SK407392A3 - Bank of oligomers - Google Patents

Bank of oligomers Download PDF

Info

Publication number
SK407392A3
SK407392A3 SK4073-92A SK407392A SK407392A3 SK 407392 A3 SK407392 A3 SK 407392A3 SK 407392 A SK407392 A SK 407392A SK 407392 A3 SK407392 A3 SK 407392A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
peptide
bio
chain
amino acids
oligomer
Prior art date
Application number
SK4073-92A
Other languages
English (en)
Other versions
SK281490B6 (sk
Inventor
Kitsang Lam
Sydney E Salmon
Viktor J Hruby
Evan M Hersh
Fahrad Al-Obeidi
Original Assignee
Bioligand Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioligand Inc filed Critical Bioligand Inc
Publication of SK407392A3 publication Critical patent/SK407392A3/sk
Publication of SK281490B6 publication Critical patent/SK281490B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/70—Enkephalins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/817—Entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Banka oligomerú
C’o L a s t t schni ky
Vynález ss tyká banky oligomerú na pevném nosiči, v níž je každý pevný nosič spojen s jediným typem bio-oligomeru a v bance jsou uložený všechny existující kombinace monomerních podjednotek. Bio-oligomerem podie vynálezu múže ’oýt peptid, oligonekleotid nebo chimérní konstrukce peptid-oligonukleotid. Vynález se rovnež týká zpúsobu výroby taková banky. Predmetem vynálezu je rovnež zpúsob použití bio-oligcmerú v bance k identifikaci a c’narakterizaci ligandú, schopných vázat molekulu akceptoru nebo zprostredkovat požadovanou biologickou účinnost. Bio-oligomery banky mohou rovnež katalyzovat chemické reakce.
2. Dosavadní stav techniky
Rozpoznávaní a vazba ligandú rídí téme? všechny biologické pochody, napríklad rozpoznaní imunologického popudu, bunečné signály a komunikace, intracelulární signál a katalyza,tj. enzymatické reakce. V oboru dlouho pretrváva zajem identifikovať molekuly, púsobící jako látky, schopné agonistické reakce nebo antagonismu účinnosti ligandú, napríklad hormonú, rústových faktorú a nervových prenašečú, múže také jít o látky, indukující 3-buňky (zprostredkování protilátkou), nebo T-buňky (bunečná cesta) pri imunologické odpovedi, dále. o látky, katalyzující chemické reakce nebc rídící expresi génu na úrovni .transkripce nebo translace.
Zvlášte zajímavé jsou ligandy typu bílkovin nebo peptidú. Jde o vštšinu hormonú, rústových faktorú, neuroaktivních molekúl a imunologickýxh epitopú. Mimoto, jak bude dále podrobnej! diskutováno, vštšina snáh vytvoriť agonisty nebo antagonisty biologické účinnosti, zprostredkované recep2 i Ä. - «* . -s,Aj tory, se soustredila na peptídy. Vývoj redku, které by byly kličovými látkami pre místa väzby na receptorech však byl do značné míny brzdén obtížemi pri stanovení ňetézce peptidových ligandu. Nesmírný počet téchto peptidových ŕetšzcú zpúsobil, že tento cíl je nedosažitelný jakýmkoliv jiným zpúsobem než prácnou izolací špecifického komplexu, identifikací uložení epitopu a analýzou jeho ňetezce. Problém je dále komplikován tím, že epitopy jsou tvcrenv retézcem aminokyselín, který se v primárním ŕetézci nepňenáší.
Nekterí výzkumní pracovníci v oboru se pokouseli obejím tento rpacný pochod stanovením retézce aminokyselín v proteínu na základe odpovídajícího oligonukleotidového ňetezce. Proteiny jsou velké peptičy, sestávající z aminokyselín. Každá aminokyselina je kótíována jedním nebo vétším pcčtem kodonú, které jsou tvorený vždy tremi zbytky nukleových kyselín. Napríklad peptid A, obsahující aminokyselinu glutamin, bude kódován kodonem tri nukleových kyselín: cytosin, adenin a guanin. Komplementem pro tento kodon by byl guanín, který se váze na cytosin, thymin, který se váze na adenin a cytosin, tento kodon by byl kódem pro peptid 5. Na základé teórie komplementarity by se peptid 3 vázal na peptid A. V publikaci Bost a Blalock, 1989, Methods in Enzymology, 15S: 16-28 se uvádí, že pravdépodovne jakýkoliv peptid se bude vázat najiný peptid, který je kódován komplementárnom retézcem zbytku nukleových kyselín. Na základe tétc informace tylo možno predpovédet retezec aminokyselín komplemer.tárního necti du. Autori použitli uvedený retezec k syntéze peptidu s ke zkouškám jeho schopnosti väzby.
Tento postup však nevyrešil svrchu uvedený problém, protože afinita väzby mezi komplementárnymi pectidy byla otec né velmi nízká a bylo zapotŕe’oí komplementárních peptidu delších než 15 zbytku. Mimoto tento prístup vyžaduje znalost buď ňetézce aminokyselín nebo ňetezce nukleových kyselín pňíslušné bílkoviny nebo jejího väzného tento postup použitelný pro epitopy, selin. které se nepŕenášeji v primám partne tvoŕen ra ΤΑ. Minoto není .zbytky aminokyt C Í .
V poslední dobe se objevilo nekolík zpráv o príprave bank peptidu a jejich použití pri identifikaci peptidových ligandu, které se mohou vázat na akceptory. Pri jednom z techto postupu bylo použito rekombinantního bakteriofágu pro získaní velkých bank. Pri použití fágové metódy (Scott a Smith, 1990, Science 249:386-390, Cwirla a další, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6373-6382, Devlin a další, 1990, Science 249: 404-406) je možno získat velké banky (10®- 10° jedinou v chemickém smyslu), avšak genetický kód a.biologický systém tyto systémy podstatné omezují, pokud jde o jejich využití. Pri dalším prístupu byiy užitý predevším chemické metódy, jako príklad je možno uvést Geysenovu metódu (Geysen a další, 1986, Molecular Immunology 23:709-715, Geysen a další, 1987, J. Immunologic Method 102:259-274) a v nejnovéjší dobe metódu Fodora a dalších (1991, Science 251, 767-773).
Pri použití methody Geysena a dalších je možno synthetizovat omezené množství peptidu (10 - 10 ) na polyethylenovém nosiči v prúbehu nekolika dnu. Pri postupu podie Fodora a dalších se využíva svétlem smerované prostorove cílené paralelní chemické syntézy. Tento postup je rovnéž omezen relatívni nevývinutostí fotochemické syntézy peptidu.
Byla také vyvinutá paralelní syntéze peptidu ve velkém méŕítku. Koughton podáva zprávu o syntéze stovsk analogických peptidu současné na polypropylenové síti (metóda čajových sáčku), postup byl popsán v Houghton, 1985, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135. Berg a další (1939, J. Amer. Chem. Soc. 111: 8024-8026) podali zprávu o novém nosiči na bazi. polyethylenového filmu s naroubovaným polystyrenem, který je vhodný k provádéní paralelní syntézy peptidu. Pri pro4 vádéní obou postupu bylo užito štandardní pryskyrice s Sccaminokyselinou a bežného postupu, spočívajícíhc v odstránení ochranné skupiny, neutralizaci, vaz’oé a premývaní pevné fáze zpusobem podie pu'olikace Marrifielč, J. Am. Chem. Soc. £3: 2149-2154, 1953.
Furka a další (1988, 14th International Congress of Biochemistry, Sv. 4, Abstrakt FR:O13) popsali postup pro výrobu smési peptidu oddeleným navázáním každé ze tri ruzných aminokyselín s následným smísením pryskyrice. Uvedený postup neposkytuje uspokojivou metódu pro izolaci požadovaného peptidu z velkého množství získaných peptidu.
Prestože beží o použitelný postup, dovoluji postupy podie Geysena, Fodora, Koughtona, 3erga a Furky se spolupracovníky syntézu a provádení zkoušek pouze v prípade nekolika set až nekolika tisíc peptidú současné. Jde tedy o velmi omezené postupy vzhledem k milionúm možných peptidových ŕetezcu, z nichž alespoň jeden by mohl odpovídat väzným místúm pro zkoumané látky. Vzhledem k existenci 20 známych bežných 5 aminokyselín je v retezci peti aminokyselín 20 nebo pribliz3,2 x 10 možných kombinací aminokyselín. Zádný ze svrchu· uvedených postupu neumožňuje syntézu tak velkého množství peptidu současné. K dalšímu zmnožení možných peptidu dochází, bere-li se v úvahu možnost ruzné délky retézce. Je tedy zrejmé, že bežná syntéze peptidu, tak jak byla shrnuta v publíkaci Stewart a Young, 1984, Solič Phase Synthesis, 2. vydání, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) není metodou, jíž by bylo možno současné získat tisíce až milióny peptidu současné.
Mimoto žádná z dosuč známých metód pro syntézu peptídu neumožňuje syntézu banky peptidu, vázané na pevnou podložku ve skutečné nahodilšm uspoŕádání. Peptidová banka se skutečné nahodilým uspoŕádáním musí mít dobrou štatistickou distribuci všech typu prítomných molekúl tak, aby banka obsahovala všschny typy prítomných peptidových ŕ blížne ekvimolárním množství.
Syntézu skutečne nahodilých peptidu tbvykle není ložno uskutečnít za současného pridaní ruznvzh anínckvselin čo jediné reakční nádoby vzhledem k tomu, že se rychlost väzby jednotlivých aminokyselín od sebe nesmime líši pri syntéze peptidu v pevné fázi SPPS (Ragnarson a další, Acta Chem. Scanč. 25:1487, 1489, Ragnarson a další, 1974, J. Org. Chem.
39:3837-3842). Napríklad rychlost väzby Fmoc-glycinu na tvorící se peptid je čaleko vétší než rychlost väzby Fmoc-valínu, pravdepodobne v dusledku sterické zábrany, které je zpusc’oena velkým postranním retézcem valinu-.-V prípade smisení všech 20 aktivovaných eukaryotických L-aminokyselin s pryskyricí v prubéhu každého cyklu väzby by doško k prednestnímu zarazení nejrychleji reagujících aminokyselín do peptidu a nebylo by možno získat ekvimolárni množství každého typu peptidu. Mimoto by mél každý z možných nukleofilú odlišnou reaktivitu.
Mimoto také žádný z postupu, dosud známých pro syntézu peptidu nemuže poskytnout banku o více než 10' peptidech tak, aby vždy jeden typ peptidu byl vázán na jeden typ pevné fáze. V prípade, že by toho bylo možno dosáhnout, byle by také možno daleko snáze od sebe izolovat jednotlivé peptidy.
Je tedy zrejmé, že by bylo zaptrebí získat banku peptičových retezcu se skutečne nahodilým rozdelením a banku oligonukleotidových retezcu, tj. bio-oligomerú, z níž je možno snadno a rýchle izolovat jeden z retezcu od retezcu oscatních. Bylo by rovnéž zapotŕebí navrhnout postup, jímž by bylo možno rýchle a levné synthetizovat tisíce až milióny téchto skutečne náhodne distribuovaných retezcu bio-oligomerú.
3. Počstata vynálezu
Podstatu vyňal merú) , obsahující všechny možné kombinace tatu vynálezu tvorí rovnež zpusob získaní zpusob jejího použití.
podjed takové otek. banky
Vynález spočivá predavším ve zpúsobu prípravy banky svrchu uvedeného typu, který spočivá v tom, že se opakuj í stupne, pri nichž se získají alespoň dva podíly pevné fáze (nosiče), k temto podílúm pevné fáze se pridá skupina podjed notek, tyto podjednotky se úplne váži na v podstate všechna väzná místa pevné fáze za vzniku komibnace pevné fáze a nové podjednotky, , prokáže se úplnost väzby a v prípade se reakce doplní, podíly kom'oinací pevné fáze a nové podjednotky se dôkladné promísí a po opakování svrchu uvedených stupňu v príslušném počtu se odstráni ochranné skupiny tak, že biooligomer zústane vázán na pevnou fázi. V jednom z provedení postupu múže být podjednotkou aminokyselina a bio-oligomerem múže být peptid. V dalším možném provedení múže být pcdjednotkou nukleosid a bio-oligomerem múže být oligonukleotid V ješté dalším možném provedení je nukleosidem kyselina deoxyribonukleová. V jiném provedení je nukleosidem kyselina ribonukkleová. V dalším provedení múže být podjednotkou amin kyselina a bio-oligomerem múže být peptit, nebo je podjedr.ot kou nukleosid a bio-oligomerem chimérní oligonukleotid.
Podstatu vynálezu tvorí také zpúsob stanovení retézce bio-oligomerního ligandu pro akceptorovou molekulu, který spočivá v tom, že sse vytvorí banka oligomerú s nahcdi lým usporádáním, vázaná na pevné fáze, pŕičemž každý typ pev né fáze je vázán na jediný typ bio-oligomeru a banka obsahuj všechny možné kom'oinace mcnomerních podjednotek, z nichž je oligomer vytvoňen, k této bance s nahodilým usporádáním bit7 oligomerú se pridá molekula zkoumar.ého akceptoru nebo substrátu, takže tato molekula akceptoru rozpozná a bude se vázat na jeden nebo vetší počet typu pevné fáze s bio-oligomerem v bance nebo se uvedená molekula substrátu účastní chemické reakce, katalyzované jedním nebo vétšírn počtem typu bio-oligomeru na pevné fázi v bance, izoluje se kombinace pevné fáze a bio-oligomeru, která má požadované vlastnosti a analyzuje se retezec bio-oligomeru v izolované kombinaci pevné fáze a bio-oligomeru. V jiném provedení se postupuje tak, že se část bio-oligomeru uvolní z kombinace pevné fáze a oligomerú in situ a in situ se také stanoví biologická účinnost. V jednom z možných provedení je bio-oligomerem peptid. V dalším možném prevedení je bio-oligomerem oligonukleotid, zejména DNA nebo RNA. V ješté dalším možném provedení je bio-oligomerem chimérní peptid/oligonukleotid.
Podtsatu vynálezu tvorí rovnéž prostŕedky pro diagnostické a léčebné použití, které obsahují retezce bío-oligo· meru, identifikované svrchu uvedenými postupy.
4. Popis výkresu
Na obr. 1 je znázorneno schéma syntézy peptidu s nahodilým rozložením s použitím syntézy, probíhající po jednotlivých stupních, synthetizuje se tripeptia s navázaným terminálním zbytkem tryptofanu: X-X-X-W (kde X znamená S, A τ nebo V), celkové množstvi možností je 3^, tj. 27.
Na obr. 2 je schematicky znázornená rada cyklických peptidu. n=0, 1, 2, 3..... a m = 1, 2, 3,..... pŕičemž n a m mohou být stejné, avšak nemusí. Plné čáry označují väzby lineárního peptidu, prerušené označují pŕíčné väzby. Páry špecifických podjednotek, mezi nimiž mohou vznikat pŕíčné väzby jsou označený A a B. Zesítení muže vznikat pouze mezi dvema jednotkami A nebo pouze mezi dvéma jednotkami S. Na obr. 2a) je znázornén tak zvaný košíkový motív, na,obr. 2 b motív žebríku a na obr. 2c motív lasa.
Na obr. .3 jsou znázornený chromatogramy (C^g, reve.rsní fáze HPLC, Vydac) pro na'nodilé tetrapeptídy (X-X-X-W, kde X = S, A nebo V), synthetizované A) novým postupem a B) obvyklou syntézou peptidu na pevné fázi. Chromatogram byl získán elucí sloupce pri použití lineárního gradientu acetonitrilu. Rozpouštedlo A: 0,1% kyselina trifluoroctová a 5% acetonitril, rozpouštedlo B: 0,1% kyselina trifluoroctová a 100% acetonitril.
Na obr. 4 je znázornená fotografie peptidu na částicíc'n nosiče ( dlouhé v-mos), značených protilátkou antimos a sekundárni protilátkou.
Na obr. 5 je znázornená fotografie smési částic nosiče (dlouhé v-mos a krátke v-mos) po značení protilátkou anti-v-mos a sekundárni protilátkou.
Na obr. 6 je znázornená obdobná smšs. jako na obr.
5, značená protilátkou proti v-mos a sekundárni protilátkou.
Na obr. 7 je znázornená mikrofotografie typického peptidového lidandu v bance, v níž je možno positivní nosič (zbarvený temné modré) snadno odlišit od pozadí, obsahujícího mnoho tisíc negativních (bezbarvých) částic nosiče.
Na obr. 8 je znázornená mikrofotografie, znázorňující na koncentraci závislý inhibiční účínek biotínu na barvení částic pryskyŕice LHPQF kombir.ací screptavidinu a alkalické fosfatázy. A: 100 nM, 3: 10 nM, C; 1 nM, D: 0,1 nM biotínu. Prázdne částice (pryskyŕice - kyselina B-Ala-aminokapronová) byly smíseny 1:1 s pryskyŕicí LHPQFD pred inkubací s kombinací streptavidinu a alkalické íosfatázy jako vnit ní kontrola.
5. Podrobný popis jednotlivých provedení
V dalších odstavcích budou podrobneji objasnená jed notlivá výhodná provedení vynálezu.
Tak je zde používán, pojem banka znamená sestavu v podstate nahodilých bio-oligomerú. Pod pojmem bio-oligomer se rozumí polymér s mene než 100 podjednotkami. Muže jít o peptid, tvorený podjednotkami aminokyselín, nebo o polynukleotid z nukleosidových podjednotek, nebo o chimérní peptid-oligonukleotid.
5.1. Zpúsob tvorby banky nahodilých bio-oligomerú
Jak již bylo uvečeno, vynález se týka zpúsobu vytvárení banky bio-oligomerú tak, že se tyto oligomery synthe tizují z nahodilých retezcú monomerních podjednotek. Pod tímto pojmem se rozumí retezce, v nichž múze kterákoliv mono merní podjednotka následovat za jakoukoliv jínou monomerní podjednotkou nebo j i múze pŕedcházet.·
V jednom z možných provedení múze být monomerní pod jednotkou aminokyselina, její analóg nebo molekula, podobná . peptidu, čímž se rozumí molekula, která štruktúrne a chemick peptid napodobuje , a je složena ze dvou nebo vetšího počtu zbytku aminokyselín. V jiném provedení múze být podjednotkou nukleosid, a to kyselina ribonukleová nebo desoxyribonukleov V ješte dalším provedení mohou být podjednotkami aminokyseli ny a nukleosidy. Bio-oligomerem muže být peptid, obsahující aminokyseliny, RNA-oligonukleotid, obsahující ribonukleosidy DNA-oligonukleotid, obsahující deoxyribonukleosidy, DNA-RNA- 10 chimérní oligonukleotid nebo chimérní peptid.oligonuklectid. 3anka s obsahem peptidu, oligonukleotidu nebo chimérních pep< tič-oligonukleotidu muže být získár.a tek, že se opakují následující stupne:
i) pripraví se alespoň dva podíly pevného nosiče pro nahodilé retézce podjednotek, ii) oddelene se privedou skupiny podjednotek k podí· lum pevného nosiče, iii) tyto podjednotky se úplné váži na v podstate všechna väzná místa pevného nosiče za vzniku nové kombinace pevného nosiče a nové podjednotky, iv) prokáže se úplnost väzby a v prípade potreby se zajistí dovŕšení reakce,
v) dôkladne se promísí podíly pevného kombinaci pevného nosiče a nové podjednotky, a pak se opakují stupne i) až v) v požadovaném počtu opaková ní, v konečném stupni vi) se pak odstráni ochranné skupiny, pŕičemž bio-oligomer zústává vázán na pevný nosič.
V dalším provedení je možno banku nahodilých biooligomeru pripraviť tak, že se v alespoň jednom stupni váze tatáž podjednotka na všechny typy pevného nosiče a v alespoň jednom dalším stupni se na tento pevný nosič váži alespoň dve podjednotky. Banka bio-oligomeru múže být pripravená jed ním opakováním stupňl i) až v) svrchu, v jiném provedení více než jedním opakováním stupňu i) až v). Pevný nosič je možno pripraviť s již navázanou jednou jednotkou nebo vétším počtém jednotek.
Banka oligomerú muže být tvorená pŕedem stanoveným omezeným počtém podjednotek. V jiném provedení muže být tvorená všemi dostupnými podjednotkami.
:ό-.11
V dalším provečení je možno idenťifikovat bio-oligomer tak, že se nejprve pripraví banka a identifikuje se retezec bio-oligomeru, který má požadované vlastnosti. Pripraví se pevný nosič s takto identifikovaným bio-oligomerem. K identifikovanému ŕetézci se pridá nový segment monomerní podjednotky a identifkuje se nový retézec, obsahující známy retézec a nahodilý retezec, tento výsledný retézec má rovnéž požadované vlastnosti. Tímto zpúsobem je možno rýchle identifikovat požadovaný bio-oligomer.
Bio-oligomery, které banka obsahuje v ní mohou, ale nemusí být obsaženy v ekvimolárním množetví. Jak je všeobecné známo, molární množství je koncentrace, v níž se molekulová hmotnost, vyjádrená v gramech určité látky, rozpustí v rozpouštédle tak, že vznikne 1 litr roztoku. Pod pojmem ekvimolární se rozumí, že podjednotky jsou prítomný v približné stejné molární koncentraci. To znamená, že v prípade, že v bance s obsahem 150 000 bio-oligomeru je bio-oligomer A prítomen v množetví 200 pmol/1, mély by být také všechny ostatní bio-oligomery prítomný v koncentraci približné 200 pmol v 1 litru. Tento pojem však zahrnuje v sobé také heterogenitu pevných nosiču. Tato heterogenita ponékud mení skutečné množství bio-oligomeru a záleží také na tom, jaké množství oligomeru muže být vázáno ne určitý nosič.
Pri provádéní zpúsobu podie vynálezu se pripravují alespoň dva podíly pevného nosiče, pŕičemž počet téchto pevných nosiču s výhodou alespoň odpovídá počtu bio-oligomerú, které mají být synthetizovány. To dovoluje prípravu banky, v níž každý z pevných nosiču váze pouze jeden typ bío-oligomeru. Pod pojmem podíl se rozumí určitá frakce celého množství pevných nosiču.
5.2. Banky nahočilých peptidu nahodí lyc'n bioVe zvláštním provedení múže bank* oligomeru obsahovat peptidy. Pod pojmem peptid se rozumí v nejširším slova smyslu sloučenina, obsahující dve nebo vetší počet aminokyselín analogu aminokyselín nebo látek, peptidum podobných. Podjednotky nohou být vázány peptidovými väzbami. V jimén pnovedení však mohou být vázány také j inými vazbami, jako esterovými, étenovými a jinými vazbami. Pod pojmem aminokyselina se rozumí prírodní nebo neprírodní, napríklad synthetická aminokyselina včetne glycinu a D i Lisomeru, analogu aminokyselín a látek, podobných peptičum. Peptid o trech a vétším počtu aminokyselín jé obvykle označován jako oligopeptid v prípade, že je peptidový ŕetézec krátky. V prípade, že je ŕetézec dlouhý, užíva se obvykle názvu polypeptid nebo bílkovina.
Vynález je založen na synthetické chémii peptidu a nezávisí na žádném živém systému, pokud jde o amplífíkaci ne’oo analýzu. Peptidová banka múze obsahovat napŕírodní aminokyseliny. Peptidy podie vynálezu mohou tedy obsahovat Daminokyseliny, kombinace D- a L-aminokyselin a rúzné značkové aminokyseliny (napríklad beta-methylaminokyseliny, Calfa-methylaminokyseliny a N-alfa-methylaminokyseliny apod.) tak, aby peptidy v bance mély špecifické vlastnosti. Mimoto je_ možno pri použití špecifických aminokyselín v určitých väzných stupních pŕipravit peptidové banky s alfa-šroubcvnicí, beta-závitem, gamma-závitem a také cyklické peptidy.
Banka peptidu podie vynálezu obsahuje všechny možné kombinace aminokyselín, jimiž jsou peptidy tvorený. Napríklad v prípade dipeptidu pri použití aminokyselín glycinu a prolinu existují čtyŕi možnosti: glycin-glycin, glycin-prolin, prolin-glycin a prolin-prolin, banka nahcdilých peptidu bude obsahovat všechny tyto kombinace.
x j DO každého podílu pevného nosiče-se r.ejprve ociéiené pňivedcu první aminokyseliny. Obvykle jsou aminokyselinami, užitými pro syntézu peptidu v bazickém prostredí laciini na alfa-aminoskúpine chránené S-fiuorenylmechcxykarbonyl (Fmoc) aminokyseliny, poprvé pocsnaé v publikaoi Carpir.o· a Han, 1972, J. Org. Chem. 37: 3403-3409. ?ŕi prevážení zpúsobu podie vynálezu je rovnéž možno použít Boc-aninckyseliny (N-alfa-chránéné terc.-butyloxykarbonylovou skupinou), .'ak aminoskupiny, chránené na alfa-aminoskupinš skupinou Fmoc, tak ty, které jsou v téze poloze chránený skupinou 3cc je možno získat od Fluka, Sachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cam bridge Research Biochemícal, Bachem, nebo Peninsula Labs nebo i od jiných firem, zabývajúcich se tímto obcre.m. Mimcto je pri provádéní zpúso’ou podie vynálezu možno použít i amino kyselín, chránených na Ν'* í jir.ak, jak je v oberú všeobec né známo.
V prípade svrchu popsaného príkladu dipeptídu by tedy první skupina zavádéných aminokyselín obsahovala giycin a prolin, každý podíl pevného nosiče by byl uveden do styku buď s N -Fmoc-glycinem nebo s Ν'* Fmoc-prolinem.
Tyto první aminokyselina se pak váži na pevný nosič tak, aby došlo k väzbe na v podstate všeohna väzná místa na pevném nosiči. To znamená, že je zapotrebí dovést väznou reakci až do konce bez chledu na rozdíly v rýchlosti väzby pro jednoptlivé aminokyseliny. Mimoto se aminokyseliny váži na v.podstate všechna väzná místa na pevném nosiči tak, že každý pevný nosič bude obsahovat v podstate pouze jeden typ peptidu. Úplnou väzbou vznikne kombinace pevného nosiče a první aminokyseliny. V prípade svrchu uvedeného dipeptídu pujde o kombinace nosič-glycin a nosič-prclin. nebo oaké častice ncsiče-glycin a částice-nosiče-prclin.
Väzbu aminokyselín je možne uskutečnií obvyklým zpusobem, tak jak bylo uvedeno napríklad v publikaci Stewart a Young, 1934, Solid Phase Synthesis, 2. vydaní, Pierce Chemical Co., Rockford, IL..Jak je odborníkúm známo, zahrnuje zpúsob syntézy peptidu na pevném nosiči postupné budovaní peptidu oč karboxylového nebo C-terminálního zakončení, na némž je C-terminální aminokyselina se svou alfa-arninoskupinou pripojená na pevný polymerni nosič. Alfa-aminoskupina je chránená a po ukončení syntézy je odštépena, načež se následující aminokyselina, rovnéž chránená, naváže peptidovou vaz'oou na alfa-aminoskupinu aminokyseliny, vázané na pevný nosič. Pak se opakuje cyklus deprotekce pŕedchozí aminokyseliny a navázání další aminokyseliny až do úplné dostavby peptidu. Jakékoliv reaktívni postranní retézce na.aminokyseline se chráni chemickými skupinami, které snesou väzbu a odstránení ochránné skupiny N , avšak je možno je odstrániť na konci syntézy.
Aby bylo možno navázat aminokyselinu, na'rostoucí retézec pri syntéze, je nutno karboxylovou skupinu chránené aminokyseliny aktivovať. Pri provádení zpúsobu podie vynálezu je možno užiť radu aktivačních postupu včetne napríklad vytvorení symetrického anhydridu (PSA), vytvorení smésného anhydridu (PMA), chloridu kyseliny, aktivního esteru a aktivace karboxylové kyseliny in situ, jak bylo popsáno v publikaci Fields and Moble, 1990, Solid Phase Peptide Synthesis. utilizing 9-f luo renylmethoxycar'oony 1 Amino Acids, Int. J. Pept. Protein aRes. 35:1501-214.
Použití Fmoc-aminokyselin je pouze jedním ze zpúsobú syntézy peptidú. Je možno použiť také Boc-aminckyse1iny, chránené terc.butyloxykarbonylovou skupinou pro prípravu banky peptidú, vázaných na pevný nosič (napr. C-eyse.n a další, 1987, J. Immunol. Methods 102:259-274).
Je nutno prokázat úplncst väzby. Obecné je známa rada testu, používaných k prukazu úplnosti réakce. jde napríklad o ninhydrinový (Kaiserúv) test, test s použitím kyseliny pikrové, 2,4,6-trinitrobenzensulfonové (TN3S), fluorescaminu a chloranilu, tyto testy jsou založený na reakci reakčního činidla s volnou aminokyselinou za vzniku chromoforní sloučeniny. V prípade, že se použijí iminokyseliny, napríklad Pro a Hyp, je výhodné použití isstinu podie svrchu uvedené publikace Fields a Noble. Kvantifikaci úplnosti reakce je možno sledovat v jejím prubéhu, napríklad podie PCT zverejnené patentové prihlášky W021/03485, Salisbury a další.
Pri syntéze Fmoc je výhodný Kaiserúv test. Pri jeho provádéní je možno vzorek z každé zkumavky zkoušet ninhydrinovým reakčním činidlera (Pierce Chemical) podie publikace Sarin a další, 1981, Anál. Biochem. 117: 147-157.
V prípade, že väzná reakce není zcela dovŕšená, je možno ji dovršit nékolika možnými známými zpúsoby, napríklad
a) druhou väzbou, pri níž se použije až petinásobného prebytku chránené aminokyseliny,
b) další väzbou pri použití dolišných nebo prídatných rozpouš tédel (napr. trifluorethanu) a
c) pridaním chaotropické soli, napríklad NaCIO^ nebo LiBr (Klis a Stewart, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and
Biology, Riviér .and Marshall eds., ESCOM Publ., str.904-905.
Po dvoršení väzné reakce se dúkladns promísí. podílv kombinaci pevného nosiče a první aminokyseliny. Tohoto dúklad· ného promísení je možno dosáhnout napríklad mísením v jediné reakční nádobe pomoci prctrepávání nebo míchadlem nebo jakýmkoliv bežným automatickým zarízením nebo také probúbláváním inertního plynu, napríklad dusíku nebo argónu.
Ιό
Výsledná smés se rozdelí které by v prípade, že mísení bylo sahovat v podstate stejná množství a první aminokyseliny. Napríklad v dipeptidu by každý podíl obsahoval ví kombinace častice nosiče-glycin alespoň do.dvou podílú, skutečné účinné, mely c'ckombinaoe pevného nosiče prípade svrchu uvedeného v podstate stejné množsta častice nosiče-prolin.
Ke každému podílu se pak oddelene pridá druhá skupina aminokyselín. Tato druhá skupina muže být tvorená
a) týmiž aminokyselinami jako v prvním prípade, tj. glycinem nebo prolinem,
b) odlišnými aminokyselinami, napríklad tryptofan nebo leucin
c) pouze jedním typem aminokyseliny, napríklad isoleucinemi
Stejné jako v prípade první skupiny aminokyselín se druhá skupina aminokyselín jednotlivé váže na kom’oinaci pevného nosiče a první aminokyseliny v každém z podílú'za vzniku peptidu, obsahujících první aminokyselinu a druhou aminokyselinu. Stejné jako v první väzbe je možno väzby dosah nout jakýmkoliv známym zpúsobem. Na príkladu svrchu uvedeného dipeptidu múze jít o následující prípady:
a) v prípade pridání týchž aminokyselín je výsledným peptidem buď glycin-glycin, glycin-prolin, prolin-glycir. nebo prolin-prolin,
b) pri pridání odlišných aminokyselín je výsledným peptidem Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Ťrp nebo Pro-Leu a
c) pri pridání jednoho typu aminokyseliny je výsledným peptidem Gly-Ile nebo Pro-Ile.
Tento postup je možno opakovat mnohokrát, pokud jsou k disposici aminokyseliny, které je možno pridávať. V prípade, že má být získán tetrapeptid X-X-X-Trp, kde X znamená valin, serin, nebo alanin, je napríklad postup možno opakovat trikrát za vzniku tetrapeptidu X-X-X-Trp. Pri prvním, druhém a tretím pridaní aminokyselín je možno k podílu nosiče pridat buď Na^ta-Fmoc valin, N^^Fmoc serin (O-Bu)·, nebo Malf>a-Fmoc alanin za vzniku 27 rúznýoh peptidu v približné ekvimolárních množstvích (Obr. 1). V prípade, že je požadován hexapeptid, opakuje se postup šestkrát. V prípade, že hexapeptid má být tvoren péti aminokyselinami, je možno postup provést s péti podíly, z nichž každý obsahuje rúznou aminokyselinu v každém vazném stupni. Avšak v prípade, že hexapeptid má být vytvoŕen z jakýchkoliv ze záklačních dvaceti aminokyselín, bylo-by možno postup provádet pri použití dvaceti podílu v každém vazném stuoni.
Zpúsob syntézy pepticú podie vynálezu je možno provést pri použití nosiče, k nemuž aminokyselina již je nebo ješté není vázána. Mimoto je možno použít väzný ŕetézec, který již byl navázán na nosič. Jedním z bežných nosiču, na némž již je aminokyselina vázána je beta-alanin-PAM-pryskyŕice (Bachem Biochemical). Tyto pryskyŕice jsou dodávaný z mnohá komerčních zdroju nebo se vyrábéjí v v laboratoŕi.
V prípade, že se jako počáteční materiál použije kombinace nosiče a aminokyseliny nebo kombinace nosiče a väzné látky,, rozdelí se tento materiál na dva podíly nebo alespoň dva podíly, z nichž ke každému se pridá aminokyselina z první skupiny aminokyselín. Jak již bylo uvedeno, je zapotŕebí vázat tuto aminokyselinu na vše.chna väzná místa na kombinaci pevného nosiče a aminokyseliny nebo pevného nosiče a väzné látky a podíly, obsahující tuto nové pridanou aminokyselinu se dúkladne promísí. Jak již bylo svrchu popsáno, smés se rozdelí na alespoň dva podíly, z nichž se ke každému pridá aminokyselina ze druhé skupiny a väzná reakce.se opakuje, čímž vzniká rostoucí peptid. Jak již bylo svrchu uvedeno, postup je možno opakovat tolikrát, kolikrát je požadováno pro vznik požadovaného peptidu.
Uvedený postup je možno použít pro syntézu nahodilých peptidu stejne jako pro syntézu peptidové banky, obsahující predem stanovené retezce. Syntéza predem stanovených retézcú v sobe zahrnuje použití špecifických Na“ia-Boc, alfa
N -Fmoc nebo jiných príslušné chránených aminokyselín.
Je napríklad možno volit ve špecifických stupních väzby aminokyseliny tak, aby výsledný peptid mél určitou pravdepodobnosť nebo aby prednostné vznikla určitá sekundárni štruktúra, napríklad beta-ŕetézec, alfa-helix, beta-závit spod. Napríklad alfa-helix se jako prednostní štruktúra vývine v prípade, že se jako aminokyseliny prednostné použijí C-lu, Ala, Leu,
His, Trp. Beta-retézce vznikaj í pri pŕevážném použití aminokyselín Val, íle, Tyr a Met. V prípade, že se užijí pŕevážné aminokyseliny Gly, Asn, Ser, Pro a Asp, vzniká velká pravdepodobnosť beta-závitu. Je možno uvést ješté cialší príklady, napríklad aminokyseliny kyselé povahy v blízkosti N-terminálního zakončení a bázické aminokyseliny v blízkosti C-termi- . nálního zakončení stabilizuj! alfa-helix.D-aminokyseliny mohou stabilizovať nékteré závity, mimoto je možno včleniť ješté radu dalších strukturníc'n prvku, jak bude dále uvedeno v odstavcích 5.2.1 a 5.2.2. Muže být dokonce pripravená i banka cyklických peptidu s difulfidovýmí, laktamovými, laktono vými skupinami nebo jinými skupinami, uzavírajícími kruh, jak bude dále uvedeno v odstave i 5.2.1.
Je nutno zduraznit, že zpuso’oem podie vynálezu je možno získať peptidy tak, že každý nosič, népríklad částice pryskyrice, bude obsahovať pouze jeden typ peptidu. Zpusob zajistí, ež každá jednotlivá částice pryskyrice se dosatne do styku pouze s jednou Fmoc-aminokyselinou v prúbéhu každého stupne väzby a že tato reakce bude dovedená do konce. Tímto zpúsobem vzrustá možnosť, oddeliť s vysokou citlivostí a účinností peptid, který je špecifický pro určitou látku, na niž se váže.
Zpúsob podie vynálezu dovoluje syntézu banky nahodí»9 7 ’ lých peptidú, cbsahující 10 až 10 rúznýoh druhú peptidú,.
V jednom z možných prevedení mchou peptidy určité banky napríklad obsahovat na C-terinální-. zakončení zvláštni aminokysleinu, která v postrannom retezci obsahuje C02H nebo COHNg, takže simuluje volný glycin nebo glycir.amidovou skupinu. Ďalší cestou ke vzniku tohoto zvlástního zbýtku je použití analogu D- nebo L-aminokyselíny s postranním ŕetézcem, tvoŕícím väzbu k částici pryskyrice. V jednom z možných provedení múze mít zdanlivé volný C-termínáiní zbytek otpickou konfiguraci D nebo L. V jiném možném provedení je možno pou· · T ..f žít racemickou smes D- a L-ísomerú.
V dalším možném provedení je možno jako N-terminální zbytek peptidu banky použit pyroglutamát. Prestože pyroglutamát není možno prokázat pri analýze Zemanovou degradací, což omezuje substituci na 50 % peptidú na čar.ém nosiči N-terminál ním pyroglutamátem, zbývá ješté dostatečné množstvi peptidú bez pyroglutamátu pro analýzu retezce. Je-zrejmé, že tuto techniku by bylo monžo použit pro analýzu jakéhekoliv peptidu s obsahem zbytku, odolného pri Zdmanové degradaci na N-terminálním zakončení. Ďalší postupy pro stanovení vlastností jednotlivých peptidú s požadovaným účir.kem fcudou dále podrobnej! uvedený. Špecifická účinnost peptidu, obsahujícího chránenou N-terminální skupinu, napríklad pyroglutamát, v 50 % peptidú by se ihned prokázala srovnáním účinnosti peptidu, blokovaného na 100 % s neblokovaným (0 %) peptidem.
V dalším možném provedení je možno volit podjednotky peptidú, které jsou príčinou vzniku užitečných chemiských nebo strukturních vlastností. Napríklad peptidy, obsahujici D-aminokyseliny budou in vivo cdolr.é proti pusobení proteáz, špecifických pro L-aminokyseliny. Nimoto poskytuje zpúsob podie vynálezu možnost prípravy bar.k peptidú s Lepe defino20 vanými strukturními vlastnostmi a pri použití látek, podobných peptidúm a jejich vazeb, napríklad escerových vazeb, je možno pripraví t banky s novými vlastnoscmi. V dalším možném provedení je možno vytvorit banku peptidu, cbsahující redukovanou peptidovou väzbu, tj. , kde R^ a R2 jsou zbytky nebo retézce aminokyselín. Redukovanou peptidovou väzbu je možno zavést jako dipeptidovou podjednotku. Tako vá molekula pak bude odolná proti hydrolyze peptidové väzby, napríklad proti púsobení proteáz. Banky tohoto typu by posky tovaly väzné látky s jedinečnnou funkcí a účinkem, napríklad s prodlouženým biologixkým poločasem vzhledem k odolnosti pro-t^m&Jgabe^^é.mtt'-'Odbourávání nebo s odolností proti púsobení proteáz. Mimoto je známo, že v určitých systémech mají peptidy podobného typu vyšší účinnost (Hrybý, 1982, Life Science 31:189-199, Hrubý a další, 1990, Biochem. J., 268:249262). Vynález poskytuje zpúsob získat peptidy s uvedenou väzbou, obsahující ve všech ostatních polohách zcela nahodilé retezce.
5.2.1. Usmernené a cyklické peptidy
Usmernené, cyklické nebo rigidizované peptidy je svrchu uvedeným zpúsobem rovnéž možno prípravit za predpokladu, že v alespoň dvou polohách retezce ve všech peptidech banky bude včlenená aminokyselina nebo analóg aminokyseliny, poskytující chemickou funkční skupinu, schopnou zesítení pro usmernení, cyklizaci nebo rigidizaci peptidu po zpracování ke vzniku zesítení. Cyklizace bude uprednostnená v prípade zarazení aminokyseliny, indukující vznik závitu, pŕikladem aminokyselín, schopných zpúsobit zesítení peptidu mohou být cysteín (zavzniku disulfidových mústkú), kyselina asparagová (za vzniku laktamu nebo laktonu) a chelatační sloučeniny, napríklad kyselina gamma-karboxylglutamová ÍG.la) (Bachem) . pro chelataci prechodného kovu s tvorbou zesítení. Chránenou kyselinu gamma-karboxylglutamovou ej možno pŕipravit tak, že se modifikuje syntéze, popsaná v pu'olikaci Zee-Cheng a další 1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94:1123-1132. Peptidovou knihovnu, v níž peptid obsahuje v retézci alespoň dve aminokyseliny, schopné zesíténí je možno zpreoovávat napríklad cxidací cysteinových zbytku za vzniku disulfidu nebo adicí kovového iontu za vzniku chelátu za současného zesítení peptidu a vzniku usmerneného, cyklického nebo rigidizovaného peptidu.
Vynález poskytuje soubor obecne rigidních motívu pro použití pri príprave bank podie vynálezu. V jednom z provedení, které je znázirnéno na obr. 2a dávají dva páry zbytku, schopných zesítení vznik košíku. Tento motív košíku muže mít své zvláštni použití jako katalytické místo. mimo väzné vlastnosti,, které jsou dusledkem této usmernené konfigurace. V dalším možném provedení vytváŕe j í dva z'oytky, schopné zesítení žebrík, tak jak je znázcrneno na obr. 2b. V prípade, že se v motívu žebríkustrídají D- a L- aminokyseliny, je možno pripravit peptid, v nemž všechny postranní retézce aminokyselín budou orientovaný srnérem k jednomu povrchu, tak jak tomu je napríklad u beta-konfigurace gramicidinu. Takový povrch muže potenciálne tvoŕit jedinečné kataly tické místo. V ješté dalším provedení je možno vytvorit jednoduchý motiv lasa, v nérnž dva zbytky vytváŕej í pričňou väzbu, tak jak' je zrejmé z obr. 2c. Kromé tvorby peptidové smyčky je možno dosáhnout také motívu kratšího lasa u usmerneného lineárního peptidu, čímž dôjde ke stabilizaci sekundárni štruktúry, napríklad alfa-helixu.
Je čále pravdepodobne možno vytvorit také mezipeptidové prične väzby, což vede k vytvorení rigidni peptidové matrice.
Vynález poskytuje stratégii k systematické príprave zesítení. Napríklad v prípade, že se čo peptičového ŕetéz ce zaradí čtari cysteinové zbytky, je možno použit rúzné ochranné skupiny (Hiskey, 1981 v The Peptides: Analysis, Synthesis, Siology, Vol. 3, Gross and Meienhofer eds., Academic Press, New York, str. 137 - 157, Ponsanti a další,
1990, Tetrahedron 45: 8255-8255). První pár cysteinových zbytku je možno zbavit ochranných skupín a oxidovat, pak je možno odstranit ochranné skupiny ze druhé dvojice zbytku a rovnéž je oxidovat. Tímto zpúsobem je možno vytvorit definovaný soubor disulfidových príčných vazeb. Je také do ŕetézce možno zaŕadit dvojici cysteinových zbytkú a dvojici chelačních analogu aminokyselín, takže pŕíčné väzby pak budou mít odlišnou chemickou povahu.
5.2.2. Neklasické aminokyseliny, které indukují usmernení štruktúry
Do banky nahodilých peptidú je možno zaŕadit také následující neklasické aminokysleiny k zavedení zvláštních tvarových motívu: 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylát (Kazmierski a další, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283), (2S,3S)-methylfebylalanin, (2S,3R)-methylfenylalanin, (2R,3S)-methylfenylalanin a (2R,3R)-methylfenylalanin (Kazmierski a Hrubý, 1991, Tetrahedron Letters, kyselinu 2-aminotetrahydronaftalen-2-karboxylovou (landis, 1989, Ph.D Thesis, University of Arizona), hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylát (miyake a další, 1989, J. Takeda Res. Labs. 43:53-75), beta-karbolin (D a L), (Kazmierski, 1988, Ph. D.' Thesis, University of Arizona), HIC (kyselina histidinisochinolinkarboxylová) (Zechel a další, 1991, Int. J. Pep. Proteín Res. 43) a HIC (histidin-cyklická močovina) (Dharanipragada).
Následující analogy aminokyselín je možno zaradit do vybraných bank k indukci nebo uprednostnení určitých špecifických sekundárních struktur: LL-Acp (kyselina LL-3-amino
2-propendon-ô-karboxylová), tíipeptidový analóg, indukující beta-závit (Kemp a další, 1985, J. Org. Chem. 50:583^-5838), analogy, indukující beta-strukturu (Kemp a další, 1988, Tetrahedron Lett 29:SOS 1-5082), analogy aminokyselín, indukující vznik beta-závitu (Kemp a další, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 5057-5060) analogy, indukující vznik alf'a-helixu (Kemp a další, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 4935-4938), analogy, indukující gamma-závit (Kemp a další, 1989, J. Org. Chem. 54:109-115) a analogy, které byly popsány v'následujících publikacích: Magai a Sato, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647650, DiMaio a další, 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans. str. 1687: také analóg Gly-Ala, (Kahn a další, 1989, Tetrahedron Lett. 30:3217), isoster amidové väzby (Jones a další, 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856), tetrazol (Zabrocki a další, 1988, J. Am. Chem. Soc.110: 5875-5830), DTC (Samanen a další, 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509) a analogy, které byly popsány v publikacích Olson a další,
J. Am. Chem. Soc. 112:323-333 a Garvey a další, 1990, J.
Org. Chem. 56:436.
Pŕestože svrchu uvedené neklasické peptidy a látky, peptidúm podobné nemusí být prístupné klasické analýze retéz ce Edmanovou degradací, je možno použit kombinace počáteční Edmanovy degradace s následnou analýzou aminokyselín zbývajícího retzece ke stanovení štruktúry peptidu s požadovanou účinností. Je také možno k analýze použit spektrálni analýzu
5.2.3. Derivatizované a modifikované peptidy
Vynález dále poskytuje možnost modifikace a derivatizace peptidu v bance. Modifikace peptidu jsou v oboru známy, jde napríklad o fosforylaci, karboxymethylaci a acylaci. Modifikaci je možno provést chemickým nebo také enzymatickým zpúsobem.
je možno pripraví* i glykosylova.né peptidy nebo peptidy, acylované alifatickými kyselinami. Pripravas techto peptidových derivátu je v oberú známa a byla pepsána napríklad v následujících pubiikacích:
1. Garg a Jeanloz. 1585, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, sv. 43, Academic Press,
2. Kunz, 1987, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308,
3. Horvat a další, 1988, Int. J. Pept. Proteín Res. 31: 499-507,
4. Bardaji a další, 1990, A.r.g. Chem. Int. Ed. English 23:231
5. Toth a další, 1990, Peptides, CHemistry, Structure and Biology, Riviér a Marshall eds., ESCOM Publ., Leiden, str. 1078-1079,
6. Torres a další, 1989, Experientía 45:574-576,
7. Torres a další, 1989, EM30 J., 8:2925-2932,
8. Hordever a Musiol, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, tamtéž, str. 811-812,
9. Zee-Cheng a Olson, 1989, Bichem. Biophys. Res. Commun.
94: 1128-1132,
10. Marki a další, 1977, Helv. Chem. Acta 60: 807,
11. Fuju a další, 1987, J. Chem. Scc. Chem. Commun., str. 163-164,
12. Ponsati a další, 1990, Peptides 1990, C-irs.lt a .Andreu eds., ESCOM Publ. str. 238-240,
13. Fuji a další, 1987, 1983, Peptides, Chemistry and Biology, Marshall ed. , ESCOM Publ., Leiden str. 217-219.
Existují rovnéž dve. hlavní skupiny vazeb mezi peptí dy a uhľohydráty. Prvni z nich, éterová vazba, spojuje serin nebo threonin hydroxylovou skupinou na hydroxylovou skupinu cukru. Druh amidová vaz'oa váze karboxylovou skupinu glutamátu nebo aspartátu na aminoskupinu chu uvedených citacích i a 2 se uváži vu prptid-uhlohydrátovýoh éteru a ani být vázán na peptid také acetalovými cukru. Zejména ve svrí oos tupý ono priprali. Uhľohydrát múze ketalovými vazbami.
Je možno pripraviť také alifatické acylpeptidcvé deriváty. Je napríklad možno acylovat volnou aminoskupinu (N-terminální nebo lysyl), napríklad kyselinou myristovou.
V dalším možném provedení je možno zaradiť do peptidu banky ainokyselinu, o'osahující alifatický postranní retezec se strukturou (CH2)nCh’3. Tyto a další konjugáty peptidu a alifatické kyseliny, vhodné pro použití p?i provádéní zpusobu podie vynálezu byly popsány v britskám patentovém spisu č. 8809162.4, v PCT/AU89/00156 a v publikaci 5 svrchu.
5.3. Banky náhodilých oligonukleotidú
Zpusob syntézy bank retézcú nukleových kyselin je možno upravit podie syntézy DNA na pevné fázi fosfoamidátovou metodou podie publikaci Caruthers, 1935, Science 230: 281, Caruthers a další, 1987, Methods in Enzymology 154: 287-313.
Jak nerozpustné polymerní nosiče na bazi oxidu kremičitého, tak chránené desoxynukleotidy. se bežne obchodne dodávají (napr. Peninsula Laboratories Inc., California, Applied Biosystems, Inc.) . Príkladem chránených deoxynukleotidu mohou být 5'-O-dimethoxytrityldeoxythymidin, 5*-0diemthoxytri tyl-4-N-benzcyldeoxycytidin, 5 * -0-dime thoxy t ríty 1-N-benzoyldeoxyadenosin a 5 ' -O-dimethoxytrityl-N-iso'outyldeoxyguanosin. Je možne užít také další špecifické ochrán né skupiny v závislosti na použití. Jdpovídající deoxyr.ukleo sid-3 -fosforamidity je možno svnthetizovat a postupne navázat na pevný nosič podie svrchu uvedené publikace Carutherse a dalších, 1957. První decxynukleosid je možne fixevat, napríklad muže jít o decxyadenosir.. ?c detritylaci a premytí dienlormethanem a pak acetcr.itrilem se pevní· r.osič rozdelí na čtyri stejné podíly a ty se pŕer.escu do čtyň reakčních nádob. Pak se jednotlivé do čoyr reakčních nádob pridají čtyri deoxynukleotid.3'-fosferamidity. ?o ukončení väzby se pevné nosiče ze čtyr reakčních nádob promísí, dúkladr.š se promyjí a pak se podrobí oxidaxi pusobeni- smési Zj/HgC/lutidin/THF.
Po oxidaci se pevný nosič dúkladr.š promyje acezonitrilem a svrchu uvedený cylus se opakuje. ?o ukončení syntézy nahodilého polydeoxynukleotidového retezce (napríklad zo 11 stupních väzby) se met'nyesterové skupiny cdstšpí púsober.ím thiofenolu a DMT-skupiny se odštšpí kyseli-ncu trichloroctc-vou. Polynukleo tidové retezce, zbavené ochranných skupín mohou zústat kovalentne vázány na pevný r.osič ( v prípade, že se užije vhodných vazebných skupín), pripravené pre použití v testech. které budou dále podrobnej! vysvetlený.
Pri provádení zpusebu podie vynálezu je možno použít oligonukleotidy s jinými než fosfodiesterovými vazbami. Oligonukleotid múže napríklad obsahovať fosfothionátovou vázou.
V oboru jsou známy i jiné modifikované fosfodiesterové väzby nebo analógy takových vaze'o. Tytc modifikované väzby jscu odolné proti pusobeni exonukleáz i endorukleáz.
Vzhledem k tomu, že se užije vždy pouze čtyň DNAnebp RNA-nukleosidú v jednom vazném stupni, v bance se 12 nukleosidovými bazemi se bude nacház'et možných polynukleotidových retezcú, což znamená l,ô8 . 1OZ možností. Mimoto múže být oligonukleotid synthetizován pri použití jak DNA-, tak RNA-nukleosidu. Je zrejmé, že krčme hlavních nukleosidu je možno užít také neobvyklé nebo modifikované nukleosicy.napr. inosin, methylované purinové nukleosidu, deriváty uridir.u a 2 -O-methylribózu, která se múže vyskytnout v jakémkoliv ribonukleosidu.
5.4. Pevné nosiče a väzné ňetezce pro použití v ba.nce nanodilých bio-oligomerú
Pevný nosič pro použití podie vynálezu bude za reakč· nich podinínek inertní vzhledem k syntéze bio-oiigomeru, naprí klad syntéze peptidu nebo oligonukleotidú nebo obou typu teoh to látek. Pevný nosič pro použití podie vynálezu musí mít reaktívni skupiny pro väzbu monomerni podjednotky nebo pro väzbu väzného retézce nebo jakékoliv skupiny, která múze sloužit jako počáteční väzné místo pro monomerni podjednotku. V jednom z možných provedení múže být pevný nosič vhodný pro použití in vivo, to znaená, že múže sloužit jako nosič pro prímou aplikaci banky bio-oligomerú ( napr. TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, SRN, dále v odstavci 5,8). Ve zvláštním provedení múže být pevný nosič perorálné poživatelný. V jiném provedení múže být jako pevný nosič použi t chromatografický materiál.
Pevný nosič není omezen.na použití špecifického typu nosiče. Dostupná je velká rada typú tšchto nosičú, jak je všeobecné známo. Jde napríklad o rúzné typy silikagélu, pryskyric, derivatizovaných plastických fílmú, kulíček z plastických hmôt a gelú oxidu hlinitého.. Vhodný pevný nosič je možno volit vzhledem ke konečnému použití a jeho vhodnosti pro rúzné predpokládané postupy v pruošhu syntézy. Napríklad pri syntéze peptidú je možno jako pevný nosič použít napríklad pryskyrice, jako polystyrén (napr. pryskyrici PAM, 3achem Inc., Peninsula Laboratories apod.), pryskyrici typu POLYHIPE (Aminotech, Kanada), polyamidovou pryskyrici (Peninsula Laboratories), polystyrénovou pryskyrici, roubovanou polyethylenglykolem (TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, SRN) nebo polydimethylakrylamidovou rpyskyŕici (Milligen/Biosearch California). Ve výhodném provedení pro syntézu peptidú se jako pevný nosič použije polydimethylakrylamidová pryskyrice.
Pevný nosič podie vynálezu múze rovnéž obsahovat väzný retezec. Pod tímto pojmem se v prúbehuprihlášky rozum:
jakákoliv molekula, která zajišťuje prostcrovou vzdálenost mezi pevným nosičem a synthetizovaným peptičem. Väzné ŕetézce mohou být kovalentne vázán.y na pevný nosič pred väzbou alfe* sLf*a
N -Boe-nebo N -Fmoc- nebo jakkoliv jinak chránených aminokyselín. Ke spojení oligomeru a pevného nosiče je možno použít rúzné väzné ŕetezce. Pŕíkladem väzných ŕetézcú mohou bý kyselina aminomáselná, aminokapronová, 7-amínoheptanová a 8-aminokaprylová. Kysleina Fmoc-aminokaproncvá se bežne dodáva (Bachem Biochem) a je velmi vhodná. V dalším možném provedeni mohou väzné retézce ješté obsahovat jednu nebo vet· ší počet molekúl beta-alaninu jako látky, zvýšující vzdáíenost. Mimoto je možno modifikovať pevný nosič tak, aby splnil požadavky, špecifické pro určitý účel biologické zkoušky nebo detekce. Modifikaci pevného nosiče je možno uskutečnit zarazením špecifického väzného ŕetezce. Modifikovaný pevný nosič je napríklad možno učinit citlivým na púsobení kyselín baží, nukleofilních látek, elektrof!lních látek, svetla, oxidačníc'n nebo redukčních oodmínek.
Krome svrchu uvedených väzných ŕetézcú je možno použít zejména selektívne odštepitelné väzné ŕetezce. Napríklad v dále uvedeném odstavci 12 bude vysvetlene použití väzného ŕetezce, citlivého na púsobení ultrafialového svetla (Barany a Albenicia, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4536-4942). Další odštepitelné väzné ŕetezce mohou ke svému cdštepení vyžadovať hydrogenolyzu nebo fotolyzu. Pŕíkladem fotosensitivních (svétlem odštépitelných) väzných ŕetézcú jsou ŕetezce, které byly popsány v publikacích Wang 1978, J. Org. Chem 41:32-58, Hammer a další, 1990, Int. J. Psôt. Proteín Res. 36:31-45 a Kreib-Cordonier a další, 1990 v Peptides- Chemist ry, Structure and Biology, Riviér and Marshall ecs., str. 895-897. Landen (1977, Methods Enzým. 47:l45-i4o) užil vodnou kyselinu mravenčí k cdštepení väzby Asp-Pro a tento pŕí29 stup byl použit k charakterizaci determinant. T-bunék ve spojení s Geysenovou metodou syntézy (Van der Zee a další, 1959, Eur. J. Immunol. 191:43-47). Další potenciálni väzné retézce, odštépitelné za bázických podmínek zahrnují ty retézce, které jsou založený na kyseline p-(hydroxymethyl)benzoové (Ather· ton a další, 1981, J. Chem. Soc. Perkin l:538-54ô) a kyseline hydroxyoctové (Baleaux a další, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28: 22-28). Geysen a další (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33) popsali štepení peptidu diketopiperazinovým mechanismem. Enzým muže špecificky odštépit väzný retézec, který obsahuje retézec, který je citlivý na pôsobení enzýmu nebo s ub s.t-.^á t?^,oľ·-p.ô^o b e n í enzýmu, jde napríklad o štepení peptidu pôsobením proteázy nebo o štepené oligonukleotidu púsobením endonukleázy. V nékterých prípadech je možno derivatizovst 10 až 50 % pryskyŕice substitucí odštepitelným väzným retezcem a zbývajících 50 až 90 % substituovat neodštepitelným väzným retezcem, aby bylo možno zajistit, že bude k disposici dostatečné množství peptidu po odštépení väzného retézce pro následnou analýzu retézce. Je možno použit také kom'cinace odštépitelných väzných retézcú, aby ’oylo možné postupné odštépení z jediné častice nosiče.
Pevný nosič pro použití vynálezu muže dále obsahovať príslušný bio-olígomer, k nemuž je možno pridať retézec r.ahodilých podjednotek. Tento bio-oligomer je možno volit na základé popsaných postupu nebo muže obsahovať retézec, který má požadované vlastnosti.
Pri syntéze oligonukleotidu muže být výhodné použití nosiče na bazi oxidu kremičitého. Jak již bylo svrchu uvedeno v odstavci 5.3, jsou nosiče na bazi oxidu kremičitého bežné dostupné (napr. Peninsula Laboratories Inc. s. Applied Biosystems, Inc.).
5.5. Zpúsoby detekce a identifikace bio-oligomerú
Krome prípravy banky skutečn? nahodilých bic-cligcmerú a zpúsobú jejich syntézy tvorí podstatu vynálezu rovnež zpúsob analyzy banky bio-oligomerú k identifikaci téch oligc merú v bance. které mají určitý typ biologické účinnosti, jako je vazba, stimulace, inhibice, toxicita, chuť apod. Jir. banky bio-oligomerú je možno analyzovať dále uvedenými zpúsc by na prítomnosť enzymatické účinnosti, inhibhiční účinnosti na enzymy a chemické a fysikální vlastnosti určitého·typu.
Bio-oligomery s určitými vlastnostmi, které jsou nalezený pri počáteční analýze nemusí být konečnými ligandy. Ve skutečnosti je výhodné synthetizovat druhou banku na zákl dé společných retézcú ligandú, vybraných pri první analýze. Tímto zpúsobem je možno identifikovať ligandy s nejvyšší účinností za predpokladu, že druhá analýza je provádena za ješté vymezenéjších podmínek.
5.5.1.Väzné zkoušky
Vynález dovoluje identifikaci ligandú typu bio-oligomerú, které váži molekuly akceptoru. Pod pojmem molekula, akceptoru se rozumí jakákoliv látka, která se váže na ’oiooligomer. Akceptorovou molekulou múže být biologická makromo lekula, napríklad protilátka, receptor nebo vírus. Mimoto múže být akceptorovou molekulou chemická sloučenina, napríklad bílkovina, uhlohydrát, nukleová kyselina, lipid, léčivo, kov nebo menší molekula.
Banka bio-oligomerú podie vynálezu múže vstupovať do interakce s mnohá rúznými molekulami akceptoru. Identifikací určitého typu bio-oligomeru. na nšjž se váže špecifická molekula akceptoru je pak možno fysikálné izolovať tento typ bio-oligomeru.
Vzhledem k tomu zanými oligomery. Z tohoto oligomeru použít mnohokrát , že pouze malé množstvi Částic nosiče bude v každém analytické nebo detekční“ stupni odstranéno zustava ve smesi stále ješce prevazna veosina nosiču s r.avadúvodu je tanku nahodilých ’oioV prípade, že se užije ruzná barva nebo jiné identifikační zbarvení pro ruzné molekuly akceptoru (napríklad fluorescenční“ barvením jako použitím fluoresceinu- zelená, Texasové červeni-červená a DAPI-modrá i po spojení s akceptorem) a pri použití vhodných excitačních filtru ve fluorescenčnom mikroskopu nebo detektoru fluorescence je možno pridat k ruzné akceptory napríklad k peptidcvé bance a současne provést rychlé vyhodr.ocení na špecifické typy ligandú. Tento postup nejen snižuje náklady, nýbrž také zvyšuje množstvi akceptorových molekúl, které je možno tímto zpúsobem nalézt.
Pri provádšní zpúsobu podie vynálezu se pridá molekula akceptoru do banky bio-oligomerú, kde bude rozpoznaná a bude se bázat na jeden nebo vétší počet typu bio-oligomerú v bance. Každý typ bio-oligomeru, na r.šjž se molekula akceptoru váže bude sám vázán na jedinšm typu pevného nosiče, takže je možno nosič a s ním i bio-cligomer snadno identifikovaz a izolovať.
Bio-oligomer je možno izolovať jakýmkoliv bežným zpúsobem, známým v oboru a vynález preto není omezen na určité zpusoby izolace. Je napríklad možno fysikálním zpúsobem izolovať kombinaci pevného nosiče a bio-oligomeru s nejsilnejší fysikálné-chemickou interakci se špecifickou molekulou akceptoru. V jednom provedení, které je založeno na fysikál né-chemické interakci se pridá roztok se špecifickou molekulou akceptoru k bance nahodilých pepticú, ekvivalentní pŕi5 7 blížne 10 až 10 typu pevného nosiče. Molekula akceptoru se inkubuje s pryskyricí na dobu. dostatečnou k dosažení väzby mezi napríklad peptidem a protilátkou, napr. 1 hodinu pri
- 32 teplote 22 °C. Pak se molekula akceptoru, povlečená kombinací bio-oligomeru a pevné fáze izoluje. Jednotlivá špecifická provedeni budou uvedená dále pri popisu jednotlivých modifikací, které popisují napríklad použití monoklonální protilátky jako rozpustné molekuly akceptoru. Je zrejmé, že tyto metódy je možon snadno upravit k detekci väzby jakékoliv molekuly akceptoru. Mimoto i dkyž se v následujících odstavcích mluví o bankách peptidu je zrejmé, že tímtéž zpusobem je možno analyzovat banky oligonukleotidu nebo peptid-oligonukleotidových chimérních sloučenin.
i) Monoklonální protilátka se nejprve označí fluorescenční skupinou zpusobem, který se v oboru bežné provádí a je obecne znám. Pak se protilátka v koncentraci l^ug/ml pridá k bance peptidu a po opatrném promíchání pri teplote 22 °C jednu hodinu se pevná fáze promyje a identifikuje se fluorescenční kombinace pevného nosiče a peptidu a tento podíl se izoluje s použitím automatického zaŕízení, oddélujícího fluorescenční molekuly. Je také možno fluorescenční kombinaci pevného nosiče a peptidu identifikovat a fysikálné oddélit pod míkroskopem s fluorescenčními doplnky pri použití miktomanipulátoru. Relatívni intensita fluorescence je obvykle úmerná afinite peptidového ligandu k monoklonální protilátce.
ii) Monoklonální protilátka se nejprve konjuguje s fero magnetickými částicemi obvyklým zpusobem. Pak se konjugovaná protilátka v koncentraci 1 ^ug/ml inkubuje s bankou 1 hodinu pri teplote 22 °C. Magnetické častice vytvorí kolem odpovídajícího peptidu na nosiči rozety, které je pak možno od smési oddélit silným magnetem.
iii) Monoklonální protilátka se nejprve konjuguje s enzymem, napríklad s alkalickou fosfatázou zpusobem, který se v oboru bežne užívá. Získaný konjugát: protilátky a iv) enzýmu se pak inkubuje s bankou nahočilých pep.tidú 30 minút až jednu hodinu pri teplote 22 °C. Po premytí se celá banka vlije do Petriho misky, která obsahuje, substrát pro alkalickou fosfatázu, napríklad 5-borm-4chlor-3-indolylfosfát (3CIP) a nitrotetrazoliovou modr (NBT). Po inkubaci nekolik dalších minút zmení kombinace protilátky, nosiče a peptidu barvu (zmodrá) vzhledem k vysrážení premeneného substrátu na pevném nosiči a tuto kombinaci je pak možno snadno identifikovat a fysikálné oddélit pod mikroskopern pri použití mikromanipulátoru. Relatívni intensita barevné reakce je obecne proporcionálni afinite peptidu vzhledem k príslušné monoklonální protilátce.
Monoklonální protilátka se nejprve konjuguje s enzy mem, napríklad s peroxidázou z krenu obvyklým zpúsobem. Tento konjugát protilátky a enzýmu se pak inkubuje 30 minút až jednu hodinu s bankou nahočilých peptidu pri tepoloté 22 °C. Po promytí se celá banka vlije do Petri ho misky, která obsahuje substrát pro peroxidázu, naprí klad 3,3* ,4,4*-diamino’oenzidin (DAS), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) nebo 5-chlor-l-naf t:ol (4CN). Po inkubaci nekolik minút- zmení kombinace protilátky, pevného nosiče a peptidu barvu a je možno ji identifikovat a snadno fysikálné izolovat pod mikroskopern pri použití mikromanipulátoru. Relatívni intensita barevné reakce je obvykle prímo úmerná afinite peptidu pro použitou monoklonální protilátku.
Monoklonální protilátka se nejprve označí biotinem (biotinyluje se) zpúsobem, který je v oboru bežné prova dén a pak se inkubuje s bankou nahočilých peptidu 30 minút až jednu hodinu pri teplote 22 °C. Po promytí banky se pridá smes streptavidinu a'alkalické fosfatázy nebo komplex strepavidinu a peroxidázy z krenu a pak se smés inku'ouje 30 minút. Pak se nosič premyje a barva se vývine obdobným zpusobem jako v pŕedchozím odstavci iii) pri použití enzymatické metódy. Kombinaci pevného nosiče a peptidu je pak možno izolovat fysikálním zpusobem stejné jako svrchu.
Kromé použití rozpustných molekúl akceptoru je také podie jiného provedení možno provádét detekci bio-oligomeru, schopných se vázst na receptory na povrchu bunék pri použití neporušených bunék. Použití neporušených bunék je výhodné v prípade receptorú, které jsou tvorený vetším počtem podjednotek nebo jsou labilní nebo v. prípade receptorú, které vyžaduj! pro svou funkci prítomnost lipidové oblasti bunečné membrány. Bunky, použité pri tomto provedení mohou být bunky živé nebo fixované. Tyto bunky se inkubuji s bankou nahodilých peptidú a bodou se vázat na určité peptidy, což se projeví tvorbou rosety mezi cílovou bunkou a príslušnou kombínací peptidu a pevného nosiče. Vytvočené rozety jé pak možno izolovat diferenciálním odstredením nebo oddšlit fysikálne pri použití mikroskopu.
Pri dalším možném provedení je možno banku analyzovat také propíráním pri použití bunečných linií, napríklad
i) linie, v níž receptor na povrchu bunék není pŕítomen a ii) linie, která byla od predchozí bunečné linie odvozená její transfekcí genem, který je kódem pro príslušný re-. ceptor.
Pak je možno analyzovať banku následujíoím zpúsobem:
i) Nejprve se banka zbaví nešpecifických částic nosiče, které by se vázaly na bunky bez receptoru tak, že se užije souvislá vrstva púvodní bunečné linie bez receptoru, na niž se uvedené častice naváží, ii) nenavázané částice, které jsou smesi částic, špecifických pro receptor a irelevantných částic se uvedou do styku se souvislou vrstvou bunečné linie, positivní vznlečem k receptoru, na niž se bude vázat kombínace pevného nosiče a látky, špecifické pro receptor, iii) odstráni se zbývající irelevantní kombínace jemným promytím a slitím a iv) špecifická kombínace receptoru, peptidu a pevného nosiče se oddelí pomoci mikromanipulátoru.
Jako alternatíva k použití celých bunek pri výzkumu receptoru, vázaných na membránu nebo receptoru, vyžadujících ke své funkci lipidovou oblast membrány je možno rekonstituovat molekuly receptoru do liposomú, kde je možno navázat odpovídající skupinu nebo enzým.
Prestože svrchu uvedené príklady byly uvedený pro ligandy typu peptidu, je možno použít pri praktickém provedení techto zkoušek všechny bio-oligomery, které byly uvedený svrchu v odstavcích 5.1, 5.2 a 5.3. Znamená to, že se molekula akceptoru múže vázat na neklasickou, cirkularizovanou, konformačné pozmenenou nebo štruktúrne usmernenou molekulu peptidu, olidonukleotidu nebo chimérního peptidu-oligonukleotidu.
V jednom z možných provedení je možno prímo označiť molekulu akceptoru. V dalším možném provedení je možno užít značenou sekundárni -reakční složku k detekci väzby molekuly akceptoru na pevný nosič, obsahující hledaný bio-oligomer. Väzbu je možno prokáazt in situ tvorbou chromoforu pomoci enzymatického značení. Vhodným enzymem pro toto použití je napríklad alkalická fosfatáza nebo peroxidáza z krenu. V dalším možném provedení je možno použít dvou barev pri použití dvou chromogenních substrátu a dvojíno enzymatického značení na rúzných hledaných akceptorových molekulách. Tímto zpúsobem lze identifikovať také prímo a zkŕížene reagující ligandy.
Další označení, jehož je možno použit pri provádení vynálezu jsou latexové barevné částice, magnetické částice, fluorescenční značení, napríklad fluoresceinisothiokyanátem FITC, phycoerythrinem PE, Texasovou červení TR, rhodeminem, j, ci fit 1, s volnymi nebo chelatovanými lanthanidy, zejména Eu ’ je možno užít chemiluminiscenční molekuly, radioisotopy.nebo označení v magnetické resonanci. Dve barevné zkoušky je možno uskutečnit pri použití dvou nebo vétšího počtu barevných latexových částic nebo fluorescenčních látek, emitujících pri ruzných vlnočtech. Značené částice je možno izolovať manuálne nebo mechanickými prostŕedky. Mechanickými prost ŕedky jsou napríklad postupy, pri níchž k delení dochází pomoci fluorescenční aktivace, tj. analogicky jako. pri FACS a také mikromanipulátory.
Ve špecifických pŕíkladech, které budou dále uvedený bylo užito značení pomoci enzymu-chromogenu a fluorescenčného značení FITC.
Reaktívni částice je možno izolovat na základe inten sity značení, napríklad intensity zbarvení, fluorescence, magnetismu nebo rádioaktivity, uvedená byla pouze nekterá kritéria. Nejintensivnéji značené částice je možno oddelit a ŕetézec materiálu analyzovať nebo materiál jinak charakterizovať, napríklad hmotovým spektrem. V jiném provedení je možno provést selekci částic s intensitou značení nad určitou úroveň a materiál, na tyto částice vázany analyzovať. Potenciálne je také možno užít moderní metódy zóbrazování pod mikroskopem pro kvantitatívni určení intensity zbarvení a tím i definovať relatívni afinitu ligandu k molekule receptoru pred analýzou retézce materiálu, vázaného na částici. Podobne je možno užít také kvantitatívni analyzy ve fluorescenční™ mikroskopu v prípade akceptoru s fluorescenční™ značením. V ješté dalším provedením je možno oddeliť částice s určitou intensitou značení pro analýzu složení na ne vázaného materiálu, napríklad muže jít o složení aminokyselín. Je také možno banky, obsahující vymezenoú skupinu monomer.ních podjednotek, které byly identifikovaný jako dúležité a tuto banku pak podrobiť analýze.
V dalším provedení je možno identifikovať bio-oligomery s nejvetší väznou aktivitou, tj. väznou konštantou tak, že se postupne redí -príslušná molekula akceptoru tak dlouho, až k väzbe dochází pouze na nekolika čísticích pevného nosiče v bance. Ja také možno postupovať tak, že se užije omezujících podmínek v roztoku, v nemž k väzbe dochází nebo v prípade nukleových kyselin hybridizace pri použití cílové nukleové kyseliny, tj. molekuly akceptoru. Omezení väzby nebo hybri dizace je možno dosáhnout
i) zvýšením iontové sily roztoku, ii) zvýšením koncentrace denaturačních látek, jako močoviny, iii) zvýšením nebo snížením pH od neutrálni hodnoty 7, iv) v prípade nukleových kyselin priblížení k teplote tání Tm
Je možno použít také jiných zmeň podmínek v roztoku, tak jak je to v oboru bežne známo. Vysoké redení nebo vazba akceptoro vé molekuly za vysoce vymezených podmínek na komplex pevného nosiče a bio-oligomeru múze být použitá k detekci príslušného ligandu v bance nahodilých látek, obsahující všechny nebo témer všechny možné monomerní počjednotky nebo v bance vymeze né skupiny sloučenin.
V dalším provedení mohou být stredem zájmu bio-oligo mery, které mají nízkou afinitu väzby. Tyto látky je možno izolovať tak, že se nejprve odstráni všechny bio-oligomery s vysokou afinitou väzby a pak se provede detekce väzby za málo vymezených podmínek nebo v méné zŕedéném prostredí.
Ve výhodném provedení je možno použít postupu s dvojím značením. První označení je možno použít k detekci nešpecifické väzby molekuly akceptoru na částice nosiče v prítomnosti rozpustného ligandu. Pak se označené částice od banky
3S oddelí a odstráni se rovnéž rozpustný ligand. Pak se zjistí špecifická vazba molekuly akceptoru na zbývající častice.
Je možno očekávat, že bic-oligomery na částicích budou váza; molekulu akceptoru na totmtéž vazném místé jako príslušný ligand a budou jej tedy určitým zpúsobem napodobovať. Zkouška s dvojitým značením má tu výhodu, že príslušnou molekulu akceptoru není nutno čistit, protože první stupeň zkoušky dovoluje odstránení nešpecifický reagujících částic nosiče.
5.5.2. Zkoušky na biologickou účinnosť
Podie vynálezu je možno provést zkoušky na biologickou účinnosť-bio-oligomeru z banky po odstránení jakýchkoliv toxických molekúl, zbývajících po syntéze, napríklad neutralizací a dúkladným promytím pomoci rozpouštédla, sterilní vody a živného prostredí. Biologická účinnosť, kterou je možno prokázat zahrnuje toxicitu až do zničení cílového objektu, stimulaci a podporu rústu a fysiologické zmeny.
Ve výhodném provedení je možno bio-oligomery banky selektívne odštépit od pevného nosiče nebo jeho částice. V jednom z možných provedení se částice nosiče pripraví tak, že pouze f-rakci bio-oligomeru je možno selektívne odštépit. Selektívne odštepitelné bio-oligomery, väzné retézce a částice nosiče byly popsány svrchu v odstaci 5.4. Na banku se púsobí stepným činidlem, čímž dôjde k odštepení frakce bio-oligomerú. Príkladem stepných činidel múže být UV-svétlo, kyselina, baze, enzým nebo katalyzátor. V jednom provedení se tímto zpúsobem z banky uvolní 10 až SO % bio-oligomeru. Ve výhodném provedení se uvolní 25 až 50 % bío-oligomerú. V prípade , že jsou odštepitelné všechny bio-oligomery, je možno uskutečnit ňekvantitativní štepení cmezením množství stepného činidla.. Je napríklad možno omezit dobu exposice a intensitu ultrafialového svetla. V jiném provedení je možno snížit koncentraci reakčního činidla, po provedeném štepení je možno banku dále zpracovávat napríklad neutraližací k dosažení bio logické kompatibility, pokud jde o požadovanou zkoušku. Odborník snadno stanoví podmínky pri štepení pro částečné štep ní v prípade, že všechny bio-oligomery banky jsou vázány na častice nosiče štépitelnými väznými retézci nebo vazbami.
Je dále obecne známo, že relatívni koncentraci uvolnéného bio-oligomeru je možno ovlivnit zmenami podmínek pri štepení
Vzhledem k tomu, že častice nosiče v bance jsou imo bilizovány, vytvorí se koncentrační gradient určitého biooligomeru. Vysokou koncentraci bio-oligomeru bude možno prokázat v blízkosti částice, z níž byl uvolnen. To znamená, že<%'pFÚWä-zt-i'iri-e'CS'äSé' biologické účinnosti v blízkosti částice dovolí ičentifikace a izolaci částice a stanovení retézce nebo jiné vlastnosti bio-oligomeru. Identifikace bio-oligome ru je možná z toho dúvodu, že po částečném odštepení bude na častici k disposici ješté dostatečné množství pro analýzu retézce nebo stanovení nekteré vlastnosti bio-oligomeru. V dalším možném provedeni je možno' částice dšlit do vyhloubení mikrotitrační plotny (napr. 10 částic/vyhloubení) a určitý podíl bio-oligomeru uvolnit a podrobit zkouškám na biologickou účinnost, čímž je možno vyloučit potenciálni problém difuse. Jak bude dále popsáno, je možno na pevný nosič vázat rúzné frakce bio-oligomeru rúznými odštépitelnými väznými retézci pro následující analýzu retézce. V dalších príkladsc znamená částice častici pevného nosiče.
Dále budeou uvedený príklady, jak je možno provést biologické zkoušky, aniž by mél být vynález na tyto príklady provedeni omezen.
i) Populace bunék ve forme suspenze jednotlivých bunék se navrství na kapalné prostredí nebo polotuhou matrici, obsahující banku nahodilých bio-oligomerú. V jednom prove dení se tento postup provádí v mikrotitrační plotné pro tkáňové kultury s 95 vynlcubeními s jednou nebo vétším počtem částic v každém vyhloubení, každé vyhloubení rovnéž obsahuje suspenzi bunék. V dalším provedení se k suspenzi bunek pridá barierová matricea částice banky, podíl peptidu na každé částici se váže na vodou otístepitelný (napr.diketopiperazin) nebo svétlem odstepitelný väzný ŕetézec.
Je možno odštépit dostatečné množství peptidu pro biologický účínek, pŕičemž zústává ješté dostatečné množství peptidu, vázaného na částici, pro analýzu retezce. Suspenze bunék múže být v roztoku nebo b polotuhé matrici. Po vhodné dobé inkubace se populace bunek zkcumá na rúst nebo proliferaci napr. identifikací koloníí. V dalším provedení je možno pŕidat tetrazoliovou súl MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-difenyltetrazoliumbromíd) podie publikace Mossraan, 1983, J. Immunol. Methods 130:140-151). Sukcinátdehydrogenáza, kterou je možno prokázat v mitochondriích životaschopných bunék pŕevádí MTT na formazanovou modr.
To znamená, že koncentrace modrého zbarvení bude znamenat prítomnost metabolický aktivnich bunék. V dalším možném provedení je možno stanovit včlenení radioaktivního značení, napr. triciovaného thymidínu jako ukazatel proliferace bunék. Podobné je možno prokázat syntézu bílkovin zara, 35 žením S-methioninu. Částice, které uvolní peptid, který stimuluje nebo púsobí inhĺbici rústu bunék se pak izolují a analyzuje se ŕetézec materiálu, identifikovaný ŕetézec peptidu se pak znovu podrobí zkcuškám v roztoku proti indíkátorovému typu bunék.
ii) V dalším provedení postupu i) se částice banky rozdelí do vyhloubení mikrotitrační plotny tak, Že každé vyhloubení obsahuje približné 10 částic. Částice se uvedou do suspenze v kapalné fázi. Z každé částice se uvolní dostatečné množství peptidu k vyvolaní biologického účinku, zatímco na částici zústává dcststečné množství peptidu pro analýzu jeho retezce. Supernatant, obsahující uvolnéný peptid je možno pŕenést na replík ve vyhloubení společr.é s ôásťicem ká: účinnost, napr. rúst nebo pro. Částice z vyhloubení s biologické
r.í pietnu nebo ponechat Stanoví se biológieí ΓΉ ~ :fc u n Č Π e 1 i n 1 e · účinností se analyzuje a každý analyzovaný ŕetézec se pripraví a testuje, aby bylo možno prokázat, který z retézcú má biologickou účinnost .
iii) V dalším provedení postupu ii) se bio-oligomery váži na častice tak, že približne 1/3 bic-oligomeru je možno uvolnit v prvním stupni, další 1/2 ve druhéra stupni a z'oývající 1/3 zustane na častici. K postupnému uvolnšní muže čojít pri použití čvou odlišných cdštepitelných väzných retézcú nebo použitím omezeného množství štépného činidla, které múže v každém stuúni odštšpúit jen určitý podíl bio-oligomeru. V tomto prípade je výhodné použití rízeného ozárení väzného ŕetézce, citlivého na svetlo, prastože i pri použití pečlivé volené do’oy púsobení chemického nebo enzymatického činidla je možno dosáhnout částečného odštépení. Banka postupné odštépitelných bio-oligomerú se pripraví a rozdelí do vyhloubení mikrotitrační plotny tak, že každé vyhloubení obsahuje více než 50, s výhodou 50 až 250 částic. Částice se zpracují tak, aby došlo k odštépení približne 1/3 bio-oligomerú. Supernatant se sleduje na biologickou účinnost v opakovaných zkoušk&ch. Částice z vyhloubení s biologickou účinností se pak uvedou suspenze a rozdelí čo vyhloubení mikrotitrační plotny tak, že každá plotna obsahuje 1 až 10 částic. Ma částice se púsobí tak, že se uvolní další 1/3 bio-oligomeru a supernatant se opét zkouší na biologickou účinnost. Částice z vyhloubení s biologickou účinností se izoiují a navázaný bio-oligomer se analyzuje k určení ŕetézce. V prípade, že účinná je více než jedna částice, pripraví se všechny identifikované ŕetézce a jednotlivé se zkouší na biologickou účinnost. Tato dvcustucňová biologická zkouška se jeví jako velmi účinný zpúsob k vyšetrení velké banky na bicoligomery se špecifickým biologickým účinkem.
iv) Stimulaci uvolnéní cytokinu je možno sledovat tak, že se suspenze jednotlivých bunek pridá ve forme, imobiiizované na polotuhé matrici, napr. na.agarozovém gélu. V prípade, že bio-oligomer podie vynálezu púsobí uvoľnení cytokinu, napr. lymphokinu, rústového faktoru, hormonu apod., je možno prítomnosťcytokinu prokázat aktivitou indikátorové bunečné línie. Špecifické testy s použitím indikátorové bunečné linie je možno provést zpúsobem podie odstavce i) svrchu. V jiném provedení je možno cytokin uvolnený stomulovanými bunkami prokázat blotem na membránu napr. z nitrocelulózy a pak cytokin prokázat imunologický nebo prúkazem väzby na receptor.
v) V dalším možném provedení je možno sledovat toxicitu bio-oligomeru. Zóny nebo piaky bez rústu, napr. v prípade transformované nebo nádorové bunečné linie, prevrstvené na banku bio-oligomerú v tomto príkatíé je índikátorem biologické účinnosti. Ve zvláštním provedení je možno navrstvit na polotuhou matrici dve populace bunek jednu na druhou. Tímto zpúsobem je možno identifikovať cytotoxický bio-oligomer, špecifický pro cílovou bunku, avšak netoxický pro jiné bunky. Touto zkouškou je možno rýchle identifikovať bio-oligomery, vhodné.pro použití jako chemotherapeutika. Cytotoxické bio-oligomery zahrnují toxické peptidy a antimediátorové oligonukleotidy.
vi) Pozorovať je možno také fyziologické zmeny. V jednom z možných provedení se na banku navrství suspenze myokardiálních bunek. Pak je možno pozorovať zmeny fysiologíe bunek, stimulované bio-cligomerem. V jiném provedení je možno sledovat ňízení určitého enzýmu tak, že se sleduje vzestup účinnosti určitého enzýmu v prípade, že je k dispo sici príslušný substrát, napríklad chromogen (napr. MTT, jak bylo uvedeno svrchu v odstavci í),íl mi luminiscenční látky. Eízs.-.f enzýmu je také imunologický. V jestš daiším možné.“ no pomoci histologické techniky prekáža: morfologické zmeny, vyvolané bío-oligome : nebo c’neuorofpr možno sledovat fysiologické nebo rem z knihovny.
vii) Vynález poskytuje postup k prúkazu účinnosti biooligomeru v bance na polarizované bunky, napríklad na bunky s basolaterální a luminální plochou. Polárni bunky a kultury tšchto bunek je možno pŕipravit na semipermeabilní membráne, podie velikosti otvoru. Banka se pridá na polotuhé matrici k basolaterální ploše nebo k luminální ploše. Pakje možno prokázat rúzné účinky bio-oiigomeru podie vynálezu, napríklad polárni transport, proliferaci, intercelulární komunikaci apod. Zvlášte je možno značením ’oiooligomeru, napr. rádioaktívne nebo pomoci fluoreforu identifikovat transportovatelné bio-oligomery. V oboru existuje také dlouhodobá potreba špecificky absorbovatelr.ých molekúl. Tyto molekuly by byly zvlášte vhodné pro podání farmaceutických látek perorálne a do nosu tam, kde je žádoucí transport z povrchu sliznice na opačnou stranu epithelu.
Je také možno uskutečnit biologické zkousky pri použití neosštepených bio-oligomerú. Pak je možno sériové sledovat biologickou účinnost celých částic s vázaným bio-oligomerem. V jednom z možných provedení je možno aplíkovat celou banku živočíchovi a častice pak izolovat ze špecifických tkání. Je možno izolovat částice, které byly vstrebaný po perorálním, nosním nebo kožním podání. Ve výhodném provedení se užijí magnetické částice nebo částice, které mají jincu identifikovateľnou vlastnost a tak je možno je snadno ze tkání izolovat.
,1 .4
Je zrejmé, že všechny svrchu uvedené biologické zkoušky se týkaj í bio-oligomerú, zahrnujících peptidy, oligcnuklectidy, nebo chimérní peptid-oligonukiectidy. Peptidy as analógy peptidú jsou dobre známé jako látky, podporující rúst, inhibítory rústu, a regulátorové molekuly. Peptidy mohou púsobit jako regulátory genú tak, že se váži na rídící retézce génu a napríklad agonizují nebo antagcnizují účinky promotrú, zesilovačú transkripce a rítíících bílkovin. Podobné mohou i nukleové kyseliny púsobit jako inhibítory nebo látky indukující expresi génu na úrovni transkripce (napr. väzbou nebo blokovaním promotorú, zesilovačú transkripce ste: kodonú apod.), pri zpracování (napríklad interŕerovánín nebo spolupráci pri zpracování mRNA) a pri translaci. V o'ooru je dobre známo, že je možno použit oligonukleotid nebo anale; oligonukleotidu k blokování translace špecifické mRNA. Všechny banky, které byly popsány v odstavci ch 5.1 až 5.3 je moŽru zkoumat na takovou biologickou účinnost.
Je dále zrejmé, že je možno použit k biologickému sledovaní jakoukoiiv bunku, kterou je možno udržovať ve. tkáňové kultuŕe po kratší nebo po delší časové období. Pod pojmem bunka se rozumí prokaryotická (napr. bakteriálni) a eukaryotická buOka, kvasinky, plísne a houby.Je možno užít primárni bunky nebo bunečné línie, udržované v kulrure. Mimo· to bude rpavdépodovne možné provádet i pokusy s viry tak, že se bunky infikují nebo transformuj! vírem, Bylo by napríklad možno sledovať schopnosť bio-oligomeru zpúsobit ir.hibic lysogenní účinnosti bakteriofágu lambda identifikací kolonií E. coli po transfekci, které by v prípade infekce nevytváŕely zretelné plaky.
Postupy pro zkoušky na účinnost bio-cligomeru v ban ce nahodilých bio-oligomeru není možno cmezit na svrchu uve dené príklady. Je totiž možno modifikovať jakýkoliv systém zarazením vynálezu, takže rovnéž bude spadať do jeho rozsahu
5.5.2.1. Biologická zkouška na anzagonísty erythrcpoezinu
Ve zvláštním provedení se vynález tyká zkoušky na bio-oligomer, který je agonistou eryt'nropoetinu. Je však zrejmé, že postup, který bude k tomuto účelu popsán muže být využit k identifikaci jakéhokoliv agonisty, napr. agonisty rústových faktoru, hormonú, cytokinú, lymphokinu a jiných intercelulárních mediátoru, jak byly svrchu popsány v odstavci 5.5.2.
V tomto provedení muže být banka bio-oligomerú tvorená peptapeptidy, pripravenými z 19 bežných aminokyselín s výjimkou cystinu. Teoretické množstvi možných vznikiých peptidu je 2 475 099. Banku je možno získat v 19 stupních k usnadnéní analyzy banky. Postupuje se tak, .že se v každém stupni pro C-terminální zakončení volí jediná aminokyselina, takže pouze další čtyri jsou volený nahodile. Vzniklý peptid má tedy obecný vzorec XXXXY, kde Y je aminokyselina, zvolená pro uvedený stupeň a X znamená nahodile navázanou aminokyselinu. Tímto zpúsobem je možno snížit počet potencíálních peptidú v každém stupni na 130 321. Pri rozdelení materiálu po 10 částicích (peptidú) do každého vyhloubení plotny s 95 vyhloubeními je počet potrebných ploten 135, další plotny je zapotrebí pro biologické zkoušky (štandardy a kontroly), takže celkový počet potrebných ploten je 137,. Zpúsob dovoľuje distribuci celého stupne tvorby banky v celém počtu ploten v prúbéhu jediného pracovního dne.
Hlavní podíl 50 až 80 % peptidu, syrrthetizovaného na částicích nosiče je možno odštépit k provedení biologických zkoušek tak, že se z každé částice nosiče uvolní alespoň 50 pmol peptidu Jako odštepitelný spojovací ňetézec je vhodná zejména diketopiperazinová vazba, pŕestože je možno použit také spojovací ŕetézec, odštepitelný púsobením svetla
Vazba je čostatečné stála v mírné kyselsm prostredí, napr.
0,1 až 1,0 mM HCl pro distribuci částic nosiče v prúbéhu ô až 8 hodín. Odštšpení je možno vyvolat pridaním 20 ^ul 1,0 až 10 mM Hepes o pH 8,5 čo. každého vyhloubení. Štepení probíhá preš noc (12-18 hodín) pri udržování konečného objemu vyhloubení na stálé hodnote. Odpaŕování je možno zabráni t uložením ploten ve vlhké komore.
Roztok peptidu, získaný štepením banky by mel být aseptický nebo spíše sterilní. Aseptické podmínky jsou nutné vzhledem k tomu, že roztok bude tvorit 25 % konečného objemu kultury a kultivace bude trvat alespoň 24 hodín. Aseptických podmínek je možno dosáhnout tak, že se
1) hydratují částice po syntéze ve sterilní vode,
2) počáteční suspenze částic se ŕedí okyselenou sterilní vodou,
3) užije se sterilní techniky pro rozdélováni částic do jednotlivých vyhloubení mikrotitračních ploten.
Konečná suspenze částic múže obsahovat méné než približne 20 % DMSO k usnadnéní solubilizace hydrofobních peptidu. DMSO by mel být pridán v prípade potreby v časném štádiu společne s vodou k usnadnéní rozpustení. Konečná suspenze částic by .mela obsahovat 10 částic/50 ^ul. Udržení částic v suspenzi v prubéhu pipetování je možno dosáhnout pridáním približné 0,8 až 3,3 % methylcelulózy. Použití methylcelulózy múže umožnit snížení množství DMSO, použitého pro zvýšení rozpustnosti. Konečná koncentrace methylceleulózy v kulture ,á být udržována pod 0,8 %, tak aby nedocházelo k interferenci s biologickými zkouškami.
Uvolnéné peptidy je možno pŕenést na pietny pro biologické pokusy ve formé vzorkú s objemem 50 ^ul, pŕičemž je nutno dbát toho, aby si odpovídaly p.lotny pro vzorky a pro péstování. Je také nutno pri prenosu zachovat sterilní podmínky. Do určitých vyhloubení ploten je možno pŕidat lidský rekombinantní EPO jako positivní kontrolu (na.každé plotr.é) a pro konstrukce standardních kŕivek (první a poslední pietna) . Do kontroiních vyr.loubení je možno vložít 0, 1 IV EPO a štandardní krivky je možno získat ze šesti zkoušek vždy s dvema vynloubeními pri použití 1,0 až ICO mjednotek EPO (D^Andrea a další, 1991, Mol. Celí Biol. 11:1950-1987).
Biologickou zkoušku je možno provést pri použití rekombinantní bunečné línie 3a/F3-T, u. níž doc'nází k expresi receptoru pro erytbropoetin (ΞΡΟ-R). Tyto bunky jsou závislé buď na prítomnosti interleukinu-3 (IL-3) nebo EPO. Pestovaní uvedených bunék v prítomnosti IL-3 (ve forme 10% roztoku) v upraveném živném roztoku WEHI muže zabránít možné interferenci EPO v prostredí s biologickou zkouškcu. Základním rustovým prostredím pro bunky 3a/E3-T je prostredí P.PMI 1540 s obsahem 2,0 g/l hydrogenuhličitanu sodného, 10 % fetálního telecího séra, 1 x penicillin-streptomycin, 5 /Ul beta-merkaptoethanolu/1 a 10 mM Hepes (konečná koncentrace), pH se upraví na 7,40. Toto prostredí je nutno doplnít 10 % upraveného prostredí WHEI, kterým se dodá IL-3. Upravené prostredí WHEI se pripraví tak, že se péstují bunky WHEI v tomtéž základním prostredí až do vytvorení souvislé vrstvy bunék. Pak se prostredí odstredí k odsatrnení bunék, nechá se projít filtrem s prumerem otvoru 0,22 ,um a skladuje ve zmrazenem ' 7 stavu. Bunky 3a/F3-T se péstují až do koncentrace 1,31 x 10 τ bunék, tyto bunky se pak rozdélí po 1 x 1C,W bunék/vyhloubsní v objemu 150 ^ul podie pubíikace Yoshimura a další, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57:4139-4143.
Pak se bunky Ba/F3-T prenesou z malých lahví do sterilních lahví do odstredivek s cbjemem 250 ml. Pak se buň ky dostŕečí pri 500g celkem 5 minút. Pak se buOky uvedou do suspenze ve 200 ml čerstvého základného prostredí bez IL-3 pro počítáni bunék. Konečný objem se pak upraví tak, aby bylo dosaženo 5,57 x 10“1 bunék/ml (1 x 10bunék/150 ^ul) pri48 dáním čalšího živného prostredí. Obvykle· je .zapotrebí rozdeliť výslednou suspenzi bunek na 4 až 8 podílu a jednotlivé počíly skladovať v inkubátoru v prubéhu dlcuhého postucu delení. Počet bunek a jejich životnosť by mely být stanovený na vzorcích, odebraných na konci a na začátku delení, aby bylo ovšreno, že na první i na poslední plotné se nachází približné stejný počet životaschopných bunek. Bunky se rozdélují do ploten s obsahem supernatantú s uvlonéných peptidem. Pak se plotny inkubují tri dny (Yoshimura a další,svrchu).
Konečným stupném biologické zkoušky je zjišténí počtu živých bunek v každém vyhloubení plotny. Tento počet je možno stanoviť zkouškou MTT podie publikace Mosmann, 1983,
J. Immunol. Methods 55:55-63 v modifikaci podie publikace Niks a Otto, 1990, J. Immunol.Methods 130:140-151. Modifikovaná zkouška dovoluje stanovení počtu živých bunék bez odstránení živného prostredí.
MTT, tj. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid se pripraví ve forme roztoku v PBS, který obsahuje 5 mg MTT/ml, zapotrebí je približné 270 ml orztoku.
Do každého vahloubení plotny se uloží 20 /Ul tohoto roztoku a plotna se inkubuje 4 hodiny pri teplote 37 °C. Po této dobé se do každého vyhloubení pridá 100 ^ul extrakčního roztoku a plotna se ulorí do lázné s ultrazvukem na 120 sekúnd. Extrakční roztok obsahuje 50 % objemových dimethylformamidu v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) s koncentrací 20 % hmotnostních, upraveném na pH 4,7 pridáním smési kyseliny octové a chlorovodíkové zpúsobem podie publikace Hansen a další, 1989, J. Immunol. Methods 119:203. Tímto postupem dochází k solubilizaci formazanového produktu metabolismu MTT pro mérení optické hustoty pri 570 nm zaŕízením pro odečítání prímo z mikrotitračních ploten.
Údaje optické hustoty, ziskar.é pri 'cicLogických zkouškách se užijí k vypočítaní prúmšru ze v.šech vyhlcufcení, obsahujících vzorky ke stanovení 95h mezi spoiehlivosti pre prúmernou hodnotu. Pre hodnoty optické hustoty ve vyhlcubeních vne uvedeného intervalu se pro stanovení Štatistické významnosti užije Študentovo t. Štatisticky významné hodnoty se srovnávají se štandardní krivkou EPO, čímž se získá údaj pro účinnost v IU relatívne k EPO. Štandardní krivka se stanoví nelineárni analýzou regresú pri použití lcgistické rovnice. Údaje z obou standardních krivek se analyzují společné i oddelené za účelem zjisténí, zda existuje štatisticky významný rozdíl v odpovedi, méŕené na obou koncích biologické zkoušky (test na pomer P). Srovnáním kcntrolních hednot, mére ných pro každou plotnu v prúbéhu celé zkoušky je možno určit ke zhišténí, zda existuje stáiá zmena v odpovedi pri biolegie ké zkousce.
Je dúležité si uvedomí t, že existují na bunkách Ba/F3-T dva receptory pro rústové faktory (IL-3R a EPO-F) a že aktivace kteréhokoliv z nich vyvolá positivní biologickou odpoveď. To znamená, že svrchu uvednenou biologickou zkouškou je možno oddelít agonisty receptorú IL-3 i EPO. YExistuje dvojí ŕešení tohoto proľoému. Jedním z nich je použití jiné bunečné línie nebo slezinných bunék z myší po podaní fenylhydrazinu (Kryštál, 1983, Exp. Kematol. 11:6^9660). Druhým je zkouška syntheíických peptidú na účinnost EPO i IL-3 ve druhé biologické zkousce nrebo pcmocí rádioaktívne značených väzných látek.
5.5.3 Látky, spolupúsobící s enzymy a inhibítory enzymú
Vynález se týka také bio-oligcmerú, které katalyzují určité reakce, napríklad banky enzymú, které mohou slcužit jako koenzymy nebo zpúsobit inhibici enzymatických reakcí. Vynález tedy také poskytuje metódy pro zkoumání účin- 30 inhibice enEnzymatickou ucmnost tvorby zjistiteiného rekačního dení katalyzuje bio-oligomer z nosti enzýmu nebo koenzymú a také ono sledovaní zymatické účinnosti.
je možr.: sledovat na základé produktu. Ve zvláštním proveba.nky enzymatickou reakci, jejímž substrátem je substrát pro alkalickou fosfatázu, tj. 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát (BCIP), čímž dôjde k modrému, nerozpustnému ’reakčnímu produktu na pevném nosiči, jak bude dále popsáno v príkladu 13.
V dalším provedení se muže tvcrit oblast pczorovatelného produktu, napríklad zabarvení nebo fluorescence na polotuhé matrici. V tomto prípade se banka navrství na polotuhou matrici, napríklad na agarozový gel a pridá se chromogenní nebo j iný indikátorový substrát. V prípade, že kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru má požadovanou enzymatickou účinnost, vytvorí se zóna produktu. Napríklad je možno biooligomer, který je analogem peroxidázy z krenu identifikovat tak, že se pridá roztok aminoantioyrenu (0,25 mg/ml, Kodak), fenolu (8 mg/ml) a (0,005%) v 0,1 M fosf&tovém pufru o pH 7,0. Částice s enzymatickou účinností budou tvoŕit purpurovou zónu. V dalším provedení je možno identifikovat částice nosiče s bio-oligomerem s účinností proteázy pŕidáním známých kolorimetrickýc'n substrátu pro proteázu.
Koenzymatickou účinnost je možno pozorovať tak, že se sleduje enzymatické účinnost, críznivš ovlivnená koenzymem tam, kde není prítomen prírodní nebo obvyklý koenzym.
Inhibiční účinek na enzymatickou reakci je možno prokázat pri.použití částečne uvoľneného bio-oligomeru. Uvoľňovaní bio-oligomeru bálo již popsáno «vrchu v odstavcích
5.4 a 5.5.2. V jednom z možných prevedení se banka bio-oligomeru navrství na polotuhou matrici, kcerá obsahuje enzým.
Σ banky se pak částečné uvoľní bio-oligomer. V prípade, že bio-oligomer pusobí inhibici enzymatické účinnosti, je možno identifikovať oblast bez produktu. V jednom z provedení je substrát enzýmu chromogenní a vytváňí se barevný produkt.
To znamená, že prítomnost inhibítoru enzýmu se prcjeví prítomností oblasti bez zbarvení. V daiším možném provedení je možno prokázat inhibici proteolyzy hemoglobínu nebo indikátorového enzýmu jako alkalické fosfatázy prítomností opakní zóny v polotuhé matrici. K tomuto jevu dochází proto, že prítomný inhibítor proteolýzy bráni degradaci hemoglobínu nebo indikátorového enzýmu.
Je dobre známo, že bio-oligomerem s enzymatickou účinností, účinností koenzymu nebo schopností pusobit inhibici enzymatické účinnosti muže být peptid, oligonukleotid nebo chimérní peptid-oligonukleotid. Zvláštni význam mají usmernené nebo cirkularizované peptidy, které mohou dát vznik katalytickým místúm nebo zónám, jak již bylo svrchu popsáno v odstave! 5.2.1. Je také možno očekávat, že chimérní peptidoligonukleotid bude mít zvláštni chemické vlastnosti, napríklad enzymatickou účinnost nebo účinnost koenzymu vzhledem ke zvláštni vzájemné poloze odpcvídajících funkčních skupin. Mimoto je možno predpokládat, že bio-oligomer, vázaný na nosič múže mít enzymatickou účinnost nebo účinnost koenzymu, kdežto volný bio-oligomer múže být neúčinný. To múže být zpúsobeno také tím, že molekuly bio-oligomeru jsou prítomností nosiče, na néjž jsou vázány,'vlastné zhustený. Bio-oligomer také múže zpúsobit inhibici účinnosti enzýmu nebo koenzymu po uvolnení z částice nosiče. Bylo by také možno chemicky zabudovať známé enzymy (kofaktory) do usmerneného bio-oligomeru k simulaci jednoduchého nebo komplexního enzýmu včetné, napríklad, retézce pro transport elektronú.
5.ô. Zpusoby charakteriz.ace bio-oligomeru
Jakmile je identifikovaná častice nosiče s hledanými vlastnostmi nekterou z metód podie svrchu uvedeného odstavce 5.5, je možno stanoviť strukturu a celý ŕetézec identifikovaného bio-oligomeru.
V prípade, že bio-oligomerem je peptid, je vhodnou metodou analyzy retézce Edmanova degračace. Zvlášté výhodné je automatická analyzování retezce, napríklad pri použití Applied Biosystems 477A Protein Sea.uencer. Je také možno určit ŕetézec aminokyselín v peptidu buď bombardovaním rýchlymi atómy v hmotové spektroskopii (FAB-MS) nebo dalšími analytickými postupy.
Ŕetézec peptidu je možno analyzovať buď na nosiči nebo po odštépení z pevného nosiče. K odštépení peptidu se na oddelené častice nosiče s peptidem pusobí obvyklými činidly pro odštépení polyméru od pevného n osiče. Volba činidla pro toto odštépení závisí na použitém pevném nosiči. Napríklad k odštépení peptidu z pryskyŕice Wang je výhodné použití 50% kyseliny triflouroctové (TFA) v dic’nlormethanu.
Je také možno postupovať tak, že se izoluje jediná pevná fáze nosiče, napríklad jeho častice s navázaným biooligomerem a tato částice se pŕivede do analyzátoru, aniž by byl bio-oligomer pŕedem od částice odštepen. Napríklad v prípade, že bio-oligomerem je peptid, obsahuje jediná částice pryskyŕice s prumérem 100 ^um se substítucí. rpyskyŕice 0,5 mekv/g približné 200 pmol peptidu. Jediná částice pryskyŕice PAM s prumérem 250 ^um a substitucí 0,5 mekv./g pryskyŕice obsahuje približné 3 125 pmol peptidu. V prípade současných automatických analyzátoru retézce je pro spolehlivou analýzu zapotŕebí pouze 5 až 10 pmol peptidu. Je tedy zrejmé že jediná častice pryskyŕice PAM s prúmérem 100 ^um obsahuje více než dostatečne množství peptidu pro analýzu retézce.
V prípade, že peptidy obsahují aminokyseliny nebo látky, podobné peptidum, které nejsou prístupné Edmanovš degradaci, je možno částice pňipravit tak, aby 10 až 50 % peptidú neobsahovalo zbytek, který uvedené metóde odoláva. Zbývající retezec je pak možno stanoviť a retézce s nestanovitelným zbytkem odvodiť extrapolací.
Dalším zpusobem, který je možno použít pro zbytky, které nelze bežným zpusobem analyzovať je dočasná ochrana části peptidu pred vaz'oou uvedeného z’oytku v prúbehu syntézy banky. V prúbehu následné identifikace štruktúry se užije Edmanovy degradace až k uvedenému z’oytku, pak se odtraní ochranná skupina a analyzuje se druhá polovina (C-termínální část) retézce až k uvedenému zbytku.
V prípade oligonukleotidú je možno analýzu ŕetezce provést na automatickém zaŕízení (napr. Applied Biosystems).
Výhodný je postup podie Maxama a Gilberta, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564. je však možno použít i jiných známých postupu.
Pri spektrofotometrii s bombardováním ryc'nlými atómy je patrné možno analýzu uskutečnit nejúčinnéji. Detekcí fragmentu i typu bio-oligomeru je možno rekonštruovať celý retezec. Pri provedeni ’nmotové spektrometrie (Einnigan MAT) je možno současné získat údaje o štruktúre i analýzu retézce.
Jakmile je stanoven retezec ’oio-oligomeru, je možno synthetizovat jeho velké množetví chemicky automatickým zaŕízením nebo jinými biologickými nebo chemickými postupy. Je v ném také možno ménit nékteré části ke zvýšení jeho špecifické biologické účinnosti.
5.7. Látky pro léčebné a diagnostické účely z bank nahodilých bio-oligomeru.
Jakmile byl určen retezec príslušného bio-oligomeru, je podie vynálezu možno získat molekuly, které obsahují ŕetézec bio-oligomeru pro použití k léčebným nebo diagnostickým účelúm. Retezec bio-oligomeru múže sám o sobé být diagnostickou nebo léčebnou látkou nebo jej je možno zabudovat do betší molekuly. Molekulu, obsahující retezec bio-oligomeru s biologickou nebo väznou účinností je možno označiť jako efektorovou molekulu. Vynález dále poskytuje banky pro použití k rúzným účelúm. ľfektorová funkce uvedené efektorové molekuly múže být kterákoliv z funkcí, které byly svrchu popsány nebo které jsou v oboru známy.
Popsaný postup je nejen novým nástrojem pro vyhledávání špecifických vaznývh ŕetezcú diagnostické nebo léčebné hodnoty, nýbrž poskytuje také dúležitou informaci o celé rade väzných ŕetezcú nebo potenciálne velni se lišících primárních ŕetezcú nebo chemických sloučenin, které mohou být pŕesto schopné interakce s totutéž molekulou akceptoru. Po integraci takové informace s molekulovým modelováním a moderní počítačovou technikou bude patrné možno získat hlubší porozumení interakcí väzných ŕetezcú a receptorú.
Léčiva podie vynálezu zahrnují molekuly efektoru, který se váze na biologicky aktívni polohy cytokinú, rúscovýc: faktorú nebo hormonálních látek a tím podporuje nebo neutralizuje jejich účinek a múže blokovať nebo podoprovat také trans kripci a/nebo translaci.
Léčiva podie vynálezu zahrnují také efektorové molekuly, které se mohou vázat na receptor, farmakologicky zajímavý, napríklad na receptor rústového faktoru, nervového pŕenašeče nebo. hormonu. Tyto molekuly je možno použit jako agonisty nebo antagonisty púsobení pŕírodních väzných ŕetezcú.
molekuly, schopné se azbe za úcelem blokov é si získavaj í pristu receptory. Príkladem
Dalším využitím efektorové zat na receptory je její použití k v väzby víru nebo mikroorganismú, kter do bunky väzbou na normálni bunečné am hoto jevu múže být vírus lidské imunodeficience na receptor CD4 a vazba viru herpes simplex na receptor rústového faktor! fibroblastú. Efektorové molekuly, které obsadí receptor je možno použít jako farmakologicky účinné látky, které blokují vírovou infekci na cílových bunkách. Podobným zpúsobem by bylo možno dosáhnout inhibice invase parasitu do ’ouňky po identifikaci vhodných efektorových molekúl zpúsobem podie vynálezu.
V dalším provedeni je možno použít efektorcvou mole kulu, obsahující retézec bio-oligomeru, který se váže na molekulu akceptoru jako cíl pro toxín nebo jínou látku. Ve výhodném provedeni je akceptorovou molekulou receptor nebo antigén na povrchu nádorové bunky, živočíšneho parasita nebo mikroorganismu, napríklad baktérie, víru, jednobunéčného parasita, jednobunéčného pathogenního mikroorganismu, houby nebo plísné.
Mimoto je možné, že nékolik bio-oligomerú z mnohá miliónu, prítomných v bance bude mít retézce s biologickou účinností. Je zásadné možno izolovat bio-oligomery, které mají protinádorovou, antiparasitární nebo antimikro'oiální, napríklad protihou'oovou, antibakteriální, antiparasitární nebo protivirovou účinnost. Mimoto mohou být p.ékteré z téchto bio-oligomeru agonisty nebo antagonisty rústových faktcrú jako erythropoetinu, epidemálního rústového faktoru, rústové ho faktoru nádorú, rústového faktoru fibroblastú a také hormonú, nervových pŕenašeču, imunomodulátorú nebo jiných ŕídících molekúl. V jednom z možných provedeni jsou bio-oligomerem peptidy.
5δ
Léčiva podie vynálezu také zahrnují efektorové molekuly, obsahující retézce bio-oligomeru s vysokou afinitou pro léčiva, napríklad pro disoxin, benzodiazepam,· heroín, kokaín nebo theofylin. Takové peptidy je možno použit jako antidota pri predávkování takových léčiv. Podobné je možno efektorové molekuly s obsahem léčiv vázat na. malé molekuly, nebo také na kovové ionty včetné iontu téžkých kovu. Retézze bio-oligomerú s vysokou afinitou k bilirubinu by mohly být užitečné pri léčení hyperbilirubinemie novorozencú.
Obecné je možno uvést, že vynález poskytuje možnost identifikovať retezce bio-oligomerú pro léče'bné účely pri léčení nemocí a chorobných stavu, tak jak jsou uvedený napríklad v Product Category Index of the Physicians Desk Reference PDR, 1991, 45. vydání, Medical Economics Data: Oradall, NJ, str. 201-202. Je napríklad možno identifikovať efektorovou molekulu s účinkem antiparasitárnim, antikoagulačním, antagonistickým proti antikoagulantiím, antidiabetickým, protikrečovým, antidepresivním, protiprújmovým, antidotálním, antigonadotropinovým, antihístaminovým, antihypertensivním, protizánétlivým, protizvracivým, protimigrenosním, antiparkinsonickým, proti shlukování destiček, protisvédivým, antipsychorickým, antipyretickým, antitoxinovým (napríklad protijedovým) , bronchodilatačním, vasodilatačním, chelatačním, kontraceptivním, relaxačním na svalovou tkáň, antiglaukomatosním nebo sedativním.
Léčivé prostŕedky podie vynálezu mohou taé obashovat príslušné, z farmaceutického hlediska prijatelné nosiče, redidla a pomocné látky. Farmaceutické nosiče mohou být sterilní kapaliny, napríklad voda a oleje včetne ropy, s tuku živočišného, rostlinného nebo synthetického púvodu, jako jsou podzemnicový olej, sójový olej, minerálni oleje, sezamový olej a podobné. Voda je výhodnýmnosičem v prípade, že se farmaceutický prosterdek podává nitrožilné.. Jako kapalné nosí 57 če je možno použit také roztoky chloridu sodného, zejména fysiologický roztok a roztoky dextrózy a glyperolu.ve vode, zvlášté pro injekční roztoky. Vhodnými farmaceutickými pomocnými látkami jeou škrob, glukóza, laktóza, sacharóza, želatína, slad, rýžová mouka, kŕída, sílikagel, uhličitan hc- rečnatý, stearan horečnatý, stearan sodný, giycerolmonostearát, mastek, chlorid sodný, sušené odstredené mléko, glycerol, propylenglykol, voda, ethanol a další. Farmaceutické prostŕedky mohou mít formu roztoku, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, prášku, lékových forem se zpomaleným uvoľňovaním účinných látek apod. Vhodné farmaceutické nosiče byly popsány v publikaci Remington's Pharmaceutícal Sciences, í.W. Martin. Obvyklé farmaceutické prostŕedky obsahuji účinné množství léčiva spolu s vhodným množstvím nosiče tak, aby vznikla léková forma, vhodná pro podaní nemocnému. Nitrožilní injelce je sice velmi účinnou formou podaní, je však možno použít i další formy,napríklad injekční podaní jinou cestou, perorální, nosní nebo jiné parenterální podaní.
Molekula, obsahující ŕetézec bio-oligomeru, určený zpúsobem podie vynálezu muže být užitá také pro výrobu diagnostického prostŕedku. Diagnostický prostŕedek muže obsahovat jeden nebo vetší počet ŕetezcu bio-oligomerú podie vynálezu, napríklad více než jeden peptidový nebo více než jeden oligonukleotidový ŕetézec. Mimoto muže diagnostický prcstŕedek obsahovat kterýkoliv z nosiču, které byly popsány svrchu pro farmaceutické léčebné prostŕedky.
Pod pojmem diagnostický prostŕedek se rozumí prostŕedek, který je možno použit pro detekci určitého stavu nebo jevu, jako napríklad nádoru, jako lymfomu z T nebo Bbunék nebo infekční'no onemocnení, jak již bylo svrchu uvedeno. Pojem detekce se užívá v nejširším smyslu tak, aby zahrnoval prukaz existence stavu, místa nebo části tela, účast ničí se stavu, nebo aby bylo možno rozpoznat závažnost stavu
Napríklad je možno komplex imunoperoxidáza z krenu a peptidu nebo podobnou imunochemicky účinnou látku, použít k detekci a kvantifikaci špecifického receptoru nebo molekuly protilátky ve tkáni, séru nebo jiné telesné tekuitne.. Diagnostické prostŕedky je možno použít in vivo i in vitro. Vynález poskytuje zejména použitelné a užitečné diagnostické prostŕedky pro použití v imunologických zkouškách, hybridizaci Southern nebo Northern blot a pro zkoušky in situ.
Mimoto múže diagnostické činidlo obsahovat jednu nebo vétší počet značících prostredku, napríklad radioisotopy fluorescenční látky, paramagnetické látky nebo jiné látky, usnadňující zobrazení. Odborník zná škálu téchto látek a zpúsoby jejich zarazení do diagnostických prostŕedkú.
Farmaceutické prostŕedky, určené pro. léčení a diagnostické prostŕedky podie vynálezu je možno použít pro léčení a pro diagnózu u-živočichu, s výhodou savcu včetné človeka, avšak také psú, koček, koní, kráv, vepŕu, morčat, myší a krýs. Léčebné a diagnostické prostŕedky je možno použít také k léčení a/nebo diagnostice chorob rostlin.
Onemocnení a stavy, prístupné pro léčení nebo diagnózu pomoci bio-oligomeru podie vynálezu jsou velmi rúzné, stejne jako permutace štruktúry banky nahoidlých bio-oligomeru. K osvetlení nekterých provedení, nikoliv však k omezení rozsahu vynálezu busou dále uvedený nekteré špecifické príklady použití vynálezu.
5.7.1. Cytotoxické prostŕedky
Molekula, tvorená ŕetézcem bio-oligomeru múže sama o sobé mít špecifickou cytotoxickou účinnost. Bio-oligomer, který se váze na príslušný akceptor múže také být modifiko- 59 ván postupy, které jsou v oboru bežné známé, napríklad konjugací s cytotoxickou sloučeninou, jako drogou nebo radionuklidem, čímž vznikne cytotozická molekula. Bio-oligomer, napríklad peptid, múže zamerit účinek cytotcxické sloučeniny a špecificky zprostredkovat zničení 'cunek,, na než jsou vázény určité akceptorové molekuly. Je napríklad možno konjugovat cytotoxickou látku tak, aby došlo k odstránení nežádoucích populací B-bunék, napríklad v prípade lymfomu z B-bunék, populace T-bunek nebo lymfomy z T-bunék u nemocného. Potenciálni klinická aplikace zahrnuje léčení autcimunních chorob, lymfomu a špecifickou imunosupresivni léčbu v prípade transplantací orgánu. Tímto zpusobem by bylo pravdepodobne možno léčit také ty formy nádorú, pri nichž nádorové bunky produkuj! väzný retezec, schopný väzby na receptor, jako tomu je v prípade karcinomu mléčné žlázy a vaječníkú, kde hraje svou úlohu pravdepodobne receptor epidermálního rústového faktoru EFG.
Cytotoxické látky, špecifické pro cílovou bunku, napríklad bunku zhoubného nádoru nebo bunku, napadenou virem, avšak nejedovaté pro okolní zdravé bunky, tkané nebo' orgány by rovnež mélo být možné tímto zpusobem získat. Bude možno nejen cílené odstranit nežádoucí bunky, jako nádorové bunky, nýbrž využít nékterých toxínu také jako účinných antimikrobiálních látek. Zejména jde v tomto prípade o bakteriostatika, bakteriocidní látky, protivirové látky, antiparasitární látky nebo fungicidní sloučeniny. Podobné je možno identifikovat i toxíny s insekticidním nebo herbicidním účinkem.
V jednom z možných provedeni múže být bio-oligomerem peptid. Tento peptid múže být látkou, napomáhající zasáhnout cíl, k nemu je pŕipoje.n toxin. V jiném možném provedeni múže peptid splnit obe úlohy a účinkcvat jako látka, zasahující cíl i jako toxin. V dalším provedeni múže být bio-oligomerem oligonukleotid, jeho vliv múže být vykonán preš transkripci nebo translaci, podstatnou pro životncst bunky.
5.7.2. Modifikátory imunity .
Podie vynálezu je možno získat molekuly a prostŕedky pro použití k modifíkaci imunologické odpovedi. Pod tím to pojmem se rozumí molekuly nebo sloučeniny, schopné zpúsobit zmeny v imunologickém systému. Zvláštš mohou modifikátory imunity stimulovať nebo zpúsobit inhibici odpovedi T-bunék, B-bunék a také nešpecifické imunologické odpovedi, tak jak jsou zprostredkovány činností makrofágu, neutrofilu, polymorfonukleárních fagocytárních bunék, granulocytú a jiných bunék myeloidní linie. Efektorové molekuly je možno použit k ovlivnéní následujících imunologických stavu:
a) ruzná autoimunologická onemocnení jako myasthenia gravis, roztroušená skleróza, Graveho onemocnení, rheumatoidní arthritis, systemický lupus erythematosus (SLE), pemphigus vulgaris, autoimunologická hemolytická anemie a ťnrombocytopenie,
b) lymphom jiného než Hodgkinova typu a další zhoubná onemocnení ,
c) alergie
d) komplex imunologických chorob,
e) odmítnutí transplantovaných orgánu a
6) infekční onemocnení a
ý) diabetes mellitus.
Modifikátory imunologické odpovedi mohou stimulovať imunologickou aktivitu tak, že napodobuj í účinnost lymphokinu jako interelukinu IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, faktoru, stimulujícího tvorbu kolonií granulocytú CSF nebo makrofágu a granulocytú/makrofágú a podobné. Ke stimulaci múže dojít účinností peptidu, který se váže na väzný retézec receptoru lymphokinu nebo oligonukleotidem zprostredkovanou aktivací bunečného ústroji pro transkripci. Modifikátor Imunologické odpovedi múže púsobit väzbou na leukocyt nebo lymfocyt, jako F-recep61 tor, LAF-1, LAF-2 apod., indukcí účinnosti, napríklad fagocytózy nebo uvlonením cytotoxinú. Efektorová molekula podie vynálezu muže púsobit také jako chemotaxin.
Ve zvláštním provedení muže molekula, obsahující bio-oligomer napodobovat antigén. Pak múže být bio-oligomer vhodnou vakcínou k vyvolaní aktivity T-'ounek ne'oo B-bunek, špecifické pro určitý pathogen. Antigén (epitop) je možno použít také k zesílení špecifické imunologické odpovedi.
Je zrejmé, že efektorové molekuly podie vynálezu budou účinné v uvolnené forme. Avšak určitý bio-oligomer 9 ·’· .........
muže mít vyšší účinek v prípade, že zustane vázán na pevný nosič. Zejména vysoká hustota napodobeného epitopu múže daleko účinnej i stimulovat odpoveď B-bunšk svou väzbou na imunoglobulin membrány nebo zprostŕedkovat j inou odpoveď pŕes príslušný receptor.
Bude patrné možno použít také omezené banky podie vynálezu jako vakcíny v prípade pathogenú,které mají rúzné epitopy. Je napríklad známo, že primárni štruktúra (ŕetézec) VSG (variabilní povrchový glykoprotein) trypanosomy se mení v prúbehu infekce s časem. Zmenou epitopu VSG unikne trypanosoma imunologickému rozpoznaní. Podobne parasit, vyvolávající malarii má tu vlastnost, že u nej dochází k expresi rúzných antigenních epitopú v rúzných jeho druzích v rúzných fázích životního cyklu. Znamená to, že pomoci banky s omezenou diversitou by bylo možno dosáhnout imunizace proti variabilním antigenúm, produkovaným parasity, vavolávajicími malarii a proti trypanosomám. Omezená banka múže mít své použití jako vakcína v jakémkoliv prípade, kdy je požadována imunita proti celé skupine antigenú.
Je pravdepodobné, že efektorové molekuly mohou také zpúsobit inhĺbici imunologické odpovedi tak, že
i) blckují špecifickou imunologickou odpovéď-na úrovni protilátky nebo receptoru antigénu v T-buňce, ii) blokovaním receptoru F nebo jiné’no receptoru, iii) väzbou na lymphokiny a cytokiny s následnou inhi'oicí účinnosti techto látek a iv) negativními zpetnými signály, pŕivádenými k bunkám, které zprostredkují imunologickou odpoveď.
Efektorové molekuly je možno použít k dosažení tolerance imunologického systému napríklad pro autoimunní antigény. Napríklad tolerance imunologického systému k DNA by bylo možno dosáhnout pomoci oligonukleotidu nebo banky oligonukleotidú, tento postup by mohl být úspešný pri léčbe SLE. Mimoto by mohlo být- dosaženo inhibice imunního systému zpúsobem, popsaným svrchu v odstavci 5.7.1.
Mimoto mohou farmaceutické prostredky podie vynálezu obsahovat vybrané synthetické peptidy s antigenním účinkem, jimiž by bylo možno dosáhnout tolerance imunologického systému k určitému antigénu a tak potlačit nebo i vyléčit odpovídající autoimunologické onemocnení. Podobne by bylo možno pri použití špecifických synthetických antigenních peptidú možno zpúsobit inhibici tvorby vícesložkových imunologických komplexú a tím i zabránit vzniku složitých imunológie kých onemocnení.
Peptidy, schopné väzby na monoklonální protilátky, špecifické pro nádory je možno izolovat, analyzovat jejic’n retezec a synthetizovat pro použití jako imunogeny k indukci aktívni imunity proti nádoru.
Špecifické peptidy s vysokou afinitou vzhledem k receptorúm Fc by mohly být použitý jako léčiva k blokovaní receptorú Fc retikuloendotheliálního systému, což by bylo pŕíznivé pro nemocné s autoimunologickými chorobami, jako jsou idiopatická throm'oocy topenie nebo autoimunologická hemolytická anemie.
Možnosti pro použití peptidu k léčebným účlúm by mohlo být ješté širší. Peptidy, napodobující epitopy invadujících organismú by mohly být použitý k zastavení infekce organismu. Napríklad současné výsledky štúdií s AIDS prokázaly, že infekce virem AIDS začíná rozpoznaním a väzbou mezi špecifickým glykoproteinem (gpl2O) na obalu viru AIDS a povrchovým receptorem CD4 bunky. V prípade podáni peptidu, napodc bujícího gpl2O je možno dostatečným zpúsobem blokovať receptor CD4, takže vírus AIDS se na tento receptor nebude mocí vázat a nebude tedy ani schooen infikovať buňku. Podobné by bylo možno dosáhnout inhibice invase parasitú a infekcí.
5.7.3. Neuroaktivní agonisté a antagonísté
Je pravdépodobné, že efektorové molekuly podie vynálezu budou agonizovat (nebo napodobovať účinek) nebo antagonizovat (púsobit inhibici) účinkú hormonú, nervových prenašečú, analgetík, anesthetik, antipsychotik, antidepresivních látek nebo narkotik. Takové efektorové molekuly by mohly být užitečné pro získání regulátorú chuti k jídlu, psychiatrických léčiv, modulátorú schopnosti se soustredit a zapamatovat si apod. Vynález je možno také využít k modifikaci vnímání určitých podnétú, bylo by napríklad možno navodiť pocity sladké nebo slané chuti apod.
5.8. Omezené banky
Je dále možno predpokládat, že omezené banky podie vynálezu by mohly 'oýt zdrojem komplexních chutí, napríklad typu rúznýc’n korení pri nižší cene a bez prípadných alergických reakcí. Bylo by tak možno nahradiť nákladná korení, nap ríklad šafran nebo vytvorit nové kombinace chutí.
V dalším provedení múže být omezená. banka zcela zvláštním chromatografickým materiálem. Je možno predpokladať, že banka bio-oligomerú, napríklad peptidu s nékterými společnými chemickými vlastnostmi, avšak s radou rúznýoh retézcú bude vhodnejším chromatografickým materiálem než současne dostupné materiály. Tyto materiály napríklad budou selektivnejší než iontomeničové materiály nebo materiály v reversní fázi. Čistenou molekuly by také bylo možno z nosiče vymývyt snadno a za šetrnejších pomdínek, než jaké je možno použít napríklad pri provádšní imunoafinitní chromatografie, čímž současne bude méné pravdepodobná denaturace Sišténé látky.
V jednom z možných provedení je možno pripraviť nosič na základe složení nebo struktry bio-oligomeru, tak aby došlo k požadovanému stupni afinity nebo k väzbe na špecifické molekuly akceptoru ve vysoké koncentrací. Mimoto by bylo možno rýchle identifikovať vysoce selektivní nosič bez použití čišténého materiálu, jak bylo také svrchu popsáno v odstavci
5.5.1.
V dalším možném provedení je možno pripraviť částice nosiče s nízkou afinitou a omezenou banku pripraviť s použitím určitých částic nosiče. V ješté dalším možném provedení je k chromatografickým účelúm možno použít částice nosiče s nízkou nebo vysokou afinitou, nesoucí jeden nebo nekolik retézcú bio-oligomeru, identifikovaných z miliónu ŕetezcú podie vynálezu.
Vynález bude dále osvetlen následujícími príklady, které však neamjí sloužit k omezení rozsahu vynálezu na popsaná provedení.
6. Príklad: Synthesa tetrapeptidové banky
Zpusob podie vynálezu byl použit pro prípravu tetrapeptidové banky s peptidy vzorce X-X-X-Trp, kde X muže znamenať valin, serin nebo alanin a první aminokyselinou je vždy tryptofán. Tryptofán byl zvolen pro karboxy-terminální zakončení k usnadnení spektrofotometrického sledovaní pri OD28O al f a
N -Fmoc-tryptofan-alkoxymethylpolystyrenová pryskyrice, popsaná v publikaci Wang, 1973, J. Amer. Chem. 95: 1328-1333 (Bachem Inc., Torrence, Ca.) byla vložená do nádoby pro bežné provádení syntézy peptidu na pevném nosiči. Pro pridání byly užitý rovnéž Fmoc-aminokyseliny (Bachem Inc.). Další reakční složky byly volený z bežných složek, obvykle užívaných pri syntéze na pevném nosiči, tak jak jsou popsány. napríklad v Austen, 1988, Peptide Synthesis, Methods in Molecular Biology, sv. 3. str. 311-331.
Pro väzné reakce byla použitá nádoba s víkem, povlečeným Teflonem a k mísení jednotlivých podílu nosiče po provedené reakci byla rovnéž použitá štandardní nádoba pro provádéní syntézy na pevném nosiči.
Približné 0,5 g Fmoc-Trp-alkoxymethylové pryskyrice bylo nabobtnáno ve 20 ml dichlormethanu (DCM). Pak byla pryskyrice dvakrát promyta DCM, jednou smésí DCM a dimethylformamidu 1:1 a trikrát dimethylformamidem (DMF). Pak byla pryskyrice zbavena ochranných skupín pusobením 20% piperidinu v DMF (objemová %). Po dukladném promytí pryskyrice, zbavené' ochranných skupín 3 x DMF, 3 x DCM a 2 x smésíDCM a DMF 1:1 byla pryskyrice znovu uvedená čo suspenze v približné
7,5 ml DMF a rozdelená na tri podíly o približné 2,5 ml a pak rozdelená do tri očíslovaných zkumavek pro uskutečnéní další väzby.
Na pryskyňici již je navázán tryptc-fán, k materiálu se nyní pridá množství chránené aminokyseliny, odocvídající množství vázaného tryptcfanu. Pre každou aminokyselinu, která má být navázána se užije petinásobného molárního prebytku aminokyseliny, který se pridá do nádoby, v níž se již nachází podíl promyté rpyskyrice. Do každé nádoby se pridá pštinásobný molární prebytek jiné aminokyseliny Pak se každá nádoba dve minutý protrepává, načež se pridá pétínásobný molární prebytek diisopropylkarbodiimidu (DIC) ve 3 ml DCM, načež se smés ješté 1 hodinu protrepává.
Aby bylo možno tkontrolovat úplnost väzby, byl vzorek z každé zkumavky zkoušen ninhydrinovým reakčním činídlem (Pierce Chemical) zpusobem, popsaným v Sarin a další, 1981, Anál. Biochem. 117: 147-157. V prípadé, že väzná reakce není zcela dovŕšená, jak je možno tímto testem prokázat, pokračuje se v reakci až do jejího dovŕšení, čehož je možno dosáhnout nekolika známými zpusoby, napríklad
a) druhou väzbou pri použití jedno- až petinásobného prebytku chránené aminokyseliny,
b) další väzbou pri použití odlišných nebo pŕídatných rozpouš· téčel, napríklad trifluorethanolu, nebo
c) pridaním c'naotropických solí, napríklad NaClO^ nebo LiBr (Klis a Stewart, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Riviér a Marshall eds, ESCOM Publ., str. 904-906.
Po dovŕšení väzby se rpyskyrice ze tri zkumavek, v nichž byla vazba provedena pečlivé pŕenesou a smísí v jediné mísící nádobé. Pak se rpyskyrice dvakrát promyje DCM/DMF (1:1), 3 x DCM, 3 x DMF a pak se odstráni ochranné skupiny pusobenim 20% piperidinu v DMF (% objemová). Po dukladném promytí DCM a DMF svrchu uvedeným zpusobem se smés opét rozdelí na tri počíly a tyto podíly se pŕenesou do tri oddelených reakčních nádob. Pak se pridá druhá skupina aminokyselín Po ukončení väzby se opet nejprve odstráni ochranné skupiny púsobením 20% piperičinu, pak se pryskyrice dôkladne promyje DCM a DMF tak, jak bylo svrcbu popsáno. Pak se stejným zpúsobem uskuteční vazba tretí aminokyseliny.
K odetšpení peptidu z pevného nosiče se k částicím pryskyrice pridá 30 ml 50% (% objemová) kyseliny trifluoroctové TFY, 5 % anisolu a 0,9 % (objemových) ethandithiolu v DCM. Pak se smes čtyri hodiny protrepává a supernatant s obsahem peptidu se oddelí. Pak se supernatant odparí na rotačním odparovači a peptidy se vysráží etherem. Po dukladném promytí se sraženina peptidú suší a je pripravená pro další analýzu. Lyoŕilizovaný peptid (ve forme prášku) se skladuje ve zmrazeném stavu.
7. Príklad: Srovnání zpúsobu podie vynálezu s bežnou metodou synthesy peptidú
7.1. Materiály a methody
Banka nahodilých tetrapeptidu byla pripravená svrchu popsaným zpúsobem (Príklad 6). Mimoto byla pripravená banka tetrapeptidu pri použití synthesy bežného typu na pevném nosiči (dále SPPS), tak jak byla popsána ve svrchu uvedené pu- ’olikaci Austenove. Jako kombinace pevného nosiče a aminokyalfa seliny byla uzita N -Fmoc-tryptofa-alkoxymethylova rpyskyŕice (Bachem, Inc.). V prubenu každého stupne väzby bylo do alfa reakční nádoby pridáno pétinásobné molární množství N aXr*a alfa
Fmoc-valinu, N -Fmoc-serinu (O-Bu) a N -Fmoc-alaninu.
Po tŕech po sobé následujících stupních väzby byly tetrapeptidy odštepeny púsobením 50% TFA, 5% anisolu a 0,9% ethandithiolu (jde vždy o % objemová) v DCM zpúsobem podie svrchu uvedené Austenovy publikace.
7.2.' Výsledky
Obe peptidové banky byly analyzovaný na HPLC chromatografickém sloupci C-1S v reversní fázi (Vydac), aby bylo možno prokázat počet rúzných peptidú v bance (počet vrchoiú) relatívni koncentrací téchto peptidú (plocha vrchoiú) a relatívni hydrofilní povahu peptidú (Časná nebo pozdni eluce ze sloupce. Výsledky jsou znázornený na obr. 1. Chromatogram v horní části (Obr. IA) byl ziskán pri použití banky peptidú podie vynálezu, druhý chromatogram ve spodní části (Obr. 13) byl získám pri použití SPPS.
V obou častech je možno odlíšit 21 vrchoiú, což uka žuje na prítomnnost alespoň 21 odlišných peptidú v každé ban ce. Avšak v chromatogramu, získanénj pri použití SPPS jsou podstatné vétší vrcholy 1, 2, 3, 4, 5, 6a7, což znamená, že banka obsahovala vétší koncentrací peptidú 1 až 7 než pep tidú 8 až 21. Zvýšené množství peptidú 1 až 7 prokazuje, že tyto peptidy byly prednostné synthetizovány na úkor peptidú 8 až 21. Mimoto docházelu u téchto vrchoiú k časné eluci ze sloupce, to znaemná, že uvedené peptidy mély kratší dobu retence ve sloupci a mély tedy hydrofilnéjší povahu než ostatní peptidy 8 až 21.
Tento výsledek nebyl pri použití systému SPPS neoče kávaný. Je známo, že valin je hydrofobní a má podstatné pcma lejší rychlost väzby (patrné vlivem sterické zábrany) než je rychlost väzby ala.ninu nebo serinu. To znamená, že pri bežne nahodilé väzbe svrchu uvedeným zpúsobem, pri níž se valin dostává do kompetice pri väzbe společné s alaninem a serinem musí čojít k tomu, že svnthetizované peptidy jsou na valin chudé a že tedy' v získané bance není distribuce nahodilých peptidú ekvimolární.
Na druhé strane je z chromazogramu banky náhodilých peptidu, získané zpusobem podie vynálezu zrejmá ekvimolární distribuoe peptidú v bance. Prestože plocha vrcholu 3, 6,
12, 13 a 1S je približné dvojnásobná než plocha vrcholu ostatních, což ukazuje na prítomnost dvou peptidu v tomto místé, vetšina ze zbývajících 15 vrcholu' má temer totožnou plochu. Mimoto všech 21 vrcholu je rovnomerne rozloženo po celkové dobé retence, což rovnéž prokazuje ekvimolární dístribuci jednotlivých peptidu.
U vybraných vrcholu byl analyzován retezec. Analýza retezce byla provedena u menších vrcholu 8, 9 a 21 a u velkého vrcholu 5. K analýze bylo použito automatického zaŕízení (Apllied Biosystems 477A) s následujícím výsldkem:
vrchol 8 : Val-Ala-Ser-Trp vrchol 9 : Val-Ser-Ala-Trp vrchol 21: Val-Val-Val-Trp vrchol 6 : (Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp
Tyto valin obsahující retezce potvrzují, že zpusob podie vynálezu umožňuje uskuteénéní skutečné riahodilé synthesy peptidu i v prípade použití aminokyselín, o nichž je známo, že jejich rychlost väzby je nízka.
Retezec pro vrchol 6 není vyčerpávajúcim zpusobem uveden vzhledem k tomu, že ve vrcholu se nacházelo pravdepodobné vatší množstvi peptidu. Retezce dvou hlavních peptidu však patrné jsou Ser-Ala-Ala-Trp a Val-Ser-Ser-Trp.
7.3. Závery
Výsledky ukazují, že zpusobem synthesy náhodilých peptidu podie vynálezu je možno získat banku náhodilých peptidu s v podstate ekvimolárním množstvím jednotlivých peptidu r: «9ϊ»γ«ϊλ
- 70 na rozdíl od standardního postupu SPPS, pri nemž prevažuje v bance ten peptid, který obsahuje zbytky aminokyselín s vyšší rýchlostí väzby.
8. Príklad: Izolace peptidu jako väzného retezce, který se váže na molekulu receptoru
Aby bylo možno prokázat použitelnost zpúsobu podie vynálezu pro izolaci určitého peptidu, byl synthetizován peptid, obsahujicí 12 aminokyselín s predem stanoveným ŕetezcem produktu génu V-mos. V-mos je onkogen, izolovaný z myšího sarkomu a je príbuzný viru Moloneyova sarkomu u myší. Je známo, že produkt génu V-mos má aktivitu serin/threoninkinázy.
8.1. Materiály a metódy
Retézec Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala byl synthetizován na polyakrylamidové částici o prúméru priblizne 300 ^um pri použití Ν&-χ -Fmoc-amino.ykselin a reakčních činidel a postupu, užívaných pri bežné svnthese peptidu na pevném nosiči. Ochranné skupina na postranním retezci byly odstránený 50% TFA, peptid zústal kovalentné vázán na polyakrylamidovou pryskyrici pred väzný retézec, ethylendiamin-kyseliny aminokapronové, čímž byľa získána konečná štruktúra Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala-aminokapronová kyselina-ethylendiaminová pryskyrice (dále bude tento materiál uvádén jako dlouhá v-mos-Částice). Tento retézec peptidu odpovídá zbytkum 100 až 111 v produktu génu v-mos.
Pri použití téže metódy byl synthetizován kratší peptid ze zbytku 106 až 111 produktu génu v-mos s ŕetézcem Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala, rovnež na polyakrylamidové částici pri použití téhož väzného retezce (krátka v-mos-částice). Tento peptid byl užit jako negatívni kontrola.
Bunečná linie hyb ri cicnu , produkuj í c í myší monoklcnální protilátku, špecifickou pro dlcuhý v.-m.cs-peptid, známou jako anti-v-mos (hybridom č. 135-2ΞΞ7, SCRF 35—, šarže č. 165-119) byla získána od ľ-!icrobiclogical Associates Inc., Maryland. Pri zkousce Blisa deoekuje tato protilátka heroiogní ŕetézec produktu génu v-mos, a tc MOS, r.eu/HER-1 a HER-2. Je známo, že uvedená protilátka má jen zanedbatelnou afinitu pro krátký peptid v-mos. Sekundárni kozí protilátka proti IgG myši (špecifická pro lehký a težký ŕetézec), značená alkalickou fosfatázou, byla získána cd Sigma.
Pri použití bežné techniky pro získaní mcnoklcnálních protilátek podie publikace Methods in Enzymology, sv.
121 (19S6) byly získaný monoklonální protilátky ve forme ascitu a byly pak čistený na sloupci C- pro bílkoviny (Pharmacia)
8.2. Výsledky
Dlouhé v-mos-částice byly smíseny s tísícinásobným prebytkem krátkých v-mos-částic. 2 ml čistené monoklonální protilátky anti-v-mos ( 1 ^ug/ml) v PBS s 0,1% Tween 20 bylo pŕidáno ke smési krátkých a dlouhých částic v-mos a smes byla inkubována pri teplote místr.osti 1 hodinu za šetrného míchání. Pak byly částice promytv na m.além polypropylenovém sloupci pro jedno použití (Isolab), v r.emž byly částice zachyceny fritou. Pak byly částice smíseny s 2 ml sekundárni protilátky na 1 hodinu pri redení 1 : 2 OCO. Po promytí byly částice uložený do polystyrénové Petriho misky a po usazení byl supernatant odstranen a jako substrát byl opatrne pŕidšn roztok 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu a tetrazoliumnitromodŕi .
Po inkubaci smési 15 minút pri teplote místnosti se dlouhé v-mos-částice zabarvily purpurové na rozdíl od krát kých částic,. které zustaly bezbarvé. Tímtc zpusobem bylo mcž71 no okamžite zjistit jedinou tmavou častici mezi tisíci bezbar vých částic. Možnost odlíšení je zňetelne znázornéna na obr.
až jde. o fotografie ve zvetšení 40x. Na obr. .2 jsou znázornený skupiny dlouhých v-mos-částic, značené monoklonální protilátkou, na obr. 3 je znázornená smes dlouhých a krátkych v-mos-částic, značených monoklonální protilátkou anti-v-mos a na obr. 4 je znázornená rychlá detekce jediné modré částice ve velké skupine bazbarvých částic. Částice, které obsahovaly hledaný retézec peptidu byly tedy ihned odlíšený a izolovány od dalších částic v bance.
Po izolaci byl použít automatický analyzátor Applied Biosystems 477A ke stanovení N-terminálního retézce aminokyselín z jediné dlouhé v-mos-částice.
8.3. Závery
Uvedený príklad prokažuje, že zpúsobem podie vynálezu je skutečné možno vyhledat častici, obsahující bio-oligomerový väzný retézec, v tomto prípade peptidový retézec, v tišícinásobném prebytku jiných odlišných částic. Mimoto je z uvedeného príkladu zrejmé, že je možno tuto častici izolovat a analyzovat retézec navázaného peptidu.
9. Príklad: Izolace kratšího peptidového väzného retézce, který se váže na molekulu receptoru
Aby bylo možno dále prokázat použití zpusobu podie vynálezu pro izolaci určitého peptidu, byl synthetizován hexapeptid Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr na štandardní pryskyrici alfa
PAM o velikosti částic 100 ^um pri použití N -Fmoc-aminokyselin a dalších reakčních činidel, bežné užívaných pri syntéze na pevném nosiči.
9.1.
Materiály a metódy
Väzné reakce byly cro’ veden svrchu v odstavci 8.1. Ochranné skupina na alfa-aminoskupiné byly odstránený púsobením 20% piperidinu, ochranné skupiny na postranním retezci byly odštépeny 50% TFA a peptid zústal kovalentne vázán na polystyrénovou pryskyrici preš väzný retezec kyselina aminokapronová-beta-alanin, čímž byla ziskána štruktúra Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-kys'elina aminokapronová-beta_alanin-pryskyrice. Tento peptídový retezec odpovídá zbytkúm 104 až 109 produktu génu v-mos, tak jak bylo svrchu popsáno v Príkladu 8.
Stejné jako v príkladu 8 byly získaný protilátky anti-v-mos z bunečné línie hybridómu, produkující myší monoklonální protilátky, špecifické proti peptidu v-mos. Značená sekundárni kozí protilátka proti myšímu IgG, značená alkalickou fosfatázou, byla ziskána od Sigma.
9.2. Výsledky
Približne 0,1 mg peptidu v-mos, vázaného na prysky-ifa rici PAM bylo smíseno se stonáso’oným prebytkern částic N1Fmoc-alanin-PAM (Bachem Inc.). 2 ml čistené monoklonální protilátky (1 /Ug/ml) v PBS s 0,1 % Tween 20 bylo pridáno ke smési peptidu na nosiči a inkubováno 45 minút pri teploté místnosti za šetrného míchání.
Pak byly částice promyyt na malém polypropylenovém sloupci pro jedno použití (Isolab), v némž byly částice zachyceny na frité. Pak byly částice smíseny s 2 ml sekundárni, alkalickou fosfatázou značené protilátky (ŕedéní 1:100) na 1 hodinu. Po promytí byly částice rozložený na. sklenený filtr a namočený do 2,2Í-azinobis(3-ethylbenzthiozolinsulŕonové kyse liny)ABTS jako substrátu apolu s H^O^. Po inkubaci 15 minút pri teplote mistnosti se komplex pryskyrice PAM a v-mos-peptidu zbarvil tmavé zelené. t!a sklenéném filtru se vytvoril malý svétleji zelený lem. Vetšina pevného nosiče, neobsahujícího v-mos-peptid nereagovala s monoklcn&lní protilátkou a nedošlo tedy ke zmene barvy. Částice nosiče s v-mos-peptidem bylo proto možno snadno identifikovat.
9.3. Závery
Tento príklad prokazuje, že hledaná molekula akceptoru nereaguje nešpecifický s pevným nosičem, nýbrž reaguje špecificky pro kombinaci pevného nosiče a peptidu. Stejné jako svrchu v príkladu 8 je možno izolovat positivne reagující častici nosiče a analyzovat ŕetézec peptidu.
10. Príklad: Stanovení väzných retézcú pro streptavidin a monoklonálnx protilátku proti β-endorfinu
V tomto príkladu je dále ilustrován špecifický prístup vynálezu k identifikaci peptidového väzného retŠzce. Místo využívaní biologického systému, napríklad filamentosního fágu se pro tvorbu banky využívá chemické syntézy velkých peptidových bank, v nichž je každý peptid vázán na jednotlivou částici nosiče. Jednotlivé částice nosiče, špecificky vázané na peptid se pak fysikálne izolují a analyzuje se ŕetézec navázaného peptidu.
Prístup závisí na schopnosti chemicky synthetizovat velkou banku nahodilých peptidú a spojit ji s príslušnou izolací po detekce a se systémem pro analýzu štruktúry.
Prostŕedkem, který vynález používá k vyrešení tohoto problému je rozdelení částic nosiče na skupiny jednotlivých podílú v prúbéhu každého väzného cyklu, pŕičemž každý podíl nosiče se nechá reagovat s jedinou aktivovanou aminokyselinou
7£
Po dovŕšení väzby se ruzné podíly pryskyŕice dúkladne promísí, promyje, odstráni se ochranné skupiny a po dalším promyt se pryskyŕice znovu rozdéli na podíly pro nový cyklus väzby. Znamená to, že v jednom cyklu není žádná částice podrobená púsobení víc.e než jedné aminokyseliny a na konci nekolika takových stupňu bude každá částice obsahovať jen jediný peptidový ŕetézec. Peptidová banka, vytvorená uvedeným zpúsobem bude teoreticky tvorená skutečne nahodilými peptidy. Mimoto bude obsahovať ekvimolární množstvi všech peptidu. Celkové mr.ožství permutací a tím i výsledné množstvi peptidu bude záviset na počtu podílu a aminokyselín, zvolených pro každý vyzný stupeň a na celkovém množstvi väzných stupňu pri syntéze (délka peptidu).
Nový prístup pro současnou syntézu veľkého množstvi peptidu současne nejen poskytuje možnosť získat banku skuteč né nahodilých peptidu v ekvimolárním množstvi, nýbrž vede také k získaní banky peptidu na částicích pevného nosiče, kde každá částice nese pouze jediný ŕetézec peptidu. Tato poslední vlastnosť je zcela zaj.išténa tím, že se pri každé väzné reakci dostáva částice do styku s jedinou aminokyselinou, pŕičemž reakce je vždy dovedená do konce.. Toto pojetí reakce má zásadní význam pro úspech nového postupu.
Pomoci nového syntetického zpúsobu podie vynálezu je možno synthetizovat prakticky jakoukoliv peptidovou banku a presné definovaným složením. Je napríklad možno použít az všech 20 pŕírodních L-aminokyselin v každém vazném stupni, každou pro jiný podíl částic, nebo je možno v každém stupni použít jen nekolik aminokyselín.
10.1. Materiály a metódy
10.1.1. Syntéza peptidové banky
Byla synthetizována velká banka se štruktúrou Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-β-Ala-kysalina ami nokapronová-ethyl er.di ami n-p ryskyŕice (X = 19 ze 20 bežných aminokyselín s výjimkou cysteinu v· každém vazném stupni. Částice pevného nosiče, zvoleného pro syntézu peptidu byly částice polydimethylakrylamidu,. tj. PDA (Milligen Inc., USA).
Syntéza peptidu pri použití této. pryskyrice byla provádena zpúsobem podie publikace Atherton a Sheppard, 1938, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practícal Approach, IP.L Press. Postup byl provádšn tak, že vždy 3 g pryskyrice (približné 2 milióny částic) byly šetrné míseny pŕes noc s ethylendiaminem. Po dúkladném promytí byla na pryskyrici navázána kyselina arr.inokapronová a pak β-alanin pri použití Fmoc ochranných skupín, avšak bez odštépitelné'no väzného ŕetézce. V péti následujících stupních byla syntéza provedena nahodile a oddelene bylo v každém vazném stupni použito všech 19 Fmoc-aminokyselin-OPfp s výjimkou cysteinu. Po ukončení péti väzných stupňú byla ochranná skupina Fmoc odstránená 20% roztokem piperidinu (% objemová) v DMF. Ochranné skupiny na postranním ŕetšzci byly odstránený smési 90 % TFA, 1 % anisolu a 0,9 % ethandithiolu (% objemová). Pryskyrice byla neutrálizována 10% diisopropylethylamiňem v DMF a uložená v DMF pri teplote 4 °C.
Spojovník β-alanín-kyselina aminokapronová-ethylendiamin je tvoŕen celkem 11 atómy uhlíku a 4 atómy dusíku a jeho nejvštší délka je 17,6 x 10_^θ m. Vzhledem k tomu, že · v každém vazném stupni bylo užito 19 rúzných aminokyselín, je teoretické množství získaných peptidú pri péti väzných stupních 19^, tj. 2 476 099 peptidú v bance.
7Ô
J ak v tom, že se jednotlivých
obsahuje pouze jeden typ peptidu. Pak. je možno snadno identi fikovat častici, reagující s molekulou akceptoru, fysíkálne ji izolovat a analyzovat retezec aminokyselín v peptidu pomoci Ečmanovy degradace. Pro úspech postupu je tedy nutná . presná identifikace peptidového retézce na jediné častici nosiče. Pri použití automatického analyzátoru bílkovin (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automatic Protein/Peptide Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, California) bylo bežne izolováno 50 až 500 pmol peptidu z každé částice nosiče. Mimoto bylo predbežnou analýzou (MÍMarch a další, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology Proceedingd of the Eleventh American Peptide Symposium, 9.-14.červene© 1588,
La Jolla, Ca., ESCOM, Leiden, str. 229-230)prokázáno, že účinnost vzby peptidu na pevný nosič pri syntéze byla vyšší než 98 %.
10.1.2. Špecifická identifikace a se.lekce peptidových vaznýc retézcú z banky
Identifikaci a selekci špecifických peptidových vaz uých retezcú z banky nahodilých peptidú je možno snadno ušku tečnit imunologickými postupy, napríklad zkouškou ELISA, im.u nofluorescencí nebo pri použití imunomagnetických částic.
Pri popsaných pokusech bylo pri detekci použito imunohistcchemických metód. Špecificky se vážícími molekulami akceptoru, které byly pri tšchto zkouškách použitý, byly
i) streptavidin, tj. bílkovina, která váže biotin, a ii) monoklonální protilátka proti endorfinu MAb.
Pri použití bank s epitopy z filamentosních fágú (Cwirla a další, Devlin a další, oddíl 2 svrchu) bylo možno peptidová väzné retézce snadno identifikovat.
ΊΊ
Pri detekci částic, r.a než se váže straptavidir. byle užito imunohistochemických postupu. Banka n'ahocilých peptidu byla šetrne promísena s postupne se zvyšujícím množstvím ’oidestilované vody k rozŕedér.í DMF. Pak byly častice dôkladne promyty PBS a k blokovaní jakékoliv nešpecifické väzby byla užitá želatína v koncentraci 0,1 % hmotnostní. Pak byl k částicím za hodinového šetrného míchání pŕidán konjugát streptavidinu a alkalické fosfatázy (Pierce, Rockford, Illinois). Pak byly částice dôkladné promyty a byl pŕidán štandardní substrát, 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát/tetrazolíová nitromodr (BCIP/NBT). Pak byly částice spolu s roztokem substrátu prenesený do polystyrénových Petrihc misek (15 misek s rozmery 100 x 20 nm) a reakce se nechala probíhat 2 hodiny. Částice nosiče s navázaným konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatázy zmenily barvu na temné modrou, kdežto vštšina částic banky zústala bezbarvá.
10.1.3- Stanovení afinity peptidového väzného retezce
Afinita peptidového väzného retézce pro monoklonální protilátku proti β-endorfinu byla stanovená v roztoku v kapalné fázi. Pri této zkoušce byla meŕena inhibice väzby 3
5,0 nM H-(Leu)enkefalinu (špecifická aktivita 39,0 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, Ma) na 125-200 ng/ml Mab proti β-endorfinu pôsobením peptidového väzného retézce v 1,0 ml 40 mM tris - KOI, 150 mM NaCl, pK 7,4 s obashsm 1,0 mg/ml albumínu ze séra skotu, 0,1 % objemových Twesn 20 a 0,05 % hmotnostních azidu sedíku. Špecifická vazba byla definovaná jako rozdíl mezi väzbou, naméŕenou v prítomnosti nebo v neprítomnosti 1,0 /UM neznačeného (Leu)enkefalinu. Navázaný rádioaktívni väzný ŕetézec byl vysrážen pridaním 10-násobného prebytku Protein-G-Sepharosy (Pharmacia· s následnou inku'oací pŕes noc pri teplote 23-2^ °c. ?rotein-G-Sepharosa byla oddelená odstŕedéním (13 000 x g r.a 5 minút), usazenina byla uvedená do suspenze ve 250 ^ul 5% (Obj. %) kyseline octové pred prenesením do lahviček pro kapalinovou scintilaci. Hodnoty K^ (n=3) byly stanovený analýzou nasycení pri použití peti koncentrací radioaktivního väzného retézce (1,57-30 nM) pro H(Leu)enkephalin, všechny zkoušky byly prevedený dvakrá* pri současném provedení nešpecifické väzby jako kontroly. Prumerná hodnota byla 9,79 ±4,53 nM. Krivky pro inhibici peptičového väzného retézce byly získaný pro S koncentrací peptidu. Údaje, získané pri zkouškách na nasycení a inhibici byly analyzovaný váženou nelineárni regresí pri použití príslušných modelu podie publikace Knapp a další, 1990, J. Pharmacol. Exp. Ther. 255:1273-1282. Hodnoty Ki pro inhibiční väzné konštanty byly vypočítány postupem podie Cheng a Prusoff, 1973, Biochem. P'narmacol. 22: 3099-3102. Každá hodnota Ki byla vypočítána ze tri až ctyr nezávislých stanovení.
10.2. Výsledky
Byla analyzována banka nahodilých synthetických peptidu vzorce X-X-X-X-X-pryskyŕice, v níž X = všech 19 bežných aminokyselín (nebyl použit cystein), celkem šlo o možný počet ζ
- 2 476 099 permutací. V podílu banky, na nérnž byla analýza provedena se nacházelo približné 2 000 000 částic nosiče.
V prvním stupni, v nérnž byl použit konjugát streptavidinu a alkalické fosfatázy (odstavec 10.1.2. svrchu) došlo ke zabarvení približne 75 částic s rúznou intensitou zbarvení a tyto částice byly fysikálné oddelený pod mikroskopem pomoci mikromanipulátoru. Každá částice byla premytá v SM guanidinhydrochloridu k odstránení vázaného streptavidinového konjugátu s enzymem. Pak byla každá částice jednotlivé uložená na sklenený filtr analyzátoru Applied Sicsystem Protein Sequencer (ABI). Retézce 28 ze 75 částic jsou uvedený v následující tabulce 1. Všechny částice mely buď společný ňetézeo HPQ nebo HPM.. Z mikrofotografie na o'or. 5 je zrejmé, že tmavou částici lze snadno identifikovat na pozadí mnohá tisíc bezbarvých částic v prubéhu analyzy.
Tabulka 1
Peptidové retézce jednotlivých částic nosiče, reagujících H ) se streotavidinem
HPQFV (°0,8, C1120) GHPQG
HPQGP (0,35 60) MYKPQ
HPQAG (1,5,53) REHPQ
LHPQF (0,47, 286) IQKPQ
FHPQG (6,23, 72) GNHPQ
GHPQN (0,5, 44) TVKPQ
THPQN (0,5, 44) IGHPQ
QHPQG (2,3, 60) WMHPQ
IHPQG (2,1, 57) GAHPQ
(0,44 250) PLHPQ (2,5 48)
AIHPQ '
( ,56 112) AAHPQ (0,9,476)
(1,8 192) aTPH?Q (0, 158)
(0,222) WNHPM (2,5, 59)
(0, 96) WTHPM (1,4, 202) VHPMA (0,6, 21)
(2,7, 257) dMH?MA (0,31, 140)
a) tyto väzné retézce byly identifikovány v bance peptidu, obsahující 195, tj. 2 476 099 peptidu
b) první číslo v závorkách udává pŕedpovétí pro Edmanovu degradaci ve stupni 5 (tj. množství zbytku 5 cyklu 4 /množství zbytku 5 v cyklu 5)
c) druhé číslo v závorkách znamená množství peptidu v pmol, izolovaného v prúbéhu analyzy retézce
d) byly identifikovaný dva retézce TPHPQ a dva retézce MHPMA, nebylo možno prokázat žáer.á další opakovaní
Aby bylo možno prokázat, že všechny retezce, v nichž se opakuje HPQ se skutečné váži na místo pro väzbu 'ciotinu vs streptavidinu, byla synthetizován retézec LrľPQF-b'eta-Aiakyselina aminokapronová-ethylentíiamin-pryskyrice (LHPQF-pryskyrice). Tento materiál byl pak smísen s konjugátem streptavidinu a alkalické ŕosfatázy za prítomnosti rúzných koncentrací biotinu. Výsledky jsou znázornený na obr. ô. Biotin v koncentraci 100 nM úplne blokoval zabarvení LKPQF-pryskyŕice. V koncentrcai 10 a 1,0 nM biotin zpúsobil částečnou inhibici zbarvení a pri koncentraci 0,1 nM nemel na zabarvení žádný účinek. Tento pokus jasné prokazuje vaz'ou retezce HPQ na místo pro väzbu biotinu v molekule Streptavidinu.
Pred použitím téze banky nahodilých peptidu k prúkazu väzby na protilátku anti-beta-endorfín-MAb, byly z banky odstránený všechny modré částice, zabarvené v predchozí zkouš ce s konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatázy. Zbývající částice nosiče pak byly zpracovány pusobenim 8M guanidín hydrochloridu k odstránení jakékolív vázané bílkoviny. Pak byla banka smísena s biotinylovanou anti-beta-endorfin-MA'o (anti-beta-endorfin, kloň 3-E7 byl získán od Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) na 16 hodín. Po dukladném promytí bylo použito skundárního stupne s konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatázy ke zjišté.ní barevné reakce. Tímto zpúso bem bylo identifikováno šest peptidú s retezcem, príbuzným nativnímu väznému retezce, Leu-enkefalinu YGGFL, a to: YGGMV, YGGLQ, YGGLS, YGGFA, YGC-FT a YGGFQ. Byly synthetizovány peptidové peptidové analogy téchto' väzných ŕetézcú s ruzným karboxy-terminálním zakončením a byla stanovene jejich afinita (Ki) pri použití HLeu-enkefalinu (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) jako značeného vezného retézce a neznačených peptidú v kompetici s tímto retezcem (jak bylo pbpsáno svrchu v odstavci 10.1.2). Výsledky téchto štúdií jsou s'nrnuty v následujíci tabulce 2.
Tabulka 2
Afinita peptidových väzných ňetézcú k monoklonální protilátce proti b'eta-endorf inu
Peptid Ki v nM, karboxyterminální zakončení
-OH -nk2 -BA-OH -ba-nh2
YGGFLa) 17,5± 3,2 27,9+2,3 17,1+1,8 13,7 ± 1,7
YGGFA 32,0 + 2,0 72,0+15,4 82,3+8,8 93,6 ± 34,7
YGGFT 35,9i 7,7 65,2+16,8 50,6+8,9 43,3 i 2,3
YGGFQ 15,0± 1,7 40,1+6,0 39,4+2,3 45,4 + 11,6
YGGLS 725 i 134 991 +52 916 +182 1150 + 247
YGGLQ 1980 + 303 2910±695 1470+120 1910 i 504
YGGMV 8780i 1500 14000+1110 5I40iS85 7160 + 1010
& )
YGGL je (Leu)enkefalin, prírodní väzná látka pro anti-βendorfin MAb
10.3. Diskuse
Možnost synthetizovat určité peptídy pouze an jednotlivých částicích nosiče spolu s citlivou a špecifickou detekcí je podstatou úspešnosti zpúsobu podie vynálezu. Jde o postup, pri nemž je možno selektívne izolovat jedinou častici nosiče z banky a po púsobení 8M guanidinchloridu k odstránení vázaných bílkovin ji účinné čistit, pŕičemž peptid zústává kovalentne vázán na· pryskyŕici a le pŕipraven pro analýzu ňetézce. Současne automatické analyzátory peptidú jsou schopné provést analýzu peptidu v koncentracích pouze 5 až 10 pmol. Mimoto modrá barva, která se ireversibiIné váze na častici nosiče, neinterferuje s analýzou ňetézce peptidu. V prúbéhu každého cyklu nahodilé väzby byly vyvinutý veškeré snahy pro optimalizaci zpúsobu syntézy včetne použití velkých pňebytkú ľi ~~ 1 -Fmoc-aminokyselin. Podie dosaženýc'n výsledku je zcela zrejmé, že účinnost synthetické reakce v jednotlivých stupních nahoidlé vaz'oy tyla vyšší než 98 %.
Vzhledem k tomu, že zbarvené částice nosiče je možno snadno zporzorovat na bezbarvém pozadí (napr. na obr. 7), je velmi snadné visuálné zkontrolovat 2 milióny částic v mik roskopu v sérii 10 až 15 Petriho misek a oddélit reaktívni částice pro analýzu retézce. Mimoto je možno stanovit rela tiv ní afinitu ruzných väzných retezcu tak, že se sleduje relatívni intensita zbarvení každé posítivní částice. Tato vlast nost umožní izolovat částice se špecifickým za'oarvením pro analýzu retézce.
Devlin a další (1990, Science 259:404-405, oddíl 2, svrchu) popsali dúležitost retézcu HPQ, KPM a HPN ve 20 väzných retézcích pro streptavidín, které izolovali pomoci fágú Z 20 izolovaných retézcu jich 15 obsahovalo HPQ, 4 obsahoval; HPM a jeden HPN. Bylo zajímavé, že analýzou banky bylo získá no 28 ruzných peptidu, z nichž 23 obsahovalo ŕetézec HPQ a 5 retezec HPM (Tabulka 1). Je také zrejmé, že poloha HPQ/HPM v pentapeptidu nebyla pro väzbu streptavidinu dúležitá. Ze všechidentifikovaných pentapeptidových retézcu s o'osahem HPQ nebo HPM se pouze dva opakovaly (TPHQ a MHPMA). Tato skutečnost je v ostrém kontrastu s údaji Devlina a dalších, v jejichž materiálu se rada retézcu opakovala ve 20 izolátech, problém spočívá patrné v tom, že biosynthetický postup nebyl skutečne nahodilý, takže docházelo k selekci aminokyselín.
V anti-B-endorfinovém systému má 5 peptidu velmi podobný retezec s retézcem príročního YGGľL (Tabulka 2).
Tyto výsledky jsou podobné tern, které byly získány pomoci fílamentosních fágú pri použití téze monoklonální protilátky (kloň 3-E7) podie Cwirla a další, 1990, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA 87:5378-5382 svrchu). Pŕestože analýzou peptidové než podie uvedené puprotilátce daleko vétískaných pomoci fágu.
banky blikac
SI Síl· byl z ískán menší počet ŕetezcú e, 50 % získaných ŕetezcú mélo k nitu než kterýkoliv z ŕetezcú, z
11. Príklad: Omezená peptidová banka
V další sérii pokusu bylo užito odlišného typu proti látky, v nšmž epitop byl uložen uprostred peptitíového ŕetezce místo na jeho N-terminálním zakončení (jako v prípade betaendorfinu) . Použitou protilátkou byla monoklonální protilátka anti-v-mos MAb (odstavec 11.1.). Tato protilátka byla získána imunizací myší peptidem, obsahujicim 12 aminokyselín, LGSGC-FGSVYKA, který odpovídá zbytkum 100 až 111 onkogenu v-mos. Peptid byl konjugován s nosnou bílkovinou pred imunizací. Pri zkoušce ELISA je možno použít anti-v-mos MAb k detekci homologních ŕetezcú v-mos, M05, neu/HER-1 a HEr-2 génu.
11.1. Materiály a metódy
Pri použití komerčne dodávaného systému (Geysen a další, 1986, Mol. Immunol. 23: 709-715) pro mapovaní epitopú (Cambridge Research Biochemical, Boston) pri syntéze pŕekrývajících se peptidú (skupiny tetrapeptidú, pentapeptidú a hexapeptidú) byl mapován epitop v rozsahu 12 aminokyselín v-mos, rozpoznávaný protilátkou antí-v-mos-MAb ve srovnání s pentapeptidovým ŕetezcem FC-5VY (tj. zbytku 6 až 10 v dodekapeptidu v-mos).
Pokusy byly prováčény s omezenou bankou nahotíilých peptidú, v níž byly aminokyseliny valin a serin, prítomné ve v-mos peptidu, umýslné vypustený. Tato banka nahodilých peptidú méla následující složení: G-X-X-X-X-X-3-Ala-aminckapronová kyselina-ethylendiamin-pryskyŕice, kde X ~ Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp. Tšchto 14 aminokyselín bylo zvolene tak, že valin a serin byly vynechány a všechny funkční skupiny postranního retézce byly zachovaný, to znamená, že
i) byl použit Asn, avšak nikoliv Gin, ii) Byl použit Glu, avšak nikoliv Asp, iii) Byl použit Thr, avšak nikoliv Ser, iv) Byl použit Leu, avšak nikoliv íle nebo Val a
v) Byl použit Met, avšak nikoliv Cys.
Vzhledem k tomu, že bylo v každém z péti nahodilých väzných stupňu použito 14 aminokyselín, bylo teoretické množství peptidú 145, to znamená 537 824.
Bunečná linie hybridomu, produkující monoklonální protilátku anti-v-mos byla získána os Microbiological Associates Inc., Maryland (Hybridom No. 165-28E7, SCRF 354, šarže č. 165-119).
Afinita peptidového väzného retézce pro anti-v-mosMAb byla merena väznými zkouškami v kapalné fázi pri použití 3 3
H-acetyl-v-mos-peptidu ( H-Ac-v-mos) jako radiaoktivního väzného retézce. Tato rádioaktívni látka byla priptaver.a Nterminální acetylací v-mos pred odstránením ochranných skupín z postranního retézce, pri použití ekvimolárního mr.ožství H-octanu sodného (špecifická aktivita = 2,52 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). Produkt °H-Ac-v-mos, který byl oddélen od nezreagovaného v-mos-peptidu pomoci HPLC v reversní. fázi mél špecifickou aktivitu 2,50 Ci/mmol. Afinita väzby H-Ac-v-mos na Anti-v-mos-MAb (10 yUg/ml) byla merena v 1,0 ml PBB-pufru s želatínou (0,05% želatína v PBS) pri teplote 23-24 °C po inkubaci tri hodiny. Špecifická vazba byla definována jako rozdíl mezi väzbou ^H-Ac-v-mos v prítomnosti (nešpecifická vazba) a v neprítomnosti (celková vazba) 100 /UM neznačeného peptidu v-mcs pro každou koncentraci ~H-Acv-mos- Vázany radioaktivný väzný retézec byl oddélen odstčedéním pri použití lOnáso’oného prebytku (kapacita väzby relatívne k použitému imuncglobulínu) bílkovina-G-Sepharosa
8-i byly vynechány a všechny funkční skupiny postranního byly zachovaný, to znamená, že .
i) byl použit Asn, avšak nikoliv Gin, ii) Byl použit Glu, avšak nikoliv Asp, iii) Syl použit Thr, avšak nikoliv Ser, iv) Byl použit Leu, avšak nikoliv íle nebo Val a
v) Byl použit Met, avšak nikoliv Cys.
Vzhledem k tomu, že bylo v každém z péti náhodilých väzných stupňu použito 14 aminokyselín, bylo teoretické množ ství peptidu 14^, to znamená 537 824.
Bunečná linie hybridomu, produkujúci mcnoklcnální protilátku anti-v-mos byla získána os Microbiological Associates Inc., Maryland (.Hybridom No. 165-28Ξ7, SCP.F 354, šarže č. 165-119).
Afinita peptidového väzného retezce pro anti-v-mosMAb byla meŕena väznými zkouškami v kapalné fázi pri použití
H-acetyl-v-mos-peptidu ( H-Ac-v-mos) jako radiaoktivního väzného retezce. Tato rádioaktívni látka byla priptavena Nterminální acetylací v-mos pred odstránením ochranných skupín z postranního retezce, pri použití ekvimolárního množství H-octanu sodného (špecifická aktivita = 2,52 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). Produkt 3H-Ac-v-mos, který byl oddšlen od nezreagovaného v-mos-peptidu pomoci HPLC v revers ní fázi mei špecifickou aktivitu 2,50 Ci/mmol. Afinita väzby
H-Ac-v-mos na Anti-v-mos-MAb (10 ^ug/ml) byla meŕena v 1,0 ml PBS-pufru s želatínou (0,05% želatína v P5S) pri teplote 23-24 °C po inkubaci tri hodiny. Špecifická vazba byla definována jako rozdíl mezi väzbou °H-Ac-v-mos v prítomnosti (nešpecifická vazba) a v neprítomnosti (celková vazba) 100 /UM neznačeného peptidu v-mos pro každou koncentrací ^H-Acv-mos- Vázahy rádioaktívny väzný retezec byl oddšlen odstŕedením pri použití lOnásobného prebytku (kapacita väzby relatívne k použitému imunoglobulinu) bílkovina-G-Seoharosa (Pharmacia), k vysrážení protilátky. Analýza väzby čo nasycení z peti stanovení v rozsahu koncentrace 125-5000 nM ukázala, že se 0H-Ac-v-mos váže na anti-v-mos-MAb s hodnotou Kč 850 ± 150 nM. Afinita väzby peptidového väzného retezce byla stanovená studiemi na inhĺbici této väzby pri použití sedmi peptidových retézcú v kompetici o 10 yug/ml anti-vmos-MAb s 20 nM H-Ac-v-mos za svrchu uvedených podmmek. Témito studiemi bylo prokázáno, že ve více než 50 % celkové väzby šlo o väzbu špecifickou. Konštanty pro nasycení väzby a pro inhibici byly méreny pro jediné místo väzby pomoci nelineárni regresní analyzy, jak bylo svrchu popsáno (Knapp a Yamamura, 1990, Life Sci. 46:1457-1463).
11.2. Výsledky
Bylo analyzováno približné 230 000 částic pomoci konjugátu anti-v-mos a alkalické fosfatázy. Bylo tedy analyzováno mene než 43 % permutací. Po inkubaci se substrátem se približné 50 částic zbarvilo intensivné modré. 24 téchto částic bylo fysikálné oddéleno a byl analyzován retezce amino kyselín na 11 techto částicích. Mimoto bylo náhodné odebráno 17 bezbarvých částic pro analýzu retezce.
Výsledky analyzy retézce pro čáetice s väzným ŕetézcem anti-v-mos jsou shrnuty v tabulce 3. vzhledem k tomu, že úmyslné nebyly použitý aminokyseliny valin a serin v bance, není prekvapující, že ani jeden z retézcú neodpovídá nativnímu epitopu z 11 analyzovaných retézcú (natívni ŕetézec odpovídá ŕetézci FGSVY). Prestože v uvedených 11 ŕetézcícn nedošlo k žádnému opakování, jejich retézce nebyly nahodilé. Vyskytuje se v nich velmi často arginin a tyrosin. mimoto je alespoň jeden a nékdv dva argininové zbytky prítomný v poloze 2 a/nebo 3 téchto ŕecezcú. Na druhé strané nahodilé zvolené nezbarvené částice nemají žádnou vlastnost, společnou pro retézce aminokyselín. Prestože je rozsah vzorku ome86 zen, hodnota chi nebyla ve srovnam s 'retézci z negatívnxch částic nosiče Štatisticky významná (chi“ = 18,27, df = 13,
P = 0,15), což prokažuje, že není k disopsici žádný prúkaz nerovnomerné distribuce aminokyselín pro nahodile vytvorené retézce na nezbarvených čásťicích.
Tabulka 3
Peptidové retézce na jednotlivých částicích nosiče, které reagovaly s monoklonální protilátkou anti-v-mos-MAb
A. Retézce z reaktivních částic
GRRGME GRYMPK
GRRPYG GFRKMA
GRRAYE GFRYHN
GRREGP GHRYFH
GRYAKH .GWREKE
GRKTYY •
zce z nereaktivních částic
uKELAG Gr C.KHP
GPYLMW GWGAYP
GTKMNF GAARPP
GEKMEF GLFGME
GYEEPK GRLNTL
GKKPNP GMTHAY
GEYAPP GPYGÍ4A
GGFMEF GHYNNL
GPKFMA
Nškteré z positivních väzných retézcú byly synthetizovány a byla stanovená jejich afinita pro anti-v-mos-MAb väzbou v kapalné fázi, jak bylo popsáno svrchu v odstavci
11.1. Výsledky téchto zkoušek jsou shrnuty v tabulce 4.
V tabulce 4 jsou shrnuty afinity v-mos-epitopu pro monoklonální protilátku anti-v-mos-MAb podie výslekdú mapovaní epitopú. Je také uveden vliv zmeny karboxyterminálního zakončení. V tabulce 4B shrnuje afinitu mimotopú, identifiko vaných z peptidová banky, v níž hcybí nekolik aminokyselín ve v-mos-epitopu. Nékteré zkoumané väzné retezce obsahovaly beta-alaninamid k napodobení štruktúry identifikovaného väzného retézce, k nemuž se protilátka váže na částici nosiče.
Afinita nejlepšího anti-v-mos-mimotopu v tabulce 4 Je približne 2,5krát menší než afinity natívního peptidu. Prestože žádný ze zkoumaných peptidových väzných retézcú nemél hodnotu Ki tak nízkou,'jako natívni väzný ŕetézec v-mos, výsledky zŕetelné prokazují, že pri použití banky nahodilých peptidú, v níž chybéjí nékteré aminokyseliny, nacházející se v nativním epitopu je možno identifikovať celou radu atrukturne odlišných mimotopú, které mají určitou afinitu k moleule akceptoru, tj. monoklonální protilátku anti-v-mos.
£3
Tabulka 4
Afinita väzby peptidového väzného retezce pro a:
ti-v-mos-MAb
Peptid Ki, /UM
A. LGSGGFGSVYKA (v-mos-peptid) 3,2 ± 0,4
GFGSVY-NH2 ( v-mos-epitop) 246 - 337
GFGSVY-OH 1000
gfgsvy-ba-nh2 409 - 442
GFGSVY-fíA-OH 529 - 770
B. GRRAYE-OH 6,79 ± 2,31
GRRAYE-NH2 24,70 ±7,00
GRRAYE-fíA-OK 15,10 ± 0,50
grraye-ba-nh2 9,02 - 20,40
GRRGME-OH 100
GRRGME-BA-NH2 24,00 ±8,40
grrepg-ba-nh2 26,90 ±6,20
GRRPYG-OH 1000
GRRPYG-BA-NK2 20,50 ± 4,50
11.3. Diskuse
Anti-v-mos-MAb, užitá v této štúdii mely pomerne nízkou afinitu k immunogenu, tj. v-mos-peptidu. Ve v-mos iineárním epitopu byl pŕxtomen serin a valin (FGSVY), avšak tyto aminokyseliny byly úmyslnš vynečhány z použité banky.
I tak však bylo možno tímto zpusobem definovat lineárni mimotop s úplné odlišným retézoem a složením aminokyselín, a89 však se srovnatelnou afinitou pro protilátku. Tím byla zcela jasne prokázána jak složitost, tak využitelnost interakcí mezi makrcmolekulárnímí peptidy.
12. Príklad: Selektívne odštépitelný väzný retézec: ONb
Byla pripravená skupina čtyr peptidu, obsahujících väzný retézec ONb, který je možno odštepit pusobením UV-svétla (Odstavec 5.4, svrchu) a tyto peptidy byly užitý k testum.
12.1 Materiály a metódy
Na dvou pryskyricích byly pripravený následující čtyri peptidy pri použití štandardní syntézy na pevném nosiči (napr. odstavce 6 a 7 svrchu):
i) Fmoc-Trp-Tyr(0bu^)-Phe-0Nb-betaAla-ACA-EDA-PepSyn K ii) TRP-Tyr-Phe-ONb-betaAla-ACA-EDA-PepSyn K iii) Fmoc-Trp-Tyr(0but)-Phe-0Nb-betaAla-ACA-4-MBHA iv) TRP-Tyr-Phe-0Nb-betaAla-ACA-4-MBHA
Každý z peptidú byl ozarován 1 a 3 hodiny UV-záŕením a viditelným (VIS) svétlem v 0,3 ml vody nebo smési chlorethanolu a dichlormethanu 3:7. Celkem bylo provedeno a vyhodnoceno 16 + 16 pokusu.
Po exposici byly supernatnty'odfiltrovaný, lyofilizovány a pak znovu rozpuštény v 0,3 ml methanolu. Produkty pak byly analyzovány pomoci HPLC.
- 90 12.2. Výsledky
Anylyza HPLC jasne prokázala, že po ozárení VIS ve vode nedošlo k zadnému uvolnení tripeptidú za 1 hodinu, kdežto po ozárení UV-svetlem došlo po této dobé k téme? úplnému uvolnení tripeptidú.
Zvlášté peptid i) byl ve vodé rozštépen na jediný produkt. V nékterýc'n pňípadech bylo možno pozorovať vymývaní dvou produktú za sloupce HPLC. Pri delší dobe exposice UVzáŕení bylo možno v alespoň nékolika pŕípadech pozorovať vzájemnou premenu mezi dvéma produkty.
12.3. Diskue
Je zrejmé, že pri použití väzného retézce, citlivého na UV-svétlo dochází ve vodném roztoku k uvolnení peptidu. Doba exposice 1 hodina je dostatečná k neúplnému uvolnení peptidu. Výsledky také ukazují, že polyamidová pryskyrice je kompatibilní s vodným systémem a je v nem stálá.
13. Príklad: Identifikace látky, podobné enzýmu
13.1. Materiály a metódy
Zpúsobem podie vynálezu byla pripravená banka nahodilých pentapeptičú (odstavec 10.ľ. svrchu), použito bylo 19 aminokyselín ze známych bežných 20 (byl vynechán cystein).
Peptidová banka byla vystavená púsobení chromogenního substrátu N3T (chlorid tetrazoliové nitromodŕi) v neprítomnosti exogenního enzýmu za podmínek, vedoucích ke tvorbe produktu a identifikuj! se positivné reagující částice. Tyto částice se oddelí a retézce produktú se analyzují.
13.2. Výsledky
V následující tabulce 5 jsou uv edeny retézce z céti částic nosiče, které zjevné katalvzovaly redukci NTB za vzniku tmavé modrého diformazanového produktu.
Tabulka 5
Retézce peptidú z částic, napodobujících pôsobení enzýmu
PNNNH WNNNM
PNNNG ........- MNNNR
QNNNR
13.3. Diskuse
Uvedené výsledky prokazují, že spojení PNNNH-částice muže redukovat NBT na temné modrý diformazanový pigment chemicky nebo enzymaticky. Peptid nebo spojení peptidu a čás tice má tedy účinnost arteficiálního enzýmu nebo účinnost enzýmu podobnou.
14. Príklad: Vyhledávání peptidových retézcú s protirakovinným účinkem
Omezená peptidová banka, obsahující pentapeptidy, v nichž první aminokyselinou je tyrosin, za riímž nasleduje retézec nahodilých zbytkú ze skupiny kyselina glutamová, serin, valin, glycin, asparagin a arginin byla vyšetrená na prítomnost retézcú s protinádorovou účinností pri použití rúzných bunečných linií nádorových bunek.
14.1. Materiály a metódy
Banka nahodilých peptidu podie vynálezu byla syr.thetizována pri použití hydrolyzovatelného diketopiperazinového väzného retézce. Pri stanovení proti-nádorové účinnosti byly použitý plotny s 96 vyhloubeními.
Po odstranéní ochranné skupiny z postranního retézalf a ce a N -Fmoc-skupiny byla peptidová banka neutralizována púsobením diisopropylethylaminu DIEA a dúkladné promyta DMF k odstránení jakýchkoliv zbývajících potenciálne toxických látek. Pak byla postupné banka uvedená do suspenze v 0,01 M mky .“ssfi.rni c h ž je väzný' retezec stály) a nakonec pro myty 0,001 M HC1. Pak bylo do každého vyhloubení pŕeneseno približné 10 částic nosiče z banky. Pak bylo do každého vyhloubení pŕidáno 50 ^ul prostredí RPMI (s 25 mM pufru Kepes) k neutralizaci pH roztoku. Pri neutrálním nebo slabé alkalic kém pH docházelo k uvolnéní peptidú napríklad v prúbéhu 16 až 24 hodín.
Pak bylo postupováno tak, že 1) buď byla část prostredí prenesená na oddélenou plotnu se špecifickou bunečnou linií nádorových bunék, nebo 2) tyto bunky byly pridány pŕímo do vyhloubení, obsahujících částice. Bylo užito približné 2500 bunék plicního nádoru/ml. Pak byly plotny inkubovány 7 dnú pri teplote 37 °c, načež byla provedena zkouška MT7 ke kvantitativnímu vyhodnocení cytotoxicity uvolnéných pepti dú v každém vyhloubení.
K této zkoušce je možno použít rúzné stabilizované bunéčné linie lidského karcinômu, lymfomu, myelomu a také leukemie. Príkiadem mohou být nádorové bunky NCI: lymfoidní leukemie L1210, melanom 316, Lewisúv karcinóm plic, sarkom M5075, karcinóm tlustého stfeva 38 a karcinóm mléčné žlázy o?
človeka MX-1. Ďalšími príklady mohou být karcinóm mléčné žlázy MCF-7, bunečná linie myelomu 822ô, bunečná linie leukemie myší P3S8 a bunečná linie Hawkinsova karcinómu piic ( z bunék, odlišných od karcinómu z malých bunék).
14.2. Výsledky
Byla analyzována banka, obsahující približné 8000 peptidu s retézcem Y-XXXXX-částice nosiče, kde Y znamená Tyr,
X znamená Glu, Ser, Val, Gly, Arg nebo Asn. Ve dvou pokusech bylo možno prokázat pro 3 až 4 supernatanty s obsahem uvolnéného peptidu inhibici ounéčné linie Kawkinsova karcinómu plic. Vzhledem k tomu, že každé vyhloubení obsahovalo približné 10 částic, bylo podrobenou zkoušce v podstaté všech 8 000 možných retézcú a byly identifikovaný 3 účinné retézce peptidu. Téhož výsledku bylo možno dosáhnout pri prímé inkubaci částic s bunkami a pri prenosu s.upernatantu s uvlonšným peptidem.
14.3. Diskuse
Uvedené výsledky ukazuj í, že omezená banka peptidu múže obsahovat nékteré peptidové retézce s cytotoxickým účinkem. V predchozím príkladu mélo približné 0,05 % všech retézcú protinádorovou účinnost. Zkouškami se supernatanty, o'osahujícími uvolnéné peptidy je možno v sériových zkouškách zjistit toxicitu i proti jiným nádorovým bunkám .a také proti -bunkám normálních tkání.
Tímto zpúsobem je možno identifikovát peptidové retézce se širokou toxicitou proti nádorovým bunkám nebo s toxicitou proti špecifickým liniím nádorových bunék. Ty ňetézce, které mají nízkou toxicitu pro normálni bunky by bylo možné použít jako léčebné látky. Stejný postup je možno použít také pro antimikrobiální a antiparasitární látky a pro antagonisty rústových faktoru.
Podobný postup pro zjištení agonistu rustového faktoru by mohl využít bunečných linií, závislých na prítomnosti rustového faktoru. Peptidy s agor.istickým účinkem by v tomto prípade stimulovaly rust techto bunečných linií v neprítomnosti rustového faktoru.
Vynález byl popsán v souvislosti s jednotlivými výhodnými provedeními, je však zcela zrejmé, že jej není možno na tato provedení omezit. Je totiž možno provést ješté radu modifikací, odborníkúm zcela zrejmých, které by rovnéž spadaly do rozsahu vynálezu.
Zastupuje:

Claims (49)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Banka bio-oligomeru, vázaná na pevnou fázi nosiče, v níž na každou častici nosiče je vázán pouze jeden typ bio-oligomeru a banka obsahuje všechny možné kombinace podjednotek, z nichž jsou bio-oligomery vytvorený.
  2. 2. Banka podie nároku 1, v níž jsou bio-oligomery tvorený pŕedem určeným počtem podjednotek.
  3. 3. Banka podie nároku 1 nebo 2, jejimiž bio-oligomery jsou peptidy.
    -
  4. 4. Banka peptidu podie nároku 3, v níž se pod jednotky, volí ze skupiny glycin, L-aminokyseliny, D-aminokyseliny, neklasické aminokyseliny a látky podobné peptidúm.
  5. 5. Banka peptidu podie nároku 3, jejíž peptidové ŕetézce obsahují alespoň dve aminokyseliny, schopné zesíténí a banka je zpracována k zesítení peptidu za vzniku omezených, cyklizovaných nebo rigidizovaných peptidu.
  6. 6. Banka bio-oligomeru podie nároku 1' nebo 2, v níž jsou bio-oligomery oligonukleotidy.
  7. 7. Banka oligonukleotidu podie nároku 6, v níž se podjednotky volí ze skupiny ribonukleosidú, deoxyribonukleosidú a nukleosidových derivátu.
  8. 8. Zpúsob prípravy banky nahočilých bio-oligomerú, vyznačující se tím, žese
    i) pripraví alespoň dva podíly pevného nosiče pro ŕetézce nahodilýc’n podjednotek, ii) oddelene se privádejí skupiny, podjednotek k podílúm pevného nosiče tak, že se ke každému podílu' privádí jedna podjednotka, iii) podjednotky se úplné váži na v podstate vsechna místa, která jsou k disposici na pevném nosiči za vzniku kombinace částice a nové podjednotky, iv) stanoví se úplnost väzby a poprípade se reakce privede až k dovŕšení,
    v) dúkladné se promísí podíly kombinací částic pevného nosiče a nových podjednotek, a stupne i) až v) se opakují v požadovaném počtu opakování, odstráni ochranné skupiny, na částici pevného nosiče.
    vyznačuj í c í s e t í m, že se pevný nosič volí ze skupiny polystyrénová pryskyrice, pryskyrice typu poly’nipe, polyamldová pryskyrice, polystyrénová pryskyrice, naroubovaná polyethylenglykolem a polydimethylakrylamidová pryskyrice.
    Zpúsob podie nároku 9, vyznačuj íc í že se jako pevný nosič užije polydimethylakZpúsob podie nároku 9,vyznačuj ící že se jako pevný nosič použije oxid kremičitý.
    Zpúsob podie nároku 8, vyznačuj íc í že pevná fáze nosiče obsahuje väzný ŕetézec.
    Zpúsob podie nároku 12, vyznačuj ící že se väzný ŕetézec volí ze skupiny kyselina aminomáselná, kyselina aminokapronová, kyselina 7-aminoheptanová, ethylenglykol a kyselina fl-aminokaprylová.
    po poslednim požadovaném stupni se pŕičemž bio-oligomer zústává vázán
  9. 9. Zpúsob podie nároku 8,
  10. 10.
    s e tím, rylamid.
  11. 11.
    s e tím,
  12. 12 .
    s e tím,
  13. 13 .
    s e tím,
  14. 14. Zpúsob podie nároku 13, vyznač u.j í c í s e t í m, že väzným retezcem je kyselina aminckapronová.
  15. 15. Zpúsob podie nároku S, vyznačuj í c í s e t í m, že se pri príprave banky nahodilých bio-oiigome rú v alespoň jednom stupni váže tatáž podjednotka na všechny šástice nosiče a v alespoň jednom dalším stupni se alespoň dve podjednotky oddelené váži na alespoň dva podíly pevného nosiče.
  16. 16. Zpúsob podie nároku 8,vyznačzjící s e t í m, že se banka nahodilých peptidú získa jedním opakováním stupňú i) až v).
  17. 17. Zpúsob podie nároku 8, vyznačuj íc í s e t í m, že se banka nahodilých peptidú vytvorí více než jedním opakovaním stupňú i) až v).
  18. 18. Zpúsob stanovení ŕetézce bio-oligomerového väzného ŕetézce pro molekulu akceptoru, vyznačující s e t í m, že se
    a) vytvorí banka nahodilých bio-oligomerú podie nároku 1,
    b) do banky nahodilých bio-oligomerú se pŕivede molekula pri slušného akceptoru, která rozpozná a bude se vázat na jeden nebo vétší počet typú kombinace částice nosiče a biooligomeru v bance,
    c) izoluje se kombinace částice pevného nosiče a bio-oligome ru, která se váže na molekulu akceptoru a
    d) analyzuje se retézec bio-oligomeru z kombinace částice pevného nosiče a bio-oligomeru, kcerá byla izolována ze stupne c) .
  19. 19. Zpúsob podie, nároku 1S, v y 2 n a č u j í c í s e t í m, že se molekula akceptoru volí ze skupiny protilátek, receptoru, virú,. baktérií, bílkovin, unlohydrátu, nukleových kyselín, lípidú, léčiv, kovu a malých molekúl.
  20. 20.
    tím,
  21. 21.
    tím,
    Zpúsob podie nároku 19,vyznačující že se jako molekula akceptoru užije protilátka.
    Zpúsob podie nároku 19, vyznačuj íc í že se jako molekula akceptoru užije receptor.
  22. 22. Zpúsob stanovení retézce biologicky účinného bio-oligomerového väzného retézce, vyznačuj ící s e t í m, že se
    a) vytvorí banka nahodilých bio-oligomerú podie nároku 1 s modifikovanými částicemi nosiče tak, že určitý podíl biooligomeru je možno uvolnit,
    b) podíl bio-oligomeru sé z kombinace pevných částic nosiče a bio-oligomeru uvolnx in situ,
    c) in situ se provede detekce biologické účinnosti uvolnéného bio-oligomeru,
    d) izoluje se kombinace pevné částice nosiče a bio-oligomeru s hledaným špecifickým biologickým účinkem a
    e) stanoví se retezec oligomeru, zbývající r.a kombinaci částice pevného nosiče a bio-oligomeru, izolované ve stupni d).
  23. 23. Zpúsob podie nároku 22, vyznačuj íc í s e tím, že se částice pevného nosiče modifikuj! na částice, citlivé na púsobení kyselín, baží, nukleofilních látek, citlivé na svetlo, na elektrofilní látky, na oxidaci nebo na redukce.
  24. 24. Zpúsob podie nároku 22, vy.zn.ačují.cí s e t í m, že částice pevného nosiče obsahuje väzný ňetezec, citlivý na pusobení kyseliny nebo baze, na nukleofílní nebo elektrofilní látky, na svetlo a na oxidaci nebo retíukci,
  25. 25. Zpúsob podie nároku 22, vyznačuj í c. í s e t í m, že se uvolnení in situ ve stupni a) provádí enzymatickým štepením, chemickým štepením nebo fotochemickým štepením.
  26. 26. Zpúsob podie nároku 22, vyznačuj íc í s e t í m, že detekce ve stupni b) se týká biologické účin nosti ze skupiny cytotoxicíta, protinádorová účinnost, antibakteriální účinnost, protivirový účinek, účinek proti houbám, proti parasitum, účinnost rúetového faktoru, inhibice rústu, prenos nervového vzruchu, imunomodulační účinnost a regulační účinek.
  27. 27. Farmaceutický prostredek, vyznačující s e t í m, že obsahuje ŕetézec, stanovený zpúsobem podie nárokú 18 nebo 22, v nérnž bio-oligomerem je oligonukleotid nebo peptid, tvorený aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery pŕírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, podobné peptidum.
  28. 28. Diagnostický prostredek, vyznačující s e t í m, že obsahuje ŕetézec, stanovený zpúsobem podie nárokú 18 nebo 22, v nemž bio-oligomerem je oligonukleotid nebo peptid, tvorený aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery pŕírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, podobné peptidum.
  29. 29. Cytotoxická molekula obysáhující peptid s ŕetéz cem, stanoveným zpúsobem podie nároku 18 nebo 22, pŕičemž
    100 tento peptid je tvoňen aminokyselinami ze skupiny glycin, neprírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, podobné peptidum.
  30. 30. Protinádorová molekula, obsahující peptid s ŕetezcem, stanoveným zpusobem podie nároku 13 nebo 22, pŕičemž tento peptid je tvoŕen aminokyselinami ze skupiny glycin, neprírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky podobné peptidum.
  31. 31. Antimikrobiální molekula, obsahující peptid s ŕetezcem,stanoveným zpusobem podie nároku 13 nebo 22, pŕíčemž tento peptid je tvoŕen aminokyselinami ze skupiny glycin, neprírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, podobné peptidúm.
  32. 32. Agonista rústového faktoru, obsahující peptid s ŕetezcem, stanovený zpusobem podie nároku 18 nebo 22, pŕičemž tento peptid je tvoňen aminokyselinami ze skupiny glycin, neprírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, podobné peptidúm.
  33. 33. Antagonista rústového faktoru, obsahující peptid s ŕetezcem,stanoveným zpusobem podie nároku 13 nebo 22, pŕičemž tento peptid je tvoŕen aminokyselinami, ze skupiny glycin, neprírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, pdo'oné peptidúm.
  34. 34. Agonista hormonu, obsahující peptid s ŕetezcem, stanoveným zpusobem podie nároku 18 nebo 22, pŕičemž tento peptid je tvoŕen aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín, analogy aminokyselín a látky, podobné peptidúm.
    101
  35. 35. Antagonista hormonu, obsahujicí^peptid s ŕetézcem, stanoveným zpúsobem podie nároku 18 nebo 22, pŕičemž tento ŕetézec je tvoren aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery pŕírodních aminokyselín, analogy aminokyselín a látky, podobné peptidúm.
  36. 36. Agonista erythropoetinu, obsahující peptid s ŕetézcem, stanoveným zpúsobem podie nároku 18 nebo 22, pŕičemž tento ŕetezec je tvoren aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery pŕírodních aminokyselín, analogy aminokyselín a látky, podobné peptidum.
  37. 37. Cytotoxická molekula, obsahujicí oligonukleotid s ŕetézcem, stanoveným zpúsobem podie nároku 18 nebo 22.
  38. 38. Protiňádorová molekula, obsahujicí·oligonukleotid s ŕetézcem, stanoveným zpúsobem podie nároku 18 nebo 22.
  39. 39. Antimikrobiální molekula, obsahujicí oligonukleotid s ŕetézcem, stanoveným zpúsobem podie nároku 18 nebo
    22.
  40. 40. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje peptidový ŕetézec, stanovený zpúsobem podie nárokú 18 nebo 22, pŕičemž tento peptid je tvoren aminokyselinami . ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery pŕírodních aminokyselín, analogy aminokyselín a látky, podobné peptidúm.
  41. 41. Zpúsob stanovení retézce bio-oligomeru, katalyzujícího určitou reakci, vyznačuj íc í se tím, že se :
    a) pridá banka oligomeru podie nároku 1 k substrátu, enzymatický produkt je možno prokázat, jehož
    102
    b) izoluje se kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, kte rá má enzymatickou účinnost a
    c) stanoví se retezec bio-oligomeru v kombinaci pevného nosiče a bio-oligomeru, izolované ve stupni b).
  42. 42. Látka, napodobujúci účinek enzýmu, obsahujúci peptidový retezec, stanovený zpusobem podie nároku 41.
  43. 43. Zpusob stanovenú retezce bio-olígomeru, inhibujícího reakci, katalyzovanou enzymem, vyznačujúci s e tím, že se:
    a) z banky bio-oligomeru podie nároku 1, v níž je bio-oligomer uvolitelný z pevného nosiče uvolní in situ část biooligomeru z kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru,
    b) prokáže se in situ inhibice reakce, katalyzované enzymem,
    c) izoluje se kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, zjiš téná ve stupni c),
    d) stanoví se retezec bio-oligomeru, zústávajícího ve vázané forme v kombinaci pevného nosiče a bio-oligomeru, izolované ve stupni c).
  44. 44. Inhibitor enzýmu, obsahujúci retezec bio-oligomeru, stanovený zpusobem podie nároku 18 nebo 43, v nemž bio-oligomerem je oligonukleotid nebo peptid, tvorený aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, Disomery prírodních aminokyselín, analógy aminokyselín a látky, podobné peptidum.
  45. 45. Inhibitor enzýmu, obsahujúci retezec peptidu, stanovený zpusobem podie nároku 18 nebo 43, v nemž peptid je tvoŕen aminokyselinami ze skupiny glycin, nepŕírodní aminokyseliny, D-isomery prírodních aminokyselín nebo látky podobné peptidum.
    103
  46. 46. Pevný nosič, vyznačujicí se t í m, že obsahuje kombinaci více než jednoho selektívne odštépitelného väzného ŕetézce.
  47. 47. Pevný nosič, vyznačujicí se tím, že obsahuje kombinaci odštšpitelného a neočštépitelného väzného retezce.
  48. 48. Pevný nosič podie nároku 46 nebo 47, vyznáčující se tím, že odštepitelný väzný ŕetézec je citlivý k pusobení kyselín, baží, nukleofilních látek, elektrofilních látek, nebo je citlivý na svétlo, oxídaci nebo redukci.
  49. 49. pevný nosič podie nároku 46 nebo 47, vyznáč u j í c í se tím, že odštepitelný väzný ŕetézec je tvoŕen ŕetézcem, citlivým na štepení enzymem nebo je substrátem pro enzymatické štepení.
SK4073-92A 1990-07-02 1991-07-01 Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu SK281490B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54684590A 1990-07-02 1990-07-02
US07/717,454 US5650489A (en) 1990-07-02 1991-06-19 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
PCT/US1991/004666 WO1992000091A1 (en) 1990-07-02 1991-07-01 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK407392A3 true SK407392A3 (en) 1994-08-10
SK281490B6 SK281490B6 (sk) 2001-04-09

Family

ID=27068387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK4073-92A SK281490B6 (sk) 1990-07-02 1991-07-01 Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5650489A (sk)
EP (1) EP0542770B1 (sk)
JP (1) JP3552718B2 (sk)
KR (2) KR100222146B1 (sk)
AT (1) ATE176330T1 (sk)
AU (3) AU659091B2 (sk)
CA (1) CA2086672C (sk)
CZ (1) CZ289365B6 (sk)
DE (1) DE69130828T2 (sk)
DK (1) DK0542770T3 (sk)
ES (1) ES2126572T3 (sk)
FI (1) FI107995B (sk)
GR (1) GR3029443T3 (sk)
HU (1) HU218007B (sk)
IE (1) IE912299A1 (sk)
IL (1) IL98682A (sk)
MX (1) MX9100052A (sk)
NO (1) NO315002B1 (sk)
NZ (1) NZ238805A (sk)
PL (2) PL169616B1 (sk)
RO (1) RO112336B1 (sk)
SK (1) SK281490B6 (sk)
WO (1) WO1992000091A1 (sk)

Families Citing this family (617)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5639595A (en) * 1990-05-01 1997-06-17 Isis Phamaceuticals, Inc. Identification of novel drugs and reagents
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6197529B1 (en) * 1990-11-21 2001-03-06 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Linear substituted oligoalkyleneimine libraries
US20050209121A1 (en) * 1990-12-05 2005-09-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
JPH07501929A (ja) * 1991-08-23 1995-03-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴマーフラグメントの合成非ランダム化
AU2580892A (en) * 1991-09-05 1993-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
CA2118806A1 (en) * 1991-09-18 1993-04-01 William J. Dower Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US6117974A (en) * 1991-10-02 2000-09-12 Peptor Limited Libraries of backbone-cyclized peptidomimetics
US20010021513A1 (en) * 1991-11-21 2001-09-13 Puijk Wouter Cornelis Test device comprising a plate containing a multiplicity of wells with an associated metering device, as well as a kit which comprises these devices and use of the devices
US5573905A (en) * 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CA2133554C (en) * 1992-04-15 2009-07-14 David R. Shortle Synthesis of diverse and useful collections of oligonucleotides
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
AU4779493A (en) * 1992-07-21 1994-02-14 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
US5721099A (en) * 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
CA2143848C (en) * 1992-10-01 2007-09-11 W. Clark Still Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US6503759B1 (en) 1992-10-01 2003-01-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5807683A (en) * 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
DE4243770A1 (de) * 1992-12-23 1994-06-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
AU6281594A (en) * 1993-03-12 1994-09-26 Jerini Bio Chemicals Gmbh Process for synthesizing and selecting sequences of covalently bound components
US6864048B2 (en) 1993-04-28 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Factorial chemical libraries
DE69434998T2 (de) * 1993-05-27 2008-03-13 Aventis Pharmaceuticals Inc. Topologisch getrennte, kodierende Festphasen-Bibliotheken
US5840485A (en) * 1993-05-27 1998-11-24 Selectide Corporation Topologically segregated, encoded solid phase libraries
JPH08510325A (ja) * 1993-05-28 1996-10-29 カイロン コーポレイション 生物学的に活性なペプチド配列の選択方法
US5480971A (en) * 1993-06-17 1996-01-02 Houghten Pharmaceuticals, Inc. Peralkylated oligopeptide mixtures
US5846731A (en) * 1993-06-17 1998-12-08 Torry Pines Institute For Molecular Studies Peralkylated oligopeptide mixtures
DE69435011T2 (de) * 1993-06-21 2008-10-23 Aventis Pharmaceuticals Inc. Selektiv spaltbare Linker, die auf einer Methionin- und einer Estergruppe basieren
EP0788370A4 (en) 1993-07-09 1998-07-08 Smithkline Beecham Corp CYCLIC, PARTIAL RANDOM PEPTIDE LIBRARIES
AU7193494A (en) * 1993-07-21 1995-02-20 Oxford Glycosystems Ltd Saccharides, their synthesis and use
US6001982A (en) * 1993-07-29 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
KR960704064A (ko) * 1993-08-13 1996-08-31 죠나단 에스. 도르딕 생물학적 활성 화합물의 합성 및 검사를 위한 생체 촉매적 방법(Biocatalytic Methods for Synthesizing and ldentifying Biologically Active Compounds)
CN1154640C (zh) * 1993-10-01 2004-06-23 纽约市哥伦比亚大学理事 用标示物编码的多元组合化学库
US5922545A (en) * 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US5503805A (en) * 1993-11-02 1996-04-02 Affymax Technologies N.V. Apparatus and method for parallel coupling reactions
US6165778A (en) * 1993-11-02 2000-12-26 Affymax Technologies N.V. Reaction vessel agitation apparatus
US6287787B1 (en) 1993-11-24 2001-09-11 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Dimeric oligopeptide mixture sets
EP0733213A1 (en) * 1993-12-09 1996-09-25 Novartis AG Process for the production of combinatorial compound libraries
JPH09506611A (ja) * 1993-12-15 1997-06-30 コンビケム，インコーポレイテッド 組合わせライブラリーおよびその使用法
US5587471A (en) * 1994-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of making oligonucleotide libraries
US7067326B2 (en) * 1994-01-13 2006-06-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthetic receptors, libraries and uses thereof
US5593853A (en) * 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5541085A (en) * 1994-02-14 1996-07-30 Zymogenetics, Inc. Method for preparing orphan receptor ligands
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
WO1995024186A1 (en) * 1994-03-11 1995-09-14 Pharmacopeia, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
US6015880A (en) * 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US6936477B2 (en) 1994-04-13 2005-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
US5846841A (en) * 1994-05-20 1998-12-08 Selectide Corporation Motif Libraries
US6407059B1 (en) 1994-06-08 2002-06-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
IL109943A (en) 1994-06-08 2006-08-01 Develogen Israel Ltd Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
WO1995034813A1 (en) * 1994-06-14 1995-12-21 Smithkline Beecham Corporation Resins for solid state synthesis
US5663046A (en) * 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
AU2871195A (en) * 1994-06-23 1996-01-19 Affymax Technologies N.V. Methods for the synthesis of diketopiperazines
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
US5939268A (en) * 1994-07-26 1999-08-17 The Scripps Research Institute Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same
JPH10506379A (ja) * 1994-07-26 1998-06-23 ザ・スクリプス・リサーチ・インスティチュート 可溶性の組合せライブラリー
US5948693A (en) * 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5463564A (en) * 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
EP0786085A4 (en) * 1994-10-14 1999-02-03 Chiron Mimotopes Pty Ltd EFFICIENT METHOD OF DISCOVERING MIMOTOPES AND APPARATUS THEREOF
US5556752A (en) * 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5688696A (en) * 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
DE4444260A1 (de) * 1994-12-13 1996-06-20 Hoechst Ag Cyclohexapeptide und deren Mischungen, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
WO1996022067A2 (en) * 1994-12-27 1996-07-25 United Biomedical, Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
GB9502225D0 (en) * 1995-02-04 1995-03-22 Zeneca Ltd Method
AU5487496A (en) * 1995-05-03 1996-11-21 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5759865A (en) * 1995-05-03 1998-06-02 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5834318A (en) * 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
AU5871196A (en) * 1995-05-23 1996-12-24 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the synthesis of oligonucleotides and the oligonucleotides thereby produced
US20010053523A1 (en) * 1995-06-02 2001-12-20 M&E Biotech A/S. Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US6051554A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5770687A (en) * 1995-06-07 1998-06-23 Peptor Limited Comformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
CA2225313A1 (en) * 1995-06-21 1997-01-09 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
SE9502286D0 (sv) * 1995-06-22 1995-06-22 Pharmacia Ab Process for detection, quantification and/or identification of a peptide
JP4105763B2 (ja) * 1995-06-23 2008-06-25 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ，アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ アグーチシグナルタンパク質およびそのペプチドの脱色活性
GB9515070D0 (en) * 1995-07-22 1995-09-20 Zeneca Ltd Label
WO1997010507A1 (en) * 1995-09-11 1997-03-20 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6743892B1 (en) 1995-09-11 2004-06-01 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ in vivo
AU728668B2 (en) * 1995-09-11 2001-01-18 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US7026114B1 (en) * 1995-09-13 2006-04-11 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for monitoring polymer array synthesis
US6841533B1 (en) 1995-12-07 2005-01-11 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists
US6147205A (en) * 1995-12-15 2000-11-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups and methods for their use
US20110028350A1 (en) * 1995-12-15 2011-02-03 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
ES2200084T3 (es) * 1995-12-18 2004-03-01 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Metodos para identificar compuestos que se unen a una diana.
AU1582197A (en) * 1996-01-22 1997-08-11 Eli Lilly And Company Combinatorial process for preparing substituted indane libraries
US6365344B1 (en) * 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
JP2000504220A (ja) 1996-01-23 2000-04-11 ライガル ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド トランス支配性細胞内作用因子ペプチドおよびｒｎａ分子のスクリーニング方法
US6277583B1 (en) * 1996-02-07 2001-08-21 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries and applications thereof
US6080719A (en) * 1996-02-23 2000-06-27 Hoechst Aktiengesellschaft Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use
US6051378A (en) 1996-03-04 2000-04-18 Genetrace Systems Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
DE19610103A1 (de) 1996-03-15 1997-09-18 Basf Ag Cycloalkylderivate und ihre Synthese an fester Phase
AU740222C (en) * 1996-03-20 2002-10-10 Genzyme Corporation A method for identifying cytotoxic T-cell epitopes
EP0901629A4 (en) * 1996-03-21 2000-02-02 Univ Princeton CARBOHYDRATE LIBRARY, ASSAY AND METHOD
US5866341A (en) * 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
US6387707B1 (en) 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
US7144119B2 (en) 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
ES2288760T3 (es) 1996-04-25 2008-01-16 Bioarray Solutions Ltd. Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies.
US5958342A (en) * 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
DE19621177A1 (de) 1996-05-24 1997-11-27 Basf Ag Kohlenhydratderivate und ihre Synthese an fester Phase
US6696251B1 (en) 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6203978B1 (en) * 1996-05-31 2001-03-20 Du Vergier Ltd. Capture of single stranded nucleic acids
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
CN1227566A (zh) 1996-06-14 1999-09-01 明治乳业株式会社 T细胞表位肽
WO1997049430A1 (en) * 1996-06-26 1997-12-31 Antigen Express, Inc. Immunotherapy by modulation of antigen presentation
DE19626762A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Basf Ag Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen
US6355613B1 (en) 1996-07-31 2002-03-12 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5922872A (en) * 1996-08-01 1999-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Meta-benzylic and alpha-amido compositions and methods for preparing same
US5817489A (en) * 1996-08-01 1998-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Di-nitrogen heterocycle compositions
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
AU4351897A (en) 1996-09-16 1998-04-02 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries with tagged leaving groups
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5798035A (en) 1996-10-03 1998-08-25 Pharmacopeia, Inc. High throughput solid phase chemical synthesis utilizing thin cylindrical reaction vessels useable for biological assay
US6838238B1 (en) * 1996-10-17 2005-01-04 Invitrogen Corporation Morphatides: novel shape and structure libraries
US20020022227A1 (en) * 1996-10-17 2002-02-21 Short Jay M. Morphatides: novel shape and structure libraries
US6149869A (en) * 1996-10-23 2000-11-21 Glaxo Wellcome Inc. Chemical synthesizers
US6042789A (en) * 1996-10-23 2000-03-28 Glaxo Group Limited System for parallel synthesis of organic compounds
US6413724B1 (en) 1996-10-28 2002-07-02 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6025371A (en) * 1996-10-28 2000-02-15 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6453246B1 (en) 1996-11-04 2002-09-17 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing proximity data in a multi-dimensional space
US6571227B1 (en) 1996-11-04 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system and computer program product for non-linear mapping of multi-dimensional data
AU732397B2 (en) 1996-11-04 2001-04-26 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method and computer program product for identifying chemical compounds having desired properties
US6054325A (en) * 1996-12-02 2000-04-25 Glaxo Wellcom Inc. Method and apparatus for transferring and combining distinct chemical compositions with reagents
US6083761A (en) * 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
US6127191A (en) * 1996-12-03 2000-10-03 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Aminobenzenedicarboxylic acid-based combinatorial libraries
WO1998026095A1 (en) 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
CA2283474A1 (en) * 1997-03-04 1998-09-11 Bio-Technology General Corp. Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs
US6045755A (en) * 1997-03-10 2000-04-04 Trega Biosciences,, Inc. Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis
US6177464B1 (en) 1997-03-14 2001-01-23 Sepracor, Inc. Ring opening metathesis of alkenes
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
JPH10260223A (ja) * 1997-03-19 1998-09-29 Fujitsu Ltd 半導体検査装置及びこれを用いた検査方法
EP1015479A4 (en) * 1997-04-11 2002-07-24 Lilly Co Eli COMBINATIVE SUBSTANCE LIBRARIES OF PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES AND THE RELATED METHODS
US6004823A (en) * 1997-05-07 1999-12-21 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5908960A (en) * 1997-05-07 1999-06-01 Smithkline Beecham Corporation Compounds
GB9710582D0 (en) 1997-05-22 1997-07-16 Oxford Glycosciences Uk Ltd A method for de novo peptide sequence determination
EP1003904B1 (en) 1997-05-23 2007-07-11 BioArray Solutions Ltd. Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
WO1998058256A1 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill PEPTIDO OLIGONUCLEOTIDES (PONs) AND THEIR COMBINATORIAL LIBRARIES
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
EP1387390B1 (en) 1997-06-20 2009-02-18 Bio - Rad Laboratories, Inc. Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine
US5874589A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for synthesizing diverse collections of tetramic acids and derivatives thereof
US6410342B1 (en) * 1997-08-19 2002-06-25 Pharmacopeia, Inc. Method and apparatus for controlled photoelution
US7252950B1 (en) 1997-09-04 2007-08-07 The Regents Of The University Of California Assays for detecting modulators of cytoskeletal function
US6960457B1 (en) 1997-09-04 2005-11-01 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
CA2305597C (en) 1997-11-07 2008-07-29 Conjuchem Inc. Affinity markers for human serum albumin
US6228579B1 (en) * 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6083682A (en) * 1997-12-19 2000-07-04 Glaxo Group Limited System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US5968361A (en) * 1998-02-24 1999-10-19 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
US6497820B1 (en) 1998-02-03 2002-12-24 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
AU2795399A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Hplc fractionation of complex chemical mixtures
US6232287B1 (en) 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
AU3198899A (en) 1998-03-20 1999-10-11 Rockefeller University, The Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
AU767185B2 (en) 1998-03-23 2003-11-06 President And Fellows Of Harvard College Synthesis of compounds and libraries of compounds
KR20010042373A (ko) * 1998-03-30 2001-05-25 린다 에스. 스티븐슨 핵 수용체 활성을 조절하는 방법 및 화합물
US6316616B1 (en) 1998-04-02 2001-11-13 President And Fellows Of Harvard College Parallel combinatorial approach to the discovery and optimization of catalysts and uses thereof
EP1071943A4 (en) 1998-04-14 2005-08-10 Univ California TEST FOR THE DETECTION OF MICROTUBULUS DEPOLYMERIZATION INHIBITORS
US6872537B1 (en) 1998-04-14 2005-03-29 Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
US6699969B1 (en) 1998-04-14 2004-03-02 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
DE19819889A1 (de) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
AU3931699A (en) 1998-05-04 1999-11-23 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Method and device for isolating nucleic acids
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US6541211B1 (en) * 1998-05-20 2003-04-01 Selectide Corporation Apparatus and method for synthesizing combinational libraries
US6872535B2 (en) 1998-05-20 2005-03-29 Aventis Pharmaceuticals Inc. Three-dimensional array of supports for solid-phase parallel synthesis and method of use
US7387779B2 (en) * 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US7402400B2 (en) 2001-07-03 2008-07-22 Regents Of The University Of California Mammalian sweet taste receptors
PT1105360E (pt) * 1998-08-17 2009-09-30 Bristol Myers Squibb Co Identificação de interacções entre compostos-proteínas, utilizando bibliotecas de moléculas de fusão entre proteínas-ácidos nucleicos
US6633543B1 (en) * 1998-08-27 2003-10-14 Intel Corporation Multicast flow control
US6423493B1 (en) * 1998-10-26 2002-07-23 Board Of Regents The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US20040242521A1 (en) * 1999-10-25 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
WO2000027627A1 (en) * 1998-11-12 2000-05-18 Eli Lilly And Company Aryloxime linkers in the solid-phase synthesis of 3-aminobenzisoxazoles
US20030027214A1 (en) * 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
WO2000073799A1 (en) 1999-06-01 2000-12-07 Caliper Technologies Corp. Microscale assays and microfluidic devices for transporter, gradient induced, and binding activities
JP2003502304A (ja) 1999-06-14 2003-01-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド ターンライブラリをファージ上に表示するための構造化ペプチド骨格
SE9902479D0 (sv) * 1999-06-30 1999-06-30 Amersham Pharm Biotech Ab Particle classification as marker
US7742877B1 (en) 1999-07-22 2010-06-22 Becton, Dickinson & Company Methods, apparatus and computer program products for formulating culture media
US7604996B1 (en) * 1999-08-18 2009-10-20 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
DK1207905T3 (da) 1999-09-03 2011-01-03 Brigham & Womens Hospital Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af inflammatorisk sygdom under anvendelse af cadherin-II modulerende midler
CA2386540A1 (en) 1999-10-04 2001-04-12 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel carbamates and ureas
US6569685B1 (en) * 1999-10-05 2003-05-27 The Molecular Sciences Institute, Inc. Protein fingerprint system and related methods
KR100378252B1 (ko) * 1999-11-12 2003-03-29 학교법인 포항공과대학교 니트로술포닐에톡시카르보닐-아미노산을 이용한 합성테트라펩티드 라이브러리의 제조방법
US6458538B1 (en) * 1999-12-14 2002-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay
US7452664B2 (en) 1999-12-15 2008-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation
US8642284B1 (en) 1999-12-15 2014-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
ATE322558T1 (de) 2000-01-24 2006-04-15 Compound Therapeutics Inc Sensible und multiplexe diagnostische tests zur proteinanalyse
JP2003523504A (ja) 2000-02-03 2003-08-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 認知に影響する因子の検出のためのアッセイ
US7416524B1 (en) 2000-02-18 2008-08-26 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method and computer program product for fast and efficient searching of large chemical libraries
WO2001065462A2 (en) 2000-02-29 2001-09-07 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method and computer program product for designing combinatorial arrays
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US7039621B2 (en) 2000-03-22 2006-05-02 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
US20050037430A1 (en) * 2000-03-29 2005-02-17 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
AU2001249805A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
US7255999B2 (en) 2001-05-21 2007-08-14 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
ATE423221T1 (de) 2000-06-13 2009-03-15 Univ Boston Verwendung von mass-matched nukleotide in der analyse von oligonukleotidmischungen sowie in der hoch-multiplexen nukleinsäuresequenzierung
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
EP1311839B1 (en) 2000-06-21 2006-03-01 Bioarray Solutions Ltd Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US6759510B1 (en) * 2000-06-30 2004-07-06 Becton, Dickinson And Company Peptides for use in culture media
US20020019010A1 (en) * 2000-07-07 2002-02-14 Stockwell Brent R. Methods for identifying combinations of entities as therapeutics
US20020051991A1 (en) * 2000-07-11 2002-05-02 Zhi Hong Rapid generation of diverse nucleoside and nucleotide libraries
WO2002014867A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
US7420030B2 (en) 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US6963807B2 (en) 2000-09-08 2005-11-08 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Automated identification of peptides
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
EP1325017A2 (en) * 2000-09-11 2003-07-09 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
AU2001292778A1 (en) * 2000-09-18 2002-03-26 Genzyme Corporation Method to identify therapeutic antibody targets associated with a therapeutic response
AU2001294654A1 (en) 2000-09-25 2002-04-08 The Regents Of The University Of California Model for neurodegenerative diseases involving amyloid accumulation
US20030045005A1 (en) 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7045283B2 (en) 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
US20020165149A1 (en) * 2000-12-08 2002-11-07 Kranz David M. Mutated class II major histocompatibility proteins
US7572575B2 (en) 2000-12-13 2009-08-11 Massachusetts Institute Of Technology SIR2 activity
ATE387507T1 (de) * 2000-12-23 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Screeningverfahren für die oligonukleotidtransfektion
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
WO2002061419A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for analyzing combinatorial libraries
DE10106339A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-22 Hans-Joachim Mueller Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
US20060228730A1 (en) * 2001-04-11 2006-10-12 Rando Robert F Methods for identifying small molecules that bind specific RNA structural motifs
WO2002083837A1 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs
US6649573B2 (en) * 2001-04-13 2003-11-18 Michael J. Mitrovich Solid lubricant and composition
US6914123B2 (en) 2001-04-17 2005-07-05 Genentech, Inc. Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
US20050164515A9 (en) * 2001-06-05 2005-07-28 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase
US20030148380A1 (en) * 2001-06-05 2003-08-07 Belcher Angela M. Molecular recognition of materials
US20030113714A1 (en) * 2001-09-28 2003-06-19 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticles
EP1406493A4 (en) 2001-06-11 2006-06-14 Xenoport Inc ADMINISTRATION OF MEDIUM BY THE PEPT-2 TRANSPORTER
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
EP2003451B1 (en) 2001-06-26 2012-05-30 Senomyx, Inc. T1r1-t1r3 hetero-oligomeric umami taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of umami taste compounds
CA2453403C (en) 2001-07-09 2013-10-08 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US6800449B1 (en) 2001-07-13 2004-10-05 Syngenta Participations Ag High throughput functional proteomics
US7413870B2 (en) 2001-08-01 2008-08-19 Rigel Pharmaceuticals, Incorporated SAK: modulation of cellular proliferation for treatment of cancer
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
TW573125B (en) * 2001-08-29 2004-01-21 Combinatorx Inc A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof
US20030073104A1 (en) * 2001-10-02 2003-04-17 Belcher Angela M. Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus
KR20040068122A (ko) 2001-10-15 2004-07-30 바이오어레이 솔루션스 리미티드 공동 검색과 효소-매개된 탐지에 의한 다형성 좌위의 다중분석
EP1440083B1 (en) 2001-10-25 2013-01-02 Medical Research Council Molecules
US7262269B2 (en) 2001-10-26 2007-08-28 The Regents Of University Of California Method for screening combinational bead library; ligands for cancer cells
US6670142B2 (en) 2001-10-26 2003-12-30 The Regents Of The University Of California Method for screening combinatorial bead library, capturing cells from body fluids, and ligands for cancer cells
EP1451588A4 (en) * 2001-11-06 2005-03-09 Agilix Corp SENSITIVE CODED DEFINITION SYSTEMS
ATE434184T1 (de) * 2001-11-20 2009-07-15 Univ Duke Grenzflächen-biomaterialien
US7871619B2 (en) 2001-11-30 2011-01-18 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
WO2003052053A2 (en) * 2001-12-17 2003-06-26 Ribapharm Inc. Nucleoside libraries and compounds by mcc combinatorial strategies on solid support
US7291456B2 (en) 2002-01-24 2007-11-06 The Regents Of The University Of California Method for determining differences in molecular interactions and for screening a combinatorial library
WO2003065358A2 (en) * 2002-01-28 2003-08-07 Burstein Technologies, Inc. Methods and apparatus for logical triggering of an optical bio-disc
CA2471017A1 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Burstein Technologies, Inc. Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system
AU2003209054A1 (en) * 2002-02-07 2003-09-02 Discovery Genomics, Inc. Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation and methods of use thereof
US7091331B2 (en) 2002-03-04 2006-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Nucleic acid molecules and polypeptides encoding baboon TAFI
IL163822A0 (en) 2002-03-15 2005-12-18 Nuevolution As An improved method for synthesising templated molecules
US7544767B2 (en) 2002-04-05 2009-06-09 Burnham Institute For Medical Research HMGN2 peptides and related molecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells
US20060275753A1 (en) * 2002-04-15 2006-12-07 Hammond David J Recovery of analytes using combinatorial libraries
CA2482529A1 (en) 2002-04-15 2003-10-30 American National Red Cross Method for detecting ligands and targets in a mixture
US20060234390A1 (en) * 2002-05-17 2006-10-19 Slanetz Alfred E Process for determining target function and identifying drug leads
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
WO2004001010A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Ptc Therapeutics, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLECULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY
US20100168037A1 (en) * 2002-07-03 2010-07-01 Bio Science International, Inc. Peptides comprising aromatic d-amino acids and methods of use
JP4486497B2 (ja) * 2002-07-11 2010-06-23 アメリカン ナショナル レッド クロス 複合混合物中の個々の活性成分を同定する方法
US7301006B2 (en) * 2002-07-16 2007-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for the synthesis of modified peptides
CA2493808A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mediated mrna decay
WO2004013070A2 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Nuevolution A/S Multi-step synthesis of templated molecules
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
KR101476067B1 (ko) 2002-09-06 2014-12-23 인설트 테라페틱스, 인코퍼레이티드 공유결합된 치료제 전달을 위한 사이클로덱스트린-기초 중합체
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US20050064508A1 (en) * 2003-09-22 2005-03-24 Semzyme Peptide mediated synthesis of metallic and magnetic materials
WO2005003291A2 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
AU2003272169A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-13 Biacore Ab Assay with co-immobilized ligands
PT1558744E (pt) 2002-10-30 2011-09-22 Nuevolution As Codificação enzimática
WO2004047007A1 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Bioarray Solutions, Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
NZ560410A (en) 2002-12-03 2008-12-24 Univ North Carolina State Prion protein ligands and methods of use
US20040185473A1 (en) * 2002-12-17 2004-09-23 Affymetrix, Inc. Releasable polymer arrays
ATE450609T1 (de) 2002-12-19 2009-12-15 Nuevolution As Durch quasizufallsstrukturen und funktionen geführte synthesemethode
US7736909B2 (en) * 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
EP1597395A2 (en) 2003-02-21 2005-11-23 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
GB0305448D0 (en) * 2003-03-10 2003-04-16 Tcp Innovations Ltd Immunoassay
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
WO2004087933A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 The Regents Of The University Of California A novel encoding method for 'one-bead one-compound' combinatorial libraries
WO2004085049A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 The Regents Of The University Of California Preparation and application of encoded bead aggregates in combinatorial chemistry
US20040235027A1 (en) * 2003-03-31 2004-11-25 Regent Of The University Of California Preparation and application of ligand-biopolymer conjugates
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
PL1615992T3 (pl) 2003-04-04 2014-03-31 Pathogen Removal And Diagnostic Tech Inc Materiały wiążące białko prionowe i sposoby ich zastosowania
US7510848B2 (en) 2003-04-04 2009-03-31 North Carolina State University Prion protein binding materials and methods of use
US20040210036A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-21 Nanogen, Inc. Peptide substrate libraries
US7858044B2 (en) 2003-04-30 2010-12-28 Nexus Biosystems, Inc. Multi-well plate providing a high-density storage and assay platform
US7910523B2 (en) * 2003-05-23 2011-03-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting AP-1 transcription factors
US20060121489A1 (en) * 2003-05-23 2006-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System High throughput screening of aptamer libraries for specific binding to proteins on viruses and other pathogens
SI1629088T1 (sl) 2003-05-30 2012-08-31 Agensys Inc Antigen izvornih celic prostate (psca) in njegova podzaporedja
US20040253642A1 (en) * 2003-06-06 2004-12-16 Grant Zimmermann System and method for multidimensional evaluation of combinations of compositions
US7672791B2 (en) * 2003-06-13 2010-03-02 International Business Machines Corporation Method of performing three-dimensional molecular superposition and similarity searches in databases of flexible molecules
CA2533691A1 (en) * 2003-07-24 2005-02-03 Board Of Regents The University Of Texas System Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies
RU2006106920A (ru) 2003-08-06 2007-09-20 Синомикс Инк. (Us) Гетеро-олигомерные вкусовые рецепторы t1r, клеточные линии, которые экспрессируют указанные рецепторы и вкусовые соединения
EP1670939B1 (en) 2003-09-18 2009-11-04 Nuevolution A/S A method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
NZ546072A (en) 2003-09-22 2009-08-28 Bioarray Solutions Ltd Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
WO2005035552A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-21 Genzyme Corporation Transducing combinatorial peptide library
CA2544041C (en) 2003-10-28 2015-12-08 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
US7049077B2 (en) 2003-10-29 2006-05-23 Bioarray Solutions Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded DNA
EP2369348A1 (en) 2003-11-07 2011-09-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for Alzheimer's disease
WO2005060739A1 (en) 2003-12-24 2005-07-07 G2 Inflammation Pty Ltd Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized c5ar
US20050164167A1 (en) * 2004-01-28 2005-07-28 Buscher Benjamin A. Method of discovery and development of broad-spectrum antiviral drugs
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
DK1734996T3 (da) 2004-04-02 2013-06-10 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling og forebyggelse af sygdom, der er associeret med alfa v beta 5-integrin
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
EP1737573A2 (en) 2004-04-08 2007-01-03 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20050239134A1 (en) * 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
WO2005116643A2 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Carlsberg A/S Identification of compounds modifying a cellular response
AU2005250370B2 (en) 2004-05-28 2010-04-01 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
DK2453024T3 (en) 2004-06-21 2018-02-12 Univ Leland Stanford Junior Genes and conduits that are differentially expressed in bipolar disorder and / or major depressive disorder
JP4507080B2 (ja) * 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
CA2829654C (en) 2004-08-20 2017-10-31 Buck Institute For Age Research Small molecules that replace or agonize p53 function
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
US7547775B2 (en) 2004-12-31 2009-06-16 Affymetrix, Inc. Parallel preparation of high fidelity probes in an array format
US8338093B2 (en) * 2004-12-31 2012-12-25 Affymetrix, Inc. Primer array synthesis and validation
US20070207555A1 (en) * 2005-02-03 2007-09-06 Cesar Guerra Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals
US20100196509A1 (en) 2005-02-28 2010-08-05 Jonathan Braun Methods for Diagnosis and Treatment of Endometrial Cancer
WO2006099386A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthesis and use of colloidal iii-v nanoparticles
CA2601400A1 (en) 2005-03-19 2006-09-28 Medical Research Council Improvements in or relating to treatment and prevention of viral infections
WO2006101187A1 (en) 2005-03-22 2006-09-28 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides that increase collagen or hyaluronic acid production
CN101495645B (zh) 2005-03-23 2012-08-22 生物-拉德实验室公司 蛋白纯化方法
JP4324636B2 (ja) 2005-03-31 2009-09-02 アジェンシス，インコーポレイテッド １６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体および関連分子
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
US20070099830A1 (en) 2005-04-21 2007-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Sirt4 activities
US20070003954A1 (en) * 2005-05-12 2007-01-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070021433A1 (en) 2005-06-03 2007-01-25 Jian-Qiang Fan Pharmacological chaperones for treating obesity
HUE040063T2 (hu) 2005-07-19 2019-02-28 Stemgen S P A Tumor õssejtek tumorképzõ potenciáljának gátlása BMP-4 segítségével
KR20080049733A (ko) * 2005-08-16 2008-06-04 더 칠드런스 머시 호스피탈 미소구체 현탁 혼성화의 정량 및 이의 용도
US7943134B2 (en) 2005-08-31 2011-05-17 Academia Sinica Compositions and methods for identifying response targets and treating flavivirus infection responses
US7781209B2 (en) 2005-09-25 2010-08-24 Multispan, Inc. GPCR-expressing cell lines
EP1937718B1 (en) 2005-10-20 2017-12-06 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
US8119572B2 (en) 2005-10-24 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries
BRPI0618247A2 (pt) 2005-11-03 2011-08-23 Redpoint Bio Corp ensaio de triagem de alto rendimento para canal iÈnico trpm5
NZ568762A (en) 2005-11-07 2011-11-25 Scripps Research Inst Use of an inhibitor of tissue factor signaling in the manufacture of a medcament for inhibiting or suppressing tissue factor/tissue factor VIIa signaling involving protease activated receptor 2 in a mammal
CA2629299C (en) 2005-11-12 2017-08-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fgf2-related methods for diagnosing and treating depression
US7576037B2 (en) 2005-11-18 2009-08-18 Mei Technologies, Inc. Process and apparatus for combinatorial synthesis
DE602006018648D1 (de) 2005-12-01 2011-01-13 Nuevolution As Enzymvermittelnde kodierungsmethoden für eine effiziente synthese von grossen bibliotheken
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
CN103301475B (zh) 2005-12-28 2016-08-03 斯克里普斯研究所 药物组合物和表达载体以及调节基因表达的方法和核酸分子的应用
JP2009536313A (ja) 2006-01-11 2009-10-08 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノリアクターの形成および制御において使用するマイクロ流体デバイスおよび方法
WO2007079755A1 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Janus Beierholm Holding Aps Reimmunization and antibody design
WO2007092777A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
CA2646597A1 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and ly6 e: targets for cancer diagnosis and therapy
US20100278821A1 (en) 2006-03-21 2010-11-04 The Regents Of The University Of California N-cadherin: target for cancer diagnosis and therapy
DK3235811T3 (en) 2006-04-21 2018-11-12 Senomyx Inc PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF OXALAMIDS
US20070287160A1 (en) * 2006-04-21 2007-12-13 Chou Judy H Methods for high throughput screening of cell lines
EP2011882B1 (en) 2006-05-02 2012-03-28 Teikyo University Method for screening of substance capable of increasing glutathione
WO2007124755A1 (en) * 2006-05-02 2007-11-08 The Antibody Project Aps Method for immunizing an avian species
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP2530168B1 (en) * 2006-05-11 2015-09-16 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
ATE458998T1 (de) 2006-06-07 2010-03-15 Nutrinova Gmbh Verfahren zum screening von substanzen die die aktivität von gpcrs modulieren
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
US7674594B2 (en) 2006-07-27 2010-03-09 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of TRPA1 activation by a lower alkyl phenol
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US20100292090A1 (en) 2006-08-25 2010-11-18 Oncotherapy Science, Inc. Prognostic markers and therapeutic targets for lung cancer
NZ575090A (en) 2006-09-06 2012-02-24 Univ California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma using RGS1, ARPC2, FN1, SPP1 and WNT-2 polypeptide markers
US20090252745A1 (en) * 2006-09-15 2009-10-08 Duke University Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis
US20100247552A1 (en) 2006-11-10 2010-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Pak modulators
US9316633B2 (en) 2006-11-16 2016-04-19 The Regents Of The University Of California Methods for identifying inhibitors of solute transporters
JP2010514804A (ja) 2006-12-29 2010-05-06 ザ・ソーク・インスティチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ 運動能力を高めるための方法
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
US8772046B2 (en) * 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080269065A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Syntrix Biosystems, Inc. Conformationally Constrained Analytical Probes
KR101440153B1 (ko) * 2007-05-09 2014-09-15 재단법인서울대학교산학협력재단 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법
EP2581081A3 (en) 2007-06-01 2013-07-31 The Trustees Of Princeton University Treatment of viral infections by modulation of host cell metabolic pathways
US10092524B2 (en) 2008-06-11 2018-10-09 Edge Therapeutics, Inc. Compositions and their use to treat complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage
NZ599430A (en) * 2007-06-11 2014-03-28 Loch Macdonald R A drug delivery system for the prevention of cerebral vasospasm
US8334239B2 (en) * 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
US8163874B2 (en) * 2007-08-06 2012-04-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media and methods for preparing same
EP2522755B1 (en) 2007-08-13 2014-04-02 Baxter International Inc. IVIG modulation of chemokines for treatment of Multiple Sclerosis, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease
US8703161B2 (en) * 2007-08-13 2014-04-22 Elc Management, Llc Skin repair compositions comprising circadian gene activators and a synergistic combination of Sirt1 gene activators
US7939671B2 (en) 2007-08-21 2011-05-10 Senomyx, Inc. Compounds that inhibit (block) bitter taste in composition and use thereof
US7875452B2 (en) 2007-10-01 2011-01-25 Redpoint Bio Corporation Non-desensitizing mutant of the transient receptor potential TRPM5 ion channel
JP5496897B2 (ja) 2007-10-04 2014-05-21 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｂ７ファミリーメンバーのｚＢ７Ｈ６ならびに関連する組成物および方法
US9464135B2 (en) 2007-10-08 2016-10-11 The Regents Of The University Of California Epithelial membrane protein-2 (EMP2) and proliferative vitroretinopathy (PVR)
EP2212693B1 (en) 2007-10-22 2015-04-22 The Regents of The University of California Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus
WO2009062112A2 (en) 2007-11-09 2009-05-14 The Salk Institute For Biological Studies Use of tam receptor inhibitors as antimicrobials
US20110015239A1 (en) 2007-12-14 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Inhibitors of calcium-activated chloride channels
US9187535B2 (en) 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
EP2257810B1 (en) 2008-03-05 2013-06-05 The Regents of the University of California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma
SG10201607710UA (en) 2008-03-17 2016-11-29 Scripps Research Inst Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
US8207205B2 (en) 2008-04-21 2012-06-26 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising oxadiazole derivatives
ES2613844T3 (es) 2008-04-21 2017-05-26 Lawrence Livermore National Security, Llc Ligandos polidentados de alta afinidad selectivos y métodos para producirlos
EP2116618A1 (en) 2008-05-09 2009-11-11 Agency for Science, Technology And Research Diagnosis and treatment of Kawasaki disease
ES2845203T3 (es) 2008-07-01 2021-07-26 Genocea Biosciences Inc Sistema de análisis de antígenos
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
EP2324044A4 (en) 2008-08-04 2012-04-25 Univ Miami STING (INTERFERON GENE STIMULATOR), A REGULATOR OF INDIAN IMMUNE RESPONSES
US8338565B2 (en) 2008-08-20 2012-12-25 Ensemble Therapeutics Corporation Macrocyclic compounds for inhibition of tumor necrosis factor alpha
AU2009298879A1 (en) 2008-09-23 2010-04-08 President And Fellows Of Harvard College SIRT4 and uses thereof
AR073683A1 (es) 2008-09-25 2010-11-24 Univ Guelph Gen de nodulina temprano que responde a nitrogeno
US10131693B2 (en) 2008-10-20 2018-11-20 Gwangju Institute Of Science And Technology Bipodal-peptide binder
EP3260123A1 (en) 2008-11-06 2017-12-27 University of Miami Role of soluble upar in the pathogenesis of proteinuric kidney disease
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
WO2010060599A1 (en) 2008-11-27 2010-06-03 Roche Diagnostics Gmbh Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers
EP2789618B1 (en) 2008-12-03 2016-07-27 The Scripps Research Institute Stem cell cultures
CA2746003C (en) 2008-12-04 2020-03-31 Opko Curna, Llc Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
MX2011005910A (es) 2008-12-04 2011-06-17 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (epo) mediante inhibicion del transcrito antisentido natural a eritropoyetina.
US20110294870A1 (en) 2008-12-04 2011-12-01 Opko Curna, Llc Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
US20100233172A1 (en) 2008-12-16 2010-09-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods of inhibiting quiescent tumor proliferation
CA2747398C (en) 2008-12-17 2023-06-20 The Scripps Research Institute Generation and maintenance of stem cells
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
KR101682735B1 (ko) 2009-02-12 2016-12-06 큐알엔에이, 인크. 뇌 유래된 신경영양성 인자 (ｂｄｎｆ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 뇌 유래된 신경영양성 인자 (ｂｄｎｆ) 관련된 질환의 치료
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
WO2010107733A2 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2
CN102549159B (zh) 2009-03-17 2016-08-10 库尔纳公司 通过抑制针对δ样1同源物(DLK1)的天然反义转录物来治疗DLK1相关的疾病
EP3415235A1 (en) 2009-03-23 2018-12-19 Raindance Technologies Inc. Manipulation of microfluidic droplets
KR20110140128A (ko) 2009-03-27 2011-12-30 고조 인더스트리즈, 인크 포자-표면 상호작용을 길항하는 화합물을 스크리닝 및 사용하기 위한 조성물 및 방법
US8343976B2 (en) 2009-04-20 2013-01-01 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising pyrazole derivatives
KR101835889B1 (ko) 2009-05-06 2018-03-08 큐알엔에이, 인크. 지질 수송 및 대사 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 지질 수송 및 대사 유전자 관련된 질환의 치료
CA2761142C (en) 2009-05-06 2021-06-08 Opko Curna, Llc Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
US9012139B2 (en) 2009-05-08 2015-04-21 Curna, Inc. Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DMD family
DK2432881T3 (en) 2009-05-18 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF REPROGRAMMING FACTOR-RELATED DISEASES BY INHIBITING NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTS TO A REPROGRAMMING FACTOR
WO2010135695A2 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Curna, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN103221541B (zh) 2009-05-28 2017-03-01 库尔纳公司 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病
JP5944311B2 (ja) 2009-06-16 2016-07-05 クルナ・インコーポレーテッド コラーゲン遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるコラーゲン遺伝子関連疾患の治療
ES2629339T3 (es) 2009-06-16 2017-08-08 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1
CA2765889A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
KR101807324B1 (ko) 2009-06-26 2017-12-08 큐알엔에이, 인크. 다운 증후군 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 다운 증후군 유전자 관련된 질환의 치료
US20120122711A1 (en) * 2009-07-15 2012-05-17 Heath James R Screening of biopolymers
WO2011010964A1 (en) 2009-07-22 2011-01-27 Agency For Science, Technology And Research Differentiation of isobaric amino acids and other species
EP2454269A4 (en) * 2009-07-15 2013-03-06 Agency Science Tech & Res IMPROVED SCREENING OF BIOPOLYMERS
KR101752515B1 (ko) 2009-07-24 2017-06-29 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ａｖｂ５ 인테그린과 결부된 질환의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물
CA2768947C (en) 2009-07-24 2018-06-19 Opko Curna, Llc Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
WO2011017516A2 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins)
EP2464731B1 (en) 2009-08-11 2016-10-05 CuRNA, Inc. Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq)
JP5823964B2 (ja) 2009-08-14 2015-11-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 自閉症を診断及び治療する方法
WO2011022638A1 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Trp inhibitors and uses thereof
EP2982755B1 (en) 2009-08-21 2020-10-07 CuRNA, Inc. Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip
US20120189578A1 (en) 2009-08-24 2012-07-26 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for potentiating interleukin-35
EP2470657B1 (en) 2009-08-25 2019-10-23 CuRNA, Inc. Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
DK2480669T3 (en) 2009-09-25 2018-02-12 Curna Inc TREATMENT OF FILAGGRIN- (FLG) RELATED DISEASES BY MODULATING FLG EXPRESSION AND ACTIVITY
WO2011042564A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
EP2503888A4 (en) * 2009-11-23 2015-07-29 Cerulean Pharma Inc POLYMERS ON CYCLODEXTRINBASIS FOR THERAPEUTIC ADMINISTRATION
CA2782366A1 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Opko Curna, Llc Treatment of membrane bound transcription factor peptidase, site 1 (mbtps1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to mbtps1
US9068183B2 (en) 2009-12-23 2015-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (UCP2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to UCP2
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
WO2011079261A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
RU2611186C2 (ru) 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
EP2519633B1 (en) 2009-12-29 2017-10-25 CuRNA, Inc. Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
RU2016115782A (ru) 2009-12-31 2018-11-28 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с субстратом рецептора инсулина 2 (irs2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irs2 и транскрипционному фактору е3 (tfe3)
US8946181B2 (en) 2010-01-04 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (IRF8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IRF8
WO2011085066A2 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
EP2524039B1 (en) 2010-01-11 2017-11-29 CuRNA, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
CN202823394U (zh) 2010-01-19 2013-03-27 伊鲁米那股份有限公司 用于处理化学反应的设备和系统
WO2011091435A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods of treating liver disease
RU2611192C2 (ru) 2010-01-25 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1
WO2011094759A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
JP5934657B2 (ja) 2010-02-12 2016-06-15 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド デジタル検体分析
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
KR101838308B1 (ko) 2010-02-22 2018-03-13 큐알엔에이, 인크. 피롤린-5-카르복실레이트 환원효소 1(ｐｙｃｒ1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｐｙｃｒ1과 관련된 질환의 치료
US8980856B2 (en) 2010-04-02 2015-03-17 Curna, Inc. Treatment of colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3
RU2610661C2 (ru) 2010-04-09 2017-02-14 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фактором роста фибробластов 21 (fgf21), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к fgf21
ES2713873T3 (es) 2010-04-16 2019-05-24 Nuevolution As Complejos bifuncionales y métodos para hacer y utilizar tales complejos
RU2693462C2 (ru) 2010-05-03 2019-07-03 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt)
TWI586356B (zh) 2010-05-14 2017-06-11 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP2576783B1 (en) 2010-05-26 2017-11-29 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
JP5917497B2 (ja) 2010-05-26 2016-05-18 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド メチオニンスルホキシドレダクターゼａ（ｍｓｒａ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｓｒａ関連疾患の治療
EP2400304A1 (en) 2010-06-22 2011-12-28 Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) Method for the characterization of intermolecular interactions
JP6023705B2 (ja) 2010-06-23 2016-11-09 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ナトリウムチャネル、電位依存性、αサブユニット（ＳＣＮＡ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるＳＣＮＡ関連疾患の治療
JP5998131B2 (ja) 2010-07-14 2016-09-28 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｄｉｓｃｓｌａｒｇｅｈｏｍｏｌｏｇ（ｄｌｇ）ｄｌｇ１への天然アンチセンス転写物の阻害によるｄｌｇ関連疾患の治療
EP2598661B1 (en) 2010-07-26 2017-09-27 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US9376709B2 (en) 2010-07-26 2016-06-28 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
SG188314A1 (en) * 2010-08-27 2013-04-30 Agency Science Tech & Res Peptide libraries for screening and other applications
EP3447155A1 (en) 2010-09-30 2019-02-27 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
ES2640755T3 (es) 2010-10-06 2017-11-06 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la Sialidasa 4 (neu4) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen neu4
WO2012052391A1 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Glaxo Group Limited Polypeptide with jmjd3 catalytic activity
EP2630241B1 (en) 2010-10-22 2018-10-17 CuRNA, Inc. Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
EP2643484A4 (en) 2010-11-22 2014-04-16 Univ California METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN
US8987225B2 (en) 2010-11-23 2015-03-24 Curna, Inc. Treatment of NANOG related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NANOG
KR20140063501A (ko) 2010-12-22 2014-05-27 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2012109600A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
ES2716865T3 (es) 2011-02-18 2019-06-17 Scripps Research Inst Diferenciación dirigida de células precursoras de oligodendrocitos a un destino celular mielinizante
WO2012122025A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
CN103517726B (zh) 2011-04-05 2016-08-17 优势医疗 用于改善脑损伤后影响脑血流的结果的脑室内药物递送系统
US20120301904A1 (en) 2011-04-26 2012-11-29 Prosetta Antiviral, Inc Multiprotein assemblies
CN103717751A (zh) 2011-05-19 2014-04-09 塞昆纳姆股份有限公司 用于多重核酸鉴定的产品和方法
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
EP2714970B1 (en) 2011-06-02 2017-04-19 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US9244074B2 (en) 2011-06-07 2016-01-26 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
US9561274B2 (en) 2011-06-07 2017-02-07 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with HMGB1 antagonists
ES2653247T3 (es) 2011-06-09 2018-02-06 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la frataxina (FXN) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen FXN
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
ES2613808T3 (es) 2011-07-29 2017-05-26 Oncotherapy Science, Inc. Péptido derivado de ERAP1 y uso del mismo
CA2846496C (en) 2011-09-02 2020-07-14 The Regents Of The University Of California Substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines and uses thereof
CN108272782B (zh) 2011-09-06 2021-04-23 库尔纳公司 小分子在制备治疗Dravet综合征或全面性癫痫伴热性惊厥附加症的药物中的用途
WO2013063530A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Presage Biosciences, Inc. Methods for drug delivery
RS57919B1 (sr) 2011-12-16 2019-01-31 Poseida Therapeutics Inc Trpc4 modulatori za primenu u lečenju ili prevenciji bola
WO2013119845A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Vibrant Holdings, Llc Substrates, peptide arrays, and methods
JP6253596B2 (ja) 2012-02-16 2017-12-27 ザ ペン ステイト リサーチ ファンデーション アシル補酵素ａ：リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素１（ａｌｃａｔ１）の発現、機能または活性の阻害物質を同定する方法
EP2825209B1 (en) 2012-03-14 2018-08-29 University of Central Florida Research Foundation, Inc. Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same
US20150031750A1 (en) 2012-03-15 2015-01-29 The Scripps Research Institute Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
JP6399660B2 (ja) 2012-04-10 2018-10-03 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア 癌治療用組成物および方法
KR20150023287A (ko) 2012-04-24 2015-03-05 더 유니버시티 오브 마이애미 침습성 및 다중약물 내성 병원체에 대한 퍼포린 2 방어
US9399019B2 (en) 2012-05-09 2016-07-26 Evonik Corporation Polymorph compositions, methods of making, and uses thereof
US9347948B2 (en) 2012-06-04 2016-05-24 The Scripps Research Institute Phenyl glyoxal probes
CA2879542A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Salk Institute For Biological Studies Regulating the interaction between tam ligands and lipid membranes with exposed phosphatidylserine
US9750705B2 (en) 2012-08-31 2017-09-05 The Regents Of The University Of California Agents useful for treating obesity, diabetes and related disorders
JP2015532287A (ja) 2012-09-26 2015-11-09 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア Ｉｒｅ１の調節
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
US20140094432A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US20140120116A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Chinese University Of Hong Kong Treatment of cancer using smad3 inhibitor
US10206911B2 (en) 2012-10-26 2019-02-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgen receptor variants and methods for making and using
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
CN105189540A (zh) * 2012-12-10 2015-12-23 弗莱德哈钦森癌症研究中心 含脂质运载蛋白融合伴侣
US9725703B2 (en) 2012-12-20 2017-08-08 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing PCR reagents
WO2014124339A2 (en) 2013-02-07 2014-08-14 The Regents Of The University Of California Use of translational profiling to identify target molecules for therapeutic treatment
CA2923379C (en) 2013-02-15 2023-01-03 Vibrant Holdings, Llc Methods and compositions for amplified electrochemiluminescence detection
UY35464A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras g12c.
US9428537B2 (en) 2013-03-15 2016-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA derived small RNAs (tsRNAs) involved in cell viability
JP2016518126A (ja) 2013-04-19 2016-06-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ローンスターウイルス
US10626178B2 (en) 2013-08-21 2020-04-21 Raz Yirmiya Treatment of mood and stress related disorders
US9950036B2 (en) 2013-08-21 2018-04-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Treatment of mood and stress related disorders
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
TWI659021B (zh) 2013-10-10 2019-05-11 亞瑞克西斯製藥公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ之抑制劑
US9644037B2 (en) 2013-10-18 2017-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and RAD3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use
CA2933590C (en) 2013-12-11 2023-10-03 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glucocorticoid inhibitors for treatment of prostate cancer
EP3444251B1 (en) 2013-12-11 2023-06-07 Biogen MA Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
WO2015103367A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Raindance Technologies, Inc. System and method for detection of rna species
EP3604499A1 (en) 2014-03-04 2020-02-05 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming methods and cell culture platforms
WO2015136509A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Genesis Theranostix Korlatolt Felelossegu Tarsasag Diagnostic and therapeutic targets for preeclampsia and closely related complications of pregnancy
JP6661554B2 (ja) 2014-06-10 2020-03-11 バイオマトリカ，インク． 周囲温度における血小板の安定化
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
JP2017528498A (ja) 2014-09-25 2017-09-28 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ変異体タンパク質のインヒビター
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
AU2016245864C1 (en) 2015-04-10 2021-09-09 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
ES2856880T3 (es) 2015-04-15 2021-09-28 Araxes Pharma Llc Inhibidores tricíclicos condensados de KRAS y métodos de uso de los mismos
WO2016172571A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
CN107787371B (zh) 2015-04-24 2022-02-01 基纳生物技术有限公司 检测和定量次要变体的并行式方法
WO2016195982A2 (en) 2015-06-01 2016-12-08 The Penn State Research Foundation Hepatitis b virus capsid assembly
US20160370380A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Pharmaseq, Inc. Combinatorial antibody diagnostic
WO2016209772A2 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Proteovista Llc Snp arrays
US10782304B2 (en) 2015-06-24 2020-09-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for detecting protein-protein interactions
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
US10858343B2 (en) 2015-09-28 2020-12-08 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356359B1 (en) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356354A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10975071B2 (en) 2015-09-28 2021-04-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2017058807A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356339A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058768A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
JP7263005B2 (ja) 2015-10-16 2023-04-24 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 基底状態の多能性の誘導及び維持に関するプラットフォーム
WO2017070256A2 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Araxes Pharma Llc Method for screening inhibitors of ras
EP3377481A1 (en) 2015-11-16 2018-09-26 Araxes Pharma LLC 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
SG11201804776SA (en) 2015-12-08 2018-07-30 Biomatrica Inc Reduction of erythrocyte sedimentation rate
US9988357B2 (en) 2015-12-09 2018-06-05 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
WO2017139329A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Alexander Krantz Site-selective functionalization of proteins using traceless affinity lables
WO2017172979A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018036503A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Fecal bacterial markers for colorectal cancer
EP3519402A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10726944B2 (en) 2016-10-04 2020-07-28 International Business Machines Corporation Recommending novel reactants to synthesize chemical products
US10377743B2 (en) 2016-10-07 2019-08-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of RAS and methods of use thereof
RU2019121922A (ru) 2016-12-15 2021-01-18 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Композиции и способы лечения рака
WO2018140513A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c modulators for treating cancer
EP3573967A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Fused hetero-hetero bicyclic compounds and methods of use thereof
WO2018140599A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
WO2018140514A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)quinazolin-2-yl)azetidin-1-yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
EP3573954A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
EP3596117A4 (en) 2017-03-17 2021-01-13 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY AGAINST THE DISTAL EXPRESSION REGULATORY ELEMENT OF TGFB2
BR112019019407A2 (pt) 2017-03-20 2020-05-26 Genocea Biosciences Inc. Métodos de tratamento
WO2018175324A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 The Broad Institute, Inc. Compounds and methods for regulating insulin secretion
EP3630747A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Araxes Pharma LLC Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
WO2018218071A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Araxes Pharma Llc Compounds and methods of use thereof for treatment of cancer
AU2018271990A1 (en) 2017-05-25 2019-12-12 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of KRAS
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
ES2947336T3 (es) 2017-09-01 2023-08-07 Univ Johns Hopkins Terapia epigenética dirigida para el aneurisma aórtico hereditario
US11725056B2 (en) 2017-10-03 2023-08-15 Cedars-Sinai Medical Center Methods for targeting the immune checkpoint PD1 pathway for treating pulmonary fibrosis
WO2019090242A1 (en) 2017-11-04 2019-05-09 Advanced Proteome Therapeutics Inc. Composition and method for modifying polypeptides
US20220412979A1 (en) 2018-10-29 2022-12-29 Genocea Biosciences, Inc. Treatment methods
EP3873488A4 (en) 2018-10-31 2022-08-03 The University of Sydney COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF VIRUS INFECTION
US11325978B2 (en) 2018-11-06 2022-05-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating beta-globinopathies
WO2020159445A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Agency For Science, Technology And Research Cnx/erp57 inhibitor for use in the treatment or prevention of cancer
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
RU2699563C1 (ru) * 2019-05-29 2019-09-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт-ПИЯФ) Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина
DE102020202529A1 (de) * 2020-02-27 2021-09-02 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zur Identifikation einer Wirkstoffkombination
US11965162B2 (en) 2020-04-16 2024-04-23 The Johns Hopkins University MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment
WO2023081167A2 (en) 2021-11-02 2023-05-11 The Regents Of The University Of California P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2023086969A2 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Ichor Medical Systems Inc. Treatment methods
WO2023146807A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Regents Of The University Of California Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4392997A (en) * 1981-07-06 1983-07-12 Northwestern University Antigenic peptide compounds
US4618598A (en) * 1982-04-12 1986-10-21 Duke University Method of regulating hormone function or release
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4555101A (en) * 1984-03-13 1985-11-26 Stobb, Inc. Method and apparatus for separating signatures from a stack
US4590003A (en) * 1984-03-23 1986-05-20 Oncogen Platelet related growth regulator
US4569792A (en) * 1984-06-14 1986-02-11 Eli Lilly And Company Anti-diabetic compounds
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
JPH07119760B2 (ja) * 1984-07-24 1995-12-20 コモンウエルス・セ−ラム・ラボラトリ−ズ・コミッション ミモトープを検出または決定する方法
US4798787A (en) * 1984-09-19 1989-01-17 Cetus Corporation Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products
US4705777A (en) * 1985-02-25 1987-11-10 The Regents Of The University Of California Cationic oligopeptides having microbicidal activity
US4863857A (en) * 1985-03-01 1989-09-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Polypeptide complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known
US4631211A (en) * 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
WO1986006487A1 (en) * 1985-04-22 1986-11-06 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
NZ215865A (en) * 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
US4710489A (en) * 1985-04-22 1987-12-01 Cornell Research Foundation, Inc. Glutathione delivery system
CS256960B1 (en) * 1985-11-16 1988-04-15 Viktor Krchnak Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
US4780421A (en) * 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
US4837304A (en) * 1987-05-22 1989-06-06 Merck & Co., Inc. Inhibitor of ribonucleotide reductase
AU635492B2 (en) * 1987-10-13 1993-03-25 Telik, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
NZ228482A (en) * 1988-03-24 1991-03-26 Terrapin Tech Inc Chromatography substrate containing a peptide paralog (active site mimicer) peptide
US5010175A (en) * 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
DE58908694D1 (de) * 1988-05-24 1995-01-12 Biotechnolog Forschung Gmbh Oligonucleotidbank und verfahren zur dna-sequenzierung.
US4988625A (en) * 1988-11-09 1991-01-29 Merck & Co., Inc. Method for determining the functionalization of a solid support
CA2009996A1 (en) * 1989-02-17 1990-08-17 Kathleen S. Cook Process for making genes encoding random polymers of amino acids
US5182366A (en) * 1990-05-15 1993-01-26 Huebner Verena D Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IE912299A1 (en) 1992-01-15
JP3552718B2 (ja) 2004-08-11
PL169616B1 (pl) 1996-08-30
NO315002B1 (no) 2003-06-23
HU218007B (hu) 2000-05-28
NO930011L (no) 1993-02-22
KR100222146B1 (en) 1999-10-01
MX9100052A (es) 1992-02-28
GR3029443T3 (en) 1999-05-28
HU9204179D0 (en) 1993-04-28
SK281490B6 (sk) 2001-04-09
IL98682A0 (en) 1992-07-15
EP0542770A4 (en) 1993-09-15
PL168354B1 (pl) 1996-02-29
FI925986A0 (fi) 1992-12-31
DK0542770T3 (da) 1999-09-13
HUT63576A (en) 1993-09-28
CZ289365B6 (cs) 2002-01-16
US5510240A (en) 1996-04-23
JPH06500308A (ja) 1994-01-13
CA2086672A1 (en) 1992-01-03
AU2845495A (en) 1996-05-16
NZ238805A (en) 1994-07-26
AU683762B2 (en) 1997-11-20
FI107995B (fi) 2001-11-15
NO930011D0 (no) 1993-01-04
KR100245767B1 (ko) 2000-03-15
ATE176330T1 (de) 1999-02-15
DE69130828T2 (de) 1999-06-17
DE69130828D1 (de) 1999-03-11
AU659091B2 (en) 1995-05-11
EP0542770B1 (en) 1999-01-27
RO112336B1 (ro) 1997-08-29
US5858670A (en) 1999-01-12
EP0542770A1 (en) 1993-05-26
ES2126572T3 (es) 1999-04-01
IL98682A (en) 1997-02-18
US5650489A (en) 1997-07-22
FI925986A (fi) 1992-12-31
AU2836995A (en) 1995-12-07
CA2086672C (en) 2005-04-12
CZ407392A3 (en) 1993-10-13
WO1992000091A1 (en) 1992-01-09
AU8238591A (en) 1992-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK407392A3 (en) Bank of oligomers
Lanar et al. Identification of paramyosin as schistosome antigen recognized by intradermally vaccinated mice
US5795958A (en) Library of glyco-peptides useful for identification of cell adhesion inhibitors
EP0332225B1 (en) Antibody to polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor
EP0639584B1 (en) Preparation and screening of highly diverse peptide libraries for binding activity
EP0675873A4 (en) PRODUCTION OF CODED POLYMERS
US5948693A (en) Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
EP0138616A2 (en) Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity, processes for making them and pharmaceutical compositions comprising them
WO1994018345A1 (en) Receptor-binding antiproliferative peptides
US5639852A (en) Immunostimulatory agents
Van Regenmortel Structure of antigens
US6429286B1 (en) Immunoregulatory molecules for costimulatory signal transduction
RU2145233C1 (ru) Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом
Hruby et al. Applications of synthetic peptides
CA2234723A1 (en) Generating d-peptides: methods and compositions
Rapaka et al. Opioid peptides: an update
Sepetov et al. A One-Bead One-Peptide Combinatorial Library Method for B-Cell Epitope Mapping
CENTERS 25 BEHAVIORAL ANALYSIS AND TREATMENT OF SUBSTANCE ABUSE. Norman A. Krasnegor, Ph. D., ed. GPO out of stock NCADI out of stock NTIS PB# 80-112428 $24.95
Stokes New methods for the synthesis of biologically active cyclosporins

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20110701