presente invención, pueden también ser sintetizados por síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensación de fragmento o síntesis de solución clásica. Los métodos para sintetizar polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 1963; Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970. Después de la síntesis completa del péptido deseado en un soporte sólido, la resina del péptido es con un reactivo el cual desdobla el polipéptido a partir de la resina y remueve la mayoría de los grupos protectores de cadenas laterales. Tales métodos están bien establecidos en la técnica. La actividad de las moléculas de la presente invención puede ser medida usando una variedad de ensayos que miden por ejemplo, la transducción de la señal, el enlace Ig, o modulación cAMP. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica. Para una referencia general, véase Nihei, Y., et al., supra; y Rindisbacher, L., et al . , supra.

ENSAYOS La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir usando una variedad de ensayos. De particular interés son los cambios en esteroidogénesis, espermatogénesis, en los testículos, producción de LH y FSH y GnRH en el hipotálamo. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica. Las proteínas de la presente invención son empleadas por ejemplo, en el aumento de la producción de esperma, tratamiento de la tiroides, las alteraciones adrenales, linfoides, inflamatorias, pancreáticas, sanguíneas u óseas, se pueden medir in vi tro usando células cultivadas o in vivo, mediante la administración de moléculas de la presente invención al modelo animal apropiado. Por ejemplo, las células hospederas que expresan una forma secretada del polipéptido Zalfa31, se pueden embeber en un ambiente de alginato e inyectar (implantadas) en recipientes animales. La microencapsulación alginato-poli-L-lisina, la encapsulación de la membrana permeselectiva y las cámaras de difusión, son un medio para atrapar células de mamíferos transfectadas o células de mamíferos principales. Estos tipos de "encapsulaciones" no inmunogénicas, permiten la difusión de proteínas y otras macromoléculas secretadas o liberadas por las células capturadas al recipiente ambiental. De manera más importante, las cápsulas enmascaran y protegen a las células embebidas, ajenas, de la respuesta inmune del recipiente animal. Tales encapsulaciones pueden ampliar la vida de las células inyectadas desde unas cuantas horas o días (células no protegidas) hasta varias semanas (células embebidas) . Los filamentos de alginato proporcionan un medio simple y rápido para la generación de células embebidas. Los materiales necesarios para generar los filamentos de alginatos se conocen en la técnica. En el procedimiento ejemplar, se prepara 3% de alginato en H20 estéril, y se filtra estéril. Justo antes de la preparación de filamentos de alginato, la solución de alginato es nuevamente filtrada. Una suspensión celular de aproximadamente 50% (que contiene aproximadamente 5 x 105 hasta aproximadamente 5 x 107 células/ml), se mezcla con la solución de alginato al 3%. Un ml de la suspensión de alginato/célula se somete a extrusión en 100 mM de solución de CaCl2 filtrada estéril, durante un periodo de tiempo de ~15 min, formando un "filamento". El filamento sometido a extrusión es entonces transferido en una solución de 50 mM de CaCl2, y después en una solución de 25 mM de CaCl2. El filamento es entonces enjuagado con agua desionizada antes de revestir la hebra incubándola en una solución de 0.01% de poli-L-lisina. Finalmente, el filamento es enjuagado con Solución de Ringer Lactada, y se retira de la solución en un barril de jeringa (sin aguja) . Una aguja perforada grande es 5 entonces unida a la jeringa, y el filamento es inyectado intraperitonealmente en un recipiente en un volumen mínimo de la Solución Ringer Lactada. Un procedimiento in vivo alternativo para ensayar las proteínas de la presente invención involucra los sistemas de suministro viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen, adenovirus, virus del herpes, virus vaccinia y virus adeno-asociados (AAV) . El adenovirus, un virus de ADN de doble hebra, es actualmente el vector de transferencia de gen mejor estudiado para el suministro del ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véase T.C. Becker et al . , Meth. Cell. Biol. 43: 161-89, 1994; y J. T Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997) . El sistema de adenovirus ofrece varias desventajas: (i) el adenovirus puede acomodar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) puede hacerce crecer a tituladores altos; (iii) infectar un rango amplio de tipos de células de mamíferos; y (iv) puede ser usados con muchos promotores diferentes incluyendo promotores ubicuitos, específicos del tejido y regulables. <JMB*.IJ"-También debido a que los adenovirus son estables en la corriente sanguínea, pueden ser administrados por inyección intravenosa. Usando vectores de adenovirus en donde las porciones del genoma de adenovirus son suprimidas, los insertos se incorporan en el ADN viral por ligación directa o por recombinación homologa con un plásmido co-transfectado. En un sistema ejemplar, el gen El esencial se ha suprimido del vector viral, y el virus no se replicará a menos que el gen El se proporcione por la célula hospedera (la línea celular 293 humana es ejemplar) . Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus se dirige principalmente al hígado. Si el sistema de suministro adenoviral tiene una supresión del gen El, el virus no se puede replicar en las células hospederas. Sin embargo, el tejido del hospedero (por ejemplo hígado), expresará y procesará (y si está presente una secuencia de señal secretoria, secretará) a la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en circulación en el hígado altamente vascularizado, y se podrán determinar los efectos en el animal infectado. Sin embargo, los vectores adenovirales que contienen varias supresiones de los genes virales, pueden ser usados en un intento por reducir las respuestas inmunes en el vector. Tales adenovirus son El suprimidos, y además, contienen supresiones de E2A o E4 (Lusky, M. et al., J. Virol. 72:2022-2032, 1998; Raper S.E. et al., Human Gene Therapy 9:671-679, 1998). Además, la supresión de E2b es reportada por reducir las respuestas inmunes (Amalfitano, A. et al., J. Virol. 72:926-933, 1998). Sin embargo, suprimiendo el genoma de adenovirus completo, muchos insertos largos del ADN heterólogo se pueden acomodar. La generación de adenovirus así llamados "pusilánimes" en donde todos los genes virales son suprimidos, son particularmente ventajosos por la inserción de insertos largos de ADN heterólogos. Para revisión, véase Yeh, P. y Perricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997. El sistema de adenovirus puede también ser usado para la producción de ,1a proteína in vi tro. Mediante el cultivo de los adenovirus infectados no en las células 293 bajo condiciones en donde las células no se están rápidamente dividiendo, las células pueden producir proteínas por periodos prolongados de tiempo. Por ejemplo, las células HBK se hacen crecer a confluencia en los factores celulares, luego se exponen al vector adenoviral que codifica a la proteína secretada de interés. Las células se hacen crecer entonces bajo condiciones de suero libre, lo cual permite a las células infectadas sobrevivir por varias semanas sin la división celular significante. Alternativamente, las células 293D infectadas con el vector de adenovirus, pueden hacerse crecer como células adherentes o en una suspensión de cultivo a una densidad celular relativamente alta para producir cantidades significantes de proteína (véase Garnier et al . , Cytotechnol. 15: 145-55, 1994) . Con cualquier protocolo, una proteína heteróloga secretada, expresada, puede ser aislada repetidamente del sobrenadante de cultivo celular, lisado o fracciones de membrana, dependiendo de la disposición de la proteína expresada en la célula. Dentro del protocolo de producción de las células 293S infectadas, las proteínas no secretadas se pueden también obtener efectivamente. La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir usando una variedad de ensayos que miden la proliferación y/o enlace a las células. De particular interés son los cambios en las células dependientes de zalfa31. Las líneas celulares adecuadas para ser diseñadas como dependientes de zalfa31, incluyen la línea celular BaF3 dependiente de IL-3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6 _ 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), y M07e (Kiss et al., Leukemia 7:235-240, 1993). Sin embargo, otras líneas celulares dependientes del factor de crecimiento, tales como FDC-1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), y M07e (Kiss et al., Leukemia 7:235-240, 1993) son adecuadas para este propósito. Las líneas celulares dependientes del factor de crecimiento pueden ser establecidas de conformidad con los métodos publicados (por ejemplo, Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., en Baum et al., Eds., Experimental Hematology Today, 8th. Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980) . Las proteínas de la presente invención son empleadas para estimular la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción o inhibición de la función de células especializadas de las células involucradas en la homeostasis de la hematopoyesis y la función inmune. En particular, los polipéptidos zalfa31 son empleados para estimular la proliferación, activación, diferenciación, inducción o inhibición de las funciones celulares especializadas de las células de los linajes hematopoyéticos, incluyendo pero no limitando a, células T, células B, células NK, células dendríticas, monocitos, y macrófagos, así como también células epiteliales. La proliferación y/o •s & -i diferenciación de las células hematopoyéticas se puede medir in vi tro usando células cultivadas, o in vivo, administrando moléculas de la presente invención al modelo animal apropiado. Los ensayos que miden la proliferación o diferenciación celular, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos que miden la proliferación incluyen tales ensayos como quimiosensibilidad al tinte rojo neutral (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, incorporado aquí por referencia) , incorporación de nucleótidos radioetiquetados (Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989, incorporado aquí por referencia), incorporación de 5-bromo-2' -desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, incorporado aquí por referencia), y uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cáncer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cáncer Res 48:4827-4833, 1998; todos incorporados aquí para referencia) . Los ensayos que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, medición de los marcadores de la superficie celular, asociados con la expresión de la etapa específica de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv.

Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todos incorporados aquí por referencia) . Como un ligando, la actividad de un polipéptido de Zalfa31 puede ser medida por un microfisiómetro biosensor a base de sílice, el cual mide la velocidad de acidificación celular o la excreción de protones asociada con el enlace del receptor y las respuestas fisiológicas celulares subsecuentes. Un dispositivo ejemplar, es el Cytosensor™ Microphysiometer, fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Una variedad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el trasporte de iones, la producción de energía, la respuesta inflamatoria, la activación del receptor y regulatoria, y las similares, pueden ser medidas por este método. Véase por ejemplo, McConnell et al., Science 257:1906-1912, 1992;, Pitchford, S. et al., Meth Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998. El microfisiómetro puede ser usado para ensayar células eucarióticas o procarióticas, adherentes o no adherentes. Midiendo los cambios en la acidificación extracelular en el medio celular, con el tiempo, el microfisiómetro mide directamente las respuestas celulares a varios estímulos, incluyendo el polipéptido Zalfa31, sus agonistas o antagonistas. Preferiblemente, el microfisiómetro se usa para medir las respuestas de las células eucarióticas responsivas de Zalfa31, comparadas con células eucarióticas de control que no responden al polipéptido Zalfa31. Las células eucarióticas responsivas a ZALFA31, comprenden células en las cuales un receptor para zalfa31 se ha transfectado, creando una célula que es responsiva a zalfa31; o células responsivas naturalmente a zalfa31 tal como células derivadas del intestino delgado, PBLs, o tejido de la médula ósea. Las diferencias medidas por un cambio por ejemplo, un incremento o disminución en la acidificación extracelular, en respuesta de las células expuestas al polipéptido zalfa31, con relación a un control no expuesto a zalfa31, son mediciones directas de las respuestas celulares moduladas por zalfa31. Sin embargo, tales respuestas moduladas por zalfa31 pueden ser ensayadas bajo una variedad de estímulos. Usando el microfisiómetro, se proporciona un método de identificación de agonistas del polipéptido zalfa31, que comprende proporcionar células responsivas a un polipéptido zalfa31, cultivando una primera porción de las células en la ausencia de un compuesto de prueba, cultivando una segunda porción de las células en la presencia de un compuesto de prueba, y detectando un cambio, por ejemplo, un incremento o disminución, en una respuesta celular de la segunda porción de las células, comparadas con la primera porción de las células. El cambio en la respuesta celular se muestra como un cambio medible de velocidad de acidificación extracelular. Sin embargo, cultivando una tercera porción de las células en la presencia del polipéptido zalfa31 y la ausencia de un compuesto de prueba, se pueden usar como un control positivo para las células responsivas de zalfa31, y como un control para comparar la actividad agonista de un compuesto de prueba con aquélla del polipéptido zalfa31. Sin embargo, usando el microfisiómetro, se proporciona un método para identificar antagonistas del polipéptido zalfa31, que comprende proporcionar células responsivas a un polipéptido zalfa31, cultivar una primera porción de las células en la presencia de zalfa31 y en la ausencia de un compuesto prueba, cultivar una segunda porción de las células en la presencia de zalfa31 y la presencia de un compuesto prueba, y detectar un cambio por ejemplo, un incremento o disminución en una respuesta celular de la segunda porción de las células, comparadas con la primera porción de las células. El cambio en la respuesta celular se muestra como un cambio medible de la velocidad de acidificación extracelular. Los antagonistas y agonistas para el polipéptido zalfa31, pueden ser rápidamente identificados usando este método. Sin embargo, el zalfa31 puede ser usado para identificar células, tejidos o líneas celulares, las cuales responden a la trayectoria estimulada por zalfa31. El microfisiómetro, descrito anteriormente, puede ser usado para identificar rápidamente células responsivas del ligando, tales como células responsivas a zalfa31 de la presente invención. Las células pueden ser cultivadas en la presencia o ausencia del polipéptido zalfa31. Aquéllas células las cuales estimulan un cambio medible en la acidificación extracelular en la presencia de zalfa31 son responsivas a zalfa31. Tales líneas celulares, pueden ser usadas para identificar antagonistas y agonistas del polipéptido zalfa31 como se describe anteriormente. Los antagonistas son empleados también como reactivos de búsqueda para la caracterización de sitios de interacción del ligando-receptor. También como un tratamiento para el cáncer de próstata. Los inhibidores de la actividad Zalfa31 (antagonistas Zalfa31) incluyen anticuerpos anti-Zalfa31 y receptores de Zalfa31 solubles, así como también otros agentes peptídicos y no peptídicos (incluyendo ribozimas) .

El Zalfa31 puede también ser usado para identificar inhibidores (antagonistas) de su actividad. Se agregan los compuestos de prueba a los ensayos descritos aquí para identificar compuestos que inhiben la actividad de Zalfa31. Además de estos ensayos descritos aquí, se pueden someter a prueba muestras para la inhibición de la actividad de Zalfa31 dentro de una variedad de ensayos designados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de Zalfa31. Por ejemplo, las líneas celulares responsables de Zalfa31 pueden ser transfectadas con un constructo de gen reportero que es responsable de una trayectoria celular estimulada por Zalfa31. Los constructos del gen reportero de este tipo se conocen en la técnica, y comprenderán de manera general, un elemento de respuesta de ADN-Zalfa31 operablemente ligado a un gen que codifica a una proteína la cual puede ser ensayada, tal como luciferasa. Los elementos de respuesta de ADN pueden incluir, pero no estar limitados a, elementos de respuesta al AMP cíclicos (CRE) , elementos de respuesta a la hormona (HRE) , elementos de respuesta a la insulina (IRE), Nasrin et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87 : 5273 (1990) y elementos de respuesta al suero (SRE) (Shaw et al. Cell 56: 563 (1989) . Los elementos de respuesta AMP cíclicos se revisan en Roestler et al . , J. Biol . Chem . 263 (19):9063 (1988) y Habener, Molec. Endocrinol . 4 (8):1087 (1990). Los elementos de respuesta a la hormona se revisan en Beato, Cell 56: 35 (1989). Los compuestos candidatos, soluciones, mezclas o extractos, son sometidos a prueba por su capacidad para inhibir la actividad de Zalfa31 en las células objetivo como se evidencia por un decremento en la estimulación de Zalfa31 de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectarán compuestos que bloquean directamente el enlace Zalfa31 a los receptores de la superficie celular, así como también a los compuestos que bloquean los procesos en la trayectoria celular subsecuente al enlace receptor-ligando. En una alternativa, los compuestos u otras muestras pueden ser sometidos a prueba por su bloqueo directo del enlace de Zalfa31 al receptor usando marcadores de Zalfa31 con una etiqueta detectable (por ejemplo, 125I, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC, y similares). Dentro de los ensayos de este tipo, la habilidad de una muestra de prueba para inhibir el enlace del Zalfa31 etiquetado al receptor, es indicativa de la actividad inhibitoria, la cual puede ser confirmada a través de los ensayos secundarios. Los receptores usados dentro de los ensayos de enlace pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados, aislados.

Un polipéptido Zalfa31 puede ser expresado como una fusión con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc, el cual contiene dos dominios de región constante y carece de la región variable. Los métodos para preparar tales fusiones se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,155,027 y 5,567,587. Tales fusiones son típicamente secretadas como moléculas multiméricas en donde las porciones Fc son disulfuros enlazados entre sí y dos polipéptidos no Ig están colocados en proximidad cercana entre sí. Las fusiones de este tipo se pueden usar para purificar la afinidad del ligando. Para uso en ensayos, las quimeras se enlazan a un soporte vía la región Fc y se usan en un formato de ELISA. Un polipéptido que se enlaza al ligando Zalfa31 puede también ser usado para la purificación del ligando. El polipéptido se inmoviliza en un soporte sólido, tal como perlillas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas a base de sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para enlazar polipéptidos a los soportes sólidos se conocen en la técnica, e incluyen química de amina, activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación de sulfhidrilo, y activación de hidrazida. El medio resultante generalmente se configurará en la forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasarán a través de la columna una o más veces para permitir al ligando, enlazarse al polipéptido receptor. El ligando es entonces eluido usando cambios en la concentración de sal, agentes caotrópicos (HCl de guanidina) , o pH para romper el enlace ligando-receptor. Un sistema de ensayo que usa un receptor de enlace al ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de enlace del mismo, y un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) , pueden ser ventajosamente empleados. Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anti-complemento o fragmento, se inmoviliza en la superficie de un chip receptor. El uso de estos instrumentos se describe por Karlsson, J. Immunol . Methods 145 : 229 (1991) y Cunningham y Wells, J. Mol . Biol . 234 : 554 (1993). Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento, está covalentemente unido, usando química de amina o sulfhidrilo, a las fibras de dextrano que están unidas a películas doradas dentro del flujo celular. Se pasa a través de la célula, una muestra de prueba. Si un ligando, epítope o miembro opuesto del par complemento/anti-complemento está presente en la muestra, se enlazará al receptor inmovilizado, anticuerpo o miembro, respectivamente, causando un cambio en el índice refractivo del medio, el cual se detecta como un cambio en la resonancia del plasmon de la superficie de la película dorada. Este sistema permite la determinación de proporciones sobre de y fuera de la cual la afinidad de enlace de puede calcular, y la valoración de la estequiometría del enlace. Los polipéptidos del receptor de enlace-ligando se pueden usar también dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen análisis Scatchard para la determinación de la afinidad de enlace, Scatchard Ann . NY Acad. Sci . 51 : 660 (1949) y ensayos calorimétricos, Cunningham et al . , Science 253 : 545 (1991); Cunningham et al., Sience 245 : 821 (1991). Los polipéptidos Zalfa31 pueden también ser usados para preparar anticuerpos que se enlazan específicamente a los epítopes Zalfa31, péptidos o polipéptidos. El polipéptido Zalfa31 o un fragmento del mismo, sirven como un antígeno (inmunógeno) para inocular un animal y estimular una respuesta inmune. Uno de habilidades en la técnica reconocerá que los polipétidos que portan epítopes antigénicos, contienen una secuencia de al menos 6, preferiblemente al menos 9, y más preferiblemente al menos 15 hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido zalfa31 (por ejemplo, SEC ID No.2). Los 5 polipéptidos que comprenden una porción más larga de un polipéptido zalfa31, es decir, desde 30 a 10 residuos hasta la longitud completa de la secuencia de aminoácidos, están incluidos. Los epítopes inmunogénicos o antígenos, pueden también incluir marcadores unidos, adyuvantes y portadores, como se describe aquí. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido zalfa31 maduro codificado por la SEC ID No.2 a partir del aminoácido número 1 (Met) hasta 142 (Arg) de la SEC ID No.2, o un fragmento de aminoácidos 9 a 122 contiguos, del mismo. Otros antígenos adecuados incluyen dominios alfa helicoidales, dominios extracelulares, porciones, regiones, epítopes, etc., como se describe aquí. Los péptidos preferidos para usarse como antígeno son péptidos hidrofílicos, tales como aquellos predichos por uno de habilidades en la técnica a partir de un manchado de hidrofobicidad. Los péptidos hidrofílicos de zalfa31 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de: aquellos epítopes antigénicos de 6 aminoácidos predichos, determinados de un ***"-perfil de hidrofilicidad de Hopp/Woods, basado en una ventana de seis residuos deslizantes, con residuos G, S y T enmascarados y los residuos H, Y y W expuestos, ignorados. Por ejemplo, en las regiones hidrofílicas zalfa31 adecuadas, incluyen: (1) residuos de aminoácidos 14 (Asp) hasta 19 (Asp) de la SEC ID NO: 2, (2) residuos de aminoácidos 26 (Ala) hasta 31 (Glu) de la SEC ID NO: 2, (3) aminoácido 27 (Glu) hasta 32 (Pro) de la SEC ID NO:2, (4) residuos de aminoácidos 136 (Tyr) hasta 141 (Lys) de la SEC ID NO:2, y (5) residuos de aminoácidos 137 (Lys) hasta 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2. Los péptidos hidrofílicos adecuados también incluyen aquellos epítopes antigénicos predichos a partir de un manchado Jameson-Wolf, que comprende: (1) residuos de aminoácidos 11 (Thr) hasta 20 (Asp) de la SEC ID NO: 2; (2) residuos de aminoácidos 60 (Ser) hasta 64 (Lys) de la SEC ID No.2; (3) residuos de aminoácidos 88 (Ser) hasta 96 (Gln) de la SEC ID No.2; (4) residuos de aminoácidos 127 (Ala) hasta 135 (Lys) de la SEC ID No.2; y (5) residuos de aminoácidos 127 (Ala) hasta 139 (Leu) de la SEC ID No.2. Los anticuerpos generados a partir de esta respuesta inmune por inoculación de un animal con estos antígenos, pueden ser aislados y purificados como se describe aquí. Los métodos para la preparación y aislamiento de los anticuerpos monoclonales y policlonales, son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Cooligan et al . (eds . ) , National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY 1989; y Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982. Como podrá ser evidente para un ordinario experto en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden ser generados a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente, tal como caballos, vacas, carneros, ovejas, perros, pollitos, conejos, ratones y ratas con un polipéptido Zalfa31 o un fragmento del mismo. La imunogenicidad de un polipéptido Zalfa31 puede incrementarse a través del uso de un adyuvante, tal como alum (hidróxido de aluminio) o adyuvante Freund completo o incompleto. Los polipéptidos empleados para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tal como fusiones de Zalfa31 o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína que se enlaza a la maltosa. El polipéptido inmunógeno puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es "como el hapteno", tal porción puede ser ventajosamente unida o ligada a un portador macromolecular (tal como la hemocianina de lapa bocallave (KLH) , albúmina de suero bovino (BSA) o tetanus toxoide) para inmunización. Como se usa aquí, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos que se enlazan al antígeno, tal como fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos diseñados genéticamente, tales como los anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena única y similares, así como también péptidos y polipéptidos que se enlazan al antígeno, están también incluidos. Los anticuerpos no-humanos pueden ser humanizados por el injerto no humano de CDRs en la estructura humana y regiones constantes, o mediante la incorporación de los dominios variables no humanos completos (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie como la humana por el reemplazo de los residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "revestido") . En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de la región variable no humana para incrementar las características del enlace apropiado. A través de los anticuerpos humanizados, se puede incrementar la vida media biológica y el potencial para las reacciones inmunes adversas después que se reduce la administración a humanos. Sin embargo, los anticuerpos humanos se pueden producir en animales no humanos, transgénicos, que se han diseñado genéticamente para contener genes de inmunoglobulina humana, como se describe en la Publicación WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmunoglobulina endógenos en estos animales, se activen o eliminen, tal como por recombinación homologa. Los anticuerpos se consideran por ser específicamente enlazantes si: 1) presentan un nivel de umbral de actividad enlazante, y/o 2) no reaccionan significantemente opuesto con las moléculas de polipéptidos relacionados. Un nivel de umbral de enlace se determina si los anticuerpos zalfa31 aquí, se enlazan a un polipéptido, péptido o epítope Zalfa31, con una afinidad de al menos 10 veces superior que la afinidad de enlace al polipéptido de control (sin zalfa31) . Se prefiere que los anticuerpos presenten una afinidad de enlace (Ka) de 106 M"1 o mayores, preferiblemente 107 M"1 o mayores, más preferiblemente 108 M_1 o mayores, y más preferiblemente 109 M"1 o mayores. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser fácilmente determinada por un ordinario experto en la técnica, por ejemplo, por el análisis Scatchard. (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949). Si los anticuerpos anti-zalfa31 no reaccionan significantemente opuestos con las moléculas del polipéptido relacionado se muestran por ejemplo, por el anticuerpo que detecta el polipéptido zalfa31 pero no a polipéptidos relacionados conocidos usando un análisis de manchado Western estándar (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de los polipéptidos relacionados conocidos son aquellos descritos en la técnica anterior, tales como ortólogos conocidos y parálogos y elementos conocidos similares de una familia de proteínas (por ejemplo, otras citocinas de cuatro hélices atadas) , la Selección puede también hacerse usando polipéptidos mutantes zalfa31 y zalfa31 no humanos. Sin embargo, los anticuerpos pueden ser polipéptidos relacionados conocidos "contra los seleccionados", para aislar una población que específicamente se enlaza a los polipéptidos zalfa31. Por ejemplo, los anticuerpos obtenidos por zalfa31 son absorbidos a polipéptidos relacionados adheridos a la matriz insoluble; los anticuerpos específicos a zalfa31 fluirán a través de la matriz bajo las condiciones amortiguadoras apropiadas. La selección permite el aislamiento de anticuerpos monoclonales y policlonales sin reactivos cruzados por polipéptidos estrechamente relacionados conocidos (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Coligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). La selección y aislamiento de los anticuerpos específicos es bien conocida en la técnica, . Véase Fundamental Immunology, Paul (eds)., Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol . 4_3: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice. Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamín et al., Ann. Rev. Immunol. 2 : 67-101, 1984. Específicamente, los anticuerpos anti-zalfa31 enlazantes, pueden ser detectados por un número de métodos en la técnica, y discutidos abajo. Una variedad de ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser utilizados para detectar anticuerpos los cuales se enlazan específicamente a las proteínas Zalfa31 o polipéptidos. Los ensayos ejemplares se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) ; manchado de punto, o ensayo de manchado Western, ensayos de inhibición o competición y ensayo intercalado. Además, los anticuerpos pueden ser seleccionados por enlazarse a una proteína o polipéptido Zalfa31 mutante contra el tipo silvestre. Las técnicas alternativas para la generación o selección de anticuerpos empleados aquí, incluyen la exposición in vitro de los linfocitos a la proteína o péptido Zalfa31, y la selección de las bibliotecas que presentan anticuerpos en los vectores del fago o similares (por ejemplo, a través del uso de proteínas o péptidos Zalfa31 etiquetados o inmovilizados) . Los genes que codifican a los polipéptidos que tienen dominios de enlace al polipéptido Zalfa31 potencial, pueden ser obtenidos mediante la selección aleatoria de las bibliotecas de péptidos presentadas en el fago (que presentan fago) o en la bacteria, tal como E. coli . Las secuencias de nucleótidos que codifican a los polipéptidos, se pueden obtener en un número de vías, tal como a través de la mutagénesis aleatoria y síntesis aleatoria de polinucleótidos. Estas bibliotecas que presentan péptidos aleatorios pueden ser usadas para seleccionar péptidos que interactúan con un objetivo conocido, el cual puede ser una proteína o un péptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o substancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para la creación y selección de tales bibliotecas que presentan péptidos aleatorios se conoce en la técnica (Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,223,409; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 4,946,778; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,403,484 y Ladner et al., Patente Norteamericana NO. 5,571,698) y bibliotecas que presentan péptidos aleatorios y equipos para seleccionar tales bibliotecas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego CA) , New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las bibliotecas que presentan péptidos aleatorios pueden ser seleccionadas usando las secuencias Zalfa31 descritas aquí para identificar proteínas las cuales se enlazan a Zalfa31. Estos "polipéptidos de enlace" los cuales interactúan con los polipéptidos Zalfa31 pueden ser usadas para células etiquetadas; por aislamiento de los polipéptidos homólogos por purificación de afinidad, pueden ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares. Estas proteínas de enlace pueden también ser usadas en métodos analíticos tal como para la selección de las bibliotecas de expresión y neutralización de la actividad, por ejemplo, por interacción de bloqueo entre el ligando y el receptor, o enlace viral a un receptor. Los polipéptidos de enlace pueden también ser usados para los ensayos diagnósticos para determinar los niveles de circulación de los polipétidos; para detectar o cuantificar los polipéptidos solubles como marcadores de la patología o padecimientos subrayados. Estos polipéptidos de enlace pueden también actuar como "antagonistas" de Zalfa31 para bloquear el enlace de Zalfa31 y la traducción de la señal in vi tro e in vivo . Estos polipéptidos de enlace anti-Zalfa31, podrán ser empleados para inhibir la actividad zalfa31 o enlace de proteína. Los anticuerpos a Zalfa31 pueden ser usados para etiquetación de células que expresan Zalfa31; por aislamiento de Zalfa31 mediante purificación de afinidad; por ensayos de diagnóstico para la determinación de los niveles circulantes de los polipéptidos Zalfa31; para detectar o cuantificar el Zalfa31 soluble como marcador de la patología subrayada o padecimientos; en métodos analíticos que emplean FACS; para las bibliotecas de expresión por selección; por la generación de anticuerpos anti-idiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear la actividad Zalfa31 in vi tro e in vivo . Las etiquetas o marcadores directos adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las etiquetas o marcadores indirectos pueden usar características de biotina-avidina u otros pares complemento/anticomplemento como intermediarios. Los anticuerpos aquí pueden también ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados usados para las aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo. Sin embargo, los anticuerpos a Zalfa31 o fragmentos del mismo, pueden ser usados in vi tro para detectar Zalfa31 desnaturalizada o fragmentos de la misma en ensayos, por ejemplo, manchados Western u otros ensayos conocidos en la técnica.

CONJUGADOS BIOACTIVOS Los anticuerpos o polipéptidos aquí pueden también estar directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados se usan para las aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. Por ejemplo, polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (receptor o antígeno respectivamente, por ejemplo) . Más específicamente, los polipéptidos Zalfa31 o anticuerpos anti-Zalfa31, o fragmentos bioactivos o porciones de los mismos, pueden ser acoplados a las moléculas detectables o citotóxicas y suministradas a un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anti-complementaria. Las moléculas detectables adecuadas pueden estar directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluir radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden estar directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluir toxinas bacterianas o de plantas (por ejemplo, toxina difteria, endotoxinas de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como también radionúclidos terapéuticos, tal como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (ya sea directamente unido al polipéptido o anticuerpo, o indirectamente unido a través de medios de una porción quelante, por ejemplo) . Los polipéptidos o anticuerpos pueden también ser conjugados a los grupos citotóxicos, tal como adriamicina. Para unión indirecta de una molécula citotóxica o detectable, la molécula citotóxica o detectable puede ser conjugada con un elemento de un par complementario/anticomplementario, en donde el otro elemento está enlazado a la porción del polipéptido o anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ejemplar. En otra modalidad, las proteínas de fusión de toxinas del péptido o proteínas de fusión de toxinas del anticuerpo, se pueden usar para la inhibición o extirpación del tejido o célula objetivo (por ejemplo, para tratar células o tejidos con cáncer). Alternativamente, si el polipéptido tiene dominios funcionales múltiples (es decir, un dominio de activación o un dominio de enlace al ligando, más un dominio objetivo), una proteína de fusión que incluye solamente el dominio objetivo, puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a una célula o tipo de tejido de interés. En ejemplos en donde la proteína de fusión solamente de dominio, incluye una molécula complementaria, la molécula anti-complementaria puede ser conjugada a una molécula detectable o citotóxica. Tales proteínas de fusión de moléculas complementarias de dominios así, representan un vehículo de objetivo genérico para el suministro específico de la célula/tejido de conjugados de moléculas detectables/citotóxicas anti-complementarias genéricas. En otra modalidad, las proteínas de fusión de la citocina de Zalfa31 o proteínas de fusión de anticuerpo-citocina, se pueden usar para incrementar la muerte in vivo de los tejidos objetivos (por ejemplo, cánceres de la médula ósea y de la sangre) , si el polipéptido Zalfa31 o un anticuerpo anti-Zalfa31 se dirige a las células de la médula ósea o la sangre hiperproliferativas. Véase, de manera general, Hornick et al . , Blood 89 : 4437 (1997). Describe las proteínas de fusión, capaces de dirigirse de una citocina a un sitio deseado de acción, con ello, se proporciona una concentración local elevada de citocina. Los polipéptidos Zalfa31 adecuados o anticuerpos anti-Zalfa31 se dirigen a una célula o tejido deseado (es decir, un tumor o una leucemia), y la lisis de la célula objetivo mejorada mediada por la citocina fusionada, por las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este propósito, incluyen por ejemplo, la interleucina 2 y el factor de estimulación de la colonia del macrófago del granulocito (GM-CSF) . En aún otra modalidad, si el polipéptido Zalfa31 o anticuerpo anti-Zalfa31 se dirige a las células o tejidos vasculares, tal polipéptido o anticuerpo puede ser conjugado con un radionúclido, y particularmente con un radionúclido de emisión beta, para reducir la restenosis. Tales procedimientos terapéuticos poseen menos daño a los médicos clínicos cuando administran la terapia radioactiva. Por ejemplo, los ribones impregnados de iridio-192 colocados juntos en recipientes enviados de pacientes hasta que la dosis de radiación requerida se suministre, muestran la disminución del crecimiento del tejido en los recipientes y diámetros luminales mayores que el grupo de control, el cual recibió ribones de placebo. Además, la revascularización y la trombosis enviada, fueron significantemente inferiores en el grupo de tratamiento. Se predicen resultados similares con la dirección de un conjugado bioactivo que contiene un radionúclido como se describe aquí. El polipéptido bioactivo o conjugados de anticuerpos descritos aquí, pueden ser suministrados intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente, o pueden ser introducidos localmente al sitio propuesto de acción. Las moléculas de la presente invención pueden ser usadas para identificar y aislar receptores involucrados en la espermatogénesis, esteroidogénesis, diferenciación testicular y control regulatorio del eje hipotalámico-pituitario-gonadal, función de la tiroides, corazón y adrenal. Por ejemplo, las proteínas y polipéptidos de la presente invención pueden ser inmovilizados en una columna y preparaciones de membrana que corren sobre la columna, Immobilized Affini ty Ligand Techniques, Hermanson et al . , eds., pp. 195-202 (Academic Press, San Diego, CA, 1992). Las proteínas y péptidos pueden también ser radioetiquetados, Methods in Enzymol . , vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., pp 721-737 (Acad. Press, San Diego, 1990) o etiquetado por fotoafinidad, Brunner et al . , Ann . Rev. Biochem . 62:483-514 (1993) y Fedan et al . , Biochem . Pharmacol . 33:1167 (1984) y pueden ser identificadas proteínas de la superficie celular específicas. Las moléculas de la presente invención se emplearán para someter a prueba alteraciones del sistema reproductivo, sistemas de la tiroides, adrenales, del corazón e inmunológicos . La zalfa31 representa un nuevo polipéptido con una secuencia líder de péptido de señal putativa y estructura alfa helicoidal. Por lo tanto, este gen puede codificar un polipéptido secretado con estructura secundaria indicando que es un miembro de la familia de citocinas de cuatro hélices atadas. Alternativamente, este polipéptido puede tener otras actividades asociadas con otras funciones biológicas que incluyen: actividad enzimática, asociación con la membrana celular, o función como una proteína portadora. La mayoría de las citocinas de cuatro hélices atadas, así como también otras proteínas producidas por los linfocitos T activados, juegan un papel biológico importante en la diferenciación celular, activación, reclutamiento y homeostasis de las células a través del organismo. La utilidad terapéutica incluye el tratamiento de padecimientos los cuales requieren regulación inmune incluyendo padecimientos autoinmunes tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus eritomatosis sistémico y diabetes. El zalfa31 puede ser importante en la regulación de la inflamación y por lo tanto, podrá ser útil en el tratamiento de artritis reumatoide, asma y sepsis. Puede haber un papel de zalfa31 en la mediación de la tumorgénesis y por lo tanto, podrá emplearse en el tratamiento de cáncer. El zalfa31 puede ser un terapéutico potencial en la supresión del sistema inmune, el cual podría ser importante para reducir el rechazo al implante. Alternativamente, el zalfa31 puede activar el sistema inmune, el cual podrá ser importante en la inmunidad de refuerzo a los padecimientos inmunes o en el mejoramiento de las vacunas . El mal funcionamiento de la tiroides y algunas de las terapias asociadas actualmente, pueden estimular efectos perjudiciales in vivo en el hueso. Así, dada la localización tiroidal y pituitaria de la presente invención, los ensayos que miden la formación ósea y/o la resorpción son ensayos importantes para valorar la actividad zalfa31. Un ejemplo es un sistema de ensayo que permite la rápida identificación de las substancias que tienen actividad del receptor de calcitonina selectiva en las células que expresan el receptor de calcitonina. El receptor de calcitonina es un elemento de la familia del receptor de la proteína G y transduce la señal vía la activación de la ciclasa adenilada, conduciendo a la elevación de los niveles cAMP celulares (Lin et al., Science 254: 1022-24, 1991). Este sistema de ensayo explota la habilidad del receptor para elevar los niveles cAMP como una forma para detectar otras moléculas que son capaces de estimular el receptor de calcitonina e iniciar la transducción de la señal. Otros ensayos que miden la formación ósea o resorpción incluyen ensayos calvariales, QCT, y ensayos que miden el tamaño y el número del osteoblasto. Tales ensayos son conocidos en la técnicas y se discuten abajo. La activación del receptor se puede detectar por: (1) medición de la actividad de ciclasa adenilada (Salomón et 5 al., Anal. Biochem. 58^:541-48, 1974; Alvarez y Daniels, Anal. Biochem. 187 : 98-103, 1990) ; (2) medición del cambio en los niveles cAMP intracelulares usando métodos de radioinmunoensayo convencionales (Steiner et al., J. Biol. Chem. 247:1106-13, 1972; Harper and Brooker, J. Cyc. Nucí.

Res. 1:207-18, 1975); o (3) a través del uso del método de ensayo de poroximidad de escintilación cAMP (SPA) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) . Mientras Estos métodos proporcionan sensibilidad y exactitud, involucran procesamiento de muestra considerable previo al ensayo, son consumidores de tiempo, involucran el uso de radioisótopos, y podrán ser engorrosos para ensayos de selección a gran escala . Un sistema de ensayo alternativo involucra la selección de polipéptidos que son capaces de inducir la expresión de un gen reportero de la luciferasa (CRE) del elemento de respuesta cAMP cíclico, como una consecuencia de los niveles cAMP elevados, en las células que expresan un receptor de calcitonina, pero no en las células que carecen de la expresión del receptor de calcitonina, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,622,839, Patente Estadounidense No. 5,674,689, y Patente Estadounidense No. 5,674,981. Los modelos animales bien establecidos son disponibles para probar la eficacia in vivo de los polipéptidos zalfa31, agonistas o antagonistas, que interactúan con el receptor de calcitonina. Sin embargo, estos modelos pueden ser usados para probar los efectos del zalfa31 en el hueso, preferentemente, a través del receptor de calcitonina. Por ejemplo, el modelo de rata o ratón hipocalcémico, pueden ser usados para determinar el efecto en el calcio del suero, y el ratón o rata ovariectomizada pueden ser usados como un sistema de modelo para la osteoporosis. Los cambios óseos vistos en estos modelos y en humanos durante las etapas tempranas de la deficiencia de estrógeno son cualitativamente similares. La calcitonina se ha mostrado como un agente efectivo para la prevención de la pérdida ósea en mujeres y ratas ovariectomizadas (Mazzuoli et al., Calcif . Tissue Int. 47:209-14, 1990; Wronski et al., Endocrinology 129:2246-50, 1991). Las altas dosis de estrógeno han mostrado inhibir la resorpción ósea y estimular la formación ósea en un modelo de ratón ovariectomizado (Bain et al., J. Bone Miner. Res. 8:435-42, 1993). Los polipéptidos zalfa31, agonistas o antagonistas biológicamente activos de la presente invención, que interactúan con el receptor de calcitonina, o ejercen otros efectos en el hueso, están por lo tanto, contemplados como ventajosos para usarse en aplicaciones terapéuticas para las cuales se emplea la calcitonina. Tales aplicaciones por ejemplo, son en el tratamiento de osteoporosis, padecimiento de Paget, hiperparatiroidismo, osteomalacia, hipercalcemia idiopática de la infancia y otras condiciones. Las aplicaciones adicionales son inhibir la secreción gástrica en el tratamiento de alteraciones gastrointestinales y pancreatitis aguda, y usos como analgésicos en particular para el dolor óseo. Ensayos in vivo para la medición de cambios en las proporciones de formación ósea, incluyen realización histológica ósea (véase, Recker, R., eds. Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Ratón: CRC Press, Inc., 1983) y tomografía computarizada cuantitativa (QCT; Ferretti, J. Bone 17 : 353S-364S, 1995; Orphanoludakis et al., Investig. Radiol. 14:122-130, 1979; y Durand et al., Medical Physics 19:569-573, 1992). Un ensayo ejemplar ex vivo para medir los cambios en la formación ósea jaja?wattM. es un ensayo calavarial (Gowen et al., J. Immunol . 136:2478-2482, 1986) o ensayo calavarial de resorpción (Linkhart, T.A., y Mohán, S., Endocrinoloqy 125:1484-1491, 1989). Además, los polipéptidos de la presente invención pueden ser sometidos a ensayos y usados por su habilidad para modificar la inflamación. Los métodos para determinar las cualidades proinflamatorias y antiinflamatorias de zalfa31 son conocidos en la técnica y se discuten aquí. Por ejemplo, la supresión de la producción de cAMP es una indicación de efectos anti-inflamatorios (Nihei, Y., et al., Arch. Dermatol. Res., 287:546-552, 1995). La supresión de cAMP y la inhibición de ICAM y HLA-Dr inducida por IFN-? en queratinocitos puede ser usada para valorar la inhibición de la inflamación. Alternativamente, el incremento de la producción de cAMP y la inducción de ICAM y HLA-Dr en este sistema, puede ser una medición de los efectos proinflamatorios de una proteína. El zalfa31 del mismo modo, puede presentar efectos inflamatorios similares, como se muestra in vivo (Ejemplo 8) y puede ejercer estos efectos en los tejidos en los cuales está expresado, o en otros tejidos. Por ejemplo, el zalfa31 es expresado en el colon, y puede ser útil en la promoción de la curación de heridas en este tejido, o presentar efectos anti-bacterianos o anti-virales.

Sin embargo, el zalfa31 o sus antagonistas, pueden ser empleados en el tratamiento de padecimientos inflamatorios del intestino, diverticulitis, inflamación durante y después de la cirugía intestinal y similares. Además, el zalfa31 expresado en la tiroides, puede tener acciones en la curación de heridas, o antimicrobianas o antivirales, en tejidos fuera de la tiroides, tales como corazón, cerebro, hígado, riñon, y similares. Sin embargo, la medición directa del polipéptido zalfa31 y los anticuerpos zalfa31 puede ser empleada en la diagnosis de padecimientos inflamatorios tales como melanoma, padecimiento inflamatorio del intestino, diverticulitis, asma, padecimiento pélvico inflamatorio, (PID) ; psoriasis, artritis, reperfusión isquémica, y otros padecimientos inflamatorios. Sin embargo, los antagonistas zalfa31 pueden ser empleados en el tratamiento de miocarditis, aterosclerosis, padecimiento inflamatorio pélvico, (PID) , psoriasis, artritis, eczema, escleroderma y otros padecimientos inflamatorios. Como tal, el polipéptido zalfa31, agonista o su antagonista, tiene usos potenciales en padecimientos inflamatorios tales como asma y artritis. Por ejemplo, si el zalfa31 es proinflamatorio, los antagonistas podrán ser valuables en la terapia del asma u otras terapias anti- inflamatorias en donde la migración de los linfocitos es perjudicial. Además, el zalfa31 puede servir para otros papeles importantes en la función del pulmón por ejemplo, broncodilatación, elasticidad del tejido, reclutamiento de linfocitos en la infección y lesión del pulmón. Los ensayos para valorar la actividad de zalfa31 en las células del pulmón, se discuten en Laberge, S. et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 17:193-202, 1997; Rumsaeng, V. et al., J^ Immunol., 159:2904-2910, 1997; y Schluesener, H. J. et al., J. Neurosci. Res. 44:606-611, 1996. Los métodos para determinar las cualidades proinflamatorias y antiinflamatorias de zalfa31, sus agonistas o sus antagonistas, son bien conocidas en la técnica. Sin embargo, otras técnicas biológicas moleculares, inmunológicas y bioquímicas conocidas en la técnica y descritas aquí, pueden ser usadas para determinar la actividad zalfa31 y aislar los agonistas y antagonistas. Mientras la prueba Northern blot (Ejemplo 2) para zalfa31 muestra distribución relativamente ubicuita del gen el northern electrónico es muy informativo. El tamaño grande de la base de datos EST accesible es tal, que la incidencia de un gen, tal como zalfa31, en los datos son sugestivos de los niveles de expresión encontrados en la biblioteca respectiva (es decir, genes regulados, raros son sobre representados en la mayoría de las bibliotecas, mientras los genes altamente abundantes o inducibles, tienen altos números de copias) . 5 Los datos para zalfa31 sugieren un gen altamente inducible que es prevalente en las células B (tonsiles) y aquellas células del linaje de monocito/macrófago/dendrítico, (consistente con una distribución ubicuita en el estado "normal", no inducido) y particularmente después del tratamiento con un estímulo proinflamatorio tal como PMA, TNF, o LPS. Esta conclusión se basa en su presencia más alta que la frecuencia esperada en los siguientes tejidos: bibliotecas de células B centrales germinales (tonsil), lesiones de esclerosis múltiple; células THP-1 estimuladas (línea pro-monocitos) ; y células dendríticas sanguíneas periféricas (estimuladas) . El gen se encontró también en una línea de células T (estimuladas) y células mononucleares sanguíneas periféricas (estimuladas), células progenitoras CD34+ de hígado fetal y cartílago de un paciente de osteoartritis que muestra una tendencia a estar asociado con eventos inflamatorios. Sin embargo, hubo un número significante de ESTs encontrados en las bibliotecas de origen neural, tanto M f>, mrtfH/it?ußHf tejidos (normal y enfermo) como líneas celulares diferenciadas (neuronas) . La asociación de padecimientos se muestra hasta con: esclerosis múltiple, Huntingtons, gliosis, oligoastrocitoma, tumor cerebral (por ejemplo, sugiere hipernefroma) , y linfoma de espina cordal, de los cuales el zalfa31 puede estar asociado con las respuestas inmunes activadas, asociadas con aquellos padecimientos. Otras citocinas proinflamatorias se producen por los tumores cerebrales encontrados en las lesiones MS, y presentan otras neuropatías (Fontana, A. et al., J. Immunol. 132:1837-1844, 1984; Suarez, GA et al., Neurology 46:559-561, 1996). Sin embargo, las anormalidades en las citocinas únicas pueden conducir a padecimientos neurológicos, tales como por inducción de la infiltración de las células inmunes en el tejido neurológico (Hanish, UK et al., Synapse 24:104-114, 1996; Sugita, Y. et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 : 480-488, 1999) ; o tanto padecimientos neurológicos como inmunes (Zhu, J. et al., J. Neurol. Sci. 125:132-137, 1994; Zhu, J. et al., J. Neurosci. Res. 54:373-381, 1998). Sin embargo, un antagonista de zalfa31 podrá predecirse como un agente anti-inflamatorio. Los agonistas y antagonistas pueden ser empleados por un rango amplio en padecimientos neurales tales como; MS o padecimiento de Huntington, mientras un radionúclido de citocina (o similar) , puede ser empleado para los tumores neurales. Sin embargo, el zalfa31 puede actuar directamente o en conjunto con otras citocinas ejerciendo sus efectos. Por ejemplo, una interferona, IL-1 o IL-2 podrá exacerbar un padecimiento en el cual hay un componente inflamatorio. Como tal, los antagonistas zalfa31 que se disocian o bloquean los efectos combinados de varias citocinas, también son empleados. Sin embargo, aparecen como un "agrupamiento de padecimientos neurológicos" presentes en el sitio de localización cromosomal para zalfa31 como se discute abajo. Esto sugiere que los polipéptidos zalfa31, polinucleótidos o anticuerpos, pueden ser usados como diagnósticos para padecimientos neurológicos o para determinar la susceptibilidad genética a tales padecimientos. Las moléculas de la presente invención pueden ser empleadas para la proliferación de células del tejido cardiaco, tales como miocitos cardiacos o mioblastos; miocitos esqueléticos o mioblastos y células del músculo suave; crondrocitos; células endoteliales; adipositos y osteoblastos in vi tro . Por ejemplo, las moléculas de la presente invención son empleadas como componentes del medio de cultivo de células definidas, y pueden usarse solas o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que es comúnmente usado en el cultivo celular. Las moléculas de la presente invención son particularmente empleadas en la promoción específicamente del crecimiento y/o desarrollo de los mioo-Ltos en cultivo, y pueden también proporcionar utilidad en el estudio de regeneración e hiperplasia del miocito cardiaco. Los péptidos, ácidos nucleicos y/ anticuerpos de la presente invención, pueden ser usados en el tratamiento de alteraciones asociadas con el infarto miocardial, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía hipertrófica y cardiomiopatía dilatada. Las moléculas de la presente invención pueden también ser empleadas para limitar el tamaño del infarto después de un ataque cardiaco, cooperando en la recuperación después del transplante de corazón, promoviendo la angiogénesis y curación de heridas después de la angioplastía o endarterectomía, para desarrollar circulación colateral coronaria, para la revascularización en el ojo, para complicaciones relacionadas a escasa circulación, tal como ulceras de pie en diabéticos, por apoplejía, después de la reperfusión coronaria usando métodos famacológicos, y otras indicaciones en donde la angiogénesis es benéfica. Las moléculas de la presente invención pueden ser empleadas para el mejoramiento de la función cardiaca, ya sea induciendo la neogénesis cardiaca del miocito y/o hiperplasia, induciendo el desarrollo colateral coronario, o induciendo la remodelación del área miocardial necrótica. Otros usos terapéuticos para la presente invención incluyen la inducción de la neogénesis músculo esquelética y/o hiperplasia, regeneración del riñon y/o tratamiento de hipertensión sistémica y pulmonar. El desarrollo colateral coronario inducido por zalfa31 es medido en conejos, perros o cerdos, usando modelos de oclusión coronaria crónica (Landau et al., Amer. Herat J. 29_924-931, 1995; Sellke et al., Surgey 120 (2): 182-188, 1996; y Lazarous et al., 1996, ibid) . La eficacia de zalfa31 para tratar la apoplejía se somete a pruebas in vivo en ratas, utilizando la oclusión de la arteria carótida bilateral y midiendo los cambios biológicos, así como también la resolución de confusión (Gage et al., Neurobiol. Aging 9 : 645-655, 1988). La eficacia de zalfa31 en la hipertensión es sometida a prueba in vivo, utilizando ratas hipertensivas espontáneamente (SHR) por hipertensión sistémica (Marche et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1:S114-116, 1995) . Sin embargo, basado en la alta expresión en la tiroides, el polipéptido zalfa31 puede presentar actividad antiviral inhibiendo la replicación viral por señalización específica vía su(s) receptor (es) en una célula hospedera (por ejemplo, células T) . El zalfa31 puede presentar actividad proliferativa celular inmune (Véase ejemplo 8), puede ser sometido a ensayos por esta actividad como se describe aquí, y puede estimular el sistema inmune para pugnar infecciones virales. Sin embargo, el zalfa31 puede enlazarse al CD4 o a otro receptor del linfocito y presentar efectos antivirales, por ejemplo, contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o virus linfotrópico de las células T humanas (VLTH) . Alternativamente, el polipéptido zalfa31 puede competir para un receptor viral o co-receptor para bloquear la infección viral. El zalfa31 puede ser dado parenteralmente para prevenir la infección viral o para reducir el progreso de la replicación viral y la re-infección (Gayowski, T. et al., Transplantation 64:422-426, 1997). Así, el zalfa31 puede ser usado como un terapéutico antiviral, por ejemplo, para leucemias virales (VLTH) , SIDA (VIH) , o infecciones virales gastrointestinales causadas por ejemplo, por rotavirus, calicivirus (por ejemplo, Agente Norwalk) y ciertas cepas de adenovirus patogénicos. Tanto el zalfa31, que modula la inflamación directa e indirecta puede ser sometido a ensayo por métodos en la técnica. Por ejemplo, véase, Hamada, T. et al., J. Exp. Med. 18^:539-548, 1998; y Liu, L. et al., J. Immunol. 161:3064- 3070, 1998. Por ejemplo, los efectos proinflamatorios del 5 polipéptido zalfa31 pueden ser directamente sometidos a ensayos usando un Transwell™ (Costar) , en donde las células endoteliales son plaqueadas en una membrana semi-permeable y el polipéptido zalfa31 está presente en la cámara inferior de la transwell (transmembrana) y el Cr51 o neutrófilos fluorescentemente etiquetados (PMNs), linfocitos, células HL60, células K562, o similares, se agregan en la cámara superior del transwell (transmembrana) . La migración de PMNS y similares a la cámara inferior de la transwell (transmembrana) en la presencia del polipéptido zalfa31, pero no en su ausencia (control Negativo) , podría demostrar al polipéptido zalfa31 como un quimioatacante directo del PMNs. Sin embargo, el IL-8 podrá ser empleado en este ensayo como un control positivo. Para probar el zalfa31 como estimulador indirecto de la respuesta inflamatoria, se puede emplear un método similar. Por ejemplo, un experimento puede colocarse hasta como por arriba en donde, además de la presencia de zalfa31 en la cámara inferior de la transwell (transmembrana) , los fibroblastos o adipocitos son colocados ??í?ri?ffí??r?^rl?iii? ahí. En esta forma, los efectos del polipéptido zalfa31 en la inducción de estas células para secretar factores que aumentan la migración de PMNS, es decir, inflamación, se pueden medir. El bFGF puede ser usado como un control positivo para el ensayo indirecto. Los efectos antiinflamatorios del polipéptido zalfa31 pueden ser medidos cuando se agregan en la cámara superior en la presencia de PMN usando un ensayo de transwell (transmembrana) similar conocido en la técnica. La actividad de las moléculas de la presente invención puede medirse usando una variedad de ensayos que, por ejemplo, miden la neogénesis o hiperplasia (es decir, proliferación) de las células cardiacas basadas en los efectos potenciales de la actividad extratiroidal de zalfa31. Las actividades adicionales probablemente asociadas con los polipéptidos de la presente invención incluyen la proliferación de las células endoteliales, cardiomiocitos, fibroblastos, miocitos esqueléticos, directamente o indirectamente a través de otros factores de crecimiento; acción como un factor quimiotáxico para las células endoteliales, fibroblastos y/o células fagocíticas; factor osteogénico; y factor para expandir las células troncales mesenquimales y poblaciones precursoras.

La proliferación se puede medir usando células cardiacas cultivadas o in vivo, administrando moléculas de la presente invención al modelo animal apropiado. De manera general, los efectos proliferativos son vistos como un 5 incremento en el número de células, y pueden incluir la inhibición de la apoptosis, así como también la estimulación de la mitogénesis. Las células cultivadas para usarse en este ensayo incluyen fibroblastos cardiacos, miocitos cardiacos, miocitos esqueléticos, y células endoteliales de la vena umbilical humana a partir de cultivos primarios. Las líneas celulares establecidas adecuadas incluyen: fibroblastos NIH 3T3 (ATCC No. CRL-1658), células cardiacas de carnadas CHH-1 (ATCC No. CRL-1680), mioblastos de corazón de rata H9c2 (ATCC No. CRL-1446), células de carcinoma mamario de Shionogi (Tanaka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 89:8928-8932, 1992), y células de adenocarcinoma de LNCap.FGC (ATCC No. CRL-1740) . Los ensayos que miden la proliferación celular son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos que miden la proliferación incluyen ensayos como quimiosensibilidad al tinte rojo neutral (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990), incorporación de nucleótidos radioetiquetados (Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989), incorporación de 5-bromo-2' -desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), y uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cáncer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cáncer Res 8:4827-4833, 1998) . La diferenciación es un proceso dinámico y progresivo, comenzando con las células troncales pluripotentes y terminando con las células terminalmente diferenciadas. Se elaboran las células troncales pluripotentes que pueden regenerarse sin encomendarse a un linaje, expresando una serie de marcadores de diferenciación que se pierden cuando son encomendadas a un linaje celular. Las células progenitoras que expresan una serie de marcadores de diferenciación que pueden o no pueden continuar expresadas como las células progresivas descendentes de la trayectoria del linaje celular hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que son expresados exclusivamente por las células maduras son usualmente propiedades funcionales tales como productos celulares, enzimas para producir los productos celulares, y receptores. La etapa de una diferenciación de la población celular es monitoreada por la identificador de marcadores presentes en la población celular. Los monocitos, osteoblastos, adipocitos, crondrocitos, fibroblastos y células reticulares se cree son originadas de una célula troncal mesenquimal común (Owen et al., Ciba Fdn. Symp. 136:42-46, 1988). Los marcadores para las células troncales mesenquinales no se han identificado bien (Owen et al., J. of Cell Sci. 87:731-738, 1987), así, la identificación es hecha usualmente en el progenitor y los estados de células maduras. La existencia de células progenitoras del miocito cardiaco de etapa temprana (a menudo referidas como células troncales del miocito cardiaco) se han especulado, pero no demostrado, en el tejido cardiaco adulto. Los nuevos polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados para los estudios para aislar las células troncales mesenquimales y las células progenitoras del miocito cardiaco, tanto in vivo como ex vivo. Existe evidencia para sugerir que los factores que estimulan los tipos celulares específicos que descienden a una trayectoria hacia la diferenciación terminal o desdiferenciación, afectan la población celular completa originada de un precursor común o célula troncal. Así, la presente invención incluye estimular o inhibir la proliferación de miocitos, células del músculo suave, • -' - * osteoblastos, adipositos, crondrocitos y células endoteliales. Las moléculas de la presente invención pueden, mientras se estimula la proliferación o diferenciación de los miocitos cardiacos, inhibir la proliferación o diferenciación de adipocitos, en virtud del afecto en sus células precursoras/troncales comunes. Estas moléculas de la presente invención pueden tener uso en la inhibición de condrosarcomas, ateroesclerosis, restenosis y obesidad. Los ensayos que miden la diferenciación incluyen por ejemplo, medición de los marcadores de la superficie celular asociados con la expresión de etapa específica de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todos incorporados aquí por referencia) . Los ensayos in vivo para evaluar la neogénesis cardiaca o hiperplasia, incluyen el tratamiento de las ratas neonatales y maduras con las moléculas de la presente invención. La función cardiaca de los animales se mide como frecuencia cardiaca, presión sanguínea y rendimiento cardiaco para determinar la función ventricular izquierda. Los métodos post-mortem para valorar el decline cardiaco o mejoramiento incluyen: incremento o disminución del peso cardiaco, volumen de núcleo/citoplásmico, y teñido de secciones histológicas cardiacas para determinar la proliferación celular del antígeno nuclear (PCNA) , contra los niveles de actina citoplásmica (Quaini et al., Circulation Res. 75:1050-1063, 1994 y Reiss et al., Proc., Nati. Acad. Sci. 93:8630-8635, 1996) . Las proteínas de la presente invención son empleadas para estimular la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción o inhibición de la función de células especializadas de las células involucradas en la homeostasis de la hematopoyesis y la función inmune. En particular, los polipéptidos zalfa31 son empleados para estimular la proliferación, activación, diferenciación, inducción o inhibición de las funciones celulares especializadas de las células de los linajes hematopoyéticos, incluyendo pero no limitando a, células T, células B, células NK, células dendríticas, monocitos, y macrófagos, así como también células epiteliales. La proliferación y/o diferenciación de las células hematopoyéticas se puede medir in vi tro usando células cultivadas, o in vivo, administrando moléculas de la presente invención al modelo animal apropiado. Los ensayos que miden la proliferación o diferenciación celular, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos que miden la proliferación incluyen tales ensayos como quimiosensibilidad al tinte rojo neutral (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, incorporado aquí por referencia) , incorporación de nucleótidos radioetiquetados (Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989, incorporado aquí por referencia), incorporación de 5-bromo-2' -desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol . Methods 82:169-179, 1985, incorporado aquí por referencia), y uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cáncer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cáncer Res 48:4827-4833, 1998; todos incorporados aquí para referencia) . Los ensayos que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, medición de los marcadores de la superficie celular, asociados con la expresión de la etapa específica de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todos incorporados aquí por referencia) . Alternativamente, el polipéptido zalfa31 mismo, puede servir como una superficie .-.. . . _,s___a_i__i_s____1 celular adicional o marcador secretado asociado con la expresión específica de la etapa de un tejido. Como tal, las mediciones directas del polipéptido zalfa31 o su pérdida de expresión en un tejido como se diferencia, pueden servir como un marcador para la diferenciación de tejidos. De manera similar, la medición directa del polipéptido zalfa31, o su pérdida de expresión en un tejido, se puede determinar en un tejido o células como se someten a la progresión del tumor. El incremento en la habilidad invasiva y movilidad de las células, o la ganancia o pérdida de la expresión de zalfa31 en una condición pre-cancerosa o cancerosa, en comparación con el tejido normal, puede servir como un diagnóstico para la transformación, invasión y metástasis en la progresión del tumor. Como tal, el conocimiento de una etapa de tumor de la progresión o metástasis, ayudará al especialista en la selección de la mayor terapia apropiada, o agresividad del tratamiento, para un paciente dado de cáncer individual. Los métodos de medición de ganancia y pérdida de expresión (de ya sea ARNm o proteína) , son bien conocidos en la técnica y se describen aquí y pueden ser aplicados a la expresión de zalfa31. Por ejemplo, la aparición o desaparición de polipéptidos que regulan la movilidad de las células, puede usarse para ayudar Jm¡?l?-rf a la diagnosis y prognosis del cáncer de próstata (Banyard, J. y Zetter, B.R., Cáncer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). Como un efector de la movilidad celular, la ganancia o pérdida de la expresión de zalfa31 puede servir como un 5 diagnóstico para el linfoide, células B, endoteliales, hematopoyéticas y otros cánceres. Sin embargo, la actividad y efecto de zalfa31 en la progresión del tumor y metástasis, puede ser medida in vivo. Los varios modelos de ratones singenéicos se han desarrollado para estudiar la influencia de los polipéptidos, compuestos u otros tratamientos en la progresión del tumor. En estos modelos, las células del tumor que pasan en el cultivo son implantadas en los ratones de la misma cepa como el donador del tumor. Las células se desarrollarán en tumores que tienen características similares en el ratón recipiente, y la metástasis ocurrirá en alguno de los modelos. Los modelos de tumores apropiados para nuestros estudios incluyen carcinoma de pulmón Lewis (ATCC NO. CRL-1642) y melanoma B16 (ATCC No. CRL-6323) , entre otros. Estas son líneas de tumores comúnmente usadas, singenéicas al ratón C57BL6, que son fácilmente cultivadas y manipuladas in vi tro. Los tumores que resultan del implante de cualquiera de estas líneas celulares son capaces de la metástasis al pulmón en ratones C57BL6. El modelo de carcinoma de pulmón Lewis se ha usado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de la angiogénesis (O'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994). Ratones C57BL6/J se trataron con un agente experimental ya sea a través de la inyección diaria de la proteína recombinante, agonista o antagonista o a una inyección de tiempo del adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento, células 105 hasta 106 se implantaron bajo la piel dorsal. Alternativamente, las células mismas pueden ser infectadas con adenovirus recombinante, tal como una que expresa zalfa31 antes del implante, de manera que la proteína es sintetizada en el sitio del tumor o intracelularmente, preferentemente sistemáticamente. Los ratones normalmente desarrollaron tumores visibles dentro de 5 días. Los tumores se dejaron crecer por un periodo de hasta 3 semanas, durante tal tiempo, pueden alcanzar un tamaño de 1500-1800 mm3 en el grupo tratado con el control. El tamaño del tumor y el peso corporal son cuidadosamente monitoreados a través de todo el experimento. Al tiempo del sacrificio, el tumor es removido y pesado junto con los pulmones y el hígado. El peso del pulmón ha mostrado correlacionarse bien con el límite del tumor metastático. Como una medida adicional, la metástasis de superficie pulmonar es contada. El tumor resectado, pulmones e hígado, son preparados por examinación histopatológica, inmunohistoquímica, e hibridización in si tu, usando métodos conocidos en la técnica y descritos aquí. La influencia del polipéptido expresado en cuestión, por ejemplo, el zalfa31 en la habilidad del tumor para reclutar la vasculatura y someter la metástasis puede además, ser ensayada. Además, a parte de usar adenovirus, las células implantadas pueden ser temporalmente transfectadas con zalfa31. El uso de transfectantes de zalfa31 estables así como también el uso de promotores inducibles para activar la expresión de zalfa31 in vivo son conocidos en la técnica y pueden ser usados en este sistema para valorar la inducción de metástasis por zalfa31. Sin embargo, el medio zalfa31 purificada o zalfa31 acondicionado, puede ser directamente inyectado a este modelo de ratón y por lo tanto, puede ser usado en este sistema. Para referencia general, véase O'Reilly MS, et al., Cell 7^:315-328, 1994; y Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metástasis, Invasión Metástasis 14:349-361, 1995. La actividad de zalfa31 y sus derivados (conjugados) en el crecimiento y diseminación de las células de tumor derivadas de las malignidades hematológicas humanas puede también ser medida in vivo en un modelo de Xenógrafo de ratón. Varios modelos de ratón se han desarrollado en el cual las células tumorales humanas son implantadas en ratones inmunodeficientes, colectivamente referidas como modelos de xenógrafos. Véase Cattan, AR y Douglas, E. Leuk. Res. 18:513-22, 1994; y Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Las características del modelo de padecimiento varían con el tipo y cantidad de células suministradas al ratón. Típicamente, las células tumorales proliferarán rápidamente y pueden encontrarse circulando en la sangre y en los sistemas de órganos numerosos de la población. Las estrategias terapéuticas apropiadas para someter a prueba en tales modelos incluyen toxicidad inducida por anticuerpo, conjugados de toxina ligando o terapias a base de células. El último método, comúnmente referido como inmunoterapia adoptiva, involucra el tratamiento del animal con componentes del sistema inmune humano (es decir, linfocitos, células NK) , y pueden incluir incubación ex vivo de células con zalfa31 u otros agentes inmunomoduladores. Los polinucleótidos que codifican a los polipéptidos Zalfa31 son empleados con las aplicaciones de la terapia del gen, en donde se desea incrementar o inhibir la actividad de Zalfa31. Si un mamífero tiene un gen Zalfa31 mutado o ausente, el gen Zalfa31 puede ser introducido en la células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido Zalfa31 se introduce in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus ADN defectivo o atenuado, tal como, pero no limitado a, el virus del herpes simplex (HSV) , papilomavirus, virus Epstein Barr (EBV) , adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), y similares. Los virus defectivos, los cuales completamente o casi completamente carecen de los genes virales son preferidos. Un virus defectivo no es infectivo después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectivos permite la administración a las células en un área específica, localizada, sin referirse a que tal vector puede infectar otras células. Los Ejemplos de los vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector del virus del herpes simple defectivo 1 (HSV1), Kaplitt et al . , Molec . Cell . Neurosci . 2:320-30, (1991); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al . , J. Clin . Invest . 30:626-30, (1992); y un vector de virus adeno-asociado defectivo, Samulski et al . , J. Virol . 61 : 3096, (1987); Samulski et al . , J. Virol . 63 : 3822, (1989) . En otra modalidad, un gen Zalfa31 puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al., Patente Estadounidense No. ,399,346; Mann et al., Cell 33 : 153 , 1983; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,650,764; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol . 62 : 1120 , (1988); Temin et al., Patente Estadounidense No. 5,124,263; Publicación de Patente Internacional No. WO 95/07358, publicado el 16 marzo de 1996 por Dougherty et al., y Kou et al . , Blood 82 : 845 , (1993). Alternativamente, el vector puede ser introducido por lipofección in vivo usando liposomas. Los lípidos catiónicos sintéticos pueden ser usados para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador, Felgner et al . , Proc Na ti . Acad. Sci . USA 84 : 1413 , 1987; Mackey et al., Proc. Na ti . Acad. Sci , USA 85: 8021-31 , (1988). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Los blancos u objetivos moleculares de las liposomas a las células específicas representan un área benéfica. Más particularmente, la transfección dirigida a las células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, la transfección que se dirige a tipos celulares particulares, podrá ser particularmente ventajosa en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, riñon y cerebro. Los lípidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para los propósitos objetivos. Los péptidos objetivos (por ejemplo hormonas o neurotransmisores) , proteínas tales como anticuerpos o moléculas no peptídicas, pueden ser acopladas a las liposomas químicamente. Es posible remover las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plásmido ADN desnudo; y después re-implantar las células transformadas en el cuerpo. Los vectores AND desnudos para la terapia del gen, pueden ser introducidos en las células huésped deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación de fosfato de calcio, uso de una pistola de genes o uso de un vector ADN transportador. Véase por ejemplo, Wu et al., J. Biol . Chem . 267:963, (1992); Wu et al . , J. Biol . Chem . 263:14621-4, 1988. Se puede usar la metodología antisentido para inhibir la transcripción del gen Zalfa31, tal como inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica al Zalfa31 (por ejemplo, un polinucleótido como se expone en la SEC ID NO:l), se designan para enlazarse a un ARNm que codifica a Zalfa31 y para inhibir la traducción de tal ARNm. Tales polinucleótidos antisentidos se usan para inhibir la expresión de los genes que codifican al polipéptido Zalfa31 en el cultivo celular o en un sujeto. La presente invención también proporciona reactivos que encuentran uso en las aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen Zalfa31, una sonda que comprende el ADN o ARN Zalfa31, o una subsecuencia del mismo, pueden ser usados para determinar si el gen Zalfa31 está presente en el cromosoma 10 o si una mutación ha ocurrido. El zalfa31 está localizado en la región 10q23-q24 del cromosoma 10 (Véase, Ejemplo 3) . Las aberraciones cromosomales detectables en el gen Zalfa31 incluyen locus o sitios, pero no están limitados a aneuploides, cambios en el número de copias del gen, inserciones, supresiones, restricciones, sitios de cambio y reacomodos. Estas aberraciones pueden detectarse usando polinucleótidos de la presente invención, mediante el empleo de las técnicas genéticas moleculares, tal como análisis de polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , técnicas de PCR empleando análisis de repetición de orden corto (SRT) , y otras técnicas de análisis de enlace genético conocidas en la técnica (Sambrook et al., ibid. ; Ausubel et. al., ibid. ; Marian, Chest 108:255 (1995). El conocimiento preciso de una posición del gen, puede ser útil para un número de propósitos, incluyendo: 1) determinar si una secuencia es parte de un contigo existente y obtención de secuencias genéticas adicionales circundantes en varias formas, tales como los clones YACs, BACs, o ADNc; 2) proporcionar un gen candidato posible para un padecimiento hereditable, el cual muestra enlace a la misma región cromosomal; 3) los organismos de modelos de referencia de cruzas, tal como un ratón, el cual puede ayudar en la determinación de que función podría tener un gen particular. Los sitios etiquetados de secuencias (STSs) , pueden también ser usados independientemente para la localización cromosomal. Un STS es una secuencia de ADN que es única en el genoma humano y puede ser usada como un punto de referencia para un cromosoma particular o región de un cromosoma. Un STS se define por un par de cebadores de oligonucleótidos que son usados en una reacción en cadena de la polimerasa para detectar específicamente este sitio en- la presencia de todas las otras secuencias genómicas. Puesto que el STSs se basan solamente en la secuencia de ADN que pueden ser completamente descritas dentro de una basa de datos electrónica, por ejemplo, Base de Datos de los Sitios Etiquetados de Secuencia (dbSTSs) , GenBank, (Centro Nacional para Información Biológica, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y pueden ser buscados con una secuencia del gen de interés para la formación de mapas de los datos contenidos dentro de estas secuencias STS de señales genómicas cortas. El gen zalfa31 está localizado en la región 10q23-q24 del cromosoma 10. Varios genes relacionados con padecimientos en un agrupamiento en esta región, están asociados con neuropatías, cáncer cerebral y otros efectos neurales. Por ejemplo, fosfatasa y homólogos de tensina (PTEN: pérdida de enlace a tumores cerebrales; 10q23.3), síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba (10q23), gen rico en leucma inactivado por el glioma (LGI1; 10q24); macrocefalia, (10q23.3); epilepsia parcial (10q23.3-q24.1) ; ataxia espinocerebelar de inicio en infantes (IOSCA; 10q24); síndrome urofacial (síndrome de Ochoa) (10q23-q24); y paraplegia espástica dominante autosomal 9 (10q23.3-q24.1) , todos mapas de esta región del cromosoma 10. Además, varios de estos padecimientos están ligados a los reacomodos de cromosomas grandes, tales como pérdida de cromosoma o pérdida de heterogeneidad en la región 10q23-q24 del cromosoma 10. Sin embargo, la pérdida de 1 copia del cromosoma 10 es el evento genético más común en un glioma de grado alto, en donde el reacomodo y la pérdida de al menos algunas partes de la segunda copia del cromosoma, particularmente en la región 10q23-26, se han demostrado en aproximadamente 80% de tumores de glioblastoma (Bigner, S. y Vogelstein, B. Brain Path. 1:12-18, 1990). Sin embargo, la pérdida de la heterogeneidad 5 a 10q23 ocurre en aproximadamente 70% de glioblastomas y 60% de cánceres de próstata avanzados (Li, J. et al. Science 275: 1943-1946, 1997), así como también otros cánceres. Sin embargo, un porcentaje significante (por ejemplo, 7%) de leucemia aguda de las células T infantes, está acompañado por 10 la translocación dentro del locus 10q24 (Dube, ID et al., Blood 78:2996-300, 1991). Como el gen zalfa31 está también localizado en la región 10q23-q24 zalfa31, las sondas de polinucleótidos pueden ser usadas para detectar la pérdida del cromosoma 10q23-q24 o la translocación asociada con los 15 padecimientos humanos, tales como glioblastoma, macrocefalia y leucemia de las células T, u otros cánceres, padecimientos neurológicos o inmunes. Además, las sondas de polinucleótidos zalfa31 pueden ser usadas para detectar anormalidades o genotipos 20 asociados con la trisomia del cromosoma 10. Por ejemplo, la malformación de división de mano/pie, tipo 3 (SHFM3), parece ser un resultado de un trisomio en 10q24-q25 (Nunes, ME et al., Hum. Molec. Genet. 4:2165-2170, 1995). Como el gen ?T ti t? lüUnlflifr'i frr - i * .>«. .* . . > . > 1_y_________________________________________________^ * .„M»«A zalfa31 está también localizado en la región 10q23-q24 de zalfa31, las sondas de polinucleótidos pueden ser usadas para detectar ganancia del cromosoma 10q223-q24, o trisomia asociada con tales padecimientos humanos. Sin embargo, entre otros loci o sitios genéticos, aquellos para la cardiomiopatía dilatada (10q21q-23), padecimientos autoinmunes asociados con el ligando FAS, el cual mapea a 10q24.1, retinitis pigmentosa asociada con la proteína G-retinal, acoplada al receptor (10q23), Citrocromo P450-2C9 (CYP2C9) (10q24) , todos ellos manifiestan un estado de padecimiento humano, así como también mapean esta región del genoma humano. Veáse el mapa genético de la Línea Hereditaria Mendeliana del Hombre (OMIM) , y referencias aquí, para esta región del cromosoma 10 en un servidor público disponible WWW (http: //www3. ncbi . nlm. nih. gov/htbin-post/Omim/getmap?chromosome=10q23-q24) . Todos estos sirven como genes candidatos posibles para un padecimiento hereditario que muestra enlace a la misma región cromosomal como el gen zalfa31. De manera similar, los defectos o la sobreexpresión en el sitio zalfa31 mismo, puede resultar en un estado de padecimiento humano hereditable. Por ejemplo, el zalfa31 está localizado en una región cromosomal que está asociada con las implicaciones neuronales y cerebrales, así como también varios tumores. Como se 'discutió aquí, un número significante de ESTs para zalfa31 se encuentra en las bibliotecas de origen neural con asociación de padecimientos con esclerosis múltiple, padecimiento de Huntington, gliosis, oligoastrocitoma, tumores cerebrales (por ejemplo, sugieren hipernefroma), linfoma de espina cordal. Sin embargo, las citocinas proinflamatorias son producidas por tumores cerebrales, encontrados en las lesiones MS, y presentan otras neuropatías. Las moléculas de la presente invención, tal como los polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención, podrán auxiliar en la detección, prevención de diagnosis y tratamiento asociado con el defecto genético de zalfa31. Un diagnóstico podrá asistir a los especialistas en la determinación del tipo de padecimiento y terapia apropiada asociada, o asistencia en el consejo genético. Como tal, los anticuerpos anti-zalfa31 inventivos, polinucleótidos y polipéptidos, pueden ser usados para la detección del polipéptido zalfa31, ARNm o anticuerpos anti-zalfa31, así sirviendo como marcadores y son directamente usados para detectar o padecimientos genéticos o cánceres, como se describe aquí, usando los métodos conocidos en la técnica y descritos aquí. Además, las sondas del polinucleótido zalfa31 pueden ser usadas para detectar anormalidades o genotipos asociados con las supresiones del cromosoma 10q23-q24 y 5 translocaciones asociadas con padecimientos humanos, otras translocaciones involucradas con el progreso maligno de tumores u otras mutaciones de 10q23-q24, las cuales se espera estén involucradas en los reacomodos del cromosoma en las malignidades; o en otros cánceres, o en aborto espontáneo. De manera similar, las sondas de polinucleótidos zalfa31 pueden ser usadas para detectar anormalidades o genotipos asociados con la trisomia del cromosoma 10q23-q24 y pérdida de cromosoma asociada con padecimientos humanos o aborto espontáneo. Así, las sondas de polinucleótidos zalfa31 pueden ser usadas para detectar anormalidades o genotipos asociados con estos defectos. Como se discute anteriormente, los defectos en el gen zalfa31 mismo, pueden resultar en un estado de padecimiento humano hereditable. Las moléculas de la presente invención, tal como los polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención, podrán ayudar en la detección, prevención de diagnosis y tratamiento asociado con un defecto genético de ^^ítas?a?= zalfa31. Además, las sondas de polinucleótidos de zalfa31 pueden ser usadas para detectar diferencias alélicas entre los padecimientos o individuos sin padecimientos en el locus o sitio cromosomal zalfa31. Como tal, la secuencia zalfa31 puede ser usada como diagnósticos en la formación de perfiles de .ADN forénsico. En general, los métodos de diagnóstico usados en el análisis de enlace genético para detectar una anormalidad o aberración genética en un paciente, se conocen en la técnica. La mayoría de los métodos de diagnostico comprenden los pasos de (a) obtener una muestra genética de un paciente potencialmente enfermo, paciente enfermo o portador potencial no enfermo de un alelo de padecimiento recesivo; (b) producir un primer producto de reacción incubando la muestra genética con una sonda de polinucleótido ZSMF16, en donde el polinucleótido hibridizará a una secuencia de polinucleótido complementaria, tal como en el análisis RFLP por incubación de la muestra genética con cebadores sentidos y antisentido en una reacción de PCR bajo condiciones de reacción de PCR apropiadas; (iii) Visualización del primer producto de reacción por electroforesis en gel y/u otro método conocido tal como visualización del primer producto de reacción con una sonda de polinculeótido ZSMF16, en donde el polinucleótido se hibridizará a la secuencia de polinucleótido complementaria de la primera reacción; y (v) comparar el primer producto de reacción visualizado con un segundo producto de reacción de control de una muestra genética a partir de un paciente de tipo nativo. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control, es indicativa de una anormalidad genética en el padecimiento o paciente potencialmente enfermo, o la presencia de un fenotipo portador recesivo heterocigoto, o la presencia de una anormalidad genética en un feto o preimplantación del embrión. Por ejemplo, una diferencia en el patrón de fragmento de restricción, longitud de productos PCR, longitud de secuencias repetitivas en el sitio genético zalfa31, y similares, son indicativos de una anormalidad genética, aberración genética, o diferencia alélica en comparación con el control de tipo nativo normal. Los controles pueden hacerse a partir de elementos de familias no afectadas, o individuos no relacionados, dependiendo de la prueba y biodisponibilidad de las muestras. Las muestras genéticas para usarse dentro de la presente invención incluyen, formas aisladas de ADN, ARNm y ADNc genómico de cualquier tejido u otra muestra biológica de un paciente, tal como pero no limitado a, sangre, saliva, semen, células embriónicas, fluido amniótico y similares. La sonda o cebador de polinucleótido puede ser ARN o ADN, y comprenderá una porción de la SEC ID N0:1, el complemento de la SEC ID N0:1, o un ANR equivalente del mismo. Tales métodos de muestras de análisis de enlace genético a fenotipos de padecimientos humanos son bien conocidos en la técnica. Para referencia a los métodos basados en PCR en diagnósticos, veáse de manera general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols : Current Methods and Applica tions (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cáncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed. ) , Clinical Applica tions of PCR (Humana Press, Inc., 1998), y Mel tzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)). Las mutaciones asociadas con el sitio del zalfa31 pueden ser detectadas usando moléculas de ácido nucleico de la presente invención, empleando métodos estándares para el análisis de mutación directa, tal como el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, técnicas de PCR empleando análisis de repetición de orden corto, análisis del sistema de mutación refractorio-amplificación, detección de polimorfismo conformacional de una sola hebra, métodos de desdoblamiento RNasa, electroforesis en gel de gradiente de desnaturalización, análisis de apareamiento asistido por fluorescencia, y otras técnicas de análisis genético conocidas en el arte (véase por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, C est 108:255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), Elles (ed. ) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed. ) , Labora tory Protocols for Muta tion Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al . (eds.), Genome Analysis , Vol . 2 : Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al . (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), y Richards and Ward, "Molecular Diagnostic Testing"; in Principies of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)). El análisis directo de un gen zalfa31 para una mutación, puede hacerse usando un ADN genómico del sujeto. Los métodos para amplificar el ADN genómico, obtenido por ejemplo de linfocitos sanguíneos periféricos, son bien conocidos por aquellos de habilidades en la técnica (véase por ejemplo, Dracopoli et al . , (eds.), Current Protocols in Human Genetics, en las páginas 7.1 a 7.1.6 (John Wiley & Sons 1998) ) . Los ratones diseñados genéticamente para expresar el gen Zalfa31, referidos como "ratones transgénicos" y ratones que presentan una ausencia completa de la función del gen zalfa31, referidos como "ratones agónicos", pueden también ser generados (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366: 740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu Rev. Genet. 20: 465-499, 1986) . Por ejemplo, ratones transgénicos que sobreexpresan el zalfa31, ya sea ubicuitamente o bajo un promotor específico del tejido o restringido del tejido, pueden ser usados para preguntar si la sobre expresión causa un fenotipo. Por ejemplo, la sobre expresión de un polipéptido zalfa31 de tipo nativo, fragmento de polipéptido o un mutante del mismo, puede alterar los procesos celulares normales, resultando en un fenotipo que identifica un tejido en el cual la expresión zalfa31 es funcionalmente relevante y puede indicar un objetivo terapéutico para el zalfa31, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico preferido para diseñarse genéticamente, es uno que sobre exprese al polipéptido maduro zalfa31 (aproximadamente residuos de aminoácidos 20 (Asp) hasta residuos 142 (Arg) de la SEC ID NO:2). Sin embargo, tal sobre expresión puede resultar en un fenotipo que muestre similitud con los padecimientos humanos. De manera similar, los ratones zalfa31 agónicos, pueden ser usados para determinar en donde el zalfa31 es absolutamente requerido in vivo. El fenotipo del ratón agónico es predictivo de los efectos in vivo de tal antagonista zalfa31, tal como el que pueden tener aquellos descritos aquí. El ADNc del zalfa31 humano, puede ser usado para aislar ARNm de zalfa31 murina, ADNc y ADN genómico, los cuales son usados subsecuentemente para generar ratones agénicos. Estos ratones pueden ser empleados para estudiar el gen zalfa31 y la proteína codificada por este en un sistema in vivo, y pueden ser usados como modelos in vivo para los padecimientos humanos correspondientes. Sin embargo, la expresión de ratones transgénicos de los polinucleótidos antisentido zalfa31 o ribozimas dirigidas contra zalfa31 descrito aquí, pueden ser usadas análogamente para ratones transgénicos descritos arriba. Para uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención son formuladas para liberación parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, de conformidad con los métodos convencionales. La administración intravenosa será por inyección del bolo o infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, una formulación farmacéutica incluirá una proteína Zalfa31 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como salina, salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden además, incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores, agentes de amortiguación, albúmina para prevenir la pérdida de proteína en las superficies viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., (Mack Publishing Co., Easton, PA, 19, ed., 1995). Las dosis terapéuticas generalmente estarán en el rango de 0.1 hasta 100 µg/kg por día, de peso del paciente, preferiblemente 0.5-20 mg/kg por día, con la dosis exacta determinada por el médico clínico de conformidad con los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y severidad de la condición a ser tratada, ensayos de pacientes, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de un ordinario experto en la técnica. Las proteínas pueden ser administradas para tratamiento agudo, durante una semana o menos, frecuentemente sobre un periodo de uno a tres días o pueden ser usadas en el tratamiento crónico, durante varios meses o años.

La invención es además, ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Identificación de zalfa31 Usando una Secuencia EST para Obtener el zalfa31 de longitud completa Explorando la base de datos de ADN traducido de un montaje de longitud completa predicha, usando una secuencia de señal y alfa hélices como cuestión, resultó en la identificación de un montaje que tiene una secuencia EST 5' (EST362610; Image Consortium) . La confirmación de la secuencia EST se hizo por el análisis de secuencia del ADNc a partir del cual se origina el EST. Este ADNc está contenido en un plásmido, y se secuencia usando los siguientes cebadores para completar la secuencia de doble hebra de este clon: ZC694 (SEC ID NO:4); ZC7625 (SEC ID NO:5), ZC22487 (SEC ID NO:6), ZC22488 (SEC ID NO:7), ZC22249 (SEC ID NO:8). La secuencia EST362610 (SEC ID NO:l), codifica una proteína de longitud completa designada zalfa31, como se describe aquí y en la SEC ID NO: 2.

Ejemplo 2 Distribución de Tejido Se realizaron manchados Northerns usando los Manchados de Tejidos Múltiples Humanos (MTNl, MTN2 y MTN3) , y el Manchado Dot Master (Clontech, Palo Alto, CA) . Una sonda de ADNc se preparó usando PCR. Los oligonucleótidos ZC22,230 (SEC ID NO: 9) y ZC22,249 (SEC ID NO: 8), designados del EST INC515639H2 (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) , se usaron como cebadores. El patrón fue el ADNc de cerebro humano de Marathón (Clontech) , elaborado en casa usando las instrucciones del fabricante. Las condiciones del termociclador de PCR fueron como sigue: un ciclo a 94 °C por 1.5 minutos; 35 ciclos a 94°C por 10 seg., 62°C por 20 seg., 72°C por 30 seg.; un ciclo a 72°C por 10 minutos; seguido por un mantenimiento a 4°C. La sonda de aproximadamente 500 pb se purificó usando un Equipo de Extracción en Gel (Quiagen, Chatsworth, CA) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. La sonda se etiquetó radioactivamente usando un Equipo de Etiquetación de ADN Rediprime II (Amersham, Arlington Heights, IL) , de conformidad con las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de empuje NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . La solución de EXPRESSHYB (Clontech) , se usó para la prehibridación y como una solución hibridizante para los manchados Northern. La hibridación tomó lugar durante la noche a 55°C, usando sonda etiquetada 1.5 x 10-6 cpm/ml. Los manchados entonces se lavaron en 2XSSC y SDS al 0.1% a temperatura ambiente, después con 2XSSC y SDS al 0.1 % a 65°C, seguido por un lavado en 0. IX SSC y SDS al 0.1% a 65°C. Se observaron dos tamaños de transcriptos en los manchados a ~1.35 kb y ~2 kb, en todos los tejidos con expresión mas fuerte en el corazón, tiroides, espina cordal, glándula adrenal, cerebro y testículos. Lo-s—Manchados—DT* también se realizaron usando Human RNA Master Blots™ (Clontech) . Los métodos y condiciones para los manchados Dots son los mismos como para los Manchados de Tejidos Múltiples discutidos anteriormente. Los Manchados Dot mostraron señales en todos los tejidos con las más fuertes en el cerebro, hígado y corazón. Los datos northern electrónicos de EST para zafla31, sugieren que es un gen altamente inducible que es prevalente en las células B (tonsiles) y aquellas células del linaje monocito/macrófago/dendrítico, (consistente con una distribución ubicuita en el estado no inducido, "normal") , y particularmente después del tratamiento con un estímulo proinflamatorio tal como PMA, TNF o LPS. Esta conclusión se basa en su presencia superior que la frecuencia esperada en los siguientes tejidos: bibliotecas de células B centrales germinales (tonsil) , lesiones de esclerosis múltiple; células THP-1 estimuladas (línea pro-monocitos) ; y células dendríticas sanguíneas periféricas (estimuladas) . El gen se encontró también en una línea de células T (estimuladas) y células mononucleares sanguíneas periféricas (estimuladas) , células progenitoras CD34+ de hígado fetal y cartílago de un paciente de osteoartritis. Sin embargo, hubo un número significante de ESTs encontrados en las bibliotecas de origen neural, tanto tejidos (normal y enfermo) como líneas celulares diferenciadas (neuronas) .

Ejemplo 3 Asignación Cromosomal y Colocación de Zalfa31 El zalfa31 se mapeo al cromosoma 10 usando el comercialmente disponible "Panel de Formación de Mapas Híbridos Por Radiación (RH) GeneBridge 4" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). El panel RH GeneBridge 4, contiene AND de cada uno de los 93 clones híbridos de radiación, más dos ADNs de control (el donador HLF y el receptor A23) . Un servidor público disponible WWW (http: //www-genome. wi.mit . edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) , permite la formación de mapas con relación al Instituto Whitehead/Centro MIT para el mapa híbrido de radiación de Genome Research, del genoma humano (el mapa híbrido de radiación "WICGR") , el cual se construyó con el panel RH de GeneBridge4. Para la formación de mapas de Zalfa31 con el panel RH de GeneBridge4, se colocaron 20 µl de reacciones en una placa microtituladora de 96 pocilios, compatible para PCR (Stratagene, La Jolla, CA) , y se usó en un ciclador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene) . Cada una de las 95 reacciones de PCR consisten de 2 µl de amortiguador de reacción PCR 10X KlenTaq (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla dNTPs (2.5 mM cada una, PERKIN-ELMER, Foster City, CA) , 1 µl de cebador sentido, ZC 23,469 (SEC ID NO: 10), 1 µl de cebador antisentido, ZC 23,470 (SEC ID NO: 11), 2 µl de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 µl de Mezcla de Polimerasa 50X de Advantage KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN a partir de un clon híbrido individual o control y agua destilada para un volumen total de 20 µl . Las reacciones se sobrecargaron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciclador térmico fueron como sigue: un ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 94 °C, 35 ciclos de una desnaturalización de 45 segundos a 94 °C, 45 segundos templado a 58 °C y 1 minuto y 15 segundos de extensión a 72 °C, seguido por un ciclo final de extensión de 7 minutos a 72 °C. Las reacciones se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% (EM Science, Gibbstown, NJ) , y se visualizaron por teñido con bromuro de etidio. Los resultados mostraron los mapas de zalfa31 distantes 0.90 cR_3000, del marcador de estructura WI-8488 en el cromosoma 10 del mapa híbrido de radiación WICGR. El uso de las posiciones de genes/marcadores circunda a zalfa31 en la región cromosomal 10q23-q24.

Ejemplo 4 Generación de Adenovirus Recombinante Zalfa31 no marcado A. Generación del constructo del vector de expresión para la expresión de Adenovirus La región codificante de la proteína de zalfa31 humana, se amplificó por PCR usando cebadores que agregan sitios de restricción Fsel y AscI en el término 5' y 3' respectivamente. Los cebadores ZC23457 (SEC ID NO: 12) y ZC23458 (SEC ID NO: 13), se usaron con la plantilla del plasmido pT7T3D, que contiene el ADNc de zalfa31 humano de longitud completa en una reacción de PCR como sigue: un ciclo a 95°C por 5 minutos; seguido por 15 ciclos a 95°C por 0.5 minutos; 58 °C por 0.5 minutos.; y 72 °C por 0.5 minutos; seguido por 72 °C por 7 minutos; seguido por un sacudimiento a 4°C. El producto de reacción de PCR se cargó en un gel de SeaPlaque GTG al 1.2% (de baja fusión) (FMC, Rockland, ME) en amortiguador TAE. El producto de PCR de zalfa31 se excisó del gel, se fusionó a 65°C, se extrajo de fenol dos veces y después se precipitó en etanol. El producto de PCR entonces se digirió con Fsel-Ascl, se extrajo de fenol/cloroformo, se precipitó en EtOH, y se rehidrató en TE (Tris/EDTA a pH 8) . El fragmento zalfa31 de 429 pb entonces se ligó en los sitios Fsel-Ascl de un pAdTrack modificado (He, T-C. et al., PNAS 95:2509-2514, 1998) . Este constructo también contiene el gen marcador GFP. El promotor CMV que acciona la expresión GFP se reemplazó con el promotor SV40 y la señal de poliadenilación SV40 se reemplazó con la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano. Además, el polienlazador nativo se reemplazó con los sitios Fsel, EcoRV y Ascl. Esta forma modificada de CMV de pAdTrack se llamó pZyTrack. La ligación se realizó usando la ligación Fast-Link™ y el equipo de selección (Epicentre Technologies, Madison, Wl) . Los clones que contienen el ADNc de zalfa31 se identificaron por procedimientos de mini prep. estándares. Para linealizar el plásmido, aproximadamente 5 µg del plásmido de zalfa31 pZyTrack, se digirieron con Pmel. 5 Aproximadamente 1 µg del plásmido linealizado se cotransformó con 200 ng de pAdEasy superbobinado (He et al., supra) en células BJ5183. La co-transformación se hizo usando un Pulsador de Gen Bio-Rad a 2.5 kV, 200 ohms y 25 mFa . La co-transformación completa se colocó en 4 placas de LB que contienen 25 µg/ml de canamicina. Las colonias más pequeñas se perforaron y expandieron en LB/canamicina y el ADN de adenovirus recombinante se identificó por procedimientos de miniprep de ADN estándares. La digestión del ADN de adenovirus recombinante con Fsel-Ascl, confirmó la presencia de zalfa31. El ADN miniprep del adenovirus recombinante se transformó en células competentes DH10B y el ADN se preparó usando un equipo de maxi prep. de Quiagen por las instrucciones del equipo.

B. Transfección de Células 293a con ADN Recombinante. Aproximadamente 5 µg del ADN adenoviral recombinante se digirió con la enzima Pací (New England íl lllllM JMÉMilÉiUl'a-', t*i*lffKA if? • ? ---- - Z -ím*..M. . M. y ^. jy ^-y.

Biolabs) por 3 horas a 37 °C en un volumen de reacción de 100 µl que contiene 20-30U de Pací. El ADN digerido se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. La pelotilla de ADN se resuspendió en 5 µl de agua destilada. Un matraz de T25 de células QBI-293A (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal, Qc. Canadá), inoculado el día antes y que crece a 60-70% de confluencia, se transfectaron con el ADN digerido con Pací. El ADN digerido con Pací se diluyó hasta un volumen total de 50 µl con HBS estéril (150 mM de NaCl, 20 mM de HEPES) . En un tubo separado, 25 µl de DOTAP (Boehringer Mannheim, 1 mg/ml) , se diluyó a un volumen total de 100 µl con HBS. El ADN se agregó al DOTAP, se mezcló uniformemente por el pipeteado ascendente y descendente, y se dejó a temperatura ambiente por 15 minutos. El medio se removió de las células 293A y se lavó con 5 ml de MEMalfa libre de suero (Gibco BRL) , que contiene 1 mM de piruvato de sodio (Gibco BRL), 0.1 mM de aminoácidos no esenciales MEM (GibcoBRL) y 25 mM de amortiguador HEPES (Gibco BRL) . 5 ml de MEM libre de suero se agregó a las células 293A y se mantuvo a 37°C. La mezcla de ADN/lípido se agregó en forma de gotas al matraz T25 de células 293A, se mezcló uniformemente y se incubó a 37 °C por 4 horas. Después de las 4 horas, el medio que contiene la mezcla de AND/lípido se aspiró y reemplazó con 5 ml de MEM completo que contiene suero bovino fetal al 5%. Las células transfectadas se monitorearon por Proteína Verde Fluorescente (GFP) , para la expresión y formación de focis, es decir, plaquetas virales. Siete días después de la transfección de células 293A con el ADN adenoviral recombinante, las células expresadas de la proteína FGFP e iniciadas, formaron el foci. Estos focis son "plaquetas virales" y el lisado viral crudo se colectó usando un raspador celular para colectar todas las células 293A. El lisado se transfirió a un tubo cónico de 50 ml. Para lograr la mayoría de las partículas virales de las células, se hicieron tres ciclos de congelamiento/descongelamiento en un baño de etanol/hielo seco y a 37 °C de un baño de agua.

C. Amplificación del Adenovirus Recombinante (rAdV) El lisado crudo se amplificó (Primera (1°) amplificación) , para obtener un "depósito" de trabajo del lisado rAdV de zalfa31. Después placas de 10 cm de células 293A cercanamente confluentes (80-90%), se colocaron 20 horas previamente, 200 ml del lisado rAdV crudo se agregó a cada placa de 10 cm y se monitoreo por 48 horas hasta 72 horas de * M?í i??t Fm observación para CPE bajo la luz blanca del microscopio y la expresión de GFP bajo el microscopio fluorescente. Cuando todas las células 293A mostraron CPE (Efecto Citopático) , este 1° depósito de lisado se colectó y se realizaron ciclos de congelamiento/descongelamiento como se describe bajo el Lisado rAdV crudo. Se obtuvo la Amplificación Secundaria (2°) de rAdV de zalfa31, como sigue: cajas de petri de cultivo de tejidos de 15 cm de células 293A, se prepararon de manera que las células fueron 80-90% confluentes. Todos los 20 ml del medio MEM al 5% se removieron y cada placa se inoculó con 300-500 ml del Io lisado amplificado de rAdV. Después de 48 horas, las células 293A se sometieron a lisis a partir de la producción de virus y este lisado se colectó en botellas centrífugas de polipropileno de 250 ml y el rAdV se purificó.

D. Purificación de Adenovirus Recombinante Se agregó detergente NP-40 a una concentración final de 0.5% a las botellas del lisado crudo para lisar todas las células. Las botellas se colectaron en una plataforma rotaroria por 10 minutos, agitando tan rápido como sea posible sin que las botellas se caigan. Los desechos fueron las pelotillas por centrifugación a 20,000 x G por 15 m^t*^ tnM minutos. El sobrenadante se transfirió a botellas centrífugas de policarbonato de 250 ml y 0.5 volúmenes de solución PEG8000 al 20%/2.5 M de NaCl se agregaron. Las botellas se sacudieron durante la noche en hielo. Las botellas se centrifugaron a 20,000 x G por 15 minutos y el sobrenadante se descargó en una solución blanqueadora. El precipitado blanco en dos líneas verticales junto con la pared de la botella en cada lado del marcador centrífugo, es el virus/PEG precipitado. Usando un raspador celular estéril, lo precipitado de las 2 botellas se suspendió en 2.5 ml de PBS. La solución del virus se colocó en tubos centrífugos de 2 ml y se centrífugo a 14.000 x G en el micrófugo por 10 minutos para remover cualquier desecho celular adicional. El sobrenadante de los tubos microcentrífugos de 2 ml, se transfirió en un tubo tapa rompible de polipropileno de 15 ml y se ajustó a una densidad de 1.34 g/ml con cloruro de cesio (CsCl) . El volumen de la solución viral se estimó y se agregó 0.55 g/ml de CsCl. El CsCl se disolvió y 1 ml de esta solución pesó 1.34 g. La solución se transfirió a tubos centrífugos de paredes gruesas de policarbonato de 3.2 ml (Beckman No. 362305) y se centrifugaron a 80,000 rpm (384,000 x G) por 3-4 horas a 25 °C en un microultracentrífugo Beckman Óptima TLX con el rotor TLA-100.4. El virus formó una banda blanca. Usando las puntas de la pipeta de diámetro interior amplio, se colectó la banda del virus. El virus del gradiente tiene una cantidad grande de CsCl la cual podrá ser removida antes de usarse en las células. Las columnas PD-10 de Pharmacia, preenvasadas con Sephadex G-25M (Pharmacia) se usaron para desalar la preparación del virus. La columna se equilibró con 20 ml de PBS. El virus se cargó y se dejó corren en la columna. 5 ml de PBS se agregaron a la columna y las fracciones de 8-10 gotas se colectaron. Las densidades ópticas de 1:50 diluciones de cada fracción se determinó a 260 nm en un espectrofotómetro. Un pico de absorbencia claro estuvo presente entre las fracciones 7-12. Estas fracciones se combinaron y la densidad óptica (OD) de una dilución 1:25 determinada. Se usa una fórmula para convertir el OD en la concentración del virus: (OD a 260 nm) (25) (1.1 x 1012) = viriones/ml. La OD de una dilución 1:25 del rAdV fue de 0.059, dando una concentración de virus de 3.0 x 1012 viriones/ml . Para almacenar el virus, se agregó glicerol al virus purificado a una concentración final de 15%, mezclado uniformemente pero efectivamente, y almacenado en alícuotas a -80°C.

— * - E. Dosis Infecciosas de Cultivos de Tejidos en Ensayos de Titulación Viral de CPE (TCID) al 50%. Se siguió un protocolo desarrollado por Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, QC. Canadá) , para medir la 5 infectividad del virus recombinante. Brevemente, dos placas de cultivo de tejido de 96 pozos se sembraron con células 293A lxlO4 por pocilio en MEM que contiene suero bovino fetal al 2% para cada virus recombinante a ser ensayado. Después de 24 horas, se prepararon 10 partes de diluciones de cada virus 10 de lxlO"2 hasta lxlO"14, en MEM que contiene suero bovino fetal al 2%. 100 µl de cada dilución se colocaron en cada uno de los 20 pocilios. Después de 5 días a 37°C, los pocilios se leyeron ya sea positivos o negativos para el Efecto Citopático (CPE) y se calculó un valor para "Unidades 15 Formadoras de Plaquetas/ml" (PFU) . La formulación TCID50 usada fue como para Quantum Biotechnologies, Inc., anterior. El titulador (T) se determinó de una placa en donde el virus usado se diluyó de 10~2 a 10~4, y se leyó 5 días después de la infección. A cada 20 dilución, se determinó una relación (R) de pocilios positivos por CPE por el número total de pocilios. Para calcular el titulador de la muestra de virus no diluida: el factor, "F" = l+d(s-0.5); en donde "S" es la ^|»j , + m -? - » «8-».,. » . . .„ . , . . . . .. .. . .. _, . ... . y ma^ Muana suma de las relaciones (R) ; y "d" es LoglO de las series de dilución, por ejemplo, "d" es igual a 1 para una serie de dilución de 10 veces. El titulador de la muestra no diluida es T = 10(1 + F> = TCID50/ml. Para convertir TCID5o/ml a pfu/ml, 0.7 es restado del exponente en el cálculo para el titulador (T) . El adenovirus zalfa31 tiene un titulador de 1.3 x 1010 pfu/ml.

Ejemplo 5 Constructo para la generación de Ratones Transgénicos zalfa31 humanos A. Constructo para expresar el zalfa31 humano a partir del promotor MT-1. Aproximadamente 10 °g del vector Zytrack que contiene la secuencia confirmada de la región que codifica a zalfa31 (Ejemplo 4), se digirió con Fsel y Ascl. El vector fue entonces precipitado de etanol y la pelotilla se suspendió en TE. El fragmento zalfa31 de 429 pb liberado, se aisló por la corrida del vector digerido en gel SeaPlaque al 1.2% y se excisó el fragmento. El ADN se purificó usando el equipo de extracción en gel QiaQuick (Qiagen) . El fragmento zalfa31 entonces se ligó en nuestro „ . , ..i,. , „, ^ , . . ^ vector transgénico estándar pTG12-8, el cual se digirió previamente con Fsel y Ascl. El plásmido pTG12-8, designado por la expresión de un gen de interés en un ratón transgénico, contiene un cásete de expresión flanqueado por 10 kb de ADN MT-1 5' y 7 kb de ADN MT-1 3' . El cásete de expresión comprende el promotor MMT-1, y el intron de insulina II de rata, un polienlazador para la inserción del clon deseado, y la secuencia poliA de la hormona de crecimiento. Cerca de un microlitro de la reacción de ligación se sometió a electroporación en células competentes DH10B ElectroMax® (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) , de conformidad con las instrucciones del fabricante, se colocaron en placas LB que contienen 100 µg/ml de ampicilina, y se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias se perforaron y se hicieron crecer en un medio LB que contiene 100 µg/ml de ampicilina. Se preparó ADN miniprep de los clones perforados y se seleccionó por el inserto zalfa31 por la digestión de restricción con EcoRI, y subsecuente electroforesis en gel de agarosa. Se realizaron las maxipreps del constructo zalfa31 pTG12-8 correcto. Un fragmento Salí contenido con las secuencias de flanqueo 5' y 3' , el promotor MT, el intron de insulina II de rata, el ADNc de zalfa31 y la secuencia poliA de la hormona de crecimiento, se prepararon usando técnicas estándares descritas aquí, y se usaron para la microinyección en oocitos de murina fertilizados. La microinyección y 5 producción de ratones transgénicos se produce como se describe en Hogan. B. et al., Manipulating the Mouse Embryo, 2da. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.

B. Constructos para expresar zalfa31 humano a partir del promotor EµLCK específico del linfoide. El fragmento AND de zalfa31 digerido con Fsel y AscI (Ejemplo 5A) , se clonó en pKF051, un vector transgénico específico del linfoide, previamente digerido con Fsel y AscI como se describe anteriormente. El vector transgénico pKF051 se deriva de pl026X (Irritan, B.M., et al., EMBO J. 16:7019- 31, 1997) y contiene el promotor próximo lck específico de la células T, el incrementador de cadena pesada µ de inmunoglobulina, específico de las células B/T, un polienlazador para la inserción del clon deseado, y un gen hGH mutado que codifica una proteína de hormona de crecimiento inactiva (proporcionando intrones 3' y una señal de poliadenilación) . Cerca de un microlitro de cada reacción de ligación se sometió a electroforesis, se colocó en placas, ^gi^^ íi se perforaron y seleccionaron los clones para el inserto zalfa31 humano por la digestión de restricción como se describe anteriormente. Un clon correcto de pKF051-zalfa31 es verificado por el secuenciamiento, y se realiza la maxiprep de este clon. Un fragmento Notl, que contiene el promotor próximo lck y el incrementador µ de inmunoglobulina (EµLCK) , ADNc de zalfa31 y el gen hGH mutado, se preparó para ser usado como microinyección en oocitos de murina fertilizados. A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque las modalidades específicas de la invención se han descrito aquí para propósitos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del espíritu y ámbito de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIA <110> ZymoGenetics , Inc. <120> PROTEINA-31 ALFA-HELICOIDAL SECRETADA <130> 99-41 <150> US 6f 136.485 <151> 1999-0F.-28 <160> 17 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 1208 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (15)... (440) <400> 1 gcgcggggtc cgct atg gcg gcg gca gcc gag ggc gta ctg gcg acc cgg 50 Met Ala Ala Ala Ala Glu Gly Val Leu Ala Thr Arg 1 5 10 agt gat gag ccc gcc cga gac gat gcc gcc gtg gag aca gct gag gaa 98 Ser Asp Glu Pro Ala Arg Asp Asp Ala Ala Val Glu Thr Ala Glu Glu 15 20 25 gca aag gag cct gct gaa gct gac ate act gag ctc tgc cgg gac atg 146 Ala Lys Glu Pro Ala Glu Ala Asp He Thr Glu Leu Cys Arg Asp Met 30 35 40 ttc tec aaa atg gcc act tac ctg act ggg gaa ctg acg gcc acc agt 194 Phe Ser Lys Met Ala Thr Tyr Leu Thr .Gly Glu Leu Thr Ala Thr Ser 45 50 55 60 gaa gac tat aag ctc ctg gaa aat atg aat aaa ctc acc age ttg aag 242 Glu Asp Tyr Lys Leu Leu Glu Asn Met Asn Lys Leu Thr Ser Leu Lys 65 70 75 tat ctt gaa atg aaa gat att gct ata aac att agt agg aac tta aag 290 Tyr Leu Glu Met Lys Asp lie Ala He Asn He Ser Arg Asn Leu Lys 80 85 90 15 gac tta aac cag aaa tat gct gga ctg cag cct tat ctg gat cag ate 338 Asp Leu Asp Gln Lys Tyr Ala Gly Leu Gln Pro Tyr Leu Asp Gln He 95 100 105 aat gtc att gaa gag cag gta gca gct ctt gag cag gca gct tac aag 386 Asn Val He Glu Glu Gln Val Ala Ala Leu Glu "Gln Ala Ala Tyr Lys 20 UO 115 120 ttg gat gca tat tea aaa aaa ctg gaa gcc aag tac aag aag ctg gag 434 Leu Asp Ala Tyr Ser Lys Lys Leu Glu Ala Lys Tyr Lys Lys Leu Glu ?i?f-~r-'?lliilüit?i¡-' -*** - - - • 125 130 135 140 aag cga tgagaaactt atttctatgg gacagagtct ttttttttta atgtggaaga 490 Lys Arg atgtcttata aaacctgaat cctgaggctg atgaattgtg aaaattcctc aaaaggaaat 550 tatgctggtc atcacaggaa catctcaacg ttcgagtaaa ctggaggact gtggctattc 610 ctgaaccttc tttgagacag aatccctcag aatctcacac ttataacttc ctacctttta 670 cttgaatgct ttgccatatt caggacagag actctcacaa agttcagaaa acagctggac 730 ttaccagtaa aatcaaatga gaggacctat tttctctggt agtggttgat tactacatta 790 ttttcttaag tggctggttt tttagttact atgtaaatgg tcgtttttct gttaatgatg 850 ctaatgtgtt gtaaacaaga ttctaaattt aaaaaggaaa acaaaacaaa cttgttcttt 910 gcagcttatc accttgtgaa tgtcggtaac ttacttttcc ataatattgc aaataacata 970 aaatcttaaa ataattccaa gctgagtctt ctagattgag cagaaatggt gaaaggagta 1030 ttgataactt ggcgtatgtg atgggcccct cttgtttat ttctatgtga gtcacattga 1090 catgcgatca gtttgggaaa tgtgatgaaa acaaagacta gatgggtatg tgtgtttatg 1150 tgttgggtag ggaggtgacg attgccactc ataaaataaa ggattttata aaatacca 1208 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213 Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Ala Ala Glu Gly Val Leu Ala Thr Arg Ser Asp Glu Pro 1 5 10 15 Ala Arg Asp Asp Ala Ala Val Glu Thr Ala Glu Glu Ala Lys Glu Pro 20 25 30 Ala Glu Ala Asp He Thr Glu Leu Cys Arg Asp Met Phe Ser Lys Met 35 40 45 Ala Thr Tyr Leu Thr Gly Glu Leu Thr Ala Thr Ser Glu Asp Tyr Lys 50 55 60 Leu Leu Glu Asn Met Asn Lys Leu Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Glu Met 65 70 75 80 Lys Asp He Ala He Asn He Ser Arg Asn Leu Lys Asp Leu Asn Gln 85 90 95 Lys Tyr Ala Gly Leu Gln Pro Tyr Leu Asp Gln He Asn Val He Glu 100 105 110 Glu Gln Val Ala Ala Leu Glu G n Ala Ala Tyr Lys Leu Asp Ala Tyr 115 120 125 Ser Lys Lys Leu Glu Ala Lys Tyr Lys Lys Leu Glu Lys Arg 130 135 140 <210> 3 <211> 426 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de polinucleótido degenerado de zalfa31 <221> misc_feature <222> (1)...(426) <223> n - A.T.C or G <400> 3 atggcngcpg cngcngargg ngtnytngcn acnmgnwsng aygarccngc nmgngaygay 60 gcngcngtng aracngcnga rgargcnaar garcengeng argcngayat hacngarytn 120 tgymgngaya tgttywsnaa ratggcnacn tayytnaeng gngarytnac ngcnacnwsn 180 gargaytaya arytnytnga raayatgaay aarytnacnw snytpaarta yytngaratg 240 aargayathg cnathaayat hwsnmgnaay ytnaargayy tnaaycaraa rtaygcnggn 300 ytncarccnt ayytngayca rathaaygtn athgargarc argtngcngc nytngarcar 360 gcngcntaya arytngaygc ntaywsnaar aarytngarg cnaartayaa raarytngar 420 aarmgn 426 <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC694 <400> 4 taatacgact cactataggg 20 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 Cebador oligonucleótido ZC7625 <400> 5 cgttgtaaaa cgacggccag 20 <210> 6 <211> 20 <212 ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC22487 <400> 6 cctgaggctg atgaattgtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC22488 <400> 7 gttctttgca gcttatcacc 20 <210> 8 <211> 24 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220 20 <223> Cebador oligonucleótido ZC22249 <400> 8 cgttgagatg ttcctgtgat gacc 24 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC22230 <400> 9 gacttgatgg aatgaaggca agt 23 <210> 10 10 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oliginucleótido ZC23469 <400> 10 aatggtcgtt tttctgtt 18 <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213 Secuencia Artificial 20 <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC23470 -1l|-' >fflÉtiin???"?1l?? <400> 11 aagctgcaaa gaacaagt 18 <210> 12 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC23457 <400> 12 cacacaggcc ggccaccatg gcggcggcag ccgagggcg 39 <210> 13 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador oligonucleótido ZC23458 <400> 13 cacacaggcg cgccttcatc gcttctccag cttcttg 37 <210> 14 <2H> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens - - L . <400> 14 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys He Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu Hi s Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly He 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro -Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu He Ser Asn He Asn Val He 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Gl u Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr He Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe 130 135 - 140 15 Cys G n Ser He He Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 15 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens 20 400> 15 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp He Thr Leu Gln 25 30 Glu He He Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp He Phe Ala Al a Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 ' 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95 Phe H.s Arg H . s Lys Gln Leu He Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr He Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 16 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens 400> 16 Met Arg He Ser Lys Pro His Leu Arg Ser He Ser He Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly He His 20 25 30 Val Phe He Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val He Ser Asp Leu Lys Lys He Glu Asp Leu He 50 55 60 Gn Ser Met His He Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu He He Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 10 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu ys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn He 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His He Val Gln Met Phe He Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 17 <211> 144 <212> PRT <213 Homo sapiens <400> 17 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser He 20 i 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala He Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp J-~"*aa-« . ¿-a-.ataa. 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val He Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln He He Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val He Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 5 1. ün polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que es al menos 90% idéntico a una secuencia de residuos de aminoácido, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido como se muestra en 10 la SEC ID NO: 2 del número de residuo 37 (lie), al número de residuo 132 (Leu) ; (b) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 20 (Asp) , al número de residuo 142 (Arg) ; y 15 (c) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (Met) , al número de residuo 142 (Arg) . 2. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido 20 codificado por el polinucleótido además contiene cuatro alfa hélices espaciados separadas de N-término al C-término en una configuración representada por los siguientes: Asp2o- { 16 } -Hl- { 13 } -H2- { 7 } -H3- { 16 } -H4- { 9 } -Arg142,
2. WBf^tf^^" -*"•*- - .-*..•*-» . > . . - -- - * , ' . . > ~¡¡ftr» en donde Asp20 es el residuo 20 (Asp) como se muestra en la SEC ID NO: 2, Argi42 es el residuo 142 (Arg) como se muestra en la SEC ID NO:2, Hl es la "hélice A" (que corresponde a aminoácidos 37 (He) hasta 51 (Tyr) de la SEC ID NO:2); H2 es la "hélice B" (que corresponde a aminoácidos 65 (Leu) hasta 79 (Glu) de la SEC ID NO:2); H3 es la "hélice C" (que corresponde a aminoácidos 87 (He) hasta 101 (Leu) de la SEC ID NO:2). H4 es la "hélice D" (que corresponde a aminoácidos 118 (Leu) hasta 132 (Leu) de la SEC ID NO:2). {#} denota el número aproximado de residuos de aminoácidos entre las porciones, hasta más o menos 2 residuos. 3. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido comprende el nucleótido 1 al nucleótido 426 de la SEC ID NO:
3. 3.
4. 4. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque codifica un polipéptido que incluye una secuencia de residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: '^' -^-- -^-^^ -^ - »- . s a . » - - - » - > »wiMálf (a) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 37 (He), al número de residuo 132 (Leu) ; (b) la secuencia de aminoácido como se muestra en 5 la SEC ID NO: 2 del número de residuo 20 (Asp) , al número de residuo 142 (Arg) ; y (c) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (Met) al número de residuo 142 (Arg) . 10
5. 5. Un vector de expresión, caracterizado porque incluye los siguientes elementos operablemente ligados: un promotor de transcripción; un segmento de ADN que codifica un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1; y 15 un terminador de transcripción.
6. 6. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además incluye una señal de secuencia secretoria operablemente ligado al segmento de ADN. 20
7. 7. Una célula cultivada en la cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN. g^^¡^¡ g
8. 8. Un constructo de ADN que codifica a una proteína de fusión, el constructo de ADN caracterizado porque incluye: un primer segmento de ADN que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (Met), al número de residuo 19 (Asp) ; (b) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 118 (Leu) , al número de residuo 132 (Leu) ; (c) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 37 (He) , al número de residuo 132 (Leu) ; y (e) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 20 (Tyr) , al número de residuo 142 (Leu) ; y al menos otro segmento de ADN que codifica un polipéptido adicional, en donde el primero y otros segmentos de ADN se conectan en estructura; y codificar la proteína de fusión.
9. 9. Una proteína de fisión producida por un método, caracterizada porque incluye: cultivar una célula hospedera en la cual ha sido introducido un vector que incluye los siguientes elementos operablemente ligados: (a) un promotor transcripcional; 5 (b) un constructo de ADN que codifica una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 8; y (c) un terminador transcripcional; y recuperación de la proteína codificada por el segmento de ADN. 10
10. 10. Un polipéptido aislado que incluye un segmento de residuos de aminoácido que es al menos 90% idéntico a la secuencia de residuos de aminoácido, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido como se muestra en 15 la SEC ID NO: 2 del número de residuo 37 (He), al número de residuo 132 (Leu) ; (b) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 20 (Asp) , al número de residuo 142 (Arg) ; y 20 (c) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (Met) , al número de residuo 142 (Arg) .
11. 11. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido además contiene cuatro alfa hélices espaciadas separas del N-término al C-término en una configuración representada por los 5 siguientes: Asp20- { 16} -Hl- { 13 } -H2- { 7 } -H3- { 16 } -H4- { 9 } -Arg?42, en donde Asp20 es el residuo iniciador del polipéptido maduro (como se muestra en la SEC ID NO:2), Argi42 es el residuo terminal del polipéptido maduro 10 (como se muestra en la SEC ID NO:2), Hl es la "hélice A" (que corresponde a aminoácidos 37 (He) hasta 51 (Tyr) de la SEC ID NO:2); H2 es la "hélice B" (que corresponde a aminoácidos 65 (Leu) hasta 79 (Glu) de la SEC ID NO:2); 15 H3 es la "hélice C" (que corresponde a aminoácidos 87 (He) hasta 101 (Leu) de la SEC ID NO:2). H4 es la "hélice D" (que corresponde a aminoácidos 118 (Leu) hasta 132 (Leu) de la SEC ID NO:2). {#} denota el número aproximado de residuos de 20 aminoácidos entre las porciones, hasta más o menos 2 residuos . l*¿m,.?*iM.. ^?taialL
12. 12. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque incluye una secuencia de residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 37 (He), al número de residuo 132 (Leu) ; (b) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 20 (Asp), al número de residuo 142 (Arg) ; y (c) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SECID NO: 2 del número de residuo 1 (Met) , al número de residuo 142 (Arg) .
13. 13. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque incluye: cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 7; e aislar el polipéptido producido por la célula.
14. 14. Un método para detectar, en una muestra de prueba, la presencia de un antagonista de la actividad proteínica, caracterizado porque incluye: cultivar una célula que es responsiva a un polipéptido aislado de los aminoácidos 20 (asp) hasta 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2; y producir un polipéptido por el método de la reivindicación 13; y exponer el polipéptido a la célula, en la presencia y ausencia de una muestra de prueba y; comparar los niveles de respuesta al polipéptido, en presencia y ausencia de una muestra de prueba por un ensayo bioquímico o biológico; y determinar de la comparación, la presencia de un antagonista de la actividad proteínica en una muestra de prueba.
15. 15. Un método de detección, en una muestra de prueba, de la presencia de un agonista de actividad proteínica, caracterizado porque incluye: cultivación de una célula que es responsable a un polipéptido aislado de aminoácidos 20 (asp) a 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2; y agregar una muestra de prueba; y comparar los niveles de respuesta en la presencia y ausencia de la muestra de prueba, por un ensayo biológico o bioquímico; y determinar de la comparación, la presencia del agonista de la actividad proteínica en la muestra de prueba.
16. 16. Un método de producción de un anticuerpo a un polipéptido caracterizado porque incluye los siguientes pasos para: inocular un animal con un polipéptido seleccionado del grupo de: (a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 10 ó 12; (b) un polipéptido que incluye un número de aminoácido 118 (Leu) a 132 (Leu) de la SEC ID NO : 2 ; (c) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 14 (Asp) hasta 19 (Asp) de la SEC ID NO: 2; (d) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 26 (Ala) hasta 31 (Glu) de la SEC ID NO: 2; (e) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 27 (Glu) hasta 32 (Pro) de la SEC ID NO: 2; (f) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 136 (Tyr) hasta 141 (Lys) de la SEC ID NO: 2; y (g) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 137 (Lys) hasta 142 (Arg) de la SEC ID NO: 2; (h) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 127 (Ala) hasta 135 (Lys) de la SEC ID NO: 2; y (i) un polipéptido que incluye un número de aminoácidos 127 (Ala) hasta 139 (Leu) de la SEC ID NO: 2; y en donde el polipéptido estimula una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo a partir del animal.
17. 17. Un anticuerpo producido por el método de la reivindicación 16, caracterizado porque específicamente se enlaza a un polipéptido de la SEC ID NO.2.
18. 18. Un anticuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido, caracterizado porque consiste de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo de: (a) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 37 (He), al número de residuo 132 (Leu) ; (b) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 20 (Asp) , al número de residuo 142 (Arg) ; y (c) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (Met) , al número de residuo 142 (Arg) , y (d) una secuencia de aminoácido que es 90% idéntica a (a) , (b) o (c) . i / c' 7 i > • RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polinucleótidos y moléculas de polipéptidos para la proteína-31 alfa helicoidal secretada de mamífero (zalfa31) . Los polipéptidos y polinucleótidos que los codifican, son una nueva citosina de cuatro hélices atadas y pueden ser usadas para regular el funcionamiento del sistema inmune. La presente invención también incluye anticuerpos a los polipéptidos Zalfa31.