FI74977B - Foerfarande foer framstaellning av antracyklinglykosider. - Google Patents

Description

74977

MENETELMÄ ANTRASYKLIINIGLYKOSIDIEN VALMISTAMISEKSI - FÖRFA-RANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV ANTRACYKLINGLYKOSIDER

Keksintä koskee menetelmää kaavan I mukaisten terapeuttisesti vaikuttavien antrasyk1iiniglykosidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi , '''oh 0 OH | r.

) (i) och3 jossa X on vety tai hydroksi.

Nämä yhdisteet nimetään seuraavasti: 4-demetoksi-4'-O-metyy-li-daunorubisiini (Ia: X=H), 4-demetoksi-4'-O-metyy1i-dokso- rubisiini (Ie: X=OH).

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että 4-demetoksi-daunomysinoni (US-patenttijulkaisu No. 4 046 878) saatetaan vedettömään metyleenidikloridiin liuotettuna reagoimaan huoneen lämpötilassa 2,3,6-trideoksi-3-1rif1uori-asetamido-4-0-metyyli-L-lykso-heksapyranosyylikloridin (US-patentti j ulkaisu No. 4 183 919) kanssa hopeatrifluorimetaa-nisulfonaatin ja molekyyliseulan läsnäollessa niin, että saadaan vastaava N-trifluoriasetyylisuojattu K-glykosidi XX JL 74977 2

0H

0 OH ! Ö (II) 0CH3 ja poistetaan N-trifluoriasetyylisuojaryhmä miedosti emäksisellä hydrolyysi11ä käyttämällä natriumhydrok sidin 0,2 N vesiliuosta, jolloin saadaan kaavan Ia mukainen dau.norubisii-ni johdannainen (X = H) vapaana emäksenä, jota kloroformiin liuotettuna käsitellään kloorivedyn 0,1 N metanoli1iuoksel la niin, että saadaan vastaava hydrokloridi, joka haluttaessa lopuksi muutetaan broraikäsi11e ly 1lä kloroformissa ja saadun 14-bromijohdannaisen hydrolyysi11ä huoneen lämpötilassa natrium formiaatin vesiliuoksella kaavan Ie mukaiseksi doksoru-bisiinijohdannaiseksi (X=0H), joka on vapaana emäksenä ja muutetaan vastaavaksi hydrokloridiksi.

Kaavan Ia mukaisen daunorubisiinijohdannaisen muuntaminen vastaavaksi kaavan Ie mukaiseksi doskorubisiinijohdannaiseksi tapahtuu US-patenttijulkaisun No. 3 803 124 mukaisesti.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja antrasyk 1iiniglykosideja voidaan käyttää farmaseuttisina seoksina, joissa on antra-syk1iiniglykosidin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan ohella farmaseuttisesti hyväksyttävää laimenninta tai kantaja-ainetta.

Ennestään tunnetaan eräitä yhdisteitä, jotka ovat rakenteeltaan lähellä keksinnön mukaisesti valmistettavia antrasyk-1iiniglykosideja. GB-paten11iju1 kaisus sa 1 467 383 on esim.

Il 3 74977 kuvattu 4-demetoksidaunomysiini lähtien synteettisestä ja täten raseemisesta 4-demetoksidaunomysinonista. Oleellista on se, että mainitun glykosidin sokeriosassa oleva 4'-hyd-roksiryhmä on aina vapaa eikä koskaan metyloitu. Keksinnön mukaisesti valmistetuissa glykosideis sa on tästä poiketen mainitussa asemassa oleva ryhmä aina metoksiryhmä. Lisäksi on mainittava, että julkaisussa kuvatussa menetelmässä on huomattavana hankaluutena saatujen diastereoisomeerien ja v- ja fl-anomeerien erottaminen toisistaan.

GB-patenttijulkaisussa 1 550 879 on edelleen kuvattu yhdisteitä, jotka poikkeavat keksinnön mukaisesti valmistettavista siinä, että niiden aglykonirungossa on aina metoksiryhmä 4-asemassa. Keksinnön mukaisesti valmistetuissa yhdisteissä ko. asemassa ei ole metoksiryhmää. DK-kuulutusjulkaisussa 146 542 on taas kuvattu menetelmä adriamysiiniana 1ogien valmistamiseksi lähtien vastaavista daunomysiinijohdannaisis ta. Mainittujen analogien 4'-asemassa on hydroksiryhmä, toisin kuin keksinnön mukaisissa yhdisteissä, joissa mainitussa asemassa on metoksiryhmä.

Mainituilla tunnetuilla yhdisteillä, kuten myös perusyhdisteillä daunorubisiinilla ja doksorubisiini1la on samankaltainen farmakologinen vaikutusprofii1i kuin keksinnön mukaisesti valmistettavilla yhdisteillä. Jäljempänä esitetyissä kokeissa on keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä verrattu daunorubisiiniin ja doksorubisiiniin, sillä nämä ovat ko. yhdisteryhmästä toistaiseksi ainoat, jotka ovat markkinoilla kaupallisina tuotteina. Kuitenkin suoritetut kokeet osoittavat, että keksinnöllä on saavutettavissa etua myös muihin vastaaviin tunnetuihin yhdisteisiin verrattuna. Metoksiryhmän puuttuminen aglykoniosan 4-asemasta lisää nimittäin keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden tehoa kasvaimia vastaan ja helpottaa niiden antamista potilaalle; toisin kuin tunnettuja yhdisteitä, voidaan keksinnön mukaisesti valmistettuja nauttia suun kautta. Tunnetuista yhdisteitä poiketen keksinnön mukaisesti valmistetut ovat 4 74977 tehonneet myös C3H-hiirten nisäsyöpään sekä kahteen erityyppiseen paksusuolen rauhassyöpään. Edelleen keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden paremmuus ilmenee kardio-toksisuuden puuttumisena sekä siinä, että ne ovat hiirillä suoritetuissa kokeissa tehonneet leukemiaan sekä kiinteisiin kasvaimiin, mikä perustuu keksinnön mukaiseen metoksyyliryh-män poistamiseen glykosidin aglykoniosan 4-asemasta.

Keksintöä valaistaan seuraavi 11a esimerkeillä ja biologisilla koetuloksilla.

ESIMERKKI 1 4-demetoksi-4'-0-metyyli-daunorubisiinihydrokloridi (Ia)

Liuosta, jossa oli 3,68 g 4-demetoksi-daunomysinonia 400 ml:ssa vedetöntä mety1 e enik 1 oridia, jossa oli 1,4 g 1-kloo-ri-4-O-metyyli-N-trifluoriasetyyli-daunosamiinia, sekoitettiin tehokkaasti molekyyliseulan (30 g, 4A Merck) ja hopea-trif1uorime taanisu1 fonaatin (1,3 g) läsnäollessa. Kun oli sekoitettu 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, reaktioseos neutraloitiin 0,55 ml:lla symkol1idiinia (symco 11idine) . 40 minuutin kuluttua suspensio suodatettiin ja orgaaninen faasi pestiin suolahapon 0,01 N vesiliuoksella, vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja lopuksi vedellä neutraaliksi. Liuotin haihdutettiin vakuumissa ja jäännös liuotettiin 150 ml:aan asetonia, käsiteltiin 600 ml :11a nat-riumhydroksidin 0,2 N vesiliuosta ja laimennettiin 450 ml:lla vettä. Kun oli pidetty 5 tuntia 0°C:ssa, liuoksen pH säädettiin arvoon 8,5 ja uutettiin kloroformilla, kunnes kloroformiuutteet eivät enää olleet väriltään punaisia. Orgaaniset uutteet yhdistettiin ja tehtiin happamiksi (pH 5) kloorivedyn 0,1 N metano1i1luokse1la. Kun haihdutettiin vakuumissa pieneen tilavuuteen (150 ml), puhdas 4-demetoksi-4'-O-metyyli-daunorubisiinihydrokloridi (0,6 g) kiteytyi. Emäliuos puhdistettiin si1ikagee1ipy1väässä, joka oli puskuroitu pH-arvoon 7 fosfaattipuskurilla M/15, käyttämällä liu-otinsysteeminä kloroformi-metanoli-vesiseosta (10:2:0,1 ti- 5 74977 1 avuusosina ) . Eluaatti, joka sisälsi puhtaan yhdisteen, laimennettiin vedellä ja orgaaninen faasi erotettiin, pestiin vedellä ja haihdutettiin pieneen tilavuuteen ja sen jälkeen tehtiin happamaksi (pH 5) kloorivedyn 0,1 N metano1i1iuok-sella. Näin saatiin vielä 0,4 g 4-demetoksi-4'-0-metyy1idau-norubisiinihydrokloridi a, sp. 189-190°C (hajoaa). Ohutker-roskromatografia silikageelilevyillä (Merck F 254) käyttämällä liuotinsysteeminä kloroformi-metanoli-vesiseosta (10:2:0,2 ti1 avuusosina ) .

R = 0,37, saanto 20 % laskettuna lähtöaineena olleesta 4-demetoksidaunomysinonista.

HPLC: koeanalyysi: pylväs microbondapack C ; liikkuva faa- j. y si: vesi-ase tonitrii1iseos (69:31 tilavuusosina) pH:ssa 2, joka oli säädetty 10 % ortofosforihapolla; virtausnopeus 1,5 ml/min, retentioaika 22 min.

FD-MS: m/z 511 (M+) H-NMR (DMS0-d ): 1.21 (d, CH -C-5'); 2.27 (s, CH.C0), 3.48 O 3 3 (s, CH30-C-4'); 4.88 (leveä s, CH-7); 5.27 (leveä s, C H-1 ' ) ; 13.26 ja 13.47 (kaksi s, fenolinen OH).

Alkuainekoostumuksen määrittämiseksi näytteitä kuivattiin 800 C:s s a tyhjössä (0,2 mm Hg) 15 tunnin ajan, minkä jälkeen ne saatettiin tasapainotilaan ilmassa (23°C, suhteellinen kosteus 55 %).

Näytteen paino saavutti kuloinkin vakioarvon 30 minuutissa painolisäyksen johtuessa adsorboituneesta vedestä. Alkuaine-analyysit tehtiin tasapainotetuista näytteistä.

Alkuaineanalyysi : määritystulos (%): C 56,12; H 5,09; N 2,32; Cl 6,49 C2,"3oVCri'7S H2° laskettu (%): C 55,77; H 5,82; N 2,41; Cl 6,11 6 74977 ESIMERKKI 2 4-demetoksi-4'-0-metyyli-doksorubisiinihydrokloridi (Ie)

Liuokseen, jossa oli 0,5 g 4-demetoksi-4'-0-metyyli-daunoru-bisiinihydrokloridia, joka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti, metanoLin (8 ml) ja dioksaanin (20 ml) seoksessa, lisättiin bromia niin, että saatiin 14-bromijohdannainen. Kun IJ-brooijohdannaista käsiteltiin 18 tuntia natriumformi-aatin vesiliuoksella, saatiin 0,310 g 4-demetoksi-4’-0-me-tyyii-doksorubisiinia, joka eristettiin hydroKloridina, sp. I54-165°C (hajoaa); ohukerroskromatografinen analyysi sili-kageelilevyllä (Merck F 254) käyttämällä liuotinsysteeminä k 1 oro formi-metano1i-vesiseosta (10:2:0,2 ti lavuusosina) ;

Rf 0,13, saanto 60 %.

HLPC : koeolosuhteet: pylväs microbondapack C1Q; liikkuvana 1 o faasina ve si-as e tönitrii1iseos (69:31 tilavuusosina) pH:ssa 2, joka oli säädetty 10 % ortofosforihapolla; virtausnopeus 1,5 ml/min; retentioaika 10 min, H-NMR(DMSO-d): 1.21 (d -CH -C-5’); 3.38 (s, CH-O-C-41); 6 3 3 4.57 (s, C H -14) ; 4.91 (leveä s, CH-7); 5,28 (leveä s, CH-1'); 13.28 ja 13.49 (kaksi 2, fenolinen OH).

Alkuaineanalyysi määritystulos (%) : C 53.10; H 5,42, N

2.21, Cl 6.70 C27H30°10C1-l-75H2°

Laskettu (%): C 54.27, H 5.67; N 2.34; Cl 5.94 Yhdisteiden Ia ja Ie biologinen aktiivisuus:

Yhdisteet Ia ja Ie testattiin emoyhdisteidensä daunorubisii-nin (DNR) ja doksorubisiinin (DX) suhteen vastaavasti useissa koesysteemeissä, jotta voitiin varmistua niiden sytotok-sisuudesta, antitumorivaikutuksesta ja sydämeen kohdistuvas-( ta myrkkyvaikutuksesta.

Il 7 74977

Taulukossa 1 esitetyt tiedot osoittavat, että Ia on noin 5 kertaa sytotoksisempi kuin DNR ja Ie on noin 9 kertaa syto-toksisempi kuin DX.

Esiseulonta in vivo suoritettiin CDF-1-hiiri11ä, joilla oli 0 P388 askiittinen leukemia (10 solua/hiiri) . Tulokset on esitetty taulukossa 2. Sekä Ia että Ie havaittiin toksisemmiksi ja voimakas tehoisemmiksi kuin emoyhdisteensä. Kun suoritettiin suurimman siedetyn annoksen (MxTD) vertailu, havaittiin, että Ia on yhtä tehokas kuin DNR (kohottavat hiiren elinaikaa samalla tavalla) ja Ie:n antitumorivaikutus on hyvä ja samaa suuruusluokkaa kuin DX:n vastaava.

Useita kokeita suoritettiin C3H-hiiri11ä, joilla oli i.v.- 0 injektoitu (2x10 solua/hiiri) Gross-leukemia. Yhdisteen Ia tulokset on esitetty taulukossa 3. Kun yhdistettä Ia annettiin i.v. vuorokauden kuluttua kasvaimen siirrostamisesta, osoittautui se huomattavasti toksisemmaksi ja voimakastehoi-semmaksi kuin DNR. MxTD:llä 1,25-1,3 mg/kg oli Ia tehokkaampi kuin DX MxTDrllä 10 mg/kg. Tiedetään hyvin, ettei DNR ole aktiivinen annettuna suun kautta, ellei anneta hyvin suuria annoks i a ( » 50 mg/kg). Taulukossa 3 esitetyt tulokset osoittavat, että lailla on hyvä antitumorivaikutus Gross-leukemian suhteen myös suun kautta annettuna. Ainoastaan 1. päivänä annettuna Ia on aktiivinen annoksena 1,25-1,3 mg/kg, joka on myös optimaalinen annos intravenöösisesti annettuna. Tämä tulos viittaa siihen, että Ia:n imeytyminen maha-suoli-kanavan läpi tapahtuu hyvin tehokkaasti. Annettaessa 1., 2.

ja 3. päivänä suun kautta Ia vaikuttaa tehokkaammin kuin annettaessa vain 1. päivänä ja optimaalisena annoksena 0,66 mg/kg/vrk sen antitumorivaikutus on samaa suuruusluokkaa kuin 4-demetoksi-daunorubisiinin vastaava, joka tutkittiin rinnakkaisesti optimiannoksella 1,9 mg/kg/vrk. Havainto, että yhdisteen Ia optimaalinen annos on pienempi kuin 4-demetoksi-daunorubisiinin vastaava viittaa siihen, että myös yhdiste imeytyy tehokkaammin maha-suolikanavan läpi.

8 74977

Yhdisteen Ie antitumorivaikutus Gross-leukemiassa yhdisteeseen DX verrattuna on esitetty taulukossa 4. Yhdisteet annettiin 1. päivänä kasvainsolujen siirrostamisen jälkeen; DX annettiin i.v.; Ie annettiin i.v. ja suun kautta. Kun annettiin i.v. MxTD:llä 1 mg/kg, osoitti Ie hyvää antitumorivai-kutusta, joka oli samanlainen kuin yhdisteellä DX käsiteltäessä havaittu. Lisäksi Ie oli aktiivinen myös suun kautta annoksina 1,3 mg/kg annettaessa.

Ie testattiin L 1 210- 1 e ukein i an suhteen, joka oli siirrostettu 5

CDF-l-hiiriin i.p. (askiittinen muoto) tai i.v. (10 solua/-hiiri). Hoito annettiin 1. päivänä kasvainsolujen siirrosta-misesta i.p. tai i.v. vastaavasti. Taulukossa 5 esitetyt tulokset osoittavat, että i.p.-i.p.-kokeessa oli Ie (MxTD

0. 83 mg/kg) yhtä aktiivinen kuin DX (MxTD 4,4 mg/kg). i.v.- 1. v.-kokeessa oli yhdisteen Ie antitumorivaikutus, kun siedetty annos oli 1 tai 1,3 mg/kg, suurempi kuin yhdisteen DX vastaava.

Jotta voitaisiin todeta antitumorivaikutus kiinteän kasvaimen suhteen, yhdiste Ie testattiin yhdisteeseen DX verrattuna C3H naaraan nisäsyövän suhteen. Käytettiin kolmannen sukupolven kasvaimensiirtoa. Hoito alkoi 15 vuorokauden kuluttua kasvaimen siirrosta ja käsittely suoritettiin i.v. kerran viikossa 4 viikon ajan. Kasvain mitattiin mittaharpi1la kerran viikossa. Kasvaimettomat hiiret käsiteltiin rinnakkaisesta, jotta voitaisiin arvioida yleinen toksisuus ja sydämeen kohdistuva toksisuus, joka tutkittiin 5 hiirellä, joille annettiin suurimmat annokset näistä kummstakin yhdisteestä, ja jotka surmattiin 5 viikon kuluttua viimeisen annoksen antamisesta. Tämän kokeen tulokset on esitetty taulukossa 6. DX oli hyvin tehokas, sillä se esti kasvaimen kasvua 93-95 % (verrattuna hoitamattomiin verrokkeihin) kummallakin koeannokse1la (6 ja 7,5 mg/kg). Kasvaimettomissa hiirissä, joille annettiin yhdistettä DX annos 7,5 mg/kg, havaittiin myrkytyskuolemia (2/3) ja kaikilla hiirillä oli histologisesti ilmeneviä sydänvaurioita. yhdiste Ie oli hie- 9 74977 man aktiivinen annoksena 0,4 mg/kg ja annoksina 0,6 ja 0,75 mg/kg se esti kasvaimen kasvua huomattavasti. Kasvai-mettomissa hiirissä, joille oli annettu yhdistettä Ie annos 0,75 mg/kg, ei havaittu lainkaan e teisvaurioita ja vain 2 hiirellä viidestä oli havaittavia kammiovaurioita, jotka olivat pienempiä kuin DX-käsittelyn jälkeen havaitut.

Tässä esitetyt tiedot osoittavat, että yhdisteet Ia ja Ie ovat uusia antrasykliinianalogeja, joilla on hyvin mielenkiintoisia biologisia ominaisuuksia. Verrattuna yhdisteeseen DNR on yhdiste Ia noin 3 kertaa voimakkaampi i.p. annettuna ja noin 8 kertaa voimakkaampi i.v. annettuna. Suurimpana siedettynä annoksena (MxTD) sillä on yhtä suuri antitumori-vaikutus askiittisen P388- ja systeemisen Gross-leukemian suhteen kuin yhdisteellä DNR. Lisäksi se on aktiivinen myös suun kautta annettuna erityisesti silloin, kun käsittely suoritetaan 3 peräkkäisenä päivänä, ja pienempinä annoksina kuin 4-demetoksi-daunorubisiinin annokset.

Yhdiste Ie on noin 10 kertaa voimakkaampi kuin DX in vivo. Verrattaessa suurimpia siedettyjä annoksia yhdisteen DX suhteen havaitaan, että Ie on yhtä aktiivinen askiittisen P388-ja L1210-leukemian, systeemisen Gross-leukemian ja kiinteän nisäsyövän suhteen kuin DX ja se on tehokkaampi kuin DX systeemisen (i.v.-injektoitu) L1210-leukemian suhteen. Lisäksi se on aktiivinen Gross-leukemian suhteen myös suun kautta annettuna ja sydämen suhteen suoritetussa esitoksisuusko-keessa C3H-hiirillä jatkuvasti i.v. annettuna se aiheutti vain hyvin pieniä sydänvaurioita. Yhdistettä Ia tutkittiin P388-leukemiasoluilla, jotka olivat resistenttejä doksorubi-siinin suhteen (P388/DX) in vitro ja in vivo. Doksorubisii-nille (DX) resistenttejä P388-leukemiasoluja (antanut tri. Schadel) pidetään yllä sarjasiirrolla hiirissä, joille on annettu yhdistettä DX i.p.. koetarkoituks e ssa CDF-1-hiiriin 4 injektoitiin 10 1eukemiaso 1ua i.p. ja ne käsiteltiin i.p. 1.

kasvaimen siirrostamisen jälkeisenä päivänä. Taulukossa 7 esitetyt tulokset osoittavat, että daunorubisiini (DNR) ei ollut aktiivinen tämän kasvaimen suhteen, kun taas yhdiste _____ - Γ“ 10 74977

Ia optimaalisena annoksena 0,8 mg/kg pidensi käsiteltyjen hiirien elinaikaa. P388- ja P388/DX-leukemiasolut otettiin talteen hiirten vesivatsanesteestä ja sovitettiin kasvamaan suspensiossa in vitro. Sytotoksisuuskokeet suoritettiin saattamalla solut alttiiksi 48 tunnin ajaksi erilaisille lääkekonsentraatioil le , solut laskettiin Coulter-solulaski-mella ja ID^-annokset (annos, joka vähentää solumäärää 50 % käsittelemättömiin verrokeihin verrattuna) laskettiin. Taulukossa 8 esitetyt tulokset osoittavat, että yhdiste Ia oli noin kaksi kertaa niin sytotoksinen kuin DNR P388-1 eukemia-solujen suhteen ja hyvin aktiivinen myös P338/DX-leukemiaso-lujen suhteen, kun taas DNR oli 163-152 kertaa vähemmän aktiivinen resitentin kuin sensitiivisen linjan suhteen.

Yhdiste Ie tutkittiin lisäksi nisäsyövän suhteen C3H-hiirii-lä. Hiiret, joilla oli mitattavissa oleva kasvain (3. sukupolven siirrännäinen), käsiteltiin kerran viikossa 4 viikon ajan i.v. yhdisteellä Ie tai yhdisteellä DX. Normaalit hiiret käsiteltiin rinnakaisesti toksisuuden arvioimistarkoi-tuksessa. Taulukossa 9 esitetyt tulokset osoittavat, että Ie oli noin 10 kertaa voimakkaampi kuin DX, ja sillä oli huomattava antitumorivaikutus tässä koejärjestelyssä myrkyttöminä annoksina, kun taas DX oli toksinen.

Koska yhdisteellä Ie oli hyv antitunorivaikutus nisäsyöpään, testattiin sen vaikutus kahden kiinteän kasvaiman, colon 26-ja colon 38-adenokarsinoman, suhteen, jotka oli siirrostettu s.c. BALB/c- ja BDF-1-hiiriin vastaavasti. Hoito aloitettiin 1. kasvaimen siirrostamisen (varhaisaste) jälkeisenä päivänä tai, kun kasvain oli jo käsin kosketeltava (kehittynyt pitkälle), ja toistettiin i.v. kerran viikossa tai joka 6. päivä 3 tai 4 kertaa. Kasvaimen kasvu todettiin mittaharpi1la mittaamalla.

Kasvaimettomat hiiret käsiteltiin rinnakkaisesti toksisuuden arvioimiseksi ja niitä arvioitiin 90 vuorokauden ajan. Koi- 11 74977 men kokeen tulokset on esitetty taulukossa 10. Varhaisen colon 26:n suhteen oli Ia :n suurin siedetty annos 0,9 m g / -kg/vrk aktiivisempi kuin DX suurimpana siedettynä annoksena 7,5 mg/kg/vrk. Pitkälle kehittyneen colon 26:n suhteen ei Ie suurimmalla koeannoksella 0,7 mg/kg/vrk ollut toksinen ja se inhiboi kasvaimen kasvua enmmän kuin DX, jonka suurin siedetty annos oli 6 mg/kg/vrk. Pitkälle kehittyneen colon 38 : n suhteen oli Ie suurimmalla koeannoksella 0,9 mg/kg/vrk yhtä aktiivinen kuin DX annoksena 9 mg/kg/vrk kasvaimen kasvun estämisessä, mutta yhdiste Ie pidensi e Los sapysymisaikaa .

Edellä olevista koetuloksista ilmenee, että yhdisteet Ia ja Ie ovat erittäin mielenkiintoisia uusia antrasykliinejä, joilla on suuri teho ja aktiivisuus suun kautta annettuina ja yhdiste Ia on aktiivinen antrasykliinille resistenttien kasvainten suhteen ja yhdiste Ie on aktiivisempi kiinteiden kasvainten suhteen kuin DX eikä Ie ole sydämeen kohdistuvasta toksinen.

TAULUKKO 1. Pesäkeinhibitiokoe Hela-soluilla in vitro (käsittelyaika 24 tuntia)

Yhdiste Annos ID

50 __ng/ml____(ng/ml) DNR 12,5 42 6,2 66 12 3.1 121

Ia 25 0 6.2 0 2,5 1.5 73 DX 12,5 20 6.2 79 9 3,1 177

Ie 10 0 2.5 9,9 1 0,62 82 _ 0,15__84__

Q

Pesäkkeiden lukumäärä: % käsittelemättömistä verrokkeista 12 74977 TAULUKKO 2. Antitumorivaikutus P 388-leukemian suhteen. Käsittely i.p. päivänä 1.

“3 H

Yhdiste Annos T/C LTS Myrkytyskuo- __(mg/kg ) %__lemia*"_ DNR 2,9 154 0/10 0/10 4,4 140,154 0/20 4/20 6.6 109,163 0/20 13/20

Ia 0,5 127 0/10 0/10 0,64 127 0/10 0/10 0,8 172,127 0/20 1/20 1.0 145 0/10 0/10 1,3 95 0/10 10/10 DX 4,4 180 0/10 0/10 6.6 200 2/10 0/10 10,O® 315 4/10 0/10

Ie 0,44 180 0/10 0/10 0,66 215 0/10 0/10 1.0 250 0/7 1/7 _ 1,5 245_ 2/10 4/10__ 3

Keskimääräinen elossapysymisaika ; % käsittelemättömistä verrokkeista b Pitkään elossa pysyneet ( 60 vrk) c

Arvioitu kuolleista hiiristä tehtyjen ruuminavaus 1öytyjen perusteella ^ Kahden kokeen tulokset 0 Tämä on yhdisteen DX suurin siedetty annos tässä koejärjestelmässä .

Il 13 74977 TAULUKKO 3. Yhdisteen Ia Gross-leukemian vastainen vaikutus _____Käsittely___

Anto- Aika- Yhdiste mg/kg/pvä Myrkytys- 3 b c tapa__taulu____T /C %__kuolemia i.v. 1 DNR 10 133,150 0/20 15 175,175,166 3/20 22,5 208,191,216 6/30 i.v 1 Ia 0,58 116 0/10 0,76 113 0/10 1.0 158,166 0/20 1,25-1,3 183,208 0/20 1,56 100 9/10 1,95 116 6/10 suun 1 1,1 133 0/10 kautta 1,25-1,3 133,166 1/20 1,56-1,6 166,166 3/20 1,95-2,0 175,183 2/20 suun 1 4-deme- 1,31 125 0,10 kautta toksi DMR 1,58-1,46 133,150 1/20 1,9 133,190 1/20 2,5 210 2/10 3,3 140 6/10 suun 1,2,3 Ia 0,44 133 0/9 kautta 0,66 183 0/10 1.0 200,220 9/20 ___ 1,25__140_ 8/10

Vuorokausia kasvaimen siirrostamisen jälkeen b’c Ks. taulukkoa 2 ___—--- - 1.

14 74977 TAULUKKO 4. Yhdisteen Ie Gross-leukemian vastainen vaikutus

Antotapa Yhdiste mg/kg T/Cb Myrkytyskuo- ____%__1 em i aC_ i . v .

DX 10 200 2/8 13 200,216 2/18 16,9 1250,266 '3/18

Ie 1,0 183,233 0/18 1,3 192,208 4/18 1.7 217,200 7/18 2,2 142 7/19 suun Ie 1,0 125 0/3 kautta 1,3 150 0/8 1.7 166 0/8 __ 2,5 166_ 0/8_ g

Yhtenä vuorokautena kasvaimen siirrostamis esta b,C Ks. taulukkoa 2 TAULUKKO 5. Yhdisteen Ie L1210-1eukemian vastainen vaikutus L1210 Myrkytys-

Siirroste Kas i ttely Yhdiste mg/kg T/C3 % LTSb kuolemia0 i.p. i.p. DX 4,4 150 0/9 0/9 6,6 150 0/10 0/10 10,0 162 10/10 1/10

Ie 0,83 162 2/10 0/10 1,0 187 1/10 1/10 1.2 393 4/10 3/10 i.v. DX 10,0 120 0/10 0/10 13,0 120 0/10 0/10 16,9 133 0/10 0/10

Ie 1,0 200 0/10 0/10 1.3 173 0/10 0/10 ____1,7 580 5/10 0/10 a , b , c

Ks . tauukkoa 2.

74977 15

I , ___ I

:3 -'CO

ό p in cm :ra

>1 4) CD I - (—I E

eo CPU p O O m p P “ Ο Ή cg h o m η ρ m

£ P > \ ^ C

s-ι ci in cm x o

0) P 3--- X

3 3 CD CO 3 0

3 E > - > X

m o e o i p oom \ •H P :3 <C - 0 3 :3 M P 33 ^ £ Ρ -X u X 3 >> \ \ :3 0 ecnCI'T OXC :3

p X ρ ——-I——>— - ' —- 3 E

Q 3 I 3 3 E 3 . ;> ρ p 33 eo 33 33 ^ μ p .x WC MOP I · \ · * ^ M3 3 33 3 33 C CM C C P 3> p

P 3 X X p 3 M

3 M--————————— _X 3 C

χ 3 O £ O £ CO CO —IX 3

p 3 \ | rj <3· CO <3" £ 3 P

3 P E-* p P p P p C C

> co - — . —- C 3 :3

P Op TJ

C 33 CJ 33 X >i

3 £ H «TC^’TincOP P JX M

c >> co in co oo oo

p S £ t, C

3 3 ————^—- U 3 p C C 0 3 33 CO 3 3 C > p 3 P > p \ 3

> P CO 3 3 C

3 3 £ Λ > 3 ePP-xa* co-pp

:3 In 3 C 3 X P

>3 C C C 3JCU0

:0 > P 3 3 E > P

>, pec eo £ eo p c — c COM £ p p 1010)100005 33 3 :3 3 3E > E 3 3 CO 3 P > >> Μ Ρ X >

P (0 3 CO P 3 3 P

CPM3M 4£>3p

1 M P X 3 \ M M

XX p — .......- — - ' :3 3 p C

CO O p e C X E

OP 3 3 3 :3 >> 3 « EEä^ >CMP03

3 3 P P P 3 >5 P P P

M> 333 ΐηοΟΓ^Ο^ίΌ· :3Pa3EM

3 >>> <T P C^ «T 00 aC33E3 CP cncocn oooocmc^c^co ρ m .x 3 m

3M 333 ^ P · Ρ M O .X P

3 Ρ X X JC CO £ O C E

p -a - - - 'j p 0 11 3

M £ C 3 3 P

HO :3 O 3 > > P

•a x > c c 0 £ a P 3 3 O p >. c \ m 3 p c 0) * t.

3 ofl m ^ io h app C3 3 P ...» 3 :3 333 • E \ liOf-OOO C 33 C P C >

CO 00 3 P :3 P P

ε E Ο :3 O 3 II

O--- £ S CP

X 3 3 '—1 P C 3 O

X P >1X3 X W M O M > II * J p X 3 3 O 3 3 :ffl

X 33 IQP X Ρ X X < C

< £ E-> >* 3 £ O 33 3

___ - TT

16 74977 TAULUKKO 7. Vaikutus doksorubisiini11e resistenttiin P388-leukemiaan in vivo

Annos Myrkytyskuo-

Yhdiste (mg/kg) T/C3 % LTSfa_ 1e m i a C__ DNR 2,9 93 0/10 0/10 4,4 87 0/10 1/10 6,6 84 0/10 3/10

Ia 0,53 133 0/10 0/10 0,8 142 17/10 0/10 __1,2 106 0/10 4/10__ 3

Keskimääräinen elossapysymisaika; käsittelemättömistä ver-rokke ista ^ Pitkään elossa pysyneet ( 60 vrk) 0

Arvioitu kuolleista hiiristä tehtyjen ruuminavauslöytöjen perusteella TAULUKKO 8. Vaikutus sensitiiviseen ja doksorubisiini11 e resistenttiin P388-1eukemiaan in vitro ID50 (ng/ml)b

Yhdiste P388C P388/DX, R® 1 .......——— - -------- -... - .... - - ———d-- DNR 5.2, 2.3 950, 350 163, 152

Ia_ 0.35,1.3__1.4, 5_4,3.8 3

Kahden kokeen tulokset b Annos, joka saa aikaan 50 % vähenemisen solujen lukumäärässä verrattuna käsittelemättömiin verrokkeihin.

0 P388-leukemia-solut, jotka ovat resistenttejä DX:lle 6 P388/DX-solujen kohdalla saadun IDcrt-arvon ja P388-solujen 50 kohdalla saadun ID,, -arvon välinen suhde.

50 74977 17 s n i

—I

e c o a o o o c o x ^ *> x N N \ \

V C — > 3 C

e w c -H ··/] ¢13 1» $ -r* V r-H ~ > t- — r—< -1

73 "J Γ3 TJ

TJ — ^ a :ϋ JZ — Π3 :.T5 03 ;3 ~j = - - - --- ^ --4 •pH O Ji 5 O .·:

— V

/) 3 x

Ξ Ό — X

- 3 > -T; o .-4 C

- ^ ä« 'J x o -* -ho y

Oi E— -I a C ·Ή -1 p ή oi

3 Λ 3 -X

> JS a c •3 - jO ιΛ -P C i.

P U · · P V ii n r' 0' 3) C 0C '3 --i S > H '/1 — V O —i ^ S 'rl Λ S ·— —· t r—f .— CO .0 p :eo > ot tfl P 4-> 'Λ —i (0 4) jj 3j io > P >, Oi 73

Ha h ·-, c h o 0) c e :S JS x. Γ^ΓΜΙΠΟ PO) >, > s- ronto^j -p-η en :0 P -w Oi >> >> Q> en oi a tn en :co o eo :rc -H — X P en tn —i oo p tn h -h e E :co <u ^ o e 0) a> p > oi ~i EE to \ p a» C -h ή (0 4) O > ·

4) CO <0 O en C —' C CO

Ρ > > C -H h 4) a

P il SI -H Ή 00 CT) (M (O 4) to to C -P

H .3 to C0 if) CO o CM to E O. Oi -H 3

•H 1C Oi α Λ CM CM T OJ -h h :cfl .O

p — -! . ... . . ..-,-. -H C CO P cc

• > 4) tn :fl O

3C E -h :co p n co -h e s o P> 3 <0 >, -H ~ 3 p > en ot o > is p tn >> en o H· CC0 3 (0 a V -I o > Ή Oi 3 Oi en e a 3 en x 4) ^ oiccnc^c

4) Qfl 4) o 1S -H

p Oi if) e P —I P !0 h

en "v OuleOC^ OPUPotP

•h QO .... oi ·Η H —< ~| Ό e i co r> o o -h -h e h 3 h C -H a 4) JS «3 3 > > C -H Oi C h e E Oi

rH U :ea 4) >1 P

• ό p o tn 3 O' 3 3 :flj 3 >1 -p p p :3 ρ a 0 4) -HP g p 3 ;3 ot p o 4s -h 4) en h 01 en -HTSOiOenp

3 H I > H tn H O H

ή T3 P O 4) CO Ή —i 3 -C x 4> <ixes:<ui

<0 > Q PH

H (0 -O O Ό 4) 18 74977

Taulukko 10. Yhdisteiden Ie ja DX vaikutus kahteen siirrettyyn colon-adenokarsinoomaan hiirillä

Kasvain Vaihe3 Aika- Yhdiste Annos %C Esty- T / 0 ^ Myrkytys k uo- ___taulu _________ m g / kg ti i n e n %__1 em i a

Colon 26 varh. q7dx4 DX 6 56 217 0/10 7,5 32 224 0/10 '3,1 3 1 161 9/10

Ie 0,6 31 253 0/ 10 0,75 35 227 0/10 0,9 93 246 1/10 kehitt. q 6 d x 3 DX 6 34 237 0/9 9 62 237 4=9

Ie 0,6 48 222 0/9 0,7 52 195 9/9

Colon 38 kehitt. q7dx4 DX 6 65 92 0/10 9 83 144 1/10

Ie 0,6 55 133 0/10 0,75 60 129 0/10 _____0,9 81_ 184 0/10__ a Käsittelyn aloitusaika kasvaimen kehitysasteeseen verrattuna ^ i.v. annon päivät c Kasvaimen kasvun estyminen (%) verrattuna käsittelemättömiin verrokkeihin.

^ Käsiteltyjen hiirien keskimääräinen elossapysymisaika/verrokkien keskimääräinen elossapysymisaika x 100.

e Kasvaimettomien, rinnakkaisesti käsiteltyjen hiirten arviointi ja havainnointi 90 vrk ajan

Claims (3)

19 PATENTTIVAATIMUS 74977 Analogiamenetelmä kaavan I mukaisten terapeuttisesti vaikuttavien antrasykliiniglykosidien valmistamiseksi

0 OH ,? CH'X

0 OH \ > (I) CH3T^—O W NH ·HC1 och3 jossa X on vety tai hydroksi, tunnettu siitä, että 4-demetoksi-daunomysinoni saatetaan vedettömään metyleenidi-kloridiin liuotettuna reagoimaan huoneen lämpötilassa 2,3,6-trideoksi-3-trifluoriasetamido-4-0-metyyli-L-lykso-heksapyra-nosyylikloridin kanssa hopeatrif1uorimetaanisulfonaatin ja molekyyliseulan läsnäollessa niin, että saadaan vastaava N-trifluoniasetyy1isuojattu -glykosidi, ja poistetaan N-trif1uoriasetyy1isuojaryhmä miedosti emäksisellä hydrolyy-sillä käyttämällä natriumhydroksidin 0,2 N vesiliuosta, jolloin saadaan kaavan I mukainen daunorubisiinijohdannainen (X=H) vapaana emäksenä, jota kloroformiin liuotettuna käsitellään kloorivedyn 0,1 N metanoliliuoksella niin, että saadaan vastaava hydrokloridi, joka haluttaessa lopuksi muutetaan bromikäsittelyllä kloroformissa ja saadun 14-bromijoh-dannaisen hydrolyysi1lä huoneen lämpötilassa natriumformiaa-tin vesiliuoksella kaavan I mukaiseksi doksorubisiinijohdan-naiseksi (X=0H), joka on vapaana emäksenä ja muutetaan vastaavaksi hydrokloridiksi. __-· 77“ 20 PATEN TKR AV 7 4 9 7 7