PT1179085E

PT1179085E - Método para a sequenciação de moléculas de ácido nucleico

Info

Publication number: PT1179085E
Application number: PT00932575T
Authority: PT
Inventors: Watt W Webb; Harold G Craighead; Jonas Korlach; Michael Levene; Stephen Turner; Mathieu Foquet
Original assignee: Cornell Res Foundation Inc
Priority date: 1999-05-19
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2010-08-12
Also published as: CA2373385C; EP2365093B1; EP1179085B2; US20050202466A1; US20080227654A1; US7485424B2; DE60044348D1; US20030044781A1; US20090137007A1; DK1179085T4; US20060134666A1; US20060057606A1; US7052847B2; WO2000070073A1; US7056676B2; EP2365093A2; US20060160113A1; DK1179085T3; US20110111401A1; ATE529529T1

Description

ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Método para a sequenciação de moléculas de ácido nucleico"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para determinar a sequência de moléculas de ácido nucleico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 objectivo de conhecer o genoma humano completo gerou interesse em tecnologias para uma sequenciação de ADN rápida, tanto para aplicações em pequena, como em grande escala. Os parâmetros importantes são a velocidade de sequenciação, o comprimento da sequência que pode ser lida durante uma única operação de sequenciação e a quantidade de ácido nucleico molde necessária. Estes desafios da investigação sugerem ter em vista a sequenciação da informação genética de células individuais, sem amplificação prévia e sem a necessidade anterior de clonar o material genético em vectores de sequenciação. Os projectos de genoma em grande escala são actualmente muito dispendiosos para serem realizados de forma realista para um grande número de organismos ou pacientes. Além disso, à medida que o conhecimento da base genética para as doenças humanas aumenta, haverá uma necessidade cada vez maior de se ter uma sequenciação de ADN precisa, de elevada eficiência, que possa ser utilizada em aplicações clinicas. Os métodos práticos para determinar as sequências de pares de bases de moléculas individuais de ácidos nucleicos, de preferência com rapidez e comprimentos de leitura longos, irão proporcionar a capacidade de medição necessária.

Duas técnicas tradicionais para a sequenciação de ADN são o método da terminação didesoxi de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74: 563-5467 (1977)) e o método da degradação química de Maxam-Gilbert (Maxam e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74: 560-564 (1977)). Ambos os métodos fornecem quarto amostras, em que cada amostra contém uma família de cadeias de ADN em que todas as cadeias terminam no mesmo nucleótido. Utiliza-se electroforese em placa de gel ultrafina ou, mais recentemente, electroforese capilar para 2 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ resolver as cadeias de diferentes comprimentos e para determinar a sequência de nucleótidos, quer por marcação diferencial das cadeias de cada amostra antes da electroforese, para indicar o nucleótido terminal, quer correndo as amostras em diferentes colunas do gel, ou em diferentes capilares. Ambos os métodos, de Sanger e de Maxam-Gilbert, são trabalhosos e demorados e requerem um pré-tratamento extenso da fonte de ADN. Foram feitas tentativas para utilizar espectroscopia de massa para substituir o passo de electroforese demorado. Para revisão das tecnologias de sequenciação existentes ver Cheng "High-Speed DNA-Sequence Analysis," Prog. Biochem. Biophys. 22: 223-227 (1995).

Foram desenvolvidos métodos relacionados utilizando corantes ou marcadores fluorescentes, associados com o nucleótido terminal, em que a determinação da sequência também é feita por electroforese em gel e detectores de fluorescência automatizados. Por exemplo, o método de extensão de Sanger foi recentemente modificado para utilização num sistema de micro-sequenciação automático que requer apenas volumes de ordem de sub-microlitro de reagentes e didesoxirribonucleótido-trifosfatos marcados com corante. Na patente U.S. 5,846,727 de Soper et al., a detecção de fluorescência é realizada on-chip com uma fibra óptica unimodal que transporta a luz de excitação até ao canal capilar e uma segunda fibra óptica unimodal que recolhe os fotões fluorescentes. As leituras de sequência são estimadas na gama de 400-500 bases, o que não é uma melhoria significativa em relação à quantidade de informação de sequência obtida com os métodos tradicionais de Sanger ou Maxam-Gilbert. Além disso, o método de Soper requer amplificação por PCR do ADN molde e purificação e electroforese em gel das "escadas" de sequenciação de oligonucleótidos antes da iniciação da reacção de separação. Estes sistemas requerem todos quantidades significativas de ADN alvo. Mesmo o método descrito na patente U.S. 5302509 de Cheeseman, que não utiliza electroforese em gel para a determinação da sequência, requer pelo menos um milhão de moléculas de ADN.

Numa melhoria recente de uma metodologia de sequenciação por sintese originalmente concebida há dez anos, as sequências de ADN são deduzidas medindo a libertação de pirofosfato por 3 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ teste de complexos ADN/polimerase com cada desoxirribonucleótido-trifosfato (dNTP), separada e sequencialmente. Ver Ronaghi et al., "A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate," Science 281: 363-365 (1998) e Hyman, "A New Method of Sequencing DNA," Anal. Biochem. 174: 423-436 (1988). Apesar de se utilizarem nucleótidos nativos, o método requer a sincronização de polimerases nas cadeias de ADN o que restringe grandemente os comprimentos de leitura das sequências. Apenas se obtiveram leituras de cerca de 40 nucleótidos e não é esperado que o método de detecção se possa aproximar da sensibilidade de moléculas individuais devido a uma eficiência quântica limitada de produção de luz pela luciferase no procedimento apresentado por Ronaghi et al., "A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate," Science 281: 363-365 (1998). Além disso, a velocidade global de sequenciação é limitada pelos passos de lavagem necessários, passos químicos subsequentes, de modo a identificar a presença de pirofosfato e pelo tempo inerente necessário para testar cada par de bases a sequenciar com todas as quatro bases, sequencialmente. Além disso, foram reconhecidas dificuldades em determinar de forma precisa porções de homonucleótidos nas sequências.

As tentativas anteriores de sequenciação de moléculas individuais (geralmente sem sucesso, mas seminais) utilizaram exonucleases para libertar sequencialmente bases individuais marcadas por fluorescência, como um segundo passo após a ADN-polimerase ter formado uma cadeia complementar completa. Ver Goodwin et ai., "Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing," Núcleos. Nucleot. 16: 543-550 (1997). Consiste em sintetizar uma cadeia de ADN marcada com quatro análogos de dNTP fluorescentes, diferentes, degradar subsequentemente a cadeia marcada por acção de uma exonuclease e detectar as bases individuais libertadas num detector de fluxo hidrodinâmico. No entanto, quer a polimerase, quer a exonuclease têm que apresentar actividade sobre uma cadeia de ADN altamente modificada e ainda não se conseguiu a produção de uma cadeia de ADN substituída com quatro análogos de dNTP fluorescentes, diferentes. Ver Dapprich et al., "DNA Attachment to Optically Trapped Beads in Microstructures Monitored by Bead Displacement," Bioimaging 6: 25-32 (1998).

Adicionalmente, há pouca informação precisa acerca da relação 4 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ entre ο grau de marcação do ADN e a inibição da actividade de exonuclease. Ver Dõrre et al., "Techniques for Single Molecule Sequencing," Bioimaging 5: 139-152 (1997).

Numa segunda abordagem utilizando exonucleases, o ADN nativo é digerido ao mesmo tempo que é puxado através de uma pelicula de liquido fina, de modo a separar espacialmente os nucleótidos clivados. Ver Dapprich et al., "DNA Attachment to Optically Trapped Beads in Microstructures Monitored by Bead Displacement," Bioimaging 6: 25-33 (1998). Em seguida eles difundem-se ao longo de uma curta distância antes de ficarem imobilizados numa superfície, para detecção. No entanto, a maioria das exonucleases exibe taxas de clivagem dependentes da sequência e estrutura, resultando em dificuldades na análise de dados e correspondência de conjuntos de sequências parciais. Além disso, ainda será necessário desenvolver ou melhorar o modo de identificar as bases na superfície de detecção.

Independentemente do sistema de detecção, os métodos que utilizam exonucleases não foram desenvolvidos originando métodos que respondem à procura actual de uma sequenciação rápida, de elevada eficiência. Além disso, a maioria das exonucleases têm taxas de renovação relativamente lentas e os métodos propostos requerem um pré-tratamento extenso, marcação e imobilização subsequente do ADN molde na pérola na corrente de fluido, o que torna mais complicada a concretização num sistema de eficiência elevada, simples.

Foram tentadas outras abordagens mais directas para a sequenciação de ADN, tais como a determinação da sequência espacial de moléculas de ADN fixadas e alongadas por microscopia de força atómica de varrimento por sonda. Os problemas encontrados utilizando estes métodos consistem no espaçamento estreito das bases na molécula de ADN (apenas 0,34 nm) e nas suas pequenas diferenças físico-químicas a ser reconhecidas por estes métodos. Ver Hansma et al., "Reproducible Imaging and Dissection of Plasmid DNA Under

Liquid with the Atomic Force Microscope," Science 256: 1180- 1184 (1992). 5 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

Numa abordagem recente para micro-sequenciação utilizando polimerase, mas não exonuclease, um conjunto de moléculas de ADN de cadeia simples (ADNcs) idênticas está ligado a um substrato e a sequência é determinada repetindo uma série de reacções utilizando os dNTP marcados por fluorescência. Patente U.S. 5302509 de Cheeseman. No entanto, este método requer que cada base seja adicionada com um marcador fluorescente e grupos bloqueadores de 3'-dNTP. Após a base ser adicionada e detectada, o marcador fluorescente e o grupo bloqueador são removidos e, em seguida, a base seguinte é adicionada ao polimero. O documento WO 00/36152 descreve métodos de sequenciação que se baseiam na libertação de porções de pirofosfato marcadas por fluorescência [PPi] a partir de nucleósido-trifosfatos [NTP], à medida que é criado o produto da extensão pela polimerase.

Deste modo, os métodos de sequenciação actuais ou requerem ambas as actividades, de polimerase e exonuclease, para deduzir a sequência, ou baseiam-se apenas na polimerase com passos adicionais de adição e remoção de dNTP bloqueados a 3' . O projecto do genoma humano intensificou a procura de uma sequenciação de ADN rápida, em pequena e grande escala que irá permitir uma eficiência elevada, com material de partida mínimo. Também persiste a necessidade de proporcionar um método para uma sequenciação de moléculas de ácido nucleico que necessite apenas de actividade de polimerase, sem utilização de substituintes bloqueadores, resultando numa maior simplicidade, miniaturização mais fácil e compatibilidade com um processamento paralelo de uma técnica de passo único. A presente invenção tem por objectivo satisfazer as necessidades e ultrapassar as deficiências na especialidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de sequenciação de uma molécula de ácido nucleico que possui uma pluralidade de bases nucleotídicas, de acordo com o método da reivindicação 1. Este método envolve proporcionar um complexo 6 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ de uma enzima de polimerização de ácido nucleico e a molécula de ácido nucleico alvo orientadas em relação uma à outra numa posição adequada para adicionar um análogo de nucleótido num local activo complementar ao ácido nucleico alvo. São proporcionados uma pluralidade de tipos de análogos de nucleótido próximo do local activo, sendo cada tipo de análogo de nucleótido complementar a um nucleótido diferente na sequência de ácido nucleico alvo. Um análogo de nucleótido é polimerizado num local activo, em que o análogo de nucleótido adicionado é complementar ao nucleótido do ácido nucleico alvo, deixando o análogo de nucleótido adicionado pronto para a adição subsequente de análogos de nucleótido. 0 análogo de nucleótido adicionado no local activo como resultado do passo de polimerização é identificado. Os passos para proporcionar uma pluralidade de análogos de nucleótido, polimerização e identificação são repetidos, sendo assim determinada a sequência do ácido nucleico alvo.

Também se descreve um dispositivo adequado para a sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo. Este dispositivo inclui um suporte, bem como uma enzima de polimerização de ácido nucleico ou um iniciador oligonucleotidico, adequado para se ligar a uma molécula de ácido nucleico, estando a polimerase ou o iniciador oligonucleotidico posicionados no suporte. Uma microestrutura define uma região confinada contendo o suporte e a enzima de polimerização de ácido nucleico, ou o iniciador oligonucleotidico que é configurado para permitir que análogos de nucleótidos marcados que não estão posicionados no suporte se movam rapidamente através da região confinada.

Um dispositivo adequado para sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo inclui um suporte sólido e uma enzima de polimerização de ácido nucleico, ou um iniciador oligonucleotidico adequado para hibridar com uma molécula de ácido nucleico alvo, em que a enzima de polimerização do ácido nucleico ou o iniciador oligonucleotidico está posicionado no suporte. Um compartimento define uma região confinada contendo o suporte e a enzima de polimerização do ácido nucleico ou o iniciador oligonucleotidico. 0 compartimento é construido para facilitar a identificação de análogos de nucleótido marcados posicionados no suporte. As ondas guia ópticas próximas da 7 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ região confinada focam a radiação activadora na região confinada e recolhem radiação a partir da região confinada.

Conseguem-se numerosas vantagens com a presente invenção. A sequenciação pode ser realizada com pequenas quantidades de ácido nucleico, com capacidade de sequenciar moléculas molde de ácido nucleico individuais, o que elimina a necessidade de amplificação antes de iniciar a sequenciação. Podem-se deduzir comprimentos de leitura de sequência longos numa operação, eliminando a necessidade de métodos computacionais extensos para reunir uma sequência de comprimento total, sem hiatos, de moléculas molde longas (e.g., clones de cromossomas artificias bacterianos (BAC)). Para dois modos operacionais da presente invenção, o comprimento de leitura da sequência é limitado pelo comprimento do molde a sequenciar, ou pela capacidade de processamento ("processividade") da polimerase, respectivamente. Utilizando os sistemas enzimáticos adequados, e.g. com proteínas acessórias para iniciar a reacção de sequenciação em locais específicos (e.g., origens de replicação) no ácido nucleico molde de cadeia dupla, podem-se eliminar os passos preparativos necessários para técnicas de sequenciação convencionais, tais como subclonagem em vectores de sequenciação.

Além disso, o método de sequenciação da presente invenção pode ser realizado utilizando polimerase e nenhuma exonuclease. Isto resulta numa maior simplicidade, miniaturização mais fácil, e compatibilidade com um processamento paralelo de uma técnica de um único passo.

Em relação à última vantagem, algumas polimerases exibem uma maiores capacidade de processamento e velocidades catalíticas do que as exonucleases, sendo adicionadas mais de 10 000 bases antes da dissociação da enzima, no caso da ADN-polimerase de T7 (comparativamente com 3000 bases para a exonuclease λ). Nalguns casos, e.g., a ADN-polimerase de T7 complexada com helicase/primase de T7, os valores de capacidade de processamento são ainda mais elevados, na gama de vários 100 000. As taxas de síntese de ADN podem ser muito elevadas, medidas in vivo de 1000 bases/s e in vitro de 750 bases/s (em contraste com 12 bases/s degradadas pela exonuclease λ in vitro). Ver Kelman et al., "Processivity of 8 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ DNA Polymerases: Two Mechanisms, One Goal," Structure 6: 121-125 (1998); Cárter et al., "The Role of Exonuclease and Beta

Protein of Phage Lambda in Genetic Recombination II. Substrate Specificity and the Mode of Action of Lambda Exonuclesse," J. Biol. Chem. 246: 2502-2512 (1971); Tabor et al., "Escherichia coli Thioredoxin Confers Processivity on the DNA Polymerase Activity of the Gene 5 Protein of Bacteriophage T7," J. Biol. Chem. 262: 16212-16223 (1987); and Kovall et ai., "Toroidal Structure of Lambda-Exonuclease" Science 277: 1824-1827 (1997).

Uma taxa de incorporação de 750 bases/s é aproximadamente 150 vezes mais rápida do que a velocidade de sequenciação de um dos sequenciadores de ADN totalmente automatizados ABI PRISM 3700 da Perkin Elmer Corp., Foster City, Califórnia, proposto para ser utilizado numa estratégia de sequenciação por pistola para o genoma humano. Ver Venter et al., "Shotgun Sequencing of the Human Genome," Science 280:1540-1542 (1998). A pequena dimensão do aparelho que pode ser utilizado para realizar o método de sequenciação da presente invenção também é altamente vantajosa. A região confinada do complexo molde/polimerase pode ser proporcionada pelo dispositivo de microestrutura com a possibilidade de séries, que permitem um modo operacional altamente paralelo, com milhares de reacções de sequenciação realizadas sequencial, ou simultaneamente. Isto proporciona uma ferramenta rápida e ultra-sensivel para investigação, bem como para diagnóstico médico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-C mostram 3 concretizações alternativas para sequenciação de acordo com a presente invenção.

As Figuras 2A-C são desenhos esquemáticos que mostram a sucessão de passos utilizados para sequenciar ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

As Figuras 3A-C mostram gráficos de sinais de fluorescência vs. tempo durante a sucessão de passos utilizados para sequenciar o ácido nucleico de acordo com a 9 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ presente invenção. A Figura 3C mostra a sequência gerada por estes passos.

As Figuras 4A-D mostram a estrutura e desenhos esquemáticas que mostram a sucessão de passos utilizados para sequenciar o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, no caso em que se utilizam os nucleótidos fluorescentes que transportam o marcador na posição de fosfato gama (aqui mostrado como dNTP ligado a gama). A Figura 5 mostra o principio da discriminação de fluoróforos por medições do tempo de decaimento de fluorescência controlada pelo tempo, que podem ser utilizado para suprimir o sinal de ruido de fundo de acordo com a presente invenção. A Figura 6A mostra um sistema para sequenciação de acordo com a presente invenção. A Figura 6B é uma ampliação de uma porção deste sistema. A Figura 7A mostra um sistema para sequenciação de acordo com a presente invenção utilizando potenciação do campo electromagnético com pontas de metal. A Figura 7B é uma ampliação de uma porção desse sistema. A Figura 8A mostra um sistema para a sequenciação de acordo com a presente invenção utilizando aberturas de campo próximo. A Figura 8B é uma ampliação de uma porção desse sistema. A Figura 9A mostra um sistema para a sequenciação de acordo com a presente invenção, utilizando nanocanais. A Figura 9B é uma ampliação de uma porção desse sistema. A Figuras 10A-B mostram sistemas para fornecer reagentes a um sistema de confinamento nanofabricado de acordo com a presente invenção.

Em particular, a Figura 10A é uma figura esquemática que mostra como os reagentes são proporcionados e passados através do sistema. A Figura 10B é semelhante, mas mostra este sistema 10 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ num único chip com almofadas para ligar o sistema a reservatórios de fluido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo que possui uma pluralidade de bases nucleotidicas. Este método envolve proporcionar um complexo de uma enzima de polimerização de ácido nucleico e a molécula de ácido nucleico alvo orientadas uma em relação à outra numa posição adequada para adicionar um análogo de nucleótido num local activo complementar ao ácido nucleico alvo. São proporcionados uma pluralidade de tipos de análogos de nucleótido próximo do local activo, em que cada tipo de análogo de nucleótido é complementar a um nucleótido diferente na sequência de ácido nucleico alvo. Um análogo de nucleótido é polimerizado num local activo, sendo o análogo de nucleótido adicionado complementar ao nucleótido do ácido nucleico alvo, deixando o análogo de nucleótido adicionado pronto para a adição subsequente de análogos de nucleótido. O análogo de nucleótido adicionado no local activo como resultado do passo de polimerização é identificado. Os passos para proporcionar uma pluralidade de análogos de nucleótido, polimerização e identificação são repetidos de modo que a sequência do ácido nucleico alvo é determinada.

Um dispositivo adequado para sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo inclui um suporte, bem como uma enzima de polimerização do ácido nucleico ou um iniciador oligonucleotídico adequado para se ligar a uma molécula de ácido nucleico alvo, em que a polimerase ou o iniciador oligonucleotídico está posicionado no suporte. Uma microestrutura define uma região confinada contendo o suporte e a enzima de polimerização do ácido nucleico, ou o iniciador oligonucleotídico que é configurado para permitir que análogos de nucleótido marcados que não estão posicionados no suporte se movam rapidamente através da região confinada.

Outro dispositivo adequado para sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo inclui um suporte e uma enzima de polimerização de ácido nucleico ou um iniciador oligonucleotídico adequado para hibridar com uma molécula de 11 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ ácido nucleico alvo, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico ou o iniciador oligonucleotidico está posicionado no suporte. Um compartimento define uma região confinada contendo o suporte e a enzima de polimerização do ácido nucleico ou o iniciador oligonucleotidico. 0 compartimento é construído para facilitar a identificação de análogos de nucleótido marcados posicionados no suporte. As ondas guia ópticas próximas da região confinada focam a radiação activadora na região confinada e recolhem a radiação da região confinada. A presente invenção refere-se a um método para a sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo que possui uma pluralidade de bases. No seu princípio fundamental, a ordem temporal de adição de bases durante a reacção de polimerização é medida numa única molécula de ácido nucleico, i.e. a actividade de uma enzima de polimerização de ácido nucleico, daqui para a frente também designada como polimerase, na molécula de ácido nucleico molde a sequenciar é seguida em tempo real. A sequência é deduzida identificando qual a base que está a ser incorporada na cadeia complementar do ácido nucleico alvo em crescimento pela actividade catalítica da enzima de polimerização do ácido nucleico, em cada passo da sequência de adições de bases. Na concretização preferida da invenção, o reconhecimento da sequência temporal de adições de bases é feito detectando a fluorescência a partir de análogos de nucleótido marcados adequadamente, à medida que eles são incorporados na cadeia de ácido nucleico crescente. A precisão de emparelhamento de bases é proporcionada pela especificidade da enzima, com taxas de erro de emparelhamento de bases falsos de IO-5 ou menos. Sobre fidelidade enzimática, ver Johnson, "Conformational Coupling in DNA-Polymerase Fidelity," Ann. Rev. Biochem. 62:685-713 (1993) and Kunkel, "DNA-Replication Fidelity," J. Biol. Chem. 267:18251-18254 (1992). A invenção aplica-se igualmente à sequenciação de todos os tipos de ácidos nucleicos (ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN etc.) utilizando várias enzimas de polimerização (ADN-polimerases, ARN-polimerases, transcritase inversa, misturas, etc.) . Deste modo, os análogos de nucleótido adequados que actuam como moléculas de substrato para a enzima de polimerização de ácido nucleico podem consistir em membros dos 12 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ grupos de dNTP, NTP, dNTP ou NTP modificados, nucleótidos peptidicos, nucleótidos peptidicos modificados, ou nucleótidos de esqueleto de fosfato-açúcar modificados. Há dois modos operacionais convenientes de acordo com a presente invenção. No primeiro modo operacional da invenção, o ácido nucleico molde é ligado a um suporte. Isto pode ser ou por imobilização de (1) um iniciador oligonucleotidico, ou (2) uma molécula de ácido nucleico alvo de cadeia simples, ou (3) de cadeia dupla. Em seguida, ou (1) a molécula de ácido nucleico alvo é hibridada com o iniciador oligonucleotidico ligado, (2) um iniciador oligonucleotidico é hibridado com a molécula de ácido nucleico alvo imobilizada, para formar um complexo de molécula de ácido nucleico alvo com iniciador, ou (3) é criado um local de reconhecimento para a polimerase no molde de cadeia dupla (e.g., através da interacção com proteínas acessórias, tais como uma primase). Uma enzima de polimerização de ácido nucleico no complexo da molécula de ácido nucleico alvo com iniciador é proporcionada numa posição adequada para mover ao longo da molécula de ácido nucleico alvo e alongar o iniciador oligonucleotidico num local activo. São proporcionados uma pluralidade de tipos de análogos de nucleótido marcados que não têm um substituinte bloqueador, próximo do local activo, em que cada tipo de análogo de nucleótido distinguível é complementar a um nucleótido diferente na sequência de ácido nucleico alvo. 0 iniciador oligonucleotidico é alongado utilizando a enzima de polimerização de ácido nucleico para adicionar um análogo de nucleótido ao iniciador oligonucleotidico no local activo, sendo o análogo de nucleótido adicionado complementar ao nucleótido do ácido nucleico alvo, no local activo. 0 análogo de nucleótido adicionado ao iniciador oligonucleotidico como resultado do passo de alongamento é identificado. Se necessário, o análogo de nucleótido marcado que é adicionado ao iniciador oligonucleotidico é tratado antes de muitos outros análogos de nucleótido serem incorporados no iniciador oligonucleotidico, para assegurar que o análogo de nucleótido adicionado ao iniciador oligonucleotidico não impede a detecção de análogos de nucleótido na polimerização e passos de identificação subsequentes. Os passos para proporcionar análogos de nucleótido marcados, alongar o iniciador oligonucleotidico, identificar o análogo de nucleótido 13 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ adicionado e tratar o análogo de nucleótido são repetidos de modo a que o iniciador oligonucleotídico seja mais alongado e a sequência de ácido nucleico alvo é determinada.

Alternativamente, o procedimento acima descrito pode ser realizado ligando primeiro a enzima de polimerização do ácido nucleico a um suporte, numa posição adequada para que o complexo da molécula de ácido nucleico alvo se mova em relação à enzima de polimerização do ácido nucleico de modo que o complexo molecular de ácido nucleico com iniciador é alongado num local activo. Nesta concretização, adicionam-se uma pluralidade de análogos de nucleótido marcados, complementares ao nucleótido do ácido nucleico alvo no local activo, à medida que o complexo de ácido nucleico alvo com iniciador se move ao longo da enzima de polimerização de ácido nucleico. Os passos para proporcionar análogos de nucleótido, alongar o iniciador, identificar o análogo de nucleótido adicionado e tratar o análogo de nucleótido durante ou após a incorporação, são repetidos, como descrito acima, de modo que o iniciador oligonucleotídico é mais alongado e a sequência de ácido nucleico alvo é determinada.

As Figuras 1A-C mostram 3 concretizações alternativas para sequenciação de acordo com a presente invenção. Na Figura IA, um iniciador de sequenciação é ligado a um suporte, e.g. por uma ligação de biotina-estreptavidina, estando o iniciador hibridado com a molécula de ácido nucleico alvo e a enzima de polimerização de ácido nucleico ligada à molécula de ácido nucleico hibridada, no local activo em que os análogos de nucleótido estão a ser adicionados ao iniciador de sequenciação. Na Figura 1B, a molécula de ácido nucleico alvo está ligada a um suporte, estando o iniciador de sequenciação hibridado com a molécula de ácido nucleico molde e a enzima de polimerização do ácido nucleico ligada à molécula de ácido nucleico hibridada, no local activo em que os análogos de nucleótido estão a ser adicionados ao iniciador de sequenciação. 0 iniciador pode ser adicionado antes ou durante o fornecimento dos análogos de nucleótido. Além destes cenários, pode-se ligar a um suporte uma molécula de ácido nucleico alvo de cadeia dupla, em que a molécula de ácido nucleico alvo contém um local de reconhecimento para a ligação da enzima de polimerização do ácido nucleico num local activo 14 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ em que os análogos de nucleótido estão a ser adicionados ao iniciador. Por exemplo, este local de reconhecimento pode ser estabelecido com a ajuda de uma proteína acessória, tal como uma ARN-polimerase ou uma helicase/primase, que irá sintetizar um iniciador curto em locais específicos no ácido nucleico alvo, proporcionando assim um local de partida para a enzima de polimerização do ácido nucleico. Ver Richardson "Bacteriophage T7: Minimal Requirement for the Replication of a Duplex DNA Molecule," Cell 33: 315-317 (1983). Na Figura 1C, a enzima de polimerização do ácido nucleico está ligada a um suporte, estando a molécula de ácido nucleico alvo com iniciador ligada no local activo em que os análogos de nucleótido estão a ser adicionados ao iniciador de sequenciação. Tal como na descrição anterior, a enzima de polimerização de ácido nucleico pode igualmente estar ligada a um suporte, mas sendo a molécula de ácido nucleico alvo um ácido nucleico de cadeia dupla, contendo um local de reconhecimento para a ligação da enzima de polimerização de ácido nucleico num local activo em que os análogos de nucleótido estão a ser adicionados à cadeia de ácido nucleico crescente. Embora as Figuras 1A-C mostrem apenas uma reacção de sequenciação a ser realizada no suporte, é possível realizar um conjunto de várias destas reacções em locais diferentes, num único suporte. Nesta concretização alternativa, cada iniciador de sequenciação, ácido nucleico alvo ou enzima de polimerização de ácido nucleico a imobilizar neste suporte sólido é colocado nessa superfície por impressão por microcontacto ou estampagem e.g., como é utilizado para tecnologia de micro-séries (microarray) de chips de ADN, ou formando uma série de locais de ligação, tratando a superfície do suporte sólido. Também se pode conceber combinar as concretizações descritas na Figura 1 e imobilizar quer a molécula de ácido nucleico alvo, quer a enzima de polimerização de ácido nucleico próximas uma da outra. 0 processo de sequenciação da presente invenção pode ser utilizado para determinar a sequência de qualquer molécula de ácido nucleico, incluindo ADN de cadeia dupla ou cadeia simples, estruturas em forma de gancho de ADN de cadeia simples, híbridos de ADN/ARN, ARN com o local de reconhecimento para ligação da polimerase ou estruturas em forma de gancho de ARN. 15 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ Ο iniciador de sequenciação utilizado para realizar o processo da presente invenção pode ser um ribonucleótido, um desoxirribonucleótido, um ribonucleótido modificado, um desoxirribonucleótido modificado, um ácido nucleico peptidico, um ácido nucleico peptidico modificado, um oligonucleótido de esqueleto fosfato-açúcar modificado e outros análogos de nucleótido e oligonucleótido. Pode ser sintético ou produzido naturalmente por primases, ARN-polimerases, ou outras enzimas de sintese de oligonucleótidos. A enzima de polimerização de ácido nucleico utilizada de acordo com a presente invenção pode ser ou uma polimerase termoestável, ou uma polimerase degradável pelo calor. Exemplos de polimerases termoestáveis adequadas incluem polimerases isoladas de Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis, and Thermotoga marítima. Polimerases termodegradáveis úteis incluem ADN-polimerase de E. coli, o fragmento Klenow de ADN-polimerase de E. coli, ADN-polimerase de T4, ADN-polimerase de T7 e outros. Exemplos de outras enzimas de polimerização que podem ser utilizadas para determinar a sequência de moléculas de ácido nucleico incluem ARN-polimerases de E. coli, T7, T3, SP6 e transcritases inversas de AMV, M-MLV e VIH. A polimerase pode ser ligada à sequência de ácido nucleico alvo com iniciador num ácido nucleico de cadeia simples com iniciador, uma origem de replicação, um corte ou hiato num ácido nucleico de cadeia dupla, uma estrutura secundária num ácido nucleico de cadeia simples, um local de ligação criado por uma proteína acessória, ou um ácido nucleico de cadeia simples com iniciador.

Os materiais que são úteis para formar o suporte incluem vidro, vidro com modificações na superfície, silício, metais, semicondutores, dieléctricos de índice de refracção elevado, cristais, géis e polímeros.

Nas concretizações da Figura 1, qualquer parceiro de ligação adequado conhecido dos peritos na especialidade pode ser utilizado para imobilizar quer o iniciador de sequenciação, a molécula de ácido nucleico alvo, ou a enzima de polimerização de ácido nucleico, no suporte. A ligação não 16 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ específica por adsorção também é possível. Como se mostra nas Figuras 1A-C, uma ligação biotina-estreptavidina é adequada para ligar o iniciador de sequenciação ou a molécula de ácido nucleico alvo ao suporte sólido. 0 componente de biotina desta ligação pode ser ligado quer ao iniciador, quer ao ácido nucleico, quer ao suporte sólido com a estreptavidina (ou qualquer outra proteína de ligação a biotina) sendo ligado à entidade oposta.

Uma abordagem para realizar esta técnica de ligação envolve ligar PHOTOACTIVATABLE BIOTIN™ ("PAB") (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) a uma superfície da câmara utilizada para realizar o procedimento de sequenciação da presente invenção. Isto pode ser conseguido por exposição a luz a 360 nm, de preferência através de uma parede transparente da câmara, como descrito em Hengsakul et al., "Protein Patterning with a Photoactivable Derivative of Biotin," Bioconjugate Chem. 7: 249-54 (1996). Quando se utiliza uma nanocâmara, a biotina é activada num ponto limitado por difracção, sob um microscópio óptico. Com excitação de campo próximo, a exposição pode ser auto-alinhada utilizando uma onda guia para dirigir luz para a área desejada. Quando exposto a luz, o PAB é activado e liga-se de forma covalente à superfície interior do canal. O PAB não ligado em excesso é então removido lavando com água.

Alternativamente, pode-se utilizar estreptavidina para revestir a superfície de suporte. O oligonucleótido iniciador de ácido nucleico adequado ou o molde de ácido nucleico de cadeia simples é em seguida biotinilado, criando um complexo iniciador de ácido nucleico imobilizado-molécula alvo, devido ao iniciador ligado a estreptavidina-biotina.

Outra abordagem para realizar o processo da presente invenção é utilizar ácidos nucleicos complementares para ligar o iniciador de sequenciação ou a molécula de ácido nucleico alvo ao suporte sólido. Isto pode ser realizado modificando um ácido nucleico de cadeia simples com uma sequência de comando e ligando a sequência de comando conhecida ao iniciador de sequenciação, ou a molécula de ácido nucleico alvo. O oligonucleótido resultante pode então ser ligado por hibridação a um oligonucleótido ligado ao suporte e tendo uma 17 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ sequência de nucleótidos complementar à da sequência de comando conhecida. Alternativamente, um segundo oligonucleótido pode ser hibridado a uma extremidade da molécula de ácido nucleico oposta à que está ligada ao iniciador oligonucleotídico. Este segundo oligonucleótido está disponível para hibridação com uma sequência nucleica complementar ligada ao suporte. A ligação reversível ou irreversível entre o suporte e, ou o iniciador oligonucleotídico, ou a sequência de ácido nucleico alvo pode ser conseguida com os componentes de qualquer par de ligação covalente ou não covalente.

Outra destas abordagens para imobilizar o iniciador de sequenciação ou a molécula de ácido nucleico alvo ao suporte inclui um par de ligação anticorpo-antigénio e moléculas de acoplamento fotoactivadas.

Na concretização da Figura 1C, pode-se utilizar qualquer técnica conhecida como útil para imobilizar de forma reversível ou irreversível materiais proteicos. Foi referido na literatura que a ADN-polimerase foi imobilizada com sucesso em superfícies activadas, sem perda de actividade catalítica. Ver Yin et al., "Transcription. Against an Applied Force," Science 270:1653-1657(1995).

Alternativamente, a proteína pode ser ligada a um anticorpo, que não interfere com a sua actividade catalítica, isto foi descrito para a transcritase inversa de VIH. Ver Lennerstrand et al.. "A Method for Combined Immunoaffinity Purification and Assay of HIV-1 Reverse Transcriptase Activity Useful for Crude Samples," Anal. Biochem. 235:141-152 (1996).

Deste modo, as enzimas de polimerização de ácido nucleico podem ser imobilizadas sem perda de função. Os anticorpos e outras proteínas podem ser ligados em superfícies inorgânicas. Ver James et al., "Patterned Protein Layers on Solid Substrates by Thin Stamp Microcontact Printing." Langmuir 14:741-744 (1998) and St John et al., "Diffraction-Based Cell Detection Using a Microcontact Printed Antibody Grating," Anal. Chem. 70:1108-1111 (1998). 18 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

Alternativamente, a proteína pode ser biotinilada (ou marcada de forma semelhante com outras moléculas de ligação) e em seguida ligada a uma superfície de suporte revestida com estreptavidina.

Em qualquer das concretizações das Figuras IA a C, o parceiro de ligação e, quer a polimerase, quer os ácidos nucleicos que imobilizam podem ser aplicados no suporte por técnicas químicas e fotolitográficas convencionais que são bem conhecidas na arte. Em geral, estes procedimentos podem envolver modificações químicas, convencionais de superfície do suporte, incubação do suporte a diferentes temperaturas em diferentes meios e passos subsequentes possíveis de lavagem e incubação da superfície de suporte com as respectivas moléculas. São concebíveis possibilidades alternativas de posicionamento do complexo de polimerização, tal como inserir o complexo num gel com poros demasiado pequenos para permitir a passagem do complexo, mas suficientemente grandes para permitir o fornecimento dos análogos de nucleótido. Meios adequados incluem géis de agarose, géis de poliacrilamida, materiais porosos sintéticos ou nanoestruturas. 0 procedimento de sequenciação da presente invenção pode ser iniciado por adição da enzima de polimerização do ácido nucleico à mistura reaccional na concretização das Figuras 1A-B. Para a concretização da Figura 1C, o ácido nucleico com iniciador pode ser adicionado para iniciação. Podem-se utilizar outros cenários para iniciação, tal como estabelecer um complexo ácido nucleico-polimerase pré-formado na ausência de iões metálicos bivalentes que são parte integrante dos locais activos da polimerase (normalmente Mg2+) . A reacção de sequenciação pode ser iniciada adicionando estes iões metálicos. 0 complexo de pré-iniciação do molde também pode ser formado com a enzima na ausência de nucleótidos, sendo os análogos de nucleótido fluorescentes adicionados para iniciar a reacção. Ver Huber et al., "Escherichia coli Thioredoxin Stabilizes Complexes of Bacteriophage T7 DNA Polymerase and Primed Templates," J-Biol.Chem. 262:16224-16232 (1987).

Alternativamente, o processo pode ser iniciado libertando um grupo no iniciador oligonucleotídico que o protege de ligação 19 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ à enzima de polimerização do ácido nucleico. A iluminação por feixe de luz laser irá então dar inicio à reacção de forma coincidente com o ponto de partida da observação.

As Figuras 2A-C são desenhos esquemáticos que mostram a sucessão de passos utilizados para sequenciar os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

Na Figura 2A, os análogos de nucleótido marcados estão presentes na proximidade do complexo de uma enzima de polimerização de ácido nucleico com iniciador, ligada ao iniciador de sequenciação hibridado e molécula de ácido nucleico alvo que estão ligados no suporte sólido. Durante esta fase do processo de sequenciação, os análogos de nucleótido marcados difundem-se ou são forçados a fluir através do meio de alongamento em direcção e em torno do complexo com iniciador.

De acordo com a Figura 2B, quando um análogo de nucleótido alcança o local activo do complexo com iniciador, ele liga-se a este e as enzimas de polimerização de ácido nucleico estabelecem se este análogo de nucleótido é ou não complementar à primeira base aberta da molécula de ácido nucleico alvo, ou se representa uma não correspondência. A base não correspondente será rejeitada com a probabilidade elevada que corresponde à fidelidade elevada da enzima, acima referida, enquanto que o análogo de nucleótido complementar é polimerizado com o iniciador de sequenciação para alongar o iniciador de sequenciação.

Durante ou após a adição de cada análogo de nucleótido marcado ao iniciador de sequenciação, o análogo de nucleótido adicionado ao iniciador de sequenciação é identificado. Isto é conseguido de forma particularmente eficaz dando a cada análogo de nucleótido um marcador diferente, distinguível. Detectando quais dos diferentes marcadores são adicionados ao iniciador de sequenciação, o análogo de nucleótido correspondente adicionado ao iniciador de sequenciação pode ser identificado e, devido à sua natureza complementar, a base do ácido nucleico alvo que o análogo de nucleótido complementa pode ser determinada. Uma vez conseguido isto, deixa de ser necessário que o análogo de nucleótido que foi adicionado ao 20 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ iniciador de sequenciação retenha o seu marcador. De facto, a presença continuada de marcadores nas bases de complementação de análogos de nucleótido no ácido nucleico alvo que já foi sequenciado iriam provavelmente interferir com a detecçao de análogos de nucleótido subsequentemente adicionados ao iniciador. Deste modo, os marcadores adicionados ao iniciador de sequenciação são removidos após terem sido detectados, como se mostra na Figura 2C. Isto ocorre de preferência antes de outros análogos de nucleótido serem incorporados no iniciador oligonucleotídico.

Repetindo a sequência de passos descrita nas Figuras 2A-C, o iniciador de sequenciação é alongado e, como resultado, toda a sequência do ácido nucleico alvo pode ser determinada. Embora a concretização de imobilização apresentada nas Figuras 2A-C seja a apresentada na Figura IA, as concretizações de imobilização alternativas apresentadas nas Figuras 1B-C também podem ser igualmente utilizadas, realizando a sucessão de passos apresentada nas Figuras 2A-C.

Ao realizar os passos de difusão, incorporação e remoção das Figuras 2A-C, utiliza-se um meio de alongamento contendo os componentes adequados para permitir que os análogos de nucleótido sejam adicionados ao iniciador de sequenciação. Os meios de alongamento adequados incluem, e.g., uma solução contendo Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl2 25 mM, NaCl 65 mM, DTT 3 mM, (esta é a composição do meio de alongamento recomendada pelo fabricante da Sequenase, uma ADN-polimerase de T7 mutante), e análogos de nucleótido numa concentração adequada para permitir a identificação da sequência. São possíveis outros meios adequados para este fim e outras polimerases, com ou sem proteínas acessórias, tais como proteínas de ligação de cadeia simples. De preferência, a fase de alongamento é realizada a 37°C para a maioria das polimerases degradáveis pelo calor, embora se possam utilizar outras temperaturas a que a polimerase é activa.

Uma vez adicionado um análogo de nucleótido marcado ao iniciador de sequenciação, como referido acima, o marcador particular da porção adicionada deve ser identificado de modo a determinar qual o tipo de análogo de nucleótido que foi adicionado ao iniciador de sequenciação e, como resultado, 21 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ qual a base complementar do ácido nucleico. 0 modo como o marcador da entidade adicionada é determinado depende do tipo de marcador utilizado. Para a concretização da invenção preferida, a discussão dos passos de identificação será restrita à utilização de análogos de nucleótido que têm porções fluorescentes. No entanto, outros marcadores adequados incluem cromóforos, enzimas, antigénios, metais pesados, sondas magnéticas, corantes, grupos fosforescentes, materiais radioactivos, porções quimiluminescentes, nanoparticulas de dispersão ou fluorescentes, porções geradoras de sinal de Raman e porções de detecção electroquimica. Estes marcadores são conhecidos na arte e estão descritos por exemplo em Prober, et. al. , Science 238: 336-41 (1997); Connell et. al., BioTechniques 5(4): 342-84 (1987); Ansorge, et. al., Nucleic Acids Res. 15(11): 4593- 602 (1987); e Smith et. al., Nature 321:674 (1986).

Nalguns casos, tal como para cromóforos, fluoróforos, marcadores fluorescentes, nanoparticulas ou grupos de sinalização de Raman, é necessário submeter o local de reacção a uma radiação activadora, de modo a detectar o marcador. Este procedimento será discutido em detalhe a seguir, para o caso de marcadores fluorescentes. As técnicas adequadas para detectar o marcador fluorescente incluem microespectroscopia de campo distante resolvida no tempo, microespectroscopia de campo próximo, medição da transferência de energia de ressonância fluorescente, fotoconversão e medição de tempos de vida de fluorescência. A identificação de fluoróforos pode ser conseguida por discriminação de comprimento de onda espectral, medição e separação de tempos de vida de fluorescência, identificação de fluoróforos e/ou supressão de ruido de fundo. A identificação de fluoróforos e/ou supressão de ruido de fundo pode ser facilitada por uma troca rápida entre os modos de excitação e fontes de iluminação e suas combinações. sinais de de passos realizar o invenção. nucleótido

As Figuras 3A-B mostram gráficos de fluorescência vs. tempo, durante a sucessão (descritos na Figura 2) que é utilizada para procedimento de sequenciação da presente

Basicamente, neste procedimento um análogo de incorporado será distinguido dos não incorporados (que se difundem aleatoriamente através do volume de observação ou são 22 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ transferidos através deste por um fluxo hidrodinâmico ou electroforético) por análise da curva temporal de fluorescência, para cada marcador distinguível, simultaneamente. Isto é conseguido por registo de pulsos de fotões e espectroscopia de correlação de fluorescência resolvida no tempo, que distingue a fluorescência estável continua do marcador incorporado (até ser removida pelos mecanismos discutidos a seguir), da emissão intermitente dos fluoróforos livres. Ver Magde et al. "Thermodynamic

Fluctuations in a Reacting System- Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy," Phys. Rev. Lett. 29:705-708 (1972), Kask. P. et al., "Fluorescence-Intensity Distribution Analysis and its Application in Biomolocular Detection Technology," Proc.Nat.Acad.Sei. U.S.A. 96: 13756-13761 (1999), e Eggeling et al., "Monitoring Conformational Dynamics of a Single Molecule by Selective Fluorescence Spectroscopy, Proc. Nat. Acad Sei. U.S.A. 95: 1556-1561 (1998). A sequência pode ser deduzida combinando as curvas de tempo de todos os canais de detecção. A Figura 3A mostra um gráfico de sinal de fluorescência vs. tempo durante apenas a fase de difusão da Figura 2A, assumindo quatro canais diferentes de detecção de fluorescência para as quatro bases diferentes (e.g., utilizando quatro marcadores diferentes, cada um com um espectro de emissão de fluorescência diferente, pelos quais podem ser separados através de filtros ópticos). Cada pico na Figura 3A representa o pico de fluorescência que resulta da presença de um análogo de nucleótido no volume de observação, sendo cada nucleótido diferente distinguido pelo seu marcador diferente que gera picos de diferentes cores (apresentado na Figura 3A por diferente padrões de linhas). A largura estreita destes picos indica que os análogos de nucleótido têm um tempo de residência curto próximo do local activo de sequenciação, por se difundirem ou fluirem livremente através do volume de observação. É esperado um pico de largura semelhante para o caso de um análogo de nucleótido não correspondente se ligar de forma transitória ao local activo da enzima de polimerização de ácido nucleico e subsequente rejeição da incorporação pela enzima. 23 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ A Figure 3Β mostra um gráfico de sinal de fluorescência vs. tempo durante a incorporação e fases de remoção subsequentes das Figura 2B-C. Tal como na Figura 3A, cada pico da Figura 3B representa a presença de um análogo de nucleótido, sendo cada análogo de nucleótido diferente distinguido pelos seus marcadores diferentes que geram picos de diferentes cores (apresentado na Figura 3B por diferentes padrões de linhas). A largura estreita de alguns picos na Figura 3B mais uma vez relaciona-se com os análogos de nucleótido que permanecem móveis no seio do meio de alongamento e não alongam o iniciador de sequenciação. Estes picos estreitos resultam de os análogos de nucleótido terem um tempo de residência curto, próximo do local activo de sequenciação, como explicado para a Figura 3A. Por outro lado, os picos mais largos correspondem a análogos de nucleótido que têm, no local activo, bases complementares na molécula de ácido nucleico molde e servem para alongar o iniciador de sequenciação. Como resultado da sua imobilização, estes análogos de nucleótido têm picos mais largos, pois permanecem no volume de observação durante e após a incorporação na cadeia de ácido nucleico crescente e, assim, continuam a emitir fluorescência. 0 seu sinal apenas termina mais tarde, como resultado do passo de remoção subsequente que elimina a fluorescência continuada e permite a identificação de fenómenos de incorporação subsequentes.

Movendo da esquerda para a direita na Figura 3B (i.e. mais tarde no tempo), a sequência dos picos mais largos corresponde ao complemento da sequência da molécula de ácido nucleico molde. A Figura 3C mostra o resultado final da

Figura 3B que pode ser conseguido, por exemplo, por um programa de computador que detecta os pulsos curtos de fluorescência e os despreza no resultado final. Como resultado desta filtração, apenas estão presentes os picos gerados por análogos de nucleótido imobilizados, e convertidos em sequências correspondentes ao complemento da sequência da molécula de ácido nucleico molde. Esta sequência complementar é aqui ATACTA, portanto a ordem das bases da molécula de ácido nucleico molde a sequenciar é TATGAT.

Os marcadores fluorescentes podem ser ligados aos nucleótidos numa variedade de locais. A ligação pode ser feita 24 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ quer com, quer sem um ligante de ponte ao nucleótido. Os análogos convencionalmente utilizados para marcar ácidos nucleicos com fluoróforos têm a porção fluorescente ligada à base da molécula de substrato de nucleótido. No entanto, também se pode ligar a uma porção de açúcar (e.g., desoxirribose) ou ao fosfato alfa. A ligação ao fosfato alfa poderá revelar-se vantajosa, pois este tipo de ligação deixa a estrutura interna do ácido nucleico intacta, tendo-se no entanto verificado que os fluoróforos ligados à base destorcem a dupla hélice da molécula sintetizada e subsequentemente inibem uma posterior actividade de polimerase. Ver Zhu et al., "Directly Labelled DNA Probes Using Fluorescent Nucleotides with Different Length Linkers," Nucleic Acids Res. 22: 3418-3422 (1994), e Doublie et al., "Crystal Structure of a Bacteriophage T7 DNA Replication Complex at 22 Ângstrom Resolution," Nature 391:251-258 (1998).

Deste modo, os nucleótidos contendo um grupo tiol que foram utilizados (na forma de NTP) para estudos de reticulação, com ARN-polimerase, poderão servir como moléculas esqueleto primárias para a ligação de ligantes adequados e marcadores fluorescentes. Ver Hanna et al., "Synthesis and Characterization of a New Photo-Cross-Linking CTP Analog and Its Use in Photoaffinity-Labeling Escherichia-coli and T7-RNA Polymerases." Nucleic Acids Res. 21:2073,2079 (1993).

No caso convencional em que o fluoróforo é ligado à base do nucleótido, está tipicamente equipado com fluoróforos de um tamanho relativamente grande, tal como fluoresceina. No entanto, fluoróforos mais pequenos, e.g., pireno ou corantes da família da cumarina, poderão revelar-se vantajosos em termos de serem tolerados numa maior extensão, do que as polimerases. De facto, é possível sintetizar um fragmento de ADN de 7300 pares de bases de comprimento em que um tipo de base é totalmente substituído pelo dNTP marcado com cumarina, correspondente, utilizando ADN-polimerase de T7, enquanto que a enzima não é capaz de realizar a síntese correspondente utilizando dNTP marcados com fluoresceina.

Em todos estes casos, o fluoróforo permanece ligado à parte da molécula de substrato que é incorporada na molécula de ácido nucleico em crescimento, durante a síntese. Meios 25 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ adequados para remoção do fluoróforo após este ter sido detectado e identificado de acordo com o esquema de sequenciação da presente invenção, incluem fotolixiviação do fluoróforo ou clivagem fotoquimica do nucleótido e do fluoróforo, e.g., clivagem de uma ligação quimica no ligante. A remoção do marcador fluorescente dos nucleótidos já incorporados, cuja velocidade pode ser ajustada pela potência laser, impede a acumulação do sinal na cadeia de ácido nucleico, maximizando desse modo a razão entre o sinal e o ruído de fundo, para identificação do nucleótido. Para este esquema, o objectivo da presente invenção é detectar todos os fotões de cada marcador e em seguida fotolixiviar ou clivar fotoquimicamente antes, ou pouco depois dos próximos nucleótidos serem incorporados, de modo a manter valores de sinal e ruído de fundo adequados para passos de identificação subsequentes. A fase de remoção do processo da presente invenção pode ser realizada por qualquer procedimento adequado para remover um marcador sem danificar o complexo da reacção de sequenciação.

Além dos marcadores de fluorescência que permanecem no ácido nucleico durante a síntese, os nucleótidos que são marcados com fluorescência ou de outro modo e que possuem o marcador ligado ou ao fosfato beta, ou gama do nucleótido, também podem ser utilizados no procedimento de sequenciação da presente invenção. Foram anteriormente sintetizados compostos análogos na forma de análogos de NTP e verificou-se que eram substratos excelentes para uma variedade de enzimas, incluindo ARN-polimerases. Ver Yarbrough et al., "Synthesis and

Properties of Fluorescent Nucleotide Substrates for DNA-dependent RNA Polymerase," Journal of Biological Chemistry 254:12069-12073 (1979), e Chatterji et al., "Fluorescence

Spectroscopy Analysis of Active and Regulatory Sites of RNA Polymerase," Methods in Enzymology 274: 456-479 (1996).

Durante a síntese de ADN, a clivagem de ligações no nucleótido ocorre entre o fosfato alfa e beta, fazendo com que os fosfatos beta e gama se libertem do local activo, após polimerização e o pirofosfato formado subsequentemente difunde-se ou é transferido para longe do ácido nucleico. De acordo com a presente invenção, é possível distinguir o fenómeno de ligação de um nucleótido e a sua incorporação no 26 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ ácido nucleico, de fenómenos que apenas envolvam a ligação (e subsequente rejeição) de um nucleótido não correspondente, pois as constantes de velocidade destes dois fenómenos são drasticamente diferentes. 0 passo limitante de velocidade nos passos elementares sucessivos de polimerização de ADN é uma alteração conformacional da polimerase que pode apenas ocorrer após a enzima ter estabelecido que o nucleótido correcto (correspondente) está ligado ao local activo. Deste modo, um fenómeno de uma ligação não correspondente de um análogo de nucleótido será muito mais curto do que o fenómeno de incorporação da base correcta. Ver Patel et al., "Pre-Steady-State Kinetic Analysis of Processive DNA Replication Including Complete Characterization of an Exonuclease-Deficient Mutant," Biochemistry 30: 511-525 (1991) e Wong et al., "An Induced-Fit Kinetic Mechanism for DNA Replication Fidelity: Direct Measurement by Single-Turnover Kinetics," Biochemistry 30: 511-525 (1991) . Como resultado, a fluorescência do marcador que é ligado ao fosfato gama ou beta do análogo de nucleótido permanece próximo da polimerase durante um tempo maior no caso do análogo de nucleótidos ser polimerizado e pode ser distinguido de acordo com o esquema descrito acima para a Figura 3. Após incorporação, o marcador irá difundir-se para longe do pirofosfato clivado. Este procedimento é apresentado na Figura 4. A Figura 4A mostra a estrutura do 1-aminonaftaleno-5-sulfonato (AmNS)-dUTP, um exemplo representativo de um análogo de nucleótido que tem um marcador fluorescente ligado ao fosfato gama, com a posição de clivagem indicada pela linha a tracejado. A Figura 4B-D mostra os passos sucessivos de incorporação e libertação do complexo pirofosfato-fluoróforo, em analogia com a Figura 2. A curva no tempo de fluorescência para este esquema será a mesma que é apresentada na Figura 3. Assim, este é um esquema alternativo ao descrito acima, em que o fluoróforo é primeiro incorporado no ácido nucleico e o sinal é subsequentemente eliminado por fotolixiviação ou clivagem fotoquimica, após identificação do marcador. A identificação do análogo de nucleótido marcado por fluorescência, particular, que é incorporado contra o ruido de fundo dos nucleótidos não incorporados que se difundem ou fluem próximo da enzima de polimerização de ácidos nucleicos pode ser ainda melhorada, utilizando o facto de para 27 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ determinados dNTP marcados por fluorescência (e.g., cumarina-5-dGTP, ou AmNS-UTP) , a presença da base na forma de uma ligação covalente reduzir significativamente (i.e., neutralizar) a fluorescência do marcador. Ver Dhar et al., "Synthesis and Characterization of Stacked and Quenched Uridine Nucleotide Fluorophores," Journal of Biological Chemistry 274: 14568-14572 (1999), e Draganescu et al., "Fhit-Nucleotide Specificity Probed with Novel Fluorescent and Fluorogenic Substrates," Journal of Biological Chemistry 275: 4555-4560 (2000). A interacção entre o fluoróforo e a base neutraliza a fluorescência, de modo que a molécula não é muito fluorescente em solução por si própria. No entanto, quando um nucleótido fluorescente deste tipo é incorporado no ácido nucleico, o fluoróforo fica desligado do nucleótido e a fluorescência não é mais neutralizada. Para o caso de uma ligação ao fosfato beta ou gama do nucleótido, isto ocorre naturalmente através da actividade enzimática da polimerase, no caso de fluoróforos ligados à base, isto terá que ser realizado por clivagem fotoquimica. O sinal de fluorescência do fluoróforo clivado é muito mais brilhante e pode ser detectado sobre o possivel ruido de fundo da variedade de moléculas neutralizadas na vizinhança do complexo polimerase/ácido nucleico.

Além disso, uma vez que o tempo de vida de fluorescência das moléculas neutralizadas que se difundem na solução é muito mais curto do que o tempo de vida da molécula clivada, pode-se conseguir uma razão entre sinal e ruido de fundo ainda melhor, utilizando iluminação pulsada e detecção de fotões controlada por tempo. Isto está ilustrado na Figura 5, que mostra curvas de decaimento de fluorescência resolvida no tempo para cumarina isolada e cumarina-dGTP, respectivamente. Uma vez que a fluorescência da cumarina é neutralizada por ligação covalente a dGTP, o tempo de vida é muito mais curto do que para o corante livre isolado, o que significa que, em média, os fotões de fluorescência são emitidos muito mais cedo após um pulso de excitação, e.g., fornecido por um laser pulsado. Eliminando este intervalo de tempo imediatamente após o pulso de detecção, que pode ser conseguido, por exemplo, com uma componente de linha de atraso variável (indicado pela barra com riscas com tempo de atraso ajustável de largura T) , a janela de resposta do detector pode ser controlada de modo a 28 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ que apenas seja detectada a fluorescência emitida a partir do componente de decaimento lento, neste caso o corante livre (ou, em termos do esquema de sequenciação, o fluoróforo clivado), e deste modo o ruído de fundo de moléculas não incorporadas é ainda mais reduzido. Saavedra et al., "Time-Resolved Fluorimetric Detection of Terbium-Labelled Deoxyribonucleic Acid Separated by Gel Electrophoresis," Analyst 114:835-838 (1989).

Os nucleótidos também podem ser convertidos em fluoróforos por reacções fotoquímicas envolvendo a formação de radicais. Esta técnica foi utilizada com serotonina e outras moléculas biologicamente relevantes. Ver Shear et al., "Multiphoton-Excited Visible Emission by Serotonin Solutions," Photochem. Photobiol. 65:931-936 (1997). A situação fotofísica ideal seria ter cada nucleótido a gerar o seu próprio sinal de fluorescência. Infelizmente, o ácido nucleico e os nucleótidos individuais são fluoróforos fracos que emitem fracamente, com eficiências quânticas minúsculas e apenas com iluminação com luz ultravioleta profunda. No entanto, a serotonina fluorófora ultravioleta nativa (5HT) pode ser fotoionizada por absorção simultânea de 4 fotões de infravermelho, para formar um radical que reage com outras moléculas de estado fundamental, para formar um complexo que emite fluorescência verde claro, por absorção de mais 2 fotões. As observações subsequentes mostraram que muitas moléculas orgânicas pequenas podem sofrer esta conversão de multifotões. A neutralização de fluoróforos por componentes de ácido nucleico e pelos fluoróforos vizinhos, conhecida, bem como a transferência de energia de ressonância podem proporcionar marcadores tolerados pela polimerase. Furey et al., "Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer to Investigate the Conformation of DNA Substrates Bound to the Klenow Fragment," Biochemistry 37:2979-2990 (1998) e Glazer et al., "Energy-

Transfer Fluorescent Reagents for DNA Analyses," Curr. Op. Biotechn. 8:94-102 (1997).

Na concretização mais eficiente da presente invenção, cada base deve ser distinguida pelo seu próprio marcador, de 29 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ modo que a sequência possa ser deduzida a partir do resultado combinado de quatro canais diferentes, como ilustrado na Figura 3C. Isto pode, por exemplo, ser conseguido utilizando diferentes fluoróforos como marcadores e quatro canais de detecção diferentes, separados por filtros ópticos. Também é possivel distinguir os marcadores por parâmetros que não a banda do comprimento de onda de emissão, tal como o tempo de vida da fluorescência, ou qualquer combinação de vários parâmetros, para as diferentes bases. Devido às possíveis interacções de um fluoróforo com uma base, é possivel utilizar o mesmo fluoróforo para distinguir mais do que uma base. Como exemplo, a cumarina-dGTP tem um tempo de vida de fluorescência muito mais curto do que a cumarina-dCTP, pelo que as duas bases podem ser distinguidas pela sua diferença no tempo de vida de fluorescência no passo de identificação do esquema de sequenciação, embora tenham a mesma substância quimica como marcador fluorescente. 0 procedimento de sequenciação também pode ser realizado utilizando menos do que 4 marcadores. Com 3 marcadores a sequência pode ser deduzida a partir da sequenciação de uma cadeia de ácido nucleico (1) se a 4a base puder ser detectada como um atraso de tempo escuro constante entre os sinais dos outros marcadores, ou (2) inequivocamente sequenciando ambas as cadeias de ácido nucleico, porque neste caso se obtém um sinal de fluorescência positivo de cada par de bases. Outro esquema possivel que utiliza dois marcadores é ter uma base marcada com um fluoróforo e as outras três bases com outro fluoróforo. Neste caso, as outras 3 bases não originem uma sequência, mas apenas algumas bases que ocorrem entre a base particular a identificar pelo outro fluoróforo. Fazendo rodar este fluoróforo identificador através das diferentes bases, em diferentes reacções de sequenciação, toda a sequência pode ser deduzida a partir de operações de sequenciação, sequenciais. Alargando este esquema de utilização de apenas dois marcadores é mesmo possivel obter toda a sequência utilizando apenas duas bases marcadas por operação de sequenciação. Como referido por Sauer et al., "Detection and Identification of Single Dye Labelled Mononucleotide Molecules Released From an Optical Fiber in a Microcapillary: First Steps Towards a New Single Molecule DNA Sequencing Technique," Phys. Chem. Chem. Phys. 1:2471-77 (1999), a sequência pode ser determinada com 2 30 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ marcadores apenas se se realizarem múltiplas reacções de sequenciação com as combinações possíveis dos dois marcadores. Deste modo, ao realizar o processo da presente invenção, é desejável marcar longas porções de ácido nucleico com pelo menos 2 marcadores diferentes.

Quando a sequenciação é realizada ligando a polimerase em vez do ácido nucleico ao suporte, é importante que a enzima sintetize longas porções de ácido nucleico, sem que o complexo ácido nucleico/proteína se desfaça. Isto é designado por síntese de ácido nucleico "processiva". Pelo menos para o sistema que utiliza ADN-polimerase de T7 e dCTP completamente substituído por cumarina-5-dCTP, a síntese é totalmente processiva em relação a pelo menos 7300 pares de bases (i.e., uma molécula de polimerase liga-se ao molde de ADNcs e constrói toda a segunda cadeia sem se desligar uma só vez) . Com um marcador, o processo da presente invenção pode ser realizado observando a polimerase em tempo real com resolução de pares de bases e identificando o perfil de sequência dessa base, mas sem conhecer as outras bases. Deste modo, utilizar quatro marcadores diferentes seria muito desejável por permitir uma maior rapidez e precisão, como referido acima. No entanto, a informação obtida de medições da incorporação de nucleótidos ao nível de uma única molécula, tal como taxas de incorporação para bases individuais num determinado contexto de sequência, pode proporcionar um meio para mais bem caracterizar a sequência que está a ser sintetizada. Em relação a assegurar uma síntese processiva para o segundo modo operacional da presente invenção, podem-se utilizar proteínas acessórias para tornar o complexo ácido nucleico/proteína ainda mais processivo do que utilizando apenas a enzima de polimerização do ácido nucleico. Por exemplo, em condições óptimas, a ADN-polimerase de T7 é processiva relativamente a pelo menos 10 000 bases, enquanto que no complexo com a proteína de helicase/primase de T7 a capacidade de processamento aumenta para mais de 100 000 bases. Kelman et al., "Processivity of DNA Polymerases: Two Mechanisms, One Goal" Structure 6: 121-125 (1998) . Uma proteína de ligação de cadeia simples também é uma proteína acessória adequada. A capacidade de processamento é especialmente importante com concentrações de análogo de nucleótido que são inferiores ao limite de saturação para uma polimerase particular, pois é 31 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ conhecido que os valores de capacidade de processamento para as polimerases são diminuídos com concentrações de substrato limitantes. Ver Patel et al., "Pre-Steady-State Kinetic Analysis of Processive DNA Replication Including Complete Characterization of an Exonuclease-Deficient Mutant,"

Biochemistry 30: 511-525 (1991).

Outra possibilidade para assegurar a capacidade de processamento é o desenvolvimento ou identificação de uma polimerase que seja totalmente processiva na ausência de, ou com uma concentração muito baixa, de substrato (como é o caso, e.g., para um complexo de alongamento ARN-polimerase/ADN). No caso da capacidade de processamento não ser suficientemente elevada é possível ligar ambos, a polimerase e a molécula de ácido nucleico alvo, no suporte, próximos um do outro. Isto iria facilitar a reformação do complexo e a continuação da síntese de ADN, no caso do complexo de sequenciação se desfazer ocasionalmente. As polimerases não processivas também podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, para o caso em que o ácido nucleico alvo está ligado ao suporte. Aqui, a mesma, ou uma molécula de polimerase diferente, podem reformar o complexo e continuar a sintese após dissociação do complexo.

Uma abordagem para realizar a presente invenção é apresentada na Figura 6. A Figura 6A mostra um sistema para a sequenciação com solução reagente R posicionada na superfície 2 na qual está imobilizado um complexo de molécula de ácido nucleico alvo com iniciador. Confinando a iluminação a uma pequena área próxima do local activo de alongamento da polimerase, e.g. focando uma radiação activadora com o auxílio de lentes ou fibra óptica 6, os análogos de nucleótido que ficam incorporados na cadeia de ácido nucleico crescente são detectados, pois estão localizados no seio da região de iluminação. A Figura 6B mostra uma secção alargada do dispositivo, com o complexo de polimerização na região de iluminação. As concentrações de substrato são escolhidas de forma que alguns análogos de nucleótido na área envolvente na solução R estão geralmente fora da região iluminada e não são detectados. 32 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

Como se pode ver na Figura 6A, a fonte de iluminação 10 (e.g., um laser) dirige a radiação de excitação por meio de um divisor de feixe dicróico 8 através da lente 6 e superfície 2 para o complexo de ácido nucleico alvo com iniciador, imobilizado. Isto excita o marcador imobilizado no complexo e a radiação emitida resultante passa de novo através da superfície 2 e lente ou fibra óptica 6. O divisor de feixe dicróico 8 permite a passagem da radiação emitida até ao detector (ou série de vários detectores) 12 que identifica o tipo de emissão. A informação de emissão detectada é então dirigida para o computador 14 onde a base nucleotidica correspondente à emissão é identificada e a sua identidade armazenada. Após múltiplos ciclos deste procedimento, o computador será capaz de gerar como resultado a sequência da molécula de ácido nucleico alvo. O resultado da detecção correspondente mais uma vez corresponde ao esquema apresentado na Figura 3, como explicado acima.

De acordo com outra concretização da presente invenção, a iluminação e detecção de fluorescência podem ser conseguidas tornando o suporte para o ácido nucleico ligado no final de uma primeira fibra óptica unimodal, que transporta a luz de excitação. Esta e/ou uma segunda fibra óptica podem ser utilizadas para recolher fotões fluorescentes. Transmitindo a radiação de comprimento de onda de excitação adequado através da primeira fibra óptica unimodal, o marcador irá fluorescer e emitir a frequência de luz fluorescente adequada. A luz fluorescente emitida será parcialmente transmitida para a segunda fibra óptica e separada espectralmente, tal como por gravação de redes de difracção na fibra. O espectro de luz devolvida identifica o análogo de nucleótido ligado particular. Podem-se conceber outras técnicas para fornecer ou recolher a luz para o local de reacção, tais como a utilização de iluminação de onda guia ou iluminação por onda evanescente, tal como iluminação de reflexão interna total. Pode-se utilizar uma ou várias fontes de iluminação, que fornecem excitação por um, ou por multifotões. Detectores adequados incluem módulos de fotodiodos avalanche, tubos fotomultiplicadores, câmaras CCD, chips CMOS, ou séries ou combinações de vários detectores. 33 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

Uma vez que é provável que exista um limite superior para a concentração de análogos de nucleótido presentes no volume de observação que está correlacionada com uma razão de sinal/ruido de fundo permissivel e a capacidade de distinguir o análogo de nucleótido particular que está a ser incorporado no ácido nucleico em relação aos análogos de nucleótido que estão apenas a difundir-se em torno da polimerase, é possível que o procedimento de sequenciação da presente invenção tenha que ser realizado a concentrações inferiores ao limite de saturação, para um ou mais análogos de nucleótido.

Por exemplo, quando se utiliza óptica limitada a difracção convencional para a detecção de fluorescência, o volume de observação é grande, pelo que se teriam que utilizar concentrações de substrato na gama nanomolar para um sinal de ruído de fundo aceitável. Isto é bem abaixo do km usual das polimerases (normalmente na gama μΜ), salvo quando se utilizam outros meios para reduzir o ruído de fundo, tais como discriminação do tempo de vida, como discutido acima (Figura 5), ou técnicas de confinamento de volume, como descrito a seguir, para reduzir, quer "electronicamente", quer fisicamente a contribuição da fluorescência de ruído de fundo. Num feixe laser convencionalmente focado, o volume focal é de aproximadamente 0,2 ym3 (0,5 ym de diâmetro, 1,5 ym na direcção axial), correspondendo a cerca de 0,2 fl. De modo a que apenas um análogo de nucleótido fluorescente esteja presente em média no volume de excitação, em qualquer altura, a concentração de substrato deve ser reduzida para ca. 10 nM, uma concentração bem abaixo dos valores de km das ADN-polimerases (ca. 1-2 yM) . Ver Polesky et al., "Identification of Residues Criticai for the Polymerase-Activity of the Klenow Fragment of DNA-Polymerase-I from Escherichia-coli." J. Biol. Chem. 265:14579-14591 (1990) and McClwe et al., "The Steady State Kinetic Parameters and Non-Processivity of Escherichia coli Deoxyribonucleic Acid Polymerase I," J. Biol. Chem. 250:4073-4080 (1975). Deste modo, se a concentração de substratos é bem abaixo do km, a capacidade de processamento da síntese de ácido nucleico tem que ser assegurada por uma das possibilidades acima referidas. Alternativamente, se o volume de observação pode ser reduzido, é permitida uma concentração de substrato mais elevada que naturalmente aumenta os valores de capacidade de processamento. Deste modo, 34 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ um objectivo da presente invenção refere-se à redução efectiva do volume de observação, de modo a reduzir ou prevenir a fluorescência de ruido fundo causada pelos nucleótidos livres marcados e a aumentar a capacidade de processamento. Isto pode ser conseguido de vários modos.

Uma abordagem para reduzir o ruido de fundo envolve a potenciação de campo electromagnético por objectos próximos, com raios de curvatura pequenos.

Devido ao designado "efeito antena" a radiação electromagnética é fortemente potenciada no final de um objecto afiado, tal como um ponta de metal. Utilizando este procedimento, o volume a potenciar corresponde grosseiramente a uma esfera com um diâmetro que é próximo do diâmetro da ponta. Esta técnica é descrita em Sanchez, E.J., et al., "Near-Field Fluorescence Microscopy Based on Two-Photon Excitation with Metal Tips," Phys. Rev. Lett, 82:4014-17 (1999).

Ao realizar o processo da presente invenção, uma enzima de polimerização é posicionada no final de uma ponta de metal com luz laser dirigida para o mesma, e.g. com uma lente de objectiva convencional. Uma vez que o volume iluminado efectivo pode agora ser da ordem do tamanho da própria polimerase, não será detectada praticamente nenhuma fluorescência a partir dos nucleótidos fluorescentes que se estão a difundir na solução. Além disso, o tempo de residência das moléculas que se estão a difundir através de um volume pequeno é extremamente curto. No entanto, a incorporação de um nucleótido fluorescente será vista como um pulso de fluorescência relativamente longo, pois essa molécula particular ficará neste volume iluminado pequeno (até ser removida, como explicado acima).

Uma abordagem para realizar esta concretização da presente invenção é apresentada nas Figuras 7A a B. A Figura 7A mostra um sistema para a sequenciação com potenciação de campo electromagnético com a solução reagente R posicionada na superfície 2, na qual está imobilizado um complexo de molécula de ácido nucleico alvo com iniciador. Como se pode ver na Figura 7B, uma ponta de metal que 35 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ transporta uma polimerase está posicionada na solução reagente R, criando uma região pequena de iluminação em torno da polimerase imobilizada, por iluminação pela lente 6. Confinando a iluminação a esta pequena área, próxima do local activo de alongamento da polimerase, os análogos de nucleótido que ficam incorporados na cadeia de ácido nucleico crescente são detectados, pois estão posicionados no seio da região de iluminação. Por outro lado, os análogos de nucleótido na área envolvente na solução R estão geralmente fora desta região e não são detectados.

Com se pode ver na Figura 7A, a fonte de iluminação 10 (e.gr., um laser) dirige a radiação de excitação de um ou múltiplos fotões com um componente de polarização não zero paralelo à ponta, por meio de um divisor de feixe dicróico 8 através da lente 6 e superfície 2, até ao complexo de ácido nucleico alvo com iniciador, imobilizado. Isto excita o marcador imobilizado no complexo, tendo como resultado que a radiação emitida passa de novo através da superfície 2 e da lente 6. O divisor de feixe dicróico 8 permite a passagem da radiação emitida para o detector 12 que identifica o tipo de emissão. A informação de emissão detectada é então dirigida para o computador 14 sendo a base nucleotídica correspondente identificada e a sua identidade armazenada. Após múltiplos ciclos deste procedimento, o computador será capaz de gerar como resultado a sequência da molécula de ácido nucleico alvo. 0 resultado de detecção correspondente mais uma vez corresponde ao esquema apresentado na figura 3, como explicado acima. A principal diferença em relação ao caso discutido acima é que os picos curtos causados pela difusão aleatória de análogos de nucleótido através do volume focal são agora extremamente curtos, pois o volume de observação é muito pequeno. Deste modo, esta abordagem de redução do volume de observação também resulta num melhor tempo de resolução em relação aos nucleótidos incorporados versus os não incorporados. Isto é verdade para todas as outras possibilidades de confinamento de volume discutidas mais à frente.

Ao realizar este procedimento, as pontas podem ser formadas a partir de uma variedade de materiais, e.g., metais como platina, prata ou ouro. O fabrico da ponta pode ser 36 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ realizado, e.g., por gravação electroquímica de arames ou por moagem por feixe de iões. Ver Sanchez, E.J., et al., "Near-Field Fluorescence Microscopy Based on Two-Photon Excitation with Metal Tips," Phys. Rev. Lett. 82:4014-17 (1999). A enzima de polimerização de ácido nucleico pode ser ligada á extremidade da ponta, quer mergulhando a ponta numa solução de moléculas de enzima de polimerização de ácido nucleico, aplicando um campo eléctrico na ponta com cargas que atraem a enzima de polimerização de ácido nucleico, ou outras técnicas de acoplamento (e.g., com ligantes, anticorpos etc.). Um modo alternativo de utilizar a potenciação de campo electromagnético para este esquema de sequenciação é posicionar uma ponta nua próximo de um complexo ácido nucleico/enzima de polimerização de ácido nucleico imobilizado, em vez de ter o complexo ligado fisicamente à extremidade da ponta. Uma população de complexos poderá, por exemplo, ser imobilizada numa lâmina de vidro e a ponta é pesquisada por varrimento na superfície, até ser encontrado um complexo útil para sequenciação. Foram desenvolvidas técnicas adequadas para realizar esta nanoposicionamento no campo da microscopia de sonda de varrimento.

Outra abordagem para reduzir o ruído de fundo durante o método de sequenciação da presente invenção envolve a utilização de iluminação de campo próximo, como se mostra nas figuras 8A-B. Aqui, como se mostra na Figura 8B, o complexo de ácido nucleico alvo com iniciador, é imobilizado na superfície 2 sendo a camada opaca 16 aplicada sobre a superfície 2. No entanto, fazem-se pequenos orifícios 18 na camada opaca 16. Quando iluminada por baixo, a luz não consegue penetrar totalmente através dos orifícios até à solução reagente R, pois o diâmetro dos orifícios 18 é menor do que metade do comprimento de onda da luz. No entanto, há alguma perda que cria uma pequena área de luz logo acima da superfície 2 no orifício 18, criando um designado volume de excitação de campo próximo. Como se mostra na figura 8B, o complexo de ácido nucleico alvo com iniciador está posicionado no orifício 18 onde é iluminado por baixo. Confinando a iluminação a esta pequena área de campo próximo, os análogos de nucleótido incorporados, posicionados no seio da região de iluminação, são detectados. Por outro lado, a quantidade de 37 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ análogos de nucleótido que não servem para alongar o iniciador são em pequena quantidade, devido ao pequeno tamanho do orificio 18 e, na pequena extensão detectada são facilmente distinguíveis dos análogos de nucleótido incorporados, como descrito acima. 0 sistema para realizar esta concretização é apresentado na figura 8A. A fonte de iluminação 10 (e.g., um laser) dirige a radiação de excitação por meio do divisor de feixe dicróico 8 através da lente 6 e superfície 2, até ao complexo de ácido nucleico alvo com iniciador, imobilizado. Isto excita o marcador imobilizado no complexo, tendo com resultado que a radiação emitida passa de novo através da superfície 2 e da lente 6. O divisor de feixe dicróico 8 permite a passagem da radiação emitida para o detector 12 que identifica o tipo de emissão. A informação de emissão detectada é então dirigida para o computador 14, onde a base nucleotídica correspondente à emissão é identificada e a sua identidade armazenada. Após múltiplos ciclos deste procedimento, o computador será capaz de gerar como resultado a sequência da molécula de ácido nucleico alvo.

Como alternativa adequada utilizando volumes de excitação de campo próximo, o volume de campo próximo também pode ser gerado utilizando uma de muitas fibras ópticas adelgaçadas, normalmente utilizadas em microscopia de varrimento campo próximo. O "nanofabrico" é outra técnica útil para limitar o volume de reacção, para reduzir o nível de fluorescência de ruído de fundo. Isto envolve confinar o volume de excitação a uma região no seio de um nanocanal. Aqui, o confinamento é possível em duas de três dimensões espaciais. Um vaso de reacção com um volume muito menor do que os volumes focais que se obtêm com ópticas de focagem de campo longínquo é fabricado numa "bolacha" de silício ou sílica fundida, a partir de materiais opticamente transparentes. Turner et al., "Solid-State Artificial Gel for DNA Electrophoresis with an Integrated Top Layer," Proceedings of SPIE: Micro- and Nano-Fabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental

Applications 3258:114-121 (1998). 38 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ A técnica tira vantagem de uma camada sacrificial de poli-silício para definir a cavidade de trabalho dos canais. Stern et al., "Nanochannel Fabrication for Chemical Sensors," J. Vac. Sei. Technol. B15:2887-2891 (1997) e Chu et al., "Silicon Nanofilter with Absolute Pore Size and High Mechanical Strength, " Proc, SFIE Int. Soc. Opt. Eng. (USA) 2593: 9-20 (1995). O chão, tecto e paredes dos canais são feitos de nitreto de silicio, que é depositado proporcionalmente sobre uma camada sacrificial de poli-silício. A camada sacrificial é então removida com uma gravação química em húmido de selectividade elevada, deixando para trás apenas o nitreto de silício. Esta técnica demonstrou um controlo preciso da dimensão crítica (DC) em relação a uma vasta gama de tamanhos de estrutura. A altura da camada de poli-silício pode ser controlada até 5 nm ao longo de todo o dispositivo, e as dimensões laterais são limitadas em tamanho e o controlo da DC apenas pela técnica de litografia aplicada. A nanoestrutura pode ter uma configuração ponteada, acicular, ou ressonante, para melhorar a detecção do marcador.

As Figuras 9A-B mostram um sistema nanofabricado.

Na Figura 9B é apresentada uma vista alargada da secção transversal do nanocanal, com os reagentes R localizados apenas na área confinada 102, que é criada pelas paredes do canal 104 e 106. O complexo de molécula de ácido nucleico com iniciador está posicionado dentro da área confinada 102. Como resultado, quando a luz de excitação passa através da área confinada 102, o marcador do análogo de nucleótido incorporado é excitado e emite radiação que é detectada e identificada como correspondente a uma base nucleotídica particular adicionada à sequência do iniciador de alongamento. Passando os reagentes através da área confinada 102, a quantidade de análogos de nucleótido que não alongam o iniciador são em menor número, em qualquer ponto de tempo particular. Na pequena extensão em que estas entidades são detectadas elas são facilmente distinguidas das porções imobilizadas como descrito acima. 39 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ A Figura 9Α mostra um sistema para realizar o sistema de nanocanal. A fonte de iluminação dirige a radiação de excitação 10 (e.g., um laser) por meio de um divisor de feixe dicróico 8 através da lente 6 e nanocanal 106, até ao complexo de ácido nucleico alvo com iniciador, imobilizado. Isto excita o marcador imobilizado no complexo, tendo com resultado que a radiação emitida passa de novo através da lente 6. O divisor de feixe dicróico 8 permite a passagem da radiação emitida para o detector 12 que identifica o tipo de emissão. A informação de emissão detectada é então dirigida para o computador 14, onde a base nucleotidica correspondente à emissão é identificada e a sua identidade armazenada. Após múltiplos ciclos deste procedimento, o computador será capaz de gerar como resultado a sequência da molécula de ácido nucleico alvo.

As Figuras 10A-B mostram sistemas para fornecer reagentes a um sistema de confinamento nanofabricado. Na Figura 10A, os reagentes que incluem dATP, dCTP. dGTP, dUTP, a fonte de ácido nucleico e tampão são mantidos em reservatórios separados e ligados através de condutas separadas até ao colector 200, onde os reagentes são misturados uns com os outros antes de entrar no nanocanal 202. Os componentes deste sistema a montante e a jusante do nanocanal 202 podem ser combinados como uma microestrutura. No processo de passar rapidamente através do nanocanal 202, os reagentes movem-se rapidamente através da zona de reacção 204 onde o procedimento de sequenciação da presente invenção é realizado a partir do nanocanal 202, os reagentes residuais R passam através da saida 206. O sistema da Figura 10B é geralmente semelhante ao da Figura 10A, mas o sistema anterior está num único chip com almofadas para ligar o sistema a reservatórios fluidos. Em particular, o reservatório para cada um dos reagentes é acoplado ao chip 208 através das almofadas de entrada 210a-f, enquanto que a saida para os reagentes desprezados é ligada à almofada 212.

Os canais nanofabricados de 75 nm de largura e 60 nm de altura foram fabricados com uma transparência óptica excelente e utilizados para controlo do fluxo de ADN. Ver Turner et al., 40 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ "Solid-State Artificial Gel for DNA Electrophoresis with an Integrated Top Layer," Proceedings of SPIE: Micro- and Nano-Fabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications 3258:114-121 (1998), que é aqui incorporado para referência. Colocando o complexo de síntese de ácido nucleico num canal com profundidade z = 25 nm, minimizando a dimensão-x do feixe de luz focada para ca. 300 nm, e fixando a dimensão y pela largura do canal a 100 nm, o volume de observação efectivo pode ser reduzido para 7,5 x 104 ym3, correspondendo a 0,75 atolitros. Aqui, a concentração para apenas uma molécula de substrato a estar presente no volume de excitação é de 2 μΜ, uma concentração de substrato bem na gama da polimerização rápida e eficiente de ácido nucleico. Além disso, uma vez que há quatro análogos de nucleótido diferentes, cada um a distinguir, a concentração efectiva de substrato para a polimerase é quatro vezes maior. Se é necessário um volume de observação efectivo menor, a dimensão-y na direcção do fluxo pode ser reduzida para cerca de 100 nm por iluminação com o padrão de interferência de duas objectivas, a ângulos axiais de cerca de 90°, como na microscopia teta. Ver Stelzer et al., "A New Tool for the Observation of Embryos and Other Large Specimens: Confocal Theta Fluorescence Microscopy," J. Microscopy 179:1-10 (1995).

Para excitar os marcadores, a energia de activação é focada próximo do local activo da extensão da polimerase (i.e. onde está localizada a polimerase) . Na extensão em que este local activo se move durante o alongamento (e.g., como resultado do movimento pela polimerase), o foco da energia activadora também se move.

Uma consideração necessária é a escolha entre a excitação de fluorescência de um fotão e multifotões. A excitação de multifotões proporciona algumas vantagens, mas é mais complexo e mais dispendioso de implementar. A fluorescência de excitação de multifotões que utiliza a absorção de dois ou mais fotões de pulsos de infravermelho claros, de fentossegundos gerados por lasers de estado sólido em modo trancado ultra rápido proporciona a abordagem mais promissora. Ver Denk et al., "2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy," Science 248:73-76 (1990). 41 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ A sensibilidade à fluorescência de molécula individual é obtida de forma rotineira e é temporalmente resolvida até ao nivel do micro segundo com tempos de vida de fluorescência mensuráveis com uma precisão razoável para moléculas individuais. Ver Mertz et al., "Single-Molecule Detection by Two-Photon-Excited Fluorescence," Optics Lett. 20:2532-2534 (1995) and Eggeling et al., "Monitoring Conformational Dynamics of a Single Molecule by Selective Fluorescence Spectroscopy," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:1556-1561 (1998). O sinal de fluorescência ideal para sequenciação de moléculas individuais consiste em pulsos resolvidos no tempo de fluorescência distinguível, à medida que cada nucleótido é ligado. Deste modo, na situação ideal, pode-se obter uma série resolvida no tempo de pulsos de fluorescência de diferente cor se os nucleótidos foram ligados a intervalos distinguíveis, como descrito na Figura 3. A resolução total da sequência temporal de fenómenos oferece assim a melhor redução de ruído de fundo e a possibilidade fiável de reconhecimento de nucleótidos. Uma vez que com as polimerases actualmente disponíveis, os nucleótidos marcados não são muito provavelmente adicionados mais rapidamente do que a intervalos de 1 milissegundo, deverá ser possível que todos os fotões de fluorescência detectados de cada nucleótido marcado possam ser acumulados e removidos antes do próximo nucleótido fluorescente ser ligado. Esta sequência ideal pulso-intervalo-pulso é realizada, embora efectivamente qualquer passo cinético de polimerização envolva o processo estocástico de Poisson. Para um único processo de Poisson, o atraso temporal mais provável entre fenómenos é de zero, embora o atraso médio seja maior que zero. No entanto, o processo de incorporação de um único dNTP no ADN pela ADN-polimerase é um processo de múltiplos passos sequenciais, de pelo menos 5 fenómenos diferentes. Ver Patel et al., "Pre-Steady-State Kinetic Analysis of Processive DNA Replication Including Complete Characterization of an Exonuclease-Deficient Mutant,"

Biochemistry 30: 511-525 (1991). A soma sequencial destes passos irá resultar num atraso de tempo muito provavelmente maior que zero. Deste modo, não é muito provável que os pulsos de fotões se sobreponham. 42 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

Para fluoróforos convencionais, cerca de 105 fotões por fluoróforo serão emitidos antes da fotolixiviação. A detecção de (no máximo) 1% dos rendimentos de emissão origina cerca de 103 fotões para uma incerteza de ruido relativa de 3%. 0 ruido de fundo devido aos nucleótidos livres é reduzido até um nível praticamente desprezável pelos esquemas discutidos acima, e.g., limitando o tamanho do volume focal para conter apenas cerca de um nucleótido marcado livre, com tempos de residência muito curtos. 0 nível de detecção esperado é de cerca de 103 fotões de cada nucleótido marcado, em cerca de 10“3s. Esta é uma taxa de contagem aceitável, ~106 Hz, e uma taxa de excitação do fluoróforo aceitável a cerca de um décimo da saturação do estado excitado singuleto. Esta excitação de fluorescência cria um pulso detectado de ~103 fotões em cerca de 1 ms ao comprimento de onda característico para cada nucleótido marcado, deixando, em média, um intervalo de cerca de 1 ms antes do próximo nucleótido ser adicionado, bem dentro dos intervalos de tempo médios entre a adição de nucleótidos, que é provavelmente de mais de um milissegundo. As possíveis sobreposições de pulsos podem ser analisadas e resolvidas pelo tratamento analítico de medições contínuas de dados em sequências de tempo coerentes, em (no máximo) 4 canais para resultados de sequenciação mais precisos. Com as estatísticas de fotões disponíveis na concepção experimental e analisadores multicanais e programas operacionais recentemente desenvolvidos, as taxas de erro podem ser tornadas aceitáveis com 4 nucleótidos marcados, ou com estratégias que envolvam um menor número de marcadores, como descrito acima. A resolução espectral de quarto fluoróforos que identificam os nucleótidos pode ser obtida com excitação de dois fotões por pulsos de infravermelho. Todos os 4 fluoróforos podem ser simultaneamente excitados devido às bandas de excitação largas normalmente características da excitação de dois fotões. Ver Xu et al., "Multiphoton Excitation Cross-Sections of Molecular Fluorophores, " Bioimaging 4:198-207 (1996).

Alternativamente, podem-se utilizar fontes de excitação múltipla em combinação, ou por troca rápida para iluminar o 43 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ complexo de sequenciação, se necessário. A separação espectral é conseguida com filtros de interferência convencionais mas os espectros de emissão podem-se sobrepor, complicando a análise de correlação de tempo, sendo talvez necessária uma correlação cruzada dos 4 canais de cor, para correcção. Se a compatibilidade dos fluoróforos com a enzima de polimerização de ácido nucleico limita a aplicabilidade de conjuntos de corantes adequados, pode-se utilizar uma combinação de técnicas para distinguir os marcadores.

Outro modo potencial para distinguir a incorporação de um nucleótido na cadeia de ácido nucleico crescente consiste em medir as alterações no tempo de vida da fluorescência. Observou-se que o tempo de vida de fluorescência de uma sonda de pireno de oligonucleótido varia de um modo dependente da sequência, por ligação do ADN. Ver Dapprich J, "Fluoreszenzdetection Molekularer Evolution (Fluorescence Detection of Molecular Evolution)." Dissertation, Georg-August-Univ., Goettingen, Alemanha (1994).

As interacções fotofisicas entre o fluoróforo e a base resultam em tempos de decaimento de fluorescência caracteristicos e também podem ser utilizados para diferenciar as bases, como discutido acima. Foi recentemente demonstrada a determinação e discriminação do tempo de vida ao nivel de molécula individual, sendo a discriminação entre as bases que estão a ser incorporadas e os nucleótidos que se difundem livremente realizada por medição dos tempos de vida de fluorescência. Ver Eggeling et al., "Monitoring Conformational Dynamics of a Single Molecule by Selective Fluorescence Spectroscopy," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:1556-1561 (1998).

As medições correlacionadas no tempo em quatro canais de comprimento de onda de fluorescência podem ser utilizadas eficazmente na realização do processo da presente invenção. A sobreposição dos espectros de emissão pode permitir que sinais de um fluoróforo entrem em vários canais, mas a taxa de contagem relativa e o timing identificam o marcador correctamente. Os sinais simultâneos de um nucleótido marcado incorporado e um marcador livre são distinguíveis pela duração e grandeza do pulso, que são limitados para o marcador livre. A ambiguidade do marcador pode ser ainda reduzida, utilizando 44 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ medições do tempo de decaimento de fluorescência que podem ser realizadas com os atrasos do tempo de resolução de 0,1 ns disponíveis para a emissão de fotões de fluorescência após cada pulso de excitação de laser de fentossegundos. A emissão de fotões de fluorescência e processos de fotolixiviação são eles próprios processos estocásticos, mas envolvem eficiências quânticas suficientemente diferentes para que as taxas de erro sejam desprezáveis.

Ao rejeitar o ruido de fundo em relação aos nucleótidos marcados que se difundem ou fluem livremente, o tempo de residência muito curto de qualquer nucleótido livre individual no volume focal é utilizado com vantagem. O tempo de difusão caracteristico para um análogo de nucleótido livre através da dimensão aberta do volume focal (no pior caso, da iluminação de campo longínquo não interferométrico) será de tD~y2/4D~2 xlO"5 s, sendo y a dimensão de volume focal e D o coeficiente de difusão. Uma velocidade de fluxo iontoforético de 1 cm/s é suficiente para manter os seus pulsos de fluorescência curtos inferiores a 10‘3 s e reduzir o número de fotões numa ordem de grandeza. Isto irá assegurar a discriminação contra nucleótidos livres e identificar a série temporal de pulsos que representam a sequência de ácido nucleico, desde que as concentrações de análogo de nucleótido sejam adequadamente baixas, como discutido. Magde et al., "Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System - Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy," Phys. Rev. Lett 29:705-708 (1972) e Maiti et al., "Measuring Serotonin

Distribution in Live Cells with Three-Photon Excitation," Science 275:530-532 (1997). A discriminação pode ser melhorada utilizando técnicas de confinamento em volume ou detecção controlada pelo tempo, como discutido acima. A detecção de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) a partir de um fluoróforo dador (e.g., um dador ligado à polimerase) para aceitadores de análogos de nucleótidos adjacentes que são incorporados na cadeia de ácido nucleico crescente sugere outra possibilidade de diminuir o ruido de fundo dos nucleótidos incorporados. A FRET apenas atinge distâncias muito curtas, incluindo cerca de 45 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 20 nucleótidos e decaimentos na sexta potência reciproca de distância. A molécula dadora excitada transfere a sua energia apenas para fluoróforos aceitadores próximos, que emitem a fluorescência do aceitador resolvido espectralmente de cada nucleótido marcado, à medida que é adicionado. Os nucleótidos já incorporados longe do dador não irão contribuir para o sinal de fluorescência, uma vez que as restrições de distância e orientação da transferência de energia reduzem a gama de observação efectiva para menos de 60 Â, eliminando deste modo de forma efectiva a fluorescência de ruído de fundo dos nucleótidos incorporados. Sem fotolixiviação, o método requer uma sensibilidade elevada, uma vez que nucleótidos repetidos deixam a gama de FRET à mesma velocidade que os nucleótidos novos são adicionados, criando possivelmente uma ambiguidade no reconhecimento de sequências. A fotolixiviação ou clivagem fotoquimica, ou sua combinação, como discutido acima, resolvem o problema. A fotolixiviação das moléculas dadoras que utilizam FRET pode ser evitada se o ácido nucleico molde que é ligado e o dador que possui a enzima de polimerização do ácido nucleico forem periodicamente substituídos.

Uma consideração final importante para o sucesso da presente invenção refere-se à estabilidade do complexo proteína/ácido nucleico na activação de radiação, tal como feixes de laser fortemente focados. Não é esperado que a enzima seja afectada pela iluminação de excitação, uma vez que são escolhidos comprimentos de onda aos quais as proteínas não absorvem, a estabilidade da polimerase no feixe de laser deverá ser suficientemente elevada para permitir operações de sequenciação precisas durante comprimentos de leitura longos. Investigações anteriores que expõem enzimas a luz laser forte analisaram os danos causados pela luz e a perda de função. Os complexos ARN-polimerase/ADN imobilizados apresentaram tempos de inactivação de 82 ± 58 s para luz laser de Nd:Y de 1047 mm a uma potência laser de 82 a 99 mW focada na proteína, correspondente a intensidades de aproximadamente 108 W/cm2. Outros estudos sobre os sistemas de actomiosina ou cinesina indicam uma estabilidade semelhante. Tanto o ADN como as ligações biotina-avidina mostraram ser fotoestáveis em armadilhas ópticas. Ver Yin et al., "Transcription Against an Applied Force," Science 270: 1653-1657 (1995), Svoboda et al. "Direct Observation of Kinesin Stepping by Optical Trapping 46 ΕΡ 1 179 085/ΡΤ

Interferometry," Nature 365:72:1-727 (1993), e Molloy et al., "Movement and Force Produced by a Single Myosin Head" Nature 378: 209-212 (1995).

Para a detecção por fluorescência de análogos de nucleótido de acordo com a presente invenção, são esperadas as potências laser (intensidades) tipicas de medições de FCS da ordem de 0,1 mW (105 W/cm2) para excitação de um fotão e 1 mW (106-107 W/cm2) para dois fotões, sendo deste modo significativamente menor do que no caso das pinças ópticas acima descritas. A estabilidade da enzima deverá assim ser maior, além disso, com a velocidade de sequenciação rápida proposta por este método (e.g., 100 pb/s), mesmo 80 s são suficientes para determinar a sequência de ácido nucleico de 8 kb.

Lisboa, 2010-08-05

Claims

ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Método para sequenciação de uma molécula de ácido nucleico alvo individual que possui uma pluralidade de bases nucleotídicas, compreendendo: proporcionar um complexo de uma enzima de polimerização de ácido nucleico e a molécula de ácido nucleico alvo, de modo a permitir a formação de uma cadeia de ácido nucleico crescente, complementar ao ácido nucleico alvo; proporcionar uma pluralidade de tipos de análogos de nucleótido marcados, em que cada tipo de análogo de nucleótido é complementar a um nucleótido diferente na sequência de ácido nucleico alvo; polimerizar a pluralidade de tipos de análogos de nucleótido marcados por incorporação da pluralidade de tipos de análogos de nucleótido marcados na cadeia de ácido nucleico em crescimento, em que cada um dos análogos de nucleótido incorporados é capaz de polimerizar com um análogo de nucleótido subsequente, para permitir a polimerização continua de uma pluralidade de análogos de nucleótido; identificar a sequência temporal de incorporação da referida pluralidade de tipos de análogos de nucleótido marcados na cadeia de ácido nucleico crescente, detectando os tempos de residência dos análogos de nucleótido marcados próximo da enzima de polimerização de ácido nucleico em tempo real, à medida que ocorre o alongamento do iniciador dirigido pelo molde, sendo o marcador removido após a detecção.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que se identificam uma pluralidade de análogos de nucleótido por segundo.
3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que se identificam até 100 análogos incorporados por segundo.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico é seleccionada do grupo constituído por uma ADN-polimerase, uma ARN-polimerase, transcritase inversa e suas misturas. ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 2/9
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico é uma polimerase termoestável.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico é uma polimerase termodegradável seleccionada do grupo constituído por ADN-polimerase de E. coli, o fragmento Klenow de ADN-polimerase de E. coli, ADN-polimerase de T4 e ADN-polimerase de T7.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico alvo é seleccionada do grupo constituído por ADN de cadeia dupla, ADN de cadeia simples, estruturas em forma de gancho de ADN de cadeia simples, hibridos de ADN/ARN, ARN com um local de reconhecimento para ligação de uma ARN-polimerase, ou estruturas em forma de gancho de ARN.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico está ligada ao complexo da molécula de ácido nucleico alvo numa origem de replicação, um corte ou hiato num ácido nucleico alvo de cadeia dupla, uma estrutura secundária num ácido nucleico alvo de cadeia simples, um local de ligação criado por uma proteina acessória seleccionada de entre uma proteina de ligação de cadeia simples, uma primase e helicase, ou um ácido nucleico de cadeia simples com iniciador.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico é proporcionada com uma ou mais proteínas acessórias, seleccionadas de entre uma proteina de ligação de cadeia simples, uma primase e helicase, para modificar a sua actividade.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico é processiva.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico é não processiva.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os análogos de nucleótido são seleccionados do grupo constituído ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 3/9 por um ribonucleótido, um desoxirribonucleótido, um ribonucleótido modificado, um desoxirribonucleótido modificado, um nucleótido peptídico, um nucleótido peptídico modificado e um nucleótido de esqueleto fosfato-açúcar modificado.
13. Método de acordo com a reivindicação 1 que compreende ainda: hibridar um iniciador oligonucleotidico com a molécula de ácido nucleico alvo, antes de, ou durante, o referido proporcionamento de uma pluralidade de análogos de nucleótido.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o iniciador oligonucleotidico compreende nucleótidos seleccionados do grupo constituído por ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos modificados, desoxirribonucleótidos modificados, ácidos nucleicos peptidicos, ácidos nucleicos peptídicos modificados e nucleótidos de esqueleto fosfato-açúcar modificado.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada um dos análogos de nucleótido incorporados é proporcionado com um marcador.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o marcador é seleccionado do grupo constituído por cromóforos, porções fluorescentes, enzimas, antigénios, metais pesados, sondas magnéticas, corantes, grupos fosforescentes, materiais radioactivos, porções quimioluminescentes, nanopartículas de dispersão ou fluorescentes, porções geradoras de sinal de Raman e porções de detecção electroquímica.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que marcador está ligado ao análogo de nucleótido na sua base porção açúcar, fosfato alfa, fosfato beta ou fosfato gama.
18 . Método de acordo com a reivindicação 1, em que marcador está ligado ao análogo de nucleótido com um ligante.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, em que marcador está ligado ao análogo de nucleótido no seu fosfato terminal. ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 4/9
20. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo ainda: remover o marcador do análogo de nucleótido, durante ou após a referida identificação e antes da referida polimerização de um análogo de nucleótido subsequente num local activo em que o análogo de nucleótido está a ser adicionado à cadeia de ácido nucleico em crescimento.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida remoção é realizada por lixiviação do marcador.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a referida lixiviação é realizada por fotolixiviação com radiação que é ajustada para induzir e controlar a remoção do marcador.
23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida remoção é realizada clivando o marcador do análogo de nucleótido.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que análogos de nucleótido marcados no fosfato beta ou marcados no fosfato gama são clivados enzimaticamente.
25. Método de acordo com a reivindicação 1, em que cada um da pluralidade de tipos de análogos de nucleótido têm marcadores diferentes que são distinguíveis uns dos outros durante a referida identificação.
26. Método de acordo com a reivindicação 1, em que três ou menos da pluralidade de tipos de análogos de nucleótido têm um marcador diferente.
27. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os diferentes tipos de análogos de nucleótido têm o mesmo marcador, mas são distinguidos por diferentes propriedades, devido à presença de fluoróforos de base, fluoróforos neutralizados ou análogos de nucleótido fluorogénicos.
28. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico transporta um ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 5/9 marcador e a referida identificação é realizada detectando a interacção entre o marcador e o análogo de nucleótido.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o marcador é um dador ou aceitador de transferência de energia de ressonância de fluorescência.
30. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida identificação é realizada por procedimentos ópticos seleccionados do grupo constituído por microespectroscopia de campo longínquo, microespectroscopia de campo próximo, iluminação por onda evanescente ou guiada por onda, potenciação de nanoestrutura e suas combinações.
31. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida identificação é realizada utilizando excitação de fotões simples e/ou múltiplos, transferência de energia de ressonância de fluorescência ou fotoconversão.
32. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida identificação é conseguida por discriminação de comprimento de onda espectral, medição e separação de tempos de vida de fluorescência, identificação de fluoróforos e/ou supressão do ruído de fundo.
33. Método de acordo com a reivindicação 30, em que a identificação de fluoróforos e/ou a supressão de ruído de fundo utilizam uma troca rápida entre os modos de excitação e fontes de iluminação e suas combinações.
34. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido proporcionamento de um complexo compreende: posicionar ou (1) um primeiro iniciador oligonucleotídico, ou (2) a molécula de ácido nucleico alvo num suporte; hibridar ou (1) a molécula de ácido nucleico alvo com o primeiro iniciador oligonucleotídico, ou (2) o primeiro iniciador oligonucleotídico com a molécula de ácido nucleico alvo posicionada, para formar um complexo da molécula de ácido nucleico alvo com iniciador; e proporcionar a enzima de polimerização de ácido nucleico no complexo da molécula de ácido nucleico alvo com iniciador. ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 6/9
35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que um segundo iniciador oligonucleotidico é hibridado com a molécula de ácido nucleico alvo num local oposto ao hibridado pelo primeiro iniciador oligonucleotidico.
36. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o suporte e, ou o iniciador oligonucleotidico ou a molécula de ácido nucleico alvo, estão ligados de forma reversivel ou irreversível com componentes correspondentes de um par de ligação covalente ou não covalente seleccionado do grupo constituído por um par de ligação antigénio-anticorpo, um par de ligação estreptavidina-biotina, moléculas de acoplamento fotoactivadas e um par de ácidos nucleicos complementares.
37. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o iniciador oligonucleotidico está posicionado no suporte e a molécula de ácido nucleico alvo é hibridada com o iniciador oligonucleotidico posicionado.
38. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a molécula de ácido nucleico alvo está posicionada no suporte e o iniciador oligonucleotidico é hibridado com a molécula de ácido nucleico alvo posicionada.
39. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido proporcionamento de um complexo compreende: posicionar, num suporte, uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla que compreende o ácido nucleico alvo e tem um local de reconhecimento próximo de um local activo onde o análogo de nucleótido está a ser adicionado à cadeia de ácido nucleico em crescimento e proporcionar a enzima de polimerização de ácido nucleico na molécula de ácido nucleico alvo.
40. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido proporcionamento de um complexo compreende: posicionar uma enzima de polimerização de ácido nucleico num suporte, numa posição adequada para que o complexo de ácido nucleico alvo se mova em relação à enzima de polimerização de ácido nucleico. ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 7/9
41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que o suporte e a enzima de polimerização de ácido nucleico estão ligados de forma reversível ou irreversível com componentes correspondentes de um par de ligação covalente ou não covalente seleccionado do grupo que consiste em um par de ligação antigénio-anticorpo, um par de ligação estreptavidina-biotina, moléculas de acoplamento fotoactivadas e um par de ácidos nucleicos complementares.
42. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico ou o ácido nucleico alvo estão posicionados num suporte.
43. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima de polimerização de ácido nucleico ou o ácido nucleico alvo estão posicionados num gel com poros.
44. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido nucleico alvo e a enzima de polimerização de ácido nucleico estão posicionados num suporte sólido.
45. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida identificação é realizada reduzindo o ruído de fundo resultante de análogos de nucleótido livres.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação compreende: dirigir a radiação activadora para uma região que correspondente substancialmente a um local activo onde o análogo de nucleótido está a ser adicionado à cadeia de ácido nucleico crescente; e detectar o análogo de nucleótido polimerizado no local activo.
47. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação distingue entre análogos de nucleótido polimerizados no local activo onde o análogo de nucleótido está a ser adicionado à cadeia de ácido nucleico em crescimento, e análogos de nucleótido livres.
48. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação é realizada numa região confinada ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 8/9 correspondente ao local activo onde o análogo de nucleótido está a ser adicionado à cadeia de ácido nucleico crescente.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a referida identificação é realizada numa nanoestrutura.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que a nanoestrutura é uma nanoestrutura ponteada, acicular ou ressonante, que potência a referida detecção.
51. Método de acordo com a reivindicação 48, em que os análogos de nucleótido que não são polimerizados no local activo se movem rapidamente através de uma microestrutura para, e a partir da região confinada correspondente ao local activo.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que a microestrutura compreende: Uma pluralidade de canais para dirigir diferentes análogos de nucleótido para a região confinada e um canal de descarga para permitir que os materiais sejam removidos da região confinada, e a nanoestrutura compreende: um compartimento que define a região confinada e é construído de modo a facilitar a referida identificação.
53. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação é realizada por potenciação de campo electromagnético, sendo a radiação electromagnética potenciada próximo de um objecto com um raio de curvatura pequeno, adjacente ao local activo.
54. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação é realizada por iluminação de campo próximo de cavidades em que a molécula de ácido nucleico alvo com iniciador está posicionada.
55. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação é realizada com fibras ópticas próximo do complexo. ΕΡ 1 179 085/ΡΤ 9/9 LO Método de acordo com a reivindicação 45, em que a referida identificação e a referida redução de ruido de fundo são realizados ; por atraso controlado no tempo da detecção de fotões. 57. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido método é realizado por sequenciação de diferentes moléculas de ácido nucleico alvo numa pluralidade de localizações numa série. 58 . Método de acordo com a reivindicação 1, em que 0 referido método é realizado por sequenciação simultânea ou sequencial do mesmo ácido nucleico alvo e combinação do resultado desta sequenciação. Lisboa, 2010-08-05