DE3301489C2

DE3301489C2 -

Info

Publication number: DE3301489C2
Application number: DE3301489A
Authority: DE
Inventors: Sergio Mailand/Milano It Penco; Giuliano Corsico Mailand/Milano It Franchi; Federico Nerviano Mailand/Milano It Arcamone; Anna Maria Mailand/Milano It Casazza
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1982-01-26
Filing date: 1983-01-18
Publication date: 1988-01-28
Also published as: GB8301178D0; CS235979B2; ATA15683A; NL8300150A; KR840003262A; FI74977B; IE53750B1; FI830155L; ZA83450B; DK157322B; DE3301489A1; DK157322C; PT76113A; NO153456B; FR2520365A1; AU551700B2; ES519255A0; IE830144L; ES8403140A1; NO830234L

Description

Die Erfindung betrifft Anthracyclinglycoside, Verfah ren zu deren Herstellung und Arzneimittel, die diese enthalten.

Von "H. S. El Khadem, Academic Press, Anthracycline Antibiotics (Symposium 24.-25. 8. 1981), New York, 1982", werden auf Seite 7, Tabelle IV und Seite 26, Tabelle XVII strukturell ähnliche Anthracyclinglycoside beschrieben.

Die Erfindung betrifft Anthracyclinglycoside der Formel I

worin bedeuten: X Wasserstoff oder Hydroxy; und pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze derselben.

Die Verbindungen werden wie folgt bezeichnet:
4-Demethoxy-4′-O-methyl-daunorubicin
(Ia: X=H),
4-Demethoxy-4′-O-methyl-doxorubicin
(Ie: X=OH)

Als Säureadditionssalze sind insbesondere Hydrochloride zu nennen.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinglycosiden der Formel (I).

Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt die Konden sation von 4-Demethoxy-daunomycinon (US-PS 40 46 878) mit 2,3,6-Trideoxy-3-trifluoroacetamido-4-O-methyl-L-lyxo- hexopyranosylchlorid (US-PS 41 83 919) unter Bildung des geschützten α-Glycosids gemäß folgender Formel

worin X die vorstehend angegebene Bedeutung hat.

Entfernen der N-Trifluoroacetyl-Schutzgruppe durch milde alkalische Hydrolyse unter Bildung des entspre chenden Daunorubicin-Derivats Ia und gegebenen falls Umwandlung des Daunorubicin-Derivats zu dem entsprechenden Doxorubicin-Derivat Ie durch Bromierung und Behandlung des erhaltenen 14-Bromo- Derivats mit wäßrigem Natriumformiat.

Die Umwandlung des Daunorubicin-Derivats Ia zu dem entsprechenden Doxorubicin-Derivat Ie er folgt nach der in US-PS 38 03 124 beschriebenen Methode.

Im weiteren umfaßt die Erfindung pharmazeutisch Mittel, welche ein Anthracyclinglycosid der Formel (I) oder ein therapeutisch annehmbares Salz desselben im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Streck mittel (Verdünner) oder Träger desselben umfassen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und biologischen Daten näher erläutert.

Beispiel 1 4-Demethoxy-4′-O-methyl-daunorubicin-hydrochlorid (Ia)

Eine Lösung von 3,68 g 4-Demethoxy-daunomycinon in 400 ml wasserfreiem Methylendichlorid, welche 1,4 g 1-Chloro-4-O-methyl-N-trifluoroacetyl-daunosamin ent hält, wurde in Gegenwart von Molekularsieb (30 g, 4 Å) und 1,3 g Silber-trifluoromethansulfonat kräftig gerührt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 0,55 ml Symcollidin® neutrali siert. Nach 40 Minuten wurde die Suspension filtriert und die organische Phase mit 0,01 N wäßriger Salzsäure lösung, mit Wasser, mit einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Der durch Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum erhaltene Rückstand wurde in 150 ml Aceton aufgelöst, mit 600 ml 0,2 N wäßrigem Natriumhydroxid behandelt und mit 450 ml Wasser ver dünnt. Nach 5 h bei 0°C wurde die Lösung auf pH 8,5 eingestellt und mit Chloroform extrahiert, bis die Chloroformextrakte keine Färbung mehr zeigten. Die organischen Extrakte wurde ver einigt und mit 0,1 N methanolischem HCl auf pH 5 ange säuert. Durch Eindampfung im Vakuum auf ein kleines Volumen (150 ml) wurde reines 4-Demethoxy-4′-O-methyl- daunorubicin-hydrochlorid (0,6 g) kristallisiert. Die Mutterlauge wurde auf einer Silicagelsäure, die mit Phosphorpuffer (M/15) auf pH 7 gepuffert war, gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem Chloroform : Methanol : Wasser (10 : 2 : 0,2 nach dem Volumen) verwendet wurde. Das Eluat, welches die reine Verbindung enthielt, wurde mit Wasser verdünnt und die organische Phase abge trennt, mit Wasser gewaschen und auf ein kleines Volumen eingeengt, und anschließend mit 0,1 N methanoli schem HCl auf pH 5 angesäuert. Es wurde eine weitere Menge (0,4 g) 4-Demethoxy-4′-O-methyl-daunorubicin- hydrochlorid erhalten; Schmelzpunkt 180 bis 190°C (unter Zersetzung). Es wurde eine Dünnschichtchromatogra fie auf Kieselgelplatten mit dem Lösungs mittelsystem Chloroform : Methanol : Wasser (10 : 2 : 0,2 nach dem Volumen) durchgeführt.

Rf (nachgereicht) = 0,37; Ausbeute (nachgereicht) = 20% bezogen auf die Ausgangsverbindung 4-Demethoxydaunomycinon.

HPLC (Hochleistungsflüssigchromatografie): experimen telle Analyse: Mikrobondapack-C₁₈-Säule; mobile Phase : Wasser : Acetonitril (69 : 31 nach dem Volumen) bei pH 2 mit 10% Orthophosphorsäure: Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/Min., Retentionszeit 22 Minuten. FD-MS: m/z 511 (M^+.).

H-NMR (DMSO-d₆) (nachgereicht): 1.21 (d, CH₃-C-5′); (s, CH₃CO); 3.48 (s, CH₃O-C-4′); 4.88 (s breit, CH-7); 5.27 (s breit, CH-1′); 13.26 und 13.47 (zwei s, phenolisches OH).

Beispiel 2 4-Demethoxy-4′-O-methyl-doxorubicin-hydrochlorid (Ie)

Eine Lösung von 0,5 g 4-Demethoxy-4′-O-methyldaunoru bicin-hydrochlorid hergestellt wie im Beispiel 1 beschrieben, in einem Gemisch aus Methanol (8 ml) und Dioxan (20 ml) wurde mit Brom unter Bildung aus 14-Bromo-Derivats be handelt. Behandlung des 14-Bromo-Derivats mit einer wäßrigen Natriumformiatlösung bei Raumtemperatur für 18 h ergab 0,310 g 4-Demethoxy-4′-O-methyl-doxorubi cin, das als Hydrochlorid isoliert wurde, Schmelzpunkt 164 bis 165°C (unter Zersetzung); Dünnschichtchromato grafie (TLC) auf Kieselgelplatten Lösungs mittelsystem Chloroform : Methanol : Wasser (10 : 2 : 0,2 nach dem Volumen); Rf=0,18; Ausbeute (nachgereicht)=60%.

HPLC: experimentelle Bedingungen: Mikrobondapack- C₁₈-Säule; mobile Phase Wasser : Acetonitril (69 : 31 nach dem Volumen) bei pH 2 mit 10% Orthophosphorsäure; Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/Min.; Retentionszeit: 10 Min.

H-NMR (DMSO-d₆) (nachgereicht): 1.21 (d, CH₃-C-5′); 3.38 (s, CH₃O-C-4′); 4.57 (s, CH₂-14); 4.91 (s breit, CH-7); 5.28 (s breit, CH-1′); 13.28 und 13.49 (zwei s, phenolisches OH).

Biologische Aktivität von Ia und Ie

Die Verbindungen Ia und Ie wurden gegenüber den Stamm verbindungen, i. e. Daunorubicin (DNR) und Doxorubicin (DX) in mehreren Versuchssystemen untersucht, um deren Cytotoxizität, Antitumoraktivität und Kardiotoxizität bei Versuchstieren zu bestimmen.

Die in Tabelle 1 wiedergegebenen Daten zeigen, daß Ia etwa fünfmal cytotoxischer als DNR, und Ie ca. neunmal cytotoxischer als DX ist.

Das in vivo durchgeführte primäre Screening wurde an CDF-1-Mäusen mit P 388 Ascites-Leukämie (10⁶ Zellen/ Maus) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 wiedergegeben. Es wurde festgestellt, daß Ia und Ie jeweils toxischer und potenter waren als die Stammver bindungen. Ein Vergleich bei der maximal tolerierten Dosis (MxTD) zeigt, daß Ia ebenso wirksam ist wie DNR (eine ähnliche Zunahme der Lebensspanne der Mäuse er gibt) und Ie eine gute Antitumoraktivität besitzt, die in der gleichen Größenordnung liegt, wie die von DX.

Mehrere Untersuchungen wurden an C3H-Mäusen mit Groß-Leukämie (intravenös injiziert, 2×10⁶ Zellen/ Maus) durchgeführt. Die Daten zu Ia sind in Tabelle 3 aufgeführt. Bei i. v. Verabreichung, am Tag 1 nach der Tumorinokulation, zeigte sich Ia deutlich toxi scher und potenter als DNR. Bei der MxTD von 1,25 bis 1,3 mg/kg war Ia wirksamer als DX bei der MxTD von 10 mg/kg. Es ist allgemein bekannt, daß DNR nicht aktiv ist, wenn es auf oralem Wege verabreicht wird, es sei denn, es wird in sehr hohen Dosen gegeben (=mg/kg). Die in Tabelle 3 aufgeführten Werte zeigen, daß Ia eine gute Antitumoraktivität gegen Groß-Leukämie besitzt, auch wenn es oral verabreicht wird. Bei oraler Verabreichung nur am Tag 1 ist Ia bei einer Dosis von 1,25 bis 1,3 mg/kg aktiv; diese Dosis stellt auch im Falle der i. v. Behandlung die optimale Dosis dar. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß die Absorption von Ia durch den gastrointestinalen Trakt sehr effizient ist. Bei oraler Verabreichung an den Tagen 1, 2 und 3 ist Ia aktiver, als wenn es nur am Tag 1 verabreicht wird; bei der optimalen Dosis von 0,66 mg/kg/Tag besitzt es eine Antitumoraktivität, die in derselben Größenordnung liegt, wie die von 4-Deme thoxy-daunorubicin, das parallel bei der optimalen Dosis von 1,9 mg/kg/Tag untersucht wurde. Die Beobach tung, daß die optimale Dosis von Ia niedriger ist als die von 4-Demethoxy-daunorubicin, ist ein Hinweis auf eine effizientere Absorption durch den gastrointesti nalen Trakt im Vergleich zu dieser Verbindung.

Daten zur Antitumoraktivität von Ie im Vergleich mit DX gegen Groß-Leukämie werden in Tabelle 4 wiederge geben. Die Verbindungen wurden am Tag 1 nach dem Tumorzellen-Inokulum verabreicht; DX wurde i. v. verab reicht; Ie wurde i. v. und oral verabreicht. Bei i. v. Verabreichung bei MxTD von 1 mg/kg zeigte Ie eine gute Antitumoraktivität, ähnlich der, wie sie nach DX- Behandlung beobachtet wurde. Außerdem war Ie auch bei oraler Verabreichung in Dosen von 1,3 mg/kg an aktiv,

Ie wurde gegen L 1210 Leukämie getestet, welche in CDF-1-Mäuse i. p. (Ascites-Form) oder i. v. (10⁵ Zellen/ Maus) inokuliert wurde. Die Behandlung erfolgte am Tag 1 nach der Tumorzelleninokulation, jeweils i. p. oder i. v. Die in Tabelle 5 aufgeführten Daten zeigen, daß bei dem i. p.-i. p.-Experiment Ie bei der MxTD von 0,83 mg/kg ebenso aktiv war wie DX bei der MxTD von 4,4 mg/kg. Bei dem i. v.-i. v.-Experiment zeigte Ie bei den tolerierten Dosen von 1 bis 1,3 mg/kg eine Antitu moraktivität, die der von DX überlegen war.

Um die Antitumoraktivität gegen einen festen Tumor zu bestätigen, wurde Ie im Vergleich mit DX gegen C3H (weiblich) Mammacarcinom gestestet. Es wurde hierfür ein Tumortransplantat der dritten Generation verwen det. Die Behandlung begann 15 Tage nach der Tumor transplantation und erfolgte i. v. einmal wöchentlich, 4 Wochen lang. Die Tumormessung erfolgte wöchentlich mit Hilfe einer Lehre (Kaliper). Mäuse ohne Tumor wurden parallel behandelt, um die allgemeine Toxizität und die Kardiotoxizität zu ermitteln, diese Unter suchung erfolgte an fünf Mäusen, die mit den höchsten Dosen der zwei Verbindungen behandelt und 5 Wochen nach der letzten Behandlung getötet wurden. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. DX war sehr wirksam; inhibierte das Tumorwachstum um 93 bis 94% (im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrollen) bei den beiden getesteten Dosen (6 und 7,5 mg/kg). Bei den mit DX (7,5 mg/kg) behandelten Mäusen ohne Tumor wurden toxische Todesfälle beobachtet (2/3) und sämtliche der untersuchten Mäuse zeigten histolo gisch nachweisbare krankhafte Veränderungen des Herzens. Ie war bei einer Dosis von 0,4 mg/kg leicht aktiv; bei Dosen von 0,6 und 0,75 mg/kg inhibierte es deutlich das Tumorwachstum. Bei den mit Ie (0,75 mg/kg) behan delten Mäusen ohne Tumor wurden keine krankhaften Ver änderungen des Atriums beobachtet und nur 2 von 5 Mäusen zeigten nachweisbare krankhafte Veränderungen des Ventrikels, die jedoch weniger ernsthaft waren als sie nach der Behandlung mit DX beobachtet wurden.

Die hier angegebenen Daten zeigen, daß Ia und Ie neue Anthracyclinanaloge darstellen, die sehr interessante biologische Eigenschaften besitzen. Im Vergleich mit DNR ist Ia bei i. p. Verabreichung um das dreifache wirksamer, und bei i. v. Verabreichung ca. um das acht fache wirksamer. Bei der MxTD weist es eine Antitumor aktivität gegen Ascites-P 388 und systemischer Groß- Leukämie auf, die der von DNR entspricht. Außerdem ist es auch bei oraler Verabreichung aktiv, insbeson dere wenn die Behandlung drei Tage hintereinander er folgt bei Dosen, die niedriger als die von 4-Deme thoxy-daunorubicin sind.

Ie ist in vivo um ca. das 10fache wirksamer (stärker) als DX. Ein Vergleich bei der MxTD zeigt, daß es in bezug auf DX ebenso aktiv gegen Ascites-P 388- und L 1210-Leukämie, systemischer Groß-Leukämie und festem Mammacarcinom ist, und daß es gegen systemische (i. v.-injiziert) L 1210-Leukämie wirksamer als DX ist. Außerdem ist es gegen Groß-Leukämie auch bei oraler Verabreichung aktiv; bei einem präliminären Kardio toxizitätstest an C3H-Mäusen, die chronisch i. v. behandelt wurden, bewirkte es nur minimale krankhafte Veränderungen des Herzens. Die Verbindung Ia wurde an P 388-Leukämiezellen, die gegenüber Doxorubicin re sistent sind (P 388/DX), in vitro und in vivo unter sucht. P 388-Leukämiezellen, die gegenüber Doxorubicin (DX) resistent sind, werden erhalten durch Serientransfer in Mäusen, die i. p. mit DX behandelt wurden. Für experimentelle Zwecke wurden BDF-1-Mäuse nach 10⁴-Leukämiezellen i. p. injiziert und am Tag 1 nach der Tumorinokulation i. p. behandelt. Die in Tabelle 7 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß Daunorubicin (DNR) nicht gegen diesen Tumor aktiv war, während die Verbindung Ia bei der optimalen Dosis von 0,8 mg/kg die Lebensspanne der behandelten Mäuse ver längerte. P 388- und P 388/DX-Leukämiezellen wurden aus der Ascites-Flüssigkeit von Mäusen geerntet und zum in vitro-Wachstum in Suspension adaptiert. Es wurden cytotoxische Tests durchgeführt, in dem man die Zellen 48 h lang verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen aus setzte; am Ende dieser Zeitdauer wurden die Zellen in einem Coulter-Cell-Counter gezählt und die ID₅₀- Werte (Dosis, die 50% Reduzierung der Zellzahl im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrollen ergibt) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt und zeigen, daß Ia etwa zweimal so cytotoxisch ist wie DNR gegen P 388-Leukämiezellen, und sich auch sehr aktiv gegen P 388/DX-Leukämiezellen erweist, während DNR 163- bis 152mal weniger aktiv auf die resistente als auf die sensitive Linie ist.

Die Verbindung Ie wurde im weiteren an Mammacarcinom bei C3H-Mäusen untersucht. Mäuse mit einem meßbaren Tumor (Transplantat der dritten Generation) wurden einmal wöchentlich, 4 Wochen lang, i. v. mit Ie oder mit DX behandelt. Normale Mäuse wurden parallel dazu behandelt, um die Toxizität zu bestimmen. Die Ergeb nisse sind in Tabelle 9 aufgeführt und bestätigen, daß Ie ca. zehnmal so wirksam ist als DX, und daß es über eine bemerkenswerte Antitumoraktivität in diesem experimentellen System bei nicht-toxischen Dosen ver fügt, während DX toxisch war.

Aufgrund der guten Antitumoraktivität gegen Mammacarcinom wurde die Verbindung Ie gegen zwei feste Tumore getestet: Colon-26- und Colon-38-Adenocarci noma, s. c. transplantiert jeweils in BALB/c-Mäuse und in BDF-1-Mäuse. Die Behandlung begann am Tag 1 nach der Tumorinokulation (früh) oder, wenn der Tumor bereits fühlbar war (fortgeschritten) und erfolgte i. v. einmal wöchentlich oder alle 6 Tage, drei- bis viermal. Das Tumorwachstum wurde bestimmt durch Mes sung mit einer Lehre (Kaliper).

Parallel dazu wurden Mäuse ohne Tumor behandelt, um die Toxizität zu bestimmen; sie wurden 90 Tage lang beobachtet. Die Ergebnisse dieser drei Experimente sind in Tabelle 10 aufgeführt. Gegen Colon-26 im Früh stadium war Ie bei der maximal tolerierten Dosis von 0,9 mg/kg/Tag wirksamer als DX bei der maximal tole rierten Dosis von 7,5 mg/kg/Tag. Gegen Colon-26 im fortgeschrittenen Stadium zeigte sich Ie bei der getesteten Maximaldosis von 0,7 mg/kg/Tag nicht to xisch und ergab eine höhere Tumorwachstums-Inhibierung als DX bei der maximal tolerierten Dosis von 6 mg/kg/Tag. Gegen Colon-38 im fortgeschrittenen Stadium war Ie bei der getesteten Maximaldosis von 0,9 mg/kg/Tag ebenso wirksam wie DX bei 9 mg/kg/Tag bei der Inhibierung des Tumorwachstums, ergab jedoch eine höhere Zunahme der Überlebensdauer.

Zusammenfassend bestätigen die hier angegebenen Daten, daß die Verbindungen Ia und Ie außerordentlich interessante neue Anthracycline darstellen, die über eine hohe Wirksamkeit, Aktivität bei oraler Anwendung, Aktivität gegen anthracyclinresistente Tumore (Ia), Aktivität gegen feste Tumore besitzen, die der von DX überlegen ist, und nicht kardiotoxisch sind (Ie).

Tabelle 1

Kolonien-Inhibierungstest nach Hela-Zellen in vitro (Behandlung für 24 h).

Tabelle 2

Antitumoraktivität gegen P 388-Leukämie Behandlung i. p. am Tag 1

Tabelle 3

Aktivität von Ia gegen Groß-Leukämie

Tabelle 4

Aktivität von Ie gegen Groß-Leukämie

Tabelle 5

Aktivität von Ie gegen L 1210-Leukämie

Tabelle 6

Aktivität gegen C3H-Mammacarcinom, Toxizität und Cardiotoxizität von Ie im Vergleich zu DX

Tabelle 7

Wirkung auf doxorubicinresistente P 388-Leukämie in vivo

Tabelle 8

Wirkung auf sensitive und doxorubicinresistente P 388-Leukämie in vitro

Tabelle 9

Aktivität von Ie gegen Mammacarcinom von C3H-Mäusen

Tabelle 10

Wirkung von Ie und DX gegen zwei transplantierte Conol-Adenocarinoma in Mäusen

Claims

1. Anthracyclinglycoside der allgemeinen Formel I worin bedeuten: X Wasserstoff oder Hydroxy; und pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze derselben.

2. Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinglycosiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise 4-Demethoxy-daunomycinon, auflöst in wasserfreiem Methylendichlorid, mit 2,3,6-Trideoxy-3-trifluoroacetamido-4-O-methyl-L-lyxohexo- pyranosylchlorid oder 2,3,6-Trideoxy-3-trifluoroacetamido-4-O-methyl-L-arabino- hexopyranosylchlorid, in Gegenwart von Silbertrifluoro-methan-sulfonat und Molekularsieb, unter Bildung der entsprechenden N-Trifluoroacetyl-geschützten alpha-Glycoside umsetzt, die N-Trifluoroacetylschutzgruppe durch milde alkalische Hydrolyse mit 0,2 N wäßrigem Natriumhydroxid entfernt unter Bildung der entsprechenden Daunorubicin-Derivate (X=H), die gegebenenfalls durch Bromierung und Behandlung der dabei gebildeten 14-Bromo-Zwischenverbindungen mit wäßrigem Natriumformiat in die entsprechenden Doxorubicin-Derivate (X=OH) umgewandelt werden.

3. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines Anthracyclinglycosids gemäß Anspruch 1 in Kombination mit einem inerten Träger derselben.