MXPA00012591A - Polipeptido inmunomodulador, zsig57 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de polinucleótidos y polipéptidos para el zsig57, un nuevo miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas de proteínas. Los polinucleótidos que codifican el zsig57, se localizan en el cromosoma 6, y pueden ser utilizados, por ejemplo, para identificar una región del genoma asociada con los estados de enfermedades humanas. La presente invención también incluye métodos para producir la proteína, usos para la misma y anticuerpos para la misma.

Description

POLIPEPTIDO INMUNOMODULADOR, ZSIG57 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proliferación y la diferenciación de las células de organismos multicelulares son controladas por las hormonas y los factores de crecimiento de polipéptidos. Estas moléculas secretadas permiten que las células se comuniquen entre si; actúan en concierto para regular la proliferación de células y el desarrollo de órganos; y regulan la reparación y la regeneración de tejido dañado. Las hormonas y los factores de crecimiento influencian el metabolismo celular mediante el enlace a los receptores. Los receptores pueden ser proteinas integrales de la membrana que se unen a las vias de señalización dentro de la célula,_ tal como segundos sistemas mensajeros. Otras clases de receptores son moléculas solubles, tal como los factores de transcripción. La superfamilia de las inmunoglobulinas esté compuesta de muchas superficies celulares y otras glicoproteinas que comparten una homologia de secuencias con dominios variables (V) y/o constantes (C) de cadenas, pesadas y ligeras de anticuerpos. Esta familia diversa de proteinas está involucrada en la regulación de las interacciones del sistema inmune con otras células ci REF: 125716 través de las moléculas tales como las proteinas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC, por sus siglas en inglés); moléculas de adhesión de linfocitos tales como ICAM-1; y los receptores Fe, células T CD8, 5 CD28, y similares (Jackson, D.G., y colaboradores, Eur . J. Immunol . , 22^:1157-1163, 1992). Una interacción de esta clase involucra el sistema inmune mucoso, mediado por las inmunoglobulinas secretorias IgA e IgM. Estos anticuerpos secretados son transcitozados del lado basolateral al lado apical (por ejemplo, lumen intestinal) del epitelio mucoso por medio del receptor de la inmunoglobulina polimérica (plgR, por sus siglas en inglés), un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Loman, S., y colaboradores, Am. 15 Physiol. Soc. :L951-L958, 1997). Cuando la IgA es transcitozada, el plgR se divide y la porción extracelular, llamada el componente secretorio (SC, por sus siglas en inglés), de la molécula es liberada ya sea libre o enlazada a la IgA. El SC se enlaza a la IgA y parece jugar un papel importante en la protección de la degradación de la IgA secretada. Además, aparte de un papel para el SC en la respuesta inmune, humoral, éste parece tener otras actividades asociadas con la inflamación, la adhesión celular y similares. Ver, Rindisbacher, L., y colaboradores, J. Biol . Chem. , S^-'j-, 23^:14220-14228, 1995; Nihei, Y., y colaboradores, Arch. Dermatol. Res., 187 : 546-552, 1995; Brandtzaeg, P. y Krajci, P., "Secretory Component (plgR) " In: Encyclopedia of Immunology, Ivan M. Roitt y Peter J. Delves (eds.,), páginas 1360-1364. Academic Press, Londres, 1992; Hughes, G.J., y colaboradores, FEBS Lett. , 410: 443-446, 1997; Bakos, M., y colaboradores, Molec. Immunol., 3^:165-168, 1993). Sin embargo, el papel biológico d?_" SC no está completamente aclarado. Existe una necesidad continua por descubrir nuevos modulad res inmunes, hormonas, citocinas, factores de crecimiento y similares. Las actividades in vi vo de los moduladores inmunes conocidos, y los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, tales como plgR y SC, ilustran el enorme potencial clínico de, y necesidad por, los polipéptidos relacionados, sus agonistas, y antagonistas. La presente invención proporciona tales polipéptidos par., estos y otros usos que deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica de las enseñanzas en la Oresente.

BREVE DESCRIPCIÓN DS LA INVENCIÓN Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona ?n polinucleótido aislado que codifica un id. di^^&l ^aA^.^^M^^i*.^-. polipéptido zsig57 que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se 5 muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (lie), al número de residuo 108 (Gly); (b) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (lie) al número de aminoácido 125 (Pro); (c) ..a secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 18 (lie) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (lie) al número de aminoácido 199 (Gly); y (e) la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 1 (met) al número de aminoácido 199 (Gly), en donde el porcentaje de identidad de aminoácidos se determina utilizando un programa FASTA con ktup=l, penalidad por abertura de la separación o vacio=10, penalidad por extensión de la separación=l , y matriz de sustitución=BLOSUM62, con otros parámetros expuestos como omisión o implícito. Dentro de una modalidad, el polinucleótido aislado descrito anteriormente se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:l del •^"-"^ •' ""-- 1 g^ nucleótido 115 al nucleótido 387; (b) una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEC ID N0:1 del nucleótido 115 al nucleótido 438; (c) una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEC ID N0:1 del 5 nucleótido 115 al nucleótido 531; (d) una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEC ID NO : 1 del nucleótido 115 al nucleótido 660; y (e) una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEC ID N0:1 del nucleótido 64 al nucleótido 660. Dentro de otra modalidad, el polinucleótido aislado descrito anteriormente comprende el nucleótido 1 al nucleótido 597 de la SEC ID N0:3. Dentro de otra modalidad, el polinucleótido aislado descrito anteriormente consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de residuo 18 (lie) al número de residuo 108 (Gly) ; (b) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 125 (Pro); (c) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO:2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos como se muestra en La SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 -^^sa^ **& (Gly) ; y (e) la secuencia de aminoácido como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 1 (Met) al número de aminoácido 199 (Gly) . Dentro de otra modalidad, el polinucleótido aislado descrito anteriormente consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) . Dentro de un segundo aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos de manera operable: un promotor de transcripción; un segmento de ADN que codifica un polipéptido zsig57 con una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) ; y un terminador de transcripción. Dentro de una modalidad, el vector de expresión como se describe anteriormente, además comprende una secuencia de señales, secretoria unida de manera operable al segmento de ADN. Dentro de un tercer aspecto, la presente invención proporciona una células cultivada en la cual se ha introducido un vector de expresión como se describe anteriormente, en donde la célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN. «g i, iwi. 3?» Dentro de un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ADN que codifica una proteina de fusión, la construcción de ADN que comprende: un primer segmento de ADN que codifica un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (met), al número de residuo 17 (Gly); (b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N0:2 del número de residuo 18 (He) al número de residuo 108 (Gly); (c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 del número de residuo 18 (He) al número de residuo 124 (Pro); (d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N0:2 del número de residuo 18 (He) al número de residuo 156 (Gly); (e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 del número de residuo 186 (Lys) al número de residuo 199 (Gln); (f) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 del número de residuo 18 (He) al número de residuo 199 (Gln) ; y al menos otro segmento de ADN que codifica un polipéptido adicional, en donde el primero y otros segmentos de ADN se conectan en la estructura; y codifican la proteina de fusión. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona una proteina de fusión producida por un método que comprende: cultivar una célula hospedante en la cual ha sido introducido un vector que comprende los siguientes elementos unidos de manera operable: (a) un promotor transcripcional; (b) una construcción de ADN que codifica una proteina de fusión como se describe anteriormente; y (c) un terminador transcripcional; y recuperar la proteina codificada por el segmento de ADN. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He), al número de residuo 108 (Gly); (b) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO:2 del número de aminoácido 18 (He), al número de aminoácidos 125 (Pro); (c) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He), al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO:2 del número de aminoácido 18 (He), al número de aminoácido 199 (Gly) ; y (e) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 1 (Met), al número de aminoácidos 199 (Gly), en donde el porcentaje de identidad de aminoácidos se determina utilizando un programa FASTA con ktup=l, penalidad por abertura de la separación o ^^x^^y^ vacio=10, penalidad por extensión de la separación o vacio=l, y matriz de sustitución=BLOSUM62, con otros parámetros expuestos como omisión o implícito. Dentro de una modalidad, el polipéptido aislado descrito 5 anteriormente consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N0:2 del número de residuo 18 (He), al número de residuo 108 (Gly) ; ;b) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 125 (Pro); (c) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 18 (He/ al número de aminoácido 199 (Gly); y (e) la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 1 (Met) al número de aminoácido 1S7 (Gly) . Dentro de otra modalidad, el polipéptido aislado descrito anteriormente es como se muestra en la SE<" ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) . Dentro ce otro aspecto, la presente invención proporciona ur método para producir un polipéptido zsig57 que comprende: cultivar una célula como se iSS8™li-Si¡SiSíg=Hí^^^^^^™ílßS-^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^-_^i^™M^^----^------^^^^^^ describe anteriormente; y aislar el polipéptido zsig57 producido por la célula. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo para 5 el polipéptido zsig57 que comprende: inocular un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un pclipéptido que consiste de 9 a 199 aminoácidos, en donde el polipéptido es una secuencia contigua de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 del número de 10 aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) ; (b) un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11; (c) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 186 (Lys) al número de residuo 199 (Gln) de la SEC ID NO:2; (d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 18 (He) al número de residuo 108 (Gly) de la SEC ID NO: 2; (e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 96 (Glu) al número de residuo 101 (Glu) de la SEC ID NO:2; (f) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 124 (Pro) al número de residuo 129 (Glu) de la SEC ID NO : 2 ; (g) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 125 (Pro) al número de residuo 130 (Glu) de la SEC ID NO:2; (h) un polipéptido que tiene una secuencia de IÍS ?iiUiS á^áÉ^^lm^^^Sít^?iií^M ^^ i^^^^^^^^^^^^ ^^^^^ ^^á títíl ^ aminoácidos del número de residuo 185 (Arg) al número de residuo 190 (Glu) de la SEC ID NO:2; e (i) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuos 186 (Lys) al número de residuo 191 (Ser) de la SEC ID NO : 2 , y en donde el polipéptido produce una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo producido por el método descrito anteriormente, el cual se enlaza a un polipéptido zsig57. Dentro de una modalidad, el anticuerpo descrito anteriormente es un anticuerpo monoclonal. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo el cual se enlaza específicamente a un polipéptido descrito anteriormente. Dentro de otra modalidad, el anticuerpo descrito anteriormente se acopla a un plásmido que contiene un ADNc que codifica un polipéptido funcional. Dentro de otra modalidad el anticuerpo descrito anteriormente se acopla a un agente químico. Estos y otros aspectos de la invención llegarán a ser aparentes con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y los dibujos anexos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un alineamiento del zsig57 (ZSIG57) (SEC ID NO: 2), la proteina CMRF35 de humano (CM35_H) (SEC ID NO:29), y el plgR de humano (PIGR_H) (SEC ID NO:30) . La Figura 2 es un diagrama de hidrofobicidad del zsig57 determinado de un perfil de hidrofilicidad de Hopp/ oods en base a una ventana corrediza de seis residuos, con los residuos escondidos G, S y T y los residuos expuestos H, Y y , ignorados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de exponer la invención en detalle, puede ser útil para el entendimiento de la misma definir los siguientes términos: El término "etiqueta de afinidad" se utiliza en la presente para representar un segmento de polipéptidos que se pueden unir a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un substrato. En principal, cualquier péptido o proteína para el cual es disponible un anticuerpo u otro agente de enlace específico se puede utilizar como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson y colaboradores, EMBO J. :1075, 1985; Nilsson y colaboradores, Methods Enzymol. 198 : 3, 1991), glutationa S transferasa (Smith y Johnson, Gene fT7_:31, 1988), etiqueta de afinidad de Glu-Glu (Grussenmeyer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2:7952-4, 1985), sustancia P, péptido FlagMR (Hopp y colaboradores, Biotechnology 6^:1204-10, 1988), péptido de enlace de estreptavidina, u otro epítope antigénico o dominio de enlace. Ver, en general, Ford y colaboradores, Protein Expression and Purification 2_: 95-107, 1991. Los ADNs que codifican las etiquetas de afinidad son disponibles de distribuidores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El término "variante alélica" se utiliza en la presente para representar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo lugar cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede dar por resultado el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de los genes pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica también se utiliza en la presente para representar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

Los términos "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se utilizan en la presente para representar posiciones dentro de los polipéptidos. Donde el contexto lo permite, estos términos se utilizan con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para representar la proximidad o la posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada en carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se localiza próxima a la terminación carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en la terminación carboxilo del polipéptido completo. El término "par de complemento/anticomplemento" representa porciones no idénticas que forman un par estable, no covalentemente asociado ba o condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par de complemento/anti-complemento . Otros pares de complemento/anti-complemento ejemplares incluyen los pares del receptor/ligando, pares de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope) , pares polinucleótidos de sentido/antisentido, y similares. Donde la disociación subsecuente del par de complemento/anti-complemento es deseable, el par de complemento/anti-complemento tiene en forma preferente una afinidad de enlace de <109 M_1.

El término "complementos de una molécula de polinucleótidos" representa una molécula de plinucleótido que tiene una secuencia de base complementaria y una orientación inversa comparada a una 5 secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria para 5' CCCGTGCAT 3' . El término "contig" representa un polinucleótido que tiene un tramo contiguo de una secuencia idént^. a o complementaria a otro polinucleótido. Se dice que las secuencias contiguas se "sobreponen" a un tramo dado de la secuencia de polinucleótidos ya sea en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los contigs representativos para la secuencia de polinucleótidos 5' -ATGGAGCTT-3' son 5'AGCTTgagt-3' y 3'- tcgacTACC-5' . El término "secuencia de nucleótidos degenerada" representa una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (comparada a una molécula de pol nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido) . Los codones degenerados contienen diferentes tripletas de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de, aminoácidos (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifica Asp) .

Una "construcción de ADN" es una molécula de ADN lineal o circular, de cadena individual o doble que comprende los segmentos del ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no encontrada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen los clones y otras copias de moléculas manipuladas. Un "segmento de ADN" es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más grande, tal como un plástido o un fragmento de plásmido, que, cuando se lee de la dirección 5' a la 3' , codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado. El término "vector de expresión" se utiliza para representar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés enlazado de manera operable a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Estos segmentos adicionales incluyen las secuencias promotoras y terminadoras, y también pueden incluir uno o más orígenes de duplicación, uno o más marcadores seleccionables, un aumentador, una señal de poliadenilación, etcétera. Los vectores de expresión se derivan en general del plásmido o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, representa que el polinucleótido ha sido separado de su ambiente genético, natural y de esta manera está libre de otros secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para utilizarse dentro de los sistemas de producción de proteínas genéticamente diseñadas. Estas moléculas aisladas son aquellas que se separan de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales éstos se asocian ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que ocurren naturalmente tales como los promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para uno de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985). Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como separado de la sangre y el tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustan?ialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir mayor que 95% puro, en forma más preferente mayor que 99% puro. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas, alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas . El término "unido de manera operable" cuando se refiere a los segmentos de ADN, indica que los segmentos se ordenan de modo que éstos funcionen en concierto para sus propósitos pensados, por ejemplo, la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación al terminador. El término "ortólogo" representa un polipéptido o una proteína obtenidos de una especie que es la contraparte funcional del polipéptido o una proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la evolución de las especies. Los "parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas, hechas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen a través de la duplicación de genes. Por ejemplo, a-globina, ß-globina, y mioglocina son parálogos entre sí.

Un "polinucleótido" es un polímero de cadena individual o doble de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas del extremo 5' al 3' . Los polinucleótidos incluyen el ARN y el ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, se pueden sintetizar in vi tro, o se pueden preparar de una combinación de moléculas naturales o sintéticas. Los tamaños de los pplinucleótidos se expresan como pares de bases (abreviado "pb") , nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb") . Donde el contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son de cadena individual o de cadena doble. Cuando el término se aplica a moléculas de cadena doble, éste se utiliza para representar la longitud total y será entendido que es equivalente al término "pares de base". Será reconocido por aquellos expertos en la técnica que las dos cadenas de un polinucleótido de cadena doble pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las mismas se pueden disponer en zigzag o escalonar como resultado de la división enzimática; de esta manera todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótidos de cadena doble no se pueden parear. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces de péptidos, ya sea producido naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son referidos comúnmente como "péptidos". El término "promotor" se utiliza en la presente por su significado reconocido en la técnica para representar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de polimerasa de ARN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones no codificantes 5' de los genes. Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos se pueden adicionar a una proteína por la célula en la cual se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en términos de sus estructuras de la cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos de carbohidratos son en general no específicos, pero no obstante pueden estar presentes . El término "receptor" representa una proteína asociada con las células que se enlaza a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media el efecto del ligando en las células. Los receptores de enlace de la membrana se caracterizan por una estructura de multi- péptidos que comprende un dominio de enlace de ligandos extracelular y un dominio efector intracelular que está 5 involucrado típicamente en la transducción de señales. El enlace del ligando al receptor da por resultado un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula (s) en 1. célula. Esta interacción a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los casos metabólicos que se unen a las interacciones de receptor-ligando incluyen la transcripción de genes, la fosforilación, la desfosforilación, los incrementos en la producción de AMP cíclica, la movilización de calcio celular, la movilización de lípidos de la membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos de inositol y la hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden ser unidos a la membrana, citosólicos o nucleares; monc néricos (por ejemplo, el receptor de la hormona de estiir ulación de la tiroides, el receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, recep.ir de la hormona de crecimiento, receptores de I u 3, receptor de GM-CSF, receptor de G- CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6) . tfa''''' " f"~ - ' * *?8-.-.< . ~.^*. .^A~?* *-. .»..t,rr?.

El término "secuencia de señales secretorias" representa una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretorio") que, como un componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de una vía secretoria de una célula en la cual se sintetiza. El polipéptido más grande es dividido comúnmente para separar el péptido secretorio durante el transito a través de la vía secretoria . El término "variante de unión" se utiliza en la presente para representar las formas alternativas del ARN transcrito de un gen. La variación de unión surge naturalmente a través del uso de sitios de unión alternativos dentro de una molécula de ARN transcrito, o menos comúnmente entre las moléculas de ARN transcrito separadamente, y puede dar por resultado varios ARNms transcritos del mismo gen. Las variantes de unión pueden codificar los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de unión también se utiliza en la presente para representar una proteína codificada mediante una variante de unión de un ARNm transcrito de un gen. Será entendido que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis del - Uní f i 'tfiÉTnliif " II III gel) son valores aproximados. Cuando este valor se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, será entendido que el valor establecido de X es preciso al ±10%. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de una nueva secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene homología al CMRF35 de humano y al componente secretorio del receptor de poly-Ig. El análisis de la distribución del tejido del ARNm correspondiente a este nuevo ADN mostró que la expresión fué más alta en el intestino delgado, la médula ósea y los leucocitos de la sangre periférica (PBLs), seguido por niveles de expresión aparentes pero disminuidos en el hígado y el riñon. El polipéptido ha sido designado zsig57. Los nuevos polipéptidos zsig57 de la presente invención fueron identificados inicialmente al averiguar una base de datos EST para proteínas homologas a las proteínas que tienen una secuencia de señales secretorias. Estas proteínas se caracterizan por un sitio de inicio de metionina corriente arriba y una región hidrofóbica de aproximadamente 13 aminoácidos, seguido por un sitio de división de peptidasa de señal de péptido. Una base de datos EST fué averiguada por las nuevas secuencias de ADN cuyas traducciones cumplirían con estos criterios de búsqueda. Un EST se encontró y su ADNc correspondiente se ordenó en secuencia. El nuevo polipéptido codificado mediante la ADNc, cuando se ordenó en secuencia completamente, mostró una secuencia de dominios Ig-variables y la homología con el CMRF3 de humano y el componente secretorio del plgR de humano (Jackson y colaboradores, supra; Krajci, P. y colaboradores, Hum. Genet. 877:642-648, 1991). Se cree que la secuencia de nucleótidos zsig57 codifica la secuencia de codificación completa de la proteína predicha. El Zsig57 puede ser un nuevo receptor de transcitosis, inmunomodulador, o similares, y es un nuevo miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas de las proteínas. Se cree que la secuencia del polipéptido zsig57 obtenida de un clon individual contiene su secuencia de polinucleótidos correspondiente. El clon se obtuvo de una genoteca de células blancas de la sangre (WBC) . Otras genotecas que también podrían ser examinadas para tales secuencias incluyen el intestino delgado, la médula ósea, los PBLs y similares. La secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica el zsig57, representativo se describe en la SEC ID N0:1, y su secuencia de 199 aminoácidos deducida se describe en la SEC ID NO : 2. En su totalidad, el polipéptido zsig57 (SEC ID NO: 2) representa un segmento de polipéptidos de longitud completa (residuo 1 (Met) al residuo 199 (Gln) de la SEC ID N0:2). El zsig57 contiene una secuencia de señales, un dominio variable de Ig individual, un dominio de transmembranas y un extremo posterior o cola citoplásmico, corto. Estos dominios colocados por todo el polipéptido zsig57 corresponden a las regiones homologas del CMRF35. Estos dominios y las características estructurales del zsig57 se describen adicionalmente más adelante. El análisis del ADN que codifica el polipéptido zsig57 (SEC ID N0:1) reveló una estructura de lectura abierta que codifica 199 aminoácidos (SEC ID NO: 2) que comprenden un péptido de señales predicho de residuos de 15 a 17 aminoácidos (residuo 1 (Met) al residuo 15 (Gly) o 17 (Gly) de la SEC ID NO : 2 ) , y un polipéptido maduro de 182 a 184 aminoácidos (residuo 18 (He) o residuo 16 (Gln) al residuo 199 (Gln) de la SEC ID NO: 2, dependiendo donde se divide el péptido de señales). El Zsig57 contiene las siguientes 4 regiones de aminoácidos conservadas (ver Figura 1) : 1) La primera región, referida más adelante como el "dominio variable de Ig" corresponde a los residuos de aminoácidos 18 (He) al residuo de aminoácido 108 (Gly) de la SEC ID NO: 2. 2) La segunda región, referida más adelante como "sitio (s) de división acídico (s)", corresponde a los residuos de aminoácidos 126 (Glu) al residuo de aminoácidos 130 (Glu) de la SEC ID NO:2, con la división potencial en el residuo 126 (Glu) ; y el diácido Asp-Glu en los residuos 157 (Asp) y 158 (Glu) de la SEC ID N0:2, con la división potencial en el residuo 157 (Asp) . Estos sitios de división acídicos sugieren que se secretó la porción de zsig57 que contiene el dominio variable de Ig. 3) La tercera región, referida más adelante como el "dominio de transmembranas" corresponde a los residuos de aminoácidos 161 (He) al residuo de aminoácido 185 (Ala) de la SEC ID NO:2. 4) La cuarta región, referida más adelante como el "fragmento citoplásmico" corresponde a los residuos de aminoácidos 186 (Lys) al residuo de aminoácido 199 (Gln) de la SEC ID NO:2. Además, dentro del dominio variable de Ig, el zsig57 contiene cisteínas conservadas, localizadas en los residuos 38, 52, 59 y 104. Los enlaces de disulfuro son predichos entre los residuos de cisteína 52 y 59 y entre los residuos 38 y 104. Estas cisteínas probablemente mantienen un pliegue estructuralmente importante en el domino variable de Ig, y se conservan por toda la familia de las proteínas. Los polinucleótidos correspondientes que codifican las regiones del polipéptido zsig57, los dominios, las configuraciones, los residuos y las secuencias descritas anteriormente se muestran en la SEC ID NO: 1. La preserva de configuraciones conservadas en general se correlaciona con o define las regiones estructurales importantes en las proteínas. Las regiones entre tales configuraciones pueden ser más variables, pero a menudo son funcionalmente significantes debido a que éstas se pueden relacionar a o definir estructuras y actividades importantes tales como los dominios de enlace, la actiiidad biológica y enzimática, la transducción de señales, los dominios de localización de tejido y similares. Como sa describe anteriormente, el nuevo polipéptido zsig5" codificado por el polinucleótido descrito en la presente contiene un dominio variable de Ig. La topología estructural de los dominios variables de Ig se cor-.-iiva en la superfamilia de las inmunoglobulinas de proteínas. Este dominio puede estar involucrado er el enlace de otro miembro de familia de ^ü^^^üHiaaü^ las proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, y conferir una función especial en la transcitosis en los tejidos donde se expresa, tal como el intestino delgado; de igual manera, el dominio variable de Ig también se puede asociar o enlazar con los polipéptidos o péptidos involucrados en la presentación de antígenos, o conferir una actividad inmunomoduladora en los PBLs o la médula ósea. Adicionalmente, el polipéptido zsig57 podría estar involucrado en el enlace con otra proteína efectora inmune destinada para la transubicación, por ejemplo en la médula ósea o intestino delgado. Los aminoácidos altamente conservados en el dominio variable de Ig, el dominio de transmembranas, u otras regiones del zsig57 se pueden utilizar como una herramienta para identificar nuevos miembros de la familia. Por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) se puede utilizar para amplificar las secuencias que codifican las regiones conservadas de ARN obtenido de una variedad de las fuentes de tejido o líneas de células. En particular, los cebadores altamente degenerados, diseñados de las secuencias del zsig57, son útiles para este propósito. El diseño y el uso de tales cebadores ¿í m— ti lu m degenerados se realizan fácilmente por uno de experiencia en la técnica. La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos zsig57 descritos en la presente. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de la secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEC ID NO: 3 es una secuencia de ADN degenerada que abarca todos los ADNs que codifican el polipéptido zsig57 de la SEC ID NO:2. Estos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEC ID NO: 3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican la SEC ID NO:2 al sustituir U por T. De esta manera, los polinucleótidos que codifican el polipéptido zsig57 que comprenden del nucleótido 1 al nucleótido 597 de la SEC ID NO: 3 y sus equivalentes de ARN están contemplados por la presente invención. La Tabla 1 expone los códigos de una letra utilizados dentro de la SEC ID NO: 3 para representar las posiciones de los nucleótido degenerados. Las "resoluciones" son nucleótidos representados por una letra del código. El "complemento" indica el código para el (los) nucleótido ( s ) complementario (s) . Por ejemplo, el código Y representa ya sea C o T y su complemento R representa A o G, A que es complementario para T, y G que es complementario para C.

TABLA 1 Nucleótido Resolución Complemento Resolución A A T T C C G G G G C C T T A A R A|G Y C|T Y C|T R A|G M A|C K G|T K G|T M A|C S C|G S C|G W A|T W A|T H A|C|T D A|G|T B C|G|T V A|C|G V A|C|G B CIGIT D A|G|T H A|C|T N A|C|G|T N A|C|G|T ^.^^gggAí^gglU^^g^g^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ «^-^^» Los codones degenerados utilizados en la SEC ID NO: 3, que abarcan todos los codones posibles para un aminoácido dado, se exponen en la Tabla 2.

TABLA 2 Aminoácido Código Codon de una Codones Degenerado Letra Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAÁ CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG He I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter • TAA TAG TGA TRR Asn lAsp B RAY Glu IGln Z SAR Any X NNN Un experto ordinario en la técnica apreciará que se introduce alguna ambigüedad en la determinación de un codon degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codon degenarado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar la arginina (AGR) , y el codon degenerado para la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar la serina (AGY) . Existe una relación similar entre los codones que codifican la fenilalanina y la leucina. De esta manera, algunos polinucleótidos comprendidos por la secuencia degenerada pueden codificar las secuencias de aminoácidos variantes, pero uno de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias variantes por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Las secuencias variantes ^^^^^^¡^^^^^^^^^^^^ se pueden someter fácilmente a una prueba de funcionalidad por la como se describe en la presente. Uno de experiencia ordinaria en la técnica también apreciará que las diferentes especies pueden 5 exhibir un "uso de codones preferenciales" . En general, ver, Grantham y colaboradores, Nuc. Acids Res. ¡3_:1893- 912, 1980; Haas y colaboradores, Curr. Biol. _6:315-24, 1996; Wain-Hobson y colaboradores, Gene l_3:355-64, 1981; Grosjean y Fiers, Gene 1^8:199-209, 1982; Holm, Nuc. 10 Acids Res. 1^:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158 : 573-97 , 1982. Como se utiliza en la presente, el término "uso de codones preferenciales" o "codones preferenciales" es un término de la técnica que se refiere a los codcnes de traducción de proteínas que son utilizados más f ecuentemente en células de una cierta especie, para favorecer de esta manera uno o algunos representativos de los codones posibles que codifican cada aminoácido (Ver la Tabla 2). Por ejemplo, el aminoácido Treoni Ta (Thr) se puede codificar por ACA, ACC, ACG, o ACT, f ro en las células de mamíferos ACC es el codon más comúnmente utilizado; en otras especies, por ejemplo, células de insectos, levadura, virus o bacterias, pueden ser preferenciales diferentes los codones de Thr Los codones preferenciales para una especie particular se pueden introducir en los n»i«?» -. •"*'*• - »• •«•"""'"-i'irVr ------------- ^J¿f^_£jnfflí¡Jt^¡ffij polinucleótidos de la presente invención por una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de las secuencias de codones preferenciales en el ADN recombinante puede, por ejemplo, aumentar la producción de la proteína al hacer una traducción de la proteína más eficiente dentro de un tipo o especie de célula particular. Por lo tanto, la secuencia de codones degenerados descrita en la SEC ID NO: 3 sirve como un patrón para optimizar la expresión de polinucleótidos en varios tipos y especies de células comúnmente utilizados en la técnica y descritos en la presente. Las secuencias que contienen codones preferenciales se pueden someter a una prueba y optimizar para la expresión en diversas especies, y se pueden someter a una prueba de funcionalidad como se describe en la presente. Dentro de las modalidades preferidas de la invención, los polinucleótidos aislados hibridizarán a las regiones de tamaño similar de la SEC ID NO:l, o una secuencia complementaria a la misma, bajo condiciones rigurosas. En general, se seleccionan condiciones rigurosas que sean alrededor de 5°C más bajo que el punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia específica a un potencial iónico y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo potencial iónico y pH definidos) en la cual 50% de la secuencia objetivo se hibridice a ?v ??r -üKiVn ffjg^iMta^g^ai una sustancia de prueba perfectamente igualada. Las numerosas ecuaciones para calcular el Tm son conocidas en la técnica, y son específicas para secuencias de ADN, ARN e híbridos de ADN-ARN y sustancia de prueba de polinucleótidos de longitud variante (ver, por ejemplo, Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Labora tory Manual , Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel y colaboradores , (eds), Curren t Pro tocol s in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecual ? Cl oning Techniques , (Academic Press, Inc. 1987); y Wermur, Crit. .Rev. Bi ochem . Mol . Biol . 26: 221 (1990)). Los elementos de programación para el análisis de secuencias tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4 . 0 (premier Biosoft International; Palo Alto, CA) , así como también los sitios en el Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y para calcular el Tm en base a criterios definidos del usuario. Tales programas también pueden analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar las secuencias de sustancias de prueba adecuadas. Típicamente, la hibridización de las secuencia de polinucleótidos más largas, >50 pares de bases, se realiza a temperaturas de alrededor de 20-25°C abajo del Tm calculado. Para las sustancias de prueba más -'•-* pequeñas, <50 pares de bases, la hibridización se lleva a cabo típicamente en el Tm o 5-10°C abajo. Esto permite la velocidad máxima de hibridización para los híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN. Los grados más altos de rigurosidad en las temperaturas más bajas se pueden lograr con la adición de formamida la cual reduce el Tm del híbrido de alrededor de 1°C por cada 1% de formamida en la solución amortiguadora. Las condiciones de hibridización rigurosas, adecuadas son equivalentes a alrededor de 5 horas para la incubación durante la noche a alrededor de 42°C en una solución que comprende: alrededor de 40-50% de formamida, hasta aproximadamente SSC 6X, alrededor de solución Denhardt' s 5X, de cero a alrededor 10% de sulfato de dextrano, y alrededor de 10-20 µg/ml de ADN portador, comercialmente disponible, desnaturalizado. En general, tales condiciones rigurosas incluyen temperaturas de 20-70°C y un amortiguador de hibridización que contiene hasta SSC 6x y 0-50% de formamida; luego se sigue la hibridización por los filtros de lavado en hasta alrededor de SSC 2X. Por ejemplo, una rigurosidad de lavado adecuada es equivalente a SSC 0. IX a SSC 2X, 0.1% de SDS, a 55°C a 65°C. Se pueden utilizar diferentes grados de rigurosidad durante la hibridización y el lavado para lograr el enlace específico, máximo a la secuencia objetivo. Típicamente, los lavados que siguen la hibridización se realizan a grados crecientes de rigurosidad para separar las sustancias de prueba de polinucleótidos no hibridizadas de los complejos hibridizados. Las condiciones de hibridización y lavado rigurosas dependen de la longitud de la sustancia de prueba, reflejado en el Tm, la hibridización y las soluciones de lavado utilizadas y se determinan rutinariamente, de manera empírica, por un experto en la técnica. Como se observa previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para preparar el ADN y el ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN se aisla de un tejido o una célula que produce grandes cantidades de ARN del zsig57. Tales tejidos y células se identifican mediante el análisis con papel secante Northern (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 7_7_:5201, 1980) e incluyen el intestino delgado, la médula ósea, los PBLs y las líneas de células derivadas de los mismos. El ARN total se puede preparar utilizando la extracción de isotiocianato de guanidinio seguido por el aislamiento por centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin y colaboradores, Biochemistry 18 : 52-94 , 1979). El ARN Poly (A) + se prepara a partir del ARN total utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972)). El ADN complementario (ADNc) se prepara a partir del ARN poly (A) + utilizando métodos conocidos. En la alternativa, el ADN genómico se puede aislar. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zsig57 luego se identifican y se aislan mediante, por ejemplo la hibridización o la PCR. Un clon de longitud completa que codifica el zsi57 se puede obtener mediante los procedimientos de clonación convencionales. Se prefieren los clones de ADN complementario (ADNc) , aunque para algunas aplicaciones (por ejemplo, la expresión en animales transgénicos) puede ser preferible utilizar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc que incluya al menos un intron genómico. Los métodos para preparar el ADNc y los clones genómicos son bien conocidos y dentro del nivel del experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita en la presente, o partes de la misma, para la prueba o cebadura de una genoteca. Las genotecas de expresión se pueden someter a una prueba con anticuerpos para el zsig57, fragmentos del receptor, u otros compañeros de enlace específicos. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden sintetizar utilizando máquinas de síntesis de ADN. Actualmente, el método de selección es el método de fosforamidita . Si se requiere ADN de cadena o hebra doble, químicamente sintetizado para una aplicación tal como la síntesis de un gen o un fragmento de gen, entonces cada cadena complementaria se hace por separado. La producción de genes cortos (60 a 80 pb) es técnicamente directa y se puede realizar al sintetizar las cadenas complementarias y luego fortalecerlas. Para la producción de genes más largos (>300 pb) , sin embargo, se deben .",vocar estrategias especiales, debido a la eficiencia de acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis química de ADN es pocas veces 100%. Para superar este problema, los genes sintéticos (de cadena doble) se congregan en forma modular de fragmentos de cadena individual que son de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Un método para construir un gen sintético requiere la producción inicial de un conjunto de oligonucleótidos complementados, sobrepuestos, cada uno de los cuales esc \ entre 20 a 60 nucleótidos de largo. Las secuencias las cadenas se planean de modo que, después del fortalecimiento, los dos segmentos de extremo del gen se alinean para dar extremos truncados. Cada sección interna del gen tiene extensiones terminales 3' y 5' complementarias que se designan al par de bases precisamente con una sección adyacente. De ^^..^- fc.. esta manera, después de que el gen se congrega, el único requerimiento restante para completar el proceso es sellar las muescas a lo largo de las cadenas principales de las dos cadenas con la ligasa de ADN T4. Además de la secuencia de codificación de proteínas, los genes sintéticos se pueden diseñar con secuencias terminales que facilitan la inserción en sitios de endonucleasa de restricción de un vector de clonación y también se deben adicionar otras secuencias que contengan señales para la iniciación y la terminación apropiadas de la transcripción y la traducción. Una forma alternativa para preparar un gen de tamaño completo es sintetizar un conjunto especificado de oligonucleótidos sobrepuestos (40 a 100 nucleótidos). Después de que se fortalecen las extensiones 3' y 5' (6 a 10 nucleótidos), las separaciones o vacíos grandes aun permanecen, pero las regiones de pares de bases son tanto suficientemente largas y suficientemente estables para mantener junta la estructura. El duplo se completa y las separaciones o vacíos se rellenan mediante la síntesis enzimática de ADN con polimerasa I de ADN de E . col i . Esta enzima utiliza los grupos 3' -hidroxilo como puntos de iniciación de la duplicación y las regiones de cadena individual como patrones. Después de que se completa la síntesis enzimática, las muescas se sellan i l -i lill MlU IM l con ligasa de ADN T4. Las construcciones de cadena doble se unen secuencialmente entre sí para formar la secuencia de genes completa y la secuencia se verifica mediante el análisis de secuencias de ADN. Ver Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura y colaboradores, Annu. Rev. Biochem. 53 323-56, 1984 y Climie y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:633-7, 1990. La presente invención además proporciona polipéptidos y polinucleótidos de contraparte de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, pero no se limitan a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. De particular interés son los polipéptidos zsig57 de otras especies de mamíferos, inclusive murino, porcino, ovino, bovino, canino, felino, equino y otros polipéptidos de primates. Los ortólogos del zsig57 de humano se pueden clonar utilizando la información y las composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc se puede clonar utilizando ARNm obtenido de un tejido o tipo de. células que expresan el zsig57 como se describe en la presente. Las fuentes adecuadas de ARNm se pueden identificar al someter a una prueba los análisis con papel secante Northern con sustancias de prueba designadas de las secuencias descritas en la presente. Luego se prepara una genoteca del ARNm de un tejido positivo o una línea de células. Luego se puede aislar un ADNc que codifica el zsig57 por una variedad de métodos, tales como mediante el sometimiento a una prueba con un ADNc de humano completo o parcial o con uno o más conjuntos de sustancias de prueba degeneradas en base a las secuencias descritas. Un ADNc también se puede clonar utilizando la reacción en cadena de polimerasa, o la PCR (Mullís, patente norteamericana No. 4,683,202), utilizando cebadores designados de la secuencia de polinucleótidos del zsig57 de humano representativa, descrita en la presente. Dentro de un método adicional, la genoteca de ADNc se puede utilizar para transformar o transfectar las células hospedantes, y la expresión del ADNc de interés se puede detectar con un anticuerpo para el polipéptido zsig57. También se pueden aplicar técnicas similares para el aislamiento de clones genómicos. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEC ID NO : 1 representa un alelo individual del zsig57 de humano y que se espera que ocurra la variación alélica y la unión alternativa.

Las variantes alélicas de esta secuencia se pueden clonar al someter a una prueba el ADNc o las genotecas genómicas de diferentes individuos de acuerdo con los procedimientos normales. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID N0:1, que incluye aquellas que contienen mutaciones inactivas y aquellas en las cuales las mutaciones dan por resultado cambios de la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como son proteínas las cuales son variantes alélicas de la SEC ID NO: 2. Los ADNcs generados a partir de los ARNms alternativamente unidos, los cuales retienen las propiedades del polipéptido zsig57 se incluyen dentro del alcance de la presente invención, como que son polipéptidos codificados por estos ADNcs y ARNms. Las variantes alélicas y las variantes unidas de estas secuencias se pueden clonar al someter a una prueba el ADNc o genotecas genómicas de los diferentes individuos o tejidos de acuerdo con los procedimientos normales conocidos en la técnica. La presente invención también proporciona polipéptidos del zsig57, aislados que sor sustancialmente similares a los polipéptidos de la SEC ID NO:2 y sus ortólogos. El término "sustancialmente similar" se utiliza en la presente para representar loe polipéptidos que tienen 70%, en forma preferente 80%, en forma más preferente al menos 85%, de identidad de la secuencia a las secuencias mostradas en la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos. Tales polipéptidos serán en forma preferente al menos 90% idénticos y en forma más preferente 95% o más idénticos a la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos) . El porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Altschul y colaboradores, Bull. Math. Bio. 48 : 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-9, 1992. En resumen, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar los registros de alineamiento utilizando una penalidad por abertura de la separación o vacío de 10, una penalidad por extensión de la separación o vacío de 1, y la matriz de registro "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (ibid. ) como se muestra en la Tabla 3 (los aminoácidos se indican por los códigos de una letra normales) . El porcentaje de identidad entonces se calcula como: Número total de igualaciones idénticas x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de separaciones o vacíos introducidos en la secuencia más larga a fin de alinear las dos secuencias] i -i I CM ro i LO CNJ CM I I oo CM Csl cri I I "3" 00 Csl CU 1 I 1 VD í CM CM 00 I I I -n M i 00 OO CM Csl ;*. I 1 1 1 CM CM 00 CM CM rH rH I I I 1 1 CM 00 00 CM 00 00 I 1 1 oo 00 CM CM CM CM CM C0 I I I I I I I O CM «3< CM 00 00 CM CM CM 00 ro I I I I I I i m N 00 OO Csl 00 O rH 00 CM Csl ? I I I I I 1 1 1 m CM CM 00 CM rH O 00 CM rH Csl s I I I 1 1 1 00 00 00 00 CM 00 CM Csl rH o I i I I I I I 1 1 1 <£> "O CM 00 sr 00 00 rH O sr 00 00 I i I I 1 1 1 V£> rH O O O 00 00 CM 00 CM rH O sr CM n 1 I I I I I 1 1 1 ID O CM r CM 00 CM CM 00 CM 00 CM ro ce 1 I I I I I I I 1 1 1 CM CM o CM CM rH O 00 CM 1 1 I I I I 1 1 o, z Q u o? ? o x ^ Í¿ S P CU EH S H m M-itea ..... -- -• *"^-^^»- La identidad de secuencia de las moléculas de polinucleótidos se determina por métodos similares utilizando una relación como se describe anteriormente. Aquellos expertos en la técnica aprecian que existen muchos algoritmos establecidos, disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda similarmente "FASTA" de Pearson y Lipan es un método de alineamiento de proteínas, adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa zsig57. El algoritmo FASTA se describe por Pearson y Lipman, Proc . Na t ' l Acad. Sci , EUA 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth . Enzimol . 183 : 63 (1990). En resumen, el FASTA primero caracteriza la secuencia similarmente al identificar las regiones compartidas por la secuencia en cuestión (por ejemplo, SEC ID NO: 2) y una secuencia de prueba que tiene ya sea la densidad más alta de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin considerar las sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos conservativas. Las diez regiones con la densidad más alta de identidades luego se vuelven a registrar al comparar la similitud de todos los pares de aminoácidos utilizando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones son "recortados" para incluir únicamente aquellos residuos que contribuyen al registro más alto. Si existen varias regiones con registros mayores que el valor de "corte" (calculado por una fórmula predeterminada en base a la longitud de la secuencia y el valor de ktup) , entonces las regiones iniciales, recortadas se examinan para determinar si las regiones se pueden unir para formar un alineamiento aproximado con las separaciones. Finalmente, las regiones de registro más altas de las dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . 48 : 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl . Ma th . 26:787 (1974)), que permite las inserciones y supresiones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup=l, penalidad por abertura de la separación o vacío=10, penalidad por extensión de la separación o vacío=l, y matriz de sustitución=BLOSUM62, con otros parámetros establecidos como omisiones o implícitos. Estos parámetros se pueden introducir en un programa FASTA al modificar el archivo de la matriz de registro ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth . Enzymol . 183 : 63 (1990).

FASTA también se puede utilizar para -determinar la identidad de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico utilizando una relación como se describe anteriormente. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor de ktup puede variar entre uno a seis, en forma preferente de tres a seis, en forma más preferente tres, con otros parámetros establecidos como omisiones o implícitos. La tabla de BLOSUM62 (Tabla 3) es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de alrededor de 2,000 alineamientos múltiples, locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc . Na t ' l Acad . Sci . EUA 89:10915 (1992)). Por consiguiente, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 se pueden utilizar para definir las sustituciones de aminoácidos conservativas que se pueden introducir en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar las sustituciones de aminoácidos en base únicamente a las propiedades químicas (como se discute posteriormente), las palabras "sustitución de aminoácidos conservativa" se refieren preferentemente a una sustitución representada por un valor BLOSUM62 de mayor que -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2, o 3. De acuerdo con este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservativas, preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las sustituciones conservativas de amominoácidos, más preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3) . Los polipéptidos zsig57 variantes o los polipéptidos zsig57 sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son en forma preferente de una naturaleza menor, esto es sustituciones de aminoácidos conservativos (ver Tabla 4) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegado o la actividad del polipéptido; las supresiones pequeñas, típicamente de uno a alrededor de 30 aminoácidos; y las extensiones amino o carboxiterminales, tal como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido de unión, pequeño de hasta alrededor 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad. La presente invención de esta manera incluye polipéptidos de residuos de alrededor de 70 a 210 aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 80%, en forma preferente al menos 90%, y en forma más preferente 95% o más idéntica a la región correspondiente de la SEC ID NO: 2. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad pueden comprender además un sitio de división proteolítico entre el polipéptido zsig57 y la etiqueta de afinidad. Estos sitios preferidos incluyen sitios de escisión de trombina y sitios de escisión del factor Xa.

Tabla 4 Sustituciones conservativas de aminoácidos Básica: arginina lisina histidina Acídica: ácido glutámico ácido aspártico Polar: glutamina asparagina Hidrofóbica: leucina isoleucina valina Aromática: fenilalanina triptófano tirosina Pequeña: glicina alanina serina treonina metionina La presente invención además proporciona una variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multiméricas, relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, un polipéptido zsig57 se puede preparar como una fusión a una proteína de dimerización como se describe en las patentes norteamericanas Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas de dimerización preferidas en este respecto incluyen domin.i 3 de región constante de inmunoglobulina. Las fusiones de inmunoglobulina-péptido zsig57 se pueden expresar en células genéticamente modificadas para producir una variedad de análogos del zsig57 ultiméricos . Los dominios auxiliares se pueden fusionar a los polipéptidos zsig57 para fijar como objetivo a las células específicas, tejidos o macromoléculas (por ejemplo, colágeno). Por ejemplo, un polipéptido zsig57 o proteína se podría fijar como objetivo a un tipo de célula predeterminado al fusionar un polipéptido sxg57 a un ligando que se enlaza específicamente a un receptor en la superficie de la celular objetivo. De esta manera, los polipéptidos y las proteínas se pueden fijas como objetivo para los propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido zsig57 se puede fusionar a dos o más porciones, tal como una etiqueta da afinidad para la purificación y un r-'' *a?áí¡ñtnfn 11 -• y 11 -¡ - ~n_ L___ dominio objetivo. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre los dominios. Ver, Tuan y colaboradores, Connective Tissue Research 34:l-9, 1996. Las proteínas de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente. Los aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen, sin limitación, trans- 3-metilprolina, 2, 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, allo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina . Diversos métodos son conocidos en la técnica para incorporar los residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente en las proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vi tro en donde las mutaciones sin sentido se suprimen utilizando ARNts supresores, químicamente aminoacilados . Los métodos para sintetizar los aminoácidos y aminoacilar el ARNt son conocidos en la técnica. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin "*-*"' "~-**- Mhri&as?iuüiiiifc.Éífi.i sentido se llevan a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E . coli S30 y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas se purifican mediante la cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 113 : 2722, 1991; Ellman y colaboradores, Methods Enzymol 202 : 301, 1991; Chung y colaboradores, Science 259: 806-9, 1993; y Chung y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos Xenopus mediante la microinyección del ARNm mutado y los ARNts supresores químicamente aminoacilados (Turcatti y colaboradores, J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, las células de E . coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que se debe reemplazar (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia de un (unos) aminoácido ( s ) que no ocurren naturalmente, deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4-fluorofenilalanina) . El aminoácido que no ocurre naturalmente se incorpora en la proteína en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide y colaboradores, Biochem. 3_3:7470-6, 1994. Los residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente se pueden convertir a especies que no ocurren naturalmente mediante una modificación química in vi tro . La modificación química se puede combinar con la mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993). Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no se codifican por el código genético, aminoácidos que no ocurren naturalmente, y aminoácidos no naturales se pueden sustituir por residuos de aminoácidos del zsig57. Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención se pueden identificar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244 : 1081-5, 1989, Bass y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8:4498-502, 1991). En la última técnica, las mutaciones de alanina individuales se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes, resultantes se someten a una prueba de la actividad biológica como se describe posteriormente para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton y colaboradores, J. Biol. Chem. 271: 4699-708, 1996. Los sitios del ligando-receptor u otra interacción biológica también se pueden determinar mediante el análisis físico de la estructura, determinada mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado por fotoafinidad, en conjunción con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativos. Ver, por ejemplo, de Vos y colaboradores, Science 255:306-12, 1992; Smith y colaboradores, J. Mol. Biol. 244:899-904, 1992; Wlodaver y colaboradores, FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden deducir a partir del análisis de homologías con las proteínas relacionadas tales como la CMRF35 de humano. Se pueden hacer múltiples sustituciones de aminoácidos y se pueden someter a prueba utilizando métodos conocidos de la mutagénesis y selección, tales como aquellas descritas por reidhaar-Olson y Sauer (Science 241 : 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). En resumen, estos autores describen los métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar por el polipéptido funcional y luego ordenar en secuencia los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de las sustituciones permitibles de cada posición. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la exhibición del bacteriófago (por ejemplo, Lowman y colaboradores, Biochem. _30: 10832-7, 1991; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409; Huse, Publicación de la WIPO WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire y colaboradores, Gene 4_6:145, 1986; Ner y colaboradores, ADN 7:127, 1988). Las variantes del ADN del zsig57 descrito y las secuencias de polipéptidos se pueden generar a través del entremezclado del ADN como se describe por Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994 y la Publicación de la WIPO WO 97/20078. En resumen, los ADNs variantes se generan mediante la recombinación homologa in vi trc mediante la fragmentación aleatoria de un ADN de origen seguido por la recongregación utilizando la PCR, lo que da por resultado las mutaciones de punto introducido aleatoriamente. Esta técnica se puede modificar al utilizar una familia de ADNs madres o de origen, tales como es las variantes alélicas o los ADNs de las diferentes especies, para introducir una variabilidad adicional en el proceso. La selección o la examinación por la actividad deseada, seguido por las iteraciones adicionales de la mutagénesis y el ensayo proporciona la "evolución" rápida de las secuencias al seleccionar las mutaciones deseadas mientras que se selecciona simultáneamente contra los cambios detrimentales.

Los métodos de mutagénesis descritos en la presente se pueden combinar con los métodos de selección automatizados, de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados en las células hospedantes. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican los polipéptidos activos (por ejemplo, las actividad de enlace de IgA, o la supresión de AMPc como se describe en la presente) se pueden recuperar ?" las células hospedantes y se pueden ordenar en secuencia rápidamente utilizando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a los polipéptidos de estructuras no conocidas. Utilizando los métodos discutidos en la presente, uno de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de fragmentos de pol--péptidos o variantes de la SEC ID NO:2 o que retienen J as propiedades de dominio variable de Ig, la actividad 7e enlace, transcitósis, o transducción de señales de la proteína zsig57 del tipo no cultivado. Por ejemplo, ''tilizando los métodos descritos anteriormente, uno podría identificar un dominio de enlace del ligando en el zsig57; dominios de enlace heterodiméricos y homodiméricos ; otros dominios _^-A-^-^-^~- funcionales o estructurales; u otros dominios importantes para las interacciones de proteína-proteína o la transducción de señales. Tales polipéptidos también pueden incluir segmentos de polipéptidos adicionales, 5 tales como etiquetas de afinidad, como se describe en general en la presente. Para cualquier polipéptido zsig57, inclusive las variantes y las proteínas de fusión, uno de experiencia ordinaria en la técnica puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótidos completamente degenerada que codifica esa variante utilizando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriormente . Los polipéptidos zsig57 de la presente invención, inclusive los polipéptidos de longitud completa, los fragmentos biológicamente activos, y los polipéptidos de fusión, se pueden producir en las células hospedantes, genéticamente modificadas de acuerdo con las técnicas convencionales. Las células hospedantes, adecuadas son aquellos tipos de células que se pueden transformar o transfectar con el ADN exógeno y desarrollar en el cultivo, inclusive bacterias, células fúngales y células eucarióticas más altas, cultivadas. Se prefieren las células eucarióticas, particularmente las células cultivadas de organismos multicelulares. Las 1? , _ . , , ., -,,. „..-,t ^^? ^^^^l^^?m?j¡K ^ ¡¿itm¡it tk técnicas para manipular las moléculas de ADN clonado e -introducir el ADN exógeno en una variedad de las células hospedantes se describen por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Láboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel y colaboradores, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido zsig57 se une de manera operable a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, en general que incluyen un promotor de transcripción y un terminador, dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de duplicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas seleccionables los marcadores se pueden proporcionar en vectores separados, y la duplicación del ADN exógeno se puede proporcionar por la integración en el genoma de las células hospedantes. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un tema de diseño de rutina dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de tales elementos se describen en la literatura y son disponibles a través de los distribuidores comerciales. Para dirigir un polipéptido zsig57 en la vía secretoria de una célula hospedante, una secuencia de señales secretorias (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) se proporciona en el vector de expresión. La secuencia de señales secretorias puede ser aquella del zsig57, o se puede derivar de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o se puede sintetizar de novo . La secuencia de señales secretorias se une de manera operable a la secuencia de ADN del zsig57, es decir, las dos secuencias se unen en la estructura de lectura correcta y se colocan para dirigir al polipéptido recientemente sintetizado en la vía secretoria de la célula hospedante. Las secuencias de señales secretorias se colocan comúnmente 5' a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señales secretorias se pueden colocar en otra parte en la secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo, Welch y colaboradores, patente norteamericana No. 5,037,743; Holland y colaboradores, patente norteamericana No. 5,143,830). De manera alternativa, la secuencia de señales secretorias contenida en los polipéptidos de la presente invención se utiliza para dirigir otros polipéptidos en la vía secretoria. La presente invención proporciona tales polipéptidos de fusión. Un polipéptido de fusión de señales se puede hacer en donde una secuencia de señales secretorias que codifica un péptido de señales del aminoácido 12 (met) a 15 (Gly) de la SEC ID NO: 2 se une de manera operable a otro segmento de ADN que codifica un polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. La secuencia de señales secretorias contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención se fusiona preferentemente amino-terminalmente a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional en la vía secretoria. Tales construcciones tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estas nuevas construcciones de fusión de secuencias de señales secretorias pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada. Tales fusiones se pueden utilizar in vivo o in vi tro para dirigir los péptidos a través de la vía secretoria. Las células cultivadas de mamíferos son hospedantes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir el ADN exógeno en las células hospedantes de mamíferos incluyen la trasnfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y colaboradores, Cell 1^4:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 1_: 603 , 1981: Graham y Can der Eb, Virology _52:456, 1973), la electroporación (Neumann y colaboradores, EMBO J. H841-5, 1982), la transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel y colaboradores, ibid. ) , y la transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson y colaboradores, Focus 15:73, 1993; Ciccarone y colaboradores, Focus 1^5:80, 1993, y los vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7_:980~90' 1989; Wang y Finer, Nature Med. 2^:714-6, 1996). La producción de polipéptidos recombinantes en las células cultivadas de mamíferos se describen, por ejemplo, por Levinson y colaboradores, patente norteamericana No. 4,713,339; Hagen y colaboradores, patente norteamericana No. 4,784,950; Palmiter y colaboradores, patente norteamericana No. 4,579,821; y Ringold, patente norteamericana No. 4,656,134. Las células cultivadas de mamíferos, adecuadas incluyen las líneas de células COS- 1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), GHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham y colaboradores, J. Gen. Virol . £6:59-72, 1977) y ovario de hámster Chino (por ejemplo, CHO-Kl; ATCC No. CCL 61) . Las líneas de células adecuadas, adicionales son conocidas en la técnica y son disponibles de depósitos públicos tales como la American Type Culture Collection, Manassas, VA. Otras líneas de células adecuadas incluyen pero no se limitan a las líneas de células intestinales, osteoblastos, osteoclastos, líneas de células hematopoyéticas, y líneas de células de leucocitos. En general, se prefieren los promotores de transcripción fuertes, tales como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Ver, por ejemplo, patente norteamericana No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de metalotioneína (p ,-3ntes norteamericanas Nos. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío, principal, de adenovirus . La selección de fármacos se utiliza en general para seleccionar las células cultivadas de mamíferos en las cuales se ha insertado el ADN extraño. Tales células son comúnmente referidas como "transfectantes". Las células que han ido cultivadas en la presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie son referidas como "transfectantes estables". Un me rador seleccionable, preferido es una resistencia de ce dificación del gen a la neomicina antibiótica. La selección se lleva a cabo en la presencia de un fármaco del tipo de neomicina, tal come G-418 o similares. Los sistemas de selección también se pueden utilizar oara incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso referido como Htf_ HjüÁMagüa^^M^^^M.^^^ "amplificación". La amplificación se lleva a cabo al cultivar transfectantes en la presencia de un nivel bajo del agente selectivo y luego incrementar la cantidad del agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable, amplificable, preferido es la reductasa de dihidrofolato, la cual confiere la resistencia al metotrexato. También se pueden utilizar otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tales como proteína color verde fluorescente, o las proteínas de la superficie celular tales como CD4, CD8, MHC Clase I, fosfatasa alcalina, placental se pueden utilizar para separar las células transfectadas de las células no transfectadas por medios tales como la clasificación FACS o la tecnología de separación magnética de cuentas. Otras células eucarióticas más altas también se pueden utilizar como hospedantes, inclusive células de plantas, células de insectos y células de aves. El uso de Agro-acterium rhi zogenes como un vector para la expresión de genes en células de plantas ha side revisado por Sinkar y colaboradores, J. Biosci. rfaaw*— . - - . -. -- _ ^^..-¿^3 t . ^ .:?__^_*i (Bangalore) H_: 47-58, 1987. La transformación de células de insectos y la producción de los polipéptidos extraños en las mismas se describen por Guarino y colaboradores, patente norteamericana No. 5,162,222 y la publicación de la WIPO WO 94/06463. Las células de insectos se pueden infectar con baculovirus recombinantes, comúnmente derivados de Autographa cali forni ca nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Ver King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. y colaboradores, Baculovirus Expression Vectors: A laboratory Manual, Nueva York, Oxford University Press., 1994; y Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ. Humana Press, 1995. El segundo método para hacer el baculovirus de zsig57 recombinante utiliza un sistema en base a transposones descrito por Luckow (Luckow, V.A. y colaboradores, J Virol £7:4566-79, 1993). Este sistema, el cual utiliza vectores de transferencia, se vende en el equipo Bac-to-BacMR (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBaclMR (Life Technologies) que contiene un transposon Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido zsig57 en un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado un "bacmido".

El vector de transferencia pFastBaclMR utiliza el promotor de polihedrina AcNPV para impulsar la expresión del gen de interés, en este caso zsig57. Sin embargo, el pFastBaclMR se puede modificar a un grado considerable. El promotor de polihedrina se puede > separar y sustituir con el promotor de proteínas básicas de baculovirus (también conocido como promotor Peor, p6.9 o MP) el cual se expresa más rápido en la infección de baculovirus, y se ha mostrado que es ventajoso para expresar las proteínas secretadas. Ver, Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J. Gen. Virol. 7H971-6, 1990; Bonning, B.C. y colaboradores, J. Gen. Virol. 7_5.1551-6, 1994; y, Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. En tales construcciones de vectores de transferencia, se puede utilizar una versión corta o larga del promotor de proteína básica. Además, se pueden construir vectores de transferencia que reemplacen las secuencias de señales secretoria del zsig57 nativas con secuencias de señales secretorias derivadas de las proteínas de insectos. Por ejemplo, una secuencia de señales secretorias de Ecdiesteroide Glucosiltransferasa (EGT), Melitina de abeja melífera (Invitrogen, Carlsbad, CA) , o baculovirus pg67 (PharMingen, San Diego, CA) se puede utilizar en las construcciones para reemplazar la secuencia de señales secretorias del zsig57, nativa.

Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión dentro de la estructura con ADN que codifica una etiqueta del epítope en la terminación C o N del polipéptido zsig57 expresado, por ejemplo, una etiqueta del epítope Glu-Glu (Grussenmeyer, T. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. £2:4952-4, 1995). Utilizando una técnica conocida en el oficio, un vector de transferencia que contiene el zsig57 se transforma en E . coli, y se selecciona por los bacmidos los cuales contienen un gen lacZ interrumpido, indicativo de baculovirus recombinante. El ADN del bacmido que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aisla, utilizando técnicas comunes, y se utiliza para transfectar las células de Spodoptera frugiperda , por ejemplo las células Sf9. El virus recombinante que expresa el zsig57 se produce subsecuentemente. Las soluciones madre, recombinantes se hacen por los métodos comúnmente utilizados en la técnica. El virus recombinante se utiliza para infectar las células hospedantes, típicamente una línea de células derivada de una polilla americana, migratoria (fall armyworm) , Spodoptera frugiperda . Ver , en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies y Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea de células adecuada es la línea de células High FiveOMR (Invitrogen) derivada de Tri chopl usia ni (patente norteamericana No. 5,300,435). Los medios libres de suero, comercialmente disponibles se utilizan para cultivar y mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 IIR (Life Technologies) o ESF 921MR (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405MR (JRH Biosciences, Lenexa, KS ) o Express FiveOMR (Life Technologies) para las células T. ni . Las células se cultivan de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células, tiempo en el cual se adiciona una solución madre, viral, recombinante en una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 a 10, en forma más típica cerca de 3. Los procedimientos utilizados se describen en general en manuales de laboratorio disponibles (King, L. A. y Possee, R.D., ibid. ; O'Reilly, D.R. y colaboradores, ibid. ; Richardson, C.D., ibid. ) . La purificación subsecuente del polipéptido zsig57 del sobrenadante se puede lograr utilizando los métodos descritos en la presente. Las células fúngales, inclusive las células de levadura, también se pueden utilizar dentro de la presente invención. Las especies de levadura de particular interés en este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanol ica . Los métodos para transformar las células S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes de las mismas se describen por, por ejemplo, Kawasaki, patente norteamericana No. 4,599,311; Kawasaki y colaboradores, patente norteamericana No. 4,931,373; Brake, patente norteamericana No. 4,870,008; Welch y colaboradores, patente norteamericana No. 5,037,743; y Murray y colaboradores, patente norteamericana No. 1,845,075. Las células transformadas se seleccionaron por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la resistencia al fármaco o la capacidad de crecimiento en la ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vectores preferido para el uso en Sa ccha romyces cerevisia e es el sistema del vector POT1 descrito por Kuwasa y y colaboradores (patente norteamericana No. 4,931,373), el cual permite que las células transformadas sean seleccionadas mediante el crecimiento en lis medio que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para el uso en la levadura incluyen aquellos de genes de enzimas glicolíticas por ejemplo, Kawasaki, patente norteamericana No. 1,599,311; Kingsman y colaboradores, patente norteamericana No. 4,615,974; y Bitter, patente norteamericano No. 4,977,092) y genes de deshidrogenasa ^ ßÉ ?t ttí^^^i^^^^m^i^má de alcohol. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyen Hansenula polymorpha , Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces la ctis , Kluyveromyces fragilis , Ustilago mayáis, Pichia pastoris , Pi chia methanoli ca , Pichia guillermondii y Candida mal tosa son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Gleeson y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 132 : 3459-65, 1986 y Cregg, patente norteamericana No. 4,882,279. Las células Aspergi l l us se pueden utilizar de acuerdo con los método de McKnight y colaboradores, patente norteamericana No. 4,935,349. Los métodos para transformar la Acremoni um chrysogenum se describen por Sumino y colaboradores, patente norteamericana No. 5,162,228. Los métodos para transformar la Neurospora se describen por Lambowitz, patente norteamericana No. 4,486,533. El uso de Pi chia methanoli ca como hospedante para la producción de proteínas recombinantes se describe en las Publicaciones de la WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para el uso en la transformación de P. methanol i ca se preparan comúnmente como plásmidos circulares de cadena doble, los cuales se linearizan en forma preferente antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanoli ca , se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean aquel de un gen de P. methanoli ca tal como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2) . Otros promotores útiles incluyen aquellos genes de dihidroxiacetona sintasa (DHAS) , formiato deshidrogenasa (DMF), y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma hospedante, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido situado en la parte lateral en ambos extremos por las secuencias de ADN hospedante. Un marcador seleccionable, preferido para el uso en Pi chia methanol i ca es un gen de P. methanol i ca ADE2 , el cual codifica la fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), el cual permite que las células hospedantes de ade2 se desarrollen en la ausencia de adenina. Para los procesos industriales a gran escala donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere utilizar células hospedantes en las cuales se suprimen ambos genes de utilización de metanol (AUG1 AUG2) . Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren células hospedantes deficientes en los genes de proteasa vacoular ( PEP4 y PRB1 ) . La electroporación se utiliza para facilitar la introducción de un plásmidc que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en las células de P. methanolica . Se prefiere transformar las células de P. methanol i ca mediante la electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado, de decrecimiento de manera exponencial que tiene una intensidad de campo de 2.5 a 4.5 kV/cm, en forma preferente alrededor de 3.75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, en forma más preferente alrededor de 20 milisegundos, las células de P. methanol i ca se cultivan en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y pequeñísimas partes de nutrientes a una temperatura de alrededor de 25°C a 35°C. Los cultivos líquidos se proveen con suficiente ventilación por medios convencionales, tales como agitación de los matraces pequeños o rocío de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanol i ca es YEPD (D-glucosa 2%, Peptona BactoMR 2% (Difco Laboratories,. Detroit, MI), extracto de levadura BactoMR 1% (Difco Laboratories), adenina 0.004% y L-leucina 0.006%) . Las células hospedantes procarióticas, inclusive cepas de la bacteria Escheri chia coli , Ba ci l l us y otros géneros, también son células hospedantes, útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para la transformación de estos hospedantes y la expresión de las secuencias de ADN extraño clonadas - -3£t~* en los mismos son bien conocidas en el oficio (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, ibid) . Cuando se expresa un polipéptido zsig57 en bacterias tales como E . col i , el polipéptido se puede retener en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o se puede dirigir al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se usan, y los granulos se recuperan y se desanturalizan utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado luego se puede volver a plegar y dimerizar al diluir el desnaturalizante, tal como mediante la diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguido por la diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido se puede recuperar del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional al disrrumpir las células (mediante, por ejemplo, el tratamiento sónico o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, debido a eso es obvia la necesidad por la desnaturalización y la replegado . Las células hospedantes, transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células hospedantes, seleccionadas. Se conoce en la técnica una variedad de medios adecuados, inclusive medios definidos y medios complejos, y en general incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, como sea requerido. El medio de crecimiento se seleccionará en general para las células que contienen el ADN exógenamente adicionado mediante, por ejemplo, la selección de fármacos o la deficiencia en un nutriente esencial el cual es complementado por el marcador seleccionable llevado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula hospedante. Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a una pureza >80%, en forma más preferente a una pureza >90%, aun en forma más preferente a una pureza >95%, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es mayor que 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. En forma preferente, un polipéptido purificado es gygfij^ sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Los polipéptidos zsig57 recombinantes, expresados (o polipéptidos zsig57 quiméricos) se pueden purificar utilizando métodos y medios de fraccionación y/o purificación convencional. Por ejemplo, los métodos de purificación particulares descritos en Rindisbacher, L. y colaboradores, supra, son ejemplares, y se pueden adaptar al polio ;• tido zsig57 por uno de experiencia ordinaria en la técnica utilizando los métodos descritos posteriormente . Los métodos de purificación de proteínas incluyen el fraccionamiento de las muestras mediante la precipitación de sulfato de amonio y la extracción de ácido o caotropo. Los pasos de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa. Los medj os cromatográficos, adecuados incluyen dextranos de . \ atizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, especialmente sílices, y similares. Se prefieren los derivados de PEÍ, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatoyr fieos, ejemplares incluyen aquellos medios derivatizedos con grupos fenilo, butilo u octilo, tal como Phen 1-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butil 650 (To?.o Haas, Montgomeryville, PA) , Octil- ^^^^^^^^^^ —*--* «••• Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas .poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos, adecuados incluyen cuentas de vidrio, resinas en base a sílices, resinas , celulósicas, cuentas de agarosa, cuentas de agarosa reticulada, cuentas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles bajo las condiciones en las cuales éstas se deben utilizar. Estos soportes se pueden modificar con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o porciones de carbohidrato. Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen la activación de bromuro de cianógeno, la activación de N- hidroxisuccinimida, la activación de epóxido, activación de sulfhidrilo, la activación de hidrazida y los derivados de carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente utilizados en la técnica, y son disponibles de los distribuidores comerciales. Los métodos para la unión de los polipéptidos del receptor a los medios de soporte son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es un tema de diseño de rutina y se determina en parte por las propiedades del soporte seleccionado. íX^¿X^i~^_ ^a ^táá as n^ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Ver, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principies & -Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988. Los polipéptidos de la presente invención se pueden aislar mediante la explotación de sus propiedades bioquímicas, estructurales y biológicas. Por ejemplo, la cromatografía de adsorción de iones metálicos, inmovilizados (IMAC) se puede utilizar para purificar las proteínas ricas en histidina, inclusive aquellas que comprenden etiquetas de polihistidina. En resumen, primero se carga un gel con los iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. £:l-7, 1985). Las proteínas ricas en histidina serán adsorbidas a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico utilizado, y serán eluidas mediante la elución competitiva, la disminución del pH, o el uso de agentes formadores de quelatos, fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante la cromatografía de afinidad de lecitina y la cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol . , Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, páginas 529-39) . Dentro de las modalidades adicionales de la invención, se pueden construir una fusión del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, proteína de enlace de maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación. Además, utilizando los métodos descritos en la técnica, las fusiones de polipéptidos, o proteínas del zsig57 híbridas, se construyen utilizando regiones o dominios del zsig57 inventivo en combinación con aquellos de las otras proteínas relacionadas (por ejemplo, el CMRF35 de humano o el receptor de poli-Ig) , o proteínas heterólogas (Sambrook y colaboradores, ibid. , Altschul y colaboradores, ibid. , Picard, Cur . Opin. Biology, 5:511-5, 1994, y las referencias en la presente) . Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de dominios o regiones más grandes en un polipéptido de interés. Tales híbridos pueden alterar la cinética de la reacción, el enlace, estrechar o expandir las especificidad del substrato, o alterar el tejido y la localización celular de un polipéptido, y se pueden aplicar a los polipéptidos de una estructura desconocida. Las proteínas de fusión se pueden preparar por métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica al preparar cada componente de la proteína de fusión y conjugarlos químicamente. De manera alternativa, un polipéptido que codifica los diferentes componentes de la proteína de fusión en la estructura de lectura apropiada se puede generar utilizando técnicas conocidas y se puede expresar por métodos descritos en la presente. Por ejemplo, parte o la totalidad de un (unos) dominio (s) que confieren una función biológica se puede (n) intercambiar entre el zsig57 de la presente invención con el (los) dominios correspondiente (s) de otro miembro de la familia de dominios variables de Ig, tal como el CMRF35. Tales dominios incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de señales secretorias, configuraciones conservadas, dominio variable de Ig, dominio de transmembrana, sitios de escisión acídicos, y el fragmento citoplásmico. Se esperaría que estas proteínas de fusión tuvieran un perfil funcional, biológico que es el mismo o similar a los polipéptidos de la presente invención u otros miembros de la familia de proteínas, dependiendo de la fusión construida. Además, tales proteínas de fusión pueden exhibir otras propiedades como se describe en la presente. Los polipéptidos zsig57 o fragmentos de los mismos también se pueden preparar a través de la síntesis química. Los polipéptidos zsig57 pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no pueden incluir un residuo de aminoácidos de metionina inicial.

Los polipéptidos de la presente invención también se pueden sintetizar mediante la síntesis de fase sólida, exclusiva, los métodos de fase sólida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis de solución clásica. Los métodos para sintetizar los polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. £5:2149, 1963; Kaiser y colaboradores, Anal. Biochem. 34:595, 1970. Después de la síntesis completa del péptido deseado en un soporte sólido, el péptido-resina está con un reactivo el cual divide el polipéptido de la resina y separa la mayoría de los grupos protectores de cadena lateral. Tales métodos están bien establecidos en la técnica. La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir utilizando una variedad de ensayos que miden por ejemplo, la transducción de señales, el enlace de Ig o la modulación de AMPc. Estos ensayos son bien conocidos en la técnica. Para una referencia general, ver Nihei, Y., y colaboradores, supra; y Rindisbacher, L., y colaboradores, supra . La actividad de los polipéptidos zsig57 de la presente invención se pueden medir mediante su capacidad para enlazar la Ig. Por ejemplo, el ensayo de enlace de IgA para el componente secretorio de plgR es conocido en la técnica y se puede aplicar a los polipéptidos de la J^^^ >^^^^^£jÉPÉ^*« presente invención. Ver, Rindisbacher, L. y colaboradores, J. Biol. Chem., 270: 14220-14228, 1995. Además, los polipéptidos zsig57 de la presente invención se pueden utilizar para estudiar la proliferación o diferenciación de células pancreáticas. Estos métodos de la presente invención comprenden en general incubar las células a, las células ß, las células ß, las células F y las células acinares en la presencia o ausencia del polipéptido zsig57, un anticuerpo monoclonal, un agonista o antagonista de los mismos y observar los cambios en la proliferación o diferenciación de las células insulares. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para estudiar la insulina. Estos métodos de la presente invención comprenden incubar los adipocitos en un medio de cultivo que comprende el polipéptido zsig57, un anticuerpo monoclonal, un agonista o antagonisa de los mismos ± insulina y observar los cambios en la secreción o diferenciación de proteínas de adipocitos. La presente invención también proporciona métodos para estudiar el metabolismo celular de mamíferos. Estos métodos de la presente invención comprenden incubar las células que se estudian, por ejemplo, células endoteliales, vasculares, de humano, ± el polipéptido zsig57, un anticuerpo monoclonal, un agonista o antagonista de los mismos y observar los cambios en la adipogénesis, gluconeogénesis, glicogenólisis, lipogénesis, captación de glucosa, o 5 similares. También, los polipéptidos zsig57, los agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser terapéuticamente útiles para promover la curación de heridas, por ejem?_3 ), en el intestino. Para verificar la presencia de esta capacidad en los polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas de la presente invención, estos polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas se evalúan con respecto a su capacidad para facilitar la curación de heridas de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. 3i se desea, el rendimiento del polipéptido zsig57 en este respecto se puede comparar a los factores de crecimiento, tales como EFG, NGF, TGF-a, TGF-ß, insulina, IFG-I, IGF-II, factor de crecimiento de fibroblastos (FGE, y similares. Además, los polipéptidos zsig57 o los acoristas o antagonistas de los mismos se pueden evaluar en combinación con uno o más factores de crecimiento para identificar los efectos sinergísticos . Además, los polipéptidos zsig57, los agonistas o antagonistas de los mismos, pueden ser útiles terapéuticamente para las aplicaciones anti-microbianas.

Para verificar la presencia de esta capacidad en los polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas de la presente invención, estos polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas, se evaluaron con respecto a sus propiedades antimicrobianas de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Barsum y colaboradores, Eur. Respir. J. £:709-14, 1995; Sandovsky-Losica y colaboradores, J. Med. Vet. Mycol (Inglaterra) 2£:279-87, 1990; Mehentee y colaboradores, J. Gen. Microbiol (Inglaterra) 135 : 2181-88, 1989; Segal y Savage, Journal of Medical and Veterinary Mycology 24 : 477-479, 1986 y similares. Si se desea, el rendimiento del polipéptido zsig57 en este respecto se puede comparar a las proteínas conocidas que son funcionales con este respecto, tales como las proteínas ricas en prolina, lisozima, histatinas, lactoperoxidasa o similares. Además, el zsig57 puede enlazarse a y proteger las moléculas inmunes (por ejemplo, IgA) del ataque proteolítico u otro ataque microbiano (Brandtzaeg, P. y Krajci, P., "Secretory Component (plgR) " In: Enciclopedia of Immunology, Ivan M. Roitt y Peter J. Delves (eds.), páginas 1360-1364. Academic Press, Londres, 1992). Además, los polipéptidos zsig57 o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden evaluar en combinación con uno o más agentes antimicrobianos para identificar los efectos sinergisticos . La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir utilizando una variedad de ensayos que miden la estimulación de la contractibilidad de células gastrointestinales, la modulación de la captación de nutrientes y/o la secreción de enzimas digestivas. De particular interés son los cambios en la contractibilidad de las células del músculo liso. Por ejemplo, la respuesta contráctil de segmentos del duodeno de mamíferos u otro tejido de músculos lisos gastrointestinales (Depoortere y colaboradores, J. Gastrointestinal Motility H150-159, 1989). Un ensayo in vi vo, ejemplar utiliza un micrómetro ultrasónico para medir los cambios dimensionales radialmente entre las comisuras y longitudinalmente al plano de la base de la válvula (Hansen y colaboradores, Society of Thoracic Surqeons 60:S384-390, 1995). Los agentes protectores, antimicrobianos se pueden hacer funcionar directamente o se pueden hacer funcionar indirectamente. Estos agentes que operan por medio de los mecanismos de acción de asociación de membranas o formación de poros se unen directamente al microbio agravante. Los agentes anti-microbianos también se pueden actuar por medio del mecanismo enzimático, descomponiendo las sustancias protectoras, microbianas o la pared/membrana celular de los mismos. Los agentes anti-microbianos, capaces de inhibir la proliferación de microorganismos o la acción o de disrrumpir la integridad de los microorganismos por cualquier mecanismo expuesto anteriormente, son útiles en los métodos para impedir la contaminación en el cultivo de células por microbios susceptibles a esa actividad antimicrobiana. Estas técnicas involucran el cultivo de células en la presencia de una cantidad efectiva del polipéptido zsig57 o un agonista o antagonista del mismo . También, los polipéptidos zsig57 o agonistas de los mismos se pueden utilizar como reactivos del cultivo de células en estudios in vi tro de la infección de microorganismos exógenos, tal como la infección bacterial, vidal o fungal. Estas porciones también se pueden utilizar en modelos de infección de animales in vivo . También, las propiedades de adherencia a microorganismos de los polipéptidos zsig57 o agonistas de los mismos se pueden estudiar bajo una variedad de condiciones en los ensayos de enlace y similares. Además, los polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas de los mismos, pueden ser útiles terapéuticamente para el mantenimiento de la integridad mucosal. La expresión de tejidos del zsig57 es alta en el intestino delgado, un tejido involucrado en la secreción mucosal. Para verificar la presencia de esta capacidad en los polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas de la presente invención, estos polipéptidos zsig57, agonistas o antagonistas, se evalúan con respecto a su mantenimiento de la integridad mucosal de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Zahm y colaboradores, Eur. Respir. J. £: 381-6, 1995, el cual describe los métodos para medir las propiedades viscoelásticas y las propiedades de la superficie del moco así como también para evaluar el transporte mucoso al toser y mediante la actividad ciliar. Si se desea, el rendimiento del polipéptido zsig57 en este respecto se puede comparar a las mucinas o similares. Además, los polipéptidos zsig57, o agonistas o antagonistas de los mismos, se pueden evaluar en combinación con las mucinas para identificar los efectos sinergísticos . Los precursores de células óseas, tales como osteoblastos y osteoclastos, se generan desde la médula ósea. Dada la localización de la médula ósea de la presente invención, los ensayos que miden la formación y/o resorción del hueso son ensayos importantes para valorar la actividad del zsig57. Un ejemplo es un sistema de ensayo que permite la identificación rápida de sustancias que tienen la actividad del receptor de calcitonina selectivo en las células que expresan el receptor de calcitonina. El receptor de calcitonina es un miembro de la familia del receptor de proteína G y transduce la señal por medio de la activación de la adenilato ciclasa, conduciendo a la elevación de los niveles de AMPc celular (Lin y colaboradores, Science 254 : 1022-24, 1991). Este sistema de ensayo explota la capacidad del receptor para elevar los niveles de AMPc como una forma de detectar otras moléculas que son capaces de estimular el receptor de calcitonina e iniciar la transducción de señales. La activación del receptor se puede detectar por: (1) la medición de la actividad de adenilato ciclasa (Salomón y colaboradores, Anal. Biochem. 58 : 541-48, 1974; Alvarez y Daniels, Anal. Biochem. 187: 98-103, 1990); (2) la medición del cambio en los niveles de AMPc intracelulares utilizando métodos de radioinmunoensayo convencionales (Steiner y colaboradores, J. Biol. Chem. 247 : 1106-13, 1972; Harper y Brooker, J. Cyc. Nucí. Res. H207-18; 1975); o (3) a través del uso de un método del ensayo de proximidad de centelleo de AMPc (SPA) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) : Mientras que estos métodos proporcionan sensibilidad y precisión, ¡?tMÚ UjjÍHjHü! estos involucran un procesamiento de muestras considerable antes del ensayo, son consumidores de tiempo, involucran el uso de radioisótopos, y serían incómodos para los ensayos de selección a gran escala. Un sistema de ensayo alternativo involucra la selección de polipéptidos que son capaces de inducir la expresión de un gen reportero de (CRE) -luciferasa del elemento de respuesta de AMP cíclico, como una consecuencia de ni/ les elevados de AMPc, en las células que expresan un receptor de calcitonina, pero no en las células que carecen de la expresión del receptor de calcitonina, con.o se describe en la patente norteamericana No. 5,622,839, la patente norteamericana No. 5,674,689 y la patente norteamericana No. 5,674,981. Los modelos de animales bien establecidos son disponibles para i-ometer a una prueba la eficacia in vivo de los polipéptidos zsig57 que interactúan con el receptor de calcitonina. Además, estos modelos se pueden utilizar para so.ecer a una prueba los efectos del zsig57 sobre el hueso diferente que a través del receptor de calcitonina. Por ejemplo, el modelo de rata o ratón hipocalcé co se puede utilizar para determinar el efecto en el calcio del suero, y la rata o ratón ovariectomizado f>e puede utilizar como un sistema modelo para la osteoporosis. Los cambios del hueso observados (-ÉÉ-------t-JÍá-MÉÍ en estos modelos y en humanos durante las etapas tempranas de deficiencia de estrógeno son cualitativamente similares. Se ha mostrado que la calcitonina es un agente efectivo para la prevención de la pérdida de hueso en mujeres o ratas ovariectomizadas (Mazzuoli y colaboradores, Calcif. Tissue Int. 47 : 209-14, 1990; Wronski y colaboradores, Endocrinology 129:2246-50, 1991). Se ha mostrado que la alta dosificación de estrógeno inhibe la resorción del hueso y estimula la formación de huesos en un modelo de ratón ovariectomizado (Bain y colaboradores, J. Bone Miner. Res. £:435-42, 1993) . Los polipéptidos zsig57 biológicamente activos de la presente invención que interactúan con el receptor de cacitonina, o ejercen otros efectos en el hueso, por lo tanto se contempla que son vetajosos para el uso en aplicaciones terapéuticas para las cuales es útil la calcitonina. Estas aplicaciones, por ejemplo, están en el tratamiento de la osteoporosis, enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo, osteomalacia, hipercalcemia idiopática de la infancia y otras condiciones. Las aplicaciones adicionales son inhibir la secreción gástrica en el tratamiento de pancreatitis aguda y desórdenes gastrointestinales y los usos como analgésicos, en particular para el dolor de huesos.

Los ensayos in vivo para medir los cambios en las velocidades de formación de huesos incluyen realizar la histología de huesos (ver, Recker, R., eds. Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Ratón: CRC Press, Inc., 1983) y tomografía computarizada, cuantitativa (WCT; Ferretti, J. Bone 17_: 353S-364S, 1995; Orphanoludakis y colaboradores, Investig. Radiol. i2: 122-130; 1979; y Durand y colaboradores, Medical Physics 19:569-573, 1992). Un ensayo ex vivo, ejemplar para medir los cambios en la formación de huesos es un ensayo calvárico (Gowen y colaboradores, J. Immunol. 136:2478-2482, 1986) o un ensayo calvárico de resorción (Linkhart, T.A., y Mohán, S., Endocrinology 125:1484-1491, 1989). Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden someter a un ensayo y utilizar por su capacidad para modificar la inflamación. Los métodos para determinar las cantidades proinflamatorias y antiinflamatorias del zsig57 son conocidos en la técnica y se discuten en la presente. Las proteínas de la presente invención son útiles por ejemplo, en el tratamiento de desórdenes gastrointestinales, linfoides, inflamatorios, pancreáticos, de la sangre o del hueso, se pueden medir in vi tro utilizando células de cultivo o in vivo al administrar las moléculas de la invención reclamada al modelo animal, apropiado. Por ejemplo, las células hospedantes que expresan una forma secretada del polipéptido zsig57 se pueden plantar en un ambiente de alginato e inyectar (implantar) en animales receptores. La microencapsulación de alginato-poli-L-lisina, la encapsulación de membranas permselectivas y las cámaras de difusión son medios para atrapar las células de mamífero transfectadas o las células de mamífero primarias. Estos tipos de "encapsulaciones" no inmunogénica permiten la difusión de proteínas y otras macromoléculas secretadas o liberadas por las células capturadas al animal receptor. De manera más importante, las cápsulas ocultan y protegen las células plantadas, extrañas de la respuesta inmune del animal receptor. Tales encapsulaciones pueden extender la vida de las células inyectadas de unas cuantas horas o días (células puras) a varias semanas (células plantadas). Los filamentos de alginato proporcionan un medio simple y rápido para generar las células plantadas. Los materiales necesarios para generar los filamentos de alginato son conocidos en la técnica. En un procedimiento ejemplar, se prepara 3% de alginato en H20 estéril y se filtra de modo estéril. Justo antes de la preparación de los filamentos de alginato, la solución de alginato se filtra nuevamente. Aproximadamente 50% de una suspensión de células (que contiene alrededor de 5 x 105 a alrededor de 5 x 107 células/ml) se mezcla con la solución de 3% de alginato. Un ml de la suspensión de alginato/célula se extruye en una solución de CaCl2 filtrada, estéril 100 mM durante un período de tiempo de ~15 min, formando un "filamento". El filamento extruído luego se transfiere en una solución de CaCl2 50 mM, y luego en una solución de CaCl2 25 mM. El filamento luego se enjuaga con agua desionizada antes de revestir el filamento mediante la incubación en una solución 0.01% de poli-L-lisina. Finalmente, el filamento se enjuaga con Solución de Ringer Lactada y se extrae de la solución en un cuerpo cilindrico de jeringa (sin aguja). Una aguja de orificio grande luego se une a la jeringa, y el filamento se inyecta intraperitonealmente en un receptor en un volumen para animal de la Solución de Ringer Lactada. Un planteamiento in vi vo, alternativo para someter a un ensayo las proteínas de la presente invención involucra los sistemas de suministro viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen adenovirus, virus del herpes, retrovirus, virus vacunales y virus adeno-asociados (AAV) . El adenovirus, un virus de ADN de cadena doble, es actualmente el vector de transferencia de genes mejor estudiado para el suministro de ácido nucleico heterólogo (para revisión, ver T.C. Becker y colaboradores, Meth. Cell Biol. 4_3: 161-89, 1994; y J.T. Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine 4_: 44-53, 1997). El sistema de adenovirus ofrece diversas ventajas: (i) el adenovirus puede acomodar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) se puede cultivar para un título alto; (iii) infecta una amplia gama de tipos de células de mamíferos; y (iv) se puede utilizar con muchos promotores diferentes inclusive promotores ubicuo, específicos del tejido y regulables. También, debido a que los adenovirus son estables en la corriente sanguínea, éstos se pueden administrar mediante la inyección intravenosa. Utilizando los vectores de adenovirus donde se suprimen las porciones del genoma de adenovirus, los insertos se incorporan en el ADN viral mediante el ligadura directa o mediante la recombinación homologa con un plásmido co-transfectado . En un sistema ejemplar, el gel El esencial ha sido suprimido del vector viral, y el virus no se duplicará a menos que el gen El se proporcione por la célula hospedante (la línea de células 293 de humano es ejemplar) . Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus tiene como objetivo el hígado. Si el sistema de ¿^^^^yy^d^zs suministro adenoviral tiene una supresión del gen El, el virus no se puede duplicar en las células hospedantes. Sin embargo, el tejido del hospedante (por ejemplo, el hígado) expresará y procesará (y, si está presente una secuencia de señales secretorias, secretará) la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en circulación en el hígado altamente vascularizado, y se pueden determinar los efectos sobre el animal infectado. Además, los vectores adenovirales que contienen las diversas supresiones de los genes virales se pueden utilizar en un intento para reducir o eliminar las respuestas inmunes al vector. Tales adenovirus son suprimidos del El, y además contienen las supresiones de E2A o E4 (Lusky, M. y colaboradores, J. Virol. 72:2022- 2032, 1998; Raper, S.E. y colaboradores, Human Gene Therapy £: 671-679, 1998). Además, la supresión de E2b se reporta que reduce las respuestas inmunes (Amalfitano, A. y colaboradores, J. Virol. : 926_933' 1998). Además, al suprimir el ge1 orna del adenovirus completo, se pueden acomodar insertos muy grandes del ADN heterólogo. La generación de los comúnmente llamados adenovirus "carentes de v-'.t lidad" donde se suprimen todos los genes virales, es particularmente ventajosa para la inserción de in.ertos grandes del ADN heterólogo. Para revisión, ver Yeh, P. y Perricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997. El sistema de adenovirus también se puede utilizar para la producción de proteínas in vi tro . Al cultivar las células 293 no infectadas con adenovirus bajo condiciones donde las células no se dividen rápidamente, las células pueden producir proteínas durante períodos de tiempo extendidos. Por ejemplo, las células BHK se cultivan para confluenciar en las fábricas de células, luego se exponen al vector adenoviral que codifica la proteína secretada de interés. Las células luego se cultivan bajo condiciones libres de suero, lo cual permite que las células infectadas sobrevivan durante varias semanas sin división de células significante. De manera alternativa, las células 293 infectadas con el vector de adenovirus se pueden cultivar como células adherentes o en un cultivo de suspensión en una densidad de células relativamente alta para producir cantidades significantes de proteína (Ver Garnier y colaboradores, Cytotechnol . 1_5: 145-55, 1994). Con cualquier protocolo, una proteína heteróloga, secretada, expresada se puede aislar repetidamente del sobrenadante del cultivo de células, del lisado o de las fracciones de membrana dependiendo de la disposición de la proteína expresada en la célula. Dentro del protocolo de producción de células 293 infectadas, las proteínas no secretadas también se pueden obtener de manera efectiva. Como un ligando, la actividad del polipéptido zsig57 se puede medir por un microfisiómetro de biosensores en base a silicio el cual mide la velocidad de acidificación extracelular o excreción de protones asociada con el enlace del receptor y respuestas celulares, fisiológicas, subsecuentes. Un dispositivo ejemplar es el Microfisiómetro CytosensorMR fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Una variedad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el transporte de iones, la producción de energía, la respuesta inflamatoria, la activación regulatoria y del receptor y similares, se pueden medir por este método. Ver, por ejemplo, McConnell, H.M. y colaboradores, Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. y colaboradores Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. y colaboradores, J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. y colaboradores, Eur. J. Pharmacol . 346 : 87-95, 1998. El microfisiómetro se puede utilizar para someter a un ensayo las células eucarióticas o procarióticas, adherentes o no adherentes. Al medir los cambios de acidificación extracelular en los medios celulares a través del tiempo, el microfisiómetro mide directamente las repuestas celulares a diversos estímulos, inclusive el polipéptido zsig57, sus agonistas o antagonistas. En forma preferente, el microfiosiómetro se utiliza para medir las respuestas de una célula eucariótica responsiva al zsig57, comparado con un control de células eucarióticas que no responden al polipéptido zsig57. Las células eucarióticas responsivas al ZSIG57 comprenden las células en las cuales un receptor para el zsig57 ha sido transfectado creando un célula que es responsiva al zsig57; o células naturalmente responsivas al zsig57 tales como las células derivadas del intestino delgado, los PBLs, o el tejido de la médula ósea. Las diferencias, medidas por un cambio, por ejemplo, un incremento o una disminución en la acidificación extracelular, en la respuesta de las células expuestas al polipéptido zsig57, relativo a un control no expuesto al zsig57, son una medida directa de las respuestas celulares moduladas por el zsig57. Además, tales respuestas moduladas por el zsig57 se pueden someter a un ensayo bajo una variedad de estímulos. Utilizando el microfisiómetro, se proporciona un método de identificación de agonistas del polipéptido zsig57, que comprende proporcionar células responsivas a un polipéptido zsig57, cultivar una primera porción de las células en la ausencia de un compuesto de prueba, cultivar una segunda porción de las células en la presencia de un compuesto de prueba, y detectar un cambio, por ejemplo, un incremento o una disminución, en una respuesta celular de la segunda porción de las células comparado con la primera porción de las células. El cambio en la respuesta celular se muestra como una velocidad de acidificación extracelular de cambio medible. Además, cultivar una tercera porción de las células en la presencia del polipéptido zsig57 y la ausencia de un compuesto de prueba se puede utilizar como un control positivo para las células responsivas al zsig57, y como un control para comparar la actividad agonista de un compuesto de prueba con aquel del polipéptido zsig57. Además, utilizando el microfisiómetro, se proporciona un método para la identificación de antagonistas del polipéptido zsig57, que comprende proporcionar células responsivas a un polipéptido zsig57, cultivar una primera porción de las células en la presencia de zsig57 y la ausencia de un compuesto de prueba, cultivar una segunda porción de las células en la presencia del zsig57 y la presencia de un compuesto de prueba y detectar un cambio, por ejemplo, un incremento o una disminución en una respuesta celular de la segunda porción de las células comparado con la ^^^^^^^^fe^^ag^^^^s^^ primera porción de las células. El cambio en la respuesta celular se muestra como una velocidad de acidificación extracelular de cambio medible. Los antagonistas y agonistas, para el polipéptido zsig57, se pueden identificar rápidamente utilizando este método. Además, el zsig57 se puede utilizar para identificar células, tejidos o líneas de células los cuales responden a la vía estimulada por el zsig57. El microfisiómetro, descrito anteriormente, se puede utilizar para identificar rápidamente las células responsivas al ligando, tales como las células responsivas al zsig57 de la presente invención. Las células se pueden cultivar en la presencia o ausencia del polipéptido zsig57. Aquellas células las cuales producen un cambio medible en la acidificación extracelular en la presencia del zsig57 son responsivas al zsig57. Estas líneas de células, se pueden utilizar para identificar los antagonistas y agonistas del polipéptido zsig57 como se describe anteriormente. En vista de la distribución del tejido observada para el zsig57, los agonistas (inclusive el ligando natural/substrato/cofactor/etcétera) y los antagonistas tienen enorme potencial en aplicaciones tanto in vi tro e in vivo . Los compuestos identificados como agonistas del zsig57 son útiles para estimular el ^aiUüügHÉM! crecimiento de las células o la transducción de señales in vi tro e in vivo . Por ejemplo, el zsig57 y los compuestos agonistas y antagonistas del zsig57 son útiles como componentes de los medios de cultivo de células, definidos y se pueden utilizar solos o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que es comúnmente utilizado en el cultivo de célulae. De esta manera, los agonistas son útiles en la prom. ion específicamente del crecimiento y/o desarrollo de las células en el cultivo. Considerando la alta expresión del zsig57 en los PBLs y médula ósea, los polipéptidos zsig57 y los agonistas del zsig57 son útiles como reactivos de experimentación, para el cultivo de muchos tipos de células, inclusive las células T, células B y otras células de los linajes linfoides y mieloides y los linajes hematopoyéticos. Como tal, el polipéptido zsig57 se puede proporcionar como un complemento en el medio de cultivo de células. Los ant qonistas también son útiles como reactivos de exper- mentación para la caracterización de sitios de interacción de ligando-receptor. Los inhibidores de Id actividad del zsig57 (antagonistas del zsig57) incluyen los anticuerpos anti-zsig57 y las proteínas solubles, las cuales se unen al polipéptido -*- ' —***—>*•>-»*'*- ' zsig57, así como también otros agentes peptídicos y no peptídicos (inclusive ribozimas). El zsig57 se puede utilizar para identificar los inhibidores (antagonistas) de su actividad. Los , compuestos de prueba se adicionan a los ensayos descritos en la presente para identificar los compuestos que inhiben la actividad del zsig57. Además de aquellos ensayos descritos en la presente, las muestras se pueden someter a una prueba de inhibición de la actividad del zsig57 dentro de una variedad de ensayos designados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes del zsig57. Por ejemplo, las líneas de células responsivas al zsig57 se pueden transfectar con una construcción de genes reporteros que es responsiva a una vía celular estimulada por el zsig57. Las construcciones de genes reporteros de este tipo son conocidas en la técnica, y comprenderán en general un elemento de respuesta de zsig57-ADN unido operablemente a un gen que codifica una proteína detectable del ensayo, tal como luciferasa. Los elementos de respuesta al ADN pueden incluir, pero no se limitan a, los elementos de respuesta al AMP cíclico (CRE) , elementos de respuesta a la hormona (HRE) , elemento de respuesta a la insulina (IRÉ) (Nasrin y colaboradores, Proc. Nati.

Acad. Sci. USA £2:5273-7, 1990) y elementos de respuesta al suero (SRE) (Shaw y colaboradores, Cell 56: 563-72, 1989) . Los elementos de respuesta al AMP cíclico se revisan en Roestler y colaboradores, J. Biol. Chem. 263 (19): 9063-6; 1988 y Habener, Molec. Endocrinol. _4 (8):1087-94; 1990. Los elementos de respuesta a la hormona se revisan en Beato, Cell £6:335-44; 1989. Los compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidatos se someten a una prueba de la capacidad para inhibir la actividad del zsig57 de las células objetivo como es evidente por una disminución en la estimulación del zsig57 de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectarán los compuestos que bloquean directamente el enlace del zsig57 a los receptores de la superficie celular, así como también los compuestos que bloquean los procesos en la vía celular subsecuente al enlace de receptor-ligando. En la alternativa, los compuestos u otras muestras se pueden someter a una prueba para el bloqueo directo del enlace del zsig57 al receptor utilizando el zsig57 etiquetado con una etiqueta detectable (por ejemplo, 125I, biotina, perosidasa de rábano picante, FITC, y similares) . Dentro de los ensayos de este tipo, la capacidad de una muestra de prueba para inhibir el enlace del zsig57 etiquetado al receptor es indicativa de la actividad inhibitoria, la cual se puede confirmar a través de los ensayos secundarios. Los receptores utilizados dentro de los ensayos de enlace pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados, aislados. Además, la actividad del zsig57 se puede ejercer cuando se enlaza a otro polipéptido o proteína en un complejo. El zsig57 se puede utilizar para identificar las proteínas a las cuales se unen como se describe en la presente. Además, los inhibidores (antagonistas) de estos complejos del zsig57 se pueden identificar como se describe anteriormente. Un polipéptido zsig57 se puede expresar como una fusión con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento de Fc, el cual contiene dos dominios de regiones constantes y carece de la región variable. Los métodos para preparar tales fusiones se describen en las patentes norteamericanas Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Tales fusiones se secretan típicamente como moléculas multiméricas en donde las porciones de Fc son disulfuro enlazado entre sí y dos polipéptidos diferentes de Ig se ordenen en una proximidad cercana entre sí. Las fusiones de este tipo se pueden utilizar para purificar por afinidad el ligando, como una herramienta de ensayo in vi tro, o antagonista del zsig57. Para el uso en los ensayos, las quimeras se unen a una vía de soporte de la región Fc y se utilizan en un formato de ELISA. Un polipéptido zsig57 también se puede utilizar para la purificación del ligando o los polipéptidos a los cuales se une. El polipéptido zsig57 se inmobiliza en un soporte sólido, tal como cuentas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas en base a sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para unir los polipéptidos a los soportes sólidos son conocidos en la técnica, e incluyen química de amina, activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación de sulfhidrilo y activación de hidrazida. El medio resultante será configurado en general en la forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasa a través de la columna una o más veces para permitir que el ligando se una al polipéptido zsig57 del receptor. El ligando luego se eluye utilizando cambios en la concentración de sal, agentes caotrópicos (HCl de guanidina) o pH para disrrumpir el enlace de ligando-receptor . Un sistema de ensayo que utiliza un receptor de enlace del ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par de complemento/anti-complemento) o un fragmento de enlace del mismo, y un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) se puede emplear de manera ventajosa. 5 Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par de complemento/anti-complemento o el fragmento se inmoviliza en la superficie de una microplaqueta o circuito integrado receptor. El uso de este instrumento se describe por Karlsson, J. Immunol. Methods 145 : 229- 10 40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se une covalentemente, utilizando la química de amino o sulfhidrilo, las fibras de dextrano que se unen a la película de oro dentro de las celdas de flujo. Una muestra de prueba se pasa a través de la celda. Si un ligando, epítope, o miembro opuesto del par de complemento/anti-complemento está presente en la muestra, se enlazará al receptor, anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, causando un cambio en el índice refractivo del medio, el cual se detecta como un cambio en la resonancia de plasmon de la superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de velocidades activadas y/o desactivadas, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de enlace, y la valoración de estequiometría de enlace.

MÉ^^^Htí^^^^Ma^^^^^^H?lll^^MÍB^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^MÉlB&É ^^^^^^^^^^^M^^^^M-I^^M Los polipéptidos del receptor de enlace del ligando también se pueden utilizar dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen el análisis Scatchard para la determinación de la afinidad de enlace (ver Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y los ensayos calorimétricos (Cunningham y colaboradores, Science 253 : 545-48, 1991; Cunningham y colaboradores, Science 24_5:821-25, 1991) . Los polipéptidos zsig57 también se pueden utilizar para preparar los anticuerpos que se enlazan a los epítopes, los péptidos o polipéptidos del zsig57. El polipéptido zsig57 o un fragmento del mismo sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular un animal y producir una respuesta inmune. Uno de experiencia en la técnica reconocerla que los polipéptidos que llevan epítopes, antigénicos contienen una secuencia de al menos 6, en forma preferente al menos 9, y en forma más preferente al me..os 15 a alrededor de 30 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido zsig57 (por ejemplo, SEC ID NO:2). Los polipéptidos que comprenden una porción más grande de un polipéptido zsig57, es decir, de 30 a lü residuos hasta la longitud completa de la secuencia de aminoácidos se incluyen. Los antígenos o epítopes inmuno énicos también pueden incluir etiquetas unidas, adyuvantes y portadores, como se describe en la presente. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido zsig57 codificado por la SEC ID NO:2 del número de aminoácido 16 (Gln) al número de aminoácido 199 (Gln) , o un fragmento de 9 a 199 aminoácidos AA contiguos del mismo. Otros antígenos adecuados incluyen el dominio variable de Ig, el dominio variable de Ig con aminoácidos adicionales hasta los sitios de división acídicos, fragmentos citoplásmicos, y otros dominios del zsig57, descritos en la presente. Los péptidos preferidos para el uso como antígenos son los péptidos hidrofílicos tales como aquellos predichos por uno de experiencia en la técnica de un diagrama de hidrofobicidad (Ver la Figura 2). Los péptidos hidrofílicos zsig57 incluyen los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: (1) el número de aminoácido 96 (Glu) al número de aminoácido 101 (Glu) de la SEC ID N0:2; (2) el número de aminoácido 124 (Pro) al número de aminoácido 129 (Glu) de la SEC. ID. NO:2; (3) el número de aminoácido 125 (Pro) al número de aminoácido 130 (Glu) de la SEC ID NO: 2; (4) el número de aminoácido 185 (Arg) al número de aminoácido 190 (Glu) de la SEC ID NO:2; y (5) el número de aminoácido 186 (Lys) al número de aminoácido 191 (Ser) de la SEC ID NO: 2. Los anticuerpos de una respuesta inmune generada por la inoculación de un animal con estos antígenos se pueden aislar y purificar como se describe en la presente. Los métodos para preparar y asilar los anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Cooligan, y colaboradores. (eds.), National Intitutes of Health, John Wiley adn Sons, Inc., 1995; Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R. , Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982. Como sería evidente para uno de experiencia ordinaria en la técnica, los anticuerpos policlonales se pueden generar a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, y ratas con un polipéptido zsig57 o un fragmento del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido zsig57 se puede incrementar a través del uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o el adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tales como las fusiones del zsig57 o una porción del mismo con un -polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína de enlace de maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es "similar al hapteno", esta porción se puede unir o enlazar de manera ventajosa a un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa de forma de ojo de cerradura (KHL) albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide tetánico) para la inmunización. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpos" incluye los anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos que se enlazan al antígeno, tales como fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos intactos, genéticamente modificados tales como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena individual y similares, así como también los péptidos y los polipéptidos de enlace de antígenos, sintéticos, también se incluyen. Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar al injertar los CDRs no humanos en una estructura humana y las regiones constantes o al incorporar los dominios variables, no humanos, completos (opcionalmente al "disfrazar" con una superficie similar a la humana mediante el reemplazo de los residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "disfrazado o revestido") . En algunos ejemplos, los anticuerpos humanizados pueden retener los residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de región variable de humano para aumentar la características de enlace apropiadas. A través de los anticuerpos de humanización, se puede incrementar el período de vida útil biológica, y se reduce el potencial para las reacciones inmunes adversas con la administración a los humanos. Las técnicas alternativas para generar o seleccionar los anticuerpos útiles en la presente incluyen la exposición in vi tro de linfocitos a la proteína o péptido zsig57, y la selección de genotecas de exhibición de anticuerpos en los bacteriófagos o vectores similares (por ejemplo, a través del uso de la proteína o polipéptido zsig57 inmovilizado o etiquetado) . Los genes que codifican los polipéptidos que tienen los dominios de enlace del polipéptidc zsig57, potenciales se pueden obtener al seleccionar genotecas de péptidos aleatorias exhibidas en loe bacteriófagos (exhibición de bacteriófagos) o er bacterias, tales como E . coli . Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos se pueden a^?^tt^j obtener en un número de formas, tal como a través de la mutagénesis aleatoria y la síntesis de polinucleótidos aleatoria. Estas genotecas de exhibición de péptidos, aleatorias se pueden utilizar para seleccionar los péptidos los cuales interactúan con el objetivo conocido el cual puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. La técnicas para crear y seleccionar tales genotecas de exhibición de péptidos, aleatorias son conocidas en la técnica (Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409); Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 4,946,778; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,403,484 y Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,571,698) y las genotecas de exhibición de péptidos, aleatorias y equipos para seleccionar tales genotecas son comercialmente disponibles, por ejemplo de Clontech (Palo Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego, CA) , New England Biolabs, Inc. (Berverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las genotecas de exhibición de péptidos, aleatorias se pueden seleccionar utilizando las secuencias del zsig57 descritas en la presente para identificar las proteínas la cuales se unen al zsig57. Estas "proteínas de enlace" las cuales aü?íM.íüi?iÉ iiitafetf*. interactúan con los polipéptidos zsig57 se pueden utilizar para etiquetar las células; para aislar los polipéptidos homólogos mediante la purificación de afinidad; éstas se pueden conjugar directa o indirectamente a fármacos, toxinas, radionucleótidos y similares. Estas proteínas de enlace también se pueden utilizar en los métodos analíticos tales como para seleccionar las genotecas de expresión y neutralizar la actividad. Las pi: eínas de enlace también se pueden utilizar para los ensayos de diagnóstico para determinar los niveles de circulación de los polipéptidos; para detectar o cuantificar los polipéptidos solubles como el marcador de patología o enfermedad implícita. Estas proteínas de enlace también pueden actuar como "antagonistas" del zsig57 para bloquear el enlace del zsig57 y la transdacción de señales in vi tro e in vivo . Por otra parte, los anticuerpos de humano se pueden producir en animales no humanos, transgénicos que se han modificado para contener los genes de inmunoglobulina co humano como se describe en la publicación de la WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmuro? lobulina endógena en estos animales sea inactivada o -lj-minada, tal como mediante la recombinación homologa. „-.,^.._ , .. ^, ,_ . .. ^--.-. aa&A., Los anticuerpos se consideran que se enlazan específicamente si: 1) éstos exhiben un nivel de umbral de actividad de enlace, y 2) éstos no reaccionan transversalmente de manera significante con moléculas de polipéptidos relacionadas. Un nivel de umbral de enlace se determina si los anticuerpos anti-zsig57 en la presente se enlazan a un polipéptido, péptido o epítope zsig57 con una afinidad en al menos 10 veces más que la afinidad de enl.ice para controlar el polipéptido (diferente de zsig57). Se prefiere que los anticuerpos exhiban una afinidad de enlace (Ka) de 106 M"1 o mayor, en forma preferente 107 M"1 o mayor, en forma más preferente 108 M"1 o mayor, y en forma mucho más preferente 109 M"1 o mayor. La afinidad de enlace de un anticuerpo se puede determinar fácilmente por uno de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard (Acatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949). Si los anticuerpos anti-zsig57 no reaccionan transversalmente de manera significante con las moléculas de polipéptidos relacionadas se muestra, por ejemplo, por el anticuerpo que detecta el polipéptido zsig57 pero no los polipéptidos relacionados, conocidos utilizando un análisis con papel secante Western, normal (Ausubel y colaboradores, ibid. ) . Los ejemplos de los polipéptidos relacionados, conocidos son aquellos -descritos en la técnica anterior, tal como los ortólogos conocidos, y los parálogos y miembros conocidos, similares de una familia de proteínas, (por ejemplo CMRF35 y SC) . La selección también se hace utilizando el zsig57 no humano, y los polipéptidos mutantes del zsig57. Además, los anticuerpos pueden ser "seleccionados contra" los polipéptidos relacionados, conocidos para aislar una población que se enlaza específicamente a los polipéptidos zsig57. Por ejemplo, los anticuerpos producidos para el zsig57 se adsorben a los polipéptidos relacionados, adheridos a la matriz insoluble; los anticuerpos específicos para zsig57 fluirán a través de la matriz bajo las condiciones del amortiguador apropiadas. La selección permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales no reactivos transversalmente para los polipéptidos estrechamente relacionados, conocidos (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan y colaboradores, (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). La selección y el aislamiento de los anticuerpos específicos es bien conocido- en la técnica. Ver, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff y colaboradores, Adv, in Immunol . 4_3: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd. , 1996; Benjamín y colaboradores, Ann. Rev. Immunol. £:67-101, 1984. Los anticuerpos anti-zsig57 de enlace significantemente se pueden detectar por un número de métodos en la técnica, y se describen posteriormente. Se puede utilizar una variedad de ensayos conocidos para aquellos expertos en la técnica para detectar los anticuerpos los cuales se unen específicamente a las proteínas o los polipéptidos zsig57. Los ensayos ejemplares se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (Eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectrofóresis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmuno-preciptación, ensayo inmunosorbente unido a la enzima (ELISA) , ensayo con papel secante de manchas o con papel secante Western, inhibición o ensayo de competencia, y ensayo de emparedado o interpuesto. Además, los anticuerpos se pueden seleccionar para el enlace a la proteína o el polipéptido zsig57 de tipo no cultivado contra tipo mutante. Los anticuerpos para el zsig57 se pueden utilizar para etiquetar las células que expresan el zsig57; para el aislamiento del zsig57 mediante la purificación por afinidad; para los ensayos de diagnóstico para determinar los niveles de circulación de los polipéptidos ozsig57; para detectar o cuantificar los polipéptidos zsig57 solubles como el marcador de patología o enfermedad implícitas. Estos polipéptidos de enlace también pueden actuar como "antagonistas" del zsig57 para bloquear el enlace de zsig57 y la transducción de señales in vi tro e in vivo . Estos polipéptidos de enlace anti-zsig57 serían útiles para inhibir la actividad del zsig57 o el enlace de proteínas . Los anticuerpos para el zsig57 se pueden utilizar para etiquetar las células que expresan el zsig57; para aislar el zsig57 mediante la purificación por afinidad; para los ensayos de diagnóstico para determinar los niveles decirculación de los polipéptidos zsig57; para detectar o cuantificar el zsig57 soluble como marcador de la patología o enfermedad implícita; en los métodos analíticos que emplean FACS; para seleccionar las genotecas de expresión; para generar anticuerpos anti-idiotípicos; y como anticuerpos de neutralización o como antagonistas para bloquear la actividad del zsig57 in vi tro e in vivo . Las etiquetas directas, adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores qumioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las etiquetas indirectas pueden caracterizarse por el uso de biotina-avidina u otros pares de complemento/anti-complemento como intermediarios. Los anticuerpos en la presente también se pueden conjugar directa o indirectamente a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados pueden ser utilizados para las aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo . Además, los anticuerpos para el zsig57 o fragmentos de los mismos se pueden utilizar in vi tro para detectar el zsig57 desnaturalizado o los fragmentos del mismo en los ensayos, por ejemplo, Análisis con Papel Secante Western u otros ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos, las proteínas de enlace o los polipéptidos en la presente también se pueden conjugar directa o indirectamente a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjuntados utilizados para las aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo . Por ejemplo, los polipéptidos o los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar para identificar o tratar los tejidos u órganos que expresan una molécula anti-complementaria, correspondiente (receptor o antígeno, respectivamente, iüuaáiUÉáaÉMHM por ejemplo) . Más específicamente, los polipéptidos zsig57 o los anticuerpos anti-zsig57, o los fragmentos o porciones bioactivos de los mismos, se pueden acoplar a las moléculas detectables o citotóxicas y se pueden suministrar a un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anti-complementaria . Las moléculas detectables, adecuadas se pueden unir directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores ß fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas, adecuadas se puede unir directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o vegetales (por ejemplo, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomona s , ricina, abrina y similares), así como también radionúclidos terapéuticos, tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (ya sea unido directamente al polipéptido o al anticuerpo, o unido indirectamente a través de un medio de una porción formadora de quelatos, por ejemplo) . Los polipéptidos o los anticuerpo-; también se pueden conjugar a los fármacos citotó?lccs, tales como adriamicina. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica se puede conjugar H-r-T -i' - --Y - ~t-: ^-^^ Íj^ßkáia ií—^^ lái^^^^^?^ ^^^^^^^ ^^^^?^^^^^ con un miembro de un par complementario/anticomplementario, donde el otro miembro se enlaza al polipéptido o la porción del anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ejemplar. En otra modalidad, las proteínas de fusión de polipéptido-toxina o las proteínas de fusión de anticuerpo-toxina se pueden utilizar para la inhibición o ablación de células o tejido fijados como un objetivo (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerígenos) . De manera alternativa, si el polipéptido tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de enlace de ligando, más un dominio de fijación como un objetivo), una proteína de fusión que incluye solo el dominio de fijación como un objetivo puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En las instancias donde incluye el dominio solo, la proteína de fusión incluye una molécula complementaria, la molécula anti-complementaria se puede conjugar a una molécula detectable o citotóxica. Tales proteínas de fusión de la molécula complementaria del dominio de esta manera representan un vehículo de fijación como un objetivo, genérico para el suministro específico a las células/tejido de conjugados de -moléculas detectables/citotóxicas, anticomplementarios, genéricos. En otra modalidad, las proteínas de fusión de zsig57-citocina o las proteínas de fusión de anticuerpo- citocina se pueden utilizar para aumentar la eliminación in vivo de los tejidos objetivo (por ejemplo, cánceres intestinales, linfoides, sanguíneos y de médula ósea) , si el polipéptido zsig57 o el anticuerpo anti-zsig57 fija como objetivo, por ejemplo, las células de la sangre o la médula ósea, hiperproliferativas (Ver, en general, Hornick y colaboradores, Blood 89:4437-47, 1997). Ellos describieron proteínas de fusión capaces de la fijación como objetivo de una citocina a un sitio deseado de acción, proporcionando debido a eso una concentración local elevada de citocina. Los, polipéptidos zsig57 adecuados o los anticuerpos anti- zsig57 fijan como un objetivo una célula o tejido no deseable (es decir, un tumor o una leucemia) , y la citocina fusionada media la lisis de células objetivo, mejorada por las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este propósito incluyen interleucina 2 y factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF), por ejemplo.

En aun otra modalidad, si el polipéptido zsig57 o el anticuerpo anti-zsig57 fija como un objetivo las células o tejidos vasculares, tal polipéptido o anticuerpo se puede conjugar con un radionúclido, y particularmente con un radionúclido de beta-emisión, para reducir la restenosis. Tal planteamiento terapéutico posee menos peligro para los clínicos quienes administran la terapia radioactiva. Por ejemplo, las cintas impregnadas de iridio-192 colocadas en recipientes extendidos de los pacientes hasta que se administró la dosis de radicación requerida mostraron un crecimiento del tejido disminuido en el recipiente y un mayor diámetro luminal que el grupo de control, el cual recibió cintas de placebo. Además, la revascularización y la trombosis extendida fueron disminuidas significantemente en el grupo de tratamiento. Se predijeron resultados similares con la fijación como objetivo de un conjugado bioactivo que contenía un radionúclido, como se describe en la presente. El polipéptido bioactivo o los conjugados de anticuerpos descritos en la presente se pueden administrar intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente, o pueden ser introducidos localmente en el sitio de acción propuesto.

Las moléculas de la presente invención se pueden utilizar para identificar y aislar los receptores a los cuales el zsig57 interactúa o se enlaza. Por ejemplo, las proteínas y los péptidos de la presente invención se pueden inmovilizar en una columna y las preparaciones de la membrana pasan por la columna (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson y colaboradores, eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, páginas 195-202) . Las proteínas y los polipéptidos también se pueden radioetiquetar (Methods in Enzymol. , vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-37) o etiquetar por fotoafinidad (Brunner y colaboradores, Ann. Rev. Biochem. £2:483-514, 1993 y Fedan y colaboradores, Biochem. Pharmacol. £3:1167-80, 1984) y las proteínas de la superficie celular, específicas se pueden identificar. Los polipéptidos, el ácido nucleico y/o los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento de desórdenes asociados con el sistema inmune, el sistema gastrointestinal, el corazón, la inflamación, el sistema linfático, la médula ósea, la sangre y los huesos. Las moléculas de la presente invención se pueden utilizar para modular o para tratar o para prevenir el desarrollo de condiciones patológicas en tal tejido diverso como el intestino delgado y médula ósea. En particular, ciertos síndromes o enfermedades pueden ser sujetos a tal diagnosis, tratamiento o prevención. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar por su capacidad para modificar la inflamación. Los métodos para valorar las cualidades proinflamatorias o antiinflamatorias del zsig57 son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la supresión de la producción de AMPc es una indicación de los efectos anti-inflamatorios del componente secretorio de plgT (SC) (Nihei, Y., y colaboradores, Arch. Dermatol. Res., 287:546-552, 1995). El componente SC libre del poli-IgR suprimió el AMPc y inhibió el ICAM y el HLA-Dr inducido por IFN-? en queratinocitos. Además, se ha reportado que el SC libre inhibe el P1A2 y se cree que actúa por medio de la cascada antiinflamatoria de ácido aracadónico. Del mismo modo, el zsig57 puede exhibir efectos antiinflamatorios similares, y puede ejercer estos efectos en los tejidos en los cuales se expresa. Por ejemplo, el zsig57 se expresa en el intestino delgado, y puede ser útil en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino, diverticulitis, inflamación durante y después de la cirugía intestinal, y similares. Además, el zsig57, t=Ü-ßttiMkteiMí expresado en los PBLs y la médula ósea, puede tener otras acciones antiinflamatorias en el corazón, enfermedad inflamatoria pélvica, (PID, por sus siglas en inglés), psoriasis, artritis, y otras enfermedades inflamatorias. Como tal, el polipéptido zsig57 o sus antagonistas, tienen usos potenciales en las enfermedades inflamatorias tales como asma y artritis. Por ejemplo, si -1 zsig57 es proinflamatorio, los antagonistas serían valiosos en la terapia para el asma u otras terapias anti-inflamatorias donde la migración de linfocitos es dañina. De manera alternativa, el zsig57 puede tener un efecto inhibitorio o competitivo en los agentes inflamatorios y puede servir directamente como un agente terapéutico o anti-inflamatorio para el asma. Además, el zsig57 puede servir para otros papeles importantes en la función del pulmón, por ejemplo, broncodilatación, elasticidad del tejido, reclutamiento de linfocitos en la infección y daño del pulmón. Los ensayos para valorar la actividad del zsig57 en las células del puJmón se discuten en Laberge, S. y colaboradores, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 17 : 193-202, 1997; Rumsaeng, V. y colaboradores J. Immunol . , 159:2904-2910, 1997; y Schluesener, H.J. y colaboradores, . Neurosci. Res. 44:606-611, 1996. Los -"--"---*"»"«*= métodos para determinar las cualidades proinflamatorias y antiinflamatorias del zsig57 o sus antagonistas son conocidos en la técnica. Además, otras técnicas de biología molecular, inmunológicas y bioquímicas conocidas en la técnica y descritas en la presente se pueden utilizar para determinar la actividad del zsig57 y para aislar los agonistas y antagonistas. Además, en base a una alta expresión en PBLs, el zsig57 puede exhibir funciones antivirales al inhibir la duplicación viral mediante la señalización específica por medio de su(s) receptor (es) en una célula hospedante (por ejemplo célula T) . El zsig57 puede exhibir una actividad proliferativa de células inmunes, como se describe en la presente, y puede estimular el sistema inmune para combatir las infecciones virales. Además, el zsig57 puede enlazar el CD4 u otro receptor de linfocitos y exhibe efectos antivirales, por ejemplo, contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus linfotrópico de las células T de humano (HTLV, por sus siglas en inglés) . De manera alternativa, el polipéptido zsig57 puede competir por un receptor viral o co-receptor para bloquear la infección viral. El zsig57 se puede dar parenteralmente para impedir la infección viral o para reducir la duplicación viral progresiva y re-infección (Gayowski, T. y colaboradores, Transplantation 6 :422-426, 1997). De esta manera, el zsig57 puede ser utilizado como un agente terapéutico, antiviral, por ejemplo, para las leucemias virales (HTLV) ; SIDA (VIH) , o infecciones virales gastrointestinales causadas por, por ejemplo, rotavirus, calicivirus (por ejemplo Agente Norwalk) y ciertas cepas de adenovirus patogénicos. Las moléculas de la presente invención pueden ser útiles para la proliferación de las células de tejido cardíaco, tal como miocitos o mioblastos cardíacos; miocitos o mioblastos esqueléticos y células del músculo liso; crondrocitos; células endoteliales; adipocitos y osteoblastos in vi tro . Por ejemplo, las moléculas de la presente invención son útiles como componentes de los medios de cultivo de células, definidos, y se pueden utilizar solos o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que es comúnmente utilizado en el cultivo de células. Las moléculas de la presente invención son particularmente útiles en la promoción específicamente del crecimiento y/o desarrollo de miocitos en cultivo, y también se pueden probar utilidad en el estudio de hiperplasia y regeneración de miocitos cardíacos. Los polipéptidos, los ácidos nucleicos y/o los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento de desórdenes asociados con el infarto miocardíaco, infarto cardíaco congestivo, cardiomiopatía hipertrófica y cardiomiopatía dilatada. Las moléculas de la presente invención también pueden ser útiles para limitar el tamaño de infarto después de un ataque al corazón, ayudar en la recuperación después del transplante de corazón, promover la angiogénesis y curar heridas después de la angioplastía o endarterectomía, para desarrollar la circulación colateral, coronaria, por la revascularización en el ojo, por complicaciones relacionadas a la pobre circulación como úlceras del pie de diabéticos, para la apoplejía después de la reperfusión coronaria utilizando métodos farmacológicos, y otras indicaciones donde la angiogénesis es de beneficio. Las moléculas de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la función cardíaca, ya sea al inducir la neogénesis y/o hiperplasia de miocitos cardíacos, al inducir el desarrollo colateral, coronario, o al inducir la remodelación del área miocardíaca, necrótica. Otros usos terapéuticos para la presente invención incluyen la inducción de neogénesis y/o hiperplasia del músculo esquelético, regeneración del riñon y/o para el tratamiento de la hipertensión sistémica y pulmonar.

El desarrollo colateral, coronario inducido por el zsig57 se mide en conejos, perros o cerdos utilizando modelos de oclusión coronaria, crónica (Landau y colaboradores, Amer. Heart J. 29 : 924-931, 1995; Sellke y colaboradores, Surgery 120 (2) : 182-188, 1996; y Lazarous y colaboradores, 1996, ibid) la eficacia del zsig57 para el tratamiento de la apoplejía se somete a una prueba in vivo en ratas, utilizando la oclusión arterial, carótida, bilateral y midiendo los cambios histológicos, así como también el rendimiento complejo (Gage y colaboradores, Neurobiol. Aging £:645-655, 1988). La eficacia del zsig57 en la hipertensión se somete a prueba in vivo utilizando ratas espontáneamente hipertensas (SHR) para la hipertensión sistémica (Marche y colaboradores, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl.1:S114-116, 1995). El polipéptido de zsig57 se expresa en el intestino delgado. De esta manera, las composiciones farmacéuticas del polipéptido zsig57 de la presente invención también pueden ser útiles en la prevención o tratamiento de desórdenes digestivos en el tracto Gl, tales como desórdenes asociados con la expansión o diferenciación de células secretorias, patológicas. Los ensayos y los modelos animales son conocidos en la técnica para monitorear tal expansión o diferenciación y para evaluar el polipéptido zsig57, fragmento, proteínas; de fusión, anticuerpo, agonista o antagonista en la prevención o tratamiento de las mismas. Además, se conoce que los factores de trébol en el intestino están involucrados en la estabilización del moco en los intestinos y los procesos de reparación asociados con la lesión aguda, particularmente leí restitución epitelial (Poulsom, R. Bail. Clin. Gastro., 10; 113-134, 1996; Sands, B.E., y Podolsky, D.K., Annu Rev. Physiol., 48; 253-273, 1996. También, las proteínas de trébol parecen tener un papel en la curación de heridas causadas por las enfermedades inflamatorias, intestinales, y la resistencia a la invasión microbiana por medio del desarrollo de secreción de moco (Palut, A.G., New Eng. J. Med., 336; 5-6-507, 1997; Playford, R.J., J. Royal Coll. Phys. Londres, 31; 37-41, 1997). Los ligandos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) pueden jugar un papel en el aumento de actividad de trébol en los intestinos; sin embargo, la reparación de la lesión del moco no es dependiente del ligando del receptor del EGF, endógeno, principal en los intestinos, el TNF-a que sugiere un papel de otros ligandos no descubiertos (Cook, G.A. y colaboradores, Am. Physiol. Soc., G1540--G1549, 1997) . Por ejemplo, los polipéptidos zsig57 ..A..^-^^.. -„.. pueden servir como tal ligando, la proteína regulatoria u otro factor en la vía de trébol, y por lo tanto juegan un papel terapéutico importante en las enfermedades y lesiones asociadas con los intestinos y el epitelio del moco. También, el polipéptido zsig57 se expresa en la médula ósea y los PBLs y puede ejercer sus efectos en los órganos virales del cuerpo. La actividad del zsig57 expresada en los ITLs y la médula ósea es independiente de la función gastrointestinal. De esta manera, las composiciones farmacéuticas del polipéptido zsig57 de la presente invención pueden ser útiles para la prevención o tratamiento de desórdenes pancreáticos asociados con la regulación patológica de la expansión de células neuroendorinas y exocrinas en el páncreas, tales como IDDM, cáncer pancreático, regulación patológica de los niveles de glucosa de la sangre, resistencia a la insulina o función digestiva. El polipjptido zsig57 de la presente invención puede actuar en 1& vía de decisión predestinada de las células neuroenaocrinas/exocrinas y por lo tanto es capaz de regular 1 =? expansión de células neuroendocrinas y exocrinas en CJ µáncreas. Un uso regulatorio de esta clase es aquel ae la degeneración de células insulares. También, se ha hipotetizado que la autoinmunidad que ^ ^ provoca el IDDM inicia in útero, y el polipéptido zsig57 es un gen de desarrollo involucrado en la división de las células. Los ensayos y modelos de animales son conocidos en la técnica para monitorear la decisión del linaje de células exocrinas/neuroendocrinas, para observar el balance de las células pancreáticas y para evaluar el polipéptido zsig57, el fragmento, la proteína de fusión, el anticuerpo, el agonista o el antagonista en la prevención o tratamiento de las condiciones expuestas anteriormente. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zsig57 son útiles dentro de la aplicaciones de la terapia de genes donde se desea incrementar o inhibir la actividad del zsig57. Si un mamífero tiene un gen zsig57 mutado o ausente, el gen zsig57 se puede introducir en las células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido zsig57 se introduce in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de ADN atenuados o defectuosos, tales como, pero no limitados a, virus simple de herpes (HSV, por sus siglas en inglés) , papilomavirus, virus Epstein Barr (EBV, por sus siglas en inglés), adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), y similares. Se prefieren los virus defectuosos, los cuales carecen completamente o casi completamente de genes virales. Un virus defectuoso no es infectivo después de la introducción en una célula. El uso de los vectores virales, defectuosos permiten para la administración a las células en un área localizada, específica, sin importar que el virus será producido y el vector transferido a otras células por medio de la infección. Los ejemplos de los vectores particulares incluyen, pero no se limitan a, un vector de virus simple de herpes defectuoso 1 (SHVl) (Kaplitt y colaboradores, Molec. Cell. Neurosci. :320-30, 1991); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Strafford-Perricaudet y colaboradores, J. Clin. Invest. £0:626-30, 1992; y un vector de virus adeno-asociado, defectuoso (Samulski y colaboradores, J. Virol. £1:3096-101, 1987; Samulski y colaboradores, J^ Virol. 63:3822-8, 1989). En otra modalidad, un gen zsig57 se puede introducir en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson y colaboradores, patente norteamericana No. 5,399,346; Mann y colaboradores, Cell £3:153, 1983; Temin y colaboradores, patente norteamericana No. 4,650,764; Temin y colaboradores, patente norteamericana No. 4,980,289; Markowits y colaboradores, J. Virol. 6£:1120, 1988; Temin y colaboradores, patente norteamericana No. 5,124,263; Publicación de Patente Internacional No. WO 95/07358, publicada el 16 de Marzo de 1995 por Dougherty y colaboradores; y Kuo y colaboradores, Blood 82 : 845, 1993) . De manera alternativa, el vector se puede introducir mediante la lipofección in vivo utilizando liposomas. Los lípidos catiónicos, sintéticos se pueden utilizar para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84 : 7413-7, 1987; Mackey y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA £5:8027-31, 1988). El uso de la lipofección para introducir los genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciercas ventajas prácticas. La fijación como objetivo, molecular de liposomas a las células específicas representa un área de beneficio. Más particularmente, dirigir la transfección a las células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, dirigir la transfección a tipos de células particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con la heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, riñon y cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas para el propósito de fijación como objetivo. Los péptidos fijados como objetivo (por ejemplo, las hormonas o neurotransmisores), las proteínas tales come anticuerpos, o moléculas no peptídicas se pueden acoplar químicamente a los liposomas. Es posible separar las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plásmido de ADN puro; y luego re-implantar las células transformadas en el cuerpo. Este método es particularmente útil para la médula ósea y los PBLs, en los cuales el zsig57 se expresa normalmente. Los vectores de ADN puro para la terapia de genes se pueden introducir en las células hospedantes, deseadas por los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, la transfección, la electroporación, la microinyección, la transducción, la fusión de células, el dextrano de DEAE, la precipitación de fosfato de calcio, el uso de una pistola de genes o el uso de un transportador de vectores de ADN. Ver, por ejemplo Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 267 : 963-7, 1992; Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 263: 14621-4, 1988. De manera alternativa, el zsig57 se puede utilizar como un receptor para administrar la terapia de genes u otras moléculas terapéuticas a las células y tejidos objetivo. En el accionamiento como un transportador, el zsig57 se puede utilizar para administrar un polinucleótido que codifica un polipéptido, o de manera alternativa, un agente d*£_ quimioterapéutico a los tejidos en los cuales se expresa, por ejemplo, la médula ósea o los PBLs o el intestino. Por ejemplo, un portador de ADN, que consiste de una porción Fab de un anticuerpo anti-zsig57 se puede construir para introducir un plásmido que contiene un ADNc que codifica un polipéptido funcional, por ejemplo, un ADNc que codifica un polipéptido de interés terapéutico. El ADNc que codifica un polipéptido funcional en general sería seleccionado para proporcionar, con la expresión dentro de la célula, un polipéptido funcional donde está presente un polipéptido defectuoso o no funcional. Este anticuerpo anti-zsig57, con el enlace a la molécula del zsig57 en la superficie de la célula será endocitozado o incluido en la célula o de otro modo transportado en la célula, en donde el polipéptido funcional se expresa dentro de la célula. Ver, por ejemplo, Ferkol, T. y colaboradores, Am. Soc. Clin. Invest. £5:493-502, 1995; Ferkol, T. y colaboradores, Gene Therapy £: 669-678, 1996. Además, las porciones químicas se pueden reticular a los anticuerpos anti-zsig57 para la administración química a las células de la misma manera y utilizadas, por ejemplo, para administrar los agentes quimioterapéuticos a las células tumorales. El acoplamiento de sustancias químicas a los anticuerpos es bien conocido en la técnica y descrito en lí--É-Ml-a---t--Í-Í ^^^^^^^& la presente. Como tal, este sistema de adminitración de terapia del zsig57 se puede utilizar in vivo o ex vivo como se describe anteriormente (Ver , por ejemplo, Wu y colaboradores, supra) . Además, los tejidos receptores 5 para la administración de tal terapia mediada por el zsig57 incluyen la médula ósea, los PBLs y el intestino, y otros tejidos y células en las cuales el zsig57 se expresa normalmente, o donde el zsig57 se introduce por métodos conocido^ . i la técnica. 10 La metodología antisentido se puede utilizar para inhibir la transcripción de genes del zsig57, tal como para inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios para un segmento de un polinucleótido que codifica el zsig57 (por ejemplo, un polinucleótido expuesto en la SEC ID NO:l) se diseñan para enlazarse al ARNm que codifica el zsig57 y para inhibir la traducción de tal ARNm. Tales polmucleótidos antisentido se utilizan para inhibir la expresión de lo-_ genes que codifican el polipéptido zsig57 en el culero de células o en un sujeto. La presente invención también proporciona reactivos los cuales encontrarán uso en las aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen del zsig57, una sustancia de prueba que comprende ADN o ARN del zsig57 o una subsecuencj a del mismo se puede utilizar para determinar si el gen del zsig57 está presente en los cromosomas 6 o si ha ocurrido una mutación. El zsig57 se localiza en la región 6p21.1-p21.2 del cromosoma 6 (ver, Ejemplo 3). Las aberraciones cromosómicas, detectables en el lugar del gen del zsig57 incluyen, pero no se limitan a, aneuploidia, cambios en el número de copias de genes, inserciones, supresiones, cambios en los sitios de restricción y reordenamientos. Tales aberraciones se pueden detectar utilizando los polinucleótidos de la presente invención al emplear técnicas de genética molecular, tales como el análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RDLP, por sus siglas en inglés), análisis de repetición una tras otra, corta (STR, por sus siglas en inglés) empleando técnicas de PCR y otras técnicas de análisis de unión genética, conocidas en el oficio (Sambrook y colaboradores, ibid. ; Ausubel y colaboradores, ibid. ; Marian, Chest 108:255-65, 1995). El conocimiento preciso de una posición del gen puede ser útil para un número de propósitos, inclusive: 1) la determinación si una secuencia es parte de un contig existente y la obtención de secuencias genéticas, circundantes, adicionales en diversas formas, tal como clones de YACs, BACs o ADNc; 2) la provisión de un gen candidato, posible para una enfermedad hereditaria la cual muestra una unión a la misma región cromosónica; y 3) la referencia recíproca de organismos modelo, tal como ratón, los cuales pueden ayudar a determinar que función podría tener un gen particular. El gen zsig57 se localiza dentro del lugar de histocompatibilidad mayor (MHC) , el cual codifica las proteínas involucradas con la presentación de antígenos a las células T. Las proteínas y los polipéptidos se procesan y luego se hacen complejos con las moléculas de MHC seguido por el transporte a la superficie de la célula para la presentación a las células T. Un número de moléculas accesorias se codifican en los lugares de MHC que son esenciales para el procesamiento de antígenos y la presentación. Por ejemplo, los transportadores de TAP y la tapasina funcionan para transportar y congregar los péptidos más la MHC respectivamente (Herberg, J.A., y colaboradores, Eur. J. Immuno., 2£: 459-467, 1998). De una manera similar, el polipéptido zsig57 se puede involucrar en la presentación de antígenos, como una chaparona, transportador, elemento de tráfico u otra y función de procesamiento y presentación. La presentación de antígenos se puede medir en ensayos normales conocidos en la técnica; por ejemplo, la presentación de antígenos para las células T citotóxicas, tal como el ensayo de liberación de cromo (Hosken, N.A., y Bevan, M.J., J. Exp. Med. 175:719-729, 1992); y la proliferación y producción de IL-2 por las células T en respuesta a las células de presentación de antígenos (Rudensky, A. Y. y colaboradores, Nature 353: 660-662, 1991; Roosnek, E., y Lanzavecchia, J. Exp. Med. 173:487-489, 1991). Los ratones modificados para expresar el gen zsig57 referidos como "ratones transgénicos", y los ratones que exhiben una ausencia completa de la función del gen zsig57, referidos como "ratones sensibilizados", también se pueden generar (Snouwaert y colaboradores, Science 257 : 1083, 1992; Lowell y colaboradores, Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. y colaboradores, Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986) . Por ejemplo, los ratones transgénicos que sobre-expresan el zsig57, ya sea ambiguamente o bajo un promotor específico del tejido o restringido del tejido se pueden utilizar para averiguar si la sobre-expresión causa un fenotipo. Por ejemplo, la sobre-expresión de un polipéptido zsig57 del tipo no cultivado, un fragmento del polipéptido o un mutante del mismo puede alterar los procesos celulares, normales, lo que da por resultado un fenotipo que identifica un tejido en el cual la expresión del zsig57 es funcionalmente relevante y puede indicar un objetivo terapéutico para el zsig57, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico, preferido para modificador es uno que sobre-expresa el polipéptido zsig57 maduro (aproximadamente los aminoácidos 18 (He) o residuo 16 (Gln) al residuo 199 (Gln) de la SEC ID N0:2). Además, tal sobre-expresión puede dar por resultado un fenotipo que muestre similitud con las enfermedades humanas. De manera similar, los ratones del zsig57, sensibilizados se pueden utilizar para determinar donde se requiere absolutamente in vivo el zsig57. El fenotipo de los ratones sensibilizados es predictivo de los efectos in vi vo de que puede tener un antagonista del zsig57, tal como aquellos descritos en la presente. El ADNc del zsig57 de humano se puede utilizar para aislar el ARNm, el ADNc y el ADN genómico del zsig57 de murino, los cuales se utilizan subsecuentemente para generar los ratones sensibilizados. Estos ratones se pueden emplear para estudiar el gen del zsig57 y la proteína codificada debido a eso en un sistema in vivo, y se pueden utilizar como modelos in vivo para las enfermedades humanas, correspondientes. Además, la expresión de los ratones transgénicos de los polinucleótidos antisentido zsig57 o ribozimas dirigidas contra el zsig57, descritos en la presente, se puede utilizar de manera análoga para los ratones transgénicos descritos anteriormente. Para el uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención se formulan para la administración parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, de acuerdo con los métodos convencionales. La administración intravenosa será mediante la inyección de bolos o la infusión durante un período típico de una o varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína del zsig57 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina amortiguada, 5% de dextrosa en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservadores, estabilizadores, agentes de amortiguamiento, albúmina para impedir la pérdida de proteínas en las superficies de los frasquitos, etcétera. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practrice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995. Las dosificaciones terapéuticas estarán en general en la gama de 0.1 a 100 µg/kg de peso del paciente por día, en forma preferente 0.5-20 mg/kg por día, con la dosificación exacta determinada por el clínico de ^^f^HjA^^^^^ acuerdo con las normas aceptadas, tomando en cuenta la naturaleza y la gravedad de la condición que es tratada, las características del paciente, etcétera. La determinación de la dosificación está dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Identificación del zsgi57 A. Utilización de una Secuencia EST para Obtener el zisg57 de Longitud completa La exploración de las bases de datos de ADN traducido de genotecas del páncreas, hígado, pulmón y pecho utilizando un colector de señales como una averiguación dio por resultado la identificación de una secuencia de la etiqueta de secuencias expresadas (EST) encontrada que es homologa a una secuencia de señales secretorias de humano. La confirmación de la secuencia de EST se hizo mediante el análisis de secuencia del ADNc del cual se origina la EST. Este ADNc se contuvo en un plásmido, y se ordenó en secuencia utilizando los siguientes -"• --»-- *•*--cebadores: ZC976 (SEC ID NO:4), ZC16,495 (SEC ID NO:5), ZC 16,494 (SEC ID NO:6), y ZC 447 (SEC ID NO:7). El clon apareció ser de longitud completa. Los cebadores de oligonucleótidos se diseñaron de la secuencia de la EST identificada. Los cebadores se utilizaron para el cebado internamente dentro de la EST para identificar los tejidos de los cuales se podría aislar un clon de longitud completa. Para obtener un ADNc de longitud nmpleta, se realizó una reacción de amplificación de la PCR en el ADNc Marathon-Ready (Clontech) de una variedad de tejidos: cerebro, hígado, placenta, monocitos, médula ósea y bazo. Una reacción PCR se llevó a cabo utilizando los oligonucleótidos ZC 16,174 (SEC. ID NO:8) y ZC 16,175 (SEC ID NO:9) como cebadores. Esta reacción PCR se llevó a cabo como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 1.5 minutos; 35 ciclos a 94°C durante 15 segundos; luego 62°C durante 20 segundos, luego 72°C durante 30 segundos; seguido por 72°C durante 10 minutos; luego a 4°C mantenidos. Los prcductos resultantes de ADN se electroforizaron en un gel de agarosa 1.5%, y se observó una banda esperada en aproximadamente 200 pb en las reacciones util: i-apdo las genotecas de ADNc de médula ósea, monocitos y bazo como un patrón. La banda de ADN de la muestra de médula ósea fué purificada en gel utilizando un equipo comercialmente disponible (QiaexIIMR; Qiagen) y fué ordenada en secuencia. Los análisis de secuencia del subclon confirmaron que el producto de la PCR incluyó la secuencia de ADN de la EST.

Ejemplo 2 Distribución del Tejido El análisis con papel secante Northern se realizó utilizando Análisis con Papel Secante de Tejidos Múltiples (MTN I, MTN II y MTN III) (Clontech). El producto de la PCR de 200 pb de la médula ósea, descrito en el Ejemplo 1, se purificó utilizando un equipo comercialmente disponible (QiaexII R; Quagen) y luego se etiquetó radioactivamente con 32P-dCTP utilizando Prime-It II, un sistema de etiquetado de cebado, aleatorio (Stratagene Cloning Systems), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La sustancia de prueba luego se purificó utilizando una columna Nuc-TrapMR (Stratagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La solución ExpressHybMR (Clontech) se utilizó para la prehibridización y como una solución de hibridización para los análisis con papel secante Northern. La hibridización tomó lugar durante la noche a 65°C utilizando 5 x 106 cpm/ml de la sustancia de prueba etiquetada. Los papeles secantes luego se lavaron en SSC 2X/SDS 1% a 65°C, seguido por un lavado en SSC 0.1X/SDS 0.1% a 55°C. Se detectó una transcripción a aproximadamente 1.4 kb en los PBLs y la médula ósea. Se detectó una transcripción a aproximadamente 2 kb en el intestino delgado. Las señales no fueron aparentes en otros tejidos representados en los análisis con papel secante. Los Análisis con Papel Secante de Manchas también se realizaron utilizando Human RNA Master BlotsMR (Clontech) . Los métodos y las condiciones para los Análisis con Papel Secante de Manchas son los mismos como para los Análisis con Papel Secante de Tejidos Múltiples descritos anteriormente. La intensidad de las señales fuertes se presentaron en el intestino delgado, hígado y riñon.

Ejemplo 3 Ordenamiento Cromosómico en Base a la PCR del Gen zsig57 El zsig57 se ordenó en el cromosoma 6 utilizando "GeneBridge 4 Radiation Hibrid Panel" comercialmente disponible (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) . El GeneBridge 4 Radiation Hibrid Panel contiene los ADNs de cada uno de los 93 clones híbridos de radiación, más dos ADNs de control (el donador de HFL y el receptor A23) . Un servidor WWW públicamente disponible (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/conting/rhmapper .pl) permite el ordenamiento relativo al Whitehead Institute/MIT Center para el mapa u ordenamiento híbrido de radiación de Genome Research del genoma humano (el mapa u ordenamiento híbrido de radiación "WICGR") el cual se construyó con el GeneBridge 4 Radiation Hibrid Panel. Para el ordenamiento del zsig57 con el "GeneBridge 4 RH Panel", se colocaron 20 µl de las reacciones en una placa de microtítulo de 96 pocilios (Stratagene, La Jolla, CA) y se utilizaron en un ciclador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene) . Cada una de las 95 reacciones PCR consistió de 2 µl de amortiguador de reacción PCR KlenTaq 10X (Clontech Laboratories, Ine, Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezcla de dNTPs (2.5 mM cada uno, Perkin-Elmer, Foster City, CA) , 1 µl de cebador de sentido, ZC16,950, (SEC ID NO: 10), 1 µl de cebador antisentido, ZC 16,951 (SEC. ID NO: 11), 2 µl de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 µl de una Mezcla de Polimerasas Advantage KlenTaq 50X (Clontech) , 25 ng de ADN de un clon híbrido, individual o control y ddH20 para un volumen total de 20 µl . Las reacciones se cubrieron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciclador de la PCR fueron como sigue: un ciclo 1 inicial 5 minutos de desnaturación a 95°C; 35 ciclos de una desnaturación de 1 minuto a 95°C, fortalecimiento de 1 minuto a 60°C, y extensión de 1.5 minutos a 72°C; seguido por una extensión de 1 ciclo final de 7 minutos a 72°C. Las reacciones se separaron mediante la electrofóresis en un gel de agarosa 2% (Life Technologies) . Los resultados mostraron que el zsig57 se ordena 2.12 cR_3000 del marcador de estructura AFM165YD12 en el mapa u ordenamiento híbrido de radiación WICGR del cromosoma 6. Los marcadores de estructura próximo y distal fueron AFM165YD12 y WI-6092, respectivamente. El uso de los marcadores circundantes coloca al zsig57 en la región 6p21.1-p21.1 en el mapa u ordenamiento del cromosoma 6 LDB integrado (The Genetic Location Datábase, Universidad de Southhampton, servidor WWW: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/) .

Ejemplo 4 Creación de los vectores de expresión de baculovirus ZSG57NE y ZSG57CE Se prepararon dos vectores de expresión para expresar los polipéptidos zsig57 en las células de insecto: ZSG57NE, diseñada para expresar un polipéptido tfHtJigfeai|¡aH)k___^ zsig57 con una etiqueta Glu-Glu N-terminal (SEC ID NO: 12), y zSG57CE diseñada para expresar un polipéptido zsig57 con una etiqueta Glu-Glu C-terminal (SEC ID NO: 13). Las sustancias madre de baculovirus recombinante se hicieron para cada una.

Preparación de los vectores de transferencia de baculovirus para la ligación Los vectores de expresión de baculovirus derivados del vector de transferencia, pFastBaclMR (Life Technologies), se prepararon como sigue. Se digirieron aproximadamente 10 µg del ADN del vector con BamHI y Xbal (Boerhinger-Mannheim) durante 2 horas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto digerido, completo luego se sujetó a la electrofóresis en un gel SeaPlaque Agarose 1.25% (en 1XTAE) . El fragmento del vector linearizado se dividió del gel y el gel se purificó utilizando un equipo comercialmente disponible (QiaexIIMR; Qiagen) .

Construcción de la zSG57NE Un fragmento de ADN zsig57 que tiene una etiqueta Glu-Glu N-terminal se generó mediante la PCR.

Un fragmento de ADN zsig57 generado mediante la PCR de 354 pb se creó utilizando ZC17,115 (SEC ID NO: 14) y j^^* ^¿^^ ZC17,228 (SEC ID NO: 15) como cebadores de la PCR y el plásmido que contiene el zsig57, descrito en el Ejemplo 1, como un patrón. La reacción PCR de 100 µl se llevó a cabo como sigue: 94°C durante 2 minutos; luego 25 ciclos de 95°C durante 50 segundos, 50°C durante 1 minuto, y 72°C durante 2 minutos; luego 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos; seguido por 10°C mantenidos. El producto de la PCR luego se pasó en un gel de agarosa 1%/TAE que confirmó la prese ¡ ia del producto de la PCR de 354 pb, esperado. Aproximadamente 1/2 del producto de la PCR se digirió durante 2 horas con BamHI y Xbal (Boerhinger-Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el producto digerido se pasó en un gel de agarosa SeaPlaque 1%/NuSieve 1%. La banda se dividió, se diluyó a agarosa 0.5% con MgCl2 2 mM, se fundió a 68°C y se ligó en un vector de expresión de baculovirus digerido BamHI/Xbal descrito anteriormente. Aproxipedamente 30 nanogramos del inserto zsig57NE digerido, de restricción y aproximadamente 141 ng del vector ae transferencia digerido BamHI/Xbal se ligaron con la Hgasa de ADN T4 (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de ligadura se inició a 37°C, y se transfirió inmediatamente a una cubeta que contenía agua a temperatura ambiente y se almacenó durante la noche a 4°C. La mezcla de ligadura se diluyó 3 veces con TE (Tris 10 mM-HCl, pH 7.5 y EDTA 1 M) y se incubó subsecuentemente a 70°C durante 5 minutos para inactivar la ligasa.

Transformación de la ligadura en Células Competentes de I.ibrary Efficiency DH5a Aproximadamente 1 fmol de la mezcla de ligadura, diluida se transformó en células competentes DH5a Library Efficiency (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con la dirección del fabricante por un choque térmico durante 45 segundos en un baño de agua a 42°C. El ADN ligado se diluyó en 450 ml de medio SOC (Bacto Tryptone 2%, Bacto Yeast Extract 0.5%, 10 ml de NaCl 1M, KCl 1.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM y glucosa 20 mM) y el cultivo se agitó a 250 rpm durante 1 hora a 37°C. Aproximadamente 100 ml del cultivo se colocó en placas LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C. Se escogieron 6 colonias (clones ) de estas placas y 2 ml de cultivos (LB + 100 mg/ml de ampicilina) desarrollados a 37°C durante la noche, con agitación a 250 rpm. El ADN del plásmido se preparó utilizando el sistema QiaVac Miniprepd (Qiagen) de acuerdo con las direcciones del fabricante. Los clones se seleccionaron mediante la digestión de restricción con Dral (Boerhinger-Mannheim) . El análisis de secuencias del ADN se utilizó para verificar la secuencia del zsig57NE de los 6 clones. Los cebadores de la secuencia fueron ZC16,084 (SEC. ID N0:16) y ZC7,350 (SEC. ID N0:17), los cuales reconocen el ADN de vector.

Transformación de ADN miniprep en las células Máximum Efficiency DHlObac Un microlitro de cada uno de los ADNs del plásmido zSG57NE, descritos anteriormente, se utilizó para transformar independientemente 20 ml de células competentes DHlOBac MaxMR Efficiency (Gibco-BRL) de acuerdo con la instrucción del fabricante, por choque térmico a 42°C durante 45 segundos. Los transformadores luego se diluyeron en un volumen apropiado (180 µl) del medio SOC, se incubaron durante 4 horas a 37 °C en un rotador. El volumen se incrementó a 1 ml con SOC y 50 µl colocado en placas Luria Agar que contenían 50 mg/ml de kanamicina, 7 mg/ml de gentamicina, 10 mg/ml de tetraciclina, 40 mg/ml de IPTG y 200 mg/ml de Bluo GalMR. Las células se incubaron durante 2 a 3 días a 37°C hasta que se distinguieron- las colonias color azul y blanco. Esta selección de color se utilizó para identificar aquellas células que contenían un virus que se había incorporado en el plásmido (referidas como un "bacmido") . Esas colonias, las cuales fueron de color-blanco, se escogieron por el análisis. El ADN del bacmido se aisló de las colonias positivas de cada placa y se seleccionó para el inserto correcto. Se escogieron 2 colonias blancas de cada placa y se cultivaron en cultivos de 2 ml de LB 50%, Terrific Broth 50% (TB) , 50 µg/ml de canamicina, 7 µg/ml d€ gentamicina, 10 µg/mL de tetraciclina. Estos se incubaron durante la noche a 37°C en un rotador. El ADM del plásmido se preparó utilizando el sistema QiaVac Miniprepd (Qiagen) como se describe anteriormente. Loe clones se seleccionaron mediante la digestión de restricción con Dral (Boerhinger-Mannheim) , como se describe anteriormente. El análisis de secuencias del ADN se utilizó para verificar las secuencias del zsig57NE en los clones del "bacmido". El ADN del bacmidc del clon zSG57NE(e), que tiene el inserto correcto, se utilizó para transfectar las células Spodoptera fruiperda (Sf9) como se describe posteriormente.

Transfección del ADN del Bacmido en Células de Insectos SF9 y Producción del Virus Recombinante. Las células Sf9 se sembraron en una placa de 6 pocilios normal, a una densidad de 9 x 105 células por pocilio de 35 mm, y se dejaron unir durante 1 hora a 27 °C. En tubos separados, 5 µl de ADN del bacmido se diluyeron con 100 µl del medios Sf-900 II SFM (GibcoBRL) ; y aproximadamente 6 µl del reactivo CellFECTINR (Gibco-BRL) se diluyeron con 100 µl de Sf-900 II SMF. El ADN del bacmido y las soluciones de lípido se mezclaron suavemente y se incubaron durante aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente, para formar un complejo de lípido-ADN. Luego se adicionaron 0.8 ml de Sf-900 II SFM al complejo de lípido-ADN (mezcla de transfección) . Los medios de crecimiento se aspiraron de las células, y la mezcla de transfección luego se aplicó a las células y se incubaron a temperatura ambiente, en un oscilador, durante 2 horas, y luego a 27°C durante 2 horas adicionales. La mezcla de transfección se aspiró completamente de las células y se aplicó el medio SF900II SMF nuevo. Los cultivos se incubaron durante 4 días y luego se recolectó el medio (ahora que contiene partículas de virus zSG57NE(e) recombinante) de las células y se almacenaron a 4°C hasta que estuvieron listos para la amplificación primaria.

MH____aj_^_¿_ Amplificación Primaria del Baculovirus Recombinante Las células Sf9 se cultivaron en 50 ml de Sf- 900 II SFM en un matraz de agitación de 50 ml a una 5 densidad aproximada de aproximadamente 5 x 105 células/ml. Estas luego se transfectaron con 0.200 ml de la sustancia madre del virus zSG57NE(e) del anterior y se incubaron a 27°C durante alrededor de 3 días, tiempo después del cual el virus se recolectó. Las células se 10 hicieron girar y el sobrenadante de 0.2 mieras se filtró. El sobrenadante se almacenó a 4°C y las pelotillas se congelaron a -20°C. La pelotilla de células se descongeló y se sometió a la lisis bajo condiciones hipotónicas para 15 determinar si existía alguna proteína la cual fué: a) producida pero que está en la célula (es decir, detergente extraíble) o b) insoluble. El Procedimiento de Lisis Hipotónica es como sigue: (1) Descongelar las pelotillas de las células; (2) Adicionar 2.5 ml de 20 amortiguador de lisis hipotónico (HLB) a cada pelotilla y resuspender. El HLB contiene Tris 20 mM-HCl (pH 8.3), EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PefablocMR 1 mM, (Boerhinger- Mannheim), 0.5 µM de aprotinina (Boerhinger-Mannheim), 4 µM de leupeptina (Boeringer-Mannheim) , 4 µM de E-64 25 (Boerhinger-Mannheim) , NP-40 1% en H20; 3) Transferir 1 ,,.-,. _ -» , r ... -t.--rn,?-n ' - ^ ^^>><a|tlti>_g_Bi_|¡^¡M_fcá_afa^a|^||_^^M a_Maaa ml del producto lisado a un tubo Eppendorf y mezclar en el rotador durante 20 minutos a 4°C (centrifugar y congelar el 1.5 ml de producto lisado, restante); (4) Centrifugar a 10,000 rpm durante 10 minutos a 4°C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Este nuevo tubo contiene proteínas extraíbles con detergente (fracción extraíble con detergente) ; (e) Adicionar 1 ml de HLB a la pelotilla y resuspender. Este tubo contiene proteínas insolub];-- (fracción insoluble). Un análisis con papel secante Western se realizó en las siguientes muestras: el sobrenadante del cultivo de zSG57NE(e), la fracción extraíble con detergente de zSG57NE(e), la fracción insoluble de zSG57NE(e). El anticuerpo, casero, utilizado para la detección fué un anticuerpo conjugado con HRP, anti-Glu-Glu de ratón (3 m?/mL) , utilizado a una dilución 1:2000 (1.5 µg/mL). 90% de la proteína ZSG57NE estuvo en el sobrenadante del cultivo, con cantidades muy pequeñas en las fracciones ex' raíbles con detergente e insolubles.

Título del virus recombinante en el cultivo El sobrenadante de cultivo se tituló para determinar el nú.iero de placas que forman las unidades/ml (pfu/ml). Las células SF9 se colocaron en las placas de 6 pocilios, normales con 2.4 ml/pocillo en una densidad de células de aproximadamente 5.2 x 10" células/ml. Las células se permitieron unirse al pocilio durante alrededor de 30 minutos. La sustancia madre del virus zSG57NE(e) se diluyó 10"4 y 10"6 en 1 ml de volumen total en el medio SF900II SMF. El medio de crecimiento se separó de las células y la sustancia madre de virus, diluida se adicionó, y se incubó en un oscilador a temperatura ambiente durante 3 horas. Mientras tanto, se preparó una soluc LÓn de Agarosa 1.3%, el medio SF900II SMF 0.9X y se dejó enfriar a 35°C. Después de 3 horas de incubación, la sustancia madre del virus diluido se aspiró de las células y 2.5 ml de la solución de agarosa a 35°C se colocó suavemente y se dejó endurecer. Estas placas luego se incubaron durante 3 días a 27°C. Después de 3 días, las placas virales se identificaron y se contaron para determinar el título del virus. Alrededor de 1 ml de una solución de tinsión, viable (medio de Agarosa 0.8%, Rojo Neutro 0.02%, y SF900 99.2% a 35°C) se colocó en cada pocilio y se dejó endurecer. Los virus crean placas de células usadas las cuales no tomaron el rojo neutro, mientras que lo hacen las células no infectadas, circundantes). Las placas se incubaron a 27°C durante 3 horas y las placas se contaron. El título del virus ZSG57NE fué 1.82 X 108 pfu/ml.

B. Construcción de ZSG57CE Un fragmento de ADN del zsig57 que tiene una etiqueta Glu-Glu C-terminal fué generado mediante la PCR, como se describe anteriormente, utilizando ZC17,116 (SEC ID N0:18) y ZC17,479 (SEC ID N0:19) como cebadores de la PCR y el plásmido que contenía zsig57, descrito en el Ejemplo 1, como un patrón. La reacción PCR de 100 µl se llevó a cabo como se describe anteriormente. El producto de la PCR se verificó en un gel de agarosa, se digirió y el gel se aisló, como se describe anteriormente. La banda de ADN se diluyó a agarosa 0.5% con 2 mM de MgCl2, se fundió a 68°C y se ligó en un vector de expresión de baculovirus digerido con BamHI/Xbal, descrito anteriormente. Aproximadamente 49 nanogramos del inserto del zsig57CE digerido por restricción y aproximadamente 229 ng del vector de transferencia digerido con BamHI/Xbal se ligaron como se describe anteriormente. La transformación de DH5a se realizó, como se describe anteriormente. Se escogieron 5 colonias (clones) y el ADN del plásmido se preparó como se describe anteriormente. Los clones se seleccionaron como se describe anteriormente. El análisis de secuencias de ADN, como se describe anteriormente, se utilizó para verificar la secuencia de zsig57 CE de los 5 clones.

La transformación de DHlObac se realizó como se describe anteriormente. El ADN del bacmido del clon zSG57CE(c), que tiene el inserto correcto, se utilizó para transfectar las células de Spodoptera frugiperda (Sf9) como se describe anteriormente. La amplificación, la lisis hipotónica, el análisis con papel secante Western y el título de la solución madre del virus zSF57CE(c) se realizó como se describe anteriormente. Un análisis con papel secante Western, utilizando el anticuerpo descrito anteriormente, no mostró proteína zSG57CE aparente en el sobrenadante de las células, aproximadamente 10% de la proteína ZSG57CE en la fracción extraíble con detergente, y aproximadamente 90% de la proteína ZSG57CE en las fracciones insolubles. El título del virus zSG57CE fué 6.6 x 107 pfu/ml .

Ejemplo 5 Construcción del Vectores de Expresión de Levadura Etiquetado con Glu-Glu Amino Terminal zsig57 y Etiquetado con Glu-Glu Carboxi-Terminal La expresión del zsig57 en Pi chia metanoli ca utiliza el sistema de expresión descrito en la publicación de la WIPO co-asignada WO 97/17450. Un plásmido de expresión que contiene todo o parte de un -polinucleótido que codifica el zsig57 se construyó por medio de la recombinación homologa. Un vector de expresión se construyó del pCZR204 para expresar los polipéptidos zsig57 etiquetados con Glu-Glu N-terminal (NEE) y C-terminal (CEE) . El vector de pCZR240 contiene el promotor AUG1, seguido por la secuencia líder aFpp, una etiqueta de péptido N-terminal (Glu-Glu) , seguido por un sitio de restricción Smal de extremo truncado, una etiqueta de péptido carboxi-terminal (Glu-Glu) , un codon de detención, traduccional, seguido por el terminador AUG1, el marcador selectable ADE2, y finalmente la región no traducida AUG1 3' . También incluidos en este vector están las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y duplicación en S . cerevi sia e , y las secuencias AmpR y colEl orí requeridas para la selección y la duplicación en E . col i . La secuencia del zsig57 insertada en estos vectores inicia en el residuo 16 (Gln) de la secuencia de aminoácidos del zsig57 (SEC ID NO: 2) . Para cada construcción se preparó un fragmento del zsig57 generado mediante la PCR que contenía ya sea una etiqueta NEE o CEE como se describe posteriormente, í___l_fl__ß_álá¡_. y fueron recombinadas homólogamente en los vectores de expresión de levadura descritos anteriormente.

A. Construcción del plásmido Zsig57 Etiquetado con NEE Un plásmido zsig57 etiquetado con NEE se hizo al recombinar homólogamente 100 ng del vector aceptor pCZR204 digerido con Smal, y 1 µg de fragmento donador de ADN NEE-zsing57, descrito posteriormente, en S . cerevisiae . El fragmento donador NEE-zsig57 se sintetizó mediante una reacción PCR. A un volumen de reacción final de 100 µl se adicionaron 100 pmoles de cada cebador ZC17,019 (SEC ID NO:20) y ZC17,021 (SEC IC NO.21), aproximadamente 10 pmoles del ADN patrón (plásmido del Ejemplo 1), y 10 µl de amortiguador PCR 10X (Boerhinger Mannheim) , 1 µl de Pwo polimerase (Boerhinger Mannheim) , 10 µl de mezcla de nucleótidc trifosfato 0.25 mM (Perkin Elmer) y dH20 para 100 µl . La reacción PCR se llevó a cabo como sigue: 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto; seguido por 1 ciclo en 72°C durante 6 minutos. El fragmento de zsig57 etiquetado con NEE, de cadena doble, de 420 pb, resultante se describe en lai SEC ID NO:22. utaf_?aMI_^t_Ml__aMÉ_Sl¡_^_l B. Construcción del plásmido CEE-zsig57 Un plásmido zisg57 etiquetado con CEE se hizc al recombinar homólogamente 100 ng del vector aceptor pCZR204 digerido con Smal, y 1 µg del fragmento donador de ADN zsig57-CEE, descrito posteriormente, en S . cerevisiae . El fragmento donador zsig57-CEE se hizo por medio de una reacción PCR, como se describe anteriormente, ut.1 izando los oligonucleótidos ZC17,022 (SEC ID NO:23) y ZC17,020 (SEC ID NO:24). El fragmento zsig57-CEE de cadena doble, de 420 pb, resultante se describe en la SEC ID NO:25. Cien microlitros de células de levadura competentes ( S . cerevi sia e) se combinaron independientemente con 10 µl de las diversas mezclas de ADN de antes y se transfirieron a una probeta de: electroporación de 0.2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se electropulsaron a 0.75 kV (5 kV/cm) , 8 ohms, 25 µF. A cada probeta se adicionaron 600 µl de sorbitol 1.2 M y la levadura se colocó en dos alícuotas de 300 µl en dos placas URA D y se incubó a 30°C. Después de alrededor de 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una placa individual se resuspendier n en 2.5 ml de H20 y se hicieron girar brevemente para formar una pelotilla de las células de levadura. La pelotilla de células se resuspendió en 1 ml de amortiguador de lisis (Tritón X-100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) . Quinientos microlitros de la mezcla de lisis se adicionaron a un tubo Eppendorf que contenía 300 µl de cuentas de vidrio lavadas con ácido y 200 µl de fenol-cloroformo, se remolinearon durante intervalos de 1 minuto dos o tres veces, seguido por una rotación de 5 minutos en una centrífuga Eppendorf como velocidad máxima. Trescientos mililitros de la fase acuosa se transfirieron a un tubo nuevo y el ADN se precipitó con 600 µl de etanol (EtOH) , seguido por la centrifugación durante 10 minutos a 4°C. La pelotilla de ADN se resuspendió en 100 µl de H20. La transformación de células DH10B de E . col i , electrocomponentes (Gibco BRL) se hizo con 0.5-2 ml de ADN de levadura prep y 40 µl de células DH10B. Las células se electropulsaron a 2.0 kV, 25 µF y 400 ohms. Después de la electroporación, se colocó en la placa 1 ml de SOC (BactoMR Tryptone 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura 0.5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 µl en cuatro placas LB AMP (LB broth (Lennox) , Agar BactoMR 1.8% (Difco), 100 mg/L de ampicilina) .

Los clones individuales que contienen la construcción de expresión correcta para el zsig57 etiquetado tanto con NEE y CEE se identificaron mediante la digestión por restricción con EcoRI (Boerhinger-Mannheim) para verificar la presencia del inserto del zsig57 y confirmar que las diversas secuencias de ADN se han unido correctamente entre sí. El ADN de los clones con los insertos correctos se sujetó al análisis de secuencias para verificar la secuencia de las construcciones NEE-zsig57 y zsig57-CEE. El ADN del plásmido de escala más grande se aisló utilizando el equipo QuagenMR Maxi (Quagen) de acuerdo con la instrucción del fabricante y el ADN se digirió con Not I para liberar el caset o cartucho de expresión Pi chia -zsig57 del vector restante. El fragmento de ADN digerido por restricción con Not I luego se transformó en el hospedante de expresión de Pi chia methanol i ca , PMAD16. Esto se hizo al mezclar 100 µl de las células PMAD16 competentes, preparadas con 10 µg de zsig57 digerido por restricción con Not I y se transfirió a una probeta de electroporación de 0.2 cm. La mezcla de levadura/ADN se electropulsó a 0.75 kV, 25 µF, onhs infinitos. A la probeta se adicionó 1 ml de Base de Nitrógeno de Levadura IX y se colocaron alícuotas de 500 ml en dos placas ADE DS (polvo de -Ade -Trp -Thr 0.056%, base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos 0.67%, D-glucosa 2%, triptofano 200X 0.5%, solución de treonina, y D-sorbitol 18.22%) para la selección y se incubaron a 30°C. Las células de levadura transformadas se colocaron en placas ADE DS para la selección. Los clones se escogieron y se seleccionaron por medio de un análisis con papel secante Western por la expresión de zsig57 de alto nivel y se sujetaron a la fermentación. Estos clones aislados se consideraron cepas de levadura clonadas, los cuales expresan los polipéptidos zsig57 etiquetados con CEE y NEE descritos en la presente. La cepa de zsig57 etiquetado con NEE resultante se designó PMAD16:pSDH125.1.8 y PMAD16 : : pSDH25.1.13 y el plásmido del zsig57 etiquetado con CEE que contenía la cepa se designó PMAD16 : : pSDHl26.2.19 y PMAD16 : : pSDH126.2.29.

Ejemplo 6 Generación de Adenovirus Recombinante del zsig57 no etiquetado A. Preparación de una construcción de ADN para la generación de Adenovirus La región de codificación de proteínas del zsig57 se amplificó mediante la PCR utilizando cebadores que adicionaron los sitios de restricción Fsel y AscI en las terminaciones 5' y 3' respectivamente. Los cebadores .. , -*»-*..—..-- «^-de PCR ZC17529 (SEC ID N0:26) y ZC17530 (SEC ID NO:27) se utilizaron con el plásmido patrón que contenía el ADNc zsig57 de longitud completa (Ejemplo 1) en una reacción PCR como sigue: un ciclo a 95°C durante 5 minutos; seguido por 15 ciclos a 95°C durante 1 minuto, 58°C durante 1 minuto y 72°C durante 1.0 minutos; seguido por 72°C durante 7 minutos; seguido por un empapamiento a 4°C. El producto de reacción PCR se cargó en un gel SeaPlaque GTG 1.2% (fusión baja) (FMC, Rockland, ME) en el amortiguador TAE. El producto de la PCR del zsig57 se dividió del gel y se purificó utilizando el equipo de limpieza de gel QIAquickMR PCR Purification Kit (Qiagen) como por instrucciones del equipo. El producto de la PCR luego se digerido con Fsel-Ascl, se extrajo con fenol/cloroformo, se precipitó con EtOH, y rehidrató en 20 ml de TE (Tris/EDTA pH 8). El fragmento del zsig57 de 600 pb luego se ligó en los sitios de Fsel-Ascl del vector transgénico pMTl2-8 (Ver Ejemplo 8) y se transformó en las células competentes DH10B mediante la electroporación. Los clones que contenían el zsig57 se identificaron por el ADN del plásmido miniprep seguido por la digestión con Fsel-Ascl. Un clon positivo se envió al departamento de ordenamiento de secuencias para asegurar que no existan supresiones u otras anomalías en la construcción. La secuencia del ADNc del zsig57 se confirmó. El protocolo Quagen Maxi Prep (Qiagen) se utilizó para generar el ADN para continuar con el proceso descrito posteriormente. El ADNc del zsig57 de 600 pb se liberó del 5 vector TG12-8 utilizando las enzimas Fsel y Ascl. El ADNc se aisló en un gel SeaPlaque GTGMR de fusión baja 1% (FMC, Rockland, ME) y luego se dividió del gel y el gel de fundió por rebanadas a 70°C, se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol amortiguado con Tris, y se precipitó con EtOH. El ADN se resuspendió en 10 µl de H20. El ADNc del zsig57 se clonó en los sitios Fsel-Ascl de pAdTrack CMV (He, T-C y colaboradores, PNAS £5:2509-2514, 1998) en los cuales se reemplazó un polienlace nativo con los sitios Fsel, EcoRV y Ascl. La ligadura se realizó utilizando la ligadura de ADN Fast- LinkMR y el equipo de selección (Epicentre Technologies, Madison, Wl). A fin de linearizar el plásmido, aproximadamente 5 µg del plásmido de zsig57 pAdTrack CMV se digirieron con Pmel. Aproximadamente 1 µg del plásmido linearizado se contransformó con 200 ng de supercoiled pAdEasy (He y colaboradores, supra) en células BJ5183. La co-transformación se hizo utilizando un Bio-Rad Gene Pulser a 2.5 kV, 200 ohms y 25 mFa . La co-transformación completa se colocó en 4 placas LB que ^...^.,^„^ ^ , ... _ ,, -^j^, , . . . ... „ ^»»„^a>^..^-,..^... ..,.,.>.^^.,J^gc. contenían 25 µg/ml de canamicina. Las colonias más pequeñas se escogieron y se expandieron en LB/canamicina y ADN de adenovirus recombinante se identificó por los procedimientos de ADN miniprep normales. La digestión del ADN de adenovirus recombinante con Fsel-Ascl confirmó la presencia del zsig57. El ADN miniprep de adenovirus recombinante se transformó en las células componentes DH10B y el ADN se preparado utilizando un equipo Qiagen ma..- prep como por instrucciones del equipo.

B. Transfección de las Células 293a con ADN Recombinante Aproximadamente 5 µg de ADN adenoviral, recombinante se digirió con la enzima Pací (New England Biolabs) durante 3 horas a 37°C en un volumen de reacción de 100 µl que contenía 20-30U de Pací. El ADN digerido se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. La pelotilla de ADN se resuspendió en 10 µl de agua destilada. Un matraz T25 de las células QBI-293A (Quantum Biotechnologies, Tnc. Montreal, Qc. Canadá), inoculadas el día anterior y cultivadas a 60-70% de confluencia, se transfectaron coa el ADN digerido con Pací. El ADN digerido con Pací se diluyó hasta un volumen total de 50 µl con HBS estéril (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM) . En un tubo separado, se diluyeron 20 µl de DOTAP (Boehringer -Mannheim, 1 mg/ml) a un volumen total de 100 µl con HBS. El ADN se adicionó al DOTAP, se mezcló suavemente mediante pipeteado arriba y abajo, y se dejó a • temperatura ambiente durante 15 minutos. El medio se separó de las células 293A y se lavó con 5 ml de MEMalpha libre de suero (Gibco BRL) que contenía Piruvato de sodio 1 mM (GibcoBRL) , aminoácidos no esenciales MEM 0.1 mM (GibcoBL) y amortiguador HEPES 25 mM (GibcoBRL) . Se adicionaron 5 ml de MEM libre de suero a las células 293A y se mantuvieron a 37°C. La mezcla de ADN/lípido se adicionó gota a gota al matraz T25 de células 293A, se mezcló suavemente y se incubó a 37°C durante 4 horas. Después de 4 horas, el medio que contenía la mezcla de ADN/lípido se aspiró y se reemplazó con 5 ml de MEM completo que contenía suero bovino fetal. Las células transfectadas se monitorearon para la expresión Proteína Fluorescente Green (GFP) y formación de focos, por ejemplo, placas virales. Siete días después de la transfección de las células 293A con el ADN adenoviral, recombinante, las células expresaron la proteína GFP y comenzaron a formarse los focos. Estos focos son "placas" virales y el lisado viral, crudo se colectó al utilizar un raspador de células para separar todas las células 293A.

El lisado se transfirió a un tubo cónico de 50 ml . Para -liberar la mayoría de las partículas de virus de las células, se hicieron tres ciclos de congelación/descongelación en un baño de hielo seco/etanol y un baño de agua a 37°.

C. Amplificación del Adenovirus Recombinante (AdVr) El producto lisado, crudo se amplificó (amplificación Primaria (Io)) para obtener una "solución madre" de elaboración del lisado de AdVr del zsig57. Diez placas de 10 cm de células 293A (80-90%) casi confluentes se colocaron 20 horas previamente, se adicionaron 200 ml de producto lisado AdVr, crudo a cada placa de 10 cm y se monitoreó durante 48 a 72 horas buscando el CPE bajo el microscopio de luz blanca y la expresión de GFP bajo el microscopio fluorescente. Cuando todas las células 293A mostraron un CPE (Efecto Citopático) este producto lisado de solución madre Io se colectó y los ciclos congelamiento/descogelamiento se realizaron como se describe bajo Producto Lisado de AdVr Crudo . La Amplificación Secundaria (2°) de AdVr del zsig57 se obtuvo como sigue: Veinte cubetas de cultivo de tejido de 15 cm de las células 293A se prepararon de modo que las células fueron 80-90% confluentes. Todc excepto 20 mis del medio MEM 5% se separó y cada cubeta de cultivo se inoculó con 300-500 ml de producto lisado de AdVr amplificado Io. Después de 48 horas, las células 293A se lisaron de la producción de virus y este producto lisado se colectó en 250 ml de botellas de centrífuga de polipropileno y el AdVr purificado.

D. Purificación de AdV/ADNc El detergente NP-40 se adicionó a una concentración final de 0.5% a las botellas del producto lisado, crudo a fin de provocar la lisis de todas las células. La botellas se colocaron en una plataforma de rotación durante 10 minutos agitando tan rápido como sea posible sin que caigan las botellas. Los residuos se formaron en pelotillas mediante la centrifugación a 20,000 X G durante 15 minutos. El sobrenadante se transfirió a 250 ml de botellas de centrífuga de policarbonato y se adicionaron 0.5 volúmenes de soluciór de PEG8000 20%/NaCl 2.5M. Las botellas se agitaron durante la noche en hielo. Las botellas se centrifugaron a 20,000 X G durante 15 minutos y el sobrenadante se' descargó en una solución blanqueadora. El producto precipitado, blanco en dos líneas verticales a lo largo de la pared de la botella en cualquier lado de la marca de rotación es el virus precipitado/PEG. Utilizando un raspador de células, estéril, el precipitado de 2 botellas se resuspendió en 2.5 ml de PBS. La solución de virus se colocó en tubos de microcentrífuga de 2 ml y se centrifugó a 14,000 X G en la microcentrífuga durante 10 minutos para separar cualquier residuo de las células adicional. El sobrenadante de los tubos de microcentrífuga de 2 ml se transfirió en un tubo de tapa ajustada de polipropileno de 15 ml y se ajustó a una densidad de 1.34 g/ml con cloruro de cesio (CsCl). El volumen de la solución de virus se estimó y se adicionó 0.55 g/ml de CsCl. El CsCl se disolvió y 1 ml de esta solución pesó 1.34 g. La solución se transfirió a tubos de centrífuga de pared gruesa de policarbonato 3.2 ml (Beckman #362305) y se hizo girar a 80,000 rpm (384,000 X G) durante 3-4 horas a 25°C en una microultracentrífuga Beckman Óptima TLX con el rotor TLA-100.4. El virus formó una banda blanca. Utilizando las puntas de la pipeta de orificio amplio, la banda de virus se colectó. El virus del gradiente tiene una gran cantidad de CsCl el cual se debe separar antes de que se pueda utilizar en las células. Las columnas Pharmacia PD-10 preempacadas con Sephadex G-25M (Pharmacia) se utilizaron para desalar la preparación del virus. La columna se equilibró con 20 ml de PBS. El virus se cargó y se dejó parar en la columna. Se adicionaron 5 ml de PBS a la columna y se colectaron fracciones de 8-10 gotas. Las densidades ópticas de las diluciones 1:50 de cada fracción se determinó a 260 nm en un espectrofotómetro. Un pico de absorbancia clara estuvo presente entre las fracciones 7-12. Estas fracciones se agruparon y se determinó la densidad óptica (OD) de una dilución 1:25. Se utiliza una fórmula para convertir la OD en la concentración de virus: (OD a 260 nm) (25) (1.1 x 1012) = viriones o partículas completas del virus/ml. La OD de una dilución 1:25 del AdVr de zsig57 fué 0.114, dando una concentración de virus de 3.1 X 1012 viriones o partículas completas del virus /ml . Para almacenar el virus, se adicionó glicerol al virus purificado a una concentración final de 15%, se mezcló suavemente pero de manera efectiva, y se almacenó en alícuotas a -80°C.

E. Dosificación Infecciosa del Cultivo de Tejido a Ensayo de Tritación Viral CPE 50% (TCID 50) Un protocolo desarrollado por Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Qc . Canadá) se siguió para medir la infectividad del virus recombinante. En resumen, dos placas de cultivo de tejido de 96 pocilios se sembraron con 1X104 células 293A por pocilio en MEM --. -. * _. t..t..^... -Í.M ?^~^. ^Ífa-_»feÍ&_.?-Í-*_-_«IÉMM_M que contenía suero bovino fetal 2% para cada virus recombinante a ser sometido a un ensayado. Después de 24 horas, se hicieron diluciones de 10 veces de cada virus de 1X10"2 a 1X10"14 en MEM que contenía suero bovino fetal 2%. Se colocaron 100 µl de cada dilución en cada uno de los 20 pocilios. Después de 5 días a 37°C, se leyó el Efecto Citopático (CPE) de los pocilios ya sea positivo o negativo para y se calculó un valor para "Unidades de Forma 'ón de Placas/ml" (PFU). La formulación de TCID50 utilizada como por Quantum Biotechnologies, Inc., anterior. El título (T) se determinó de una placa donde el virus utilizado se diluyó de 10"2 a 10"14, y se leyó 5 días después de la infección. En cada dilución se determinó una relación (R) de los pocilios positivos para el CPE por el número total de pocilios. Para calcular el título de la muestra de virus no diluida: el f-actor, "F" = l+d(S-0.5); donde "S" es la suma de las relaciones (R) ; y "d" es LoglO de la serie de dilución, por ejemplo, "d" es igual a 1 durante una serie de dilución de diez veces. El título de la muestra no diluida es T -= 10<1+F) = TCID5o/ml. Para convertir el RCÍDso/ml a pfu/rtj , 0.7 es sustraído del exponente en el cálculo para el título (T) .

El adenovirus del zsig57 tuvo un título de 5.6 X 109 pfu/ml.

Ejemplo 7 Purificación del zsig57 CEE y NEE del medio acondicionado de pichia methanolica A. Purificación del zsig57 CEE del medio de células Sf9 infectadas con baculovirus A menos c;ue se observe de otro modo, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4°C. Una mezcla de inhibidores de proteasa se adicionó a una muestra de 3000 ml del medio acondicionado de los cultivos de pichia (Ejemplo 5) a las concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2.5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co. St . Louis, MO) , 0.001 mM de leupeptina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis , IN) , pepstatina 0.001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0.4 mM (Boehringer-Mannheim). El pH del medio se ajustó a 7.2 con una solución concentrada de NaOH (Sigma Chemical Co., St. Louis) después de la adición de fosfato de potasio (Sigma Chemical Co.) a una concentración final de 0.05M. La muestra se centrifugó a 18,000 x g durante 30 minutos a 4°C en un rotor Beckman JLA-10.5 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) en una centrífuga Beckman Avanti J25I (Beckman Instruments) para separar los residuos de las células. A la fracción del sobrenadante se adicionó una muestra de 50.0 ml de Sepharose anti-EE, preparada como se describe posteriormente, y la mezcla se agitó suavemente en un aparato de cultivo de rodillos Wheaton (Millville, NJ) durante 18.0 horas a 4°C. La mezcla luego se vació en una Econo-Columna de 5.0 x 20.0 cm (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA) y el gel se lavó con 30 volúmenes de la columna de solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Se descargó la fracción a través del flujo no retenida. Una vez que la absorbancia del efluente a 280 nM fué menor que 0.05, el flujo a través de la columna se redujo a cero y el gel de Sepharose anti-EE se eluyó por lotes con 2.0 volúmenes de la columna de PBS que contenía 0.4 mg/ml de péptido EE (AnaSpec, San José, CA) . El péptido EE utilizado para las construcciones del zsig57 tanto CEE y NEE tiene la secuencia GluTyrMetProValAsp (SEC ID NO:28). Después de 1.0 horas a 4°C, el flujo se digirió y la proteína eluida se colectó. Esta fracción se refirió como una fracción de elución de péptido. El gel de Sepharose anti-EE luego se lavó con 2.0 volúmenes de la columna de glicina 0.1M, pH 2.5, y el lavado con glicina se colectó separadamente. El pH de la fracción eluida con glicina se ajustó a.7.0 mediante la adición de un volumen pequeño de PBS 10X y se almacenó a 4°C para el análisis futuro si era necesario. La fracción de elución de péptido se concentró a 5.0 ml utilizando un concentrador de membranas de corte de peso molecular 3,000 (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína NEE o CEE del zsig57 pura en la fracción de elución de péptido se separó del péptido libre, contaminante por la cromatografía de la fracción de elución de péptido en una columna Sephadex G-50 de 1.5 x 50 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en PBS a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min utilizando la CLAP BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) . Las fracciones de dos ml se colectaron y la absorbancia a 280 nM se monitoreó. El primer pico del material absorbiendo a 280 nM y eluyendo casi al volumen vacío de la columna se colectó. Esta fracción fué zsig57 NEE o zsig57 CEE puro. El material puro se concentró como se describe anteriormente, se analizó por SDS-PAGE y el análisis con papel secante Western con anticuerpos anti-EE, y las muestras se tomaron para el análisis de aminoácidos y el ordenamiento en secuencia N-terminal. El resto de la muestra fué prorrateó, y se almacenó a -80°C de acuerdo con los procedimientos normales. La concentración de proteínas del zsig57 NEE purificado fué 0.5 mg/ml y aquella del zsig57 CEE fué 0.46 mg/ml. En los geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie Blue, la preparación de zsig57 NEE contuvo una banda 5 mayor de peso molecular aparente 14,000. La movilidad de esta banda fué la misma en la presencia y ausencia de los agentes de reducción y fué visible en los análisis con papel secante con anticuerpos anti-EE. La proteína purificada de zsig57 CEE también mostró una banda mayor a 14,000 Da en geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie- Blue. El análisis con papel secante Western con anticuerpos anti-EE mostró una banda mayor del material reactivo transversal en 14,000 Da. La movilidad de la banda de 14,000 Da en los análisis con papel secante western no se cambió por la presencia o ausencia de agentes de reducción.

B. Purificación del zsig57 NEE del medio de las células Sf9 infectadas con baculovirus. 20 A menos que se observe de otro modo, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4°C. Una mezcla de los inhibidores de proteasa se adicionó a una muestra de 200 ml del medio acondicionado de las células Sf9 infectadas con baculovirus (Ejemplo 4) a las concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2.5 mM (EDTA, _^a ">*i*AJto*-1 "•*»-Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) , leupeptina 0.001 mN (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) , pepstatina 0.001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0.4 mM (Boehringer-Mannheim). La muestra se centrifugó a 10,000 rpm durante 30 minutos a 4°C en un rotor Beckman JLA- 10.5 (Beckman instruments, Palo Alto, CA) en una centrífuga Beckman Avanti J251 (Beckman Instruments) para separar los residuos de las células. A la fracción del sobrenadante se adicionó una muestra de 50.0 ml de Sepharose anti-EE (preparada como se describe posteriormente) , y la mezcla se agitó suavemente en un aparato de cultivo de rodillos Wheaton (Millville, NJ) durante 18.0 horas a 4°C. La mezcla luego se procesó como se describe anteriormente por el zsig57 NEE de Pichia methanolica. El material puro se concentró como se describe anteriormente, se analizó mediante SDS-PAGE y el análisis con papel secante Western con anticuerpos anti-EE, y las muestras se tomaron para el análisis de aminoácidos y el ordenamiento en secuencias N-terminal. El resto de la muestra se prorrateó y se almacenó a -80°C de acuerdo con los procedimientos normales. La concentración del zsig57 NEE purificado fué 0.3 mg/ml. La electrofóresis en los geles SDS-PAGE en la ausencia de los agentes de reducción mostró dos bandas teñidas con Coomassie Blue de pesos moleculares -•*-- --*-" --*•- _Ü_B_ aparentes 14,000 y 28,000. Cada una de estas bandas mostraron reactividad cruzada en los análisis con papel secante western con IgG anti-EE. En la presencia de agentes de reducción, en contraste, solo se observó una banda teñida con Coomassie Blue de 14,000 Da y esta banda fué la única proteína que mostró reactividad cruzada con anticuerpos anti-EE en los análisis con papel secante Western.

C. Preparación de Sepharose Anti-EE IgG Un volumen de lecho de 100 ml de proteína G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) se lavó 3 veces con 100 ml de PBS que contenía azida de sodio 0.02% utilizando 500 ml de unidad de filtro de 0.45 mieras Nalgene. El gel se lavó con 6.0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8.2 (TEA, Sigma, St . Louis, MO) , y se adicionó un volumen igual de la solución de anticuerpos EE gue contiene 900 mg de anticuerpo. Después de la L cubación durante la noche a 4°C, el anticuerpo no enlazado se separó mediante el lavado de la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM como se describe anteriormente. 7a resina se resuspendió en 2 volúmenes de TEA, se tran.jf±rió a un recipiente adecuado, y se adicionó dimet "-lpimilimidato-2HCl (Pierce, Rockford, IL) , disueltc en TEA, a una concentración final de 36 mg/ml del gel. El gel se osciló a temperatura ambiente durante 45 minutos y el líquido se separó utilizando la unidad de filtro descrita anteriormente. Los sitios no específicos en el gel luego se bloquearon mediante la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mM. El gel luego se lavó con 5 volúmenes de PBS que contenía 0.02% de azida de sodio y se almacenó en esta solución a 4°C.

Ejemplo 8 Construcción para generar Ratones Transgénicos del zsig57 Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento de PCR que contenía una secuencia Kozak consensual y la región de codificación zsig57 exacta.

Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio Fsel en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación en pMT12-8, el vector transgénico normal. El PMT12-8 contiene el promotor MT-1 del ratón y un intron de insulina II de rata 5' corriente arriba del sitio Fsel. Las reacciones PCR se llevaron acabo con 200 ng del patrón de plásmido del zsig57 (Ejemplo 1) y los oligonucleótidos ZC17,529 (SEC ID NO:26) y ZC17,530 (SEC ID NO:27) como cebadores. Las condiciones de la reacción PCR fueron como sigue: 95°C durante 5 minutos, en donde se adicionó la polimerasa de ADNc Advantage® (Clontech) ; 15 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 62°C durante 60 segundos, y 72°C durante 90 segundos; y 72°C durante 7 minutos. Los productos de la PCR se separaron mediante la electrofóresis de gel de agarosa y se purificaron utilizando un equipo de extracción de gel QiaQuickMR (Qiagen) . El fragmento de ADN, de 599 pb, aislado se digirió con Fsel y AscI (Boerhinger-Mannheim) , se precipitó con etanol y se ligó en pMT12-8 que fué digerido previamente con Fsel y Ascl. El plásmido pMT12-8 diseñado para la expresión de un gel de interés en ratones transgénicos, contiene un caset o cartucho de expresión situado en la parte lateral por 10 kb de ADN Mt-1 5' y 7 kb de ADN MT-1 3' . El caset o cartucho de expresión comprende el promotor MT-1, el intron de insulina II de rata, una poliunión para la inserción del clon deseado, y la secuencia poly A de la hormona de crecimiento de humano. Aproximadamente un microlitro de la reacción de ligadura fué electroporado en las células componentes DH10B ElectroMaxMR (GIBCO BRL, Gainthersburg, MD) de acuerdo con la dirección del fabricante y se colocó en placas en placas LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina, y se incubó durante la noche. Las colonias se escogieron y se cultivaron en el medio LB que contenía 100 µg/ml de ampicilina. El ADN miniprep se preparó de los clones escogidos y se seleccionó por el inserto zsig57 mediante la digestión por restricción con EcoRI, y la electrofóresis de gel de agarosa subsecuente. Los maxipreps de la construcción pMT-zisg57 correcta se realizaron. Un fragmento Salí que contenía con las secuencias situadas en la parte posterior 5' y 3' , el promotor MT-1, el intron de insulina II de rata, ADNc del zsig57 y la secuencia poly A de la hormona de crecimiento de humano se preparó para ser utilizada para la microinyección en los oocitos de murino fertilizados. A partir de lo anterior, será apreciado que, aunque han sido descritas las modalidades específicas de la invención en la presente para propósitos de ilustración, se pueden hacer diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no se limita excepto por las reivindicaciones anexas.

-^^^^^¡ $ LISTADO DE SECUENCIAS <110> ZymoGenetics, Inc. 1201 Eastlake Avenue East Seattle. Washington 98102 Estados Unidos de América <120> POLIPEPTIDO INMUNOMODULADOR. ZSIG57 <130> 98-23PC <150> 09/099.600 <151> 1998-06-18 <160> 30 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 1218 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (64)... (660) <400> 1 gaattcggct cgagtgcatc agtgcccagg caagcccagg agttgacatt tctctgccca 6(1 gcc atg ggc etc acc ctg etc ttg ctg ctg etc ctg gga cta gaa ggt 10£l Met Gly Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Glu Gly 1 5 10 15 cag ggc ata gtt ggc age etc ect gag"gtg ctg cag gca ccc gtg gga 156 Gln Gly He Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly 20 25 30 age tcc att ctg gtg cag tgc cac tac agg etc cag gat gtc aaa gct 204 Ser Ser He Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala 35 40 45 cag aag gtg tgg tgc cgg ttc ttg ccg gag ggg tgc cag ccc ctg gtg 252 Gln Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val •á^ükA 50 55 60 tcc tea gct gtg gat cgc aga gct cea gcg ggc agg cgt acg ttt etc 300 Ser Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu 65 70 75 acá gac ctg ggt ggg ggc ctg ctg cag gtg gaa atg gtt acc ctg cag 348 Thr Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln 80 85 90 95 gaa gag gat gct ggc gag tat ggc tgc atg gtg gat ggg gcc agg ggg 396 Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly 100 105 110 ccc cag att ttg cac aga gtc tet ctg aac ata ctg ccc cea gag gaa 444 Pro Gln He Leu His Arg Val Ser Leu Asn He Leu Pro Pro Glu Glu 115 120 125 gaa gaa gag acc cat aag att ggc agt ctg gct gag aac gca ttc tea 492 Glu Glu Glu Thr His Lys lie Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser 130 135 - 140 gac ect gca ggc agt gcc aac ect ttg gaa ccc age cag gat gag aag 540 Asp Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys 145 150 155 age ate ccc ttg ate tgg ggt gct gtg etc ctg gta ggt ctg ctg gtg 588 Ser He Pro Leu He Trp Gly Ala Val Leu Leu Val Gly Leu Leu Val 160 165 170 175 gca gcg gtg gtg ctg ttt gct gtg atg gcc aag agg aaa caá gaa tcc 636 Ala Ala Val Val Leu Phe Ala Val Met Ala Lys Arg Lys Gln Glu Ser 180 185 190 etc etc agt ggt cea cea cgt cag tgactctgga ccggctgctg aattgccttt 690 Leu Leu Ser Gly Pro Pro Arg Gln 195 ggatgtacca cacattaggc ttgactcacc acetteattt gacaatacca cctacaccag 750 cctacctctt gattccccat caggaaaacc ttcactccca gctccatcct cattgccccc 810 tctacctcct aaggtcctgg tctgctccaa gcctgtgaca tatgecacag taatcttccc 870 gggagggaac aagggtggag ggacctcgtg tgggccagcc cagaatccac ctaacaatca 930 gactccatcc agetaagetg ctcatcacac tttaaactca tgaggaccat ccctaggggt 990 tctgtgcatc catccagcca gctcatgccc taggatcett aggatatctg agcaaccagg 1050 gactttaaga tetaatecaa tgtcctaact ttactaggga aagtgacgct cagacatgac 1110 m^^^^^^^^^^^^^^ ¿? ßßm m?¡m tgagatgtct tggggaagac ctccctgcac ccaactcccc cactggttct tctaccatta 1170 cacactgggc taaataaacc ctaataatga tgtgcaaaaa aaaaaaaa 12..8 <210> 2 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Gly He Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser 20 25 30 Ser He Leu Val Gp Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln 35 40 45 Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser 50 55 60 Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr 65 70 75 80 Asp Leu Gly Gly Gly leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu 85 90 95 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro 100 105 110 Gln He Leu His Arg Val Ser Leu Asn He Leu Pro Pro Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Glu Thr His Lys He Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser Asp 130 135 140 Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys Ser 145 150 155 160 lie Pro Leu He Trp Gly Ala Val Leu Leu Val GTy Leu Leu Val Ala 165 170 175 Ala Val Val Leu Phe ?'d Val Met Ala Lys Arg Lys Gln Glu Ser Leu 180 185 190 Leu Ser Gly Pro Pro Arg Gln 195 <210> 3 <211> 597 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de polinucleótidos degenerada para el zsig57 <221>misc característica <222> (D...Í597) <223> n - A.T.C o G <400> 3 atgggnytna cnytnytnyt nytnytnytn ytnggnytng arggncargg nathgtnggn 60 wsnytnccng argtnytnca rgcnccngtn ggnwsnsna thytngtnca rtgycaytay 120 mgnytncarg aygtnaargc ncaraargtn tggtgymgnt tyytnccnga rggntgycar 180 ccnytngtnw snwsngcngt ngaygnmgn gcnccngcng gnmgnmgnac nttyytnacn 240 gayytnggng gnggnytnyt ncargtngar atggtnacny tncargarga rgaygcnggn 300 gartayggnt gyatggtnga yggngcnmgn ggnccncara thytncaymg ngtnwsnytn 360 aayathytnc cnccngarga rgargargar acncayaara thggnwsnyt ngcngaraay 420 gcnttywsng ayccngcngg nwsngcnaay ccnytngarc cnwsncarga ygaraarwsn 480 athccnytna thtggggngc ngtnytnytn gtnggnytny tngtngcngc ngtngtnytn 540 ttygcngtna tggcnaamg naarcargar wsnytnytnw snggnccncc ngncar 597 <210> 4 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC976 <400> 4 cgttgtaaaa cgacggcc 18 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC16495 <400> 5 caggcgtacg tttctcacag " - 20 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de Oligonucleótidos ZC16494 <400> 6 ggtttattta gcccagtgtg 20 <210> 7 <211> 17 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC447 <400> 7 taacaatttc acacagg 17 <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC16174 <400> 8 aagaaccggc accacacctt ct 22 <210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC16175 <400> 9 ggcaagccca ggagttgaca tt 22 <210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos'ZC16950 <400> 10 aggcgtacgt ttctcaca 18 <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC16951 <400> 11 ctcgccagca tcctcttc 18 <210> 12 <211> 138 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223>Polipéptido Zsig57con etiqueta Glu-Glu N-terminal 400> 12 Met Thr He Leu Cys Trp Leu Ala Leu Leu Ser Thr Leu Thr Ala Val 5 10 15 Asn Ala Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu Gly Ser Gln Gly He Val Gly 20 25 30 Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser Ser He Leu Val 35 40 45 Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln Lys Val Trp Cys 50 55 60 Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser Ser Ala Val Asp 65 70 75 80 Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr Asp Leu Gly Gly 85 90 95 Gly Leu Leu Gln Val G)u Met Val Thr Leu Gln Glu Glu Asp Ala Gly 100 105' - 110 Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro Gln He Leu His 115 120 125 Arg Val Ser Leu Asn He Leu Pro Pro Glu 130 135 <210> 13 <211> 134 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> pol ipéptido zsig57 con etiqueta Glu-Glu C-terminal <400> 13 Met Gly Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Glu Gly Gln 1 5 10 , 15 Gly He Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser 20 25 30 Ser He Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln 35 40 45 Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser 50 55 60 Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr 65 70 75 80 Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu 85 90 95 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro 100 105 110 Gln He Leu His Arg Val Ser Leu Asn He Leu Pro Pro Glu Gly Leu 115 120 • 125 Glu Tyr Met Pro Met Asp 130 <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17115 <400> 14 ttaggatccc agggcatagt tggcagc 27 <210> 15 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17228 <400> 15 taatctagat tactctgggg gcagtatgtt caga 34 <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC16084 <400> 16 gtcgaatgca aagcgtaaaa 20 <210> 17 <211> 21 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC7350 <400> 17 cctctacaaa tgtggtatgg c 21 <210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17116 <400> 18 ttaggatcca tgggcctcac cctgctc 11 <210> 19 <211> 40 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17479 <400> 19 gggtctcttc tagaccctct gggggcagta tgtteagaga 40 gH----l--i-----------i--ili------------H <210> 20 <211> 65 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223 Cebador de oligonucleótidos ZC17019 <400> 20 ctcaaaaatt ataaaaatat ccaaacaggc agccgaattc tactctgggg gcagtatgtt 60 cagag 65 <210> 21 <211> 64 <212> ADN <213 Secuencid Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17021 <400> 21 ttggacaaga gagaagaaga atacatgeca atggaaggtg gtcagggcat agttggcagc 60 etec 64 <210> 22 <211> 417 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> fragmento «el zsig57 etiquetado con NEE <400> 22 ttggacaaga gagaagaaga ¿.tacatgeca atggaaggtg gtcagggcat agttggcagc (50 ctccctgagg tgctgcaggc acccgtggga agCtccattc tggtgcagtg ccactacagg 120 ctccaggatg tcaaagctca gaaggtgtgg tgccggttct tgccggaggg gtgccagccc 180 ctggtgtcct cagctgtgg? tegeagaget ccagcgggca ggcgtacgtt tctcacagac 240 ctgggtgggg gcctgctgci ggtggaaatg gttaccctgc aggaagagga tgctggcgag 300 tatggctgca tggtggatgg jgccaggggg ccccagattt tgcacagagt ctctctgaac 360 atactgcccc cagagtagaa ttcggctgcc tgtttggata tttttataat ttttgag 43.7 <210> 23 <211> 64 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17022 <400> 23 attgctgcta aagaagaagg tgtaagcttg gacaagagag aacagggcat agttggcagc 60 ctcc 64 <210> 24 <211> 65 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17020 <400> 24 atactaggaa ttctactcca taggcatata ctcctcgcct ccctctgggg gcagtatgtt 60 cagag 65 <210> 25 <211> 417 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> fragmento del zsig57 etiquetado con CEE <400> 25 attgctgcta aagaagaagg tgtaagcttg gacaagagag aacagggcat agttggcagc 60 ctccctgagg tgctgcaggc acccgtggga agctccattc tggtgcagtg ccactacagg 120 ctccaggatg tcaaagctca gaaggtgtgg tgccggttct tgccggaggg gtgccagccc 10 ctggtgtcct cagctgtgga tcgcagagct ccagcgggca ggcgtacgtt tctcacagac 240 ctgggtgggg gcctgctgca ggtggaaatg gttaccctgc aggaagagga tgctggcgag 300 tatggctgca tggtggatgg ggccaggggg ccceagattt tgcacagagt ctctctgaac 360 atactgcccc cagagggagg cgaggagtat atgcctatgg agtagaattc ctagtat 4..7 <210> 26 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17529 <400> 26 gtatacggcc ggccaccatg ggcctcaccc tg 32 <210> 27 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de oligonucleótidos ZC17530 <400> 27 cgtatcggcg cgcctcactg acgtggtgga ce 32 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido EE <400> 28 Glu Tyr Met Pro Val Asp 1 5 <210> 29 <211> 224 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Thr Ala Arg Ala Trp Ala Ser Trp Arg Ser Ser Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Pro Gly Tyr Phe Pro Leu'Ser His Pro Met Thr Val Ala 20 25 30 Gly Pro Val Gly Gly Ser Leu Ser Val Gln Cys Arg Tyr Glu Lys Glu 35 40 45 His Arg Thr Leu Asn Lys Phe Trp Cys Arg Pro Pro Gln He Leu Arg 50 55 60 Cys Asp Lys He Val Glu Thr Lys Gly Ser Ala Gly Lys Arg Asn Gly 65 70 • 75 80 Arg Val Ser He Arg Asp Ser Pro Ala Asn Leu Ser Phe Thr Val Thr 85 90 95 Leu Glu Asn Leu Thr Glu Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Gly Val 100 105 110 Asp Thr Pro Trp Leu Arg Asp Phe His Asp Pro He Val Glu Val Glu 115 120 125 Val Ser Val Phe Pro Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ser Ser Pro Gln Ser 130 135 140 Ser Met Gly Thr Ser Gly Pro Pro Thr Lys Leu Pro Val His Thr Trp 145 150 155 160 Pro Ser Val Thr Arg Lys Asp Ser Pro Glu Pro Ser Pro His Pro Gly 165 170 175 Ser Leu Phe Ser Asn Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Leu Leu Glu Leu 180 185 190 Pro Leu Leu Leu Ser Met Leu Gly Ala Val Leu Trp Val Asn Arg Pro 195 200 205 Gln Arg Ser Ser Arg Ser Arg Gln Asn Trp Pro Lys Gly Glu Asn Gln 210 215 220 <210> 30 <211> 764 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala He 1 5 10 15 Ser Thr Lys Ser Pro He Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu 25 30 Gly Asn Ser Val Ser He Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn 40 45 Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys 50 55 60 He Thr Leu He Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly 65 /0 75 80 Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn 85 90 95 He Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Serlaly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu 100 105 110 Gly He Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser 115 120 125 Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu 130 135 140 Gly Arg Thr Val Tr.r He Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln 145 150 155 160 Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln He Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val 165 170 175 He Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg He Arg 180 185 190 Leu Asp He Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val He Asn 195 200 205 Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp 210 215 220 Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His 245 250 255 Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg 260 265 - 270 Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys 275 280 285 Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg He Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys 290 295 300 Asp Gly Ser Phe Ser Val Val He Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala 305 310 315 320 Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly 325 330 335 Ser Pro He Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn G>u Glu Ser Thr He 340 345 350 Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Ser Ser Val Ala 355 360 365 Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser He Lys Tyr Trp 370 375 380 Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp 385 390 395 400 Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu 405 410 415 Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val He Leu Asn Gln Leu Thr 420 425 430 Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu 435 440 445 Trp Arg Thr Thr Val Glu He Lys He He Glu Gly Glu Pro Asn Leu 450 455 '- 460 Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val 465 470 475 480 Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys 485 490 495 Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly 500 505 510 Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser 515 520 525 Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^gjlg^J^^^^^^^Ml^^^^^*^^^^^^^^^^^^^.^^^^^^^^!^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 530 535 540 Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val 545 550 555 560 Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala 565 570 575 Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg 580 585 590 Glu He Glu Asn Lys Ala He Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu 595 600 605 Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser 610 615 - 620 Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu 625 630 635 640 Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val 645 650 655 Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val 660 665 670 Ser He Arg Ser Tyr Arg Thr Asp He Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn 675 680 685 Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly ATa Ser Ser He Thr 690 695 700 Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu 705 710 715 720 Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys 725 730 735 Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr 740 745 750 - Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala 755 760 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 del número de residuo 18 (lie), al número de residuo 108 (Gly) ; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (lie) al número de aminoácido 125 (Pro); (c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (lie) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (lie) al número de aminoácido 199 (Gly) ; y (e) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 1 (Met) al número de aminoácido 199 (Gly) ; en donde el porcentaje de identidad de los aminoácidos se determina utilizando un programa FASTA con tup=l, penalidad por abertura de separación o vacío=10, penalidad por la extensión de la separación o vacío=l, y matriz de sustitución=BLOSUM62, con otros parámetros establecidos por omisión o implícitos.

2. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEC ID NO : 1 del nucleótido 115 al nucleótido 387; (b) una secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEC ID NO:l del nucleótido 115 al nucleótido 438; (c) una secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEC ID NO:l del nucleótido 115 al nucleótido 531; (d) una secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEC ID N0:1 del nucleótido 115 al nucleótido 660; y (e) una secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEC ID NO:l del nucleótido 64 al nucleótido 660.

3. Una secuencia de polinucleótidos aislados de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido comprende el nucleótido 1 al nucleótido 597 de la SEC ID NO:3.

4. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He) al número de residuo 108 (Gly) ; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N0:2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 125 (Gln) ; (c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gly) ; y (e) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 1 (Met) al número de aminoácido 199 (Gly);

5. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) .

6. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos unidos de manera operable: un promotor de transcripción; un segmento de ADN que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO : 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) ; y un terminador de transcripción.

7. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende una secuencia de señales secretorias unida de manera operable al segmento de ADN.

8. Una célula cultivada en la cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN.

9. Una construcción de ADN que codifica una -proteína de fusión, la construcción de ADN está caracterizada porque comprende: un primer segmento de ADN que codifica un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 1 (met), al número de residuo 17 (Gly) ; (b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He), al número de residuo 108 (Gly) ; (c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He), al número de residuo 124 (Pro); (d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He) , al número de residuo 156 (Gly) ; (e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 186 (Lys) , al número de residuo 199 (Gln) ; (f) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He), al número de residuo 199 (Gln) ; y al menos otro segmento de ADN que codifica un polipéptido adicional, im en donde el primero y el otro segmentos de ADN están conectados en la estructura; y codifican la proteína de fusión.

10. Una proteína de fusión caracterizada porque es producida por un método que comprende: cultivar una célula hospedante en la cual ha sido introducido un vector que comprende los siguientes elementos unidos < <- manera operable: (a) un promotor transcripcional; (b) una construcción de ADN que codifica una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 9; y (c) un terminador transcripcional; y recuperar la proteína codificada por el segmento de ADN.

11. Un polipéptido aislado, caracterizado porque compreno > una secuencia de residuos de aminoácidos que s al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) le secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He), al número de residuo 108 'Gly); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 125 (Pro) ; (c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gly) ; y (e) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 1 (Met) al número de aminoácido 199 (Gly) ; en donde el porcentaje de identidad de aminoácidos se determina utilizando un programa FASTA con ktup=l, penalidad por abertura de separación o vacío=10, penalidad por la extensión de separación o vacío=l, y matriz de sustitución=BLOSUM62, con otros parámetros establecidos como omisión o implícitos.

12. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polipéptido consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de residuo 18 (He) al número de residuo 108 (Gly) ; (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 125 (Pro); (c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 156 (Gln) ; (d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gly) ; y (e) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 1 (Met) al número de aminoácido 199 (Gly) .

13. Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de residuos de aminoácidos es como se muestra en la SEC I NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) .

14. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: . cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 8; y aislar el polipéptido producido por la célula.

15. Un método para producir un anticuerpo para el polipéptido, caracterizado porque comprende: inocular un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que consiste de 9 a 199 aminoácidos, en donde el polipéptido es una secuencia contigua de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 del número de aminoácido 18 (He) al número de aminoácido 199 (Gln) ; (b) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 11; (c) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 186 (Lys) al número de residuo 199 (Gln) de la SEC ID NO:2; (d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 18 (He) al número de residuo 108 (Gly) de la SEC ID N0:2; (e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 96 (Glu) al número de residuo 101 (Glu) de la SEC ID N0:2; (f) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 124 (Pro) al número de residuo 129 (Glu) de la SEC ID NO:2; (g) un polipéptido que tiene una secuencia de 5 aminoácidos del número de residuo 125 (Pro) al número de residuo 130 (Glu) de la SEC ID NO:2; (h) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 185 (Arg) al número de residuo 190 (Glu) de la SEC ID N0:2; e 10 (i) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del número de residuo 186 (Lys) al número de residuo 191 (Ser) de la SEC ID NO:2; y en donde el polipéptido produce una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y 15 aislar el anticuerpo del animal.

16. Un anticuerpo producido por el método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se enlaza a un polipéptido de la reivindicación 20 11.

17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoplano. 25 aaS=a^£la&" ^^ t^SB^ _... - ^ ^^^I^ ^^ ^ ^^^?^^^

18. Un anticuerpo caracterizado porque se enlaza específicamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 11.

19. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo se acopla a un plásmido que contiene un ADNc que codifica un polipéptido funcional.

20. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo se acopla a un agente químico.