MXPA01004743A - Proteina similar a la condromodulina de mamifero - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de polinucleótidos y polipéptidos para el polipéptido similar a la condromodulina de mamífero.

Description

PROTEINA SIMILAR A LA CONDROMODULINA DE MAMÍFERO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La condromodulina-I (Chm-I) es un factor descrito del cartílago bovino [Hiraki et al . , BBRC , 1 75 : 971-977 (1991), Hiraki et al . J. Biol . Chem . 271 : 22657-22662 (1996) . La Chm-I se reportó primero como una glicoproteina de 18 kilodaltons (kD) , purificada del cartílago nasal de bovino. La secuencia de aminoácido completa de la proteina purificada se reportó por Neame et al . J. Biol . Chem . 265 : 9628-9633 (1990) . Después, un ADNc codificante que se cree es una variante polimórfica de esta proteina, que difiere por dos residuos de aminoácidos, se aisló a partir de una genoteca de ADNc de cartílago epifisial fetal de bovino por Hiraki et al . , BBRC, 1 75 : 911- 9.11 (1991) . ün ortólogo humano a la Chm-I de bovino, se descubrió por Hirai et al . Solicitud de Patente Europea Serie No. EP-624645-A, presentada el 11 de mayo de 1994. La Chm-I de bovino y humana portan un alto grado de conservación de secuencia estructural. La Chm-I de bovino es producida como un polipéptido precursor del 335 aminoáciods, lo cual es una característica común a Ref: 129518 las proteínas de la superficie celular de la clase II. De manera más notable, el polipéptido precursor tiene una secuencia lider no clásica que es seguida por una secuencia de dominio de la transmembrana putativa hidrofóbica (TDM) . La escisión proteolitica del polipéptido precursor da origen a una proteina madura activa que consiste de los residuos de 121 aminoácidos carboxi-terminal . Una señal de procesamiento (Arg-Glu-Arg-Arg, SEC ID NO: 10) precede de la secuencia de proteina madura. La Chm-I humana y de bovino madura, tiene dos dominios. Un dominio cubre la mitad amino-terminal de la proteina madura. El dominio amino es preferentemente hidrofilico y contiene todos los sitios de glicosilación potencial y exhibe menos conservación de la secuencia que el dominio carboxi-terminal. El dominio carboxi-terminal contiene una región hidrofóbica y ocho residuos de cisteina. Este dominio está altamente conservado en la Chm-I humana y de bovino. Los residuos son 98% idénticos en esta región. El dominio carboxi-terminal de la Chm-I madura ha mostrado ser altamente resistente a la proteinasa y se cree está estrechamente ligado, Neame et al . , J. Biol . Chem . 265 : 9628-9633 (1990). La expresión de un ADNc que codifica a la proteina precursora de Chm-I en las células COS-1 produce una proteina Chm-I procesada en el sobrenadante del cultivo que parece ser estructuralmente y funcionalmente idéntica a la proteina madura nativa. Los transcriptos de Chm-I bovina, se encuentran solamente en los tejidos cartilaginosos. Los niveles de transcriptos altos se localizan en los condrocitos, especialmente abundan en las células en las zonas de cartílago proliferantes, Hiraki et al . , J. Biol . Chem . , 272 : 32419-32426 (1997) . La expresión de Chm-I se localiza específicamente en las zonas avasculares de cartílago en el hueso que se desarrolla y no está expresada en el cartílago calcificante ni en el óseo o en los tejidos suaves circundantes. El estudio inmunohistoquimico indica que la proteina Chm-I se colocaliza con su transcripto. La Chm-I tiene un número de actividades biológicas relacionadas con el cartílago y el hueso. La Chm-I ha mostrado estimular la proliferación de osteoblastos, Mori et al . FEBS Let t . , 406 : 310-314 (1997). La Chm-I de bovino muestra estimular la síntesis del ADN de los condrocitos de la placa de crecimiento del cultivo en la presencia del factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), Hiraki et al . , BBRC, 1 75 : 971-977 (1991). Parece funcionar como un factor de estimulación de la colonia del condrocito autocrino, el cual sinergiza con el FGF-2 para estimular la formación de la colonia de los condrocitos de la placa de crecimiento en los cultivos de agarosa, Inoue et al . BBRC, 241 : 395-400 (1997). Más recientemente, la Chm-I se ha identificado como un inhibidor del crecimiento de células endoteliales, Hiraki et al . FEBS Let t . , 415 : 321-324 (1997) e Hiraki et a l , J. Biol . Chem . , 272 : 32419-32426 (1997). Este hallazgo sugiere que la Chm-I tenga un papel regulatorio en la invasión vascular durante la formación endocondral y el mantenimiento de la avascularización en el cartílago. Existe una necesidad por encontrar factores de crecimiento adicionales, los cuales promuevan el crecimiento del cartílago, músculo, corazón y las células del linaje del tejido mesenquimal en general.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención dirige esta necesidad al proporcionar nuevos polipéptidos y composiciones y métodos relacionados. Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica a una proteina similar a la condromodulina de mamífero llamada Zchml . El polipéptido Zchml humano, con una secuencia de señal, está comprendido de una secuencia de aminoácidos de 317 aminoácidos de longitud con la Met inicial como se muestra en la SEC ID NO : 1 y SEC ID NO : 2. Los residuos de aminoácidos 34-48 de la SEC ID NO: 2 pueden definir un dominio de la transmembrana, también definido por la SEC ID NO : 3. Un dominio de la transmembrana alternativo puede ser definido por los residuos de aminoácidos 31-50 de la SEC ID N0:2, también definido por la SEC ID NO : 4. Los residuos de lisina en las posiciones 213-214 indican un sitio de escisión similarmente entre el residuo de aminoácido 214, una lisina, y un residuo de aminoácido 215, una glicina. Esto podria producir un polipéptido Zchm-1 maduro, que se extiende del residuo de aminoácido 215, una glicina, a través de un residuo de aminoácido 317 de la SEC ID NO: 2, también definido por la SEC ID NO: 5. En una modalidad alternativa, la secuencia madura se extiende del residuo de aminoácido 255, una fenilalanina, a través de un residuo de aminoácido 317 de la SEC ID NO: 2, también definido por la SEC ID NO: 6. Otras formas solubles de Zchm-1 incluyen una secuencia que se extiende del residuo de aminoácido 202 a través del residuo de aminoácido 311 de la SEC ID NO : 2 también definido por la SEC ID NO: 11, y la secuencia que se extiende del residuo de aminoácido 48 a través del residuo de aminoácido 311 de la SEC ID NO: 2 también definida por la SEC ID NO: 12. Dentro de un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende (a) un promotor de transcripción; (b) un segmento de ADN que codifica a un polipéptido Zchml, y (c) un terminador transcripcional, en donde el promotor, el segmento de ADN y el terminador, están operablemente ligados. Dentro de un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula eucariótica cultivada en la cual se ha introducido un vector de expresión como se describe anteriormente, en donde la célula expresa al polipéptido de la proteina codificado por el segmento de ADN. Dentro de un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que consiste esencialmente de una primera porción y una segunda porción unidas por un enlace peptidico. La primera porción del polipéptido quimérico consiste esencialmente de (a) un polipéptido Zchml como se muestra en la SEC ID N0:2, (b) variantes alélicas de la SEC ID NO: 2; y (c) polipéptidos de proteínas que no al menos, 90% idénticos a (a) o (b) . La segunda porción del polipéptido quimérico consiste esencialmente de otro polipéptido tal como una etiqueta de afinidad. Dentro de una modalidad, la etiqueta de afinidad es un polipéptido Fc de inmunoglobulina. La invención también proporciona vectores de expresión que codifican a los polipéptidos quiméricos y las células hospederas transfectadas para producir los polipéptidos quiméricos. Dentro de un aspecto adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo, el cual se enlaza específicamente a un polipéptido Zchml descrito anteriormente, y también un anticuerpo anti-idiotipico, el cual neutraliza el anticuerpo a un polipéptido Zchml . Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un péptido o polipéptido el cual tiene la secuencia de aminoácido de una porción que lleva al epitope de un polipéptido Zchml que tiene una secuencia de aminoácido descrita anteriormente. Los péptidos o polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácido de una porción que lleva un epitope de un polipéptido Zchml de la presente invención, incluyen porciones de tales polipéptidos con al menos nueve, preferiblemente al menos 15 y más preferiblemente al menos 30 a 50 aminoácidos, aunque los polipéptidos que llevan epitopes de cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia de aminoácido completa de un polipéptido de la presente invención descrito anteriormente, también están incluidos en la presente invención. Los ejemplos de tales polipéptidos son polipéptidos comprendidos de las SEC ID NOs: 2, 5, 6, 11, 12 y 16-22. También reivindicados son cualquiera de estos polipéptidos que están fusionados a potros polipéptidos o moléculas portadoras . Previo a la exposición de la invención en detalle, puede ser beneficioso para el entendimiento de la misma, definir los siguientes términos: El término "etiqueta de afinidad" es usado aqui para denotar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar purificación o detección del segundo polipéptido, o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un substrato. En principio, cualquier polipéptido o proteina por la cual un anticuerpo u otro agente de enlace especifico está disponible, puede ser usado como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidin'a, proteina A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferasa S de glutationa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu, (Grussenmeyer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:1952-4, 1985), substancia P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), péptido de enlace a la estreptavidina, u otro epitope antigénico u dominio de enlace. Véase en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Las etiquetas de afinidad que codifican a los ADNs, están disponibles a partir de proveedores comerciales (por ejemplo Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El término "variante alélica" es usado aqui para denotar cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa los mismos locus o sitios cromosomales . La variación alélica se alcanza naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en el polimorfismo fenotipico dentro de las poblaciones. Las mutaciones del gen pueden ser silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácido alteradas. El término variante alélica es también usado aqui para denotar una proteina codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxil-terminal" son usados aqui para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos término son usados con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia carboxil-terminal colocada a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está localizada próxima al término carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el término carboxilo del polipéptido completo. El término "par complemento/anticomplemento", denota porciones no idénticas que forman un par estable, asociado no covalentemente, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son elementos fenotipicos de un par complemento/anticomplemento. Otros pares ejemplares de complemento/anticomplemento, incluyen pares de receptor/ligando, pares anticuerpo/antigeno (o hapteno o epitope) , pares de polinucleótido sentido/antisentido, y similares. En donde la disociación subsecuente del par complemento/anticomplemento es deseable, el par complemento/anticomplemento preferiblemente tiene una afinidad de enlace de <109 M"1. El término "complementos de una molécula de polinucleótido" denota una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia base complementaria y orientación inversa comparada con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' . El término "contig" (o contiguo) denota un polinucleótido que tiene un alargamiento contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Las secuencias contiguas son las que "traslapan" un alargamiento dado de secuencia de polinucleótido ya sea en su totalidad o solo un alargamiento parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los contigs (o contiguos) representativos a la secuencia de polinucleótido 5' -ATGGCTTAGCTT-3' son 5' -TAGCTTgagtct-3' y 3 -gtcgacTACCGA-5' . El término "secuencia de nucleótido degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (como los comparados a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica a un polipéptido) . Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican al mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifican a Asp) . El término "vector de expresión" es usado para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica a un polipéptido de interés operablemente ligado a segmentos adicionales que se proporcionan para su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y pueden también incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un incrementador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión se derivan de manera general, del plasmido o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos . El término "aislado" cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido se ha removido de su medio genético natural y está además, libre de otras secuencias codificantes no deseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para usarse con sistemas de producción de la proteina diseñadas genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que están separadas de su ambiente natural e incluyen clones genómicos y ADNc. Las moléculas ADN aisladas de la presente invención, están libres de otros genes con los cuales están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se originan naturalmente, tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para un ordinario experto en la técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Na ture 31 6: 774-78, 1985) . Un polipéptido o proteina "aislada" es un polipéptido o proteina que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como aparte de la sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, mayores del 95% puro, más preferiblemente mayores del 99% puro. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dimeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas. El término "operablemente ligado", cuando se refiere a los segmentos ADN, indica que los segmentos están colocados de tal forma que funcionan de acorde a sus propósitos propuestos, por ejemplo, inician la transcripción en el promotor y proceden a través del segmento de codificación al terminador. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteina obtenida a partir de unas especies que son la contraparte funcional de un polipéptido o proteina de unas especies diferentes. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la evolución de las especies . "Parálogas" son proteínas distintas, pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Las parálogas se cree se alcanzan a través de la duplicación del gen. Por ejemplo, a-globina, ß-globina, y mioglobina, son parálogas de cada una de las otras . Un "polinucleótido" es un polimero de hebra sencilla o doble de bases de desoxiribonucleótido o ribonucleótido leidas a partir del extremo 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, sintetizados in vi tro, o preparados a partir de una combinación de moléculas sintéticas o naturales. Los tamaños de polinucleótidos están expresados como pares base (abreviados "bp") , nucelótidos ("nt"), o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permite, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de hebra sencilla o doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para denotar la longitud completa y se entenderán como equivalentes al término "pares base". Se reconocerá por aquellos expertos en la técnica, que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en la longitud y que los extremos del mismo pueden ser escalonados como un resultado de la escisión o desdoblamiento enzimático; asi, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polincleótido de doble hebra no pueden ser apareados. Tales extremos no apareados en general, no excederán de 20 nt en longitud. Un "polipéptido" es un polimero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptidicos, de algún modo producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente referidos como "péptidos".

El término "promotor" es usado aqui por su significado reconocido en la técnica para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que se proporcionan para el enlace de la polimerasa de ARN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente pero no siempre, encontradas en las regiones no codificantes 5' de los genes. Una "proteina" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteina puede también comprender componentes no peptidicos, tales como grupos carbohidratos. Los carbohidratos y otros substituyentes no-peptidicos pueden ser agregados a una proteina por la célula en la cual la proteina se produce, y variará con el tipo de célula. Las proteínas están definidas aqui en términos de sus estructuras de esqueletos de aminoácidos; los substituyentes tales como los grupos carbohidratos no están especificados de manera general, pero sin embargo pueden estar presentes. El término "receptor" denota una proteina asociada a la célula que se enlaza a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) , y media el efecto del ligando en la célula. Los receptores que se enlazan a la membrana están caracterizados por una estructura de dominios múltiples que comprenden un dominio extracelular que se enlaza al ligando y un dominio efector intracelular que está típicamente involucrado en la transducción de la señal. El enlace del ligando al receptor resulta en un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otras molécula (s) en la célula. Esta interacción en cambio, conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están ligados a las interacciones ligando-receptor, incluyen la transcripción del gen, fosforilación, desfosforilación, incremento en la producción cíclica de AMP, mobilización del calcio celular, mobilización de los lipidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lipidos de inositol e hidrólisis de los fosfolipidos. En general, los receptores pueden estar enlazados a la membrana, citosólicas o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona que estimula la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multimérico (por ejemplo, receptor PDFG, receptor de la hormona de crecimiento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor eritropoietina y receptor IL-6). El término "secuencia de señal secretoria" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (una "secuencia secretoria") que, como un componente de un polipéptido más largo, dirige el polipéptido más largo a través de una trayectoria secretoria de una célula en la cual es sintetizada. El polipéptido más largo es comúnmente escindido para remover el péptido secretorio durante el tránsito a través de la trayectoria secretoria . El término "variante de unión" se usa aqui para denotar formas alternativas de ARN transcrito de un gen. La variación de unión se alcanza naturalmente a través del uso de sitios de unión alternativos con una molécula de ARN transcrito, o menos comúnmente entre las moléculas de ARN transcritas separadamente, y puede resultar en varios ARNms transcritos a partir de los mismos genes. Las variantes de unión pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido alterada. El término variante de unión es también usado aqui para denotar una proteina codificada por una variante de unión de un ARNm transcrito a partir de un gen.

Los pesos y longitudes de los polímeros determinados por los métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel), se entenderán como valores aproximados. Cuando tal valor está expresado como "aproximado" X o "aproximadamente" X, el valor declarado de X será entendido como exacto hasta +_ 10%. La presente invención dirige esta necesidad al proporcionar nuevos polipéptidos y composiciones y métodos relacionados. Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica a una proteina similar a la condromodulina de mamífero llamada Zchml . El polipéptido Zchml humano, con una secuencia de señal, está comprendido de una secuencia de aminoácidos de 317 aminoácidos de longitud con la Met inicial como se muestra en la SEC ID NO:l y SEC ID NO : 2. Los residuos de aminoácidos 34-48 de la SEC ID NO: 2 pueden definir un dominio de la transmembrana, también definido por la SEC ID NO : 3. Un dominio de la transmembrana alternativo puede ser definido por los residuos de aminoácidos 31-50 de la SEC ID NO: 2, también definido por la SEC ID NO : 4. Los residuos de lisina en las posiciones 213-214 indican un sitio de escisión similarmente entre el residuo de aminoácido 214, una lisina, y un residuo de aminoácido 215, una glicina. Esto podria producir un polipéptido Zchm-1 maduro, que se extiende del residuo de aminoácido 215, una glicina, a través de un residuo de aminoácido 317 de la SEC ID NO: 2, también definido por la SEC ID NO: 5. En una modalidad alternativa, la secuencia madura se extiende del residuo de aminoácido 255, una fenilalanina, a través de un residuo de aminoácido 317 de la SEC ID NO : 2 , también definido por la SEC ID NO: 6. La presente invención dirige esta necesidad al proporcionar nuevos polipéptidos y composiciones y métodos relacionados. Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica a una proteina similar a la condromodulina de mamífero llamadas Zchml . El polipéptido Zchml humano, con una secuencia de señal, está comprendido de una secuencia de aminoácidos de 317 aminoácidos de ' longitud con la Met inicial como se muestra en la SEC ID NO:l y SEC ID NO:2. Los residuos de aminoácidos 34-48 de la SEC ID NO: 2 pueden definir un dominio de la transmembrana, también definido por la SEC ID NO : 3. Un dominio de la transmembrana alternativo puede ser definido por los residuos de aminoácidos 31-50 de la SEC ID NO: 2, también definido por la SEC ID NO: 4. Los residuos de lisina en las posiciones 213-214 indican un sitio de escisión similarmente entre el residuo de aminoácido 214, una lisina, y un residuo de aminoácido 215, una glicina. Esto podria producir un polipéptido Zchm-1 maduro, que se extiende del residuo de aminoácido 215, una glicina, a través de un residuo de aminoácido 317 de la SEC ID NO: 2, también definido por la SEC ID NO: 5. En una modalidad alternativa, la secuencia madura se extiende del residuo de aminoácido 255, una fenilalanina, a través de un residuo de aminoácido 317 de la SEC ID N0:2, también definido por la SEC ID NO : 6. La ausencia de una secuencia lider clásica y la presencia de una secuencia hidrofóbica amino-terminal, el dominio de la transmembrana, son características estructurales de las proteínas de la superficie de las células de clase II. Como tal, la Zchm-1 se puede fijar en la membrana celular via su dominio de la transmembrana y orientar con su termino-carboxi hacia afuera. La proteina precursora Chm-I de bovino se cree adopta la misma configuración en la superficie celular, Hiraki et al . BBRC, 1 75 : 971-977 (1991). La alineación de la Chm-I precursora humana y de bovino con las secuencias de Zchm-I, revela una región mayor de similitud que reside con el carboxil-terminal de más de 63 residuos de aminoácidos. Esta región de Zchm-1 (residuos 255-316) de la SEC ID NO : 2 corresponde al dominio carboxil-terminal de la forma madura y procesada de la Chm-I humana y de bovino y exhibe 65% de identidad de secuencia. Siete de las ocho posiciones de cisteina en esta región de Zchm-1 (Cys265, Cys266, Cys269, Cys276, Cys280, Cys300 y Cys306) son idénticos en la Chm-1 humana y de bovino, con el residuo de cisteina restante único (Cys292) expuesto por cuatro posiciones de residuos hacia el termino amino en la Chm-1. Se predice que el alto grado de conservación de secuencia junto con la casi conservación perfecta de las posiciones de cisteina podrían resultar en los residuos 255-317 adoptando uno de los dos patrones de disulfuro posibles deducidos para la Chm-I de bovino, Neame et a l . , J. Bi ol . Chem . , 265 : 9628-9633 (1990). La conservación de secuencia de aminoácido entre la Zchml y Chm-I disminuye rápidamente para el residuo 255 de la Zchm-I de las secuencias precedentes de la SEC ID NO: 2. La región análoga de la Chm-I humana y de bovino corresponde al dominio N-terminal de la proteina madura la cual también es menos conservada entre la Chm-I de bovino y humana. La conservación de secuencia disminuida en Chm-I sugiere que esta región de la proteina y quizás aquella de la Zchm-I pueden ser funcionalmente menos importante. El sitio de escisión dibásica conservado que da origen a la Chm-I humana y de bovino no está presente en Zchm-I, un sitio de escisión dibásico alternativo puede estar presente en los residuos 213-214 de aminoácidos de la SEC ID NO:2. Estos sitios diferentes no son sitios de procesamientos alternativos en Zchm-I que corresponden al sitio de escisión de la Chm-I. En consecuencia, el polipéptido Zchm-I maduro puede ser una proteina enlazada a la membrana. Existen ejemplos de familias de factores de crecimiento tales como factores del necrosis del tumor, en los cuales, los elementos de la familia son ya sea soluble o son dependientes de la membrana en la susceptibilidad al procesamiento proteolítico.

POLINUCLEOTIDOS La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, incluyendo moléculas de ADN y ARN, que codifican a los polipéptidos Zchml descritos aquí. Aquellos expertos en la técnica fácilmente reconocerán que, en vista de la degeneración del código-genético, la variación de secuencia considerable es posible entre estas moléculas de polinucleótidos. Los polinucleótidos, de manera general una secuencia de ADNc de la presente invención, codifican a los polipéptidos descritos aquí. Una secuencia de ADNc la cual codifica a un polipéptido de la presente invención, está comprendida de una serie de codones, cada residuo de aminoácidos del polipéptido es codificado por un codón y cada codón está comprendido de tres nucleótidos. Los residuos de aminoácidos están codificados por sus codones respectivos como sigue: La alanina (Ala) está codificada por GCA, GCC, GCG o GCT; La cisteína (Cys) está codificada por TGC o TGT; El ácido aspártico (Asp) está codificado por GAC o GAT; El ácido glutámico (Glu) está codificado por GAA o GAG; La fenilalanina (Phe) está codificada por TTC o TTT; La glicina (Gly) está codificada por GGA, GGC, GGG o GGT; La histidina (His) está codificada por CAC o CAT; La isoleucina (He) está codificada por ATA, ATC o ATT; La lisina (Lys) está codificada por AAA, o AAG; La leucina (Leu) está codificada por TTA, TTG, CTA, CTC, CTG, o CTT; La metionina (Met) está codificada por ATG; La asparagina (Asn) está codificada por AAC o ATT; La prolina (Pro) está codificada por CCA, CCC, CCG o CCT; La glutamina (Gln) está codificada por CAÁ o CAG; La arginina (Arg) está codificada por AGA, AGG, CGA, CGC, CGG o CGT; La serina (Ser) está codificada por AGC, AGT, TCA, TCC, TCG o TCT; La treonina (Thr) está codificada pro ACÁ, ACC, ACG o ACT; La valina (Val) está codificada por GTA, GTC, GTG o GTT; El triptofano (Trp) está codificado por TGG; y La tirosina (Tyr) está codificada por TAC o TAT, Se reconoce que de conformidad con la presente invención, cuando un polinucleótido es reivindicado como se describe aquí, se entiende que se reivindican tanto la hebra sentido, la hebra anti-sentido, como el ADN de doble hebra que tienen tanto las hebras sentido como antisentidos anelados juntas por sus enlaces de hidrógeno respectivos. También se reivindica el ARN mensajero (ARNm) , el cual codifica al polipéptido de la presente invención, y en el cual el ARNm está codificado por el ADNc descrito aquí. El ARN (ARNm) mensajero codificará a un polipéptido usando los mismos codones como aquellos definidos aquí, con la excepción de que cada nucleótido de timina (T) es reemplazado por un nucleótido de uracilo (U) . Un ordinario experto en la técnica, también apreciará que diferentes especies pueden exhibir "empleos de codones preferenciales" . En general, véase Grantham, et al . , Nuc . Acids Res . 8 : 1893-1912 (1980); Haas, et al . Curr . Biol . 6: 315-324 (1996); ain-Hobson, et al . , Gene 13 : 355-364 (1981); Grosjean and Fiers, Gene 18 : 199-209 (1982); Holm, Nuc . Acids . Res 14 : 3075-3087 (1986); Ikemura, J. Mol . Biol . 158 : 573-597 (1982). Como se usó aquí, el término "empleo de codon preferencial" o "codones preferenciales", es un término de la técnica con relación a los codones de traducción de la proteína que son más frecuentemente usados en las células de ciertas especies, así se favorecen uno o unos cuantas representativos de los posibles codones que codifican a cada aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido Treonina (Thr) puede ser codificado por ACÁ, ACC, ACG o ACT, pero en las células de mamíferos el ACC es el codon más comúnmente usado; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, levaduras, virus o bacterias, los codones Thr diferentes pueden ser preferenciales . Los codones preferenciales para una especie particular se pueden introducir en los polinucleótidos de la presente invención por una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de las secuencias de codones preferenciales en el ADN recombinante puede, por ejemplo, incrementar la producción de la proteína al hacer la traducción de la proteina más eficiente con un tipo de células o especies particulares. Las secuencias que contienen codones preferenciales se pueden probar y optimizar para la expresión en varias especies, y probar por su funcionalidad como se describe aquí. Dentro de las modalidades preferidas de la invención, los polinucleótidos aislados hibridizarán a las regiones de tamaños similares de la SEC ID N0:1, o una secuencia • complementaria a esta,' bajo condiciones estrictas o rigurosas. En general, las condiciones estrictas o rigurosas se seleccionan por estar entre 5°C o por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definido. La Tm es la temperatura (bajo la fuerza y pH iónico definido) al cual, el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente igualada. Las condiciones rigurosas o estrictas típicas son aquellas en las cuales, la concentración de sal es hasta aproximadamente 0.03 M a pH 7 y la temperatura es al menos aproximadamente 60 °C. Como se notó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para la preparación de ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN es aislado a partir de una célula o tejido que produce grandes cantidades de ARN Zchml. Tales tejidos y células están identificados por los manchados de Northern (Thomas, Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 77:5201, 1980), e incluyen médula ósea y músculo. El ARN total puede prepararse usando la extracción de HCl de guanidina, seguida por el aislamiento mediante centrifugación en un gradiente CsCl (Chirgwin et al . , Biochemistry 18 : 52- 94 , 1979). El Poli (A) + ARN se prepara a partir del ARN total usando el método de Aviv y Leder Proc. Na ti . Acad . Sci . USA 59:1408-12, 1972. El ADN complementario (ADNc) se prepara de poli (A) + ARN usando métodos conocidos. En la alternativa, el ADN genómico puede ser aislado. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Zchml son entonces identificados y asilados mediante, por ejemplo, hibridación o PCR. Un clon de longitud completa que codifica al Zchml se puede obtener por procedimientos de clonación convencionales. Los clones de ADN complementarios (ADNc) son preferidos, aunque para algunas aplicaciones (por ejemplo, expresión en animales transgénicos) puede ser preferible, usar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc para incluir al menos, un intron genómico. Los métodos para la preparación del ADNc y los clones genómicos son bien conocidos y están dentro del nivel del ordinario experto en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita aqui, o partes de la misma, para someter a sondas o someter a cebadores una genoteca. Las genotecas de expresión pueden ser sondeadas con anticuerpos a Zchml, fragmentos de receptores, u otros patrones de enlace específicos.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden también ser sintetizados usando sintetizadores de ADN. Actualmente, el método de selección es el método de fosforamidita. Si el ADN de doble hebra químicamente sintetizado es requerido para una aplicación, tal como la síntesis de un gen o fragmento de gen, entonces cada hebra complementaria se elabora separadamente. La producción de genes cortos (60 a 80 bp) es técnicamente de manera directa y puede estar acompañada por la sintetización de las hebras complementarias y después el alineamiento. Sin embargo, para producir genes más largos (>300 bp) , se podrán invocar las estrategias especiales, debido a que la eficiencia del acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis de ADN químico es rara vez del 100%. Para superar este problema, los genes sintéticos (doble hebra) son ensamblados en forma modular a partir de fragmentos de hebras únicas que son desde 20 hasta 100 nucleótidos de longitud. Véase Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Applica tions of Recombinan t DNA, (ASM Press, Washington, D.C, 1994); Itakura et al . , Annu . Rev. Biochem . 53 : 323-356 (1984) y Cumie et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87 : 633-637 (1990) . La presente invención además proporciona contrapartes de polipéptidos y polinucleótidos de otras especies (ortólogos) . Estas especies incluyen, pero no están limitadas a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. De interés particular son los polipéptidos Zchml de otras especies de mamíferos, que incluyen murina, porcina, ovina, bovina, canina, felina, equina y otros polipéptidos de primates. Los ortólogos de Zchml humano pueden ser clonados usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede ser clonado usando ARNm obtenido a partir de un tipo de tejido o célula que expresa el Zchml como se describe aquí. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden ser identificadas al someter a sondas los manchados Northern con sondas designadas de las secuencias descritas aquí. Una biblioteca es entonces preparada del ARNm de una línea celular o tejido positivo. Un ADNc que codifica al Zchml puede entonces ser aislado por una variedad de métodos, tal como por el sondeo con un ADNc humano parcial o completo o con una o más series de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADNc puede también ser clonado usando la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullís, Patente Estadounidense No. 4,683,202), usando cebadores designados de la secuencia Zchml humana representativa descrita aquí. Dentro de un método adicional, la genoteca de ADNc puede ser usada para transformar o transfectar las células hospederas, y la expresión del ADNc de interés puede ser detectada con un anticuerpo al polipéptido Zchml . Las técnicas similares pueden también ser aplicadas al aislamiento de los clones genómicos . Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEC ID NO:l representa un alelo único de Zchml humano y se espera que ocurra tal variación alélica y uniones alternativas. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas mediante el ADNc de sondeo o las bibliotecas genómicas a partir de individuos diferentes de conformidad con los procedimientos estándares. Las variantes alélicas de la secuencia del ADN mostradas en la SEC ID NO : 1 , incluyendo aquellas que contienen mutaciones silentes y aquellas en las cuales las mutaciones resultan en los cambios de la secuencia de aminoácido, están dentro del ámbito de la presente invención, como son las proteínas las cuales son variantes alélicas de la SEC ID NO : 2. Los ADNcs degenerados a partir de los ARNms alternativamente unidos, los cuales retienen las propiedades del polipéptido Zchml, están incluidos dentro del ámbito de la presente invención, como son los polipéptidos que codifican para tales ADNcs y ARNms. Las variantes alélicas y variantes de unión de estas secuencias pueden ser clonadas mediante el sondeo de ADNc o genotecas de diferentes individuos o tejidos de conformidad con los procedimientos estándares conocidos en la técnica. La presente invención también proporciona polipéptidos Zchml aislados que son substancialmente homólogos a los polipéptidos de la SEC ID NO : 2 y sus ortólogos. El término "substancialmente similar" se usa aquí para denotar polipéptidos que tienen al menos 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente al menos 80% de identidad a las secuencias mostradas en la SEC ID NO : 2 o sus ortólogos. Tales polipéptidos, serán más preferiblemente al menos 90% idénticos y más preferiblemente 95% o más idénticos a la SEC ID NO : 2 o sus ortólogos. El porcentaje de identidad de la secuencia está determinado por los métodos convencionales. Véase por ejemplo, Altschul et al . , Bull . Ma th . Biol . 48 : 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 89:10915-9, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos son alineadas para optimizar los registros de alineación usando una falta de apertura gap de 10, una falta de extensión gap de 1, y la matriz de registro "blosum 62" de Henikoff y Henikoff ( ibid . ) , como se muestra en la Tabla 1 (los aminoácidos están indicados por los códigos estándares de una letra) . El porcentaje de identidad entonces es calculado como: Número total de pares idénticos x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de gaps (aberturas) introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias] o <_p cp A R N !D C Q E G K I L K M P P S T W Y V A 4 R -1 5 N -2 0 e D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 t> -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 .•1 -3 -2 -2 6. H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 ß ? I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 Ol L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 P -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 O 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 s 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 O -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 w -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 O -3 La identidad de la secuencia de las moléculas de polinucleótidos se determina por los métodos usando una proporción como se describe anteriormente. Las variantes de los polipéptidos Zchml o polipéptidos Zchml substancialmente homólogos, están caracterizadas por tener una o más substituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, que son substituciones conservativas de aminoácidos (véase Tabla 2) y otras substituciones que no afectan significantemente el desdoblamiento o actividad del polipéptido; supresiones menores, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxil-terminal menores, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad. La presente invención, así incluye polipéptidos desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, y más preferiblemente 99% o más idénticos a la región correspondiente de la SEC ID NO : 4. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad que pueden además comprender un sitio de desdoblamiento proteolítico entre el polipéptido Zchml y la etiqueta de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen los sitios de desdoblamiento de trombina y los sitios de desdoblamiento del factor Xa.

Tabla 2 Substituciones conservativas de aminoácidos Básicas Arginina Lisina Histidina Acídica : Acido glutámico Ácido aspártico Polar: Glutamina Asparagina Hidrofóbicas: Leucina Isoleucina Valina Aromática Fenilalanina Triptofano Tirosina Pequeña : Glicina Alanina Serina Treonina Metionina La presente invención además proporciona una variedad de otras fusiones de polipéptidos [y proteínas ultiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos]. Por ejemplo, un polipéptido Zchml puede ser preparado como una fusión a una proteína dimerizante como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas dimerizantes preferidas en este sentido, incluyen dominios de región constante de inmunoglobulina. Las fusiones del polipéptido Zchml de inmunoglobulina, pueden ser expresadas en células diseñadas genéticamente [para producir una variedad de análogoso Zchml multiméricos] . Los dominios auxiliares pueden ser fusionados a los polipéptidos Zchml para se objetivos a las células específicas, tejidos o macrotúbulos (por ejemplo, colágeno). Por ejemplo, un polipéptido Zchml o proteína, podrían ser objetivos a un tipo celular predeterminado al someter a fusión un polipéptido Zchml a un ligando que se enlaza específicamente a un receptor en la superficie de la célula objetivo. En esta forma, los polipéptidos y proteínas pueden ser objetivos para los propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido Zchml puede ser fusionado a dos o más porciones, tal como una etiqueta de afinidad para la purificación y un dominio de objetivo o dimerización. Las fusiones del polipéptidos pueden también comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996. Las proteínas de la presente invención pueden también comprender residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente. Los aminoácidos que no se originan naturalmente incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2 , 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metil-g.licina, allo-treonina, metiltreonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3, 3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina . Se conocen varios métodos en la técnica para la incorporación de residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente en las proteínas. Por ejemplo, un sistema in vi tro puede ser empleado cuando las mutaciones no sentido se suprimen usando el tARNs de supresión químicamente aminoacilado . Los métodos para sintetizar aminoácidos y tARN aminoacilantes se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de los plasmidos que contienen mutaciones no sentido se llevan a cabo en un sistema libre de células que comprenden un extracto E . coli S30 y sistemas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase por ejemplo, Robertson et al., J. Am . Chem . Soc . 113 : 2122 , 1991; Ellman et al., Methods Enzymol . 202 : 301 , 1991; Chung et al., Science 259 : 806- 9 , 1993; y Chung et al., Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 90:10145-1019, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus por los microinj ertos de ARNm mutados y supresores químicamente aminoacilados tARNs (Turcatti et al . , J. Biol . Chem . 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, las células E . coli son cultivadas en la ausencia de un aminoácido natural que es reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia de aminoácido (s) deseados que no se originan naturalmente (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina) . El aminoácido que no se origina naturalmente, es incorporado en la proteína en lugar de su contraparte natural. Véase Koide et al., Biohem . 33 : 1 1 - , 1994. Los residuos de aminoácidos que se originan naturalmente pueden ser convertidos a especies que no se originan naturalmente por la modificación química in vi tro . La modificación química puede ser combinada con mutagénesis dirigida al sitio para expandir además el rango de substituciones (Wynn y Richards, Protein Sci . 2:395-403, 1993). Un número limitado de aminoácidos no. conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que no se originan naturalmente y aminoácidos no naturales pueden ser substituidos por los residuos de aminoácidos Zchml. Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden ser identificados de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244 : 1081-1085, 1989; Bass et al . , Proc .

Nati. Acad. Sci. USA 88:4498-502, 1991). En la última técnica, las mutaciones únicas de alanina son introducidas a todos los residuos en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas por su actividad biológica como se describen abajo para identificar residuos de aminoácidos que son críticos a la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699-708, 1996. Los sitios de interacción del receptor-ligando pueden también ser determinados por los análisis físicos de estructura, como se determinan por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción del electrón, o etiquetación de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de los aminoácidos de sitio de contacto putativo. Véase por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 244:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las substituciones múltiples de aminoácidos se pueden hacer y probar usando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tal como aquellas descritas por Reidhaar-Olson y Sauer Science 241: 53-7 , (1988) o Bowiw y Sauer Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2152-6, (1989). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionado por el polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de las substituciones permitibles a cada posición. Otros métodos que pueden ser usados incluyen exposición del fago por ejemplo, Lowman et al . , Biochem 30:10832-10837, (1991); Ladner et al . , Patente Estadounidense No. 5,223,409; Huse, publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región Derbyshire et al . , Gene 46 : 145 , 1986; Ner et al., ADN 7:127, 1988). Las variantes del ADN Zchml descritas y las secuencias de polipéptidos pueden ser generadas a través del desordenamiento del ADN como se describe por Stemmer, Na ture 370:389-91, 1994 y Stemmer, Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 91 : 10141 -51 , 1994, y Publicación WIPO WO 97/20078. Brevemente, las variantes ADNs son generadas por recombinación homologa in vi tro por fragmentación aleatoria de un ADN original, seguida por el reensamblamiento usando PCR, resultando en las mutaciones de punto aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede ser modificada usando una familia de un ADNs original, tal como variantes alélicas o genes a partir de las especies diferentes, introducen la ?-variabilidad adicional en el proceso. La selección o proyección para la actividad deseada, seguida por las interacciones adicionales de mutagénes y ensayos, proporcionan rápida "evolución" de las secuencias por la selección de mutaciones deseables, mientras simultáneamente se seleccionan contra los cambios perjudiciales . Los métodos de mutagénesis como se describen aquí, pueden ser combinados con métodos de selección automatizados, de alta salida para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados en las células hospederas. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos, pueden ser recuperadas a partir de las células hospederas y rápidamente secuenciadas usando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructuras desconocidas. Usando los métodos discutidos aquí, un ordinario experto en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de fragmentos o variantes de polipéptidos de la SEC ID NO: 2 o que retienen las propiedades de la proteína Zchml de tipo silvestre. Para cualquier polipéptido zchml, que incluye variantes y proteínas de fusión, un ordinario experto en la técnica puede fácilmente generar una secuencia de polinucleótido completamente degenerada que codifica tal variante usando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriores.

PRODUCCIÓN DE LA PROTEINA Los polipéptidos de Zchml de la presente invención, incluyen polipéptidos de longitud completa, fragmentos biológicamente activos, y polipéptidos de fusión, pueden ser producidos en células hospederas genéticamente diseñadas de conformidad con las técnicas convencionales. Las células hospederas adecuadas son aquellos tipos de células que pueden ser transformadas o transfectadas con ADN exógeno y que crecen en cultivos, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucarióticas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para la manipulación de las moléculas de ADN clonadas y la introducción del ADN exógeno en una variedad de células hospederas están descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora tory Manual , 2nd . Ed. , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y Ausubel et al . , eds . , Current Protocols in Molecular Biology¿_ John Wiley and Sons, Inc., NY 1987. En general, una secuencia de ADN que codifica un polipétpido Zchml está operablemente ligada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, generalmente incluyendo un promotor y terminador de transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también comúnmente contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que con ciertos sistemas de marcadores seleccionables pueden ser proporcionados en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada por la integración del genoma en la célula hospedera. La selección de promotores, terminadores, marcadores selccionables, vectores y otros elementos es un tema de rutina designado con el nivel del experto en la técnica. Muchos elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido Zchml en la trayectoria secretoria de una célula hospederos, una secuencia de señal secretoria (también conocida como una secuencia líder, secuencia de señal, secuencia prepro o secuencia pre) se proporcionan en el vector de expresión. La secuencia de la señal secretoria puede ser aquella del Zchml o puede derivarse de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretoria está operablemente ligada a la secuencia ADN Zchml, es decir, las dos secuencias están unidas en la estructura lectora correcta y colocadas para dirigir .el polipéptido nuevamente sintetizado en la trayectoria secretoria de la célula hospederos. Las secuencias de señal secretorias son comúnmente colocadas en el 5' a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal secretorias pueden ser colocadas de cualquier modo en la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., Patente Norteamericana No. 5,037,743; Holland et al., Patente Estadounidense No. 5,143,830). Alternativamente, la secuencia de señal secretoria contenida en los polipéptidos de la presente invención se usan para dirigir otros polipépotidos en la trayectoria secretoria. La presente invención proporciona tales polipéptidos de fusión. La secuencia de señal secretoria contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención, está preferiblemente amino terminalmente fusionada a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional en la trayectoria secretoria. Tales constructos tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estos nuevos constructos de fusión de la secuencia de señal secretora pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada, tal como un receptor. Tales fusiones pueden ser usadas in vivo o in vitro para dirigir los péptidos a través de la trayectoria secretoria. Las células de mamíferos cultivadas son hospederos adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir el ADN exógeno en las células hospederas de mamíferos incluyen transfección mediada por fosfato de calcio. Wigler et al., Cell 14 : 125 , (1978); Corsaro y Pearson, Soma tic Cell Geneti cs 7:603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52 : 456 , (1973), electroporación Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, (1982), transfección mediada por DEAE-dextrano Ausubel et al., ibid. , y transfección mediada por el liposoma Hawley-Nelson e't al . , Focus 15 : 13 , 1993; Ciccarone et al . , Focus 15 : 80 , (1993), y vectores virales Miller y Rosman, BioTechniques 7:980-90; 1989; Wang y Finer, Na ture Med. 2 : 114 , (1996). Se describe la producción de los polipéptidos recombinantes en las células cultivadas de mamíferos, por ejemplo por Levinson et al., Patente Estadounidense No. 4,713,339; Hagen et al., Patente Estadounidense No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente Estadounidense No. 4,579,821; y Ringold, Patente Estadounidense No. 4,656,134. Las células cultivadas de mamíferos adecuadas incluyen la COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC NO. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen . Virol . 36: 59-12 , (1977) y ovario de Hámster Chino (por ejemplo CHO-Kl; ATCC No. CCL 61) líneas celulares. Las líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en la técnica y están disponibles de depósitos públicos tal como el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. En general, se prefieren los promotores fuertes de la transcripción, tal como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de metalotioneina (Patentes Estadounidenses Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor último mayor de adenovirus. La selección del fármaco es usada generalmente para seleccionar células cultivadas de mamíferos en las cuales el ADN extraño ha sido insertado. Tales células son comúnmente referidas como "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en la presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés en su progenie son referidas como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia de la neomicina al antibiótico. La selección se lleva a cabo en la presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección pueden también ser usados para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo mediante la cultivación de los transfectantes en la presencia de un nivel bajo del agente selectivo y después incrementar la cantidad del agente selectivo seleccionado para las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificado preferido es la reductasa de dihidrofolato, la cual confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a los fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, acetiltransferasa de la puromicina) pueden también ser usados. Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde, o proteínas de superficie celular tal como CD4, CD8, MHC Clase I, fosfatasa alcalina placental pueden ser usados para distribuir células transfectadas de células no transfectas por tales medios como FACS de distribución o tecnología de separación de cama magnética. Otras células eucarióticas superiores pueden también ser usadas como hospederas, incluyen células de plantas, células de insectos y células de aves. El uso de Agroba cteri um rhizogenes como un vector para expresar genes en las células de plantas que han sido revisadas por Sinkar et al., J. Biosci . (Bangalore) 11 : 47-58 , 1987. La transformación de las células de insectos y la producción de los polipéptidos ajenos se describen por Guarino et al., Patente Estadounidense No. 5,162,222 y Publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insectos pueden ser infectadas con vectores de baculovirus recombinantes, los cuales son comúnmente derivados de virus de polihedrosis nuclear múltiples de Autographa californica (AcNPV) . El ADN que codifica el polipéptido Zchml, es insertado en el genoma baculoviral en lugar del gen polihedrina AcNPV que codifica la secuencia por uno de los dos métodos. El primero es el método tradicional de recombinación de ADN homólogo entre el AcNPV de tipo silvestre, y un vector de transferencia que contiene las secuencias AcNPV por flanqueo de Zchml . Las células de insecto adecuadas, por ejemplo células SF9, son infectadas con AcNPV de tipo silvestre y transfectadas con un vector de transferencia que comprende un polinucleótido Zchml operablemente ligado a un promotor de gen de polihedrina AcNPV, terminador y secuencias de flanqueo. Véase, King, L.A. y Posee, R. D., The Baculovirus Expression System : A Labora tory Guide, (Chapman & Hall, London); O'Reilly, D. R. et al., Baculovirus Expression Vectors : A Labora tory Manual (Oxford University Press, New York, 1994); y Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols . Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ 1995) . La recombinación natural con una célula de insecto resultará en un baculovirus recombinante el cual contiene Zchml accionado por el promotor de polihedrina. Los depósitos virales recombinantes se elaboran por métodos comúnmente usados en la técnica. El segundo método de elaboración del baculovirus recombinante, utiliza un sistema a base del transposon descrito por Luckow, V.A, et al . , J Virol 67 : 4566 (1993) . Este sistema es vendido en el equipo Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBacl™ (Life Technologies) que contiene un transposon Tn7 para mover el ADN que codifica al polipéptido Zchml en un genoma de baculovirus mantenido en E . coli como un plasmido grande llamadao un "bacmido". El vector de transferencia pFastBacl™ utiliza el promotor de polihedrina AcNPV para accionar la expresión del gen de interés, en este caso Zchml._Sin embargo, el pFastBacl™ puede ser modificado a un grado considerable. El promotor de polihedrina se puede remover y substituir con el promotor de la proteína básica del baculovirus (también conocido como promotor Peor, p6.9 o MP) el cual es expresado tempranamente en la infección del baculovirus, y se ha mostrado como ventajoso para la expresión de las proteínas secretadas. Véase Hill-Perkin, M.S y Posee, R. D., J Gen Virol 71; 971 (1990); Bonning, B. C. et al . , J Gen Virol 75 : 1551 (1994); y Chazenbalk, G. D., y Rapoport, B., J Biol Chem 270 : 1543 (1995) . En tal constructo de vector de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Sin embargo, los vectores de transferencia se pueden construir, los cuales reemplazan a las secuencias de señal secretoria de Zchml nativa, con las secuencias de señal secretoria derivada de las proteínas de insectos. Por ejemplo, una señal de secuencia secretoria de Glucosiltransferasa de Ecdisteroide (EGT), Melitina de miel de abeja (Invitrogen, Carlsbad, CA) o baculovirus gpß7 (PharMingen, San Diego, CA) , puede ser usada en los constructos para reemplazar la secuencia de señal secretoria de Zchml nativa. Además, los vectores de transferencia puede incluir una fusión en estructura con el ADN que codifica a un extremo epitope al C o N-término del polipéptido Zchml expresado, por ejemplo un extremo de epitope Glu-Glu, Grussenmeyer, T. et al., Proc Na ti Acad Sci . 82 : 7952 (1985). Usando una técnica conocida en la técnica, un vector de transferencia que contiene la Zchml se transforma en E . coli , y se selecciona para los bacmidos los cuales contienen un gen lacZ interrumpido indicativo del baculovirus recombinantes. Se aisla el ADN bacmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante, usando técnicas comunes y usados para transfectar las células de Sodoptera fugiperda , por ejemplo células Sf9. Los virus recombinantes que expresan Zchml se producen subsecuentemente. Los depósitos virales recombinantes se elaboran por métodos comúnmente usados en la técnica. El virus recombinante resultante se usa para infectar células hospederas, típicamente una linea celular derivada del gusano soldado, Spodoptera frugiperda . Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applica tions of Recombinan t ADN, ASM Pres , Washington , D . C. , 1994 . Otra línea celular adecuada es la línea celular alta FiveO™ (Invitrogen), derivada de Tri chopl usia ni (Patente Estadounidense .#5,300,435). El medio libre de suero comercialmente disponible, se usa para crecer y mantener las células. El medio estable es Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cel0405™ (JRH Biosciences, Lexena, KS) o Express Five™ (Life Technologies) para las células T. ni . Las células se hacen crecer hata una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células al tiempo del cual un depósito viral recombinante se agrega a una multipicidad de infección (MOI) de 0.1 a 10, más típicamente, cercana a 3. Las células infectadas con el virus recombinante, típicamente producen el polipéptido Zchml recombinante a las 12-72 horas post-infección y se secretan con eficiencia variante en el medio. El cultivo es cosechado usualmente 48 horas post-infección . La centrifugación se usa para separar las células del medio (sobrenadante) . El sobrenadante que contiene el polipéptido Zchml se filtra a través de filtros microporos, usualmente de 0.45 µm de tamaño de poro. Los procedimientos usados se describen de manera genral en manuales de laboratorio disponibles (King, L. A. y Posee, R. D., ibid., O'Reilly, D. R. et al., ibid.; Richardson, C.D. ibid.). La purificación subsecuente del polipéptido de Zchml a partir del sobrenadante, se puede alcanzar usando métodos descritos aquí . Las células fúngales, incluyendo células de levaduras, pueden ser usadas dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés particular en este sentido, incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris , y Pichia methanolica . Los métodos para la transformación de las células S . cerevisiae con ADN exógeno y que producen polipéptidos recombinantes a partir de estos, se describen mediante, por ejemplo, Kawasaki, Patente Estadounidense No. 4,599,311; Kawasaki et al., Patente Estadounidense No. 4,931,373; Brake, Patente Estadounidense No.4, 870, 008; Welch et al. Patente Estadounidense No. 5,037,743; y Murray et al., Patente Estadounidense No. 4,845,075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente de resistencia al fármaco o por la habilidad para crecer en la ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vector preferido para usarse en Sa ccharomyces cerevisia e en el sistema vector POT1 descrito por Kawasaki et al., (Patente Estadounidense No. 4,931,373), permite a las células transformadas ser seleccionadas por el crecimiento en el medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usarse en la levadura incluyen aquellos a partir de las enzimas glicolíticas (véase por ejemplo, Kawasaki, Patente Norteamericana No., 4,599,311; Kingsman et al., Patente Estadounidense No. 4,615,974; y Bitter, Patente Estadounidense No. 4,977,092) y genes de deshidrogenasa del alcohol. Véase también Patentes Estadounidenses Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras incluyen Hansenula polymorpha , Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis , Kl uyveromyces fragilis , Ustilago maydis, Pichia pastoris , Pichia methanolica , Pichia gui llermondii y Candida mal tosa son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen . Microbiol . 132 : 3459- 65 , 1986 y Cregg, Patente Estadounidense No. 4,882,279. Las células Aspergill us pueden ser utilizadas de conformidad con los métodos de McKnight et al., Patente Estadounidense No. 4,935,349. Se describen los métodos para la transformación de Acremoni um chrysogenum se describen por Sumino et al., Patente Estadounidense No. 5,162,228. Los métodos para la transformación de Neurospora se describen por Lambowitz, Patente Estadounidense No. 4,486,533. El uso de la Pi chia methanoli ca como hospederos para la producción de las proteínas recombinantes se describe en las Publicaciones WIPO WO 97/17450 y W097/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para usarse en la transformación de P. methanoli ca serán comúnmente preparadas como plasmidos circulares de doble hebra, los cuales son preferiblemente linearizados antes de la transformación. Para la producción del polipéptido en P. methanolica , se prefiere que el promotor y el terminador en el plasmido sea aquel de un gen P. methanoli ca , tal como un gen de utilización de alcohol P. methanolica (AUG1 o AUG2) . Otros promotores empleados incluyen aquellos de la sintasa de dihidroxiacetona (DHAS) , deshidrogenasa de formiato (FDM) , y genes catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospederos, se prefiere tener el segmento de expresión total del plasmido flanqueado a ambos extremos por las secuencias del ADN hospederos. Un marcador seleccionable preferido para usarse en Pi chia methanoli ca es el gen P. methanol i ca ADE2 , el cual codifica al de fosforibosil-5-aminoimidazolcarboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), los cuales permiten a las células hospederas ade2, crecer en la ausencia de adenina. Para gran escala, los procesos industriales en donde es deseable minimizar el uso de metanol, prefieren usar células hospederas en la cual ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2) son suprimidos. Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren las células hospederas deficientes en los genes proteasa vacuolar ( PEP4 y PRV1) . La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plasmido que contiene un ADN que codifica a un polipéptido de interés en las células P. methanol i ca . Se prefiere transformar a las células P. methanoli ca mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsado, exponencialmente descompuesto, que tiene un campo de extensión de 2.5 a 4., 5 kV/cm, preferiblemente, de aproximadamente 3.75 kV/cm, y un tiempo constante (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferiblemente aproximadamente 20 milisegundos. Las células hospederas procarióticas, incluyendo hebras de la bacteria Escherichia coli , Ba cill us y otros géneros son también empleadas como células hospederas dentro de la presente invención. Las técnicas para la transformación de estos hospederos y que expresan las secuencias de ADN extrañas, clonadas aquí, son bien conocidas en la técnica véase por ejemplo, Sambrook et al., ibid. Cuando se expresa un polipéptido Zchm-1 en la bacteria tal como E. coli , el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso formador, las células son usadas, y los granulos son recuperados y desnaturalizados usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede entonces ser replegado y dimerizado por la dilución del desnaturalizante, tal como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguida por diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido puede ser recuperado del espacio periplasmático en una forma soluble y funcional por el rompimiento de las célula (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) , para liberar los contenidos del espacio periplasmático y recuperar la proteína, con ello se obvia la necesidad de la desnaturalización y repliegue. Las células hospederas transformadas o transfectadas .son cultivadas de conformidad con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento y la selección de la célula hospederas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo el medio definido y el medio complejo, se conocen en la técnica y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. El medio puede también contener tales componentes como los factores del crecimiento o el suero, como se requiera. El medio de crecimiento generalmente se seleccionará de células que contienen el ADN exógenamente agregados por ejemplo, la selección o deficiencia del fármaco, en un nutriente esencial el cual es complementado por el marcador seleccionable llevado en el vector de expresión o co-transfectados en la célula hospederos. Las células P. methanoli ca son cultivadas en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y rastros de nutrientes a una temperatura de aproximadamente 25°C hasta 35°C. Los cultivos líquidos se proporcionan con suficiente aireación por medios convencionales, tal como sacudimiento de frascos pequeños o rocío de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanoli ca es YEPD (D-glucosa al 2%, Peptone Bacto™ al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto™ al 1% (Difco Laboratories), 0.004% de adenina y L-leucina al 0.006%).

Aislamiento de la Proteína Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a >_80% de pureza, más preferiblemente a ^> 90% de pureza, aún más preferiblemente >95% de pureza, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es mayor de 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes de infecciones y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Los polipéptidos Zchm-1 recombinantes expresados (o polipéptoidos Zchm-1 quiméricos o de fusión) pueden ser purificados usando métodos y medios de fraccionación y/o purificación convencional. La precipitación de sulfato de amonio y ácido o extracción de chaotropos pueden ser usadas para el fraccionamiento de muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. El medio cromatográfico adecuado incluye dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, silices de especialidad y similares. Se prefieren los derivados PEÍ, DEAE, QAE y Q. El medio cromatográfico ejemplar incluye aquellos medios derivatizados con los grupos fenilo, butilo u octilo, tal como Fenil-Sefarosa FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octil-Sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tal como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen camas vitreas, resinas a base de sílice, resinas celulósicas, camas de agarosa, camas de agarosa reticuladas, camas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y las similares que son insolubles bajo condiciones en las cuales son usadas. Estos soportes pueden ser modificados con grupos reactivos que permiten la unión de las proteínas por los grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones de carbohidratos. Los ejemplos de quimicas de acoplamiento incluyen activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epoxidos, activación de sulfhidrilo, activación de hidrazida, y derivados amino y carboxilo para las quimicas de acoplamiento de carbodiimidas . Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente usados en la técnica y son disponibles de los proveedores comerciales. Los métodos para enlazar los polipéptidos del receptor al medio de soporte son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es un tema de diseño de rutina y se determina en parte por las propiedades del soporte seleccionado. Véase por ejemplo, Affini ty Chroma tography: Principies & Methods , (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala , Sweden 1988). Los polipéptidos de la presente invención pueden ser aislados por explotación de sus propiedades enlazantes. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de ion metálico inmobilizado (IMAC), puede ser usada para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden etiquetas de polihistidina . Brevemente, un gel es cargado primero con iones de metal divalente para formar un quelato Sulkowski, Trends in Biochem . 3 : 1 -1 , 1985). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán por esta matriz con afinidades que difieren, dependiendo del ion metálico usado, y serán eluidas por elución competitiva, disminuyendo el pH o el uso de agentes de quelación fuertes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas por cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio de iones Methods in Enzymol . , Vol.. 182, "Guide to Protein Purification", M.

Deutscher, (ed.), (Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529-39) . Dentro de las modalidades adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y un etiqueta de afinidad (por ejemplo el etiqueta Glu-Glu) pueden ser construidos para facilitar la purificación. Sin embargo, usando los métodos descritos en la técnica, se construyen las fusiones de polipéptidos o proteínas Zchml híbridas, usando regiones o dominios de la Zchml inventiva, Sambrook et al . , ibid. , Altschul et al . , ibid . , Picard, Cur. Opin . Biology, 5:511 (1994). Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de dominios o regiones grandes en un polipéptido de interés. Tales híbridos pueden alterar los cinéticos de reacción, enlaces, contraer o expandir la especificidad del substrato, o alterar el tejido y la localización celular de un polipéptido, y pueden aplicarse a los polipéptidos de estructura desconocida. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica por la preparación de cada componente de la proteína de fusión y químicamente conjugándolos. Alternativamente, un polinucleótido que codifica a ambos componentes de la proteína de fusión en su estructura lectora apropiada, puede ser generado usando técnicas conocidas y expresado por los métodos descritos aquí. Por ejemplo, parte o todos los dominios que se relacionan con una función biológica, se pueden escalonar entre Zchml de la presente invención con el dominio o dominios funcionalmente equivalentes de otros miembros de la familia. Tales dominios incluyen, pero no están limitados a, la secuencia de señal secretoria, conservada y dominios o regiones significantes en esta familia. Tales proteínas de fusión podrá esperarse tengan un perfil funcional biológico que son los mismos o similares a los polipéptidos de la presente invención u otra familia conocida de proteínas, dependiendo de la fusión construida. Sin embargo, tales proteínas de fusión pueden presentar otras propiedades como se describe aquí. Los polipéptidos Zchml o fragmentos del mismo pueden ser preparados a través de síntesis química. Los polipéptidos Zchml pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial.

Síntesis Química de Polipéptidos Los polipéptidos, especialmente los polipéptidos de la presente invención, pueden también ser sintetizados por síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensación de fragmento o síntesis de solución clásica. Los polipéptidos son preferiblemente preparados por la síntesis petídica de fase sólida, por ejemplo, como se describe por Merrifield, J Am . Chem . Soc . 85 : 2149 (1963) .

ENSAYOS La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir usando una variedad de ensayos. La Zchml se pude medir in vi tro usando células cultivadas o in vivo, mediante la administración de moléculas de la invención reivindicadas al modelo animal apropiado. Por ejemplo, las células hospederas de expresión de Zchml transfectada (o co- transfectadas) se pueden embeber en un ambiente de alginato e inyectar (implantadas) en recipientes animales. La microencapsulación alginato-poli-L-lisina, la encapsulación de la membrana permeselectiva y las cámaras de difusión, se han descrito como un medio para atrapar células de mamíferos transfectadas o células de mamíferos principales. Estos tipos de "encapsulaciones" no inmunogénicas o microambientes, permiten la transferencia de nutrientes en el microambiente, y también permiten la difusión de las proteínas y otras macromoléculas secretadas o liberadas por las células capturadas a través de la barrera ambiental al recipiente animal. Más importantemente, las cápsulas o ambientes se enmascaran y protegen a las células embebidas, ajenas, de la respuesta inmune del recipiente animal. Tales microambientes pueden ampliar la vida de las células inyectadas de unas cuantas horas o días (células no protegidas) a varias semanas (células embebidas). Un procedimiento in vivo alternativo para ensayar las proteínas de la presente invención, involucra los sistemas de suministro viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen, adenovirus, virus del herpes, virus vaccinia y virus adeno-asociados (AAV) . El adenovirus, un virus de ADN de doble hebra, es actualmente el vector de transferencia de gen mejor estudiado para el suministro del ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véase T.C. Becker et al .- , Meth . Cell . Bi ol . 43 : 161 (1994); y J. T Douglas y D.T.

Curiel, Science & Medi cine 4 : 44 (1997). El sistema de adenovirus ofrece varias desventajas: el adenovirus puede (i) acomodar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) crecer a tituladores altos; (iii) infectar un rango amplio de tipos de células de mamíferos; y (iv) ser usado con un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores. También debido a que los adenovirus son estables en la corriente sanginea, pueden ser administrados por inyección intravenosa. Mediante las porciones suprimidas del genoma de adenovirus, se pueden acomodar los insertos grandes (hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos se pueden incorporar en el ADN viral por ligación directa o por recombinación homologa con un plasmido co-transfectado . En un sistema ejemplar, el gen El esencial se ha suprimido del vector viral, y el virus no se replicará a menos que el gen El se proporcione por la célula hospedera (la línea celular 293 humana es ejemplar). Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus se dirige principalmente al hígado. Si el sistema de suministro adenoviral tiene una supresión del gen El, el virus no se puede replicar en las células hospederas. Sin embargo, el tejido del hospedero (por ejemplo hígado), expresará y procesará (y si está presente una secuencia de señal secretoria, secreta) a la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en circulación en el hígado altamente vascularizado, y se podrán determinar los efectos en el animal infectado. El sistema de adenovirus puede también ser usado para la producción de la proteína in vi tro . Mediante el cultivo de los adenovirus infectados no en las células 293 bajo condiciones en donde las células no se están rápidamente dividiendo, las células pueden producir proteínas por periodos prolongados de tiempo. Por ejemplo, las células HBK se hacen crecer a confluencia en los factores celulares, luego se exponen al vector adenoviral que codifica a la proteína secretada de interés. Las células se hacen crecer entonces bajo condiciones de suero libre, lo cual permite a las células infectadas sobrevivir pro varias semanas sin la división celular significante. Alternativamente, las células 293D infectadas con el vector de adenovirus, crecen en una suspensión de cultivo a una densidad celular relativamente alta para producir cantidades significantes de proteína (véase Garnier et al . , Cytotechnol . 15 : 145 (1994). Con cualquier protocolo, una proteína heteróloga secretada, expresada, puede ser aislada repetidamente del sobrenadante de cultivo celular. Dentro del protocolo de producción de las células 293S infectadas, las proteínas no secretadas se pueden también obtener efectivamente.

Agonistas y Antagonistas En vista de la distribución del tejido observada para Zchml, los agonistas (incluyendo el ligando natural/substrat/cofactor/etc . ) , y los antagonistas tienen enormes potenciales en las aplicaciones tanto in vi tro como in vivo . Por ejemplo, los compuestos Zchml y agonistas, son empleados como componentes de medios de cultivos celulares definidos, y pueden ser usados solos o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que es comúnmente usado en el cultivo celular.

Antagonistas Los antagonistas son empleados también como reactivos de búsqueda para la caracterización de sitios de interacción del ligando-receptor. También como un tratamiento para el cáncer de próstata. Los inhibidores de la actividad Zchml (antagonistas Zchml) incluyen anticuerpos anti-Zchml y receptores de Zchml solubles, así como también, otros agentes peptídicos y no peptídicos (incluyendo ribozimas) . La Zchml puede también ser usada para identificar inhibidores (antagonistas) de su actividad. Se agregan los compuestos de prueba a los ensayos descritos aquí para identificar compuestos que inhiben la actividad de Zchml . Además de estos ensayos descritos aquí, se puden probar muestras para la inhibición de la actividad de Zchml dentro de una variedad de ensayos designados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de Zchm-1. Por ejemplo, las líneas celulares responsables de Zchml pueden ser transfectadas con un constructo de gen reportero que es responsable de una trayectoria celular estimulada por Zchml . Los constructos del gen reportero de este tipo se conocen en la técnica, y comprenderán de manera general un elemento de respuesta de ADN-Zchml operablemente ligado a un gen que codifica a una proteina la cual puede ser ensayada, tal como luciferasa. Los elementos de respuesta de ADN pueden incluir, pero no estar limitados a, elementos de respuesta al AMP cíclicos (CRE) , elementos de respuesta a la hormona (HRE) , elementos de respuesta a la insulina (IRÉ), Nasrin et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87 : 5273 (1990) y elementos de respuesta al suero (SRE) (Shaw et al. Cell 56: 563 (1989). Los elementos de respuesta AMP cíclicos se revisan en Roestler et al . , J. Biol . Chem . 263 (19):9063 (1988) y Habener, Molec . Endocrinol . 4 (8):1087 (1990). Los elementos de respuesta a la hormona se revisan en Beato, Cell 56: 35 (1989). Los compuestos candidatos, soluciones, mezclas o extractos, son probados por su capacidad para inhibir la actividad de Zchml en las células objetivo como evidencia por un decremento en la estimulación de Zchml de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectarán compuestos que bloquean directamente el enlace Zchml a los receptores de la superficie cleular, así como también a los compuestos que bloquean los procesos en la trayectoria celular subsecuente al enlace receptor-ligando. En una alternativa, los compuestos u otras muestras pueden ser probadas por su bloqueo directo del enlace de Zchml al receptor usando blancos de Zchml con una etiqueta detectable (por ejemplo, 125I, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC, y similares) . Dentro de los ensayos de este tipo, la habilidad de cada muestra para inhibir el enlace del Zchml etiquetado al receptor, es indicativa de la actividad inhibitoria, la cual puede ser confirmada a través de los ensayos secundarios. Los receptores usados con los ensayos de enlace pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados, aislados . Un polipéptido Zchml puede ser expresado como una fusión con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc, el cual contiene dos dominios de región constante y carece de la región variable. Los métodos apra preparar tales fusiones se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,155,027 y 5,567,587. Tales fusiones son típicamente secretadas como moléculas multiméricas en donde las porciones Fc son disulfuros enlazados a cada uno de los otros y dos polipéptidos no Ig están colocados en proximidad cercana a cada otro. Las fusiones de ete tipo se pueden usar para purificar la afinidad del ligando. Para uso en ensayos, las quimeras se enlazan a un soporte vía la región Fc y se usan en un formato de ELISA. Un polipéptido que se enlaza al ligando Zchml puede también ser usado para la purificación del ligando. El polipéptido se inmoviliza en un soporte sólido, tal como perlillas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas a base de sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para enlazar polipéptidos a los soportes sólidos se conocen en la técnica, e incluyen química de amina, activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación de sulfhidrilo, y activación de hidrazida. El medio resultante generalmente se configurará en la forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasarán a través de la columna una o más veces para permitir al ligando, enlazarse al polipéptido receptor. El ligando es entonces eluido usando cambios en la concentración de sal, agentes chaotrópicos (HCl de guanidina), o pH para romper el enlace ligando-receptor. Un sistema de ensayo que usa un receptor de enlace al ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de enlace del mismo, y puede ser ventajosamente empleado un instrumento biosensor comerciablemente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) . Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anti-complemento o fragmento, se inmoviliza en la superficie de un chip receptor. El uso de estos instrumentos se describe por Karlsson, J. Immunol . Methods 145 : 229 (1991) y Cunningham y Wells, J. Mol . Biol . 234 : 554 (1993). Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento, está covalentemente unido, usando química de amina o sulfhidrilo, a las fibras de dextrano que están unidas a películas doradas dentro del flujo celular. Se pasa a través de la célula, una muestra de prueba. Si un ligando, epitope o miembro opuesto del par complemento/anti-complemento está presente en la muestra, se enalazará al receptor inmovilizado, anticuerpo o miembro, respectivamente, causando un cambio en el Índice refractivo del medio, el cual se detecta como un cambio en la resonancia plasmon de la superficie de la película dorada. Este sistema permite la determinación de proporciones sobre de y fuera de la cual la afinidad de enlace de puede calcular, y la valoración de la estequiometría del enlace. Los polipéptidos del receptor de enlace-ligando se pueden usar también dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen análisis Scatchard para la determinación de la afinidad de enlace, Scatchard Ann . NY Acad . Sci . 51 : 660 ("1949) y ensayos calorimétricos, Cunningham et al . , Science 253 : 545 (1991); Cunningham et al., Si ence 245 : 821 (1991). Los polipéptidos Zchml pueden también ser usados para preparar anticuerpos que se enlazan específicamente a los epitopes Zchml, péptidos o polipéptidos. El polipéptido Zchml o un fragmento del mismo, sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular una animal y estimular una respuesta inmune. Los antígenos adecuados podrían ser el polipéptido Zchml codificado por las SEC ID NOs:2-24. Los anticuerpos generados a partir de esta respuesta inmune, pueden ser aislados y purificados como se describe aquí. Los métodos para la preparación y aislamiento de los anticuerpos monoclonales y policlonales, son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Curren t protocol s in Immunology, Cooligan et a l . (eds . ) , National Institutes of Health, (John Wyiley and Sons, Inc., 1995); Sambrook et al., Molecua lr Cloning: A Labora tory Manual , Secund Edi tion, (Cold Spring Harbor, NY 1989); y Hurrel, J.G.R., (Ed.), Monoclonal Hybridoma An tibodies : Techniques and Applica tions , CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982.

Como podrá ser evidente para un ordinario experto en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden ser generados a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente, tal como caballos, vacas, carneros, ovejas, perros, pollitos, conejos, ratones y ratas con un polipéptido Zchml o un fragmento del mismo. La imunogenicidad de un polipéptido Zchml puede incrementarse a través del uso de un adyuvante, tal como alum (hidróxido de aluminio) o adyuvante Freund completo o incompleto. Los polipéptidos empleados para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tal como fusiones de Zchml o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína que se enlaza a la maltosa. El polipéptido inmunógeno puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es "como el hapteno", tal porción puede ser ventajosamente unida o ligada a un portador macr.omolecular (tal como la hemocianina del limpet clave (KLH) , albúmina de suero bovino (BSA) o tetanus toxoide) para inmunización. Como se usó aquí, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos que se enlazan al antígeno, tal como fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos diseñados genéticamente, tales como los anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena única y similares, así como también péptidos y polipéptidos que se enlazan al antigeno, están también incluidos. Los anticuerpos no-humanos pueden ser humanizados por el injerto no humano de CDRs en la estructura humana y regiones constantes, o mediante la incorporación de los dominios variables no humanos completos (opcionalmente "cubriéndolos" con una superifice como la humana por el reemplazo de los residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "revestido"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de la región variable no humana para incrementar las características del enlace propio. A través de los anticuerpos humnizados, se puede incrementar la vida media biológica y el potencial para las reacciones inmunes adversas después que se reduce la administración a humanos . Las técnicas alternativas para la generación o selección de anticuerpos empleados aquí, incluyen la exposición in vi tro de los linfocitos a la proteína o péptido Zchml, y la selección de las bibliotecas que presentan anticuerpos en los vectores del fago o similares (por ejemplo, a través del uso de proteínas o péptidos Zchml etiquetados o inmovilizados). Los genes que codifican a los polipéptidos que tienen dominios de enlace al polipéptido Zchml potencial, pueden ser obtenidos mediante la selección aleatoria de las bibliotecas de péptidos presentadas en el fago (que presentan fago) o en la bacteria, tal como E . coli . Las secuencias de nucleótidos que codifican a los polipéptidos, se pueden obtener en un número de vias, tal como a través de la mutagénesis aleatoria y síntesis aleatoria de polinucleótidos. Estas bibliotecas que presentan péptidos aleatorios pueden ser usadas para seleccionar péptidos que interactúan con un objetivo conocido, el cual puede ser una proteína o un péptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o substancias orgánicas o inorgáncias. Las técnicas para la creación y selección de tales bibliotecas que presentan péptidos aleatorios se conoce en la téncia (Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,223,409; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 4 , 946 ,778 ; Ladner et al., Patente Norteamericana No.5, 403, 484 y Ladner et al., Patente Norteamericana NO. 5,571,698) y bibliotecas que presentan péptidos aleatorios y equipos para seleccionar tales bibliotecas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego CA) , New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las bibliotecas que presentan péptidos aleatorios pueden ser seleccionadas usando las secuencias Zchml descritas aquí para identificar proteínas las cuales se enlazan a Zchml. Estas "proteínas de enlace" las cuales interactúan con los polipéptidos Zchml pueden ser usadas para células etiquetadas; por aislamineto de los polipéptidos homólogos por purificación de afinidad, pueden ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionuclidos y similares. Estas proteínas de enlace pueden también ser usadas en métodos analíticos tal como para selección de las bibliotecas de expresión y neutralización de la actividad. Las proteínas de enlace pueden también ser usadas para los ensayos diagnósticos para determinar los niveles de circulación de los polipétidos; para detectar o cuantificar los polipéptidos solubles como marcadores de la patología o padecimientos subrayados. Estas proteínas de enlace pueden también actuar como "antagonistas" de Zchml para bloquear el enlace de Zchml y la traducción de la señal in vi tro e in vivo . Estas proteínas de enlace anti-Zchml, podrán ser empleadas para inhibir los efectos de Zchml . Los anticuerpos se determinan por ser específicamente enlazantes si: 1) presentan un nivel de umbral de actividad enlazante, y/o 2) no reaccionan significantemente opuesto con las moléculas de polipéptidos relacionados. Primero, los anticuerpos aquí, se enlazan específicamente si se enlazan a un polipéptido, péptido o epitope Zchml, con una afinidad de enlace (Ka) de 106 M_1 o mayores, preferiblemente 107 M"1 o mayores, más preferiblmente 108 M"1 o mayores, y más preferiblemente 109 M_1 o mayores. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser fácilmente determinada por un ordinario experto en la técnica, por ejemplo, por el análisis Scatchard. Segundo, los anticuerpos son determinados por enlazarse específicamente si no reaccionan significantemente contrario con los polipéptidos relacionados. Los anticuerpos no reaccionan contrario significantemente con las moléculas de polipéptidos relacionados, por ejemplo, si detectan Zchml, pero no polipéptidos relacionados conocidos, usando análisis de manchado Western estándar (Ausubel et al., ibid) . Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son ortólogos, proteínas de la mismas especies que son miembros de una familia de proteínas (por ejemplo, IL-16) , polipéptidos Zchml, y Zchml no humanos. Sin embargo, los anticuerpos pueden ser polipéptidos relacionados conocidos "contra los seleccionados", que aislan la población que específicamente se enlaza a los polipéptidos inventivos. Por ejemplo, los anticuerpos alcanzados por Zchml son adsorbidos a polipéptidos relacionados adheridos a la matriz insoluble; anticuerpos específicos a Zchml fluirán a través de la matriz bajo las condiciones de amortiguadores propias. Tales selecciones permiten el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales que no reaccionan contrariamente a los polipéptidos estrechamente relacionados An tbodies : A Labora tory Manua l , Harlow y Lañe (eds.), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al . , (Eds.), National Institutes of Health, (John Wilwy and /Sons, Ine, 1995) . La selección y aislamiento de los anticuerpos específicos es bien conocida en la técnica. Véase, Fundamen tal Immunology, Paul (eds), (Raven Press, 1993); Getzoff et al . , Ad. In Immunol . 43 : 1-98, 1988; Monoclonal An tibodies : Principies and Pra ctice, Goding, J.W. (eds.), (Academic Press Ltd., 1996); Benjamin et al., Ann . Rev. Immunol . 2 : 61 - 101 1984. Una variedad de ensayos concidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser utilizados para detectar anticuerpos y proteínas de enlace, las cuales se enlazan específicamnte a las proteínas Zchml o péptidos. Los ensayos ejemplares se describen en detalle en An tibodies : A Labora tory Manual , Harlow and Lañe (Eds.), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA) ; manchado de punto, o ensayo de manchado Western, ensayos de inhibición o competición y ensayo intercalado. Además, los anticuerpos pueden ser seleccionados por enlazarse a una proteína o polipéptido Zchml mutante contra el tipo silvestre. Los anticuerpos a Zchml pueden ser usados para etiquetación de células que expresan Zchml; por aislamiento de Zchml mediante purificación de afinidad; por ensayos de diagnóstico para la determinación de los niveles circulantes de los polipéptidos Zchml; para detectar o cuantificar el Zchml soluble como marcador de la patología subrayada o padecimientos; en métodos analíticos que emplean FACS; para las bibliotecas de expresión por selección; por la generación de anticuerpos anti-idiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear el enlace Zchml in vi tro e in vivo . Las etiquetas o marcadores directos adecuados incluyen radionuclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las etiquetas o marcadores indirectos pueden usar características de biotina-avidina u otros pares complemento/anticomplemento como intermediarios. Los anticuerpos aquí pueden también ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionuclidos y similares, y estos conjugados usados para las aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo . Sin embargo, los anticuerpos a Zchml o fragmentos del mismo, pueden ser usados in vi tro para detectar Zchml desnaturalizada o fragmentos de la misma en ensayos, por ejemplo, manchados Western u otros ensayos conocidos en la técnica.

CONJUGADOS BIOACTIVOS Los anticuerpos o polipéptidos aquí pueden también ser directamente o indirectamente conjugados a los fármacos, toxinas, radionuclidos y similares, y estos conjugados se usan para las aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo . Por ejemplo, polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anti-complementaria correspondiente (receptor o antígeno respectivamente, por ejemplo) . Más específicamente, los polipéptidos Zchml o anticuerpos anti-Zchml, o fragmentos bioactivos o porciones de los mismos, pueden ser acoplados a las moléculas detectables o citotóxicas y liberadas en un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anti-complementaria. Las moléculas detectables adecuadas pueden estar directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluir radionuclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden estar directamente o indirectamente unidas al polipéptido o anticuerpo, e incluir toxinas bacterianas o de plantas (por ejemplo, toxina difteria, endotoxinas de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como también radionuclidos terapéuticos, tal como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (ya sea directamente unido al polipéptido o anticuerpo, o indirectamente unido a través de medios de una porción quelante, por ejemplo). Los polipéptidos o anticuerpos pueden también ser conjugados a los grupos citotóxicos, tal como adriamicina. Para unión indirecta de una molécula citotóxica o detectable, la molécula citotóxica o detectable puede ser conjugada con un elemento de un par complementario/anticomplementario, en donde el otro elemento está enlazado a la porción DEL polipéptido o anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ejemplar. En otra modalidad, las proteínas de fusión de toxinas del péptido o proteínas de fusión de toxinas del anticuerpo, se pueden usar para la inhibición o extirpación del tejido o célula objetivo (por ejemplo, para tratar células o tejidos con cáncer). Alternativamente, si el polipéptido tiene dominios funcionales múltiples (es decir, un dominio de activación o un dominio de enlace al ligando, más un dominio objetivo), una proteína de fusión que incluye solamente el dominio objetivo, puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a una célula o tipo de tejido de interés. En ejemplos en donde la proteína de fusión solamente de dominio, incluye una molécula complementaria, la molécula anti-complementaria puede ser conjugada a una molécula detectable o citotóxica. Tales proteínas de fusión de moléculas complementarias de dominios así, representan un vehículo de objetivo genérico para el suministro específico de la célula/tejido de conjugados de moléculas detectables/citotóxicas anti-complementarias genéricas. En otra modalidad, las proteínas de fusión de la citocina de Zchml o proteínas de fusión de anticuerpo-cítocina, se pueden usar para incrementar la muerte in vivo de los tejidos objetivos (por ejemplo, cánceres de la médula ósea y de la sangre), si el polipéptido Zchml o un anticuerpo anti-Zchml se dirige a las células de la médula ósea o la sangre hiperproliferativas. Véase, de manera general, Hornick et a l . , Blood 89 : 4437 (1997). Describe las proteínas de fusión, capaces de dirigirse de una citocina, a un sitio deseado de acción, con ello, se proporciona una concentración local elevada de citocina. Los polipéptidos Zchml adecuados o anticuerpos anti-Zchml se dirigen a una célula o tejido deseado (es decir, un tumor o una leucemia), y la lisis de la célula objetivo mejorada mediada por la citocina fusionada, por las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este propósito, incluyen por ejemplo, la interleucina 2 y el factor de estimulación de la colonia del macrófago del granulocito (GM-CSF) . En aún otra modalidad, si el polipéptido Zchml o anticuerpo anti-Zchml se dirige a las células o tejidos vasculares, tal polipéptido o anticuerpo puede ser conjugado con un radionúclido, y particularmente con un radionúclido de emisión beta, para reducir la restenosis. Tales procedimientos terapéuticos poseen menos daño a los médicos clínicos cuando administran la terapia radioactiva. Por ejemplo, los ribones impregnados de iridio-192 colocados juntos en recipientes enviados de pacientes hasta que la radicación requerida se suministre, muestran la dismunición del crecimiento del tejido en los recipientes y diámetros luminales mayores que el grupo de control, el cual recibió ribones de placebo. Además, la revascularización y la trombosis enviada, fueron significantemente inferiores en el grupo de tratamiento. Se predicen resultados similares con la dirección de un conjugado bioactivo que contiene un radionúclido como se describe aquí. El polipéptido bioactivo o conjugados de anticuerpos descritos aquí, pueden ser suministrados intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente, o pueden ser introducidos localmente al sitio propuesto de acción.

USOS DEL POLINUCLEOTIDO/POLIPEPTIDO Los polipéptidos de la presente invención pueden ser usados como un regulador de crecimiento o diferenciación para las células, especialmente aquellas de las células mesenquimales, miogénicas, condrogénicas y endoteliales. Las preparaciones de la Zchml se pueden colocar en áreas en necesidad de reparación del cartílago o del hueso. La Zchml puede también ser administrada a los músculos o células endoteliales, las cuales están en necesidad de reparación. En lugar de polipéptido, el gen Zchml se puede administrar como se describe abajo.

TERAPIA DEL GEN Los polinucleótidos que codifican a los polipéptidos Zchml son empleados con las aplicaciones de la terapia del gen, en donde se desea incrementar o inhibir la actividad de Zchml . Si un mamífero tiene un gen Zchml mutado o ausente, el gen Zchml puede ser introducido en la células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido Zchml se introduce in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virs ADN defectivo o atenuado, tal como, pero no limitado a, el virus del herpes simplex (HSV), papilomavirus, virus Epstein Barr (EBV) , adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , y similares. Los virus defectivos, los cuales completamente o casi completamente carecen de los genes virales son preferidos. Un virus defectivo no es infectivo después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectivos permite la adminsitración a las células en un área específica, localizada, sin referirse a que tal vector puede infectar otras células. Los Ejemplos de los vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector del virus del herpes simple defectivo 1 (HSV1), Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, (1991); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 626-30 , (1992); y un vector de virus adeno-asociado defectivo, Samulski et al., J. Virol. 61:3096, (1987); Samulski et al., J. Virol. 63: 3822, (1989). En otra modalidad, un gen Zchml puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al., Patente Estadounidense No. 5,399,346; Mann et al., Cell 33:153, 1983; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,650,764; Temin et al., Patente Estadounidense No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, (1988); Temin et al., Patente Estadounidense No. 5,124,263; Publicación de Patente Internacional No. WO 95/07358, publicado el 16 marzo de 1996 por Dougherty et al., y Kou et al., Blood 82:845, 1993. Alternativamente, el vector puede ser introducido por lipofección in vivo usando liposomas. Los lípidos catiónicos sintétios pueden ser usados para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador, Felgner et al . , Proc Na ti . Acad. Sci . USA 84 : 1413 , 1987; Mackey et al., Proc . Na ti . Acad. Sci , USA 85 : 8021 -31 , (1988). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Los blancos u objetivos moleculares de las liposomas a las células específicas representan un área benéfica. Más particualrmente, la tranfección dirigida a las células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, la transfección que se dirige a tipos celulares particulares, podrá ser particularmente ventajosa en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, higado, riñon y cerebro. Los lipidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para los propósitos objetivos. Los péptidos objetivos (por ejemplo hormonas o neutrotransmisores) , proteínas tales como anticuerpos o moléculas no peptíticas, pueden ser acopladas a las liposomas químicamente. Es posible remover las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plasmido ADN desnudo; y después re-implantar las células transforamdas en el cuerpo. Los vectores AND desnudos para la terapia del gen, pueden ser introducidos en las células huésped deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAR, precipitación de fosfato de calcio, uso de un gen propulsor o uso de un vector ADN transportador. Véase por ejemplo, Wu et al., J. Biol . Chem . 267 : 963 , (1992); Wu et al . , J. Biol . Chem . 263 : 14621 -4 , 1988. Se puede usar la metodología antisentido para inhibir la transcripción del gen Zchml, tal como inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica al Zchml (por ejemplo, un polinucleótido como se expone en la SEC ID NO : 1 ) se designan para enlazar a un ARNm que codifica a Zchml y para inhibir la traducción de tal ARNm. Tales polinucleótidos antisentidos se usan para inhibir la expresión de los genes que codifican al polipéptido Zchml en el cultivo celular o en un sujeto. La presente invención también proporciona reactivos que encuentran uso en las aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen Zchml, una sonda que comprende el ADN o ARN Zchml, o una subsecuencia del mismo, pueden ser usados para determinar si el gen Zchml está presente en el cromosoma llpl5.4 o si una mutación ha ocurrido. Las aberraciones cromosomales detectables en el gen Zchml incluyen locus o sitios, pero no están limitados a aneuploides, cambios en el número de copia del gen, inserciones, supresiones, restricciones, sitios de cambio y reacomodos. Estas aberraciones pueden detectarse usando polinucleótidos de la presente invención, mediante el empleo de las técnicas genéticas moleculares, tal como análisis de polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , técnicas de PCR empleando análsis de repetición de orden corto (SRT) , y otras técnicas de análisis de enlace genético conocidas en la técnica (Sambrook et al., ibid.; Ausubel et. al., ibid.; Marian, Chest 108:255 (1995). Los ratones transgénicos, diseñados genéticamente para expresar el gen Zchml y los ratones que presentan una ausencia completa de la función del gen Zchml, referidos como "ratones noqueados o golpeados" Snouwaert et al., Science 257 : 1083 , 1992), pueden también generarse Lowell et al., Na ture 366: 740-42, 1993). Estos ratones pueden ser empelados para estudiar el gen Zchml y la proteína codificada con ello en un sistema in vivo .

LOCALIZACION CROMOSOMAL La formación de mapas híbridos por radiación, es una técnica genética de células somáticas, desarrollada para cronstruir mapas cotiguos, de alta resolución, de cromosomas de mamíferos (Cox et al., Science 250-245 (1990). El conocimiento completo o parcial de una secuencia de gen, permite a uno diseñar genéticamente, cebadores de PCR adecuados para usarse con los paneles de formación de mapas híbridos por radiación cromosomal. Los paneles de formación de mapas híbridos por radiación, están comercialmente disponibles, los cuales cubren el genoma humano completo, tal como el Panel RH G3 de Stanford y el Panes RH 4 GeneBridge (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Estos paneles permiten las localizaciones cromosomales a base de PCR, rápidas, y el ordenamiento de los genes, sitios etiquetados de secuencia (STSs), y otros marcadores no polimórficos y polimórficos, dentro de una región de interés. Estos incluyen el establecimiento de las distancias físicas directamente proporcionales entre los genes de interés recientemente descubiertos y los marcadores previamente mapeados . El conocimiento preciso de una posición del gen, puede ser útil para un número de propósitos, incluyendo: 1) determinar si una secuencia es parte de un contigo existente y obtención de secuencias genéticas adicionales circundantes en varias formas, tales como los clones YACs, BACs, o ADNc; 2) proporcionar un gen candidato posible para un padecimiento hereditable, el cual muestra enlace a la misma región cromosomal; 3) los organismos de modelos de referencia de cruzas, tal como un ratón, el cual puee ayudar en la determinación de que función podría tener un gen particular. El Zchml se mapeó a la región del cromosoma llpl5.4. Los sitios etiquetados de secuencias (STSs), pueden también ser usados independientemente para la localización cromosomal. Un STS es una secuencia de ADN que es única en el genoma humano y puede ser usada como un punto de referencia para un cromosoma particular o región de un cromosoma. Un STS se define por un par de cebadores de oligonucleótidos que son usados en una reacción en cadena de la polimerasa pra detectar específicamente este sitio en la presencia de todas las otras secuencias genómicas. Puesto que el STSs se basan solamente en la secuencia de ADN que pueden ser completamente descritas dentro de una basa de datos electrónica, por ejemplo, Base de Datos de los Sitios Etiquetados de Secuencia (dbSTSs), GenBank, (Centro Nacional para Información Biológica, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y pueden ser buscados con una secuencia del gen de interés para la formación de mapas de los datos contenidos dentro de estas secuencias STS de señales genómicas cortas. Para uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención son formuladas para liberación parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, de conformidad con los métodos convencionales. La administración intravenosa será por inyección del bolo o infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, una formulación farmacéutica incluirá una proteina Zchml en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como salina, salina amortiguada, destroxa al 5% en agua o similares. Las formulaciones peuden además, incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores , agentes de amortiguación, albúmina para prevenir la pérdida de proteína en las superficies viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Remington: The Science and Pra ctice of Pharma cy, Gennaro, ed., (Mack Publishing Co., Easton, PA, 19, ed. , 1995). Las dosis terapéuticas generalmente estarán en el rango de 0.1 hasta 100 µg/kg por día, de peso del paciente, preferiblemente 0.5-20 mg/kg por día, con la dosis exacta determinada por el médico clínico de conformidad con los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y severidad de la condición a ser tratada, ensayos de pacientes, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de un ordinario experto en la técnica. Las proteínas pueden ser administradas para tratamiento agudo, durante una semana o menos, frecuentemente sobre un periodo de uno a tres días o pueden ser usadas en el tratamiento crónico, durante varios meses o años. En particular, estas preparaciones se pueden usar para promover la reparación del cartílago o del hueso.

UTILIDAD DE LAS HERRAMIENTAS DE INVESTIGACIÓN Los polinucleótidos proporcionados por la presente invención, pueden ser usados por la comunidad de investigación para varios propósitos. Los polinucleótidos pueden ser usados para expresar la proteína recombinante para el análisis, caracterización o terapéuticos; como marcadores para los tejidos en los cuales la proteína correspondiente está expresada preferencialmente (ya sea constitutivamente o a un estado particular de diferenciación o desarrollo de tejido o estados de padecimientos); como marcadores de peso molecular en geles de Southern; como marcadores de cromosoma (cuando se etiquetan) , para formar mapas relacionados con las posiciones del gen; comparado con las secuencias del ADN endógeno en pacientes para identificar los desórdenes genéticos potenciales; como sondas para hibridizar y así descubrir nuevas secuencias de ADN relacionadas; como una fuente de información para derivar cebadores por PCR para la impresión dactilar genética; como una sonda para "sustraer" secuencias conocidas en los procesos de descubrimiento de otros polinucleótidos nuevos; para alcanzar anticuerpos anti-proteinas, usando técnicas de inmunización de ADN; y como un antígeno para alcanzar anticuerpos anti-ADN o estimular otra respuesta inmune. Cuando los polinucleótidos codifican una proteína la cual se enlaza o potencialmente se enlaza a otra proteína (tal como por ejemplo, en una interacción ligando-receptor), el polinucleótido puede también ser usado en los ensayos de trampas de interacción [tal como por ejemplo, que se describe en Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)], para identificar polinucleótidos que codifican las otras proteínas con las cuales ocurre el enlace o para identificar inhibidores de la interacción de enlace. Las proteínas proporcionadas por la presente invención pueden similarmente, ser usadas para alcanzar anticuerpos o para estimular otra respuesta inmune: como un reactivo (incluyendo el reactivo etiquetado) en ensayos designados para determinar cuantitiativamente, los niveles de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos, usando anticuerpos etiquetados; y para aislar receptores o ligandos correlativos aislados. Cuando la proteína se enlaza o potencialmente se enlaza a otra proteina (tal como, por ejemplo, en una interacción ligando-receptor); la proteína puede ser usada para dientificar a la otra proteina con la cual ocurre el enlace o para identificar inhibidores de la interacción de enlace. Las proteínas involucradas en estas interacciones de enlace, se puden usar para seleccionar péptidos o inhibidores de moléculas pequeñas o agonistas de la interacción de enlace. Cualquiera o todas de estas utilidades de "herramientas de investigación", son capaces de desarrollarse en el grado reactivo o formato de equipo para la comercialización como "productos de investigación" .

Actividad de Diferenciación/Proliferación Celular y Citocina Una proteína de la presente invención puede exhibir la proliferación celular de la citocina (ya sea induciendo o inhibiendo) o la actividad de diferenciación celular (ya sea induciendo o inhibiendo) , o puede inducir la producción de otras citocinas en ciertas poblaciones celulares. Muchos factores de proteínas descubiertos a la fecha, incluyendo todas las citocinas conocidas, tienen actividad presente en uno o más ensayos de proliferación celular dependientes del factor, y por lo tanto, los ensayos sirven teniendo una confirmación conveniente de la actividad de la citocina. La actividad de una proteína de la presente invención está evidenciada por un número de ensayos de proliferación celular dependientes del factor de rutina para las líneas celulares, incluyendo sin limitación, 32D, DA2, DA1G, TÍO, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DAI, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e, y CMK. La actividad de una proteína de la invención puede, entre otros medios, ser medida por un ensayto para la célula T o proliferación del timocito, ensayos apra la producción de la citocina o proliferación de las células del bazo, células del nudo linfoide o timocitos, ensayos para la proliferación y diferenciación de las células hematopoieticas y linfopoieticas, y ensayos para las respuestas del clon de las células T a los antígenos en los cuales se identificarán, entre otros, a las proteínas que afectan a las células que presentan el atígeno (APC) /interacciones de las células T, así como también efectos de las células T directos, por la medición de la proliferación y producción de citocina. Otros ensayos inmunológicos incluyen ensayos para las respuestads de inmunoglobulinas dependientes de las células T e interruptores de ispotipos (los cuales identificarán, entre otros, proteínas que modulan las respuestas de anticuerpos dependientes de las células T y qaue afectan los perfiles Thl/Th2); ensayos de reacción del linfocito mezclado (MLR) (los cuales identificarán proteínas que generan predominantemente respuestas Thl y CTL) ; ensayos dependientes de las céluals dendríticas (las cuales identificarán entre otros, proteínas expresadas por células dendríticas que activan a las células T nativas) ; ensayos para la sobrevivencia del linfocito/apoptosis (los cuales identificarán proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción del superantígeno y las proteínas que regulan la homeostasis del linfocito) ; ensayos para la función de las células B y ensayos para la proteína que incluencia las etapas tempranas del desarrollo y confinación de las células T. los ensayos descritos anteriormente se describen en una o más de las siguientes referencias: Current Protocols in Immunology, (John Wiley and Sons, Toronto, 1997); Takai et al., J. Immunol 137:3494-3500 (1986); Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712 (1990); Bertagnolli et al., Cell. Immunol. 133:327-341 (1991); Bertagnolli et al., J. Im unol. 149: 3778-3783 (1992); Bowman et al., J. Im unol. 152:1756-1761 (1994); de Vries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211 (1991); Moreau et al., Nature 336:690-692 (1988); Greenberger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A. 80:2931-2938 (1983); Weinberger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:6091-6095 (1980); Weinberger et al., Eur. J. Immunol. 11:405-411 (1981); Takai et al., J. Immunol. 140:508-512 (1988); Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033 (1990); Herrmann et al., Proc. Nati Acad.

Sci USA 78: 24882492 (1981); Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974 (1982); Handa et al. Immunol. 135:1564-1572 (1985); Bowmanet et al., J. Virology 61:1992-1998; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092 (1994); Maliszewski, J.

Immunol. 144:3028-3033 (1990); Guery et al., J. Im unol. 134:536-544 (1995); Inaba et al., J. Exp. Med. 173:549- 559 (1991); Macatonia et al., J. Immunol. 154:5071-5079 (1995); Porgador et al., J. Exp. Med. 182:255-260 (1995); Nair et al. J. Virol. 67:4062-4069 (1993); Huang et al., Science 264:961-965 (1994); Macatonia et al., J. Exp.

Med. 169:1255-1264 (1989); Bhardwaj et al., J. Clin.

Invest. 94:797-807 (1994); Inaba et al., J. Exp. Med. 172:631-640 (1990); Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808 (1992); Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670 (1993); Gorczyca et al., Can. Res. 53:1945-1951 (1993); Ithoh et al., Cell 66:233-243 (1991); Zacharchuck, J.

Immunol. 145:4037-4045 (1990); Zamai et al., Cytometry 14:891-897 (1993); Gorczyca et al., ínter. J. Oncol. 1:639-648 (1998); Antica et al., Blood 84:111-117 (1994); Fine et al., Cell. Immunol. 155:111-122 (1994); Galy et al., Blood 85:2770-2778 (1995); y Toki et al., Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 88:7548-7551 (1991).

Actividad Supresiva/Estimulante Inmune Una proteína de la presente invención puede también exhibir actividad supresiva inmune o estimulante inmune, incluyendo sin limitación, las actividades para las cuales se describen aquí los ensayos. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de varias deficiencias inmunes y desórdenes [incluyendo varias inmunodeficiencias combinadas (SCIC) ] por ejemplo, en la regulación del crecimiento (hacia arriba o hacia abajo) y proliferación de los linfocitos B y T, así como también efectuando la actividad citolítica de células muertas naturalmente (NK) , y otras poblaciones celulares. Estas deficiencias inmunes pueden ser genéticas o causadas por infecciones virales así como también bacterianas o fúngicas o pueden resultar de los desórdenes autoinmunes. La proteína de la presente invención pude ser posiblemente usada para tratar tales padecimientos o para fomentar el sistema inmune.

Hematopoiesis La proteína de la presente invención pueden ser usada en la promoción de la hematopoiesis, incluyendo el origen de la proliferación de las células rojas de la sangre, megacariocitos, y células mieloides tales como monocitos/macrófagos . Los ensayos que se relacionan con el crecimiento o diferenciación de las células derivadas incluyen: Freshney, M.G., en Culture of Hematopoietic Cells, Freshney, R.I. et al., Eds. (Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y., 1994); Johansson et al. Cell. Biol. 15:141-151 (1995); Keller et al., Mol & Cell. Biol. 13:473-486 (1993); McClanahan et al., Blood 81: 2903-2915 (1993); Hirayama et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5907-5911 (1992); y Neben et al., Exp. Hematol. 22:353-359 (1994).

Regeneración o Reparación del Tejido La proteína de la presente invención puede ser usada para reparar o regenerar cualquier número de tejidos diferentes incluyendo, hueso, ligamentos, tendones, neuronas y la piel. Los ensayos para la regeneración del tejido incluyen aquellos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO95/16035 (hueso, cartílago, tendón) ; WO95/05846 (neurona) ; y WO91/07491 (piel, endotelio) .

Actividad Inhibina/Activina Una proteína de la presente invención puede también exhibir actividades relacionadas con la activina o inhibina. La inhibina es una glicoproteína que circula en el plasma e inhibe la secreción de la hormona de estimulación del folículo (FSH), estimulado por la hormona de liberación de la gonadotropina (GnRH) , por la glándula pituitaria. La activina tiene la acción contraria y estimula la secreción de FHS. Así, la proteína de la presente invención puede ser útil como un anticonceptivo o como una base después de la capacidad de las inhibinas para desminuir la fertilidad en mamíferos hembras y disminuir la espermatogénes en mamíferos macho. Los ensayos para la actividad de la activina/inhibina se describen en los siguientes: Vale et al., Endocrinology 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature 321: 779-782 (1986); Vale et al., Nature 321:776-779 (1986); Masón et al., Nature 318:659-663 (1985); Forage et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:3091-3095 (1986). La invención además está ilustrada por los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Descubrimiento de Zchml y Construcción del Plasmido de Expresión El ADNc de Zchml se descubrió en un tumor mesenteral, sigmoide, encontrados en la genoteca de ADNc del tumor de mulerian mezclado. La genoteca se construyó usando 1 microgramo de ARN polyA aislado del tejido del tumor mesenterial sigmoide, removido de una hembra de 61 años de edad, durante una histerectomía abdominal total y una salpingo-ooforectomía bilateral con excisión del nodo del linfo regional. La patología indicó un tumor de mulerian mezclado maligno de grado metastático 4 presente en el mesenterio signmoide en dos sitios. Este tumor se asoció con un tumor de mulerian mezclado maligno de grado 4, de tipo heterólogo, de los úteros, que forman una película, la masa de infiltración a través del miometrio e involucran la superficie serosal. Los elementos heterólogos del tumor consisten de cartílago inmaduro y rabdomioblastos . El tumor también involucra el segmento uterino inferior y se extiende en la pared cervical. La permeación vascular y linfática extensiva, se identificó en la pared cervical y del miometrio. Nudos linfáticos de iliaca común derecha (de 7) e iliaca externa derecha (de 9), se identificaron con el tumor mulerian mezclado maligno de grado 4, con metástasis comprendiendo principalmente de adenocarcinomas . Hubo también receptores de la progesterona y estrógeno positivos. La síntesis de ADNc se inició usando un cebador Notl-oligo (dT) . El ADNc de doble hebra se mitigó, se ligó a los adaptores EcoRI, se digerió con Notl, de tamaño seleccionado, y se clonó en los sitios Notl y EcoRI de un plasmido. Los extremos de secuencias expresadas (EST) de la genoteca de ADNc, se exploraron para descubrir las secuencias que tienen homología con el gen de la condromodulina . El EST de la SEC ID NO: 15 se descubrió y el clon obtenido y secuenciado, resultó en el gen Zchml de la SEC ID NO : 1. La estructura lectora abierta de Zchml se subclonó en el vector pZP9CEE para la expresión en las células de mamíferos. La pZP9CEE fue la pZP9 (ATCC 98668) en la cual el ADN que codifica a un extremo de epitope glu-glu se insertó. Véase Grussenmeyer, T. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 82:7952 (1985). Para facilitar la clonación en el vector, se usó la reacción en cadena de la polimerasa para crear sitios Sal I y Bam Hl corriente arriba del codon de iniciación de Zchml y corriente abajo del codon de terminación de la traducción, respectivamente. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en una reacción que contiene 10 µl del amortiguador de la polimerasa de ADN Pfu nativa, 1 µl de una solución de trifosfato de desoxinucleótido que contiene 10 mM cada uno de dATP, dGTP, dTTP, y dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) , 5 µl de 7 pmole/µl de cebador ZC18149 (SEC ID NO : 7 ) , 5 µl de 7pmole/µl de cebador ZC18150 (SEC ID NO : 8 ) , 74 µl de agua, 3 µl de 10 ng/µl del patrón pSLZchml-3 digerido con Xho I, un plasmido el cual contiene el ADNc de Zchml, y 2 µl de 2.5 de U/µl de la polimerasa de ADN de Pfu nativo (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . La reacción en cadena de la polimerasa se corrió por 13 ciclos (20 segundos a 95°C y 1.5 minutos a 72°C), seguida por una incubación de 5 minutos a 72°C. Los productos amplificados se extrajeron serialmente con fenol/dicloroformo, cloroformo y se precipitaron en etanol en la presencia de un portador PELLET PAINT® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 0.3 M de acetato de sodio. La pelotilla de re-suspendió en 10 µl de agua a la cual se le agregó 4 µl del amortiguador 2X TANGO® (MBl Fermentas, Inc.), y 1 µl de 10 U/µl de Sal I (MBl Fermentas) . La digestión se llevó a cabo a 37 °C por 30 minutos. La reacción se terminó por la incubación a 65°C por 15 minutos seguida por precipitación de etanol en la presencia de O .' 3 M de acetato de sodio. La pelotilla resultante se resuspendió en 10 µl de agua, a la cual se le agregó 4 µl de amortiguador 2X TANGO® y 1 µl de 10 U/µl de Bam Hl (MBl Fermentas, Inc.). La digestión se llevó a cabo a 37°C por 30 minutos. La reacción se terminó por la extracción con fenol y cloroformo, seguida por precipitación de etanol en la presencia de 0.3M de acetato de sodio. Los insertos de ADNc aislados descritos anteriormente, se ligaron en Xho I y Bam Hl digeridos y el vector pZP9CEE desfosforilado . El ADN ligado se transfectó en las células de componentes MÁXIMUM EFFICIENCY DH10B® (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . El plasmido resultante pSLZchml-8 codifica al polipéptido Zchm-1 nativo de longitud completa. Para facilitar la detección y purificación de la proteína recombinante, un extremo Glu se agregó al C-terminal de Zchml . El codon de terminación de Zchml nativo se removió por la mutagénesis dirigida al sitio, permitiendo la producción de una fusión de estructura del C-término de Zchml a un extremo de afinidad Glu codificado por las secuencias del vector pZPCEE. Un fragmento de ADNc que codifica a la secuencia codificante de Zchml mutageneizada, se obtuvo por la reacción en cadena de la polimerasa de 30 ng del patrón pSLZchml03 diferido por Xho I, empleando el cebador 5' de la SEC ID N0:7, y el cebador ZC18987 mutagénico 3' (SEC ID NO: 9). Para facilitar la clonación en los cebadores pZP9CEEE de la SEC ID NO: 7 y SEC ID NO : 9 se incorporó un sitio de restricción Sal I y Bam Hl, respectivamente. Las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa y la clonación en pZP9CÉE fueron idénticas a quellas descritas anteriormente para la construcción de pSLZchml-8. El plasmido resultante, pSLZChmlCT-1, codifica al polipéptido Zchml de longitud completa con un extremo C-terminal de Glu.

EJEMPLO 2 Análisis del Manchado Northern Un fragmento de 683 bp de EcoRI/Bgl purificado de pSLZchml-13 se etiquetó con 32P por cebación aelatoria. La sonda Zchml etiquetada se híbrido a Manchados Northern de tejidos múltipes (Clontech). Los manchados se lavaron a 50°C en amortiguador de citrato de sodio 0. IX estándar (SSC) y se expusieron a una película de rayos-X por 5 días con pantallas de intensificación. El análisis del manchado Northern mostró un transcripto de 1.4 kb de Zchml presente en las muestras de ARNm de polyA purificadas del músculo esqueleto y médula ósea.

Ejemplo 3 Localización Cromosomal El locus o sitio Zchml formó mapas al cromosoma llpl5.4. Formó mapas al cromosoma 11 usando el "Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4 " comercialmente disponible (Research Genetic, Inc., Huntsville, AL). El Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4 contiene el ADN amplificable por PCR de cada uno de los 93 clones híbridos por radiación, más dos ADNs de control (el donador HLF y el recipiente A23) . Un servidor WWW públicamente disponible (http://www-genome . wi .mit . edu/cgi-bin/contig/rhmapper . pl) permite la formación de mapas con relación al Whitehead Institute/MIT Center por el mapa híbrido por radiación del genoma humano por Genome Research' s (el mapa híbrido de radiación "WICGR"), el cual se construyó con el Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4. Para el mapeo de Zchm-1 con el "Panel Híbrido por Radiación de GeneBridge 4", 20 µl de las reacciones se colocaron en una placa microtituladora de 96 pozos (Stratagene, La Jolla, CA) amplificalbes por PCR, y se usaron en un circuito termal "RoboCycler Gradiente 96 " (Stratagene) . Cada una de las reacciones de 95 PCR consisten de 2 µl 10X de amortiguador de reacción KlenTaq PCR (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla dNTPs (2.5 mM cada uno, PE, Applied Biosistems, Foster City, CA) , 1 µl de cebador sentido, ZC 18,314 5' CCG CGT CTG TGA ACC TTT 3' (SEC ID NO: 13), 1 µl cebador antisentido, ZC 18,315 5' GGG CCA CCC ACC AGT TAG 3' (SEC ID NO: 14), 2 µl REDIOLOAD® (Research Genetics, Inc.), 0.4 µl 50X de mezcla de Polimerasa Advantage KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN de un clon híbrido individual o control y agua para un volumen total de 20 µl . Las reacciones se sobrecargaron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del circuito o ciclizador PCR fueron como sigue: un ciclo inicial de 5 minutos, desnaturalización a 95°C, 40 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C, 1 minuto de recocción a 62°C y 1.5 minutos de extensión a 72°C, seguido por una extensión de 1 ciclo final de 7 minutos a 72°C. Las reacciones sé separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los resultados muestran a los mapas de Zchm-1 fr 17.08 cR_300 del marcador de estructura D11S922 en el mapa híbrido de radiación WICGR en el cormosoma 11. Los marcadores de estructura proximal y distal fueron D11S922 y D11S932, respectivamente. Esto coloca al Zchml en la región llpl5-4 en el mapa del cromosoma 11 LDB integrado (The Genetic Location Datábase, University pf Southhampton, WWW servidor: http://cedar.genetics.soton.ac. uk/public_html/) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (3)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 11 y 1

2. 2. Un polipéptido caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 11 y 12.

3. Un anticuerpo el cual se enlaza específicamente a un polipéptido, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 11 y 12.