MXPA00010232A

MXPA00010232A - Proteina solublek ztmpo-1

Info

Publication number: MXPA00010232A
Application number: MXPA/A/2000/010232A
Authority: MX
Inventors: Paul O Sheppard; Theresa M Farrah; Darrell C Conklin; Mark F Maurer; Angelika Grossmann
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2001-09-07

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de polinucleótidos y polipéptidos para ZTMPO-1, una proteína soluble con homología a la emerina y a las timopoietinas. Los polipéptidos y polinulceótidos que los codifican son empleados en la modulación de la proliferación celular y la diferenciación y pueden ser usados para propósitos de diagnósticos .La presente invención también incluye anticuerpos a los polipéptido ZTMPO-1.

Description

PROTEINA SOLUBLE ZTMPO-l ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe una familia de crecimiento de proteínas, las cuales portan o llevan regiones de homología y localización de secuencia hacia el núcleo. Estas proteínas incluyen las timopoie tinas , (Zevin-Sonkin et al., Imuno . Letts. 31:301-10, 1992; Harris et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:6283:87, 1994; Harris et al., Genomics 28 : 198-205, 1995; Berger et al., Genome Res. 6 : 361-70, 1996 y Ishijima et al., Biochem. Byophys . Res. Comm. 226:431-8, 1996), proteínas asociadas con la lámina, (Sénior y Gerace, J. Cell . Biol . 107 : 2029-36, 1988; Worman et al., J. Cell Biol. 111:1535-42, 1990; Wozniak y Blobel J. Cell. Biol. 119: 1441-9, 1992; Foisner y Gerace, Cell 73 : 1267-79, 1993; Ye y Worman, J. Biol. Chem. 269: 11306-11, 1994 y Furukawa et al., EMBO J. 14 : 1626-36, 1995) y emerina (Bione et al., Nat. Genet. 8 : 323-7, 1994; Manual et al., Hum. Mol. Gen. 5:801-8, 1996 y Small et al., Mamm. Genom. 8:337-41, 1997) . La emerina es una proteína dé membrana nuclear responsable de la distrofia muscular Emeri-Dreifuss, una alteración recesiva ligada con X. Se REF: 124298 han reportado las secuencias de emerina de ratón, rata y humano (Bione et al., Nat. Genet. 8_: 323-7, 1994; Manila et al., Hum. Mol. Genet. 5 : 801-8," 1996 y Small et al., Mammal. Genol. 8:337-41, 1997). La emerina de ratón, rata y humano contribuye al 73-95% de la identidad' de nucleótido y aminoácido. Todos portan alguna homología estructural con las timopoietinas y LAP2, en particular con las porciones de la región N-terminal conservada y el dominio de transmembrana putativa hidrófoba de la timopoietina . Como las timopoietinas y LAP2, la emerina está expresada ubicuitamente y se predice que la emerina tienen la misma organización de membrana nuclear interna como de la timopoietina y LAP2 (Manual et al., ibid. ) . El antisuero sobresale de la expresión localizada de los péptidos de emerina de la proteína a las membranas nucleares de las células del músculo caridaco y esquelético normal, pero se encuentra ausente en aquellas células de pacientes con distrofia muscular. Es claro como una deficiencia de una proteína nuclear resulta en el padecimiento (Nagano et al., Nat. Genet. ^^254-9, 1996 y Small et al . , ibid) . La presente invención proporciona polipéptidos asociados para estos y otros usos que deberán ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia da residuos de aminoácidos que son al menos, 80% idénticos en secuencia de aminoácidos a los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO : 2. En una modalidad de la secuencia los residuos de aminoácidos, son al menos 90% idénticos. En otra modalidad, cualquier diferencia entre dicho polipéptido y residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO:2, es debido a las substituciones de aminoácidos conservativos. Dentro de otra modalidad, el polipéptido se enlaza específicamente con un anticuerpo que se enlaza específicamente con un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO : 2. Dentro de una modalidad adicional, el polipéptido está covalentemente enlazado a una porción seleccionada a partir del grupo que consiste de etiquetas de afinidad, radionucleótidos , enzimas y fluoroforos.

En una modalidad relacionada, la porción es una etiqueta de afinidad seleccionada a partir del grupo que consiste de polihistidina, FLAG, Glu-Glu, transferasa S de glutationa y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. También se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:2: Dentro de otro aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que consiste esencialmente de una primera porción y una segunda porción unida por un enlace péptido, dicha primera porción consiste de un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que son al menos, 80% idénticos en secuencia de aminoácidos a los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO:2; y dicha segunda porción comprende de otro polipéptido . Dentro de aún otro aspecto la invención proporciona una composición farmacéutica que comrende de un polipéptido como se describe anteriormente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dentro de todavía otro aspecto, se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido como se describe anteriormente. Dentro de una modalidad, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal de murina; c) un anticuerpo humanizado derivado de b) ; y d) un anticuerpo monoclonal humano. Dentro de otra modalidad, el fragmento de anticuerpo se selecciona a partir del gurpo que consiste de F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv, y una unidad de reconocimiento mínimo. Dentro de todavía otra modalidad, se proporciona un anticuerpo anti-idiotipo que se enlaza específicamente al anticuerpo descrito .anteriormente . También se proporciona una proteína enlazante que se enlaza específicamente a un epitope de un polipéptido como se describe anteriormente. Dentro de otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado a partir del grupo que consiste de: a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende de una secuencia de residuos de aminoácidos que son al menos, 80% idénticos en la secuencia de aminoácidos a los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO : 2 ; b) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO : 5 ; c) un polinucleótido que permanece hibridizado después de las condiciones de lavado rigurosas para un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO : 1 , o el complemento de la SEC ID NO : 1. Dentro de una modalidad, la secuencia de los residuos de aminoácidos es al menos, 90% idéntica. Dentro de otra modalidad, cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácido codificada por el polinucleótido y la secuencia de aminoácido correspondiente de la SEC ID NO:2, es debida a una substitución de aminoácido conservativo. Dentro de aún otra modalidad el polinucleótido comprende el nucleótido 127 hasta el nucleótido 2754 de la SEC ID NO : 1. Dentro de todavía otra modalidad, el polinucleótido es ADN. Dentro de otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operablemente ligados: un promotor de transcripción; un segmento de ADN que consiste de un polinucleótido como se describe anteriormente; y un terminador transcripcional. Dentro de una modalidad, la secuencia de residuos de aminoácido es al menos, 90% idéntica. Dentro de otra modalidad, cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácido codificada por el polinucleótido y la secuencia de aminoácido correspondiente de la SEC ID NO : 2 es debida a una substitución de aminoácido conservativo. Dentro de otra modalidad, el segmento de ADN codifica un polipéptido covalentemente ligado a un etiqueta de afinidad, seleccionada a partir del grupo que consiste de polihisitidina, Glu-Glu, transferasa S de glutationa y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Dentro de todavía otra modalidad, el vector de expresión además comprende una secuencia de señal secretoria operablemente ligada a dicho segmento de ADN. También se proporciona una célula cultivada dentro de la cual se ha introducido un vector de expresidn como se describe anteriormente, en donde la célula expresa al polipéptido codificado por el segmento de ADN. Dentro de un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir un polipéptido ZTMPO-l que comprende: cultivar una célula dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión como se describe anteriormente, con ello la célula expresa al polipéptido codificado por el segmento de AND; y se recupera el polipéptido expresado. También proporcionado por la invención está un método para la detección de una anormalidad genética en un paciente, que comprende: obtención una muestra genética a partir de un paciente; incubación de la muestra genética con un polinucleótido que comprende al menos, 14 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO : 1 o el complemento de la SEC ID NO : 1 , bajo condiciones en donde dicho polinucleótido se hibridizará hasta la secuencia de polinucleótido complementaria, para producir un primer producto de reacción; comparando dicho primer producto de la reacción con un producto de reacción de control, en donde una diferencia entre dicho primer producto de reacción y dicho producto de reacción de control es indicativo de una anormalidad genética en el paciente. Estos y otros aspectos de la invención llegarán a ser evidentes después de la referencia con la siguiente descripción detalla de la invención y de los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura muestra una alineación de secuencia de aminoácido múltiple para ZTMPO-l (SEC ID NO: 2), emerina humana (EMD-HU). Bione et al., Nat. Genet. 8_^_323-27, 1994 (SEC ID NO : 3 ) , timopoietina a humana (PIR_A5) Harris et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 91: 6283-7, 1994 (SEC ID NO: 4), timopoietina ß humana (PIR_B5) Harris et al., ibid. (SEC ID NO: 30) y timopoietina ? humana (PIR C5) Harris et al., ibid. (SEC ID NO:31) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Previo a la exposición de la invención en detalle, puede ser beneficioso para el entendimiento de la misma, definir los siguientes términos : El término "etiqueta de afinidad" es usado aquí para denotar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar purificación del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier polipéptido o proteína por la cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico está disponible, puede ser usado como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4_: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferasa S de glutationa (Smith y Johnson, Gene jT7_:31, 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu, substancia P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6_:1204-10, 1988), péptido de enlace a estreptavidina, u otro epitope antigénico u dominio de enlace. Véase en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2_: 95-107, 1991. Las etiquetas de afinidad que codifican los ADNs están disponibles a partir de proveedores comerciales (por ejemplo Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El término "variante alélica" se usó aquí para denotar cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa los mismos locus o sitios cromosomales . La variación alélica se alcanza naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones del gen pueden ser silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácido alteradas. El término variante alélica es también usado aquí para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxil-terminal" son usados aquí para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos término son usados con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia carboxil- terminal colocada a una secuencia con una secuencia de referencia con un polipéptido está localizada proximal al término carboxilo de la secuencia de refernecia, pero no está necesariamente en el término carboxilo del polipéptido completo. El término "complementos de una molécula de polinucleótido" es una molécula, de polinucleótido que tiene una secuencia base complementaria y orientación inversa comparada con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' . El término "contig" (o contiguo) denota un polinucleótido que tiene un alargamiento contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Las secuencias contiguas son las que "traslapan" un alargamiento dado de secuencia de polinucleótido ya sea en su totalidad o solo un alargamiento parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los contigs (o contiguos) representativos a la secuencia de polinucleótido 5 ' -ATGGCTTAGCTT-3 ' son 5'-TAGCTTgagtct-3' y 3 ' -gtcgacTACCGA- 5' . El término "secuencia de nucleótido degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (como los comparados a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido) . Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican al mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifican a Asp) . El término "vector de expresión" es usado para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifca un polipéptido de interés operablemente ligado a segmentos adicionales que se proporcionan para su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras , y pueden también incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un incrementador, una señal de poliadenilación, etc.

Los vectores de expresión son derivados de manera general del plasmido o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. El. término "aislado" cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido removido de su medio genético natural y está además, libre de otras secuencias codificantes no deseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para usarse con sistemas de producción de la proteína diseñada genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que están separadas de su ambiente natural e incluyen clones genómicos y ADNc. Las moléculas ADN aisladas de la presente invención, están libres de otros genes con los cuales están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se originan naturalmente, tal como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para un ordinario experto en la técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985) . Un polipéptido o proteína "aislada" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como parte de la sangre del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, mayores del 95% puro, más preferiblemente mayores del 99% puro. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o alternativamente glicosilados o formas derivatizadas . El término "operablemente ligado", cuando se refiere a los segmentos ADN, indica que los segmentos están colocados de tal forma que funcionan de acorde a sus propósitos propuestos, por ejemplo, inician la transcripción en el promotor y proceden a través del segmento de codificación al terminador. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenida a partir de unas especies que son la contraparte funcional de un polipéptido o proteína de unas especies diferentes. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la especificación. Un "polinucleótido" es un polímero de hebra sencilla o doble de bases de desoxiribonucleó tido o ribonucleótido leídas a partir del etiqueta 3 ' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, sintetizados in vi tro , o preparados a partir de una combinación de moléculas sintéticas o naturales. Los tamaños de polinucleótidos están expresados como pares base (abreviados "bp") , nucelótidos ("nt") , o kilobases ("kb") . Cuando el contexto lo permite, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de hebra sencilla o doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para denotar la longitud completa y se entenderán como equivalentes al término "pares base". Se reconocerá por aquellos expertos en la técnica, que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en la longitud y que los extremos del mismo pueden ser escalonados como un resultado del desdoblamiento enzimático; así, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polincleótido de doble hebra no pueden ser apareados. Tales extremos no apareados en general, no excederán de 20 nt en longitud. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces péptidos, de algún modo producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente referidos como "páptidos" Las "sondas y/o cebadores" como se usaron aquí, pueden ser ARN o ADN. El ADN puede ser ya sea ADNc o ADN genómico. Las sondas y cebadores de polinucleótidos son ADN o ARN de hebras sencillas o dobles, oligonucleótidos generalmente sintéticos, pero pueden ser generados a partir de secuencias genómicas o ADNc clonado o sus complementos. Las sondas analíticas serán generalmente al menos, de 20 nucleótidos de longitud, aunque algunas veces se pueden usar sondas más cortas (14-17 nucleótidos) . Los cebadores de PCR son de al menos, 5 nucleótidos de longitud, preferiblemente 15 o más nt, más preferiblemente 20-30 nt . Pueden usarse los polinucleótidos cortos cuando una región pequeña del gen es objetivo para el análisis. Para análisis generales de los genes, una sonda de polinucleótido puede comprender un exon completo o más. Las sondas pueden ser etiquetadas para proporcionar una señal detectable, tal como con una enzima, biotina, un radionuclido, fluoroforo, fosforescentes, partículas paramagnéticas y similares, las cuales son comercialmente disponibles a partir de muchas fuentes, tales como Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, and Amersham Corp., Arlington Heights, IL, usando técnicas que son bien conocidas en el arte. Los ejemplos de sondas y cebadores ZTMPO-l incluyen, pero no están limitados a las secuencias descritas aquí como SEC ID NOs:6-29. El término "promotor" es usado aquí por su significado reconocido en la técnica para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que se proporcionan para el enlace de la polimerasa de ARN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente pero no siempre, encontradas en las regiones no codificantes del 5' de los genes. Una "proteína" es una . macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tal como grupos carbohidratos. Los carbohidratos y otros substituyentes no-peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual la proteína se produce, y variará con el tipo de célula. Las proteínas están definidas aquí en términos de sus estructuras de esqueletos de aminoácidos; los substituyentes tales como los grupos carbohidratos no están especificados de manera general, pero sin embargo pueden estar presentes . El término "receptor" denota una proteína asociada a la célula que se enlaza a una molécula _,- bioactiva (es decir, un ligando), y media el efecto del ligando en la célula. Los receptores que se enlazan a la membrana están caracterizados por una estructura de dominios múltiples que comprenden un dominio extracelular que se enlaza al ligando y un dominio efector intracelular que está típicamente involucrado en la transducción de la señal. El enlace del ligando al receptor resulta en un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otras molécula (s) en la célula. Esta interacción en turno conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están ligados a las interacciones ligando-receptor, incluyen la transcripción del gen, fosforilación, desfosforilación, incremento en la producción cíclica de AMP, mobilización del calcio celular, mobilización de los lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de los fosfolípidos. En general, los receptores pueden ser enlazados a la membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor .de la hormona que estimula la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multimérico (por ejemplo, receptor PDFG, receptor de la hormona de crecimiento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor eritropoietina y receptor IL-6) . El término "secuencia de señal secretoria" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (una "secuencia secretoria") que, como un componente de un polipéptido más largo, dirige el polipéptido más largo a través de una trayectoria secretoria de una célula en la cual es sintetizada. El polipéptido más largo es comunmente desdoblado para remover el péptido secretorio durante el tránsito a través de la senda secretoria . El término "variante de unión" se usa aquí para denotar formas alternativas de ARN transcrito de un gen. La variación de unión se alcanza naturalmente a través del uso de sitios de unión alternativos con una molécula de ARN trasncrito, o menos comúnmente entre las moléculas de ARN transcritas separadamente, y puede resultar en varios ARNms transcirtos a partir de los mismos genes. Las variantes de unión pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido alterada. El término variante de unión es también usado aquí para denotar una proteína codificada por una variante de unión de un ARNm transcrito a partir de un gen. Los pesos y longitudes de los polímeros determinados por los métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel), se entenderán como valores aproximados. Cuando tal valor está expresado como "aproximado" X o "aproximadamente" X, el valor declarado de X será entendido como exacto hasta +_ 10%. La presente invención está basada en parte, en el descubrimiento de una nueva proteína que tiene regiones de homología a los elementos de la familia de timopoietina-emerina de las proteínas de la membrana nuclear. Esta proteína se ha designado como "ZTMPO-l". La secuencia de nucleótido ZTMPO-l humana está representada en la SEC ID NO:l y la secuencia de aminoácido deducida en la SEC ID NO: 2. Las proteínas ZTMPO-l y los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la presente invención fueron inícialmente identificados por la interrogación de una base de datos EST (Etiqueta de Secuencia Expresada) para las secuencias homologas a los movimientos conservados dentro de la familia timopoietina. La ZTMPO-l como se representó en la SEC ID N0:1, es como un polinucleótido de 2,754 bp, los cuales tiene una estructura lectora abierta que codifica una proteína de 876 residuos de aminoácidos. El análisis de secuencia de la secuencia de aminoácido deducida como se representa en la SEC ID NO:2, no indica la presencia de una secuencia de señal de secreción o dominio de la transmembrana. Existe una región putativa como la ancirina, de residuos 333-385 de los aminoácidos de la SEC ID N0:2, que tienen una repetición ancirina (residuos 347-379 de la SEC ID NO : 2 ) , los cuales pueden indicar que la ZTMPO-l es retenida en la membrana del plasma. Las repeticiones de ancirina han sido descritas como un movimiento de 33 aminoácidos, usualmente encontrados en los órdenes o formaciones una tras otra de cuatro a siete copias, que median las interacciones de la proteína (Michaely and Bennett, J. Biol. Chem. 268 : 22703-9, 1993) . Las repeticiones ancirina han sido reportadas en numerosas proteínas en las especies de bacterias hasta en el hombre (Sentenac et al., Science 256:663-5, 1992; Zhang et al., Plant Cell 4_:1575-88, 1992; Gustine et al., Plant Physiol. 108 : 1748, 1995; Andrews and Herskowitz, Nature 342: 830-3, 1989; Warton et al., Cell 43:567-81, 1995 y Yochem and Greenwald, Cell 58 : 53-63, 1989. Las repeticiones ancirina han sido propuestas como un movimiento de enlace de la proteína generalizado, una función de las repeticiones ancirina es servir como adaptadores, asociándose con las proteínas de la membrana y esqueleto citoplasmático a base de espectrina. La ancirina es usada como un sitio de unión de membrana en neuronas y puede proporcionar un mecanismo de transporte a través de las vesículas secretorias. La etiqueta C-terminal de ZTMPO-l es una región como la proteína de enlace al calcio que tiende dos sitios de enlaces al calcio potenciales (residuos 678-692 y residuos 719-731 de la SEC ID NO:2), similares a aquellos que se observan en la proteína de enlace al calcio del erizo de mar LPS1-beta (Xiang et al., J. Biol. Chem. 16: 10524-33, 1991) . El polinucleótido ZTMPO-l de la SEC ID NO : 1 codifica una proteína de residuos de 876 aminoácidos, la cual es mucho más larga que los otros miembros de la familia timopoiet ina/emerina . La timopoietina humana a es una proteína de 693 residuos de aminoácidos, la emerina humana es una proteína de 354 residuos de aminoácidos y la LAP2 de rata es una proteína de 452 residuos de aminoácidos . Como la emerina, la secuencia de aminoácido de ZTMPO-l no contiene el péptido de timopoietina de 42 aminoácidos, originalmente identificados por Goldstein (Nature 247 : 11-14, 1974), pero portan regiones discretas de homología con las timopoietinas humanas a, ß y ? (Harris et al., ibid. , Genbank Accession Nos. a (U09086), ß (UO9087) y ? (UO9088)) y las timopoietinas de ratón a, ß, ?, e, d, y ? (Berger et al., ibid. , Genbank Accession Nos. a (U39078), ß U3.9074, ? (U39077), e (U39074), 6 (U39076) y ? (U39073)) . En particular, sobre la región definida por los residuos de aminoácidos 13 a 14 de la SEC ID NO:2, el ZTMPO-l porta el 50% de la identidad de aminoácidos con las regiones correspondientes de las timopoietinas de ratón y humana y 30% con la emerina humana. En particular, la región definida por los residuos de aminoácidos 30-44 de la SEC ID NO : 2 es altamente conservada entre las proteínas, véase Figura. Como podrá esperarse, el ZTMPO-l también porta regiones de homología con la proteína 2, LAP2, asociada con la lámina de rata (Furukawa et al., ibid, Genbank Accesión No, U18314) . Estas regiones corresponden a muchas de las mismas regiones con las cuales el ZTMPO-l porta identidad con las timopoietinas. Las ZTMP0--1 y LAP2 de rata, portan 70% de identidad de aminoácido sobre la región correspondiente a los residuos de aminoácidos 13 a 44 de la SEC ID NO : 2. El ZTMPO-l también porta un grado limitado de homología con las regiones de la subunidad del factor IIF alfa de transcripción de la levadura, sobre la región correspondiente a los residuos de aminoácidos 86 a 160 y residuos de aminoácidos 205 a 260 de la SEC ID NO : 2. Adicionalmente, la ZTMPO-l porta el 27% de la identidad de aminoácidos con la ribonucleasa Hl de Tripanosoma brucei (Hesslein and Campbell, Mol . Biochem. Parasitol. 8_6: 121-6, 1997, Genbank Accesión No. U74470) sobre la región correspondiente a los residuos de aminoácidos 156 a 203 de la SEC ID NO : 2. Esta homología, junto con aquella que porta con LAP2, así como también la posible repetición ancirina, sugieren la posibilidad de que el ZTMPO-l posee propiedades enlazantes al ADN o a la cromatina. Aquellos expertos en la técnica, reconocerán que estos límites del domino son aproximados, y están basados en las alineaciones con proteínas conocidas y las predicciones de los pliegues de las proteínas. El análisis del Manchado Northern de varios tejidos humanos se realizó usando una sonda de ADN humano de 218 bp (SEC ID NO : 8 ) . Un transcripto de 3.2 y 5 kb correspondiente a la ZTMPO-l fueron expresados ubicuitamente con el nivel más alto estando en el tejido de los testículos. Los patrones de expresión ubicuita similar fueron también reportados para las timopoietinas y la emerina (Harris et al., ibid . Y Small et al., ibid. ) . Los resultados de localización cromosomal muestran que el ZTMPO-l mapea el 636.18 cR_3000 de la parte superior del grupo de enlace al cromosoma humano 12 en el mapa híbrido por radiación WICGR. Los marcadores del sistema proximal fueron D12S367. El uso de posiciones marcadoras redondean o circundan al ZTMPO-l en la región 12q24.33 en el mapa del cromosoma 12 LBD integrado. Entre los genes que mapean al rededor de esta región están el factor 1 de crecimiento como la insulina, el cual está involucrado en el crecimiento y desarrollo; la hormona de concentración de melanina, un neuropéptido asociado con las conductas asociadas con las metas y de excitación general (Nahon et al., Genomics 12 : 846-8, 1992); atrofia muscular espinal, una atrofia muscular no progresiva que involucra principalmente las extremidades inferiores (van Ravenswaaij, et al., Am. J. Hum.

Genet . 61 (supp.): A299, 1997); atrofia muscular espinal 4 (Timmerman, et al., Hum. Molec. Genet. 5_: 1065-9, 1996) y cadenas ligeras regulatorias de la miosina las cuales están involucradas en la regulación de la actividad de ATPase de la miosina en el músculo liso (Macera, et al., Genomics 13 : 829-31, 1992) . La timopoietina mapea el cromosoma 12q22. (Harris et al., ibid) . Las secuencias de nucleótidos que codifican regiones de los residuos de aminoácidos conservados entre ZTMPO-l y proteínas nucleares, tales como las timopoietinas, LAP2 y emerina, por ejemplo, la región entre los nucleótidos 163 y 258 de la SEC ID NO : 1 , en particular la región entre los nucleótidos 214 y 258 de la SEC ID NO : 1 , pueden ser usadas como una herramienta para identificar nuevos miembros de la familia. Por ejemplo, la reacción de cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT_PCR) , puede ser usada para amplificar secuencias codificando estas regiones conservadas a partir del ARN obtenido de una variedad de fuentes de tejidos o líneas celulares. En particular, los cebadores altamente degenerados designados a partir de la secuencias ZTMPO-l son empleados para este propósito. La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, que incluyen las moléculas de ADN y ARN, que codifican a los polipéptidos ZTMPO-l descritos aquí. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, la variación de secuencia considerable es posible entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEC ID NO : 5 es una secuencia de ADN degenerada que abarca todos los ADNs que codifican al polipéptido ZTMPO-l de la SEC ID NO : 2. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEC ID NO: 5 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican a la SEC ID NO : 2 mediante la substitución de U (uracilo) por T (tiamina) . Así, los polinucleótidos que codifican al polipéptido ZTMPO-l, comprenden el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2628 de la SEC ID NO : 5 y sus equivalentes ARN están contemplados por la presente invención. La Tabla 1 expone los códigos de una letra usados con la SEC ID NO: 5, para denotar posiciones de nucleótidos degenerados. "Resoluciones" son los nucleótidos denotados por una letra código. "Complemento de Nucleótido", indica el código para el nucleótido (s) complementario. Por ejemplo, el código Y denota ya sea C (citosina) o T, y su complemento R denota A (adenosina) o G (guanina), A es complementario a T, y G es complementario a C.

TABLA 1 Código base Resoluciones Código base Complemento de nucleótido A A T T C C G G G G C C T T A A R A|G Y C|T Y C|T R A|G M A|C K G|T K G[T M A|C S C|G S C|G w A|T W A|T H A|C| T D A|G| T B C| G I T V A|C|G V AIC|G B C | G 1 T D A|G|T H A| C | T N AICIGIT N AICI GIT TABLA 2 Código de Código de Codon fres una Codones Sinónimos Degenerado letras letra Cys C TTGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAÁ CAG CAR Kis H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys AAA AAG AR Met H ATG ATG lie I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT pA pG YTN Val V GTA GTC GTG Gp GTN Phe F TTC Tp TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp TGG TGG Ter • TAA TAG TGA TRR Asn | Asp B RAY Glu|Gln Z SAR Cualquiera X NNN Un ordinario experto en la técnica apreciará que alguna ambiguidad es introducida en la determinación de un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codon degenerado para serina (WSN) puede en algunas circunstancias, codificar la arginina (ARG), y codón degenerado para arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar a la serina (AGY) . Existe una relación similar entre los codones que codifican a fenilalanina y leucina. Así, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero un ordinario experto en la técnica puede fácilmente, identificar tales secuencias variantes mediante la referencia a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 2. Las secuencias variantes pueden ser fácilmente probadas por su funcionalidad como se describe aquí. Un ordinario experto en la técnica apreciará también que las especies diferentes pueden presentar "empleo de codon preferencial". En general, véase Grantham et al., Nuc. Acids. Res., 8^:1893-912, 1980; Haas, et al., Curr. Biol. , _6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene, 13:355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene, l_8:199-209, 1982; Holm, Nuc . Acids Res . , l_4:3075-87, 1986; Ike ura, J. Mol. Biol., 158 : 573-97, 1982. Como se usó aquí, el término "empleo de codon diferencial" o "codones preferenciales" son un término de técnica que se refiere a los codones de traducción de la proteína que son más frecuentemente usados en las células de unas ciertas especies, favoreciendo así, uno o unos cuantos representativos de los codones posibles que codifican a cada aminoácido (Véase Tabla 2) . Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en las células de mamíferos, el ACC es el codón más comúnmente usado; en otras especies, por ejemplo, pueden ser preferencial codones Thr diferentes de células de insectos, levaduras, virus o bacterias. Los codones preferenciales para unas especies particulares pueden ser introducidos en. los polinucleótidos de la presente invención por una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales en el ADN recombinante puede, por ejemplo, incrementar la producción de la proteína mediante la elaboración de la traducción de la proteína más eficiente dentro de un tipo de célula o especie particular. Por lo tanto, la secuencia de codon degenerado, descrita en la SEC ID NO: 5, sirve como un patrón para optimizar la expresión de los polinucleótidos en varios tipos y especies celulares comúnmente usados en la técnica y descritos aquí. Las secuencias que contiene los codones preferenciales pueden ser probadas y optimizadas para la expresión en varias especies, y probadas por su funcionalidad como se describe aquí . La presente invención también proporciona fragmentos de polipéptidos o péptidos que comprenden una porción que porta un epitope de un polipéptido ZTMPO-l descrito aquí. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender un "epitope inmunogénico", el cual es una parte de una proteína que estimula una respuesta anticuerpo cuando la proteína completa es usada como un inmunógeno. Los péptidos que portan epitopes inmunogénicos pueden ser identificados usando métodos estándares (véase por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81 : 3998, 1983) . En contraste, los fragmentos de polipéptidos o péptidos pueden comprender un "epitope antigénico", el cual es una región de una molécula de proteína a la cual un anticuerpo puede específicamente enlazarse. Ciertos epitopes consisten de una extensión lineal o contigua de aminoácidos, y la antigenicidad de tal epítope no está interrumpida por los agentes desnaturalizantes. Se sabe en la técnica que péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar o son epitopes imicos de una proteína, pueden ser usados para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science 219: 660, 1983) . En consecuencia, los péptidos que portan epítopes antigénicas y polipéptidos de la presente invención, son empleados para alcanzar anticuerpos que se enlazan con los polipéptidos descritos aquí. Los péptidos que portan epitopes antigénicas y los polipéptidos, preferiblemente contienen al menos, de cuatro a diez aminoácidos, al menos, de diez a quince aminoácidos, o aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de la SEC ID NO : 2. Tales péptidos que portan epitopes y polipéptidos, pueden ser producidos mediante la fragmentación de un polipéptido ZTMPO-1, o por síntesis peptídica química, como se describe aquí. Sin embargo, los epítopes pueden ser seleccionados por la exposición del fago de las biliotecas peptídicas aleatorias (véase por ejemplo, Lañe and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5_:268, 1993, y Córtese et al., Curr. Opin. Biotechnol 7^:616, 1996) . Se describen los métodos estándares para la identificación de epitopes y que producen anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epitope, por ejemplo, por Mole, "Epitope Mapping" in Methodos in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price "Production and Characterization of Synthetic Peptide Derived Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et a l . (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1 - 9.3.5 y páginas 9.4.1 - 9.4.11' (John Wiley & Sons 1997). Los sitios antigénicos potenciales en ZTMPO-l pueden ser identificados usando el método Jameson-Wolf (Jameson and Wolf, CABIOS 4_:181, 1988), como los implementados por el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, Wl). El método Jameson-Wolf predice las determinantes antigénicas potenciales mediante la combinación de seis subrutinas mayores para la predicción estructural de la proteína. Brevemente, el método Hopp-Woods (Hopp et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7_8_:3824, 1981), es usado primero para identificar secuencias de aminoácidos que representan áreas de hidrofilicidad local más grandes (parámetros: siete residuos promediados) . En la segunda etapa, el método Emini (Emini et al., J. Virology 5J5:836, 1985), es usado para calcular las probalidades de superficies (parámetro: umbral de decisión de superficie (0.6) = 1) . Tercero, el método Karplus-Schultz, (Karpluz and Schultz, Naturwissenchaften 72:212, 1985), es usado para predecir la flexibilidad de la estructura de la cadena (parámetro: umbral de flexibilidad (0.2) 1) . En la cuarta y quinta etapas de los análisis, las predicciones de la estructura secundaria son aplicadas a los datos usando los métodos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", en Prediction of Protein Structure and the Principies of Protein Conformat ion, Fasman (ed.), páginas 549-586 (Plenum Press 1990), y Garnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97, 1978 (parámetros Chou-Fasman: tabla de conformación = 64 proteínas; un umbral de región = 103; umbral de región b = 105; parámetros Garnier-Robson: constantes de decisión a y b = 0) . En la sexta subrutina, los parámetros de flexibilidad y factores de hidropatía/accesibilidad de solvente, son combinados para determinar un valor contador de superficie, designado como el "índice antigénico". Finalmente, una función de amplitud de pico es aplicada al índice antigénico, el cual amplia los picos de mayor superficie por la adición de 20, 40, 60 o 80% del valor del pico respectivo al conteo por la energía libre adicional derivada a partir de la movilidad de las regiones de superficies relativas a las regiones interiores. A pesar de la secuencia de nucleótido particular de un gen ZTMPO-l variante, el gen codifica un polipéptido que se caracteriza por su síntesis de glicoproteína o actividad de interacción célula-célula, o por la capacidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-ZTMPO-l. Más específicamente, los genes ZTMPO-l de la variante codifican polipéptidos los cuales presentan al menos, 50%, y preferibleme tne mayor de 70, 80 o 90% de la actividad del polipéptido codificado por el gen ZTMPO-l humano descrito aquí. Para cualquier polipéptido ZTMPO-l, incluyendo variantes y proteínas de fusión, un ordinario experto en la técnica puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótidos degenerado completamente, que codifica tal variante usando la información presentada en las Tablas 1 y 2 anteriormente. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica pueden usar software estándar para divisar variantes de ZTMPO-l basadas en las secuencias de nucleótido y aminoácido descritas aquí. En consecuencia, la presente invención incluye un medio legible por computadora codificado con una estructura de datos que proporciona al menos una de las siguientes secuencias: SEC ID NO:l, SEC ID NO:2 o SEC ID NO : 5. Formas adecuadas de medios legibles por computadora incluyen, medios magnéticos y medios ópticamente legibles. Los ejemplos de medios magnéticos incluyen un drive duro o fijo, un chip de memoria de acceso aleatorio (RAM) , un disco duro, cinta lineal digital (DLT), un caché de disco, y un disco ZIP. El medio ópticamente legible está ejemplificado por discos compactos (por ejemplo, memoria solo para leer CD (ROM) , CD-reescribible (RW) , y CD-grabable) , y discos versátiles/video digitales (DVD) (por ejemplo, DVD-ROM, DVD-RAM, y DVD+RW) .

Dentro de las modalidades preferidas de la invención, los polinucleótidos aislados pueden hibridizar bajo condiciones rigurosas a los polinucleótidos que tienen la. secuencia de nucleótido de la SEC ID NO : 1 o a las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótido complementaria a la SEC ID N0:1. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan por ser aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión termal (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definido. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definido) a la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente igualada. Un par de moléculas de ácido nucleico, tal como ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN, pueden hibridizarse si las secuencias de nucleótidos tienen algún grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares base desiguales en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido es influenciada por el grado de igualdad. La Tm del híbrido desigual disminuye por 1°C por cada 1-1.5% de desigualación de pares base. Variando la rigurosidad o rigurosidad de las condiciones de hibridación se permite el control sobre el grado de desigualdad que estará presente en el híbrido. El grado de rigurosidad se incrementa conforme la temperatura de hibridación se incrementa y la extensión iónica del amortiguador de hibridación se incrementa. Las condiciones de hibridación rigurosas abarcan temperaturas de aproximadamente 5-25°C por debajo de la Tm del híbrido y un amortiguador de hibridación que tiene hasta 1 M de Na" Los grados superiores de rigurosidad temperaturas inferiores se pueden alcanzar con la adición de formamida la cual reduce la Tm del híbrido aproximadamente 1°C por cada 1% de formamida en la solución amortiguadora. De manera general, tales condiciones rigurosas incluyen temperaturas de 20-70°C y un amortiguador de hibridación que contiene hasta 6xSSC y 0-50% de formamida. Un grado superior de rigurosidad puede alcanzarse a temperaturas desde 40-70°C con un amortiguador de hibridación que tiene hasta 4xSSC y desde 0-50% de formamida. Las condiciones altamente rigurosas típicamente abarcan temperaturas de 42-70°C con un amortiguador de hibridación que tiene hasta lxSSC y 0-50% de formamida. Los diferentes grados de rigurosidad pueden ser usados durante, la hibridación y el lavado para alcanzar el enlace específico máximo a la secuencia objetivo. Típicamente, los lavados después de la hibridación se realizan a grados incrementados de rigurosidad para remover las sondas de polinucleótidos no hibridizados a partir de complejos hibridizados. Las condiciones anteriores se sugieren para servir como una guía y están también dentro de las habilidades de un experto en la técnica para adaptar estas condiciones para usarse con un híbrido polipéptido particular. La Tm para una secuencia objetivo específica es la temperatura (bajo condiciones definidas) a la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridizará a una secuencia de sonda perfectamente igualada. Aquellas condiciones las cuales influencian la Tm incluyen, el tamaño y el contenido de pares bases . de la sonda de polinucleótidos, la fuerza iónica de la solución de hibridación, y la presencia de los agentes de desestabilización en la solución de hibridización. Las ecuaciones numerosas para el cálculo de Tm se conocen en la técnica, y son específicas para ADN, ARN, e híbridos de ADN-ARN y secuencias de sondas de polinucleótidos de longitud variantes (véase por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al . , (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2_6:227 (1990). El software de análisis de la secuencia, tal como OLIGO 6-0 (LRS; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) , así como también sitios en el Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular la Tm basada en el criterio definido del usuario. Tales programas pueden también analizar una secuencia dada bajo condiciones defindas e identificar secuencias de sonda adecuadas. Típicamente, la hibridación de las secuencias de polinucleótidos más largas, >50 pares base, se realiza a temperaturas de aproximadamente 20-25°C por debajo de la Tm calculada. Para sondas más pequeñas, <50 pares base, la hibridación se realiza típicamente al Tm o por debajo de 5-10°C. Esto permite la proporción máxima de hibridación para los híbridos ADN-ADN y ADN-ARN. La longitud de la secuencia de polinucleótido influencia la relación y estabilidad de la formación híbrida. Las secuencias de sondas más pequeñas, <50 pares base, alcanzan el equilibrio con las secuencias complementaria rápidamente, pero pueden formar menos híbridos estables. Los tiempos de incubación de cualquiera de minutos a horas, pueden ser usados para alcanzar la formación híbrida. Las secuencias de la sonda más largas llegan al equilibrio más lentamente; pero forman complejos más estables aún a temperaturas más bajas. Las incubaciones están típicamente permitidas para proceder durante la noche o permanecer. De manera general, las incubaciones se llevan a cabo por un periodo igual a tres veces el tiempo Cot calculado. El tiempo Cot, es el tiempo que se toma para reasociar las secuencias de polinucleótidos, puede ser calculado por una secuencia particular por métodos conocidos en la técnica. La composición de pares base de la secuencia de polinucleótidos efectuará la estabilidad termal del complejo híbrido, con ello, influenciará la selección de la temperatura de hibridación y la fuerza iónica del amortiguador de hibridación. Los pares A-T son menos estables que los pares G-C en soluciones acuosas que contienen cloruro de sodio. Por lo tanto, si el contenido G-C es más alto, el híbrido es más estable. Aún la distribución de los residuos G y C dentro de la secuencia también contribuyen positivamente a la estabilidad del híbrido. Además, la composición de pares bases puede ser manipulada para alterar la Tm de una secuencia dada. Por ejemplo, la 5- etildesoxicitidina puede ser substituida por desoxicitidina y la 5-bromodesoxiuridina puede ser substituida por timidina para incrementar la Tm mientras el 7-deazz-2 ' -desoxiguanosina pueden ser substituido por guanosina para reducir la dependencia a la Tm. La concentración iónica del amortiguador de hibridación también afecta la estabilidad del híbrido. Los amortiguadores de hibridación contienen de manera general, agentes bloqueadores tales como la solución de Denhardt (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo . ) , el ADN desnaturalizado de esperma de salmón, tARN, leche en polvo (BLOTTO) , heparina o SDS, y una fuente de Na+, tal como SSC (IX SSC: 0.15 M de cloruro de sodio, 15 mM de citrato de sodio) o SSPE (lx SSPE: 1.8 M de NaCl, 10 mM de NaH2P0 , 1 mM de EDTA, pH 7.7). Mediante la disminución de la concentración iónica del amortiguador, la estabilidad del híbrido se incrementa. Típicamente, los amortiguadores de hibridación contienen de entre 10 mM - 1 M Na+. La adición de agentes de desestabilización o desnaturalización tal como formamida, sales de tetralquilamonio, cationes de guanidinio o cationes de tiocianato hasta la solución de hibridación, alterarán la Tm de un híbrido. Típicamente, se usa la formamida en una concentración de hasta 50% para permitir incubaciones llevadas a cabo a temperaturas más bajas y más convenientes. La formamida también actúa para reducir los antecedentes no específicos cuando se usan las sondas de ARN. Como una ilustración, un polinucleótido que codifica un polipéptido variante ZTMPO-l puede ser hibridizado con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO : 1 (o su complemento) a 42°C durante la noche en una solución que comprende formamida al 50%, 5xSSC (lxSSC: 0.15 M de cloruro de sodio y 15 mM de citrato de sodio) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución 5x de Denhardt (solución Denhardt lOOx: 2% (p/v) Ficoll 400, 2% (p/v) polivinilpirrolidona y 2% (p/v) de albúmina de suero bovino), sulfato de dextrano 10%, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón recortado, desnaturalizado. Un experto en la técnica puede divisar variaciones de estas condiciones de hibridación. Por ejemplo, la mezcla de hibridación puede ser incubada a una temperatura superior o inferior, tal como aproximadamente 65°C en una solución que no contiene formamida. Sin embargo, las soluciones de hibridación premezcladas están disponibles [por ej empl o , Solución de Hibridación EXPRESSHYB de CLONTECH Laboratories, Inc.), y la hibridación puede ser realizada de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de la hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden ser lavadas para remover las moléculas de ácido nucleico no hibridizadas bajo condiciones rigurosas, o bajo condiciones altamente rigurosas. Las condiciones de lavado rigurosas típicas incluyen el lavado en una solución de 0.5x-2x SSC con 0.1% de sulfato dodecilo de sodio (SDS) a 55-65°C. Esto es, las moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido ZTMPO-l variante hibridizan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótido de la SEC ID NO : 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado rigurosas, en el cual la rigurosidad de lavado es equivalente a 0.5x-2x SSC con 0.1% SDS a 50-65°C, incluyendo 0.5x SSC con 0.1% SDS a 55°C, o 2x SSC con 0.1% SDS a 65°C. Un experto en la técnica puede fácilmente divisar condiciones equivalentes, por ejemplo, mediante la substitución SSPE para SSC en la solución lavada. Típicamente, las condiciones de lavado altamente rigurosas incluyen el lavado en una solución de 0.1x-0.2x SSC con 0.1% de sulfato dodecilo de sodio (SDS) a 50-65°C. En otras palabras, los polinucleótidos que codifican un polipéptido ZTMPO-l variante, hibridizan con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleódios SEC ID NO : 1 (o su complemento), bajo condiciones de lavado altamente rigurosas, en las cuales, la rigurosidad es equivalente a 0.1x-0.2x SSC con 0.1% SDS a 50-65°C, incluyendo 0.1 x SSC con 0.1% SDS a 50°C, o 0.2x SSC con 0.1% SDS a 65°C. La presente invención también contempla polipéptidos variantes ZTMPO-l que pueden ser identificados usando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido que codifica con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 2 , y un ensayo de hibridación, como se describe anteriormente. Tales variantes ZTMPO-l incluyen moléculas de ácido nucleico (1) que hibridizan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleotido de la SEC ID NO : 1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado rigurosas, en el cual, la rigurosidad del lavado es equivalente a 0.5x-2x SSC con 0.1% SDS a 50-65°C, y (2) que codifica un polipéptido que tiene al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o mayor que 95% de idnetididad de secuencia a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 2. Alternativamente, las variantes ZTMPO-l pueden caracterizarse como moléculas de ácido nucleico (1) que hibridizan con una molécula de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N0:1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado altamente rigurosas, en el cual, el lavado de rigurosidad es equivalente a 0.1x0.2x SSC con 0.1% de SDS a 50-65°C, y (2) que codifica un polipéptido que tiene al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o mayor que 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 2. Como se notó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para la preparación de ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN es aislado a partir de una célula o tejido que produce grandes cantidades de ARN ZTMPO-1. Tales tejidos y células están identificados por los manchados de Northern (Thomas, Proc . Nati . Acad. Sci. USA 7_7:5201, 1980), una fuente ejemplar es el tejido del testículo humano. El ARN total puede prepararse usando la extracción de HCl guanidina seguida por el aislamiento mediante centrifugación en un gradiente CsCl (Chirg in et al., Biochemistry !L8_:52-94, 1979) . El Poli (A) + ARN se prepara a partir del ARN total usando el método de Aviv y Leder (Proc. Nati. Acad. Sci. USA ^9:1408-12, 1972). El ADN complementario (ADNc) se prepara de poli (A) + ARN usando métodos conocidos. En la alternativa, el ADN genómico puede ser aislado. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos ZTMPO-l son entonces identificados y asilados mediante, por ejemplo, hibridación o PCR. Los polinucleótidos de la presente invención pueden también ser sintetizados usando técnicas ampliamente conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Applications of Recombinant ADN, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53 : 323-56, 1984 y Cumien et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 82:633-7, 1990. La presente invención además proporciona contrapartes de polipéptidos y polinucleótidos de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, pero no están limitadas a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. De interés particular son los polipéptidos ZTMPO-l de otras especies de mamíferos, que incluyen murina, porcina, ovina, bovina, canina, felina, equina y otros polipéptidos primates. Los ortólogos de ZTMPO-l humano pueden ser clonados usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con técnicas de clonación convencional. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado usando ARNm obtenido a partir de un tipo de tejido o célula que expresa el ZTMPO-l como se describe aquí. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden ser identificadas mediante los manchados Northern ensayando con sondas designadas de las secuencias descritas aquí. Una biblioteca es entonces preparada de ARNm de una línea celular o tejido positivo. Un ADNc que codifica al ZTMPO-l puede entonces ser aislado por una variedad de métodos, tal como por el sondeo con un ADNc humano parcial o completo o con una o más series de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADNc puede también ser clonado usando la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullís, Patente Norteamericana No. 4,683,202), usando cebadores designados de la secuencia ZTMPO-l humana representativa descrita aquí. Dentro de un método adicional, la biblioteca ADNc puede ser usada para transformar o transfectar las células huéspedes, y la expresión del ADNc de interés puede ser detectada con un anticuerpo al polipéptido ZTMPO-l. Las técnicas similares pueden también ser aplicadas al aislamiento de los clones genómicos. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEC ID NO : 1 representa un alelo único de ZTMPO-l humano y se espera que ocurra tal variación alélica y uniones alternativas. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas mediante el ADNc de sondeo o las bibliotecas genómicas a partir de individuos diferentes de conformidad con los procedimientos estándares. Las variantes alélicas de la secuencia del ADN mostradas en la SEC ID NO : 2 , incluyendo aquellas que contienen mutaciones silentes y aquellas en las cuales las mutaciones resultan en los cambios de la secuencia de aminoácido, están dentro del ámbito de la presente invención, como son las proteínas las cuales son variantes alélicas de la SEC ID NO: 2. El ADNcs degenerado a partir de los ARNms alternativamente unidos, los cuales retienen las propiedades del polipéptido ZTMPO-l, están incluidos dentro del ámbito de la presente invención, como son los polipéptidos que condifican para tales ADNcs y ARNms. Las variantes alélicas y variantes de unión de estas secuencias pueden ser clonadas mediante el sondeo de ADNc o genoteas de diferentes individuos o tejidos de conformidad con los procedimientos estándares conocidos en la técnica. La presente invención también proporciona polipéptidos ZTMPO-l aislados que son substancialmente homólogos a los polipéptidos de la SEC ID NO:2 y sus ortólogos. El término "substanciamente homólogo" se usa aquí para denotar polipéptidos que tiene 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente al menos, 80% de identidad de secuencia a las secuencias mostradas en la SEC ID N0:2 o sus ortólogos. Tales polipéptidos, serán más preferiblemente al menos 90% idénticos y más preferiblemente 95% o más idénticos a la SEC ID NO:2 o sus ortólogos) . El porcentaje de identidad de la secuencia está determinado por los métodos convencionales. Véase por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Biol. 48 : 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-9, 1992. La presente invención además incluye moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad se describen más abajo. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos son alineadas para optimizar los registros de alineación usando una falta de apertura gap de 10, una falta de extensión gap de 1, y la matriz de registro "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (ibid. ) , como se muestra en la Tabla 3 (los aminoácidos están indicados por los códigos estándares de una letra) . El porcentaje de identidad entonces es calculado como: Número total de pares idénticos x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de gaps (aberturas) introducidas en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias I-» -* o en o Ul Tabla 3 R N D C Q E O H I L K. M F P S T Y V A A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 ¿3 -3 •3 9 Q -1 1 0 0 •3 5 E -1 0 0' 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 •3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 o" -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 1 5 F -2 -3 -3 -3 •2 •3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 P J-l -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T o -1 0 -1 -1 -1 -1 -2" -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 Aquellos expertos en la técnica apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineación de la proteína adecuado para examinar el nivel de identidad portado por una secuencia de aminoácido descrita aquí y la secuecia de aminoácido de una variante putativa de ZTMPO-l. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 8_5:2444, 1988, y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63, 1990. Brevemente, el FASTA primero caracteriza la similitud de la secuencia mediante la identificación de las regiones portadas por la secuencia de interrogación (por ejemplo SEC ID NO : 2 ) , y una secuencia de prueba que tiene ya sea la densidad más alta de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin la consideración de las substituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos conservativos. Las diez regiones con la densidad más alta de identidades son entonces re-registradas por la comparación de la similitud de todos los aminoácidos apareados usando una matriz de substitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones son "ordenados" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen al registro más alto. Si existen varias regiones con registros más grandes que el valor "cutoff" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup) , después las regiones iniciales ordenadas son examinadas para determinar si las regiones pueden ser unidas para formar una alineación aproximada con gaps o ranuras. Finalmente, las regiones de registro más altas de las dos secuencias de aminoácidos están alineadas usando una modificación del algoritmo Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J . Mol . Biol . 48:444, 1970; Sellers, SIAM, J. App . Math. 26:787, 1974), el cual permite las inserciones y supresiones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=l, falta de apertura gap=10, falta de extensión gap=l, y matriz de substitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden ser introducidos en un programa FASTA por la modificación del archivo de matriz de registro ("SMATRIX") , como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol 183:63, 1990. El FAST puede también ser usado para determinar la identidad de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico usando una relación como se describe anteriormente. Para las comparaciones de la secuencia de nucleótidos, el valor ktup puede variar entre uno a seis, preferiblemente de cuatro a seis. Las proteínas substancialmente homologas y polipéptidos están caracterizados por tener una o más substituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, que son substituciones conservativas de aminoáciods y otras substituciones que no afectan significantemente el desdoblamiento o actividad de la proteína o polipéptido; supresiones menores, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxil-terminal menores, tal como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad que pueden además conmprender un sitio de desdoblamiento proteolítico entre el polipéptido zsig37 y la etiqueta de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen los sitios de desdoblamiento de trombina y los sitios de desdoblamiento del factor Xa. La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una o más "substituciones de aminoácido conservativos", comparadas con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 2. Las substituciones de aminoácidos conservativos pueden basarse en las propiedades químicas de los aminoácidos. Esto es, las variantes pueden ser obtenidas conteniendo una o más substituciones de aminoácidos de la SEC ID NO : 2 , en la cual un alquilo aminoácido es substituido por un alquilo aminoácido en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l, un aminoácido aromático es substituido por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l, un aminoácido que contiene azufre es substituido por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l, un aminoácido que contiene hidroxi es substituido por un aminoácido que contiene hidroxi en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l, un aminoácido acídico es substituido por un aminoácido acídico en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l, un aminoácido básico es substituido por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l, o un aminoácido monocarboxí lico dibásico es substituido por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácido ZTMPO-l. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "substitución conservativa de aminoácido" es ilustrada por una substitución entre los aminoácidos con cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptofano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. Se proporcionan otras substituciones conservativas de aminoácido en la Tabla 4.

Tabla 4 Substituciones conservativas de aminoácidos Básicas : Arginina Lisina Histidina Acídica; Acido glutámico Ácido aspártico Polar Glutamina Asparagina Hidrófobas Leucina Isoleucina Valina Aromática Fenilalanina Triptofano Tirosina Pequeña Glicina Alanina Serina Treonina Metionina La tabla BLOSUM62 es una matriz de substitución de aminoácido derivada desde aproximadamente 2,000 alineaciones múltiples locales de los segmentos de la secuencia de la proteína, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc . Nati . Acad. Sci. USA 8_9:10915, 1992). En consecuencia, las frecuencias de substitución BLOSUM62 pueden ser usadas para definir las substituciones conservativas de aminoácidos que pueden ser introducidas en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible designar substituciones de aminoácidos basadas solamente en las propiedades químicas (como se discute anteriormente), el lenguaje "substitución conservativa de aminoácido" preferiblemente se refiere a una substitución representada por un valor BLOSUM62 mayor de -1. Por ejemplo, una substitución de aminoácido es conservativa si la substitución se caracteriza por un valor BL0SUM62 de 0, 1, 2 o 3. De conformidad con este sistema, las substituciones preferidas conservativas de aminoácidos se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo 1, 2 o 3), muentras las substituciones conervativas más preferidas de aminoácidos se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo 2 o 3) . Los cambios de aminoácido conservativos en un gen ZTMPO-l pueden introducirse por los nucleótidos de substitución para los nucleótidos recitados en la SEC ID NO : 1. Se pueden obtener tales variantes de "aminoácidos conservativos", por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido, mutagénesis de exploración del ligador, mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa, y similares (véase Ausuble (1995) en las páginas 8-10 hasta 8-22; y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)) . La habilidad de tales variantes para promover la proliferación y las funciones cardiacas como serán otras propiedades de la proteína de tipo silvestre, pueden ser determinadas usando métodos estándares, tales como los ensayos descritos aquí. Alternativamente, un polipéptido ZTMPO-l variante puede ser identificado por la habilidad para enlazar específicamente anticuerpos ant i-ZTMPO-1. Las proteínas de la presente invención pueden también comprender residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente. Los aminoácidos que no se originan naturalmente incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, c?s-4-hidroxiprolina, trans- 4 -hidroxiprolina, N-met il-glicina, alio- treonina, metiltreonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietilhomo cisteína, ni tro- glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3 , 3-dimet ilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenil-alanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina . Se conocen varios métodos en la técnica para la incorporación de residuos de aminoácidos que no se orginan naturalmente en las proteínas. Por ejemplo, un sistema i n vi tro puede ser empleado cuando las mutaciones no sentido se suprimen usando el tARNs de supresión químicamente aminoacilado . Los métodos para sintetizar aminoácidos y tARN aminoacilante-s se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de los plasmidos que contienen mutaciones no sentido se llevan a cabo en un sistema libre de células que comprenden un extracto E . coli S30 y sistemas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113 : 2722, 1991; Ell an et al., Methods Enzymol. 202 : 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; y Chung et al., Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 9_0:10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus por los microinj ertos de ARNm mutados y supresores químicamente aminoacilados tARNs (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271 : 19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, las células E . col i son cultivadas en la ausencia de un aminoácido natural que es reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia de aminoácido (s ) deseados que no se originan naturalmente (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina) . El aminoácido que no se origina naturalmente, es incorporado en la proteína en lugar de su contraparte natural. Véase Koide et al., Bichem. 3_3 7470-6, 1994. Los residuos de aminoácidos que se originan naturalmente pueden ser convertidos a especies que no se originan naturalmente por la modificación química in vi tro . La modificación química puede ser combinada con mutagénesis dirigida al sitio para expandir además el rango de substitucioens (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993) . Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que no se originan naturalmente y aminoácidos no naturales pueden ser substituidos por los residuos de aminoácidos ZTMPO-l. Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden ser identificados de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 2_44 : 1081-5, 1989; Bass et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8_8: 4498-502, 1991). En la última técnica, las mutaciones únicas de alanina son introducidas a todos los residuos en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas por su actividad biológica como se describen abajo para identificar residuos de aminoácidos que son críticos a la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271 : 4699-708, 1996. Los sitios de interacción del receptor-ligando pueden también ser determinados por los análisis físicos de estructura, como se determinan por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción del electrón, o etiquetación de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de los aminoácidos de sitio de contacto putativo. Véase por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 244 : 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden también ser inferidas de los análisis de homologías con proteínas que se enlazan a la membrana nuclear relacionada. Las substituciones múltiples de aminoácidos se pueden hacer y probar usando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tal como aquellas descritas por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-7, 1988) o Bowi y Sauer (Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 8_6:2152-6, 1989). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionado por el polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de las substituciones permitibles a cada posición. Otros métodos que pueden ser usados incluyen exposición del fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem 3_0:10832-7, 1991; Ladner et al., Patente Estadounidense No. 5,223,409; Huse, publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al . , Gene 46: 1 5, 1986; Ner et al., ADN 7:127, 1988). Las variantes del ADN ZTMPO-l descritas y las secuencias de polipéptidos pueden ser generadas a través del desordenamiento del ADN como se describe por Stemmer, Nature 370:389-91, 1994 y Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 10747-51, 1994. Brevemente, las variantes ADNs son generadas por recombinación homologa i n vi tro por fragmentación aleatoria de un ADN original, seguida por el reensamblamiento usando PCR, resultando en las mutaciones de punto aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede ser modificada usando una familia de un ADNs original, tal como variantes alélicas o genes a partir de las especies diferentes, para introducir la variabilidad adicional en el proceso. La selección o proyección para la actividad deseada, seguida por las interacciones adicionales de mutagénes y ensayos, proporcionan rápida "evolución" de las secuencias por la selección de mutaciones deseables, mientras simultáneamente se seleccionan contra los cambios perjudiciales . Los métodos de mutagénesis como se describen aqui, pueden ser combinados con métodos de selección automatizado, de alta salida para detectar la acitivad de los polipéptidos mutagenizados, clonados en las células huésped. Los ensayos preferidos en este sentido, incluyen los ensayos de proliferación celular y ensayos de enlace al ligando a base de biosensores, los cuales se describen abajo. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden ser recuperadas a partir de las células huésped y rápidamente secuenciadas usando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importacia de los residuos de aminoácidos individuales en un . polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructuras desconocidas. Usando los métodos discutidos aquí, un ordinario experto en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de fragmentos o variantes de polipéptidos de la SEC ID NO : 2 o que retienen las propieades que se enlazan al receptor de la proteína ZTMPO-l del tipo silvestre. Tales polipéptidos pueden también incluir segmentos polipéptidos adicionales como se describe aquí generalmente. Para cualquier polipéptido ZTMPO-l, que incluye variantes y proteínas de fusión, un ordinario experto en la técnica puede fácilmente generar una secuencia de polinucleótido completamente degenerada que codifica tal variante usando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriores . Como se usó aquí una proteína de fusión consiste esencialmente de una primera porción y una segunda porción unida por un enlace peptídico. En una modalidad, la primer porción consiste de un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que son al menos, 80% idénticas en secuencias de aminoácidos a los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO:2 y la segunda porción es cualquier otro polipéptido. Los otros polipéptidos pueden ser dominios alternativos o adicionales de otros elementos de la familia de las timopoietinas o emerinas, una señal peptídica para facilitar la secreción de la proteína de fusión, etiquetas de afinidad, dominios Ig o similares. Los polipéptidos ZTMPO-l de la presente invención, incluyen polipéptidos de longitud completa, fragmentos biológicamente activos, y polipéptidos de fusión, pueden ser producidos en células huésped genéticamente diseñadas de conformdiad con las técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos de células que pueden ser transformadas o transfectadas con ADN exógeno y crecer en cultivos, e incluyen bacterias, células fúngales y células eucarióticas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para la manipulación de las moléculas de ADN clonadas y la introducción del ADN exógeno en una variedad de células huésped están descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al . , eds . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY 1987. En general, una secuencia de ADN que codifica un polipétpido ZTMPO-l está operablemente ligada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, generalmente incluyendo un promotor y terminador de transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también comúnmente contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que con ciertos sistemas de marcadores seleccionables pueden ser proporcionados en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada por la integración del genoma en la célula huésped. La selección de promtores, terminadores, marcadores selccionables, vectores y otros elementos es un tema de rutina designado con el nivel del experto en la técnica. Muchos elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido ZTMPO-l en la trayectoria secretoria de una célula huésped, una secuencia de señal secretoria (también conocida como una secuencia líder, secuencia de señal, secuencia prepro o secuencia pre (se proporcionan en el vector de expresión. La secuencia de la señal secretoria puede derivarse de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretoria está operablemente ligada a la secuencia ADN ZTMPO-l, es decir, las dos secuencias están unidas en la estructura lectora correcta y colocadas para dirigir el polipéptido nuevamente sintetizado en la trayectoria secretoria de la célula huésped. Las secuencias de señal secretorias son comunmente colocadas en el 5' a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal secretorias pueden ser colocadas de cualquier modo en la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., Patente Norteamericana No. 5,037,743; Holland et al., Patente Estadounidense No. 5,143,830) . Las células de mamíferos cultivadas son huéspedes adecuados dentro de la presente invención. Los métods para introducir el ADN exógeno en las células huéspedes de mamíferos incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14_:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 1_: 603 , 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52^:456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1_: 841-5, 1982) , transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid . , ) , y transfección mediada por el liposoma (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; C?ccarone et al., Focus 15^:80, 1993, y vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7_:980-90; 1989; Wang y Finer, Nature Med. 2^:714-6, 1996) . Se describe la producción de los polipéptidos recombinantes en las células cultivadas de mamíferos, por ejemplo por Levinson et al., Patente Estadounidense No. 4,713,339; Hagen et al., Patente Estadounidense No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente Estadounidense No. 4,579,821; y Ringold, Patente Estadounidense No. 4,656,134. Las células cultivadas de mamíferos adecuadas incluyen la COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No . ' CRL 1632), BHK 570 (ATCC NO. CRL 10314), 293 (ARCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y ovario de Hámster Chino (por ejemplo CHO-Kl; ATCC No. CCL 61) líneas celulares. Las líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en la técnica y están disponibles de depósitos públicos tal como el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. En general, se prefieren los promotores fuertes de la transcripción, tal como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de metalotioneina (Patentes Estadounidenses Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor último mayor de adenovirus. La selección del fármaco es usada generalmente para seleccionar células cultivadas de mamíferos en las cuales el ADN extraño ha sido insertado. Tales células son comúnmente referidas como "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en la presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés en su progenie son referidas como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia de la neomicina al antibiótico. La selección se lleva a cabo en la presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección pueden también ser usados para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo mediante la cultivación de los transfectantes en la presencia de un nivel bajo del agente selectivo y después incrementar la cantidad del agnete selectivo seleccionado para las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificado preferido es la reductasa de dihidrofolato, el cual confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a los fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, acetiltransferasa de la puromicina) pueden también ser usados. Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde, o proteínas de superficie celular tal como CD4, CD8, MHC Clase I, fosfatasa alcalina placental pueden ser usados para distirbuir células transfectadas de células no transfectas por tales medios como FACS de distribución o tecnología de separación de cama magnética.

Otras células eucarióticas superiores pueden también ser usadas como huéspedes, incluyen células de plantas, células de insectos y células de aves. El uso de Agroba c t eri um rhi z ogenes como un vector para expresar genes en las células de plantas que han sido revisadas por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) ll_:47-58, 1987. La transformación de las células de insectos y la producción de los polipéptidos ajenos se describen por Guarino et al., Patente Estadounidense No. 5,162,222 y Publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insectos pueden ser infectadas con vectores de baculovirus recombinantes, los cuales son comúnmente derivados de virus polihedrosis nuclear múltiples de Au t ographa cal i forni ca (AcMNPV) . El ADN que codifica el polipéptido de interés es insertado en el genoma viral en lugar del gen polihedrina que codifica la secuencia por recombinación homologa en las células infectadas con AcMNPV de tipo silvestre, intacto, y transfectadas con un vector de transferencia que comprende el gen clonado operablemente ligado al promotor del gen polihedrina, terminador y secuencias de flanqueo. El virus recombinante resultante se usa para infectar células huésped, típicamente una línea celular derivada del gusano soldado, Spodop t era frugiperda . Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant ADN, ASM Pres, Washington, D.C., 1994. Las células fúngales, incluyen células de levaduras, que pueden ser usadas dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés particular en este sentido, incluyen Saccharomyces cerevi si ae, Pi chi a pa s tori s , y Pi chi a methanol i ca . Los métodos para la transformación de las células S . cerevi si a e con ADN exógeno y que producen polipéptidos recombinantes a partir de estos, se describen mediante, por ejemplo, Kawasaki, Patente Estadounidense No. 4,599,311; Kawasaki et al., Patente Estadounidense No. 4,931,373; Brake, Patente Estadounidense No .4, 870, 008 ; Welch et al., Patente Estadounidense No. 5,037,743; y Murray et al., Patente Estadounidense No. 4,845,075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente de resistencia al fármaco o por la habilidad para crecer en la ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vector preferido para usarse en Saccharomyces cerevisiae en el sistema vector POTl descrito por Kawasaki et al., (Patente Estadounidense No. 4,931,373), permite a las células transformadas ser seleccionadas por el creciemiento en el medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usarse en la levadura incluyen aquellos a partir de las enzimas glicolíticas (véase por ejemplo, Kawasaki, Patente Norteamericana No., 4,599,311; Kingsman et al., Patente Estadounidense No. 4,615,974; y Bitter, Patente Estadounidense No. 4,977,092) y genes de deshidrogenasa del alcohol. Véase también Patentes Estadounidenses Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras incluyen Hansenula polymorpha , Schizosaccharomyces pomber Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago mayáis, Pichia pastoris , Pichia methanolica , Pichia guillermondii y Candida maltosa son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 y Cregg, Patente Estadounidense No. 4,882,279. Las células Aspergillus pueden ser utilizadas de conformidad con los métodos de McKnight et al., Patente Estadounidense No. 4,935,349. Se describen los métodos para la transofrmación de Acremonium chrysogenum por Sumino et al., Patente Estadounidense No. 5,162,228. Los métodos para la transformación de Neurospora se describen por Lambowitz, Patente Estadounidense No. 4,486,533. El uso de la Pichia methanolica como huésped para la producción de las proteínas recombinantes se describe en las Publicaciones WIPO WO 9717450 y W09717451. Las moléculas de ADN para usarse en la transformación de P. methanolica serán comúnmente preparadas como plasmidos circulares de doble hebra, los cuales son preferiblemente linearizados antes de la transformación. Para la producción del polipéptido en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plasmido sea aquel de un gen P. methanolica, tal como un gen de utilización de alcohol P. methanolica [AÜG1 o AUG2) . Otros promotores empleados incluyen aquellos de la sintasa de dihidroxiacetona (DHAS), deshidrogenasa de formiato (FDM) , y genes catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del huésped, se prefire tener el segmento de expresión total del plasmido flanqueado a ambos extremos por las secuencias del ADN huésped. Un marcador seleccionable preferido para usarse en Pi chi a methanoli ca es el gen P. me thanol i ca ADE2, el cual codifica al de fosforibosil-5-aminoimidazolcarboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), los cuales permiten a las células huésped ade2, crecer en la ausencia de adenina. Para gran escala, los procesos industriales en donde es deseable minimizar el uso de metanol, prefieren usar células huésped en la cual ambos genes de utilización de metanol [ A UG1 y A UG2) son suprimidos. Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren las células huésped deficientes en los genes proteasa vacuolar { PEP4 y PRV1 ) . La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plasmido que contiene un ADN que codifica un polipéptido de interés en las células P . me thanol i ca . Se prefiere transformar las células P . methanol i ca mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsado, exponencialmente descompuesto, que tiene un campo de extensión de 2.5 a 4.5 kV/cm, preferiblemente, de aproximadamente 3.75 kV/cm, y un tiempo constante (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferiblemente aproximadamente 20 milisegundos.

Las células huésped procarióticas, incluyendo hebras de la bacteria Es ch eri chi a col i , Bacill us y otros géneros son también empleadas como células huésped dentro de la presente invención. Las técnicas para la transformación de estos huéspedes y que expresan las secuencias de ADN extrañas, clonadas aquí, son bien conocidas en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook et al., ibid) . Cuando se expresa un polipéptido ZTMPO-l en la bacteria tal como E . col i , el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o pueden dirigirse al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso formador, las células son lisadas, y los granulos son recuperados y desnaturalizados usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede entonces ser replegado y dimerizado por la dilución del desnaturalizante, tal como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguida por diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido puede ser recuperado del espacio periplasmático en una forma soluble y funcional por el rompimiento de las célula (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico), para liberar los contenidos del espacio periplasmático y recuperar la proteína, con ello se obvia la necesidad de la desnaturalización y repliegue. Las células huésped transformadas o transfectadas son cultivadas de conformidad con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento y la selección de la célula huésped. Una variedad de medios adecuados, incluyendo el medio definido y el medio complejo, se conocen en la técnica y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. El medio puede también contener tales componentes como los factores del crecimiento o el suero, como se requiera. El medio de crecimiento generalmente se seleccionará de células que contienen el ADN exógenamente agregados por ejemplo, la selección o deficiencia del fármaco, en un nutriente esencial el cual es complementado por el marcador seleccionable llevado en el vector de expresión o co-transfectados en la célula huésped. Las células P. me than ol i ca son cultivadas en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y rastros de nutrientes a una temperatura de aproximadamente 25°C hasta 35°C. Los cultivos líquidos se proporcionan con suficiente aereación por medios convencionales, tal como sacudimiento de frascos pequeños o rocío de termentadores. Un medio de cultivo preferido para P . me th anol i ca es YEPD (D-glucosa al 2%, Peptone Bacto™ al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto™ al 1% (Difco Laboratories), 0.004% de adenína y L-leucina al 0.006%). Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a >_80% de pureza, más preferiblemente a >^ 90% de pureza, aún más preferiblemente >^95% de pureza, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es mayor de 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciones y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado es substancialmente libre de otros polipéptidos, particualrmente otros polipéptidos de origen animal. Los polipéptidos ZTMPO-l recombinantes expresados (o polipéptoidos ZTMPO-l quiméricos o de fusión) pueden ser purificados usando métodos y medios de fraccionación y/o purificación convencional. La precipitación de sulfato de amonio y ácido o extracción de chaotropos pueden ser usadas para la fraccionación de muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. El medio cromatográfico adecuado incluye dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad y similares. Se prefieren los derivados PEÍ, DEAE, QAE y Q. El método cromatográfico ejemplar incluye aquellos medios derivatizados con los grupos fenilo, butilo u octilo, tal como Fenil-Sefarosa FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octil-Sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tal como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares, Los soportes sólidos adecuados incluyen camas vitreas, resinas a base de sílice, resinas celulósicas, camas de agarosa, camas de agarosa reticuladas, camas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y las similares que son usadas. Estos soportes pueden ser modificados con grupos reactivos que permiten la unión de las proteínas por los grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones de carbohidratos. Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epoxidos, activación de sulfhidrilo, activación de hidrazida, y derivados amino y carboxilo para las químicas de acoplamiento de carbodiimidas . Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente usados en la técnica y son disponibles de los proveedores comerciales. Los métodos para enlazar los polipéptidos del receptor al medio de soporte son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es un tema de diseño de rutina y se determina en parte por las propiedades del soporte seleccionado. Véase por ejemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden 1988. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser aislados por explotación de sus propiedades enlazantes. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de ion metálico inmobilizado (IMAC), puede ser usada para purificar proteinas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden etiquetas de polihistidina . Brevemente, un gel es cargado primero con iones de metal divalente para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3_:l-7, 1985) . Las proteínas ricas en histidina se adsorberán por esta matriz con afinidades que difieren, dependiendo del ion metálico usado, y será eluidas por elución competitiva, disminuyendo el pH o el uso de agentes de quelación fuertes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas por cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio de iones (Methods in Enzymol . , Vol.. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529-39). Dentro de las modalidades adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y un etiqueta de afinidad (por ejemplo el etiqueta Glu-Glu) pueden ser construidos para facilitar la purificación. Los polipéptidos ZTMPO-l o fragmentos de los mismos, pueden tabmién ser preparados a través de síntesis químicas de conformidad con los métodos conocidos en la técnica, incluyendo síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida §7 parcial, fragmentos de condensación o síntesis de solución clasicas. Véase por ejemplos, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963. Usando métodos conocidos en la técnica, las polipéptidos ZTMPO-l pueden ser prepados como monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial . Una aproximación i n vi vo para ensayar las proteínas de la presente invención, involucra los sistemas de liberación viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen adenovirus, virus del herpes, virus de vacunas, y virus adeno-asociados (AAV) . Los adenovirus, un virus ADN de doble hebra, es actualmente el vector de transferencia del gen mejor estudiado para la liberación del ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véase Becker et al., Meth. Cell. Biol. 4J^:161-89, 1994; y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4^:44-53) . Los sitemas de adenovirus ofrecen varias ventajas: el adenovirus puede: (i) acomodar relativamente insertos de ADN largos; (ii) crecer a alto-titutador; (iii) infectar un rango amplio de tipos de células de mamíferos; y (iv) ser usados con un 8 gran número de vectores disponibles que contienen promotores diferentes. También, debido a que los adenovirus son estables en la corriente sanguínea, pueden ser adminsitrados por inyección itnravenosa. Por las supresiones de porciones del genoma de adenovirus, los insertos más grandes (hasta 7 kb) del ADN heterólogo pueden ser acomodados. Estos insertos pueden ser incorporados en el ADN viral por ligación directa o por recombinación homologa con un plasmido co-transfectado . En un sistema ejemplar, el gen El esencial ha sido suprimido del vector viral, y el virus no se replicará a menos que el gen El se proporcione por la célula huésped (la línea celular 293 humana es ejemplificada) . Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, el objetivo principalmente del adenovirus es el hígado. Si el sistema de liberación adenoviral tiene una supresión del gen El, el virus no puede replicar en las células huésped. Sin embargo, el tejido del huésped (por ejemplo, hígado), expresa y procesa (y si una secuencia de señal secretoria está presente, se secreta) , la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en la circulación en el hígado altamente vascularizado, y los efectos en el animal infectado pueden ser determinados. El sistema de adenovirus puede también ser usado para la producción de la proteína i n vi tro . Mediante la cultivación de las células 293 no infectadas con el adenovirus bajo condiciones en donde las células no se dividen rápidamente, las células pueden producir proteínas por periodos prolongados de tiempo. Por ejemplo, las células BHK crecen a confluencia en los factores celulares, después se exponen al vector adenoviral que codifica la proteína secretada de interés. Las células se hacen crecer entonces bajo condiciones libres de suero, las cuales permiten sobrevivir a las células infectadas por varias semanas sin división celular significante. Alternativamente, las células 293S infectadas con el vector de adenovirus se pueden hacer crecer en cultivo de suspensión a densidad celular relativamente alta para producir cantidades significantes de proteína (véase Garnier et al., Cyto technol 15 : 145-55, 1994) . Con cualquier protocolo, una proteína heteróloga secretada, expresada, puede ser repetidamente aislada a partir del sobrenadante del cultivo celular. Dentro del protocolo de producción celular 293S infectado, las proteínas no secretadas § 0 pueden también ser efectivamente obtenidas. La distribución amplia del tejido de ZTMPO-1 sugiere que puede jugar un papel crítico en los procesos biológicos de un organismo y como tal la expresión alterada de ZTMPO-l es parecida por involucra un número de patologías asociadas con la genética y otros estados de padecimientos humanos, en particular aquellos relacionados a patologías inmunológicas, reproductivas, cardiacas y del músculo, tal como diabetes, distrofia muscular, alteraciones hematopoieticas, alteraciones inmunes, leucemias, hipertensión y padecimientos y alteraciones cardiacas. Los polipéptidos ZTMPO-l , agonistas y antagonistas, tienen potencial en ambas aplicaciones in vitro e in vivo. El ZTMPO-l es expresado ubicuitamente, muchos de estos tejidos se caracterizan por una relación alta de proliferación celular. Los polipéptidos ZTMPO-l podrán encontrar uso como reguladores de la proliferación celular y/o diferenciación. La proliferación y diferenciación pueden ser medidas usando células cultivadas o i n vi vo mediante la administración de moléculas de la presente invención al modelo animal apropiado. Las células cultivadas adecuadas, incluyen pero no §1 están limitadas a las líneas celulares testiculares, del músculo, linfáticas y de tumores, las cuales son todas fácilmente disponibles por un experto en la técnica a partir de tales fuentes como American Type Culture Collection Rockville, MD. En particular, la proliferación se puede medir usando células cardiacas cultivadas o i n vi vo por la administración de moléculas de la presente invención al modelo animal apropiado. De manera general, los efectos proliferativos se observan como incremento en el número de células, y pueden incluir la inhibición de apoptosis así como también estimulación de mitogénesis. Las células cultivadas para usarse en estos ensayos incluyen fibroblastos cardiacos, miocitos cardiacos, miocitos del esqueleto, y células endoteliales de la vena umbilical humana a partir de cultivos primarios. Las líneas celulares establecidas adecuadas incluyen: fibroblastos NIH 3T3 (ATCC. No. CRL-1658), células caradiacas chum CHH-1 (ATCC No. CRL-1680), mioblastos de corazón de rata H9c2 (ATCC No. CRL-1446), células de carcinoma de mama Shionogi (Tanaka et al., Proc. Nati. Acad. Scoi. 89 : 8928-32, 1992), y células de adenocarcinoma LNCap.FGC (ATCC No. CRL-1740) . Las células testiculares cultivadas §2 incluyen células DBl.Tes de delfín (ATCC No. CRL-6258); células GC-1 spg de ratón (ATCC NO. CRL-2053); células TM3 (ATCC No. CRL-1714); células TM4 (ATCC No. CRL-1715) ; y células ST de cerdo (ATCC No. CRL-1746) . El músculo esqueleto de ratón (ATCC No. CRL-2174) , y el músculo humano (ATCC No. CRL-7522) y Raji, (Burkitt's human lymphoma, ATCC No. CCL86) , Ramos (Burkitt's lymphoma cell line, ATCC No. CRL-1596) , Daudi (Burkitt's human lymphoma, ATCC No. CCL213) y RPMI 1788 (una línea celular del linfocito B, CCL-156) todos disponibles del American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Los ensayos de cultivos que miden la proliferación celular son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos de medición de la proliferación incluyen quimiosensitividad al tinte rojo neutral (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8_:347-54, 1990), incorporación de nucleótidos readioetiquetados (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989), incorporación de 5-bromo-2' -desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 8_2:169-79, 1985), y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63; 1983; All.ey et al., Cáncer Res. £8:589-601, 1988; Marshal et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cáncer Res. 48 : 4827-33, 1988) . Los métodos adicionales se pueden encontrar en la téncica, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. NY, 1997. Los ensayos de medición de diferenciación incluyen, por ejemplo, marcadores de medición de la superficie celular asociados con la expresón específica del estado de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-4, 1991; Francis, Differentiation 57_:63-75, 1994; Raes, Adv . Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses , 161-71, 1989). Los Bioensayos y de ELISAs son viables o disponibles para mediar la respuesta celular a ZTMPO-l, en particular son aquellos que miden los cambios en la producción de citocina como una medida de la respuesta celular (véase por ejemplo, Cúrrente Protocols in Immunology ed. John E. Coligan et al., NIH, 1996). Los ensayos i n vi vo son disponibles para la evaluación de neogénesis cardiaca o hiperplasia, incluyen el tratamiento de ratas neonatales y maduras con molécuals de la presente invención. La 54 función cardiaca de los animales se mide como presión sanguínea, proporción del corazón, y salida cardiaca para determinar la función ventricular izquierda. Los métodos Post-mórtem para la valoración del decline o mejoramiento cardiaco incluyen: incremento o decremento del peso cardiaco, volumen del núcleo/citoplásmico, y teñido de secciones de histología cardiaca para determinar la proliferación del antígeno nuclear celular (PCNA) contra los niveles de actina citoplásmica (Quaini et al., Circulation Res. 75^:1050-63, 1994 y Reiss et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 93:8630-5, 1996). Los defectos cardiacos relacionados con la condicción han sido reportados en pacientes que tienen un gen emerina suprimido (Emery, J. Med. Genet. 2_6: 637-41, 1989). El defecto de condición cardiaca resultante es la amenaza de vida en estos pacientes. Los defectos en el sistema de conducción intrínseca pueden causar irregularidades en el ritmo cardiaco, tales como arritmias y fibrilación. La distribución del tejido y las similitudes de secuencia entre la emerina y ZTMPO-l sugieren que el ZTMPO-l puede estar involucrado en la re-polarización de las membranas celulares cardiacas.

La localización de la emerina a las desmosomas y fascias adherentes, sugiere que la asociación con la conexión entre las células epiteliales encontradas por el defecto de conducción cardiaca cuando el gen está ausente. Los polipéptidos ZTMPO-1 y antagonistas, pueden influenciar en la comunicación célula-célula, ya sea independientemente, o en conjunto con otras proteínas, tales como la emerina, y pueden regular los mensajes entre las membranas celulares. Para verificar la presencia de esta capacidad en los polipéptidos ZTMPO-l, los agonistas o antagonistas de la presente invención tal como, los polipéptidos ZTMPO-l, agonistas o antagonistas, son evaluados con respecto a su habilidad para modular la conductancia cardiaca de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica. Si se desea, la realización del polipéptido ZTMPO-l en este sentido, puede compararse con la emerina y puede ser evaluado en combinación con la emerina para identificar los efectos sinergísticos. Con respecto a la conductancia cardiaca, un incremento o decremento resultante es medido por la valoración de la conductancia dependiente del voltaje, flujo de iones de calcio o sodio, en un sistema de ensayo apropiado conocido en la técnica. Los cambios en la conductancia de voltaje o en los substratos indicadores, reflejan las actividades del polipéptido ZTMPO-l en el incremento o inhibición de la conductancia cardiaca relativa a un control no sometido a tratamento. Un electrocardiógrafo es usado para monitorear las corrientes eléctricas generadas y transmitidas a través del corazón. Los cambios en las líneas de registro del electrocardiograma (ECG) (patrón de onda y/o tiempo) podrían indicar una alteración en el sistema de conducción del corazón. Por lo tanto, un regreso a un patrón EGC normal después de la administración de ZTMPO-l podría indicar un re-establecimiento de un ritmo cardiaco regular. La invención también proporciona sondas o cebadores de polinucleótido ZTMPO-l aislado y purifcado. Tales sondas de polinucleótidos pueden ser ARN o ADN. El ADN puede ser ya sea ADNc o ADN genómico. Las sondas de polinucleótidos son ADN o ARN de hebra sencilla o doble hebra, generalmente oligonucleótidos sintéticos, pero pueden ser generados de ADNc clonados o secuencias genómicas y comprenderán de manera general, al menos 16 nucleótidos, más frecuentemente de 17 nucleótidos hasta 25 o más nucleótidos, algunas veces 40 hasta 60 nucleótidos y en algunos casos una porción substancial, dominio o aún el gen ZTMPO-l o ADNc completo. Las sondas y cebadores son generalmente oligonucleótidos sintéticos, pero pueden ser generados a partir de secuencias genómicas o ADNc clonados o sus complementos. Las sondas analíticas generalmente serán al menos, de 20 nucleótidos de longitud, aunque algunas veces sondas más cortas pueden ser usadas (14-17 nucleótidos) . Los cebadores de PCR son al menos, de 5 nucleótidos de longitud, más preferiblemente 20-30 nucleótidos. Los polinucleótidos cortos pueden ser usados cuando una región pequeña del gen es blanco para el análisis. Para análisis grandes de genes, una sonda de polinucleótido puede comprender un exon completo o más. Las sondas pueden ser etiquetadas para proporcionar una señal detectable, tal como con una enzima, biotina, un radionúclido, fluoroforo, fosforescentes, partículas magnéticas y similares, las cuales están comercialmente disponibles de cualquier fuente, tal como Molecualr Probes, Inc., Eugene, OR, y Amersham Corp., Arlington Heights, IL, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Las regiones preferidas de las cuales se construyen las sondas incluyen regiones de homología con otras timopoietinas y emerinas como se describe aquí, la región como la ancirina, la región como la proteína de enlace al calcio, la secuencia de seña, y similares. Las técnicas para desarrollar sondas de polinucleótidos e hibridación, son técnicas que se conocen en el arte, véase por ejemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc., NY, 1991. Los polipéptidos ZTMPO-l pueden ser usados dentro de los sistemas de diagnóstico para detectar la presencia de ZTMPO-l. La información derivada de tales métodos de detección podrá proporcionar discernimiento en la significancia de los polipéptidos ZTMPO-l en varios padecimientos, y podrán servir como herramientas de diagnóstico para padecimientos por los cuales los niveles alterados de ZTMPO-l son significantes. Los niveles alterados de los polipéptidos receptores de ZTMPO-l pueden ser indicativos de condiciones patológicas incluyendo cáncer, alteraciones autoinmunes o cardiacas y padecimientos infecciosos. En un ensayo básico, una molécula de sonda de hebra sencilla es incubada con ARN, aislada de una muestra biológica, bajo condiciones de temperatura y fuerza iónica que promueven el apareamiento base etre la sona y las especies ARN del ZTMPO-l objetivo. Después de la separación de la sonda no enlazada de las moléculas hibridizadas, se detecta la cantidad de híbridos. Los métodos de hibridación bien establecidos para la detección de ARN incluyen hibridación por análisis northern y manchado de punto/muesca (véase por ejemplo, Ausubel ibid. , y Wu et al. (eds.), "Analysis of Gene Expression at the ARN Level" en Methods in Gene Biotechnology, páginas 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)) . Las sondas de ácido nucleico pueden ser detectablemente etiqutadas con radioisótopos tal como 35, Alternativamente, el ARN de ZTMPO-l puede ser detectado con un método de. hibridación no radioactivo (véase por ejemplo, Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis b _ Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993) . Típicamente, la detección no radioactiva es alcanzada por la conversión enzimáticoa de substratos cromogénicos o quimioluminiscentes . Las porciones no radioactivas ilustrativas incluyen biotina, fluoresceína y digoxigenina .

Las sondas de oligonucleótidos ZTMPO-l son también empleadas para diagnosis i n vi vo . Como una ilustración, los oligonucleótidos 18F-etiquetados , pueden ser administrados a un sujeto y visualizados por la tomografía de emisión positrón (Tavitian et a., Nature Medicine 4 : 467, 1998) . Los procedimientos de diagnóstico numeroros toman ventaja de esta reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por incrementar la sensitividad de los métodos de detección. Las técnicas estándares para la realización de la PCR son bien conocidas (véase, de manera general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cáncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek and Walaszek (eds.) Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)). Los cebadores PCR pueden ser diseñados para amplificar una secuencia que codifica un dominio ZTMPO-l particular o una región de homología como se describe aquí. Una variación del PCR para los ensayos de diagnóstico es la PCR inversa de la transcriptasa (RT_PCR) . En la técnica RT-PCR, el ARN es aislado a partir de una muestra biológica, transcrito inverso al ADNc, y. el ADNc es incubado con cebadores ZTMPO-1 (véase por ejemplo, Wu et al., (ed.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR", en Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., páginas 15-28, 1997) . La PCR es entonces realizada y los productos son analizados usando técnicas estándares. Como una ilustración, el ARN es aislado de la muestra biológica usando, por ejemplo, el procedimiento de lisis celular de guanidinio-tiocianato, descrito anteriormente. Alternativamente, una tecnia de fase sólida puede ser usada para aislar el ARNm de un lisado celular. Una reacción PCR de transcripción inversa puede ser cebada con el ARN aislado usando oligonucleótidos aleatorios, homopolímeros cortos de dT, o oligómeros anti-sentido del ZTMPO-l. Los cebadores oligo-dT ofrecen la ventaja de que varias secuencias de nucleótidos ARNm son amplificadas que pueden proporcionar el control de las secuencias objetivo. Las secuencias ZTMPO-l son amplificadas por la reacción en cadena de la polimerasa usando dos cebadores de olugonucleótidos de flanqueo que son típicamente al menos, de 5 bases de longitud. Los productos de amplificación de PCR pueden ser detectados usando una variedad de aproximaciones. Por ejemplo, los productos PCR pueden ser fraccionados por electroforesis en gel, y visualizados por teñido de bromuro de etidio. Alternativamente, los productos PCR fraccionados pueden ser transferidos a una membrana, hibridizados con una sonda ZTMPO-l detectablemente etiquetada, y examinados por autoradiografía. Los alcances alternativos adicionales incluyen el uso de trifosfatos del ácido desoxiribonucleótido dioxigenina-etiquetado para proprocionar detección quimioluminiscente, y el ensayo colorimétrico C-TRAK. Otros alcances son el PCR cuantitativo de tiempo real (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.) . Una sonda fluorogénica, que consiste de un oligonucleótido con ambos, un reportero y un apagador unido al tinte, fortalecen específicamente entre los cebadores inversos y delanteros. Usando la actividad de la endonucleasa del 5' de la polimerasa ADN Taq, el tinte reportero se separa del tinte apagador y una señal específica de secuencia se genera e incrementa como se incrementa la amplificación. La intensidad de fluorescencia puede ser monitoreada continuamente y cuantificada " durante la reacción de PCR. Otro alcance para la detección de la expresión de ZTMPO-l es la tecnología de sonda periódica (CTP) , en la cual un blanco ADN de hebra sencilla se enlaza con un exceso de sonda quimérica ADN-ARN-ADN, para formar un complejo, la poricón de ARN es desdoblada con el Rnase H, y la presencia de la sonda quimérica desdoblada se detecta (véase por ejemplo, Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34:2985, 1996 y Bekkaoui et al., Biotechniques 20 : 240, 1996) . Los métodos alternativos para la detección de las secuencias ZTMPO-l pueden utilizar aproximaciones tal como con amplificación basada en la secuencia . de ácido nucleico (NASBA) , la amplificación cooperativa de los patrones mediantes la hibridación transversal (CATCH) , y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase por ejemplo, Marshall et al., Patente Estadounidense NO. 5,686,272 (1997), Dyer et al., J. Virol. Methods, 6_0:161, 1996; Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358, 1997 y Chadwick et al-, J. Virol. Methods 7_0:59, 1998). Otros métodos estándares se conocen por aquellos expertos en la técnica. Las sondas y cebadores ZTMPO-l pueden también ser usados para detectar y localizar la expresión del gen del ZTMPO-l en muestras de tejido. Los métodos para tales hibridaciones i n si t u son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Choo (ed.), In Situ Hyhridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; Wu et al. (eds.), "Analysis of Cellular ADN o Abundance of ARNm by Radioactive Tn Si t u Hybridization (RISH) ", en Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., páginas 259-278, 1997 y Wu et al., (eds.), "Locali zation of ADN or Abundance of mRNA by Fluorescence In Si t u Hybridizaton (RISH) ", en Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., páginas 279-289, 1997) . Los varios alcances diagnósticos adicionales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 y Elles Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc. , 1996) . La invención también proporciona antagonistas o inhibidores de la actividad de ZTMPO-l. Tales antagonistas podrían incluir anticuerpos anti-ZTMPO-1 , receptores ZTMPO-l solubles, así como también otros agentes peptídicos y no peptídicos (incluyendo ribozimas) . Tales antagonistas prodrían tener uso como reactivos de búsqueda pra la caracterización de sitios de interacción ligando-receptor. Los antagonistas podrán encontrar también uso en la modulación de la proliferación celular y la diferenciación tal como en el crecimiento y desarrollo del tumor. Los .niveles altos de expresión de ZTMPO-l en el tejido testicular, sugieren un papel en la espermatogénesis. Estos antagonistas de ZTMPO-l podrán ser empleados para la . inhibición de la espermatogénesis y la activación del esperma. Tales antagonistas ZTMPO-l pueden ser usados para la anticoncepción en humanos y animales, y en particular, en animales domésticos y de zoológicos y en granjas, en donde podrían actuar para prevenir la fertilización del huevo. Tales antagonistas ZTMPO-l podrán ser usados por ejemplo, en lugar de las formas quirúrgicas de anticoncepción (tal como quitar los ovarios y útero) , y podrán permitir la posibilidad de futura crianza de los animales tratados, si se desea. Los antagonistas de ZTMPO-l podrán también ser usados para mediar la respuesta inmune, por ejemplo, por el levantamiento de la respuesta humoral en individuos con riesgo de una enfermedad infecciosa o como complemento a la vacunación. El ZTMPO-l puede ser usado para identificar inhibidores (Antagonistas) de esta actividad. Los compuestos prueba son transfectados en células o posiblemente agreados a los ensayos descritos aquí para identificar compuestos que inhiben la actividad de ZTMPO-l. Además, para aquellos ensayos descritos aquí, las muestras pueden ser probadas por la inhibición de la acitvidad ZTMPO-l dentro de una variedad de ensayos designados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de ZTMPO-l. Por ejemplo, las líneas celulares responsivas del ZTMPO-l - pueden ser transfectadas con un constructo de gen reportero que es responsable de una trayectoria celular estimulada con ZTMPO-l. Los constructos del gen reportero de este tipo son conocidos en la técnica, y comprenderán de manera general, un elemento de respuesta ZTMPO-1-ADN operablemente ligados a un gen que codifica una proteína ensayable, tal como la luciferasa. Los elementos .de respuesta al ADN pueden incluir, pero no están limitados a, los elementos de respuesta AMP cíclicos (CRE), los elementos de respuesta a la hormona (HRE), el elemento de respuesta a la insulina (IRE) (Nasrin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA jT7_:5273-7, 1990) y elementos de respuesta del suero (Shaw et al. Cell 5_6:563-72, 1989). Los elementos de respuesta AMP cíclica son revisados en Roestler et al., J. Biol. Chem. 263:9063-6; 1988 y Habener, Molec. Endocrinol. 4_1087-94; Los elementos de respuesta a la Hormona están revisados en Beato., Cell 5_6_:335-44; 1989. Los compuestos candidatos, soluciones, mezclas o extractos, son probados por su capacidad para inhibir la actividad de ZTMPO-l en las células objetivo como evidencia por un decremento en la estimulación de ZTMPO-l de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectarán compuestos que bloquean directamente el enlace ZTMPO-l a los receptores de la superficie cleular, así como también a los compuestos que bloquean los procesos en la trayectoria celular subsecuente al enlace receptor-ligando. En una alternativa, los compuestos u otras muestras pueden ser probadas por su bloqueo directo del enlace de ZTMPO-l al receptor usando blancos de ZTMPO-l con una etiqueta detectable (por ejemplo, 125I, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC, y similares) . Dentro' de los ensayos de este tipo, la habilidad de cada muestra para inhibir el enlace del ZTMPO-l etiquetado al receptor, es indicativa de la actividad inhibitoria, la cual puede ser confirmada a través de los ensayos secundarios. Los receptores usados con los ensayos de enlace pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados, aislados. Los polipéptidos ZTMPO-l pueden también ser usados para preparar anticuerpos que se enlazan específicamente a los epitopes ZTMPO-l, péptidos o polipéptidos. El polipéptido ZTMPO-l o un fragmento del mismo, sirven como un antígeno (inmunógeno) para inocular una animal y estimular una respuesta inmune. Los antígeno adecuados podrían ser el polipéptido ZTMPO-l codificado por la SEC ID NO : 2 a partir de un aminoácido número 1 hasta un aminoácido número 876, o fragmentos de los mismos de residuos de aminoácidos contiguos de 1 a 25. Los anticuerpos generados a partir de esta respuesta inmune, pueden ser aislados y purificados como se describe aquí. Los métodos para la preparación y aislamiento de los anticuerpos monoclonales y policlonales, son bien conocidos .en la técnica. Véase por ejemplo, Current protocols in Immunology, Cooligan et al. (eds.) , National Institutes of Health, John Wyiiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecualr Cloning: A Laboratory Manual, Secund Edition, Cold Spring Harbor, NY 1989; y Hurrel, (Ed.), Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982. Como podría ser evidente para un ordinario experto en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden ser generados a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente, tal como caballos, vacas, carneros, ovejas, perros, pollitos, conejos, ratones y ratas con un polipéptido ZTMPO-l o un fragmento del mismo. La imunogenicidad de un polipéptido ZTMPO-l puede incrementarse a través del uso de un adyuvante, tal como alum (hidróxido de aluminio) o adyuvante Freund completo o incompleto. Los polipéptidos empleados para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tal como fusiones de ZTMPO-1 o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína que se enlaza a la maltosa. El polipéptido inmunógeno puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es "como el hapteno", tal porción puede ser ventajosamente unida o ligada a un portador macromolecular (tal como la hemocianina del limpet clave (KLH) , albúmina de suero bovino (BSA) o tetanus toxoide) para inmunización. Como se usó aquí, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos que se enlazan al antígeno, tal como fragmentos proteolí ticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos diseñados genéticamente, tales como los anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena única y similares, así como también péptidos y polipéptidos que se enlazan al antígeno, están también incluidos. Los anticuerpos no-humanos pueden ser humanizados por el injerto no humano de CDRs en la estructura humana y regiones constantes, o mediante la incorporación de los dominios variables no humanos completos (opcionalmente "cubriéndolos" con una superifice como la humana por el reemplazo de los residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "revestido") . En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de la región variable no humana para incrementar las características del enlace propio. A través de los anticuerpos humnizados, se puede incrementar la vida media biológica y el potencial para las reacciones inmunes adversas después que la administración a humanos se reduce. Las técnicas alternativas para la generación o selección de anticuerpos empleados aquí, incluyen la exposición in vi t ro de los linfocitos a la proteína o péptido ZTMPO-l, y la selección de las bibliotecas que presentan anticuerpos en los vectores del fago o similares (por ejemplo, a través del uso de proteínas o péptidos ZTMPO-l etiquetados o inmovilizados) . Los genes que codifican los polipéptidos que tienen dominios de enlace polipéptido ZTMPO-l potencial, pueden ser obtenidos mediante la selección aleatoria de las bibliotecas de péptidos presentadas en el fago (que presentan fago) o en la bacteria, tal como E. col i . Las secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido se pueden obtener en un número de vías, tal como a través de la mutagénesis aleatoria y síntesis aleatoria de polinucleótidos. Estas bibliotecas que presentan péptidos aleatorios pueden ser usadas para seleccionar péptidos que interactúan con un objetivo conocido, el cual puede ser una proteína o un péptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o substancias orgánicas o inorgáncias. Las técnicas para la creación y selección de tales bibliotecas que presentan péptidos aleatorios se conoce en la téncia (Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,223,409; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 4,946,778; Ladner et al., Patente Norteamericana No.5, 403, 84 y Ladner et al., Patente Norteamericana NO. 5,571,698) y bibliotecas que presentan péptidos aleatorios y equipos para seleccionar tales bibliotecas son comercialmente disponibles, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego CA) , New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) y pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las bibliotecas que presentan péptidos aleatorios pueden ser seleccionadas usando las secuencias ZTMPO-l descritas aquí para identificar proteínas las cuales se enlazan a ZTMPO-l. Estas "proteínas de enlace" las cuales interactúan con los polipéptidos ZTMPO-l pueden ser usadas para células etiquetadas; por aislamineto de los polipéptidos homólogos por purificación de afinidad, pueden ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionuclidos y similares. Estas proteínas de enlace pueden también ser usadas en métodos analíticos tal como para selección de las bibliotecas de expresión y neutralización de la actividad. Las proteínas de enlace pueden también ser usadas para los ensayos diagnósticos para determinar los niveles de circulación de los polipétidos; para detectar o cuantificar los polipéptidos solubles como marcadores de la patología o padecimientos subrayados. Estas proteínas de enlace pueden también actuar como "antagonistas" ZTMPO-l para bloquear el enlace ZTMPO-l y la traducción de la señal i n vi tro e i n vi vo . Estas proteínas de enlace anti-ZTMPO-1, podrán ser empleadas para inhibir los enlaces . Los anticuerpos son determinados por ser específicamente enlazantes si: 1) presentan un nivel de umbral de actividad enlazante, y/o 2) no reaccionan significantemente opuesto con las moléculas de polipéptidos relacionados. Primero, los anticuerpos aquí, se enlazan específicamente si se enlazan a un polipéptido, péptido o epitope ZTMPO-l, con una afinidad de enlace (Ka) de 106 M"1 o mayores, preferiblemente 107 M-1 o mayores, más preferiblmente 108 M"1 o mayores, y más preferiblemente 109 M"1 o mayores. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser fácilmente determinada por un ordinario experto en la técnica, por ejemplo, por el análisis Scatchard (Scatchard,, Ann. NY Acad. Sci, 51:660-72, 1949) . Segundo, los anticuerpos son determinados por enlazarse específicamente si no reaccionan significantemente contrario con los polipéptidos relacionados. Los anticuerpos no reaccionan contrario significantemente con las moléculas de polipéptidos relacionados, por ejemplo, si detectan ZTMPO-l, pero no polipéptidos relacionados conocidos, usando análisis de manchado Western estándar (Ausubel et al., ibid) . Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son aquellos descritos en la técnica anterior, tal como ortólogos conocidos, y paralogos, y elementos conocidos similares de una familia de proteína. Sin embargo, los anticuerpos pueden ser polipéptidos relacionados "contra los seleccionados", tal como el ZTMPO-l no humano, y los polip.éptidos mutantes ZTMPO-l, para aislar la población que específicamente se enlaza a los polipéptidos inventivos. Por ejemplo, los anticuerpos alcanzados por ZTMPO-l son adsorbidos a polipéptidos relacionados adheridos a matriz insoluble; anticuerpos específicos a ZTMPO-l fluirán a través de la matriz bajo las condiciones de amortiguadores propias. Tales selecciones permiten el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales que no reaccionan contrariamente a los polipéptidos estrechamente relacionados (Antbodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.)/ Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al., (Eds.), National Institutes of Health, John Wilwy and Sons, Inc, 1995) . La selección y aislamiento de los anticuerpos específicos es bien conocida en la técnica. Véase, Fundamental Immunology, Paul (eds), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Ad . In Immunol. 43 : 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd. , 1996; Benjamín et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101,, 1984. Una variedad de ensayos concidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser utilizados para detectar anticuerpos y proteínas de enlace, las cuales se enlazan especí ficamnte a las proteínas ZTMPO-l o péptidos. Los ensayos ejemplares se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA) ; manchado de punto, o ensayo de manchado Western, ensayos de inhibición o competición y ensayo intercalado. Además, los anticuerpos pueden ser seleccionados por enlazarse a una proteína o polipéptido ZTMPO-l mutante contra el tipo silvestre. Los anticuerpos a ZTMPO-l pueden ser usados para etiquetación de células que expresan ZTMPO-l; por aislamiento de ZTMPO-l mediante purificación de afinidad; por ensayos de diagnóstico para la determinación de los niveles circulantes de los polipéptidos ZTMPO-l; para detectar o cuantificar el ZTMPO-l soluble como marcador de la patología subrayada o padecimientos; en métodos analíticos que emplean FACS; para las bibliotecas de expresión por selección; por la generación de anticuerpos anti-idiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear el enlace ZTMPO-l in vi tro e in vi vo . Las etiquetas o marcadores directos adecuados incluyen radionuclidos , enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, fluorescentes, marcadores, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéitcas y similares; las etiquetas o marcadores indirectos pueden usar características de biotina-avidina u otros pares complemento/anticomplemento como intermediarios. Los anticuerpos aquí pueden también ser directamente o indirectamente . conjugados a los fármacos, toxinas, radionuclidos y similares, y estos conjugados usados para las aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas i n vi vo . Sin embargo, los anticuerpos a ZTMPO-l o fragmentos del mismo, pueden ser usados i n vi tro para detectar ZTMPO-l desnaturalizado o fragmentos del mismo en ensayos, por ejemplo, manchados Western u otros ensayos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos o polipéptidos aquí pueden también ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionuclidos y similares, y estos conjugados se usan para las aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vi vo . Por ejemplo, polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anti-complementaria correspondiente (receptor o antígeno respectivamente, por ejemplo). Más específicamente, los polipéptidos ZTMPO-l o anticuerpos anti-ZTMPO-1 , o fragmentos bioactivos o porciones de los mismos, pueden ser acoplados a las moléculas detectables o citotóxicas y liberadas en un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anti-complementaria. Las moléculas detectables adecuadas pueden ser directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluir radionuclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden ser directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluir toxinas bacterianas o de plantas (por ejemplo, toxina difteria, endotoxinas de Pse udomona s, ricina, abrina y similares), así como también radionuclidos terapéuticos, tal como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (ya sea directamente unido al polipéptido o anticuerpo, o indirectamente unido a través de medios de una porción quelante, por ejemplo) . Los polipéptidos o anticuerpos pueden también ser conjugados a los grupos citotóxicos, tal como adriamicina. Para unión indirecta de una molécula citotóxica o detectable, la molécula citotóxica o detectable puede ser conjugada con un elemento de un par complementario/anticomplementario, en donde el otro elemento está enlazado a la porción polipéptido o anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ej emplar . Las moléculas de la presente invención pueden ser usadas para identificar y aislar receptores involucrados en el enlace ZTMPO-l. Por ejemplo, las proteínas y péptidos de la presente invención pueden ser inmovilizados en una columna y correr las preparaciones de la membrana sobre la columna (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego CA, 1992, pp.195-202) . Las proteínas y péptidos pueden también ser radioetiquetados (Mehtods in Enzymol, vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deustscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-37) o etiquetado de fotoafinidad (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. ^2:483-514, 1993 y Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 3_3 : 1 IL 67~ 8 ° ' 1984) y proteínas de superficie celular específicas pueden ser identificadas. Las moléculas de la presente invención serán reguladores empleados en organismos celulares múltiples. Las moléculas de la presente invención pueden ser usadas para modular la proliferación y diferenciación, por ejemplo espermatogénesis. En particular, ciertas alteraciones proliferativas tal como cánceres, pueden ser receptivos a tal diagnosis, tratamiento o prevención. El ZTMPO-l podrá ser empelado en la modulación del .ciclo celular tal como la duración de la diferenciación o en las células que rápidamente proliferan tal como en el tejido tumoral. El ZTMPO-l podrá encontrar aplicación en un arreglo diverso de tejido como testículos, músculo esqueleto, glándula tiroide y adrenal por ejemplo. Los polinucleótidos que codifican a los polipéptidos ZTMPO-l son empleados con las aplicaciones de la terapia del gen, en donde se desea incrementar o inhibir la actividad de ZTMPO-1. Si un mamífero tiene un gen ZTMPO-l mutado o ausente, el gen ZTMPO-l puede ser introducido en la células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido ZTMPO-l se introduce i n vi vo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virs ADN defectivo o atenuado, tal como, pero no limitado a, el virus del herpes simplex (HSV) , papilomavirus, virus Epstein Barr (EBV) , adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , y similares. Los virus defectivos, los cuales completamente o casi completamente carecen de los genes virales son preferidos. Un virus defectivo no es infectivo después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectivos permite la adminsitración a las células en un área específica, localizada, sin referirse a que tal vector puede infectar otras células. Los Ejemplos de los vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector del virus del herpes simple defectivo 1 (HSVl), (Kaplitt et al., Molec . Cell. Neurosci. 2_:320-30, 1991); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J Clin. Invest 90:626-30, 1992; y un vector de virus adeno-asociado defectivo (Samulski et al Virol 6^:3096-101, 1987; Samulski et alk., J. Virol. 63: 3822-8, 1989) . En otra modalidad, un gen ZTMPO-l puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al., Patente Estadounidense No. 5,399,346; Mann et al., Cell 33:153, 1983; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,650,764; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin et al., Patente Estadounidense No. 5,124,263; Publicación de Patente Internacional No. WO 95/07358, publicado el 16 marzo de 1996 por Dougherty et al., y Kou et al., Blood 8_2:845, 1993. Alternativamente, el vector puede ser introducido por lipofección i n vi vo usando liposomas. Los lípidos catiónicos sintétios pueden ser usados para preparar liposomas para transfección in vi vo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., Proc Nati.. Acad. Sci. USA 84 : 7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA 8_5:8027-31, 1988). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos i n vi vo tiene ciertas ventajas prácticas. Los blancos u objetivos moleculares de las liposomas a las células específicas representan un área benéfica. Más particualrmente, la tranfección dirigida a las células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, la transfección que se dirige a tipos celulares particulares, podrá ser particularmente ventajosa en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, riñon y cerebro. Los lípidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para los propósitos objetivos. Los péptidos objetivos (por ejemplo hormonas o neutrotransmisores) , proteínas tales como anticuerpos o moléculas no peptíticas, peuden ser acopladas a las liposomas químicamente. Es posible remover las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plasmido ADN desnudo; y después re-implantar las células transforamdas en el cuerpo. Los vectores AND desnudos para la terapia del gen, pueden ser introducidos en las células huésped deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAR, precipitación de fosfato de calcio, uso de un gen propulsor o uso de un vector ADN transportador. Véase por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-4, 1988. La presente invención también proporciona reactivos para usarse en las aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen ZTMPO-l, una sonda que comprende el ADN o ARN ZTMPO-l, o una secuencia del mismo, pueden ser usados para determinar si el gen ZTMPO-l está presente en el cromosoma 12 o si una mutación ha ocurrido. El gen emerina no se detecta en las muestras de pacientes con distrofia muscular Emery-Dreifuss, y está presente en pacientes normales (Bione et al., Nati . Genet. 8_:323-7, 1994 y Nagano et al., Nati. Genet. L2:254-9, 1996) y además sirven como un marcador para el padecimiento. Las aberraciones cromosomales detectables en el gen ZTMPO-l incluyen locus o sitios, pero no están limitados a aneuploides, cambios en el número de copia del gen, insersiones, supresiones, restricciones, sitios de cambio y reacomodos. Estas aberracones pueden ocurrir con la secuencia codificante, dentro de intrones o con secuencias de flanqueo, incluyendo promotores corriente arriba y regiones reguladoras, y pueden ser manifestados como alteraciones físicas con una secuencia codificante o cambios en el nivel de expresión del gen. En general, estos métodos diagnósticos comprenden las etapas de (a) obtener una muestra genética a partir de un paciente; (b) inclubar la muestra genética con una sonda o cebador de polinucleótido como se describe anteriormente, bajo condiciones en donde el polinucleótido se hibridizará a la secuencia de polinucleótido complementaria, para producir un primer producto de reacción; y (iii) comparar el primer producto de reacción con un producto de reacción de control. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control es indicativa de una anormalidad genética en el paciente. Las muestras genéticas par ausarse dentro de la presente invención incluyen ADN genómico, ADNc, y ARN. La sonda o cebador polinucleótido puede ser ARN o ADN, y comprenderá una porción de la SEC ID NO : 1 , el complemento de la SEC ID NO : 1 , o un equivalente ARN del mismo. Los métodos de ensayos adecuados en este sentido inlcuyen técnicas genéticas moleculares conocidas por aquellos en la técnica, tal como análisis del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , análisis de repetición de orden corto (STR), empleando técnicas de PCR, reacción de ligación de cadena (Barany, PCR Methods and Applications 1 : 5-16, 1991), ensayos de protección de la ribonucleasa, y otras técnicas de análisis de enlace genético conocidas en la tecnia (Sambrook et al., ibid. ; Ausubel et al., ibid. ; Marian, Chest 108 : 255-65, 1995) . Los ensayos de protección de la ribonucleasa (véase por ejemplo, Ausubel et al., ibid. , ch. 4) comprenden la hibridación de una sonda ARN en una muestra ARN de paciente, después del cual el producto de reacción (híbrido ARN-ARN) se expone como Rnase. Las reacciones hibridizadas del ARN son protegidas de la digestión. Con los ensayos PCR, una muestra genética de un paciente es incubada con un par de cebadores de polinucleótidos, y la región entre el cebador se amplifica y recupera. Los cambios en el tamaño o cantidad del producto recuperado son indicativas de las mutaciones en el paciente. Otra técnica a base de PCR que puede ser empleada es un polimorfismo conformacional de hebra sencilla (SSCP), análisis (Hayashi, PCR Methods and Applications, l_:34-8, 1991) .

Los ratones transgénicos, diseñados para expresar el gen ZTMPO-l y los ratones que presentan una ausencia completa de la función del gen ZTMPO-1, se refieren como "ratones noque&dos o golpeados" (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992), pueden también generarse (Loweil et al., Nature 366 : 740-42, 1993) . Estos ratones pueden ser empelados para estudiar el gen ZTMPO-l y la proteína codificada con ello en un sistema in vi vo . Tal ratón debe ser usado, por ejemplo en estudios de crianza para determinar el efecto que ZTMPO-l tiene en la espermatogénesis y la función del esperma así como también en la conductividad del corazón. Para uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención son formuladas para liberación parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, de conformidad con los métodos convencionales. La administración intravenosa será por inyección del bolo o infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, una formulación farmacéutica incluirá una proteína ZTMPO-l en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como salina, salina amortiguada, destroxa al 5% en agua o similares. Las formulaciones peuden además, incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores , agentes de amortiguación, albúmina para prevenir la pérdida de proteína en las superficies virales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co . , Easton, PA, 19, ed., 1995. La determinación de la dosis está dentro del nivel de un ordinario experto en la técnica. Las proteínas pueden ser administradas para tratamiento agudo, durante una semana o menos, frecuentemente sobre un periodo de uno a tres días o puede ser usado en el tratamiento crónico, durante varios meses o años. La evaluación del efecto terapéutico de ZTMPO-l para aplicaciones cardiacas pude hacerse por la observación de los cambios en ECG. La disminución en los niveles de la cinasa creatina y una disminución en la debilidad podría servir como indicadores para los cambios en los desgastes musculares asociadso con distrofia muscular . La invención además está ilustrada por los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Aislamiento de ZTMPO-l Los nuevos polinucleótidos y polipéptidos que codifican al ZTMPO-l de la presente invención, son inicialmente identificado mediante la cuestión de una base de datos EST. Para identificar el ADNc correspondiente, dos clones a partir de los cuales un EST identificado se derivó, que fueron consíderadso similares por contener la secuencia humana ZTMPO-l completa, fueron usados para el secuenciamiento. Usando un equipo de plasmido QIAwell 8 (Quiagen, Inc., Chatsworth, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante, se preparó un cutivo de 5 ml durante la noche en LB + 50 µg/ml de amplicilina. Los patrones se secuenciaron en un secuenciador de ADN modelo 377 de Applied Biosístems™ (Perkim-Elmer Cetus, Norwalk, Ct . ) usando el Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit de ABI PRISM™.

(Perkim-Elmer Corp.) de conformdiad con las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos ZC694 (SEC ID NO:9), ZC976 (SEC ID NO : 10 ) y ZC447 (SEC ID NO: 14), se usaron como cebadores secuenciadores . Los oligonucleótidos ZC15976 (SEC ID NO: 11), ZC15485 (SEC ID NO:12), ZC15526 (SEC ID NO:13), Z15620 (SEC ID NO : 15 ) y ZC15823 (SEC ID NO: 16) se usaron para completar la secuencia de los clones . Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en un Hybaid OmniGene Temperatura Cycling System (National Labnet Co . , Woodbridge, NY) . El software de análisis de secuencia SequencherTM 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI), se usó para los análisis de datos. Las secuencias de los dos clones se traslapó por 740 bp y contiene el extremo 3' del gen y el extremo poli A. Un tercer clon preparado como se describe anteriormente se secuenció en la secuencia 5' restante. Los oligonucleótidos ZC447 (SEC ID NO : 14 ) , ZC976 (SEC ID NO:10), ZC16162 (SEC ID N0:17), ZC16038 (SEC ID NO:18), ZC16249 (SEC ID NO : 19 ) AC16164 (SEC ID NO:20), AC16163 (SEC ID NO : 21 ) , ZC16165 (SEC ID NO:22) y ZC16037 (SEC ID NO:23), se usaron en la secuenciación. Se detectaron las diferencias entre las secuencias EST originales la secuencia final de ZTMPO-l. La carencia de identidad se alcanza de la ambigüedad en las secuencias EST originales.

Para confirmar que la secuencia de polinucelótidos que codifica a la metionina inicial se ha identificado, se realizó un 5'RACE de nido (amplificación rápida de los extremos ADNc) . Varias biblioteacas ADNc Marathón™ (próstata humana, pulmón, testículos y útero) se prepararon usando un equipo de ANDc Marathón™ (Clontech) de conformdiad con las instrucciones del fabricante. Para la primera ronda de API de poligonucleótidos PCR (SEC ID NO:24, suministrado con el equipo o sintetizado), y ZC15527 (SEC ID N0:25) se usaron como cebadores y la reacción se llevó a cabo a 94°C por 2 minutos, seguido por 25 ciclos a 94°C por 15 segundos, 61°C por 20 segundos y 72°C por 30 segundos, seguido por 1 minuto de extensión a 72°C. Los productos PCR de la primer ronda de reacción se diluyeron 1/100 y se usaron como patrones para una segunda ronda de PCR usando oligonucleótidos AP2 (SEC ID NO:32, proporcionados con el equipo Marathón™ o sintetizados) y ZC15526 (SEC ID N0:13) como cebadores. El PCR derivado de los fragmentos de ADN se resolvió por electrofóresis en gel, excisado y ligado en el vector de expresión fue el vector pCR2.1 ( TA Cloning Kit, Invitrogen Inc., San Diego, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. La secuencia de los insertos se confirmó por el análisis de secuencia usando los oligos ZC694 (SEC ID NO:9) y ZC695 (SEC ID NO : 26 ) como cebadores, como se describe anteriormente y se confirma que el Met (residuo de aminoácido 1 de la SEC ID NO : 2 ) fue en en realidad la metionina inicial. El polinucleótido de 2,754 bp resultante (SEC ID NO : 1 ) tiene una estructura lectora abierta que codifica una secuencia de proteína de residuo de 876 aminoácidos (SEC ID NO : 2 ) y se designó como ZTMPO-l.

EJEMPLO 2 Análisis del Manchado Northern de ZTMPO-l Los manchados Northern del Tejido Humano Múltiple (MTN I, MTN II y MTN III; Clontech), se sometieron a sondas para determinar la distribución del tejido de la expresión ZTMPO-l humana. Una sonda derivada del PCR de aproximadamente 218 (SEC ID N0:8) se amplificó usando el clon EST EST934031 (SEC ID NO:27) como un patrón y el oligonucleótido ZC15521 (SEC ID NO:28) y el ZC15525 (SEC ID NO:29) como cebadores. La amplificación se llevó a cabo como sigue: 1 ciclo a 94°C por 2 minutos, 30 ciclos de 94°C por 15 segundos, 65°C por 20 segundos y 72°C por 30 segundos, seguido por 1 ciclo a 72°C por 1 minuto. El producto PCR se . purificó en gel usando el método QUIquick (Quiagen, Chatsworth, CA) , y radiactivamente etiquetados usando el equipo de etiquetación ADN Rediprime (Amerham, Arlington Heights, IL) ambos de conformidad con las sugerencias del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de empuje NUCTRAP (Stratagene) . Las solución EXPRESSHYB (Clontech) se usó para la pre-hibridación y como una solución hibridizante para los manchados Northern. La hibridación toma lugar durante la noche a 65°C usando 4 x 106 cpm/ml de la sonda etiquetada. Los manchados entonces se lavaron en 2X SSC y 0.05% SDS a TM, seguido por lavados en 0. IX SSC y 0.1% SDS a 50°C dos veces a 55° C una vez. Dos transcriptos de aproximadamente 3.2 kb y 5 kb se observaron claramente en todos los tejidos la mayor expresión predominante estando en los testículos.

Ejemplo 3 Asignación Cromosomal y Colocación de ZTMPO-l El ZTMPO-l se mapeó al cromosoma 12 usando el Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge '4 comercialmente disponible (Research Genetic, Inc., Huntsville, AL) . El Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4 contiene el ADN PCRviable de cada uno de los 93 clones híbridos por radiación, más dos ADNs de control (el donador HLF y el recipiente A23) . Un servidor WWW públicamente disponible (http : //www-genome .wi . mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper .pl ) permite el mapeo relativo al Whitehead Institute/MIT Center por el mapa híbrido por radiación del genoma humano por Genome Research' s (el mapa híbrido de radiación "WICGR") , el cual se construyó con el Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4. Para el mapeo de ZTMPO-l con el Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4, 20 µl de las reacciones se colocaron en una placa microtituladora de 96 pozos (Stratagene, La Jolla, CA) y se usó en un circuito termal RoboCycler Gradiente (Stratagene) . Cada una de las reacciones de 95 PCR consisten de 2 µl 10X de amortiguador de reacción KlenTaq PCR (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla dNTPs (2.5 mM cada uno, PERKIN-ELMER, Foster City, CA) , 1 µl de cebador sentido, ZC15,487 (SEC ID NO: 6), 1 µl cebador antisnetido, ZC 15486 (SEC ID NO : 7 ) , 2 µl -RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0.4 µl 50X de mezcla de Polimerasa Advantage KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN de un clon híbrido individual o control y ddH20 para un volumen total de 20 µl . Las reacciones se sobrecargaron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciructo o ciclizador PCR fueron como sigue: un ciclo inicial de 5 minutos, desnaturalización a 95°C, 35 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C, 1 minuto de recocción a 62°C y 1.5 minutos de extensión a 72°C, seguido por una extensión de 1 ciclo final de 7 minutos a 72°C. Las reacciones se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los resultados muestran que los mapas de ZTMPO-l 636.18 cR_300 superiores del cromosoma 12 humano, se ligan a un grupo en el mapa híbrido de radiación WICGR. El marcador de estructura proximal fue D12S367. Esto coloca el ZTMPO-l en la región 12q24.33 en el mapa del cromosoma 12 LBD integrado (The Genetic Location Datábase, University pf Southhampton, WWW servidor: http: //cedar. genetics . soton . ac . uk/public_html/ ) . A partir de lo anterior, se apreciará que a pesar de que las modalidades específicas de la invención, se han descrito aquí para propósitos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y ámbito de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones anexas .

LISIADO DE SECUENCIA <110> ZymoGenetics. Inc. 1201 Eastla e Avenue East Seattle. Washington 98102 Estados Unidos de América <120> PROTHNAZTMPO-1 SOLUBLE <130> 97-67PC <150> 60/082.513 51> 1998-04-21 <150> 32 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 2884 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (127). (2754) 400> 1 aaagttttta atgaaagaaa cagaaactga tgccattata taatgaaccc tagtacccat 60 cacccagctt cagcaggtgt tagtattttg tgactctttg atttttttgt cttgggccta 120 ggtgaa atg acá atg gat gct ctg ttg gct cga ttg aaa ctt ctg aat 168 Met Thr' Met Asp Ala Leu Leu Ala Arg Leu Lys Leu Leu Asn 1 5 10 cea gat gac ctt aga gaa gaa ate gtc aaa gee gga ttg aaa tgt gga 216 Pro Asp Asp Leu Arg Glu Glu lie Val Lys Ala Gly Leu Lys Cys Gly 15 20 25 30 ecc att acá tea act acá agg ttc att ttt gag aaa aaa ttg gct cag 264 Pro He Thr Ser Thr Thr Arg Phe He Phe Glu Lys Lys Leu Ala Gln 35 40 45 gct tta ctg gag caá gga gga agg ctg tet tet ttc tac cae cat gag 312 Ala Leu Leu Glu Gln Gly Gly Arg Leu Ser Ser Phe Tyr His His Glu 50 55 60 gca ggt gtc acá gct etc age cag gac cea caá agg att ttg aag cea 360 Ala Gly Val Thr Ala Leu Ser Gln Asp Pro Gln Arg He Leu Lys Pro 65 70 75 gct gaa ggg aac cea act gat cag gct ggt ttt tet gaa gac aga gat 408 Ala Glu Gly Asn Pro Thr Asp Gln Alá Gly Phe Ser Glu Asp Arg Asp 80 85 90 ttt ggt tac agt gtg ggc ctg aat ect cea gag gag gaa gct gtg acá 456 Phe Gly Tyr Ser Val Gly Leu Asn Pro Pro Glu Glu Glu Ala Val Thr '95 100 105 110 tec aag acc tgc tcg gtg ecc ect agt gac acc gac acc tac aga gct 504 Ser Lys Thr Cys Ser Val Pro Pro Ser Asp Thr Asp Thr Tyr Arg Ala 115 120 125 gga gcg act gcg tet aag gag ceg ecc ctg tac tat ggg gtg tgt cea 552 Gly Ala Thr Ala Ser Lys Glu Pro Pro Leu Tyr Tyr Gly Val Cys Pro 130 135 140 gtg tat gag gac gtc cea gcg aga aat gaa agg ate tat gtt tat gaa 600 Val Tyr Glu Asp Val Pro Ala Arg Asn Glu Arg He Tyr Val Tyr Glu 145 150 155 aat aaa aag gaa gca ttg caá gct gtc aag atg ate aaa ggg tec cga 648 Asn Lys Lys Glu Ala Leu Gln Ala Val Lys Met He Lys Gly Ser Arg 160 165 170 ttt aaa gct ttt tet acc aga gaa gac gct gag aaa"ttt gct aga gga 696 Phe Lys Ala Phe Ser Thr Arg Glu Asp Ala Glu Lys Phe Ala Arg Gly 175 180 185 190 att tgt gat tat ttc ect tet cea age aaa acg tec tta cea ctg tet 744 lie Cys Asp Tyr Phe Pro Ser Pro Ser Lys Thr Ser Leu Pro Leu Ser 195 200 205 ect gtg aaa acá gct cea etc ttt age aat gac agg ttg aaa gat ggt 792 Pro Val Lys Thr Ala Pro Leu Phe Ser Asn Asp Arg Leu Lys Asp Gly 210 215 220 ttg tgc ttg tcg gaa tea gaa acá gtc aac aaa gag cga gcg aac agt 840 Leu Cys Leu Ser Glu Ser Glu Thr Val Asn Lys Glu Arg Ala Asn Ser 230 235 tac aaa aat ecc cgc acg cag gac etc acc gee aag ctt cgg aaa gct 888 Tyr Lys Asn Pro Arg Thr Gln Asp Leu Thr Ala Lys Leu Arg Lys Ala 240 245 250 gtg gag aag gga gag gag gac acc ttt tet gac ctt ate tgg age aac 936 Val Glu Lys Sly Glu Glu Asp Thr Phe Ser Asp Leu He Trp Ser Asn 255 260 265 270 ecc cgg tat ctg ata ggc tea gga gac aac ecc act ate gtg cag gaa 984 Pro Arg Tyr Leu He Gly Ser Gly Asp Asn Pro Thr He Val Gn Glu 275 280 285 ggg tgc agg tac ^ac gtg atg cat gtt gct gee aaa gag aac cag gct 1032 Gly Cys Arg Tyr Asn Val Met His Val Ala Ala lys Glu Asn Gln Ala 290 295 300 tec ate tgc cag ctg act ctg gac gtc ctg gag aac ect gac ttc atg 1080 Ser He Cys Gln Leu Thr Leu Asp Val Leu Glu Asn Pro Asp Phe Met 305 310 315 agg ctg atg tac ect gat gac gac gag gee atg ctg cag aag cgt ate 1128 Arg Leu Met Tyr Pro Asp Asp Asp Glu Ala Met Leu Gln Lys Arg He 320 325 330 cgt tac gtg gtg gac ctg tac etc aac acc ecc gac aag atg ggc tat 1176 Arg Tyr Val Val Asp Leu Tyr Leu Asn Thr Pro Asp Lys Met Gly Tyr 335 340 345 350 gac acá ceg ttg cat ttt gct tgt aag ttt gga aat gca gat gta gtc 1224 Asp Thr Pro Leu His Phe Ala Cys Lys Phe Gly Asn Ala Asp Val Val 355 360 365 aac gtg ctt tcg tea cae cat ttg att gta aaa aac tea agg aat aaa 1272 Asn Val Leu Ser Ser His His Leu He Val Lys Asn Ser Arg Asn Lys 370 375 380 tat gat aaa acá ect gaa gat gta att tgt gaa aga age aaa aat aaa 1320 Tyr Asp Lys Thr Pro Glu Asp Val He Cys Glu Arg Ser Lys Asn Lys 385 390 395 tet gtg gaa ctg aag gag cgg ate aga gag tat tta aag ggc cae tac 1368 Ser Val Glu Leu Lys Glu Arg He Arg Glu Tyr Leu Lys Gly His Tyr 400 405 410 tac gtg ecc etc ctg aga gcg gaa gag act tet tet cea gtc ate ggg 1416 Tyr Val Pro Leu Leu Arg Ala Glu Glu Thr Ser Ser Pro Val He Gly 415 420 425 430 gag ctg tgg tec cea gac cag acg gct gag gcc tet cae gtc age cgc 1464 Glu Leu Trp Ser Pro Asp Gln Thr Ala Glu Ala Ser His Val Ser Arg .435 440 445 tat gga ggc age ecc aga gac ceg gta ctg acc ctg aga gcc ttc gca 1512 Tyr Gly Gly Ser Pro Arg Asp Pro Val Leu Thr Leu Arg Ala Phe Ala 450 455 460 ggg ecc ctg agt cea gcc aag gca gaa gat ttt cgc aag etc tgg aaa 1560 Gly Pro Leu Ser Pro Ala Lys Ala Glu Asp Phe Arg Lys Leu Trp Lys 465 470 475 act cea ect cga gag aaa gca ggc ttc ctt cae cae gtc aag aag tcg 1608 Thr Pro Pro Arg Glu Lys Ala Gly Phe Leu His His Val Lys Lys Ser 480 485 490 gac ceg gaa aga ggc ttt gag aga gtg gga agg gag cta gct cat gag 1656 Asp Pro Glu Arg Gly Phe Glu Arg Val Gly Arg Glu Leu Ala His Glu 495 500 505 510 ctg ggg tat ecc tgg gtt gaa tac tgg gaa ttt ctg ggc tgt ttt gtt 1704 Leu Gly Tyr Pro Trp Val Glu Tyr Trp Glu Phe Leu Gly Cys Phe Val 515 520 525 gat ctg tet tec cag gaa ggc ctg caá aga cta gaa gaa tat etc acá 1752 Asp Leu Ser Ser Gln Glu Gly 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Asn Ala Asp Val Val' Asn Val 355 360 365 Leu Ser Ser His His Leu He Val Lys Asn Ser Arg Asn Lys Tyr Asp 370 375 380 Lys Thr Pro Glu Asp Val He Cys Glu Arg Ser Lys Asn Lys Ser Val 385 390 395 400 Glu Leu Lys Glu Arg He Arg Glu Tyr Leu Lys Gly His Tyr Tyr Val 405 410 415 Pro Leu Leu Arg Ala Glu Glu Thr Ser Ser Pro Val He Gly Glu Leu 420 425 430 Trp Ser Pro Asp Gln Thr Ala Glu Ala Ser His Val Ser Arg Tyr Gly 435 440 445 Gly Ser Pro Arg Asp Pro Val Leu Thr Leu Arg Ala Phe Ala Gly Pro 450 455 460 Leu Ser Pro Ala Lys Ala Glu Asp Phe Arg Lys Leu Trp Lys Thr Pro 465 470 475 480 Pro Arg Glu Lys Ala Gly Phe Leu His His Val Lys Lys Ser Asp Pro 485 490- 495 Glu Arg Gly Phe Glu Arg Val Gly Arg Glu Leu Ala His Glu Leu Gly 500 505 510 Tyr Pro Trp Val Glu Tyr Trp Glu Phe Leu Gly Cys Phe Val Asp Leu 515 520 525 Ser Ser Gln Glu Gly Leu Gln Arg Leu Glu Glu Tyr Leu Thr Gln Gln 530 535 540 Glu He Gly Lys Lys Ala Gln Gln Glu Thr Gly Glu Arg Glu Ala Ser 545 550 555 560 Cys Arg Asp Lys Ala Thr Thr Ser Gly Ser Asn Ser He Ser Val Arg 565 570 575 Ala Phe Leu Asp Glu Asp Asp Met Ser Leu Glu Glu He Lys Asn Arg 580 585 590 Gln Asn Ala Ala Arg Asn Asn Ser Pro Pro Thr Val Gly Ala Phe Gly 595 600 605 His Thr Arg Cys Ser Ala Phe Pro Leu Glu Gln Glu Ala Asp Leu He 610 615 620 Glu Ala Ala Glu Pro Gly Gly -Pro His Ser Ser Arg Asn Gly Leu Cys 625 630 635 640 His Pro Leu Asn His Ser Arg Thr Leu Ala Gly Lys Arg Pro Lys Ala 645 650 655 Pro His Gly Glu Glu Ala His Leu Pro Pro Val Ser Asp Leu Thr Val 660 665 670 Gíu Phe Asp Lys Leu Asn Leu Gln Asn He Gly Arg' Ser Val Ser Lys 675 ' 680 685 Thr Pro Asp Glu Ser Thr Lys Thr Lys Asp Gln He Leu Thr Ser Arg 690 695 700 He Asn Ala Val Glu Arg Asp Leu Leu Glu Pro Ser Pro Ala Asp Gln 705 710 715 720 Leu Gly Asn Gly His Arg Arg Thr Glu Ser Glu Met Ser Ala Arg He 725 730 735 Ala Lys Met Ser Leu Ser Pro Ser Ser Pro Arg His Glu Asp dn Leu 740 745 750 Glu Val Thr Arg Glu Pro Ala Arg Arg Leu Phe Leu Phe Gly Glu Glu 755 760 765 Pro Ser Lys Leu Asp Gln Asp Val Leu Ala Ala Leu Glu Cys Ala Asp 770 775 780 Val Asp Pro His Gln Phe Pro Ala Val His Arg Trp Lys Ser Ala Val 785 790 795 800 Leu Cys Tyr Ser Pro Ser Asp Arg Gln Ser Trp Pro Ser Pro Ala Val 805 810 815 Lys Gly Arg Phe Lys Ser Gln Leu Pro Asp Leu Ser Gly Pro His Ser 820 825 830 Tyr Ser Pro Gly Arg Asn Ser Val Ala Gly Ser Asn Pro Ala Lys Pro 835 840 845 Gly Leu Gly Ser Pro Gly Arg Tyr Ser Pro Val His Gly Ser Gln Leu 850 855 860 Arg Arg Met Aa Arg Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu 865 870 875 <210> 3 211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Asn Tyr Ala Asp Leu Ser Asp Thr Glu Leu Thr Thr Leu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Asn He Pro His Gly Pro Val Val Gly Ser Thr Arg Arg 25 30 Leu Tyr Glu Lys Lys He Phe Glu Tyr Glu Thr Gln Arg Arg Arg Leu 40 45 Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Tyr Ser Phe Ser Asp Leu 50 55 60 Asn Ser Thr Arg Gly Asp Ala Asp Met Tyr Asp Leu Pro Lys Lys Glu 65 70 75 80 Asp Ala Leu Leu Tyr Gln Ser Lys Gly Tyr Asn Asp Asp Tyr Tyr Glu 85 90 95 Glu Ser Tyr Phe Thr Thr Arg Thr Tyr Gly Glu Pro Glu Ser Ala Gly 100 . 105 110 Pro Ser Arg Ala Val Arg Gln Ser Val Thr Ser Phe Pro Asp Ala Asp 115 . 120 125 Ala Phe His His Gln Val His Asp Asp Asp Leu Leu Ser Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Glu Cys Lys Asp Arg Glu Arg Pro Met Tyr Gly Arg Asp Ser Ala 145 150 155 160 Tyr Gln Ser He Thr His Tyr Arg Pro Val Ser Ala Ser Arg Ser Ser 165 170 175 Leu Asp Leu Ser Tyr Tyr Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Phe Met Ser 180 185 190 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Trp Leu Thr Arg Arg Ala He Arg Pro 195 200 205 Glu Asn Arg Ala Pro Gly Ala Gly Leu Gly Gln Asp Arg Gln Val Pro 210 215 220 Leu Trp Gly Glp Leu Leu Leu Phe Leu Val Phe Val He Val Leu Phe 225 230 235 240 Phe He Tyr His Phe Met Gln Ala Glu Glu Gly Asn Pro Phe ; 245 250 <210> 4" <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens 400> 4 Met Pro Glu Phe Leu Glu Asp Pro Ser Val Leu Thr Lys Asp Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Val Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Gln 20 25 30 Arg Lys Asp Val Tyr Val Gln Leu Tyr Leu Gln His Leu Thr Ala Arg 40 45 Asn Arg Pro Pro Leu Pro Ala Gly Thr Asn Ser Lys Gly Pro Pro Asp 50 55 60 Phe Ser Ser Asp Glu Glu Arg Glu Pro Thr Pro Val Leu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ser Arg Ala Ala Val Gly Arg Lys Ala Thr 85 90 95 Lys Lys Thr Asp Lys Pro Arg Gln Glu Asp Lys Asp Asp Leu Asp Val 100 105 110 Thr Glu Leu Thr Asn Glu Asp Leu Leu Asp Gln Leu Val Lys Tyr Gly 115 120 125 Val Asn Pro Gly Pro He Val Gly Thr Thr Arg Lys Leu Tyr Glu Lys 130 . 135 140 Lys Leu Leu Lys Leu Arg Glu Gln Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Thr 145 ' 150 155 160 Pro Leu Pro Thr He Ser Ser Ser Ala Glu Asn Thr Arg Gln Asn Gly 165 170 175 Ser Asn Asp Ser Asp Arg Tyr Ser Asp Asn Glu Glu Gly Lys Lys Lys 180 185 19ff Glu His Lys Lys Val Lys Ser Thr Arg Asp He Val Pro Phe Ser Glu 195 200 205 Leu Gly Thr Thr Pro Ser Gly Gly Gly Phe Phe Gln Gly He Ser Phe 210 * 215 220 Pro Glu lie Ser Thr Arg Pro Pro Leu Gly Ser Thr Glu Leu Gln Ala 225 . 230 235 240 Ala Lys Lys Val His Thr Ser Lys Gly Asp Leu Pro Arg Glu Pro Leu 245 250 255 Val Ala Thr Asn Leu Pro Gly Arg Gly Gln Leu Gln Lys Leu Ala Ser 260 265 270 Glu Arg Asp Leu Phe He Ser Cys Lys Ser Ser His Asp Arg Cys Leu 275 280 285 Glu Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser G n Pro Glu His Ser Ala Met Leu 290 295 300 Val Ser Thr Ala Ala Ser Pro Ser Leu He Lys Glu Thr Thr Thr Gly 305 310 315 320 Tyr Tyr Lys Asp He Val Glu Asn He Cys Gly Arg Glu Lys Ser Gly 325 330 335 He Gln Pro Leu Cys Pro Glu Arg Ser His He Ser Asp G n Ser Pro 340 345 350 Leu Ser Ser Lys Arg Lys Ala Leu Glu Glu Ser Glu Ser Ser Gln Leu 355 360 365 He Ser Pro Pro Leu Ala Gln Ala He Arg Asp Tyr Val Asn Ser Leu 370 375 380 Leu Val Gln Gly Gly Val Gly Ser Leu Pro Gly Thr Ser Asn Ser Met 385 390 395 400 Pro Pro Leu Asp Val Glu Asn He Gln Lys Arg He Asp Gln Ser Lys 405 410 415 Phe Gln Glu Thr Glu Phe Leu Ser Pro Pro Arg Lys Val Pro Arg Leu 420 425 430 Ser Glu Lys Ser Val Glu Glu Arg Asp Ser Gly Ser Phe Val Ala Phe 435 440 445 Gln Asn He Pro Gly Ser Glu Leu Met Ser Ser Phe Ala Lys Thr Val 450 455 460 Val Ser His Ser Leu Thr Thr Leu Gly Leu Glu Val Ala Lys Gln Ser 465 470 475 480 Gln His Asp Lys He Asp Ala Ser Glu Leu Ser Phe Pro Phe His Glu 485 490 495 Ser He Leu Lys Val He Glu Glu Glu Trp Gln Gln Val Asp Arg Gln 500 505 510 Leu Pro Ser Leu Ala Cys Lys Tyr Pro Val Ser Ser Arg Glu Ala Thr 515 -520 525 Gln He Leu Ser Val Pro Lys Val Asp Asp Glu He Leu Gly Phe He 530 535 540 Ser Glu Ala Thr Pro Leu Gly Gly He Gln Ala Ala Ser Thr- Glu Ser 545 550 555 560 Cys Asn Gln Gln Leu Asp Leu Ala Leu Cys Arg Ala Tyr Glu Ala Ala 565 570 575 Ala Ser Ala Leu Gln He Ala Thr His Thr Ala Phe Val Ala Lys Ala 580 585 590 Met Gln Ala Asp He Ser G n Ala Ala Gln lie Leu Ser Ser Asp Pro 595 600 605 Ser Arg Thr His Gln Ala Leu Gly He Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Ala 610 615 620 Ala Ser Tyr He Cys Glu Ala Ala Phe Asp Glu Val Lys Met Ala Ala 625 630 635 640 His Thr Met Gly Asn Ala Thr Val Gly Arg Arg Tyr Leu Trp Leu Lys 645 650 655 Asp Cys Lys He Asn Leu Ala Ser Lys Asn Lys Leu Ala Ser Thr Pro 660 665 670 Phe Lys Gly Gly Thr Leu Phe Gly Gly Glu Val Cys Lys Val He Lys 675 680 685 Lys Arg Gly Asn Lys His 690 <210> 5 <211> 2628 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> Secuencia de nucleótido que codifica al polipéptido de ia SEC ID No. 2 221> variación <222> (1) . .. (2628) <223 Cada N es independientemente uno cualquiera de A,T,G, ó C. <400> 5 atgacnatgg aygcnytnyt ngcnmgnytn aarytnytna ayccngayga yytnmgngar 60 garathgtna argcnggnyt naartgyggn ccnathacnw snacnacnmg nttyathtty 120 garaaraary tngcncargc nytnytngar carggnggn gnytnwsnws nttytaycay 180 caygargcng gngtnacngc nytnwsncar gayccncarm gnathytnaa rccngcngar 240 ggnaayccna cpgaycargc nggnttywsn gargaymgng ayttyggnta ysngtnggn 300 ytnaayccnc cngargarga rgcngtnacn wsnaaracnt gywsngtncc nccnsngay 360 acngayacnt ayfiígngcngg ngcnacngcn wsnaargarc cnccnytnta ytayggngtn 420 tgyccngtnt aygargaygt nccngcnmgn aaygapngna thtaygtnta ygaraayaar 480 aargargcny tncargcpgt naaratgath aarggnwsnm gnttyaargc nttysnacn 540 .mgngargayg cngaraártt ygcngnggn athtgygayt ayttyccnws nccnwsnaar 600 acnwsnytnc cnytnwsncc ngtnaaracn gcnccnytnt tywsnaayga ymgnytnaar 660 gayggnytnt gyytnwsnga rwsngaracn gtnaayaarg armgngcnaa ywsntayaar 720 aayccnmgna cncargayyt nacngcnaar ytnmgnaarg cngtngaraa rggngargar 780 gayacntty sngayytnat htggwsnaay ccnmgntayy tnathggnws nggngayaay 840 cenacnathg tncargargg ntgymgntay aaygtnatgc aygtngcngc naargaraay 900 cargcnwsna thtgycaryt nacnytngay gtnytngara ayccngaytt yatgmgnytn 960 atgtayceng aygaygayga rgcnatgytn caraarmgna thmgntaygt ngtngayytn 1020 tayytnaaya cncengayaa ratgggntay gayacpccny. tncayttygc ntgyaartty 1080 ggnaaygcng aygtngtnaa ygtnytnwsn wsncaycayy tnathgtnaa raaywsnmgn 1140 aayaartayg ayaaracnce pgargaygtn athtgygapn gnwsnaaraa yaarwsngtn 1200 garytnaarg argnathipg ngartayytn aarggncayt aytaygtncc nytnytnmgn 1260 gcngargara cnwsnwsncc ngtnathggn garytntggw sneengayea raengengar 1320 gcnwsncayg tnwsnmgpta yggnggnwsn ccnmgngayc cngtnytnac nytnmgngcn 1380 ttygcnggnc cnytnwsncc ngenaargen gargayttym gnaarytntg gaaracnccn 1440 ccnmgngara argcpggntt yytncaycay gtnaaraarw sngaycenga rmgnggntty 1500 garmgpgtng gnmgngaryt ngcncaygar ytnggntayc cntgggtnga rtaytgggar 1560 ttyytnggnt gyttygtñga yytnwsnwsn cargarggny tncarmgnyt ngargartay 1620 ytnacncarc argarathgg naaraargen carcargara cnggngarmg ngargcnwsn 1680 tgymgngaya agenacnac nwsnggnwsn aaywsnathw sngtnmgngc nttyytpgay 1740 gargaygaya tgwsnytnga rgarathaar aayrogncara aygcngcnmg paayaaywsn 1800 ccnecnacng tnggngcntt yggncayacn mgntgywsng cnttyccnyt ngarcargar 1860 gcngayytna thgargenge ngarccnggn ggnccncayw. snwsnmgnaa yggnytntgy .1920 cayccnytna aycaywsnmg nacnytngcn ggnaarmgnc cnaargcpcc ncayggngar 1980 gargcncayy tnccnccngt nwsngayytn acngtngart tygayaaryt naayytncar 2040 aayathggnm gnwsngtnws naaracncen gaygarwsna cnaaracnaa rgaycarath 2100 ytnacpwsnpi gnathaaygc ngtngapngn gayytnytng arccnwsncc ngengayear 2160 ytnggnaayg gncaymgnmg pacngarwsn garatgwsng cnmgnathgc naaratgwsn 2220 ytnwsnccnw snwsnccnmg ncaygargay carytngarg tnacnmgnga rccngcnmgn 2280 mgnytnttyy tnttyggnga rgarccnwsn aarytngayc argaygtnyt ngcngcnytn 2340 gartgygcng aygtngaycc neayeartty ccngcngtnc aymgntggaa rwsngcngtn 2400 ytntgytayw snccnwsnga ygncarwsn tggccnwsnc cngcngtnaa rggngntty 2460 aarwsncary tnccngayyt nwsnggnccn Caywsntayw snccnggnmg naaywsngtn 2520 gcnggnwsna ayeengenaa rccnggnytn ggnwsnccng gnmgntayws nccngtncay 2580 ggnwsncary tntngnmgnat ggcnmgnytn gcngarytng cngcnytn 2628 <210> 6 <211> ?8 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> O?gonucleot do ZC15487 <400> 6 ggaeccatta catcaact 18 <210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01igonucleotido ZC15486 <400> 7 cctccttgct ccagtaaa 18 <210> 8 <211> 218 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Sonda de Manchado Northern <400> 8 ctcaggcttt actggagcaa ggaggaaggc tgtcttcttt ctaccaccat gaggcaggtg 60 tcacagctct cagccaggac ccacaaagga ttttgaagcc agctgaaggg aacccaactg 120 atcaggctgg tttttetgaa gacagagatt ttggttacag tgtgggcctg aatcctccag 180 aggaggaagc tgtgacatcc aagacctgct cggtgccc 218 <210> 9 211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 ZC694 <400> 9 taatacgact cactatag 18 <210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220 -e2 3> 01 i gonuc eoti d o ZC976 <400> 10 cgttgtaaaa cgacggcc 18 <210> 11 <211> 22 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01 gonucleot? o ZC15976 <400> 11 cagctctgta ggtgtcggtg tc 22 <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01 i gonucleoti d o ZC15485 <400> 12 caccgacacc tacagagc 18 <210> 13 <211> 25 <212» ADN <213> Secuencia Artificial 220> <223 ZC15526 400> 13 tgctccagta aagcctgagc caatt 25 <210> 14 <211> 17 <212> ADN 213> Secuencia Artificial <220> <223> 01igonucleotido ZC447 <400> 14 taacaatttc acacagg 17 <210> 15 <211> 20 <212> ADN 213> Secuencia Artificial <220> <223> 01igonucleotidoZCl5620 <400> 15 acagagctgg agcgactgcg 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN J13 Secuencia Artificial <220> 223> 01 igonucleotido ZC15823 400> 16 tctctttggc agcaacatgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01 igonucleotido ZC16162 <400> 17 gtgcaggtac aacgtgatgc 20 <210> 18 X1> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 01igonucleotido ZC16035 400> 18 ctgacttcat gaggctgatg 20 <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01igonucleotidoZC16249 <400> 19 cagggtacat cagcctcatg 20 <210> 20 <Z11> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC16164 <400> 20 tctgtcttcc caggaaggcc 20 <210> 21 <211> 20 <2i2> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC16163 400> 21 ggaattgctg ccagacgtgg 20 <210> 22 211> 20 <212> ADN < J3> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC16165 <400> 22 agagccttct cccgcagacc 20 <210> 23 01> 20 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido 16037 <400> 23 ggctgctggg actcaaggac 20 210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido API <400> 24 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 25 <211> 25 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> 01tgonucleotidoZC15527 <400> 25 ctcatggtgg tagaaagaag acagc 25 <210> 26 211> 19 212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC695 <400> 26 gatttaggtg acactatag 19 <210> 27 <211> 424 212> ADN <213> Secuencia Artificial <S0> <223> EST934031 <400> 27 gctcgattga aacttctgaa tccagatgac ettagagaag aaatcgtcaa agccggattg 60 aaatgtggac ccattacatc aactacaagg ttcatttttg agaaaaaatt ggctcaggct 120 ttactggagc aaggaggaag gctgtcttct ttctaccacc atgaggcagg tgtcacagct 180 ctcagccagg acccacaaag gattttgaag ccagctgaag ggaacccaac tgatcaggct 240 ggtttttctg aagacagaga ttttggttac agtgtgggcc tgaatcctcc agaggaggaa 300 gctgtgacat ccaagacctg ctcggtgccc cctagtgaca ccgacaccta cagagctgga 360 gcgactgcgt ctataggagc cgccccctgt actatgnggg tgtgtccagt tgtatgagga 420 cgtc 424 <210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01 gonucleoti do ZC15521 <400> 28 gggcaccgag caggtcttgg atgt 24 ^ 210> 29 211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 Oligonucleotido ZC15525 <400> 29 ctcaggcttt actggagcaa ggagg 25 <210> 30 <211> 454 212> PRT <213> Homo sapiens 400> 30 Met Pro Glu Phe Leu Glu Asp Pro Ser Val Leu Thr Lys Asp Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Val Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Gln 20 25 30 Arg Lys Asp Val Tyr Val Gln Leu Tyr Leu Gln His Leu Thr Ala Arg 35 40 45 Asn Arg Pro Pro Leu Pro Ala Gly Thr Asn Ser Lys Gly Pro Pro Asp 50 55 60 Phe Ser Ser Asp Glu Glu Arg Glu Pro Thr Pro Val Leu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ser Arg Ala Ala Val Gly Arg Lys Ala Thr 85 90 95 Lys Lys Thr Asp Lys Pro Arg Gln Glu Asp Lys Asp Asp Leu Asp Val 100 105 110 Thr Glu Leu Thr Asn Glu Asp Leu Leu Asp Gln LLeeuu VVaall Lys Tyr Gly 115 120 125 Val Asn Pro Gly Pro He Val Gly Thr Thr Arg Lys Leu Tyr Glu Lys 130 135 140 Lys Leu Leu Lys Leu Arg Glu Gln Gly Thr Glu SSeerr AArrgg Ser Ser Thr 145 150 " 155 160 Pro Leu Pro Thr He Ser Ser, Ser Ala Glu Asn Thr Arg Gln Asn Gly 165 170 175 Ser Asn Asp Ser Asp Arg Tyr Ser Asp Asn Glu Glu Asp Ser Lys He 180 185 190 Glu Leu Lys Leu Glu Lys Arg Glu Pro Leu Lys GGllyy AArrgg Ala Lys Thr 195 200 205 Pro Val Thr Leu Lys Gln Arg Arg Val Glu His Asn Gln Ser Tyr Ser 210 215 220 Gln Ala Gly He Thr Glu Thr Glu Trp Thr Ser GGllyy SSeerr Ser Lys Gly 225 230 235 240 Gly Pro Leu Gln Ala Leu Thr Arg Glu Ser Thr Arg Gly Ser Arg Arg 245 250 255 Thr Pro Arg Lys Arg Val Glu Thr Ser Glu His Phe Arg He Asp Gly 260 265 270 Pro Val He Ser Glu Ser Thr Pro He Ala Glu Thr He Met Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Glu Ser Leu Val Val Asn Arg Val Thr Gly Asn Phe Lys His 290 295 300 Ala Ser Pro He Leu Pro He Thr Glu Phe Ser Asp He Pro Arg Arg 305 310 315 320 Ala Pro Lys Lys Pro Leu Thr Arg Ala Glu Val Gly Glu Lys Thr Glu - 325 330 335 Glu Arg Arg Val Glu Arg Asp He Leu Lys Glu Met Phe Pro Tyr Glu 340 345 350 Ala Ser Thr Pro Thr Gly He Ser Ala Ser Cys Arg Arg Pro He Lys 355 360 365 Gly Ala Ala Gly Arg Pro Leu Glu Leu Ser Asp Phe Arg Met Glu Glu 370 375 380 Ser Phe Ser Ser Lys Tyr Val Pro Lys Tyr Val Pro Leu Ala Asp Val 385 390 395 .400 Lys Ser Glu Lys Thr Lys Lys Gly Arg Ser He Pro Val Trp He Lys 405 410 415 He Leu Leu Phe Val Val Val Ala Val Phe Leu Phe Leu Val Tyr Gln 420 425 430 Ala Met Glu Thr Asn Gln Val Asn Pro Phe Ser Asn Phe Leu His Val 435 440 445 Asp Pro Arg Lys Ser Asn 450 <21'0> 31 <211> 345 <212> PRT <213> Homo sapiens <4TJ0> 31 Met Pro Glu Phe Leu Glú Asp Pro Ser Val Leu Thr Lys Asp Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Val Ala Asn Asn Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Gln 25 30 Arg Lys Asp Val Tyr Val Gln Leu Tyr Leu Gln His Leu Thr Ala Arg 40 45 Asn Arg Pro Pro Leu Pro Ala Gly Thr Asn Ser Lys Gly Pro Pro Asp 50 55 60 Phe Ser Ser Asp Glu Glu Arg Glu Pro Thr Pro Val Leu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ala Ala ATa Ala Gly Arg Ser Arg Ala Ala Val Gly Arg Lys Ala Thr 85 90 95 Lys Lys Thr Asp Lys Pro Arg Gln Glu Asp Lys Asp Asp Leu Asp Vari 100 105 110 Thr Glu Leu Thr Asn Glu Asp Leu Leu Asp Gln Leu Val Lys Tyr Gly 115 120 125 Val Asn Pro Gly Pro He Val Gly Thr Thr Arg Lys Leu Tyr Glu Lys 130 135 140 Lys Leu Leu Lys Leu Arg Glu Gln Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Thr 145 150 155 160 Pro Leu Pro Thr He Ser Ser Ser Ala Glu Asn Thr Arg Gln Asn Gly - 165 170 175 Ser Asn Asp Ser Asp Arg Tyr Ser Asp Asn Glu Glu Asp Ser Lys He 180 185 190 Glu Leu Lys Leu Glu Lys Arg Glu Pro Leu Lys Gly Arg Ala Lys Thr 195 200 205 Pro Val Thr Leu Lys Gln Arg Arg Val Glu His Asn Gln Val Gly Glu 210 215 220 Lys Thr Glu Glu Arg Arg Val Glu Arg Asp He Leu Lys Glu Met Phe 225 230 235 240 Pro Tyr Glu Ala Ser Thr Pro Thr Gly He Ser Ala Ser Cys Arg Arg 245 250 255 Pro He Lys Gly Ala Ala Gly Arg Pro Leu Glu Leu Ser Asp Phe Arg 260 265 270 Met Glu Glu Ser Phe Ser Ser Lys Tyr Val Pro Lys Tyr Val Pro Leu 275 280 285 Ala Asp Val Lys Ser Glu Lys Thr Lys Lys Gly Arg Ser He Pro Val 290 295 300 Trp He Lys He Leu Leu Phe Val Val Val Ala Val Phe Leu Phe Leu 305 310 315 320 Val Tyr Gln Ala Met Glu Thr Asn Gln Val Asn Pro Phe Ser Asn Phe .325 330 335 Leu His Val Asp Pro Arg Lys Ser Asn 340 345 <210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido AP2 <400> 32 actcactata gggctcgagc ggc 23 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante, para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrita la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de residuos de amino ácidos que es al menos 80% idéntica en secuencia de amino ácido para los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO: 2.

2. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha secuencia de residuos de aminoácidos son al menos 90% idénticos .

3. Un polipéptido de conformidad a la reivindicación 1, caracterizado porque cualquier diferencia entre el polipéptido y los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO: 2, son debidas a la conservación de substituciones de amino ácido conservativos .

4. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido se enlaza específicamente con un anticuerpo que se enlaza específicamente con un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2.

5. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se enlaza covalentemente a una porción seleccionada del grupo que consiste de etiquetas de afinidad,

6. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha porción es una etiqueta de afinidad seleccionada del grupo que consiste de polihistidina, FLAG, Glu-Glu, transfsrasa S de glutationa y una región constante de cadena pesa de inmunoglobulina.

7. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2.

8. Una proteína de fusión, porque consiste esencialmente de una primera porción y una ¡segunda porción anidaí, por un enlace peptídico, dicha primera porción consiste de un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que son al menos 80% idénticos en secuencia de aminoácidos a los residuos 1 hasta 876 de la SEC ID NO: 2; y dicha segunda porción comprende otro polipéptido.

9. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, caracterizado porque se enlaza e ri **s ir r»-? 4- A. f~t \ r. 4- ""* n r-» y ^i T ** vs ? y> 4- i H r^ ""í O ^^ ^ ^ *"*« A s4 -\ *-i 1 * reivindicación 1.

11. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho anticuerpo se selecciona a partir del grupo que /-*,*-»* -r* c* -f c« +* v*"\ /-$/-* • a) anticuerpo policlonal; b) anticuerpo policlonal de murina; c) anticuerpo humanizado derivado de b) ; y d) anticuerpo monoclonal humano.

12. Un fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de F(ab') , F(ab), Fab-', Fv, scFv y una unidad dQ reconocimiento mínima.

13. Un anticuerpo anti-idiotipo, caracterizado porque enlaza específicamente a dicho anticuerpo de ia reivindicación 10.

14. Una proteína enlazante, caracterizada porque se enlaza específicamente a un epitope de un polipéptido de conformidad a la reivindicación 1.

15. Un polinucleótido aislado caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) un poiinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos C sßcußpcis ás sminoácido 3 los ^residuos 1 3S13. 876 d? la SEC ID NO: 2; b) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucieótido de ia SEC ID NO: 5; c) un polinucleótido que permanece rigurosas a un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1, o el complemento de la SEC ID NO: 1.

16. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque dicha secuencia de residuos de aminoácidos es ai menos 90% idéntica.

17. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque cualquier diferencia entre ia secuencia de aminoácido que es codificado por el polínucle?tido y la NO: 2 es debida a una substitución de aminoácido conservativo .

18. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende el nucieótido 127 al nucieótido 2754 de ia SEC ID NO: 1.

19. Un polinucleótido aislado de conformidad a la reivindicación 15, caracterizado porque dicho polinucleótido es ADN.

20. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos enlazados operables : un promotor de transcripción; un segmento de ADN que consiste de un polinucleótido de la reivindicación 15; y un terminador transcripcional.

21. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque dicha secuencia de residuos de aminoácido son ai menos 90% Idénticas .

22. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque cualquier diferencia entre ia secuencia de aminoácido codificada por- el polinucle?tido y la secuencia de m u?ai — a. co vfi?u c?i LC v-?o -i. a • ts debida a una substitución de aminoácido conservativo.

23. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque dicho segmento de ADN codifica a un polipéptido v V d 1 b u c butß ii b d u.?ici c i La u ci a.?i J. J.ci* seleccionada del rupo que consiste de polihistidinß/ Glu-Glu, transferasa S de glutationa y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

24. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque además, comprende una secuencia de señal secretoria operablemente ligada a dicho segmento de ADN.

25. Una célula cultivada en la cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque dicha célula de expresión del polipéptído es codificada por dicho segmento de ADN.

26. Un método para producir un polipétido ZTMPO-l, caracterizado porque comprende: cultivar una célula en ia cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con _ T?» e •-¿> * _-» ?l C - / x u a -- "es a. .x. ca c . expresada del polip?ptido codificado por dicho segmento de ADN; y recuperar dicho polipétido expresado.

27. Un método para la detección de una anormalidad genética en un paciente, caracterizado porque comprende: obtener una muestra genética de un paciente; lu ua x n 0.6 a. ß Uiufeoi-xa JCIICLXL.(J ^^n un ^olinucleótido ^u comprende al menos 14 nucleótidos contiguo.1, de la SEC ID NO: 1 o el complemento de la SEC ID NO: 1, bajo condiciones en donde dicho polinucleótido hibridazará a la secuencia de polinucleótido complementaria, para producir un primer producto de reacción; comparar dicho primer- producto de reacción con un producto de reacción de control, en donde una diferencia entre dicho primer producto de reacción dicho producto de reacción de control eí. indicativo de una anormalidad genética en el paciente.