DK158269B

DK158269B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af morpholinyldaunorubicin- eller morpholinyldoxorubicinderivater

Info

Publication number: DK158269B
Application number: DK332983A
Authority: DK
Inventors: Carol Walker Mosher; George Low Tong; Edward Mcintosh Acton
Original assignee: Stanford Res Inst Int
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-19
Publication date: 1990-04-23
Also published as: ES8501415A1; PT77060A; ES530593A0; CH655729A5; AT381319B; AU1694683A; ES524271A0; IE55795B1; FR2530640B1; IT1163818B; YU140585A; GB2124224A; NO832610L; IT8322143A0; NZ204911A; DK332983D0; GR78885B; DK158269C; PT77060B; DK332983A

Description

i

DK 158269 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte morpholinyldaunorubicin- eller morpholinyldoxorubicinderivater med formlen

0 OH

I I "X°H

h3co X OH 0 HO -

N A

O

5 hvor R betyder -CO-CH^, -CHOH-CH^, -CO-C^OH eller -CHOH-C^OH, X er O eller NH, og A er H eller CN, idet dog A er CN, når X er 0. Forbindelserne med formlen I er nyttige som antitumormidler.

Doxorubicin (adriamycin), som er kendt fra us patentskrift 10 nr. 3.590.028, er måske det mest nyttige nye anticancermid-del, som anvendes for tiden. Doxorubicin (sammen med dauno-rubicin) er et af de vigtigste midler til behandling af et usædvanligt stort antal faste tumorer og leukæmi. Desværre reagerer mange patienter med tumorer ikke på denne behand-15 ling, og praktisk taget ingen patienter med nogle alvorlige typer tumorer (coloncancer, melanoma) reagerer på denne behandling. Hos nogle patienter bevirker endvidere langvarig eller vedvarende behandling irreversibel beskadigelse af hjertet, som kan være fatal, hvis behandlingen fortsæt-20 tes. Der er således et stort behov for forbindelser, som giver en bedre responshyppighed, et bredere responsspektrum eller formindsket cardiotoksicitet. Mere virksomme og mindre toksiske midler efterforskes i vid udstrækning og

DK 158269 B

2 er det grundlæggende formål med den foreliggende opfindelse. På baggrund af forsøgsresultater opnået i en udbredt anvendt test mod museleukasni P388 i et 3-do s isbehandl ing s-skema (q4d 5,9,13), er de for tiden mest aktive analoge 5 forbindelser to lipophile derivater (AD32 og N,N-dibenzyl-daunorubicin), som kræver signifikant større doser, og som ikke reagerer med DNA in vitro, selv om DNA antages at være et primært biologisk mål for anthracyclinforbindelserne.

Et stort antal N-alkylderivater har været virksomme ved an-10 titumortesten mod museleukæmi P388, men de adskiller sig ikke væsentligt fra doxorubicin eller daunorubicin. Nogle få af disse derivater har været inaktive.

Baggrunden for doxorubicin og dets anthracyclinanaloge er beskrevet i artiklen "Adriamycin" af David W. Henry, ACS 15 Symposium Series, No. 30, Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, side 15-57 (1976) samt i bogen "Doxorubicin" af Federico Arcamone, Academic Press, 1981. Endvidere er forbindelsen med betegnelsen AD32 kendt fra US patentskrift nr. 4.035.566.

20 5-Iminodaunorubicin er kendt fra US patentskrift nr.

4.109.076, og den ækvivalente doxorubicinforbindelse er beskrevet i "Synthesis and Preliminary Antitumor Evaluation of 5-Iminodoxorubicin", J. Medicinal Chem., 24, 669 (1981) af Edward M. Acton og George L. Tong. 5-Iminodaunorubicin 25 har samme aktivitet med formindskede bivirkninger, medens 5-iminodoxorubicin har forøget aktivitet, men kræver større doser.

Fra US patentskrift nr. 4.301.277 kendes 3'-deamino-3'-(4-morpholinyl)daunorubicin, som er virksom i en dosis på 30 1/40 af dosis af doxorubicin, men som giver stort set samme T/C-værdi (166% i forhold til 160% mod P388) . Denne forbindelse samt dens fremstilling og egenskaber er endvidere beskrevet i "Enhanced Antitumor Properties of 3'-(4-Morpholi-nyl) and 3*-(4-Methoxy-l-piperidinyl) Derivatives of 3'-De-

DK 158269 B

.3 aminodaunorubicin", J. Medicinal Chem., 25, side 18-24 (1982) af Carol W. Mosher, Helen Y. Wu, Allan N. Fujiwara og Edward M. Acton.

En almen reducerende alkyleringsfremgangsmåde til fremstil-5 ling af nye semi-syntetiske anthracyclinderivater er desuden beskrevet i "Adriamycin Analogs. 3. Synthesis of N-Al-kylated Anthracyclines With Enhanced Efficacy and Reduced Cardiotoxicity", J. Medicinal Chem., 22, side 912-918 (1979) af G.L. Tong, H.Y. Wu, T.H. Smith og D.W. Henry.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en forbindelse med formlen

o OH

H3CO o oh o €>

HO I

nh2*hci hvori R betyder -CO-CH^ eller -CO-CH2OH, omsættes i et blandet vandigt polært organisk medium med overskud (18 15 molækvivalenter) af 2,21-oxydiacetaldehyd med formlen

^/CH2 - CHO

°\

^CH2 - CHO

der er dannet in situ ved spaltning af 1,4-anhydroerythritol i vandig opløsning med natriumperiodat ved stuetemperatur, idet omsætningen gennemføres ved stuetemperatur i nærværelse 20 af 2 molækvivalenter alkalimetalcyanoborhydrid, såsom natrium-cyanoborhydrid, beregnet på udgangsmaterialet, det rå reaktionsprodukt, som opnås som en blanding af basiske 3'-morpho-

DK 158269 B

4 linoderivater af udgangsmaterialet sammen med de analoge 13-dihydroforbindelser og af de tilsvarende analoge neutrale 3"-cyanomorpholino-forbindelser, adskilles i neutrale og basiske fraktioner, hvorpå enten de basiske eller de neutrale 5 fraktioner separat underkastes en kromatografisk separation på en silicagelsøjle under anvendelse af et CE^C^/CI^OH-system (9:1 r/r) som elueringsmiddel til opnåelse af henholdsvis 31-morpholino- og 3”-cyano-morpholino-derivaterne med formlen I (X = 0), som hver for sig om ønsket omsættes, efter passende 10 blokering af hydroxygruppen i gruppen -C0-CH20H, når denne er til stede, med en mild syrelabil beskyttelsesgruppe, såsom p-methoxy-tritylgruppen, ved en temperatur på fra 0 til 3°C med overskud af alkoholisk ammoniak, hvorpå, om nødvendigt, efter fraspaltning af den milde syrelabile beskyttel-15 sesgruppe ved behandling med eddikesyre eller kold trifluor-eddikesyre ved stuetemperatur den ønskede forbindelse med formlen I (X = NH) fås som den fri base, der efter kromatografisk rensning på en silicagelsøjle under anvendelse af systemet CHCl^/CH^OH (9:1 r/r) som elueringsmiddel til sidst 20 isoleres som sådan (A = CN) eller omdannes (A = H) til det tilsvarende hydrochlorid ved behandling med 0,1 N saltsyre

De omhandlede forbindelser er beslægtet med de kendte anti-cancermidler daunorubicin og doxorubicin (adriamycin), fremstillet ud fra disse ved kemisk syntese og derivatiserings-25 teknik og er aktive midler mod cancer. De synes at kombinere to fordelagtige og eftertragtede egenskaber, nemlig høj antitumorvirkning ved lav dosering. Med de omhandlede forbindelser skulle det således være muligt at opnå kraftig virkning med formindskede dosisrelaterede bivirkninger, så-30 som cardiotoksicitet sammenlignet med de kendte forbindelser.

Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes morpholinyl-derivater af iminodaunorubicin og iminodoxorubicin og farmaceutisk acceptable salte deraf samt cyanomorpholinylderi-35 vater af daunorubicin, doxorubicin, iminodaunorubicin og iminodoxorubicin. Disse forbindelser er anført i nedenstående tabel I.

5

DK 158269 B

Tabel I

Forbindelser med formlen I

X A R ..........Forbindelse ' _ NH H CO-CH3 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-5-imino- daunorubicin og farmaceutisk acceptable salte deraf NH H CHOH-CH^ 31-deamino-31-(4"-morpholinyl)-13-di- hydro-5-iminodaunorubicin og farmaceutisk acceptable salte deraf NH H CO-CH2OH 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-5-imino- doxorubicin og farmaceutisk acceptable salte deraf NH H CHOH-CH^OH 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-di- hydro-5-iminodoxorubicin og farmaceutisk acceptable salte deraf 0 CN CO-CH^ 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholi nyl) daunorubicin 0 CN CHOH-CH^ 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl) -13-dihydrodaunorubicin 0 CN CO-C^OH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholi- nyl)doxorubicin 0 CN CHOH-CH2OH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl ) -13-dihydrodoxorubicin NH CN CO-CH^ 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl) -5-iminodaunorubicin NH CN CHOH-CH^ 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl) -13-dihydro-5-iminodaunorubicin NH CN CO-OE^OH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl) -5-iminodoxorubicin NH CN CHOH-CH2OH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl) -13-dihydro-5-iminodoxorubicin

Blandt de ovenfor anførte forbindelser foretrækkes de nedenfor anførte forbindelser på grund af deres udmærkede virkning som antitumormidler.

3'-Deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-doxorubicin/ 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin/ 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)daunorubicin, 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin og 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin.

DK 158269 B

6

Blandt de foretrukne forbindelser er den førstnævnte forbindelse den mest foretrukne.

De første fire forbindelser anført i tabel I kan foreligge som frie baser som anført i tabel I eller som farmaceutisk 5 acceptable syreadditionssalte af disse baser. Syreadditionssaltene har den fordel/ at de er opløselige i vand og vandige blandede opløsningsmidler, såsom vand-alkanoler eller vand-alkandioler. Som eksempler på disse blandede opløsningsmidler kan nævnes vand-propylenglycol, vand-ethanol, 10 vand-ethylenglyco1, fysiologisk saltopløsning, forskellige andre vandige injektionsmedier og lignende. De frie baser er opløselige i mindre polære, organiske opløsningsmidler, såsom chloroform, methylenchlorid, blandede chloroform-me-thanol-opløsninger og lignende. De kan også anvendes som 15 suspensioner.

Saltene er syreadditionssalte af de frie baser med en farmaceutisk acceptabel syre. Ved en farmaceutisk acceptabel syre forstås en syre, som er ugiftig og almindeligt anvendt i farmaceutiske produkter. Som eksempler på disse syrer kan 20 nævnes uorganiske syrer, såsom hydrogenchloridsyre, hydro-genbromidsyre, svovlsyre og phosphorsyre, og organiske syrer, såsom carboxylsyrerne, f.eks. eddikesyre, glycolsyre, maleinsyre, æblesyre, hydroxymaleinsyre, vinsyre samt salicylsyrerne og organosulfonsyrerne, f.eks. methansulfonsyre 25 og p-toluensulfonsyre. Blandinger af to eller flere syrer kan anvendes såvel som blandinger af én eller flere frie baser plus ét eller flere syreadditionssalte. På grund af deres enkle sammensætning og store opløselighed foretrækkes hydrochlorid- og hydrobromidsyreadditionssaltene.

30 Som anført ovenfor kan de omhandlede forbindelser også foreligge i form af derivater. Disse derivater dannes med henblik på at forøge forbindelsernes opløselighed eller med henblik på at variere andre fysiske egenskaber ved forbindelserne .

7

DK 158269 B

Fremstilling af nogle foretrukne omhandlede forbindelser

Disse forbindelser kan fremstilles ved anvendelse af følgende almene syntesevej: Først omsættes kommercielt tilgængeligt daunorubicin eller doxorubicin (som et syreadditions-5 additionssalt) under betingelserne for en reduktiv.alkyle-ring med 2,2'-oxydiacetaldehyd med formlen -0=CH CH=0

L I

ch2-o-ch2

Ved denne alkylering opnås et blandet produkt indeholdende fire hovedkomponenter. I tilfælde af daunorubicin er disse 10 komponenter 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)daunorubicin, 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin, 31-deamino-3'-{3"-cyano-4"-morpholinyl)daunorubicin og 31-deamino-31 -(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodaunoru- bicin.

15 I tilfælde af doxorubicin indeholder reaktionsproduktet 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)doxorubicin, 31-deamino-3'--(4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin, 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)doxorubicin og 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin.

20 2,2'-Oxydiacetaldehyd kan fremstilles ved sur hydrolyse af 2,2'-oxydiacetaldehyd-bis(diethylacetal).

(Et-O) -CH CH-(Ο-Et)^ \ \ ch2-o-ch2 ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Fields et al., jf.

BE patentskrift nr. 655.436, eller ved spaltning af 1,4-an-25 hydroerythritol

HO-CH-CH-OH

I I

CH2-0-CH2 ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Barry et al., Carbohydrate Research, 7, 299 (1968) og Greenberg, et al., Carbohydrate Research, 35, 195 (1974).

DK 158269 B

8

Den reduktive alkylering kan gennemføres under anvendelse af overskud af dialdehydet i et blandet vandigt - polært organisk medium såsom vand-acetonitril/ sædvanligvis ved en pH-værdi på ca. 7 i nærværelse af et reduktionsmiddel/ såsom 5 et alkalimetalcyanoborhydrid/ f.eks. natrium- eller kalium-cyanoborhydrid. Omsætningen forløber relativt glat, og den er sædvanligvis afsluttet i løbet af 1 time eller derunder ved stuetemperatur. Den reduktive alkylering illustreres i de efterfølgende eksempler og er endvidere beskrevet i 10 US patentskrift nr. 4.301.277 og J. Medicinal Chem./ 25/ side 18-24 (1982).

Oparbejdningen af reaktionsproduktet kan gennemføres under anvendelse af en hvilken som helst fremgangsmåde/ som bevirker den ønskede isolering og adskillelse. Syreekstrak-15 tion af reaktionsproduktet er effektivt til adskillelse af de syreekstraherbare ikke-cyano-substituerede materialer fra de syreuopløselige cyanosubstituerede materialer. De fremkomne to produktblandinger kan derefter adskilles i de enkelte forbindelser ved anvendelse af forskellige chroma-20 tograferingsfremgangsmåder/ såsom præparativt tyndtlags-chromatografi, søjlechromatografi eller præparativt high performance væskechromatografi.

5-Iminoforbindelserne kan fremstilles let og direkte ud fra de isolerede 5-oxoforbindelser under anvendelse af den 25 ovenfor omtalte fremgangsmåde beskrevet i J. Medicinal Chem., 24, side 669 (1981). Ved denne fremgangsmåde omsættes 5-oxo-forbindelserne med overskud af alkoholisk ammoniak ved lave til moderate temperaturer, f.eks. fra ca. -25 til ca.

25°C, i fra ca. 0,5 til ca. 100 timer. I tilfælde af 3'-de-30 amino-3'-(4”-morpholinyl)doxorubicin og 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)doxorubicin er det nødvendigt at blokere hydroxylgruppen på 14-carbonatomet inden behandlingen med ammoniak. Der kan anvendes en vilkårlig mild syrelabil beskyttelsesgruppe. Som følge af dens omfattende anvendelse 35 inden for den farmaceutiske kemi er methoxytrityl en foretrukket beskyttelsesgruppe. Tritylfunktionen kan indføres

DK 158269 B

9 ved at omsætte 31-deamino-3' -(4"-morpholinyl)doxorubicin eller 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)doxorubicin med overskud af p-anisylchlordiphenylmethan ved stuetemperatur eller lignende. Når omsætningen med ammoniak er afslut-5 tet kan 14-hydroxylgruppen gendannes ved behandling med syre, f.eks. eddikesyre eller kold vandig trifluoreddikesyre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 ]_0 Fremstilling, isolering og identificering af 3'-deamino-3'--(3"-cyano-4"-morpholinyl)daunorubicin.

A. Under anvendelse af fremgangsmåden til fremstilling af 3'-deamino-3'-morpholinodaunorubicin-hydrobromid, jf. Mosher, et al., J. Medicinal Chem., 25, side 18-24 (1982) fremstil-15 les et råprodukt indeholdende 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-daunorubicin, 3'-deamino-3'—(4"-morpholinyl)-13-dihydrodau-norubicin, 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)daunorubicin og 31 -deamino-3 ' - (3 "-cyano-4 ’’-morpholinyl) -13-dihydro-daunorubicin. Råproduktet ekstraheres med CHCl^ som beskre-20 vet i ovenstående litteratursted til overføring af de fire primærprodukter til CHCl^-fasen. Ved udtømmende ekstraktion af CHCl^-fasen med 0,01 N saltsyre fjernes de to basiske morpholinoforbindelser, som beskrevet i ovennævnte litteratursted. CHCl^-fasen med stort indhold af.det neutrale 25 produkt vaskes med natriumhydrogencarbonatopløsning, tørres og inddampes. Prøver opløses i 4:1-blandinger af CHCl^ og CHgOH og anbringes på en high performance væskechromato-graferingssøjle (Waters Radial-Pak C-18) og elueres med et elueringsmiddel bestående af en 65:35-blanding af 30 0,05 M citratpuffer med pH = 4 og CH^CN i en mængde på 2 ml pr. minut. Et produkt (sædvanligvis 19-24% af det samlede produkt) elueres ved 6,1-6,8 minutter, medens et andet produkt, sædvanligvis 26-27%, elueres ved 11,9 minutter. Påvisningen foretages med UV-spektroskopi ved 254 nm. Det

DK 158269 B

10 fremgår af det følgende, at produktet ved 6,1-6,8 minutter er 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodauno-rubicin, og at produktet ved 11,9 minutter er 3'-deamino-31-(3"-cyano-4"-morpholinyl)daunorubicin.

5 B. I større målestok opløses 5,41 g af det faste biprodukt i 500 ml af en 9:l-blanding af CHCl^ og CH^OH. Denne opløsning vaskes med 0,01 N saltsyre (3 x 100 ml), vand (1 x 100 ml) og fortyndet natriumhydrogencarbonatopløsning (1 x 100 ml). Den organiske fase tørres, inddampes til tør-10 hed, og remanensen vakuumtørres ved et tryk på 0,1 mm og stuetemperatur, hvorved der fås 5,10 g glasagtig remanens.

Den vandige fase tilbageholdes ligeledes.

C. 5,09 g af den ovenfor under B fremstillede glasagtige remanens opløses i 50 ml 4:l-blanding af og CHgOH. Op- 15 løsningen omrøres under dråbevis tilsætning af 30 ml CH^CN.

Den dannede uklare opløsning inddampes til tørhed, hvorved der fås en halvfast remanens, som tritureres med 200 ml CH^CN i mørket. Det uopløselige faste stof isoleres og tritureres endnu engang med 100 ml CI^CN. Væskefaserne fra de 20 to tritureringer indeholder det ønskede produkt. Ved ind-dampning af faserne fås 2,23 g halvfast remanens.

D. Den ovenfor under C fremstillede halvfaste remanens opløses i 5 ml CH2Cl2 og anbringes på en søjle med en ydre diameter på 3,1 cm og en længde på 59 cm af Cl^C^-vasket 25 silicagel (200-325 mesh, Mallinckrodt Silic AR CC-7).

Søjlen elueres med CI^C^ (500 ml) og derpå med C^C^--CH^OH-blanding (99:1, 1500 ml, 98:2, 1000 ml, 97:3, 1500 ml, 90:10, 500 ml). Efter opsamling (10 ml fraktioner, kontrolleret ved tyndtlagschromatografi) af 2550 ml af be-30 gyndelseseluatet, fordampes en fraktion på 190 ml, hvorved der fås 0,48 g produkt. Primærkomponenten bestemmes ved sammenlignende high performance væskechromatografi og tyndtlagschromatografi som værende identisk med en forbindelse, der senere bestemmes til 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpho-35 linyl)-daunorubicin.

DK 158269 B

11 E. 0,35 g af det ovenfor under D fremstillede produkt renses yderligere først i mørket på fem 2 mm x 20 cm x 20 cm silicagelplader med to fremkaldelser med en 29:1-blanding af C^C^-CH^OH. Et midterbånd indeholdende 65% af den an- 5 bragte vægt af prøven udskæres, elueres, filtreres og inddampes til tørhed.

F. 0,18 g af det ovenfor under E fremstillede produkt sammen med andre tilsvarende rensede materialer udvundet fra chromatograferingsrandzonerne, underkastes en afsluttende 10 rensning på en silicagelsøjle (200-400 mesh) med en ydre diameter på 1,1 cm og en længde på 27 cm. Søjlen elueres med blandinger af CH2C12 og ethylacetat (80:20 = 30 ml, 60:40 = 30 ml,' 40:60 = 30 ml og 20:80 = 30 ml), og derpå med 175 ml ethylacetat. Efter opsamling (2 ml-fraktioner 15 kontrolleret ved hjælp af tyndtlagschromatografi) af 162 ml af begyndelseseluatet opsamles en fraktion på 88 ml, som inddampes, hvorved der fås 0,15 g produkt.

Elementæranalyse af denne rene forbindelse bekræfter, at forbindelsen er 3'-deamino-31 -(3"-cyano-4"-morpholinyl)-20 daunorubicin, hvilket også bekræftes ved hjælp af 360 MHz NMR, UV-spektroskopi, IR-spektroskopi og massespektroskopi.

Fremkomsten af dette produkt som en diastereoisomer blanding indiceres ved hjælp af HPLC og 360 MHz NMR-analyse. HPLC-analyse på en Waters Radial-Pak C-18 søjle med 0,05 M 25 pH-4 extratpuffer-CH^CN-blanding (60:40) ved 2 ml pr. minut viser to tætliggende toppe (ved 9,6 minutter og 10,2 minutter i forholdet 53:44. 360 MHz NMR-spektret fra dette produkt udviser to resonanser for protonerne i 6-0H, 11-0H, 1-H, 2-H, 3-H, 1»-H, 7-H, 9-OH, 10A-H, 14-H- og 6-H0.

30 360 MHz NMR, CDC13, é :13,99, 13,98 (2s, 6-OH), 13,25, 13,24, (2s, 11-0Ή), 8,02, 8,00 (2d, 1-H), 7,79, 7,77 (2t, 2-H), 7,40, 7,38 (2d, 3-H), 5,59, 5,56 (2d, l'-H), 5,29, 5,26 (2bs, 7-H), 4,47*, 4,34* (2s, 9-OH), 4,08 (s,

DK 158269 B

12 OCH3)r 3,97-4,07 (m, 2" B-H, 5'-H), 3,92 (t, J=12Hz 3"-H), 3,74 (m, 2"Å-H) , 6"B-H, 3,68 (bs, 4Ή), 3,58 (t, J=12Hz, 6"A-H), 3,20 (d, J=19Hz, 10B-H), 2,91, 2,90 (2d, J=19Hz, 10A-H) 2,75-2,95 (m, 3'-H) , 2,68 (in, 5"-H2) , 2,43, 2,42 5 (2s, 14-H3), 2,35 (m, 8B-H), 2,13 (m, 8A-H), 1,70-2,0 (m, 2'-H2), 1,86* (s, 4'-0H, H20), 1,37, 1,36 (2d, J=6,4Hz), 6-H3) * kan ombyttes med D30.

Massespektrum: 10 [som trimethylsilyl(TMS)derivater], m/e 910 [M(TMS)41, 895 [M(TMS)4-Me], 883 [M(TMS)^-HCN], 838 [M(TMS)3], 823 [M(TMS)3-Me], 811 [M(TMS)3«HCN], MS ved 70 EV viser en basetop (HCN) ved m/e 27.

Eksempel 2 15 Isolering af 3'-deamino-3'-(3 "-cyano^'-morpho lino]-13--dihydrodaunorubicin.

DK 158269 B

13

Eksempel 3

Isolering af 31-deamino-3'-(4"-morpholinyl)daunorubicin og 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin.

I eksempel 1, A og B isoleres en 0,01 N saltsyrefase indeholdende 3' -deamino-3 ' - (4 ’’-morpholinyl) daunorubicin og 5 3 *-deamino-3'-(4”-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin.

Denne vandige fase indeholder ca. 40% af det tilsatte materiale. Den vandige fase oparbejdes under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i det tidligere omtalte litteratursted J. Medicinal Chem., 25, hvorved man får 3'-deami-10 no-3'- (4"-morpholinyl)daunorubicin og S'-deamino-S'-H"-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin som særskilte isolerede forbindelser.

Eksempel 4

Fremstilling og isolering af 3'-deamino-31-(3"-cyano-4"-15 -morpholinyl)doxorubicin og 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin.

A. Under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i artiklen i J. Medicinal Chem., 25 sættes 6,42 g (30,0 mmol) natri-ummetaperiodat til en omrørt opløsning af 6,25 g (60,0 mmol) 20 1,4-anhydroerythritol

OH OH

DK 158269 B

14 i 75 ml vand afkølet i et vandbad ved en temperatur på 15-20°C. Den dannede klare opløsning omrøres ved stuetemperatur i 17 timer. Derpå indstilles opløsningens pH-værdi fra 4,0 til 7,3 med med NaHCO^/ hvorpå opløsningen fortyn-5 des under omrøring med 75 ml CH^CN, hvorved der dannes et bundfald. Blandingen omrøres, og der tilsættes 0,126 g (2,0 mmol) NaBH^CN i 5 ml 1:1 (rumfang) blanding af CH^CN og vand. Til denne blanding sættes derpå 1,16 g (2,0 mmol) doxorubicin-hydrochlorid i 30 ml af en l:l-blan-10 ding af CH^CN og vand. Efter 10 minutters forløb fortyndes reaktionsblandingen med 50 ml fortyndet natriumhydrogencar-bonatopløsning, hvorefter der ekstraheres med 3 x 50 ml CHCl^- Den rå ekstrakt indeholder 3'-deamino-31 -(4"-morpho-linyl)doxorubicin, 31-deamino-31 -(4"-morpholinyl)-13-di-15 hydrodoxorubicin, 3'-deamino-31 -(3"-cyano-4"-morpholinyl)-doxorubicin og 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13--dihydrodoxorubicin. De sammenblandede ekstrakter ekstraheres med 0,1 N eddikesyre (5 x 25 ml) og derpå med vand, hvorpå der vaskes med fortyndet natriumhydrogencarbonatop-20 løsning og med mættet vandig natriumchloridopløsning. Den sure vandige fase isoleres. Chloroformfasen tørres over natriumsulfat, filtreres gennem "Celite"® diatoméjord og koncentreres til en remanens. Denne remanens opløses i 25 ml CHCl^, og opløsningsmidlet fordampes under vakuum i 25 stuetemperatur. Der fås 0,518 g (40%) af en mørk rød op-skummet glasagtig masse.

B. En prøve af den ovenfor i A fremstillede opskummede glasagtige masse opløses i CH^CN og sættes på en Waters Radial-Pak C-18 high performance væskechromatograferings-30 kolonne, og der elueres med en 55:45-blanding af 0,05 M

citratpuffer pH-4,0 og CH2CN i en mængde på 2 ml pr. minut. Eluering af forbindelser følges ved 254 nm. Ved 2,3 minutter afgives et produkt, der identificeres som 3'-deamino--3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin, i et 35 udbytte på 13% (beregnet på den tilsatte blanding), og ved 3,8 minutter afgår 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4”-morpholinyl)-doxorubicin i et udbytte på 69%. Andre produkter, der er opsamlet på samme måde, isoleres og adskilles ved hjælp af HPLC.

15 C. Isoleringen af 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-doxorubicin og 31-deamino-31 -(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-5 -dihydroxorubicin gentages derpå på følgende måde: 0,424 g af det opskummede glasprodukt fremstillet ovenfor under A opløses i 1,5 ml CH2C12 og sættes til en 1,5 x 35,5 cm søjle indeholdende CH^C^-vasket silicagel (200-400 mesh Bio-Sil A. Søjlen elueres med CH2C12 (50 ml) og derpå med 10 CH2Cl2-CH3OH-blanding (99:1 150 ml, 98:2 150 ml, 97:3 300 ml, 95:5 100 ml og 90:10 300 ml). Efter opsamling af 445 ml af det første eluat fordampes en fraktion på 80 ml, hvorved man får 0,217 g produkt. Dette materiale kombineres med 0,039 g tidligere fremstillet renset produkt, og blan-15 dingen opløses i 2 ml CH2C12 fortyndet med 10 ml CH^OH, og der inddampes til tørhed. Ved triturering af denne remanens med 5 ml CH^OH fås 0,218 g 31 -deamino-3* - (3"-cyano-4"-mor-pholinyl)doxorubicin.

HPLC-analyse og 400 MHz NMR-analyse indicerer, at produktet 20 er en diastereoisomer blanding. HPLC-analyse på en Waters Radial-Pak C-18-søjle med en 65:35-blanding af 0,05 M citratpuffer pH-4-CH3CN i en mængde på 2 ml pr. minut viser to tætliggende toppe (ved 14,4 minutter og 15,7 minutter) i forholdet 58:39. Produktets 400 MHz-spektrum udviser to 25 resonanser for 1-H, 2-H, 3-H, l'-H, 7-H, 14-H2, 9-OH, 0CH3, 10A-H og 6'-H3 protonerne.

400 MHz NMR, CDCl3, <5: 14,02 (s, 6-0H), 13,26 (s, 11-0H), 8,05, 8,04, (2d, 1-H), 7,80, 7,79 (2t, 2-H), 7,41, 7,40 (2d, 3-H), 5,61, 5,57 (2d, l’-H), 5,34, 5,30 (2m, 7-H), 30 4,79, 4,78 (2s, 14-H2), 4,54, 4,42 (2s, 9-OH), 4,11, 4,10 (2s, 0CH3), 4,05 (m, 5*-H), 3,97 (m, 2"B-H, 3"-H, 6"B-H), 3,71 (m, 4'-H, 6"A-H), 3,58 (t, 2"A-H), 3,30 (d, J=19Hz, 10H-H), 3,07, 3,06 (2d, 10A-H), 3,03 (m, 3'-H), 2,69 (m, 5”-H2), 2,38 (m, 8B-H), 2,22 (m, 8A-H), 1,84 (m, 2'-H2), 16

DK 150269 B

1,61 (s, H20), 1,40, 1,39 (2d, J = 6,5 Hz, 6'-H3).

UV-Vis (CH3OH) max 234 nm (ε 40.100), 252 (27.700), 289 (9.420), 478 (13.000), 495 (12.900), 530 (7.190). Massespektrum [som trimethylsilyl(TMS)derivatet], m/e 899 5 M(TMS)4-HCN.

Elementæranalyse: C% H% N%

Beregnet for C32H34N2012·2H20 56,97 5,68 4,15

Fundet 57,07 5,37 4,17 10 Ved yderligere eluering af søjlen fås 0,041 g 3'-deamino--3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin.

UV-Vis (CH30H) max 234 nm (ε 37.400), 252 (28.000),

289 (9.390), 475 (12.700), 496 (12.800), 530 (7.410). Massespektrum [som trimethylsilyl(TMS)derivatet], m/e 15 985 M(TMS)5-CH3, 973 M(TMS)5~HCN

Elementæranalyse: c % H% N%

Beregnet for ^32^36^2°12*^ H2° 57,57 5,89 4,20

Fundet 57,35 5,94 3,82 20 Eksempel 5

Isolering af 3 *-deamino-3'-(4"-morpholinyl)doxorubicin og 3 ’-deamino-31-(4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin.

A. Den sure vandige fase dannet i eksempel 4, A gøres basisk med natriumhydrogencarbonat og ekstraheres med CHC13.

25 CHCl3~fasen vaskes med mættet natriumchloridopløsning, tørres over Na2S04, filtreres gennem "Celite"®, koncentreres og tørres, hvorved man får 0,828 g rødt skumformigt produkt, som ved HPLC, 90 MH NMR, 300 MHz NMR, UV-Vis-spektroskopi z og massespektroskopi viser sig at indeholde to hovedkompo-30 nenter, nemlig 31-deamino-3’-(4"-morpholinyl)doxorubicin og 31-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydrodoxorubicin.

DK 158269 B

17 B. 0,98 g skumformigt glasagtigt produkt fremstillet som beskrevet ovenfor under A opløses i 3 ml CH2C12 og chroma-tograferes på en 2,2 x 33 cm silicagelsøjle. Søjlen elueres med CH2C12 (50 ml) og derpå med blandinger af CH2C12 og 5 CH30H (99:1 300 ml, 98:2 300 ml, 97:3 900 ml og 90:10 700 ml). Efter opsamling af de første 1170 ml eluent isoleres en fraktion på 490 ml, som inddampes til dannelse af en remanens. Denne remanens indeholder 45% af det tilsatte materiale, og ved HPLC viser den sig at være praktisk taget 10 ren (99+%) 31-deamino-31 -(4"-morpholinyl)doxorubicin.

90 MHz NMR, CDC13, 6 13,88 (s, 6-OH), 13,07 (s, 11-0H), 7,90 (d, J = 8 Hz, 1-H), 7.72 (t, J = 8 Hz, 2-H), 7,38 (d, J = 8 Hz, 3-H), 5,51 (bs, l'-H), 5,20 (bs, 7-H), 4,75 (s, 14-H2), 4,68 (s, 9-0H), 4,07 (s, 0CH3), 3,98 (m, 5'-H), 15 3,67 (m, 4'-H, 2"-H2, 6"-H2), 3,09 (d, J = 19 Hz, 10B-H), 2,83 (d, J = 19 Hz, 10A-H), 2,80-3,20 (m, 3'-H), 2,50-3,00 (bs, 4'-OH, 14-0H), 1,95-2,65 (m, 8-H2, 3”-H2, 5"-H2), 1,80 (m, 2'-H2), 1,38 (d, J = 6,5 Hz, 6'-H3). Massespektrum [som trimethylsilyl(TMS)derivatet], m/e 973 M(TMS),., 20 901 M(TMS)4.

Den frie base suspenderes i vand, og suspensionen syrnes til pH-værdien 4,4 med 0,1 N saltsyre. Den dannede opløsning lyofiliseres, og produktet opløses i CHgOH og fældes med 10 rumfangsdele ether, hvorved man får hydrochloridet.

25 Elementæranalyse: C% H% Cl’% N%

Beregnet for C3^H33N0^2·Η01·2Η20 54,27 5,88 5,17 2,04

Fundet 54,08 5,35 4,78 2,00 UV-Vis (CH30H) max 234 nm (ε 39.000), 252 (26.300), 30 290 (8.990), 480 (12.600), 495 (12.500), 530 (6.700).

18

DK 1S 8 2 6 9 B

Der udtages en fraktion på 190 ml og derefter en fraktion på 160 ml. Fraktionen på 160 ml inddampes, og det viser sig, at den indeholder 19,5% af det tilsatte materiale som 97% rs ren 3' -deamino-3(4’'-morpholinyl) -13-dihydrodoxo-5 rubicin.

300 MHZ NMR, CDC13/ 6: 13,98, 13,96 (2s, 6-OH), 13,34, 13,32 (2s, 11-OH), 8,03 (d, 1-H9, 7,79 (t, 2-H), 7,40 (d, 3-H), 5,56 (bs, l'-H), 5,29 (bs, 7-H), 4,64, 4,59 (2s, 9-OH), 4,09 (s, 0CH3), 4,03 (m, 5'-H), 3,82-4,05 10 (m, 41-Η, 13-H), 3,68 (m, 2"-H2, 6”-H2, 14B-H), 3,54 (bs, 14A-H) , 3,30 (m, 10B-H), 2,98 (bs, OH), 2,87 (bs, OH), 2,77 (m, 10A-H, 3'-H), 2,30-2,70 (m, 8B-H, 3"-H2, 5"-H2), 1,99 (m, 8A-H), 1,78 (m, 2'-H2), 1,41 (d, δ'-Η^). Massespektrum [som trimethylsilyl(TMS)derivatet]. m/e 975 15 M(TMS)5.

Eksempel 6

Fremstilling af 31-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-5-iminodoxo-rubicin.

A. Til en opløsning af 0,396 g 3'-deamino-3'-(4"-morpho-20 linyl)doxorubicin fremstillet som beskrevet i eksempel 5 i 5 ml tørt pyridin sættes 0,990 g p-anisylchlordiphenylme-than. Blandingen henstår til omsætning med stuetemperatur i mørket i ca. 2 dage. Opløsningen afkøles i isvand, og der tilsættes 0,5 ml CH^OH. Blandingen omrøres i 2 timer, hvor-25 på den sættes til 50 ml fortyndet natriumhydrogencarbonat-opløsning, og der ekstraheres med CH2C12. Ekstrakterne koncentreres til en gummiagtig remanens, som opløses i toluen, koncentreres, opløses i CH2C12 og fældes ved langsom tilsætning af petroleumsether (kogeinterval 35-60°C). Bundfaldet 30 isoleres, opløses i CH2C12 og fældes med en 2:l-blanding af petroleumsether og diethylether, hvorved man får 14-0-p-ani-syldiphenyl-methyl-3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)doxorubicin, (III) som et amorft fast stof i et udbytte på 94%.

DK 158269 B

19

f-V

o - oh . A A λ xo-ch_o~c_/ \-ocH, Α/γγγ I \ / 3 Τ Jj Τ T"oH jAs —

TiTi^ KJ (ιιι) H.CO Ο OH Ο ^ φΙ ' Ν η

Forbindelsen identificeres ved 90 MHz NMR i CDCl^.

B. En opløsning af 0,532 g 14-0-p-anisyldiphenyl-methyl-3'-deamino-3’-(4"-morpholinyl)doxorubicin i 10 ml CH2C1 sættes 5 til 30 ml CH^OH mættet med ammoniak ved 0°C. Blandingen omrøres ved 0°C i 1 time, hvorefter den henstår ved 3°C i 27 timer. Opløsningsmidlet fordampes fra reaktionsblandingen. Remanensen opløses i en 4: iblanding af CH2C12-CH30H, og opløsningen koncentreres. Dette gentages to gange, hvor-10 efter det faste stof opløses i CH0C1«, filtreres gennem , koncentreres, opløses i en l:2-blanding af CH2C12 og CH^OH, koncentreres atter og tørres, hvorved man får 0,52 g (97%) af et violet produkt.

C. Det ovenfor under B fremstillede produkt opløses i 2 ml 15 CH2C12 og sættes på en 1,5 x 40 cm silicagelsøjle, elueres med CH2C12 (50 ml) og derpå med CH2C12iCH^OH-blandinger (99:1 150 ml, 98:2 150 ml, 97:3 500 ml, 95:5 100 ml, 93:7 100 ml, og 90:10 200 ml). Efter udløb af 565 ml eluent ud- 20

DK 158269 B

tages en fraktion på 335 ml, som filtreres og inddampes, hvorved der fås et produkt, som udgør 59,9% af den tilsatte prøve som en enkelt forbindelse. Denne forbindelse identi- | ficeres som 14-0-p-anisyldiphenylmethyl-3'-deamino-3' -(4"-5 -morpholinyl)-5-iminodoxorubicin ved 90 MHz NMR.

D. 0,341 g af den under C fremstillede forbindelse opløses i 20 ml 80%'s eddikesyre, hvorefter opløsningen omrøres i mørket i 7 timer. Opløsningen fortyndes derpå med 50 ml vand, hvorefter den ekstraheres tre gange med CHClg. Den 10 vandige fase indeholdende det ønskede produkt lyofiliseres i mørket, og man får 0,294 g fast stof. Det faste stof opløses i 0,1 N eddikesyre. Opløsningen vaskes med CHCl^, gøres basisk med NaHC03 og ekstraheres med CHCl3· Det ønskede produkt går over i den organiske fase, som vaskes, tørres, 15 filtreres og koncentreres til en remanens. Remanensen opløses i CHC13:CH30H (1:10), opløsningen koncentreres og tørres, hvorved man får 0,228 g 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)--5-iminodoxorubicin). Forbindelsens identitet bekræftes ved hjælp af 300 MHz NMR analyse og elementæranalyse.

20 Eksempel 7

Fremstilling af syreadditionssalt.

Den i eksempel 6 fremstillede fri base suspenderes i 200 ml vand. Blandingen omrøres, og der tilsættes langsomt 3,2 ml 0,1 N saltsyre til en pH-værdi på 4,5. Det suspenderede fa-25 ste stof går gradvis i opløsning. Opløsningen lyofiliseres i mørket, hvorved man får syreadditionssaltet 3'-deamino--3'-(4"-morpholinyl)-5-iminodoxorubicin-hydrochlorid i en renhed på 97+% ved hjælp af HPLC.

Elementæranalyse: 30 C% H% Cl”% N%

Beregnet for C^H^^O^'HCl, 2^0 54,35 6,03 5,17 4,09

Fundet 54,20 5,96 4,33 4,03

DK 158269 B

21

Eksempel 8

Fremstilling og isolering af 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)- 5-imino-13-dihydrodoxorubicin.

A. En opløsning af 0,186 g 3'-deamino-31-(4"-morpholinyl)-5 -13-dihydrodoxorubicin fremstillet som i eksempel 5 i 6 ml l:l-blanding af CE^C^ og CH^OH sættes til 20 ml CH^OH mættet med ammoniak ved 0°C. Blandingen omrøres i 1 time, hvorefter den henstår ved 3°C i ca. 21 timer, koncentreres, og remanensen opløses i en 4:l-blanding af CE^C^ og CHgOH, 10 hvorpå opløsningen koncentreres tre gange til fuldstændig fjernelse af ammoniak. Den fremkomne remanens renses ved præparativ tyndtlagschromatografi på 2 mm x 20 cm x 20 cm silicagelplader under anvendelse af en 9:l-blanding af CHClg og CHgOH som fremkalder. Bånd indeholdende praktisk 15 taget ren 31-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-5-imino-13-di- hydrodoxorubicin isoleres, elueres, og elueringsmidlet inddampes, hvorved man får 0,139 g af den fri baseforbindelse, som identificeres ved hjælp af 300 MHz NMR.

B. Den ovenfor under A fremstillede fri base omdannes til 20 hydrochloridet under anvendelse af den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde. HPLC-analyse viser, at forbindelsen har en renhed på 9.7-98%.

Elementæranalyse: C% H% Cl % N%

Beregnet for α3ΐΗ38Ν201ΐ'Η<:1*2Η20 54,19 6,31 5,16 4,08 25 Fundet 54,17 5,95 4,88 3,87

Eksempel 9

Fremstilling af 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-5--iminodaunorubicin.

En opløsning af 0,031 g 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpho-30 linyl) daunorubicin i 1,0 ml sættes til 5 ml ammoni- akmættet methanol ved 0°C. Blandingen omrøres i 30 minutter, hvorefter den henstår ved 3°C i 45 timer. Reaktions-

DK 158269 B

22 blandingen inddampes til tørhed, og remanensen opløses i 5 ml 19:1-blanding af CHCl^ og CH^OH, og opløsningen koncentreres. Dette trin gentages. Remanensen opløses i en blanding af CHCl^ og CH^OH og sættes på en 2 ml x 20 cm x 5 20 cm silicagelplade, som fremkaldes under anvendelse af en blanding af CHC13 og CH^OH (9:1). Hovedbåndet elueres og analyseres. Ved massespektroskopi konstateres det, at forbindelsen er 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-5--iminodaunorubicin.

10 Eksempel 10

Der gås frem under anvendelse af den i eksempel 6 beskrevne fremgangsmåde, idet man dog anvender 3'-deamino-31-(3”-cyano-4"-morpholinyi)-doxorubicin fremstillet som beskrevet i eksempel 4 som udgangsmateriale i stedet for 3'-deamino-15 31 -(4”-morpholinyl)doxorubicin. Under anvendelse af bloke- rings-aminerings-deblokeringsisoleringsteknikken beskrevet i eksempel 6 får man 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholi-nyl)-5-iminodoxorubicin som slutprodukt.

I det følgende angives en mere detaljeret beskrivelse af 20 den ovenfor beskrevne fremstilling: A. Til en opløsning af 0,241 g 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"--morpholinyl)doxorubicin fremstillet som beskrevet i eksempel 4, i 4 ml tør pyridin sættes 0,587 g p-anisylchlordi-phenylmethan. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i mør-25 ke i 44 timer. Reaktionsblandingen afkøles, fortyndes med 0,5 ml CH^OH, omrøres ved stuetemperatur i 3 timer, hvorpå den sættes til 50 ml fortyndet natriumhydrogencarbonatopløs-ning, og der ekstraheres med CH2C12. Ekstrakterne koncentreres, remanensen opløses i 3 ml CH2C12, og der foretages 30 fældning ved langsom tilsætning af 40 ml diethylether, hvorved man får 0,333 g (97%) 14-0-p-anisyldiphenylmethyl-3 -deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)doxorubicin. 90 MHz . NMR, CDC13, 6: 13,84 (s, 6-OH), 12,99 (s, 11-0H), 7,82 (d, 1-H), 6,70-7,75 (m, 2-H, 3-H, trityl-aryl), 5,42 (bs,

DK 158269 B

23 l'-H), 5/08 (bs, 7-H), 4,45 (bs, 2, 14-H2), 4,19 (s, 9-0H), 4,00 (s, 0CH3), 3,79 (s, 0CH3), 3,30-4,15 (m, 4'-H, 5'-H, 2"-H2, 3"-H, 6"-H2), 1,60-3,10 (m, 2'-H2, 8-H2, 5"-H2, 10-H2, 31-H), 1,13 (d, 6'-H3).

5 B. En opløsning af 0,369 g 14-0-p-anisyldiphenylmethyl-3'--deamino-3'- (3,,-cyano-4,,-morpholinyl) doxorubicin i 8 ml CH2C12 sættes til 25 ml CH30H mættet med ammoniak ved 0°C. Blandingen omrøres ved 0°C i 1 time, hvorefter den henstår ved 3°C i 26 timer. Reaktionsblandingen inddampes til fuld-10 stændig fjernelse af ammoniakken, hvorved der fås 0,376 g af et violet produkt.

C. Det ovenfor under B. fremstillede produkt opløst i 1,5 ml CH2C12 sættes på en 1,5 x 28 cm (200-400 mesh) sili-cagelsøjle, og der elueres med CH2C12 (50 ml) og derpå med 15 blandinger af CH2C12 og CH30H (99:1 200 ml, 98:2 300 ml, 97:3 100 ml, 95:5 100 ml og 90:10 200 ml). Efter opsamling af 360 ml begyndelseseluat udtages en fraktion på 125 ml, som inddampes, hvorved man får 0,203 g 14-0-p-anisyldiphe-nylmethyl-31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-5-imino-20 doxorubicin.

D. 0,158 g af den ovenfor under C fremstillede forbindelse afkøles til 0°C og opløses i 8 ml iskold 50%'s trifluored-dikesyre. Opløsningen omrøres ved 0°C i 2 minutter, hvorefter den hældes i 100 ml isvand. Den vandige blanding ekstra- 25 heres med CHCl3 (4 x 10 ml), hvorpå de kombinerede ekstrakter vaskes med fortyndet natriumhydrogencarbonatopløsning og med vand, tørres over Na2S0^, filtreres gennem "Celite'® og inddampes. Remanensen opløses i 3 ml af en blanding af CHC13 og CH30H (4:1), opløsningen omrøres, og der tilsættes 30 dråbevis 25 ml ether. Det dannede bundfald isoleres, og man får 0,093 g 3 '-deamino-3-(3,,-4"-morpholinyl)-5-iminodoxo-rubicin.

DK 158269 B

24 HPLC- og 300 MHz NMR-analyse viser, at den fremstillede 1 forbindelse er en diastereoisomer blanding. HPLC-analyse på en Waters Radial-Pak C-18-søjle med 0,05 M pH 4 citratpuf fer-CH30H (40:60) viser toppe ved 18,4 minutter og 5 25,0 minutter i forholdet 69:31. Produktets 300 MHz spek trum udviser to resonanser for 1-H, 2-H, 3-H, l'-H, 7-H, I4-H2, 9-OH, OCH^, 10A-H, og 61-H^ protonerne.

300 MHz NMR, CDC13, 6:15,61 (s, 11-0H), 13,74 (d, 6-OH), 9,27 (d, NH), 8,21, 8,19 (2d, 1-H), 7,73, 7,72 (2t, 2-H), 10 7,33, 7,32 (2d, 3-H), 5,77, 5,72 (2d, l'-H), 5,41, 5,38 (2m, 7-H), 4,79, 4,77 (2s, 14-H2), 4,72, 4,66 (2s, 9-OH), 4,15, 4,14 (2s, 0CH3), 4,04 (m, 5'-H), 3,97 (m, 3"-H, 2"B-H), 3,75 (m, 6"-H2, 4'-H), 3,59 (m, 2"A-H), 3,23 (d, 10B-H), 3,03 (m, 10A-H, 3'-H), 2,72 (m, 5"-H2), 15 2,33 (m, 8B-H), 2,14 (m, 8A-H), 1,85 (m, 2'-H2), 1,38, 1,37 (2d, 6'-H3).

UV-Vis (CH30H) max 221 nm (ε 31.000), 252 (32.900), 307 (7.110), 520 sh (9.110), 551 (17.400), 592 (20.700).

DCI-MS m/e 638 (M + H), 611 (M + H-HCN).

20 Elementæranalyse: C% H% N%

Beregnet for ^32Η35Ν30ιΐ*H20 58,62 5,69 6,41

Fundet 58,79 5,47 6,30

Eksempel 11 25 Analogt med den i eksempel 8 beskrevne fremgangsmåde og under anvendelse af en ækvivalent molmængde udgangsmateriale i stedet for 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydro-doxorubicin-omsættes 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholi-nyl)-13-dihydrodoxorubicin til dannelse af 3'-deamino-3'-30 -(3"-cyano-4"-morpholinyl)-5-imino-13-dihydrodoxorubicin, 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyDdaunorubicin til dannelse af 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-5-iminodaunorubicin, 3'-de-amino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin til dannelse af 3'-deamino-3'-(4,,-morpholinyl)-5-imino-13-dihydro-

DK 158269 B

25 daunorubicin og 31 -deamino-3 '- (3"-cyano-4"-morpholinyl) --13-dihydrodaunorubicin til dannelse af 3'-deamino-31--(3"-cyano-4"-morpholiny1)-5-imino-13-dihydrodaunorubi-cin.

5 De omhandlede forbindelser kan anvendes som antitumormidler til mennesker og pattedyr. Denne virkning er påvist ved in vivo- og in vitro-forsøg. I ét af in vivo-forsøgene, som gennemføres i overensstemmelse med metoden beskrevet i Cancer Chemotherapy Reports, National Cancer Institute, 10 3, No. 2, Part 3, September, 1972, inokuleres raske mus in-traperitonealt med Lymphocyte Leukemia P-388 ascitesvæske.

De inokulerede mus behandles derefter den 5., 9. og 13. dag efter inokuleringen med forskellige mængder af de omhandlede forbindelser. Til sammenligningsformål anvendes ube-15 handlede mus og endvidere mus, som behandles med daunorubicin, doxorubicin, 3'-deamino-31-(4"-morpholiny1)daunorubicin eller 3'-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydrodaunorubicin, som er kendt fra US patentskrift nr. 4.301.277, eller 3'-deamino-3'-(4-methoxy-l-piperidinyl)daunorubicin el-20 ler dets 13-dihydroderivat, som er kendt fra US patentskrift nr. 4.314.054.

Gennemsnitsoverlevelsestiden for de forskellige behandlede mus bestemmes og sammenlignes med gennemsnitsoverlevelses-25 tiden for mus inokuleret med leukæmi-ascitesvæsken, men som ikke er behandlet med forsøgsforbindelserne. De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel A. Resultaterne anføres som % T/C-værdier, som er overlevelsestiden for de behandlede mus divideret med overlevelsestiden for kon-30 trolmusene multipliceret med 100. I tabel A anføres endvidere dosiskoncentrationen fra de forskellige forbindelser, som viser sig at give de bedste overlevelsestider.

DK 158269 B

26

Tabel A

Virkning mod leukæmi Leukæmi _P-388 i mus_ L-1210 celler

Over- Optimal Inhibering levelses- dosis af syntese af tid (q4d 5,9,13) ED50, μΜ

Forbindelse_ NSC No.X % T/C mg/kg DN& RNA

31 -deamino-31 - (3 cyano-4"-morpholi- nyl)daunorubicin 332.304 197 0,4 0,012 0,002 3'-deamino-3'-(3"~ cyano-4"-morpholi-nyl)-13-dihydro- daunorubicin 332.305 143 0,1 0,019 0,002 3'-deamino—3 *-(3 cyano-4"-morpholi- nyl)doxorubicin 357.704 187 0,075 0,003 0,0005 3'-deamino-3'-(3 cyano-4"-morpholi-nyl)-13-dihydro- doxorubicin 360.291 150 0,2 0,021 0,0030 3’-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13-dihydro-5-imino- doxorubicin 355.465 161 50 > 100 24

Til sammenligning: daunorubicin 82.151 130 8 0,66 0,33 doxorubicin 123.127 160 8 1,5 0,58 31-deamino-3'-(4"-morpholinyl)- daunorubicin 327.451 166 0,2 0,76 0,10 31-deamino-3'-(4"-morpholinyl)-13- dihydrodaunorubicin 327.450 132 0,2 2,2 0,67 3'-deamino-3'-(4"-methoxy-1"-piperi- dinyl)daunorubicin 334.353 199 6,25 0,63 0,12 3'-deamino-31-(4-methoxy-l-piperidi-nyl)-13-dihydro- daunorubicin 334.354 199 12,5 0,58 0,08 x NSC No. = Registreringsnummer i National Service Center under US National Cancer Institut.

DK 158269B

27

Disse resultater viser, at de omhandlede forbindelser har god til fremragende in vivo antitumor virkning ved lave optimale doser. Forbindelse NSC 357.704 har en optimal dosiskoncentration på ca. 1/150 af den dosiskoncentration, som 5 kræves for udgangsforbindelsen. Andre af de omhandlede forbindelser har optimale dosiskoncentrationer, som er langt mindre end dosiskoncentrationerne for daunorubicin og doxorubicin. Disse resultater indicerer, at de omhandlede forbindelser kan anvendes som virksomme antitumormidler med væ-10 sentlig formindsket cardiotoksicitet.

In vitro-forsøg med 3,-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morpholinyl)-daunorubicin illustrerer også den overraskende gode virkning af de omhandlede forbindelser. Ved forsøg med disse forbindelser som inhibitorer af DNA- og RNA-syntesen i L 1210 cel-15 ler under anvendelse af metoden beskrevet i G. Tong, W.W.

Lee, D.R. Black og D.W. Henry, J. Medicinal Chem, 19, 395 (1976), er forbindelserne virksomme i doser, der er 600 gange mindre end doserne af daunorubicin, doxorubicin eller de kendte analoge. De har endvidere en langt større inhiberen-20 de virkning mod RNA-syntese end mod DNA-syntese (ED,-0-for-hold DNA/RNA = 10:11). Det er anført af S.T. Crooke, et al,

Mol. Pharmacol., 14, 290 (1978), at et sådant forhold indicerer klasse II anthracycliner med forbedrede terapeutiske egenskaber. Disse data fremgår af tabel A.

25 De i tabel A anførte data, som viser forøget antitumorstyrke med morpholinostrukturen og endvidere forøget virkning med cyanomorpholinstrukturen, er typiske eksempler på virkningen opnået med denne type forbindelser.

Der gennemføres yderligere forsøg til påvisning af de om-30 handlede forbindelsers biologiske virkning. Disse forsøg er in vivo forsøg med mus mod P-388 og L 1210 leukæmi og B-16 Melanoma, og forsøgene udføres på stort set samme måde som beskrevet i den ovenfor anførte Cancer Chemotherapy Reports, 1972. I forsøgene indgår forskellige dosisstørrelser samt 35 intraperitoneal, intravenøs og oral indgift af forsøgsforbindelser. Resultaterne er anført i de efterfølgende tabeller B og C.

DK 158269 B

28

In In in m m mm

cm o cm O CM CM CM

i—i O v O o o o σ> -O - O - - - cm O—O — o oo O — co —' m — — — vo cm cm oo co r- 01 ri m m h ^ η m 'd* «Ν

Η Λ H CM Η H

Λ

In In m In In H m min NNIO MO -Ό ON

Ο Ή Ο >-1- O O Q Η ^ - ο ο οο —ο ο ο Ο Ο··* - —' οο * - - γ- —ΟΟ 0<ν ιηο ΟΟ r-. --'in η— — — m νο'ϊ'χι tu ri Λ.Ο oom

mHiQioiommcM rlH CM m H H

Λ. l·· rr ^ In m cm »» —' *—* *— _ — ^ cm r- c~ r- »-η c- m — r~- r~ r-

j? £ CB 10 <N <N CM

O CM _j i η . . «

tn ^ H i-H Η H

S’ m O O O

.5 m _ mm m minincMininin * · · η * o cm O <J3 Ο O cm ^

<. ~ *0 - O - *· H

* - S o- SoSS°. M ft P U

dp CM — cm ^ ^ m o S G G

in m h co m cm Γ' — .. .. g1 „ CO^^^H^jCMHg £ £ ° £ « tn CM Ή ·Η \Q Ή

X ^ K Λ. <-> MM U

* £ m ra φ m

Λ Ο O G G S31 G

n 3 § o 5 3 8 5 ffl n ro ^ id id AS $ ,-H ft ro H ft ft (D ft o ° 2 co cn tu m

So B 5 5 H

E-ι a) ^

In ίη in G

bi O cm * H ‘n

Cm *· O ' 3 •ft cm O — Ο ο ΰ cm — r— Λ w $ ” £3 S δ ϋ '£ H H S Λ £ *L ~ 8 S ts PH m >3 ο *h

§ d CM 0 G ><! O

•Do - d ’ft £t ‘ri il m Ο Π3 C Ό Λ

Tj S — >1 ’ft g 3 £3 Η Λ Ά G ft

d £ h m S s G

g - H V 0 3 3 S V m X I (d S — — — - T1 ,2 ΐ ?

in in m ι Ό i I

v CNJ *. 03 ^ ^ __ι *0 ** · Η Η ι—I rl

in O — O

«%^ cs W β β Cm G

^ mm m η ή ή *h h

oa lo Η Γ0 (DHiHHH

βν ,λ, s. /-%► Ή ft ft ft ft B d - S ’Sgssg S-9S S S S S H f ?

Q ft CM HH CM CO CM CM <Bn <N

h mn λ η σι 5? B S 3 S

I Gx ^ Λ3 H I 1 I I

c “ϋί - S ? ? ? 7

3 Ή H in -Η I I I I

(drscj n 2 ccBB§

Ω M “ ft ft ο 51 H I -H -S I H

•ft -rTft ^ I § g I §

oTft G 01 ft H

I Ο-Ή -- -ft - „ 01¾¾¾¾ id . h Qjin - oo ft in in - >d ft ft ι ι ι ι C ο N ·1ΐ · Ol 00 'ft > · · Ol 10 ft · 10 'ft iiiUiUiir.lin •ft (D Z H Him ΗΗΗΐΗΗΐηΗ idmmmm

Sto Dl-iftft-- H m - PQ- C

ft H U Hid HHidid H Id Λ ft 1? D « rn Ϊ

OdW ft ^1¾ ^,¾¾ J* 3 w B 3 fa rtf jg *ri'd d1 t?1 ,r*n 'd'd^irD1 H'dtf ,riv ft

DK 158269 B

29 S H ft >

SB (ti H -H -H

j*: a w en 3 ή ·η u Λ! m ο m ο oo Φ4-)ω \ * * ' - - η ftOWUi η- cn cn ο

Oft — 6 ft 0 S W ι d ^ ft a g) d κ* ft ft φ ft ΰ Η ft 13ί> ν m L ον πιοιηιη Μ oo tu t n U m σ> id ft ίο η oo > tu \ on r-iHtN η > ρ Ο tn Εη λλλ όο Γ-i >* ση ft *· S η in (Β ιβ χ S ω ft ft 1/1 d ft ft ίρ χ ' α) +J οι \ ooooo ο η ft ο ft ft m od- a ft o

+3 S to I

03 d ft a) ft a tu -μ s >

I ·Η ·Η Hl D

0 C ft ft o\° > ,¾ co Μ ft o ο i i n- •Η h co li to o tn ίο 10 m

> ft 00 > (U \ ft ft ft H

O > Pn O tn eh λ fft 'm M tw r-· m r* Æft tu td moo 3 O ft ¢¢00 in oo O o o én rHfttUS-- - - - - 1 tu α t n 3 o o ^ ft o o o o o ή tu a ft

it ·Η I Ij 4J i ι—I

-ft B o ti) ti 10 tn oo m

ft a ft ,q >i - io m io o mcN

> ,Mft-Hino - - * 3 ft ,d ID <C O ft O CN o o o ti tu i d m Q 3 o H ft p H ti W P ft Ά 1 2 3 ^ ii id i—I d ft ft d ft I ft ft

>1 ft >, >i ft >i O >i O

d u d ti o ti m ti ft ft ft ft ft ft ft ft ft Λ ft 3 ft ft rd r-1 Ϊ>1 ft 3

o3o 0 d 0 ,d OM

.ti Μ Λ -ti Μ .d ft ft 0 ftoOi ft o ft ft ftd MX Μ MXMI M d 000 0 0 0 oo od a ft ad a ft a ft aft

1 0 I ft II I I II

= ti = o =0 = 0 =0 ft ft 'H· ti d ^ ti —' a — λ —· -Η — -Η — ft 2 i -ft i 3 i a i a i a - I - M " ft - ft "ft d oo m ro O oo i oo i 00 i φ ftd i ) IX i m i m d i m 3 O ft OOOO 0 10 1 ft 0 1 ft ftOdMdft d d ^ o d m Λ ft ft ft ft I ft 0 ft 0 ft ft 0 ft 3 λ a a o isgs-sgs ej m d ti ft ti ti ti ti ti ti d ti ti ft OMtUfttUft <D >1 <D >1 M <D >i

Λ dooftoa POQOOPO

M d * I I I ft I I IIX II

0 ti 0 - oo - i - = ~ ' 0 " = li) p ft oo ft oo in on on tn on ft on on

DK 158269B

30

De omhandlede forbindelser, herunder saltene deraf, kan indgives på en vilkårlig mulig måde, herunder oralt og parenteralt (intravenøst, intraperitonealt, subkutant og intramuskulært). Parenteral indgift, især intravenøs ind-5 gift, er den traditionelle indgiftsmåde, og denne foretrækkes. Doseringshyppigheden og dosisstørrelsen skal være tilstrækkelig til at afhjælpe leukæmien eller anden cancertype, hvorimod forbindelserne er virksomme. Ved behandling af f.eks. laverestående forsøgsdyr er en dosis af den om-10 handlede forbindelse i området fra ca. 0,0010 mg/kg til ca.

25 mg/kg pr. dag tilstrækkelig til at bedre leukæmi. Den øvre dosisgrænse er den dosis, hvorved der kommer toksiske bivirkninger, og den kan bestemmes ved forsøgs-fejl-metoden anvendt på det dyr, som skal behandles. Sædvanligvis er 15 dosis af den omhandlede forbindelse mindre (f.eks. 1/20 til 1/200 gange) end den dosis, som kræves af stamforbin-delserne. Indgift af én dosis hveranden til syvende dag er virksom, men der kan også anvendes kortere intervaller, f.eks. 1 dag eller mindre, mellem dosisangivelserne.

20 For at lette indgivelsen af forbindelserne, herunder saltene, kan de anvendes i form af farmaceutiske præparater, især i enhedsdosisform. Selv om forbindelserne per se kan indgives, er det mere almindeligt at indgive dem i forbindelse med et farmaceutisk acceptabelt bærestof, som fortyn-25 der forbindelsen og letter håndteringen. Med udtrykket farmaceutisk acceptabel skal forstås, at bærestoffet, samt det færdige præparat, er sterilt og ugiftigt.

Til oral indgift kan bærestoffet eller fortyndingsmidlet være fast, halvfast eller flydende og kan tjene som hjælpe-30 stof, strækkemiddel eller medium formidlet som beskrevet i farmakologiske forskrifter. Til parenteral indgift opløses eller suspenderes forbindelsen i et egnet flydende injektionsmedium på kendt måde.

Ved fremstillingen af disse dosisformer kan der anvendes 35 den anerkendte teknik til formulering af vandopløselige

DK 158269 B

31 farmaceutiske præparater (i tilfælde af salte) og vanduop-løselige præparater (i tilfælde af de frie baser). Injektionspræparater kan eksempelvis fremstilles på følgende:

Præparat A: 5 Steril suspension i vandigt medium til injektio'n..... ' Mg

Forbindelse ifølge eksempel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 eller 10 som suspenderbart pulver 3

Natriumcitrat 5,7 10 Natriumcarboxymethy 1 c e 1 lulos e (lavviskositetskvalitet) 2,0

Methyl-para-hydroxybenzoat 1/5

Propyl-para-hydroxybenzoat 0,2

Vand til injektion ad 1,0 ml 15 Præparat A':

Steril suspension i vandigt medium til injektion'..... Mg "3'-Deamino-31 -(3"-cyano-4"-morpholinyl) doxorubicin ifølge eksempel 4 0,5 20 Natriumcitrat 5,7

Natriumcarboxymethylcellulose (lavviskositetskvalitet) 2,0

Methyl-para-hydroxybenzoat 1/5

Propyl-para-hydroxybenzoat 0,2 25 Vand til injektion ad 1,0 ml

Præparat B:

Steril opløsning i vandigt bæremedium til injektion Mg

Forbindelse ifølge eksempel 7 4 30 Natriumcitrat 5,7

Natriumcarboxymethylcellulose (lavviskositetskvalitet) 2,0

Methyl-para-hydroxybenzoat 1,5

Propyl-para-hydroxybenzoat 0,2 35 Vand til injektion ad 1,0 ml

DK 158269 B

32

Tabletter til oral indgift kan fremstilles på følgende måde:

Præparat C:

Table tformuler ing Mg 5 Forbindelse ifølge eksempel 7 5,0

Lactose 91

Majsstivelse (tørret) 51,5

Gelatine 2,5

Magnesiumstearat 1,0 10 Forbindelsen ifølge eksempel 7 pulveriseres og sigtes, hvorefter den blandes med lactosen og 30 mg af majsstivelsen, som begge er blevet sigtet forinden.

Gelatinen udrøres i vand under opvarmning til dannelse af en 10%1 s vægt/vægt opløsning, og der fremstilles en masse 15 af pulverblandingen og den varme gelatineopløsning. Massen granuleres gennem en sigte, og det fugtige granulat tørres ved 40°C.

Det tørre granulat regranuleres gennem en sigte, og resten af stivelsen og magnesiumstearatet tilsættes, hvorefter der 20 foretages omhyggelig blanding.

Granulatet komprimeres til tabletter med en vægt på 150 mg pr. tablet»

Kapsler kan fremstilles på følgende måde:

Præparat D: 25 Kaps elformul er ing Mg

Forbindelse ifølge eksempel 8 10

Lactose 190

DK 158269 B

33

Præparat D':

Kap s el forum ler ing- Mg 3 ' -Deamino-3 1 - (3"-cyano-4"-morpholinyl) - doxorubicin ifølge eksempel 4(C) 1 5 Lactose 199

Forbindelsen ifølge eksempel 8 eller 4(C) og lactose sigtes, og pulverne blandes grundigt inden påfyldning i hårde gelatinekapsler af en egnet størrelse, således at hver kapsel indeholder 200 mg pulverblanding.

Claims

DK 158269B PATENT KRAV. Analogifremgangsmåde til fremstilling af morpholinyl-daunorubicin- eller morpholinyldoxorubicinderivater med formlen O OH \ X X jT >H H3CO x oh o 0 HO ]-f N A ^o^ hvor R betyder -C0-CH3, -CH0H-CH3, -C0-CH20H eller -CH0H-CH20H, X er 0 eller NH, og A er H eller CN, idet dog A er CN, når X er O, kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen o OH H3C0 o oh o .—o 0 HO 1 NH2-HC1 hvori R betyder -CO-CH3 eller -CO-C^OH, omsættes i et blandet vandigt polært organisk medium med overskud (18 molækvivalenter) af 2,21-oxydiacetaldehyd med formlen DK 158269 B ^CH2 - CHO ° \ CH2 - CHO der er dannet in situ ved spaltning af 1,4-anhydroerythritol i vandig opløsning med natriumperiodat ved stuetemperatur, idet omsætningen gennemføres ved stuetemperatur i nærværelse 5 af 2 molækvivalenter alkalimetalcyanoborhydrid, såsom natrium-cyanoborhydrid, beregnet på udgangsmaterialet, det rå reaktionsprodukt, som opnås som en blanding af basiske 3'-morpho-linoderivater af udgangsmaterialet sammen med de analoge 13-dihydroforbindelser og af de tilsvarende analoge neutrale 10 S'^cyanomorpholino^forbindelser, adskilles i neutrale og basiske fraktioner, hvorpå enten de basiske eller de neutrale fraktioner separat underkastes en kromatografisk separation på en silicagelsøjle. under anvendelse af et CH2Cl2/CH2OH-s.ystem (9:1 r/r) som elueringsmiddel til opnåelse af henholds-15 vis 3'-morpholino- og 3"-cyano-morpholino-derivaterne med formlen I (X = O) , som hver for sig om ønsket omsættes, efter passende blokering af hydroxygruppen i gruppen -C0-CH20H, når denne er til stede, med en mild syrelabil beskyttelsesgruppe, såsom p-methoxy-tritylgruppen, ved en temperatur på fra 0 til 20 3°C med overskud af alkoholisk ammoniak, hvorpå, om nødven digt, efter fraspaltning af den milde syrelabile beskyttelsesgruppe ved behandling med eddikesyre eller kold trifluor-eddikesyre ved stuetemperatur den ønskede forbindelse med formlen I (X = NH) fås som den fri base, der efter kromato-25 grafisk rensning på en silicagelsøjle under anvendelse af systemet CHCl^/CH^OH (9:1 r/r) som elueringsmiddel til sidst isoleres som sådan (A = CN) eller omdannes (A = H) til det tilsvarende hydrochlorid ved behandling med 0,1 N saltsyre.