ES2345137T3 - Procedimiento para la secuenciacion de moleculas de acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de secuenciación de una sola molécula de ácido nucleico diana que presenta una pluralidad de bases nucleotídicas que comprende: proporcionar un complejo de una enzima que polimeriza el ácido nucleico y la molécula de ácido nucleico diana para permitir la formación de una cadena de ácido nucleico en crecimiento complementario al ácido nucleico diana; proporcionar una pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados, en el que cada tipo de análogo nucleotídico es complementario a un nucleótido diferente en la secuencia de ácido nucleico diana; polimerizar la pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados incorporando la pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados en la cadena de ácido nucleico en crecimiento, en el que cada uno de los análogos incorporados puede polimerizarse con un análogo nucleotídico posterior para permitir la polimerización continua de una pluralidad de análogos nucleotídicos; identificar la secuencia de tiempo de la incorporación de dicha pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados en la cadena de ácido nucleico en crecimiento detectando los tiempos de residencia de los análogos nucleotídicos marcados próximos a la enzima que polimeriza el ácido nucleico en tiempo real mientras que la extensión del cebador dirigida por la plantilla tiene lugar, y eliminándose el marcador tras la detección.
Description
Procedimiento para la secuenciación de moléculas
de ácido nucleico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para determinar la secuencia de moléculas de ácido
nucleico.
El objetivo que consiste en aclarar el genoma
humano completo ha creado un interés en las tecnologías para la
secuenciación rápida del ADN, tanto en aplicaciones a pequeña como a
gran escala. Los parámetros importantes son la velocidad de
secuenciación, la longitud de la secuencia que puede leerse durante
una sola serie de secuenciación y la cantidad de plantilla de ácido
nucleico requerida. Estos retos en investigación sugieren aspirar a
secuenciar la información genética de células aisladas sin
ampliación previa, y sin necesidad previa de clonar el material
genético en vectores de secuenciación. Los proyectos del genoma a
gran escala son actualmente demasiado costosos para ser realizados
de modo realista para un gran número de organismos o pacientes.
Además, a medida que aumenta el conocimiento de las bases genéticas
para las enfermedades humanas, existirá una necesidad siempre
creciente de secuenciación de ADN preciso y de alto rendimiento que
sea asequible para aplicaciones clínicas. Los procedimientos
prácticos para determinar las secuencias de pares de bases de
moléculas individuales de ácidos nucleicos, preferentemente con
alta velocidad y longitudes largas de lectura, proporcionarían la
capacidad de medición necesaria.
Dos técnicas tradicionales para secuenciar el
ADN son el método de la terminación didesoxi de Sanger (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:
563-5467 (1977)) y el método de degradación química
de Maxam-Gilbert (Maxam y Gilbert, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 74: 560-564 (1977)). Ambos
procedimientos suministran cuatro muestras que contiene cada una,
una familia de cadenas de ADN en las que todas las cadenas terminan
en el mismo nucleótido. La electroforesis en gel de bloque
ultrafino, o más recientemente la electroforesis en matriz capilar
se utilizan para resolver las cadenas de diferente longitud y
determinar la secuencia de nucleótidos, ya sea etiquetando de
manera diferente las cadenas de cada muestra antes de la
electroforesis para indicar el nucleótido terminal o introduciendo
las muestras en diferentes bandas del gel o en diferentes
capilares. Tanto el procedimiento de Sanger como el de
Maxam-Gilbert son laboriosos y ocupan tiempo, y
requieren un pretratamiento dilatado de la fuente de ADN. Se han
hecho intentos para hacer uso de la espectroscopia de masas para
reemplazar la etapa de electroforesis intensiva. Para el estudio de
tecnologías de secuenciación existentes, véase Cheng
"High-Speed-Sequence Analysis",
Progr. Biochem. Biophys. 22:
223-227(1995).
Se han desarrollado procedimientos afines que
utilizan marcadores con colorantes o fluorescentes asociadas al
nucleótido terminal, donde la determinación de la secuencia se
realiza también por electroforesis en gel y detectores
fluorescentes automáticos. Por ejemplo, el procedimiento de
ampliación de Sanger ha sido modificado recientemente para su
utilización en un sistema de microsecuenciación automático que
requiere solamente volúmenes de submicrolitros de reactivos y
trifosfatos de didesoxiribonucleótido marcados con colorante. En la
patente US nº 5.846.727 de Soper et al., se lleva a cabo la
detección por fluorescencia en chip con fibra óptica de un solo
modo llevando la luz de excitación al canal capilar, y una segunda
fibra óptica de un solo modo que recoge los fotones fluorescentes.
Se estiman lecturas de las secuencias en el intervalo de 400 a 500
bases lo que no es una mejora significativa sobre la cantidad de
información de secuencias obtenidas con los procedimientos de
Sanger o de Maxam-Gilbert. Además, el procedimiento
de Soper requiere la ampliación por RCP de la plantilla de ADN, y
la purificación y la electroforesis en gel de los "escalones"
de secuenciación de oligonucleótidos, antes del inicio de la
reacción de separación. Estos sistemas requieren todos cantidades
significativas de ADN diana. Incluso el procedimiento descrito en
la patente US nº 5.302.509 de Cheeseman, que no utiliza
electroforesis en gel para la determinación de secuencias, requiere
por lo menos un millón de moléculas de ADN.
En una mejora reciente de una metodología de
secuenciación por síntesis originalmente inventada hace diez años,
la secuencias de ADN se deducen midiendo la liberación de
pirofosfato en las pruebas de complejos de ADN/polimerasa con cada
trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) por separado y
sucesivamente. Véase Ronaghi et al., "A Sequencing Method
Based on Real-Time Pyrophosphate", Science
281: 363-365 (1998) y Hyman, "A New Method of
Sequencing DNA", Anal. Biochem. 174:
423-436(1988). Aunque utilizando nucleótidos
naturales, el procedimiento necesita la sincronización de las
polimerasas en las cadenas de ADN, que limitan en gran medida las
longitudes de lectura de las secuencias. Se consiguieron solo
aproximadamente lecturas de 40 nucleótidos y no cabe esperar que el
procedimiento de detección pueda aproximarse a la sensibilidad de
una sola molécula debido a la eficacia cuántica limitada de la
producción de luz por la luciferasa en el procedimiento presentado
por Ronaghi et al., "A Sequencing Method Based on
Real-Time Pyrophosphate", Science 281:
363-365(1998). Además, la velocidad de
secuenciación global está limitada por las etapas necesarias de
lavado, posteriores a las etapas químicas con objeto de identificar
la presencia de pirofosfato, y por el tiempo intrínseco requerido
para determinar cada par de bases que ha de secuenciarse con las
cuatro bases sucesivamente. Además, se reconocieron dificultades
para determinar con precisión los segmentos de homonucleótidos en
las secuencias.
Los intentos previos para secuenciar
moléculas aisladas (en general sin éxito pero originales) han
utilizado exonucleasas para liberar sucesivamente bases
individuales marcadas con fluorescencia como una segunda etapa una
vez la ADN polimerasa ha formado una cadena complementaria completa.
Véase Goodwin et al., "Application of Single Molecule
Detection to DNA Sequencing", Nucleos. Nucleot. 16:
543-550 (1997). Consiste en sintetizar una cadena
de ADN marcada con cuatro análogos diferentes de dNTP fluorescentes,
después de la degradación de la cadena marcada por la acción de una
exonucleasa, y la detección de las bases individuales liberadas en
un detector de flujo hidrodinámico. Sin embargo, tanto la polimerasa
como la exonucleasa tienen que mostrar actividad en una cadena de
ADN muy modificada, y la generación de una cadena de ADN sustituida
con cuatro análogos dNTP fluorescentes diferentes no se ha
conseguido todavía. Véase Dapprich et al., "DNA Attachment
to Optically Trapped Beads in Microstructures Monitored by Bead
Displacement", Bioimaging 6: 25-32 (1998).
Además, se conoce información poco precisa acerca de la relación
entre el grado de marcado del ADN y la inhibición de la actividad
de la exonucleasa. Véase Dörre et al., "Techniques for
Single Molecule Sequencing", Bioimaging 5:
139-152 (1997).
En una segunda estrategia que utiliza
exonucleasas, se digiere ADN natural mientras está siendo
impulsado hacia una película líquida delgada con objeto de separar
espacialmente los nucleótidos escindidos. Véase Dapprich et
al., "DNA Attachment to Optically Trapped Beads in
Microstructures Monitored by Bead Displacement",
Bioimaging 6:25-33 (1998). Éstas a
continuación se difunden a corta distancia antes de llegar a
inmovilizarse en una superficie para la detección. Sin embargo, la
mayoría de las exonucleasas presentan tasas de escisión
dependientes de la secuencia y de la estructura, dando como
resultado dificultades en el análisis de los datos e igualando
conjuntos de secuencias parciales. Además, las formas de identificar
las bases en la superficie de detección tienen que desarrollarse o
mejorarse todavía.
Independientemente del sistema de detección, los
procedimientos que utilizan exonucleasas no han sido desarrollados
en los procedimientos que satisfacen la demanda actual de
secuenciación rápido y de alto rendimiento. Además, la mayoría de
las exonucleasas presentan velocidades de renovación relativamente
lentas, y los procedimientos propuestos requieren pretratamiento
dilatado, marcado y posterior inmovilización de la plantilla de ADN
sobre el lecho en la corriente en circulación del fluido, todo lo
cual convierte una realización más complicada en un sistema
sencillo de alto rendimiento.
Se han intentado otras estrategias más directas
para la secuenciación del ADN, tal como la determinación de la
secuencia espacial de moléculas de ADN fijas y alargadas por
microscopia de sonda atómica explorada. Los problemas encontrados
al utilizar estos procedimientos consisten en un espaciado estrecho
de las bases en la molécula de ADN (solamente 0,34 nm) y sus
pequeñas diferencias fisicoquímicas para ser reconocidas por estos
procedimientos. Véase Hansma et al., "Reproducible Imaging
and Dissection of Plasmid DNA Under Liquid with the Atomic Force
Microscope", Science 256: 1180-1184
(1992).
En una estrategia reciente de microsecuenciación
que utiliza polimerasa pero no exonucleasa, una serie de moléculas
idénticas de ADN de una sola cadena (ssADN) se unen a un sustrato y
se determina la secuencia repitiendo una serie de reacciones que
utilizan los dNTP marcados por fluorescencia. Patente US nº
5.302.509 de Cheeseman. Sin embargo, este procedimiento requiere
que cada base se añada con un marcador fluorescente y grupos de
bloqueo 3'-dNTP. Una vez se añade la base y se
detecta, el marcador fluorescente y el grupo de bloqueo se separan,
y, a continuación, la siguiente base se añade al polímero.
El documento WO 00/36152 describe procedimientos
de secuenciación que se basan en la liberación de restos de
pirofosfato marcados con fluorescencia [PPi] liberados de
trifosfatos de nucleósido [NTP] a medida que se crea el producto de
ampliación de la polimerasa.
De este modo, los procedimientos de
secuenciación actuales requieren tanto actividad de polimerasa como
de exonucleasa para reducir la secuencia o se basan en la
polimerasa sola con etapas adicionales de adición y separación de
los dNTP bloqueados en 3'. El proyecto del genoma humano ha
intensificado la demanda de secuenciación de ADN rápido, a pequeña
y gran escala que permita alto rendimiento con mínimo material de
partida. Continúa habiendo además necesidad de proporcionar un
procedimiento para secuenciar moléculas de ácido nucleico que
necesite solamente actividad de polimerasa, sin utilización de los
sustituyentes de bloqueo, produciendo mayor simplicidad,
miniaturización más fácil y compatibilidad para el tratamiento en
paralelo de una técnica de una sola etapa.
La presente invención está dirigida a satisfacer
las necesidades de superar las deficiencias en la técnica.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de secuenciación de una molécula de ácido nucleico que
tiene diversas bases nucleotídicas según el procedimiento de la
reivindicación 1. Este procedimiento implica proporcionar un
complejo de una enzima que polimeriza el ácido nucleico y la
molécula de ácido nucleico diana orientados uno con respecto al
otro en una posición adecuada para añadir un análogo nucleotídico en
un sitio activo complementario con el ácido nucleico diana. Se
proporcionan varios tipos de análogos nucleotídicos próximos al
sitio activo, en los que cada tipo de análogo nucleotídico es
complementario con un nucleótido diferente en la secuencia de ácido
nucleico diana. Un análogo nucleotídico se polimeriza en un sitio
activo, en el que el análogo nucleotídico que se añade es
complementario del nucleótido del ácido nucleico diana, quedando
preparado el análogo de ácido nucleico añadido para la adición
posterior de análogos nucleotídicos. El análogo nucleotídico
añadido al sitio activo se identifica como resultado de la etapa de
polimerización. Se repiten las etapas de provisión de varios
análogos nucleotídicos, de polimerización e identificación de modo
que se determina la secuencia del ácido nucleico diana.
Se describe además un aparato adecuado para
secuenciar una molécula de ácido nucleico diana. Este aparato
incluye un soporte, así como una enzima que polimeriza el ácido
nucleico o un cebador oligonucleotídico adecuado para unirse a una
molécula de ácido nucleico diana, donde la polimerasa o el cebador
oligonucleotídico está colocado sobre el soporte. Una
microestructura define una zona confinada que contiene el soporte y
la enzima que polimeriza el ácido nucleico o el cebador
oligonucleotídico que está configurado para permitir análogos
nucleotídicos marcados que no están colocados sobre el soporte para
desplazarse rápidamente en la zona confinada.
Un aparato adecuado para secuenciar una molécula
de ácido nucleico diana incluye un soporte sólido y una enzima que
polimeriza el ácido nucleico o el cebador oligonucleotídico adecuado
para hibridar una molécula de ácido nucleico diana, donde la enzima
que polimeriza el ácido nucleico o el cebador oligonucleotídico está
colocado sobre el soporte. Un alojamiento define una zona confinada
que contiene el soporte y la enzima que polimeriza el ácido
nucleico o el cebador oligonucleotídico. El alojamiento se construye
para facilitar la identificación de análogos nucleotídicos marcados
colocados sobre el soporte. Los guiaondas ópticos se aproximan al
foco de la zona confinada que activa la radiación en la zona
confinada y recogen la radiación de la zona confinada.
Se han conseguido numerosas ventajas con la
presente invención. la secuenciación puede realizarse con pequeñas
cantidades de ácido nucleico, con capacidad de secuenciar moléculas
con la plantilla de ácido nucleico aislado que elimina la necesidad
de la ampliación antes del inicio dla secuenciación. Las longitudes
largas de lectura de la secuencia pueden deducirse en una serie,
eliminando la necesidad de procedimientos informáticos extensos
para ensamblar una secuencia completa sin separaciones de moléculas
largas de la plantilla (por ejemplo, clones de cromosoma bacteriano
artificial (CBA)). Para dos modos de operación de las presentes
invenciones, la longitud de la lectura de las secuencias está
limitada por la longitud de la plantilla que va a secuenciarse, o el
procesamiento de la polimerasa, respectivamente. Utilizando los
sistemas enzimáticos apropiados, por ejemplo, con proteínas
accesorias para iniciar la reacción de secuenciación en los sitios
específicos (por ejemplo, orígenes de la replicación) en el ácido
nucleico de plantilla bicatenario, pueden eliminarse las etapas de
preparación necesarias para las técnicas de secuenciación
convencionales, tales como la subclonación en vectores de
secuenciación.
Además, el procedimiento de secuenciación de la
presente invención puede realizarse utilizando polimerasa y no
exonucleasa. Esto da como resultado mayor sencillez, miniaturización
más fácil y compatibilidad con el tratamiento en paralelo de una
técnica de una sola etapa.
En relación con la última ventaja, algunas
polimerasas presentan mayor procesividad y velocidades catalíticas
que las exonucleasas, añadiéndose más de 10.000 bases antes de la
disociación de la enzima para el caso de la T7 ADN polimerasa
(comparada con las 3.000 bases para \lambda exonucleasa). En
algunos casos, por ejemplo, la T7 ADN polimerasa acomplejada con T7
belicasa/primasa, los valores de procesividad son aún mayores,
oscilando entre varios 100.000. Las velocidades de síntesis de ADN
pueden ser muy altas, medidas in vivo de 1.000 bases/s. e
in vitro de 750 bases/s. (en contraste con 12 bases/s.
degradadas por la \lambda exonucleasa in vitro). Véase
Kelman et al., "Processivity of DNA Polymerases: Two
Mechanisms, One Goal", Structure 6:
121-125 (1998); Carter et al., "The Role of
Exonuclease and Beta Protein of Phage Lambda in Genetic
Recombination II. Substrate Specificity and the Mode of Action of
Lambda Exonuclesse", J. Biol. Chem. 246:
2502-2512 (1971); Taboret et al.,
"Escherichia coli Thioredoxin Confers Processivity on the
DNA Polymerase Activity of the Gene 5 Protein of Bacteriophage
T7", J. Biol. Chem. 262: 16212-16223
(1987); y Kovall et al., "Toroidal Structure of
Lambda-Exonuclease" Science 277:
1824-1827 (1997).
Una velocidad de incorporación de 750 bases/s.
es aproximadamente 150 veces más rápida que la velocidad de
secuenciación de uno de los secuenciadores de ADN ABI Prism 3700
totalmente automático de Perkin, Elmer Corp., Foster City,
California, propuesto para ser utilizado en una estrategia de
secuenciación por perdigonada para el genoma humano. Véase Venter
et al., "Shotgun Sequencing of the Human Genome",
Science 280: 1540-1542 (1998).
El pequeño tamaño del aparato que puede
utilizarse para realizar el procedimiento de secuenciación de la
presente invención es además muy ventajoso. La zona confinada del
complejo plantilla/polimerasa puede ser suministrada por el aparato
con microestructura con la posibilidad de matrices que permiten un
modo de operación muy paralelo con miles de reacciones de
secuenciación realizadas sucesiva o simultáneamente. Esto
proporciona una herramienta rápida y ultrasensible para aplicación
en investigación así como en diagnósticos médicos.
Las figuras 1A-C representan 3
formas de realización alternativas de secuenciación según la
presente invención.
Las figuras 2A-C son dibujos
esquemáticos que presentan la sucesión de etapas utilizadas para
secuenciar ácidos nucleicos según la presente invención.
Las figuras 3A-C representan
diagramas de señales de fluorescencia frente al tiempo durante la
sucesión de etapas utilizada para secuenciar el ácido nucleico
según la presente invención. La figura 3C presenta la secuencia
generada por estas etapas.
Las figuras 4A-D representan la
estructura y dibujos esquemáticos que muestran la sucesión de etapas
utilizadas para secuenciar el ácido nucleico según la presente
invención en el caso en que se utilicen nucleótidos fluorescentes
que llevan el marcador en la posición gamma de fosfato (representada
aquí como dNTP unido en gamma).
La figura 5 representa el principio de
discriminación de fluoróforos por mediciones del tiempo de
debilitamiento de la fluorescencia controlada por el tiempo, que
puede utilizarse para suprimir la señal de fondo según la presente
invención.
La figura 6A representa un sistema para la
secuenciación según la presente invención. La figura 6B es una
ampliación de una parte de este sistema.
La figura 7A representa un sistema de
secuenciación según la presente invención utilizando la
intensificación del campo electromagnético con puntas metálicas. La
figura 7B es una ampliación de una parte de este sistema.
La figura 8A presenta un sistema para la
secuenciación según la presente invención utilizando aberturas del
campo próximo. La figura 8B es una ampliación de una parte de este
sistema.
La figura 9A presenta un sistema para la
secuenciación según la presente invención utilizando nanocanales.
La figura 9B es una ampliación de una parte de este sistema.
Las figuras 10A-B presentan
sistemas para proporcionar reactivos a un sistema de confinamiento
nanofabricado según la presente invención. En particular, la figura
10A es un dibujo esquemático que representa cómo se proporcionan
reactivos y atraviesan el sistema. La figura 10B es similar pero
representa este sistema en un solo chip con almohadillas para
conectar el sistema a los depósitos de fluido.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de secuenciación de una molécula de ácido nucleico que
presenta una pluralidad de bases nucleotídicas. Este procedimiento
implica proporcionar un complejo de una enzima que polimeriza el
ácido nucleico y la molécula de ácido nucleico diana orientados uno
con respecto al otro en una posición adecuada para añadir un
análogo nucleotídico en un sitio activo complementario al ácido
nucleico diana, quedando el análogo nucleotídico añadido preparado
para la adición posterior de análogos nucleotídicos. El análogo
nucleotídico añadido al sitio activo se identifica como resultado de
la etapa de polimerización. Se repiten las etapas de provisión de
varios análogos nucleotídicos, de polimerización e identificación
de modo que se determina la secuencia del ácido nucleico diana.
Un aparato adecuado para secuenciar una molécula
de ácido nucleico diana incluye un soporte, así como una enzima que
polimeriza el ácido nucleico o un cebador oligonucleotídico adecuado
para unirse a una molécula de ácido nucleico diana, donde la
polimerasa o el cebador oligonucleotídico está colocado sobre el
soporte. Una microestructura define una zona confinada que contiene
el soporte y la enzima que polimeriza el ácido nucleico o el
cebador oligonucleotídico que está configurado para permitir
análogos nucleotídicos marcados que no están colocados sobre el
soporte para desplazarse rápidamente en la zona confinada.
Un aparato adicional adecuado para secuenciar
una molécula de ácido nucleico diana incluye un soporte sólido y
una enzima que polimeriza el ácido nucleico o el cebador
oligonucleotídico adecuado para hibridar una molécula de ácido
nucleico diana, donde la enzima que polimeriza el ácido nucleico o
el cebador oligonucleotídico está colocado sobre el soporte. Un
alojamiento define una zona confinada que contiene el soporte y la
enzima que polimeriza el ácido nucleico o el cebador
oligonucleotídico. El alojamiento se construye para facilitar la
identificación de análogos nucleotídicos marcados colocados sobre el
soporte. Los guiaondas ópticos se aproximan al foco de la zona
confinada que activa la radiación en la zona confinada y recogen la
radiación de la zona confinada.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de secuenciación de una molécula de ácido nucleico
diana que presenta una pluralidad de bases. En su principio
fundamental, el orden temporal de las adiciones de bases
durante la reacción de polimerización se mide en una sola molécula
de ácido nucleico, es decir, la actividad de una enzima, que
polimeriza el ácido nucleico, denominada en adelante también
polimerasa, en la molécula de ácido nucleico plantilla que va a ser
secuenciada se sigue en tiempo real. La secuencia se deduce
identificando qué base se está incorporando en la cadena
complementaria en crecimiento del ácido nucleico diana por la
actividad catalítica de la enzima que polimeriza el ácido nucleico
en cada etapa en la secuencia de adiciones de bases. En la forma de
realización preferida de la invención, el reconocimiento de la
secuencia temporal de las adiciones de las bases, se consigue
detectando la fluorescencia de análogos nucleotídicos marcados de
forma apropiada ya que se incorporan en la cadena de ácido nucleico
en desarrollo. La precisión del emparejamiento de bases es
proporcionada por la especificidad de la enzima, con tasas de error
de emparejamiento de bases falsas de 10^{-5} o inferior. Para la
fidelidad enzimática, véase Johnson, "Conformational Coupling in
DNA-Polymerase Fidelity", Ann. Rev.
Biochem. 62: 685-713 (1993) y Kunkel,
"DNA-Replication Fidelity", J. Biol.
Chem. 267: 18251-18254 (1992).
La invención se aplica igualmente al
secuenciación de todos los tipos de ácidos nucleicos (ADN, ARN,
híbridos de ADN/ARN, etc.) utilizando un número de enzimas de
polimerización (ADN polimerasas, ARN polimerasas, transcriptasas
inversas, mezclas, etc.). Por consiguiente, los análogos
nucleotídicos apropiados que actúan como moléculas del sustrato
para la enzima que polimeriza el ácido nucleico pueden consistir en
miembros de los grupos dNTP, NTP, dNTP o NTP modificados,
nucleótidos peptídicos, nucleótidos peptídicos modificados o
nucleótidos con esqueleto de fosfato-azúcar
modificado.
Existen dos modos de operación convenientes
según la presente invención. En el primer modo de operación de la
invención, el ácido nucleico de la plantilla está unido a un
soporte. Esto puede ser ya sea por inmovilización de (1) un cebador
oligonucleotídico o (2) una molécula de ácido nucleico diana
monocatenaria o (3) bicatenaria. A continuación, (1) la molécula de
ácido nucleico diana está hibridada con el cebador oligonucleotídico
unido, (2) un cebador oligonucleotídico está hibridado con la
molécula de ácido nucleico diana inmovilizada para formar un
complejo de la molécula de ácido nucleico diana cebada, o (3) una
zona de reconocimiento para la polimerasa se crea en la plantilla
bicatenaria (por ejemplo, por interacción con las proteínas
accesorias, tal como un primate). Una enzima que polimeriza ácido
nucleico en el complejo de la molécula de ácido nucleico diana
cebada, se proporciona en una posición adecuada para desplazarse a
lo largo de la molécula de ácido nucleico y ampliar el cebador
oligonucleotídico en una zona activa. Una variedad de tipos marcados
de análogos nucleotídicos, que no tienen un sustituyente de
bloqueo, se suministran próximos a la zona activa, distinguiéndose
cada tipo de análogo nucleotídico que es complementario de un
nucleótido diferente en la secuencia de ácido nucleico diana. El
cebador oligonucleotídico se amplía utilizando una enzima de
polimerización del ácido nucleico para añadir un análogo
nucleotídico al cebador oligonucleotídico en la zona activa, donde
el análogo nucleotídico que se añade es complementario del
nucleótido del ácido nucleico diana en la zona activa. Como
resultado de la etapa de ampliación se identifica el análogo
nucleotídico añadido al cebador oligonucleotídico. Si fuera
necesario, el análogo nucleotídico marcado que se añade al cebador
nucleotídico, se trata antes de que muchos análogos nucleotídicos
más se incorporen en el cebador oligonucleotídico para asegurar que
el análogo nucleotídico añadido al cebador oligonucleotídico no
impide la detección de análogos nucleotídicos en las posteriores
etapas de polimerización e identificación. Se repiten las etapas de
provisión de análogos nucleotídicos marcados, que amplían el
cebador oligonucleotídico, que identifican el análogo nucleotídico
añadido, y que tratan el análogo nucleotídico, de modo que el
cebador oligonucleotídico se amplía más y se determina la secuencia
del ácido nucleico diana.
Alternativamente, el procedimiento descrito
anteriormente puede llevarse a cabo acoplando en primer lugar la
enzima que polimeriza el ácido nucleico a un soporte en una posición
adecuada para que el complejo de la molécula de ácido nucleico
diana se desplace en relación a la enzima de polimerización del
ácido nucleico de modo que el complejo molecular del ácido nucleico
cebado se extiende a una zona activa. En esta forma de realización,
una variedad de análogos nucleotídicos marcados complementarios con
el nucleótido del ácido nucleico diana en el sitio activo, se añade
a medida que el complejo de ácido nucleico diana cebado se desplaza
a lo largo de la enzima que polimeriza el ácido nucleico. Se
repiten las etapas de provisión de análogos nucleotídicos, que
amplían el cebador, que identifican el análogo nucleotídico añadido,
y que tratan el análogo nucleotídico durante o después la
incorporación, como se describió anteriormente, de modo que se
amplía más el cebador oligonucleotídico y se determina la secuencia
del ácido nucleico diana.
Las figuras 1A-C representan 3
formas de realización alternativas de secuenciación según la
presente invención. En las figuras 1A un cebador de secuenciación
está unido a un soporte, por ejemplo, mediante un enlace
biotina-estreptavidina, con el cebador hibridado a
la molécula de ácido nucleico diana y la enzima que polimeriza el
ácido nucleico unida a la molécula de ácido nucleico hibridada en
el sitio activo donde los análogos nucleotídicos se están añadiendo
al cebador de secuenciación. En la figura 1B, la molécula de ácido
nucleico diana, está unida a un soporte, con un cebador de
secuenciación hibridado con la molécula de ácido nucleico plantilla
y la enzima de polimerización del ácido nucleico unida a la
molécula de ácido nucleico hibridada en la zona activa donde se
están añadiendo los análogos nucleotídicos al cebador de
secuenciación. El cebador puede añadirse antes o durante la
provisión de análogos nucleotídicos. Además de estos escenarios, una
molécula de ácido nucleico diana bicatenaria puede unirse a un
soporte, conteniendo la molécula de ácido nucleico diana una zona de
reconocimiento para unirse a la enzima de polimerización de ácido
nucleico en una zona activa donde los análogos nucleotídicos se
están añadiendo al cebador. Por ejemplo, dicha zona de
reconocimiento puede crearse con ayuda de una proteína accesoria,
tal como una ARN polimerasa o una helicasa/primasa que sintetizará
un cebador corto en las zonas específicas del ácido nucleico diana
y de este modo proporcionan una zona de partida para la enzima que
polimeriza el ácido nucleico. Veáse Richardson, "Bacteriophage
T7: Minimal Requeriment for the Replication of the Duplex DNA
Molecule", Cell 33: 315-317 (1983). En la
figura 1C, la enzima que polimeriza el ácido nucleico está unida a
un soporte uniéndose en la molécula de ácido nucleico diana cebada a
la zona activa donde análogos nucleotídicos se están añadiendo al
cebador de secuenciación. Como en la descripción anterior, la enzima
de polimerización de ácido nucleico puede asimismo estar unida a un
soporte, pero siendo la molécula de ácido nucleico diana ácido
nucleico bicatenario, que contiene una zona de reconocimiento para
la unión de la enzima de polimerización del ácido nucleico en una
zona activa donde los análogos nucleotídicos se están añadiendo a
la cadena de ácido nucleico en crecimiento. Aunque las figuras
1A-C muestran solamente una reacción de
secuenciación que se lleva a cabo sobre el soporte, es posible
conducir una matriz de varias de dichas reacciones a zonas
diferentes en un solo soporte. En esta forma de realización
alternativa, cada cebador de secuenciación, ácido nucleico diana o
enzima de polimerización de ácido nucleico que ha de inmovilizarse
sobre el soporte sólido está moteada en esta superficie por
impresión por microcontacto o estampado, por ejemplo, tal como se
utiliza para la tecnología de chips de los chips de ADN, o mediante
la formación de una red de puntos de enlace tratando la superficie
del soporte sólido. También es posible combinar las formas de
realización expuestas en la figura 1 e inmovilizar tanto la
molécula de ácido nucleico diana como la enzima de polimerización
del ácido nucleico próximas entre sí.
El procedimiento de secuenciación de la presente
invención puede utilizarse para determinar la secuencia de la
molécula de ácido nucleico, incluyendo el ADN bicatenario o
monocatenario, las horquillas de ADN monocatenario, los híbridos de
ADN/ARN, ARN con una zona de reconocimiento para la unión de la ARN
polimerasa, u horquillas de ARN.
El cebador de secuenciación utilizado para la
realización del procedimiento de la presente invención puede ser un
ribonucleótido, desoxirribonucleótido, ribonucleótido modificado,
desoxirribonucleótido modificado, ácido nucleico peptídico, ácido
nucleico peptídico modificado, oligonucleótido con esqueleto de
fosfato-azúcar modificado, y otros análogos
nucleotídicos y oligonucleotídicos. Puede ser sintético o producido
en la naturaleza por primasas, ARN polimerasas u otras enzimas
sintetizadoras de oligonucleótidos.
La enzima que polimeriza el ácido nucleico
utilizada según en la presente invención puede ser una polimerasa
termoestable o una polimerasa térmicamente degradable. Los ejemplos
de polimerasas termoestables adecuadas incluyen las polimerasas
aisladas de Thermus aquaticus, Thermus thermophilus,
Pyrococcus woesei, Pyrococcus furiosus,
Thermococcus litoralis y Thermotoga maritima. Las
polimerasas termodegradables útiles incluyen la ADN polimerasa de
E. coli, el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa de
E. coli, T4 ADN polimerasa, T7 ADN polimerasa y otras. Los
ejemplos de otras enzimas de polimerización que pueden utilizarse
para determinar la secuencia de moléculas de ácido nucleico incluyen
las T7, T3, SP6 ARN polimerasas de E. coli, y las
transcriptasas inversas de VAM, M-MLV y VIH. La
polimerasa puede estar unida a la secuencia de ácido nucleico diana
cebada a un ácido nucleico monocatenario cebado, a un origen de
replicación, a una hendidura o separación en un ácido nucleico
bicatenario, a una estructura secundaria en un ácido nucleico
monocaternario, a una zona de unión creada por un proteína accesoria
o a un ácido nucleico monocatenario cebado.
Los materiales que son útiles en la formación
del soporte incluyen, vidrio, vidrio con modificaciones en la
superficie, silicio, metales, semiconductores, dieléctricos de alto
índice de refracción, cristales, geles y polímeros.
En las formas de realización de las figuras 1,
podría utilizarse cualquier acompañante de unión adecuada conocido
por los expertos en la materia, para inmovilizar bien el cebador de
secuenciación, la molécula de ácido nucleico diana o la enzima que
polimeriza el ácido nucleico al soporte. También es posible el
enlace no específico por adsorción. Como se representa en las
figuras 1A-C, un enlace de
biotina-estreptavilina es adecuado para unir el
cebador de secuenciación o la molécula de ácido nucleico diana al
soporte sólido. El componente de biotina de dicho enlace puede
estar unido al cebador o al ácido nucleico o al soporte sólido con
la estreptavidina o cualquier otra proteína que se une a la
biotina, estando acoplado a la entidad opuesta.
Una estrategia para llevar a cabo esta técnica
de fijación implica acoplar BIOTINA FOTOACTIVABLE^{TM}
("PAB") (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) a una
superficie de la cámara utilizada para realizar el procedimiento de
secuenciación de la presente invención. Este puede conseguirse por
exposición a la luz a 360 mn, preferentemente a través de una pared
transparente de la cámara, como se describe en Hengsakul et
al., "Protein Patterning with a Photoactivable Derivative of
Biotin", Bioconjugate Chem. 7: 249-54
(1996). Cuando se utiliza una nanocámara se activa la biotina en un
punto limitado por difracción al microscopio óptico. Con excitación
de campo próximo, la exposición puede alinearse utilizando un
guiaondas para dirigir la luz al área deseada. Cuando se expone a
la luz, la PAB se activa y se une por enlace covalente a la
superficie interior del canal. El exceso de PAB sin unir se elimina
entonces enjuagando con agua.
Alternativamente, la estreptavidina puede
revestirse sobre la superficie del soporte. El cebador
oligonucleotídico de ácido nucleico apropiado o la plantilla de
ácido nucleico monocatenario se biotinila a continuación, creando
un complejo inmovilizado de cebador de ácido
nucleico-molécula diana en virtud del cebador unido
a estreptavidina-biotina.
Otra estrategia para llevar a cabo el
procedimiento de la presente invención consiste en utilizar ácidos
nucleicos complementarios para unir el cebador de secuenciación o
la molécula de ácido nucleico diana al soporte sólido. Esto puede
llevarse a cabo modificando un ácido nucleico monocatenario con una
secuencia principal conocida y ligando la secuencia principal
conocida al cebador de secuenciación o a la molécula de ácido
nucleico diana. El oligonucleótido resultante puede unirse a
continuación por hibridación a un oligonucleótido acoplado al
soporte y que presenta una secuencia de nucleótidos complementaria
de la de secuencia principal conocida. Alternativamente, un segundo
oligonucleótido puede hibridarse a un extremo de la molécula de
ácido nucleico diana opuesto a este enlace al cebador
oligonucleotídico. Este segundo oligonucleótido está disponible para
la hibridación a una secuencia nucleica complementaria unida al
soporte.
El enlace reversible o irreversible entre el
soporte y el cebador oligonucleotídico y la secuencia de ácido
nucleico diana puede conseguirse con los componentes de cualquier
par de enlace covalente o no covalente. Otros de dichos
planteamientos para inmovilizar el cebador de secuenciación o la
molécula de ácido nucleico diana al soporte, incluyen un par con
enlace anticuerpo-antígeno y moléculas de
acoplamiento fotoactivadas.
En la forma de realización de la figura 1C,
puede utilizarse cualquier técnica conocida por resultar de utilidad
para inmovilizar de manera reversible o irreversible los materiales
proteicos. Se ha publicado en la bibliografía que la ADN
polimerasa, se inmovilizó con éxito en superficies activadas sin
pérdida de actividad catalítica. Véase Yin et al.,
"Transcription. Against an Applied Force", Science
270:1653-1657 (1995).
Alternativamente, la proteína puede unirse a un
anticuerpo que no interfiere con su actividad catalítica, como se
ha publicado para la transcriptasa inversa del VIH. Véase
Lennerstrand et al., "A Method for Combined Inmunoaffinity
Purification and Assay of HIV-1 Reverse
Transcriptase Activity Useful for Crude Samples", Anal.
Biochem. 235: 141-152 (1996).
Por consiguiente, las enzimas que polimerizan el
ácido nucleico pueden inmovilizarse con pérdida de función. Los
anticuerpos y otras proteínas pueden diseñarse sobre superficies
inorgánicas. Véase James et al., "Patterned Protein layers
on Solid Substrates by Thin Stamp Microcontact Printing".
Langmuir 14:741-744 (1998) y St John et
al., "Diffraction-Based Cell detection Using a
Microcontact Printed Antibody Grating", Anal. Chem.
70:1108-1111
(1998).
(1998).
Alternativamente, la proteína se podría
biotinilar (o marcar igualmente con otras moléculas de enlace) y a
continuación unirse a una superficie de soporte revestida con
estreptavidina.
En cualquiera de las formas de realización de
las figuras 1A a C, el acompañante de enlace y la polimerasa o los
ácidos nucleicos que inmovilizan pueden aplicarse al soporte por
técnicas químicas y fotolitográficas convencionales que son bien
conocidas en la técnica. Generalmente, estos procedimientos pueden
llevar modificaciones convencionales en la superficie química del
soporte, la incubación del soporte a diferentes temperaturas en
diferentes medios y posibles etapas sucesivas de lavado e incubación
de la superficie del soporte con las moléculas respectivas.
Son posibles posibilidades alternativas de
colocación del complejo de polimerización, tales como por oclusión
del complejo en los poros que contienen el gel demasiado pequeños
para permitir el paso del complejo, pero lo suficientemente grandes
para acomodar la provisión de análogos nucleotídicos. Los medios
adecuados incluyen geles de agarosa, geles de poliacrilamida,
materiales porosos sintéticos o nanoestructuras.
El procedimiento de secuenciación de la presente
invención puede iniciarse por adición de la enzima que polimeriza
el ácido nucleico a la mezcla de reacción en la forma de realización
de las figuras 1A-B. Para la forma de realización
de la figura 1C, el ácido nucleico cebado puede añadirse para el
inicio. Pueden emplearse otros escenarios para el inicio, tales
como la creación de un complejo ácido
nucleico-polimerasa preformado en ausencia de iones
metálicos bivalentes que forman partes integrales de las zonas
activas de las polimerasas (más generalmente Mg^{2+}). La
reacción de secuenciación puede iniciarse entonces añadiendo estos
iones metálicos. El complejo de preiniciación de la plantilla
podría encontrase también con la enzima en ausencia de nucleótidos,
añadiéndose análogos nucleotídicos fluorescentes al comienzo de la
reacción. Véase Huber et al., "Escherichia coli
Thioredoxin Stabilizes Complexes of Bacteriophage T7 DNA Polimerase
and Primed Templates", J. Biol. Chem.
262:16224-16232 (1987). Alternativamente, el proceso
puede iniciarse mediante la liberación de un grupo en el cebador
oligonucleotídico que le protege del enlace a la enzima que
polimeriza el ácido nucleico. La iluminación con rayo láser
iniciaría a continuación la reacción coincidiendo con el punto de
inicio de la observación.
Las figuras 2A-C son dibujos
esquemáticos que muestran las sucesión de etapas utilizadas para
secuenciar ácidos nucleicos según la presente invención.
En la figura 2A, están presentes análogos
nucleotídicos marcados en la proximidad del complejo cebado de una
enzima que polimeriza el ácido nucleico acoplada al cebador de
secuenciación hibridado y a la molécula de ácido nucleico diana que
están acoplados sobre el soporte sólido. Durante esta fase del
proceso de secuenciación, los análogos nucleotídicos marcados se
difunden o son forzados a circular a través del medio de ampliación
hacia y alrededor del complejo cebado.
Según la figura 2B, una vez un análogo
nucleotídico ha alcanzado la zona activa del complejo cebado, se une
a él y las enzimas que polimerizan el ácido nucleico prueban si
este análogo nucleotídico es complementario a la primera base
abierta de la molécula de ácido nucleico diana o si representa una
incompatibilidad. Esta base incompatible será rechazada con muchas
probabilidades de que corresponda a la alta fidelidad de la enzima
mencionada anteriormente, mientras que el análogo nucleotídico
complementario se polimeriza con el cebador de secuenciación para
ampliar el cebador de secuenciación.
Durante o después de añadir cada análogo
nucleotídico marcado al cebador de secuenciación, se identifica el
análogo nucleotídico añadido al cebador de secuenciación. Esto se
consigue de la manera más eficaz proporcionando a cada análogo
nucleotídico un marcador distinguible diferente. Al detectar cuál de
los diferentes marcadores se añaden al cebador de secuenciación, el
análogo nucleotídico correspondiente añadido al cebador de
secuenciación puede identificarse y, en virtud de su naturaleza
complementaria, puede determinarse la base del ácido nucleico diana
que complementa el análogo nucleotídico. Una vez se consigue esto,
ya no es necesario el análogo nucleotídico que se añadió al cebador
de secuenciación para conservador su marcador. De hecho, la
presencia continua de marcadores en bases que complementan análogos
nucleotídicos en el ácido nucleico diana que ya ha sido
secuenciación interferirían muy probablemente con la detección de
análogos nucleotídicos sucesivamente añadidos al cebador. Por
consiguiente, los marcadores añadidos al cebador de secuenciación se
eliminan después de haber sido detectados, tal como se representa
en la figura 2C. Esto tiene lugar preferentemente antes de que se
incorporen análogos nucleotídicos adicionales en el cebador
oligonucleotídico.
Repitiendo la secuencia de etapas descrita en
las figuras 2A-C, se amplía el cebador de
secuenciación y, como resultado, puede determinarse la secuencia
completa del ácido nucleico diana. Aunque la forma de realización
de inmovilización representada en las figuras 2A-C
es la presentada en la figura 1A, las formas de realización de
inmovilización alternativa representadas en las figuras
1B-C, podrían utilizarse asimismo en la realización
de la sucesión de etapas representadas en las figuras
2A-C.
Al realizar la difusión, la incorporación y las
etapas de eliminación de las figuras 2A-C, se
utiliza un medio de ampliación que contiene los componentes
apropiados para permitir añadir los análogos nucleotídicos al
cebador de secuenciación. Los medios de ampliación adecuados
incluyen, por ejemplo, una solución que contiene
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 25 mM, NaCl 65
mM, DTT 3 mM (esta es la composición del medio de ampliación
recomendada por el fabricante para Secuenasa, T7 ADN polimerasa
mutante) y análogos nucleotídicos a una concentración apropiada que
permita la identificación de la secuencia. Son posibles otros medios
que son apropiados para esto y otras polimerasas, con o sin
proteínas accesorias, tales como las proteínas de enlace
monocatenarias. Preferentemente, la fase de ampliación se lleva a
cabo a 37ºC para la mayoría de las polimerasas térmicamente
degradables, aunque pueden utilizarse otras temperaturas a las
cuales la polimerasa es activa.
Una vez añadido el análogo del nucleótido
marcado al cebador de secuenciación, como se indicó anteriormente,
el marcador específico del resto añadido debe identificarse para
determinar qué tipo de análogo nucleotídico se añadió al cebador de
secuenciación y, como resultado qué base complementaria de ácido
nucleico diana es. Cómo se determina el marcador de la entidad
añadida depende del tipo de marcador que se utilice. Para la forma
de realización preferida de la invención, la exposición de las
etapas de identificación se limitará a la utilización de análogos
nucleotídicos portadores de restos fluorescentes. Sin embargo, otros
marcadores adecuados incluyen cromóforos, enzimas, antígenos,
metales pesados, sondas magnéticas, colorantes, grupos
fosforescentes, materiales radioactivos, restos
quimioluminiscentes, nanopartículas dispersantes o fluorescentes,
restos generadores de la señal Raman, y restos de detectores
electroquímicos. Dichos marcadores son conocidos en la técnica y se
dan a conocer por ejemplo en Prober et al., Science
238: 336-41 (1997); Connell et al.,
BioTechniques 5(4): 342-84 (1987);
Ansorge, et al., Nucleic Acids Res. 15(11):
4593-602 (1987); y Smith et al.,
Nature 321:674 (1986).
En algunos casos, tales como para los
cromóforos, fluoróforos, marcadores fosforescentes, nanopartículas o
grupos de señalización Raman, es necesario someter la zona de
reacción a radiación activadora para detectar el marcador. Este
procedimiento se expondrá con detalle a continuación para el caso de
marcadores fluorescentes. Las técnicas adecuadas para detectar el
marcador fluorescente incluyen la microespectroscopia en campo
lejano resuelta en el tiempo, la microespectroscopia en campo
próximo, la medición de la transferencia de energía por resonancia
de fluorescencia, la fotoconversión y la medición de los tiempos de
permanencia de la fluorescencia. La identificación de fluoróforos,
puede conseguirse por discriminación de la longitud de onda del
espectro, la medición y separación de los tiempos de permanencia de
la fluorescencia, la identificación de fluoróforos y/o la supresión
del fondo. La identificación de fluoróforos y/o la supresión del
fondo, pueden facilitarse por conexión rápida entre los modos de
excitación y las fuentes de iluminación y combinaciones de los
mismos.
Las figuras 3A-B, presentan
gráficos de señales de fluorescencia frente al tiempo durante la
sucesión de las etapas (expuestas en la figura 2) que se utilizan
para realizar el procedimiento de secuenciación de la presente
invención. En esencia, en este procedimiento, se distinguirá un
nucleótido incorporado de los no incorporados (que se difunden al
azar a través del volumen de observación o que son transferidos por
convección a través de él por flujo hidrodinámico o
electroforético) analizando los tiempos minúsculos de fluorescencia
para cada marcador distinguible simultáneamente. Esto se consigue
mediante registros de ráfagas de fotones y espectroscopia de
correlación de fluorescencia resuelta en el tiempo que distingue la
fluorescencia estacionaria continua del marcador incorporado (hasta
la eliminación por los mecanismos expuestos a continuación) de la
emisión intermitente de los fluoróforos libres. Véase Magde et
al., "Thermodynamic Fluctuations in a Reacting
System-Measurement by Fluorescence Correlation
Spectroscopy", Phys. Rev. Lett. 29:705-708
(1972), Kask. P. et al.,
"Fluorescence-Intensity Distribution Analysis and
its Application in Biomolocular Detection Technology", Proc.
Nat. Acad. Sci. U.S.A 96:13756-13761 (1999) y
Eggeling et al., "Monitoring Conformational Dynamics of a
Single Molecule by Selective Fluorescence Spectroscopy", Proc.
Nat. Acad. Sci. U.S.A 95:1556-1561 (1998). La
secuencia puede deducirse combinando los tiempos minúsculos de todos
los canales de detección.
La figura 3A, presenta un gráfico de señal de
fluorescencia frente al tiempo durante solo la fase de difusión de
la figura 2A, suponiendo cuatro canales diferentes de detección de
fluorescencia para las cuatro bases diferentes (por ejemplo,
utilizando cuatro marcadores diferentes, cada uno con un espectro de
emisión de fluorescencia diferente, mediante el que pueden
separarse a través de filtros ópticos). Cada pico en la figura 3A,
representa la ráfaga de fluorescencia resultante de la presencia de
un análogo nucleotídico en el volumen de observación, siendo
distinguido cada análogo nucleotídico diferente por su diferente
marcador que genera picos de diferentes colores (representados en
la figura 3A, por diferentes tipos de línea). La estrechez de estos
picos indica que los análogos nucleotídicos tienen un tiempo de
residencia breve próximo a la zona activa de secuenciación, debido
a que se difunden libremente o que circulan a través del volumen de
observación. Cabe esperar un pico de anchura similar para el caso
de un análogo nucleotídico incompatible que se une
temporalmente a la zona activa de la enzima que polimeriza el ácido
nucleico y el rechazo posterior de la incorporación por la
enzima.
La figura 3B, presenta un gráfico de señal de
fluorescencia frente al tiempo durante la incorporación y
posteriores y fases de eliminación de las figuras
2B-C. Como en la figura 3A, cada pico de la figura
3B representa la presencia de un análogo nucleotídico
distinguiéndose cada análogo nucleotídico diferente por su marcador
diferente que genera picos de colores diferentes (representados en
la figura 3B por diferentes tipos de línea). La estrechez de
algunos picos en la figura 3B, se refiere de nuevo a los análogos
nucleotídicos que permanecen móviles en el medio de ampliación y no
amplían el cebador de secuenciación. Dichos picos estrechos resultan
porque estos análogos nucleotídicos tienen un tiempo de residencia
breve próximo a la zona activa de secuenciación como se explicó
para la figura 3A. Por otra parte, los picos más amplios
corresponden a análogos nucleotídicos que tienen, en la zona
activa, bases complementarias en la molécula plantilla de ácido
nucleico y sirven para ampliar el cebador de secuenciación. Como
resultado de su inmovilización, estos análogos nucleotídicos tienen
picos más amplios, debido a que permanecerán en el volumen de
observación durante y después de la incorporación en la cadena de
ácido nucleico en desarrollo, y de este modo continúan emitiendo
fluorescencia. Su señal se termina solamente después en el tiempo
como resultado de la ulterior etapa de eliminación que elimina la
fluorescencia continua y que permite la identificación de episodios
de incorporación ulteriores.
Desplazándose de izquierda a derecha en la
figura 3B (es decir, tiempo después), la secuencia de los picos más
amplios corresponde al complemento de la secuencia de la molécula
plantilla de ácido nucleico. La figura 3C, presenta el resultado
final y de la figura 3B, que puede conseguirse, mediante un programa
informático, que detecta las ráfagas breves de fluorescencia y las
descarga en el resultado final. Como resultado de dicha filtración,
únicamente los picos generados por los análogos nucleotídicos
inmovilizados están presentes, y se transfieren por convección a la
secuencia que corresponde al complemento de la secuencia de la
molécula plantilla de ácido nucleico. Esta secuencia complementaria
es aquí ATACTA, por consiguiente, el orden de las bases de la
molécula plantilla de ácido nucleico que se secuencia es TATGAT.
Pueden acoplarse marcadores fluorescentes a
nucleótidos en varias posiciones. El acoplamiento puede hacerse con
o sin un enlazador en puente al nucleótido. Convencionalmente los
análogos nucleotídicos utilizados para el marcado del ácido
nucleico con fluoróforos transportan el resto fluorescente acoplado
a la base de la molécula del sustrato nucleotídico. Sin
embargo, pueden acoplarse también a un resto de azúcar (por ejemplo,
desoxirribosa) o alfa-fosfato. El acoplamiento al
alfa-fosfato, se mostraría ventajoso, porque este
tipo de enlace deja intacta la estructura interna del ácido
nucleico, mientras que los fluoróforos acoplados a la base se ha
observado que distorsionan la doble hélice de la molécula
sintetizada y posteriormente inhiben más la actividad de la
polimerasa. Véase Zhu et al., "Directly Labelled DNA Probes
Using Fluorescent Nucleotides with Different Lenght Linkers",
Nucleic Acids Res. 22: 3418-3422 (1994) y
Doublie et al., "Crystal Structure of a Bacteriophage T7
DNA Replication Complex at 22 Angstrom Resolution", Nature
391: 251-258 (1998).
De este modo, los nucleótidos que contienen el
grupo tiol, que se han utilizado (en forma de NTP) para los
estudios de reticulación en ARN polimerasa, podrían actuar como
moléculas con eje central primario para el acoplamiento de
enlazadores y marcadores fluorescentes adecuados. Véase Hanna et
al., "Synthesis and Characterization of a New
Photo-Cross-Linking CTP Analog and
Its Use Photoaffinity-Labeling
Escherichia-coli and T7-RNA
Polymerases". Nucleic Acids Res. 21:
2073-2079 (1993).
En el caso convencional en el que el fluoróforo
se acople a la base del nucleótido, está provisto por lo general de
fluoróforos de un tamaño relativamente grande, tal como
fluoresceína. Sin embargo, fluoróforos más pequeños, por ejemplo,
pireno o colorantes de la familia de la cumarina, demostrarían ser
ventajosos desde el punto de vista de ser tolerados en mayor medida
por las polimerasas. De hecho, es posible sintetizar un fragmento
de ADN de 7.300 pares de bases de longitud en el que un tipo de base
se reemplaza completamente por el correspondiente dNTP marcado con
cumarina que utiliza T7 ADN polimerasa, mientras que la enzima no
puede llevar a cabo la correspondiente síntesis utilizando dNTP
marcados con fluoresceína.
En todos estos casos, el fluoróforo continúa
acoplado a la parte de la molécula del sustrato que se incorpora en
la molécula de ácido nucleico en desarrollo durante la síntesis. Se
han detectado e identificado medios adecuados para la eliminación
del fluoróforo después según el esquema de secuenciación de la
presente invención incluyen el fotoblanqueo del fluoróforo o la
escisión fotoquímica del nucleótido y del fluoróforo, por
ejemplo, la escisión de un enlace químico en el enlazador. La
eliminación del marcador fluorescente de los nucleótidos ya
incorporados, cuya cantidad puede ajustarse por la potencia del
láser, impide la acumulación de la señal en la cadena de ácido
nucleico maximizando de este modo la señal a la relación de fondo
para la identificación del nucleótido. Para este esquema, el
objetivo de la presente invención consiste en detectar todos los
fotones de cada marcador y a continuación fotoblanquear o escindir
fotoquímicamente antes o inmediatamente después de los siguientes
pocos nucleótidos se incorporen para mantener los adecuados valores
de señal a ruido para posteriores etapas de identificación. La fase
de eliminación del proceso de la presente invención puede llevarse
a cabo por cualquier procedimiento adecuado para eliminar una
etiqueta sin dañar el complejo de la reacción de secuenciación.
Además de los marcadores fluorescentes que
quedan en el ácido nucleico durante la síntesis, los nucleótidos
que están marcados con fluorescencia o de otro modo y transportan el
marcador acoplado a uno de los dos, el fosfato beta o
gamma del nucleótido puede utilizarse también en el
procedimiento de secuenciación de la presente invención.
Anteriormente se han sintetizado compuestos análogos en forma de
análogos de NTP y se ha demostrado que son excelentes sustratos
para varias enzimas, incluyendo las ARN polimerasas. Véase
Yarbrough et al., "Synthesis and Properties of Fluorescent
Nucleotide Substrates for DNA-dependent RNA
Polymerase", Journal Of Biological Chemistry 254:
12069-12073 (1979), y Chatterji et al.,
"Fluorescence Spectroscopy Analysis of Active and Regulatory
Sites of RNA Polymerase", Methods in Enzymology 274:
456-479 (1996).
Durante la síntesis del ADN, la escisión del
enlace en el nucleótido tiene lugar entre el fosfato alfa y el
beta, dando lugar a que los fosfatos beta y gamma se liberen de la
zona activa después de la polimerización, y el pirofosfato formado
posteriormente se difunde o es transferido por convección fuera del
ácido nucleico. Según la presente invención, es posible distinguir
el episodio de fijación de un nucleótido y su incorporación en el
ácido nucleico a partir de los episodios que implican solo la
fijación (y el rechazo posterior), de un nucleótido incompatible,
debido a que las velocidades constantes de estos dos episodios son
drásticamente diferentes. La etapa limitativa de la velocidad en
las etapas elementales sucesivas de polimerización del ADN es un
cambio de conformación de la polimerasa que puede ocurrir solamente
una vez la enzima ha establecido que el nucleótido correcto
(compatible) está unido a la zona activa. Por consiguiente, un
episodio de un enlace incompatible de un análogo nucleotídico será
mucho más corto en el tiempo que el episodio de la incorporación de
la base correcta. Véase Patel et al.,
"Pre-Steady-State Kinetic Analysis
of Processive DNA Replication Including Complete Characterization
of an Exonuclease-Deficient Mutant",
Biochemistry 30: 511-525 (1991) y Wong et
al., "An Induced-Fit Kinetic Mechanism for DNA
Replication Fidelity: Direct Measurement by
Single-Turnover Kinetics". Biochemistry
30: 511-525 (1991). Como resultado, la fluorescencia
del marcador que está acoplado al fosfato beta o gamma del análogo
nucleotídico continúa siendo próxima a la de las polimerasas durante
un más tiempo en el caso de que se polimerice el análogo
nucleotídico, y puede distinguirse según el esquema descrito
anteriormente para la figura 3. Tras la incorporación, el marcador
se difundirá con el pirofosfato escindido. Este procedimiento se
muestra en la figura 4. La figura 4A presenta la estructura de
I-aminonaftalen-5-sulfonato
(AmNS)-dUTP, ejemplo representativo de un análogo
nucleotídico que lleva un marcador fluorescente acoplado al fosfato
gamma, con la posición de la escisión indicada por la línea de
puntos. La figura 4B-D presenta las etapas
sucesivas de incorporación y la liberación del complejo
pirofosfato-fluoróforo, en analogía con la figura
2. El tiempo minúsculo de fluorescencia para este esquema será el
mismo que se muestra en la figura 3. De este modo, existe un
esquema alternativo al expuesto anteriormente en el que fluoróforo
se incorpora en primer lugar en el ácido nucleico y la señal se
elimina posteriormente por fotoblanqueo o escisión fotoquímica tras
la identificación del marcador.
La identificación del análogo nucleotídico
específico marcado por fluorescencia que se incorpora frente al
fondo de nucleotídicos no incorporados que se difunden o fluyen
cerca de la enzima que polimeriza el ácido nucleico pueden
aumentarse más empleando la observación de que para determinados
dNTP marcados por fluorescencia (por ejemplo,
cumarina-5-dGTP o
AmNS-UTP la presencia de la base en forma de enlace
covalente reduce de manera significativa (es decir, extingue) la
fluorescencia del marcador. Véase Dhar et al., "Synthesis
and Characterization of Stacked and Quenched Uridine Nucleotide
Fluorophores", Journal of Biological Chemistry 274:
14568-14572 (1999), y Draganescu et al.,
"Fhit-Nucleotide Specificity Probed with Novel
Fluorescent and Fluorogenic Substrates", Journal of
Biological Chemistry 275: 4555-4560 (2000). La
interacción entre el fluoróforo y la base extingue la
fluorescencia, de modo que la molécula no es muy fluorescente en la
solución por sí misma. Sin embargo, cuando dicho nucleótido
fluorescente se incorpora en el ácido nucleico, el fluoróforo queda
desconectado del nucleótido y no se extingue ya la fluorescencia.
Para el caso de un enlace al fosfato beta o gamma del nucleótido,
esto se produce de forma natural mediante la actividad catalítica de
la polimerasa, en el caso de los fluoróforos unidos a la base, esto
tendría que realizarse por escisión fotoquímica. La señal de
fluorescencia procedente del fluoróforo escindido es mucho más
brillante y puede detectarse sobre el posible fondo de la
diversidad de moléculas extinguidas en la proximidad del complejo
polimerasa-ácido nucleico.
Además, ya que el tiempo de permanencia de la
fluorescencia de las moléculas escindidas que se difunden en la
solución es mucho más breve que el tiempo de permanencia de la
molécula escindida, puede conseguirse una mejora adicional de la
señal al fondo utilizando iluminación pulsada y detección de fotones
controlada por el tiempo. Esto se ilustra en la figura 5, que
muestra las curvas de debilitamiento de la fluorescencia resueltas
en el tiempo para la cumarina sola y la
cumarina-dGTP, respectivamente. Debido a que la
fluorescencia de la cumarina se extingue en el enlace covalente a
dGTP, el tiempo de permanencia es mucho más breve que para el
colorante libre solo, lo que significa que de promedio, se emiten
fotones fluorescentes mucho antes después de una pulsación de
excitación, por ejemplo, suministradas por un láser pulsado.
Eliminando este intervalo de tiempo inmediatamente después de la
pulsación de detección, que puede conseguirse, por ejemplo, con un
componente de la línea de demora variable (indicado por la barra de
trama cruzada con el tiempo de demora ajustable de anchura T), el
umbral de respuesta del detector puede controlarse de modo que
solamente se detecta la fluorescencia emitida desde el componente
de debilitamiento lento, en este caso el colorante libre (o, en
términos del esquema de secuenciación, el fluoróforo escindido), y
de este modo el fondo de las moléculas no incoporporadas se reduce
aún más. Saavedra et al., "Time-Resolved
Fluorimetric Detection of Terbium-Labelled
Deoxyribonucleic Acid Separated by Gel Electrophoresis".
Analyst 114: 835-838 (1989).
Los nucleótidos pueden convertirse también en
fluoróforos por reacciones fotoquímicas que conllevan la formación
de radicales. Esta técnica se ha utilizado con la serotonina y otras
moléculas biológicamente relevantes. Véase Shear et al.,
"Multiphoton-Excited Visible Emission by Serotonin
Solutions", Photochem. Photobiol. 65:
931-936 (1997).
La situación fotofísica ideal sería que cada
nucleótido haya generado su propia señal de fluorescencia.
Desgraciadamente, el ácido nucleico y los nucleótidos individuales
son fluoróforos débiles que emiten débilmente con eficacias
cuánticas minúsculas y solamente en la iluminación con luz
ultravioleta oscura. Sin embargo, el fluoróforo serotonina (5HT)
ultravioleta natural puede fotoionizarse por absorción simultánea de
4 fotones infrarrojos, para formar un radical que reacciona con
otras moléculas en estado fundamental para formar un complejo que
emite fluorescencia verde brillante en la absorción de 2 fotones
más. Los descubrimientos posteriores demuestran que muchas
moléculas orgánicas pequeñas pueden experimentar esta conversión en
multifotones.
La conocida extinción de los fluoróforos por los
componentes del ácido nucleico y por los fluoróforos adyacentes así
como la transferencia de la energía de resonancia puede proporcionar
marcadores tolerados por la polimerasa. Furey et al., "Use
of Fluorescence Resonance Energy Transfer to Investigate the
Conformation of DNA Substrates Bound to the Klenow Fragment",
Biochemistry 37: 2979-2990 (1998) y Glazer
et al., "Energy-Transfer Fluorescent
Reagents for DNA Analvses". Curr. Op. Biotechn. 8:
94-102 (1997).
En el montaje más eficaz de la presente
invención, cada base debería distinguirse por su propio marcador de
modo que la secuencia puede deducirse del resultado combinado de
cuatro canales diferentes, tal como se ilustra en la figura 3C.
Esto puede realizarse, por ejemplo, utilizando diferentes
fluoróforos como marcadores y cuatro diferentes canales de
detección, separados por fibras ópticas. Es posible distinguir los
marcadores por parámetros distintos de la banda de longitud de onda
de emisión tal como el tiempo de permanencia de la fluorescencia o
cualquier combinación de varios parámetros para las diferentes
bases. Debido a las posibles interacciones de un fluoróforo con una
base, es factible emplear el mismo fluoróforo para distinguir más de
una base. Como ejemplo, la cumarina-dGTP tiene un
tiempo de permanencia de la fluorescencia mucho más breve que la
cumarina-dCTP de modo que las dos bases podrían
distinguirse por su diferencia en el tiempo de permanencia de la
fluorescencia en la etapa de identificación del esquema de
secuenciación, aunque llevan la misma sustancia química que el
marcador fluorescente.
El procedimiento de secuenciación puede
realizarse también utilizando menos de los 4 marcadores utilizados.
Con 3 marcadores, la secuencia puede deducirse a partir dla
secuenciación de una cadena de ácido nucleico (1) si la 4ª base
puede detectarse como un retraso de tiempo en oscuridad constante
entre las señales de los demás marcadores o (2) de manera
inequívoca secuenciando ambas cadenas de ácido nucleico, porque en
este caso se obtiene una señal de fluorescencia positiva de cada
par de bases. Otro posible esquema que utiliza dos
marcadores consiste en presentar una base marcada con un fluoróforo
y las otras tres bases con otro fluoróforo. En este caso, las otras
tres bases no proporcionan una secuencia sino únicamente un numero
de bases que se producen entre la base específica que es
identificada por el otro fluoróforo. Ciclando este fluoróforo de
identificación mediante las diferentes bases en diferentes
reacciones de secuenciación, la secuencia completa puede deducirse
a partir de sucesivas series de secuenciación. Ampliando este
esquema de utilización de dos marcadores solamente, es posible
incluso obtener la secuencia completa empleando solamente dos bases
marcadas por serie de secuenciación. Como apuntaron Sauer et
al., "Detection and Identification of Single Dye Labelled
Mononucleotide Molecules Released From an Optical Fiber in
Microcapillary: First Steps Towards a New Single Molecule DNA
Sequencing Technique". Phys. Chem. Chem. Phys.
1:2471-77 (1999), la secuencia puede determinarse
con 2 marcadores solos si uno realiza múltiples reacciones de
secuenciación con las posibles combinaciones de los dos marcadores.
Por consiguiente, en la realización del proceso de la presente
invención, es deseable marcar segmentos largos de ácido nucleico
por lo menos con 2 marcadores diferentes.
Cuando la secuenciación se realiza acoplando al
soporte la polimerasa en lugar del ácido nucleico, es importante
que la enzima sintetice segmentos largos de ácido nucleico, sin el
complejo ácido nucleico/proteína que se deshace. Esto se denomina
síntesis procesiva de ácido nucleico. Por lo menos para el
sistema que utiliza T7 ADN polimerasa y dCTP reemplazadas
completamente por cumarina-5-dCTP,
la síntesis es completamente procesiva por lo menos en 7.300 pares
de bases (una molécula de polimerasa se une a la plantilla ssADN y
construye la segunda cadena completa sin desprenderse ni una vez).
Con un marcador, el procedimiento de la presente invención puede
realizarse observando la polimerasa en tiempo real con la resolución
de pares de bases e identificando las características de la
secuencia de la base, pero sin conocer las demás bases. Por
consiguiente, lo más deseable sería utilizar cuatro marcadores
diferentes para una velocidad y precisión mayores como se apuntó
anteriormente. Sin embargo, la información de la medición de la
incorporación de nucleótidos a un solo nivel molecular, tal como
las velocidades de incorporación para bases individuales en un
contexto de secuencia dado, puede proporcionar medios para
caracterizar más la secuencia que se está sintetizando. En lo que
respecta a asegurar la síntesis del proceso para el segundo modo de
operación de la presente invención, pueden utilizarse proteínas
accesorias para construir el complejo ácido nucleico/proteína aún
más procesivo que utilizando la enzima sola que polimeriza el ácido
nucleico. Por ejemplo, en condiciones óptimas, la T7 ADN polimerasa
es procesiva en por lo menos 10.000 bases, mientras que en el
complejo con la proteína T7 helicasa/primasa, la procesividad
aumenta hasta más de 100.000 bases. Kelman et al.,
"Processivity of DNA Polymerases: Two Mechanisms, One Goal",
Structure 6: 121-125 (1998). Una proteína de
enlace monocatenaria es también una proteína accesoria adecuada. La
procesividad es especialmente importante a concentraciones de
análogos nucleotídicos que están por debajo del límite de
saturación de una polimerasa específica, porque es sabido que los
valores de procesividad de las polimerasas disminuyen al limitar
las concentraciones de sustrato. Véase Patel et al.,
"Pre-Steady-State Kinetic Analysis
of Processive DNA Replication Including Complete Characterization
of an Exonuclease-Deficient Mutant",
Biochemistry 30: 511-525 (1991). Otra
posibilidad de asegurar la procesividad es el desarrollo o
descubrimiento de una polimerasa que es totalmente procesiva en
ausencia o en concentraciones de sustrato muy bajas (como es el
caso, por ejemplo, para la prolongación del complejo ARN
polimerasa/ADN). En el caso de que la procesividad no sea
suficientemente elevada, es posible unir tanto la polimerasa como
la molécula de ácido nucleico diana sobre el soporte próximo uno con
otro. Esto facilitaría la reforma del complejo y la continuación de
la síntesis del ADN, en caso de que el complejo de secuenciación se
deshaga ocasionalmente. Pueden utilizarse también polimerasas no
procesivas según la presente invención en el caso en el que el
ácido nucleico diana esté unido al soporte. En la presente memoria,
la misma o diferente molécula de polimerasa puede reformar el
complejo y continuar la síntesis después de la disociación del
complejo.
Una estrategia para llevar a cabo la presente
invención se muestra en la figura 6. La figura 6A presenta un
sistema de secuenciación con la solución R de reactivo colocada en
la superficie 2 a la que se inmoviliza un complejo con la molécula
de ácido nucleico diana cebado. Confinando la iluminación a una
pequeña área próxima a la zona activa de la prolongación de la
polimerasa, por ejemplo, enfocando la radiación activadora con la
ayuda de lentes o de fibra óptica 6, se detectan los análogos
nucleotídicos que se incorporarán en la cadena de ácido nucleico en
desarrollo, debido a que están situados en la zona de iluminación.
La figura 6B muestra una sección ampliada del dispositivo, con el
complejo de polimerización en la zona de iluminación. Las
concentraciones de sustrato se seleccionan de modo que el número de
análogos nucleotídicos en el área circundante en la solución R
están generalmente fuera de la zona iluminada y no se detectan.
Como se representan en la figura 6A, la fuente
de iluminación 10 (por ejemplo, un láser) dirige la radiación de
excitación a modo de un separador de rayo dicroico 8 a través de
lentes 6 y la superficie 2 al complejo de ácido nucleico diana
cebado e inmovilizado. Esto excita el marcador inmovilizado al
complejo con una radiación emitida resultante que vuelve a pasar a
través de la superficie 2 y de las lentes o de la fibra óptica 6.
El separador de rayos dicroicos 8 permite el paso de la radiación
emitida al detector (o la matriz de varios detectores) 12 que
identifica el tipo de emisión. La información de la emisión
detectada es dirigida a continuación al ordenador 14 donde se
identifica la base nucleotídica correspondiente a la emisión y su
identidad almacenada. Después de muchos ciclos de este
procedimiento, el ordenador podrá generar como resultado la
secuencia de la molécula de ácido nucleico diana. El
correspondiente resultado de la detección corresponde de nuevo al
esquema mostrado en la figura 3, como se explicó anteriormente.
Según otra forma de realización de la presente
invención, la iluminación y la detección de la fluorescencia puede
conseguirse construyendo el soporte para el ácido nucleico unido al
final de una primera fibra óptica en modo individual que lleva la
luz de excitación. Ésta y/o una segunda fibra óptica pueden
utilizarse para recoger los fotones fluorescentes. Transmitiendo la
radiación de longitud de onda de excitación apropiada a través de
la primera fibra óptica en modo individual, el marcador fluorecerá y
emitirá la frecuencia de la luz fluorescente apropiada. La luz
fluorescente emitida se transmitirá en parte a la segunda fibra
óptica y espectralmente separada tal como por rejillas de
difracción grabadas en la fibra. El espectro de la luz retornada
identifica el análogo nucleotídico específico unido. Son posibles
otras técnicas para proporcionar o recoger la luz en el punto de
reacción, tales como la utilización de la iluminación guiada por
ondas evanescentes o por ondas, tal como la iluminación por
reflexión interna total. Puede emplearse una o varias fuentes de
iluminación, que suministran excitación de uno o múltiples fotones.
Los detectores adecuados incluyen módulos de fotodiodo en
avalancha, tubos fotomultiplicadores, cámaras CCD, chips CMOS o
matrices o combinaciones de varios detectores.
Debido a que es probable que exista un límite
superior a la concentración de los análogos polinucleotídicos
presentes en el volumen de observación que se correlaciona con una
señal permisible a la relación de fondo y capacidad para distinguir
el análogo nucleotídico específico que está siendo
incorporado en el ácido nucleico de los análogos nucleotídicos que
solo se difunden alrededor de la polimerasa, es posible que el
procedimiento de secuenciación de la presente invención debe
realizarse a concentraciones por debajo del límite de saturación
para uno o más análogos nucleotídicos.
Por ejemplo, si se utilizan ópticas
convencionales limitadas a la difracción para la detección de la
fluorescencia, el volumen de observación es grande de modo que
tendrían que utilizarse concentraciones del sustrato en el
intervalo de nanomolar para una señal de fondo aceptable. Éste es
muy inferior a la k_{m} habitual de las polimerasas (normalmente
en el intervalo de \muM), a menos que se utilicen otros medios
para reducir el fondo, tal como la discriminación del tiempo de
permanencia como se expuso anteriormente (figura 5) o técnicas de
confinamiento de volumen, como se describe a continuación, para
reducir "electrónicamente" o físicamente la contribución de la
fluorescencia de fondo. En un rayo láser enfocado
convencionalmente, el volumen focal es aproximadamente 0,2
\mum^{3} (0,5 \mum de diámetro, 1,5 \mum en la dirección
axial), correspondiente a aproximadamente 0,2 fl. Con objeto de que
esté presente solamente un nucleótido fluorescente por término
medio en el volumen de excitación en un momento dado, la
concentración de sustrato debe reducirse a aprox. 10 nM,
concentración muy inferior a los valores k_{m} de las ADN
polimerasas (aprox. 1 a 2 \muM). Veáse Polesky et al.,
"Identification of Residues Critical for the
Polymerase-Activity of the Klenow Fragment of
DNA-Polymerase-I fron
Escherichia-coli". J. Biol. Chem.
265: 14579-14591 (1990) y McClwe et al.,
"The Steady State Kinetic parameters and
Non-Processivity of Escherichia coli
Deoxyribonucleic Acid Polymerase I", J. Biol. Chem.
250:4073-4080 (1975). De este modo, si la
concentración de sustratos es muy inferior a k_{m}, la
procesividad de la síntesis de ácido nucleico ha de asegurarse
mediante una de las posibilidades mencionadas anteriormente.
Alternativamente, si el volumen de observación puede reducirse, es
permisible una concentración en sustrato superior, lo que aumenta
naturalmente los valores de la procesividad. Por consiguiente un
objetivo de la presente invención se refiere a una reducción eficaz
del volumen de observación para reducir o prevenir la fluorescencia
del fondo causada por nucleótidos libres marcados y aumentar la
procesividad. Esto puede lograrse de numerosas maneras.
Una estrategia para reducir de ruido de fondo
conlleva la intensificación del campo electromagnético cerca de los
objetos con pequeños radios de curvatura.
Debido al denominado "efecto antena", la
radiación electromagnética está muy intensificada en el extremo de
un objeto agudo, tal como una punta metálica. Utilizando este
procedimiento, el volumen que se aumenta aproximadamente
corresponde a una esfera con un diámetro próximo al diámetro de la
punta. Esta técnica está expuesta en Sánchez, E. J., et al.,
"Near-Field Fluorescence Microscopy Base on
Two-Photon Excitation with Metal Tips", Phys.
Rev. Lett. 82: 4014-17 (1999).
En la realización del procedimiento de la
presente invención, una enzima que polimeriza el ácido nucleico se
coloca al final de una punta metálica dirigiéndose la luz de láser
sobre ella, por ejemplo, con una lentes de objetivo convencional.
Debido a que el volumen iluminado eficaz puede ser actualmente del
orden del tamaño de la propia polimerasa prácticamente no se
detectará ninguna fluorescencia a partir de los nucleótidos
fluorescentes que se difunden en la solución. Además, el tiempo de
residencia de las moléculas de difusión a través de dicho pequeño
volumen es sumamente breve. Sin embargo, la incorporación de un
nucleótido fluorescente se verá como una ráfaga de fluorescencia
relativamente larga, debido a que esta molécula específica
permanecerá en este pequeño volumen iluminado (hasta que sea
eliminada como se expuso anteriormente).
Una estrategia para llevar a cabo esta forma de
realización de la presente invención se muestra en las figuras 7A a
B. La figura 7A presenta un sistema para secuenciación con
intensificación del campo electromagnético con la solución de
reactivo R colocada en la superficie 2 en la que se inmoviliza un
complejo de molécula de ácido nucleico diana. Como se representa en
la figura 7B, una punta metálica que lleva una polimerasa se coloca
en la solución de reactivo R, creando una pequeña zona de
iluminación alrededor de la polimerasa inmovilizada durante la
iluminación por la lente 6. Confinando la iluminación en esta
pequeña área, próxima a la zona activa de la prolongación de la
polimerasa, se detectan análogos nucleotídicos que se incorporarán a
la cadena de ácido nucleico en desarrollo, debido a que están
colocados en la zona de iluminación. Por otra parte, los análogos
nucleotídicos en el área circundante en la solución R están
generalmente fuera de esta zona y no se detectan.
Como se representa en la figura 7A, alguna
iluminación 10 (por ejemplo, un láser) dirige una o radiación de
excitación de multifotones con un componente de polimerización
distinto de cero paralelo a la punta a modo de un separador de
rayos dicroicos 8 mediante la lente 6 y la superficie 2 al complejo
del ácido nucleico diana cebado e inmovilizado. Esto excita el
marcador inmovilizado al complejo con la radiación emitida
resultante que vuelve a pasar a través de la superficie 2 y la
lente 6. El separador 8 de rayos dicroicos permite el paso de la
radiación emitida al detector 12 que identifica el tipo de emisión.
La información de la emisión detectada se dirige a continuación al
ordenador 14 donde la base nucleotídica correspondiente a la emisión
se identifica y se almacena su identidad. Después de múltiples
ciclos de este procedimiento, el ordenador podrá generar como
resultado la secuencia de una molécula de ácido nucleico diana. El
correspondiente resultado de detección corresponde de nuevo al
esquema representado en la figura 3, como se explicó anteriormente.
La principal diferencia con el caso expuesto anteriormente es que
los picos cortos producidos por análogos nucleotídicos que se
difunden al azar a través del volumen focal son ahora sumamente
cortos, al ser tan pequeño el volumen de observación. Por
consiguiente, esta estrategia de reducción del volumen de
observación también produce aumento de la resolución en el tiempo
con respecto a los nucleótidos incorporados frente a los no
incorporados. Esto es cierto para todas las demás posibilidades de
confinamiento de volumen expuestas con mayor detalle a
continuación.
En la realización de este procedimiento, las
puntas pueden estar formarse por varios materiales, por ejemplo,
metales tales como platino, plata u oro. La fabricación de la punta
puede llevarse a cabo, por ejemplo, por grabado electroquímico de
alambres o por molienda con rayo iónico. Véase Sánchez, E. J., et
al., "Near-Field Fluorescence Microscopy Base
on Two-Photon Excitation with Metal Tips",
Phys. Rev. Lett. 82: 4014-17 (1999).
La enzima que polimeriza el ácido nucleico puede
acoplarse al extremo de la punta sumergiendo la punta en una
solución de moléculas de la enzima que polimeriza el ácido nucleico,
aplicando un campo eléctrico a la punta con cargas que atraen la
enzima que polimeriza el ácido nucleico u otras técnicas de
acoplamiento (por ejemplo, con enlazadores, anticuerpos, etc.). Un
modo alternativo de utilizar la intensificación del campo
electromagnético para este esquema de secuenciación consiste en
colocar una punta desnuda en íntima proximidad a un complejo
enzimático que polimeriza el ácido nucleico inmovilizado/ácido
nucleico, en lugar de tener el complejo físicamente acoplado al
final de la punta. Una población de complejos podría inmovilizarse,
por ejemplo en un portaobjetos de vidrio, y la punta se explora
sobre la superficie hasta que se encuentra un complejo útil para la
secuenciación. Se han desarrollado técnicas adecuadas para llevar a
cabo este nanoposicionamiento en el campo de la microscopia de
sonda de exploración.
Otra estrategia para reducir el ruido de fondo
mientras se realiza el procedimiento de secuenciación de la
presente invención implica la utilización de iluminación en campo
próximo, como se representa en las figuras 8A-B.
Aquí, como se representa en la figura 8B, el complejo de ácido
nucleico diana cebado se inmoviliza en la superficie 2 aplicándose
la capa opaca 16 sobre la superficie 2. Sin embargo, pequeños
orificios 18 están grabados en la capa opaca 16. Cuando se iluminan
desde abajo, la luz no puede penetrar completamente a través de los
orificios en la solución de reactivo R porque el diámetro de los
orificios 18 es más pequeño que la mitad de la longitud de onda de
la luz. Sin embargo, existe alguna fuga que crea una pequeña área de
luz recta por encima de la superficie 2 en el orificio 18, creando
un denominado volumen de excitación en campo próximo. Como se
representa en figura 8B, el complejo de ácido nucleico diana cebado
está colocado en el orificio 18 donde se ilumina desde abajo.
Confinando la iluminación en esta pequeña área en campo próximo, se
detectan los análogos nucleotídicos incorporados, colocados en la
zona de iluminación. Por otra parte, la cantidad de análogos
nucleotídicos que no sirven para ampliar el cebador son pocos debido
al pequeño tamaño del orificio 18 y, a la pequeña extensión
detectada, se distinguen fácilmente de los análogos nucleotídicos
incorporados, tal como se describió anteriormente.
El sistema para llevar a cabo esta forma de
realización se presenta en la figura 8A. La fuente de iluminación
10 (por ejemplo, un láser) dirige la radiación de excitación a modo
de separador de rayo dicroico 8 a través de la lente 6 y de la
superficie 2 al complejo de ácido nucleico diana cebado
inmovilizado. Esto excita al marcador inmovilizado en el complejo
volviendo a pasar la radiación emitida resultante a través de la
superficie 2 y de la lente 6. El separador de rayos dicroicos 8
permite el paso de la radiación emitida al detector 12 que
identifica el tipo de emisión. La información de la emisión
detectada se dirige a continuación al ordenador 14 donde se
identifica la base nucleotídica correspondiente a la emisión y se
almacena su identidad. Tras múltiples ciclos de este procedimiento,
el ordenador podrá generar como resultado la secuencia de la
molécula ácido nucleico diana.
Como alternativa adecuada, utilizando volúmenes
de excitación en campo próximo, el volumen en campo próximo puede
también generarse mediante la utilización de una o muchas fibras
ópticas cónicas utilizadas frecuentemente en microscopia en campo
próximo de exploración.
La nanofabricación es otra técnica útil en la
limitación del volumen de reacción para reducir el nivel de
fluorescencia de fondo. Esto implica el confinamiento del volumen de
excitación a una zona con un nanocanal. Aquí, el confinamiento es
posible en dos o tres dimensiones espaciales. Un hervidor de
reacción con un volumen mucho más pequeño que los volúmenes focales
obtenibles con ópticas de enfoque en campo lejano se fabrica en una
oblea de silicio o de sílice fundida a partir de materiales
ópticamente transparentes. Turner et al.,
"Solid-State Artificial Gel DNA Electrophoresis
whith an Integrated Top Layer", Proceedings of SPIE. Micro-
and Nano-Fabricated Structures and Devices for
Biomedical Environmental Applications 3258:
114-121 (1998).
La técnica aprovecha una capa de polisilicio de
sacrificio para definir una calidad operativa de los canales. Stern
et al., "Nanochannel Fabrication for Chemical Sensors",
J. Vac. Sci. Technol. B15: 2887-2891 (1997)
y Chu et al., "Silicon Nanofilter with Absolute Pore Size
and High Mechanical Strength", Proc. SFIE Int.
Soc.Opt. Eng.(USA) 2593: 9-20 (1995).
El suelo, el techo y las paredes de los canales
son de nitruro de silicio, que está depositado de forma ajustada
sobre una capa de sacrificio diseñada de polisilicio. La capa de
sacrificio se elimina a continuación con un grabado químico húmedo
de alta selectividad, dejando detrás solamente el nitruro de
silicio. Esta técnica ha demostrado un control preciso de la
dimensión crítica (DC) sobre un amplio intervalo de tamaños de
estructuras. La altura de la capa de polisilicio puede controlarse
dentro de 5 nm sobre un dispositivo completo, y las dimensiones
laterales están limitadas en tamaño y control DC solamente por la
técnica de litografía aplicada. La nanoestructura puede presentar
una configuración punteada, acicular o resonante, para aumentar la
detección del marcador.
Las figuras 9A-B muestran un
sistema nanofabricado.
En la figura 9B se muestra una vista ampliada de
la sección transversal del nanocanal, con reactivos R situados
solamente en el área confinada 102, que está creada por las paredes
de los canales 104 y 106. El complejo de la molécula de ácido
nucleico diana cebado está colocado dentro del área confinada 102.
Como resultado, cuando la luz de excitación atraviesa el área
confinada 102, el marcador del análogo nucleotídico incorporado se
excita y emite radiación que es detectada e identificada como
correspondiente a una base nucleotídica particular añadida a la
secuencia del cebador de extensión. Pasando los reactivos a través
del área confinada 102, la cantidad de análogos nucleotídicos que
no amplían el cebador son pocos en cualquier punto específico en
tiempo. En pequeña medida se detectan dichas entidades móviles, se
distinguen fácilmente de los restos inmovilizados tal como se
describió anteriormente.
La figura 9A presenta un sistema para llevar a
cabo el sistema de nanocanal.
La fuente de iluminación 10 (por ejemplo, un
láser) dirige la radiación de excitación a modo de separador de
rayo dicroico 8 a través de la lente 6 y del nanocanal 106 al
complejo de ácido nucleico diana cebado e inmovilizado. Esto excita
al marcador inmovilizado en el complejo con la radiación emitida
resultante que vuelve a pasar a través de la lente 6. El separador
de rayos dicroicos 8 permite el paso de la radiación emitida al
detector 12 que identifica el tipo de emisión. La información de la
emisión detectada se dirige a continuación al ordenador 14 donde la
base nucleotídica correspondiente a la emisión se identifica y se
almacena su identidad. Después de múltiples ciclos de este
procedimiento, el ordenador podrá generar como resultado la
secuencia de la molécula de ácido nucleico diana.
Las figuras 10A-B muestran
sistemas para proporcionar reactivos al sistema de confinamiento
nanofabricado. En la figura 10A, el reactivo que incluye dATP,
dCTP, dGTP, dUTP, la fuente de ácido nucleico y el tampón se
mantienen en depósitos separados y se conectan a través de conductos
separados al colector 200 donde los reactivos se mezclan antes de
enfocar el nanocanal 202. Los componentes de este sistema corriente
arriba y corriente abajo del nanocanal 202 pueden combinarse, como
una microestructura. En el procedimiento de pasar rápidamente a
través del nanocanal 202, los reactivos se desplazan rápidamente a
través de la zona de reacción 204 donde el procedimiento de
secuenciación de la presente invención se lleva a cabo desde el
nanocanal 202, los reactivos R restantes pasan a través de la
salida 206. El sistema de la figura 10B, es en general similar al
de la figura 10A, pero el sistema anterior está en un solo chip con
almohadillas para conectar el sistema a depósitos de fluido. En
particular, el depósito para cada uno de los reactivos está acoplado
al chip 208 con almohadillas a la entrada 210 a-f,
mientras que la salida para los reactivos descargados está conectada
a la almohadilla 212.
Los canales nanofabricados de 75 nm de anchura y
60 nm de altura se han fabricado con excelente transparencia óptica
y se han utilizado, para el control de flujo de ADN. Véase Turner
et al., "Solid-State Artificial Gel DNA
Electrophoresis with an Integrated Top Layer", Proceedings of
SPIE. Micro-and Nano-Fabricated
Structures and Devices for Biomedical Environmental
Applications 3258: 114-121 (1998), que está
incorporado por la presente como referencia. Colocando el complejo
de síntesis de ácido nucleico en un canal de anchura z = 25 nm,
minimizando la dimensión x del rayo de láser enfocado a aprox. 300
nm y fijando la dimensión y por la anchura del canal en 100 nm, el
volumen eficaz de conservación puede reducirse a 7,5 x 10^{4}
\mum^{3}, correspondiente a 0,75 altolitros. Aquí, la
concentración para que solamente una molécula de sustrato esté
presente en el volumen de excitación asciende a 2 \muM, una
concentración de sustrato dentro del intervalo de la polimerización
del ácido nucleico rápida y eficaz. Además, dado que existen cuatro
análogos nucleotídicos diferentes, cada uno a distinguir, la
concentración del sustrato eficaz para la polimerasa es cuatro veces
mayor. Si se necesita un pequeño volumen eficaz de observación, la
dimensión y en la dirección del flujo puede reducirse a
aproximadamente 100 nm por iluminación dentro del modelo de
interferencia de dos objetivos a aproximadamente ángulos axiales de
90º como en la microscopia theta. Véase Stelzer et al., " A
New Tool for the Observa- tion of Embryos Other Large
Specimens: Confocal Theta Fluorescence Microscopy", J.
Microscopy 179: 1-10 (1995).
Para excitar los marcadores, la energía de
activación se enfoca en la proximidad a la zona activa de la
ampliación de polimerasa (es decir, donde está localizada la
polimerasa). En la medida en que esta zona activa se desplaza
durante la ampliación (por ejemplo, como resultado por el movimiento
por la polimerasa), el foco de la energía de activación se desplaza
también.
Una consideración necesaria, es la elección
entre la excitación monofotónica y multifotónica de fluorescencia.
La excitación multifotónica proporciona algunas ventajas poderosas,
pero es más compleja y más costosa de realizar. La fluorescencia de
excitación multifotónica, que utiliza la absorción simultánea de dos
o más fotones, las pulsaciones infrarrojas del brillo en
femtosegundo generadas por láseres bloqueados en modo de estado
sólido ultrarrápido proporciona la estrategia más prometedora. Véase
Denk et al., "2-Photon Laser Scanning
Fluorescence Microscopy", Science 248:
73-76 (1990).
La sensibilidad a la fluorescencia de una sola
molécula, se obtiene de manera rutinaria y se puede resolver
temporalmente a nivel de microsegundos con tiempos de permanencia de
la fluorescencia mensurables con precisión razonable para moléculas
individuales. Véase Mertz et al.,
"Single-Molecule Detection by
Two-Photon Excited Fluorescence", Optics.
Lett. 20: 2532-2534 (1995) y Eggeling et
al., "Monitoring Conformational Dynamics of a Single Molecule
by Selective Fluorescence Spectroscopy". Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95: 1556-1561 (1998).
La señal fluorescente ideal para la
secuenciación de una sola molécula consiste en ráfagas resueltas en
el tiempo de fluorescencia distinguible ya que cada nucleótido está
unido. Por lo tanto, en la situación ideal, una serie resuelta en
el tiempo de ráfagas fluorescentes resueltas por color podrían
obtenerse si los nucleótidos se unieran a intervalos distinguibles
como los descritos en la figura 3. La resolución completa de la
secuencia en el tiempo de episodios ofrece por consiguiente la
mejor reducción del fondo y la posibilidad fehaciente para el
reconocimiento de nucleótidos. Como con las polimerasas disponibles
actualmente, los nucleótidos marcados se añaden más probablemente
no más rápido que a intervalos de 1 milisegundo, sería posible que
todos los fotones de fluorescencia detectados de cada nucleótido
marcado puedan acumularse y eliminarse antes de que se una el
siguiente nucleótido fluorescente. Esta secuencia ideal de
ráfaga-hueco-ráfaga está realizada
aunque realmente cada etapa de la cinética molecular de
polimerización conlleva el procedimiento estocástico de Poisson.
Para un solo procedimiento de Poisson, la demora en el tiempo más
probable entre los episodios es cero aunque la demora media sería
mayor de cero. Sin embargo, el procedimiento de incorporación de un
solo dNTP en el ADN por la ADN polimerasa es un procedimiento
multietapa sucesivo de por lo menos 5 episodios diferentes. Véase
Patel et al.,
"Pre-Steady-State Kinetic Analysis
of Processive DNA Replication Including Complete Characterization
of an Exonuclease-Deficient Mutant",
Biochemistry 30: 511-525 (1991). La suma de
secuencias de estas etapas producirá una demora en el tiempo más
probablemente mayor de cero. Por consiguiente las ráfagas de fotones
no es muy probable que se solapen.
Para los fluoróforos convencionales,
aproximadamente 10^{5} fotones por fluoróforo se emitirán antes
del fotoblanqueo. La detección de (por lo menos) el 1% de la
emisión da una incertidumbre relativa de ruido del 3%. El fondo
debido a los nucleótidos libres se reduce a un nivel casi
insignificante por los esquemas expuestos anteriormente,
por ejemplo, limitando el tamaño del volumen focal para que
contenga sólo aproximadamente un nucleótido marcado libre, con
tiempos de permanencia muy breves.
El nivel de detección esperado es de
aproximadamente 10^{3} fotones por cada nucleótido marcado, en
aproximadamente 10^{-3} s. Esta es una cantidad de recuento
aceptable, \sim10^{6} Hz, y una cantidad de excitación del
fluoróforo a aproximadamente una décima de saturación del estado
excitado del singlete. Esta excitación de fluorescencia crea una
ráfaga detectada de \sim10^{3} fotones en aproximadamente 1 ms a
la longitud de onda característica de cada nucleótido marcado,
dejando de promedio, una separación de aproximadamente 1 ms antes de
añadir el siguiente nucleótido, muy dentro de los intervalos de
tiempo medios entre la adición del nucleótido a probablemente más
de un milisegundo. Los posibles solapamientos de las ráfagas pueden
analizarse y resolverse mediante el tratamiento analítico de
mediciones continuas de datos en secuencias coherentes con el tiempo
en (en el mejor de los casos) 4 canales de la mayoría de los
resultados precisos de secuenciación. Con las estadísticas de los
fotones disponibles en el diseño experimental y los analizadores
multicanal acoplados recientemente desarrollados y el programa
informático operativo, las tasas de error pueden hacerse aceptables
con 4 nucleótidos marcados o con las estrategias que implican un
número más pequeño de marcadores como se expuso anteriormente.
La resolución espectral de cuatro fluoróforos
que identifican los nucleótidos puede conseguirse con la excitación
de dos fotones por pulsaciones infrarrojas. Los 4 fluoróforos pueden
excitarse simultáneamente debido a las bandas de excitación amplias
características normalmente de la excitación de dos fotones. Véase
Xu et al., "Multiphoton Excitation
Cross-Sections of Molecular Fluorophores",
Bioimaging 4: 198-207 (1996).
Alternativamente, pueden utilizarse múltiples
fuentes de excitación en combinación o por conexión rápida para
iluminar el complejo de secuenciación si es necesario. La separación
espectral se realiza con filtros de interferencia convencionales
pero los espectros de emisión pueden solaparse, complicando el
análisis de correlación temporal y quizás acompañando la
correlación cruzada de los 4 canales de color para la corrección. Si
la compatibilidad de los fluoróforos con la enzima que polimeriza
el ácido nucleico limita la aplicación de las series de colorantes
adecuadas, una combinación de técnicas puede aplicarse para
distinguir los marcadores.
Otra manera potencial de distinguir la
incorporación de un nucleótido en la cadena de ácido nucleico en
desarrollo, consiste en medir los cambios del tiempo de permanencia
de la fluorescencia. Se ha observado que el tiempo de permanencia
de la fluorescencia de una sonda de pireno con oligonucleótido varía
en función de la secuencia durante el acoplamiento del ADN. Véase
Dapprich J., "Fluoreszenzdetection Molekularer Evolution
(Fluorescence Detection of Molecular Evolution)".
Dissertation,
Georg-August-Univ., Goettingen,
Alemania (1994).
Las interacciones fotofísicas entre el
fluoróforo y la base dan como resultado tiempos de debilitamiento de
la fluorescencia característicos y pueden utilizarse también para
diferenciar las bases como se expuso anteriormente. La
determinación del tiempo de permanencia y la discriminación en el
contexto molecular individual se ha demostrado recientemente de
modo que la discriminación entre las bases que se incorporan y los
nucleótidos que se difunden libremente podría realizarse por
mediciones del tiempo de permanencia de la fluorescencia. Véase
Eggeling et al., "Monitoring Conformational Dynamics of a
Single Molecule by Selective Fluorescence Spectroscopy".
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1556-1561
(1998).
Las mediciones correlacionadas en el tiempo en
cuatro canales de longitud de onda de fluorescencia pueden
utilizarse con eficacia en la realización del proceso de la presente
invención. El solapamiento de los espectros de emisión puede dejar
que señales procedentes de un fluoróforo entren en varios canales
pero la tasa de recuento relativa y la medida del tiempo de
permanencia identifica al marcador correctamente. Las señales
simultáneas procedentes de un nucleótido marcado incorporado y un
marcador libre se pueden distinguir por la duración y la magnitud
de la ráfaga, que están limitadas por el marcador libre. La
ambigüedad del marcador puede reducirse más mediante la utilización
de mediciones de tiempo de debilitamiento de la fluorescencia que
pueden realizarse con la resolución de 0,1 ns disponibles de las
demoras en el tiempo por emisión de fotones de fluorescencia
después de cada pulsación de excitación del láser de femtosegundo.
La emisión de fotones de fluorescencia y los propios procesos de
fotoblanqueo son también procesos estocásticos pero conllevan
eficiencias cuánticas suficientemente dispares que las tasas de
error serían insignificantes.
En el rechazo del fondo procedente de los
nucleótidos marcados que se difunden o que circulan libremente, se
utiliza con ventaja el tiempo de permanencia muy breve de cualquier
nucleótido libre individual en el volumen focal. El tiempo de
difusión característico para un análogo nucleotídico libre a través
de la dimensión abierta del volumen focal (en el peor de los casos
de iluminación en campo lejano no interferométrica) será
\tau_{D}\simy^{2}/4D-2x10^{-5} s., siendo
y la dimensión del volumen focal y D el coeficiente difusión. Una
velocidad de flujo iontoforética de 1 cm/s es suficiente para
mantener sus breves ráfagas de fluorescencia en menos de 10^{-3} s
y reducir el número de fotones en un orden de magnitud. Esto
asegurará la discriminación frente a los nucleótidos libres e
identificará la serie en el tiempo de las ráfagas que representan la
secuencia de ácidos nucleicos, con la condición de que las
concentraciones de análogo nucleotídico sean propiamente bajas como
se expuso. Magde et al., "Thermodynamic Fluctuations in a
Reacting System-Measurement by Fluorescence
Correlation Spectroscopy", Phys. Rev. Lett. 29:
705-708 (1972) y Maiti et al., "Measuring
Serotonin Distribution in Live Cells with
Three-Photon Excitation", Science 275:
530-532 (1997).
La discriminación puede mejorarse utilizando
técnicas de confinamiento en volumen o de detección controlado por
el tiempo, como se expuso anteriormente.
La detección de la transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET) de un fluoróforo donador (por
ejemplo, un donador acoplado a la polimerasa) para los aceptadores
de análogos nucleotídicos adyacentes que están incorporados en la
cadena de ácido nucleico en desarrollo sugiere una posibilidad más
elegante de reducir el fondo de los nucleótidos incorporados. La
FRET alcanza solamente distancias muy cortas que incluyen
aproximadamente 20 nucleótidos y disminuye al recíproco de la sexta
potencia de la distancia. La molécula de donador excitada
transfiere su energía solamente a los fluoróforos aceptadores
próximos, que emiten fluorescencia del aceptador espectralmente
resuelta de cada nucleótido marcado a medida que se añade. Los
nucleótidos ya incorporados más lejos del donador no contribuirían
a la señal de fluorescencia ya que las limitaciones en la
distancia y orientación de la transferencia de energía reducen el
margen eficaz de observación a menos de 60 \ring{A}, eliminando
de este modo con eficacia la fluorescencia de fondo de los
nucleótidos no incorporados. Sin fotoblanqueo, el procedimiento
requiere gran sensibilidad ya que la repetición del nucleótido
abandona el margen de la FRET a la misma velocidad a la que se
añaden nuevos nucleótidos, creando posiblemente ambigüedad en el
reconocimiento de las secuencias. El fotoblanqueo o la escisión
fotoquímica, o su combinación como se expuso anteriormente podrían
resolver el problema. El fotoblanqueo de las moléculas del donador
que utilizan la FRET puede evitarse si es el ácido nucleico
plantilla el que se acopla y el donador que lleva la enzima que
polimeriza el ácido nucleico se reemplaza periódicamente.
Una consideración final importante para el éxito
de la presente invención se refiere a la estabilidad del complejo
proteína/ácido nucleico en la radiación de activación, tal como los
rayos de láser enfocados de manera ajustada. No es de esperar que
la enzima esté afectada por la iluminación de excitación, porque se
eligen longitudes de onda en las que las proteínas no se absorben,
la estabilidad de la polimerasa en el rayo de láser sería lo
suficientemente alta para permitir series de secuenciación precisas
sobre longitudes largas de lectura. Las investigaciones previas
exponiendo enzimas a la luz de láser potente han examinado el velado
fotográfico y la pérdida de función. Los complejos de ARN
polimerasa/ADN inmovilizados presentaban tiempos de inactivación de
82 \pm 58 s. para luz de láser Nd:Y de 1047 nm de 82 a 99 mW de
potencia enfocada a la proteína, correspondiente a intensidades de
aproximadamente 10^{8} W/cm^{2}. Otros estudios sobre los
sistemas de actomiosina o cinesina indicaban estabilidad similar.
Tanto el ADN como los enlaces de biotina-avidina
han demostrado ser fotoestables en trampas ópticas. Véase Yin et
al., "Transcription Against an Applied Force",
Science 270: 1653-1657 (1995), Svoboda et
al., "Direct Observation of Kinesin Stepping by Optical
Trapping Interferometry". Nature 365:
721-727 (1993) y Molloy et al., "Movement
and Force Produced by a Single Myosin Head", Nature 378:
209-212 (1995).
Para la detección de la fluorescencia de los
análogos nucleotídicos según la presente invención, son de esperar
potencias (intensidades) de láser típicas de las mediciones de FCS,
del orden de 0,1 mW (10^{5} W/cm^{2}) para la excitación de un
fotón y de 1 mW (10^{6}-10^{7} W/cm^{2}) para
la de dos fotones, siendo de este modo significativamente inferior
que en el caso de las pinzas ópticas descritas anteriormente. La
estabilidad enzimática sería por consiguiente mayor, además, con la
velocidad rápida de secuenciación propuesta por este procedimiento
(por ejemplo 10 pb/s) incluso 80 s. son suficientes para determinar
la secuencia del ácido nucleico de 8 kb.
Claims (58)
1. Procedimiento de secuenciación de una sola
molécula de ácido nucleico diana que presenta una pluralidad de
bases nucleotídicas que comprende:
- proporcionar un complejo de una enzima que polimeriza el ácido nucleico y la molécula de ácido nucleico diana para permitir la formación de una cadena de ácido nucleico en crecimiento complementario al ácido nucleico diana;
- proporcionar una pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados, en el que cada tipo de análogo nucleotídico es complementario a un nucleótido diferente en la secuencia de ácido nucleico diana;
- polimerizar la pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados incorporando la pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados en la cadena de ácido nucleico en crecimiento, en el que cada uno de los análogos incorporados puede polimerizarse con un análogo nucleotídico posterior para permitir la polimerización continua de una pluralidad de análogos nucleotídicos;
- identificar la secuencia de tiempo de la incorporación de dicha pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos marcados en la cadena de ácido nucleico en crecimiento detectando los tiempos de residencia de los análogos nucleotídicos marcados próximos a la enzima que polimeriza el ácido nucleico en tiempo real mientras que la extensión del cebador dirigida por la plantilla tiene lugar, y eliminándose el marcador tras la detección.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se identifica una pluralidad de análogos nucleotídicos
incorporados por segundo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que se identifican hasta 100 análogos incorporados por
segundo.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico se selecciona de
entre el grupo constituido por una ADN polimerasa, una ARN
polimerasa, transcriptasa inversa y mezclas de las mismas.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico es una polimerasa
termoestable.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico es una polimerasa
termodegradable seleccionada de entre el grupo constituido por ADN
polimerasa de E. coli, el fragmento de Klenow de la ADN
polimerasa de E. coli, T4 ADN polimerasa y T7 ADN
polimerasa.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la molécula de ácido nucleico diana se selecciona de entre
el grupo constituido por ADN bicatenario, ADN monocatenario,
horquillas de ADN monocatenario, híbridos de ADN/ARN, ARN con una
zona de reconocimiento para la unión de una ARN polimerasa y
horquillas de ARN.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico está unida al
complejo con la molécula del ácido nucleico diana en un origen de
replicación, en una hendidura o separación en un ácido nucleico
diana bicatenario, una estructura secundaria en un ácido nucleico
diana monocaternario, una zona de unión creada por un proteína
accesoria seleccionada de entre una proteína de enlace
monocatenaria, una primasa, y una helicasa o a un ácido nucleico
monocatenario cebado.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico está provista de
una o más proteínas accesorias seleccionadas de entre una proteína
de enlace monocatenaria, una primasa, y una helicasa para modificar
su actividad.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico es procesiva.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico es no
procesiva.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los análogos nucleotídicos se seleccionan de entre el grupo
constituido por un ribonucleótido, un desoxirribonucleótido, un
ribonucleótido modificado, un desoxirribonucleótido modificado, un
nucleótido peptídico, un nucleótido peptídico modificado y un
nucleótido de esqueleto central de fosfato-azúcar
modificado.
13. Procedimiento según la reivindicación 1 que
comprende además:
- hibridar un cebador oligonucleotídico a la molécula de ácido nucleico diana antes de o durante dicha provisión de una pluralidad de análogos nucleotídicos.
\newpage
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el cebador oligonucleotídico comprende nucleótidos
seleccionados de entre el grupo constituido por ribonucleótidos,
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos modificados,
desoxirribonucleótidos modificados, ácidos nucleicos peptídicos,
ácidos nucleicos peptídicos modificados y nucleótidos de esqueleto
de fosfato-azúcar modificado.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que cada uno de los análogos nucleotídicos incorporados esta
provisto de un marcador.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el marcador se selecciona de entre el grupo constituido por
cromóforos, restos fluorescentes, enzimas, antígenos, metales
pesados, sondas magnéticas, colorantes, grupos fosforescentes,
materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes, nanopartículas
dispersantes o fluorescentes, restos generadores de la señal Raman,
y restos de detección electroquímica.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el marcador se acopla al análogo nucleotídico en su base,
resto de azúcar, alfa fosfato, beta fosfato o gamma fosfato.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el marcador se acopla al análogo nucleotídico con un
enlazador.
19. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el marcador se acopla al análogo nucleotídico en su terminal
fosfato.
20. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además:
- retirar el marcador del análogo nucleotídico durante o después de dicha identificación y antes de dicha polimerización de un análogo nucleotídico posterior en una zona activa en la que el análogo nucleotídico se está añadiendo a la cadena cadena de ácido nucleico en crecimiento.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha retirada se lleva a cabo blanqueando el marcador.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicho blanqueo se lleva a cabo por fotoblanqueo con
radiación que está ajustada para provocar una retirada del marcador
de referencia.
23. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha retirada se lleva a cabo por escisión del marcador del
análogo nucleotídico.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que los análogos nucleotídicos marcados con
beta-fosfato o con gamma-fosfato se
escinden con enzimas.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que cada uno de la pluralidad de tipos de análogos nucleotídicos
presentan diferentes marcadores que se distinguen entre sí durante
dicha identificación.
26. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que tres o menos de la pluralidad de tipos de análogos
nucleotídicos presentan un marcador diferente.
27. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los diferentes tipos de análogos nucleotídicos presentan el
mismo marcador pero se distinguen por las propiedades diferentes
debido a la presencia de fluoróforos de base, fluoróforos
extinguidos o análogos nucleotídicos fluorógenos.
28. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico es portadora de
un marcador y dicha identificación se lleva a cabo detectando la
interacción entre el marcador y el análogo nucleotídico.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que el marcador es un donador o un aceptor de transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia.
30. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha identificación se lleva a cabo por procedimientos
ópticos seleccionados de entre el grupo constituido por
microespectroscopia en campo lejano, microespectroscopia en campo
próximo, iluminación guiada por ondas evanescentes o por ondas,
reforzamiento de nanoestructuras y las combinaciones de los
mismos.
31. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha identificación se lleva a cabo utilizando la
excitación monofotónica o multifotónica, la transferencia de energía
por resonancia de fluorescencia o la fotoconversión.
32. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha identificación se consigue mediante discriminación de
las longitudes de onda del espectro, medición y separación de los
tiempos de permanencia de la fluorescencia, identificación de
fluoróforos y/o supresión del fondo.
\newpage
33. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que la identificación del fluoróforo y/o la supresión del fondo
utilizan la conexión rápida entre los modos de excitación y las
fuentes de iluminación y las combinaciones de los mismos.
34. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha provisión de un complejo comprende:
- disponer (1) un primer cebador oligonucleotídico o (2) la molécula de ácido nucleico diana en un soporte;
- hibridar (1) la molécula de ácido nucleico diana con el primer cebador oligonucleotídico o (2) el primer cebador oligonucleotídico con la molécula de ácido nucleico diana dispuesta, para formar un complejo con la molécula de ácido nucleico diana cebada; y
- proporcionar la enzima que polimeriza el ácido nucleico en el complejo con la molécula de ácido nucleico diana cebada.
35. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que un segundo cebador oligonucleotídico se hibrida con la
molécula de ácido nucleico diana en la zona opuesta a la hibridada
por el primer cebador oligonucleotídico.
36. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que el soporte y el cebador oligonucleotídico o la molécula de
ácido nucleico diana se unen de manera reversible o irreversible con
los componentes correspondientes de un par de enlace covalente o no
covalente seleccionado de entre el grupo constituido por un par de
enlace antígeno-anticuerpo, un par de enlace
estreptavidina-biotina, moléculas de acoplamiento
fotoactivadas, y un par de ácidos nucleicos complementarios.
37. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que el cebador oligonucleotídico está dispuesto sobre el soporte
y la molécula de ácido nucleico diana está hibridada con el cebador
oligonucleotídico dispuesto.
38. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que la molécula de ácido nucleico diana está dispuesta sobre el
soporte y el cebador oligonucleotídico está hibridado con la
molécula de ácido nucleico diana dispuesta.
39. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha provisión de un complejo comprende:
- disponer, sobre un soporte, una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende el ácido nucleico diana y que presenta una zona de reconocimiento próxima a una zona activa en la que se está añadiendo el análogo nucleotídico a la cadena de ácido nucleico en crecimiento, y
- proporcionar la enzima que polimeriza ácido nucleico sobre la molécula de ácido nucleico diana.
40. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha provisión de un complejo comprende:
- disponer una enzima que polimeriza ácido nucleico sobre un soporte en una posición adecuada para que el complejo con ácido nucleico diana se desplace en relación a la enzima que polimeriza ácido nucleico.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, en
el que el soporte y la enzima que polimeriza el ácido nucleico se
unen de manera reversible o irreversible con los componentes
correspondientes de un par de enlace covalente o no covalente
seleccionado de entre el grupo constituido por un par de enlace
antígeno-anticuerpo, un par de enlace
estreptavidina-biotina, moléculas de acoplamiento
fotoactivadas y un par de ácidos nucleicos complementarios.
42. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico o el ácido
nucleico diana se dispone sobre un soporte.
43. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la enzima que polimeriza el ácido nucleico o el ácido
nucleico diana se dispone en un gel con poros.
44. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ácido nucleico diana y la enzima que polimeriza el ácido
nucleico se disponen sobre un soporte sólido.
45. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha identificación se lleva a cabo reduciendo el ruido de
fondo resultante de los análogos nucleotídicos libres.
46. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que dicha identificación comprende:
- dirigir la radiación de activación a una zona que corresponde sustancialmente a una zona activa en la que se está añadiendo análogo nucleotídico a la cadena de ácido nucleico en crecimiento; y
- detectar el análogo nucleotídico polimerizado en la zona activa.
\newpage
47. Procedimiento según la reivindicación 45,
en el que dicha identificación distingue análogos nucleotídicos
polimerizados en la zona activa en la que se está añadiendo análogo
nucleotídico a la cadena de ácido nucleico en crecimiento
procedente de los análogos nucleotídicos libres.
48. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que dicha identificación se lleva a cabo en una zona confinada
correspondiente a la zona activa en la que se está añadiendo análogo
nucleotídico a la cadena de ácido nucleico en crecimiento.
49. Procedimiento según la reivindicación 48, en
el que dicha identificación se lleva a cabo en una
nanoestructura.
50. Procedimiento según la reivindicación 49, en
el que dicha nanoestructura es una nanoestructura punteada,
acicular o resonante que aumenta dicha detección.
51. Procedimiento según la reivindicación 48, en
el que los análogos nucleotídicos que no se polimerizan en la zona
activa se desplazan rápidamente por una microestructura hasta y
desde la zona confinada correspondiente a la zona activa.
52. Procedimiento según la reivindicación 51, en
el que la microestructura comprende:
- una pluralidad de canales para dirigir diferentes análogos nucleotídicos a la zona confinada y
- un canal de descarga para permitir que los materiales se retiren de la zona confinada, y la nanoestructura comprende:
- un alojamiento que define la zona confinada y se construye para facilitar dicha identificación.
53. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que dicha identificación se lleva a cabo por intensificación del
campo electromagnético con radiación electromagnética
intensificándose en la proximidad a un objeto con un radio de
curvatura pequeño adyacente a la zona activa.
54. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que dicha identificación se lleva a cabo por iluminación en
campo próximo de las cavidades en las que está dispuesta la molécula
de ácido nucleico diana cebada.
55. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que dicha identificación se lleva a cabo con fibras ópticas
próximas al complejo.
56. Procedimiento según la reivindicación 45,
en el que dicha identificación y dicha reducción del fondo se
llevan a cabo por retardo controlado por tiempo de la detección de
fotones.
57. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho procedimiento se lleva a cabo secuenciando diferentes
moléculas de ácido nucleico diana en una variedad de ubicaciones
diferentes en una matriz.
58. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho procedimiento se lleva a cabo secuenciando simultánea
o secuencialmente el mismo ácido nucleico diana y combinando la
salida de dicha secuenciación.
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2011
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