NL8302586A

NL8302586A - Derivaten van morfolinyl daunorubicine en morfolinyl doxorubicine alsmede analogen daarvan.

Info

Publication number: NL8302586A
Application number: NL8302586A
Authority: NL
Original assignee: Stanford Res Inst Int
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-19
Publication date: 1984-02-16
Also published as: NO157146C; CH655729A5; GB8319165D0; IL69260A0; SE8304045D0; SE459921B; AU555902B2; IT8322143A0; FR2530640A1; SE8304045L; ES530593A0; NL188905C; FI832637A; NO157146B; IE55795B1; ES524271A0; US4464529A; PT77060B; FI832637A0; FR2530640B1

Description

* Jk . * VO 4949

Derivaten van morfolinyl daunorubicine en morfolinyl doxorubicine alsmede analogen daarvan.

De uitvinding die op het gebied van anthracycline-chemie ligt heeft in het bijzonder betrekking op analogen van de anthracyclinen doxorubicine en daunorubicine die bruikbaar als antitumor middelen.

Doxorubicine (adriamycine) als beschreven in het Ame-5 rikaanse octrooischrift 3.590.028 is waarschijnlijk het meest bruikbare nieuwe antikankermiddel wat momenteel wordt toegepast. Het is (tezamen met daunorubicine) een hoofdmiddel voor de behandeling van een ongebrui- r kelijk groot aantal vaste tumoren en leucemie. Helaas blijken vele patiënten met deze tumoren niet te reageren en patiënten met sommige em-10 stige tumortypen (karteldarmkanker, melanoma) reageren in het geheel niet. Voorts geeft bij sommige patiënten een chronische behandeling aanleiding tot onomkeerbare hartbeschadiging die bij voortzetting van de behandeling fataal kan zijn. Aldus bestaat er een grote behoefte aan analogen die een betere graad van reactie, een breder spectrum van reac-15 tie of verminderde cardiotoxiciteit geven. Er wordt voortdurend gezocht naar meer effectieve en minder giftige middelen en de onderhavige aanvrage is op dit fundamentele doel gericht. De momenteel het meest actieve nieuwe analogen zijn, beoordeeld volgens de onderzoekresultaten van een algemeen toegepaste test tegen muizen-leucemie P388 in een 3-dosis-20 behandelingsschema (q4d 5,9,13), zijn twee lipofiele derivaten (AD32 en Ν,Ν-dibenzyldaunorubicine) waarvan echter significant hogere doses nodig zijn en die niet met DNA in vivo in reactie treden hoewel aangenomen wordt dat DNA een primair biologisch doel voor de anthracycline-reeks is. De meeste N-alkylderivaten zijn actief in het antitumor-onderzoek 25 tegen muizen-leucemie P388, maar verschillen niet significant van doxorubicine en daunorubicine. Enkele van dergelijke derivaten zijn inactief.

Vrijwel de gehele geschiedenis en de stand van de techniek van doxorubicine en zijn anthracycline-analogen kan men aantreffen in het artikel "Adriamycin" door David W. Henry, ACS Symposium Series, 30 nr. 30, Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, blz. 15 - 57 (1976) en in het boek Doxorubicine door Frederico Arcamone, Academie Press, 1981. AD32 wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.035.566.

8302586 * » 4 2 5-Iminodaunorubicine wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.109.076 van aanvraagster. Het doxorubicine-equivalent wordt aangegeven in "Synthesis and Preliminary Antitumor Evaluation of 5-Iminodoxorubicin", J. Medicinal Chem., 24, 669 (1981) door Edward M.

5 Acton en George L. Tong. 5-Iminodaunorubicine behield zijn activiteit met verlaagde neveneffecten terwijl 5-iminodoxorubicine een verhoogde activiteit vertoonde maar hogere doseringen vereiste.

3'-Deamino-3(4-morfolinyl)daunorubicine, beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.301.277 van aanvraagster was actief 10 bij l/40ste deel van de dosis van doxorubicine maar gaf een nagenoeg identieke T/C waarde (166% vs 160% tegen P388). Deze verbinding en de bereiding en eigenschappen daarvan worden tevens beschreven in "Enhanced Antitumor Properties of 3(4-Morpholinyl) and 3(4-Methoxy-l-piperidi-nyl) Derivatives of 3'-Deaminodaunorubicin", J. Medicinal Chem., 25, biz. 15 18 - 24 (1982) door Carol W. Mosher, Helen Y. Wu, Allan N. Fujiwara en

Edward M. Acton.

Een algemene reduetieve alkyleringsmethode ter bereiding van nieuwe semi-synthetische anthracycline-derivaten wordt beschreven in "Adriamycin Analogs. 3. Synthesis of N-Alkylated Anthracyclines 20 With Enhanced Efficacy and Reduced Cardiotoxicity", J. Medicinal Chem., 22, biz. 912 - 918 (1979) door G. L. Tong, H.Y. Wu, T.H. Smith en D.W. Henry.

Voor de achtergrond van de onderhavige uitvinding wordt in het bijzonder naar deze stand van de techniek verwezen.

25 Er is nu een groep van nieuwe daunorubicine-en doxo- rubicine-derivaten gevonden, die worden voorgesteld door de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R CO-CH^ of CHOH-CH^ in het geval van daunorubicine-derivaten of C0-CH20H of CHOH-C^OH in het geval van doxorubicine-derivaten is; X O of NH is; terwijl A hetzij een cyano-30 groep (CN) of een waterstofatoom is, met de beperking dat walmeer X O is, A een cyanogroep moet zijn. Wanneer A waterstof is kunnen deze verbindingen tevens als zuuradditiezouten bestaan. Deze zouten zijn een ander aspect van deze uitvinding.

In een volgend breder aspect van de uitvinding wordt 35 voorzien in derivaten van deze verbindingen welke derivaten zijn gevormd door een of meer modificaties waarvan in de stand van de techniek 8302585 * * 1 3 is aangetoond dat deze effectief zijn voor analoge daunorubicine- en doxorubicine-materialen. Dergelijke modificaties betreffen verdere veranderingen in de R-groep, verwijdering van de methoxygroep op de 4-plaatsf verandering in de 4'-koolstofsubstituenten, veranderingen in A en sub-5 stitutie in de morfolinyl-ring. De verbindingen die door deze verschillende modificaties worden omvat worden in het algemeen gerang-; schikt als morfolinyl- of analogen van morfolinyl-derivaten van daunorubicine-.en doxorubicine-type materialen die worden voorgesteld door de algemene formule 2 van het formuleblad, waarin R -CO-CH^ of -CHOH-10 CH^ in het geval van eenvoudige daunorubicine-derivaten, -CO-CH2OH of -CHOH-CH^OH in het geval van eenvoudige doxorubicine-derivaten; hydroxy; een alkylgroep met 1 - 3 koolstofatomen zoals -CH^CH^; een eindstandige hydroxyalkylgroep met 1-3 koolstofatomen zoals -CH2-OH of -C^-CH^-OH; een op een organisch zuur met 2-7 koolstofatomen geba-15 seerde esters en diësters van -CO-CH^OH, -CHOH-CH^OH, en -CHOH-CH^ met inbegrip van bijvoorbeeld acetaat (-QAc), propionaat (-OPr), benzoaat (-OBz) en glycolaat (-0-G1) esters zoals -CO-C^OAc, -CO-CH2-OBz, -CO-CH2-OPr, -CO-CH2-OGl, -CH (QAC) -CHj-OAC , -CH (OBZ) -C^-OBz, -CH(0Ac)CH3, en -CH (OBz) CH^ en dergelijke; een alkylgroep met 1-6 koolstofatomen 20 of arylether-vervanging van een of meer hydroxylgroepen van -CO-CHjOH, -CHOH-CH3, en -CBOHH^OH, zoals -CH (OCH3)-CH3, -C0-CH20-CH3, -CO-C^O- -C^^, -C0-CH20-CgH3 en dergelijke; en 13-ketimine-derivaten van -CO-CHj of -CO-CH2OH zoals -C(N0H)-CH3, -C(NNHBz)CH3, -C(NOCH3>-CH3, -C(NOH)-CH20H, -C(NOCH3)-CH2OH, en C(NNHBz)-GH2OH en dergelijke is; Y gewoon-25 lijk me thoxy (-0CH3) is maar tevens waterstof kan zijn, X *0 of =NH is;

R' en R" tezamen een waterstof of een hydroxy vormen (d.w.z. hetzij R' of R” is hydroxy en de andere waterstof), of beide zijn waterstofatomen of R* is 0-methoxy en R" is waterstof; terwijl A wordt gekozen uit cyano (-C= N) en waterstof als boven aangegeven. Wanneer A waterstof 30 is kunnen deze verbindingen tevens als zuuradditiezouten bestaan. Z

wordt gekozen uit zuurstof, zwavel, -CH- waarin R"' een alkylgroep met OR" · 1-3 koolstofatomen is en -CHj- met de voorwaarde dat wanneer Z -CH2~ of -CH- is A -C=N is.

OR" ’ 8302586 * * * 4

Bereiding van de verbindingen met de algemene formule 2

De bereiding van deze verbindingen wordt daardoor gekenmerkt dat het bekende daunorubicine en doxorubicine alsmede analogen t daarvan met de structuur volgens formule 5 van het formuleblad, waarin 5 R, R', R", X en Y de voornoemde betekenissen hebben, in reactie worden gebracht in een gemengd waterig polair organisch medium met de verbinding met de structuur volgens formule 6 van het formuleblad of een geschikte voorloper daarvan, waarbij Z wordt gekozen uit zuurstof, zwavel, -CH--, -CH- en R"' de voornoemde betekenissen heeft, welke reactie

^ I

10 OR" ’ wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een cyaanboorhydride-zout, zoals een alkalimetaal-cyanoboorhydride, waarbij de gewenste verbindingen op een op zichzelf bekende wijze worden geïsoleerd en gezuiverd. Deze verbindingen zijn verwant aan de gevestigde antikanker-middelen dauno-15 rubicine en doxorubicine '(adriamycine), worden daaruit bereid volgens een chemische synthese en derivaat-vormingstechnieken, waarbij zij actieve middelen tegen kanker zijn. Zij blijken twee voordelige nagestreefde eigenschappen te combineren - een hoog antitumor effect bij lage doseringen. Aldus bieden zij de belofte van een sterke effectiviteit 20 met minder neveneffecten in verband met de lagere dosering, zoals cardio-toxiciteit vergeleken met de eerder beschreven materialen.

In andere aspecten voorziet de uitvinding in farmaceutische preparaten die deze nieuwe derivaten bevatten alsmede een methode voor het behandelen van kanker bij. warmbloedigen door dergelijke prepa-25 raten aan een warmbloedige die daaraan behoefte heeft toe te dienen.

De onderhavige uitvinding voorziet in morfolinyl-derivaten van iminodaunorubicine en iminodoxorubicine en de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan alsmede in cyanomorfolinyl-derivaten van daunorubicine, doxorubicine, Iminodaunorubicine en iminodoxorubicine.

30 Deze verbindingen zijn gerangschikt in tabel A.

8302586 5

TABEL A

Verbindingen volgens de uitvinding X A R _Naam van de verbinding_ NH H CO-CH^ 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-iminodauno- rubicine en farmaceutisch aanvaardbare zou-5 ten daarvan NH h CHOH-CH3 3'-deamino-31-(4"-morfolinyl)-13-dihydro-5- imino-daunorubicine en farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan NH H CO-CI^OH 31-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-iminodoxoru- 10 bicine en farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan NH h CHOH-C^OH 3 '-deamino-3 *-(4"-morfolinyl) -13-dihydro-5- iminodoxorubicine en farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan 15 O CN CO-CH^ 3 '-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)dauno- rubicine 0 CN CHOH-CHj 3'-deamino-3 * -(3"-cyano-4"-morfolinyl) -13- dihydro-daunorubicine 0 CN CO-CHjOH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxo- 20 rubicine 0 CN CHOH-CH^OH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4,,-mQrfolinyl)-13- dihydrodoxorubicine NH CN CO-CH^ 3'-deamino-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-5- iminodaunorubic ine 25 NH CN CHOH-CH3 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13- dihydro-5-iminodaunorubicine NH CN CO-C^OH 3' -deamino-3' - (3 " - cyano-4 " -morf olinyl) -5- iminodoxorubic ine NH CN CHOH-CH2OH 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13- 30 dihydro-5-iminodoxorubicine

Vijf van deze materialen hebben de voorkeur vanwege hun uitstekende activiteit als antitumor-middelen. Deze zijn 3' -deamino-3'- (3''-cyano-4"-morf olinyl) -doxorubicine; 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydro- 35 doxorubicine; 6302586 6 3'-deamino-3'-(3"-cy ano-4"-morfoliny1)daunorubicine; 3'-deamino-3(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodauno- rubicine; en 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine.

5

Het materiaal dat de meeste voorkeur heeft is het eerste van deze_.yijf materialen.

De eerste vier verbindingen van de uitvinding als gerangschikt in de tabel A kunnen de vrije basen zijn als weergegeven in tabel A of zij kunnen de farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten van deze basen zijn. De zuuradditiezouten bieden het. voordeel dat zij in water en waterige gemengde oplosmiddelen zoals water-alkanolen of water-alkaandiolen oplosbaar zijn. Voorbeelden van deze gemengde oplosmiddelen zijn water-propyleenglycol, water-ethanol, water-ethyleenglycol, pekel, verschillende andere waterige injecteerbare media en dergelijke. De vrije 15 basen zijn in minder polaire organische oplosmiddelen, zoals chloroform, methyleenchloride, gemengde chloroform-methanol-oplosmiddelen en dergelijke oplosbaar. Zij kunnen tevens als suspensies worden toegepast.

De zouten zijn de zuuradditieprodukten van de vrije basen met een farmaceutisch aanvaardbaar zuur. Een "farmaceutisch-aan- 20 vaardbaar" zuur is een zuur dat niet-giftig is en in het algemeen in farmaceutische produkten wordt toegepast. Voorbeelden van deze zuren zijn anorganische zuren zoals chloorwaterstofzuur, broomwaterstofzuur, zwavelzuur en fosforzuur alsmede organische zuren, zoals de carbonzuren, 22 bijvoorbeeld azijnzuur, glycolzuur, malelnezuur, appelzuur, hydroxy-maleinezuur, wijnsteenzuur, citroenzuur en salicylzuur en de organosul-fonzuren, bijvoorbeeld methaansulfonzuur en p-tolueensulfonzuur. Mengsels van twee of meer van deze zuren kunnen worden toegepast evenals mengsels van een of meer vrije basen plus een of meer zuuradditiezou-ten. Vanwege hun eenvoud en gemakkelijkeoplosbaarheid hebben zuuradditiezouten gebaseerd op chloorwaterstofzuur en broomwaterstofzuur de voorkeur.

Als eerder opgemerkt, kunnen deze verbindingen tevens als derivaten aanwezig zijn. Deze derivaten worden gevormd om de oplos-22 baarheid van de verbinding te vergroten ofwel om andere fysische eigenschappen van de verbindingen te modificeren.

3302586 7

De verbindingen, kunnen met de volgende algemene route worden bereidt

Commercieel beschikbaar daunorubicine of doxorubicine (als een zuuradditiezout) laat men eerst reageren onder reductieve alkyle-5 ringsomstandigheden met 2,2'-oxydiaceetaldehyde, zie formule 7 van het formuleblad. Deze alkylering levert een gemengd produkt dat vier half-componenten bevat. In het geval van daunorubicine zijn deze componenten: 3'-deamino-3(4"-morfolinyl)daunorubicine, 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine, 10 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)daunorubicine, en 3' -deamino-31 - (3"-cyano-4,,-morfolinyl)-13-dihydrodauno- rubicine.

In het geval van doxorubicine bevat het reactieprodukt: 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)doxorubicine, 15 3'-deamino-3'-(4"-morf olinyl)-13-dihydrodoxorubicine, 3' -deamino-3' - (3 "-cyano-4" -morfolinyl) doxorubicine, en 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxo- rubicine.

2,2*-Oxydiaceetaldehyde kan worden gevormd door zure 20 hydrolyse van 2,2'-oxydiaceetaldehyde bis(diëthylacetaal), zie formule 8 van het formuleblad, volgens de methode van Field, et al (zie Belgisch octrooischrift 655.436) of door splitsing van 1,4-anhydroerythritol, zie formule 9 van het formuleblad, volgens de methode van Barry et al, Carbohydrate Research, 7, 299 (1968) en Greenberg et al, Carbohydrate 25 Research, 35, 195 (1974).

De reductieve alkylering kan worden uitgevoerd onder toepassing van een overmaat van het dialdehyde in een gemengd waterig-polair organisch medium, zoals water-acetonitril, in het algemeen bij een pH van ongeveer 7 in aanwezigheid van een reductiemiddel, zoals een 30 alkalinetaal-cyanoboorhydride, bijvoorbeeld natrium- of kalium-cyano-boorhydride. Dit is een betrekkelijk gemakkelij kereactie die gewoonlijk binnen een uur of minder bij kamertemperatuur kan worden voltooid. De reductieve alkylering is geïllustreerd in de voorbeelden en wordt tevens in het reeds genoemde Amerikaanse octrooischrift 4.301.277 en in J.Medi-35 cinal Chem., 25, blz. 18 - 24 (1982) vermeld.

Het opwerken van het gemengde reactieprodukt kan volgens 3302586 8 elke methode waarbij de gewenste isolering en scheiding tot stand kan worden gebracht worden uitgevoerd. Zuurextractie van het reactieprodukt is een effectieve methode om de zuur-extraheerbare niet-cyano-gesubstitueer-de materialen te scheiden van de zuur-onoplosbaar cyano-gesubstitueerde 5 materialen.. De verkregen paren materialen kunnen in de individuele verbindingen worden gescheiden volgens verschillende chromatografische methoden, zoals preparatieve laagchromatografie, kolamchromatografie, of preparatieve vloeistofchromatografie met hoge capaciteit.

De 5-iminoverbindingen kunnen gemakkelijk en recht-10 streeks uit de geïsoleerde 5-oxo verbindingen worden bereid met de methode beschreven in het reeds vermelde J. Medicinal Chem, 24, blz. 669 (1981) artikel. In deze methode worden de 5-oxo materialen in aanraking gebracht met een overmaat alcoholisch ammoniak bij lage tot gematigde temperaturen, zoals van -25°C tot +25°C gedurende ongeveer 0,5 tot onge-15 veer 100 uur. In het geval van 3’-deamino-3'-(4"-morfolinyl)doxorubicine en 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxorubicine is het noodzakelijk het hydroxyl op het koolstofatoom op de 14-plaats te blokkeren voorafgaande aan de ammoniak-behandeling. Elke milde zuur-labiele beschermende groep kan worden toegepast. Door zijn algemene toepassing in de farmaceu-20 tische chemie is methoxy-trityl een voorkeurs-beschermende groep. De trityl-functionaliteit kan worden ingevoerd door 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)doxorubicine of 3'-deamino-3'—(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxo-rubicine te behandelen met een overmaat p-anisyl-chloordifenylmethaan bij kamertemperatuur en dergelijke. Nadat de reactie met ammoniak vol-25 tooid is kan de hydroxygroep op de 14-plaats worden geregenereerd door contact met een zuur zoals azijnzuur of koud waterig trifluorazijnzuur.

Derivaten en analogen

De uitvinding voorziet tevens in derivaten en analogen van de voornoemde 12 primaire verbindingen. Zoals blijkt uit de algemene 30 formule 2 kunnen deze derivaten een of meer van de volgende modificaties van de primaire verbindingen omvatten.

a. Een of meer van de hydroxylgroepen die in R aanwezig zijn, kunnen aanwezig zijn als esters van organische zuren met 2 tot 7 koolstofatomen, met inbegrip van alkaanzuur, oxyalkaanzuur, hydroxy-35 alkaanzuren en benzoëzuur. Deze modificatie kan aanleiding geven tot de R-groepen als weergegeven in tabel B.

8302586 9 TABEL B Ester R-symbolen

Zuur Ester R

Azijnzuur -C0-CH2“0-C0CH3 -CH(ococh3)-ch2-o-coch3

5 -CH(OCOCH3)-CH2OH

-ch(ococh3)-ch3

Propionzuur -CO-CH2-0-COC2H5 -ch(ococ2h5)-ch2-o-coc2h5 -CH(OCOC2H5)-CH3

10 Glycolzuur -C0-CH2-0-C0CH20H

-CH (OCOCH2OH)-CH2-OCOCH2OH -CH (OCOC^OH) -CH3

Benzoëzuur -C0-CH_-0-C0C^H_ 2 6 5 -CH(QC0C-He)-CH„-OCOC^H 6 5 2 6 5 15 -CH(OCOCgHg)-CH3

Meer complexe zuren zoals HOOC-CH (OC2H5) 2 -C0-CH2-0-C0CH(OC^) 2 enz.

Esters van doxorubicine van het type als beschreven 20 [Arcamone, et al, J. Medicinal Chem., 17, 335 (1974); Belgisch .octrooi-schrift 848.219)] kunnen gemakkelijk volgens de hierin beschreven reduc-tieve alkyleringsmethode worden omgezet in de overeenkomstige ester-derivaten van verbindingen van deze uitvinding.

b. Een of meer van de in R aanwezige hydroxylgroepen 25 kan als ether aanwezig zijn - in het bijzonder alkyl (1-6 koolstofatomen) ethers of aryl (ongeveer 6 of 7 koolstofatomen) ethers.

Representatieve "ether" R-eenheden worden weergegeven in tabel C.

8302586 10 TABEL· C Ether R~symbolen

Methylether -CO-CH^-OCH^ -CH(OH)-CH2-OCH3

Ethylether -CO-CH2-OC2H5 5 -CH(OH)-CH2-OC2H5

Butylether -CO-CH2OC4Hg

Fenylether -CO-CH^O-CgH,.

-ch(oh)-ch2-oc6h5

Dergelijke 14-ethers van doxorubicine zijn beschre-10 ven [Masi, et al, II Farmaco, Ed. Sci., 34, 907 (1979)] en kunnen als uitgangsmaterialen in de reductieve alkyleringsmethode van deze uitvinding worden toegepast.

c. De substituenten van het 4'-koolstofatoom in.de "suiker"-ring kunnen worden gemodificeerd. De 4'-O-methyl-derivaten (in 15 de suikereenheid) van doxorubicine en daunorubicine worden gemakkelijk verkregen [Cassinelli, J. Medicinal Chem., 22, 121 (1979)3 en omgezet in de verbindingen van deze uitvinding. Andere bekende structuurveranderingen bij de 4'-plaats van de suikereenheid zijn de 4'-deoxy (geen OH) en 4'-epi (OH extra) derivaten vein doxorubicine en daunorubi-20 cine (Suarato, et al, Carbohydrate Res. 98, cl (1981)) die veelbelovende farmaceutische eigenschappen vertonen. Deze verbindingen worden door de reductieve alkyleringsmethode gemakkelijk omgezet in de overeenkomstige verbindingen van deze uitvinding.

b. De 4-demethoxy-analogen van doxorubicine en dauno-25 rubicine (geen CH^O in de A-ring van het aglycon) worden gemakkelijk verkregen [Arcamone, et al, Cancer Test Rpts., 60, 829 (1976); Duits octrooi 2.652.391] en omgezet in de verbindingen van deze uitvinding, e. Carbonyl-groepen ;

O

II

(-C-) 30 in de R-eenheden van daunorubicine en doxorubicine kunnen gemakkelijk worden omgezet in N-

•V

(-C-) 8302586 11 groepen volgens de algemene methodes voor het omzetten van ketonen in oximen, hydrazonen en andere ketiminen.

Tabel D geeft een opsomming van representatieve ketimine R-symbolen.

TABEL D

5 Ketimine R-symbolen -c(noh)-ch2oh -C (NOH) -CH3 -c(noch3)-ch2oh -c(noch3)-ch3

10 -c (NNHC0C6H5) -CH2OH

-C (NNHC0C6H5) -CH3 -C(NNHC0NH2)CH2OH -C(NNBCONH2)-CH3 en dergelijke.

Deze 13-ketimine R-materialen kunnen gemakkelijk door 15 de bovengenoemde reductieve alkylering in de verbindingen van deze uitvinding worden omgezet.

f. De R-eenheid kan worden vereenvoudigd ter eliminering van carbonyl en de eenvoudige hydroxyl- of de R-eenheden doen ontstaan als aangegeven in tabel £.

TABEL E

20 Vereenvoudigde R-symbolen

-OH

-ch2oh -c2h4oh

Deze daunorubicine en doxorubicine materialen worden 25 beschreven in het Duitse octrooi 27 57 057 en in Penco et al, J. Antibiotics, 30:764 (1977), die in de verbindingen van deze uitvinding door reductieve alkylering kunnen worden omgezet.

g. 2-Cyanopiperidino (Z = CH2) en 2-cyano-4-methoxy-piperidino (Z = CH0CH3) (formule 2). De piperidino-derivaten van dauno- 30 rubicine en doxorubicine zijn beschreven in de Amerikaanse octrooischrif-ten 4.202.967 j 8302586 12 en het Amerikaanse octrooischrift 4.314.054

rS

v 5 OCH3

De overeenkomstige 2-cyano-l-piperidinyl-derivaten kunnen worden gesynthetiseerd door de bovengenoemde verbindingen met meta-chloorperbenzoëzuur in een dichloormethaan-oplossing om te zetten in de N-oxyden, en door omlegging van de N-oxyden met trifluorazijnzuur-anhy-10 dride in aanwezigheid van cyanide-ionen (Polonovski-Potier-Husson).

Zie reactieschema A van het formuleblad.

Wanneer de reductieve alkyleringsprocedure van deze uitvinding wordt uitgevoerd met daunorubicine met uitzondering dat 2,2'-thiobisaceetaldehyde (C^CHC^SCE^CI^O; Carbohydrate Res., 110, 195(1982)) 15 in plaats van 2,2'-oxybisaceetaldehyde wordt toegepast en de pH zwak zuur is (pH 6 in plaats van pH 7,2), wordt het thiomorfoline-derivaat (A=H) (formule 1) van daunorubicine verkregen. Dit produkt is even actief tegen muis-leucemie P388 (T/C = 169%) als doxorubicine (T/C = 160%), hoewel een hogere dosis nodig is (50 mg/kg in plaats van 8 mg/kg). Even-20 eens wordt het thiomorfoline-derivaat van doxorubicine gevormd wanneer in deze reactie doxorubicine wordt toegepast.

De neutrale produktfractie uit deze reacties, die in de organische laag achterblijft na extractie met een waterig zuur ter verwijdering van het thiomorfolino-derivaat als het water-oplosbare 25 zure zout, bevatten deovereenkomstige 3-cyano-l-thio-4-morfolinyl-deri-vaten (A = CN) van daunorubicine en doxorubixine.

Voor een nadere toelichting van al deze methoden voor het bereiden van derivaten wordt verwezen naar alle hierboven genoemde literatuurplaatsen.

30 De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, die als illustratie en niet als beperking van de uitvinding zijn bedoeld.

Voorbeeld I

Bereiding, isolering en identificering van 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-35 morfolinyl)daunorubicine A. Onder het volgen van de methode ter bereiding van 8302586 13 -3'-deamino-3'-morfolinodaunorubicine-hydrobromide als beschreven in Mosher et al, J.'Medicinal Chem., 25, bl2. 18-24 (1982) werd een ruw reactieprodukt dat 3,-deamino-3,-(4"-morfilinyl)daunorubicine, 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine, 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-5 morfolinyl)daunorubicine en 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine bevatte bereid. Voor bijzonderheden wordt verwezen naar genoemde literatuurplaats. Het ruwe materiaal werd geëxtraheerd met CHC1.J als daarin aangegeven ter verwijdering van de vier primaire produkten in de CHCl^-fase. Een uitputtende extractie van de 10 CHCl^-fase met 0,01N HCl verwijderde de twee basis morfolino-produkten, als in de referentie beschreven. Het neutrale produkt-rijke CHCl^ werd gewassen met een NaHCO^-oplossing, gedroogd en ingedampt. Monsters werden opgelost in 4 ; 1 CHCl^«CH^OH en aangebracht in een Waters Radial-Pak C-18 hoge capaciteit vloeistof-chromatografiekolom en geëlueerd 15 met 2 ml/min van een 65 : 35 0,05M pH 4 citraat buffer : CH^CN eluent.

Een materiaal (gewoonlijk 19 - 24% van het totaal) werd bij 6,1 - 6,8 minuten geëlueerd terwijl een ander materiaal (gewoonlijk 26 - 27%) bij 11.9 minuten werd geëlueerd. De . detectie vond plaats door UV bij 254 nm. Zoals zal worden aangetoond was het 6,1 - 6,8 minuten-materiaal 20 3’-deamino-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine en het 11.9 minuten-materiaal 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)daunorubi-cine.

B. Op een grotere schaal werd 5,41 g van het vaste nevenprodukt opgelost in 500 ml van 9:1 CHCl^-CH^OH. Deze oplossing werd 25 gewassen met 0,01 N HCl (3 x 100 ml), (1 x 100 ml) en verdund NaHCO^ (1 x 100 ml). De organische fase werd gedroogd, drooggedampt en het residu onder vacuum bij 0,1 mm en kamertemperatuur gedroogd waarbij 5,10 g van een glasachtig residu werd verkregen. De waterfase werd tevens gewonnen.

30 C. Het glasachtige residu van deel B, 5,09 g, werd op gelost in 50 ml 4 : 1 CH2C12-CH30H. De oplossing werd geroerd terwijl 30 ml CH^CN druppelsgewijze werd toegevoegd. De ontstane troebele oplossing werd drooggedampt en leverde een halfvast residu dat werd aangewreven met 200 ml CH^CN in het donker. Het onoplosbare vaste materiaal 35 werd verzameld en een tweede aangewreven met 100 ml CH^CN. De vloeibare fasen verkregen uit de twee aanwrijfbehandelingen bevatten het ge- 8302586 14 wenste produkt. Zij werden ingedampt en gaven 2,23 g van een halfvast residu.

D. Het halfvaste residu van deel C werd opgelost in 5 ml CH^Cl^ en aangebracht op een 3,1 cm buitendiameter x 59 cm kolom 5 van C^Cl-gewassen 200 - 325 mesh (Mallinckrodt kiezelzuur AR CC-7 silica-gel. De kolom werd geëlueerd met CH2C12 (500 ml) en daarna CH^Cl^-CH^OH (99 : 1, 1500 ml; 98 : 2, 100 ml; 97.: 3, 1500 ml; 90 : 10, 500 ml).

Na verzameling (10 ml fracties, gevolgd door TLC) van 2550 ml begin-eluaat, werd een 190 ml fractie verdampt en leverde 0,48 g produkt. Vol-10 gens vergelijkende hoge capaciteit vloeistofchromatografie en dunne-laag-chromatografie werd vastgesteld dat de primaire component identiek was aan een materiaal dat later 3'-deamino-3'- (3"-cyano-4"-morfolinyl) -daunorubicine bleek te zijn.

E. Een 0,35 g monster van het materiaal van deel D werd 15 verder eerst in het donker gezuiverd aan vijf 2 mm x 20 x 20 cm silica- gel-platen met twee CH^Clj-CH^OH 29 : 1 ontwikkelingen. Een centrale band die 65% van het aangebrachte gewicht vein het monster bevatte werd uitgesneden, geëlueerd, gefiltreerd en drooggedampt.

F. Het produkt van deel E tezamen met andere equivalent 20 gezuiverde materialen teruggewonnen uit de chromatografische randzones, (0,18 g) werd aan een eindzuivering onderworpen in een 1,1 cm buitendiameter x 27 cm kolom van 200 - 400 mesh silicagel. De kolom werd geëlueerd met CH2Cl2-EtOAc (80 : 20, 30 ml; 60 : 40, 30 ml; 40 : 60, 30 ml; 20 : 80, 30 ml) en daarna EtOAc (175 ml). Na verzameling (2 ml fracties gevolgd 25 door TLC) van 162 ml begin-eluaat, werd een. 88 ml-fractie verzameld en ingedampt die 0,15 g produkt opleverde.

De elementairanalyse van dit zuivere materiaal werd aangetoond dat de structuur 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)daunorubicine was zoals ook geschiedde door 360 MHz NMR, UV, IR en massa-30 spectroscopie.

De aanwezigheid van dit produkt als een diastereomeer-mengsel werd aangetoond door HPLC en 360 MHz NMR-analyse. HPLC-analyse over een Waters Radial-Pak C-18 kolom met 0,05M pH 4 citraat-buffer-CH^CN (60 : 40) met 2 ml/minuut leverde twee dicht bij elkaar liggende 35 pieken (bij 9,6 minuten en 10,2 minuten) in de verhouding 53 : 44. Het 360 MHz NMR-spectrum van dit materiaal vertoonde twee resonanties voor de 8302586 15 6-ΟΗ, Π-ΟΗ, 1-H, 2-H, 3-H, 1*-H, 7-H, 9-OH, 10A-H, 14-¾ en 6-^-protonen.

360 MHz NMR CDCl3 / 13,99, 13,98 (2s, 6-OH), 13,25, 13,24 (2s, 11—QH), 8,02, 8,00 (2d, 1-H), 7,79, 7,77 (2t, 2-H), 7,40, 7,38 5 (2d, 3-H), 5,59, 5,56 (2d, l'-H), 5,29, 5,26 (2bs, 7-H), 4,47*, 4,34* (2s, 9-OH), 4,08 (s, OCH3), 3,97 - 4,07 (m, 2" B-H, 5*-H), 3,92 (t, J= 12 Hz 3"-H), 3,74 (m, 2"A-H), 6"B-H), 3,68 (bs, 4'H), 3,58 (t, 12Hz, 6"A-H), 3,20 (d, J*19 Hz, 10B-H), 2,91, 2,90 (2d, J=19 Hz, 10A-H) 2,75 - 2,95 (m, 3'-H), 2,68 (m, 5--¾), 2,43, 2,42 (2s, 14-¾), 2,35: 10 (m, 8B-H), 2,13 (m, 8A-H), 1,70 - 2,0 (m, 2'-H2), 1,86* (s, 4'-OH, H20), 1,37, 1,36 (2d, J= 6,4 Hz), 6,-¾) uitwisselbaar met D20 Massaspectrum: [als de trimethylsilyl (IMS) derivatenJ, m/e 910 [M(TMS)43, 895 [M(TMS)4~ 15 Me], 883 [M(TMS)4-HCN], 838 [M(TMS)33, 823 [M(IMS)3«Me], 811 [M(TMS)3-HCN], MS bij 70 ev. vertoonde een basispiek (HCN) bij m/e 27.

Voorbeeld II

Isolering van 3^deamino-S*-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubl-cine 20

In voorbeeld I, deel D, werd een mengsel van 3*-deamino- 3'-(3,,-cyano-4,,-morfolinyl)daunorubicine en 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"- morfolinyl)-13-dihydro-daunorübicine gechromatografeerd en een reeks van fracties genomen. Na verzameling van 3460 ml eluent werd-een 430 ml fractie die 12,5% van het aanvankelijk toegevoerde materiaal als in wezen 25 een enkele verbinding bevatte verzameld en ingedampt. Door HPLC werd vastgesteld dat de verbinding van deze fractie identiek was aan een materiaal dat eerder was gekenmerkt door NMR en massaspectroscopie als 3’-deamino-3,-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine te zijn.

Dit materiaal werd in wezen volgens de methoden als aangegeven in voor-^ beeld I, .delen E en F gezuiverd en gaf het nagenoeg zuivere 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morf olinyl)-13-dihydrodaunorubicine.

Voorbeeld III

Isolering van 3'-deamino-3,-(4w-morfolinyl)daunorubicine en 3'-de^mino- 31-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine 35 In voorbeeld I, delen A en B, werd de 0,0IN HCl-fase die 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)daunorubicine en 31-deamino-3'-(4"-mor- 8302586 16

folinyl)-13-dihydrodaunorubicine bevatte geïsoleerd. Deze waterfase bevatte ongeveer 40% van het toegevoerde materiaal. Deze waterfase werd daarna opgewerkt onder toepassing van de methode als aangegeven in het reeds eerder genoemde J. Medicinal Chem., 25, waarbij 3'-deamino-3'-(4"-5 morfolinyl)daunorubicine en 3 *-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydro-daunorubicine als afzonderlijk geïsoleerde verbindingen werden verkregen. Voorbeeld IV

Bereiding en isolering van 3'-deamino-3'-(3 *'-cyano-4''-morf olinyl )doxo-rubicine en 3'-deamino-3'-(3l,-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubi-10 cine A. In een reactie analoog aan die beschreven in het J. Medicinal Chem., 25 artikel, werd aan een geroerde oplossing van 6,25 g (60,0 mmol) 1,4-anhydro-erythritol, zie formule 10 van het formuleblad, in 75 ml ^0 gekoeld in een waterbad tot 15 - 20°C 6,42 g (30,0 mmol) 15 natrium-metaperjodaat toegevoegd. De verkregen heldere oplossing werd bij kamertemperatuur gedurende 17 uur geroerd. De oplossings-pH werd ingesteld van 4,0 op 7,3 met NaHCO^ en daarna werd de oplossing verdund met 75 ml CH^CN. Er vormde zich een neerslag. Het mengsel werd geroerd en 0,126 g (2,0 mmol) NaBH^CN in 5 ml 1 : 1 (vol) CH^CN-H^O werd toe-20 gevoegd. Aan dit mengsel werd daarna 1,16 g (2,0 mmol) doxorubicine-hydrochloride in 30 ml 1 : 1 CH^CN-^O toegevoegd. Na 10 minuten werd het reaetiemengsel verdund met 50 ml verdund NaHCO^ en driemaal geëxtraheerd met 50 ml porties CHCl^· Dit ruwe extract bevatte 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)doxorubicine, 31-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxo-25 rubicine, 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxorubicine en 3'-de-amino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine. De gecombineerde extracten werden geëxtraheerd met 0,1 N azijnzuur (5 x 25 ml) en daarna met HgO en gewassen met verdund Na^HCO^ en verzadigde waterige NaCl.

De zure waterfase werd achtergehouden. De chloroform-fase werd gedroogd 30 op NaSO^, gefiltreerd over Celite diatomeeënaarde en geconcentreerd waarbij een residu werd verkregen. Dit residu werd opgelost in 25 ml CHCl^ en het oplosmiddel onder vacuum bij kamertemperatuur opnieuw verdampt. Dit leverde 0,518 g (40%) van een donker rood geschuimd glas.

B. Een monster van het geschuimde glas van deel A werd 35 opgelost in CH^CN en geïnjecteerd in een Waters Radial-Pak C-18 hoge

capaciteits-vloeistof-chromatografiekolom geëlueerd met pH 4,0 0,05 M

8302586 17 citraat-buffer- CH^CN 55 : 45 bij 2 ml/minuut. De elutie van de verbindingen werd gedetecteerd bij 254 xun. Na 2,3 minuten verkreeg men een materiaal geïdentificeerd als 3'-deamino-3(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine in een opbrengst van 13% (gebaseerd op het injectie-5 mengsel) en na 3,8 minuten verkreeg men 3'-deamino-3,-(3"-cyano-4"- morfolinyl)doxorubicine in een opbrengst van 69%. Andere op soortgelijke wijze samengevoegde produkten werden verkregen en gescheiden door HPLC.

C. De isolering van 3 '-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfoli- . ) nyl)doxorubicine en 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl}-13-dihydroxo-10 rubicine werd aansluitend als volgt herhaald:

Een 0,424 g monster van het geschuimde glas van deel A werd opgelost in 1,5 ml CH2C12 en aangebracht in een 1,5 x 35,5 cm kolom van C^C^-gewassen ¢00 - 400 mesh) Bio-Sil A silicagel. De kolom werd geëlueerd met CE^Cl^ (50 ml) en daarna net CH2Cl2-CH3OH (99 : 1, 15 150 ml; 98 : 2, 150 ml; 97 ï 3, 300 ml; 95 : 5, 100 ml en 90 : 10, 300 ml). Na verzameling van 445 ml van begin-eluaat werd 80 ml fractie ingedampt en leverde 0,217 g produkt. Dit materiaal werd gecombineerd met 0,039 g gezuiverd produkt uit een eerdere bereiding en het mengsel werd opgelost in 2 ml CH2C12, verdund met 10 ml CH^OH en drooggedampt.

20 Aanwrijving van dit residu met 5 ml CH^OH leverde 0,218 g 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxorubicine.

HPLC- en 400 MHz NMR-analyse toonde aan dat dit produkt een diastereomeer mengsel was. HPLC analyse over een Waters Radial-Pak C-18-kolom met 0,05 M pH 4 citraatbuffer-CH^CN (65 : 35) bij 2ml/ 25 minuut toonde twee dicht bij elkaar liggende pieken (bij 14,4 minuten en 15,7 minuten) in de verhouding 58 : 39. Het 400 MHz-spectrum van dit materiaal vertoonde twee resonanties voor de 1-H, 2-H, 3-H, l'-H, 7-H, 14-H2, 9-OH, OCH^, 10A-H en β'-Ξ^ protonen.

400 MHz NMR CDCLj S 14,02 (s, 6-OH), 13,26 (s, 11-ΟΞ), 30 8,05, 8,04 (2d, 1-H), 7,80, 7,79 (2t, 2-H), 7,41, 7,40 (2d, 3-H), 5,61, 5,57 (2d, l'-H), 5,34, 5,30 (2m, 7-H), 4,79, 4,78 (2s, 14-H2), 4,54, 4,42 (2s, 9-OH), 4,11, 4,10 (2s, 0CH3), 4,05 (m, 5'-H), 3,97 (m, 2"B-H, 6"B-H), 3,71 (m, 4'-H, 6"A-H), 3,58 (t, 2”A-H), 3,30 (d, J = 19 Hz, 10B-H), 3,07, 3,06 (2d, 10A-H), 3,03 (m, 3*-H), 2,69 (m, 5"-H2), 2,38 (m, 8B-H), 35 2,22 (m, 8A-H), 1,84 (m, 2’-^), 1,61 (s, HjO), 1,40, 1,39 (2d, J = 6,5 Hz, 6*-H3).

8302586 18 UV-Vis (CH3OH) max 234 nm ( £ 40.100), 252 (27.700) 289 (9.420), 478 (13.000), 495 (12.900), 530 (7.190). Massaspectrum [als het trimethylsilyl (TMS) derivaat], m/e 899 M (TMS)4-HCN.

C Η N

5 Ber. voor ^2^34^2^12*2H20 56,97 5,68 4,15 gevonden 57,07 5,37 4,17

Verdere elutie van de bovengenoemde kolom gaf 0,041 g 31-deamino-3'-(3”-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine. UV-Vis (CH3OH) max 234 nm ( & 37.400), 252 (28.000), 289 (9.390), 475 (12.700), 10 496 (12.800), 530 (7.410). Massaspectrum [als het trimethylsilyl(TMS)

derivaat], m/e 985 M(TMS)-CH,, 973 M(TMS)_-HCN

O w O r

C Η H

Ber. voor C32H36N2012.1-1/2H20 57,57 5,89 4,20 gevonden 57,35 5,94 3,82

15 Voorbeeld V

Isolering van 3l-deamino-3l-(4"-morfolinyl)doxorubicine en 3 *-deamine-3'-(411 -morf olinyl) -13-dihydrodoxorubicine A. De zure fase verkregen in deel A van voorbeeld XV werd basisch gemaakt met NaHC03 en geëxtraheerd met CHClj. De CHC^-fase 20 werd gewassen met verzadigd NaCl, gedroogd op Na2S04, gefiltreerd door Celite, geconcentreerd en gedroogd en gaf 0,828 g van een rood sghuim dat volgens HPLC, 90 MHz NMR, 300 MHz NMR, UV-Vis-spectroscopie en massa-spectroscopie twee primaire componenten, 3*-deamino-3(4lt-morfollnyl)-doxorubicine en 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine 25 bleek te bevatten.

B. Een verzameling van 0,98 g van het geschuimde glas zoals bereid in deel A werd klaargemaakt. Dit materiaal werd opgelost in 3 ml CH2C12 en gechromatografeerd over een 2,2 x 33 cm kolom van silicagel. De kolom werd geëlueerd met CH2C12 (50 ml) en daarna CH2C12- 30 CH30H (99 : 1, 300 ml; 98 : 2, 300 ml; 97 : 3, 900 ml en 90 : 10, 700 ml). Nadat eerst 1170 ml eluent was verzameld werd een 490 ml fractie geïsoleerd en ingedampt tot een residu. Dit residu bevatte 45% van het toegevoerde monster en bleek volgens HPLC in wezen zuiver (99 + %) 3'-de- .....

amino-31-(4"-morfolinyl)doxorubicine te zijn.

35 90 MHz NMR CDC13 ê 13,88 (s, 6-OH), 13,07 (s, 11-OH), 7,90 (d, J = 8 Hz, 1—Ξ), 7,72 (t, J - 8 Hz, 2-H), 7,38 (d, J = 8 Hz, 3-H), 5,51 (bs, Γ-Ξ), 5,20 (bs, 7-H) , 4,75 (s, 14-H2), 4,68 (s, 9-OH), 4,07 (s, 0CH3), 3,98 (m, 5'-H), 3,67 (m, 4'-H, 2"-H2, 6"-H2), 3,09 (d, 8302586 19 J = 19 Hz, 10B-H), 2,83 (d, J - 19 Hz, 10A-H), 2,80 - 3,20 (m, 3'-H), 2,50 - 3,00 (bs, 4‘-0H, 14-OH), 1,95 - 2,65 (m, 8-H2, 3"-H2, 5"-H2), 1,80 (m, 2'-H2), 1,38 (d, J = 6,5 Hz, 6'-H^). Massaspectrum [als de trime-thylsilyl (TMS) derivaten], m/e 973 MtTMS)^, 901 M(IMS)^.

5 De vrije base werd gesuspendeerd in H20 en aange zuurd tot pH 4,4 met 0,1N HCl. De verkregen oplossing werd gevriesdroogd en het produkt opgelost in CH^OH en neergeslagen met 10 volume ether waarbij het hydrochloride werd verkregen.

Berekend voor C31H35N012-HC1.2H20 C 54,27 H 5,88, Cl” 5,17, N-2,04 10 gevonden C 54,08 H 5,35, Cl 4,78, N 2,00 UV-Vis (CEjOH) max 234 nm ( £ 39.000), 252 (26.300), 290 (8.990), 480 (12.600), 495 (12.500), 530 (6.700).

Een fractie van 190 ml werd af genomen gevolgd door een 160 ml-fractie. Deze laatste fractie werd ingedampt en bleek 19,5% van 15 het toegevoerde materiaal in de vorm van 97% zuiver 3’-deamino-31-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine te bevatten.

300 MHz NMR CDC13 £ 13,98, 13,96 (2s, 6-OH), 13,34, 13,32 (2s, 11-OH), 8,03 (d, 1-H), 7,79 (t, 2-H), 7,40 (d, 3-H), 5,56 (bs, 1 *-H), 5,29 (bs, 7—H), 4,64, 4,59 (2s, 9-OH), 4,09 (s, OCH^, 4,03 (m, 20 51 -H), 3,82 - 4,05 (m, 4*-H, 13-H), 3,68 (m, 2**-H2, 6"-H2, 14B-H), 3,54 (bs, 14A-H), 3,30 (m, 10B-H), 2,98 (bs, OH), 2,87 (bs, OH), 2,77 (m, 10A-H, 3'-H), 2,30 - 2,70 (m, 8B-H, 3"-H2, 5"-H2), 1,99 (m, 8A-H), 1,78 (m, 2'-h2), 1,41 (d, 6'-H3). Massaspectrum [als het trimethylsilyl (TMS) derivaat], m/e 975 m(0MS)3.

25 Voorbeeld VI

Bereiding van 31-deamino-3 *-(4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine A. Aan een oplossing van 0,396 g 3'-deamino-3'- (4"-mor-folinyl)doxorubicine bereid als aangegeven in voorbeeld V in 5 ml droge pyridine werd 0,990 g p-anisyl-chloordifenylmethaan toegevoegd. Het meng-30 sel liet men bij kamertemperatuur in het donker gedurende ongeveer twee dagen reageren. De oplossing werd in ijswater gekoeld en 0,5 ml CH3QH toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2 uur geroerd en toegevoegd aan 50 ml verdund NaHC03 en geëxtraheerd met CH2C12. De extracten werden geconcentreerd en gaven een gomachtig residu dat werd opgelost in tolu-35 een, geconcentreerd, opgelost in CH2C12 en neergeslagen door langzame toevoeging van petroleumether van 35° - 60°. Dit neerslag werd gewonnen, weer opgelost in CHjClj en neergeslagen met 2 : 1 petroleumether : di- 8302586 20 ethylether en leverde 14-0-p-anisyldifenyl-methyl-3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)doxorubicine, (formule 3 van het formuleblad), als een amorfe vaste stof in een opbrengst van 94%. Dit materiaal werd door 90 MHz NMR in CDClg geïdentificeerd.

5 B. Een oplossing van 0,532 g 14-O-p-anisyldifeny1-methyl- 31 -deamino-31 - (411 -morfolinyl) doxorubicine in 10 ml CH2C12 werd toegevoegd aan 30 ml CH3OH verzadigd met ammoniak bij 0°C. Het mengsel werd bij 0®C gedurende een uur geroerd waarna men het gedurende 27 uur bij 3°C liet staan. Het oplosmiddel in het reactieprodukt werd afgedampt. Het 10 residu werd opgelost in 4 : 1 C^C^-CH^OH en geconcentreerd. Dit werd tweemaal herhaald en de vaste stof werd opgelost in CH2Cl2, gefiltreerd over Celite, geconcentreerd, opgelost in 1 : 2 C^C^-CH^OH en opnieuw geconcentreerd en gedroogd en leverde 0,52 g (97%) van een violet residu.

C. Het residu van deel B werd opgelost in 2 ml CH2C12 15 en aangebracht in een 1,5 x 40 cm silicagel-kolom en geëlueerd met CH2C12 (50 ml) en daarna CH2C12-CH30H (99 : 1, 150 ml; 98 : 2, 150 ml; 97 : 3, 500 ml; 95 : 5, 100 ml; 93 : 7, 100 ml; en 90 : 10, 200 ml).

Na 565 ml eluent werd een 335 ml-fractie afgescheiden, gefiltreerd en ingedampt die 59,9% van het aangebrachte monster als 20 enkelvoudig materiaal bevatte. Dit materiaal werd geïdentificeerd als 14-O-p-anisyldifeny Imethy1-3 *-deamino-3'-(4"-morfolinyl) -5-iminodoxo-rubicine door 90 MHz NMR.

D. Een monster van 0,341 g van het produkt van trap C werd opgelost in 20 ml 80%'s azijnzuur waarna de oplossing gedurende 7 25 uren in het donker werd geroerd. De oplossing werd daarna verdund met 50 ml water en driemaal met CHCl^ geëxtraheerd. De waterfase bevat _het gewenste produkt en werd in het donker gevriesdroogd waarbij 0,294 g vaste stof werd verkregen. De vaste stof werd opgelost in 0,1 N azijnzuur. Deze oplossing werd gewassen met CHCl^, basisch gemaakt met NaHCO^ en geëxtra-30 heerd met CHCl^. Het gewenste produkt ging over in de organische fase die werd gewassen, gedroogd, gefiltreerd en geconcentreerd tot een residu. Dit residu werd opgelost in CHCl^-CH^OH (1 : 10), geconcentreerd en gedroogd en gaf 0,228 g 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine.

De identiteit van het materiaal werd geverifieerd door 300 MHz NMR en 35 elementair-analyse.

8302586 21

Voorbeeld VII

Bereiding van zuuradditlezout

Het vrije base-produkt van voorbeeld VI werd gesuspendeerd in 20 ml water. Het mengsel werd geroerd en 3,2 ml 0,1 N HCl lang-5 zaam toegevoegd tot een pH van 4,5. De gesuspendeerde vaste stof loste geleidelijk op. De oplossing werd gevriesdroogd in het donker en gaf het zuuradditiezout 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine hydrochloride in een zuiverheid van 97 + % volgens HPLC-analyse.

C H Cl“ N

10 Ber. voor C^H^Ï^O^.HCl^H^ 54,35 6,03 5,17 4,09 gevonden 54,20 5,96 4,33 4,03

Voorbeeld VIII

Bereiding en isolering van 3'-deamino-3 '-^"-morfolinyl) -5-imino-13-dihydrodoxorubicine 15 A. Een oplossing van 0,186 g 3'-deamino-3'-(4"-morfoli- nyl)-13-dihydrodoxorubicine bereid als in voorbeeld V in 6 ml 1 : 1 O^Clj-CH^OH werd toegevoegd aan 20 ml CH^OH verzadigd met ammoniak bij 0eC.

Het mengsel werd gedurende een uur geroerd en daarna bij 3°C gedurende ongeveer 27 uur opgeslagen, geconcentreerd waarna het restprodukt werd 20 opgelost in CH^l^-CH^OH (4 : 1) en driemaal geconcentreerd om het ammoniak volledig te verwijderen. Het verkregen residu werd gezuiverd door preparatieve dunne-laag-chromatografie over 2 mm x 20 cm x 20 cm silicagel-platen onder toepassing van CHCl^-CH^OH 9 : 1 ontwikkeling.

Banden die in hoofdzaak zuiver 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-imino-13-25 dihydrodoxorubicine bevatten, werden geïsoleerd, geêlueerd en het eluent gedroogd waarbij 0,139 g van het vrije-base-produkt werd verkregen als geïdentificeerd door 300 MHz NMR.

B. De vrije base van deel A werd omgezet in het hydrochloride volgens de methode van voorbeeld VII. Volgens HPLC-analyse was 30 het hydrochloride voor 97 - 98% zuiver.

C H Cl" N

Ber. voor C^Hg^O^.HCl^jO 54,19 6,31 5,16 4,08 gevonden 54,17 5,95 4,88 3,87

Voorbeeld IX

35 Bereiding van 3'-deami no-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-5-iminodaunorubicine

Een oplossing van 0,031 g 3 *-deamino-3(311-cyano-4"- 8302586 22 morfolinyl)daunorubicine in 1,0 ml CE^C^ werd toegevoegd aan 5 ml ammoni-ak-verzadigd methanol bij 0eC. Het mengsel werd gedurende 30 minuten geroerd en daarna gedurende 45 uren bij 3°C opgeslagen. Het produkt van deze reactie werd drooggedampt en gaf een residu dat werd opgelost in 5 5 ml 19 : 1 CHCl^-CH^OH en geconcentreerd. Deze trap werd herhaald. Het residu werd opgelost in CHCl^-CH^OH en aangebracht op een 2 mm 20 cm x 20 cm silicagel-plaat en ontwikkeld onder toepassing van 9 : 1 CHCl^-CH-jOH. De hoofdband werd geëlueerd en geanalyseerd. Door massaspectros-copie werd vastgesteld dat de verbinding 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfo-10 linyl)-5-iminodaunorubicine was.

Voorbeeld X

De bereiding van voorbeeld VI werd herhaald onder toepassing van 31-deamino-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxorubicine bereid als in voorbeeld IV als toevoermateriaal in de plaats van 3'-deamino-31-15 (4"-morfolinyl)doxorubicine. De blokkering-aminering-deblokkering isola- tievolgorde van voorbeeld VI werd toegepast waarbij 3'-deamino-3'-(3"-cy-ano-4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine als eindprodukt wordt verkregen.

In meer bijzonderheden was deze bereiding als volgt: A. Aan een oplossing van 0,241 g 3'-deamino-3'-(3"-20 cyano-4”-morfolinyl)doxorubicine bereid als aangegeven in voorbeeld IV in 4 ml droge pyridine werd 0,587 g p-anisylchloordifenylmethaan toegevoegd. De oplossing werd bij kamertemperatuur in het donker gedurende 24 uren geroerd. Het reactiemengsel werd gekoeld, verdund met 0,5 ml CH^OH, bij kamertemperatuur gedurende 3 uur geroerd en daarna toegevoegd aan 25 50 ml verdund NaHCO^ en geëxtraheerd met CH2C12. De extracten werden geconcentreerd, het residu werd opgelost in 3 ml CH2C12 en neergeslagen door langzame toevoeging van 40 ml diëthylether waarbij 0,333 g (97%) 14-0-p-anisyldifenylmethyl-3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-doxorubicine werd verkregen.

30 90 MHz NMR CDC13 $ 13,84 (s, 6-OH), 12,99 (s, 11-OH), 7,82 (d, 1-H) , 6,70 - 7,75 (m, 2-H, 3-H, trityl-aryl), 5,42 (bs, l'-H), 5,08 (bs, 7-H), 4,45 (bs, 2, 14-H2), 4,19 (s, 9-OH), 4,00 (s, OCH3), 3,79 (s, OCH3), 3,30 - 4,15 (m, 4'-H, 5'-H, 2”-H2, 3"-H, 6"-H2), 1,60 - 3,10 (m, 2'-H2, 8-H2, 5"-H2, 10-H2, 3'-H), 1,13 (d, 6'-H3).

35 B. Een oplossing van 0,369 g 14-O-p-anisyldifenylme- thyl-3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxorubicine in 8 ml CH2C12 werd toegevoegd aan 25 ml CH3OH verzadigd met ammoniak bij =°C. Het meng- 8302586 • Zi l 23 sel werd gedurende een uur bij 0°C geroerd, waarna men het gedurende 26 uren bij 3°C liet staan. Het reactiemengsel werd ingedampt, voor het volledig verwijderen van ammoniak waarna 0,376 g van een violet residu werd verkregen.

5 C. Het residu van deel B in 1,5 ml CH2C12 werd aange bracht op een 1,5 x 28 cm (200 - 400 mesh), silicagel-kolom en geëlueerd met CH2C12 (50 ml) en daarna C^C^-CH^OH (99 : 1, 200 ml; 98 : 2, 300 ml; 97 : 3, 100 ml; 95 : 5, 100 ml; en 90 : 10, 200 ml). Na verzameling van 360 ml van het begin-eluaat werd een 125 ml-fractie ingedampt en 10 leverde 0,203 g 14-0-p-anisyldifenylmethyl-3,-deamino-3,-(3”-cyano-4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine.

D. Een monster van 0,158 g van het residu van deel C werd gekoeld tot 0eC en opgelost in 8 ml ijskoud 50%'s trifluorazijnzuur.

De oplossing werd bij 0°C gedurende 2 minuten geroerd en daarna geschon-15 ken in 100 ml ijswater. Het waterige mengsel werd geëxtraheerd met CHCl^ (4 x 10 ml) en de gecombineerde extracten werden gewassen met verdund NaHCO^ en ^0, gedroogd op Na2S04, gefiltreerd door Celite en ingedampt.

Het residu werd opgelost in 3 ml CHCl^-CH^OH (4 : 1); de oplossing werd geroerd en 25 ml ether werd druppelsgewijze toegevoegd. Het verkregen 20 neerslag werd verzameld en leverde 0,093 g 3 '-deamino-S- (3"-cyano-4tl-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine.

Door HPLC en 300 MHz NMR-analyse werd aangetoond dat dit materiaal een diastereomeer mengsel was. HPLC-analyse over een Waters Radial-Pak C-18 kolom werd 0,05M pH 4 citraatbuffer-CH^OH (40 : 60) 25 toonde pieken aan bij 18,4 minuut en 25,0 minuut in de verhouding 69 : 31. Het 300 MHz-spectrum van dit produkt vertoonde twee resonanties voor de 1—Η, 2-H, 3-H, l'-H, 7-H, 14-H2, 9-OH, 0CH3, 10A-H, en 6'-H3 protonen.

300 MHz NMR CDC13 c? 15,61 (s, 11-OH), 13,74 (d, 6-OH), 9,27 (d, NH), 8,21, 8,19 (2d, 1-Ξ), 7,73, 7,72 (2t, 2-H), 7,33; 7,32 30 (2d, 3-H), 5,77, 5,72 (2d, l'-H), 5,41, 5,38 (2m, 7-H), 4,79, 4,77 (2s, 14-H2), 4,72, 4,66 (2s, 9-OH), 4,15, 4,14 (2s, 0CH3), 4,04 (M, 5'-H), 3,97 (m, 3n-H, 2"B-H), 3,75 (m, 6"-H2, 4*-H), 3,59 (m, 2"A-H), 3,23 (d, 10B-H), 3,03 (m, 10A-H, 3'-H), 2,72 (m, 5"-H2), 2,33 (m, 8B-H), 2,14 (m, 8A-H), 1,85 (m, 2*-H2), 1,38, 1,37 (2d, 6'-^).

35 UV-Vis (CH30H) max 221 nm ( £ 31.000),252 (32.900), 307 (7.110), 520 sh (9.110), 551 (17.400), 592 (20.700). DCI-MS m/e 8302586 24 638 (Μ + Η), 611 (Μ + H-HCN) ' Ber. voor α32Η3ςΝ3°ιΐ·Η20 C Η 5,69, Ν 6,41 gevonden C 58,79, Η 5,47, Ν 6,30

Voorbeeld XI

5 De bereiding van voorbeeld VIII werd viermaal herhaald waarbij steeds een equivalente molaire hoeveelheid van een ander uitgangsmateriaal in de plaats van 3,-deamino-3,-(4"-morfolinyl)-13-dihydro-. doxorubicine werd toegepast. In de eerste herhaling wordt 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine als toevoermateriaal toe- 1.0 gepast en geeft 31 -deamino-3'- (3"-cyano-4"-morfolinyl) -5-imino-l3-dihy-drodoxorubicine als eindprodukt. In de tweede herhaling wordt 3'-de-a.mino-31 - (4"-morfolinyl)daunorubicine als toevoermateriaal toegepast en geeft 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)'-5-iminodaunorübicine als eindprodukt. In de derde herhaling wordt 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydro-15 daunorubicine als toevoermateriaal toegepast en geeft 31-deamino-31-(4"-morfolinyl)-5-imino-13-dihydrodaunorubicine als eindprodukt. In de vierde herhaling wordt 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydro-daunorubicine als toevoermateriaal toegepast en geeft 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-5-imino-13-dihydrodaunorubicine als eindprodukt.

20 Voorbeeld XII

De bereiding van voorbeelden I - XI worden herhaald waarbij in plaats van doxorubicine of daunorubicine als uitgangsmateriaal de reeks van doxorubicine- en daunorubicine-derivaten, als eerder beschreven onder derivaten en analogen werd toegepast. Deze herha-r 25 lingen leiden tot de corresponderende derivaten en analogen van de verbindingen van de uitvinding.

De verbindingen van deze uitvinding zijn bruikbaar als antitumor-middelen voor warmbloedigen. Deze activiteit wordt aangetoond door in vivo en in vitro onderzoekingen. In een in vivo test, 30 uitgevoerd volgens het schema beschreven in Cancer Chemotherapy Reports, National Cancer Institute, 3, nr. 2, deel 3, september 1972, werden gezonde muizen gelnoculeerd i.p. met lymfocyt leucemie P-388 ascitische vloeistof. De geinoculeerde muizen werden daarna op de dagen 5, 9 en 13 van de volgende periode behandeld met verschillende hoeveelheden van de 35 verbindingen van de uitvinding. Ter vergelijking werden andere muizen niet behandeld of extra muizen behandeld met daunorubicine of doxorubicine; 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)daunorubicine of 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubicine volgens hetAmerikaanse octrooischrift 8302586 25 4.301.277 of 3'-deamino-3'(4-methoxy-l-piperidinyl)daunorubicine of het 13-dihydro-ecruivalent daarvan als beschreven in het Amerikaanse octrooi-schrift 4.314.054.

De gemiddelde overlevingstijd voor de verschillende 5 behandelde muizen werd bepaald en vergeleken met die van de muizen gein-oculeerd met de leucemie-ascitische vloeistof maar die niet met de test-verbindingen waren behandeld. In de nu volgende tabel A' worden de verzamelde gegevens aangegeven. De gegevens worden opgegeven als % T/C waarden die de overlevingstijd van de behandelde muizen gedeeld door de over-10 levingstijd van de controles vermenigvuldigd met 100 voorstellen.

Tevens worden in tabel A' de doseringsniveaus van de verschillende verbindingen aangegeven waarvan werd waargenomen dat deze de beste overle-vingstij dverbeteringen gaven.

8302586 26 TABEL· A'

Activiteit vs leucemie Leucemie L-1210 P-388 in muizen_ cellen_ overlevings- optimale inhibiëring van tijd dosis synthese ED5q, _ _ (q4d 5,9,13) ,uM_ •J ^ /

Verbinding_ NSC Nr. % T/C mg/kg DNA rna 3'-deamino-3(3"-cyano-4"-morfolinyl) daunorubicine 332.304 197 0,4 0,012 0,002 10 3'-deamino-3(3"- cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodaunorubi- · cine 332.305 143 0,1 0,019 0,002 3'-deamino-3'-(3"-15 cyano-4"-morfolinyl)- doxorubicine 357.704 187 0,075 0,003 0,0005 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)- 13-dihydrodoxorubicine 360.291 150 0,2 0,021 0,0030 20 3'-deamino-3'-(4"- morfolinyl)-13-di-hydro-5-iminodoxo- rubicine 355.465 161 50 >100 24

Ter vergelijking: 25 daunorubicine 82.151 130 8 0,66 0,33 doxorubicine 123.127 160 8 1,5 0,58 i £ NSC Nr. = nummer van National Service Center of US National Cancer Institute Registratie.

8302585 27 T Α Β Ε L &' (Vervolg)

Activiteit vs leucemie Leucemie L-1210 P-388 in muizen cellen overlevings- optimale inhibiëring van tijd dosis synthese ED-n,

5 _ (g4d 5,9,13) ,UM

Verbinding_ NSC Nr. % T/C mg/kg DNA RNA

3'-deamino-31-(4"-mor- folinyl)daunorubicine 327.451 166 0,2 0,76 0,10 3'-deamino-31-(4”-mor-10 folinyl)-13-dihydro- daunorubicine 327.450 132 0,2 2,2 0,67 3'-deamino-3'-(4M-methoxy-1"-piperidi- nyl)-daunorübicine 334.353 199 6,25 0,63 0,12 15 3'-deamino-31-(4-me- thoxy-l-piperidinyl)-13-dihydrodauno- rubicine 334.354 199 12,5 0,58 0,08

Deze resultaten tonen aan dat de verbindingen van deze 20 uitvinding een goede tot superieure in vivo antitumor-activiteit bij lage optimale doseringen geven. Verbinding NSC 357704 toonde een optimaal dosisniveau van ongeveer 1/150ste van dat vereist voor de hoofdverbinding. Andere materialen van de uitvinding tonen een optimaal dosisniveau dat veel lager is dan voor daunorubicine en doxorubicine. Dit is veelbe-25 lovend voor het voorzien in een actief antitumor-middel met een aanzienlijk verlaagde cardiotoxiciteit.

In vitro-proeven van 3' -deamino-31 - (311 -cyano-4" -mor-folinyl)daunorubicine en 31-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-di-hydrodaunorubicine toonden tevens de verhoogde activiteit voor deze 30 klasse van verbindingen aan. Bij ondersoek van deze materialen als inhibitoren van DNA en RNA synthese in L 1210 cellen volgens de methode beschreven in G. Tong, W.W. Lee, D.R. Black en D.W. Henry, J. Medicinal Chem., 19, 395 (1976) waren zij actief in doseringen die wel 600 keer lager waren dan de doseringen van daunorubicine, doxorubicine of de 35 eerdere analogen. Waargenomen werd dat zij tevens veel meer inhibiërende invloed ten opzichte van de RNA-synthese hadden dan ten opzichte van de DNA-synthse (ED 50 verhouding DNA/RNA =10 tot 11). Er is door S.T.

Crooke et al, Mol. Pharmacol., 14, 290 (1978) gesuggereerd dat een derge- 8302586 28 lijke verhouding een indicatie is dat klasse II anthracyclinen verbeterde therapeutische eigenschappen bezitten. Deze gegevens worden aangegeven in tabel A'..

De gegevens in tabel A' die een verhoogde antitumor-5 werking voor de morfolino-structuur en een verdere toename in de doelmatigheid voor de cyanomorfolino-structuur weergeven zijn typerend voor de activiteit van deze klasse van verbindingen.

Er werden extra proeven uitgevoerd om de biologische activiteit van verbindingen van deze uitvinding te verifiëren. Dit waren 10 in vivo-proeven met muizen tegen P-388 en L1210 leucemie en B-16 Melanoma die in wezen werden uitgevoerd volgens de methode van de bovengenoemde Cancer Chemotherapy Reports, 1972. Verschillende dosis-schema1s en I.P., I.V. 'en orale toedieningsroutes werden onderzocht. Deze resultaten worden in tabel B aangegeven.

8302586 29 in —» Γ» Φ M O' O (Ö 3 s ί a g ~J_ $ m r» p* r» π r~~ r~~ <d c— N W D>N - · -H ·

»H »-l > T-H

O O Λ O

Λ λ η η Λ η -ς< tntrj --» * * fcj * ο CM* «Λ 'ί ^ ® <ί m ' Ο «-* . Ή .

_ OJ Ow * · · Η · θί η ^ γ- £ g g 0 g * η £2 ω 0 °β 0 ΐ ^ 2 68^8

£ « «5 g S

_ ιο ,, +> -Ρ > +> υ ® φ ® >· * £ Λ r» Λ 64 “2 .

Γ3 H i—I Η H

2 OUÜÜ « Tj oooo ft * 0 0 ü ü j 0 ίη ίη S ®ü ® ®

M _ w CM» CN —I iH -Η —I

H 3 m *0‘ - N « « ^ o m o — o www

a ^ cn X

jj p* m ui < o cn m -t 2 ® n -< 0

Jj c®

m -WC

® o -H

o -H 0 0 η ·0 0-| 2 3 -Η Λ § Λ Λ Λ H ü 3

jj Λ ^ Λ<*^ Λ on -f 0 -HM

3 gx s - £ ££ £ I f8 e i5?» mm p*w[^m r* ό* σι «J M o § i u cn vo p* w m in co oi —< cm o nH <H m w CM CO CM CM -I S5nu “ o 3 CN S *"* A Λ m ^ OOfl | Ό * - Si C^fl fi Λ

* Ή -H 3 —I -I

Jifl H ΒΌ •o i 0—11 •Η m x i m ^ Η 0 ^

0 ! Ό I I

ζΠ «««k o*··* Λ m ^ Η Η H i-l 2 Φ >1 >i >( >i

i5s: — >CCdC

Λ η H NT —I —I -H —i

2 w HrlHHH

in Φ 0 0 0 0 2 -g rj O ϋΉΉΉΐΗ

mum -< Μ P P U

^ M 00 I 0 0 0 0 S B S S C I I I I Φ : ί : · O' ^ ^ •5 I I I I •o---- C m m m m •w i i i i Οι A 0 0 0 0

OiO -Γ P C 3 C C

o. -«O· . Γβε1| g* m 5* w <n -S' 2 ««II® X O* » * » όόόόό

Ό · m ft in » ooQi>ioin*,daei 0* Cl I IJ

csm cm —i * σι co-w—(»»σιιο*Η*ιο—i 2 —iZ -1 ι-h i m m m i m in -j ,¾ m m m m n J «. w CU*» wCQ* CQ* Φ 5-iU *-i Ό mmOO -1 fl A H ^ ^222

Gi U) Qj sf irt Qi 0i —1 c^l ^3* > g -2]¾ 0,01 ·Η|Ό Ό O' O' O' -HIO 01 ·Η|Ό K wwww 8302586 29a ö>

X

N

Ë o È?

dP

O W Η -H

o ra > o Μ Ό 0) > ω ^ Λ Λ Λ ιβ in in in in ininm Η η non o cm n n ,-h o o1o 1 ooo CQ«p CN %> O 1 O ·1 1 1

£v 001^0 « OOO

0 O -00-- co ^ w w n cm cm oo co t" σ> 1-t in -h t-ι id rr cm

•Η ι-H A ι-Ι ΙΊ H H

Η Λ A /\ Λ 4J Ü < a) M-)

Eh ΜΗ Ο) !m in m m m m —1 m m in

O CM CM 10 CM Ο 1 10 10 CM

O 1-1 O 1-1 - O O O 1-1 ο -oo oo rr ο oo ; 1 p- o <» 1 1. 1-1 CO ^ ·ιί

•H r- — Ο O OCNinO OO

.μ m — — —- m »h — —- — c η ιο ό1 vo cm -π a o coo

10 1-HlOlO 10 'ID O CM

CM o »-<

3 Λ AA

ΰ s ΓΟ ο-1 p—%

CN LO

t1·1 w’ 1 rn cn cn σ> ^ LO t-ί in y\ o

Ο ' iH

3302586 in m m n in m m λ o cm o io o o cm cm - o — o - o » ο ο o 10 — O—O—'— · «0· CM CM — M1 in o ίο in ι-t co m cm r- — •>0< 1-1 ltf< rt CM H Cl in iH 1-4 o " A /\ Ν 30

De verbindingen van deze uitvinding met inbegrip van de zouten daarvan kunnen volgens elke beschikbare route worden toegediend, met inbegrip van de orale en parenterale (intraveneus, intraperitoneaal, subcutaan en intramusculair) toediening. Parenterale toediening, in het 5 bijzonder de intraveneuze toediening, is historisch gezien de voorkeursmethode. Het doseringsvoorschrift en de toegediende hoeveelheid zijn voldoende om de leucemie of een ander type kanker, waartegen de verbindingen effectief zijn te verlichten. Bij de behandeling van lagere proefdieren bleek bijvoorbeeld een dosering van een verbinding volgens de 10 onderhavige uitvinding in het gebied van ongeveer 0,0010 mg/kg tot ongeveer 25 mg/kg per dag voldoende te zijn voor een verlichting van leucemie. De bovenste dosisgrens wordt vastgelegd door toxische neveneffecten en kan door proefnemingen aan het te behandelen dier worden vastgesteld. In het algemeen zal de dosering voor verbindingen van deze 15 uitvinding lager zijn dan (bijvoorbeeld 1/20 tot 1/200 maal) die vereist voor de hoofdverbindingen. Doseringsvoorschriften van een dosis op elke 2 tot 7 dagen zijn effectief terwijl ook kortere intervallen tussen de doseringen kunnen worden toegepast, bijvoorbeeld een dag of minder.

Voor het vergemakkelijken van de toediening kunnen de 20 verbindingen van de uitvinding met ingebrip van de zouten daarvan worden aangeboden in farmaceutische preparaatvormen, in het bijzonder als een-heidsdoseringsvorm. Hoewel de verbindingen op zichzelf kunnen worden toegediend, is het meer gebruikelijk hen tezamen met de farmaceutisch aanvaardbare drager welke de verbinding verdunt en het hanteren verge-25 makkelijkt toe te dienen. De term "farmaceutisch aanvaardbaar" betekent dat de drager (evenals de verkregen samenstelling) steriel en niet-giftig is.

Voor een orale dosering kan de drager of het verdun-ningsmiddel een vaste stof, halfvaste stof of vloeistof zijn en kam fun-30 geren als een drager, excipiêns of medium voor het middel als beschreven in de farmacologische proeven. Voor de parenterale toediening wordt de verbinding opgelost of gesuspendeerd in een geschikt inj ecteerbaar vloei-stofmedium zoals in de techniek bekend is.

Bij de bereiding van deze doseringsvormen kan men de 35 aanvaarde technieken voor het samenstellen van water-oplosbare farmaceutische middelen (in het geval van zouten) en water-onoplosbare midde- 8302586 31 len (in het geval van de vrije basen) toepassen. De injecteerbare materialen kunnen bijvoorbeeld als volgt worden samengesteld.

Samenstelling A:

Steriele suspensie in 5 waterige drager voor injectiedoeleinden mg

Verbinding van voorbeelden I, II, III, IV, V, VI, IX of X als suspendeerbaar poeder 3 natriumcitraat 5,7 natriumcarboxymethylcellulose 10 (lage viscositeitskwaliteit) 2,0 methyl-para-hydroxybenzoaat · 1,5 * propyl-para-hydroxybenzoaat 0,2-.

water voor injectie tot 1,0 ml

Samenstelling A'; 15 Steriele suspensie in waterige drager voor injectie mg "3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl) doxorubicine van voorbeeld IV 0,5 natriumcitraat 5,7 20 natriumcarboxymethylcellulose (lage viscositeitskwaliteit) 2,0 methyl-para-hydroxybenzoaat 1,5 propyl-para-hydroxybenzoaat 0,2 water voor injectie tot 1,0 ml 25 Samenstelling B;

Steriele oplossing in waterige drager

Systeem voor injectie mg

Verbinding van voorbeeld VII 4 natriumcitraat _ 5,7 30 natriumcarboxymethylcellulose (lage viscositeitskwaliteit) 2,0 methyl-para-hydroxybenzoaat 1,5 propyl-para-hydroxybenzoaat 0,2 water voor injectie tot 1,0 ml 35 Men kan eveneens als volgt tabletten voor orale toe diening samenstellen.

3302586 32

Samenstelling C:

Tablet samenstelling mg verbinding van voorbeeld VII 5,0 lactose 91 5 .maïszetmeel (gedroogd) 51,5 gelatine 2,5 magnesiumstearaat '1,0

De verbinding van voorbeeld VII wordt verpoederd en gepasseerd door een maaszeef en goed gemengd met het lactose en 30 mg 10 van het maïszetmeel, en beide door een zeef gepasseerd.

De gemengde poeders worden samengeroerd met een warme gelatine-oplossing, bereid door gelatine in water te roeren en te verhitten onder vorming van een 10% w/w oplossing. De massa wordt gekorreld door passage door een zeef en de vochtige korrels worden bij 40eC ge-15 droogd.

De gedroogde korrels worden opnieuw gekorreld door deze door een zeef te passeren en het restant van het zetmeel en het magne-siumstearaat wordt toegevoegd waarna grondig wordt gemengd.

De korrels worden samengeperst tot tabletten die elk 20 150 mg wegen.

De capsules kunnen als volgt worden samengesteld.

Samenstelling D:

Capsule-samenstelling m£ 3 *-deamino-3'-(3"-cyano-25 4"-morfolinyl) doxorubicine van voorbeeld IV (C) 1 lactose 199

De verbinding volgens voorbeeld VIII of IV(C) en lactose worden door een zeef gepasseerd en de poeders tezamen goed gemengd 30 alvorens deze in harde gelatine-capsules met een geschikte afmeting worden afgevuld, en wel zodanig dat elke capsule 200 mg gemengd poeder bevat.

8302586

Claims

33 * , ►
1. Verbinding met de structuur volgens formule -2, waarin R wordt gekozen uit -CO-CH3, -CHOH-CH3, -CO-CH^H, -CHOH-CH2OH, hydroxy, alkylgroepen met 1-3 koolstofatomen, eindstandige hydroxyalkylgroepen met 1-3 koolstofatomen, organische zuur (2-7 koolstofatomen) esters 5 en diësters van -CO-CH2OH, -CHOH-CH2OH en -CHOH-CH3/ -CO-CH2OH, -CHOH-CH2OH en -CHOH-CH3 met alkyl (1-6 koolstofatomen) of arylether-vervangingen van een of meer van de hydroxylgroepen daarvan en -13-ketimine-derivaten van -CO-CH3 en -CO-CH2OH; Y waterstof of methoxy is; X =0 of =NH is, R' en R" tezamen een waterstofatoom plus een hydroxy-10 groep zijn, beide waterstofatomen zijn of R' O-methoxy en R" waterstof is; A waterstof of cyano is met de voorwaarde, dat wanneer X =0, A cyano moet zijn; Z wordt gekozen uit zuurstof, zwavel, -CH2~ en -CH- , waarin OR"' R"' een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen is met de voorwaarde dat wan-15 neer Z -CH2- of -CH- is, A cyano is. 0R"'
2. Verbinding volgens conclusie 1 met de structuur volgens formule 1, waarin R wordt gekozen uit C0-CH3, CHOH-CH3, CO-CH2OH en CH0H-CH20H, X wordt gekozen uit 0 en NH en A wordt gekozen uit CN en H 20 waarbij A CN is wanneer X 0 is.
3. Verbinding volgens conclusie 2 met de structuur volgens formule 11.
4. Verbinding volgens conclusie 2 met de structuur volgens formule 12.
5. Verbinding volgens conclusie 2 met de structuur volgens formule 13, waarin R de betekenissen van conclusie 2 heeft. 6. 3'-Deamino-31-(3"-cyano-4"-morfolinyl)daunorubicine. .7. 3'-Deamino-3(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13dihydrodauno- rubicine. 308. 3'-Deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)doxorubicine. 9. 3’-Deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxo-rubicine. 10. 3'-Deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-iminodoxorubicine en farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan. 8302586 34
11. Farmaceutisch preparaat omvattende een verbinding vol gens conclusie 1 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan gemengd met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel of aanvaardbare drager.
12. Farmaceutisch preparaat met antitumor-werking omvatten de een verbinding volgens conclusies 2-5, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan gemengd met een farmaceutisch aanvaardbare drager.
13. Farmaceutisch preparaat met antitumor-werking omvattende een effectieve hoeveelheid van 31-deamino-3 *-(3"-cyano-4"-morfolinyl)- 10 daunorubicine.
14. Farmaceutisch preparaat met antitumor-werking omvattende een effectieve hoeveelheid vein 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfoli-nyl)-13-dihydrodaunorubicine.
15. Farmaceutisch preparaat met antitumor-werking omvat- 15 tende een effectieve hoeveelheid van 3'-deamino-3 ,-(3"-cyano-4,,-morfoli-nyl)doxorubicine.
16. Farmaceutisch preparaat met antitumor-werking omvattende een effectieve hoeveelheid van 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-13-dihydrodoxorubicine.
17. Farmaceutisch preparaat met antitumor-werking omvatten de een effectieve hoeveelheid van 3'-deamino-3'-(4"-morfolinyl)-5-imi-nodoxorubicine.
18. Werkwijze ter bereiding van een verbinding met de structuur volgens formule 2, waarin R wordt gekozen uit -CO-CH^, -CHOH-25 CH3, -CO-CE2OH, -CHOH-CH2OH, hydroxy, alkylgroepen met 1-3 koolstof-atomen, eindstandige hydroxyalkylgroepen met 1-3 koolstofatomen, organische zuur (2-7 koolstofatomen) esters en diësters van -CO-CE^OH, -CHOH-CH2OH en -CHOH-C&j, -CO-CH2OH, -CHDH-CH20B en -CHOH-CH3 waarbij een of meer van de hydroxylgroepen daarvan is vervangen door alkyl met 1 30 - 6 koolstofatomen of arylethergroepen, alsmede -13-ketimine-derivaten van -C0-CH3 en -CO-CH2OH; Y waterstof of methoxy is; X =0 of =NH, R' en R" tezamen een waterstofatoom plus een hydroxygroep vormen, beide waterstofatomen zijn of R' 0-methoxy en R" waterstof is; A waterstof of cyano is met de voorwaarde dat wanneer X =0, A cyano moet zijn; Z wordt 35 gekozen uit zuurstof, zwavel, -CH2- en > waarin R'" een alkyl- OR"' groep met 1-3 koolstofatomen is met de voorwaarde dat wanneer Z -CH2- 8302586 35 of -CH- is, A cyano is, met het kenmerk, dat het bekende daunorubicine OR"' en doxorubicine en de analogen daarvan met de structuur volgens formule 5, waarin R, R', R", x en Y de voomoemde betekenissen hebben, in reactie 5 worden gebracht in een gemengd waterig polair organisch medium met een verbinding met de structuur volgens formule 6, of een geschikte voorloper daarvan, waarbij Z wordt gekozen uit zuurstof, zwavel, -C^-, -CH- , OR"' waarbij R"' de voomoemde betekenissen heeft, welke reactie wordt uit-10 gevoerd in aanwezigheid van een cyanoboorhydride-zout, zoals een alkali-metaal-cyanoboorhydride, en de gewenste verbindingen op op zichzelf bekende wijze worden geïsoleerd en gezuiverd.
19. Werkwijze ter bereiding van een verbinding met de structuur volgens formule 11, waarin R wordt gekozen uit -CO-CH^, -CHOH-
15 CH^, -CO-CH2OH, en -CHOH-C^OH, met het kenmerk, dat een verbinding met de structuur volgens formule 14, waarin R de voornoemde betekenissen heeft, in een gemengd waterig polair organisch medium in reactie wordt gebracht met de verbinding met de structuur volgens formule 7 of een geschikte voorloper daarvan, welke reactie wordt uitgevoerd in aanwezig-20 heid van een cyanoboorhydride-zout, zoals een alkalimetaal-cyanoboor-hydride, en de gewenste, verbindingen op op zichzelf bekende wijze worden geïsoleerd en gezuiverd.
20. Werkwijze ter bereiding van een verbinding met de structuur volgens formule 4, met het kenmerk, dat doxorubicine of een 25 gebruikelijk zout daarvan in een gemengd waterig polair organisch medium in reactie wordt gebracht met 2,2'-oxydiaceetaldéiyde of met een verbinding waardoor de laatste in situ wordt gevormd, in aanwezigheid van een alkalimetaal-cyanoboorhydride, zoals natrium- of kaliumcyanoboor-hydride, en dat de gewenste verbinding volgens op zichzelf bekende 30 chemisch-fysische methoden wordt geïsoleerd en gezuiverd.
21. Werkwijze ter bereiding van de verbinding met formule 4 volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat het ruwe reactieprodukt dat na de "morfoline-ringsluiting" is verkregen wordt gescheiden in neutrale en basische fracties, waarbij de neutrale fractie wordt onder- 35 worpen aan chromatografische zuivering, waarbij het zuivere produkt met formule 4 wordt verkregen. 8302586 36
22. Werkwijze ter bereiding van een verbinding met de struc tuur volgens formule 15, waarin R wordt gekozen uit CO-CH^, CHOH-CH^· CO-CH2OH en CHOH-C^OH en A wordt gekozen uit CN en H, met het kenmerk, dat de verbinding met de structuur volgens formule 16, waarin R de ge-5 noemde betekenissen heeft en nadat de 14-hydroxy-groep, indien aanwezig, geschikt is geblokkeerd door een mild-zure labiele beschermende groep, genoemde verbinding in reactie wordt gebracht met een overmaat alcoholisch ammoniak bij een temperatuur tussen -25°C en +25°C en na afsplitsing van genoemde mild-zure labiele beschermende groep de gewenste ver-10 bindingen op op zichzelf bekende wijze worden geïsoleerd en gezuiverd. 8302533