DE3325816C2

DE3325816C2 -

Info

Publication number: DE3325816C2
Application number: DE3325816A
Authority: DE
Inventors: Carol Walker Stanford Calif. Us Mosher; George Low Cupertino Calif. Us Tong; Edward Menlo Park Calif. Us Mc Intosh Acton
Original assignee: SRI International Inc
Current assignee: SRI International Inc
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-18
Publication date: 1990-05-03
Also published as: ES524271A0; CH655729A5; NO157146B; IE831680L; PT77060B; GR78885B; NZ204911A; GB2124224A; FI75174C; DE3325816A1; PT77060A; IE55795B1; FR2530640B1; IT8322143A1; DK332983A; US4464529A; ES8602032A1; FI832637A0; ES530593A0; ATA260883A

Description

Das in US-PS 35 90 529 beschriebene Doxorubicin (Adriamycin®) ist eines der wichtigsten Antikrebsmittel. Zusammen mit Daunorubicin wird es zur Behandlung einer großen Zahl von festen Tumoren sowie von Leukämie eingesetzt. Es scheint jedoch bei Tumorarten, wie Colonkrebs und Melanomen, nicht wirksam zu sein. Außerdem führt Doxorubicin bei langzeitiger Behandlung bei einigen Patienten zu einem irreversiblen Herzschaden, der bei fortgesetzter Behandlung tödlich sein kann. Es besteht somit ein Bedarf nach einem Doxorubicin-Analog, das eine bessere Wirkungsrate, ein breiteres Reaktionsspektrum oder eine verminderte Cardiotoxizität besitzt.

Im Hinblick auf Doxorubicin und seine Anthracyclin-Derivate wird auf den Artikel "Adriamycin" von David W. Henry, ACS Sympsosium Series, Nr. 30, Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, S. 17-57 (1976), sowie die Publikation "Doxorubicin" von Federico Arcamone, Academic Press, 1981, verwiesen.

5-Iminodaunorubicin wird in US-PS 41 09 076 offenbart. Diese Verbindungen unterscheiden sich in ihrer Zuckerkomponente von den hier beanspruchten Verbindungen. Das Doxorubicinanaloge ist in "Synthesis and Preliminary Antitumor Evaluation of 5-Iminodoxorubicin", J. Medicinal Chem. 24, 669 (1981) beschrieben.

3′-Desamino-3′-(4-morpholinyl)-daunorubicin wird in US-PS 43 01 277 offenbart. Diese Verbindung war in 1/40 der Dosis von Doxorubicin aktiv, ergab aber (gegen P 388) einen im wesentlichen identischen T/C-Wert.

Ein reduzierendes Alkylierungsverfahren zur Herstellung neuer halbsynthetischer Anthracyclin-Derivate wird in "Adriamycin Analogs, 3. Synthesis of N-Alkylated Anthracyclines With Enhanced Efficacy and Reduced Cardiotoxicity", J. Medicinal Chem. 22, S. 912-198 (1979) beschrieben.

Auf den Inhalt des vorstehend genannten Standes der Technik wird hiermit Bezug genommen.

Gemäß der Erfindung wird eine Gruppe neuer Daunorubicin- und Doxorubicin-Derivate zur Verfügung gestellt, die die folgende allgemeine Formel aufweisen:

worin R -CO-CH₃, -CHOH-CH₃, -CO-CH₂OH oder -CHOH-CH₂-OH darstellt; X -O, oder =NH bedeutet; A Wasserstoff oder -CN darstellt, mit der Maßnahme, daß, wenn X Sauerstoff bedeutet, A eine CN-Gruppe darstellt.

Die Herstellung der Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) erfolgt dadurch, daß man das bekannte Daunorubicin, Doxorubicin oder Analoge hiervon mit der allgemeinen Formel:

worin R -CO-CH₃ oder -CO-CH₂-OH darstellt, in einem gemischten wäßrigen polaren organischen Medium mit einer Verbindung der allgemeinen Formel

in Anwesenheit eines Cyanoborhydridsalzes, wie eines Alkalicyanoborhydrids, umsetzt, und die gewünschten Verbindungen (A=CN) in an sich bekannter Weise isoliert und reinigt. Diese Verbindungen können dann z. B. mit 0,1 N Salzsäure in die entsprechenden Hydrochloride (A=H) überführt werden.

Die erhaltenen Verbindungen verfügen über zwei vorteilhafte Eigenschaften, nämlich eine hohe Antitumor-Wirksamkeit sowie niedrige Dosiserfordernisse. Aufgrund dessen führen sie zu verminderten dosisbezogenen Nebenwirkungen, wie Cardiotoxizität, im Vergleich zu den bisher bekannten Analogen.

Die Erfindung umfaßt die nachfolgend in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen:

Tabelle 1

Die folgenden Verbindungen haben sich als besonders bevorzugt erwiesen:

3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-doxorubicin;
3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-dihydrodoxorubicin;
3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubicin,
3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-dihydrodaunorubicin,
und
3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin.

Am meisten bevorzugt ist 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-doxorubicin.

Die ersten vier Verbindungen von Tabelle 1 können die dort angegebenen freien Basen oder pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze derselben darstellen. Die Säureadditionssalze bilden den Vorteil, daß sie in Wasser und wäßrigen gemischten Lösungsmitteln, wie Wasser-Alkanolen oder Wasser-Alkandiolen, löslich sind. Beispiele dieser gemischten Lösungsmittel sind Wasser-Propylenglykol, Wasser-Ethanol, Wasser-Ethylenglykol, Kochsalzlösung, verschiedene andere wäßrige injizierbare Medien und dergleichen. Die freien Basen sind in wenig polaren organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Methylenchlorid, Chloroform-Methanol-Lösungsmittelgemischen und dergleichen löslich. Sie können auch als Suspensionen verwendet werden.

Die Salze sind die Säureadditionsprodukte der freien Basen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure. Eine "phar mazeutisch annehmbare" Säure ist eine solche, die nicht toxisch ist und allgemein in pharmazeutischen Produkten ver wendet wird. Beispiele dieser Säuren sind anorganische Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und organische Säuren, wie die Carbonsäuren, z. B. Essig-, Glykol-, Malein-, Äpfel-, Hydroxymalein-, Wein-, Citronen- und Salicylsäure, und die Organosulfonsäuren, z. B. Methansulfon- und p-Toluolsulfonsäure. Mischungen von zwei oder mehr Säuren können verwendet werden sowie Mischungen einer oder mehrerer freier Basen puls einem oder mehreren Säureadditionssalzen. Aus Gründen der Einfachheit und leichten Löslichkeit werden Additionssalze der Salz- und Brom wasserstoffsäure bevorzugt.

Im folgenden wird die Herstellung einiger bevorzugter Verbindungen der Erfindung beschrieben.

Diese Verbindungen können gemäß folgendem allgemeinen Schema erhalten werden:

Zuerst setzt man kommerziell erhältliches Daunorubi cin oder Doxorubicin (als Säureadditionssalz) mit 2,2′-Oxydiacetaldehyd

unter reduzierenden Alkylierungsbedingungen um. Diese Alkylierung ergibt ein ge mischtes Produkt, das vier Hauptbestandteile enthält. Im Falle von Daunorubicin sind dies:

3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-daunorubicin,
3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin,
3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubicin und 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13-dihydrodauno rubicin.

Im Falle von Doxorubicin enthält das Reaktionsprodukt:

3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-doxorubicin,
3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin,
3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-doxorubicin und 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin.

2,2′-Oxydiacetaldehyd kann durch Säurehydrolyse von 2,2′- Oxydiacetaldehyd-bis-(diethylacetal) der Formel

gemäß dem Verfahren von Field et al., BE-PS 655 436, oder durch Spaltung von 1,4-Anhydroerythrit der Formel

gemäß dem Verfahren von Barry et al., Carbohydrate Research, 7, 299 (1968), und Greenberg et al., Carbohydrate Research, 35, 195 (1974), gebildet werden.

Die reduktive Alkylierung kann unter Verwendung eines Überschusses des Dialdehyds in einem gemischten wäßrigen polaren organischen Medium, wie Wasser-Acetonitril, im allge meinen bei einem pH-Wert von etwa 7 in Anwesenheit eines Alkalimetallcyanoborhydrids, z. B. Natrium- oder Kaliumcyanoborhydrid, durchgeführt werden. Dies ist eine relativ leichte Reaktion, die üblicherweise in 1 h oder weniger bei Raumtemperatur beendet werden kann. Die reduktive Alkylierung wird in den Beispielen erläutert und ist auch in der vorher genannten US-PS 43 01 277 und in J. Medicinal Chem. 25, S. 18-24 (1982), beschrieben.

Das Aufarbeiten des gemischten Reaktionsproduktes kann gemäß jedem Verfahren erfolgen, das die gewünschte Isolierung und Abtrennung erlaubt. Säureextraktion des Reaktionsproduk tes ist wirksam, um die säureextrahierbaren nicht-cyano-sub stituierten Materialien von den säureunlöslichen cyanosub stituierten Materialien abzutrennen. Die resultierenden Paare an Materialien können dann durch verschiedene chromato graphische Methoden, wie präparative Schichtchromatographie, Säulenchromatographie oder präparative Hochleistungs-Flüssig chromatographie, in die einzelnen Verbindungen getrennt wer den.

Die 5-Iminoverbindungen können leicht und direkt aus den iso lierten 5-Oxoverbindungen unter Anwendung des im vorstehend genannten Artikel aus J. Medicinal Chem. 24, S. 669 (1981), offenbarten Verfahren hergestellt werden. Bei diesem Verfahren werden die 5-Oxoverbindungen mit einem Überschuß an alkoholischem Ammo niak bei niedrigen bis mäßigen Temperaturen, wie von -25°C bis +25°C, während 1/2 bis etwa 100 h in Berührung gebracht. Im Falle von 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-doxorubicin und 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-doxorubicin ist es not wendig, die Hydroxygruppe am 14-Kohlenstoffatom vor der Be handlung mit Ammoniak zu schützen. Es kann jede milde säure labile Schutzgruppe verwendet werden. Wegen ihrer weitver breiteten Anwendung in der pharmazeutischen Chemie ist die Methoxytritylgruppe eine bevorzugte Schutzgruppe. Die Trityl funktionalität kann eingeführt werden, indem 3′-Desamino-3′- (4′′-morpholinyl-doxorubicin oder 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano- 4′′-morpholinyl)-doxorubicin mit überschüssigem p-Anisylchlor diphenylmethan bei Raumtemperatur behandelt wird. Nach Beendigung der Reaktion mit Ammoniak kann die 14-Hydro xylgruppe durch Behandlung mit Säure, wie Essigsäure oder kalter wäßriger Trifluoressigsäure regeneriert werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne daß diese hierauf beschränkt sein soll.

Beispiel 1 Herstellung, Isolierung und Identifizierung von 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubicin

A. Gemäß dem Verfahren zum Herstellen von 3′-Desamino-3′-mor pholinodaunorubicin-hydrobromid, gezeigt in Mosher et al., J. Medicinal Chem. 25, S. 18-24 (1982)), wurde ein rohes Reaktionsprodukt enthaltend 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)- daunorubicin, 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-13-dihydrodauno rubicin, 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubicin und 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13-dihydrodauno rubicin hergestellt. (Dieser Artikel ist für Bezugszwecke ge nannt.) Das Rohmaterial wurde mit CHCl₃ extrahiert, wie dort angegeben, um die vier primären Produkte in die CHCl₃-Phase zu entfernen. Erschöpfende Extraktion der CHCl₃-Phase mit 0,01 n HCl entfernte die beiden basischen Morpholinprodukte, wie im Bezugsartikel beschrieben. Das neutrale produktreiche CHCl₃ wurde mit NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet und ein gedampft. Proben wurden in 4 : 1 CHCl₃·CH₃OH gelöst und auf eine HPLC-Säule aufgebracht und mit 2 ml/min eines 65 : 35 0,05 M pH4 Citratpuffer : CH₃CN-Eluierungsmittels eluiert. Ein Material (gewöhnlich 19 bis 24% der Gesamt masse) eluierte bei 6,1-6,8 min, während ein anderes Ma terial (gewöhnlich 26 bis 27%) bei 11,9 min eluierte. Der Nachweis erfolgte durch UV bei 254 nm. Wie sich zeigte, war das 6,1-6,8 min-Material 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-mor pholinyl)-13-dihydrodaunorubicin und das 11,9 min-Material 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubicin.

B. In größerem Maßstab wurden 5,41 g festes Nebenprodukt in 500 ml 9 : 1 CHCl₃-CH₃OH gelöst. Diese Lösung wurde dreimal mit je 100 ml 0,01 n HCl, einmal mit 100 ml H₂O und einmal mit 100 ml verdünntem NaHCO₃ gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet, zur Trockene eingedampft und der Rückstand im Vakuum bei 13,30 Pa und Raumtemperatur getrocknet, wobei 5,10 g glasartiger Rückstand erhalten wurden. Die wäßrige Phase wurde auch zurückgehalten.

C. 5,09 g des glasartigen Rückstandes von B. wurden in 50 ml 4 : 1 CH₂Cl₂-CH₃OH gelöst. Die Lösung wurde gerührt, wobei 30 ml CH₃CN tropfenweise zugegeben wurden. Die sich ergebende trübe Lösung wurde zur Trockene eingedampft, wobei ein halb fester Rückstand erhalten wurde, der mit 200 ml CH₃CH im Dunkeln zerrieben wurde. Der unlösliche Feststoff wurde gesammelt und ein zweites Mal mit 100 ml CH₃CN zerrieben. Die flüssigen Phasen der beiden Zerreibungen enthielten das gewünschte Produkt. Sie wurden eingedampft, wobei 2,23 g eines halb festen Rückstandes erhalten wurden.

D. Der halbfeste Rückstand von C. wurde in 5 ml CH₂Cl₂ ge löst und auf eine 3,1 cm×59 cm Säule von mit CH₂Cl gewaschenem 200-325 mesh Silikagel aufgebracht. Die Säule wurde mit 500 ml CH₂Cl₂ und dann mit 99 : 1 1500 ml; 98 : 2 1000 ml; 97 : 3 1500 ml; und 90 : 10 500 ml CH₂Cl₂-CH₃OH eluiert. Nach Sammeln (10 ml-Fraktionen, durch TLC beobachtet) von 2550 ml Anfangseluat wurde eine 190 ml Fraktion eingedampft, wobei 0,48 g Produkt erhalten wurden. Die primäre Komponente wurde durch vergleichende HPLC und TLC als identisch mit einer Verbindung bestimmt, die sich später als 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubi cin erwies.

E. Eine 0,35 g-Probe des Materials von D. wurde weiter zu erst im Dunkeln auf fünf 2 mm×20×20 cm-Silikagelplatten mit zwei CH₂Cl₂-CH₃OH 29 : 1-Entwicklungen gereinigt. Eine Mittelbande enthaltend 65% der aufgebrachten Probenmasse wurde herausgeschnitten, eluiert, filtriert und zur Trockene eingedampft.

F. Das Produkt von E. zusammen mit anderen äquivalent ge reinigten Materialien, die aus angrenzenden chromatographischen Zonen gewonnen worden waren (0,18 g), wurde einer Endreinigung auf einer 1,1 cm×27 cm Säule von 200-400 mesh-Silikagel unterworfen. Die Säule wurde mit 80 : 20 30 ml; 60 : 40 30 ml; 40 : 60 30 ml; 20 : 80 30 ml CH₂Cl₂ EtOAc und dann 175 ml EtOAc eluiert. Nach Sammeln (2 ml-Fraktionen, durch TLC beobachtet) von 162 ml Anfangseluat wurde eine 88 ml- Fraktion gesammelt und eingedampft, wobei 0,15 g Produkt erhalten wurden.

Elementaranalyse dieses reinen Materials bestätigte, daß die Struktur jene von 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)- daunorubicin war, wie es auch bei 360 MHz NMR, UV, IR und Massespektroskopie der Fall war.

Das Vorliegen dieses Produktes als eine Diastereoisomeren mischung wurde durch HPLC und 360 MHz NMR-Analyse gezeigt. HPLC-Analyse auf einer Säule mit 0,05 M pH 4 Citratpuffer-CH₃CN (60 : 40) mit 2 ml/min zeigte zwei eng nebeneinander befindliche Peaks (bei 9,6 min und 10,2 min) im Verhältnis von 53 : 44. Das 360 MHz NMR-Spektrum dieses Materials zeigte zwei Resonanzen für die 6-OH-, 11-OH-, 1-H-, 2-H-, 3-H-, 1′-H-, 7-H-, 9-OH-, 10A-H, 14-H₃- und 6-H₃-Protonen.

360 MHz NMR CDCl₃ δ 13,99, 13,98 (2s, 6-OH), 13,25, 13,24 (2s, 11-OH), 8,02, 8,00 (2d, 1-H), 7,79, 7,77 (2t, 2-H), 7,40, 7,38 (2d, 3-H), 5,59 5,56 (2d, 1′-H), 5,29, 5,26 (2bs, 7-H), 4,47*, 4,34* (2s, 9-OH), 4,08 (s, OCH₃), 3,97-4,07 (m, 2′′ B-H, 5′-H), 3,92 (t, J=12 Hz 3′′-H), 3,74 (m, 2′′A-H), 6′′B-H), 3,68 (bs, 4′H), 3,58 (t, J=12 Hz, 6′′A-H), 3,20 (d, J=19 Hz, 10B-H), 2,91, 2,90 (2d, J=19 Hz, 10A-H) 2,75-2,95 (m, 3′-H), 2,68 (m, 5′′-H₂), 2,43, 2,42 (2s, 14-H₃), 2,35 (m, 8B-H), 2,13 (m, 8A-H), 1,70-2,0 (m, 2′-H₂), 1,86 (austauschbar mit D₂O) (s, 4′-OH, H₂O), 1,37, 1,36 (2d, J=6,4 Hz), 6-H₃)
Massespektrum:
[als die Trimethylsilyl (TMS)-Derivate], m/e 910 [M(TMS)₄], 895 [M(TMS)₄-Me], 883 [M(TMS)₄-HCN], 838 [M(TMS)₃], 823 [M(TMS)₃-Me], 811 [M(TNS)₃-HCN], MS bei 70 ev. zeigte ein Basenpeak (HCN) bei m/e 27.

Beispiel 2 Isolierung von 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)- 13-dihydrodaunorubicin

In Beispiel 1, Teil D., wurde eine Mischung von 3′-Desamino- 3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-daunorubicin und 3′-Desamino-3′- (3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin chromatogra phiert und eine Reihe von Fraktionen genommen. Nach Sammeln von 3460 ml Eluens wurde eine 430 ml-Fraktion ent haltend 12,5% des anfänglich beladenen Materials im wesent lichen als einzige Komponente gesammelt und eingedampft. Die Verbindung dieser Fraktion wurde durch HPLC als identisch mit einem Material bestimmt, das vorher durch NMR und Masse spektrokopie als 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13- dihydrodaunorubicin charakterisiert worden war. Dieses Material konnte im wesentlichen durch die in Beispiel 1, Teil E. und F., gezeigten Verfahren gereinigt werden, wobei im wesent lichen reines 3′-Desamino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13-di hydrodaunorubicin erhalten wurde.

Beispiel 3 Isolierung von 3′-Desamino-3′-(4′′-morpho linyl)-daunorubicin und 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-13-di hydrodaunorubicin

In Beispiel 1, Teil A. und B., wurde die 0,01 n HCl-Phase enthaltend 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-daunorubicin und 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin isoliert. Diese wäßrige Phase enthielt etwa 40% des beladenen Ma terials. Diese wäßrige Phase wurde dann unter Verwendung des in J. Medicinal Chem. 25 (oben erwähnt) gezeigten Verfah rens aufgearbeitet, wobei 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)- daunorubicin und 3′-Desamino-3′-(4′′-morpholinyl)-13-dihydro daunorubicin als getrennte isolierte Verbindungen erhalten wurden.

Beispiel 4 Herstellung und Isolierung von 3′-Desamino- 3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-doxorubicin und 3′-Des amino-3′-(3′′-cyano-4′′-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin

A. Bei einer Reaktion analog der in dem Artikel in J. Medi cinal Chem. 25, gezeigten wurden zu einer gerührten Lösung von 6,25 g (60,0 mMol) 1,4-Anhydroerythrit

in 75 ml H₂O, im Wasserbad auf 15 bis 20°C gekühlt, 6,42 g (30,0 mMol) Natriummetaperjodat zugegeben. Die resultierende klare Lösung wurde 17 h bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit NaHCO₃ von 4,0 auf 7,3 eingestellt und dann unter Rühren mit 75 ml CH₃CN verdünnt. Es bildete sich ein Niederschlag. Die Mischung wurde gerührt und 0,126 g (2,0 mMol) NaBH₃CN in 5 ml 1 : 1 (Vol.) CH₃CN-H₂O wurden zugesetzt. Zu dieser Mischung wurden danach 1,16 g (2,0 mMol) Doxorubicinhydrochlorid in 30 ml 1 : 1 CH₃CN-H₂O zugegeben. Nach 10 min wurde die Reaktionsmischung mit 50 ml verdünntem NaHCO₃ verdünnt und dreimal mit 50 ml- Portionen CHCl₃ extrahiert. Dieser rohe Extrakt enthielt 3′- Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-doxorubicin, 3′-Desamino-3′-(4″- morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin, 3′-Desamino-3′-(3″-cyano- 4″-morpholinyl)-doxorubicin und 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″- morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin. Die vereinigten Extrakte wurden fünfmal mit je 25 ml 0,1 n Essigsäure und dann mit H₂O extrahiert und mit verdünntem NaHCO₃ und gesättigtem wässerigen NaCl gewaschen. Die saure wässerige Phase wurde zurück gehalten. Die Chloroformphase wurde über NaSO₄ getrocknet, durch Diatomeerde filtriert und konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde in 25 ml CHCl₃ gelöst und das Lösungsmittel unter Vakuum bei Raumtemperatur wieder abgedampft. Dabei wurden 0,518 g (40%) eines dunkelroten geschäumten Glases erhalten.

B. Eine Probe des geschäumten Glases von A. wurde in CH₃CN gelöst und in eine HPLC-Säule eingespritzt und mit pH 4,0 0,05 M Citratpuffer-CH₃CN 55 : 45 mit 2 ml/min eluiert. Das Eluieren von Verbindungen wurde bei 254 nm festgestellt. Bei 2,3 min erhielt man ein Material in 13%iger Ausbeute (bezogen auf die Einspritzmischung), das als 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin identifiziert wurde, und bei 3,8 min erhielt man in 69%iger Ausbeute 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-doxorubicin. Andere ähnliche vereinigte Produkte wurden erhalten und durch HPLC getrennt.

C. Das Isolieren von 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)- doxorubicin und 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-13- dihydrodoxorubicin wurde anschließend wie folgt wiederholt:

Eine 0,424-g-Probe des geschäumten Glases von A. wurde in 1,5 ml CH₂Cl₂ gelöst und auf eine 1,5×35,5 cm Säule von mit CH₂Cl₂ gewaschenem 200-400 mesh Silikagel aufgebracht. Die Säule wurde mit 50 ml CH₂Cl₂ und dann 99 : 1 150 ml; 98 : 2 150 ml; 97 : 3 300 ml; 95 : 5 100 ml und 90 : 10 300 ml CH₂Cl₂- CH₃OH eluiert. Nach Sammeln von 445 ml des Anfangseluats wurde eine 80 ml-Fraktion eingedampft, wobei 0,217 g Produkt erhalten wurden. Dieses Material wurde mit 0,039 g gereinigtem Produkt aus einer früheren Herstellung kombiniert und die Mischung in 2 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 10 ml CH₃OH verdünnt und zur Trockene eingedampft. Das Zerreiben dieses Rückstandes mit 5 ml CH₃OH ergab 0,218 g 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-doxo rubicin.

HPLC und 400 MHz NMR-Analyse zeigten, daß dieses Produkt eine Diastereoisomerenmischung war. HPLC-Analyse auf einer Waters Radial-Pak C-18-Säule mit 0,05 M pH 4 Citratpuffer-CH₃CN (65 : 35) mit 2 ml/min zeigte zwei eng nebeneinander befindliche Peaks (bei 14,4 min und 15,7 min) im Verhältnis von 58 : 39. Das 400 MHz-Spektrum dieses Materials zeigte zwei Resonanzen für die 1-H-, 2-H-, 3-H-, 1′-H-, 7-H-, 14-H₂-, 9-OH-, OCH₃-, 10A-H- und 6′-H₃-Protonen.

400 MHz NMR CDCl₃ δ 14,02 (s, 6-OH), 13,26 (s, 11-OH), 8,05, 8,04, (2d, 1-H), 7,80, 7,79 (2t, 2- H), 7,41, 7,40 (2d, 3-H), 5,61, 5,57 (2d, 1′-H), 5,34, 5,30 (2m, 7-H), 4,79, 4,78 (2s, 14-H₂), 4,54, 4,42 (2s, 9-OH), 4,11, 4,10 (2s, OCH₃), 4,05 (m, 5′-H), 3,97 (m, 2″B-H, 3″-H, 6″B-H), 3,71 (m, 4′-H, 6″A-H), 3,58 (t, 2″A-H), 3,30 (d, J=19 Hz, 10B-H), 3,07, 3,06 (2d, 10A-H), 3,03 (m, 3′-H), 2,69 (m, 5″-H₂), 2,38 (m, 8B-H), 2,22 (m, 8A-H), 1,84 (m, 2′-H₂), 1,61 (s, H₂O), 1,40, 1,39 (2d, J=6,5 Hz, 6′-H₃).

UV-Vis (CH₃OH) max. 234 nm (ε 40 100), 252 (27 700), 289 (9 420), 478 (13 000), 495 (12 900), 530 (7 190). Massespektrum [als das Trimethylsilyl (TMS)- Derivat], m/e 899 M(TMS)₄-HCN.

Berechnet für: C₃₂H₃₄N₂O₁₂ · 2H₂O
C 56,97; H 5,68; N 4,15;
gefunden:
C 57,07; H 5,37; N 4,17.

Weiteres Eluieren der obigen Säule ergab 0,041 g 3′-Desamino- 3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin. UV-Vis (CH₃OH) max. 234 nm (ε 37 400), 252 (28 000), 289 (9390), 475 (12 700), 496 (12 800), 530 (7410). Masse spektrum [als das Trimethylsilyl (TMS)-Derivat], m/e 985 M (TMS)₅-CH₃, 973 M (TMS)₅-HCN.

Berechnet für: C₃₂H₃₆N₂O₁₂ · 1-1/2 H₂O
C 57,57; H 5,89; N 4,20;
gefunden:
C 57,35; H 5,94; N 3,82.

Beispiel 5 Isolierung von 3′-Desamino-3′-(4″- morpholinyl)-doxorubicin und 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)- 13-dihydrodoxorubicin

A. Die saure wässerige Phase, die gemäß A. von Beispiel 4 erhalten worden war, wurde mit NaHCO₃ basisch gemacht und mit CHCl₃ extrahiert. Die CHCl₃-Phase wurde mit gesättigtem NaCl gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Diatomeenerde filtriert, konzentriert und getrocknet, wobei 0,828 g eines roten Schaumes erhalten wurden, von dem durch HPLC, 90 MHz NMR, 300 MHz NMR, UV-Vis-Spektroskopie und Masse spektroskopie gezeigt wurde, daß er zwei primäre Komponenten, 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-doxorubicin und 3′-Desamino-3′- (4″-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin enthielt.

B. Eine Ansammlung von 0,98 g des geschäumten Glases, wie es in Teil A. hergestellt worden war, wurde zubereitet. Dieses Material wurde in 3 ml CH₂Cl₂ gelöst und auf einer 2,2×33 cm-Silikagelsäule chromatographiert. Die Säule wurde mit 50 ml CH₂Cl₂ und dann 99 : 1 300 ml, 98 : 2 300 ml, 97 : 3 900 ml und 90 : 10 700 ml CH₂Cl₂-CH₃OH eluiert. Nach Sammeln von anfänglichen 1170 ml Eluens wurde eine 490 ml- Fraktion isoliert und eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wurde. Der Rückstand enthielt 45% der beladenen Probe und durch HPLC war ersichtlich, daß es sich um im wesentlichen reines (99+%) 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)- doxorubicin handelte.

90 MHz NMR CDCl₃ δ 13,88 (s, 6-OH), 13,07 (s, 11-OH), 7,90 (d, J=8 Hz, 1-H), 7,72 (t, J= 8 Hz, 2-H), 7,38 (d, J=8 Hz, 3-H), 5,51 (bs, 1′-H), 5,20 (bs, 7-H), 4,75 (s, 14-H₂), 4,68 (s, 9-OH), 4,07 (s, OCH₃), 3,98 (m, 5′-H), 3,67 (m, 4′-H, 2″-H₂, 6″- H₂), 3,09 (d, J=19 Hz, 10B-H), 2,83 (d, J=19 Hz, 10A-H), 2,80-3,20 (m, 3′-H), 2,50-3,00 (bs, 4′-OH, 14- OH), 1,95-2,65 (m, 8-H₂, 3″-H₂, 5″-H₂), 1,80 (m, 2′- H₂), 1,38 (d, J=6,5 Hz, 6′-H₃). Massespektrum [als die Trimethylsilyl (TMS)-Derivate], m/e 973 M(TMS)₅, 901 M(TMS)₄.

Die freie Base wurde in H₂O suspendiert und mit 0,1 n HCl auf 4,4 angesäuert. Die resultierende Lösung wurde gefriergetrocknet und das Produkt in CH₃OH gelöst und mit 10 Volumsteilen Ether ausgefällt, wobei das Hydrochlorid erhalten wurde.

Berechnet für: C₃₁H₃₅NO₁₂ · 2H₂O
C 54,27; H 5,88; Cl 5,17; N 2,04;
gefunden:
C 54,08; H 5,35; Cl 4,78; N 2,00.

UV-Vis (CH₃OH) max. 234 nm (ε 39 000), 252 (26 300), 290 (8990), 480 (12 600), 495 (12 500), 530 (6700).

Es wurde eine 190 ml-Fraktion und danach eine 160 ml-Fraktion genommen. Diese letztere Fraktion wurde eingedampft und es wurde gefunden, daß sie 19,5% des beladenen Materials als 97%ig reines 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-13-dihydro doxorubicin enthielt.

300 MHz NMR CDCl₃ δ 13,98, 13,96 (2s, 6-OH), 13,34, 13,32 (2s, 11-OH), 8,03 (d, 1-H), 7,79 (t, 2-H), 7,40 (d, 3-H), 5,56 (bs, 1′-H), 5,29 (bs, 7-H), 4,64, 4,59 (2s, 9-OH), 4,09 (s, OCH₃), 4,03 (m, 5′-H), 3,82-4,05 (m, 4′-H, 13-H), 3,68 (m, 2″-H₂, 6″-H₂, 14B-H), 3,54 (bs, 14A-H), 3,30 (m, 10B-H), 2,98 (bs, OH), 2,87 (bs, OH), 2,77 (m, 10A-H, 3′-H), 2,30-2,70 (m, 8B-H, 3″-H₂, 5″-H₂), 1,99 (m, 8A-H), 1,78 (m, 2′- H₂), 1,41 (d, 6′-H₃). Massespektrum [als das Trimethylsilyl (TMS)-Derivat] m/e M(TMS)₅.

Beispiel 6 Herstellung von 3′-Desamino-3′-(4″- morpholinyl)-5-iminodoxorubicin

A. Zu einer Lösung von 0,396 g 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)- doxorubicin, hergestellt wie in Beispiel 5 gezeigt, in 5 ml trockenem Pyridin wurden 0,990 g p-Anisylchlordiphenylmethan zugesetzt. Die Mischung wurde im Dunkeln etwa 2 Tage lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Lösung wurde in Eiswasser gekühlt und 0,5 ml CH₃OH wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 2 h gerührt und zu 50 ml verdünntem NaHCO₃ zugesetzt und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die Extrakte wurden konzentriert, wobei ein gummiartiger Rückstand erhalten wurde, der in Toluol gelöst, konzentriert, in CH₂Cl₂ gelöst und durch langsames Zusetzen von Petrolether (35-60°C) ausgefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde gewonnen, in CH₂Cl₂ wieder gelöst und mit 2 : 1 Petrolether: Diethylether ausgefällt, wobei 14-O-p-Anisyldiphenylmethyl-3′-desamino-3′-(4″-morpholinyl)- doxorubicin (III) als amorpher Feststoff in 94%iger Ausbeute erhalten wurde.

Dieses Material wurde durch 90 MHz NMR in CDCl₃ identi fiziert.

B. Eine Lösung von 0,532 g 14-O-p-Anisyldiphenylmethyl- 3′-desamino-3′-(4″-morpholinyl)-doxorubicin in 10 ml CH₂Cl₂ wurde zu 30 ml CH₃OH, mit Ammoniak gesättigt, bei 0°C zugesetzt. Die Mischung wurde 1 h bei 0°C gerührt und dann 27 h bei 3°C stehen gelassen. Das Lösungsmittel im Reaktionsprodukt wurde abgedampft. Der Rückstand wurde in 4 : 1 CH₂Cl₂-CH₃OH gelöst und konzentriert. Dies wurde zweimal wiederholt und der Feststoff in CH₂Cl₂ gelöst, durch Diatomeenerde filtriert, konzentriert, in 1 : 2 CH₂Cl₂-CH₃OH gelöst, wieder konzentriert und getrocknet, wobei 0,52 g (97%) eines violetten Rückstandes erhalten wurden.

C. Der Rückstand von B. wurde in 2 ml CH₂Cl₂ gelöst und auf eine 1,5×40 cm Silikagelsäule aufgebracht und mit 50 ml CH₂Cl₂ und dann 99 : 1 150 ml; 98 : 2 150 ml; 97 : 3 500 ml; 95 : 5 100 ml; 93 : 7 100 ml und 90 : 10 200 ml CH₂Cl₂-CH₃OH eluiert. Nach 565 ml Eluens wurde eine 335 ml-Fraktion abgetrennt, filtriert und eingedampft, die 59,9% der aufgebrachten Probe als einzige Verbindung enthielt. Diese Verbindung wurde durch 90 MHz NMR als 14-O-p-Anisyldiphenylmethyl-3′-desamino-3′-(4″-morpholinyl)- 5-iminodoxorubicin identifiziert.

D. Eine 0,341 g-Probe des Produktes von C. wurde in 20 ml 80%iger Essigsäure gelöst und die Lösung im Dunkeln 7 h gerührt. Die Lösung wurde dann mit 50 ml Wasser verdünnt und dreimal mit CHCl₃ extrahiert. Die wässerige Phase enthielt das gewünschte Produkt und wurde im Dunkeln gefriergetrocknet, wobei 0,294 g Feststoff erhalten wurden. Der Feststoff wurde in 0,1 n Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde mit CHCl₃ gewaschen, mit NaHCO₃ basisch gemacht und mit CHCl₃ extrahiert. Das gewünschte Produkt ging in die organische Phase, die gewaschen, getrocknet, filtriert und konzentriert wurde, wobei ein Rückstand erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde in 1 : 10 CHCl₃-CH₃OH gelöst, konzentriert und getrocknet, wobei 0,228 g 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin erhalten wurden. Die Identität dieses Materials wurde durch 300 MHz NMR und Elementaranalyse bestätigt.

Beispiel 7 Herstellung des Säureadditionssalzes

Das freie Basenprodukt von Beispiel 6 wurde in 20 ml Wasser suspendiert. Die Mischung wurde gerührt und 3,2 ml 0,1 n HCl wurden langsam zugesetzt, um einen pH von 4,5 zu ergeben. Der suspendierte Feststoff wurde allmählich gelöst. Die Lösung wurde im Dunkeln gefriergetrocknet, wobei das Säureadditionssalz 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-5-iminodoxorubicinhydrochlorid in 97+%iger Reinheit (HPLC Analyse) erhalten wurde.

Berechnet für: C₃₁H₃₆N₂O₁₁ · HCl · 2H₂O
C 54,35; H 6,03; Cl 5,17; N 4,09;
gefunden:
C 54,20; H 5,96; Cl 4,33; N 4,03.

Beispiel 8 Herstellung und Isolierung von 3′-Desamino- 3′-(4″-morpholinyl)-5-imino-13-dihydrodoxorubicin

A. Eine Lösung von 0,186 g 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-13- dihydrodoxorubicin, hergestellt wie in Beispiel 5, in 6 ml 1 : 1 CH₂Cl₂-CH₃OH wurde zu 20 ml CH₃OH, mit Ammoniak gesättigt, bei 0°C zugesetzt. Die Mischung wurde 1 h gerührt und dann etwa 27 h bei 3°C gelagert und konzentriert und das verbliebene Produkt in 4 : 1 CH₂Cl₂-CH₃OH gelöst und dreimal konzentriert, um Ammoniak vollständig zu entfernen. Der resultierende Rückstand wurde durch prärative Dünnschichtchromatographie auf 2 mm×20 cm×20 cm-Silikagelplatten unter Anwendung von 9 : 1 CHCl₃-CH₃OH-Entwicklung gereinigt. Banden, die im wesentlichen reines 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-5-imino-13-di hydrodoxorubicin enthielten, wurden abgetrennt, eluiert und das Eluens getrocknet, wobei 0,139 g freies Basenprodukt erhalten wurden, das durch 300 MHz NMR identifiziert wurde.

B. Die freie Base von A. wurde durch das Verfahren von Beispiel 7 in das Hydrochlorid überführt. Bei HPLC-Analyse erwies sich das Hydrochlorid als zu 97 bis 98% rein.

Berechnet für: C₃₁H₃₈N₂O₁₁ · HCl · 2H₂O
C 54,19; H 6,31; Cl 5,16; N 4,08;
gefunden:
C 54,17; H 5,95; Cl 4,88; N 3,87.

Beispiel 9 Herstellung von 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″- morpholinyl)-5-iminodaunorubicin

Eine Lösung von 0,031 g 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-mor pholinyl)-daunorubicin in 1,0 ml CH₂Cl₂ wurde zu 5 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol bei 0°C zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min gerührt und dann 45 h bei 3°C gelagert. Das Produkt dieser Reaktion wurde zur Trockene eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wurde, der in 5 ml 19 : 1 CHCl₃-CH₃OH gelöst und eingeengt wurde. Dieser Schritt wurde wiederholt. Der Rückstand wurde in CHCl₃-CH₃OH gelöst und auf eine 2 mm×20 cm×20 cm- Silikagelplatte aufgebracht und unter Verwendung von 9 : 1 CHCl₃-CH₃OH entwickelt. Die Hauptbande wurde eluiert und analysiert. Massespektroskopie bestätigte, daß die Verbindung 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-5-iminodaunorubicin war.

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-doxorubicin, erhalten wie in Beispiel 4 beschrieben, als Ausgangsmaterial anstelle von 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-doxorubicin ver wendet wurde. Die Sequenz Schützen - Aminieren - Entfernung von Schutzgruppen - Isolierung von Beispiel 6 wird dazu verwendet, 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin als Endprodukt zu erhalten.

Im einzelnen erfolgte diese Herstellung wie folgt:

A. Zu einer Lösung von 0,241 g 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″- morpholinyl)-doxorubicin, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, in 4 ml trockenem Pyridin wurden 0,587 g p-Anisyl chlordiphenylmethan zugesetzt. Die Lösung wurde im Dunkeln 44 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt, mit 0,5 ml CH₃OH verdünnt, bei Raumtemperatur 3 h gerührt und dann zu 50 ml verdünntem NaHCO₃ zugesetzt und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die Extrakte wurden konzentriert, der Rückstand in 3 ml CH₂Cl₂ gelöst und durch langsames Zugeben von 40 ml Diethylether ausgefällt, wobei 0,333 g (97%) 14-O-p- Anisyldiphenylmethyl-3′-desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)- doxorubicin erhalten wurden.

90 MHz NMR CDCl₃ δ 13,84 (s, 6-OH), 12,99 (s, 11-OH), 7,82 (d, 1-H), 6,70-7,75 (m, 2-H, 3-H, Trityl-aryl), 5,42 (bs, 1′-H), 5,08 (bs, 7-H), 4,45 (bs, 2, 14-H₂), 4,19 (s, 9-OH), 4,00 (s, OCH₃), 3,79 (s, OCH₃), 3,30- 4,15 (m, 4′-H, 5′-H, 2″-H₂, 3″-H, 6″-H₂), 1,60-3,10 (m, 2′-H₂, 8-H₂, 5″-H₂, 10-H₂, 3′-H), 1,13 (d, 6′-H₃).

B. Eine Lösung von 0,369 g 14-O-p-Anisyldiphenylmethyl-3′- desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-doxorubicin in 8 ml CH₂Cl₂ wurde zu 25 ml CH₃OH, mit Ammoniak gesättigt, bei 0°C zugesetzt. Die Mischung wurde 1 h bei 0°C gerührt und dann 26 h bei 3°C stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde eingedampft, um Ammoniak vollständig zu entfernen, und es wurden 0,376 g eines violetten Rückstandes erhalten.

C. Der Rückstand von B. in 1,5 ml CH₂Cl₂ wurde auf eine 1,5× 28 cm (200-400 mesh)-Silikagelsäule aufgebracht und mit 50 ml CH₂Cl₂ und dann 99 : 1 200 ml; 98 : 2 300 ml; 97 : 3 100 ml; 95 : 5 100 ml und 90 : 10 200 ml CH₂Cl₂-CH₃OH eluiert. Nach Sammeln von 360 ml Anfangseluat wurde eine 125 ml-Fraktion eingedampft, wobei 0,203 g 14-O-p-Anisyldiphenylmethyl-3′-desamino- 3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin erhalten wurden.

D. Eine 0,158 g-Probe des Rückstandes von C. wurde auf 0°C gekühlt und in 8 ml eiskalter 50%iger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wurde 2 min bei 0°C gerührt und dann in 100 ml Eiswasser gegossen. Die wässerige Mischung wurde viermal mit je 10 ml CHCl₃ extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden mit verdünntem NaHCO₃ und H₂O gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, durch Diatomeenerde filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde in 3 ml 4 : 1 CHCl₃-CH₃OH gelöst; die Lösung wurde gerührt und 25 ml Ether wurden tropfenweise zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, wobei 0,093 g 3′-Desamino- 3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin erhalten wurden.

HPLC- und 300 MHz NMR-Analyse zeigten, daß dieses Material eine Diastereoisomerenmischung war. HPLC-Analyse auf einer Säule mit 0,05 M pH 4 Citratpuffer-CH₃OH (40 : 60) zeigte Peaks bei 18,4 min und 25,0 min im Verhältnis von 69 : 31. Das 300 MHz-Spektrum dieses Produktes zeigte zwei Resonanzen für die 1-H-, 2-H-, 3-H-, 1′-H-, 7-H-, 14-H₂-, 9-OH-, OCH₃-, 10A-H- und 6′-H₃-Protonen.

300 MHz NMR CDCl₃ δ 15,61 (s, 11-OH), 13,74 (d, 6-OH), 9,27 (d, NH), 8,21, 8,19 (2d, 1-H), 7,73, 7,72 (2t, 2-H), 7,33, 7,32 (2d, 3-H), 5,77, 5,72 (2d, 1′-H), 5,41, 5,38 (2m, 7-H), 4,79, 4,77 (2s, 14-H₂), 4,72, 4,66 (2s, 9-OH), 4,15, 4,14 (2s, OCH₃), 4,04 (m, 5′-H), 3,79 (m, 3″-H, 2″B-H), 3,75 (m, 6″-H₂, 4′-H), 3,59 (m, 2″A-H), 3,23 (d, 10B-H), 3,03 (m, 10A-H, 3′-H), 2,72 (m, 5″-H₂), 2,33 (m, 8B-H), 2,14 (m, 8A-H), 1,85 (m, 2′-H₂), 1,38, 1,37 (2d, 6′-H₃).

UV-Vis (CH₃OH) max. 221 nm (ε 31 000), 252 (32 900), 307 (7110), 520 sh (9110), 551 (17 400), 592 (20 700). DCI-MS m/e 638 (M+H), 611 (M+H-HCN)

Berechnet für: C₃₂H₃₅N₃O₁₁ · H₂O
C 58,62; H 5,69; N 6,41;
gefunden:
C 58,79; H 5,47; N 6,30.

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 8 wurde viermal wiederholt, wobei jedesmal ein äquivalenter Molanteil eines anderen Ausgangsmaterials anstelle von 3′-Desamino- 3′-(4″-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin verwendet wurde. Bei der ersten Wiederholung wird 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″- morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin als Ausgangsmaterial verwendet, wobei 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-5- imino-13-dihydrodoxorubicin als Endprodukt erhalten wird. Bei der zweiten Wiederholung wird 3′-Desamino-3′-(4″-morpho linyl)-daunorubicin als Ausgangsmaterial verwendet, wobei 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-5-iminodaunorubicin als Endprodukt erhalten wird. Bei der dritten Wiederholung wird 3′-Des amino-3′-(4″-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin als Ausgangs material verwendet, wobei 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-5- imino-13-dihydrodaunorubicin als Endprodukt erhalten wird. Bei der vierten Wiederholung wird 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″- morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin als Ausgangsmaterial verwendet, wobei 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-5-imino- 13-dihydrodaunorubicin als Endprodukt erhalten wird.

Die Verbindungen dieser Erfindung werden als Antitumormittel bei Säugern angewendet. Diese Aktivität wird durch Untersuchungen in vivo und in vitro bewiesen. Bei einem in vivo-Test, durchgeführt gemäß dem in Cancer Chemotherapy Reports, National Cancer Institute, 3, Nr. 2, Teil 3, September 1972, beschriebenen Protokoll, wurden gesunde Mäuse i. p. mit lymphocytischer Leukämie P-388 ascitischer Flüssigkeit angeimpft. Die angeimpften Mäuse wurden dann an den Tagen 5, 9 und 13 des folgenden Zeitraumes mit verschiedenen Anteilen von Verbindungen der Erfindung behandelt. Zu Vergleichszwecken blieben andere Mäuse unbehandelt und zusätzliche Mäuse wurden mit Daunorubicin oder Doxorubicin: 3′-Desamino-3′-(4″-morpholinyl)-daunorubicin oder 3′-Des amino-3′-(4″-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin der US-PS 43 01 277 oder 3′-Desamino-3′-(4-methoxy-1-piperidinyl)-dauno rubicin oder dessen 13-Dihydroäquivalent, in der US-PS 43 14 054 offenbart, behandelt.

Die mittlere Überlebenszeit der verschiedenen behandelten Mäuse wurde bestimmt und mit jener der Mäuse verglichen, die mit der ascitischen Leukämieflüssigkeit angeimpft, aber keiner Behandlung mit den Testverbindungen unterzogen worden waren. In der folgenden Tabelle A sind die so erhaltenen Daten gezeigt. Die Daten sind als %T/C-Werte angeführt, wobei es sich um die Überlebenszeit der behandelten Mäuse dividiert durch die Überlebenszeit der Kontrollen multipliziert mit 100 handelt. In Tabelle A sind auch die Dosierungsanteile der verschiedenen Verbindungen angegeben, von welchen festgestellt wurde, daß sie die besten Verbesserungen der Überlebenszeit ergeben.

Tabelle A

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verbindungen dieser Erfindung eine gute bis hervorragende in vivo-Antitumoraktivität bei niedrigen optimalen Dosierungen aufweisen. Die Verbindung NSC 357 704 zeigte einen optimalen Dosisanteil von etwa 1/150 dessen, der mit der Stammverbindung erforderlich ist. Andere Verbindungen der Erfindung zeigen optimale Dosisanteile, die weit niedriger sind als jene von Daunorubicin und Doxorubicin. Dies verspricht ein Antitumormittel mit wesentlich verminderter Cardiotoxizität.

In-vitro-Versuche mit 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)- daunorubicin und 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-13-di hydrodaunorubicin zeigten auch die erhöhte Wirksamkeit in dieser Verbindungsklasse. Als diese Verbindungen als Inhibitoren von DNS- und RNS-Synthese in L 1210-Zellen nach der von G. Tong, W. W. Lee, D. R. Black und D. W. Henry in J. Medicinal Chem. 19, 395 (1976) beschriebenen Methode getestet wurden, waren sie in Dosen aktiv, die sogar mehr als 600fach niedriger waren als die Dosen von Daunorubicin, Doxorubicin oder den früheren Analoga. Es wurde auch festgestellt, daß sie gegen RNS-Synthese wesentlich hemmender waren als gegen DNS-Synthese (ED₅₀ Verhältnis DNS/RNS = 10 bis 11). Es wurde von S. T. Crooke et al., Mol. Pharmacol. 14, 290 (1978) angegeben, daß ein derartiges Verhältnis anzeigt, daß Anthracycline der Klasse II verbesserte therapeutische Eigenschaften besitzen. Diese Daten sind in Tabelle A gezeigt.

Die Daten der Tabelle A, welche eine erhöhte Antitumorstärke mit der Morpholinstruktur und eine weitere Zunahme der Wirksamkeit mit der Cyanomorpholinstruktur zeigen, sind typisch für die Aktivität dieser Verbindungsklasse.

Es wurden weitere Versuche durchgeführt, um die biologische Wirksamkeit der Verbindungen dieser Erfindung zu beweisen. Es handelte sich um in vivo-Versuche an Mäusen gegen P-388 und L 1210 Leukämie und B-16 Melanom, durchgeführt im wesentlichen gemäß dem Verfahren der oben angegebenen Literaturstelle Cancer Chemotherapy Reports, 1972. Verschiedene Dosispläne und i. p.-, i. v.- und orale Verabreichungsart wurden getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle B angegeben.

Weitere Vergleichsversuche an leukämischen Zellen sind in der nachfolgenden Tabelle C zusammengestellt:

Tabelle C in vitro und in vivo Tests

Die für die erfindungsgemäßen Verbindungen erhaltenen T/C-%-Werte sind denen für Doxorubicin oder für 4-Iminodoxorubixin, wie in US-PS 43 01 277 beschrieben., überlegen.

Die Verbindungen der Erfindung, einschließlich der Salze hiervon, können auf jede mögliche Art verabreicht werden, einschließlich oral und parenteral (intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär). Parenterale Verabreichung, insbesondere intravenöse Verabreichung, war in der Vergangenheit die übliche Art und wird bevorzugt. Die Dosierungsvorschrift und der verabreichte Anteil reichen aus, die Leukämie und andere Krebsart, gegen welche die Verbindungen wirksam sind, zu verbessern. Beispielsweise sollte bei der Behandlung von kleineren Versuchstieren eine Dosierung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung im Bereich von etwa 0,0010 bis etwa 25 mg/kg pro Tag ausreichen, um Leukämie zu verbessern. Die obere Dosierungsgrenze wird durch toxische Nebenwirkungen gesetzt und kann durch entsprechende Versuche für das jeweilige zu behandelnde Tier bestimmt werden. Im allgemeinen ist die Dosierung mit den Verbindungen dieser Erfindung niedriger als (z. B. 1/20 bis 1/200fach) jene, die mit den Stammverbindungen erforderlich sind. Dosierungsvorschriften einer Dosis alle 2 bis 7 Tage sind wirksam, obwohl kürzere Intervalle, beispielsweise 1 Tag oder noch weniger, zwischen den Dosierungen ebenfalls angewandt werden können.

Um die Verabreichung der Verbindungen dieser Erfindung, einschließlich der Salze hiervon, zu erleichtern, können diese in pharmazeutischer Zusammensetzungsform, insbesondere in Einheitsdosierungsform vorgesehen werden. Obwohl die Verbindungen an sich verabreicht werden können, ist es üblicher, sie zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zu verabreichen, der die Verbindung verdünnt und die Handhabung erleichtert. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbar" bedeutet, daß der Träger (sowie die resultierende Zusammensetzung) steril und nicht-toxisch ist.

Für orale Dosierung kann der Träger oder das Verdünnungsmittel fest, halbfest oder flüssig sein und kann als ein Vehikel, Exzipient oder Medium für das Mittel dienen, wie in pharmakologischen Handbüchern beschrieben. Für parenterale Verabreichung wird die Verbindung in einem geeigneten injizierbaren flüssigen Medium, wie es auf diesem Gebiet bekannt ist, gelöst oder suspendiert.

Bei der Herstellung dieser Dosierungsformen kann man die auf diesem Gebiet üblichen Methoden zum Formulieren von wasserlöslichen pharmazeutischen Mitteln (im Falle von Salzen) und wasserunlöslichen Mitteln (im Falle der freien Basen) anwenden. Beispielsweise können injizierbare Materialien wie folgt formuliert werden:

Formulierung A: Sterile Suspension in wässerigem Träger für Injektion

Verbindung der Beispiele 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 oder 10 als suspendierbares Pulver\|3,0 mg
Natriumcitrat	5,7 mg
Natriumcarboxymethylzellulose (niedriger Viskositätsgrad)	2,0 mg
Methyl-p-hydroxybenzoat	1,5 mg
Propyl-p-hydroxybenzoat	0,2 mg
Wasser für Injektion, auf	1,0 ml

Formulierung A′: Sterile Suspension in wässerigem Träger für Injektion

3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-doxorubicin von Beispiel 4\|0,5 mg
Natriumcitrat	5,7 mg
Natriumcarboxymethylzellulose (niedriger Viskositätsgrad)	2,0 mg
Methyl-p-hydroxybenzoat	1,5 mg
Propyl-p-hydroxybenzoat	0,2 mg
Wasser für Injektion, auf	1,0 ml

Formulierung B: Sterile Suspension in wässerigem Trägersystem für Injektion

Verbindung von Beispiel 7\|4,0 mg
Natriumcitrat	5,7 mg
Natriumcarboxymethylzellulose (niedriger Viskositätsgrad)	2,0 mg
Methyl-p-hydroxybenzoat	1,5 mg
Propyl-p-hydroxybenzoat	0,2 mg
Wasser für Injektion, auf	1,0 ml

Auf ähnliche Weise können Tabletten für orale Verabreichung wie folgt hergestellt werden:

Formulierung C: Tablettenformulierung

Verbindung Beispiel 7\|5,0 mg
Lactose	91,0 mg
Maisstärke (getrocknet)	51,5 mg
Gelatine	2,5 mg
Magnesiumstearat	1,0 mg

Die Verbindung von Beispiel 7 wurde pulverisiert und durch ein Maschensieb geleitet und gut mit der Lactose und 30 mg der Maisstärke gemischt, die beide durch ein Sieb gesiebt waren.

Die gemischten Pulver wurden mit einer warmen Gelatinelösung vereinigt, welche durch Rühren der Gelatine in Wasser und Erhitzen unter Bildung einer 10% (Masse/Masse) Lösung hergestellt worden war. Die Masse wurde durch Durchleiten durch ein Sieb granuliert und das feuchte Granulat bei 40°C getrocknet.

D getrockneten Granulat wurden durch Durchleiten durch ein Sieb nochmals granuliert und der Rest Stärke und Magnesiumstearat zugesetzt und das Ganze gründlich gemischt.

D Granulat wurden komprimiert, um Tabletten mit jeweils einer Masse von 150 mg zu erhalten.

Kapseln können wie folgt hergestellt werden:

Formulierung D: Kapselformulierung

Verbindung von Beispiel 8\|10 mg
Lactose	190 mg
Formulierung D′: Kapselformulierung 3′-Desamino-3′-(3″-cyano-4″-morpholinyl)-doxorubicin von Beispiel 4(C)	1 mg
Lactose	199 mg

Die Verbindung von Beispiel 8 oder 4(C) und Lactose wurden durch ein Sieb geleitet und die Pulver gut miteinander vermischt, bevor sie in Hartgelatinekapseln geeigneter Größe gefüllt wurden, so daß jede Kapsel 200 mg gemischtes Pulver enthielt.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel (I) worin R -CO-CH₃, -CHOH-CH₃, -CO-CH₂OH oder -CHOH-CH₂-OH darstellt; X -O- oder =NH bedeutet; A Wasserstoff oder -CN darstellt, mit der Maßnahme, daß, wenn X Sauerstoff bedeutet, A eine CN-Gruppe darstellt.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel: worin R -CO-CH₃ oder -CO-CH₂-OH darstellt, in einem gemischten wässerigen polaren organischen Medium mit einer Verbindung der allgemeinen Formel in Anwesenheit von Cyanoborhydridsalz umsetzt, die gewünschte Verbindung chromatographisch reinigt, gegebenenfalls in eine Verbindung mit X = NH und gegebenenfalls in eine Verbindung mit A = H in an sich bekannter Weise überführt.

3. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 als Antitumor mittel.